EP1963861A1 - Rna-helikase als marker für seltene tumore - Google Patents

Rna-helikase als marker für seltene tumore

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Publication number
EP1963861A1
EP1963861A1 EP06829599A EP06829599A EP1963861A1 EP 1963861 A1 EP1963861 A1 EP 1963861A1 EP 06829599 A EP06829599 A EP 06829599A EP 06829599 A EP06829599 A EP 06829599A EP 1963861 A1 EP1963861 A1 EP 1963861A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
rna helicase
carcinoma
rna
polypeptide
level
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06829599A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kathrin Zeller
Sven Laarmann
Karin Mittmann
Christoph Block
Ralf Janknecht
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Signalomics GmbH
Mayo Foundation for Medical Education and Research
Original Assignee
Signalomics GmbH
Mayo Foundation for Medical Education and Research
Mayo Clinic in Florida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Signalomics GmbH, Mayo Foundation for Medical Education and Research, Mayo Clinic in Florida filed Critical Signalomics GmbH
Publication of EP1963861A1 publication Critical patent/EP1963861A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids

Definitions

  • RNA helicase as a marker for rare tumors
  • RNA helicases constitute a large superfamily of conserved proteins that perform many functions in biochemical processes involving RNA (ribonucleic acid) molecules, such as transcription, splicing, transport, translation, RNA degradation, and ribosome biogenesis ,
  • RNA helicase can cause unwinding of duplex RNA or interruption of RNA-protein interactions.
  • RNA helicases may also be involved in gene transcription; they have been shown to function as transcriptional cofactors [Abdelhaleem, 2005].
  • RNA helicases Since the expression of key proteins involved in cell growth regulation, proliferation, differentiation, and cell death is controlled at the translational level and thus with the involvement of RNA helicases [Abdelhaleem, 2004], there is also a correlation between translational dysregulation and carcinogenesis. progression.
  • the RNA helicase Rck / p54 is overexpressed in colorectal carcinomas and adenomas as well as some other tumors and tumor cell lines.
  • the DDX1 RNA helicase gene is often co-amplified with N-myc in retinoblastoma and neuroblastoma, with a correlation of coamplification to poorer prognosis being discussed [Abdelhaleem, 2004].
  • p68 (DDX5) and p82 (DDX17) as well as its alternative splicing isoform p72 are closely related members of the DEAD-box family of RNA helicases, characterized by a conserved, Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD) sequence. containing motif are characterized.
  • the proteins have been shown to have ATPase, RNA-binding and helicase activities.
  • p68 RNA helicase continues to be involved in the regulation of gene transcription [Abdelhaleem, 2004]. It interacts with the estrogen receptor- ⁇ (ER- ⁇ , estrogen receptor- ⁇ ) to stimulate ER- ⁇ -dependent transcription.
  • p68 RNA helicase, SRA and AIB1, synergistically stimulate ER- ⁇ dependent transcription [Watanabe et al., 2001].
  • p68 presumably affects transcription by interacting with RNA polymerase II and further stimulating the transcriptional co-activators CBP and p300 [Rossow and Janknecht, 2003].
  • the homologous proteins CBP and p300 are endowed with acetyltransferase activity and are therefore able to adapt the chromatin structure as well as the function of a variety of different transcription factors [Goodman and Smolik, 2000; Janknecht, 2002].
  • rare diseases also known as orphan or rare diseases.
  • Rare diseases are diseases in which less than one in 2,000 sufferers, that would be less than 40,000 sufferers in Germany and less than 200,000 sufferers in the United States. In total, there are approximately 6,000-7,000 rare diseases, of which approximately 1,000 are known as rare tumors or tumor subtypes.
  • Esophageal carcinomas are malignant epithelial tumors of the esophagus, ie the upper gastrointestinal tract between the larynx and the transition into the stomach. These tumors are 96% squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. Within the EU, the incidence is between 3-10 / 100,000. In Germany, esophageal carcinoma is one of the rarer tumors with an increasing tendency. The 5-year survival rate in the United States is 14%. The mortality data are in Germany with 4 / 100,000 almost as high as the incidence, so die every year 4000 people in an esophageal carcinoma. Mortality has hardly changed, but there is a dramatic shift in the frequency of the two histological subtypes. The proportion of adenocarcinomas was below 10% in the 1970s, but this tumor entity has now surpassed the number of squamous cell carcinomas in the US since 1990. Comparable developments are also observed at many centers in Europe and Germany.
  • the diagnosis is made histologically directly by esophagoscopy with multiple biopsies taken.
  • Conventional histology with hematoxylin / eosin staining on paraffin sections allows for a distinction between squamous cell and adenocarcinoma as well as very rare small cell carcinoma.
  • Additional staining methods of the oesophageal mucous membrane are helpful in the detection of macroscopically ambiguous early cancers or multicenter carcinomas. Special tumor markers or molecular genetic markers are not yet available for esophageal carcinoma.
  • pancreatic carcinoma is the fifth most common cause of tumor-related death. There are approximately 27,000 deaths annually in the US and 50,000 in Europe. Due to the difficult diagnosis, the aggression of the course of the disease and the ultimately unsatisfactory effectiveness of systemic forms of therapy, only 1-5% of all patients with adenocarcinoma of the exocrine pancreas live 5 years after diagnosis. Therefore, the incidence of this malignancy corresponds approximately to the mortality rate. This poor 5-year survival rate is the worst survival of all tumors in the United States and Europe.
  • pancreatic carcinoma is suspected, sonographic examination of the gallbladder and pancreas is performed. In order to exclude other diseases, an X-ray examination of the upper gastrointestinal tract or, even better, an esophageal gastroduodenoscopy is performed. Magnetic Resonance Cholangiopancreatography (MRCP) is one of the best non-invasive imaging modalities for imaging pancreatic stenosis and biliary dilation. The best imaging assessment of the pancreas is by endoscopic ultrasonography.
  • MRP Magnetic Resonance Cholangiopancreatography
  • tumor markers such as CA19-9, CA125 and CEA
  • Molecular genetic diagnostic methods such as e.g. Although the detection of mutated k-ras in the pancreatic secretase has a high sensitivity, but only a moderate specificity, so it is not routinely used to confirm the diagnosis.
  • a biopsy endoscopy is performed which detects 94% of gastric carcinomas.
  • CA72-4 and CEA can only be used in advanced disease for therapy control.
  • No molecular genetic markers are used in the diagnosis of gastric carcinoma.
  • Hepatocellular carcinoma is a very rare tumor of childhood. It occurs in Western Europe and the US with an incidence of 1-5 / 100,000 inhabitants. Primary hepatic tumors account for approximately 1-1.5% of all pediatric neoplasms and have an incidence of 1.5 / 1,000,000 children at the age of 15 years. Hepatoblastoma is the most common primary liver tumor in this age group followed by HCC. This usually occurs in adolescents. In adults, HCC is the most common form of liver cancer. The main symptoms are palpable liver mass, abdominal pain and, in advanced cases, cachexia and jaundice. The serum alpha-fetoprotein is often elevated.
  • HCC can be a complication of viral hepatitis, especially in endemic areas but also as a result of metabolic diseases. HCC in an otherwise healthy liver is more likely to be seen in childhood than in adults. The HCC is extremely chemoresistant, and most of the diagnosis is already advanced. Accordingly, the 5-year survival rate is only about 6%.
  • the tumor marker alphai-fetoprotein is known to be a sensitive and specific serum marker for the presence of hepatocellular carcinoma, with hepatitis C and chronic liver diseases also affecting this marker.
  • the sensitivity can be increased to 78%.
  • Cholangiocellular carcinoma is fundamentally different from hepatocellular carcinoma in that it does not derive from hepatocytes but from the bile duct epithelium. Pathogenetically, it is more akin to adenocarcinoma than to hepatocellular carcinoma, although mixed tumors are occasionally diagnosed. There is no association with viral hepatitis, liver cirrhosis or hepatic metabolic defects. Cholangiocellular carcinomas are often associated with inflammatory bowel disease and primary sclerosing cholangitis and are prognostically unfavorable.
  • the present invention relates to methods and materials for the diagnosis and treatment of tumors, preferably esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma as well as hepatoblastoma and cholangiocellular carcinoma in mammals.
  • the invention likewise relates to a method for producing a corresponding diagnostic agent.
  • the invention further identifies molecules that inhibit the activity of RNA helicase (e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase).
  • the invention further relates to a method of treating cancer (e.g., esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma).
  • the methods and materials provided herein may be used for diagnosis in mammals having esophageal carcinoma or pancreatic carcinoma or gastric carcinoma or hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma or cholangiocellular carcinoma. Diagnosing these cancers may allow physicians to treat the mammal earlier than without diagnosis of the mammal. Early onset of appropriate treatment for cancer (e.g., esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma) may give the mammal a better chance of surviving the cancer.
  • cancer e.g., esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma
  • the methods and materials provided herein can also be used to identify molecules that inhibit helicase (e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase) activity.
  • Such molecules can be used to treat mammals having cancerous cells (eg, esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, or cholangiocellular carcinoma) so as to reduce the number of cancer cells (eg, 10 , 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100 percent reduction).
  • this document particularly highlights a method to determine if a Mammalian cancer (eg, esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma, but not breast cancer) or not.
  • the method involves determining whether a sample of a mammal has an increased amount of an RNA helicase (eg p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide, wherein the presence of an increased amount indicates that the mammal has cancer (eg Esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma).
  • an RNA helicase eg p68, p72 and / or p82 RNA helicase
  • the mammal may be a human or else another mammal, eg a horse or a pig.
  • the sample may be a tissue sample from the organ to be diagnosed (suspected organ). In the case of esophageal carcinomas, this is a sample from the esophagus, in the case of pancreatic carcinomas a sample from the pancreas, in the case of pancreatic carcinomas, a sample from the pancreas.
  • Carcinoma a sample from the stomach, in hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma or cholangiocarcinoma carcinoma each a sample from the liver.
  • the method of the invention for diagnosing tumors is based on the qualitative and / or quantitative determination of one or more RNA helicases in a tissue sample or in samples derived therefrom (e.g., tissue lysates or the like). These are preferably helicases of the DEAD-box family, which are known to the person skilled in the art. In a particularly preferred embodiment, the amount of at least one of the helicases from the group of p68, p72 and / or p82 RNA helicases is examined. The diagnostic method according to the invention therefore depicts the use of RNA helicases as tumor-associated markers.
  • the p68 RNA helicase polypeptide assayed according to the invention may have the sequence given in FIG.
  • the RNA helicase polypeptide may also be a p72 RNA helicase polypeptide.
  • the p72 RNA helicase polypeptide may have the sequence shown in FIG.
  • the RNA helicase polypeptide may be a p82 RNA helicase polypeptide.
  • the p82 RNA helicase polypeptide may have the sequence as described for p82 in FIG.
  • this document particularly relates to a method of treating a mammal (eg, a human) with cancer (eg, esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma).
  • the method involves administration of an inhibitor of RNA helicase polypeptide activity in the mammal.
  • these are helicases of the DEAD-box family.
  • an inhibitor from the group of substances is administered, the activity of the At least reduce RNA helicases p68, p72 and / or p82.
  • the treatment according to the invention reduces the growth of the tumor. It is of particular advantage if the treatment reduces the number of cancer cells in patients (mammals) compared to the untreated patient. For the purposes of this invention, however, it is already a treatment success, provided that the tumor shows only a low growth or stagnates in growth
  • any substance which leads to a lower activity of the RNA helicases, preferably the p68, the p72 and / or the p82 helicase, in the tumor cell is considered an inhibitor of the RNA helicase.
  • This definition includes inhibitors of gene expression as well as inhibitors of enzymatic activity.
  • the mammal to be treated can be a human.
  • the inhibitor may e.g. reduce the p68 RNA helicase polypeptide activity in the cancer cells (e.g., from esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocellular carcinoma) in the mammal.
  • the inhibitor may e.g.
  • siRNA molecule anti-sense oligonucleotide or ribozyme which reduces the expression level of the p68 RNA helicase polypeptide in cancer cells (eg esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma) ,
  • cancer cells eg esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma
  • the inhibitor employable in the present invention may also be an inhibitor of p72 RNA helicase polypeptide activity in cancer cells (e.g., esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma).
  • the inhibitor may e.g. be an siRNA molecule, anti-sense oligonucleotide or ribozyme that reduce the expression level of p72 RNA helicase polypeptide in cancer cells (eg esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma) can.
  • the inhibitor may also reduce the p82 RNA helicase polypeptide activity in the cancer cells (eg, from esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma) in the mammal.
  • the inhibitor may be, for example, an siRNA molecule, antisense oligonucleotide or ribozyme which regulates the expression level of p82 RNA helicase polypeptide in cancer cells (eg esophageal carcinoma, pancreatic carcinoma, gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, hepatoblastoma, cholangiocarcinoma carcinoma ) can reduce.
  • At least two inhibitors may also be administered in a therapeutically effective amount.
  • Particularly advantageous is a combination of an inhibitor of p68 RNA helicase with an inhibitor of p72 RNA helicase or p82 RNA helicase.
  • the inhibitors may be present in equal or different proportions in the pharmaceutical composition.
  • Nucleic acid sequence encoding human p68 RNA helicase polypeptide (NM_004396, coding region 171-2015).
  • FIG. 9 Nucleic acid sequence coding for human p82 RNA helicase polypeptide or for p72 isoform (NM_006386, coding region for p82: 75-2264, coding region for p72: 312-2264).
