EP1954289A2 - Utilisation du guanabenz et de ses derives pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules - Google Patents

Utilisation du guanabenz et de ses derives pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules

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EP1954289A2
EP1954289A2 EP06831184A EP06831184A EP1954289A2 EP 1954289 A2 EP1954289 A2 EP 1954289A2 EP 06831184 A EP06831184 A EP 06831184A EP 06831184 A EP06831184 A EP 06831184A EP 1954289 A2 EP1954289 A2 EP 1954289A2
Authority
EP
European Patent Office
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cells
guanabenz
derivatives
protein
cystic fibrosis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06831184A
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German (de)
English (en)
Inventor
Frédéric BECQ
Marc Blondel
Déborah TRIBOULLARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Poitiers
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Poitiers
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Poitiers filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1954289A2 publication Critical patent/EP1954289A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the invention relates to the use of derivatives and guanabenz guanabenz to manufacture drugs to restore addressing "proteins from the endoplasmic reticulum to the plasma membranes.
  • the functional organization of the eukaryotic cell is based on an elaborate system of membrane compartments or organelles (nucleus, endoblastic reticulum, Golgi apparatus, endosomes) with their own protein and lipid composition.
  • the targeting of proteins in the cell is a set of molecular mechanisms to ensure, during protein synthesis, the correct folding, maturation and localization of functional proteins.
  • Cystic fibrosis (CF: Cystic Flbrosis) is the most common recessive genetic, autosomal, and lethal disease in European and North American populations.
  • the CF gene (locus 7q31) encodes the trans-membrane protein named CFTR (for Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). This protein is a chloride channel located in the apical plasma membrane of pulmonary and digestive epithelial cells in healthy individuals. Although there are more than 1000 mutations of the CFTR protein, the most common mutation (70% of patients) is the deletion of a phenylalanine in the NBF1 domain. position 508 (delF508).
  • CFTR is responsible for the trans-epithelial transport of water and electrolytes, and allows in a healthy individual, the hydration of the pulmonary airways, the proper digestive secretory function and exocrine glands in general.
  • One of the keys to a treatment of this disease, and in general of any pathology related to such addressing problems, consists of a re-addressing of the CFTR delF508 protein to the apical membrane of the cells. Once at the membrane, CFTR delF508 transport activity can be stimulated by physiological agonists.
  • guanabenz long used clinically for the treatment of hypertension, was able to activate wild-type CFTR and mutated forms and to cause a membrane relocation of the delF508-protein. CFTR thus restores its trans-membrane transport capacity.
  • the invention therefore aims to provide a new use of these derivatives to manufacture drugs for the treatment of cystic fibrosis and diseases related to a defective targeting of proteins in cells, in particular as indicated above.
  • the derivatives used in accordance with the invention correspond to formula (I):
  • R H or Cl and the phenyl group comprises at least two substituents, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • guanabenz as used in the specification and claims, corresponds to the compound of formula (II):
  • the active ingredients used in therapeutically effective amounts, are mixed with the pharmaceutically acceptable carriers for the chosen mode of administration.
  • These vehicles can be solid or liquid.
  • the drugs are, in the form of capsules, tablets, dragees, capsules, pills, drops, syrups and the like. Such drugs may contain from 1 to 100 mg of active ingredient per unit.
  • the drugs are in the form of sterile or sterilizable solutions.
  • They can also be in the form of emulsions or suspensions.
  • the medicaments of the invention are more particularly administered in the form of aerosols.
  • the doses per unit dose may vary from 1 to 50 mg of active ingredient.
  • the daily dosage is chosen so as to obtain a final concentration of not more than 100 ⁇ M guanabenz derivative in the blood of the treated patient.
  • Other features and advantages of the invention are given in the results reported below to illustrate the invention.
  • FIGS. 1 and 2 represent, respectively: FIGS. 1A and 1B: the activation of delF508-CFTR in CF15 cells after treatment with guanabenz;
  • Figure 2A the dose-response relationship observed with a 2 hour treatment with guanabenz;
  • FIG. 2B the pharmacological profile of CFTR channels in CF15 cells after 2 hours of incubation with guanabenz.
  • CHO-WT Cells CHO (Chinese Hamster Ovary) cells are fibroblasts that have been transfected with the wild-type CFTR gene (CFTR-WT). These cells will therefore overexpress the CFTR protein.
