EP1971863A1 - Use of polymers for increasing the signal intensity when carrying out detection reactions - Google Patents

Use of polymers for increasing the signal intensity when carrying out detection reactions

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EP1971863A1
EP1971863A1 EP07703606A EP07703606A EP1971863A1 EP 1971863 A1 EP1971863 A1 EP 1971863A1 EP 07703606 A EP07703606 A EP 07703606A EP 07703606 A EP07703606 A EP 07703606A EP 1971863 A1 EP1971863 A1 EP 1971863A1
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EP
European Patent Office
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interval
polyvinyl
molecular weight
polyvinylpyrrolidone
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07703606A
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German (de)
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Inventor
Peter Porschewski
Kerstin Steinert
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Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1971863A1 publication Critical patent/EP1971863A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • GPHYSICS
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    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to the increase of the signal intensity with simultaneous reduction of non-specific background binding when carrying out detection reactions - in particular of immunoassays.
  • Immunoassays find i.a. in the analytics of medical diagnostics and human therapy a wide application.
  • ELISA and antibodies are routinely used in medical analytics labs to screen blood for relevant pathogens.
  • Polyclonal antibodies - a mixture of antibodies with different binding epitopes - are the most commonly used.
  • attempts have been made in recent years to establish new diagnostic methods that should be distinguished by greater sensitivity, lower costs and shorter processing times.
  • developments have become known from the prior art, based on the so-called.
  • Luminex xMap technology to develop detection techniques that meet the above requirements as much as possible.
  • microspheres or beads The basis of the Luminex xMAP technology are microscopically small spherical polymer particles, in particular polystyrene particles, commonly referred to in the art as microspheres or beads. These have in their interior at least two different fluorescent dyes. The variation of different proportions of the two dyes defines spectrally clearly distinguishable populations of beads. Thus, for example, one hundred different types of microspheres are available. Each species of the different beads can be coated with a specific detection reagent or antigen by simple coupling chemistry. In this way, it becomes theoretically possible to perform up to one hundred different detection reactions simultaneously in one sample. By the year 2004, about 30 of these detection reactions had already been established.
  • each MirosphDCpopulation binds with the appropriately coated detection reagent their specific target molecule.
  • the target molecules bound on the surface of the microspheres are recognized by a specific detection molecule, which - in the described example - carries a green fluorescent marker, also called a reporter.
  • Luminex 100 analyzer thousands of microspheres can be evaluated individually within seconds.
  • a first laser in the device is used to excite the red fluorescent dyes within the beads, which are classified based on their fluorescence emission.
  • a second laser is - in the present example - e.g. the green fluorescent dye of the reporter is excited and the intensity of the emitted light is recorded.
  • the identity of the antigen is specified, while qualitatively and quantitatively the antibodies specifically bound to the respective antigen can be detected by the second laser.
  • the principle of a LiquiChip immunoassay is based on the use of an (ELISA) antibody sandwich pair on LiquiChip beads.
  • an antibody of the sandwich pairs is immobilized covalently as a capture molecule (capture antibody) on the surface of the polystyrene beads.
  • the second antibody is used as the antigen-specific primary antibody.
  • This primary antibody can e.g. be biotinylated and detected using a streptavidin-phycoerythrin conjugate or by a corresponding (fluorophore) -marker-conjugated species-specific detection antibody.
  • the area in which the biomarker is detectable and quantifiable is called the dynamic range.
  • the biomarker concentration increases, the binding saturates. However, the measurement at high concentrations above saturation is no longer possible. By contrast, low concentrations can not be detected due to the low sensitivity or because of the unspecific background signal.
  • the present invention thus has the object to enable an improved signal-to-background ratio (S / B).
  • the assay sensitivity can thus be improved, resulting in a larger dynamic range and an improved signal-to-background ratio (S / B).
  • a further advantage is that by achieving higher sensitivities, it is also possible to carry out assays with reduced sample quantities, especially if only a small initial amount of sample material is available.
  • proteinogenic Substances - such as BSA, casein or gelatin - or non-proteinogenic substances - especially detergents - can be used. These substances are used in the corresponding reaction buffers.
  • the detection antibodies are able to bind nonspecifically to the capture antibodies.
  • the buffers used in the prior art are usually standard buffers such as PBS or Tris buffer (pH 7 - 7.8).
  • detergents used in the corresponding buffers to reduce the non-specific binding that results from protein-protein or protein-matrix interactions have the serious disadvantage that they are too high in the specific antigen antibodies - Dissolve interactions or even denaturing effect on antigen and antibodies and thus ultimately have an inactivating effect.
  • the object underlying the present invention in view of the prior art described above, is now to overcome the described disadvantages of the prior art and not to optimize immunoassays - LiquiChip immunoassays - with respect to the increase of the signal intensity enzymatically mediated signal amplification - and to allow simultaneous reduction of non-specific background binding.
  • Another object of the present invention is to increase the signal intensity while reducing unspecific binding to so-called planar To enable protein arrays in which the detection of bound analytes on a substantially planar array.
  • a further object of the present invention is to provide assay conditions in a detection method which also make it possible to generate the highest possible specific signal with small sample quantities.
  • Polyvinyl derivatives in the sense of the invention are all derivatives of a polymer or oligomer obtained by polymerizing a monomer having a vinyl structure, in particular polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone (PVP).
  • polyvinyl derivatives are understood as meaning oligomers or polymers with ester partial structures, such as, for example, Polyvinyl acetate, optionally partially saponified and copolymers, such.
  • soluble polyvinyl derivatives By using soluble polyvinyl derivatives, the disadvantages of the prior art can thus be overcome.
  • soluble polyvinyl derivatives can be used in a larger concentration range than detergents and cause an increase in signal intensity and sensitivity and at the same time contribute to the reduction of non-specific bonds. - This results in a improved signal-to-background ratio over a wider dynamic range.
  • soluble polyvinyl derivatives e.g. Polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone (PVP) in the reaction buffers in all immunoassays or ELISAs, which are performed on hydrophobic surfaces, the signal intensities with simultaneous reduction of non-specific bonds.
  • PVA Polyvinyl alcohol
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the use of polyvinyl derivatives can also improve the results of detection reactions which are carried out in a higher degree of reaction (multiplex assay).
  • the use of the polyvinyl derivatives opens up the possibility that, by increasing the sensitivity, it is also possible to analyze those parameters in parallel in the setup whose signal intensities prove to be too low under the previous conditions.
  • buffers comprising the mentioned polyvinyl derivatives improve protein-protein and protein-DNA interaction assays as well as DNA applications in LiquiChip assays on polystyrene surfaces as mentioned above.
  • the polyvinyl derivatives especially polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone PVP contribute to prevent the unwanted aggregation of the beads.
  • the present invention allows an increase in the signal intensity - also with simultaneous reduction of non-specific binding in the detection of bound analytes by means of so-called planar protein arrays.
  • planar protein arrays contain the
  • Catcher molecules on a carrier e.g. Glass or glass slides, nitrocellulose, PVDF or polystyrene surfaces, and embodies, for example, an antibody, a fragment of an antibody, an aptamer, a peptide or an anticalin.
  • LiquiChip immunoassays involves the use of an (ELISA) antibody sandwich on LiquiChip beads.
  • an antibody of the sandwich pairs is covalent as
  • Capture molecule immobilized on the surface of polystyrene beads. These beads are incubated with a sample (e.g., serum, cell culture or tissue lysate, cell culture supernatant) containing the appropriate antigen.
  • a sample e.g., serum, cell culture or tissue lysate, cell culture supernatant
  • the beads can optionally be washed.
  • Antigen should remain bound to the beads via the capture antibody.
  • the specifically bound antigen can be labeled, for example, with a second antigen-specific antibody and subsequently detected. This can be done, for example, with a fluorophore-labeled antibody directed against this second antibody.
  • non-specific binding of other assay components eg, other proteins from the sample
  • the incubation of the capture antibody beads with the sample (antigen) is carried out in a buffer containing a soluble polyvinyl derivative.
  • Suitable polyvinyl derivatives in the solution of the object according to the invention are all polyvinyl derivatives which are soluble or water-soluble under the given reaction conditions.
