EP1812587A1 - Atp-metry for detecting and counting viruses - Google Patents

Atp-metry for detecting and counting viruses

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Publication number
EP1812587A1
EP1812587A1 EP05812075A EP05812075A EP1812587A1 EP 1812587 A1 EP1812587 A1 EP 1812587A1 EP 05812075 A EP05812075 A EP 05812075A EP 05812075 A EP05812075 A EP 05812075A EP 1812587 A1 EP1812587 A1 EP 1812587A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
atp
target
adp
virus
viruses
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05812075A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Dominique Champiat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Testlife Technologies
Original Assignee
Testlife Technologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Testlife Technologies filed Critical Testlife Technologies
Publication of EP1812587A1 publication Critical patent/EP1812587A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a novel ATP-metry technique for detecting and counting viruses from adenine nucleotides (AN) of host cells or genetic inheritance (DNA or RNA) of viruses. It also relates to the use of this new technique and a method of implementation from host cells according to whether the viruses to be determined are lytic (at the end of their development, they cleave the wall of the host cells) or non-lytic. (at the end of their development, they cross the wall of the host cells without destroying it), on the one hand, or from the DNA or the RNA of the viruses according to whether they are DNA or RNA viras , on the other hand.
  • Prior art is a novel ATP-metry technique for detecting and counting viruses from adenine nucleotides (AN) of host cells or genetic inheritance (DNA or RNA) of viruses. It also relates to the use of this new technique and a method of implementation from host cells according to whether the viruses to be determined are lytic (at the end of their development, they cleave the wall
  • This reaction is specific for I 1 ATP, regardless of the system used luciferin (substrate) / luciferase (enzyme). It distinguishes dead cells (lacking ATP) from living cells when they contain 1 I ATP.
  • ATP-metry is not applicable to viruses as organisms, therefore the viruses are free of ATP, ADP and free intracellular AMP.
  • viruses use ATP from their host cells. When they mature, they leave their host cells to infect other cells.
  • viral expressed as ATP, taking into account that the sum of the ATP, ADP and AMP of the genetic material of the same family of viras is constant according to said relationship (2), said measurement being carried out (i) without addition of ATP and (ii) after addition of a known amount of ATP.
  • a method for detecting and enumerating by ATP-metry the viruses from the ANs of the target cells, or ANs obtained by cleaving DNA or viral RNA, said AN being expressed under form of ATP there is provided a metering kit for carrying out said method.
  • Said assay kit is characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly and ATP for the metered addition, and optionally the myokinase, the pyruvate kinase, a DNA-ase, a RNA-ase and / or pyruvate orthophosphate dikinase, and / or microbeads coated with ApoH or a virus-specific antibody to be determined.
  • Said necessary may further include, where appropriate, living and healthy cells of the target.
  • ATP adenosine triphosphate
  • cAMP adenosine cyclic monophosphate
  • adPad adenosine diphosphate dimer
  • dAMP adenosine monophosphate dimer
  • GDP guanosine diphosphate
  • GTP guanosine triphosphate NDPK nucleotide diphosphate kinase RLU relative light unit.
  • Viruses are not cells. These are intracellular parasitic structures. Viruses can only reproduce when they are inside a cell. We then speak of virions (viral particles). A virus outside a cell has no metabolic activity. Viruses that parasitize prokaryotic (bacteriophage) cells are distinguished from those that parasitize eukaryotic cells.
  • viruses are essentially as follows. They occupy a "strange undetermined region" between the living and the non-living
  • any cell reproduces by increasing in size and then dividing into two new cells, each containing a complete assortment of components necessary for life.
  • viruses are disassembled into their components, i.e., into proteins and nucleic acids; the metabolic machinery of the host cell then produces a few tens to a few hundred viral genomes and as many protein capsids that will constitute the new viral envelopes. All these components are then assembled and produce new viral particles definitively.
  • viruses do not grow. It seems that they do not obey the laws of thermodynamics that apply to open systems. In addition, viruses can be crystallized. This is a property of minerals and most organic molecules, but not of the living cell. Placed in good humidity conditions and in the presence of living cells, the viruses make them produce new viral particles. Viral life cycles
  • viruses consist of a nucleic acid and an envelope.
  • the viral genome II consists of a single molecule of nucleic acid (DNA or RNA), generally linear or circular, ranging from a few genes to several hundred, which represents a certain number of bases (NMP: AMP, CMP, GMP, TMP in the case of RNA, ribonucleic acid) or (dNMP: dAMP, dCMP, dGMP, dTMP in the case of DNA, deoxyribonucleic acid).
  • NMP AMP, CMP, GMP, TMP in the case of RNA, ribonucleic acid
  • dNMP dAMP, dCMP, dGMP, dTMP in the case of DNA, deoxyribonucleic acid
  • the nucleic acid is surrounded by a protein shell: the capsid. In some viruses, this capsid is itself surrounded by a membranous envelope, formed of a lipid double layer containing proteins.
  • the first two cycles concern almost exclusively bacteriophages.
  • the genetic material is a double-stranded DNa molecule of size 5 to 650 kbp (a potential of 10,000 to 1300000 nucleotides triphosphate) and their size varies from 24 to 200 nm.
  • the lytic cycle occurs when a virus invades a cell, reproduces, then disperses as a result of lysis of the host cell.
  • a cell invaded by a lytic virus is almost invariably killed in a short period of time.
  • nucleotides bases: ATP, CTP, GTP, TTP, or XTP
  • bases: ATP, CTP, GTP, TTP, or XTP will have been manufactured by the machinery of the host cell.
  • the bacteria bursts and releases many virions.
  • This remark is very important to allow us to differentiate between nucleic acids derived from viruses or any other prokaryotic or eukaryotic cell, because before the hydrolysis of nucleic acids, we will test the adenyl nucleotides present which will testify to the presence of non-viral cells. .
  • the lysogenic cycle occurs when a virulent or lytic virus combines its genetic material with that of the host cell and thereby becomes dormant.
  • the DNA (or RNA) of the virus replicates at the same time as that of the host cell, which is called a lysogenic cell; the virus or phage is called prophage.
  • a lysogenic cell the virus or phage is called prophage.
  • prophage a lysogenic cell
  • Certain stimuli cause the prophage to become virulent and to begin a lytic cycle.
  • the lysogenic cell is then lysed and the viral particles are released.
  • the viral DNA (or RNA) integrates into the bacterial chromosome. The bacteria continues to live until an external event makes it switch to the lytic cycle. Certain lysogenic bacteria are of great importance to human health.
  • the bacterium responsible for diphtheria produces the toxin responsible for this disease only if its DNA is infected with a prophage carrying the gene that codes for diphtheria toxin.
  • the same phenomenon is observed in Clostridium botulinum, responsible for botulism, and in Streptococcus pyogenes, the scarlet fever agent. So in these cases (lytic cycle see lysogenics since during the latter, the virus becomes dormant until until an external event makes it switch in the lytic cycle.), It is the extracellular AN assay ( released by lysis of the host cell wall) and totals of said host cells that will highlight the presence of viruses.
  • the extracellular NA will allow us to quantify the number of viruses and the ratio AN e ⁇ tra / NAt o rate will give us the level of contamination. For example if AN extra - AN tota u x this implies that all host cells are lysed thus dead (necrosis).
  • the continuous release cycle is the result of a few phages and many animal viruses. These viruses reproduce and are released continuously by host cells that remain intact. Viruses enter the cell through endocytosis. The vesicle endocytosis fuses with a lysosome, which allows the release of the viral capsid which can release its genetic material into the cytoplasm of the host cell. The genetic material is replicated and used to produce new capsids including viral genetic material to form nucleocapsids. These are transported by the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus from the host cell to the plasma membrane where the viral particle buds and is released, surrounded by a membrane envelope from the host cell. Influenza, mumps, measles or rabies viruses have such continuous release cycles.
  • the extracellular AN assay does not provide information, however, as previously reported, given the metabolic and particularly energetic disruption of the host cell in the presence of viruses, the total AN assay will make it possible to detect this anomaly by compared to the NA assay of the same cells without viras
  • This sensitivity can be increased by assaying the other nucleotides of the host cell by luminescence as proposed in the article by M. Gendraud, Physiol. Veg. 1977 15 (1) 121-132, according to the mechanism:
  • step (4 °) introducing into the medium resulting from step (4 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP;
  • step (7 °) may include the use of a pre-established chart system.
  • the content of extracellular total ANs can be determined by comparison with that of the cells of the target obtained by reproducing steps (1 °) at (7 °) in the absence of said virus, and then deduce therefrom the number of strains of said virus (V) in the initial sample (E).
  • the technique of metered addition allows a good direct determination of the number of strains of the virus. It also relates to a method for detecting and counting strains of a bioluminescence continuous release virus according to reaction (1):
  • aqueous liquid sample which is capable of containing strains of a virus (V) to be tested and which is devoid of Free AN; (2a) contacting said sample (E) with the cells of the target;
  • (3a) incubate the resulting reaction medium until the virus arriving at the end of its development through the wall of the target;
  • (7a) determine the total intracellularly free AN content, in the form of ATP, and deduce the number of strains of said virus (V) in said sample (E).
  • Step (7a) can be carried out as described 'above for step (7 °); especially by comparison. with the target cells treated by reproducing the steps (°) to (7a °) in the absence of said virus ,.
  • the determination of the total intracellular NA content can be performed by means of a pre-established mapping system. We then deduce the number of strains of said virus (V) in said sample (E). In short the steps (1 °) - (2 °) and (5 °) are identical to the steps (°) -
  • steps (3 °) and (6 °) - (7 °) are substantially similar to steps (3a) and (6a) - (7a); and step (4 °) is different from step (4a °).
  • the procedures for implementing identical or similar steps will be dealt with in common. On the other hand, those of the respective steps (4 °) and (4a °) will be treated separately.
  • the sample (E) is an aqueous liquid composition, where appropriate it can be an organic liquid composition.
  • This sample (E) comes from a sampling gas [in particular by bubbling], solid [in particular by contact, dissolution or dispersion] or liquid [by extraction, dissolution or emulsion] by means of a liquid which is advantageously aqueous.
  • the reaction (1) above provides oxyluciferin, photons, AMP and one or more phosphates, mainly pyrophosphate. It is specific for ATP, luciferin and luciferase being at an optimal concentration, the number of photons emitted as soon as these three substances are present, is directly proportional to the amount of ATP. In the body and any reaction medium, the extracellular ATP disappears relatively quickly, either by reuse or mainly by degradation.
  • ATP is involved in the cell as a source of energy (mechanical energy, osmotic energy, chemical energy, caloric energy, light energy) phosphate donor, pyrophosphate donor, MPA donor and adenosine donor.
  • the ATP content in cells of the same species varies greatly depending on the physiological state.
  • the detection threshold is of the order of 10 3 bacteria. According to the invention, a better sensitivity will be attained, ranging from 1 attomole of ATP (without stabilization of the emitted light signal) to 0.5 attomole of ATP (with stabilization of said signal), which corresponds approximately to the content mean total intracellular NA of a bacterium.
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • step (1 °) or (la) of the process of the invention which relates to the isolation and concentration, is carried out by membrane filtration, evaporation-centrifugation, in particular under vacuum and at room temperature (15-25 ° C.), and / or immunocapture.
  • the immunocapture technique is preferred. It allows the concentration and purification of strains of the virus by fixing them with antibodies.
  • these antibodies can be directed against surface antigens of the virus without destroying it.
  • these antibodies are immobilized on magnetic latex microbeads for concentration and purification of virus-antibody-bead conjugates in a magnetic field and for the collection of said conjugates.
  • non-magnetic or non-magnetizable microbeads, bound to the antibodies that bind the virus strains also allow, by decantation, the concentration and purification of said strains.
  • the best mode for implementing immunocapture is to use magnetic microbeads coated with ApoH, a protein that binds living matter and does not fix fragments, especially the wall, of dead organisms. It is recalled that ⁇ poH is a protein that occurs only just before or at the time of cell death (apoptosis).
  • Said conjugates are then separated, if necessary, in particular by elution, in order to have a concentrated liquid composition of viral strains which are no longer bound to the antibodies.
  • Evaporation-centrifugation at room temperature offers the advantage of being able to remove most of the water from the medium containing the strains.
  • the steps (2 °) - (3 °) or (2a °) - (3a °) relating to the contacting of viral strains with the strains of the target and then to their development are carried out according to a method. known to the person skilled in the art.
  • step (4a) lysis of the cell wall of the target is carried out in the medium resulting from step (3a °) by addition of an aqueous buffer containing
  • the transformation at step (4 °) or (4a °) of the ADP and AMP in ATP is carried out by means of myokinase and pyruvate kinase.
  • the reaction mechanisms are as follows:
  • step (5 °) of the process of the invention relating to the conversion of ADP and AMP to ATP can be carried out simultaneously with step (4 °).
