EP1949110A2 - Procedes de diagnostic de maladies hepatiques et de criblage de molecules pour le traitement de ces maladies - Google Patents

Procedes de diagnostic de maladies hepatiques et de criblage de molecules pour le traitement de ces maladies

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Publication number
EP1949110A2
EP1949110A2 EP06831103A EP06831103A EP1949110A2 EP 1949110 A2 EP1949110 A2 EP 1949110A2 EP 06831103 A EP06831103 A EP 06831103A EP 06831103 A EP06831103 A EP 06831103A EP 1949110 A2 EP1949110 A2 EP 1949110A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
apo
blood
liver
tissues
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06831103A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Casellas
Hubert Vidal
Isabelle Buisson
Jean Marchand
Dominique Simon
Sylvaine Galiegue
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi Aventis France
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis France filed Critical Sanofi Aventis France
Publication of EP1949110A2 publication Critical patent/EP1949110A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides

Definitions

  • the present application relates to a method for diagnosing liver diseases. It also relates to a method for screening molecules for the treatment of these diseases.
  • Apolipoprotein A4 (Apo A4) is an abundant circulating apolipoprotein.
  • the Apo A4 has multiple functions. It regulates lipid transport and metabolism through various mechanisms such as activation of cholesterol fluxes from liver tissue and stimulation of lipoprotein iipase activity (Stan et al., Biochim Biophys acta, 1631). 2003, 177-187).
  • the Apo A4 is also known to be a factor of satiety.
  • Hepatic diseases are a major public health problem. It is therefore essential to diagnose all liver diseases as early as possible, using specific and sensitive assays.
  • the Applicant has surprisingly demonstrated that Apo A4 is expressed in the liver in humans and that the level of hepatic expression of the gene encoding Apo A4 is significantly increased in liver diseases.
  • the present invention relates to a method for detecting, diagnosing or prognosing liver disease comprising measuring the expression of Apo A4 in liver cells or tissues or extracts from such cells and tissues, or in blood and its derivatives.
  • the object of the present invention is to measure the expression of Apo A4 not only in liver cells or tissues but also in the blood, in which is found Apo A4 of hepatic origin.
  • Such a method may include the steps of:
  • liver diseases any disease affecting the tissues and liver cells, whether chronic or etiological (alcoholic, viral, toxic, food, environmental ).
  • the subject of the present invention is a method for the detection, diagnosis or prognosis of steatohepatitis, carcinogenesis of the liver, cirrhosis, viral hepatitis, hepatocellular insufficiency, cholestasis, portal hypertension, steatosis and steatohepatitis, vein and hepatic artery disease, fibrosis, obesity, and metabolic syndromes.
  • blood derivative is understood to mean any cellular or acellular fraction derived from the blood by physical (for example by centrifugation), biological (for example by coagulation) or chemical treatment or by any other treatment making it possible to obtain such derivatives.
  • such derivatives are plasma and serum.
  • said method comprises measuring the amount of messenger RNA (mRNA) transcribed from the gene or genes encoding Apo A4 in the cells or liver tissues of an individual in which one wishes to diagnose or prognose liver disease.
  • the liver cells or tissues or in the blood and its derivatives of said mammal are removed and treated by methods known to those skilled in the art, in particular to avoid the degradation of messenger RNAs and proteins and the amount of transcribed messenger RNA. by the gene (s) encoding Apo A4 is measured.
  • the amount of transcribed messenger RNA is measured by amplification according to the so-called quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR) or QPCR method.
  • PCR quantitative Polymerase Chain Reaction
  • the total RNAs are extracted and purified and the messenger RNAs contained in the extract are converted firstly into DNAs. (cDNA), using reverse transcriptase.
  • the polymerase preferably used in the present invention is Taq polymerase, but it can be any other enzyme having a polymerase activity and usable under the operating conditions of the PCR. Due to its properties, this enzyme allows a doubling of the amount of initial DNA at each synthesis cycle.
  • cDNAs derived from the mRNAs contained in the biological sample is performed by quantitative PCR in real time.
  • the cDNAs are amplified using primers and probes specific for the sequence of the Apo A4, according to a method which essentially comprises a repetition of the cycle comprising the following steps:
  • the sense and antisense primers comprise at least 15 nucleotides and have an identity of at least 80%, preferably 90%, and still more preferably 95% with the sequence of the human Apo A4, corresponding to the sequence SEQ ID N ° 13 (Gene bank No. NM 000482), or with its complementary sequence.
  • the product of the reaction, or amplimer is detected using a probe, consisting of an oligonucleotide comprising at least 15 nucleotides and having an identity of at least 80%, preferentially 90%, and even more preferably 95% with the sequence of the human Apo A4, corresponding to the sequence SEQ ID No. 13 (Gene bank No. NM 000482), or with its complementary sequence.
  • a probe consisting of an oligonucleotide comprising at least 15 nucleotides and having an identity of at least 80%, preferentially 90%, and even more preferably 95% with the sequence of the human Apo A4, corresponding to the sequence SEQ ID No. 13 (Gene bank No. NM 000482), or with its complementary sequence.
  • the two primers are respectively selected on the sense and antisense strands, and so as to allow the amplification of a DNA fragment.
  • the probe is in turn targeted so as to hybridize with the DNA fragment resulting from the amplification delimited by the position of the two primers.
  • the probe has a theoretical melting temperature Tm greater than about 10 0 C + 0.5 to the theoretical Tm of the primers.