  • Preferred polyvinyl derivatives are such as e.g. Polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol in the form of their pure polymers, as copolymers with each other and / or with other suitable comonomers and as mixtures.
  • suitable copolymers With a view to the use of suitable copolymers is the use of any copolymer of vinyl alcohol or vinyl acetate and vinylpyrrolidone as well as copolymers of both - poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl acetate] or poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl alcohol] in addition to the above-mentioned copolymers, possible, provided that they have a suitable solubility behavior in an essentially aqueous environment.
  • the respective molecular weights can be varied within wide limits for the successful realization of the method according to the invention. Conveniently, they are in a range of 5,000 to 500,000 Da, preferably in an interval of 24,000 to
  • Polymers with mixtures of polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone being preferred.
  • polyvinyl alcohol alone or in mixtures with polyvinylpyrrolidone is conveniently a molecular weight range of 9,000 to 500,000 Da, preferably 31,000 to 186,000 Da and more preferably between 86,000 and 126,000 Da and between 146,000 and 186,000 Da.
  • a molecular weight range of 5,000 to 500,000 Da, preferably 10,000 to 450,000 Da, and more preferably 24,000 to 360,000 Da is practically suitable.
  • the concentration - individually or in combination - of the polyvinyl derivatives is for example in the LiquiChip-Imunoassays in an interval of 0.025 to 5% (w / v), preferably in an interval of 0.025 to 2% (w / v), and more preferably in one Interval from 0.1 to 1% (w / v).
  • the beads are preincubated with the buffer containing the polyvinyl derivative, followed by the addition of the sample and a further incubation.
  • the soluble polyvinyl derivatives e.g. preferably polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone - but may also be included in the following steps in the respective buffers, e.g. upon addition and incubation of the second antigen-specific antibody.
  • the present invention further relates to a method for increasing the signal intensity while reducing unspecific binding, which is characterized in that the detection of bound analytes on beads or on planar protein arrays in the presence of a polyvinyl derivative.
  • the present invention relates to a method in which the capture molecules are applied to glass (glasslides), nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or on polystyrene surfaces and the detection reaction is carried out in the presence of a polyvinyl derivative.
  • the capture molecule may be, for example, an antibody, the fragment of an antibody, an aptamer, a peptide or an anticalin.
  • the present invention relates to a kit for carrying out an immunoassay containing at least one buffer with a polyvinyl derivative as component.
  • the present invention also relates to a kit in which the capture molecules are bound to the beads or to planar arrays.
  • the beads or planar arrays may have a carrier material made of glass, nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or polystyrene.
  • Assay buffer II (contains no PVA or PVP):
  • Sodium chloride, NaH 2 PO 4 -H 2 O and the polyvinyl derivative were autoclaved in 900 ml of distilled water and dissolved. Thereafter, the pH is adjusted to 7.4 with sodium hydroxide solution (NaOH). Then BSA and Tween 20 are added and the Total volume filled up to 1 liter. Before use, the solution is filtered through a 0.45 ⁇ m filter.
  • the polymeric substances were also included in the first step in the binding of the antigens to the capture antibody beads in the incubation buffer.
  • assay buffer I 50 .mu.l of assay buffer I were initially charged and mixed with 25 .mu.l of sample dissolved in assay buffer II. This is followed by the addition of 25 .mu.l of assay buffer II containing each
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Abstract

The present invention relates to the use of polyvinyl derivatives for increasing the signal intensity while simultaneously reducing unspecific background bonds when carrying out detection reactions particularly of immunoassays.

Description

Verwendung von Polymeren zur Erhöhung der Signalintensität bei der Durchführung von Nachweisreaktionen Use of polymers to increase the signal intensity when carrying out detection reactions
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Hintergrundbindung bei der Durchführung von Nachweisreaktionen - insbesondere von Immunoassays.The present invention relates to the increase of the signal intensity with simultaneous reduction of non-specific background binding when carrying out detection reactions - in particular of immunoassays.
Immunoassays finden u.a. in der Analytik der medizinischen Diagnostik und der Humantherapie eine breite Anwendung. So werden mit Hilfe der ELISA-Technik und Antikörpern in medizinischen Analytiklabors routinemäßig Blutkonserven auf relevante Krankheitserreger untersucht. Dabei werden polyklonale Antikörper - ein Gemisch von Antikörpern mit verschiedenen Bindungsepitopen - am häufigsten eingesetzt. Neben der bewährten ELISA-Technik waren in den letzten Jahren immer wieder Bestrebungen zu beobachten, neuere Methoden in der Diagnostik zu etablieren, die sich durch höhere Sensitivität, geringere Kosten und kürzere Bearbeitungszeiten auszeichnen sollten. So sind aus dem Stand der Technik Entwicklungen bekannt geworden, auf der Basis der sog. Luminex-xMap-Technologie Nachweistechniken zu entwickeln, welche die oben geschilderten Anforderungen so weit wie möglich erfüllen.Immunoassays find i.a. in the analytics of medical diagnostics and human therapy a wide application. For example, ELISA and antibodies are routinely used in medical analytics labs to screen blood for relevant pathogens. Polyclonal antibodies - a mixture of antibodies with different binding epitopes - are the most commonly used. In addition to the tried and tested ELISA technique, attempts have been made in recent years to establish new diagnostic methods that should be distinguished by greater sensitivity, lower costs and shorter processing times. Thus, developments have become known from the prior art, based on the so-called. Luminex xMap technology to develop detection techniques that meet the above requirements as much as possible.
Grundlage der Luminex-xMAP-Technologie sind mikroskopisch kleine sphärische Polymerpartikel, insbesondere Polystyrolpartikel, im Stand der Technik gemeinhin als Mikrosphären oder Beads bezeichnet werden. Diese weisen in ihrem Inneren mindestens zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auf. Die Variation von verschiedenen Anteilen der beiden Farbstoffe definiert dabei spektral eindeutig unterscheidbare Populationen von Beads. Somit sind z.B. einhundert verschiedene Mikrosphären-Typen verfügbar. Jede Spezies der verschiedenen Beads kann mit einem spezifischen Nachweisreagenz oder Antigen durch einfache Kopplungschemie beschichtet werden. Auf diese Weise wird es theoretisch möglich, bis zu einhundert verschiedene Nachweisreaktionen simultan in einer Probe durchzuführen. Bis zum Jahr 2004 waren ca. 30 dieser Nachweisreaktionen bereits etabliert. Bei der erwähnten Inkubation mit wenigen Mikrolitern einer Probe bindet jede Mirosphärenpopulation mit dem entsprechend beschichteten Nachweisreagenz ihr spezifisches Zielmolekül. Die auf der Oberfläche der Mikrosphären gebundenen Zielmoleküle werden von einem spezifischen Detektionsmolekül, welches - in dem geschilderten Beispiel - einen grünen Fluoreszenzmarker trägt, auch als Reporter bezeichnet, erkannt.The basis of the Luminex xMAP technology are microscopically small spherical polymer particles, in particular polystyrene particles, commonly referred to in the art as microspheres or beads. These have in their interior at least two different fluorescent dyes. The variation of different proportions of the two dyes defines spectrally clearly distinguishable populations of beads. Thus, for example, one hundred different types of microspheres are available. Each species of the different beads can be coated with a specific detection reagent or antigen by simple coupling chemistry. In this way, it becomes theoretically possible to perform up to one hundred different detection reactions simultaneously in one sample. By the year 2004, about 30 of these detection reactions had already been established. In the mentioned incubation with a few microliters of a sample each Mirosphärenpopulation binds with the appropriately coated detection reagent their specific target molecule. The target molecules bound on the surface of the microspheres are recognized by a specific detection molecule, which - in the described example - carries a green fluorescent marker, also called a reporter.
