EP1866444A1 - Procede de detection d'isolats du virus de la pomme de terre y (pvy) responsables de necroses - Google Patents
Procede de detection d'isolats du virus de la pomme de terre y (pvy) responsables de necrosesInfo
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- EP1866444A1 EP1866444A1 EP06725478A EP06725478A EP1866444A1 EP 1866444 A1 EP1866444 A1 EP 1866444A1 EP 06725478 A EP06725478 A EP 06725478A EP 06725478 A EP06725478 A EP 06725478A EP 1866444 A1 EP1866444 A1 EP 1866444A1
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
Definitions
- the viral genome consists of a single-stranded RNA molecule of positive polarity about 10 kb in length, with a VPg protein covalently linked at its 5 'end and a poly-A tail at its 3' end.
- Viral RNA encodes a polyprotein, which is cleaved into 9 products by three proteases encoded by the virus
- PVY isolates were classified into four different strains corresponding to the potato, pepper, tobacco and tomato strains.
- isolates were characterized on the basis of their biological properties (symptoms and responses to different sources of resistance). This characterization made it possible to define different groups of viruses.
- three groups of potato strains PVY N ,
- a probe comprising from 14 to 40, from 15 to 25 or from 18 to 22 or 20 consecutive nucleotides of a sequence capable of hybridizing with the sequence SEQ ID No. 5 (FIG. nucleotide at position 2213, especially SEQ ID No 7: ctcaaatg ⁇ atattctac
- the SNP-based diagnostic test as described above enabled the reliable detection of 42 PVY potato isolates from 13 countries and was able to correctly assign them in the PVY N or PVY 0 groups .
- Samples containing more than 10 4 copies of PVY N RNA and / or PVY 0 were efficiently detected by this assay and the latter makes possible the co-detection of PVY N and PVY 0 in mixed infections.
- the quencher a non-fluorescent small-groove linker (MGB [Applied Biosystems]) linked to the 3 'end of the fluorescent probes, is indicated by gray stars.
- a The positions of the given nucleotides are as in Jakab et al., (1997).
- Figure 3 Raw fluorescent signal (CFS) obtained using positive control samples (PVY N , PVY ° and Y N / Y ° mixed) and negative (control without matrix).
- Detection of PVY in a plant was performed using a DAS-ELISA protocol.
- the wells of the microtiter plates were filled with 1 ⁇ g / ml PVY polyclonal antibody (FNPPPT-INRA, France) in carbonate buffer (pH 9.6) for 2 h at 37 ° C.
- carbonate buffer pH 9.6
- the plates were washed three times with PBST buffer (PBS, 0.05% (v / v) Tween 20). 100 ⁇ L of the raw plant juices were added to the wells and left overnight at 4 ° C.
- Alkaline phosphatase conjugated mouse monoclonal antibodies to PVY N [Bioreba, Switzerland] or PVY O / C [Adgen, UK] were diluted to
- Example 3 Detection of PVY N -605 and PVY ° -139 in pure and mixed samples using an SNP assay according to Example 2.
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de détection du virus PVY consistant en un test SNP ou une réaction d'extension spécifique des mutations correspondant à R/K<SUB>400</SUB> et D/E<SUB>419</SUB>, la présence d'au moins une desdites mutations étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente pouvant être responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées, en particulier chez la pomme de terre.
Description
Procédé de détection d'isolats du virus de la pomme de terre Y (PVY) responsables de nécroses
La présente invention concerne un procédé de détection du virus PVY consistant en un test SNP ou une réaction d'extension spécifique des mutations correspondant à RZK400 et D/E419, la présence d'au moins une desdites mutations étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente pouvant être responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées, en particulier chez la pomme de terre.
Le virus de la pomme de terre Y (PVY), appartenant à la famille Potyvirus, est l'un des pathogènes des plantes les plus importants d'un point de vue économique (Milne, 1988 ; Shukla et al, 1994). Tout d'abord signalé dans les années 1930 chez la pomme de terre (Smith, 1931), le PVY est maintenant distribué dans le monde entier sur de nombreux hôtes différents. Le virus est transmis par des pucerons selon le mode non persistant (Sigvald, 1984) et infecte plusieurs espèces de plantes cultivées appartenant à la famille des Solanacées (De Bokx et Huttinga, 1981 ; Brunt et al, 1996).
Le génome viral est constitué d'une molécule d'ARN monocaténaire de polarité positive d'environ 10 kb de longueur, avec une protéine VPg liée de manière covalente à son extrémité 5' et une queue poly-A à son extrémité 3'. L' ARN viral code une polyprotéine, qui est clivée en 9 produits par trois protéases codées par le virus
(Dougherty et Carrington, 1988). Selon l'hôte dont on les a récolté à l'origine, les isolats de PVY ont été classés en quatre souches différentes correspondant aux souches pomme de terre, piment, tabac et tomate. Au sein de la souche pomme de terre, les isolats ont été caractérisés sur la base de leur propriétés biologiques (symptômes et réponses à différentes sources de résistance). Cette caractérisation a permis de définir différents groupes de virus. Ainsi, trois groupes de souches de pomme de terre : PVYN,
PVY0 et PVYC (De Bokx et Huttinga, 1981) ont été identifiées. Ces groupes sont notamment définis par le caractère systémique ou local des symptômes induits sur
Nicotiana tabacum et Solanum tuberosum.
Les isolats appartenant au groupe PVYN induisent une nécrose des nervures sur les feuilles de N. tabacum cv. Xanthi et une très légère marbrure, avec seulement rarement des feuilles nécrotiques sur pomme de terre. Les isolats PVY0 induisent seulement des symptômes de marbrure et de mosaïque sur tabac et une mosaïque légère à grave et une chute des feuilles sur pomme de terre. Finalement, les isolats PVYC induisent des symptômes de stries nécrotiques sur certains cultivars de pomme de terre.
Les isolats PVYN et PVY0 sont responsables de pertes à haut rendement allant jusqu'à 40 à 70 % dans le cas des pommes de terre. Ainsi, la détection et l'identification efficace des isolats de PVY nécrotiques et non nécrotiques dans les cultures de pomme de terre sont un problème majeur pour les producteurs.
La caractérisation des isolats « pomme de terre » de PVY à tout d'abord reposé sur des tests biologiques. Cependant, une telle approche prend à la fois du temps et de l'espace et n'est pas facilement adaptable soit pour un diagnostic rapide soit pour un test à grande échelle.
Puis, pour remplir les besoins en un test fiable et rapide, des tests immuno- enzymatiques en sandwich à double ou triple anticorps (DAS- ou TAS-ELISA), utilisant des anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux (Gugerli et Fries, 1983 ; Matt et Huttinga, 1987 ; Oshima et al., 1990 ; Sanz et al., 1990 ; Singh et al., 1993 ; Ellis et al., 1996), une approche par immuno microscopie électronique (Walkey et Webb, 1984) et par agglutination au latex (Berckx, 1967 ; Tallay et al., 1980) on été développés.
Néanmoins, aucun de ces tests ne s'est avérer capable de discriminer les isolats capable ou non d'induire un nécrose (Mac Donald et Singh, 1996 ; Boonham et Barker, 1998 ; Ounouna, 2002).
En effet, la récente émergence de nouveaux variants de PVYN comprenant les isolats pyyNTN ^6 ja nécrose en tache annulaire sur tubercule (Le Romancer et al., 1994 ;
Kerlan et al., 1999) et les isolats PVYN-W (Chrzanowska, 1991) a souligné les limites des outils sérologiques disponibles. En effet, les anticorps monoclonaux et/ou polyclonaux spécifiques de PVY placent les isolats PVYN-W dans le groupe PVY0. De plus, les outils sérologiques ne sont pas capables de faire la distinction entre les isolats pγγN™ et les isolats PVYN.