  • step (5 °) or (5a °) of the process of the invention is implemented with luciferin and firefly luciferase (Photinus pyralis).
  • the substrate and the enzyme can be extracted simultaneously from the firefly.
  • step (6 °) or (6a °) relating to the measurement of the light emitted by the reaction (1) in the presence of a substance stabilizing the emission of photons to a value substantially constant for at least 10 minutes.
  • suitable substances for this purpose are:
  • PPDK Pyruvate orthophosphate dikinase
  • Adenosine phosphate deaminase which degrades the residual ADP and / or AMP that may be present in the reaction medium
  • the first enzyme provides a stable signal by regenerating the ATP substantially continuously.
  • the second enzyme makes it possible to reduce the background noise due to the residual presence in the test medium of ADP and / or AMP, without the process of using ATP as a source of light energy being disturbed. .
  • Said second enzyme adenosine phosphate deaminase, is more advantageously used to eliminate the nucleotide residues in the reaction medium and more particularly to eliminate by destroying the extracellular nucleotide residues present in the sample where appropriate in the step (1) above.
  • the method of the invention is particularly suitable for the detection and enumeration of viruses, such as HIV, bacteriophages, hepatitis C virus.
  • viruses such as HIV, bacteriophages, hepatitis C virus.
  • the ANs, initially bound and thus obtained, are converted into ATP by means of Myokinase and Pyruvate kinase as in step (4 °).
  • Photon emission is carried out by means of firefly luciferol and firefly luciferase as indicated above for carrying out step (5 °) or (5a °) without addition of ATP and then after metered addition of ATP.
  • the firefly luciferin / luciferase assembly is commercially available, especially from the company known as Controlife.
  • the procedure is as described above by stabilizing said photon emission by means of PPDK.
  • the measurement of the amplified signal and the determination are carried out as indicated above in steps (6 °) and (7 °).
  • a method for detecting and counting viruses by ATP-metry is recommended, said method being characterized in that it comprises:
  • aqueous liquid sample (E) is used as in step (1 °) above. Insulation / concentration is carried out by
  • the virus wall is lysed by adding an aqueous buffer containing (i) Tris plus EDTA, and / or (ii) DMSO, followed by microwave treatment (for about 1 minute) to open the target cells, followed by rapid cooling (especially at refrigerator) and, if necessary, centrifugation to collect the resulting liquid medium.
  • the viral DNA or RNA is cleaved by means of (i) endonucleases to release ologonucleotides, for example DNA-ase or RNA-ase (in particular RNA-ase T1 for cleavage of G of the 5'-side, or RNA-ase).
  • endonucleases to release ologonucleotides
  • ologonucleotides for example DNA-ase or RNA-ase (in particular RNA-ase T1 for cleavage of G of the 5'-side, or RNA-ase).
  • pancreatic for C / U cleavage on the 5 'side) or restriction enzymes (ii) exonuclease, or (iii) ox spleen phosphodiesterase
  • AMV reverse transcriptase MMLV reverse transcriptase
  • DNA polymerase ⁇ and ⁇ Taq polymerase
  • T4 DNA polymerase Klenow fragment
  • poly A polymerase at concentrations of 0.1 to 100 U / ml.
  • 5-Phosporibosyl pyrophosphate synthetase (or ribose-phosphate pyrophosphokinase) is an enzyme common to various synthetic pathways, including the synthesis of purines and that of pyrimidines in humans. It catalyzes a pyrophosphate transfer reaction on ⁇ -D-ribose from the pentose phosphate pathway. It is advantageously used at a concentration of 0.001 to 10 U / ml. ATP is the pyrophosphate donor coenzyme and energy donor.
  • 5-phosphoribosyl-pyrophosphate is a metabolic "crossroads", acting as a substrate for many nucleotide synthesis enzymes: adenine phosphoribosyl transferase hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT-ase) orotate phosphoribosyl transferase (U complex) 5-PRPP amidotransferase.
  • HGPRT-ase hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase
  • U complex 5-PRPP amidotransferase
  • the enzyme is inhibited by purine nucleotides: ADP and GDP (c) with NDKP, according to:
  • the phosphate donor is dCTP or ⁇ , ⁇ - methyleneadenosine 5'-triphosphate.
  • NMPK nucleotide monophosphate kinase
  • pyruvate kinase nucleotide monophosphate kinase
  • the limiting and delicate step is the hydrolysis step of the nucleic acids.
  • the detection threshold is a function of the composition of the number of bases of the viral genome.
  • the molecular weight of ATP is 551 and that the detection threshold of ATP is a function of the luminometer and the reagent, but that today it is of the order of attomole, by the use of the number Avogadro (6.022 x 10 23 ), it is easy to predict the number of detectable viral particles, metering ATP metry being performed with the firefly luciferase / luciferin couple (product is manufactured by the company called Controlife).
  • - Buffer solution limits the pH variations of the medium which avoids the denaturation of the DNA (or RNA).
  • SDS sodium dodecyl sulfate: a detergent that breaks the lipid layers.
  • EDTA ethylene diamine tetraacetate: chelates calcium ions. Ca ions are necessary for the activity of DNases, enzymes that destroy DNA and are present in all cells.
  • Lactic acid bacteria have been used as target cells for bacteriophages which are lytic viruses.
  • the quality of dairy products is a function of the amount of lactic acid produced by the lactic acid bacteria, and the bacteriophage content must be monitored to prevent the destruction of said lactic acid bacteria.
  • Luciferase Bacteriophage detection by Na assay of host cells
  • the ATP, ADP, AMP nucleotide assay is performed by bioluminescence in the presence of the luciferin-luciferase complex.
  • Luciferase is an enzyme extracted from the firefly abdomen (Photinus pyralis or Luciola mingrelica). A luciferin molecule is oxidized by
  • the ATP assay can be performed directly by bioluminescence. Here it is necessary to transform the ADP and AMP into ATP by enzymatic reactions, using myokinase and pyruvate kinase according to reactions (3), (3a) and (4) above.
  • Bacterial strains two industrial strains of mesophilic Streptococci, SM10 and SM26, were used for the development of the detection of virulent phages (respectively ⁇ 10 and ⁇ 26); for the detection of temperate phages, the lysogenic SM1 strain was retained.
  • Action of a temperate phage The induction of integrated prophage in the DNA is triggered by the action of mitomycin (MC) at 0.3 ⁇ g / ml as soon as the growth reaches 0.1 of optical density.
  • MC mitomycin
  • Measurement of growth Growth is monitored in parallel by measuring the optical density and by determining the adenyl nucleotides.
  • Tris 2 buffer (20 mM Tris, 10 mM acetate Mg, 5 mM K acetate, 40 ⁇ M PEP), to make an internal control, 50 ⁇ l of Tris buffer 2 containing 10 picomoles of ATP,
  • the growth curves obtained by ATP assay are equivalent to those obtained by measuring the optical density.
  • the decrease due to lysis of cells is more accentuated in ATP measurements than by measurement of optical density (curves a 1 and b 1, FIGS. and 2).
  • the concentration of ATP better reflects the amount of "live" bacteria while the measurement of optical density additionally includes the cell debris present in the medium in large amounts during lysis phenomena.
  • RLUs of total ATP are dosed without using the metered addition. While it shows a variation of RLUs in phage-attacked cells, sometimes in the examples of this US patent the values are increasing and other times decreasing. This is because an internal control is not used and intracellular ATP is not distinguished from extracellular ATP.
  • Example 3 shows in its three variants that the direct dosage of the
  • Extracellular AN allows continuous control. Indeed, this control can be carried out by automatic sampling of a sample followed by the transformation of the AN to ATP then the assay of ATP thus formed by bioluminescence with an instantaneous reading.
  • the results obtained according to the three variants of Example 3 were obtained from tests carried out on the M17 synthetic reference medium. But in a natural environment, it is difficult to make optical density, and other control techniques are either tedious or imprecise to quickly detect the action of a virus that is "virulent” or "temperate” . On the other hand, the NA assay is rapid and the use using an internal control consisting of a known ATP solution makes it possible to quantify.
  • the report AN extra / AN tota ⁇ IX makes it possible to highlight a viral attack and its importance. It can thus be detected up to 10 phages per ml
  • the extracellular AN assay allows faster and simpler detection. This is the only method to identify a viral attack in a complex medium containing different virus species, by bringing this sample into contact with different host cell cultures. According to the invention, the sensitivity is increased by assaying the ANs and not the ones. RLU of ATP.

Abstract

The invention concerns the use of ATP-metry for detecting and counting viruses, via free adenyl nucleotides of their target host cells or via adenyl nucleotides bound to the viral DNA or RNA The invention also concerns the method for determining viruses by ATP-metry.

Description

ATP-METRIE POUR DETECTER ET DENOMBRER LES VIRUS ATP-METRY FOR DETECTING AND DENOMBRATING VIRUSES
Domaine de l'inventionField of the invention
La présente invention a trait à une nouvelle technique d'ATP-métrie pour détecter et dénombrer les virus à partir des nucléotides adényliques (AN) des cellules hôtes ou du patrimoine génétique (DNA ou ARN) des virus. Elle concerne également l'utilisation de cette nouvelle technique et un procédé de mise en œuvre à partir de cellules hôtes selon que les virus à déterminer sont lytiques (à l'issue de leur développement, ils clivent la paroi des cellules hôtes) ou non lytiques (à l'issue de leur développement, ils traversent la paroi des cellules hôtes sans la détruire), d'une part, ou à partir du DNA ou du RNA des virus selon qu'il s'agit de viras à DNA ou à RNA, d'autre part. Art antérieurThe present invention relates to a novel ATP-metry technique for detecting and counting viruses from adenine nucleotides (AN) of host cells or genetic inheritance (DNA or RNA) of viruses. It also relates to the use of this new technique and a method of implementation from host cells according to whether the viruses to be determined are lytic (at the end of their development, they cleave the wall of the host cells) or non-lytic. (at the end of their development, they cross the wall of the host cells without destroying it), on the one hand, or from the DNA or the RNA of the viruses according to whether they are DNA or RNA viras , on the other hand. Prior art
On sait l'ATP-métrie, qui est fondée sur la réaction :We know ATP-metry, which is based on the reaction:
(1) luciférine + ATP 4- O2 + Mg2+ + luciférase → oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP 4 O 2 + Mg 2+ + luciferase → oxyluciferin + photons,
permet de mesurer efficacement la teneur en ATP d'un milieu. Cette réaction est spécifique de I1ATP, quel que soit le système utilisé luciférine (substrat)/luciférase (enzyme). Elle permet de distinguer les cellules mortes (dépourvues d'ATP) des cellules vivantes quand celles-ci contiennent de I1ATP.makes it possible to effectively measure the ATP content of a medium. This reaction is specific for I 1 ATP, regardless of the system used luciferin (substrate) / luciferase (enzyme). It distinguishes dead cells (lacking ATP) from living cells when they contain 1 I ATP.
Cependant l'ATP-métrie n'est pas applicable aux virus en tant qu'organismes, dès lors les virus sont dépourvus d'ATP, d'ADP et d'AMP intracellulaires libres. Pour leur développement, les viras utilisent l'ATP de leurs cellules hôtes. Quand ils arrivent à maturité, ils quittent leurs cellules hôtes pour aller infecter d'autres cellules.However, ATP-metry is not applicable to viruses as organisms, therefore the viruses are free of ATP, ADP and free intracellular AMP. For their development, viras use ATP from their host cells. When they mature, they leave their host cells to infect other cells.
Or on sait que, à l'intérieur d'une même espèce ou variété de cellules non virales, la teneur en AN intracellulaires libres totaux est constante, eu égard à la relation (2) :It is known that, within the same species or variety of non-viral cells, the content of total free intracellular AN is constant, with respect to the relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, voir à cet effet l'article de Champiat D. et al, Luminescence, 2001 ; 16: 193- 198, où il est proposé, d'une part, de transformer l'AMP et, respectivement, l'ADP en ATP au moyen de pyruvate kinase et, respectivement, de myokinase, et d'autre part, de mesurer la lumière émise (en RLU, i.e. en unité relative de lumière) sans ajout puis après ajout de 10 μL d'ATP supplémentaire.(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate, see the article by Champiat D. et al, Luminescence, 2001; 16: 193-198, where it is proposed, on the one hand, to transform the MPA and, respectively, the ADP into ATP by means of pyruvate kinase and, respectively, myokinase, and on the other hand, to measure the light emitted (in RLU, ie in relative light unit) without addition then after addition of 10 μL of additional ATP.