So können beispielsweise in einem Luminex 100- Analysegerät Tausende von Mikrosphären innerhalb von Sekunden individuell ausgewertet werden. Ein erster Laser im Gerät dient der Anregung der roten Fluoreszenzfarbstoffe innerhalb der Beads, die aufgrund ihrer Fluoreszenzemission klassifiziert werden. Durch einen zweiten Laser wird - im vorliegenden Beispiel - z.B. der grüne Fluoreszenzfarbstoff des Reporters angeregt und die Intensität des emittierten Lichts wird aufgezeichnet. Mit Hilfe des ersten Lasers wird also die Identität des Antigens spezifiziert, während durch den zweiten Laser qualitativ und quantitativ die an das jeweilige Antigen spezifisch gebundenen Antikörper nachgewiesen werden können.For example, in a Luminex 100 analyzer, thousands of microspheres can be evaluated individually within seconds. A first laser in the device is used to excite the red fluorescent dyes within the beads, which are classified based on their fluorescence emission. By a second laser is - in the present example - e.g. the green fluorescent dye of the reporter is excited and the intensity of the emitted light is recorded. With the aid of the first laser, therefore, the identity of the antigen is specified, while qualitatively and quantitatively the antibodies specifically bound to the respective antigen can be detected by the second laser.
Innerhalb von weniger als 3 Stunden können mit dieser Technologie bis zu 9.600 diagnostische Tests in einer einzigen 96-Well Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Damit bietet die Luminex-xMAP-Technologie gegenüber konventionellen Verfahren - wie z. B. dem bekannten ELISA - entscheidende Vorteile:Within less than 3 hours, this technology can perform up to 9,600 diagnostic tests in a single 96-well microtiter plate. Thus, the Luminex xMAP technology compared to conventional methods - such. B. the known ELISA - decisive advantages:
• so erfolgt der Nachweis in einem Well ohne Waschschritte, womit kürzere Bearbeitungszeiten und geringere Kosten verbunden sind;• proofing in a well without washing steps, resulting in shorter processing times and lower costs;
• aufgrund der sehr hohen Sensitivität werden nur geringste Mengen der Probe benötigt;• due to the very high sensitivity, only the smallest amounts of sample are needed;
• daneben ist der Prozess vollständig automatisierbar. Demgemäß sind aus dem Stand der Technik bereits spezielle Immunoassays bekannt, die für die Luminex-Technologie entworfen wurden. Hierzu gehören insbesondere die von der Firma Qiagen in Hilden entwickelten LiquiChip-Immunoassys.• In addition, the process is completely automatable. Accordingly, the prior art already discloses special immunoassays designed for Luminex technology. These include in particular the LiquiChip immunoassays developed by Qiagen in Hilden.
Das Prinzip eines LiquiChip-Immunoassays beruht auf der Verwendung eines (ELISA-) Antikörper-Sandwich-Pairs auf LiquiChip-Beads. Dazu wird ein Antikörper des Sandwich-Pairs kovalent als Fänger-Molekül (Capture-Antikörper) auf die Oberfläche der Polystyrol-Beads immobilisiert. Der zweite Antikörper wird als Antigen- spezifischer Primärantikörper verwendet. Dieser Primärantikörper kann z.B. biotinyliert sein und mit Hilfe eines Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugates oder durch einen entsprechend (Fluorophor)-Marker-konjugierten Spezies-spezifischen Detektions-Antikörper nachgewiesen werden.The principle of a LiquiChip immunoassay is based on the use of an (ELISA) antibody sandwich pair on LiquiChip beads. For this purpose, an antibody of the sandwich pairs is immobilized covalently as a capture molecule (capture antibody) on the surface of the polystyrene beads. The second antibody is used as the antigen-specific primary antibody. This primary antibody can e.g. be biotinylated and detected using a streptavidin-phycoerythrin conjugate or by a corresponding (fluorophore) -marker-conjugated species-specific detection antibody.
Wie bei einem Western-blot oder einem ELISA kann es allerdings auch bei einem LiquiChip-Immunoassay zu unspezifischen Bindungen von einzelnen Proben- oder Assay-Komponenten an die Matrix-Oberfläche oder an den immobilisierten Capture- Antikörper kommen (Hintergrundbindung). Ein weiteres Problem betrifft die Affinität, eine der physiko-chemischen Eigenschaften des Antikörpers für den jeweiligen Biomarker. Die Affinität des jeweiligen Antikörpers bestimmt - wie aus dem Stand der Technik bekannt ist - das Ausmaß der Bindung des Biomarkers in der Probe mit.However, as with a Western blot or an ELISA, non-specific binding of individual sample or assay components to the matrix surface or to the immobilized capture antibody may also occur in a LiquiChip immunoassay (background binding). Another problem concerns the affinity, one of the physicochemical properties of the antibody for the particular biomarker. The affinity of the particular antibody determines, as is known from the prior art, the extent of binding of the biomarker in the sample.
Der Bereich, in dem der Biomarker detektierbar und quantifizierbar ist, wird dabei als dynamischer Bereich bezeichnet. Mit steigender Konzentration des Biomarkers wird die Bindung gesättigt. Die Messung bei hohen Konzentrationen oberhalb der Sättigung ist dabei allerdings nicht mehr möglich. Geringe Konzentrationen können dagegen aufgrund der niedrigen Sensitivität bzw. aufgrund des unspezifischen Hintergrundsignals ebenfalls nicht detektiert werden.The area in which the biomarker is detectable and quantifiable is called the dynamic range. As the biomarker concentration increases, the binding saturates. However, the measurement at high concentrations above saturation is no longer possible. By contrast, low concentrations can not be detected due to the low sensitivity or because of the unspecific background signal.
Für die Quantifizierung eines Analyten bzw. Biomarkers ist es daher wichtig, einen möglichst großen dynamischen Bereich abzudecken. Dies ist insbesondere dann von großer Bedeutung, wenn nur eine geringe Menge an Ausgangsmaterial bzw. Probe zur Verfügung steht.For the quantification of an analyte or biomarker, it is therefore important to cover the largest possible dynamic range. This is especially true of of great importance if only a small amount of starting material or sample is available.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, in den entsprechenden Assays Bedingungen zu schaffen, die für den gebundenen Analyt die Ausbildung eines maximalen Signals ermöglichen - und zwar über einen möglichst großen dynamischen Bereich hinweg - und, die auf der anderen Seite gleichzeitig nur ein minimales Hintergrundsignal entstehen lassen.It is therefore an object of the present invention to provide conditions in the corresponding assays which allow the bound analyte to form a maximum signal - over a dynamic range that is as large as possible - and at the same time only a minimal one Background signal.
In ihrer Gesamtheit betrachtet stellt sich die vorliegende Erfindung somit die Aufgabe, ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund- Verhältnis (Signal-to-Background, S/B) zu ermöglichen.Considered as a whole, the present invention thus has the object to enable an improved signal-to-background ratio (S / B).
Aus dem Stand der Technik ist zwar die Reduktion von unspezifischer Hintergrundbindung durch die Verwendung von sog. Blocking Reagenzien („blocking agent") wie z.B. BSA (bovine serum albumin), Gelatine, Casein und/oder in Kombination mit verschiedenen Detergentien (NP-40, Tween20, Triton X-100) bekannt. - Auf der anderen Seite ist dem Stand der Technik auch zu entnehmen, dass eine Signal- Erhöhung bei Immunoassays im Wesentlichen nur durch Enzym-vermittelte Signal- Amplifikationsmethoden erreicht werden kann. Derartige Lösungsvorschläge beinhalten z.B. klassische ELISA Anwendungen, ECL-basierte Ansätze (Electro- ChemiLuminescence), RCAT (Rolling Circle Amplification Technology) und weitere Methoden, die auch bei Protein- Arrays angewendet werden können.Although the reduction of nonspecific background binding by the use of so-called "blocking agents" such as BSA (bovine serum albumin), gelatin, casein and / or in combination with various detergents (NP-40 Tween20, Triton X-100) On the other hand, it can also be seen from the prior art that a signal increase in immunoassays can essentially only be achieved by enzyme-mediated signal amplification methods ELISA applications, ECL-based approaches (ElectrochemiLuminescence), RCAT (Rolling Circle Amplification Technology) and other methods that can also be applied to protein arrays.
Mit einer Signal-Amplifikation kann also die Assay-Sensitivität verbessert werden, was in einem größeren dynamischen Bereich und einem verbesserten Signal-zu-Hintergrund Verhältnis (S/B) resultiert.With signal amplification, the assay sensitivity can thus be improved, resulting in a larger dynamic range and an improved signal-to-background ratio (S / B).
