EP1807528A1 - Atp-metry based on intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells, use and implementing method for determining bacteria in particular devoid of atp - Google Patents

Atp-metry based on intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells, use and implementing method for determining bacteria in particular devoid of atp

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Publication number
EP1807528A1
EP1807528A1 EP05809294A EP05809294A EP1807528A1 EP 1807528 A1 EP1807528 A1 EP 1807528A1 EP 05809294 A EP05809294 A EP 05809294A EP 05809294 A EP05809294 A EP 05809294A EP 1807528 A1 EP1807528 A1 EP 1807528A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
atp
cells
adp
luciferin
intracellular
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05809294A
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German (de)
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Inventor
Dominique Champiat
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TESTLIFE TECHNOLOGIES Sas
Original Assignee
Testlife Technologies
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1807528A1 publication Critical patent/EP1807528A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase

Definitions

  • ATP-metry from intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells use and method of implementation for the determination of bacteria in particular without ATP
  • the present invention relates to a new technique of one ATP-metry from adenyl nucleotides (AN) free intracellular for detecting and counting the cells. It also relates to the use of this new technique and an implementation method for the determination of bacteria including those which are devoid of ATP.
  • AN adenyl nucleotides
  • This reaction is specific for ATP, regardless of the system used luciferin (substrate) / luciferase (enzyme). It distinguishes dead cells (lacking ATP) from living cells when they contain 1 I ATP.
  • This technique comprises contacting a test sample with the luciferin + luciferase assembly in order to measure the emitted light (ie to measure with amplification the photons produced) by the above-mentioned reaction (1) in the presence of microorganisms releasing ATP. , ADP and / or AMP, with transformation of ADP and AMP to ATP 5 on the one hand, and with and without adding extra ATP on the other hand.
  • This article neither describes nor suggests that this technique is applicable to the detection and enumeration of cells containing at least one of the three ANs.
  • the present invention makes it possible to satisfy the said requirement for all the cells, to the exclusion of the viruses which do not contain ATP (in fact the viruses, which do not have AN, use to develop the ATP of the cells which they infect).
  • AN total free intracellular adenyl nucleotide
  • reaction (1) a method for detecting and counting the cells of a given non-viral species likely to be present in a liquid sample (E), in particular bacteria, by a bioluminescence method according to the invention.
  • step (4 °) introducing into the medium resulting from step (3 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP; (5) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
  • Said assay is characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly, ATP for the metered addition, myokinase, pyruvate kinase, and optionally pyruvate orthophosphate dikinase and or adenosine phosphate deaminase.
  • Adenyl nucleotide (other usable nomenclature: adenosine nucleotide), the set of AN includes here the ATP, ADP and
  • This sample (E) comes from a sampling gas [in particular by bubbling], solid [in particular by contact, dissolution or dispersion] or liquid [in particular by extraction, dissolution or emulsion] by means of a liquid which is advantageously aqueous.
  • the reaction (1) above provides oxyluciferin, photons, AMP and one or more phosphates, mainly pyrophosphate. She . is characteristic of the living, since the intracellular ATP released in the reaction medium does not have a long life.
  • Free intracellular AN means here the ANs present in the free state in the cell, more precisely in the cytoplasm.
  • the invention is therefore not interested in the non-free ANs that are found in the cell and are linked at the level of DNA or RNA.
  • L 1 ATP is involved in the cell as a source of energy (mechanical energy, osmotic energy, chemical energy, caloric energy, light energy) phosphate donor, pyrophosphate donor, donor AMP and adenosine donor.
  • the ATP content in cells of the same species varies greatly depending on the physiological state; the detection limit is generally limited to 10 bacteria. According to the invention, a better sensitivity will be attained, ranging from 1 attomole of ATP (without stabilization of the emitted light signal) to 0.5 attomole of ATP (with stabilization of said signal), which corresponds approximately to the content mean total free intracellular AN of a bacterium.
  • cells of a given species all have the same AN content.
  • AN expressed as ATP
  • step (1 °) of the process of the invention which relates to the isolation and concentration, is carried out by
  • the immunocapture technique is preferred. It allows the concentration and purification of cells by fixing them with immobilized antibodies.
  • these antibodies can be directed against cell surface antigens without destroying said cells.
  • these antibodies are immobilized on magnetic latex beads for concentration and purification of cell-antibody-bead conjugates in a magnetic field and for the collection of said conjugates.
  • non-magnetic or non-magnetizable beads, bound to the antibodies that bind the cells also allow, by decantation, the concentration and purification of the cells.
  • the concentration / purification stage can be carried out on an affinity column.
  • Said conjugates are then separated, if necessary, in particular by elution, in order to have a concentrated liquid composition of cells which are no longer bound to the antibodies. If necessary, to limit the dilutions which decrease the sensitivity, it may be advisable to concentrate the said liquid composition by means of an evaporation-centrifugation device (operating from 2000-10000 revolutions / 15 minutes to 2000-10000 revolutions / 1 minute), which makes it possible to dry a large number of samples in a few minutes without loss of products. Evaporation-centrifugation at. Ambient temperature offers the advantage of being able to remove most of the water from the medium containing the cells.
  • step (2 °) relating to lysis of the cell wall is carried out in the medium resulting from step (1 °) by addition of an aqueous buffer containing
  • Lysis is required in order to access free intracellular ANs, transform ADP and AMP to ATP, and bring into contact ATP resulting from said lysis and / or transformation with substrate (luciferin) and enzyme (luciferase) .
  • step (3 °) relating to the conversion of ADP and AMP to ATP is carried out using myokinase and pyruvate kinase.
  • the reaction mechanisms are as follows:
  • step (3 °) of the process of the invention relating to the conversion of ADP and AMP to ATP can be carried out at the same time as step (2 °).
  • step (4 °) of the process of the invention is carried out with luciferin and firefly luciferase (Photinus pyralis).
  • the substrate and the enzyme can be extracted together from the firefly.
  • PPDK Pyruvate orthophosphate dikinase
  • ATP Pyruvate orthophosphate dikinase
  • adenosine phosphate deaminase which degrades ADP and / or AMP residuals that may be present in the reaction medium.
  • the first enzyme provides a stable signal by regenerating the ATP substantially continuously.
  • the second enzyme makes it possible to reduce the background noise due to the residual presence of ADP and / or AMP, without the process of using ATP as a source of light energy being disturbed.
  • Said second enzyme adenosine phosphate deaminase, is more advantageously used to eliminate the nucleotide residues in the reaction medium and more particularly to eliminate by destroying the extracellular nucleotide residues present in the sample where appropriate in the step (1) above.