  • Amino acid sequence of the human p72 or p82 RNA helicase polypeptide (the amino acid sequence for p82 starts with amino acid 1 and ends with amino acid 729, the amino acid sequence for p72 starts at amino acid residue 80 and ends with amino acid 729 (NP_006377).
  • Retrovirus 1 encodes the expression of a shRNA
  • the present invention includes methods and material for targeting rarer cancers such as hepatoblastoma, hepatocellular, cholangiocarcinoma, pancreatic, esophageal, and gastric cancers in mammals (eg, humans, dogs, cats, horses, cattle, goats, pigs, and rodents). to diagnose and treat.
  • rarer cancers such as hepatoblastoma, hepatocellular, cholangiocarcinoma, pancreatic, esophageal, and gastric cancers in mammals (eg, humans, dogs, cats, horses, cattle, goats, pigs, and rodents).
  • RNA helicase e.g., p68, p72, and / or p82 RNA helicase
  • the patient may be classified as "cancerous" or at least "suspected of being cancerous" if the level of RNA helicase is e.g. a RNA helicase of the DEAD-box family such as p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide in a sample has an elevated level.
  • the level p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide can be determined by measuring each p68, p72, p82 RNA helicase polypeptide, including but not limited to native and mutant to restrict p68, p72, p82 RNA helicase polypeptides.
  • p68 RNA helicase polypeptides include, without limiting to this, human p68 RNA helicase polypeptides (for example, GenBank ® Accession No. NP_004387, Fig. 8), horse-p68 RNA helicase polypeptides rabbit p68 RNA helicase polypeptides and mouse p68 RNA helicase polypeptides.
  • p72 RNA helicase polypeptides include, without limiting to this, human p72 RNA helicase polypeptides (for example, GenBank ® Accession No. NP_006377, Fig. 10), horse-p72 RNA helicase polypeptides rabbit p72 RNA helicase polypeptides and mouse -p72 RNA helicase polypeptides.
  • RNA helicase polypeptides examples include, without limiting to this, human p82 RNA helicase polypeptides (for example, GenBank ® Accession No. NP_006377 Fig. 10), horse-p82 RNA helicase polypeptides rabbit p82 RNA helicase polypeptides and mouse p82 RNA helicase polypeptides.
  • RNA helicase eg p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide that is higher than a reference level for an RNA helicase (eg p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide
  • reference level is used herein to refer to an RNA helicase (p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide level, as is typical of non-cancerous / healthy mammals (eg people) is expressed.
  • the reference level of a p68 RNA helicase polypeptide may be, for example, the average level of p68 RNA helicase polypeptide contained in samples from 50 randomly selected healthy mammals of the respective species.
  • the average p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide level in healthy normal tissue samples of a particular organ from the same randomly selected group of the same mammal species may be a certain number X units / g normal tissue, while the average corresponding level of p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide in the tumor tissue of the same organ from the same randomly selected group mammals thereof, namely, for example, is a smaller amount Y units / g tumor tissue.
  • the reference level for the RNA helicase polypeptide level in the tumor tissue sample from a particular organ would thus be the level of RNA helicase polypeptide in the normal tissue sample of the corresponding organ.
  • the determination of whether or not its RNA helicase polypeptide level is elevated would, if possible, be made by reference to the level of RNA helicase polypeptide in the associated normal tissue. Belonging in this context refers to the fact that the normal tissue was taken from the same organ (but possibly from another patient), from which also the tumor originates; The determination of the reference level would then take place from this normal tissue.
  • the reference level may be the result of a determination from the non-diseased tissue parts of the identical organ or else from the corresponding non-diseased tissue of another patient. In both cases, it is a reference sample to be used for the diagnosis.
  • RNA helicase polypeptide levels in a tumor sample must be based on a reference level determined in normal tissue that belongs to the same tissue type as the tumor sample, even if the normal tissue sample is from another individual.
  • a liver tumor sample should be compared to a normal liver tissue sample from the same patient; if this is not possible, a comparison with a normal tissue sample from the liver of another patient should alternatively be used.
  • the level indicative of the pathological condition has no absolute value.
  • the increased level for an RNA helicase (e.g., p68, p72, or p82 RNA helicase) polypeptide may basically assume any value, provided that the level is higher than the corresponding reference level for the RNA helicase (Ex p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide.
  • an elevated level for an RNA helicase polypeptide may be 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20-fold, or even more, several times higher than the reference level for an RNA Helicase polypeptide in the reference sample.
  • a reference level may represent any value, it may also be 0, for example, for the p68 RNA helicase polypeptide. In this case, each level greater than 0 would be an elevated level for the p68 RNA helicase polypeptide.
  • any known method can be used to determine the level of an RNA helicase (e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide present in a sample.
  • RNA helicase e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase
  • anti-p68 RNA helicase polypeptide antibodies can be used to examine the level of expression of the p68 RNA helicase polypeptide in a sample.
  • the level of a p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide in a sample can be determined using protein chemical detection methods such as Western blots or immunochemical techniques. Another method that may be used to study a p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide in a sample may be functional. For example, an ATPase assay can be used to determine whether or not a tissue sample contains an elevated level of p68 RNA helicase polypeptide.
  • the level of an RNA helicase (eg, p68, p72, p82 RNA helicase) polypeptide present in a sample can also be determined by measuring a level of mRNA containing an RNA helicase (eg, p68, p72, p82 RNA helicase ) Polypeptide encoded. Any method can be used to measure the level of RNA encoding an RNA helicase (e.g., p68, p72, p82 RNA helicase) polypeptide, including, but not limited to, PCR-based methods.
  • RT-PCR can be used with oligonucleotide primers designed to amplify nucleic acid (e.g., RNA) encoding a p68, p72, and / or p82 RNA helicase polypeptide.
  • nucleic acid e.g., RNA
  • Any methods can be used to identify primers that are capable of amplifying nucleic acid or nucleic acids encoding an RNA helicase polypeptide.
  • a computer algorithm can be used for nucleic acid searching a database (for example, GenBank ®) to p68 RNA helicase.
  • amplified products corresponding to p68, p72 and / or p82 RNA helicase mRNA can be fractionated by gel electrophoresis and the level of the p68, p72 and / or p82 RNA helicase-specific product determined by densitometry.
  • the level of the p68, p72 and / or p82 RNA helicase-specific product can be determined via quantitative RT-PCR using fluorescent signal molecules or dyes.
  • any type of sample including a tissue sample, can be used to determine the level of an RNA helicase (p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide.
  • any method can be used to obtain a sample.
  • a tissue sample can be obtained via a biopsy. Once received, a sample can be processed prior to measuring the level of an RNA helicase (p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide.
  • a tissue sample can be treated to obtain mRNA. Once obtained, the mRNA can be evaluated to determine the level of p68, p72 and / or p82 RNA helicase mRNA present.
  • a tissue sample may be processed to obtain cell lysate. Is this cell lysate once available for use? In addition, it may be analyzed using anti-RNA helicase polypeptide antibodies (eg, p68, p72, and / or p82 RNA helicase polypepetide antibodies) to increase the level of RNA helicase polypeptide (eg, p68, p72, and / or p82 RNA helicase polypeptide) in the sample.
  • anti-RNA helicase polypeptide antibodies eg, p68, p72, and / or p82 RNA helicase polypeptide
  • the present invention provides a method to aid medical or research professionals in determining whether or not a mammal has cancer.
  • Healthcare professionals may be, for example, doctors, nurses, medical-technical laboratory personnel or pharmacists.
  • Research personnel may include, for example, working group leaders, technical assistants, PhDs and doctoral candidates.
  • the diagnostic methods according to the invention can advantageously be carried out with an antibody directed against the RNA helicase polypeptide, preferably against the p68 RNA helicase polypeptide whose binding via an immunological method z.
  • the present document provides a method of treating mammals, especially humans, who have cancer (eg, mammals having a hepatoblastoma, a hepatocellular, a cholangiocarcinoma, a pancreatic, a gastric, or an esophageal carcinoma ).
  • the method of the invention may e.g. be used to treat cancerous mammals in a manner that reduces the number of cancer cells (eg, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100% reduction) or But the growth of the tumor slows down or even stagnates.
  • the method according to the invention is basically applicable to all types of tumors. However, it is not claimed for breast cancer.
  • At least one compound is administered to a cancer patient, which compound reduces the level of RNA helicase (e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide activity in the mammalian cancer cells.
  • RNA helicase e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase
  • Any type of compound can be used to reduce the level of RNA helicase (e.g., p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide activity in the mammalian cancer cells.
  • RNA helicase polypeptide activity e.g. any inhibitor of p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide activity (e.g.
  • antisense nucleic acid molecules shRNA (small hairpin RNA), siRNA molecules, RNAi constructs and / or PNA oligos can be used to reduce the level of p68, p72 and / or p82 RNA helicase polypeptide activity in a mammalian cancer cells by adjusting the level of p68, p72 and / or p82 RNA helicase) polypeptide expression in the cells is reduced.
  • one or more compounds may be administered to a cancerous mammal such that the level of more than one RNA helicase polypeptide activity is reduced in mammalian cancer cells.
  • a single compound can be administered to reduce the level of p68 and p72 RNA helicase polypeptide activity.
  • two compounds may be administered to a cancer patient: a compound (eg, a siRNA molecule that is directed against expression of the p68 RNA helicase polypeptide) that can reduce the level of p68 RNA helicase polypeptide activity, and another Compound (eg, an siRNA molecule that is directed against both the expression of p72 and p82 RNA helicase polypeptides) that can reduce both the level of p72 and p82 RNA helicase polypeptide activity.
  • a compound eg, a siRNA molecule that is directed against expression of the p68 RNA helicase polypeptide
  • another Compound eg, an siRNA molecule that is directed against both the expression of p72 and p82 RNA helicase polypeptides
  • a rabbit polyclonal anti-p68 antibody was developed to stain tissue samples immunohistochemically. This is directed against amino acids 555 to 576 and was affinity purified against the corresponding oligopeptide ( ⁇ -p68- (555-576)). This antibody specifically recognizes endogenous p68 RNA helicase (see Fig. 1) [Rossow and Janknecht, 2003] and was used in the present example for immunohistochemical staining of paraffin-embedded tissue samples. Similarly, two additional antibodies were obtained from rabbits, one of which, ⁇ -p68-1583, is directed against amino acids 501 to 524 and the other, ⁇ -p68-1581, against amino acids 4 to 25.
  • tissue microarrays were used which, in addition to normal tissue samples, comprise numerous tumor samples of a particular tumor form, the normal and abnormal tissue samples being in part from the same patient. After deparaffinization and rehydration of the approximately 10 ⁇ m thick tissue sections, followed by heat-induced antigen retrieval, nonspecific protein binding sites were saturated with a BSA (bovine serum albumin, bovine serum albumin) solution.
  • BSA bovine serum albumin, bovine serum albumin
  • p68 was detected in the tissues using the anti-p68 primary antibody ⁇ -p68- (555-576) and an AlexaFluor488 secondary antibody conjugate (goat), and after being embedded in Moll / Dabco using a fluorescence microscope (Axiovert 200, Zeiss).
  • tissue microarrays with samples from hepatocellular carcinomas, cholangiocarcinomas, pancreatic carcinomas, gastric cancer and esophageal carcinomas.
  • a sample is classified as "negative” if the localization and intensity of the p68 signal after immunofluorescence staining corresponds approximately to the level of autofluorescence or the unspecific background.
  • Moderately stained refers to samples showing a mild to moderate increase in the p68 signal compared to autofluorescence and / or the nonspecific background
  • a sample is classified as "strong” if a significant increase in p68 signal to autofluorescence and / or nonspecific background staining in neoplastic tissue is to be detected, even if the signal is limited to individual structures / cell groups within the tissue sample If necessary, non-neoplastic samples having a corresponding level of expression will also be given this rating.
  • the p68 signal was classified as strong in 37% of the tumor tissue samples in comparison with the autofluorescence and the normal tissue, which corresponds to a significantly increased expression level of the protein. In 9% ("negative") of the cases no or only a very weak expression of p68 in the tissue was detected after comparison with autofluorescence and unspecific background, in 54% the increase of the p68-level was moderate (“moderate”). ).
  • the p68 RNA helicase was stained as described in the Cholangio carcinoma microarray and the expression levels of the normal and tumor tissues were compared and evaluated. Even before the specific immunohistochemical staining, a high degree of autofluorescence was detected. However, a detected p68 signal was clearly distinguishable (FIG. 3).
  • the p68 signal was classified as strong or very strong in comparison with the autofluorescence and the normal tissue in 37% of the tumor tissue samples, which corresponds to a greatly increased expression level of the protein.
  • 11% (“negative") of the cases no or only a very weak expression of p68 in the tissue was detected after comparison with autofluorescence and unspecific background, in 52% the increase of the p68-level was moderate (“moderate”). ).
  • Pancreatic carcinoma Microarrav p68 was stained as described in the pancreatic tissue samples and the expression levels of the normal and tumor tissues were compared and evaluated. Already before the specific immunohistochemical staining a weak autofluorescence was shown. A detected p68 signal was clearly distinguishable from this (FIG. 4).
  • the p68 signal was classified as strong or very strong in comparison with the autofluorescence and the normal tissue in 48% of the tumor tissue samples, which corresponds to a greatly increased expression level of the protein.
  • the increase of the p68 level was moderate (“moderate").