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch die Erreichung höherer Sensitivitäten auch Assays mit reduzierten Probenmengen durchgeführt werden können, vor allem dann, wenn nur eine geringe Ausgangsmenge an Probenmaterial zur Verfügung steht. Mit Blick auf die Lösung der oben geschilderten Problematik, ist dem Stand der Technik bereits zu entnehmen, dass zur Vermeidung der unspezifischen Bindung von Antikörpern oder Antigenen an die Matrix-Oberfläche oder an den Capture-Antikörper in Western Blot- oder ELIS A- Applikationen proteinogene Substanzen - wie z.B. BSA, Casein oder Gelatine - oder nicht-proteinogene Substanzen - insbesondere Detergenzien - eingesetzt werden können. Diese Substanzen kommen in den entsprechenden Reaktionspuffern zur Anwendung.A further advantage is that by achieving higher sensitivities, it is also possible to carry out assays with reduced sample quantities, especially if only a small initial amount of sample material is available. With a view to solving the problem described above, it can already be gathered from the prior art that in order to avoid the non-specific binding of antibodies or antigens to the matrix surface or to the capture antibody in Western blot or ELIS A applications, proteinogenic Substances - such as BSA, casein or gelatin - or non-proteinogenic substances - especially detergents - can be used. These substances are used in the corresponding reaction buffers.
Daneben ist aber aus dem Stand der Technik auch bekannt, dass die Detektions- Antikörper unspezifisch an die Capture-Antikörper zu binden vermögen.In addition, however, it is also known from the prior art that the detection antibodies are able to bind nonspecifically to the capture antibodies.
Bei den im Stand der Technik verwandten Puffern handelt es sich in der Regel um Standardpuffer wie PBS- oder Tris-Puffer (pH 7 - 7.8). Detergenzien, die in den entsprechenden Puffern Verwendung finden, um die unspezifischen Bindungen, die durch Protein-Protein- oder Protein-Matrix-Interaktionen entstehen, zu reduzieren, weisen allerdings den gravierenden Nachteil auf, dass diese in zu hoher Konzentration die spezifischen Antigen- Antikörper- Interaktionen auflösen oder sogar denaturierend auf Antigen und Antikörper wirken können und somit letztendlich eine inaktivierende Wirkung haben.The buffers used in the prior art are usually standard buffers such as PBS or Tris buffer (pH 7 - 7.8). However, detergents used in the corresponding buffers to reduce the non-specific binding that results from protein-protein or protein-matrix interactions have the serious disadvantage that they are too high in the specific antigen antibodies - Dissolve interactions or even denaturing effect on antigen and antibodies and thus ultimately have an inactivating effect.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht angesichts des oben beschriebenen Standes der Technik nunmehr darin, die geschilderten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und eine Optimierung von Immunoassays - LiquiChip-Immunoassays - in Bezug auf die Erhöhung der Signalintensität - bei nicht enzymatisch vermittelter Signal-Amplifikation - und bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Hintergrundbindung zu ermöglichen.The object underlying the present invention, in view of the prior art described above, is now to overcome the described disadvantages of the prior art and not to optimize immunoassays - LiquiChip immunoassays - with respect to the increase of the signal intensity enzymatically mediated signal amplification - and to allow simultaneous reduction of non-specific background binding.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen auf sog. planaren Protein- Arrays zu ermöglichen, bei denen der Nachweis von gebundenen Analyten auf einem im wesentlichen planaren Array erfolgt.Another object of the present invention is to increase the signal intensity while reducing unspecific binding to so-called planar To enable protein arrays in which the detection of bound analytes on a substantially planar array.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Assaybedingungen in einem Nachweisverfahren zu schaffen, die es daneben auch ermöglichen, mit geringen Probenmengen ein möglichst hohes spezifisches Signal zu generieren.A further object of the present invention is to provide assay conditions in a detection method which also make it possible to generate the highest possible specific signal with small sample quantities.
Gelöst werden diese Aufgaben durch den Einsatz von unter den Assay-/Verfahrensbedingungen löslichen Polyvinylderivaten. Als Polyvinyldervivate im Sinne der Erindung werden alle Abkömmlinge eines Polymeren oder Oligomeren, die durch Polymerisation eines Monomeren mit einer Vinylstruktur erhalten wurde, worunter insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) fallen. Daneben werden erfindungsgemäß aber unter Polyvinylderivaten Oligomere bzw. Polymere mit Ester-Partialstrukturen verstanden wie z.B. Polyvinylacetat, ggf. teilweise verseift sowie Copolymere, wie z.B. Ethylen-Vinylacetat-Copolymere, (l-Vinyl-2-pyrrolidon)- Vinylacetat-Copolymere, Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymere verstanden.These objects are achieved by the use of soluble under the assay / process conditions polyvinyl derivatives. Polyvinyl derivatives in the sense of the invention are all derivatives of a polymer or oligomer obtained by polymerizing a monomer having a vinyl structure, in particular polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone (PVP). In addition, according to the invention, however, polyvinyl derivatives are understood as meaning oligomers or polymers with ester partial structures, such as, for example, Polyvinyl acetate, optionally partially saponified and copolymers, such. Ethylene-vinyl acetate copolymers, (l-vinyl-2-pyrrolidone) - understood vinyl acetate copolymers, vinyl acetate-vinyl laurate copolymers.
Überraschenderweise wurde gefunden dass die Gegenwart der erwähnten Polyvinylderivate - insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) - in den Reaktionspuffern die Bildung spezifischer Antikörper-Antigen Interaktionen unterstützen - was in einem höheren Signal resultiert - und die offensichtlich dafür verantwortlich sind, unspezifische Interaktionen zu reduzieren.Surprisingly, it has been found that the presence of the mentioned polyvinyl derivatives - especially polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone (PVP) - in the reaction buffers promote the formation of specific antibody-antigen interactions - resulting in a higher signal - and which are apparently responsible for nonspecific interactions to reduce.
Erfindungsgemäß resultiert hieraus ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis über einen größeren dynamischen Bereich.In accordance with the invention, this results in an improved signal-to-background ratio over a larger dynamic range.
Durch die Verwendung löslicher Polyvinylderivate können somit die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden. Lösliche Polyvinylderivate können daneben in einem - im Vergleich zu Detergenzien - größeren Konzentrationsbereich eingesetzt werden und bewirken eine Erhöhung der Signalintensität und Sensitivität und tragen gleichzeitig noch zur Reduktion unspezifischer Bindungen bei. - Hieraus resultiert ein verbessertes Signal- zu-Hintergrund Verhältnis über einen größeren dynamischen Bereich hinweg.By using soluble polyvinyl derivatives, the disadvantages of the prior art can thus be overcome. In addition, soluble polyvinyl derivatives can be used in a larger concentration range than detergents and cause an increase in signal intensity and sensitivity and at the same time contribute to the reduction of non-specific bonds. - This results in a improved signal-to-background ratio over a wider dynamic range.
Grundsätzlich steigert die erfindungsgemäße Verwendung von löslichen Polyvinylderivaten wie z.B. Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) in den Reaktionspuffern bei allen Immunoassays bzw. ELISAs, die auf hydrophoben Oberflächen durchgeführt werden, die Signalintensitäten bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen.Basically, the use according to the invention of soluble polyvinyl derivatives, e.g. Polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone (PVP) in the reaction buffers in all immunoassays or ELISAs, which are performed on hydrophobic surfaces, the signal intensities with simultaneous reduction of non-specific bonds.
Des Weiteren wurde überraschenderweise gefunden, dass durch den Einsatz von Polyvinylderivaten auch die Resultate von Nachweisreaktionen verbessert werden können, die in einem höheren Reaktionsgrad (Multiplex-Assay) durchgeführt werden. Erfindungsgemäß wird durch den Einsatz der Polyvinylderivate die Möglichkeit eröffnet, dass durch die Steigerung der Sensitivität auch solche Parameter parallel in dem Setup analysiert werden können, deren Signalintensitäten sich unter den bisherigen Bedingungen als zu niedrig erwiesen.Furthermore, it has surprisingly been found that the use of polyvinyl derivatives can also improve the results of detection reactions which are carried out in a higher degree of reaction (multiplex assay). According to the invention, the use of the polyvinyl derivatives opens up the possibility that, by increasing the sensitivity, it is also possible to analyze those parameters in parallel in the setup whose signal intensities prove to be too low under the previous conditions.