  • the method of the invention is particularly suitable for the detection and enumeration of (i) sporulated bacteria, such as anthrax, and (ii) legionella, salmonella and other unicellular organisms such as amoebae.
  • an aqueous sample is obtained by bubbling. Immuno-capture of the strains present by means of a column comprising immobilized anti-polyclonal antibodies (anthrax). The anthrax strains thus purified and concentrated are collected in a reduced volume of aqueous buffer. It is further concentrated by evaporation and centrifugation under vacuum at room temperature. Nucleotide residues such as ANs, which may be present in the resulting aqueous medium, are removed by means of adrenosine phosphate deaminase, which is then inactivated.
  • the wall of the anthrax strains is treated by the addition of Tris and EDTA and then microwaving. By centrifugation, the liquid medium which contains the intracellular ANs is collected. Myokinase and pyruvate kinase are added to convert AMP and ADP to ATP. Firefly luciferin and firefly leuciferase are added with PPDK to stabilize the photon emission.
  • the multiplied photons are measured by means of a known device in RLU units. 2 ⁇ l of ATP are added and the multiplied photons re-measured RLU unit.
  • Example 2 The same procedure is repeated from a known quantity (50 strains) of anthrax, and determines that the liter of starting air contains 65 strains of anthrax.
  • Example 2 The same procedure is repeated from a known quantity (50 strains) of anthrax, and determines that the liter of starting air contains 65 strains of anthrax.
  • the objective is to obtain an average value of AN per cell of Legionella pneumophilaparente to perform a count by culture and choose the optimal operating conditions. Parameters studied:
  • the raw water samples are pre-concentrated (volume from 50 ml to 11 to 1-5 ml). This step makes it possible to increase the sensitivity and to save the means of immunoseparation (IMS).
  • the samples used are concentrated either:
  • legionella In the case of legionella, it is the latter technique of concentration that is preferred because legionella can be released from the binding with the beads and allows optimized immunocapture IMS.
  • concentration and recovery of the bead-legionella complexes can be carried out by various techniques known in the art. Legionellae released from magnetic beads are resuspended to undergo optimized IMS protocol as follows: B2 - Optimization of protocol after capture in 1 ml
  • the capture antibody anti-Lpl-14 or anti-Lpl.
  • the protocol optimized for a volume of 1 ml will be applied to increasing volumes ranging from 1 to 5 ml.
  • the beads are recovered with Legionella pneumophila (dead or alive).
  • the beads are put into the lysis solution which can be:
  • the amount of picomoles of NA in ATP equivalent in the sample is thus calculated.
  • the amount of living legionella is calculated (the molecular weight of ATP is 551).
  • the duration of the manipulation, from the sampling to the final result, does not exceed 60 minutes for the detection of 10 live legionella.
  • Arthrobacter NS48 the evolution of the ratio AN / cell depending on the culture time of this strain, the bacterial population being from 5.10 6 cells / ml and 3.5.10 8 cells / ml.

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Abstract

The invention concerns the use of bioluminescence dependent on the reaction (1): luciferin + ATP + O2 + Mg2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons for detecting and counting living cells of a given species potentially present in a liquid sample, said use being characterized in that it consists in measuring the total free intracellular adenyl nucleotides (AN) content, expressed in ATP form, of living cells of a given non-viral species, taking into account the fact that the sum of free intracellular ATP, ADP and AMP of said family is constant according to the relationship (2): [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte after transforming the free intracellular ATP, ADP and AMP by using myokinase and pyruvate kinase, said measurement being performed (i) without adding ATP and (ii) after adding a known amount of ATP. The invention also concerns a method for detecting and counting cells by ATP-metry.

Description

ATP-métrie à partir de nucléotides adényliques intracellulaires pour détecter et dénombrer des cellules, utilisation et procédé de mise en œuvre pour la détermination de bactéries notamment dépourvues d'ATP ATP-metry from intracellular adenyl nucleotides for detecting and counting cells, use and method of implementation for the determination of bacteria in particular without ATP
Domaine de l'inventionField of the invention
La présente invention a trait à une nouvelle technique d1 ATP-métrie à partir de nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres pour détecter et dénombrer des cellules. Elle concerne également l'utilisation de cette nouvelle technique et un procédé de mise en œuvre pour la détermination de bactéries notamment celles qui sont dépourvues d'ATP. Art antérieurThe present invention relates to a new technique of one ATP-metry from adenyl nucleotides (AN) free intracellular for detecting and counting the cells. It also relates to the use of this new technique and an implementation method for the determination of bacteria including those which are devoid of ATP. Prior art
On sait l'ATP-métrie, qui est fondée sur la réaction :We know ATP-metry, which is based on the reaction:
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -» oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase - »oxyluciferin + photons,
permet de mesurer efficacement la teneur en ATP d'un milieu. Cette réaction est spécifique de l'ATP, quel que soit le système utilisé luciférine (substrat)/luciférase (enzyme). Elle permet de distinguer les cellules mortes (dépourvues d'ATP) des cellules vivantes quand celles-ci contiennent de I1ATP.makes it possible to effectively measure the ATP content of a medium. This reaction is specific for ATP, regardless of the system used luciferin (substrate) / luciferase (enzyme). It distinguishes dead cells (lacking ATP) from living cells when they contain 1 I ATP.
Dans le passé, on a cru (en vain) que la connaissance de la teneur en ATP intracellulaire provenant de la lyse de bactéries d'une même espèce pourrait permettre de détecter et dénombrer la population (i. e. nombre de souches par unité de volume) desdites bactéries. Voir à cet effet les publications US 6200767 B, EP 1333097 A, US 6465201 B, Stender H. et al., Journal of Microbilogical Methods, 2001; 46: 69-7 J5, et Lee J-Y. et al, Luminescence 2004; 19:31-36.In the past, it has been believed (unsuccessfully) that knowledge of the intracellular ATP content from the lysis of bacteria of the same species could detect and enumerate the population (ie number of strains per unit volume) of bacteria. See, for example, US 6200767 B, EP 1333097 A, US 6465201 B, Stender H. et al., Journal of Microbilogical Methods, 2001; 46: 69-7 J 5, and Lee JY. et al, Luminescence 2004; 19: 31-36.