  • said oligonucleotides (primers and probe) comprise between 15 and 25 nucleotides.
  • the primers used for the amplification of the gene encoding human Apo A4 preferentially present the sequences
  • SEQ ID No. 1 gcagctggctccctatgct and SEQ ID No. 2: ggaaggtcaggccctcaag.
  • the probe preferably has the sequence SEQ ID No. 3: cacgcaggagaag ctcaaccacca.
  • the probe comprises a molecule or a system of developer molecules.
  • the developer system is preferably a reporter dye and a fluorescent quencher dye, respectively attached to the 5 'and 3' ends of the probe.
  • the developer system is constituted by the "reporter / quencher” pair represented by 6-carboxyfluorescein (FAM) and 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) respectively fixed at 5 'and 3' of the probe. .
  • the quantification of the number of targets initially set in the reaction is very reliable and reproducible. Detection of the PCR product is done during PCR cycles using a fluorescent probe. This is necessary to detect the PCR product and takes place in full exponential phase of PCR and not in end point; this detection principle is therefore more sensitive and more specific.
  • Another advantage of the QPCR lies in the fact that nonspecific amplifications are avoided, thanks to the principle of "hot start", real-time PCR being performed in the presence of a thermostable DNA polymerase activating at the first denaturation.
  • the method according to the present invention comprises measuring the amount of protein or fragments of the Apo A4 protein expressed in the liver cells or tissues or in the blood and its derivatives. Particularly advantageously the amount of protein or fragments of the protein Apo A4 is measured using at least one antibody specific for this protein.
  • These antibodies can be obtained by a method of injecting animals, such as rodents, with an emulsion of the purified human Apo A4 protein or a peptide sequence of Apo A4 of about 20 amino acids, optionally in the presence of an adjuvant such as Freund's adjuvant. Injections are repeated and the antiserum is harvested.
  • animals such as rodents
  • an adjuvant such as Freund's adjuvant
  • the measurement of the binding between these antibodies and the Apo A4 expressed in the liver cells or tissues or in the blood and its derivatives of the individuals in whom it is desired to quantify the hepatic Apo A4 can be carried out by any suitable means.
  • it can be done by the ELISA technique (abbreviation for Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) and even more preferably by a so-called "Sandwich” method.
  • the so-called "Sandwich” method uses two antibodies: a first capture antibody is bound to a solid phase such as a microplate, a second detection antibody makes it possible to quantify the protein.
  • the detection antibodies are coupled with a peroxidase.
  • the antibodies bound to the Apo A4 protein are isolated from the unbound antibodies and placed in the presence of a peroxidase substrate, preferentially the O-phenylenediamine dihydrochloride.
  • a peroxidase substrate preferentially the O-phenylenediamine dihydrochloride.
  • the colorimetric reaction makes it possible to quantify the number of bound antibodies and therefore the amount of bound protein. This colorimetric reaction is measured using a suitable apparatus, for example by measuring the optical density.
  • An amplification of the reaction can be carried out using at least two antibodies, on the one hand anti-Apo A4 antibodies not coupled to peroxidase and on the other hand peroxidase-coupled antibodies recognizing the first antibodies.
  • another anti-Apo A4 antibody can be used to fix the antibody-Apo A4 complexes on a support thus facilitating the isolation of the complexes and the separation of the non-fixed antibodies.
  • the binding between these antibodies and Apo A4 can also be measured using antibodies labeled with a radioactive isotope.
  • the antibodies bound to the Apo A4 protein are isolated and the radioactivity of the antibody-Apo A4 complexes is measured using a measuring device adapted to the isotope used.
  • the present invention further relates to a method for screening compounds for the prevention or treatment of liver diseases comprising the steps of:
  • the mammal in cells or blood from which the measurement of Apo A4 expression can be made is any mammal in which Apo A4 is expressed in the liver. It can be advantageously a rodent and preferably a mouse.
  • animal lines with a natural tendency to obesity are used.
  • C57BI / 6J is preferably used.
  • the measurement of the expression of Apo A4 can be carried out by measuring the amount of Apo A4 expressed in the liver cells or tissues or in the blood and its derivatives of said mammal or by measuring the amount of RNA messenger transcribed by the gene or genes encoding Apo A4 expressed in cells or tissues hepatic of said mammal, as indicated above.
  • a piece of liver (75-130 mg) was collected in 2 ml tubes containing 1.5 ml of RNA Later (Ambiom).
  • liver and the plasma were stored at -20 ° C. for the assay of the mRNAs and the Apo A4 protein.
  • cDNA analysis performed by quantitative PCR in real time. The relative expressions of the gene are given in% relative to an invariant internal reference gene, such as beta2-microglobulin or 18S ribosomal RNA.
  • tissue lysates 80 mg of mouse liver are excised and immediately immersed in 2 ml of RNAlater in order to preserve the integrity of 1 RNA before any manipulation.
  • the piece of liver is transferred dry in an Eppendorf tube into which 2 ml of lysis buffer (RNAtotal extraction kit, RNeasy Midi Kit marketed by QIAGEN) and 2 steel balls (diameter, 3 mm) are added.
  • Tissue lysis is performed with Tissuelyser (marketed by QIAGEN) by stirring for 5 min at 30HZ. At this stage, the lysates can be stored at -20 ° C.
  • the lysates are centrifuged for 3 min at 14000xg and filtered on QIAshredder
  • RNA concentration is obtained by measuring the optical density (OD) at 260 nm.