  • the p68 signal was classified as strong in comparison with the autofluorescence and the normal tissue in 24% of the tumor tissue samples, which corresponds to a significantly increased expression level of the protein. In 14% ("negative") of the cases no or only a very weak expression of p68 in the tissue was detected after comparison with autofluorescence and nonspecific background, in 62% the increase of the p68-level was moderate (“moderate”). ).
  • 1.6 ⁇ sopha ⁇ us carcinoma Microarrav p68 was stained as described in the esophageal carcinoma microarray and the expression levels of the normal and tumor tissues were compared and evaluated. Even before the specific immunohistochemical staining, a high degree of autofluorescence and non-specific binding of the secondary antibody was already evident. However, a detected p68 signal was clearly distinguishable (FIG. 6).
  • the p68 signal was classified as strong in comparison with the autofluorescence and the normal tissue in 25% of the tumor tissue samples, which corresponds to a significantly increased expression level of the protein.
  • 8% negative
  • the expression level of the p68 RNA helicase polypeptide in hepatocellular, cholangiocarcinoma, pancreatic, gastric and esophageal carcinoma is determined by the immunoblot method.
  • the total proteins are isolated from carcinogenic and corresponding normal tissue (non-diseased tissue) of the corresponding types of tumors (commercially available, for example, from BioCat) and separated according to their molecular weight by means of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the detection of p68 RNA helicase is then carried out in an immunoblot with a specifically directed against the p68 protein polyclonal antibody and a peroxidase-conjugated secondary antibody.
  • the expression level of p68 is then read by the strength of the Enhanced Chemiluminescence System (ECL) and correlated with the amount of p68 protein present in the tissue examined.
  • the expression strength of the p68 RNA helicase polypeptide in hepatocellular, cholangiocarcinoma, pancreatic, gastric and esophageal carcinoma is determined by means of an "immunoassay" (eg the ELISA, enzyme linked immunosorbent assay).
  • an "immunoassay” eg the ELISA, enzyme linked immunosorbent assay.
  • the entire proteins from carcinogenic and corresponding normal tissue (non-diseased tissue) of the corresponding Tumor species commercially available, for example, from BioCat
  • immobilized in a 'multi-well ELISA plate' are examples of the entire proteins from carcinogenic and corresponding normal tissue (non-diseased tissue) of the corresponding Tumor species (commercially available, for example, from BioCat) and immobilized in a 'multi-well ELISA plate'.
  • p68 RNA helicase is detected with a polyclonal antibody specifically directed against the p68 protein and with a secondary antibody conjugated with enzyme (eg alkaline phosphatase or peroxidase) or fluorescent dye-conjugated.
  • enzyme eg alkaline phosphatase or peroxidase
  • the expression level of p68 is then read from the strength of the enzymatic detection reaction (a substrate conversion yields a colored product) or fluorescence intensity in an 'LISA reader' and correlated with the amount of p68 protein present in the sample being studied. Comparison with the expression level in normal tissue reveals overexpression in carcinogenic tissue.
  • the Cancer Profiling Array (BD Clonetech) contains an expression profile of 19 tumor forms and corresponding normal tissue, represented by 154 sample pairs, with most tumors represented by at least 10 patient samples.
  • the RNA isolated from the tissue samples was rewritten into cDNA using SMART technology, ensuring the original complexity and relative abundance in the amplified cDNA.
  • the p68 expression is used with a radioactive or alternatively a fluorescently labeled gene-specific DNA probe for hybridization and read the resulting profile with a phosphor imager or a fluorescence scanner.
  • the signal strength correlates with the frequency of the p68-specific cDNA molecules and provides information about the expression strength (mRNA) of the p68 RNA helicase in the original tissue samples.
  • Protein stability is largely determined by posttranslational modification.
  • p68 polypeptides are isolated from tumor tissue and corresponding normal tissue with anti-p68 antibodies, and the purified p68 polypeptides are subjected to mass spectrometric analysis. Mass differences may be the exact nature of a post-translational modification that distinguishes the p68 RNA helicase from tumor cells from that from normal cells.
  • a finding of p68 RNA helicase polypeptide expression level is the investigation of cell extracts in an immunoblot analysis of electrophoretically separated proteins.
  • a hepatocellular, cholangiopancreatic, pancreatic, gastric or esophageal carcinoma isolated and established cell lines, such as for example, HuCCA-1, Pand, ASPC-1, HUP-T3, NCI-N87, AGS, KYSE, as well as corresponding, non-tumor, but normal tissue isolated, and transformed with the SV40 "large T" antigen cell lines, such as THLE -2 and HeMA 1 used.
  • These cell lines are cultured under standard cell culture conditions and each considered as a model system for the indicated tumor types.
  • the expression level of the p68 RNA helicase polypeptide can be determined from total cell lysates or from lysates of the nuclear or cytosolic fraction by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by immunoblot with a polyclonal antibody specifically directed against the p68 protein and with a peroxidase antibody. conjugated secondary antibodies are determined.
  • the expression level of p68 is then read by the strength of the detection reaction (e.g., ECL system) and correlated with the amount of p68 protein present in the particular cell line. When normalized to cell number or a reference protein such as e.g. Actin p68 expression levels can thus be compared (see Fig. 12 A to H).
  • a comparison of the signal strengths between carcinogenic and non-carcinogenic cell line indicates the expression level of the p68 RNA helicase in a tissue sample (compare 12 A to F with negative control 12 G and positive control 12 H).
  • Another possibility for determining the expression strength of the p68 RNA helicase polypeptide in the cell lines mentioned under 3.1 is an "immunoassay" (eg an ELISA, enzyme linked
  • ELISA enzyme linked
  • the entire proteins from the cultured cell lines are isolated (total cell lysate) and immobilized in a 'multi-well ELISA plate'.
  • p68 RNA helicase is detected with a polyclonal antibody specifically directed against the p68 protein and a secondary antibody conjugated with enzyme (eg alkaline phosphatase or peroxidase) or fluorescent dye-conjugated.
  • enzyme eg alkaline phosphatase or peroxidase
  • the expression strength of p68 is then read from the strength of the enzymatic detection reaction (a substrate conversion leads to a colored product) or the fluorescence intensity in an ⁇ LISA Reader 1 and correlated with the amount of p68 protein present in the sample examined. Comparison with the expression level in normal tissue reveals overexpression in carcinogenic tissue.
  • the level of p68 RNA helicase can be detected by means of specific antibodies (such as ⁇ -p68- (555-576), ⁇ -p68-1582, ⁇ -p68-1583) in an immunocytochemical method.
  • specific antibodies such as ⁇ -p68- (555-576), ⁇ -p68-1582, ⁇ -p68-1583)
  • cells of the corresponding line are cultivated on glass coverslips and fixed in the subconfluent to confluent state. After permeabilization of the membranes and saturation of nonspecific protein binding sites with a BSA solution, the p68 protein can be isolated by means of the specific binding primary antibodies ( ⁇ -p68- (555-576), ⁇ -p68-1582, ⁇ -p68-1583)) and fluorescently labeled secondary antibodies in be made visible in a fluorescence microscope.
  • the fluorescence intensity correlates with the expression strength or frequency of the protein in the cell and can be compared with signals from other cell lines. Furthermore, the subcellular localization (cytosol, nucleus) of the p68 protein can also be determined and give information about its normal or abnormal distribution in the cell (compare 13 A to F).
  • siRNA molecules are potent agents to study the effects of downregulation of p68 RNA helicase polypeptide expression in living cells. Especially in the case where p68 is a proto-oncogene its downregulation may inhibit cell transformation.
  • established tumor cell lines can be transfected with siRNA molecules with the goal of producing RNA interference for p68, and the resulting effect can be assessed via substrate-independent growth (e.g., via the soft agar assay) or cell proliferation.
  • RNA helicase cDNA sequences can be used as siRNA 'target' sequences:
  • substrate-independent growth in the soft agar assay and colony formation assay can be used to study the ability of p68 polypeptides, the ⁇ -catenin mediated transformation of NIH3T3, and To promote RK3E cells (rat). These assays can determine whether p68 RNA helicase polypeptides are involved in the maintenance and / or induction of cell transformation.
  • RNA helicase cDNA sequences can be used as siRNA 'target' sequences:
  • Human RKO colon cancer cells were infected with a mixture of 2 retroviruses.
  • the first retrovirus encodes the expression of a shRNA (small-hairpin RNA) directed against human p68 and the second retrovirus encodes the expression of a shRNA directed against human p72.
  • This shRNA also binds p82.
  • the term "p72 / p82" will be used hereinafter when both p72 and p82 are meant, thus “p72 / p82" is to be understood as “and / or”.
  • RKO cells were seeded after infection with the mixture of both retroviruses at 25% confluence and viewed 2 days later in a phase contrast microscope. While control cells proliferated strongly and formed a nearly confluent cell lawn, the cells infected with p68 and p72 / p82 shRNA hardly grew. Furthermore, many round cell bodies (which show a high refractive index in Figure 11 B) could be indicative of dying cells. Obviously, the proliferation of RKO cells is inhibited by p68 and p72 / p82 shRNA.
  • RKO cells were infected with the mixture of both retroviruses (see above) and subsequently injected into the left trunk side of nude mice. In parallel, the experiment was carried out using control shRNA.
  • a Steroid receptor coactivator, SRA functions as RNA and is present in an SRC-1 complex. Cell 97: 17-27.

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Abstract

Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen in einem Säuger, vorzugsweise in einem Menschen, wobei eine Probe aus dem Säuger im Hinblick auf ein erhöhtes Level an RNA Helikase untersucht wird und das erhöhte Level an RNA Helikase die Erkrankung anzeigt. Bei der Erkrankung handelt es sich um Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, Hepatocelluläres Karzinom, Hepatoblastom und cholangiozelluläres Karzinom.

Description

"RNA-Helikase als Marker für seltene Tumore"
Hintergrundinformation
RNA-Helikasen bilden eine große Superfamilie konservierter Proteine, die viele Funktionen in biochemischen Prozessen, an denen RNA- (Ribonukleinsäuren) Moleküle beteiligt sind, übernehmen, wie beispielsweise im Rahmen von Transkription, Spleissen, Transport, Translation, RNA-Abbau und Ribosomen-Biogenese. Die RNA-Helikase kann beispielsweise die Entwindung von Duplex- RNA oder die Unterbrechung von RNA-Protein-Wechselwirkungen bewirken. Zusätzlich können RNA-Helikasen auch an der Gentranskription beteiligt sein; es wurde gezeigt, dass sie als transkriptioneile Cofaktoren fungieren [Abdelhaleem, 2005].
Da die Expression von Schlüsselproteinen, die an Zellwachstumsregulation, Proliferation, Differen- zierung und Zelltod beteiligt sind, auf Translationsebene und damit unter Beteiligung von RNA- Helikasen kontrolliert wird [Abdelhaleem, 2004], ist auch von einem Zusammenhang zwischen Translationsdysregulation und Krebsentstehung bzw. -progression auszugehen. Beispielsweise wird die RNA-Helikase Rck/p54 in Colorectal-Karzinomen und -adenomen sowie von einigen anderen Tumoren und Tumorzelllinien überexprimiert. Weiterhin wird das DDX1 RNA-Helikase Gen oftmals mit N-myc in Retinoblastoma und Neuroblastoma koamplifiziert, wobei eine Korrelation der Koamplifizierung mit einer schlechteren Prognose diskutiert wird [Abdelhaleem, 2004].
p68 (DDX5) und p82 (DDX17) sowie dessen durch alternatives Spleissen entstehende Isoform p72 sind eng verwandte Mitglieder der DEAD-box Familie der RNA-Helikasen, die durch ein konser- viertes, die Sequenz Asp-Glu-Ala-Asp (D-E-A-D) enthaltendes Motiv charakterisiert werden. Die Proteine besitzen nachgewiesenermaßen ATPase, RNA-Binde- und Helikase-Aktivitäten. Neben ihrer Rolle im RNA-Metabolismus ist beispielsweise die p68 RNA-Helikase weiterhin in der Regulation der Gentranskription aktiv [Abdelhaleem, 2004]. Sie interagiert mit dem Östrogen-Rezeptor-α (ER-α, estrogen receptor-α) und stimuliert so die ER-α abhängige Transkription. Zusätzlich finden Wechselwirkungen zwischen p68 und AIB1 (amplified in breast Cancer - amplifiziert in Brustkrebs), einem Steroidrezeptor-Coaktivator, der in der Mehrheit aller Brusttumoren überexprimiert wird [An- zick ef al., 1997], und mit SRA (Steroidrezeptor rNA-Aktivator), einem Kofaktor, der als RNA fungiert [Lanz et al., 1999], statt.
Es wird davon ausgegangen, dass die p68 RNA-Helikase, SRA und AIB1 synergetisch die ER-α abhängige Transkription anregen [Watanabe et al., 2001]. Zusätzlich beeinflusst p68 vermutlich die Transkription, indem es mit der RNA-Polymerase Il interagiert und weiterhin die Transkriptions- Koaktivatoren CBP und p300 stimuliert [Rossow und Janknecht, 2003].
Die homologen Proteine CBP und p300 sind mit einer Acetyltransferase-Aktivität ausgestattet und daher in der Lage, die Chromatin-Struktur sowie die Funktion einer Vielfalt verschiedener Transkriptionsfaktoren anzupassen [Goodman und Smolik, 2000; Janknecht, 2002].