Quatre séquences complètes de PVYN (Robaglia et al., 1989 ; Jakab et al., 1997 ; Abdelmaksoud et Gamal Eldin, 2002 ; Nie et Singh, 2003), deux séquences complètes de PVYN™ (Thole et al., 1993 ; Nie et Singh, 2003) et une séquence complète de PVY0 (Singh et Singh, 1996) (numéro d'accès : PVYN-Fr : Do00441 ; PVYN-605 : X97895 ; PVYN-Egypte : AF522296 ; PVYN-Jg : AYl 66867 ; PVYNTN-H : M95491 ; PVYNTN-Tu660 : AYl 6866 ; PVYO- 139 : U09509) ont été publiées.
En complément des outils sérologiques décrit ci-dessus, des tests moléculaires ont été développés par différentes équipes. Cependant aucun de ces outils n'est capable de caractériser précisément les isolats de PVY inducteurs de nécroses. Pour résoudre ce problème, nous avons développé des outils moléculaires plus rapides, fiables et plus spécifique pour la détection des virus capable d'induire la nécrose de la plante infectée. En d'autres termes, l'invention apporte pour la première fois un test permettant une telle discrimination entre les différents isolats et plus particulièrement une détection très sensible des PVY selon leurs propriétés biologiques différentes (par exemple, nécrose (YN) ou marbrure (Y0)) liées aux propriétés biologiques réelles utilisées dans la classification du PVY.
Dans le cadre de nos investigations, nous avons découvert deux mutations chez ces différents isolats directement impliquées dans la nécrose, notamment la nécrose tuberculaire de la pomme de terre, et d'autres plantes de la famille des Solanacées.
Cette découverte n'a été rendue possible que par une approche de génétique inverse lors de laquelle des mutations d'acides aminés situés dans la partie carboxy-terminale de la protéine HC-Pro ont été identifiées comme étant responsables de la nécrose.
L'invention ouvre désormais la voie à une détection systématique des isolats de PVY nécrotiques et non nécrotiques, ce qui permettra aux producteurs de diminuer très sensiblement le risque de perte de récolte.
DESCRIPTION
Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, b) amplification RT-PCR d'une région de l'ARN viral de PVY comprenant les codons 738 et 757 (SEQ ID No 1 et 3) correspondant aux acides aminés 400 et 419 respectivement de la protéine HC-Pro (SEQ ID No 2 et 4, fig 7A et 7B), c) détection de la présence ou de l'absence des mutations R/IQoo et D/E419, la détection d'au moins une desdites mutations étant une indication d'une souche de PVY virulente pouvant être responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
Dans la description, on fera référence à la numérotation correspondant à la séquence NCBI numéro d'accession X97895 (Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D. and Malnoe P. Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605, a Swiss necrotic isolate of potato virus Y. J. Gen. Virol. 78 (Pt 12), 3141-3145 (1997)). La séquence nucléotidique et la séquence peptidique sont présentées respectivement aux SEQ ID No 1 et 2. Pour les souches PVY0, une séquence de référence est accessible dans NCBI sous le numéro U09509 (Singh M. and Singh R.P., Nucleotide séquence and génome organization of a Canadian isolate of the common strain of potato virus Y (PVYo). Can. J. Plant Pathol. 18, 209-214 (1996) (SEQ ID No 3 et 4), mais la numérotation se fera selon Jakab et al. (1997) par alignement.
Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé décrit ci-dessus de détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à RZK400 et D/E419 au moyen i) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et ii) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent, la présence d'au moins une desdites mutations RZK400 et D/E419 étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne un procédé décrit ci- dessus, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à RZK400 et D/E419 au moyen d'une réaction d'extension d'amorces oligonucléotidique à l'aide de ddNTP marqués différentiellement et i) d'une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polymorphe 2213 du codon 738 et ii) d'une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polyporphe 2271 du codon 757, la présence d'au moins une desdites mutations RZK400 et D/E419 étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
Grâce à ce procédé, on détecte en un seul test les 4 génotypes/phénotypes suivants :
- [R400 , D419] (souche incapable d'induire la nécrose)
- [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400 , E419] (souche induisant la nécrose)
Des exemples de séquences détectées comportant une de ces combinaisons de polymorphismes sont présentés à la figure 6B (SEQ ID No 14 à 19).
A titre d'exemple, on peut mettre en œuvre ce procédé chez la pomme de terre. Dans ce cas, la détection à l'étape c) de souches de PVY [R400 , E419] et/ou [K400 , D419] et/ou [K400 , E419] est une indication que la plante de pomme de terre est contaminée avec une ou plusieurs souche(s) pouvant induire des nécroses tuberculaires (Figure 6A).
Dans le premier mode réalisation, on utilise comme sonde i) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 (correspondant à R/IQoo), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon : K (Lysine) : AAA, AAG
De préférence, on utilise une sonde comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence capable de s'hybrider avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 7 : ctcaaatgαααatattctac
On peut utiliser en outre une sonde i) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AGA avec le polymorphisme G2213. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon : R (Arginine) CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
A ce effet, on peut utiliser une sonde contrôle comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence capable de s'hybrider avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 8 : ctcaaatgαgαatattcta
Avantageusement, la sonde i) et la sonde i) contrôle sont marquées différemment.
Egalement dans un mode préféré de réalisation, on utilise comme sonde ii) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon : E (Glutamique) : GAA, GAG
De préférence, on utilise une sonde comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2271, notamment avec la SEQ ID No 9 ou SEQ ID No 10 qui sont des sondes spécifiques YN : 5'- cgatcacgααacgcagaca - 3' (SEQ ID No 9) 5'- atcacgααacgcagaca - 3' (SEQ ID No 20)
On peut utiliser en outre une sonde ii) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAC avec le polymorphisme C2271. Le test peut être complété avec d'autres sondes en fonction d'autres polymorphismes sur ce codon : D (Aspartique) : GAT5GAC
A ce effet, on peut utiliser une sonde ii) contrôle comportant de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2271, notamment avec la SEQ ID No 10 : 5'- accatgαçactcaaa -3' ou avec la SEQ ID No 21 : 5'- tgaccatgαçactcaa -3'
Avantageusement, la sonde ii) et la sonde ii) contrôle sont marquées différemment.
On peut utiliser des sondes telles que décrites ci-dessus comportant un marqueur fluorescent (reporter) et une molécule captant le signal lorsqu'elle se trouve à proximité du marqueur fluorescent (quencher).
Dans le deuxième mode de réalisation, le procédé décrit ci-dessus est caractérisé en ce qu'on utilise comme amorce i) à l'étape c), au moins une amorce s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval du nucléotide polymorphe du codon 738 (correspondant à R/IQoo), en particulier une amorce s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213.
De préférence, l'amorce i) comporte de 10 à 120 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2212 ou 2214.
Dans le deuxième mode de réalisation on peut également utiliser comme amorce ii) à l'étape c), au moins une amorce s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval du nucléotide polymorphe du codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une amorce s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271.
De préférence, l'amorce ii) comporte de 10 à 120 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2270 ou 2272.
A titre d'exemples, dans le deuxième mode de réalisation, la détection et l'identification du nucléotide polymorphe en position 2213 est réalisée avec une amorce sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 34 OUI: 5'-GACAACTTGTGCTCAAATGA-S' SEQ ID No 35 OH2: 5'-CTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-3 '
SEQ ID No 36 OH3: 5'-TGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S' SEQ ID No 37 OH4: 5'-CATGATGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S' SEQ ID No 38 OH5: 5 '-CCAACCATGATGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S '
et une amorce anti-sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 39 OH6: 5'-GAACATCAGGGTAGAATATT-S' SEQ ID No 40 OH7: 5'-ATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 41 OH8: 5'-TCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 42 0119!5'-GCAGTTCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 43 Olil0:
5 '-TCTAGGCAGTTCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S '
En outre, la détection et l'identification du nucléotide polymorphe en position 2271 est réalisée avec une amorce sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 44 Olil 1 : 5'-GCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S' SEQ ID No 45 Olil2: 5'-GAACTGCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S' SEQ ID No 46 Olil3: 5'-GAACTGCCTAGAATATTGGTTGACCATGA-S' SEQ ID No 47 Olil4: 5'-ATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S ' SEQ ID No 48 Olil5: 5'-ATGCAGAACTGCCTAGAATATTGGTTGACCATGA-S'
et une amorce anti-sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 49 Olil6: 5'-GTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S' SEQ ID No 50 Olil7: 5'-AACGAGTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S' SEQ ID No 51 Olil8: 5'-AACGAGTCAACTACATGGCATGTCTGCGT-S' SEQ ID No 52 Olil9: 5'-AACCAAACGAGTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S' SEQ ID No 53 Oli20: 5'-AGCCAAACGAGTCAACTACATGGCATGTCTGCGT-S'
Quelque soit le mode de réalisation de l'étape c), l'étape b) peut être définie comme suit
Les étapes de RT et de PCR ont lieu l'une après l'autre dans le même tube. Lors de l'étape b), la transcription inverse est effectuée avec au moins 2 ou 4 paires d'amorces sens et antisens, plus particulièrement au moins une première paire permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY-N, au moins une deuxième paire permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYo.