  • the cDNA is synthesized using the Superscipt III reverse transcription kit (marketed by INVITROGEN). The cDNA obtained is recovered in 20 .mu.l of final volume.
  • the sequences of the primers and probes used for the amplification of the gene encoding human and mouse Apo A4 and beta2-m are shown in Table VII (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12).
  • the gene amplification reaction is carried out with temperature cycles (denaturation 95 ° C / 15s then hybridization and synthesis 60 ° C / 1 min) in microplates of 96 or 384 wells. The duration of the analysis is 90 min.
  • the amplification kinetics (amplification signal function of the number of cycles) are analyzed in a linear representation of the exponential phase (software: SDS Enterprise Database).
  • Ct 1 cycle number measured constant amplification signal the Ct is inversely proportional to the amount of messenger RNA present in the original sample.
  • the capture antibody is goat anti-Apo A4 antibody marketed by
  • Anti serum against mouse Apo A4 is obtained from rabbits immunized with a peptide corresponding to the C-terminal sequence (amino acid
  • a peptide emulsion coupled to a carrier protein (KLH) in complete Freund's adjuvant is injected subcutaneously to the animals. Subsequent injections are made with a peptide emulsion coupled in incomplete Freund's adjuvant.
  • KLH carrier protein
  • the antiserum is harvested 10 days after the third booster and the antibody is purified by affinity chromatography on the peptide coupled to a chromatography gel.
  • Table IA shows the tissue distribution of Apo A4 in mice.
  • Apo A4 is expressed in smooth muscle, small intestine, liver, colon, placenta, stomach, ovaries, rectum, adipose tissue ... There is a strong expression in the intestine hail.
  • Table IB confirms strong expression in small bowel and localization of Apo A4 in different regions (duodenum, jejunum, ileum).
  • Table II shows the expression of Apo A4 in liver and plasma and shows that this expression is increased in liver and plasma when comparing normal and obese mice.
  • the cDNAs are prepared from human liver and the measurements performed as described in the previous example for the preparation from mouse liver.
  • Table III shows the tissue distribution of Apo A4 in humans: presence in fundus uterus, esophagus, retina, placenta, epididymis, and adipose tissue.
  • Apo A4 as a potential marker for these conditions is demonstrated by the comparative analysis of Apo A4 from other apolipoprotein classes: Apo A1, Apo A2 and Apo A5 (Tables IV and V-B).
  • Example 3 Measurement of the amount of Apo A4 protein in plasma in humans by sandwich ELISA method
  • the capture antibody is goat anti-Apo A4 antibody marketed by (Santa Cruz Biotechnology, Inc. 21414 Delaware Avenue Santa Cruz, California 95060 U.S.A.).
  • Purified human Apo A4 is obtained from human serum as described by Weinberg RB, Hopkins RA, Jones JB. (Methods Enzymol 1996, 263: 282-96, Purification, isoform characterization, and quantitation of human apolipoprotein A4).
  • Anti serum against human Apo A4 is obtained from rabbits.
  • An h-Apo A4 emulsion purified in complete Freund's adjuvant is injected subcutaneously to the animals. Subsequent injections are made with a purified Apo A4 emulsion in incomplete Freund's adjuvant. The antiserum is harvested 10 days after the third booster.
  • the wells of a 96-well plate are incubated with 100 ⁇ l of goat anti-Apo A4 antibody at 4 ⁇ g / ml in PBS for 4 hours at 20 ° C. After washing with PBS containing 0.1% Tween 20 non-specific binding sites are blocked with PBS buffer containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) for 60 min at room temperature. 100 ⁇ l of plasma samples (dilution in PBS containing 0.1% BSA from 1/3000 to 1/20000) are added and incubated overnight at 4 ° C. After washing, 100 ⁇ l of rabbit anti-human Apo A4 polyclonal serum antibodies (dilution 1/5000 in PBS BSA) are added and incubated for 1 h at room temperature.
  • BSA bovine serum albumin
  • a study focused on obesity was performed by analyzing the expression of apoA4 in the liver of overweight patients. This pathology is correlated with the body mass index (IMC ⁇ Poids in kg / (height in meter) 2 ). Normal weight load corresponds to a BMI ⁇ 25.
  • Experimentally apolipoprotein expression was analyzed by the previously described QPCR technique from a collection of human liver RNA provided by Asterand, Inc. (TechOne Bldg, Suite 501, 440 Burroughs, Str. Ml 48202, US) . Body Mass Index (BMI) is given by Asterand.
  • Table 1B Expression of Apo A4 in Small Intestine Regions (% / Beta2-m, Mean +/- Standard Deviation (4 animals))
  • Table II Expression of 1 mRNA of Apo A4 in the liver and measurement of Apo A4 in plasma of normal (C57 B16) or obese (C57 B16 / obob) mice.
  • Table VB Expression of Apo A1, 2 & 5 Human in Liver Samples.
  • Table VII Sequences of primers and probes for the quantitative PCR assay of beta2-microqlobulin and Apo A4 Human and Mouse.
  • Table VIII Expression of human hepatic apoA4 in overweight patients

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Abstract

La présente demande a pour objet une méthode de diagnostic de maladies hépatiques comprenant la mesure de l'expression de l'apolipoprotéine A4 dans les cellules ou tissus hépatiques et dans la circulation (sang, plasma, sérum). Elle est en outre relative à un procédé de criblage de molécules pour le traitement de ces maladies mise en contact desdits composés avec un mammifère et mesure de l'expression de l'apolipoprotéine A4 dans lesdites cellules d'origine hépatique ou dans la circulation dudit mammifère.