  • CF15 cells CF15 cells are human nasal epithelial cells that express the ⁇ F508-CFTR gene.
  • Culture medium Medium DMEM + HAM F12 + 10% FCS + 0.6% penicillin / streptomycin + growth factors (insulin 5 ⁇ g / ml, transferrin 5 ⁇ g / ml, epinephrine 5.5 ⁇ M, adenine 0.18 mM, EGF 10 ng / ml, T3 2 nM, hydrocortisone 1, 1 ⁇ M).
  • Calu-3 Cells Calu-3 cells are human lung epithelial cells that express the wild-type CFTR gene.
  • Culture medium DMEM / F12 medium with glutamax + 7% fetal calf serum + 1% penicillin / streptomycin. M2. immunostaining
  • Immunolabeling allows to visualize the cellular localization of the CFTR protein by means of a primary anti-CFTR antibody (Ac), then a Cy3 fluorophore-labeled primary anti-body secondary antibody.
  • the cells are first seeded on slides in appropriate culture medium. 3 washings with TBS (NaCl: 157 mM, Tris base: 20 ⁇ M, pH 7.4) of 5 min each are carried out. The cells are then fixed by adding TBS-paraformaldehyde (3%) for 20 min.
  • the slats can be mounted on the slide after the last 3 washes with TBS of 5 min. Slides are observed under a confocal microscope (Bio-Rad) by laser excitation at appropriate wavelengths. In order to differentiate the labeling between Cy3 and Topro3 the fluorescence color of Topro3 has been changed to blue (color of the nuclei). M3. Efflux of radiotracers
  • the cells are cultured on 24-well plates in a suitable medium.
  • 2 rinses with efflux medium NaCl: 136.6 mM, KCl: 5.4 mM, KH 2 PO 4 : 0.3 mM, NaH 2 PO 4 : 0.3 mM, NaHCO 3 : 4.2 mM
  • efflux medium NaCl: 136.6 mM, KCl: 5.4 mM
  • KH 2 PO 4 0.3 mM
  • NaH 2 PO 4 0.3 mM
  • NaH 2 PO 4 0.3 mM
  • NaHCO 3 NaHCO 3
  • CaCl 2 1.3 mM
  • MgCl 2 0.5 mM
  • MgSO 4 0.4 mM
  • HEPES 10 mM
  • D-glucose 5.6 mM
  • the cells are incubated with 500 ⁇ l of loading (1 ⁇ Ci / ml of 125 INa) for 30 min for CHO-WT or 1 hour for CF15 and Calu-3. Iodide equilibrates on both sides of the cell membrane.
  • the robot (MultiPROBE, Packard) performs the following steps: the loading medium is rinsed with medium • efflux to remove extracellular radioactivity. The supernatant is collected every minute in hemolysis tubes and the medium is replaced by an equivalent volume
  • R radioactive iodide
  • HiIrT 1 [In ( 125 I t x ) -In ( 125 I t 2 )] / (t-t 2 ) with 125 I ti: cpm at time ti; 125 I t 2 : cpm at time t 2 .
  • This iodide stream is represented as a curve.
  • M4 Cytotoxicity test The MTT toxicity test is a colorimetric test based on the ability of mitochondrial dehydrogenases to metabolize MTT (yellow tetrazolium salt) to formazan.
  • the absorbance proportional to the converted dye concentration, can then be measured spectrophotometrically.
  • the cells are incubated on 96-well plates in the presence of the agent to be tested for 2 hours. 3 controls are performed: 100% living cells: cells without agents; 0% living cells: cells left in the open air; white: medium without cell.
  • the cells are rinsed with RPMI medium without phenol red so that the color of the medium does not interfere with the absorbance measurements. They are then incubated for 4 h with 100 ⁇ l of RPMI solution supplemented with MTT (0.5 mg / ml). The medium is then removed, the addition of 100 .mu.l of DMSO makes it possible to solubilize the converted dye (formazan).
  • the delF508-CFTR protein addressing study is carried out by combining pharmacology, cell imaging, biochemical and electrophysiological assays on pulmonary human epithelial CF15 cells homozygous for delF508 deletion.
  • FIG. 1 the results of the activation of delF508-CFTR in CF15 cells after treatment with guanabenz are reported (the results concerning an anti-prion compound, namely 6AP (for 6-amino-phenanthridine) are also given ).
  • the iodide efflux experiments are carried out after 2 h of incubation with 100 .mu.m of the test compound or in the absence of this compound.