In Europa leiden über zwei Millionen Bürger an seltenen Krankheiten, auch „Orphan" oder „Rare Diseases" genannt. Seltene Krankheiten sind Krankheiten, an denen weniger als eine von 2000 Personen erkrankt, dies wären in Deutschland weniger als 40.000 Erkrankte bzw. in den Vereinigten Staaten weniger als 200.000 Erkrankte. Insgesamt gibt es ca. 6.000-7.000 seltene Krankheiten, von denen ca. 1.000 als seltene Tumore bzw. Tumor-Subtypen bekannt sind.
Ösophagus-Karzinome sind maligne epitheliale Tumoren der Speiseröhre, also des oberen Ga- strointestinaltrakts zwischen Kehlkopf und dem Übergang in den Magen. Es handelt sich bei diesen Tumoren zu 96 % um Plattenepithel-Karzinome und Adeno-Karzinome. Innerhalb der EU liegt die Inzidenz zwischen 3-10/100.000, in Deutschland gehört das Ösophagus-Karzinom zu den selteneren Tumoren mit steigender Tendenz. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt in den Vereinigten Staaten 14 %. Die Mortalitätsdaten liegen in Deutschland mit 4/100.000 nahezu genauso hoch wie die Inzidenz, demnach sterben jährlich 4000 Menschen an einem Ösophagus-Karzinom. Die Mortalität hat sich kaum geändert, jedoch beobachtet man eine dramatische Verschiebung der Häufigkeit der beiden histologischen Subtypen. In den 70er-Jahren lag der Anteil der Adeno-Karzinome unter 10 %, mittlerweile hat diese Tumorentität die Zahl der Plattenepithel-Karzinome in den USA seit 1990 übertroffen. Vergleichbare Entwicklungen werden auch an vielen Zentren in Europa und in Deutschland beobachtet.
Die Diagnose wird in aller Regel direkt durch die Ösophagoskopie mit Entnahme mehrerer Biopsien histologisch gestellt. Eine konventionelle Histologie mit Hämatoxilin/Eosin-Färbung an Paraffinschnitten ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Plattenepithel- und Adeno-Karzinom als auch der sehr seltenen kleinzelligen Karzinome. Zusätzliche Färbemethoden der Ösopha- gusschleimhaut sind hilfreich in der Entdeckung makroskopisch nicht eindeutiger Frühkarzinome oder multizentrischer Karzinome. Spezielle Tumormarker oder molekulargenetische Marker gibt es bisher nicht für das Ösophaguskarzinom .
Eine ständige Zunahme der Inzidenz des Pankreas-Karzinoms vor allem in der westlichen Welt ist zu beobachten. Heute stellt das Pankreaskarzinom die fünfthäufigste tumorbedingte Todesursache dar. Jährlich sind in den USA etwa 27.000 und in Europa 50.000 Todesfälle zu verzeichnen. Aufgrund der diffizilen Diagnose, der Aggressivität des Krankheitsverlaufs und der letztendlich unbefriedigenden Wirksamkeit systemischer Therapieformen leben nur noch 1-5 % aller Patienten mit Adeno-Karzinom des exokrinen Pankreas 5 Jahre nach Diagnosestellung. Daher entspricht die Inzidenz dieser Malignomerkrankung in etwa der Mortalitätsrate. Diese schlechte 5-Jahre-Überle- bensrate ist die schlechteste Überlebensrate aller Tumorerkrankungen in den Vereinigten Staaten und Europa.
Bei Verdacht auf ein Pankreaskarzinom wird eine sonographische Untersuchung von Gallenblase und Pankreas durchgeführt. Um andere Erkrankungen auszuschliessen, wird eine Röntgenkon- trastuntersuchung des oberen Gastrointestinaltraktes oder noch besser eine Ösophagusgastroduodenoskopie durchgeführt. Die Magnetresonanz-Cholangiopankreatographie (MRCP) ist eines der besten nichtinvasiven bildgebenden Verfahren, um Stenosen des Pankreas bzw. Dilatationen der Gallenwege darzustellen. Die beste bildgebende Beurteilung des Pankreas erfolgt mittels Endosonographie.
Bisher spielen labormedizinische Parameter bei der Diagnostik nur eine untergeordnete Rolle. Bestimmte Tumormarker wie CA19-9, CA125 und CEA können zusammen mit der Anamnese und dem klinischen Zustandsbild den Verdacht erhärten, haben aber bei der Diagnosesicherung keine Bedeutung. Molekulargenetische Diagnoseverfahren wie z.B. der Nachweis von mutiertem k-ras im Pankreassekret haben zwar eine hohe Sensitivität, jedoch nur eine mäßige Spezifität, so dass er zur Diagnosesicherung nicht routinemäßig eingesetzt wird.
Die Häufigkeit des Magen-Karzinoms nimmt weltweit ab. Im Jahr 1995 erkrankten 20.000 Personen in Deutschland an einem Magen-Karzinom. Die relative Überlebensrate liegt mit 28 % (USA 22 %) im unteren Drittel der 5-Jahres-Überlebensraten bei Tumorerkrankungen. Die Lokalisation der Tumoren hat sich ebenfalls in den letzten Jahren geändert; früher lagen diese vor allem im distalen Magen vor, nun zunehmend im proximalen Magen und am gastroösophagalen Übergang. - A -
Am Beginn der Diagnosestellung wird eine Endoskopie mit Biopsie durchgeführt, die 94 % der Magen-Karzinome erfasst. Es gibt für das Magenkarzinom keine spezifischen Serum-Tumormar- ker. So kann CA72-4 und CEA lediglich bei fortgeschrittener Erkrankung zur Therapiekontrolle eingesetzt werden. Es werden keine molekulargenetischen Marker in der Diagnostik des Magen- Karzinoms eingesetzt.
Das Hepatocelluläre Karzinom (HCC) ist ein sehr seltener Tumor des Kindesalters. Es tritt in Westeuropa und den USA mit einer Inzidenz von 1-5/100.000 Einwohnern auf. Primäre hepatische Tumoren machen etwa 1-1 ,5% aller pädiatrischen Neoplasmen aus und haben bei einem Alter bis zu 15 Jahren eine Inzidenz von 1 ,5/1.000.000 Kinder. Das Hepatoblastom ist der häufigste primäre Lebertumor in dieser Altersgruppe gefolgt vom HCC. Dieses tritt in der Regel bei Adoleszenten auf. Bei Erwachsenen ist das HCC die häufigste Form von Leberkrebs. Hauptsymptome sind eine pal- pable Lebermasse, Bauchschmerzen und in fortgeschrittenen Fällen Kachexie und Ikterus. Das Serum-Alpha-Fetoprotein ist häufig erhöht. Bei Kindern kann das HCC als Komplikation einer Vi- rus-Hepatitis auftreten, besonders in Endemiegebieten aber auch als Folge von Stoffwechselkrankheiten. Ein HCC in einer sonst gesunden Leber wird eher im Kindesalter als bei Erwachsenen gesehen. Das HCC ist außerordentlich chemoresistent, und bei der Diagnose ist die Erkrankung meist schon fortgeschritten. Entsprechend liegt die 5-Jahres-Überlebensrate nur bei ca. 6 %.
Beim Hepatozellulären Karzinom ist der Tumormarker alphai-Fetoprotein als ein sensitiver und spezifischer Serummarker für das Vorliegen eines hepatozellulären Karzinoms bekannt, wobei auch Hepatitis C-Erkrankungen und chronische Lebererkrankungen diesen Marker beeinflussen. In Kombination mit dem Nachweis von Isoenzymen der Gammaglutamyltranspeptidase oder des abnormen Plasma-Prothrombin kann die Sensitivität auf 78 % gesteigert werden.
Das cholangiozelluläre Karzinom unterscheidet sich grundsätzlich vom hepatozellulären Karzinom, indem es sich nicht von Hepatozyten, sondern vom Gallengangsepithel ableitet. Pathogenetisch entspricht es eher einem Adeno-Karzinom als einem hepatozellulären Karzinom, wobei auch Mischtumoren gelegentlich diagnostiziert werden. Es besteht keine Assoziation mit Virushepatiden, Leberzirrhose oder hepatalen Stoffwechseldefekten. Cholangiozelluläre Karzinome treten häufig in Zusammenhang mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und primär sklerosierender Cholangitis auf und sind prognostisch ungünstig.
Die Mortalität für das Hepatozelluläre und das Cholangiozelluläre Karzinom ist sehr hoch, in den Vereinigten Staaten ergibt sich nur eine 6 %ige 5-Jahres-Überlebensrate. Beim cholangiozellulären Karzinom werden bisher keine molekulargenetischen Marker in der Diagnostik eingesetzt.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Diagnose und zur Behandlung von Tumoren, insbesondere des Ösophagus-Karzinoms, des Pankreas-Karzinoms, des Magen-Karzinoms, des hepatozellulären Karzinoms sowie des Hepatoblastoms und des cholan- giozellulären Karzinoms in Säugern, vor allem im Menschen, bereitzustellen.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden und Materialien zur Diagnose und zur Behandlung von Tumoren, vorzugsweise des Ösophagus-Karzinoms, des Pankreas-Karzinoms, des Magen-Karzinoms, des hepatozellulären Karzinom sowie des Hepatoblastoms und des cholangiozellulären Karzinoms in Säugern. Ebenso betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines entsprechenden Diagnostikums. Mit Hilfe der Erfindung lassen sich des Weiteren Moleküle identifizieren, die die Aktivität von RNA-Helikasen- (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) inhibieren. Die Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Behandlung von Krebs (z.B. Ösophagus-Karzi- nom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, cho- langiozelluläres Karzinom). Die Methoden und Materialien, die hierin zur Verfügung gestellt werden, können zur Diagnose bei Säugern herangezogen werden, die ein Ösophagus-Karzinom oder Pankreas-Karzinom oder Magen-Karzinom oder hepatozelluläres Karzinom oder Hepatoblastom oder cholangiozelluläres Karzinom haben. Das Diagnostizieren dieser Krebsformen kann Medizinern eine frühere Behandlung des Säugers ermöglichen als ohne eine Diagnostik des Säugers. Der frühere Beginn einer geeigneten Behandlung von Krebs (z.B. beim Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozel- lulären Karzinom) kann dem Säuger eine bessere Chance geben, die Krebserkrankung zu überleben.
Die Methoden und Materialien, die hierin zur Verfügung gestellt werden, können auch zur Identifizierung von Molekülen, die eine Helikase- (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA Helikase) Aktivität inhibieren, genutzt werden. Solche Moleküle können benutzt werden, um Säuger zu behandeln, die Krebszellen haben (z.B. ein Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom oder ein cholangiozelluläres Karzinom), so dass die Anzahl an Krebszellen reduziert wird (z.B. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 Prozent Reduktion).
Im Allgemeinen hebt dieses Dokument besonders eine Methode hervor, um zu bestimmen, ob ein Säuger Krebs (z.B. ein Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozel- luläres Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozelluläres Karzinom; nicht aber Brustkrebs) hat oder nicht. Die Methode beinhaltet die Bestimmung, ob eine Probe eines Säugers eine erhöhte Menge eines RNA Helikase- (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptids aufweist, wobei die Präsenz einer erhöhten Menge zeigt, dass der Säuger Krebs hat (z.B. ein Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozelluläres Karzinom). Der Säuger kann ein Mensch sein oder aber auch ein anderer Säuger, z.B. ein Pferd oder ein Schwein sein. Die Probe kann eine Gewebsprobe aus dem zu diagnostizierenden Organ (Verdachtsorgan) sein. Dabei umfasst der Begriff „Probe" eine oder mehrere Gewebeproben ggf. aus verschiedenen Lokalitäten des zu untersuchenden Organs oder Referenzorgans. Im Falle der Ösophagus-Karzinome ist dies eine Probe aus der Speiseröhre, bei Pankreas-Karzinomen eine Probe aus der Bauchspeicheldrüse, bei Magen-Karzinomen eine Probe aus dem Magen, bei Hepatozellulären Karzinomen, Hepatoblastomen oder cholangiozellulären Karzinomen jeweils eine Probe aus der Leber.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose der Tumoren basiert auf der qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung einer oder mehrerer RNA-Helikasen in einer Gewebeprobe oder in daraus abgeleiteten Proben (z.B. Gewebelysaten o.a.). Vorzugsweise handelt es sich dabei um Helikasen der DEAD-box Familie, die dem Fachmann bekannt sind. In einer besonders bevorzug- ten Ausführungsform wird die Menge mindestens einer der Helikasen aus der Gruppe der p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikasen untersucht. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren stellt demnach auf die Verwendung von RNA-Helikasen als tumorassoziierte Marker ab.
Das erfindungsgemäß untersuchte p68 RNA-Helikase Polypeptid kann die Sequenz haben, die in Fig. 8 angegeben ist. Das RNA-Helikase-Polypeptid kann aber auch ein p72 RNA-Helikase Polypeptid sein. Das p72 RNA-Helikase Polypeptid kann die Sequenz haben, die in Fig. 10 angegeben ist. Das RNA-Helikase Polypeptid kann ein p82 RNA-Helikase Polypeptid sein. Das p82 RNA-Helikase Polypeptid kann die Sequenz haben, wie sie für p82 in Fig. 10 beschrieben ist.