Von besonderem Interesse ist dies, wenn in einem Assay-Setup neben hochexprimierten Analyten gleichzeitig niedrigexprimierte Analyten beobachtet werden sollen. Der erfindungsgemäße Einsatz der erwähnten Polivinylderivate verkörpert somit einen weiteren Vorteil gegenüber auf ELISA oder Western-Blot basierenden Verfahren, bei denen in der Regel lediglich ein Analyt betrachtet wird.This is of particular interest if, in addition to highly expressed analytes, low-expressed analytes are to be observed simultaneously in an assay setup. The use according to the invention of the mentioned polyvinyl derivatives thus represents a further advantage over methods based on ELISA or Western blot, in which generally only one analyte is considered.
Die Verwendung dieser Substanzen führt daneben nicht nur bei Immunoassays bzw. ELISAs zu einer überraschenden Verbesserung der Assayresultate, sondern ermöglicht auch einen verbesserten Nachweis solubilisierter Membranproteine. Daneben verbessern Puffer, welche die erwähnten Polyvinylderivate aufweisen, in der oben erwähnten Weise Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktions-Assays sowie DNA-Applikationen in LiquiChip-Assays auf Polystyrol-Oberflächen. Des Weiteren wurde überraschenderweise gefunden, dass die Polyvinylderivate, insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) bzw. Polyvinylpyrrolidon PVP dazu beitragen, die unerwünschte Aggregation der Beads zu verhindern.In addition, the use of these substances not only leads to a surprising improvement in the assay results in immunoassays or ELISAs, but also enables improved detection of solubilized membrane proteins. In addition, buffers comprising the mentioned polyvinyl derivatives improve protein-protein and protein-DNA interaction assays as well as DNA applications in LiquiChip assays on polystyrene surfaces as mentioned above. Furthermore, it has surprisingly been found that the polyvinyl derivatives, especially polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone PVP contribute to prevent the unwanted aggregation of the beads.
Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Erhöhung der Signalintensität - ebenfalls bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen beim Nachweis von gebundenen Analyten mittels sogenannter planarer Protein- Arrays. Bei diesen Protein- Arrays befinden sich dieIn addition, the present invention allows an increase in the signal intensity - also with simultaneous reduction of non-specific binding in the detection of bound analytes by means of so-called planar protein arrays. These protein arrays contain the
Fängermoleküle auf einer Trägersubstanz, wie z.B. Glas oder Glasslides, Nitrocellulose, PVDF oder Polystyroloberflächen und verkörpert beispielsweise einen Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein Peptid oder ein Anticalin.Catcher molecules on a carrier, e.g. Glass or glass slides, nitrocellulose, PVDF or polystyrene surfaces, and embodies, for example, an antibody, a fragment of an antibody, an aptamer, a peptide or an anticalin.
Als besonders vorteilhaft hat sich freilich die Verwendung der oben genannten Polyvinylderivate in den sog. Liquichip-Immunoassays herausgestellt. Das Prinzip einesOf course, the use of the abovementioned polyvinyl derivatives in the so-called Liquichip immunoassays has proven to be particularly advantageous. The principle of a
LiquiChip-Immunoassays ist die Verwendung eines (ELISA-) Antikörper-Sandwich- pairs auf LiquiChip Beads. Dazu wird ein Antikörper des Sandwich-pairs kovalent alsLiquiChip immunoassays involves the use of an (ELISA) antibody sandwich on LiquiChip beads. For this purpose, an antibody of the sandwich pairs is covalent as
Fänger-Molekül (Capture-Antikörper) auf die Oberfläche der Polystyrol-Beads immobilisiert. Diese Beads werden mit einer Probe (z.B. Serum, Lysat von Zellkulturen oder Gewebe, Zellkulturüberstand) inkubiert, die das entsprechende Antigen enthält.Capture molecule (capture antibody) immobilized on the surface of polystyrene beads. These beads are incubated with a sample (e.g., serum, cell culture or tissue lysate, cell culture supernatant) containing the appropriate antigen.
Nach der Inkubation können die Beads optional gewaschen werden. Das spezifischeAfter incubation, the beads can optionally be washed. The specific one
Antigen sollte über den Fänger- Antikörper gebunden an den Beads verbleiben.Antigen should remain bound to the beads via the capture antibody.
In einem weiteren Schritt kann das spezifisch gebundene Antigen z.B. mit einem zweiten Antigen-spezifischen Antikörper markiert und anschließend detektiert werden. Dies kann z.B. mit einem Fluorophor-gelabelten- Antikörper erfolgen, der gegen diesen zweiten Antikörper gerichtet ist. Bei jedem dieser Schritte kann es zu unspezifischen Bindungen von anderen Assay-Komponenten (z.B. andere Proteine aus der Probe) an die Bead- Oberfläche oder an die Fänger- Antikörper kommen. Zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen wird die Inkubation der Capture-Antikörper-Beads mit der Probe (Antigen) in einem Puffer durchgeführt der ein lösliches Polyvinylderivat enthält.In a further step, the specifically bound antigen can be labeled, for example, with a second antigen-specific antibody and subsequently detected. This can be done, for example, with a fluorophore-labeled antibody directed against this second antibody. In each of these steps, non-specific binding of other assay components (eg, other proteins from the sample) to the bead surface or to the capture antibodies may occur. To increase the signal intensity while reducing non-specific binding, the incubation of the capture antibody beads with the sample (antigen) is carried out in a buffer containing a soluble polyvinyl derivative.
Als Polyvinylderivate kommen bei der Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe alle Polyvinylderivate in Frage, die unter den vorgegebenen Reaktionsbedingungen löslich bzw. wasserlöslich sind. Bevorzugte Polyvinylderivate sind, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol in Form ihrer reinen Polymerisate, als Copolymerisate miteinander und/oder mit anderen geeigneten Comonomeren sowie als Mischungen.Suitable polyvinyl derivatives in the solution of the object according to the invention are all polyvinyl derivatives which are soluble or water-soluble under the given reaction conditions. Preferred polyvinyl derivatives are such as e.g. Polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol in the form of their pure polymers, as copolymers with each other and / or with other suitable comonomers and as mixtures.
Polymere sowie Copolymere des Vinylalkohols bzw. dessen Ester sowie des Vinylpyrrolidons sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik wohlbekannt, da sie in zahlreichen Anwendungsgebieten des täglichen Lebens - so z.B. als Verdickungsmittel in der Nahrungsmittelindustrie sowie als Hilfsstoffe in der Galenik und in der Textilindustrie - um nur einige Einsatzgebiete zu nennen - seit Jahrzehnten Verwendung finden. Mit Blick auf den Einsatz geeigneter Copolymerisate ist die Verwendung jedes Copolymerisats des Vinylalkohols bzw. Vinylacetats sowie des Vinylpyrrolidons wie auch Copolymerisate beider - Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylacetat] bzw. Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylalkohol] neben den bereits oben erwähnten Copolymerisaten - möglich, sofern sie ein geeignetes Löslichkeitsverhalten in einem - im wesentlichen - wässrigen Milieu aufweisen.Polymers as well as copolymers of the vinyl alcohol or its esters as well as the vinylpyrrolidone are well-known to the person skilled in the art, since they are used in numerous fields of daily use - e.g. as thickening agents in the food industry as well as additives in the galenics and in the textile industry - to name but a few applications - have been used for decades. With a view to the use of suitable copolymers is the use of any copolymer of vinyl alcohol or vinyl acetate and vinylpyrrolidone as well as copolymers of both - poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl acetate] or poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl alcohol] in addition to the above-mentioned copolymers, possible, provided that they have a suitable solubility behavior in an essentially aqueous environment.