Ladite première paire d'amorces (FpN et RpN) comprend de préférence une amorce sens FpN et une amorce antisens RpN pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 1 ou 5. L'amorce sens FpN se situe de préférence en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpN se situe de préférence en aval du codon 757 polymorphique. Dans une autre alternative, on met en œuvre deux premières paires :
- FpNl en amont du codon 738
- RpNl en aval du codon 738 - FpN2 en amont du codon 757
- RpN2 en aval du codon 757
Ladite deuxième paire d'amorces (FpO et RpO) comprend de préférence une amorce sens FpO et une amorce antisens RpO pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 3 ou 6. L'amorce sens FpO se situe de préférence en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpO se situe de préférence en aval du codon 757 polymorphique. Dans une autre alternative, on met en œuvre deux deuxièmes paires :
- FpOl en amont du codon 738 - RpOl en aval du codon 738
- FpO2 en amont du codon 757
- RpO2 en aval du codon 757
Ce mode de réalisation préféré n'est pas limitatif. En effet, l'invention vise également un procédé tel que défini ci-dessus dans lequel l'étape b) comprend l'utilisation de nombreuses paires d'amorces couvrant l'ensemble du spectre des virus PVY.
Un exemple de réalisation est illustré à la figure 2. Parmi ces amorces, on peut citer les SEQ ID No I l et 12.
Dans un mode préféré de réalisation, les amorces des deux paires sont choisies parmi :
Amorces sens pour YN
SEQ ID No 22 Fl : 5'-ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGT-S'
SEQ ID No 23 F2 : 5'-ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTC-S'
SEQ ID No 24 F3 : 5'-CATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTA-S' Amorces anti-sens pour YN :
SEQ ID No 28 Rl : 5'-GTGAGCCAAACGAGTCAACTACAT-S'
SEQ ID No 29 R2 : 5'-TTTGTGAGCCAAACGAGTCAACTA-S'
SEQ ID No 30 R3 : 5'-TTGTGAGCCAAACGAGTCAACT-S'
Amorces sens pour YO SEQ ID No 25 Fl : 5'-GCAGAGCTGCCTAGTTTATTGGTT-S'
SEQ ID No 26 F2 : 5'-ATGATGCAGAGCTGCCTAGTTTATT-S'
SEQ ID No 27 F3 : 5'-TGCAGAGCTGCCTAGTTTATTGG-S'
Amorces anti-sens pour YO :
SEQ ID No 31 Rl : 5'-GCCAAATGAGTCAACCACATGA-S' SEQ ID No 32 R2 : 5'-AGCCAAATGAGTCAACCACATG-3'
SEQ ID No 33 R3 : 5'-CCAAATGAGTCAACCACATGACA-S'
L'invention porte également sur un procédé de sélection sanitaire de plants appartenant à la famille des Solanacées susceptibles d'être contaminés par des souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires, notamment de nécroses tuberculaires chez la pomme de terre comprenant la mise en œuvre
systématique du procédé de détection mentionné ci-dessus sur les semences, plants et/ou plantes susceptibles d'être mis en culture et procéder à la destruction ou mise sous quarantaine desdites semences, plants ou plantes contaminés avec une souche présentant au moins un des polymorphismes correspondant à - [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , E419] (souche induisant la nécrose)
Le contrôle sanitaire peut être effectué comme mentionné ci-dessus avec des semences, plants et/ou plantes importés dans un territoire donné, par exemple entrant dans l'Union Européenne ou au Canada ou encore provenant de zones à risque.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un kit de détection de la présence ou de l'absence du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY0.
- au moins une sonde marquée i) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et au moins une sonde marquée ii) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) étant telle que décrite ci-dessus et présentant des marqueurs émettant des signaux de fluorescence différents.
Le kit peut comprendre également les sondes i) et ii) de contrôle telles que décrites précédemment, les sondes i) et contrôle i) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents, les sondes ii) et contrôle ii) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents.
Dans le cas ou l'étape correspond au deuxième mode de réalisation, le kit de détection de la présence ou de l'absence d'isolats du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, est caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY0.
- une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polymorphe 2213 du codon 738 et ii) d'une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polyporphe 2271 du codon 757. De nombreux exemples d'amorces sens et d'amorces antisens spécifiques respectivement du polymorphe 2213 et 2271 sont décrits précédemment.
Le kit peut également comprendre des moyens d'extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, par exemple un tampon de broyage et un tampon d'extraction des ARN viraux tels que décrits ci-après. Le Kit peut également comprendre les réactifs nécessaires à l'amplification et/ou un dispositif de détection qualitative et quantitative des signaux de fluorescence.
A titre d'exemple, le kit peut comprendre une solution comprenant les amorces pour qu'elles puissent être utilisées à une concentration optimale se situant entre 400 nM et 1200 nM, notamment 80O nM et une solution comprenant les sondes à une concentration se situant entre 100 nM et 300 nM, notamment 200 nM.
Dans un autre aspect, l'invention se rapporte à une sonde ou amorce et aux collections de sondes et collection d'amorces mentionnées ci-dessus.
Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation desdites sondes et amorces et collections de sondes et amorces pour la détection de la présence ou de l'absence du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les
plantes de la famille des Solanacées, notamment chez la pomme de terre et aussi l'aubergine, la tomate, les piments ou le tabac.
Ainsi, dans la présente invention, nous proposons un dosage à base de polymorphisme nucléotidique pour la détection des isolats PVYN et PVY0, qui cible un marqueur moléculaire spécifique lié à la capacité des membres du groupe de PVYN à provoquer une nécrose. Le protocole développé comprend un mode opératoire rapide pour l'échantillonnage des plantes, un processus d'extraction de l'acide nucléique rapide
("feuille humide") et une réaction de RT-PCR fluorescente en une seule étape (en utilisant au moins deux sondes TaqMan®), qui ne nécessitent pas de manipulation post-PCR.
De telles caractéristiques font qu'il est possible d'effectuer jusqu'à 96 tests en moins de 3 heures, à partir de l'échantillonnage de la plante jusqu'à la génération des résultats diagnostiques.
Le test de diagnostic à base de SNP tel que décrit ci-dessus a permis la détection fiable de 42 isolats de pomme de terre de PVY de 13 pays et a été capable de les assigner de manière correcte dans les groupes PVYN ou PVY0. Les échantillons contenant plus de 104 copies de l'ARN de PVYN et/ou PVY0 ont été efficacement détectés par ce test et ce dernier rend possible la co-détection de PVYN et de PVY0 dans les infections mixtes.
Ce nouvel outil de détection combine une sensibilité élevée des techniques de détection moléculaire avec rapidité (séries de RT-PCR effectuées en environ deux heures), simplicité (pas de kit d'extraction nécessaire pour la préparation de l'échantillon et mode opératoire sans gel) et une compatibilité avec les postes de travail robotiques utilisés pour les dosages sérologiques. Les principales améliorations offertes par ce test pour la détection de PVY sont tout d'abord le choix d'utiliser la technologie SNP, habituellement appliquée pour les dosages de discrimination
allélique, les études de ségrégation génique et la cartographie chromosomique d'organismes diploïdes (pour une revue, voir Oefher, 2002).