Description

Procédés de diagnostic de maladies hépatiques et de criblage de molécules pour le traitement de ces maladies
La présente demande a pour objet un procédé de diagnostic de maladies hépatiques. Elle a en outre pour objet un procédé de criblage de molécules pour le traitement de ces maladies.
L'apolipoprotéine A4 (Apo A4) est une apolipoprotéine circulante abondante.
L'expression de cette protéine a été mise en évidence chez les rongeurs dans l'hypothalamus, l'intestin grêle et le foie. La majeure partie de l' Apo A4 trouvée dans le plasma chez la souris est considérée comme d'origine intestinale (Wu et al
JBC 254, 7316-7322 1979).
Chez l'homme la synthèse d'Apo A4 a été décrite par Elshourbagy (JBC 262 1987) comme étant limitée au petit intestin.
L'Apo A4 a de multiples fonctions. Elle régule le transport des lipides et le métabolisme par l'intermédiaire de différents mécanismes tels que l'activation des flux de cholestérol à partir de tissus hépatiques et la stimulation de l'activité lipoprotéine iipase (Stan ét al., Biochim Biophys acta, 1631 2003, 177-187).
L'Apo A4 est aussi connue pour être un facteur de satiété.
Les maladies hépatiques constituent un problème majeur de santé publique. Il est donc indispensable de diagnostiquer toutes les maladies hépatiques à un stade aussi précoce que possible, à l'aide de méthodes de dosage spécifiques et sensibles.
La demanderesse a mis en évidence de manière surprenante que l'Apo A4 est exprimée dans le foie chez l'homme et que le niveau d'expression hépatique du gène codant l'Apo A4 est augmenté de manière significative dans les maladies hépatiques.
La présente invention a pour objet une méthode de détection, de diagnostic ou de pronostic d'une maladie hépatique comprenant la mesure de l'expression de l'Apo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques ou des extraits de ces cellules et tissus, ou dans le sang et ses dérivés.
Ainsi la présente invention a pour objet la mesure de l'expression de l'Apo A4 non seulement dans les cellules ou tissus hépatiques mais aussi dans le sang, dans lequel on retrouve l'Apo A4 d'origine hépatique. Une telle méthode peut comprendre les étapes de :
- isolement des cellules, tissus hépatiques ou d'extraits de ces cellules et tissus, ou du sang ou de ses dérivés. et
- mesure de l'expression de l'Apo A4.
De tels extraits peuvent être obtenus par lyse des cellules et tissus hépatiques. On entend par maladies hépatique toute maladie ayant une influence sur les tissus et cellules hépatiques, qu'elle soit chronique ou étiologique (alcoolique, virale, toxique, alimentaire, environnementale...).
Plus particulièrement la présente invention a pour objet une méthode de détection, de diagnostic ou de pronostic des stéatohépatites, des carcinogenèses du foie, des cirrhoses, des hépatites virales, des insuffisances hépatocellulaires, des cholestases, des hypertensions portales, des stéatoses et stéatohépatites, de la maladie de la veine et l'artère hépatique, des fibroses, de l'obésité, et des syndromes métaboliques.
On entend par dérivé du sang toute fraction cellulaire ou acellulaire issue du sang par traitement physique (par exemple par centrifugation), biologique (par exemple par coagulation) ou chimique ou par tout autre traitement permettant l'obtention de tels dérivés.
Préférentiellement de tels dérivés sont le plasma et le sérum. Selon un mode de mise en œuvre préférentiel de l'invention ladite méthode comprend la mesure de la quantité d'ARN messager (ARNm) transcrits à partir du ou des gènes codant l'Apo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques d'un individu chez lequel on souhaite diagnostiquer ou pronostiquer une maladie hépatique. Les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés dudit mammifère sont prélevés et traités par des méthodes connues de l'homme du métier, afin notamment d'éviter la dégradation des ARN messager et des protéines puis la quantité d'ARN messager transcrits par le ou les gènes codant l'Apo A4 est mesurée.
De manière particulièrement avantageuse la quantité d'ARN messager transcrits est mesurée par amplification suivant la méthode dite de Polymerase Chain Reaction (PCR) quantitative ou QPCR. Selon cette technique les ARN totaux sont extraits et purifiés et les ARN messager contenus dans l'extrait sont convertis dans un premier temps en ADNs complémentaires (ADNc), à l'aide d'une transcriptase inverse. La polymérase préférentiellement utilisée dans la présente invention est la Taq polymérase, mais elle peut être toute autre enzyme présentant une activité polymérase et utilisable dans les conditions opératoires de la PCR. De part ses propriétés cet enzyme permet un doublement de la quantité d'ADN initial à chaque cycle de synthèse.
L'analyse des ADNc dérivés des ARNm contenus dans l'échantillon biologique est réalisée par PCR quantitative en temps réel. Les ADNc sont amplifiés à l'aide d'amorces et de sonde spécifiques de la séquence de l'Apo A4, selon un procédé qui comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes :
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADNc préparé à partir de l'échantillon,
- hybridation de la sonde et d'un couple d'amorces sens et anti-sens, et
- synthèse de brins d'ADN de novo par élongation avec une polymérase.
Avantageusement les amorces sens et anti-sens comprennent au moins 15 nucléotides et présentent une identité d'au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et encore préférentiellement 95 % avec la séquence de l'Apo A4 humaine, correspondant à la séquence SEQ ID N°13 (Gène bank n° NM 000482), ou avec sa séquence complémentaire.