Weiterhin betrifft dieses Dokument besonders eine Methode zur Behandlung eines Säugers (z.B. eines Menschen) mit Krebs (z.B. Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozelluläres Karzinom). Die Methode beinhaltet die Verabreichung eines Inhibitors einer RNA-Helikase Polypeptid Aktivität im Säuger. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Helikasen der DEAD-box Familie. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Inhibitor aus der Gruppe der Substanzen verabreicht, die die Aktivität der RNA-Helikasen p68, p72 und/oder p82 zumindest verringern. Vorteilhafterweise wird durch die erfindungsgemäße Behandlung das Wachstum des Tumors reduziert. Es ist von besonderem Vorteil, wenn durch die Behandlung die Anzahl der Krebszellen in Patienten (Säuger) im Vergleich zum unbehandelten Patienten zurückgeht. Im Sinne dieser Erfindung handelt es sich jedoch be- reits um einen Behandlungserfolg, sofern der Tumor lediglich ein geringeres Wachstum zeigt oder aber im Wachstum stagniert
Als Inhibitor der RNA-Helikase gilt im Sinne der Erfindung jede Substanz, die zu einer geringeren Aktivität der RNA-Helikasen, vorzugsweise der p68, der p72 und/oder der p82 Helikase, in der Tumorzelle führt. Diese Definition schließt Inhibitoren der Genexpression ebenso wie Hemmstoffe der enzymatischen Aktivität ein.
Der zu behandelnde Säuger kann ein Mensch sein. Der Inhibitor kann z.B. die p68 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität in den Krebszellen (z.B. von Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozelluläres Karzinom) im Säuger reduzieren. Der Inhibitor kann z.B. ein siRNA-Molekül, Anti-sense Oligonukleotid oder Ri- bozym sein, der das Expressionslevel des p68 RNA-Helikase Polypeptids in Krebszellen (z.B. vom Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozellulären Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozellulären Karzinom) reduziert.
Der erfindungsgemäß einsetzbare Inhibitor kann auch ein Inhibitor der p72 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität in den Krebszellen (z.B. vom Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen- Karzinom, hepatozellulären Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozellulären Karzinom) sein. Der Inhibitor kann z.B. ein siRNA-Molekül, Anti-sense Oligonukleotid oder Ribozym sein, der das Ex- pressionslevel von p72 RNA-Helikase Polypeptid in Krebszellen (z.B. vom Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozellulären Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozellulären Karzinom) reduzieren kann.
Der Inhibitor kann aber auch die p82 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität in den Krebszellen (z.B. vom Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozellulären Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozellulären Karzinom) im Säuger reduzieren. Der Inhibitor kann z.B. ein siRNA-Molekül, Anti-sense Oligonukleotid oder Ribozym sein, der den Expressionslevel von p82 RNA-Helikase Polypeptid in Krebszellen (z.B. vom Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, hepatozellulären Karzinom, Hepatoblastom, cholangiozellulären Karzinom) re- duzieren kann. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können auch mindestens zwei Inhibitoren in einer therapeutisch effektiven Menge verabreicht werden. Besonders vorteilhaft ist eine Kombination eines Inhibitors der p68 RNA-Helikase mit einem Inhibitor der p72 RNA-Helikase oder der p82 RNA Helikase. Die Inhibitoren können zu gleichen oder aber zu unterschiedlichen Anteilen in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sein.
Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Termini, die hierin benutzt werden, die gleiche Bedeutung wie sie gemeinhin von einer in dem Fachgebiet, dem diese Erfindung zugehörig ist, einschlägig ausgebildeten Person verstanden wird. Alle Publikationen, Patentanmeldungen, Patente oder andere Referenzen, die hierin in Bezug genommen werden, werden zu Offenbarungszwecken in ihrer Gesamtheit mit einbezogen.
Die hier angegebenen Ausführungsbeispiele dienen nur der Darstellung der Erfindung und sind nicht limitierend zu verstehen.
Andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Claims deutlich.
Beschreibung der Figuren
Fig. 1
Charakterisierung des anti-p68-(555-576) Antikörpers. (A) Anti-p68 Western Blot von Gesamtzell- lysaten aus den humanen Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und Hs578T. (B) Peptid-Kompetitio- nen. Ein Peptid, das die Aminosäuren 555 bis 576 der p68 RNA-Helikase umfasst, unterdrückt die Erkennung endogener p68 RNA-Helikase durch den anti-p68-(555-576) Antikörper in einem Western Blot mit Hs578T Zellextrakten, ein nichtverwandtes Peptid hingegen nicht. (C) Die p68 RNA-Helikase Expression in MDA-MB-231 oder Hs578T Brustkrebszellen wurde mit einer Immunfärbung unter Verwendung des anti-p68-(555-576) Antikörpers nachgewiesen. DNA wurde mit einem Hoechst-Farbstoff angefärbt.
Fig. 2
Immunhistochemische Analyse der p68-Expression (weiß, Fluoreszenzsignal) in Lebergewebe unter Verwendung des α-p68-(555-576)-Antikörpers. (A) Normalgewebe. (B, C) Hepatozelluläres Karzinom. Fig. 3
Immunhistochemische Analyse der p68-Expression (weiß, Fluoreszenzsignal) in Gewebe aus dem humanen Gallengang unter Verwendung des α-p68-(555-576)-Antikörpers. (A) Normalgewebe (Gallengang). (B, C) Cholangio-Karzinom.
Fig. 4
Immunhistochemische Analyse der p68-Expression (weiß, Fluoreszenzsignal) in Pankreasgewebe unter Verwendung des α-p68-(555-576)-Antikörpers. (A) Normalgewebe. (B, C) Duktales Adeno-Karzinom.
Fig. 5
Immunhistochemische Analyse der p68-Expression (weiß, Fluoreszenzsignal) in Magengewebe unter Verwendung des α-p68-(555-576)-Antikörpers. (A) Normalgewebe. (B, C) Adeno-Karzinom.
Fig. 6
Immunhistochemische Analyse der p68-Expression (weiß, Fluoreszenzsignal) in Ösophagusge- webe unter Verwendung des α-p68-(555-576)-Antikörpers. (A) Normalgewebe. (B) Adeno-Karzinom.
Fig. 7
Nukleinsäure-Sequenz, für humanes p68 RNA-Helikase Polypeptid kodierend (NM_004396, kodierender Bereich 171-2015).
Fig. 8
Aminosäuresequenz des humanen p68 RNA-Helikase Polypeptids (NP_004387).
Fig. 9 Nukleinsäure-Sequenz, für humanes p82 RNA-Helikase Polypeptid bzw. für p72-lsoform kodierend (NM_006386, kodierender Bereich für p82: 75-2264, kodierende Bereich für p72: 312-2264).
Fig. 10
Aminosäuresequenz des humanen p72 bzw. p82 RNA-Helikase Polypeptids (die Aminosäurese- quenz für p82 startet mit Aminosäure 1 und endet mit Aminosäure 729; die Aminosäuresequenz für p72 beginnt bei Aminosäurerest 80 und endet mit Aminosäure 729 (NP_006377).
Fig. 11
(A) Humane RKO Darmkrebszellen wurden dreimal mit einer Mischung aus 2 Retroviren (rechte Spur) bzw. Kontrollviren (linke Spur) infiziert. Retrovirus 1 kodiert die Expression einer shRNA
(small-hairpin RNA) gerichtet gegen humanes p68, Retrovirus 2 eine shRNA, die gegen humanes p72 gerichtet ist. Nach 48 h wurden aus den Zellen Proteinextrakte hergestellt und gelelektropho- retisch getrennt. In den dargestellten Western Blots zu diesen Proteinextrakten zeigt sich eine deutliche Herunterregulation von p68 und p72/p82 Protein, wohingegen das Kontrollprotein Aktin nicht beeinflusst wird. Cyclin D1 und c-Myc wurden in der Gegenwart der p68+p72/p82 shRNAs ebenfalls herunterreguliert. Zudem ist ein Heraufregulieren der aktivierten Form der Caspase 3 zu erkennen.
(B) RKO-Zellen wie in A) wurden mit 25 %iger Konfluenz ausgesät und 2 Tage später unter einem Phasenkontrastmikroskop untersucht. Die Kontrollzellen bilden einen nahezu konfluenten Zellrasen, während sich die mit p68+p72/p82 shRNA infizierten Zellen kaum vermehrten und zahlreich abrundeten (hell im Bild zu erkennen).
(C) und (D) 3.5 x 106 RKO Zellen wie unter A) beschrieben behandelt wurden in die linke Flanke von Nacktmäusen injiziert. Nach 32 Tagen wurden resultierende Tumore isoliert. (C) zeigt repräsentativ je einen Tumor aus Kontroll- und p68+p72/p82 shRNA behandelten Zellen. (D) zeigt die statistische Auswertung des Experiments hinsichtlich der untersuchten Tumormasse mit je 8 Mäusen in beiden Gruppen. Die durchschnittliche Tumormasse für die mit p68+p72/p82 shRNA behandelten Zellen ist gegenüber der in der Kontrollgruppe deutlich verringert.
Fig. 12
Immunoblot-Analyse des p68 RNA-Helikase Expressionslevels in humanen Karzinom Zelllinien (A) Zellen der humanen Zelllinie Hep-G2 des hepatozellulären Karzinoms wurden lysiert, und eine auf den Proteingehalt normierte Menge Lysat wurde mittels SDS-Palyacrylamigelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf eine ECL Western Blot Membran geblottet. Der Nachweis erfolgte mit dem gegen p68 gerichteten Antikörper α-p68-1583 Primärantikörper gefolgt von einem Peroxidase gekoppelten Sekundärantikörper und anschließender ECL Reaktion. Die Feststellung der erhöhten p68 Expression erfolgt durch Vergleich mit der nicht tumorigenen permanenten humanen endothelialen Zelllinie Hs BST (vgl.12 G). (B) Zellen der humanen Zelllinie des Pankreas-Karzinoms ASPC1 wurden wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt.
(C) Zellen der humanen Zellinie PaTu des Pankreas-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt.
(D) Zellen der humanen Zellinie KYSE 70 des schwach differenzierten Ösophagus-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt.
(E) Zellen der humanen Zellinie KYSE 140 des mäßig differenzierten invasiv wachsenden Ösophagus-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt.
(F) Zellen der humanen Zellinie KYSE 510 des gut differenzierten Ösophagus-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt.
(G) Zellen der nicht tumorigenen endothelialen Zelllinier Hs BST wurden wie unter (A) behandelt. Der Nachweis von p68 zeigt nur eine schwache Expression.
(H) Zellen der humanen Zellinie MCF7 des Mamma-Karcinoms wurden als Positivkontrolle wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt und steht in Übereinstimmung mit Janknecht, 2006 (WO 2006/002053 A2
Fig. 13
Immunocytochemischer Nachweis der erhöhten Expression von p68 in humanen Tumorzelllinien
(A) Zellen der humanen Zelllinie Hep-G2 des hepatozellulären Karzinoms wurden fixiert und nach Absättigung der unspezifischen Proteinbindungsstellen mit BSA zunächst mit dem Primärantikörper α-p68-1583 und im weiteren mit einem Alexa488 fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper im fluoreszenzmikroskop visualisiert. Eine erhöhte p68 Expression wurde durch Vergleich mit der Positivkontrolle der als p68 überexpremierend dokumentierten humanen Brustkrebszelllinie MCF7 ermittelt.
(B) Zellen der humanen Zelllinie ASPC1 des Pankreas-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt und die Überexpression von p68 wurde analog ermittelt. (C) Zellen der humanen Zelllinie PaTu des Pankreas-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt und die Überexpression von p68 wurde analog ermittelt.
(D) Zellen der humanen Zelllinie KYSE 70 des schwach differenzierten Ösophaguskarzinoms wurden wie unter (A) behandelt und die Überexpression von p68 wurde analog ermittelt.
(E) Zellen der humanen Zelllinie KYSE 140 des mäßig differenzierten invasiv wachsenden Ösophaguskarzinoms wurden wie unter (A) behandelt und die Überexpression von p68 wurde analog ermittelt.
(F) Zellen der humanen Zelllinie KYSE 510 des gut differenzierten Ösophagus-Karzinoms wurden wie unter (A) behandelt und die Überexpression von p68 wurde analog ermittelt.
(H) Zellen der humanen Zellinie MCF7 des Mamma-Karcinoms wurden als Positivkontrolle wie unter (A) behandelt. Die erhöhte Expression von p68 wird durch Vergleich mit 12 G festgestellt und steht in Übereinstimmung mit Janknecht, 2006 (WO 2006/002053 A2).
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Methoden und Material, um seltenere Krebsarten wie ein Hepatoblastom, Hepatozellulären, Cholangio-, Pankreas-, Ösophagus- und Magen-Krebs in Säugern (z.B. in Menschen, Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, Ziegen, Schweinen und Nagern) zu diagnostizieren und zu behandeln.
Erfindungsgemäß werden zu Zwecken der Diagnose bekannte Verfahren zur quantitativen und qualitativen Bestimmung einer RNA-Helikase in den betroffenen Tumorgeweben verwendet. Insbesondere werden Verfahren/Methoden eingesetzt, um zu bestimmen, ob eine Patientenprobe ein erhöhtes RNA-Helikase (Bsp. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid Level enthält. Wie hierin ausgewiesen, kann der Patient als „krebskrank" oder zumindest „krebsverdächtig" klassifiziert werden, wenn das Level an RNA-Helikase z.B. einer RNA-Helikase der DEAD-box Familie wie p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid in einer Probe ein erhöhtes Level aufweist.