Les méthodes décrites dans ces publications sont efficaces pour l'étude de bactéries provenant d'une même culture de collection et se trouvant toutes à un même état de développement (i.e. des bactéries qui ne sont pas au repos et contiennent toute la même teneur en ATP). En revanche, elles sont inefficaces vis-à-vis de pratiquement toutes les autres bactéries que l'on rencontre en particulier dans la nature, à savoir notamment (i) les bactéries qui ne contiennent pas d'ATP (c'est le cas bactéries qui sont sous forme de spores, c'est à dire au repos), et (ii) des bactéries qui se trouvent à des états de développements différents et qui de ce fait n'ont pas chacune la même teneur en ATP.The methods described in these publications are effective for the study of bacteria from the same collection culture and are all in the same state of development (ie bacteria that are not at rest and contain all the same ATP content ). On the other hand, they are ineffective with regard to practically all the other bacteria that are found especially in nature, namely in particular (i) bacteria that do not contain ATP (this is the case with bacteria). which are in the form of spores, ie at rest), and (ii) bacteria which are in states different developments and therefore do not each have the same ATP content.
Or on sait que, à l'intérieur d'une même espèce ou variété de cellules, la teneur en AN intracellulaires libres totaux est constante, eu égard à la relation (2) :It is known that, within the same species or variety of cells, the content of total free intracellular AN is constant, with respect to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate
Voir à cet effet l'article de Champiat D. et al, Luminescence, 2001; 16:193- 198, où il est proposé, d'une part, de transformer l'AMP et, respectivement, l'ADP en ATP au moyen de pyruvate kinase et, respectivement, de myokinase, et d'autre part, de mesurer la lumière émise (en RLU, i.e. en unité relative de lumière) sans ajout puis après ajout de 10 μL d'ATP supplémentaire. Par ailleurs dudit article de Champiat D., on connaît une technique d'évaluation de la présence de contaminants, tels que les microorganismes (notamment les bactéries), dans un échantillon aqueux provenant de l'eau de mer, de l'eau de boisson ou d'un aliment. Cette technique comprend la mise en contact d'un échantillon à tester avec l'ensemble luciférine + luciférase pour mesurer la lumière émise (i. e. mesurer avec amplification les photons produits) par la réaction (1) précitée en présence de microorganismes libérant de l'ATP, de l'ADP et/ou de l'AMP, avec transformation des ADP et AMP en ATP5 d'une part, et avec et sans ajout d'ATP supplémentaire, d'autre part. Ledit article ne décrit ni ne suggère que cette technique est applicable à la détection et au dénombrement des cellules contenant au moins un des trois AN. En effet cet article ne vise que la mesure en RLU de la lumière émise sans penser pouvoir corréler les valeurs obtenues à la teneur en AN intracellulaires libres totaux puis au nombre de cellules ayant fourni lesdits AN intracellulaires libres totaux, ni suggérer cette corrélation. But de l'inventionSee the article by Champiat D. et al, Luminescence, 2001; 16: 193-198, where it is proposed, on the one hand, to transform the MPA and, respectively, the ADP into ATP by means of pyruvate kinase and, respectively, myokinase, and on the other hand, to measure the light emitted (in RLU, ie in relative light unit) without addition then after addition of 10 μL of additional ATP. Moreover, from the article by Champiat D., a technique is known for evaluating the presence of contaminants, such as microorganisms (in particular bacteria), in an aqueous sample from sea water, drinking water. or a food. This technique comprises contacting a test sample with the luciferin + luciferase assembly in order to measure the emitted light (ie to measure with amplification the photons produced) by the above-mentioned reaction (1) in the presence of microorganisms releasing ATP. , ADP and / or AMP, with transformation of ADP and AMP to ATP 5 on the one hand, and with and without adding extra ATP on the other hand. This article neither describes nor suggests that this technique is applicable to the detection and enumeration of cells containing at least one of the three ANs. Indeed, this article only aims at the RLU measurement of the light emitted without thinking of being able to correlate the values obtained with the content of total free intracellular ANs then with the number of cells having provided said total free intracellular ANs, nor to suggest this correlation. Purpose of the invention
II existe un besoin en ce qui concerne une technique permettant de détecter et de dénombrer les cellules, notamment les bactéries, les moisissures et les algues microscopiques, rapidement, efficacement et de façon nettement moins onéreuse que les méthodes EIA, RIA, FIA et PCR actuellement préconisées. Ce besoin se manifeste avec acuité quand on veut entreprendre la numération de microorganismes dépourvus d'ATP ou d'AN.There is a need for a technique for detecting and counting cells, including bacteria, molds and microscopic algae, quickly, efficiently and significantly cheaper than current EIA, RIA, FIA and PCR methods. recommended. This need is acute when one wants to undertake the count of microorganisms lacking ATP or AN.
On se propose donc de fournir une nouvelle solution technique mettant en œuvre une ATP-métrie portant sur l'ensemble des AN intracellulaires libres totaux, exprimés sous forme d'ATP, pour satisfaire ce besoin. Objet de l'inventionIt is therefore proposed to provide a new technical solution implementing an ATP-metry covering all the total free intracellular AN, expressed in the form of ATP, to satisfy this need. Object of the invention
La présente invention permet de satisfaire ledit besoin pour toutes les cellules à l'exclusion des virus qui ne contiennent pas d'ATP (en fait les virus, qui n'ont pas d'AN, utilisent pour se développer l'ATP des cellules qu'ils infectent).The present invention makes it possible to satisfy the said requirement for all the cells, to the exclusion of the viruses which do not contain ATP (in fact the viruses, which do not have AN, use to develop the ATP of the cells which they infect).