Au cours de la réaction d'amplification le produit de la réaction, ou amplimère, est détecté à l'aide d'une sonde, constituée d'un oligonucléotide comprenant au moins 15 nucléotides et présentant une identité d'au moins 80 %, préférentiellement 90 %, et encore préférentiellement 95 % avec la séquence de l'Apo A4 humaine, correspondant à la séquence SEQ ID N°13 (Gène bank n° NM 000482), ou avec sa séquence complémentaire.
Les deux amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et antisens, et de manière à permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle ciblée de manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification délimitée par la position des deux amorces.
De manière avantageuse la sonde présente une température de fusion Tm théorique supérieure d'environ 100C + 0,5 aux Tm théoriques des amorces. Préférentiellement lesdits oligonucléotides (amorces et sonde) comprennent entre 15 et 25 nucléotides. Le procédé est mis en œuvre durant un nombre de cycles suffisant pour permettre l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification (n=40). Les amorces utilisées pour l'amplification du gène codant l'Apo A4 Humaine présentent préférentiellement les séquences
SEQ ID N°1 : gcagctggctccctatgct et SEQ ID N°2 : ggaaggtcaggccctcaag.
La sonde présente préférentiellement la séquence SEQ ID N°3 : cacgcaggagaag ctcaaccacca .
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système révélateur est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant extincteur de fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3' de la sonde. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire « reporter / quencher » représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6-carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la sonde.
Pour mettre en oeuvre la PCR dans le cadre de la présente invention on peut se référer aux revues générales des techniques PCR et aux instructions des fabricants et distributeurs de réactifs et de thermocycleurs, et en particulier à la notice explicative intitulée « Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Détection » publiée par Perkin Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Académie Press New-York 1989).
L'un des avantages de la méthode de détection par QPCR est que l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles de PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. Il n'est donc pas nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de contamination pour les analyses ultérieures.
En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction est très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours des cycles PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter le produit de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ; ce principe de détection est donc plus sensible et plus spécifique. Un autre avantage de la QPCR réside dans le fait que les amplifications non spécifiques sont évitées, grâce au principe du « hot start », la PCR en temps réel étant réalisée en présence d'une ADN polymérase thermostable s'activant à la première dénaturation.
Selon un autre mode de mise en œuvre de l'invention la méthode selon la présente invention comprend la mesure de la quantité de protéine ou de fragments de la protéine Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés. De manière particulièrement avantageuse la quantité de protéine ou de fragments de la protéine Apo A4 est mesurée à l'aide d'au moins un anticorps spécifique de cette protéine.
Ces anticorps peuvent être obtenus par une méthode consistant à injecter à des animaux, tels que des rongeurs, une émulsion de la protéine Apo A4 humaine purifiée ou une séquence peptidique de l'Apo A4 d'environ 20 acides aminés, éventuellement en présence d'un adjuvant tel que l'adjuvant de Freund. Les injections sont répétées et l'antisérum est récolté.
La mesure de la liaison entre ces anticorps et l'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés des individus chez lesquels on souhaite quantifier l'Apo A4 hépatique peut être effectuée par tout moyen adapté. Préférentiellement elle peut se faire par la technique ELISA (abréviation de Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) et encore plus préférentiellement par une méthode dite « en Sandwich ». La méthode dite « en Sandwich » fait appel à deux anticorps: un premier anticorps de capture est lié à un phase solide telle qu'une microplaque un deuxième anticorps de détection permet de quantifier la protéine. Selon cette technique les anticorps de détection sont couplés avec une peroxydase. Les anticorps liés à la protéine Apo A4 sont isolés des anticorps non-liés et mis en présence d'un substrat de la peroxydase, préférentiellement le dihydrochlorure de O-phenylenediamine. La réaction colorimétrique permet de quantifier le nombre d'anticorps liés et de ce fait la quantité de protéine liée. Cette réaction colorimétrique est mesuré à l'aide d'un appareil adapté, par exemple par mesure de la densité optique.
Une amplification de la réaction peut être effectuée en utilisant au moins deux anticorps, d'une part des anticorps anti-Apo A4 non couplés à la peroxydase et d'autre part des anticorps couplés à la peroxydase reconnaissant les premiers anticorps. En outre un autre anticorps anti-Apo A4 peut être utilisé pour fixer les complexes anticorps-Apo A4 sur un support facilitant ainsi l'isolement des complexes et la séparation des anticorps non-fixés.
La liaison entre ces anticorps et l'Apo A4 peut aussi être mesurée en utilisant des anticorps marqués par un isotope radioactif. Dans ce mode de mise en oeuvre les anticorps liés à la protéine Apo A4 sont isolés et la radioactivité des complexes anticorps-Apo A4 est mesurée à l'aide d'un appareil de mesure adapté à l'isotope utilisé.
D'autres techniques que la technique ELISA et radioisotopique peuvent être mises en oeuvre pour le dosage de la protéine Apo A4 telle que la nephelométrie et la turbidimétrie.
Pour l'obtention des anticorps et la mise en œuvre des technique ELISA et radioisotopique notamment,on peut se reporter au manuel "Antibodies, A Laboratory Manual," (CoId Spring Harbor Press (1988)).
La présente invention a en outre pour objet un procédé de criblage de composés destinés à la prévention ou au traitement de maladies hépatiques comprenant les étapes de :
• mise en contact desdits composés avec un mammifère, et
• mesure de l'expression de l'Apo A4 dans lesdites cellules d'origine hépatique ou dans les ou dans le sang et les dérivés du sang cellules dudit mammifère.