Das Level p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid kann über das Messen eines jeden p68, p72, p82 RNA-Helikase Polypeptids einschließlich nativer und mutanter, aber ohne auf diese zu beschränken, p68, p72, p82 RNA-Helikase Polypeptide bestimmt werden. Beispiele für p68 RNA-Helikase Polypeptide umfassen, ohne auf diese zu begrenzen, humane p68 RNA-Helikase Polypeptide (z.B. GenBank® Zugangsnummer NP_004387, Fig. 8), Pferde-p68 RNA-Helikase Polypeptide, Kaninchen-p68 RNA-Helikase Polypeptide und Maus-p68 RNA-Helikase Polypeptide. Beispiele für p72 RNA-Helikase Polypeptide umfassen, ohne auf diese zu begrenzen, humane p72 RNA-Helikase Polypeptide (z.B. GenBank® Zugangsnummer NP_006377, Fig. 10), Pferde-p72 RNA-Helikase Polypeptide, Kaninchen-p72 RNA-Helikase Polypeptide und Maus-p72 RNA-Helikase Polypeptide.
Beispiele für p82 RNA-Helikase Polypeptide umfassen, ohne auf diese zu begrenzen, humane p82 RNA-Helikase Polypeptide (z.B. GenBank® Zugangsnummer NP_006377 Fig. 10), Pferde-p82 RNA-Helikase Polypeptide, Kaninchen-p82 RNA-Helikase Polypeptide und Maus-p82 RNA-Helikase Polypeptide.
Der Begriff „erhöhtes Level" wie hier verwendet bezieht sich auf ein Level an RNA-Helikase (Bsp. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid, das höher ist als ein Referenzlevel für ein RNA- Helikase (Bsp. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid. Der Begriff „Referenzlevel" wird hier in Bezug auf ein RNA-Helikase (p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid Level verwendet, wie es typischerweise von nicht krebskranken/gesunden Säugern (z.B. Menschen) expri- miert wird. Das Referenzlevel eines p68 RNA-Helikase Polypeptids kann beispielsweise das durchschnittliche Level an p68 RNA-Helikase Polypeptid sein, das in Proben aus 50 zufällig ausgewählten gesunden Säugern der entsprechenden Spezies enthalten ist.
Es ist vorteilhaft, wenn vergleichbare Proben zur Bestimmung, ob es sich bei dem betrachteten Level um ein erhöhtes Level handelt oder nicht, verwendet werden. Beispielsweise kann das durchschnittliche p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid Level in gesunden Normalgewebeproben eines bestimmten Organs aus derselben zufällig ausgewählten Gruppe gleicher Säugerart eine bestimmte Anzahl X Einheiten/g Normalgewebe betragen, während das durchschnittliche entsprechende Level an p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid im Tumor- gewebe desselben Organs aus derselben zufällig ausgewählten Gruppe Säugern davon abweicht, nämlich beispielsweise eine demgegenüber geringere Menge Y Einheiten/g Tumorgewebe beträgt.
Das Referenzlevel für das RNA-Helikase Polypeptid Level in der Tumorgewebeprobe aus einem bestimmten Organ wäre demnach das Level an RNA-Helikase Polypeptid in der Normalgewebe- probe des entsprechenden Organs. Für Tumorproben, die aus einem anderen Gewebe entnom- men wurden, würde die Bestimmung, ob ihr RNA-Helikase Polypeptid Level erhöht ist oder nicht, nach Möglichkeit unter Bezugnahme auf das Level an RNA-Helikase Polypeptid im zugehörigen Normalgewebe erfolgen. Zugehörig bezieht sich in diesem Zusammenhang darauf, dass das Normalgewebe demselben Organ (aber u.U. von einem anderen Patienten) entnommen wurde, aus dem auch der Tumor stammt; aus diesem Normalgewebe würde dann die Bestimmung des Referenzlevels erfolgen. Demnach kann es sich bei dem Referenzlevel um das Ergebnis einer Bestimmung aus dem nicht-erkrankten Gewebeteilen des identischen Organs oder aber aus dem entsprechenden nicht-erkrankten Gewebe eines anderen Patienten handeln. In beiden Fällen handelt es sich um eine für die Diagnose heranzuziehende Referenzprobe.
Zumindest jedoch muss die Bestimmung des RNA-Helikase Polypeptid Levels in einer Tumorprobe anhand eines Referenzlevels erfolgen, das in Normalgewebe ermittelt wurde, das dem gleichen Gewebetyp angehört wie die Tumorprobe, auch wenn die Normalgewebeprobe aus einem anderen Individuum stammt. Z.B. sollte eine Lebertumorprobe mit einer Leber-Normalgewebeprobe aus demselben Patienten verglichen werden; ist dies nicht möglich, ist alternativ ein Vergleich mit einer Normalgewebeprobe aus der Leber eines anderen Patienten heranzuziehen.
Das auf den pathologischen Zustand hinweisende Level hat keinen absoluten Wert. Vielmehr kann das erhöhte Level für eine RNA-Helikase (Bsp. p68-, p72- oder p82-RNA-Helikase) Polypeptid dem Grunde nach jeden Wert annehmen, vorausgesetzt, das Level ist höher als das korrespondierende Referenzlevel für das RNA-Helikase (Bsp. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid. Beispielsweise kann ein erhöhtes Level für ein RNA-Helikase Polypeptid 0.1 , 0.5, 1 , 2 , 3 ,4 , 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 15, 20fach oder noch darüber hinaus mehrfach höher als das Referenzlevel für ein RNA- Helikase Polypeptid in der Referenzprobe sein. Weiterhin kann ein Referenzlevel einen beliebige Wert darstellen, es kann beispielsweise für das p68 RNA-Helikase Polypeptid auch 0 betragen. Für diesen Fall wäre jedes Level größer als 0 für das p68 RNA-Helikase Polypeptid ein erhöhtes Level.
Dem Grunde nach kann jede bekannte Methode verwendet werden, um das Level an einem RNA- Helikase (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid, das in einer Probe vorliegt, zu bestimmen. Z.B. können anti-p68 RNA-Helikase Polypeptid Antikörper verwendet werden, um das Expressionslevel des p68 RNA-Helikase Polypeptids in einer Probe zu untersuchen.
In einigen Ausführungsformen kann das Level eines p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptids in einer Probe unter Verwendung von proteinchemischen Detektionsmethoden wie We- stern Blots oder immunchemische Techniken bestimmt werden. Eine andere Methode, die zur Untersuchung eines p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptids in einer Probe verwendet werden kann, kann funktional sein. Beispielsweise kann ein ATPase Assay benutzt werden, um zu bestimmen, ob eine Gewebeprobe ein erhöhtes Level an p68 RNA- Helikase Polypeptid enthält oder nicht.
Das Level eines RNA-Helikase (z.B. p68, p72, p82 RNA-Helikase) Polypeptids, das in einer Probe vorliegt, kann auch über das Messen eines Levels einer mRNA, die ein RNA-Helikase (z.B. p68, p72, p82 RNA-Helikase) Polypeptid kodiert, bestimmt werden. Jede Methode kann verwendet wer- den, um das Level einer RNA, die ein RNA-Helikase (z.B. p68, p72, p82 RNA-Helikase) Polypeptid kodiert, zu messen, einschließlich, aber ohne auf diese begrenzen, PCR-basierter Methoden. Z.B. kann RT-PCR mit Oligonukleotid-Primern benutzt werden, die zur Amplifizierung von Nukleinsäure (z.B. RNA), die ein p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid kodiert, entworfen wurde.
Beliebige Methoden können verwendet werden, um Primer zu identifizieren, die fähig sind, Nukleinsäure oder Nukleinsäuren, die eine RNA-Helikase Polypeptid kodiert bzw. kodieren, zu ampli- fizieren. Zum Beispiel kann ein Computeralgorithmus zum Durchsuchen einer Datenbank (z.B. GenBank®) nach p68 RNA-Helikase Nukleinsäure benutzt werden.
Beliebige Methoden können verwendet werden, um die amplifizierten Produkte zu analysieren. Beispielsweise können amplifizierte Produkte, p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase mRNA entsprechend, über Gelelektrophorese aufgetrennt und das Level des p68, p72 und/oder p82 RNA- Helikase spezifischen Produktes über Densitometrie bestimmt werden. Alternativ kann das Level des p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase spezifischen Produktes über quantitative RT-PCR unter der Verwendung von fluoreszenten Signalmolekülen oder Farbstoffen bestimmt werden.
Jede Art von Probe einschließlich einer Gewebeprobe kann verwendet werden, um das Level eines RNA-Helikase (p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptids zu bestimmen. Weiterhin kann jedwede Methode angewendet werden, um eine Probe zu beschaffen. Beispielsweise kann eine Gewebeprobe über eine Biopsie erhalten werden. Einmal erhalten, kann eine Probe vor dem Messen des Levels eines RNA-Helikase (p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptids bearbeitet werden. Z.B. kann eine Gewebeprobe so behandelt werden, dass mRNA erhalten wird. Einmal erhalten, kann die mRNA ausgewertet werden, um das vorliegende Level an p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase mRNA zu bestimmen. In einer weiteren Beispiel kann eine Gewebe- probe so aufgearbeitet werden, dass Zelllysat erhalten wird. Steht dieses Zelllysat einmal zur Ver- fügung, kann es unter der Verwendung von anti-RNA-Helikase Polypeptid Antikörpern (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polyppetid Antikörper) analysiert werden, um das Level an RNA- Helikase Polypeptid (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid) in der Probe zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, um medizinisches oder Forschungsfachpersonal bei der Bestimmung, ob ein Säuger Krebs hat oder nicht zu unterstützen. Medizinisches Fachpersonal können beispielsweise Ärzte, Krankenschwestern, medizinisch-technisches Laborpersonal oder Pharmazeuten sein. Forschungsfachpersonal können zum Beispiel Arbeitsgruppenleiter, technisches Assistenten, promovierte Wissenschaftler und Doktoranden umfassen.
Die erfindungsgemäßen Diagnose-Verfahren können vorteilhafterweise mit einem gegen das RNA- Helikase Polypeptid, vorzugsweise gegen das p68 RNA-Helikase Polypeptid gerichteten Antikörper durchgeführt werden, dessen Bindung über ein immunologisches Verfahren z. B. eine immunhisto- chemische Färbung oder einen Immunoblot nachgewiesen wird.
p68 als therapeutisches Target
Das vorliegende Dokument stellt ein Verfahren bereit zur Behandlung von Säugern, vor allem Menschen, die eine Krebserkrankung haben (z.B. Säuger, die ein Hepatoblastom, ein Hepatozel- luläres, ein Cholangio-, ein Pankreas-, ein Magen- oder ein Ösophagus-Karzinom haben). Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. dazu verwendet werden, um an Krebs erkrankte Säuger in einer Weise zu behandeln, daß die die Anzahl der Krebszellen reduziert wird (z.B. eine 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100%ige Reduktion) oder aber das Wachstum des Tumors verlangsamt wird oder sogar stagniert. Das erfindungsgemäße Verfahren gilt ist dem Grunde nach für alle Tu- morarten anwendbar. Es wird jedoch nicht für Brustkrebs beansprucht.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird mindestens eine Verbindung einem krebskranken Säuger verabreicht, wobei diese Verbindung das Level an RNA-Helikase (z.B. ein p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid Aktivität in den Krebszellen des Säugers verringert. Jede Art von Verbindung kann verwendet werden, um das Level an RNA-Helikase (z.B. p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid Aktivität in den Krebszellen des Säugers zu reduzieren.
Es kann z.B. jeder Inhibitor einer p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität (z.B.
ATPase-lnhibitoren) verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können Antisense- Nukleinsäure Moleküle, shRNA (small hairpin RNA), siRNA-Moleküle, RNAi-Konstrukte und/oder PNA-Oligos verwendet werden, um das Level an p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität in den Krebszellen eines Säugers zu verringern, indem das Level an p68, p72 und/oder p82 RNA-Helikase) Polypeptid Expression in den Zellen reduziert wird.
In einigen Fällen können eine oder mehrere Verbindungen einem krebskranken Säuger so verabreicht werden, dass das Level von mehr als einer RNA-Helikase Polypeptid Aktivität in Krebszellen des Säugers reduziert wird. Beispielsweise kann eine einzige Verbindung verabreicht werden, um das Level an p68 und p72 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität zu verringern. In einem anderen Beispiel können zwei Verbindungen einem krebskranken Säuger verabreicht werden: eine Verbindung (z.B. ein siRNA Molekül, das gegen die Expression des p68 RNA-Helikase Polypeptid gerichtet ist), die das Level an p68 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität verringern kann und eine weitere Verbindung (z.B. ein siRNA Molekül, das sowohl gegen die Expression von p72 als auch von p82 RNA- Helikase Polypeptiden gerichtet ist), die sowohl das Level der p72 als auch der p82 RNA-Helikase Polypeptid Aktivität verringern kann.
Die Erfindung wird in den folgenden Ausführungsbeispielen näher beschrieben; diese schränken aber nicht den Gültigkeitsbereich der Erfindung, wie er in den Claims beschrieben ist, ein.
A usführungsbeispiele
1. Immunhistochemischer Nachweis von p68 RNA-Helikase
Ein polyklonaler anti-p68-Antikörper aus Kaninchen wurde entwickelt, um Gewebeproben immun- histochemisch färben zu können. Dieser ist gegen die Aminosäuren 555 bis 576 gerichtet und wurde gegen das entsprechende Oligopeptid affinintätsgereinigt (α-p68-(555-576)). Dieser Antikörper erkennt spezifisch endogene p68 RNA-Helikase (vgl. Fig. 1 ) [Rossow und Janknecht, 2003] und wurde im vorliegenden Beispiel für eine immunhistochemische Färbung von in Paraffin eingebetteten Gewebeproben herangezogen. In gleicher Weise wurden zwei weitere Antikörper aus Kaninchen gewonnen, von denen sich einer, α-p68-1583, gegen die Aminosäuren 501 bis 524 und der andere, α-p68-1581 , gegen die Aminosäuren 4 bis 25 richtet.