On vient de trouver de façon surprenante que la teneur en AN totaux obtenus par clivage du DNA ou du RNA du virus est également constante. On sait de US 3575812 A, que l'on a déjà proposé de détecter des virus par ATP-métrie au moyen de I1ATP de leurs cellules hôtes. Les résultats obtenus ne sont pas reproductibles dès lors que la teneur en ATP libre des cellules hôtes varie. Ceci est clairement confirmé par un article de 2005, postérieur à la date de priorité de la présente invention, voir Dick van der Kooij et al, Water Research, 2005; 39: 2789-2798, où il est montré que la teneur en ATP varie d'un facteur de 1 à 100 (voir figure 2 de cet article).It has surprisingly been found that the total AN content obtained by cleaving DNA or RNA from the virus is also constant. It is known from US Pat. No. 3,575,812 A, that it has already been proposed to detect viruses by ATP-metry using ATP- 1 of their host cells. The results obtained are not reproducible since the free ATP content of the host cells varies. This is clearly confirmed by a 2005 article, post-priority date of the present invention, see Dick van der Kooij et al, Water Research, 2005; 39: 2789-2798, where it is shown that the ATP content varies by a factor of 1 to 100 (see Figure 2 of this article).
Comme on le verra plus loin il faut tenir compte (a) de la relation 2 précitée et (b) de la teneur en NA extracellulaires, quand le virus utilisé est lytique.As will be seen below, it is necessary to take into account (a) the aforementioned relation 2 and (b) the extracellular NA content, when the virus used is lytic.
On sait également de US 6312902, qu'il a été proposé de cliver le DNA ou le RNA des virus pour déterminer leur présence dans un échantillon par ATP-métrie. Ce document ne décrit ni ne suggère la détermination des AN pour évaluer le nombre de souches virales pouvant être contenues dans ledit échantillon, d'une part, ni l'utilisation d'un ajout dosé, d'autre part. But de l'inventionIt is also known from US Pat. No. 6,312,902 that it has been proposed to cleave DNA or RNA from viruses to determine their presence in a sample by ATP-metry. This document neither describes nor suggests the determination of the NAs to evaluate the number of viral strains that may be contained in said sample, on the one hand, nor the use of a metered addition, on the other hand. Purpose of the invention
II existe un besoin, qui se manifeste avec acuité, en ce qui concerne la détection et la numération des virus.There is an acute need for detection and enumeration of viruses.
On se propose donc de fournir une nouvelle solution technique mettant en œuvre une ATP-métrie portant soit sur l'ensemble des AN libres des cellules hôtes, exprimés sous forme d'ATP, pour satisfaire ce besoin, lesdits AN étant libres extracellulairement quand le virus à tester est lytique et intracellulairement quand le virus à tester est non lytique, soit sur les AN produits par clivage ou hydrolyse du DNA ou du RNA du virus. Objet de l'invention Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :It is therefore proposed to provide a new technical solution implementing an ATP-metry covering either all of free ANC host cells, expressed in the form of ATP, to meet this need, said AN being free extracellularly when the virus to be tested is lytic and intracellularly when the virus to be tested is non lytic, or on the ANs produced by cleavage or hydrolysis of the DNA or RNA of the virus. Object of the invention According to a first aspect of the invention, a use of the bioluminescence according to reaction (1):
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons,
pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en œuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres d'une même famille de cellules est constante selon la relation (2) :for detecting and counting viruses, said use being characterized in that it implements (a) bringing said viruses into contact with cells of their target in an aqueous liquid medium free of ATP, ADP and AMP, then the measurement of the content of free adenylic nucleotides (AN) from the cells of the target, expressed as ATP, taking into account that the sum of the ATP, ADP and free intracellular AMP of the same family of cells is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
après avoir transformé les ADP et AMP libres de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA- ase, avec transformation des dimères dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et AMP, la transformation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de viras est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.after transforming the free ADP and AMP of the target into ATP, or (b) cleaving the viral genetic inheritance, constituted by the DNA or the RNA of said viruses, by means of a DNA-ase or, respectively, a RNA-ase, with transformation of dAMP, dADP and dATP dimers into AMP, ADP and AMP monomers, transformation of total MPAs and ADP into ATP, and then measurement of adenyl nucleotide (AN) content from DNA or RNA cleavage. viral, expressed as ATP, taking into account that the sum of the ATP, ADP and AMP of the genetic material of the same family of viras is constant according to said relationship (2), said measurement being carried out (i) without addition of ATP and (ii) after addition of a known amount of ATP.
Selon un second aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à partir des AN des cellules de la cible, ou des AN obtenus par clivage dut DNA ou RNA viral, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un nécessaire de dosage pour mettre en œuvre ledit procédé.According to a second aspect of the invention, there is provided a method for detecting and enumerating by ATP-metry the viruses from the ANs of the target cells, or ANs obtained by cleaving DNA or viral RNA, said AN being expressed under form of ATP. According to another aspect of the invention, there is provided a metering kit for carrying out said method.
Ledit nécessaire de dosage est caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole et de l'ATP pour l'ajout dosé, et le cas échéant de la myokinase, de la pyruvate kinase, une DNA-ase, une RNA-ase et/ou de la pyruvate orthophosphate dikinase, et/ou des microbilles revêtues d'ApoH ou d'un anticorps spécifique du virus à déterminer.Said assay kit is characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly and ATP for the metered addition, and optionally the myokinase, the pyruvate kinase, a DNA-ase, a RNA-ase and / or pyruvate orthophosphate dikinase, and / or microbeads coated with ApoH or a virus-specific antibody to be determined.
Ledit nécessaire pouvant en outre comporter, le cas échéant, des cellules vivantes et saines de la cible. AbréviationsSaid necessary may further include, where appropriate, living and healthy cells of the target. Abbreviations
Par commodité, la liste des abréviations et acronymes utilisés dans la présente invention a été fournie ci-après. ADP adénosine diphosphate, AMP adénosine monophosphate, AN nucléotide adénylique (autre nomenclature utilisable : adénosine nucléotide), l'ensemble des AN comprend ici les ATP, ADP et AMP,For convenience, the list of abbreviations and acronyms used in the present invention has been provided hereinafter. ADP adenosine diphosphate, AMP adenosine monophosphate, AN adenylic nucleotide (other usable nomenclature: adenosine nucleotide), the set of ANs here includes ATP, ADP and AMP,
ATP adénosine triphosphate, cAMP adénosine monophosphate cyclique, dADP adénosine diphosphate dimère, dAMP adénosine monophosphate dimère, GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate, NDPK nucléotide diphosphate kinase RLU unité relative de lumière. Description détaillée de l'invention Les virusATP adenosine triphosphate, cAMP adenosine cyclic monophosphate, adPad adenosine diphosphate dimer, dAMP adenosine monophosphate dimer, GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate, NDPK nucleotide diphosphate kinase RLU relative light unit. Detailed Description of the Invention Viruses
Les virus ne sont pas des cellules. Ce sont des structures parasites intracellulaires. Les virus ne peuvent se reproduire que lorsqu'ils sont à l'intérieur d'une cellule. On parle alors de virions (particules virales). Un virus en dehors d'une cellule n'a aucune activité métabolique. On distingue les virus qui parasitent les cellules procaryotes (bactériophages) de ceux qui parasitent les cellules eucaryotes.Viruses are not cells. These are intracellular parasitic structures. Viruses can only reproduce when they are inside a cell. We then speak of virions (viral particles). A virus outside a cell has no metabolic activity. Viruses that parasitize prokaryotic (bacteriophage) cells are distinguished from those that parasitize eukaryotic cells.
Les particularités des virus sont essentiellement les suivantes. Ils occupent une "étrange région indéterminée" entre le vivant et le non vivantThe particularities of viruses are essentially as follows. They occupy a "strange undetermined region" between the living and the non-living
Ils ressemblent au vivant puisqu'ils ont du matériel génétique et sont capables de mutations et de recombinaisons. Ils peuvent donc évoluer et s'adapter à des milieux en changement. Mais en même temps, ils sont acellulaires : ils ne possèdent ni ribosomes, ni machinerie métabolique leur permettant de synthétiser des protéines et de générer de l'énergie. En l'absence de ces composants, les virus ne peuvent se reproduire qu'à l'intérieur de cellules hôtes et même alors, leur mode de reproduction est unique.They look like the living because they have genetic material and are capable of mutations and recombinations. They can therefore evolve and adapt to changing environments. But at the same time, they are acellular: they have neither ribosomes nor metabolic machinery that allows them to synthesize proteins and generate energy. In the absence of these components, viruses can reproduce only inside host cells and even then, their mode of reproduction is unique.
On sait que toute cellule se reproduit en augmentant de taille, puis en se divisant en deux nouvelles cellules, chacune renfermant un assortiment complet des composants nécessaires à la vie. En revanche, les virus sont désassemblés en leurs composants, c'est-à-dire en protéines et acide nucléique ; la machinerie métabolique de la cellule hôte produit alors quelques dizaines à quelques centaines de génomes viraux et autant de capsides protéiques qui constitueront les nouvelles enveloppes virales. Tous ces composants sont ensuite assemblés et produisent de nouvelles particules virales définitives.It is known that any cell reproduces by increasing in size and then dividing into two new cells, each containing a complete assortment of components necessary for life. In contrast, viruses are disassembled into their components, i.e., into proteins and nucleic acids; the metabolic machinery of the host cell then produces a few tens to a few hundred viral genomes and as many protein capsids that will constitute the new viral envelopes. All these components are then assembled and produce new viral particles definitively.
Les virus ne croissent pas. Il semble qu'ils n'obéissent pas aux lois de la thermodynamique qui s'appliquent aux systèmes ouverts. Par ailleurs, les virus peuvent être cristallisés. C'est là une propriété des minéraux et de la plupart des molécules organiques, mais pas de la cellule vivante. Placés dans de bonnes conditions d'humidité et en présence de cellules vivantes, les virus et leur font produire de nouvelles particules virales. Les cycles biologique virauxViruses do not grow. It seems that they do not obey the laws of thermodynamics that apply to open systems. In addition, viruses can be crystallized. This is a property of minerals and most organic molecules, but not of the living cell. Placed in good humidity conditions and in the presence of living cells, the viruses make them produce new viral particles. Viral life cycles
On rappelle que les virus sont constitués d'un acide nucléique et d'une enveloppe. Le génome viral II est constitué par une seule molécule d'acide nucléique (DNA ou RNA), généralement linéaire ou circulaire, allant de quelques gènes à plusieurs centaines ce qui représente un certain nombre de bases (NMP : AMP, CMP, GMP, TMP dans le cas du RNA, acide ribonucléique) ou (dNMP : dAMP, dCMP, dGMP, dTMP dans le cas du DNA, acide désoxyribonucléique). L'acide nucléique est entouré d'une coque protéique : la capside. Chez certains virus, cette capside est elle- même entourée d'une enveloppe membraneuse, formée d'une double couche lipidique contenant des protéines.It is recalled that viruses consist of a nucleic acid and an envelope. The viral genome II consists of a single molecule of nucleic acid (DNA or RNA), generally linear or circular, ranging from a few genes to several hundred, which represents a certain number of bases (NMP: AMP, CMP, GMP, TMP in the case of RNA, ribonucleic acid) or (dNMP: dAMP, dCMP, dGMP, dTMP in the case of DNA, deoxyribonucleic acid). The nucleic acid is surrounded by a protein shell: the capsid. In some viruses, this capsid is itself surrounded by a membranous envelope, formed of a lipid double layer containing proteins.
On connaît chez les virus trois types de cycles reproductifs : le cycle lytique, le cycle lysogène et le cycle à libération continue. Les deux premiers cycles concernent presque exclusivement des bactériophages. Pour plus de 95% des phages connus, le matériel génétique est une molécule de DNa double brin d'une taille de 5 à 650 kpb ( soit un potentiel de 10000 à 1300000 nucléotides triphosphate) et leur taille varie de 24 et 200 nm.Three types of reproductive cycles are known in viruses: the lytic cycle, the lysogenic cycle and the continuous release cycle. The first two cycles concern almost exclusively bacteriophages. For more than 95% of known phages, the genetic material is a double-stranded DNa molecule of size 5 to 650 kbp (a potential of 10,000 to 1300000 nucleotides triphosphate) and their size varies from 24 to 200 nm.
Le cycle lytique se déroule quand un virus envahit une cellule, se reproduit, puis se disperse par suite de la lyse de la cellule hôte. Une cellule envahie par un virus lytique est presque invariablement tuée en un court laps de temps.The lytic cycle occurs when a virus invades a cell, reproduces, then disperses as a result of lysis of the host cell. A cell invaded by a lytic virus is almost invariably killed in a short period of time.