Selon un premier aspect de l'invention, on fournit une utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :According to a first aspect of the invention, a use of the bioluminescence according to reaction (1) is provided:
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg + luciférase -» oxyluciférine + photons,(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg + luciferase - »oxyluciferin + photons,
pour détecter et dénombrer les cellules vivantes d'une espèce donnée -pouvant être présentes dans un échantillon liquide, ladite utilisation étant caractérisée en ce qu'elle met en œuvre la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres totaux, exprimée sous forme d'ATP, de cellules vivantes d'une espèce non virale donnée, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2) :for detecting and counting living cells of a given species -may be present in a liquid sample, said use being characterized in that it implements the measurement of total free intracellular adenyl nucleotide (AN) content, expressed as form of ATP, of living cells of a given non-viral species, taking into account that the sum of the free intracellular ATP, ADP and AMP of said family is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte,(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate,
après avoir transformé les ADP et AMP intracellulaires libres en ATP au moyen de myokinase et de pyruvate kinase, ladite mesure étant réalisée (i) sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP. Selon un second aspect de l'invention, on fournit un procédé pour détecter et dénombrer les cellules d'une espèce non virale donnée susceptibles d'être présentes dans un échantillon liquide (E), notamment des bactéries, par une méthode de bioluminescence selon la réaction (1)after converting free intracellular ADP and AMP to ATP using myokinase and pyruvate kinase, said measurement being performed (i) without the addition of ATP and (ii) after addition of a known amount of ATP. According to a second aspect of the invention, there is provided a method for detecting and counting the cells of a given non-viral species likely to be present in a liquid sample (E), in particular bacteria, by a bioluminescence method according to the invention. reaction (1)
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase → oxyluciférine + photons ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que pour une cellule vivante d'une espèce non virale donnée, la somme des nucléotides adényliques (AN) intracellulaires est constante selon la relation (2) :(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase → oxyluciferin + photons said method, which is based on the fact that for a living cell of a given non-viral species, the sum of the intracellular adenyl nucleotides (AN) is constant according to relation (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate
étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à :characterized by comprising the following steps:
(1°) isoler et concentrer les cellules de ladite espèce donnée susceptibles d'être présentes dans l'échantillon (E), après avoir éliminer les AN extracellulaires pouvant être contenus dans ledit échantillon ;(1) isolating and concentrating the cells of said given species likely to be present in the sample (E), after eliminating extracellular AN that can be contained in said sample;
(2°) lyser la paroi des cellules ;(2) lysing the cell wall;
(3°) traiter le milieu liquide résultant pour transformer les ADP et AMP intracellulaires qu'il contient et qui proviennent desdites cellules en ATP ;(3) treating the resulting liquid medium to transform the ADP and intracellular AMP it contains and which come from said cells into ATP;
(4°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (3°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ; (5°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ; et(4 °) introducing into the medium resulting from step (3 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP; (5) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(6°) déterminer la teneur en AN totaux intracellulaires libres sous la forme d'ATP, par comparaison avec la reproduction des étapes (1°) à (5°) avec une population connue desdites cellules.(6) determine the total free intracellular AN content in the form of ATP, compared with the reproduction of steps (1 °) to (5 °) with a known population of said cells.
Selon un autre aspect de l'invention, on fournit une utilisation dudit procédé pour la numération de bactéries sous forme de spores qui de ce fait sont dépourvues d'ATP, d'une part, et un nécessaire de dosage pour mettre en œuvre ledit procédé, d'autre part. Ledit nécessaire de dosage est caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole, de l'ATP pour l'ajout dosé, de la myokinase, de la pyruvate kinase, et le cas échéant de la pyruvate orthophosphate dikinase et/ou de l'adénosine phosphate déaminase. Abréviations Par commodité, la liste des abréviations et acronymes utilisés dans la présente invention a été fournie ci-après.According to another aspect of the invention, there is provided a use of said method for the counting of bacteria in the form of spores which therefore are devoid of ATP, on the one hand, and an assay kit for carrying out said method , on the other hand. Said assay is characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly, ATP for the metered addition, myokinase, pyruvate kinase, and optionally pyruvate orthophosphate dikinase and or adenosine phosphate deaminase. Abbreviations For convenience, the list of abbreviations and acronyms used in the The present invention has been provided hereinafter.
ADP adénosine diphosphate,ADP adenosine diphosphate,
AMPadénosine monophosphate,AMPadenosine monophosphate,
AN nucléotide adénylique (autre nomenclature utilisable : adénosine nucléotide), l'ensemble des AN comprend ici les ATP, ADP etAdenyl nucleotide (other usable nomenclature: adenosine nucleotide), the set of AN includes here the ATP, ADP and
AMP,AMP
ATP adénosine triphosphate, cAMP adénosine monophosphate cyclique,ATP adenosine triphosphate, cAMP cyclic adenosine monophosphate,
GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate,GDP guanosine diphosphate, GTP guanosine triphosphate,
RLU unité relative de lumière.RLU relative light unit.
Description détaillée de l'inventionDetailed description of the invention
L'échantillon (E), qui est une composition liquide aqueuse ou organique, est avantageusement une composition aqueuse, et les cellules à tester sont avantageusement des bactéries. Cet échantillon (E) provient d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [notamment par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide qui est avantageusement aqueux. La réaction (1) précitée fournit de l'oxyluciférine, des photons, de l'AMP et un ou plusieurs phosphates, principalement le pyrophosphate. Elle. est caractéristique du vivant, dès lors que l'ATP intracellulaire libéré dans le milieu réactionnel n'a pas une longue durée de vie. Elle est spécifique de l'ATP, la luciférine et la luciférase étant à une concentration optimale, le nombre de photons émis dès que ces trois substances sont en présence, est directement proportionnel à la quantité d'ATP. Dans l'organisme et ledit milieu réactionnel, l'ATP extracellulaire disparaît relativement rapidement, soit par réutilisation, soit principalement par dégradation.The sample (E), which is an aqueous or organic liquid composition, is advantageously an aqueous composition, and the cells to be tested are advantageously bacteria. This sample (E) comes from a sampling gas [in particular by bubbling], solid [in particular by contact, dissolution or dispersion] or liquid [in particular by extraction, dissolution or emulsion] by means of a liquid which is advantageously aqueous. The reaction (1) above provides oxyluciferin, photons, AMP and one or more phosphates, mainly pyrophosphate. She . is characteristic of the living, since the intracellular ATP released in the reaction medium does not have a long life. It is specific for ATP, luciferin and luciferase being at an optimal concentration, the number of photons emitted as soon as these three substances are present, is directly proportional to the amount of ATP. In the body and said reaction medium, the extracellular ATP disappears relatively quickly, either by reuse or mainly by degradation.
Par AN intracellulaires libres, on entend ici les AN présents à l'état libre dans la cellule, plus précisément dans le cytoplasme. L'invention ne s'intéresse donc pas aux AN non libres que l'on trouve dans la cellule et qui sont liés au niveau du DNA ou RNA.Free intracellular AN means here the ANs present in the free state in the cell, more precisely in the cytoplasm. The invention is therefore not interested in the non-free ANs that are found in the cell and are linked at the level of DNA or RNA.
L1ATP intervient dans la cellule en tant que source d'énergie (énergie mécanique, énergie osmotique, énergie chimique, énergie calorique, énergie lumineuse) donneur de phosphate, donneur de pyrophosphate, donneur d'AMP et donneur d'adénosine.L 1 ATP is involved in the cell as a source of energy (mechanical energy, osmotic energy, chemical energy, caloric energy, light energy) phosphate donor, pyrophosphate donor, donor AMP and adenosine donor.
La teneur en ATP dans les cellules d'une même espèce varie fortement selon l'état physiologique; le seuil de détection se limite en général à 10 bactéries. Selon l'invention, on va atteindre une meilleure sensibilité qui va de 1 attomole d'ATP (sans stabilisation du signal lumineux émis) jusqu'à 0,5 attomole d'ATP (avec stabilisation dudit signal), ce qui correspond approximativement au contenu moyen en AN intracellulaires libres totaux d'une bactérie.The ATP content in cells of the same species varies greatly depending on the physiological state; the detection limit is generally limited to 10 bacteria. According to the invention, a better sensitivity will be attained, ranging from 1 attomole of ATP (without stabilization of the emitted light signal) to 0.5 attomole of ATP (with stabilization of said signal), which corresponds approximately to the content mean total free intracellular AN of a bacterium.