  • CF 15 cells, treated for 24 h at 27 ° C. were used as a positive control and untreated CF15 cells as a negative control (37 ° C.).
  • Figure 2A Dose-response results after 2 h of guanabenz treatment are reported in Figure 2A.
  • Figure 2B shows the pharmacological profile of CFTR channels in CF15 cells after 2 h of incubation with 100 ⁇ M guanabenz.
  • the work carried out has shown that a treatment of CF15 cells (F508del / F508del) with guanabenz makes it possible to relocate the mutated F508del-CFTR protein to the membrane.
  • guanabenz allows the re-addressing of the F508del-CFTR protein after 2 h of treatment with a 40 ⁇ M EC 50 .
  • these experiments revealed a competition between guanabenz and MG132, a proteasome inhibitor, and between guanabenz and swainsonine, a mannosidase inhibitor.
  • guanabenz allows the relocation of F508del-CFTR protein by inhibition of degradation pathway and / or that it is possible to modulate the glycosylation state of the protein inhibiting its interaction with chaperones of the endosplasmic reticulum (ER).
  • Glyposylation Inhibitors Calnexin Inhibitors ole ⁇ g ⁇ ⁇ 0 - - - -
  • a solution for inhalation with a bulb nebulizer is prepared from sodium chloride, dehydrated calcium chloride and water for injections.
  • Guanabenz, or a guanabenz derivative is added as an active ingredient.
  • the solution is formulated in ampoules of 2,5mL. Ampoules containing 5, 10 or 20 mg of guanabenz or guanabenz derivatives are thus prepared.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation du guanabenz et de ses dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, ces dérivés répondant à la formule (I) : (I) dans laquelle R = H ou Cl et le groupe phényle comporte aux moins deux substituants, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ces dérivés.

Description

"UTILISATION DU GUANABENZ ET DE SES DERIVES POUR LA
FABRICATION DE MEDICAMENTS POUR LE TRAITEMENT DE LA
MUCOVISCIDOSE ET DE MALADIES LIEES A UN DEFAUT D'ADRESSAGE DES
PROTEINES DANS LES CELLULES"
L'invention vise l'utilisation du guanabenz et de dérivés du guanabenz pour fabriquer des médicaments capables de restaurer l'adressage de 'protéines du réticulum endoplasmique vers les membranes plasmiques .
Il existe un grand nombre de situations pathologiques humaines dans lesquelles un défaut d'adressage est à l'origine d'une altération de la localisation des protéines, et donc de la composition membranaire et de' la fonction cellulaire. Ces maladies comprennent la mucoviscidose, 1 ' hyperinsulinémie hypoglycémiante chez l'enfant, des pathologies neuro- dégénératives comme la maladie de Parkinson, l'emphysème héréditaire, le syndrome congénital du QT long.
Un ré-adressage des protéines impliquées constitue donc un moyen thérapeutique pour ces pathologies .
L'organisation fonctionnelle de la cellule eucaryote repose sur un système élaboré de compartiments membranaires ou organites (noyau, réticulum endoblastiques, appareil de Golgi, endosomes) possédant leur propre composition protéique et lipidique. L'adressage des protéines dans la cellule constitue un ensemble de mécanismes moléculaires permettant d'assurer, au cours de la synthèse protéique, le bon repliement, la maturation et la localisation des protéines fonctionnelles.
La mucoviscidose (CF : Cystic Flbrosis) est la maladie génétique récessive, autosomique, létale la plus répandue dans les populations européennes et nord américaines. Le gène CF (locus 7q31) code pour la protéine trans-membranaire nommée CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) . Cette protéine est un canal chlorure localisé dans la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales pulmonaires et digestives chez les individus sains. Bien qu'il existe plus de 1000 mutations de la protéine CFTR, la mutation la plus fréquente (70 % des patients) est la délétion d'une phénylalanine dans le domaine NBFl en position 508 (delF508) .