Die jeweiligen Molekulargewichte sind für die erfolgreiche Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens in weiten Grenzen variierbar. Sie liegen praktischerweise in einem Bereich von 5.000 bis 500.000 Da, bevorzugt in einem Intervall von 24.000 bisThe respective molecular weights can be varied within wide limits for the successful realization of the method according to the invention. Conveniently, they are in a range of 5,000 to 500,000 Da, preferably in an interval of 24,000 to
360.000 Da und besonders bevorzugt von 31.000 bis 186.000 Da. Diese Bereiche gelten sowohl für die einzelnen Polymere wie auch für Mischungen aus zwei, drei oder mehr360,000 Da and more preferably from 31,000 to 186,000 Da. These ranges apply both to the individual polymers as well as to mixtures of two, three or more
Polymeren, wobei Mischungen aus Polyvinylakohol und Polyvinylpyrrolidon bevorzugt werden. Für die Verwendung von Polyvinylalkohol alleine oder in Mischungen mit Polyvinylpyrrolidon eignet sich praktischerweise ein Molekulargewichtsbereich von 9.000 bis 500.000 Da, bevorzugt 31.000 bis 186.000 Da und besonders bevorzugt zwischen 86.000 und 126.000 Da sowie zwischen 146.000 und 186.000 Da.Polymers, with mixtures of polyvinyl alcohol and polyvinylpyrrolidone being preferred. For the use of polyvinyl alcohol alone or in mixtures with polyvinylpyrrolidone is conveniently a molecular weight range of 9,000 to 500,000 Da, preferably 31,000 to 186,000 Da and more preferably between 86,000 and 126,000 Da and between 146,000 and 186,000 Da.
Für die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon alleine oder in Kombination mit Polyvinylalkohol eignet sich praktischerweise ein Molekulargewichtsbereich von 5.000 bis 500.000 Da, bevorzugt 10.000 bis 450.000 Da und besonders bevorzugt 24.000 bis 360.000 Da.For the use of polyvinylpyrrolidone alone or in combination with polyvinyl alcohol, a molecular weight range of 5,000 to 500,000 Da, preferably 10,000 to 450,000 Da, and more preferably 24,000 to 360,000 Da is practically suitable.
Die Konzentration - einzeln oder in Kombination - der Polyvinylderivate liegt beispielsweise in den LiquiChip-Imunoassays in einem Intervall von 0.025 bis 5 % (w/v), bevorzugt in einem Intervall von 0.025 bis 2 % (w/v) und besonders bevorzugt in einem Intervall von 0.1 bis 1 % (w/v).The concentration - individually or in combination - of the polyvinyl derivatives is for example in the LiquiChip-Imunoassays in an interval of 0.025 to 5% (w / v), preferably in an interval of 0.025 to 2% (w / v), and more preferably in one Interval from 0.1 to 1% (w / v).
Die Beads werden mit dem das Polyvinylderivat enthaltenden Puffer vorinkubiert, wonach die Zugabe der Probe und eine weitere Inkubation erfolgen. Die löslichen Polyvinylderivate - wie z.B. vorzugsweise Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon - können aber auch bei den folgenden Schritten in den jeweiligen Puffern enthalten sein, so z.B. bei der Zugabe und Inkubation des zweiten Antigen-spezifischen- Antikörpers.The beads are preincubated with the buffer containing the polyvinyl derivative, followed by the addition of the sample and a further incubation. The soluble polyvinyl derivatives - e.g. preferably polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone - but may also be included in the following steps in the respective buffers, e.g. upon addition and incubation of the second antigen-specific antibody.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen, das sich dadurch auszeichnet dass der Nachweis von gebundenen Analyten auf Beads oder auf planaren Protein-Arrays in Gegenwart eine Polyvinylderivats erfolgt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren bei dem die Fängermoleküle auf Glas (Glasslides), Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder auf Polystyroloberflächen aufgebracht sind und die die Nachweisreaktion in Gegenwart eine Polyvinylderivats erfolgt.The present invention further relates to a method for increasing the signal intensity while reducing unspecific binding, which is characterized in that the detection of bound analytes on beads or on planar protein arrays in the presence of a polyvinyl derivative. In particular, the present invention relates to a method in which the capture molecules are applied to glass (glasslides), nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or on polystyrene surfaces and the detection reaction is carried out in the presence of a polyvinyl derivative.
Dabei kann das Fängermolekül beispielsweise einen Antikörper, das Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein Peptid oder ein Anticalin darstellen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung eines Immunoassays enthaltend zumindest einen Puffer mit einem Polyvinylderivat als Komponente. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung daneben auch ein Kit bei dem die Fängermoleküle an die Beads oder an planare Arrays gebunden sind. - Dabei können die Beads oder planaren Arrays ein Trägermaterial aus Glas, Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder Polystyrol aufweisen.The capture molecule may be, for example, an antibody, the fragment of an antibody, an aptamer, a peptide or an anticalin. In a further embodiment, the present invention relates to a kit for carrying out an immunoassay containing at least one buffer with a polyvinyl derivative as component. In particular, the present invention also relates to a kit in which the capture molecules are bound to the beads or to planar arrays. - The beads or planar arrays may have a carrier material made of glass, nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or polystyrene.
Der positive Effekt der erfindungsgemäßen Verwendung der Polyvinylderivate lässt sich experimentell eindrucksvoll belegen. - So konnte z.B. in einem Monoplex-Immuno- Sandwichassay zum Nachweis von ß-Catenin (vgl. Protokoll in Beispiel 1) eine deutliche Signalerhöhung bei gleichzeitiger Reduktion der unspezifischen Hintergrundbindung erreicht werden. In der graphischen Darstellung (Fig. 1) ist eindeutig zu erkennen, dass sich die Signale unter Verwendung der Polyvinylderivate besonders im unteren Bereich der Kurve deutlich vom Hintergrund absetzen. Als weiteres Merkmal ist zu beobachten, dass unter Verwendung der Polyvinylderivate bereits bei niedrigeren Proteinkonzentrationen Signalwerte erhalten werden, die in der Kurve ohne Polyvinylderivate erst bei wesentlich höheren Proteinkonzentrationen erreicht werden. So erhält man in der Probe, die mit Polyvinylakohol versetzt wurde, bei einer Konzentration von ca. 3000 pg Protein einen Wert von ca. 2000 MFI (Median-Fluorescence-Intensity), wohingegen dieser Wert in der Probe ohne Polyvinylalkohol erst bei einer Konzentration von ca. 6000 pg Protein erreicht werden kann. Daneben ist ersichtlich, dass sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für alle Messwerte ein besseres Signal-zu-Hintergrund- Verhältnis (S/B) erreichen lässt.The positive effect of the use according to the invention of the polyvinyl derivatives can be demonstrated experimentally impressively. - For example, In a monoplex immuno-sandwich assay for the detection of β-catenin (see protocol in Example 1), a significant increase in signal can be achieved with simultaneous reduction of the unspecific background binding. It can clearly be seen in the graph (FIG. 1) that the signals using the polyvinyl derivatives, especially in the lower region of the curve, clearly stand out from the background. As a further feature, it can be observed that signal values are obtained even at lower protein concentrations using the polyvinyl derivatives, which are achieved in the curve without polyvinyl derivatives only at significantly higher protein concentrations. Thus, in the sample, which was mixed with polyvinyl alcohol, at a concentration of about 3000 pg protein, a value of about 2000 MFI (median fluorescence intensity), whereas this value in the sample without polyvinyl alcohol only at a concentration of about 6000 pg protein can be achieved. In addition, it can be seen that with the method according to the invention a better signal-to-background ratio (S / B) can be achieved for all measured values.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern und die oben geschilderten Befunde untermauern. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen werden aus den Beispielen ersichtlich. BeispieleThe following examples are intended to illustrate the invention and to substantiate the findings described above. Further advantageous embodiments will be apparent from the examples. Examples