Le mammifère dans les cellules ou le sang duquel la mesure de l'expression de l'Apo A4 peut être effectuée est tout mammifère chez lequel l'Apo A4 est exprimée dans le foie. Il peut être avantageusement un rongeur et préférentiellement une souris. Avantageusement on utilise des lignées d'animaux ayant une tendance naturelle à l'obésité.
Ainsi une souris d'une lignée Balbc ByJ, DlO Balbc ByJ, DIO Balbc AnN ou DIO
C57BI/6J est préférentiellement utilisée.
La mesure de l'expression de l'Apo A4 peut être effectuée par la mesure de la quantité d'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés dudit mammifère ou par la mesure de la quantité d'ARN messager transcrit par le ou les gènes codant l'Apo A4 exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques dudit mammifère, comme indiqué ci-dessus.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples de mise en œuvre qui suivent.
Exemple 1 : Mesure de l'expression de l'Apo A4 chez des souris normales (C57 B16) ou obèses (C57 B16/obob) par quantification des ARN messager transcrits et de la protéine Apo A4 plasmatique
1. Matériels et méthodes
Protocole expérimental
Le sang des souris normales (C57 B16) ou obèses (C57 B16/obob) a été prélevé et centrifugé 10 mn à 10 000 rpm et le plasma a été prélevé.
Un morceau de foie (75-130 mg) a été prélevé dans des tubes de 2 ml contenant 1,5 ml de RNA Later (Ambiom).
Le foie et le plasma ont été conservés à -200C pour en vue du dosage des ARNm et de la protéine Apo A4.
Analyse par QPCR en temps réel de l'expression de l'Apo A4 de Souris
Cette technique en 2 étapes principales fait intervenir :
1. L'extraction et la purification des ARN totaux puis la conversion des ARNm contenus dans l'échantillon en ADN complémentaires (ADNc).
2. L'analyse des ADNc, réalisée par PCR quantitative en temps réel. Les expressions relatives du gène sont données en % par rapport à un gène de référence interne invariant, comme la béta2-microglobuline ou l'ARN Ribosomal 18S.
L'analyseur de séquence 7900HT Fast Real-Time PCR System et les réactifs pour l'amplification sont fournis par Applied Biosystems
Méthodes :
Préparation des lysats tissulaires. 80 mg de foie de souris sont excisés et immédiatement plongés dans 2 ml de RNAlater afin de préserver au maximum l'intégrité de I1ARN avant toute manipulation.
Le morceau de foie est transféré à sec dans un tube Eppendorf dans lequel sont ajoutés 2 ml de tampon de lyse (Kit d'extraction des ARNtotaux, RNeasy Midi Kit commercialisé par QIAGEN) et 2 billes en acier (diamètre, 3 mm). La lyse tissulaire est réalisée avec le Tissuelyser (commercialisé par QIAGEN) par agitation 5 min à 30HZ. A ce stade les lysats peuvent être conservés à -200C.
Extraction des ARN totaux.
Les lysats sont centrifugés 3 min à 14000xg et filtrés sur QIAshredder
(commercialisé par QIAGEN) (3 x 0,7 ml). L'extraction suit le protocole du kit RNeasy Midi avec étape à la Dnase. L'étape finale est une élution de l'ARN total dans 150 μl d'eau. La concentration des ARN est obtenue par la mesure de la densité optique (DO) à 260 nm.
Synthèse des ADN complémentaires (ADNc).
A partir de 5 μg d'ARN total l'ADNc est synthétisé en utilisant le kit de réverse transcription Superscipt III (commercialisé par INVITROGEN). L'ADNc obtenu est récupéré dans 20 μl de volume final.
Analyse de l'expression des gènes par PCR sur le 7900HT.
5 μl d'une dilution d'ADNc sont additionnés de 15 μl de mélange réactionnel contenant en particulier : du tampon, de la polymérase nécessaires à la réaction de PCR ainsi que les amorces et sonde spécifiques du gène à quantifier. Ces derniers sont disponibles chez le fournisseur sous forme de Taqman Gène Expression Assays. Le gène de la béta2-microglobuline (B2-m) ou l'ARN ribosomal 18S sont utilisés comme références internes.
Les séquences des amorces et sondes utilisées pour l'amplification du gène codant l'Apo A4 et la Béta2-m humaines et de souris sont représentées dans le tableauVIl (SEQ ID N°1 à SEQ ID N°12). La réaction d'amplification génique est réalisée avec des cycles de température (dénaturation 95°C/15s puis hybridation et synthèse 60°C/1 min) dans des microplaques de 96 ou de 384 puits. La durée de l'analyse est de 90 min. Les cinétiques d'amplification (signal d'amplification fonction du nombre de cycles) sont analysées dans une représentation linéaire de la phase exponentielle (logiciel: SDS Enterprise Database).
Dans cette phase est défini le Ct1 nombre de cycle mesuré à signal d'amplification constant, le Ct est inversement proportionnel à la quantité d'ARN messager présent dans l'échantillon d'origine. La différence de Ct (ΔCt) entre le gène cible (Apo A4) et la référence interne (B2-m) donne l'abondance relative à partir de la relation Q = (2)"ΔCt (valeur données en % par rapport au gène de référence).