Chez les patients CF, cette protéine est absente des membranes plasmiques du fait d'un adressage défectueux de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE) , puis dégradée par le système ubiquitine/protéasome . Chez ces patients, les cellules dont la protéine CFTR est mutée en delF508 ne sont plus fonctionnelles. Physiologiquement, CFTR est responsable du transport trans-épithélial d'eau et d'électrolytes, et permet chez un individu sain, l'hydratation des voies aériennes pulmonaires, le bon fonctionnement sécrétoire digestif et des glandes exocrines en général. Une des clés pour un traitement de cette maladie, et de manière générale de toute pathologie liée à de tels problèmes d'adressage, consiste en un ré-adressage de la protéine CFTR delF508 vers la membrane apicale des cellules. Une fois à la membrane, l'activité de transport de CFTR delF508 peut être stimulée par des agonistes physiologiques.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le guanabenz, utilisé depuis longtemps en clinique pour le traitement de l'hypertension, était capable d'activer le CFTR sauvage et des formes mutées et de provoquer une relocalisation membranaire de la protéine delF508-CFTR restaurant ainsi sa capacité de transport trans-membranaire .
Cette propriété a également été mise en évidence avec les dérivés du guanabenz. De manière générale, ces composés sont capables de restaurer un défaut d'adressage des protéines dans les cellules.
De plus, ils présentent l'intérêt d'une innocuité élevée. L'invention à donc pour but de fournir une nouvelle utilisation de ces dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, en particulier telles qu'indiquées plus haut. Les dérivés utilisés conformément à l'invention répondent à la formule (I) :
dans laquelle R = H ou Cl et le groupe phényle 'comporte aux moins deux substituants, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ces dérivés .
Ces dérivés sont capables de restaurer l'adressage de la protéine CFTR vers les membranes plasmiques des cellules et constituent donc des composés de grand intérêt pour le traitement de pathologies liées à de tels problèmes de défaut d'adressage. Parmi les maladies concernées, on citera, outre la mucoviscidose, l ' hyperinsulinémie hypoglycémiante chez l'enfant, des pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson, l'emphysème héréditaire, le syndrome congénital du QT long.
Comme illustré par les exemples, ils sont particulièrement efficaces pour provoquer la re-localisation de la protéine delF508-CFTR dans la mucoviscidose où cette protéine est retenue dans le réticulum endoplasmique, et de restaurer ainsi, sa capacité de transfert trans-membranaire .
L'invention vise en particulier l'utilisation du guanabenz et de ses sels. Le terme "guanabenz", tel qu'utilisé dans la description et les revendications, correspond au composé de formule (II) :
ou à un de ses sels , en particulier, l ' acétate de formule ( III ) :
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la molécule utilisée répond à la formule (IV)
ou à un sel pharmaceutiquement acceptable.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ces véhicules peuvent être solides ou liquides.
Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments sont, préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, sirops et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire) , les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables .
Ils peuvent être également sous forme d' émulsions ou de suspensions .
Les médicaments de l'invention sont plus particulièrement administrés sous forme d'aérosols.
Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 μM en dérivé de guanabenz dans le sang du patient traité. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les résultats rapportés ci-après afin d'illustrer 1 ' invention.
Il y est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent, respectivement : - les figure IA et IB : l'activation de delF508-CFTR dans des cellules CF15 après traitement par du guanabenz ; la figure 2A : la relation dose-réponse observée avec un traitement de 2 h avec le guanabenz ; et la figure 2B : le profil pharmacologique des canaux CFTR dans des cellules CF15 après 2 h d'incubation avec du guanabenz.
MATERIEL ET METHODES Ml. Culture cellulaire
Cellules CHO-WT : Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) sont des fibroblastes qui ont été transfectés avec le gène du CFTR sauvage (CFTR-WT) . Ces cellules vont donc surexprimer la protéine CFTR.
Milieu de culture : Milieu MEM alpha (GIBCO) + 7 % de sérum de veau fœtal + 0,5 % de pénicilline/streptomycine + 100 μM de méthotrexate (améthoptérine, Sigma) . Cellules CF15 : Les cellules CF15 sont des cellules épithéliales humaines d'origine nasale qui expriment le gène ΔF508-CFTR.
Milieu de culture : Milieu DMEM + HAM F12 + 10 % de FCS + 0,6 % de pénicilline/streptomycine + facteurs de croissance (insuline 5 μg/ml, transferrine 5 μg/ml, épinéphrine 5,5 μM, adénine 0,18 mM, EGF 10 ng/ml, T3 2 nM, hydrocortisone 1,1 μM) . Cellules Calu-3 : Les cellules Calu-3 sont des cellules épithéliales humaines d'origine pulmonaire qui expriment le gène du CFTR sauvage.