Quand on considère la relation (2), on néglige ici la teneur intracellulaire d'adénosine monophosphate cyclique (cAMP) libre, qui est le précurseur intervenant dans la synthèse de l'AMP, car (i) la concentration intracellulaire de ce produit est relativement faible et surtout (ii) la technique telle que proposée plus loin implique la transformation de l'ADP en AMP puis de l'AMP en ATP, ce qui diminue ladite teneur en cAMP. On utilise selon l'invention le principe bien connu de la lucioleWhen we consider the relation (2), we neglect here the intracellular content of free cyclic adenosine monophosphate (cAMP), which is the precursor involved in the synthesis of AMP, because (i) the intracellular concentration of this product is relatively weak and especially (ii) the technique as proposed below involves the transformation of ADP to AMP and then AMP to ATP, which decreases the cAMP content. According to the invention, the well-known firefly principle is used.
(Photinus pyralis), qui fonctionne avec un enzyme (luciférase), un substrat luminophore (luciférine) et un coenzyme (en l'occurrence I1ATP). Le résultat est souvent affiché au photomètre (ou luminomètre) en RLU, qui bien que proportionnel à la quantité d'ATP, ne permet pas de déterminer d'un échantillon à l'autre la concentration réelle en ATP.(Photinus pyralis), which works with an enzyme (luciferase), a phosphor substrate (luciferin) and a coenzyme (in this case I 1 ATP). The result is often displayed by photometer (or luminometer) in RLU, which although proportional to the amount of ATP, does not allow to determine from one sample to the other the actual concentration of ATP.
Pour remédier à cette difficulté, on préconise l'apport d'une quantité connue (par exemple 102 à 10 pmol d'ATP), après la première lecture (entreprise sans apport d'ATP). Cependant, la technique de l'apport dit dosé ne permet pas une détermination quantitative de la numération car la teneur en ATP dans lesdites cellules ne reste pas constante : il y a un "turnover" rapide en fonction de l'état physiologique.To overcome this difficulty, it is recommended to add a known quantity (for example 10 2 to 10 pmol of ATP), after the first reading (company without ATP supply). However, the so-called dosing technique does not allow a quantitative determination of the count because the ATP content in said cells does not remain constant: there is a rapid "turnover" as a function of the physiological state.
En revanche, les cellules d'une espèce donnée présentent toutes la même teneur en AN. Selon l'invention, en déterminant la teneur en AN, exprimée sous forme d'ATP, on va pouvoir réaliser des déterminations quantitatives pour la numération des cellules différentes des virus.In contrast, cells of a given species all have the same AN content. According to the invention, by determining the content of AN, expressed as ATP, it will be possible to carry out quantitative determinations for counting different cells of the viruses.
De façon avantageuse, l'étape (1°) du procédé de l'invention, qui est relative à l'isolation et concentration, est effectuée parAdvantageously, the step (1 °) of the process of the invention, which relates to the isolation and concentration, is carried out by
• filtration sur membrane,• membrane filtration,
• évaporation-centrifugation, notamment sous vide et à température ambiante (15-25 0C), et/ou • immunocapture.Evaporation-centrifugation, in particular under vacuum and at room temperature (15-25 ° C.), and / or • immunocapture.
La technique d'immunocapture est préférée. Elle permet la concentration et la purification des cellules par fixation de celles-ci au moyen d'anticorps immobilisés. De façon pratique, ces anticorps peuvent être dirigés contre des antigènes de surface des cellules sans détruire lesdites cellules. De façon également pratique, ces anticorps sont immobilisé sur des billes de latex magnétique en vue de la concentration et de la purification des produits de conjugaison du type cellule-anticorps-bille dans un champ magnétique et du recueil desdits produits de conjugaison. En variante, des billes non magnétiques ou non magnétisables, liées aux anticorps qui fixent les cellules, permettent également, par décantation, la concentration et la purification des cellules. En variante également, le stade de concentration/purification peut être réalisé sur colonne d'affinité.The immunocapture technique is preferred. It allows the concentration and purification of cells by fixing them with immobilized antibodies. In practice, these antibodies can be directed against cell surface antigens without destroying said cells. Also conveniently, these antibodies are immobilized on magnetic latex beads for concentration and purification of cell-antibody-bead conjugates in a magnetic field and for the collection of said conjugates. Alternatively, non-magnetic or non-magnetizable beads, bound to the antibodies that bind the cells, also allow, by decantation, the concentration and purification of the cells. Alternatively also, the concentration / purification stage can be carried out on an affinity column.
Lesdits produits de conjugaison sont ensuite séparés, si nécessaire, notamment par élution, pour disposer d'une composition liquide concentrée de cellules qui ne sont plus liées aux anticorps. Le cas échéant, pour limiter les dilutions qui diminuent la sensibilité, il peut être judicieux de concentrer ladite composition liquide au moyen d'un dispositif d'évaporation- centrifugation (opérant de 2000-10000 tours/ 15 minutes à 2000-10000 tours/1 minute), qui permet de sécher un grand nombre d'échantillons en quelques minutes, sans perte de produits. L'évaporation-centrifugation à . température ambiante offre l'avantage de pouvoir éliminer la majeur partie de l'eau du milieu contenant les cellules.Said conjugates are then separated, if necessary, in particular by elution, in order to have a concentrated liquid composition of cells which are no longer bound to the antibodies. If necessary, to limit the dilutions which decrease the sensitivity, it may be advisable to concentrate the said liquid composition by means of an evaporation-centrifugation device (operating from 2000-10000 revolutions / 15 minutes to 2000-10000 revolutions / 1 minute), which makes it possible to dry a large number of samples in a few minutes without loss of products. Evaporation-centrifugation at. Ambient temperature offers the advantage of being able to remove most of the water from the medium containing the cells.
De façon également avantageuse, l'étape (2°) relative à la lyse de la paroi cellulaire est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (1°) par addition d'un tampon aqueux contenantAlso advantageously, step (2 °) relating to lysis of the cell wall is carried out in the medium resulting from step (1 °) by addition of an aqueous buffer containing
(i) Tris plus EDTA, et/ou(i) Tris plus EDTA, and / or
(ii) DMSO, puis (a) traitement au micro-onde (pendant environ 1 minute) pour ouvrir les cellules, (b) refroidissement rapide (notamment au réfrigérateur) et, si nécessaire, (c) centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant.(ii) DMSO, then (a) microwave treatment (for about 1 minute) to open the cells, (b) rapid cooling (especially in the refrigerator) and, if necessary, (c) centrifugation to collect the resulting liquid medium .