Für die immunhistochemischen Färbungen wurden Gewebemicroarrays verwendet, die neben Normalgewebeproben zahlreiche Tumorproben einer bestimmten Tumorform umfassen, wobei die normalen und abnormalen Gewebeproben teilweise demselben Patienten entstammen. Nach der Deparaffinisierung und Rehydratisierung der ca. 10 μm dicken Gewebeschnitte, an die sich ein Hitze induziertes "Antigenretrieval" anschloss, wurden unspezifische Proteinbindungstellen mit einer BSA- (bovine serum albumin, Rinderserumalbumin) Lösung abgesättigt. p68 wurde unter Verwendung des anti-p68-Primärantikörpers α-p68-(555-576) und einem AlexaFluor488-Sekundär- antikörper Konjugat (Ziege) in den Geweben nachgewiesen und nach dem Einbetten in Mo- viol/Dabco mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes (Axiovert 200, Zeiss) ausgewertet. Ein Abgleich der Fluoreszenzsignale mit zuvor dokumentierter Autofluoreszenz bzw. unspezifischer Hintergrundbindung des Sekundärantikörpers ermöglicht eine präzise Feststellung des spezifischen p68 RNA-Helikase Signals. Auch geringe Expressionsunterschiede können mit dieser Methodik durch ein gutes Signal-Hintergrund-Verhältnis dargestellt werden.
Zusätzlich erfolgte eine weitere Evaluierung der Ergebnisse mit dem Antikörper α-p68-1583, welche die Aussagen, die sich mit dem Antikörper α-p68-(555-576) ergeben hatten, bestätigte. Für weitere Untersuchungen kann auch der anti-p68-Antikörper α-p68-1581 herangezogen werden.
Untersucht wurden Gewebemicroarrays mit Proben aus Hepatozellulären Karzinomen, Cholangio- Karzinomen, Pankreas-Karzinomen, Magenkrebs und Ösophagus-Karzinomen.
1.1 Beariffserklärunq für die Auswertung negativ: Als „negativ" wird eine Probe klassifiziert, wenn Lokalisation und Intensität des p68- Signals nach der Immunfluoreszenzfärbung etwa dem Level der Autofluoreszenz oder des unspezifischen Hintergrundes entspricht.
moderat: Als moderat gefärbt werden Proben bezeichnet, die eine schwache bis mäßige Erhöhung des p68-Signals im Vergleich zur Autofluoreszenz und/oder zum unspezifischen Hintergrund zeigen
stark: Als „stark" wird eine Probe klassifiziert, wenn eine deutliche Erhöhung des p68-Signals gegenüber Autofluoreszenz und/oder der unspezifischen Hintergrundfärbung in neoplastischen Ge- webe zu detektieren ist; auch wenn sich das Signal auf einzelne Strukturen/Zellgruppen innerhalb der Gewebeprobe begrenzt. Falls nötig, werden auch nicht-neoplastische Proben, die ein entsprechendes Expressionslevel aufweisen, mit dieser Bewertung versehen.
sehr stark: Diese Klassifizierung wird für Proben mit einem extrem auffälligen und signalintensiven Färbemuster verwendet. 1.2 Heoatozelluläres Karzinom Microarrav p68 wurde wie beschrieben im Hepatozellulärem-Karzinom Microarray angefärbt und die Expressionslevel des Normal- und Tumorgewebes verglichen und ausgewertet. Dabei zeigte sich bereits vor der spezifischen immunhistochemischen Färbung ein hohes Maß an Autofluoreszenz. Ein de- tektiertes p68 Signal war hiervon allerdings deutlich zu unterscheiden (Fig. 2).
Wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, wurde das p68-Signal im Abgleich mit der Autofluoreszenz und dem Normalgewebe in 37 % der Tumorgewebeproben als stark klassifiziert, was einem deutlich erhöhten Expressionslevel des Proteins entspricht. In 9 % („negativ") der Fälle war keine oder nur eine sehr schwache Expression von p68 im Gewebe nach Abgleich mit Autofluoreszenz und unspezifischem Hintergrund zu detektieren, in 54 % war die Erhöhung des p68-Levels als mäßig zu bezeichnen („moderat").
Tabelle 1 Auswertung des Hepatozellulären Karzinom Microarray p68-Signal für neoplastische Proben / Gesamtanzahl neopl. Proben negativ (0) 3/35 (9 %)
moderat (1 ) 19/35 (54 %)
stark (2) 13/35 (37 %)
sehr stark (3) 0
1.3 Cholanaio-Karzinom Microarrav
Die p68 RNA-Helikase wurde wie beschrieben im Cholangio Karzinom Microarray angefärbt und die Expressionslevel des Normal- und Tumorgewebes verglichen und ausgewertet. Dabei zeigte sich bereits vor der spezifischen immunhistochemischen Färbung ein hohes Maß an Autofluoreszenz. Ein detektiertes p68 Signal war hiervon allerdings deutlich zu unterscheiden (Fig. 3).
Wie Tabelle 2 zu entnehmen ist, wurde das p68-Signal im Abgleich mit der Autofluoreszenz und dem Normalgewebe in 37 % der Tumorgewebeproben als stark bzw. sehr stark klassifiziert, was einem stark erhöhten Expressionslevel des Proteins entspricht. In 11 % („negativ") der Fälle war keine oder nur eine sehr schwache Expression von p68 im Gewebe nach Abgleich mit Autofluoreszenz und unspezifischem Hintergrund zu detektieren, in 52 % war die Erhöhung des p68-Levels als mäßig zu bezeichnen („moderat").
Tabelle 2 Auswertung des Cholangio-Karzinom Microarray p68-Signal für neoplastische Proben / Gesamtanzahl neopl. Proben negativ (0) 5/46 (11 %)
moderat (1 ) 24/46 (52 %)
stark (2) 16/46 (35 %)
sehr stark (3) 1/46 (2 %)
1.4 Pankreas-Karzinom Microarrav p68 wurde wie beschrieben in den Pankreasgewebeproben angefärbt und die Expressionslevel des Normal- und Tumorgewebes verglichen und ausgewertet. Dabei zeigte sich bereits vor der spezifischen immunhistochemischen Färbung eine schwache Autofluoreszenz. Ein detektiertes p68 Signal war hiervon deutlich zu unterscheiden (Fig. 4).
Wie Tabelle 3 zu entnehmen ist, wurde das p68-Signal im Abgleich mit der Autofluoreszenz und dem Normalgewebe in 48 % der Tumorgewebeproben als stark bzw. sehr stark klassifiziert, was einem stark erhöhten Expressionslevel des Proteins entspricht. In nur 3 % („negativ") der Fälle war keine oder nur eine sehr schwache Expression von p68 im Gewebe nach Abgleich mit Autofluores- zenz und unspezifischem Hintergrund zu detektieren, in 49 % war die Erhöhung des p68-Levels als mäßig zu bezeichnen („moderat").
Tabelle 3 Auswertung des Pankreas-Karzinom Microarray p68-Signal für neoplastische Proben / Gesamtanzahl neopl. Proben negativ (0) 1/33 (3 %) moderat (1 ) 16/33 (49 %)
stark (2) 15/33 (45 %)
sehr stark (3) 1/33 (3 %)
1.5 Magen-Karzinom Microarray p68 wurde wie beschrieben im Magen-Karzinom Microarray angefärbt und die Expressionslevel des Normal- und Tumorgewebes verglichen und ausgewertet. Dabei zeigte sich bereits vor der spezifischen immunhistochemischen Färbung eine schwache Autofluoreszenz. Ein detektiertes p68 Signal war hiervon allerdings deutlich zu unterscheiden (Fig. 5).
Wie Tabelle 4 zu entnehmen ist, wurde das p68-Signal im Abgleich mit der Autofluoreszenz und dem Normalgewebe in 24 % der Tumorgewebeproben als stark klassifiziert, was einem deutlich erhöhten Expressionslevel des Proteins entspricht. In 14 % („negativ") der Fälle war keine oder nur eine sehr schwache Expression von p68 im Gewebe nach Abgleich mit Autofluoreszenz und unspezifischem Hintergrund zu detektieren, in 62 % war die Erhöhung des p68-Levels als mäßig zu bezeichnen („moderat"). Tabelle 4 Auswertung des Magen-Karzinom Microarray p68-Signal für neoplastische Proben / Gesamtanzahl neopl. Proben negativ (O) 7/50 (14 %)
moderat (1 ) 31/50 (62 %)
stark (2) 12/50 (24 %)
sehr stark (3) 0
1.6 Ösophaαus-Karzinom Microarrav p68 wurde wie beschrieben im Ösophagus-Karzinom Microarray angefärbt und die Expressionslevel des Normal- und Tumorgewebes verglichen und ausgewertet. Dabei zeigte sich bereits vor der spezifischen immunhistochemischen Färbung ein hohes Maß an Autofluoreszenz und unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers. Ein detektiertes p68 Signal war hiervon allerdings deutlich zu unterscheiden (Fig. 6).
Wie Tabelle 5 zu entnehmen ist, wurde das p68-Signal im Abgleich mit der Autofluoreszenz und dem Normalgewebe in 25 % der Tumorgewebeproben als stark klassifiziert, was einem deutlich erhöhten Expressionslevel des Proteins entspricht. In 8 % („negativ") der Fälle war keine oder nur eine sehr schwache Expression von p68 im Gewebe nach Abgleich mit Autofluoreszenz und unspezifischem Hintergrund zu detektieren, in 67 % war die Erhöhung des p68-Levels als mäßig zu bezeichnen („moderat").
Tabelle 5 Auswertung des Ösophagus-Karzinom Microarray p68-Signal für neoplastische Proben / Gesamtanzahl neopl. Proben negativ (O) 3/40 (8 %)
moderat (1 ) 27/40 67 %)
stark (2) 10/40 (25 %)
sehr stark (3) 0
2. Nachweis von p68 RNA-Helikase Polypeptid in Gewebeextrakten
Die folgenden Experimente dienen der Bestimmung des zugrunde liegenden Mechanismus der p68 Polypeptid Überexpression in Tumoren.
2.1 Die Expressionsstärke des p68 RNA-Helikase Polypeptids im Hepatozellulären, Cholangio-, Pankreas-, Magen- und Ösophagus-Karzinom wird mit Hilfe des Immunoblot Verfahrens bestimmt. Hierzu werden die gesamten Proteine aus karzinogenem und korrespondierendem Normalgewebe (nicht erkranktes Gewebe) der entsprechenden Tumorarten isoliert (kommerziell z. B. von BioCat erhältlich) und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach ihrem MoIe- kulargewicht getrennt. Der Nachweis von p68 RNA-Helikase erfolgt anschließend in einem Immunoblot mit einem spezifisch gegen das p68-Protein gerichteten polyklonalen Antikörper und einem mit Peroxidase konjugierten Sekundärantikörper. Die Expressionsstärke von p68 ist dann anhand der Stärke der Nachweisreaktion (Enhanced Chemiluminescence System, ECL-System) abzulesen und korreliert mit der Menge an vorhandenem p68-Protein im untersuchten Gewebe. Ein Vergleich mit dem Expressionslevel in normalem Gewebe lässt eine Überexpression in karzinogenem Gewebe erkennen.
2.2
Die Expressionsstärke des p68 RNA-Helikase Polypeptids im Hepatozelluläre, Cholangio-, Pan- kreas-, Magen- und Ösophagus-Karzinom wird mit Hilfe eines "Immuno-Assay" (z.B. dem ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) bestimmt. Hierzu werden die gesamten Proteine aus karzinogenem und korrespondierendem Normalgewebe (nicht erkranktes Gewebe) der entsprechenden Tumorarten isoliert (kommerziell z. B. von BioCat erhältlich) und in einer 'Multiwell-ELISA-Platte' immobilisert. Nach Absättigung von Proteinbindungsstellen mit BSA-Lösung erfolgt der Nachweis von p68 RNA-Helikase mit einem spezifisch gegen das p68-Protein gerichteten polyklonalen Antikörper und einem mit Enzym- (z. B. Alkalische Phosphatase oder Peroxidase) oder Fluores- zenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörper. Die Expressionsstärke von p68 ist dann anhand der Stärke der enzymatischen Nachweisreaktion (ein Substratumsatz führt zu einem farbigen Produkt) oder der Fluoreszenzintensität in einem ΕLISA-Reader' auszulesen und korreliert mit der Menge an vorhandenem p68-Protein in der untersuchten Probe. Ein Vergleich mit dem Expressionslevel in normalem Gewebe lässt eine Überexpression in karzinogenem Gewebe erkennen.
Diese Immuno-Assays sind besonders vorteilhaft, da sie sich für Hochdurchsatzanalysen automatisieren lassen.