In den Beispielen werden folgende Pufferlösungen eingesetzt:The following buffer solutions are used in the examples:
Puffer- Lösungen:Buffer solutions:
Assay-Puffer I (mit PVA oder PVP):Assay buffer I (with PVA or PVP):
10 mM NaH2PO4 H2O 1.4 g NaH2PO4 H2O (MW 137.99 g/mol), mit Natronlauge auf einen H- Wert von 7,4 eingestellt10 mM NaH 2 PO 4 H 2 O 1.4 g NaH 2 PO 4 H 2 O (MW 137.99 g / mol), adjusted to an H value of 7.4 with sodium hydroxide solution
150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g/mol)150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g / mol)
0.1% (w/v) BSA I g BSA0.1% (w / v) BSA I g BSA
0.02% (v/v) Tween® 20 200 μl Tween 200.02% (v / v) Tween® 20 200 μl Tween 20
2% (w/v) PVA 20 g Polyvinylalkohol (MW 86000-126000, 98-99% hdrolysiert) oder2% (w / v) PVA 20 g Polyvinyl alcohol (MW 86000-126000, 98-99% hydrolysed) or
2% (w/v) PVP 20 g Polyvinylpyrrolidon (MW 40000)2% (w / v) PVP 20 g polyvinylpyrrolidone (MW 40000)
Assay-Puffer II (enthält kein PVA bzw. PVP):Assay buffer II (contains no PVA or PVP):
10 mM NaH2PO4 1.4 g NaH2PO4-H2O (MW 137.99 g/mol), mit10 mM NaH 2 PO 4 1.4 g NaH 2 PO 4 -H 2 O (MW 137.99 g / mol), with
Natronlauge auf einen pH- Wert von 7,4 eingestellt 150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g/mol)Caustic soda adjusted to a pH of 7.4 150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g / mol)
0.1% (w/v) BSA I g BSA0.1% (w / v) BSA I g BSA
0.02% (v/v) Tween® 20 200 μl Tween 200.02% (v / v) Tween® 20 200 μl Tween 20
Natriumchlorid, NaH2PO4-H2O und das Polyvinylderivat wurden in 900 ml destilliertem Wasser autoklaviert und dabei aufgelöst. Danach wird der pH- Wert mit Natronlauge (NaOH) auf 7.4 eingestellt. Danach werden BSA und Tween 20 zugefügt und das Gesamtvolumen auf 1 Liter aufgefüllt. Vor der Verwendung wird die Lösung durch ein 0.45 μm Filter filtriert.Sodium chloride, NaH 2 PO 4 -H 2 O and the polyvinyl derivative were autoclaved in 900 ml of distilled water and dissolved. Thereafter, the pH is adjusted to 7.4 with sodium hydroxide solution (NaOH). Then BSA and Tween 20 are added and the Total volume filled up to 1 liter. Before use, the solution is filtered through a 0.45 μm filter.
Beispiel 1:Example 1:
Die Experimente wurden nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: In einer 96-Well Platte wurden pro Well wurden folgende Lösungen in eine Filterplatte pipettiert. Die Filterplatte wird mit 50 μl Assay-Puffer I äquilibriert und Puffer danach abgesaugt.The experiments were carried out according to the following protocol: In a 96-well plate, the following solutions were pipetted per well into a filter plate. The filter plate is equilibrated with 50 μl of assay buffer I and buffer is then removed by suction.
Danach wurden 30 μl Assay-Puffer I zugefügt und mit 10 μl Bead- Lösung (1250 Beads Assay-Puffer II) versetzt. Danach erfolgt die Zugabe der Probe in 10 μl Probe Assay- Puffer IL Die Multiwell-Platte wird daraufhin verschlossen und unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur (ca. 18 - 25 0C) über einen Zeitraum von 2h auf einem Schüttler (MTPShaker) bei 450 Umdrehungen/min inkubiert (optional kann die Inkubation bei 40C o/n erfolgen). Danach wird der Puffer in der Filterplatte abgesaugt und die Beads werden mit 150 μl Assay-Puffer II gewaschen. Daraufhin wird erneut abgesaugt und die Beads werden in 100 μl Assay-Puffer II resuspendiert. Darauf erfolgt die Zugabe von 15-20 ng (bis 200 ng) des zweiten Antigen-spezifischen Antikörpers in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II und es wird über einen Zeitraum von 90 min bei Raumtemperatur auf Schüttler bei 450 Umdrehungen/min inkubiert. Nach der Zugabe von 200 ng Fluorophor- gelabelten-Detektions-Antikörper (optional 100 ng Streptavidin-R-Phycoerythrin [SAPE] bei Verwendung eines biotinylierten Antikörpers) jeweils in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II wird erneut bei Raumtemperatur über ein Zeitintervall von 30 min auf einem MTP-Shaker bei 450 Umdrehungen/min inkubiert und anschließend im Reader analysiert.Thereafter, 30 .mu.l of assay buffer I were added and mixed with 10 .mu.l of bead solution (1250 beads assay buffer II). Thereafter, the addition of the sample in 10 .mu.l of sample is assay buffer IL The multiwell plate is then closed and with exclusion of light at room temperature (about 18 - 25 0 C) over a period of 2h on a shaker (MTPShaker) at 450 revolutions / min incubated (optionally, the incubation at 4 0 C o / n done). Thereafter, the buffer is aspirated in the filter plate and the beads are washed with 150 ul of assay buffer II. Then it is again aspirated and the beads are resuspended in 100 ul assay buffer II. This is followed by the addition of 15-20 ng (to 200 ng) of the second antigen-specific antibody in a volume of 10 μl of assay buffer II and incubated for 90 minutes at room temperature on shakers at 450 revolutions / min. Following the addition of 200 ng of fluorophore labeled detection antibody (optionally 100 ng of streptavidin-R-phycoerythrin [SAPE] using a biotinylated antibody), each in a volume of 10 μl of Assay Buffer II, reconstitute at room temperature for a period of time Incubated for 30 min on a MTP shaker at 450 revolutions / min and then analyzed in the reader.
Der Einfluss, den die Polyvinylderivate auf einen Multiplex-Immunoassay haben ist in Fig. 2 abgebildet. Gezeigt wird das Ergebnis eines Cytokin-Multiplex Immuno-The influence that the polyvinyl derivatives have on a multiplex immunoassay is shown in FIG. Shown is the result of a cytokine-multiplex immune system
Sandwichassays zum Nachweis der Interleukine IL- 12, IL-10, IL 8 und IL-6, bei dem 1% (w/v) PVA (MW 86000-126000) bzw. 1% (w/v) PVP (MW 40000) im Puffer während der Capture-Antikörper/Antigen-Reaktion verwendet wurde [in dem dreidimensionalen Schaubild von Fig. 2 sind die Wertebalken für IL 12, ILIO, IL 8 und IL 6 in der Betrachtungsrichtung von vorne nach hinten angeordnet!]. Auch bei diesem Experiment konnte gezeigt werden, das neben PVA auch PVP einen positiven Effekt auf die Hintergrundreduktion bzw. auf die Erhöhung der Signalintensität der einzelnen Interleukine hat. Bei diesem Experiment waren die polymeren Substanzen ebenfalls im ersten Schritt bei der Bindung der Antigene an die Capture-Antikörper-Beads im Inkubationspuffer enthalten.Sandwich assays for the detection of interleukins IL-12, IL-10, IL 8 and IL-6, in which 1% (w / v) PVA (MW 86000-126000) or 1% (w / v) PVP (MW 40000) was used in the buffer during the capture antibody / antigen reaction [in the three-dimensional graph of FIG Value bars for IL 12, ILIO, IL 8 and IL 6 are arranged in the viewing direction from front to back!]. Also in this experiment it could be shown that in addition to PVA also PVP has a positive effect on the background reduction or on the increase of the signal intensity of the individual interleukins. In this experiment, the polymeric substances were also included in the first step in the binding of the antigens to the capture antibody beads in the incubation buffer.
Beispiel 2:Example 2:
Die Experimente wurden nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: In einer 96-Well Platte wurden pro Well wurden folgende Lösungen in eine Filterplatte pipettiert: Die Filterplatte wurde zunächst mit 50 μl Assay-Puffer I äquilibriert und Puffer danach abgesaugt.The experiments were carried out according to the following protocol: In a 96-well plate, the following solutions were pipetted per well into a filter plate: The filter plate was first equilibrated with 50 μl of assay buffer I and buffer was then suctioned off.