La lyse est requise afin de pouvoir accéder aux AN intracellulaires libres, transformer les ADP et AMP en ATP et mettre en contact l'ATP résultant de ladite lyse et/ou de ladite transformation avec le substrat (luciférine) et l'enzyme (luciférase). Comme indiqué plus haut, l'étape (3°) relative à la transformation des ADP et AMP en ATP est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase. Les mécanismes réactionnels sont les suivants :Lysis is required in order to access free intracellular ANs, transform ADP and AMP to ATP, and bring into contact ATP resulting from said lysis and / or transformation with substrate (luciferin) and enzyme (luciferase) . As indicated above, step (3 °) relating to the conversion of ADP and AMP to ATP is carried out using myokinase and pyruvate kinase. The reaction mechanisms are as follows:
myokinase (3) AMP + ATP *- 2ADPmyokinase (3) AMP + ATP * - 2ADP
myokinase (3a) AMP + GTP *- ADP + GDPmyokinase (3a) AMP + GTP * - ADP + GDP
phosphoénolpyruvate pyruvate phosphoenolpyruvate pyruvate
Pour gagner du temps, l'étape (3°) du procédé de l'invention relative à la transformation des ADP et AMP en ATP peut être mise en œuvre en même temps que l'étape (2°).To save time, step (3 °) of the process of the invention relating to the conversion of ADP and AMP to ATP can be carried out at the same time as step (2 °).
De façon avantageuse, l'étape (4°) du procédé de l'invention est mise en œuvre avec la luciférine et là luciférase de luciole (Photinus pyralis). Le substrat et l'enzyme sont susceptibles d'être extraits ensemble de la luciole.Advantageously, step (4 °) of the process of the invention is carried out with luciferin and firefly luciferase (Photinus pyralis). The substrate and the enzyme can be extracted together from the firefly.
De façon pratique, il -est recommandé de réaliser l'étape (5°) relative à la mesure de la lumière émise par la réaction (1) en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes. Parmi les substances qui conviennent à cet effet, on peut mentionner :Practically, it is recommended to carry out the step (5 °) relating to the measurement of the light emitted by the reaction (1) in the presence of a substance stabilizing the emission of photons at a substantially constant value during minus 10 minutes. Among the suitable substances for this purpose are:
• la pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) qui transforme l'AMP et le pyrophosphate, produits au cours de la réaction (1) précitée, en ATP, et • l'adénosine phosphate déaminase, qui dégrade l'ADP et/ou l'AMP résiduels pouvant être présents dans le milieu réactionnel. Le premier enzyme fournit un signal stable en régénérant l'ATP de façon sensiblement continue. Le second enzyme permet de diminuer le bruit de fond dû à la présence résiduelle d'ADP et/ou d'AMP, sans que le processus d'utilisation de l'ATP comme source d'énergie lumineuse soit perturbé. Ledit second enzyme, l'adénosine phosphate déaminase, est plus avantageusement utilisé pour éliminer les résidus de nucléotides dans le milieu réactionnel et plus particulièrement pour écarter en les détruisant les résidus de nucléotides extracellulaires présents le cas échéant dans l'échantillon lors de l'étape (1°) précitée.Pyruvate orthophosphate dikinase (PPDK) which converts AMP and pyrophosphate, produced during the aforementioned reaction (1), into ATP, and adenosine phosphate deaminase, which degrades ADP and / or AMP residuals that may be present in the reaction medium. The first enzyme provides a stable signal by regenerating the ATP substantially continuously. The second enzyme makes it possible to reduce the background noise due to the residual presence of ADP and / or AMP, without the process of using ATP as a source of light energy being disturbed. Said second enzyme, adenosine phosphate deaminase, is more advantageously used to eliminate the nucleotide residues in the reaction medium and more particularly to eliminate by destroying the extracellular nucleotide residues present in the sample where appropriate in the step (1) above.
En pratique, pour stabiliser l'émission de photons conformément à la réaction (1), on recommande plus particulièrement l'utilisation de PPDK à l'étape (5°).In practice, to stabilize the photon emission according to reaction (1), it is more particularly recommended to use PPDK in step (5 °).
Le procédé de l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la numération (i) des bactéries sporulées, telles que l'anthrax, et (ii) des légionelles, des salmonelles et d'autres organismes unicellulaires tels que les amibes.The method of the invention is particularly suitable for the detection and enumeration of (i) sporulated bacteria, such as anthrax, and (ii) legionella, salmonella and other unicellular organisms such as amoebae.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces éléments ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration.Other advantages and features of the invention will be better understood on reading the following examples of embodiments. Of course, these elements are not limiting, but are provided by way of illustration.
Exemple 1Example 1
Numération d'AntraxAntrax count
A partir d'un prélèvement de 1 L d'air contenant des souches d'anthrax, à dénombrer, on obtient un échantillon aqueux par barbotage. On procède à l'immuno-capture des souches présentes au moyen d'une colonne comportant des anticorps polyclonaux anti(anthrax) immobilisés. On recueille les souches d'anthrax ainsi purifiées et concentrées dans un volume réduit de tampon aqueux. On concentre encore par évaporation- centrifugation sous vide à température ambiante. On élimine les résidus de nucléotides tels que les AN, susceptibles d'être présents dans le milieu aqueux résultant, au moyen d'adrénosine phosphate déaminase qu'on inactive ensuite.From a sample of 1 L of air containing anthrax strains to be counted, an aqueous sample is obtained by bubbling. Immuno-capture of the strains present by means of a column comprising immobilized anti-polyclonal antibodies (anthrax). The anthrax strains thus purified and concentrated are collected in a reduced volume of aqueous buffer. It is further concentrated by evaporation and centrifugation under vacuum at room temperature. Nucleotide residues such as ANs, which may be present in the resulting aqueous medium, are removed by means of adrenosine phosphate deaminase, which is then inactivated.
On procède à la Iy se de la paroi des souches d'anthrax par addition de Tris et d'EDTA puis passage au micro-onde. Par centrifugation on recueille le milieu liquide qui contient les AN intracellulaires. On ajoute de la myokinase et de la pyruvate kinase pour transformer les AMP et ADP en ATP. On ajoute la luciférine de luciole et la leuciférase de luciole avec de la PPDK pour stabiliser l'émission de photons.The wall of the anthrax strains is treated by the addition of Tris and EDTA and then microwaving. By centrifugation, the liquid medium which contains the intracellular ANs is collected. Myokinase and pyruvate kinase are added to convert AMP and ADP to ATP. Firefly luciferin and firefly leuciferase are added with PPDK to stabilize the photon emission.