Dans le cycle lytique, il y a destruction du chromosome bactérien. Le DNA viral est traduit en protéines, celles qui sont nécessaires à la implication du virus introduit. Il y a réplication du DNA viral. Ces copies constituent des matrices pour la synthèse des protéines de la capside. Cette synthèse est assurée par les ribosomes de la bactérie (détournement de la machinerie bactérienne) d'où une perturbation importante de l'énergie cellulaire et particulièrement des AN intracellulaires puisque les virus non pas de source d'énergie propre..In the lytic cycle, there is destruction of the bacterial chromosome. The viral DNA is translated into proteins, those that are necessary for the involvement of the introduced virus. There is replication of the viral DNA. These copies constitute templates for the synthesis of capsid proteins. This synthesis is provided by the ribosomes of the bacterium (diversion of the bacterial machinery) hence a significant disruption of cellular energy and particularly intracellular ANs since viruses are not a source of clean energy.
Ainsi lorsqu'il y aura synthèse d'acides nucléiques, les nucléotides (bases : ATP,CTP,GTP,TTP, soit les XTP) auront été fabriqués par la machinerie de la cellule hôte. Ensuite, il y a auto-assemblage des protéines et du DNA (ou RNA) viral. La bactérie éclate et libère de nombreux virions. Cette remarque est très importante pour nous permettre de différencier les acides nucléiques issus de virus ou de tout autre cellule procaryote ou eucaryote, car avant de provoqué l'hydrolyse des acides nucléiques on dosera les nucléotides adényliques présents qui témoigneront de la présence de cellules non virales.Thus, when nucleic acids are synthesized, the nucleotides (bases: ATP, CTP, GTP, TTP, or XTP) will have been manufactured by the machinery of the host cell. Then, there is self-assembly of proteins and viral DNA (or RNA). The bacteria bursts and releases many virions. This remark is very important to allow us to differentiate between nucleic acids derived from viruses or any other prokaryotic or eukaryotic cell, because before the hydrolysis of nucleic acids, we will test the adenyl nucleotides present which will testify to the presence of non-viral cells. .
Le cycle lysogène se déroule quand un virus virulent ou lytique combine son matériel génétique avec celui de la cellule hôte et devient de ce fait dormant. Le DNA (ou RNA) du virus se réplique en même temps que celui de la cellule hôte laquelle porte le nom de cellule lysogène ; le virus ou phage est appelé prophage. Certain stimulus conduisent le prophage à devenir virulent et à entamer un cycle lytique. La cellule lysogène est alors lysée et les particules virales sont libérées. Dans le cycle lysogène, le DNA (ou RNA) viral s'intègre dans le chromosome bactérien. La bactérie continue à vivre jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique. Certaine bactéries lysogènes sont d'une grande importance pour la santé humaine. Par exemple, la bactérie responsable de la diphtérie, Corynebacterium diphtheriae, n'élabore la toxine responsable de cette maladie que si son DNA est infecté par un prophage portant le gène qui code pour la toxine diphtérique. On note le même phénomène chez Clostridium botulinum, responsable du botulisme, et chez Streptococcus pyogenes, l'agent de la scarlatine. Donc dans ces cas (cycle lytique voir lysogènique puisque lors de ce dernier, le virus devient dormant jusqu' à jusqu'à ce qu'un événement extérieur la fait basculer dans le cycle lytique.), c'est le dosage des AN extracellulaires (libérés par la lyse de la paroi des cellules hôtes) et totaux desdites cellules hôtes qui permettra de mettre en évidence la présence de virus. Les NA extracellulaire nous permettront de quantifier le nombre de virus et le rapport ANeχtra/NAtotaux nous donnera le niveau de contamination. Par exemple si ANextra - ANtotaux cela implique ique toutes les cellules hôtes sont lysées donc morte (nécrose).The lysogenic cycle occurs when a virulent or lytic virus combines its genetic material with that of the host cell and thereby becomes dormant. The DNA (or RNA) of the virus replicates at the same time as that of the host cell, which is called a lysogenic cell; the virus or phage is called prophage. Certain stimuli cause the prophage to become virulent and to begin a lytic cycle. The lysogenic cell is then lysed and the viral particles are released. In the lysogenic cycle, the viral DNA (or RNA) integrates into the bacterial chromosome. The bacteria continues to live until an external event makes it switch to the lytic cycle. Certain lysogenic bacteria are of great importance to human health. For example, the bacterium responsible for diphtheria, Corynebacterium diphtheriae, produces the toxin responsible for this disease only if its DNA is infected with a prophage carrying the gene that codes for diphtheria toxin. The same phenomenon is observed in Clostridium botulinum, responsible for botulism, and in Streptococcus pyogenes, the scarlet fever agent. So in these cases (lytic cycle see lysogenics since during the latter, the virus becomes dormant until until an external event makes it switch in the lytic cycle.), It is the extracellular AN assay ( released by lysis of the host cell wall) and totals of said host cells that will highlight the presence of viruses. The extracellular NA will allow us to quantify the number of viruses and the ratio AN e χtra / NAt o rate will give us the level of contamination. For example if AN extra - AN tota u x this implies that all host cells are lysed thus dead (necrosis).
Le cycle à libération continue est le fait de quelques phages et de beaucoup de virus animaux. Ces virus se reproduisent et sont libérés sans interruption par des cellules hôtes qui demeurent intactes. Les virus pénètrent dans la cellule par endocytose. La vésicule d'endocytose fusionne avec'un lysosome qui permet la libération de la capside virale laquelle peut libérer son matériel génétique dans le cytoplasme de la cellule hôte. Le matériel génétique est répliqué et utilisé pour produire de nouvelles capsides incluant du matériel génétique viral pour former des nucléocapsides. Celles-ci sont transportées par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi de la cellule hôte jusqu'à la membrane plasmique où la particule virale bourgeonne et est libérée, entouré d'une enveloppe membranaire provenant de la cellule hôte. Les virus de la grippe, des oreillons, de la rougeole ou de la rage ont de tels cycles à libération continue.The continuous release cycle is the result of a few phages and many animal viruses. These viruses reproduce and are released continuously by host cells that remain intact. Viruses enter the cell through endocytosis. The vesicle endocytosis fuses with a lysosome, which allows the release of the viral capsid which can release its genetic material into the cytoplasm of the host cell. The genetic material is replicated and used to produce new capsids including viral genetic material to form nucleocapsids. These are transported by the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus from the host cell to the plasma membrane where the viral particle buds and is released, surrounded by a membrane envelope from the host cell. Influenza, mumps, measles or rabies viruses have such continuous release cycles.
Dans ce cas le dosage des AN extracellulaires n'apporte pas d'information, par contre comme signalé préalablement compte tenu de la perturbation métabolique et particulièrement énergétique de la cellule hôte en présence de virus, le dosage des AN totaux permettrons de détecter cette anomalie par rapport aux dosage des AN des même cellules dépourvues de virasIn this case the extracellular AN assay does not provide information, however, as previously reported, given the metabolic and particularly energetic disruption of the host cell in the presence of viruses, the total AN assay will make it possible to detect this anomaly by compared to the NA assay of the same cells without viras
On peut augmenter cette sensibilité en dosant les autres nucléotides de la cellule hôte par luminescence comme proposé dans l'article de M. Gendraud, Physiol. Vég. 1977 15(1) 121-132, selon le mécanisme :This sensitivity can be increased by assaying the other nucleotides of the host cell by luminescence as proposed in the article by M. Gendraud, Physiol. Veg. 1977 15 (1) 121-132, according to the mechanism:
XTP + ADP → XDP + ATP en présence de NDPKXTP + ADP → XDP + ATP in the presence of NDPK
Ainsi selon un aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lytiques à partir des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.Thus, according to one aspect of the invention, there is provided a method for detecting and enumerating by ATP-metry lytic viruses from the extracellularly released ANs by lysis of the cell wall of the target, said ANs being expressed as ATP.
Selon un autre aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à libération continue à partir des AN libres des cellules de la cible, ou à partir des AN produits par le clivage du DNA ou RNA viral.According to another aspect of the invention, there is provided a method for ATP-metry detection and enumeration of continuous release viruses from free ANs of target cells, or from ANs produced by DNA or RNA cleavage. viral.
On peut ainsi détecter et dénombrer les AN totaux liés qui se trouvent associés au patrimoine génétique des virus constitué par leur DNA pour les virus à DNA, ou leur RNA pour les virus à RNA, lesdits AN liés étant libérés par action d'une DNA-ase ou RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et ATP, lesdits AMP et ADP étant transformés en ATP pour mesurer les AN sous forme d'ATP.It is thus possible to detect and enumerate the total bound ANs which are associated with the genetic inheritance of the viruses constituted by their DNA for the DNA viruses, or their RNA for the RNA viruses, said linked ANs being released by action of a DNA- ase or RNA-ase, then optionally the transformation of dimers dAMP, dADP and dATP into monomers AMP, ADP and ATP, said AMP and ADP being converted to ATP to measure the AN in the form of ATP.
Procédé mettant en œuvre des cellules cibles On vise un procédé de détection et de numération des souches d'un virus lytique par bioluminescence selon la réaction (1) :Method using target cells A method for detecting and counting the strains of a lytic virus by bioluminescence according to reaction (1) is aimed at:
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase — > oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons said method, which is based on the fact that the sum of the free intracellular adenylic nucleotides (AN) of the uninfected target is constant according to the relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (1°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres ;(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte, being characterized in that it comprises the following steps: (1) using an aqueous liquid sample (E), which is likely to contain strains of a virus (V) to be tested and which lacks free AN;
(2°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ; (3°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible ; (4°) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP ;(2) contacting said sample (E) with the cells of the target; (3 °) incubate the resulting reaction medium until the virus arriving at the end of its development lyses the wall of the target; (4) collect the resulting extracellular medium and treat it to transform ADP and AMP into ATP;
(5°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;(5 °) introducing into the medium resulting from step (4 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP;
(6°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ; et(6) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(7°) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme d'ATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.(7) determine the content of extracellularly free total ANs in the form of ATP, and then deduce the number of strains of said virus (V) in the initial sample (E).
Pour la déduction du nombre de souches dudit virus, l'étape (7°) peut comprendre l'utilisation d'un système d'abaques pré-établi. En variante, la teneur en AN totaux extracellulaires peut être déterminée par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1°) à (7°) en l'absence dudit virus, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial. En pratique, la technique de l'ajout dosé permet une bonne détermination directe du nombre de souches du virus. ' On vise également un procédé de détection et de numération des souches d'un virus à libération continue par bioluminescence selon la réaction (1) :For the deduction of the number of strains of said virus, step (7 °) may include the use of a pre-established chart system. As a variant, the content of extracellular total ANs can be determined by comparison with that of the cells of the target obtained by reproducing steps (1 °) at (7 °) in the absence of said virus, and then deduce therefrom the number of strains of said virus (V) in the initial sample (E). In practice, the technique of metered addition allows a good direct determination of the number of strains of the virus. It also relates to a method for detecting and counting strains of a bioluminescence continuous release virus according to reaction (1):
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase →- oxyluciférine + photons(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase → - oxyluciferin + photons
ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :said method, which is based on the fact that the sum of free intracellular adenyl nucleotides (AN) of the uninfected target is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (la°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres ; (2a°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;characterized in that it comprises the following steps: (a) using an aqueous liquid sample (E), which is capable of containing strains of a virus (V) to be tested and which is devoid of Free AN; (2a) contacting said sample (E) with the cells of the target;
(3a°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible ;(3a) incubate the resulting reaction medium until the virus arriving at the end of its development through the wall of the target;
(4a°) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en ATP ; (5a°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;(4a) collecting target cells, lysing them to collect the resulting intracellular medium, and then treating said intracellular medium to transform ADP and AMP to ATP; (5a) introducing into the medium resulting from step (4a) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP;
(6a°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ; et(6a) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(7a°) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, et en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E).(7a) determine the total intracellularly free AN content, in the form of ATP, and deduce the number of strains of said virus (V) in said sample (E).
L'étape (7a) peut être réalisée comme indiqué plus' haut pour l'étape (7°) ; notamment par comparaison. avec les cellules de la cible traitées en reproduisant les étapes (la°) à (7a°) en l'absence dudit virus,. En variante, la détermination de la teneur en AN totaux intracellulaires peut être réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli. On en déduit ensuite le nombre de souches dudit virus (V) dans ledit échantillon (E). En bref les étapes (l°)-(2°) et (5°) sont identiques aux étapes (la°)-Step (7a) can be carried out as described 'above for step (7 °); especially by comparison. with the target cells treated by reproducing the steps (°) to (7a °) in the absence of said virus ,. Alternatively, the determination of the total intracellular NA content can be performed by means of a pre-established mapping system. We then deduce the number of strains of said virus (V) in said sample (E). In short the steps (1 °) - (2 °) and (5 °) are identical to the steps (°) -
(2a°) et (5a°) ; les étapes (3°) et (6°)-(7°) sont sensiblement analogues aux étapes (3a°) et (6a°)-(7a°) ; et l'étape (4°) est différente de l'étape (4a°). Les modalités de la mise en œuvre des étapes identiques ou similaires seront traitées en commun. En revanche, celles des étapes respectives (4°) et (4a°) seront traitées séparément.(2a) and (5a); steps (3 °) and (6 °) - (7 °) are substantially similar to steps (3a) and (6a) - (7a); and step (4 °) is different from step (4a °). The procedures for implementing identical or similar steps will be dealt with in common. On the other hand, those of the respective steps (4 °) and (4a °) will be treated separately.