En outre, nous apportons pour la première fois un test permettant de détecter spécifiquement les isolats de PVY qui induisent la nécrose par rapport aux isolats avirulentes grâce à l'identification des caractéristiques des nucléotides polymorphes cités ci-dessus. Appliquée à des organismes haploïdes (tels que des virus à ARN simple brin), la technologie de l'invention a le potentiel d'identifier des échantillons contenant seulement une (visualisée comme homozygote) soit une combinaison de deux variants (considérées par le test comme hétérozygote) de la séquence polymorphe ciblée.
Ainsi, l'invention porte également sur un lot de semences, plants et/ou plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de semences, plants ou plantes contaminés par le PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à :
- [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , E419] (souche induisant la nécrose).
Parmi ces lots, l'invention vise des lots de tomates, piments, tabac, poivron et aubergines. De préférence, l'invention vise un lot de plants ou tubercules de pomme de terre, caractérisé en ce que qu'il est dépourvu de plants ou tubercules contaminés avec une souche de PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à :
- [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , E419] (souche induisant la nécrose).
Les lots précités sont susceptibles d'être obtenus par la mise en œuvre du procédé ou du kit décrit ci-dessus.
Pour la suite de la description, on fera référence aux légendes des figures.
Légendes des figures
Figure 1 : Séquences encadrant les polymorphismes responsables de la nécrose Figure 2 : Séquences de PVYN-605 et de PVY°-139 utilisées comme cible dans un test à base de polymorphisme nucléotidique. Sont présentés les sites de liaison pour les amorces sens (FpN et FpO), les amorces anti-sens (RpN et RpO) et les deux sondes TaqMan® (SondeN et Sonde0). On a indiqué le nucléotide polymorphe A/G22i3. L'indicateur spécifique (rapporteur) de la sonde (FAM et Vie pour la SondeN et la Sonde0 respectivement) est illustré par une carré gris et un cercle respectivement. Les quencheur, molécules de liaison à petit sillon non fluorescentes (MGB [Applied Biosystems]) liées à l'extrémité 3' des sondes fluorescentes, sont indiquées par des étoiles grises. a : les positions des nucléotides données sont comme dans Jakab et al., (1997). Figure 3 : Signal fluorescent brut (CFS) obtenu en utilisant des échantillons de contrôle positif (PVYN, PVY° et YN/Y° mélangés) et négatif (contrôle sans matrice). A. CFS associé avec des sondes spécifiques de PVYN(FAM) et PVY0 (Vie). Sont indiquées les valeurs moyennes et écarts types calculés avec quatre réplications de NTC, PVYN-605 purs et PVY0- 139 purs. Les valeurs obtenues avec les deux réplicats des échantillons mélangés YN/Y° sont listées. B. représentation schématique des données de CFS. Chaque point correspond aux données (FAM ; Vie) associées à un des échantillons testés. On a défini quatre zones n'ayant pas de chevauchement selon la nature des échantillons testés. Figure 4 : Représentation schématique des données fluorescentes brutes (A) cibles (B) et normalisées (C). Les triangles, les carrés et les cercles correspondent aux échantillons de PVY0 purs, NTC et PVYN purs. La quantité d'ARN de PVY théorique présente dans chaque échantillon testé est indiquée. FAMt et Vict correspondent aux seuils pour la détection efficace de PVYN et PVY0 respectivement. Les zones de détection et de caractérisation sont indiquées sur les graphiques bruts (A) et normalisés (C).
Figure 5 : Représentation graphique de la co-dέtection de PVYN et de PVY° en utilisant des données fluorescentes cibles par SNP. Les limites de détection seuil pour PVYN et PVY0 sont indiquées par FAMt et Vict, respectivement. La détection simple de PVYN et ou PVY0 correspond aux zones O et θ, respectivement. Les groupes de la zone θ n'ont pas détecté d'échantillon. Les rapports YN/Y° correspondant à 1/100, 1/10, 1,10/1 et 100/1 sont représentés par des triangles, des cercles, des carrés, des étoiles et des losanges, respectivement.
Figure 6 : Analyse des propriétés nécrotiques des isolats PVY chimères sur pomme de terre. Figure 7 : Séquence PVYN-605 et zone d'intérêt et HC-PRO
A - Séquence nucleotidique (codon d'initiation de la traduction en gras, bases polymorphes d'intérêt en gras italique)^ - Séquence en aa de la polyproteine (qui contient la protéine HC-Pro séquence soulignée), aa d'intérêt en gras. Figure 8 : Séquence PVYO-139 et zone d'intérêt et HC-PRO A- Séquence nucleotidique (codon d'initiation de la traduction en gras, bases polymorphes d'intérêt en gras italique)
B - Séquence en aa de la polyproteine (qui contient la protéine HC-Pro séquence souligné), aa d'intérêt en gras. Figure 9 : Schématisation de la procédure de caractérisation de nucléotides polymorphes en utilisant la technique d'élongation d'amorces d'un seul nucléotide. Les étapes (extraction, RT-PCR, Elongation SNap Shot et électrophorèse en gel de polyacrylamide) allant de l'échantillon végétal au résultat obtenu par analyse informatisée du signal fluorescent sont présentées. Les amorces liées à un ddNTP fluorescent sont visualisées à l'aide d'une excitation par un laser après migration en gel de polyacrylamide.
Figure 10 : Electrophérogrammes obtenus à l'aide de la technique de marquage d'amorces spécifiques par ddNTP pour différents site polymorphe à caractériser. Chaque site est étudié en utilisant une amorce spécifique s'hybridant en amont (ou en aval ; amorce anti-sens non illustrée) du site polymorphe. Les différentes amorces présentent des longueur différentes afin de permettre leur caractérisation lors de la migration. Les pics obtenus révèlent la présence d'amorces fluorescente aux tailles
attendues. La nature de la fluorescence permet la caractérisation du nucléotide du site polymorphe considéré.
Exemple 1 : Origines des souches de PVY et préparation des échantillons
1.1 Virus et plantes hôtes
On a utilisé dans cette étude 42 isolats de PVY de pomme de terre caractérisés de manière sérologique et moléculaire appartenant aux différents groupes de PVY (PVYN ou PVY0) et variants (YN™ ou YN-W) -tableau 1). On a utilisé PVYN-605 (Jakab et al., 1997) et PVY°-139 (Singh et Singh, 1996) comme isolats de référence pour les groupes PVYN et PVY0 respectivement. On les a utilisé pour développer le test alors qu'on a utilisé d'autres isolats de PVY dans le processus d'évaluation du dosage développé. On a maintenu les isolats dans une serre par inoculation mécanique sur Nicotiana tabacum cv. Xanthi. On a utilisé ce dernier comme plante test dans un test biologique pour la caractérisation des isolats PVYN et PVY0, sur la base de leur capacité ou leur incapacité à induire des symptômes de nécrose des feuilles.