Milieu de culture : Milieu DMEM/F12 avec glutamax + 7 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline/streptomycine. M2. Immunomarquage
L ' immunomarquage permet de visualiser la localisation cellulaire de la protéine CFTR grâce à un anticorps (Ac) primaire anti-CFTR, puis un anticorps secondaire antianticorps primaire marqué au fluorophore Cy3. Les cellules sont préalablement ensemencées sur des lamelles dans du milieu de culture approprié. 3 lavages au TBS (NaCl : 157 mM, Tris base : 20 μM, pH 7,4) de 5 min chacun sont effectués. Les cellules sont alors fixées par ajout de TBS-paraformaldéhyde (3 %) pendant 20 min. Après 3 lavages au TBS (5 min) , les cellules sont incubées avec du TBS-Triton 0,1 % (10 min) qui permet la formation de trous dans la membrane cellulaire, puis 3 lavages au TBS sont à nouveau effectués avant la mise en présence des cellules avec le TBS- BSA 0,5 %-saponine 0,05 % pendant 1 h. Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-C terminal CFTR (2 μg/ml) pendant 1 h. Trois lavages au TBS-BSA-saponine de 5 min chacun sont réalisés avant l'incubation avec l'anticorps secondaire GAM-cy3 (1/400) pendant 1 h. Suite à 2 lavages au TBS de 5 min, les noyaux sont marqués par incubation au Topro3 (1/1000) pendant 5 min. Enfin, les lamelles peuvent être montées sur lame après 3 derniers lavages au TBS de 5 min. Les lames sont observées au microscope confocal (Bio-Rad) grâce à une excitation au laser aux longueurs d'onde appropriées. Afin de différencier le marquage entre Cy3 et Topro3 la couleur de fluorescence de Topro3 a été changée en bleu (couleur des noyaux) . M3. Efflux de radiotraceurs
Les mesures de transport d'ions chlorure dans les cellules ont été réalisées à l'aide de la technique des efflux d'iodure radioactif (Becq et al., 1999 ; Donner et al., 2001). Le traceur (125I) est incorporé dans le milieu intracellulaire. Puis, la quantité de radiotraceur qui sort de la cellule est comptée après l'ajout de différents agents pharmacologiques . L'iodure est utilisé comme un traceur du transport d'ions chlorure. 125I a de plus l'avantage d'avoir une courte durée de vie comparée à celle d'autres marqueurs comme 35Cl (1/2 vie respective : 30 jours et 300 000 ans) .
Les cellules sont mises en culture sur des plaques 24 puits dans un milieu adéquat. 2 rinçages avec du milieu d' efflux (NaCl : 136,6 mM, KCl : 5,4 mM, KH2PO4 : 0,3 mM, NaH2PO4 : 0,3 mM, NaHCO3 : 4,2 mM, CaCl2 : 1,3 mM, MgCl2 : 0,5 mM, MgSO4 : 0,4 mM, HEPES : 10 mM, D-glucose : 5,6 mM) sont effectués afin d'éliminer les cellules mortes qui relarguent la radioactivité de façon anarchique. Puis, les cellules sont mises à incuber avec 500 μl de charge (1 μCi/ml de 125INa) pendant 30 min pour les CHO-WT ou 1 h pour les CF15 et Calu-3. L'iodure s'équilibre de part et d'autre de la membrane cellulaire. Le robot (MultiPROBE, Packard) réalise les étapes suivantes : le milieu de charge est rincé avec du • milieu d' efflux pour éliminer la radioactivité extracellulaire. Le surnageant est collecté toutes les minutes dans des tubes à hémolyse et le milieu est remplacé par un volume équivalent
(500 μl) . Les prélèvements des 3 premières minutes ne subissent pas l'addition de drogue, ils permettent d'obtenir une ligne de base stable, caractérisant la sortie passive des ions I. Les 7 prélèvements suivants sont obtenus en présence de la molécule à tester. A la fin de l'expérience, les cellules sont lysées par ajout de 500 μl de NaOH (0,1 N) /0,1 % SDS (30 min), ainsi, la radioactivité restée à l'intérieur de la cellule peut être déterminée. La radioactivité présente dans les tubes à hémolyse est comptée en coups par minute (cpm) grâce à un compteur gamma (Cobra II, Packard) . Les résultats en cpm sont exprimés sous forme de vitesse de sortie d'iodure radioactif (R) d'après la formule suivante : R (HiIrT1) = [In (125I tx) -In (125I t2) ] / (tχ-t2) avec 125I ti : cpm au temps ti ; 125I t2 : cpm au temps t2. Ce flux d'iodure est représenté sous forme de courbe. Afin de quantifier la sortie d'iodure due à l'administration de la molécule testée, on calcule le flux relatif suivant qui