L'échantillon (E) est une composition liquide aqueuse, le cas échéant il peut être une composition liquide organique. Cet échantillon (E) provient d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide qui est avantageusement aqueux. La réaction (1) précitée fournit de l'oxyluciférine, des photons, de l'AMP et un ou plusieurs phosphates, principalement le pyrophosphate. Elle est spécifique de l'ATP, la luciférine et la luciférase étant à une concentration optimale, le nombre de photons émis dès que ces trois substances sont en présence, est directement proportionnel à la quantité d'ATP. Dans l'organisme et tout milieu réactionnel, l'ATP extracellulaire disparaît relativement rapidement, soit par réutilisation, soit principalement par dégradation.The sample (E) is an aqueous liquid composition, where appropriate it can be an organic liquid composition. This sample (E) comes from a sampling gas [in particular by bubbling], solid [in particular by contact, dissolution or dispersion] or liquid [by extraction, dissolution or emulsion] by means of a liquid which is advantageously aqueous. The reaction (1) above provides oxyluciferin, photons, AMP and one or more phosphates, mainly pyrophosphate. It is specific for ATP, luciferin and luciferase being at an optimal concentration, the number of photons emitted as soon as these three substances are present, is directly proportional to the amount of ATP. In the body and any reaction medium, the extracellular ATP disappears relatively quickly, either by reuse or mainly by degradation.
L'ATP intervient dans la cellule en tant que source d'énergie (énergie mécanique, énergie osmotique, énergie chimique, énergie calorique, énergie lumineuse) donneur de phosphate, donneur de pyrophosphate, donneur d'AMP et donneur d'adénosine.ATP is involved in the cell as a source of energy (mechanical energy, osmotic energy, chemical energy, caloric energy, light energy) phosphate donor, pyrophosphate donor, MPA donor and adenosine donor.
La teneur en ATP dans les cellules d'une même espèce varie fortement selon l'état physiologique. Le seuil de détection est de l'ordre de 103 bactéries. Selon l'invention, on va atteindre une meilleure sensibilité qui va de 1 attomole d'ATP (sans stabilisation du signal lumineux émis) jusqu'à 0,5 attomole d'ATP (avec stabilisation dudit signal), ce qui correspond approximativement au contenu moyen en AN intracellulaires totaux d'une bactérie. Quand on considère la relation (2), on néglige ici la teneur intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (cAMP), qui est le précurseur intervenant dans la synthèse de l'AMP. Cette teneur est pratiquement négligeable dans les milieux réactionnels de l'invention.The ATP content in cells of the same species varies greatly depending on the physiological state. The detection threshold is of the order of 10 3 bacteria. According to the invention, a better sensitivity will be attained, ranging from 1 attomole of ATP (without stabilization of the emitted light signal) to 0.5 attomole of ATP (with stabilization of said signal), which corresponds approximately to the content mean total intracellular NA of a bacterium. When we consider relation (2), we neglect here the intracellular content of cyclic adenosine monophosphate (cAMP), which is the precursor involved in the synthesis of AMP. This content is practically negligible in the reaction media of the invention.
On utilise selon l'invention le principe bien connu de la luciole (Photinus pyralis), qui fonctionne avec un enzyme (luciférase), un substrat luminophore (luciférine) et un coenzyme (en l'occurrence I1ATP). Le résultat est souvent affiché au photomètre (ou luminomètre) en RLU, qui bien que proportionnel à la quantité d'ATP, ne permet pas de déterminer d'un échantillon à l'autre la concentration réelle en ATP. Pour remédier à cette difficulté, on préconise l'apport d'une quantité connue (par exemple 102 à 10 pmol d'ATP), après la première lecture (entreprise sans apport d'ATP). Cependant, la technique de l'apport dit dosé ne permet pas une détermination quantitative de la numération car la teneur en ATP dans lesdites cellules ne reste pas constante : il y a un "turnover" rapide en fonction de l'état physiologique. En revanche, les cellules d'une cible donnée présentent toutes la même teneur en AN. Selon l'invention, en déterminant la teneur en AN, exprimée sous forme d'ATP, on va pouvoir réaliser des déterminations quantitatives pour la numération des cellules de la cible et des souches de virus. De façon avantageuse, l'étape (1°) ou (la°) du procédé de l'invention, qui est relative à l'isolation et concentration, est effectuée par * filtration sur membrane, © évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 0C), et/ou • immunocapture.According to the invention is used the well known principle of firefly (Photinus pyralis), which works with an enzyme (luciferase), a phosphor substrate (luciferin) and a coenzyme (in this case I 1 ATP). The result is often displayed by photometer (or luminometer) in RLU, which although proportional to the amount of ATP, does not allow to determine from one sample to the other the actual concentration of ATP. To overcome this difficulty, it is recommended to add a known quantity (for example 10 2 to 10 pmol of ATP), after the first reading (company without ATP supply). However, the so-called dosing technique does not allow a quantitative determination of the count because the ATP content in said cells does not remain constant: there is a rapid "turnover" as a function of the physiological state. In contrast, the cells of a given target all have the same AN content. According to the invention, by determining the content of AN, expressed as ATP, it will be possible to carry out quantitative determinations for the counting of target cells and strains of virus. Advantageously, step (1 °) or (la) of the process of the invention, which relates to the isolation and concentration, is carried out by membrane filtration, evaporation-centrifugation, in particular under vacuum and at room temperature (15-25 ° C.), and / or immunocapture.
La technique d'immunocapture est préférée. Elle permet la concentration et la purification des souches du virus par fixation de celles-ci par des anticorps. De façon pratique, ces anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes de surface du virus sans le détruire. De façon également pratique, ces anticorps sont immobilisés sur des microbilles de latex magnétique en vue de la concentration et de la purification des produits de conjugaison du type virus-anticorps-bille dans un champ magnétique et du recueil desdits produits de conjugaison. En variante, des microbilles non magnétiques ou non magnétisables, liées aux anticorps qui fixent les souches du virus, permettent également, par décantation, la concentration et la purification desdites souches.The immunocapture technique is preferred. It allows the concentration and purification of strains of the virus by fixing them with antibodies. In practice, these antibodies can be directed against surface antigens of the virus without destroying it. Also conveniently, these antibodies are immobilized on magnetic latex microbeads for concentration and purification of virus-antibody-bead conjugates in a magnetic field and for the collection of said conjugates. Alternatively, non-magnetic or non-magnetizable microbeads, bound to the antibodies that bind the virus strains, also allow, by decantation, the concentration and purification of said strains.
Le meilleur mode pour la mise en œuvre de l'immunocapture consiste à utiliser des microbilles magnétiques revêtue de ApoH, une protéine qui fixe la matière vivante et ne fixe pas les fragments, notamment la paroi, d'organismes morts. Il est rappelé que l'ΑpoH est une protéine qui se manifeste uniquement juste avant ou au moment de la mort cellulaire (apoptose).The best mode for implementing immunocapture is to use magnetic microbeads coated with ApoH, a protein that binds living matter and does not fix fragments, especially the wall, of dead organisms. It is recalled that ΑpoH is a protein that occurs only just before or at the time of cell death (apoptosis).
Lesdits produits de conjugaison sont ensuite séparés, si nécessaire, notamment par élution, pour disposer d'une composition liquide concentrée de souches virales qui ne sont plus liées aux anticorps.Said conjugates are then separated, if necessary, in particular by elution, in order to have a concentrated liquid composition of viral strains which are no longer bound to the antibodies.
Le cas échéant, pour limiter les dilutions qui diminuent la sensibilité, il peut être judicieux de concentrer ladite composition liquide au moyen d'un dispositif d'évaporation-centrifugation (opérant de 2000-10000 tours/15 minutes à 2000-10000 tours/1 minute), qui permet de sécher un grand nombre d'échantillons ou de milieux réactionnels en quelques minutes, sans perte de produits. L'évaporation-centrifugation à température ambiante offre l'avantage de pouvoir éliminer la majeur partie de l'eau du milieu contenant les souches.If necessary, to limit the dilutions which decrease the sensitivity, it may be advisable to concentrate the said liquid composition by means of an evaporation-centrifugation device (operating from 2000-10000 revolutions / 15 minutes to 2000-10000 revolutions / 1 minute), which makes it possible to dry a large number of samples or reaction media in a few minutes minutes, without loss of products. Evaporation-centrifugation at room temperature offers the advantage of being able to remove most of the water from the medium containing the strains.
De façon également avantageuse, les étapes (2°)-(3°) ou (2a°)-(3a°) relatives à la mise en contact des souches virales avec les souches de la cible puis à leur développement sont réalisées selon un mode connu de la personne du métier.Also advantageously, the steps (2 °) - (3 °) or (2a °) - (3a °) relating to the contacting of viral strains with the strains of the target and then to their development are carried out according to a method. known to the person skilled in the art.
A l'étape (4a°) la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a°) par addition d'un tampon aqueux contenantIn step (4a), lysis of the cell wall of the target is carried out in the medium resulting from step (3a °) by addition of an aqueous buffer containing
(i) Tris plus EDTA, et/ou(i) Tris plus EDTA, and / or
(ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. La lyse est requise afin de pouvoir accéder aux AN intracellulaires.(ii) DMSO, then microwave treatment (for about 1 minute) to open the cells of the target, followed by rapid cooling (especially in the refrigerator) and, if necessary, centrifugation to collect the resulting liquid medium. Lysis is required in order to access intracellular NAs.
La transformation à l'étape (4°) ou (4a°) des ADP et AMP en ATP est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. Les mécanismes réactionnels sont les suivants :The transformation at step (4 °) or (4a °) of the ADP and AMP in ATP is carried out by means of myokinase and pyruvate kinase. The reaction mechanisms are as follows:
myokinase (3) AMP + ATP *- 2ADPmyokinase (3) AMP + ATP * - 2ADP
myokinase (3a) AMP + GTP >- ADP + GDPmyokinase (3a) AMP + GTP> - ADP + GDP
C I OO" O il pyruva *t.e , ki . nase Ç | °°CI OO " O it pyruva * te, ki. Nase Ç | °°
( 4 ) C— O— -P— O" 7===c •- C=O(4) C- O- -P- O "7 === • c - C = O
CH2 O 1 ^, CH3 CH 2 O 1 ^, CH 3
ADP ATP phosphoénolpyruvate pyruvateADP ATP phosphoenolpyruvate pyruvate
Pour gagner du temps, l'étape (5°) du procédé de l'invention relative à la transformation des ADP et AMP en ATP peut être mise en œuvre en même temps que l'étape (4°).To save time, step (5 °) of the process of the invention relating to the conversion of ADP and AMP to ATP can be carried out simultaneously with step (4 °).
De façon avantageuse, l'étape (5°) ou (5a°) du procédé de l'invention est mise en œuvre avec la luciférine et la luciférase de luciole (Photinus pyralis). Le substrat et l'enzyme sont susceptibles d'être extraits simultanément de la luciole.Advantageously, step (5 °) or (5a °) of the process of the invention is implemented with luciferin and firefly luciferase (Photinus pyralis). The substrate and the enzyme can be extracted simultaneously from the firefly.
De façon pratique, il est recommandé de réaliser l'étape (6°) ou (6a°) relative à la mesure de la lumière émise par la réaction (1) en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner :In practice, it is recommended to perform step (6 °) or (6a °) relating to the measurement of the light emitted by the reaction (1) in the presence of a substance stabilizing the emission of photons to a value substantially constant for at least 10 minutes. Among the suitable substances for this purpose are:
• la pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) qui transforme l'AMP et le pyrophosphate, produits au cours de la réaction (1) précitée, en ATP, etPyruvate orthophosphate dikinase (PPDK), which converts the AMP and pyrophosphate produced during the aforementioned reaction (1) into ATP, and
• l'adénosine phosphate déaminase, qui dégrade l'ADP et/ou l'AMP résiduels pouvant être présents dans le milieu réactionnelAdenosine phosphate deaminase, which degrades the residual ADP and / or AMP that may be present in the reaction medium
Le premier enzyme fournit un signal stable en régénérant l'ATP de façon sensiblement continue. Le second enzyme permet de diminuer le bruit de fond dû à la présence résiduelle dans le milieu d'essai d'ADP et/ou d'AMP, sans que le processus d'utilisation de l'ATP comme source d'énergie lumineuse soit perturbé.The first enzyme provides a stable signal by regenerating the ATP substantially continuously. The second enzyme makes it possible to reduce the background noise due to the residual presence in the test medium of ADP and / or AMP, without the process of using ATP as a source of light energy being disturbed. .