Tableau I : Origine et références des isolats PVY testés dans le cadre de l'invention
Souche isolât origine référence
605 Switzerland Jakab et al, 1997
C3VN Scotland Glais e? α/., 1996
IrI Ireland Glais e? α/., 1996
607 The Netherlands Glais e? α/., 1996
P21 Tunisia Fakhfakh et al, 1996
B203 France Glais e? al, 1998
N Sp20 Spain Blanco-Urgoiti e? α/., 1998
Sp 125 Spain Blanco-Urgoiti e? α/., 1998
TVNQ Canada Mc Donald and Kristjansson,
B4 France From this report
B7 France From this report
B8 France From this report
139 Canada Singh and Singh, 1996
IrI Ireland Glais e? al., 1998
Sc Scotland Glais e? al., 1998
O N1702 The Netherlands Glais e? al., 1998
Lw Poland Glais e? al., 1998
B18 France From this report i-P Poland Glais e? al., 1998
N242 France Glais e? al., 1998
BI l France Glais e? al., 2002
Spl7 Spain Blanco-Urgoiti e? al., 1998
B15 France From this report
N5 France From this report
N-W NlO France From this report
N12 France From this report
N15 France From this report
N324 France From this report
N341 France From this report
N362 France From this report
Lb Lebanon Glais ét al., 1996
FrOrI France Glais ét al, 1996
H Hungary Glais ét al, 1996
CzLukl Czech Republic Glais ét al, 1996
Sp47 Spain Blanco-Urgoiti ét al, 1998
Lx2 Tunisia From this report
NTN B6 France From this report
B9 France From this report
N4 France From this report
N18 France From this report
May2 France From this report
Dk Denmark From this report
1.2 Préparation de l'échantillon
On a extrait le jus brut des plantes de N. tabacum sains ou infectées par PVY en pressant les feuilles (0,5 g) dans une presse à cylindre, en présence de 1 mL de tampon de broyage froid (PBS ; 0,05 % (v/v) de Tween 20). On a immédiatement utilisé ces échantillons pour effectuer un test ELISA ou une extraction des acides nucléiques.
On a effectué un mode opératoire d'extraction "par feuilles humides" rapide adapté de Robert et al., 2000, en utilisant trois disques de feuille (0,2 cm2 chacun récoltés en utilisant un bouchon de microtube comme dispositif de perforation) de chaque plante. On a incubé le matériau récolté pendant 15 min à 95 °C dans 100 μL de tampon de broyage et on l'a placé à 4°C pendant 10 min. Après une étape de centrifugation (8 000 g pendant 5 min), on a récolté le surnagent, on l'a transféré dans un nouveau tube et on l'a dilué 10 fois dans de l'eau sans RNase. On a stocké les extraits à - 20 °C jusqu'à utilisation.
1.3 Dosage par méthode immunoenzymatique. (ELISA)
On a réalisé une détection de PVY dans une plante en utilisant un protocole DAS- ELISA. On a rempli les puits des plaques de microtitrage avec 1 μg/mL d'anticorps polyclonal de PVY (FNPPPT-INRA, France) dans un tampon carbonate (pH 9,6) pendant 2 h à 37 °C. Entre chaque étape du protocole ELISA, on a lavé les plaques trois fois avec un tampon PBST (PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20). On a ajouté 100 μL des jus bruts de plante dans les puits et on les a laissés jusqu'au lendemain à 4 °C. On a dilué les anticorps monoclonaux de souris conjugués à une phosphatase alcaline et dirigés contre le PVYN [Bioreba, Suisse] ou le PVYO/C [Adgen, Royaume-Uni] au
1/1000 ou au 1/2000 respectivement, dans un tampon de broyage complété avec 0,2 % d'ovalbumine (p/v). Selon la spécificité attendue de la détection, on a ajouté 100 μL de l'un de ces anticorps monoclonaux aux puits de la plaque pendant 2 heures à 37 °C. On a rempli les puits de la plaque avec 100 μL de phosphate de p-nitrophényle (1 mg/mL) dans un tampon substrat (diéthanolamine à 1 N, pH 9,6). Après incubation pendant 1
heure à température ambiante, on a lu l'absorbance des échantillons à 405 nm en utilisant un lecteur de plaque de microtitrage (Titertek Multiscan [MCC]).
1.4 Préparation des standard d'ARN viral pour les test par SNP
On a extrait l'acide nucléique total de 100 μL de jus brut pris dans des plantes infectées par PVYN-605 ou PVY0- 139, en utilisant un mode opératoire de phénol/chloroforme et on l'a remis en suspension dans 50 μL d'une eau sans nucléase. On a réalisé une transcription inverse de l'ARN viral avec 3 U de transcriptase inverse AMV [Promega], 10 pmoles de l'oligonucléotide 5'-9702GTCTCCTGATTGAAGTTTAC9682- 3' (SEQ ID No 13) (positions nucléotidiques selon l'isolât PVYN-605), 20 nmoles de dNTP, 20 U de RNasin [Promega] et 10 μL de l'extrait d'acide nucléique total. On a effectué la réaction selon les instructions du fabricant de l'enzyme dans un volume final de 20 μL. On a ensuite amplifié par PCR la région de l'ADNc correspondant à une partie des gènes HC-Pro/P3 de PVYN-605 ou PVY0- 139 en utilisant 2,5 U de la polymérase AmpliTaq [Applied Biosystems], 40 pmoles de l'amorce avant 5'-aacgtgtttctcgcgatgctaattaacattggcgaggagg-3' (SEQ ID No 11 correspondant à nt 2079 à 2108 de PVY0- 139 et comprenant un site Nruï) et l'amorce inverse 5'- agccatcagtataccaggggataatattgatagaatcaac-3' (SEQ ID No 12 correspondant à nt de 2592 à 2561 PVY°-139, et comprenant un site BstZ17l),
20 nmol de dNTP, 75 nmol de MgCl2, 10 μL d'ADNc et on a ajusté un volume final de 50 μL avec de l'eau stérile. On a fait des cycles de réaction avec un cycleur thermique Hybaid Express® pendant 40 cycles de 94°C pendant 1 min, 52 °C pendant 1 min et 72 °C pendant 1 min. On a clone séparément les produits de la PCR correspondant aux séquences de PVYN ou PVY0 dans les sites NmI et BstZIΑ dans d'un vecteur pBluescript modifié (pMTlink), dans lequel la cassette de clonage multiple de pBluescriptKS [Statagene] a été remplacée entre les sites Kpnl et Sacl par une courte séquence nucléotidique, comprenant les sites de restriction unique Kpnl-NruI-BstZl 71- Sacl. On a utilisé les plasmides résultants PMTMB N et PMTNB 0 pour produire des produits de la transcription de l'ARN viral correspondant aux nucléotides 2086 à 2591 de PVYN-605 et PVY0- 139 respectivement. On a séparément linéarisé 1 μg de
pMTiMBN et PMTNB 0 par Sacl, on l'a purifié en utilisant un protocole d'extraction par phénol/chloroforme et on l'a remis en suspension dans 5 μL d'eau sans nucléase. On a généré les produits de la transcription de l'ARN de PVY en présence de 15 U de l'ARN polymérase T3 [Promega], 10 mM de rNTP et 5 mM de dithiotreitol pendant 3 heures à 37 °C. On a complété le processus de la transcription in vitro par la digestion du plasmide en utilisant une ADNase I dépourvue d'activité ARNase pendant 15 min à 37 °C. On a extrait les produits de transcription viraux en utilisant la procédure d'extraction au phénol/chloroforme, de l'alcool isoamylique, on les a précipités et mis en suspension dans 100 μL d'eau sans ARNase. On a déterminé la concentration d'ARN final (μg/μL et copies/μL) par spectrophotométrie. On a effectué des dilutions des produits de la transcription in vitro de PVYN et PWY0 afin d'obtenir des solutions contenant 108, 107, 106, 105, 104, 103 ou 102 copies de l'ARN viral produit in vitro dans 2,5 μL.
Exemple 2 : Conception d'une amorce et d'une sonde et détection SNP
On a choisi le nucléotide 2213 de PVY (numéroté selon Jakab et al., 1997), signalé comme étant impliqué dans la nécrose des nervures du tabac de l'isolât PVYN-605 (Balme-Sinibaldi et al., 2004), pour définir deux sondes marquées par FAM-(SondeN) ou Vic-(Sonde°) de TaqMan®-MGB, [Applied Biosystems] correspondant aux séquences de PVYN-605 ou PVY0- 139 respectivement (figures 1 et 2). On a conçu les paires d'amorce sens (Fp) et anti-sens (Rp) (figure 2) qui encadrent les séquences ciblées par la sonde pour PVYN-605 (FpN et RpN) et PVY0- 139 (FpO et RpO) en utilisant le logiciel Primer Express [Applied Biosystems].