permet de s'affranchir du flux de base : Vitesse relative (min"1) =Rpic-Rbasal . Enfin, ces résultats sont normalisés pour pouvoir comparer l'effet des différentes drogues entre elles. Les résultats sont présentés sous la forme de moyenne +/- SEM. Le test statistique de Student est utilisé pour comparer l'effet des drogues aux contrôles (les valeurs correspondantes à P < 0,01 sont considérées comme statistiquement significatives) . M4. Test de cytotoxicité Le test de toxicité au MTT est un test colorimétrique qui repose sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales à métaboliser le MTT (sel de tétrazolium jaune) en formazan
(pourpre). L' absorbance, proportionnelle à la concentration de colorant converti, peut être alors mesurée par spectrophotométrie . Les cellules sont mises à incuber sur des plaques 96 puits en présence de l'agent à tester pendant 2 h. 3 contrôles sont réalisés : 100 % cellules vivantes : cellules sans agent ; 0 % cellules vivantes : cellules laissées à l'air libre ; blanc : milieu sans cellule. Les cellules sont rincées avec du milieu RPMI sans rouge de phénol pour que la couleur du milieu n'interfère pas dans les mesures de 1 ' absorbance . Puis, elles sont incubées pendant 4 h avec 100 μl de solution de RPMI supplémentée en MTT (0,5 mg/ml) . Le milieu est alors éliminé, l'ajout de 100 μl de DMSO permet de solubiliser le colorant converti (formazan). L 'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm (pourpre) ; 630 nm (bruit de fond) . Afin de s ' affranchir du bruit de fond, le calcul suivant est effectué : DOréeiie=DO570nm-Dθ630nm- Puis, les résultats sont normalisés par rapport aux contrôles (100 % et 0 % de cellules vivantes) et sont présentés sous forme de moyenne +/- SEM.
RESULTATS
Rl. Effet du guanabenz sur l'adressage de delF508 dans les cellules CF15 L'étude de l'adressage de la protéine delF508-CFTR est réalisée en combinant des approches de pharmacologie, d'imagerie cellulaire, des tests biochimiques et électrophysiologiques sur des cellules CF15 épithéliales humaines pulmonaires homozygotes pour la délétion delF508.
Pour chaque expérience, l'addition de Forskoline (fsk) 1 μM permet l'activation du CFTR quand celui-ci est lié à la membrane. Ainsi un efflux d' iodure pourra être observé si l'adressage de delF508 a été restauré. Les résultats, présentés sous forme d'histogramme ont été normalisés par rapport à un traitement de référence (traitement des cellules au MPB-91 250 μM pendant 2 h) pour lequel on considère qu'on a 100 % d'activité CFTR.
Sur la figure 1, on rapporte les résultats de l'activation de delF508-CFTR dans des cellules CF15 après traitement par du guanabenz (les résultats concernant un composé anti-prion, à savoir 6AP (pour 6-amino-phénanthridine) sont également donnés). Les expériences d' efflux d' iodure sont réalisées après 2 h d'incubation avec 100 μm du composé à tester ou en l'absence de ce composé. Les cellules CF 15, traitées 24 h à 270C, ont été utilisées comme contrôle positif et les cellules CF15 non traitées comme contrôle négatif (37°C) .
Les résultats dose-réponse après 2 h de traitement par du guanabenz sont rapportés sur la figure 2A. La figure 2B donne le profil pharmacologique de canaux CFTR dans des cellules CF15 après 2 h d'incubation avec 100 μM de guanabenz.
Les travaux réalisés ont montré qu'un traitement des cellules CF15 (F508del/F508del) par le guanabenz permet de réadressage de la protéine mutée F508del-CFTR à la membrane.
Des expériences d' efflux d' iodure ont montré que le guanabenz permet le ré-adressage de la protéine F508del-CFTR après 2 h de traitement avec une EC5O de 40μM. De plus, ces expériences ont révélé une compétition entre le guanabenz et le MG132, un inhibiteur du protéasome ainsi qu'entre le guanabenz et la swainsonine, un inhibiteur de mannosidase. Il ressort de ces résultats que le guanabenz permet le réadressage de la protéine F508del-CFTR par l'inhibition de la voie de dégradation et/ou qu'il est possible de moduler l'état de glycosylation de la protéine inhibant son interaction avec les chaperonnes du réticulum endosplasmique (RE) .