Mesure de la quantité de Apo A4 dans le plasma chez la souris par méthode ELISA sandwich
Anticorps
L'anticorps de capture est de l'anticorps de chèvre anti-Apo A4 commercialisé par
(Santa Cruz Biotechnology, lnc.2145 Delaware Avenue Santa Cruz, California
95060 U.S.A.). De l'anti sérum dirigé contre l'Apo A4 de souris est obtenu à partir de lapins immunisés par un peptide correspondant à la séquence C-terminale (acide aminé
361-380) de l'Apo A4 de souris.
Une émulsion de peptide couplé sur une protéine porteuse (KLH) dans de l'adjuvant de Freund's complet est injectée de manière subcutanée aux animaux. Des injections ultérieures sont effectuées avec une émulsion de peptide couplé dans de l'adjuvant de Freund's incomplet.
L'antisérum est récolté 10 jours après le troisième rappel et l'anticorps est purifié par chromatographie d'affinité sur le peptide couplé à un gel de chromatographie.
Mise en oeuyre de la méthode ELISA sandwich
Dans les puits d'une plaque de 96 puits 100 μl d'anticorps de chèvre anti-Apo A4 à 4 μg/ml dans du PBS sont incubés durant 4 heures à 200C. Après lavage par du PBS contenant 0,1 % de tween 20 les sites de liaisons non spécifiques sont bloqués avec du tampon PBS contenant 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA) durant 60 min à température ambiante. 100 μl d'échantillons de plasma (dilution dans du PBS contenant 0,1 % BSA de 1/3000 à 1/20000) sont ajoutés et incubés durant la nuit à 4°C. Après lavage 100 μl à 0,1 μg/ml d'anticorps polyclonaux de lapin anti-Apo A4 de souris sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 100 μl de conjugués IgG anti lapin -péroxydase (PERCE 1/200 dans du PBS contenant 0,1 % BSA) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante.
Après lavage 150 μl d'une solution contenant de PO-phenylenediamine et du peroxyde d'hydrogène qui est le substrat de la péroxydase (Sigma) sont ajoutés. Après 20 min 50 μl de H2SO4 3M sont ajoutés pour arrêter la réaction et la densité optique à 492 nm est mesurée.
2. Résultats :
Le tableau IA montre la distribution tissulaire de l'Apo A4 chez la souris. L'Apo A4 est exprimée dans le muscle lisse, l'intestin grêle, le foie, le colon, le placenta, l'estomac, les ovaires, le rectum, les tissus adipeux ... On note une forte expression dans l'intestin grêle.
Le tableau IB confirme forte expression dans l'intestin grêle et la localisation de l'Apo A4 dans les différentes régions (duodénum, jéjunum, ileum).
Le tableau II montre l'expression de l'Apo A4 dans le foie et le plasma et montre que cette expression est augmentée dans le foie et le plasma si l'on compare les souris normales et les souris obèses.
Exemple 2 : Mesure de l'expression de i'Apo A4 chez l'homme par quantification des ARN messager transcrits
Les ADN c sont préparés à partir de foie humain et les mesures effectuées comme décrit dans l'exemple précédent pour la préparation à partir de foie de souris.
Résultats de l'analyse par QPCR en temps réel de l'expression de l'Apo A4 Humaine
Le tableau III montre la distribution tissulaire de l'Apo A4 chez l'homme : présence dans l'utérus fundus, l'oesophage, la rétine, le placenta, l'épididyme et les tissus adipeux.
On note une forte expression dans l'intestin grêle, en accord avec les données de la littérature.
Peu d'expression dans le foie total, mais celle ci semble concentrée sur la région hépatoportale. Le tableau IV-A confirme les résultats sur la localisation de Apo A4 dans les régions de l'intestin grêle (jéjunum, ileum, duodénum).
Il ressort en outre que l'expression locale de l'Apo A4 dans le foie est plus liée à certaines états physiopathologiques (système porte hépatique) (tableau IV-B).
Ce résultat est confirmé dans les tableaux V-A & Vl qui regroupent une analyse des Apo A4 sur différents échantillons de foies pathologiques et de foie normal. Les valeurs élevées sont corrélées pour les pathologies suivantes : cirrhose, lupus et infarctus.
La spécificité de Apo A4 comme marqueur potentiel de ces affections est démontrée par l'analyse comparée de l'Apo A4 des autres classes d'apolipoproteines : Apo A1 , Apo A2 et Apo A5 (tableaux IV et V-B).
Exemple 3 : Mesure de la quantité de protéine Apo A4 dans le plasma chez l'homme par méthode ELISA sandwich
Anticorps
L'anticorps de capture est de l'anticorps de chèvre anti-Apo A4 commercialisé par (Santa Cruz Biotechnology, lnc.2145 Delaware Avenue Santa Cruz, California 95060 U.S.A.).
De l'Apo A4 humaine purifiée est obtenue à partir de sérum humain comme décrit par Weinberg RB, Hopkins RA, Jones JB. (Methods Enzymol. 1996 ; 263:282-96. Purification, isoform characterization, and quantitation of human apolipoprotein A4).
De l'anti sérum dirigé contre l'Apo A4 humaine est obtenu à partir de lapins. Une émulsion h-Apo A4 purifiée dans de l'adjuvant de Freund's complet est injectée de manière subcutanée aux animaux. Des injections ultérieures sont effectuées avec une émulsion d'Apo A4 purifiée dans de l'adjuvant de Freund's incomplet. L'antisérum est récolté 10 jours après le troisième rappel.