Ledit second enzyme, l'adénosine phosphate déaminase, est plus avantageusement utilisé pour éliminer les résidus de nucléotides dans le milieu réactionnel et plus particulièrement pour écarter en les détruisant les résidus de nucléotides extracellulaires présents le cas échéant dans l'échantillon lors de l'étape (1°) précitée.Said second enzyme, adenosine phosphate deaminase, is more advantageously used to eliminate the nucleotide residues in the reaction medium and more particularly to eliminate by destroying the extracellular nucleotide residues present in the sample where appropriate in the step (1) above.
En pratique, pour stabiliser l'émission de photons conformément à la réaction (1), on recommande plus particulièrement l'utilisation de PPDK à l'étape (5°).In practice, to stabilize the photon emission according to reaction (1), it is more particularly recommended to use PPDK in step (5 °).
Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la numération des virus, tels que HIV, les bactériophages, le virus de l'hépatite C. On transforme les AN, initialement liés et ainsi obtenus, en ATP au moyen de Myokinase et de Pyruvate kinase comme à l'étape (4°).The method of the invention is particularly suitable for the detection and enumeration of viruses, such as HIV, bacteriophages, hepatitis C virus. The ANs, initially bound and thus obtained, are converted into ATP by means of Myokinase and Pyruvate kinase as in step (4 °).
L'émission de photons est mise en œuvre au moyen de luciférine de luciole et luciférase de luciole comme indiqué plus haut pour la réalisation de l'étape (5°) ou (5a°) sans ajout d'ATP puis après ajout dosé d'ATP. L'ensemble luciférine/luciférase de luciole est disponible dans le commerce, notamment auprès de la société dite Controlife.Photon emission is carried out by means of firefly luciferol and firefly luciferase as indicated above for carrying out step (5 °) or (5a °) without addition of ATP and then after metered addition of ATP. The firefly luciferin / luciferase assembly is commercially available, especially from the company known as Controlife.
De façon avantageuse on opère comme indiqué ci-dessus en stabilisant ladite émission de photons au moyen de PPDK.Advantageously, the procedure is as described above by stabilizing said photon emission by means of PPDK.
La mesure du signal amplifié et la détermination sont réalisées comme indiqué plus haut aux étapes (6°) et (7°).The measurement of the amplified signal and the determination are carried out as indicated above in steps (6 °) and (7 °).
Selon l'invention, on préconise un procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend :According to the invention, a method for detecting and counting viruses by ATP-metry is recommended, said method being characterized in that it comprises:
- le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP,cleavage of the viral DNA or RNA by means of DNA-ase or RNA-ase, and then, if appropriate, the transformation of dAMP and DADP dimers into AMP and ADP monomers,
- la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP,the transformation of the MPAs and ADP thus obtained into ATP,
- la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP,bringing the ATP into contact with a luciferin and a luciferase first (i) without the addition of ATP, and then (ii) after adding a known quantity of ATP,
- la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, etthe measurement of the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after the addition of ATP, and
- la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus.- the determination of the total AN content initially bound, expressed in the form of ATP to deduce the number of viruses.
Procédé mettant en œuvre le patrimoine génétique des virus Ce procédé va être maintenant décrit de façon succincte par référence aux étapes précédentes.Method implementing the genetic inheritance of viruses This method will now be described briefly with reference to the preceding steps.
On fait appel à un échantillon liquide aqueux (E) comme à l'étape (1°) ci-dessus. L'isolation/concentration est effectuée parAn aqueous liquid sample (E) is used as in step (1 °) above. Insulation / concentration is carried out by
• filtration sur membrane,• membrane filtration,
• évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 0C), et/ouEvaporation-centrifugation, in particular under vacuum and at room temperature (15-25 ° C.), and / or
• immunocapture. comme indiqué plus haut, avantageusement au moyen dApoH.• immunocapture. as indicated above, advantageously by means of ApoH.
On lyse la paroi virale par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou (ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant.The virus wall is lysed by adding an aqueous buffer containing (i) Tris plus EDTA, and / or (ii) DMSO, followed by microwave treatment (for about 1 minute) to open the target cells, followed by rapid cooling (especially at refrigerator) and, if necessary, centrifugation to collect the resulting liquid medium.
On clive le DNA ou le RNA viral au moyen (i) d'endonucléases pour libérer des ologonucléotides, par exemples des DNA-ase ou RNA-ase (notamment RNA-ase Tl pour clivage de G du coôté 5', ou RNA-ase pancréatique pour clivage de C/U du côté 5') ou encore des enzymes de restriction, (ii) d'exonucléase, ou (iii) de phosphodiestérase de rate de bœufThe viral DNA or RNA is cleaved by means of (i) endonucleases to release ologonucleotides, for example DNA-ase or RNA-ase (in particular RNA-ase T1 for cleavage of G of the 5'-side, or RNA-ase). pancreatic for C / U cleavage on the 5 'side) or restriction enzymes, (ii) exonuclease, or (iii) ox spleen phosphodiesterase
(pour cliver le RNA à partir de 5'-OH libérant des 3'-P) ou de phosphodiestérase de venin de serpent (pour cliver le RNA à partir de 3'- OH libérant les 5'-P) et transforme les dimères présents dAMP, dADP et dATP en monomères AMP, ADP et ATP.(to cleave RNA from 5'-OH releasing 3'-P) or phosphodiesterase from snake venom (to cleave RNA from 3'-OH releasing 5'-P) and transforms the present dimers dAMP, dADP and dATP in AMP, ADP and ATP monomers.
Pour la transformation des nucléotide monophosphates en nucléoside triphosphates, on peut utiliser les mécanismes opératoires décrit dans le brevet US 6312902 B. Les mécanismes préférés selon l'invention comprennent ce qui suit.For the transformation of nucleotide monophosphates into nucleoside triphosphates, the operating mechanisms described in US Pat. No. 6,312,902 B can be used. The preferred mechanisms according to the invention include the following.
II
(a) Selon ANn +PPi → ANn-1 +XTP XTP sous l'action : de DNA polymérase reverse transcriptase pour l'DNA, de RNA polymérase pour RNA.(a) According to AN n + PPi → AN n-1 + XTP XTP under the action of: DNA polymerase reverse transcriptase for DNA, RNA polymerase for RNA.
Plusieurs enzymes ont été utilisés dans cette transformation, notamment :Several enzymes have been used in this transformation, including:
AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, DNA polymérase α et β, Taq polymérase, T4 DNA polymérase, Klenow fragment, poly A polymérase, à des concentrations de 0,1 à 100 U/ml.AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, DNA polymerase α and β, Taq polymerase, T4 DNA polymerase, Klenow fragment, poly A polymerase, at concentrations of 0.1 to 100 U / ml.
(b)-→Avec NDPK, selon :(b) - → With NDPK, according to:
NDPK XTP + ADP ^ XDP + ATP avec 0,01 à 0,50μM de préférence 0,5μM d'ADP et 0,1 à 10 U/ml de NDPK.NDPK XTP + ADP → XDP + ATP with 0.01 to 0.50 μM, preferably 0.5 μM ADP and 0.1 to 10 U / ml NDPK.
IIII
(a) Etape d'hydrolyse des AN, selon :(a) AN hydrolysis step, according to:
ANn + H2O → ANn-1 + XMPAN n + H 2 O → AN n-1 + XMP
ANn + exonucléase -» nXMP [soit NMP si RNA, ou dNMP si DNA] (b)→Avec PRPP synthétase, selon :AN n + exonuclease - »nXMP [is NMP if RNA, or dNMP if DNA] (b) → With PRPP synthetase, according to:
PRPP synthétase XMP + PRPP +. ribose + XTPPRPP synthetase XMP + PRPP + . ribose + XTP
[XTP est soit NTP si RNA3 soit dNTP si DNA] La 5-phosρhoribosyl pyrophosphate synthétase (ou ribose-phosphate pyrophosphokinase) est une enzyme commune à diverses voies de synthèse, dont la synthèse des purines et celle des pyrimidines chez l'homme. Elle catalyse une réaction de transfert de pyrophosphate sur l'α-D-ribose issu de la voie des pentoses-phosphates. Elle est avantageusement utilisée à la concentration de 0.001 à 10 U/ml. L'ATP est le coenzyme donneur de pyrophosphate et donneur d'énergie.[XTP is either NTP if RNA 3 or dNTP if DNA] 5-Phosporibosyl pyrophosphate synthetase (or ribose-phosphate pyrophosphokinase) is an enzyme common to various synthetic pathways, including the synthesis of purines and that of pyrimidines in humans. It catalyzes a pyrophosphate transfer reaction on α-D-ribose from the pentose phosphate pathway. It is advantageously used at a concentration of 0.001 to 10 U / ml. ATP is the pyrophosphate donor coenzyme and energy donor.
Le 5-phosphoribosyl-pyrophosphate (i. e. 5-PRPP) est un "carrefour" métabolique, intervenant comme substrat de nombreuses enzymes de synthèse des nucléotides : adénine phosphoribosyl transférase hypoxanthine-Guanine phosphoribosyl transférase (HGPRT-ase) orotate phosphoribosyl transférase (complexe U) 5-PRPP amidotransférase.5-phosphoribosyl-pyrophosphate (ie 5-PRPP) is a metabolic "crossroads", acting as a substrate for many nucleotide synthesis enzymes: adenine phosphoribosyl transferase hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT-ase) orotate phosphoribosyl transferase (U complex) 5-PRPP amidotransferase.
L'enzyme est inhibée par les nucléotides puriques : ADP et GDP (c) avec NDKP, selon :The enzyme is inhibited by purine nucleotides: ADP and GDP (c) with NDKP, according to:
NDPK XTP + ADP *- XDP + ATPNDPK XTP + ADP * - XDP + ATP
avec 0,01 à 0,50 μM, de préférence 0,5 μM d'ADP, et de 0.1 à lOOU/ml de NDPK, (quand on utilise la NDPK, le donneur de phosphate est dCTP ou l'a, β-méthylèneadenosine 5 '-triphosphate.with 0.01 to 0.50 μM, preferably 0.5 μM ADP, and 0.1 to 10 μ / ml NDPK, (when NDPK is used, the phosphate donor is dCTP or α, β- methyleneadenosine 5'-triphosphate.
III Avec nucléotide monophosphate kinase (NMPK) et pyruvate kinase, selon :III With nucleotide monophosphate kinase (NMPK) and pyruvate kinase, according to:
NMPK XTP + AMP »_- XDP +ADPNMPK XTP + AMP "_- XDP + ADP
Pyruvate kinase ADP + PEP *~ ATP ou encore avec NMPK et/ou myokinase.Pyruvate kinase ADP + PEP * ~ ATP or with NMPK and / or myokinase.
Cette dernière technique est celle qui est recommandée selon l'invention. L'étape limitante et délicate est l'étape d'hydrolyse des acides nucléiques. Le seuil de détection est fonction de la composition du nombre de bases du génome viral.This last technique is that which is recommended according to the invention. The limiting and delicate step is the hydrolysis step of the nucleic acids. The detection threshold is a function of the composition of the number of bases of the viral genome.
En sachant que le poids moléculaire de l'ATP est de 551 et que le seuil de détection de l'ATP est fonction du luminomètre et du réactif, mais qu'aujourdhui il est de l'ordre de l'attomole, par utilisation du nombre d'Avogadro (6,022 x 1023), il est facile de prévoir le nombre de particules virales détectables, le dosage par ATP métrie étant réalisé avec le couple luciférase/luciférine de luciole (de produit est fabriqué par la société dite Controlife).Knowing that the molecular weight of ATP is 551 and that the detection threshold of ATP is a function of the luminometer and the reagent, but that today it is of the order of attomole, by the use of the number Avogadro (6.022 x 10 23 ), it is easy to predict the number of detectable viral particles, metering ATP metry being performed with the firefly luciferase / luciferin couple (product is manufactured by the company called Controlife).
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces exemples ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration. Exemple 1Other advantages and features of the invention will be better understood on reading the following examples of embodiments. Of course, these examples are not limiting, but are provided by way of illustration. Example 1
Protocole pour ATP-métrie sur le DNA ou RNA viralProtocol for ATP-metry on DNA or viral RNA
- 100ml d'échantillon tamponné Tris HCl 5OmM, NaCl 150 mM à pH7,6. - On ajoute 10 μl de billes prêtes à l'emploi (avec ApoH ou anticorps spécifique du virus recherché).100 ml of 5mMM Tris HCl buffered sample, 150 mM NaCl at pH 7.6. 10 μl of ready-to-use beads (with ApoH or specific antibody of the desired virus) are added.