Test SNP utilisant des sondes fluorescentes TaqMan®
On a effectué des réactions de SNP basés sur la technologie TaqMan® dans un volume final de 25 μL en utilisant le kit One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit [Applied Biosystems], selon les instructions du fabricant. On a effectué des réactions de RT- PCR en une seule étape, réalisées avec 2,5 μL d'extraits de "feuilles humides » provenant de plantes saines ou infectées, ou en utilisant des produits de la transcription
in vitro, en utilisant le système ABI Prism 7700 Séquence Détection System [Applied Biosystems]. On a effectué la transcription inverse de l'ARN viral à 48 °C pendant 30 minutes. On a effectué la PCR avec une polymérase hot-start AmpliTaq [Applied Biosystems] et en utilisant une étape d'activation enzymatique (10 min à 95 °C), suivie de cycles de dénaturation/hybridation/extension (15 s à 95 °C ; 1 min à 60 °C). Pour chaque échantillon, on a lu les signaux de fluorescence correspondant à FAM, Vie et au contrôle interne ROX de Applied Biosystems® au point final du programme de RT- PCR. On a mathématiquement transformé les données obtenues (fluorescence brute) en utilisant le logiciel SDS vl.7 [Applied Biosystems], afin de produire des données correspondant au signal fluorescent du composant cible (FAMm et Vicm) et les données fluorescentes normalisées (FAMn et Vicn). On a répliqué le test SNP et le mode opération de validation complet dans au moins trois expériences indépendantes.
Exemple 3 : Détection de PVYN-605 et PVY°-139 dans des échantillons purs et mélangés en utilisant un dosage de SNP suivant l'exemple 2.
Selon les recommandations du fabricant et en prenant en compte les protocoles connus de RT-PCR en temps réel publiés au préalable (Fabre et al. 2003 ; Roberts et al. 2000), on a testé les deux sondes TaqMan® (SondeN et Sonde0) et les paires d'amorce (FpN et RpN ; FpO et RpO) à différentes concentrations allant de 50 nM à 900 M. Les signaux fluorescents récoltés à la fin des réactions de PCR étaient optimaux quand chaque sonde était inclus à 200 nM et les quatre amorces à 800 nM. On a effectué trente-deux cycles de PCR dans toutes les expériences de détection pour éviter le clivage non spécifique des sondes observées dans les expériences utilisant plus de 35 cycles de PCR. On a effectué le test SNP sur la base de quatre répétitions, y compris un contrôle sans matrice (NTC) ou des produits de la transcription de l'ARN virale in vitro (106 PVYN ou 1O6 PVY0 copies/réaction) et avec duplication des échantillons mélangés contentant PVYN et PVY0 (106 de chaque type d'ARN). On a enregistré des signaux fluorescents bruts (CFS) associés à chaque sonde à la fin de la réaction de RT- PCR en une seule étape (figure 3). Pour les échantillons NTC, CFS correspond au niveau fluorescent de base du système (0,782 ± 0,024 et 0,424 ± 0,008 pour la
fluorescence de FAM et de Vie respectivement), produit par les sondes non clivées (figure 3A). Quand on a testé les échantillons contenant les produits de la transcription de l'ARN, les CFS associés à une sonde ont augmenté selon le type d'ARN présent dans les échantillons testés (SondeN (signal FAM) et Sonde0 (signal Vie) pour PVYN et PVY0 respectivement),. Ce résultat prouve l'hybridation hautement spécifique des sondes à leurs cibles d'ARN et l'absence de tout niveau significatif d'interaction non spécifique. Dans les échantillons mélangés YN/Y°, à la fois les signaux fluorescents de FAM et de Vie ont augmenté de manière significative quand on les compare aux données NTC, ce qui reflète la liaison et le clivage de deux sondes au cours de la réaction de PCR. La représentation graphique des données des signaux fluorescents bruts (figure 3B) illustre à la fois la distinction de quatre zones correspondant à chaque d'échantillon testé et dans ces zones, la variation du niveau fluorescent enregistré pour chaque réplication.
Exemple 4 : Test de la sensibilité du test SNP de PVYN/O
On a produit et testé des fractions issues de dilutions en série contenant de 107 à 103 copies d'ARN/2,5 μL, de transcript in vitro de PVYN et PVY0 en utilisant le protocole de test SNP, afin de déterminer la limite de détection de ce nouveau procédé (figure 4). Une bonne corrélation a pu être observée entre la quantité virale décroissante dans les échantillons testés et la baisse du signal fluorescent, à la fois pour PVYN et PVY0 (figure 4A). On a détecté de manière efficace les trois dilutions les plus concentrées et on les a identifiées comme un type PVYN ou PVY0 par le dosage SNP (figure 4A) ; 107, 106 et 105 fractions dans les zones de PVYN et PVY0). Cependant, quand on a testé les échantillons contenant seulement 104 et 103 molécules d'ARN, les données fluorescentes obtenues étaient soit proches (104) soit non distinguâmes (103) de celles associées aux échantillons NTC. Les variations de ces données pour les réplications de NTC (figures 3A et 3B) fait qu'il est difficile d'identifier clairement le seuil fluorescent qui délimite la détection de PVY positive de la détection de PVY négative. Afin de résoudre ce problème, le logiciel SDS sofware® [Applied Biosystems] permet des transformations mathématiques du signal fluorescent brut en données fluorescentes
cibles (figure 4B) et en données fluorescentes normalisées (figure 5C). Ces données permettent de déterminer de manière précise la dilution du critère d'évaluation du dosage SNP dans la gamme (104 à 105) pour PVYNet PVY0.
Exemple 5 : Co-détection de PVYN et PVY° en mélange dans un échantillons (mimant une co-infection)
En utilisant des fractions contenant entre 104 et 108 de produits de la transcription in vitro de PVYN ou PVY0 [NruI-BsZ17I], on a préparé plusieurs fractions mélangées, en créant des échantillons avec des rapports de YN/Y° de 1/100 à 100/1 (tableau 2 et figure 5). On a testé ces fractions comme des échantillons inconnus dans un dosage SNP comprenant NTC, des échantillons de contrôle de PVYN purs (106 produits de la transcription) et de PVY0 purs (106 produits de la transcription). Les données fluorescentes bruts obtenues à partir des échantillons purs (F AM=I, 753 et Vic=l,276 pour PVYN et PVY0, respectivement) étaient équivalentes à celles obtenues dans les échantillons mélangés contenant 106 copies des deux types d'ARN (rapport 1/1 ; PVYN et PVY0 à 106 copies ; FAM=I, 653 et Vic=l,198). Ceci illustre que la détection simple et la co-détection de PVYN et/ou PVY0 dans des échantillons contenant des quantités similaires d'ARN ciblée étaient efficaces pour les deux cibles. Comme précédemment démontré, la quantité d'ARN de PVY présente dans les échantillons tests influence directement le niveau fluorescence brute. Les fractions contenant 108 copies des deux types d'ARN de PVY étaient associées à des valeurs de CFS élevées (proches de 2,000), alors que les fractions contenant seulement 104 copies d'ARN de PVY ont produit des données de CFS (FAM=0,860 et Vic=0,563) proches de celles attendues pour le contrôle négatif (NTC ; FAM=0,754 et Vic=0,427). L'utilisation des données fluorescentes cibles (tableau 2) avec le seuil de détection de FAMt et Vict (figure 5) fait qu'il est facile de distinguer la détection simple d'une co-détection. En prenant en compte les observations, on a efficacement caractérisé les fractions avec des quantités d'ARN de PVY allant de 105 à 108 à un rapport de YN/Y° de 1 comme des échantillons mélangés. Quand on a testé les fractions contenant un type d'ARN de PVY en excès (rapport=l/100, 1/10, 10/1 ou 100/1), le CFS pour une quantité constante d'un type
d'ARN de PVY est réduit selon l'excès de l'autre type d'ARN de PVY (PVYN=106 : FAMm était 1,216, 0,970, 0,798, 0,454 et 0,68 pour les échantillons contenant 104, 105, 106, 107 et 108 PVY0, respectivement)..