On mesure les photons multipliés au moyen d'un dispositif connu en unités RLU. On ajoute 2 μl d'ATP et remesure les photons multipliés en unité RLU.The multiplied photons are measured by means of a known device in RLU units. 2 μl of ATP are added and the multiplied photons re-measured RLU unit.
On reproduit le même mode opératoire à partir d'une quantité connue (50 souches) d'anthrax, et détermine que le litre d'air de départ contenait 65 souches d'anthrax. Exemple 2The same procedure is repeated from a known quantity (50 strains) of anthrax, and determines that the liter of starting air contains 65 strains of anthrax. Example 2
Numération de Streptococcus faecalisStreptococcus faecalis count
A partir du sol d'une bergerie présumée infectée par des Streptococcus faecalis, on procède comme indiqué à l'exemple 1.From the soil of an alleged sheepfold infected with Streptococcus faecalis, the procedure is as in Example 1.
On observe que le sol contient 260 CFU/L de Streptococcus faecalis. Exemple 3It is observed that the soil contains 260 CFU / L of Streptococcus faecalis. Example 3
Mise au point d'un protocole pour l'identification de légionnellesDevelopment of a protocol for the identification of legionella
I- Obtention du rapport NA/Cellule pour bactéries en culture pureI- Obtaining the NA / cell ratio for bacteria in pure culture
A - Etablissement d'une relation intensité du signal/nombre de légionellesA - Establishment of a signal intensity / number of legionella relationship
L'objectif est d'obtenir une valeur moyenne des AN par cellule de Legionella pneumophila vivante pour réaliser un dénombrement par culture et choisir les conditions opératoires optimales. Paramètres étudiés :The objective is to obtain an average value of AN per cell of Legionella pneumophila vivante to perform a count by culture and choose the optimal operating conditions. Parameters studied:
Température ambianteAmbient temperature
Conditions de tampon Tris pH 7,75Tris buffer conditions pH 7.75
Conditions de lyse • lOOμl DMSO puis 500μl Tris pH7.75 ou 600μl Tris bouillant ( micro-onde 3mn)Lysis conditions • lOOμl DMSO then 500μl Tris pH7.75 or 600μl Tris boiling (microwave 3mn)
Volume réactionnel 200 μl Échantillon avec IUI PyruvateReaction volume 200 μl Sample with IUI Pyruvate
Kinase et 1 UI Adénylate kinase+ PEP (temps : 10 min)Kinase and 1 IU adenylate kinase + PEP (time: 10 min)
Ajout de 10 μl LL (complexe luciférine/luciférase de luciole) Temps d'acquisition du signal 10 secondes (RLU NA) Ajout de 10 μl ATP (100 pmole) 10 secondes (RLU NA+ATPs) Après immunoséparation : le résultat final est obtenu en moins de 15 minutesAddition of 10 μl LL (luciferin complex / firefly luciferase) Signal acquisition time 10 seconds (RLU NA) Addition of 10 μl ATP (100 pmol) 10 seconds (RLU NA + ATPs) After immunoseparation: the final result is obtained in less than 15 minutes
B - Essais sur bactéries immobilisées sur billes magnétiques Paramètres étudiés :B - Tests on bacteria immobilized on magnetic beads Parameters studied:
Nature de la bille magnétique. Conditions de tampon de capture. Conditions de lyse sur microbilles. Etude de sensibilité. Objectifs :Nature of the magnetic ball. Capture buffer conditions. Lysis conditions on microbeads. Sensitivity study. Goals :
- évaluer les interférences du signal avec les billes magnétiques de différentes natures (silice, polystyrène, ferrofluide...)- evaluate signal interference with magnetic beads of different types (silica, polystyrene, ferrofluid ...)
- nécessité ou pas de séparer les microbilles des légionelles avant la mesure (élution).- need or not to separate the microbeads from legionella before measurement (elution).
II- Obtention et optimisation du signal sur bactéries en conditions naturelles A - Evaluation du niveau de bruit de fond des échantillons Paramètres étudiés :II- Obtaining and optimizing the signal on bacteria under natural conditions A - Evaluation of the background noise level of the samples Parameters studied:
Nature de l'échantillon. Conditions de capture dans l' échantillon. Conditions de lavage des microbilles. Etude de sensibilité.Nature of the sample. Capture conditions in the sample. Microbead washing conditions. Sensitivity study.
Objectifs :Goals :
- évaluer les interférences du signal avec la nature de l'échantillon : eaux chaudes sanitaires, eaux de tours aéroréfrigérées, eaux de rivières, eaux deionisées, et - mise au point des conditions de lavage des billes après capture afin de lever ces interférences B — Essais sur échantillons naturels et optimisation- evaluate the signal interference with the nature of the sample: hot sanitary water, water cooled tower towers, river water, deionized water, and - development of ball wash conditions after capture to remove this interference B - Tests on natural samples and optimization
Bl - ConcentrationBl - Concentration
Les échantillons d'eaux brutes sont préalablement concentrés (volume de 50 ml à 11 ramené à 1-5 ml). Cette étape, permet d'augmenter la sensibilité et d'économiser les moyens d'immunoséparation (IMS). Les échantillons utilisés sont concentrées soit :The raw water samples are pre-concentrated (volume from 50 ml to 11 to 1-5 ml). This step makes it possible to increase the sensitivity and to save the means of immunoseparation (IMS). The samples used are concentrated either:
- par centrifugation,by centrifugation,
- par filtration, - par séparation magnétique avec ApoH, et/ouby filtration, by magnetic separation with ApoH, and / or
- par séparation magnétique sur billes de silice- by magnetic separation on silica beads
Dans le cas des légionnelles, c'est cette dernière technique de concentration qui est préférée car les légionnelles peuvent être libérées de la liaison avec les billes et permet une immunocapture IMS optimisée. La concentration et la récupération des complexes billes-légionnelles peuvent s'effectuer par différentes techniques connues dans l'art. Les légionnelles libérées des billes magnétiques sont remises en suspension pour subir le protocole d'IMS optimisé comme suit : B2 - Optimisation du protocole après capture dans 1 mlIn the case of legionella, it is the latter technique of concentration that is preferred because legionella can be released from the binding with the beads and allows optimized immunocapture IMS. The concentration and recovery of the bead-legionella complexes can be carried out by various techniques known in the art. Legionellae released from magnetic beads are resuspended to undergo optimized IMS protocol as follows: B2 - Optimization of protocol after capture in 1 ml
Les paramètres intervenant dans la capture sont les suivants :The parameters involved in the capture are as follows:
- L'anticorps de capture : anti-Lpl-14 ou anti-Lpl.- The capture antibody: anti-Lpl-14 or anti-Lpl.