- Incuber de 30 à 90 min à 37 0C sous agitation rotative modérée.Incubate for 30 to 90 min at 37 ° C. with moderate rotary stirring.
- Laver une fois dans du PBS.- Wash once in PBS.
- Récupérer les billes avec un système aimanté. - Lyser les virus, en mettant les billes en contact avec une solution extractante du type DMSO.- Recover the balls with a magnet system. - Lyse the viruses, bringing the beads into contact with an extractant solution of the DMSO type.
- Ensuite procéder à l'hydrolyse des acides nucléiques en nucléotides et à leur transformation en ATP.- Then hydrolyze the nucleic acids into nucleotides and transform them into ATP.
Prévoir : - Solution tampon : limite les variations de pH du milieu ce qui évite la dénaturation du DNA (ou RNA). SDS (sodium dodécyl sulfate) : détergent qui rompt les couches de lipides.Provide: - Buffer solution: limits the pH variations of the medium which avoids the denaturation of the DNA (or RNA). SDS (sodium dodecyl sulfate): a detergent that breaks the lipid layers.
EDTA (éthylène diamine tétraacétate) : chélateur des ions calcium. Les ions Ca sont nécessaires à l'activité des DNases, enzymes qui détruisent le DNA et sont présentes dans toutes les cellules.EDTA (ethylene diamine tetraacetate): chelates calcium ions. Ca ions are necessary for the activity of DNases, enzymes that destroy DNA and are present in all cells.
Centrifuger pour séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes). Acétate de sodium froid et éthanol glacé pour insolubiliseer le DNA. Exemple 2 Dosage de bactériophagesCentrifuge for fast separation of solid particles (the heaviest) from substances in solution (less heavy). Cold sodium acetate and ice cold ethanol to insolubilize the DNA. Example 2 Determination of Bacteriophages
On a utilisé des bactéries lactiques en tant que cellules cibles des bactériophages qui sont des virus lytiques.Lactic acid bacteria have been used as target cells for bacteriophages which are lytic viruses.
Dans les laiteries et les fromageries, la qualité des produits laitiers est fonction de la quantité d'acide lactique produit par les bactéries lactiques, et il convient de surveiller la teneur en bactériophages pour empêcher la destruction desdites bactéries lactiques.In dairies and cheese factories, the quality of dairy products is a function of the amount of lactic acid produced by the lactic acid bacteria, and the bacteriophage content must be monitored to prevent the destruction of said lactic acid bacteria.
A une population connue de bactéries lactiques [déterminée selon le procédé décrit dans la demande de brevet intitulée : "ATP-métrie à partir de Nucléotides Adényliques intracellulaires pour détecter et dénombrer des cellules, utilisation et procédé de mise en œuvre pour la détermination de bactéries notamment dépourvues d'ATP" déposée le même jour que la présente demande] on a ajouté des quantités croissantes de bactériophages (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L, 20 virus/L). Par la mise en œuvre des étapes (1°) - (7°) précitées, on retrouve les populations correctes de départ (0 virus/L, 1 virus/L, 10 virus/L et 20 virus/L).To a known population of lactic acid bacteria [determined according to the process described in the patent application entitled: "ATP-metry from intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells, use and method of implementation for the determination of bacteria, in particular lacking ATP "deposited on the same day as the present application], increasing amounts of bacteriophage (0 virus / L, 1 virus / L, 10 viruses / L, 20 viruses / L) were added. By the implementation of steps (1 °) - (7 °) above, we find the correct starting populations (0 viruses / L, 1 virus / L, 10 viruses / L and 20 viruses / L).
Exemple 3Example 3
Détection de bactériophages par dosage des Na des cellules hôtes (a) Le dosage des nucléotides ATP, ADP, AMP est effectué par bioluminescence en présence du complexe luciférine-luciférase. La luciférase est une enzyme extraite de l'abdomen de luciole (Photinus pyralis ou Luciola mingrelica). Une molécule de luciférine est oxydée parBacteriophage detection by Na assay of host cells (a) The ATP, ADP, AMP nucleotide assay is performed by bioluminescence in the presence of the luciferin-luciferase complex. Luciferase is an enzyme extracted from the firefly abdomen (Photinus pyralis or Luciola mingrelica). A luciferin molecule is oxidized by
1 mole d'ATP et 1 mole de O2 et pour chaque molécule de luciférine, un quantum d'énergie lumineuse est émis selon la réaction globale (1) précitée:1 mole of ATP and 1 mole of O2 and for each luciferin molecule, a quantum of light energy is emitted according to the above-mentioned overall reaction (1):
Le dosage de l'ATP peut s'effectuer directement par bioluminescence. Ici il est nécessaire de transformer l'ADP et de l'AMP en ATP par réactions enzymatiques, en utilisant la myokinase et la pyruvate kinase selon les réactions (3), (3a) et (4) précitée.The ATP assay can be performed directly by bioluminescence. Here it is necessary to transform the ADP and AMP into ATP by enzymatic reactions, using myokinase and pyruvate kinase according to reactions (3), (3a) and (4) above.
MATERIEL ET METHODESMATERIAL AND METHODS
Souches bactériennes : deux souches industrielles de Streptocoques mésophiles, SMlO et SM26, ont été utilisées pour la mise au point de la détection de phages virulents (respectivement φlO et φ26) ; pour la détection de phages tempérés, c'est la souche SMl 6 lysogène qui a été retenue.Bacterial strains: two industrial strains of mesophilic Streptococci, SM10 and SM26, were used for the development of the detection of virulent phages (respectively φ10 and φ26); for the detection of temperate phages, the lysogenic SM1 strain was retained.
Milieu de culture : Le milieu synthétique Ml 7 a été employé dans tous les essais.Culture medium: The synthetic medium Ml 7 was used in all the tests.
Action d'un phage virulent : La croissance est suivie dans desAction of a virulent phage: Growth is followed in
Erlenmeyers de 250 ml, contenant 100 ml de milieu M17. Les Erlenmeyers sont inoculés à 1 % p/v avec une culture âgée de 16 heures et mise à incuber à 320C. Lorsque la densité optique (mesurée à 580 nm) atteint 0,1 on ajoute ImI de la solution contenant les phages virulents (109 pfu/ml).250 ml Erlenmeyer flasks, containing 100 ml of M17 medium. The Erlenmeyer flasks are inoculated at 1% w / v with an aged culture of 16 hours and incubated at 32 ° C. When the optical density (measured at 580 nm) reaches 0.1, the solution containing the virulent phages is added to 1 μM. (10 9 pfu / ml).
Action d'un phage tempéré : L'induction du prophage intégré dans le DNA est déclenchée par action de la mitomycine (MC) à 0,3 μg/ml dès que la croissance atteint 0,1 de densité optique.Action of a temperate phage: The induction of integrated prophage in the DNA is triggered by the action of mitomycin (MC) at 0.3 μg / ml as soon as the growth reaches 0.1 of optical density.
Mesure de la croissance : La croissance est suivie parallèlement par mesure de la densité optique et par dosage des nucléotides adényliques.Measurement of growth: Growth is monitored in parallel by measuring the optical density and by determining the adenyl nucleotides.
Trois échantillons son t ainsi préparés : n° 1 — dosage des nucléotides totaux - 200 μl d'échantillon + 1.8 ml de DMSO pur + 10 ml tampon Tris (20 mM Tris, 10 mM acétate Mg, pH 7,75) ; n° 2 - dosage des nucléotides extracellulaires - 200 μL d'échantillon, filtré sur membrane Millipore (0.22 μm) + 4.8 ml tampon Tris 1 : n° 3 — dosage des nucléotides sans extraction, ni filtration - 200 μl d'échantillon + 4,8 ml tampon Tris 1.Three samples were thus prepared: No. 1 - total nucleotide assay - 200 μl of sample + 1.8 ml of pure DMSO + 10 ml of Tris buffer (20 mM Tris, 10 mM acetate Mg, pH 7.75); n ° 2 - extracellular nucleotide assay - 200 μL of sample, filtered on a Millipore membrane (0.22 μm) + 4.8 ml Tris 1 buffer: n ° 3 - nucleotide assay without extraction or filtration - 200 μL of sample + 4 , 8 ml Tris buffer 1.
A 200 μl d'échantillon préparé on ajoute 100 μl de luciférase et :To 200 .mu.l of prepared sample is added 100 .mu.l of luciferase and:
- pour le dosage de l'ATP, 50 μl de tampon Tris 2 (20 mM Tris, 10 mM acétate de Mg, 5 mM acétate de K, 40 μM PEP), - pour réaliser un témoin interne, 50 μl de tampon Tris 2 contenant 10 picomoles d'ATP,for the determination of ATP, 50 μl of Tris 2 buffer (20 mM Tris, 10 mM acetate Mg, 5 mM K acetate, 40 μM PEP), to make an internal control, 50 μl of Tris buffer 2 containing 10 picomoles of ATP,
- pour le dosage de l'ATP et de l' ADP, 50 μl de tampon Tris 2 contenant 2 U de pyruvate-kinase, etfor the determination of ATP and ADP, 50 μl of Tris 2 buffer containing 2 U of pyruvate kinase, and
- pour le dosage de l'ATP, l'ADP et l'AMP, 50 μl de tampon Tris 2 contenant 2 U de pyruvate-kinase et 2 U de myokinase. RESULTATSfor the determination of ATP, ADP and AMP, 50 μl of Tris 2 buffer containing 2 U of pyruvate kinase and 2 U of myokinase. RESULTS
D'après les figures 1 et 2, les courbes de croissance obtenues par dosage de l'ATP sont équivalentes à celles obtenues par mesure de la densité optique. Dans les deux cas (action des bactériophages et lyse des bactéries après addition de mitomycine), la décroissance due à la lyse des cellules est plus accentuée dans les mesures d'ATP que par mesure de la densité optique (courbes al et bl, figures 1 et 2). La concentration en ATP reflète mieux la quantité de bactéries "vivantes" alors que la mesure de la densité optique inclut en plus les débris cellulaires présents dans le milieu en quantité importante lors des phénomènes de lyse.According to FIGS. 1 and 2, the growth curves obtained by ATP assay are equivalent to those obtained by measuring the optical density. In both cases (action of bacteriophages and lysis of bacteria after addition of mitomycin), the decrease due to lysis of cells is more accentuated in ATP measurements than by measurement of optical density (curves a 1 and b 1, FIGS. and 2). The concentration of ATP better reflects the amount of "live" bacteria while the measurement of optical density additionally includes the cell debris present in the medium in large amounts during lysis phenomena.
Les résultats rapportés dans les figures 1 et 2 correspondent aux mesures de l'ATP total (par extration de l'ATP intracellulaire au DMSO). Les flèches indiquent l'instant d'introduction du phage.The results reported in Figures 1 and 2 correspond to measurements of total ATP (by extrac- tion of intracellular ATP to DMSO). The arrows indicate the moment of introduction of the phage.
Comme indiqué dans US 3575812 A précité, on ne dose que les RLU de l'ATP total (intra- et extracellulaire) sans utiliser l'ajout dosé .Certes il met en évidence une variation des RLU dans les cellules attaquées par les phages, mais certaines fois dans les exemples de ce brevet US les valeurs sont croissantes et d'autres fois décroissantes. Ceci est dû au fait qu'un témoin- interne n'est pas utilisé et que on ne distingue pas l' ATP intracellulaire de l'ATP extracellulaire.As indicated in US Pat. No. 3,575,812 A, RLUs of total ATP (intra- and extracellular) are dosed without using the metered addition. While it shows a variation of RLUs in phage-attacked cells, sometimes in the examples of this US patent the values are increasing and other times decreasing. This is because an internal control is not used and intracellular ATP is not distinguished from extracellular ATP.