Exemple 6 : Validation du test SNP sur une large gamme d'isolats de PVY
On a validé le test SNP développé en utilisant une large gamme d'isolats de PVY comprenant trente-sept isolats européens, deux isolats africains, deux isolats nord- américain et un isolât du proche orient, appartenant aux groupes PVYN et PVY0, comprenant des variants PVYN™ et PVYN-W (tableau 1). On a caractérisé les propriétés biologiques et sérologiques des quarante-deux isolats en utilisant les observations des symptômes sur N. tabacum cv. Xanthi et des tests ELISA (tableau 3). Tous les résultats étaient en accord avec les résultats attendus. On a préparé des extraits de « feuilles humides » provenant de N. tabacum cv. Xanthi infectées par ces isolats de PVY et on les a testées en utilisant le test SNP développé. Les données fluorescentes cibles et les résultats diagnostiques de SNP associés à chaque échantillon testé sont présentés dans le tableau 3. Tous les 42 isolats de PVY testés ont pu être correctement assignés par le test SNP dans leur groupe de PVY respectif. Les variants pyyNTN et pγγN"\y ont été correctement caractérisés comme membres du groupe PVYN. Comme on s'y attendait, aucun des échantillons testés provenant de notre collection d'isolats de PVY n'a été identifié par le test SNP comme un échantillon co- infecté.
Exemple 7: détection spécifique des isolats PVYN et PVYO à l'aide de la technique d'élongation d'amorces par un nucléotide (ddNTP) fluorescent
Apres avoir extrait les acides nucléiques du matériel végétal à tester, une étape de RT- PCR est réalisée de manière semblable à celle décrite dans l'exemple 1.4. Le produit d'amplification obtenu est ensuite purifié à l'aide d'une étape de filtration sur une matrice de type Sephadex G-50 afin d'éliminer les nucléotides libres et les composants (enzyme, amorces...) encore présents dans l'échantillon. Le produit PCR (amplicon)
purifié subit ensuite une étape d'élongation par l'intermédiaire d'une réaction de polymérisation cyclique (10 secondes à 96°C, 5 secondes à 50°C et 30 secondes à 60°C) réalisée 25 fois en présence des amorces s'hybridant en amont ou en aval des sites polymorphes à caractériser, d'une enzyme de type Taq polymérase et en présence de ddNTP (possédant un marquage fluorescent différentiel). A l'issue de cette phase d'élongation simple, les échantillons sont mis en présence d'une unité d'alcaline phosphatase et incubés 1 heure à 37°C afin de limiter la perturbation de la lecture des résultats par les ddNTP libres. L'enzyme est ensuite désactivée par incubation de l'échantillon 15 minutes à 75°C. Enfin, l'échantillon est déposé sur un gel de polyacrylamide et subit une migration sous l'effet d'un champ électrique. Afin de pouvoir à terme positionner les différents signaux fluorescent enregistrés au fur et à mesure de la migration, un marqueur de taille (standard possédant des fragments nucléotidiques fluorescents de différentes tailles allant de 10 à 120 nucléotides) a été ajouté à chaque échantillon avant dépôt sur le gel d'électrophorèse. La vitesse de migration en gel de polyacrylamide étant proportionnelle à la taille (longueur) des molécules, le marqueur de taille permet d'identifier la taille de chaque amorce observée durant la migration. La nature de la fluorescence de ces amorces permet d'en identifier la nature du ddNTP fluorescent auquel elle est liée. Ce ddNTP fluorescent correspond à la base complémentaire du nucléotide polymorphe initialement présent sur la molécule cible présente dans l'échantillon testé. Les principes généraux de ce test sont schématisés aux figures 9 et 10.
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Claims
1. Procédé de détection de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) extraction des acides nucléiques d'un échantillon de plante, b) amplification RT-PCR d'une région de l'ARN viral de PVY comprenant les codons 738 et 757 (SEQ ID No 1 et 3) correspondant aux acides aminés 400 et 419 respectivement de la protéine HC-Pro (SEQ ID No 2 et 4, fig 7A et 7B), c) détection de la présence ou de l'absence des mutations R/IQoo et D/E419, la détection d'au moins une desdites mutations étant une indication d'une souche de PVY virulente pouvant être responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à R/IQoo et D/E419 au moyen i) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et ii) d'au moins une sonde marquée spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent, caractérisé en ce que la présence d'au moins une desdites mutations R/IQoo et D/E419 est une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape c) comprend la détection sur les cDNA obtenus à l'étape b) de la présence ou de l'absence de mutations correspondant à R/IQoo et D/E419 au moyen d'une réaction d'extension d'amorces oligonucléotidique à l'aide de ddNTP marqués différentiellement et i) d'une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polymorphe 2213 du codon 738 et ii) d'une amorce non marquée s'hybridant
spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polyporphe 2271 du codon 757, la présence d'au moins une desdites mutations RZK400 et D/E419 étant une indication de la présence d'une souche de PVY virulente responsable de la nécrose chez les plantes de la famille des Solanacées.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'en un seul test, on détecte les 4 génotypes/phénotypes suivants :
- [R400 , D419] (souche incapable d'induire la nécrose) - [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , E419] (souche induisant la nécrose).
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est effectué chez la pomme de terre.
6. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que la détection à l'étape c) de souches de PVY [R400 , E419] et/ou [K400 , D419] et/ou [K400 , E419] est une indication que la plante de pomme de terre est contaminée avec une ou plusieurs souche(s) induisant des nécroses tuberculaires.
7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme sonde i) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 (correspondant à R/IQoo), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde i) comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 7 : ctcaaatgαααatattctac
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'on utilise en outre une sonde i) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AGA avec le polymorphisme G22i3.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la sonde i) contrôle comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2213, notamment la SEQ ID No 8 : ctcaaatgαgαatattcta
11. Procédé selon l'une des revendications 9 et 10, caractérisé en ce que la sonde i) et la sonde i) contrôle sont marquées différemment.
12. Procédé selon l'une des revendications 2 et 7 à 11, caractérisé en ce qu'on utilise comme sonde ii) à l'étape c), au moins une sonde spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la sonde ii) comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2271, notamment avec la séquence 5'- cgatcacgααacgcagaca - 3' (SEQ ID No 9) ou 5'- atcac^ααacgcagaca - 3' (SEQ ID No 20).
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'on utilise en outre une sonde ii) contrôle à l'étape c), en particulier une sonde s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAC avec le polymorphisme C227i-
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la sonde ii) contrôle comporte de 14 à 40, de 15 à 25 ou de 18 à 22 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 6 (Figure 1) et comprenant le
nucléotide en position 2271, notamment avec la SEQ ID No 10 : 5'- accatgαçactcaaa - 3' ou avec la SEQ ID No 21 : 5'- tgaccatgαçactcaa -3'
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que la sonde ii) et la sonde ii) contrôle sont marquées différemment.
17. Procédé selon l'une des revendications 7 à 16 dans lequel les sondes comporte un marqueur fluorescent (reporter) et une molécule captant le signal lorsqu'elle se trouve à proximité du marqueur fluorescent (quencher).
18. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme amorce i) à l'étape c), au moins une amorce s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval du nucléotide polymorphe du codon 738 (correspondant à R/IQoo), en particulier une amorce s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 738 est AAA avec le polymorphisme A2213.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'amorce i) comporte de 10 à 120 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2212 ou 2214.
20. Procédé selon la revendications 3, caractérisé en ce qu'on utilise comme amorce ii) à l'étape c), au moins une amorce s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval du nucléotide polymorphe du codon 757 (correspondant à D/E419), en particulier une amorce s'hybridant spécifiquement à la séquence cible lorsque le codon 757 est GAA avec le polymorphisme A2271.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que l'amorce ii) comporte de 10 à 120 ou encore 20 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 5 (Figure 1) et comprenant le nucléotide en position 2270 ou 2272.
22. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lors de l'étape b), la transcription inverse est effectuée avec au moins 2 paires d'amorces sens et antisens.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que la transcription inverse est effectuée au moins avec une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, et au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY0.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la première paire d'amorces (FpN et RpN) comprend une amorce sens FpN et une amorce antisens RpN pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 1 ou 5.
25. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l'amorce sens FpN se situe en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpN se situe en aval du codon 757 polymorphique.
26. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'on met en œuvre deux premières paires :
- FpNl en amont du codon 738
- RpNl en aval du codon 738
- FpN2 en amont du codon 757
- RpN2 en aval du codon 757
27. Procédé selon l'une des revendications 23 à 26, caractérisé en ce que la deuxième paire d'amorces (FpO et RpO) comprend de préférence une amorce sens FpO et une amorce antisens RpO pouvant comporter une séquence de 20 à 40 nucléotides consécutifs d'une séquence s'hybridant avec la séquence SEQ ID No 3 ou 6.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'amorce sens FpO se situe en amont du codon 738 polymorphique et l'amorce RpO se situe en aval du codon 757 polymorphique.
29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'on met en œuvre deux deuxièmes paires :
- FpOl en amont du codon 738
- RpOl en aval du codon 738
- FpO2 en amont du codon 757 - RpO2 en aval du codon 757
30. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce les amorces des deux paires sont choisies parmi :
Amorces sens pour YN SEQ ID No 22 Fl : 5'-ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGT-S'
SEQ ID No 23 F2 : 5'-ATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTC-S'
SEQ ID No 24 F3 : 5'-CATGATGCAGAACTGCCTAGAATACTA-S'
Amorces anti-sens pour YN :
SEQ ID No 28 Rl : 5'-GTGAGCCAAACGAGTCAACTACAT-S' SEQ ID No 29 R2 : 5'-TTTGTGAGCCAAACGAGTCAACTA-S'
SEQ ID No 30 R3 : 5'-TTGTGAGCCAAACGAGTCAACT-S'
Amorces sens pour YO
SEQ ID No 25 Fl : 5'-GCAGAGCTGCCTAGTTTATTGGTT-S'
SEQ ID No 26 F2 : 5'-ATGATGCAGAGCTGCCTAGTTTATT-S' SEQ ID No 27 F3 : 5'-TGCAGAGCTGCCTAGTTTATTGG-S'
Amorces anti-sens pour YO :
SEQ ID No 31 Rl : 5'-GCCAAATGAGTCAACCACATGA-S' SEQ ID No 32 R2 : 5'-AGCCAAATGAGTCAACCACATG-S' SEQ ID No 33 R3 : 5'-CCAAATGAGTCAACCACATGACA-S'
31. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la détection et l'identification du nucléotide polymorphe en position 2213 est réalisée avec une amorce sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 34 OUI: 5'-GACAACTTGTGCTCAAATGA-S'
SEQ ID No 35 OH2: 5'-CTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S' SEQ ID No 36 OH3: 5'-TGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S'
SEQ ID No 37 OH4: 5'-CATGATGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S'
SEQ ID No 38 OH5:
5 '-CCAACCATGATGGATCTGGCGACAACTTGTGCTCAAATGA-S ' et une amorce anti-sens sélectionnée parmi : SEQ ID No 39 OH6: 5 '-GAACATCAGGGTAGAATATT-3 '
SEQ ID No 40 OH7: 5'-ATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 41 OH8: 5'-TCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 42 0119!5'-GCAGTTCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S'
SEQ ID No 43 Olil0: 5 '-TCTAGGCAGTTCTGCATCATGAACATCAGGGTAGAATATT-S '
32. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la détection et l'identification du nucléotide polymorphe en position 2271 est réalisée avec une amorce sens sélectionnée parmi : SEQ ID No 44 Olil 1 : 5'-GCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S'
SEQ ID No 45 Olil2: 5'-GAACTGCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S' SEQ ID No 46 Olil3: 5'-GAACTGCCTAGAATATTGGTTGACCATGA-S' SEQ ID No 47 Olil4: 5'-ATGCAGAACTGCCTAGAATACTAGTCGATCACGA-S ' SEQ ID No 48 Olil5: 5'-ATGCAGAACTGCCTAGAATATTGGTTGACCATGA-S' et une amorce anti-sens sélectionnée parmi :
SEQ ID No 49 Olil6: 5'-GTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S'
SEQ ID No 50 OH17: 5'-AACGAGTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S' SEQ ID No 51 OH18: 5'-AACGAGTCAACTACATGGCATGTCTGCGT-S' SEQ ID No 52 Olil9: 5'-AACCAAACGAGTCGACCACATGGCATGTCTGAGT-S' SEQ ID No 53 OH20: 5'-AGCCAAACGAGTCAACTACATGGCATGTCTGCGT-S'
33. Procédé de sélection sanitaire de plants de la famille des Solanacées susceptibles d'être infectées par une ou plusieurs souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires, notamment de nécroses tuberculaires chez la pomme de terre, comprenant la mise en œuvre systématique du procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 32 sur les semences, plants et/ou plantes susceptibles d'être mis en culture et procéder à la destruction ou mise sous quarantaine desdites semences, plants ou plantes contaminés avec une souche présentant au moins un des polymorphismes correspondant à :
- [R400 , E419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K400 , D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400 , E419] (souche induisant la nécrose)
34. Kit de détection de la présence ou de l'absence d'isolats du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY0. - au moins une sonde marquée i) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 738 et au moins une sonde marquée ii) spécifique d'un polymorphisme sur le codon 757, lesdites sondes i) et ii) étant définies selon l'une des revendications 5 à 6 et 10 à 11 respectivement, et présentant des marqueurs émettant un signal de fluorescence différent.
35. Kit de détection selon la revendication 26 comprenant en outre les sondes i) et ii) de contrôle telles que définies selon l'une des revendications 7 à 8 et l2 à l3 respectivement, les sondes i) et contrôle i) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents, les sondes ii) et contrôle ii) étant marquées avec des marqueurs de fluorescence différents.
36. Kit de détection de la présence ou de l'absence d'isolats du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins une première paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVYN, au moins une deuxième paire d'amorces permettant l'amplification de séquences nucléotidiques incluant les codons 738 et 757 des souches du type PVY0. - une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polymorphe 2213 du codon 738 et ii) d'une amorce non marquée s'hybridant spécifiquement en amont ou en aval (+/-1 nt) du nucléotide polyporphe 2271 du codon 757, notamment une amorce sens et une amorce antisens selon la revendication 31 et une amorce sens et une amorce antisens selon la revendication 32.
37. Kit de détection selon l'une des revendications 34 à 36 comprenant une solution comprenant les amorces à une concentration optimale se situant entre 400 nM et 1200 nM, notamment 800 nM et une solution comprenant les sondes à une concentration se situant entre 100 nM et 300 nM, notamment 200 nM.
38. Sonde ou collection de sondes définie(s) selon l'une des revendications 2 et 6 à 16.
39. Amorce ou collection d'amorces défïnie(s) selon l'une des revendications 3, 18 à
32.
40. Utilisation d'une sonde ou collection de sondes selon la revendication 38 et/ou d'une amorce ou d'une collection d'amorces selon la revendication 39 pour la détection
de la présence ou de l'absence de souches du virus PVY responsables de nécroses nervaires, foliaires ou tuberculaires chez les plantes de la famille des Solanacées, notamment chez la pomme de terre, l'aubergine, la tomate, les piments et le tabac.
41. Lot de semences, plants et/ou plantes de la famille des Solanacées, caractérisé en ce qu'il est dépourvu de semences, plants ou plantes contaminés avec une souche de PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à :
- [R400, E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K400, D419] (souche capable d'induire la nécrose) - [K4OO, E419] (souche induisant la nécrose).
42. Lot de plants ou tubercules de pomme de terre, caractérisé en ce que qu'il est dépourvu de plants ou tubercules contaminés avec une souche de PVY présentant au moins un des polymorphismes correspondant à : - [R4OO, E419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K4OO, D419] (souche capable d'induire la nécrose)
- [K4OO, E419] (souche induisant la nécrose).
43. Lot selon la revendication 41 ou 42 susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre du procédé selon la revendication 33 ou du kit selon l'une des revendications 34 à 37.
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