Mise en oeuyre de la méthode ELISA sandwich
Les puits d'une plaque de 96 puits sont incubés avec 100 μl d'anticorps de chèvre anti-Apo A4 à 4 μg/ml dans du PBS durant 4 heures à 200C. Après lavage par du PBS contenant 0,1 % de tween 20 les sites de liaisons non spécifiques sont bloqués avec du tampon PBS contenant 0,5 % de sérum albumine bovine (BSA) durant 60 min à température ambiante. 100 μl d'échantillons de plasma (dilution dans du PBS contenant 0,1 % BSA de 1/3000 à 1/20000) sont ajoutés et incubés durant la nuit à 4°C. Après lavage 100 μl d'anticorps sériques polyclonaux de lapin anti- Apo A4 humaine (dilution 1/5000 dans PBS SAB) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 100 μl de conjugués IgG anti lapin -péroxydase (PIERCE 1/200 dans du PBS contenant 0,1 % BSA) sont ajoutés et incubés 1 h à température ambiante. Après lavage 150 μl d'une solution contenant de PO-phenylenediamine et du peroxyde d'hydrogène qui est le substrat de la péroxydase (Sigma) sont ajoutés. Après 20 min 50 μl de H2SO4 3M sont ajoutés pour arrêter la réaction et la densité optique à 492 nm est mesurée.
Exemple 4 : Obésité et apoA4 hépatique Humaine
Une étude centrée dans l'obésité a été réalisée par l'analyse de l'expression de l'apoA4 dans le foie de patients en surpoids. Cette pathologie est corrélée à l'indice de masse corporelle (IMC≈Poids en kg/(taille en mètre)2 ). Une charge pondérale normale correspond à un IMC<25. Expérimentalement l'expression des apolipoprotéines a été analysée par la technique de QPCR précédemment décrite à partir d'une collection d'ARN de foies humains fournie par Asterand, Inc. (TechOne Bldg, Suite 501 , 440 Burroughs, Détroit Ml 48202, US). Les indices de masse corporelle (IMC, ou BMI pour Body Mass Index) sont donnés par Asterand.
Les résultats figurent dans le tableau VIII. On constate une relation positive directe entre le % d'expression de PapoA4 et l'indice de masse corporelle.
Ces résultats démontrent la pertinence de l'utilisation de PapoA4 comme marqueur dans le diagnostic ou le pronostic et suivi thérapeutique de l'obésité. Tableau IA : Expression de l'Apo A4 chez la souris (exprimées en % par rapport à la béta2-microglobuline)
Tableau IB : Expression de Apo A4 dans les régions de l'intestin grêle (%/béta2-m, moyenne +/- écart type (4 animaux))
Tableau II : Expression de I1ARNm de l'Apo A4 dans le foie et mesure de l'Apo A4 dans le plasma de souris normales (C57 B16) ou obèses (C57 B16/obob).
Tableau III : Expression de Apo A4 humaine dans les tissus
Tableau IVA : Expression des apolipoprotéines dans l'intestin
Tableau IVB : Résultats regroupés pour le foie
Tableau VA : Expression de Apo A4 humaine dans les échantillons de foie
Tableau VB : Expression de Apo A1, 2 & 5 humaines dans les échantillons de foie.
Tableau VI : Expression de Apo A4 dans les échantillons Humains
Tableau VII : Séquences des amorces et des sondes pour le dosage par PCR quantitative de la béta2-microqlobuline et de l'Apo A4 Humain et Souris.
Tableau VIII : Expression de l'apoA4 hépatique Humaine chez des patients en surpoids

Claims

Revendications
1. Méthode de diagnostic ou de pronostic de maladie hépatique comprenant la mesure de l'expression de PApo A4 dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés.
2. Méthode selon la revendication 1 comprenant les étapes de : isolement des cellules, des tissus hépatiques ou d'extraits de ces cellules et tissus, du sang ou des ses dérivés et mesure de l'expression de l'Apo A4.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité d'ARN messagers transcrits par le ou les gènes codant l'Apo A4, exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques.
4. Méthode selon la revendication 3 caractérisée en ce la quantité d'ARN messagers transcrits est mesurée par méthode PCR.
5. Méthode selon la revendication 4 caractérisée en ce la quantité d'ARN messagers transcrits est mesurée par méthode PCR quantitative.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 et 2 caractérisée en ce qu'elle comprend la mesure de la quantité de protéine Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et ses dérivés.
7. Méthode selon la revendication 6 caractérisée en ce que la quantité d'Apo A4 est mesurée à l'aide d'au moins un anticorps spécifique de cette protéine.
8. Méthode selon la revendication 7 caractérisée en ce que l'anticorps spécifique est couplé avec une peroxydase ou est marqué par un isotope radioactif.
9. Méthode selon l'une des revendications 7 et 8 caractérisée en ce que la liaison de l'anticorps à la protéine est mesurée par la technique ELISA.
10. Procédé de criblage ou de détection de composés destinés à la prévention ou au traitement de maladies hépatiques comprenant les étapes de : mise en contact desdits composés avec un mammifère et mesure de l'expression de l'Apo A4 dans les cellules d'origine hépatique ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.
11. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la quantité d'Apo A4 exprimée dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.
12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce qu'il comprend la mesure de la quantité d'ARN messagers transcrits par le ou les gènes codant l'Apo A4 exprimés dans les cellules ou tissus hépatiques ou dans le sang et les dérivés du sang dudit mammifère.
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12 caractérisé en ce que ledit mammifère est une souris de la lignée Balbc ByJ, DIO Balbc ByJ, DIO Balbc AnN ou DIO C57BI/6J.
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