Le tableau qui suit donne un résumé d'expériences de compétition réalisées par la technique d' efflux d' iodure entre le guanabenz et la machinerie chaperone du RE.
Potentialisation J1 J. A ± ± i ^ U • <* , J. J. de l' effet de la guanabenz y y 1^v" '.
Inhibiteurs de glyposylation Inhibiteurs de calnexine ole ^^g^'0" ^- '
On constate une inhibition de l'effet du guanabenz par la Brefeldine-A (BFA) , inhibiteur du trafic ERGIC vésiculaire, ce qui montre que le guanabenz induit un ré-adressage de delF508-CFTR.
Aucune modulation de l'effet du guanabenz n'est observée en présence de MG132, inhibiteur du protéasome, révélant une compétition entre le guanabenz et MG132. Une faible potentialisation de l'effet du guanabenz est observée en présence de swainsonine, un inhibiteur de mannosidase, ce qui montre une action potentielle du guanabenz sur le glycosylation du CFTR.
Exemple de formulation : On prépare une solution pour inhalation avec un nébuliseur ampoule à partir de chlorure de sodium, de chlorure de calcium déshydraté et d'eau pour préparations injectables.
Le guanabenz, ou un dérivé de guanabenz est ajouté comme ingrédient actif. La solution est formulée dans des ampoules de 2,5mL. Des ampoules renfermant 5, 10 ou 20 mg de guanabenz ou de dérivés de guanabenz sont ainsi préparées. BIBLIOGRAPHIE
BECQ et al. (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27415-27425. DORMER et al. (2001) Journal of CeIl Science 114, 4073- 4081.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Utilisation du guanabenz et de ses dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, ces dérivés répondant à la formule (I) :
dans laquelle R = H ou Cl et le groupe phényle comporte aux moins deux substituants, ou un sel pharmaceutiquement acceptable de ces dérivés.
2/ Utilisation selon la revendication 1, du guanabenz de formule (II) :
3/ Utilisation selon la revendication 1 d'un sel de guanabenz, en particulier de l'acétate de formule (III) :
4/ Utilisation selon la revendication 1 d'une molécule de formule (IV) :
ou d'un sel pharmaceutiquement acceptable.
5/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose . β/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous formes de gélules, comprimés, dragées ou capsules . 7/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.
8/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous forme d'aérosol.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1908465B1 (fr) * 2006-10-04 2009-04-29 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Utilisation de dérivées chlores du guanabenz dans le traitement des maladies à prions
US20100196286A1 (en) * 2008-12-01 2010-08-05 Armer Thomas A Inhalation delivery methods and devices
RU2712452C2 (ru) * 2014-07-02 2020-01-29 Инфлектис Байосайенс Новое терапевтическое применение производных бензилиденгуанидина для лечения протеинопатий
MX379437B (es) 2015-04-08 2025-03-10 Res & Innovation Uk Derivados de hidrazina-bencilo sustituidos, como inhibidores de ppp1r15a y ppp1r15b, y el uso de los mismos para el tratamiento de trastorno de proteostasis.
US20210177814A1 (en) 2018-05-09 2021-06-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of guanabenz or derivates thereof for the treatment of type i ifn-dependent pathologies

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1223492A (en) * 1967-10-13 1971-02-24 American Home Prod Guanidines
US4847300A (en) * 1986-11-07 1989-07-11 Yale University Use of alpha-2I selective adrenergic receptor agonists in memory enhancement
US6413962B1 (en) * 1988-05-02 2002-07-02 N. Eric Naftchi Guanidino compounds effective as anesthetics
US5665739A (en) * 1992-12-15 1997-09-09 Hoechst Aktiengesellschaft Substituted benzoylguanidines, process and their preparation, their use as pharmaceutical or diagnostic, and pharmaceutical containing them
DE19933879A1 (de) 1999-07-22 2001-02-15 Hohe Gmbh & Co Kg Rückspiegel mit schwenkbar gelagerten Teilspiegeln
EP1908464A1 (fr) * 2006-10-04 2008-04-09 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Utilisation de dérivés de chlorine guanabenz pour le traitement de maladies à expansion de polyglutamine

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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