Danach wurden 50 μl Assay-Puffer I vorgelegt und mit 25 μl Probe gelöst in Assay- Puffer II versetzt. Daraufhin erfolgt die Zugabe von 25 μl Assay-Puffer II enthaltend jeThereafter, 50 .mu.l of assay buffer I were initially charged and mixed with 25 .mu.l of sample dissolved in assay buffer II. This is followed by the addition of 25 .mu.l of assay buffer II containing each
2500 Beads pro Cytokin (Assay-buffer II). Die Multiwell-Platte wird daraufhin verschlossen und unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur (ca. 18 - 25 0C) über einen2500 beads per cytokine (assay buffer II). The multiwell plate is then closed and with exclusion of light at room temperature (about 18 - 25 0 C) on a
Zeitraum von 2h auf einem Schüttler (MTPShaker) bei 450 Umdrehungen/min inkubiertPeriod of 2 h on a shaker (MTPShaker) at 450 revolutions / min incubated
(optional kann die Inkubation bei 40C o/n erfolgen). Danach wird der Puffer in der Filterplatte abgesaugt und die Beads werden mit 100 μl Assay-Puffer II gewaschen.(Optionally, the incubation at 4 0 C o / n take place). Thereafter, the buffer is sucked off in the filter plate and the beads are washed with 100 μl of assay buffer II.
Daraufhin wird erneut abgesaugt und die Beads werden in 100 μl Assay-Puffer II resuspendiert. Darauf erfolgt die Zugabe von 15-20 ng (bis 200 ng) des zweiten Antigen- spezifischen Antikörpers (biotinyliert) in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II und es wird über einen Zeitraum von 90 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 450 Umdrehungen/min inkubiert. Danach erfolgt die Zugabe 100 ng Streptavidin-R-Then it is again aspirated and the beads are resuspended in 100 ul assay buffer II. This is followed by the addition of 15-20 ng (to 200 ng) of the second antigen-specific antibody (biotinylated) in a volume of 10 μl of assay buffer II and it is incubated over a period of 90 min at room temperature on a shaker at 450 rpm / min incubated. Thereafter, the addition of 100 ng streptavidin-R
Phycoerythrin [SAPE] in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer IL Es wird erneut bei Raumtemperatur über ein Zeitintervall von 30 min auf einem MTP-Shaker bei 450 Umdrehungen/min inkubiert und anschließend im Reader analysiert.Phycoerythrin [SAPE] in a volume of 10 μl assay buffer IL It is added again Room temperature over a period of 30 min on a MTP shaker at 450 revolutions / min incubated and then analyzed in the reader.
Das Ergebnis zeigt (Fig. 2), dass die Signale für die einzelnen Analyten signifikant gesteigert werden konnten. Somit konnten einheitliche Bedingungen geschaffen werden, die es ermöglichen mehrere Analyten in einem Multiplex- Ans atz messen zu können. The result shows (Figure 2) that the signals for the individual analytes could be significantly increased. Thus, uniform conditions could be created, which make it possible to measure several analytes in a multiplex approach.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verwendung von Polyvinylderivaten zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen.1. Use of polyvinyl derivatives to increase the signal intensity while reducing unspecific binding.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyvinylderivate Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol in Form ihrer reinen Polymerisate, als Copolymerisate miteinander und/oder mit anderen geeigneten Comonomeren sowie als Mischungen eingesetzt werden.2. Use according to claim 1, characterized in that are used as polyvinyl derivatives polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol in the form of their pure polymers, as copolymers with each other and / or with other suitable comonomers and as mixtures.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Copolymerisat ein Copolymerisat des Vinylacetats oder und/oder des Vinylpyrrolidons, Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylacetat] und/oder Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylalkohol] eingesetzt werden.3. Use according to claim 1 or 2, characterized in that a copolymer of vinyl acetate or and / or vinylpyrrolidone, poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl acetate] and / or poly [vinylpyrrolidone-co-vinyl alcohol] are used as the copolymer.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von 5.000 bis 500.000 Da liegt.4. Use according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the molecular weight of the polymer or copolymer is in an interval of 5,000 to 500,000 Da.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von 24.000 bis 360.000 Da liegt.5. Use according to claim 4, characterized in that the molecular weight of the polymer or copolymer is in an interval of 24,000 to 360,000 Da.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von6. Use according to claim 5, characterized in that the molecular weight of the polymer or copolymer at an interval of
31.000 bis 186.000 Da liegt.31,000 to 186,000 Da lies.
7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargwicht des Polyvinylalkohols alleine oder in Mischungen mit7. Use according to claim 1 to 3, characterized in that the Molekulargwicht the polyvinyl alcohol alone or in mixtures with
Polyvinylpyrrolidon in einem Intervall von 9.000 bis 500.000 Da liegt. Polyvinylpyrrolidone in an interval of 9,000 to 500,000 Da lies.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 31.000 bis 186.000 Da liegt.8. Use according to claim 7, characterized in that the molecular weight is in an interval of 31,000 to 186,000 Da.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 86.000 und 126.000 Da liegt.9. Use according to claim 8, characterized in that the molecular weight is in an interval of 86,000 and 126,000 Da.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 146.000 und 186.000 Da liegt.10. Use according to claim 8, characterized in that the molecular weight is in an interval of 146,000 and 186,000 Da.
11. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons alleine oder in Kombination mit Polyvinylalkohol in einem Intervall von 5.000 bis 500.000 Da liegt.11. Use according to claim 1 to 3, characterized in that the molecular weight of the polyvinylpyrrolidone is alone or in combination with polyvinyl alcohol in an interval of 5,000 to 500,000 Da.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons in einem Intervall von 10.000 bis 450.000 Da liegt.12. Use according to claim 11, characterized in that the molecular weight of the polyvinylpyrrolidone is in an interval of 10,000 to 450,000 Da.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons in einem Intervall von 24.000 bis13. Use according to claim 12, characterized in that the molecular weight of the polyvinylpyrrolidone in an interval of 24,000 to
360.000 Da liegt.360,000 There is.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.025 bis 5 % (w/v) liegt.14. Use according to one of claims 1 to 13, characterized in that the concentration of the polyvinyl derivative in an assay in an interval of 0.025 to 5% (w / v).
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.025 bis 2 % (w/v) liegt. 15. Use according to claim 14, characterized in that the concentration of the polyvinyl derivative in an assay in an interval of 0.025 to 2% (w / v).
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.1 bis 1 % (w/v) liegt.16. Use according to claim 15, characterized in that the concentration of the polyvinyl derivative in an assay in an interval of 0.1 to 1% (w / v).
17. Verfahren zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis von gebundenen Analyten auf Beads oder auf planaren Protein- Arrays in Gegenwart eines Polyvinylderivats erfolgt.17. A method for increasing the signal intensity while reducing unspecific binding, characterized in that the detection of bound analytes on beads or on planar protein arrays in the presence of a polyvinyl derivative takes place.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle auf Glas (Glasslides), Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder auf Polystyroloberflächen aufgebracht werden.18. The method according to claim 17, characterized in that the catcher molecules are applied to glass (Glasslides), nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or on polystyrene surfaces.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein19. The method according to claim 17 or 18, characterized in that the capture molecule is an antibody, a fragment of an antibody, an aptamer, a
Peptid oder ein Anticalin ist.Peptide or an anticalin.
20. Kit zur Durchführung eines Immunoassays enthaltend zumindest einen Puffer mit einem Polyvinylderivat als Komponente.20. Kit for carrying out an immunoassay containing at least one buffer with a polyvinyl derivative as a component.
21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es Fängermoleküle enthält, die auf Beads oder planaren Arrays gebunden sind.21. Kit according to claim 20, characterized in that it contains capture molecules which are bound to beads or planar arrays.
22. Kit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads oder planaren Arrays ein Trägermaterial aus Glas, Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder Polystyrol aufweisen. 22. Kit according to claim 21, characterized in that the beads or planar arrays comprise a carrier material of glass, nitrocellulose, PVDF (polyvinylidene fluoride) or polystyrene.
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