2.3 Das folgende Experiment dient der schnellen, umfassenden und akkuraten Identifizierung von Tumor-spezifischen Expressionsänderungen einzelner Gene. In Kürze: Der Cancer Profiling Array (BD Clonetech) beinhaltet ein Expressionsprofil aus 19 Tumorformen und korrespondierendem Normalgewebe, die durch 154 Probenpaare repräsentiert sind, wobei die meisten Tumore mit mindestens 10 Patientenproben repräsentiert sind. Die aus den Gewebeproben isolierte RNA wurde mittels der SMART Technologie in cDNA umgeschrieben, wobei die ursprüngliche Komplexität und relative Häufigkeit in der amplifizierten cDNA gewährleistet. Die p68 Expression wird mit einer radioaktiven oder alternativ einer fluoreszenzmarkierten Gen-spezifischen DNA-Sonde zur Hybridisierung verwendet und das resultierende Profil mit einem Phosphor-Imager oder einem Fluoreszenzscanner ausgelesen werden. Dabei korreliert die Signalstärke mit der Häufigkeit der p68-spe- zifischen cDNA-Moleküle und gibt Aufschluss über die Expressionsstärke (mRNA) der p68 RNA- Helikase in den ursprünglichen Gewebeproben.
2.4
Die Proteinstabilität wird maßgeblich durch die posttranslationale Modifikation bestimmt. p68 PoIy- peptide werden aus Tumorgewebe und korrespondierendem Normalgewebe mit anti-p68 Antikörpern isoliert und die gereinigten p68 Polypeptide einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Massendifferenzen können die genaue Art einer posttranslationalen Modifikation darstellen, die die p68 RNA-Helikase aus Tumorzellern von der aus normalen Zellen unterscheidet.
Diese Studien sind essenziell zur Feststellung, ob der Promotor des p68 Gens hochreguliert wird (wie z.B. bei ER alpha) oder ob das p68 Polypeptid durch posttranslationale Modifikationen stabilisiert wird (z.B. durch Blockierung von Ubiquitylierungsstellen durch eine Acetylierung oder Sumo- sylierung an den selben Lysinresten.
Ähnlich Experimente werden durchgeführt, um den zugrunde liegenden Mechanismus der p72 und p82 Polypeptid Überexpression in Tumoren zu bestimmen.
3. p68 Expression im Zeillinienmodell
3.1
Eine Feststellung des p68 RNA-Helikase Polypeptid Expressionslevels stellt die Untersuchung von Zellextrakten in einer Immunoblot-Analyse von elektrophoretisch getrennten Proteinen dar. Hierzu werden aus einem Hepatozellulärem, Cholangio-, Pankreas-, Magen- bzw. Ösophagus-Karzinom isolierte und etablierte Zelllinien, wie z.B. HuCCA-1 , Pand , ASPC-1 , HUP-T3, NCI-N87, AGS, KYSE, sowie korrespondierende, nicht aus Tumoren, sondern aus Normalgewebe isolierte, und mit dem SV40 "large T" Antigen transformierte Zelllinien, wie z.B. THLE-2 und HeMA1 herangezogen. Diese Zelllinien werden unter Standard-Zellkulturbedingungen kultiviert und jeweils als Modellsystem für die angegebenen Tumorarten betrachtet.
Das Expressionslevel des p68 RNA-Helikase Polypeptids kann aus Gesamtzelllysaten oder aus Lysaten der Kern- bzw. der zytosolischen Fraktion mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und nachfolgendem Immunoblot mit einem spezifisch gegen das p68 Protein gerichteten polyklonalen Antikörper und einem mit Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper bestimmt werden. Die Expressionsstärke von p68 ist dann anhand der Stärke der Nachweisreaktion (z.B. ECL-System) abzulesen und korreliert mit der Menge an vorhandenem p68-Protein in der jeweiligen Zelllinie. Bei Normierung auf Zellzahl oder ein Referenzprotein wie z.B. Aktin können so p68- Expressionslevel miteinander verglichen werden (vgl. Fig. 12 A bis H).
Ein Vergleich der Signalstärken zwischen karzinogener und nicht-karzinogener Zelllinie gibt dabei das Expressionslevel der p68 RNA-Helikase in einer Gewebeprobe an (vgl. 12 A bis F mit Negativkontrolle 12 G und Positivkontrolle 12 H).
3.2
Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung der Expressionsstärke des p68 RNA-Helikase Polypep- tids in den unter 3.1 erwähnten Zelllinien stellt ein "Immuno-Assay" (z.B. ein ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) dar. Hierzu werden die gesamten Proteine aus den kultivierten Zelllinien isoliert (Gesamtzelllysat) und in einer 'Multiwell-ELISA-Platte' immobilisiert. Nach Absättigung von Proteinbindungsstellen mit BSA-Lösung erfolgt der Nachweis von p68 RNA-Helikase mit einem spezifisch gegen das p68-Protein gerichteten polyklonalen Antikörper und einem mit Enzym- (z. B. Alkalische Phosphatase oder Peroxidase) oder Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörper. Die Expressionsstärke von p68 ist dann anhand der Stärke der enzymatischen Nachweisreaktion (ein Substratumsatz führt zu einem farbigen Produkt) oder der Fluoreszenzintensität in einem ΕLISA-Reader1 auszulesen und korreliert mit der Menge an vorhandenem p68-Protein in der untersuchten Probe. Ein Vergleich mit dem Expressionslevel in normalem Gewebe lässt eine Überexpression in karzinogenem Gewebe erkennen.
3.3
In einer weiteren Ausführungsform kann das Level an p68 RNA-Helikase mittels spezifischer Antikörper (wie α-p68-(555-576), α-p68-1582, α-p68-1583) in einer immunzytochemischen Methode nachgewiesen werden. Dazu werden Zellen der entsprechenden Linie auf Glasdeckgläschen kultiviert und im subkonfluenten bis konfluenten Zustand fixiert. Nach Permeabilisierung der Membranen und Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen mit einer BSA-Lösung kann das p68 Protein mittels der spezifisch bindenden Primärantikörpern (α-p68-(555-576), α-p68-1582, α- p68-1583)) und fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern in einem Fluoreszenzmikroskop sicht- bar gemacht werden. Die Fluoreszenzintensität korreliert dabei mit der Expressionsstärke bzw. Häufigkeit des Proteins in der Zelle und kann mit Signalen aus anderen Zellinien verglichen werden. Des Weiteren kann auch die subzelluläre Lokalisation (Zytosol, Nukleus) des p68 Proteins bestimmt werden und über seine normale oder abnormale Verteilung in der Zelle Aufschluss geben (vgl. 13 A bis F).
4. Die Rolle der 068 RNA-Helikase Polypeptide in Tumorzellen
4.1
Die folgenden Experimente werden durchgeführt, um den Einfluss der p68 RNA-Helikase Polypep- tide auf den Tumorzellphänotyp zu untersuchen. Die p68 RNA-Helikase Polypeptid Expression wird in humanen Tumorzelllinien unter Einsatz von RNA-I nterferenz unterdrückt und die daraus resultierenden Veränderungen in der Wachstumsrate und des Substrat-unabhängigen Wachstums bestimmt. In Kürze: bei siRNA Molekülen handelt es sich um potente Agenzien, um die Effekte der Herunterregulation ("Downregulation") der p68 RNA-Helikase Polypeptid Expression in lebenden Zellen zu untersuchen. Insbesondere für den Fall, dass es sich bei p68 um ein Proto-Oncogen handelt, kann dessen Herunterregulation die Zelltransformation hemmen.
Beispielsweise können etablierte Tumor-Zelllinien mit siRNA-Molekülen mit dem Ziel transfiziert werden, RNA-Interferenz für p68 zu erzeugen und der resultierende Effekt kann über Substrat- unabhängiges Wachstum (z.B. über den "Soft Agar Assay") oder die Zellproliferation untersucht werden.
Die folgenden humanen p68 RNA-Helikase cDNA Sequenzen können als siRNA 'target' Sequenzen verwendet werden:
1. TAAGGAAGATTGTGGATCA
2. TAAGACCTGATAGGCAAAC
3. ACCACAACATTCTTCAGAT
4. ACTTATTCGTCTAATGGAA 5. AGAAGATGTGATGAGCTTA
6. GACAGAGGTTCAGGTCGTT
7. GAACTGCTCGCAGTACCAA
Weiterhin können das Substrat-unabhängige Wachstum im "Soft Agar Assay" und der Kolonie- Bildungs-Assay ("Colony Formation Assay") verwendet werden, um die Fähigkeit von p68 Polype- tiden zu untersuchen, die ß-Catenin vermittelte Transformation von NIH3T3 und RK3E-Zellen (Ratte) zu fördern. Diese Untersuchungen können bestimmen, ob p68 RNA-Helikase Polypeptide an dem Erhalt und/oder der Induktion der Zelltransformation beteiligt sind.
Ähnliche Techniken können verwendet werden, um die Expression von p72 oder p82 RNA-Helikase zu verringern. Beispielsweise können folgende humane p72 und p82 RNA-Helikase cDNA Sequenzen als siRNA 'target' Sequenzen verwendet werden:
1. GAGACGCTGTGATGATCTG 2. GATGTCAAGTTTGTGATCA
In vivo Experiment
Humane RKO-Darmkrebszellen wurden mit einer Mischung aus 2 Retroviren infiziert. Der erste Retrovirus kodiert für die Expression einer shRNA (small-hairpin RNA), die gegen humanes p68 gerichtet ist, und der zweite Retrovirus kodiert für die Expression einer shRNA, die gegen humanes p72 gerichtet ist. Diese shRNA bindet auch p82. Zu Zwecken der sprachlichen Vereinfachung wird nachfolgend der Begriff „p72/p82" daher verwendet, wenn sowohl p72 als auch p82 gemeint ist. Demnach ist „p72/p82" als „und/oder" zu verstehen. Nach dreimaliger Infektion der RKO-Zellen mit dieser Virenmischung (Fig. 11 A, rechte Spur) oder mit Kontrollviren (Fig. 11 A, linke Spur) und im Anschluss an eine 48 h-Wachstumsphase wurden Proteinextrakte unter Verwendung von Laemmli Puffer hergestellt. Dargestellt sind entsprechende Westernblots dieser Proteinextrakte. Es zeigt sich, dass die p68 und p72/p82 Proteine zu mehr als 80 % durch shRNAs herunterreguliert werden, wohingegen das Kontrollprotein Aktin nicht beein- flusst wird. Interessanterweise wurden auch Cyclin D1 und c-Myc in der Gegenwart der p68 und p72/p82 shRNAs herunterreguliert, was eine Reduktion der Zeilproliferation hervorrufen könnte. Weiterhin wurde beobachtet, dass die aktivierte Form der Caspase 3 heraufreguliert worden ist, was auf eine erhöhte Apoptoserate hinweisen kann. Dies deutet darauf hin, dass eine Überexpression von p68 und/oder p72/p82 zu einer Erhöhung der Zeilproliferation und zu einem Schutz vor Apoptose beitragen kann. Beides sind Merkmale, die eine Tumorentwicklung unter Beteiligung von p68 und p72/p82 fördern würden.
Auch ein Experiment zur Zellproliferation bestätigte die bereits beschriebenen Beobachtungen. RKO Zellen wurden nach Infektion mit der Mischung aus beiden Retroviren mit einer 25 %igen Konfluenz ausgesät und 2 Tage später in einem Phasenkontrastmikroskop betrachtet. Während Kontrollzellen stark proliferierten und einen nahezu konfluenten Zellrasen ausbildeten, haben sich die mit p68 und p72/p82 shRNA infizierten Zellen kaum vermehrt. Des Weiteren zeigten sich viele runde Zellkörper (die stark lichtbrechend in Fig. 11 B zu erkennen sind), die auf sterbende Zellen hinweisen könnten. Offensichtlich wird die Proliferation von RKO- Zellen durch p68 und p72/p82 shRNA inhibiert wird.
Auch in einem in vivo Experiment konnte die Bedeutung der RNA-Helikasen p68 und p72/p82 für das Tumorwachstum nachgewiesen werden.
(3.5 x 106) RKO-Zellen wurden mit der Mischung aus beiden Retroviren infiziert (s.o.) und nachfolgend in die linke Rumpfseite von Nacktmäusen injiziert. Parallel wurde der Versuch unter Verwendung von Kontroll-shRNA durchgeführt.
Nach 32 Tagen wurden die Tumoren isoliert und die Tumormasse bestimmt. Die statistische Auswertung der Tumoren aus je 8 Mäusen in beiden Versuchsgruppen zeigt deutlich, dass das Tumorwachstum durch p68 und p72/p82 shRNA stark inhibiert wird (vgl. Fig. 11 C und D).
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose eine der folgenden Erkrankungen in einem Säuger, vorzugsweise in einem Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe aus dem Säuger im Hinblick auf ein erhöhtes Level an RNA Helikase untersucht wird, wobei das erhöhte Level an RNA Helikase die Erkrankung anzeigt: Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen- Karzinom, Hepatocelluläres Karzinom, Hepatoblastom und cholangiozelluläres Karzinom.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine DEAD-box Helikase ist
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p68 Helikase ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p 72 Helikase ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p 82 RNA-Helikase ist.
6. Verfahren zur Behandlung eine der folgenden Erkrankungen in einem Säuger, vorzugsweise in einem Menschen, dadurch gekennzeichnet daß dem Säuger ein Hemmstoff der RNA-Helikase-Aktivität verabreicht wird: Ösophagus-Karzinom, Pankreas-Karzinom, Magen-Karzinom, Hepatocelluläres Karzinom, Hepatoblastom und cholangiozelluläres Karzinom.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine DEAD-box Helikase ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p68 RNA-Helikase ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p72 RNA-Helikase ist.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die RNA-Helikase eine p82 RNA-Helikase ist.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Hemmstoff ein siRNA- Molekül ist, dass die Expression der Helikase reduziert.
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