Les résultats de la figure 3 donnée ci-après permettent de comparer les dosages de l'ATP extracellulaire par rapport à l'ATP total. L'avantage de doser les NA extracellulaires réside dans la simplification du protocole : on n'a plus besoin de lyser les cellules (cette lyse est effectuée par les phages). Les courbes des AN extracellulaires après filtration et sans filtration sont identiques (elles se chevauchent), (b) La figure 4 montre une culture de souche de Streptocoques MlO, phagée en début de culture par le Phage SMlOThe results of FIG. 3 given below make it possible to compare the extracellular ATP assays relative to the total ATP. The advantage of assaying the extracellular NA lies in the simplification of the protocol: there is no longer any need to lyse the cells (this lysis is carried out by the phages). The extracellular AN curves after filtration and without filtration are identical (they overlap), (b) Figure 4 shows a strain culture of MlO Streptococci, phage at the beginning of culture by Phage SM10
L'exemple 3 montre dans ses trois variantes que le dosage directe desExample 3 shows in its three variants that the direct dosage of the
AN extracellulaires permet un contrôle en continu. En effet, ce contrôle peut s'effectuer par prélèvement automatique d'un échantillon suivi de la transformation des AN en ATP puis du dosage de l'ATP ainsi formé par bioluminescence avec une lecture instantanée. Les résultats obtenus selon, les trois variantes de l'exemple 3 ont été obtenus à partir d'essais réalisés sur le milieu synthétique de référence M17. Or dans un milieu naturel, il est difficile de faire de la densité optique, de plus les autres techniques de contrôle sont soit fastidieuses soit imprécises pour permettre détecter rapidement l'action d'un virus qu'il soit "virulent" ou "tempéré". En revanche, le dosage des NA est rapide et l'utilisation utilisant du témoin interne constitué d'une solution d'ATP connue permet de quantifier.Extracellular AN allows continuous control. Indeed, this control can be carried out by automatic sampling of a sample followed by the transformation of the AN to ATP then the assay of ATP thus formed by bioluminescence with an instantaneous reading. The results obtained according to the three variants of Example 3 were obtained from tests carried out on the M17 synthetic reference medium. But in a natural environment, it is difficult to make optical density, and other control techniques are either tedious or imprecise to quickly detect the action of a virus that is "virulent" or "temperate" . On the other hand, the NA assay is rapid and the use using an internal control consisting of a known ATP solution makes it possible to quantify.
Le rapport ANextra/ANtotaιIX permet de mettre en évidence une attaque virale et son importance. On peut ainsi dépister jusqu'à 10 phages par mlThe report AN extra / AN totaιIX makes it possible to highlight a viral attack and its importance. It can thus be detected up to 10 phages per ml
Le dosage des AN extracellulaires, en ce qui concerne les virus lytiques, permet une détection plus rapide et plus simple. C'est la seule méthode qui permette de repérer une attaque virale dans un milieu complexe contenant différentes espèces de virus, en mettant cette échantillon en contact avec différentes cultures de cellules hôtes. Selon l'invention on augmente, la sensibilité en dosant les AN et non les. RLU de l'ATP. The extracellular AN assay, for lytic viruses, allows faster and simpler detection. This is the only method to identify a viral attack in a complex medium containing different virus species, by bringing this sample into contact with different host cell cultures. According to the invention, the sensitivity is increased by assaying the ANs and not the ones. RLU of ATP.

Claims

REVENDICA TIONS
1. Utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :1. Use of bioluminescence according to reaction (1):
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons,
pour détecter et dénombrer les virus, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en œuvre (a) la mise en contact des dits virus avec des cellules de leur cible dans un milieu liquide aqueux exempt d'ATP, d'ADP et d'AMP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) libres provenant des cellules de la cible, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2) :for detecting and counting viruses, said use being characterized in that it implements (a) bringing said viruses into contact with cells of their target in an aqueous liquid medium free of ATP, ADP and AMP, then measuring the content of free adenyl nucleotides (AN) from the target cells, expressed as ATP, taking into account that the sum of the free intracellular ATP, ADP and AMP of said family is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
après avoir transformé les ADP et AMP de la cible en ATP, ou (b) le clivage du patrimoine génétique viral, constitué par le DNA ou le RNA desdits virus, au moyen d'une DNA-ase ou, respectivement, d'une RNA- ase, avec transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP, la transformation des AMP et ADP totaux en ATP, puis la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) provenant du clivage du DNA ou RNA viral, exprimée sous forme d'ATP, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP du matériel génétique d'une même famille de virus est constante selon ladite relation (2), ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout dATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.after having transformed the ADP and AMP of the target into ATP, or (b) the cleavage of the viral genetic inheritance, constituted by the DNA or the RNA of said viruses, by means of a DNA-ase or, respectively, of a RNA - Ase, with transformation of dAMP and DADP dimers into AMP and ADP monomers, the transformation of total MPA and ADP into ATP, and then the measurement of the adenylic nucleotide (AN) content from cleavage of viral DNA or RNA, expressed as of ATP, taking into account that the sum of the ATP, ADP and AMP of the genetic material of the same virus family is constant according to said relation (2), said measurement being carried out (i) without adding dATP and (ii) ) after adding a known amount of ATP.
2. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que I1ATP- métrie des virus lytiques est entreprise à partir des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP.2. Use according to claim 1, characterized in that I 1 ATP-metry lytic viruses is undertaken from the AN extracellularly released by lysis of the cell wall of the target, said AN being expressed as ATP.
3. Utilisation suivant la revendication 1, caractérisée en ce que l'ATP- métrie des virus à libération continue est entreprise à partir des AN intracellulaires libérés par la lyse provoquée de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. 3. Use according to claim 1, characterized in that the ATP-metry of the sustained-release virus is initiated from the intracellular ANs released by the induced lysis of the cell wall of the target, said AN being expressed as ATP.
4. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus lyriques, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN extracellulairement libérés par la lyse de la paroi des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP. 4. A method for detecting and enumerating by ATP-metry the lyric viruses, characterized in that it comprises the measurement of the ANs extracellularly released by the lysis of the cell wall of the target, said AN being expressed in the form of ATP.
5. Procédé pour détecter et dénombrer par ATP-métrie les virus à libération continue, caractérisé en ce qu'il comprend la mesure des AN intracellulaires libres des cellules de la cible, lesdits AN étant exprimés sous forme d'ATP, la teneur en AN intracellulaires libres totaux des cellules infectées de la cible étant différente de celles des mêmes cellules non infectées de ladite cible.5. A method for detecting and counting by ATP-metry the continuous-release viruses, characterized in that it comprises the measurement of the free intracellular ANs of the target cells, said ANs being expressed in the form of ATP, the content of AN total free intracellular cells of the infected cells of the target being different from those of the same non-infected cells of said target.
6. Procédé suivant la revendication 4, pour la détection et la numération des souches d'un virus lyrique par bioluminescence selon la réaction (1) :6. Process according to claim 4, for the detection and enumeration of strains of a lytic virus by bioluminescence according to reaction (1):
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -» oxyluciférine + photons(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase - »oxyluciferin + photons
ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :said method, which is based on the fact that the sum of the intracellular adenyl nucleotides (AN) of the uninfected target is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (1°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN libres;characterized in that it comprises the following steps: (1) using an aqueous liquid sample (E), which is likely to contain strains of a virus (V) to be tested and which is devoid of Free AN;
(2°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible; (3°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement lyse la paroi de la cible;(2) contacting said sample (E) with the cells of the target; (3 °) incubate the resulting reaction medium until the virus arriving at the end of its development lyses the wall of the target;
(4°) recueillir le milieu extracellulaire résultant et le traiter pour transformer les ADP et AMP en ATP;(4) collect the resulting extracellular medium and treat it to transform ADP and AMP into ATP;
(5°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP; (6°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP; et(5 °) introducing into the medium resulting from step (4 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP; (6) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(7°) déterminer la teneur en AN totaux extracellulairement libres sous la forme dATP, puis en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.(7) determine the extracellularly free total AN content in the dATP form, and then deduce the number of strains of said virus (V) in the initial sample (E).
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que, à l'étape (7°), la teneur en AN totaux extracellulaires est déterminée au moyen d'un système d'abaques ou par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (1°) à (7°) en l'absence dudit virus, pour en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.7. Process according to claim 6, characterized in that, in step (7 °), the total extracellular AN content is determined by means of an abacus system or by comparison with that of the cells of the target obtained. by reproducing the steps (1 °) to (7 °) in the absence of said virus, to deduce the number of strains of said virus (V) in the sample (E) initial.
8. Procédé suivant la revendication 5, pour la détection et la numération des souches d'un virus non lytique par bioluminescence selon la réaction (1) qui suit :The method of claim 5 for detecting and enumerating strains of a non lytic virus by bioluminescence according to the following reaction (1):
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -→- oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase - → - oxyluciferin + photons,
ledit procédé,' qui s'appuie sur le fait que la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires de la cible non infectée est constante selon la relation (2) :said method 'which is based on the fact that the sum of adenyl nucleotides (AN) of the uninfected intracellular target is constant according to equation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à :characterized by comprising the following steps:
(la°) faire appel à un échantillon liquide aqueux (E), qui est susceptible de contenir des souches d'un virus (V) à tester et qui est dépourvu de AN ;(°) use an aqueous liquid sample (E), which is likely to contain strains of a virus (V) to be tested and which is devoid of AN;
(2a°) mettre en contact ledit échantillon (E) avec les cellules de la cible ;(2a) contacting said sample (E) with the cells of the target;
(3a°) laisser incuber le milieu réactionnel résultant jusqu'à ce que le virus arrivant à l'issue de son développement traverse la paroi de la cible ;(3a) incubate the resulting reaction medium until the virus arriving at the end of its development through the wall of the target;
(4a°) recueillir les cellules de la cible, les soumettre à une lyse de façon à recueillir le milieu intracellulaire résultant, puis traiter ledit milieu intracellulaire pour transformer les ADP et AMP en(4a) collect cells from the target, lysed to collect the resulting intracellular medium, and then treat said intracellular medium to transform ADP and AMP into
ATP ; (5a°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (4a°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;ATP; (5a) introducing into the medium resulting from step (4a) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP;
(6a°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ; et(6a) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(7a°) déterminer la teneur en AN totaux intracellulairement libres, sous la forme d'ATP, pour en déduire le nombre de souches dudit virus (V) dans l'échantillon (E) initial.(7a) determine the total intracellularly free AN content, in the form of ATP, to deduce the number of strains of said virus (V) in the initial sample (E).
9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (7a°), la teneur en AN totaux intracellulaires est réalisée au moyen d'un système d'abaques préétabli, ou par comparaison avec celle des cellules de la cible obtenue par reproduction des étapes (Ia0) à (7a°) en l'absence dudit virus, pour en déduire le nombre de virus (V) de F'échantillon (E) initial.9. A method according to claim 8, characterized in that, in step (7a °), the total intracellular NA content is achieved by means of a pre-established system of abacuses, or by comparison with that of the cells of the target obtained by reproducing the steps (Ia 0 ) to (7a °) in the absence of said virus, to deduce the number of viruses (V) of the sample (E) initial.
10. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape (4a°), la lyse de la paroi cellulaire de la cible est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (3a°) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou10. Process according to claim 8, characterized in that, in step (4a °), lysis of the cell wall of the target is carried out in the medium resulting from step (3a °) by addition of a aqueous buffer containing (i) Tris plus EDTA, and / or
(ii) DMSO, puis traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules de la cible, suivi d'un refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant.(ii) DMSO, then microwave treatment (for about 1 minute) to open the cells of the target, followed by rapid cooling (especially in the refrigerator) and, if necessary, centrifugation to collect the resulting liquid medium.
11. Procédé suivant la revendication 6 ou 8, caractérisé en ce que l'étape (4°) ou (4a°) de la transformation des ADP et AMP en ATP est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase.11. The method of claim 6 or 8, characterized in that the step (4 °) or (4a °) of the transformation of ADP and AMP ATP is performed by means of myokinase and pyruvate kinase.
12. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une phase de capture des virus ou de leur cellules hôtes au moyen de microbilles magnétiques revêtues d'ApoH.12. A method according to any one of claims 4 to 11, characterized in that it comprises a capture phase of viruses or their host cells by means of magnetic microbeads coated with ApoH.
13. Nécessaire de dosage mettant en œuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole et de l'ATP pour l'ajout dosé, et le cas échéant de la myokinase, de la pyruvate kinase, de la pyruvate orthophosphate dikinase et/ou des microbilles magnétiques revêtues d'ApoH.13. A dosing kit implementing the method according to any one of claims 4 to 12, characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly and ATP for the metered addition, and the case appropriate myokinase, pyruvate kinase, pyruvate orthophosphate dikinase and / or magnetic microbeads coated with ApoH.
14. Procédé pour détecter et dénombrer les virus par ATP-métrie, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend : - le clivage du DNA ou du RNA viral au moyen de DNA-ase ou de14. A method for detecting and counting viruses by ATP-metry, said method being characterized in that it comprises: cleaving DNA or viral RNA by means of DNA-ase or
RNA-ase, puis le cas échéant la transformation des dimères dAMP et dADP en monomères AMP et ADP,RNA-ase, then if necessary the transformation of dimers dAMP and ADP into monomers AMP and ADP,
- la transformation des AMP et ADP ainsi obtenus en ATP,the transformation of the MPAs and ADP thus obtained into ATP,
- la mise en contact de l'ATP avec une luciférine et une luciférase d'abord- bringing the ATP into contact with a luciferin and a luciferase first
(i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP,(i) without addition of ATP, then (ii) after addition of a known quantity of ATP,
- la mesure du signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'ATP, et - la détermination de la teneur en AN totaux initialement liés, exprimés sous la forme d'ATP pour en déduire le nombre de virus. measurement of the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after addition of ATP, and determination of the content of total ANs initially bound, expressed in the form of ATP for deduce the number of viruses.
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