- Le tampon d'IMS.- The IMS buffer.
- La charge en anticorps à la surface de la bille. - Volume de billes.- The load of antibodies on the surface of the ball. - Volume of beads.
- Le nombre de lavages après la capture.- The number of washes after capture.
- Le temps d'incubation.- The incubation time.
B3 - Application du protocole de capture à des volumes allant de 1 à 5 ml.B3 - Application of the capture protocol at volumes ranging from 1 to 5 ml.
Le protocole optimisé pour un volume de 1 ml sera appliqué à des volumes croissants allant de 1 à 5 ml.The protocol optimized for a volume of 1 ml will be applied to increasing volumes ranging from 1 to 5 ml.
Selon les rendements de capture obtenus, il est nécessaire d'ajuster certains paramètres tels que le volume de billes ou le temps d'incubation.Depending on the capture yields obtained, it is necessary to adjust certain parameters such as the volume of beads or the incubation time.
B4 - QuantificationB4 - Quantification
- Une fois l'étape d'immunocapture terminée, on récupère les billes (par aimantation) avec les Legionella pneumophila (mortes ou vivantes).- Once the immunocapture step is complete, the beads (by magnetization) are recovered with Legionella pneumophila (dead or alive).
- Les billes sont mises dans la solution de lyse qui peut être :- The beads are put into the lysis solution which can be:
100 μl de DMSO que l'on agite 30 secondes puis on rajoute 500 μl de tampon Tris pH 7,75,100 μl of DMSO which is stirred for 30 seconds and then 500 μl of Tris buffer pH 7.75,
600 μl de tampon Tris EDTA que l'on porte à ébullition entre 1 à 2 min au micro-onde.600 μl of Tris EDTA buffer which is boiled for 1 to 2 minutes in the microwave.
- Après refroidissement si nécessaire, on rajoute 10 μl d'une solution contenant les enzymes de la transformation de l'AMP et ADP en ATP soit la PK et l'AK à raison de 1-3 UI les sels du tampon Tris (Mg et K) le phosphoénol pyruvate.After cooling if necessary, 10 μl of a solution containing the enzymes of the transformation of AMP and ADP into ATP is added, ie PK and AK at the rate of 1-3 IU, the salts of the Tris buffer (Mg and K) phosphoenol pyruvate.
- Incuber 5 à 10 mn à température ambiante (15-25 0C).- Incubate for 5 to 10 minutes at room temperature (15-25 ° C.).
- Répartir dans 3 tubes à raison de 200 μl/tube. - Injecter 10 μl du complexe luciférine-luciférase (de la Sté Controlife).- Distribute in 3 tubes at the rate of 200 μl / tube. - Inject 10 μl of the luciferin-luciferase complex (from Controlife).
- Introduire le tube dans le luminomètre.- Insert the tube into the luminometer.
- Intégrer 10 secondes les RLU = RLU NA - Injecter immédiatement après, 10 μl de solution standard d'ATP [10 à lOO pmoles].- Incorporate for 10 seconds the RLU = RLU NA - Inject immediately afterwards, 10 μl of standard ATP solution [10 to 100 μmol].
- Intégrer 10 secondes les RLU = RLU NA+ATPs.- Integrate for 10 seconds the RLU = RLU NA + ATPs.
- On calcul ainsi la quantité de picomoles de NA en équivalent ATP dans l'échantillon. - Avec la concentration de AN/légionnelle connue, on calcul la quantité de légionnelles vivantes (le poids moléculaire de l'ATP est de 551). La durée de la manipulation, du prélèvement au résultat final, ne dépasse pas les 60 minutes pour la détection de 10 légionnelles vivantes.The amount of picomoles of NA in ATP equivalent in the sample is thus calculated. With the known AN / Legionella concentration, the amount of living legionella is calculated (the molecular weight of ATP is 551). The duration of the manipulation, from the sampling to the final result, does not exceed 60 minutes for the detection of 10 live legionella.
III- Détermination globale d'une biomasse ramenée en équivalent Legionella ou E. coliIII- Overall determination of biomass reduced to Legionella or E. coli equivalent
II s'agit là d'une méthode dérivée de la précédente qui permet de faire du screening rapidement et économiquement. Ainsi par exemple :This is a method derived from the previous one that allows screening quickly and economically. For example:
(a) On veut contrôler si une tour aéroréfrigérée présente plus de 1000 légionnelles/1 : o On concentre les légionnelles avec les billes magnétiques en silice. o Les billes sont directement plongées dans 100 μl de DMSO et le dosage est effectué comme précédemment. o Si les valeurs obtenues sont inférieures à 1000 équivalent légionnelles, il n'est pas nécessaire de faire une énumération spécifique (gain de temps et de coût) et d'intervenir. o On peut se fixer une valeur seuil d'intervention par exemple 1500 équivalents légionnelles. (b) On veut contrôler si une eau de baignade a moins de 100 E.coli o Dans ce cas on préférera la concentration par les billes magnétiques avec la protéine ApoH, qui en plus de sa faculté d'interaction avec de multiples micro-organismes est déjà intéressante, présente une caractéristique qui la rend encore plus précieuse dans le domaine du diagnostic médical : elle reconnaît seulement les pathogènes à l'état infectieux, c'est-à- dire en cours de multiplication. o Le cheminement sera le même que précédemment. Globalement, cette démarche ne correspond pas à une énumération spécifique. Elle offre néanmoins l'avantage de réduire la durée des manipulations et le coût. Ce qui est intéressant ici c'est de ramener la détermination d'une valeur à celle d'un équivalent. Exemple 4(a) We want to control if an air-cooled tower has more than 1000 legionella / 1: Legionella is concentrated with magnetic beads made of silica. o The beads are directly immersed in 100 .mu.l of DMSO and the assay is carried out as above. o If the values obtained are less than 1000 legionial equivalents, it is not necessary to make a specific enumeration (saving of time and cost) and to intervene. o An intervention threshold value of 1500 equivalents of legionella can be set. (b) We want to control if a bathing water has less than 100 E. coli o In this case we prefer the concentration by the magnetic beads with the ApoH protein, which in addition to its ability to interact with multiple microorganisms is already interesting, has a feature that makes it even more valuable in the field of medical diagnosis: it recognizes only pathogens in the infectious state, that is, in the process of multiplication. o The path will be the same as before. Overall, this approach does not correspond to a specific enumeration. It nevertheless offers the advantage of reducing the duration of the manipulations and the cost. What is interesting here is to reduce the determination of a value to that of an equivalent. Example 4
Corrélation entre AN et cellules Selon le protocole établi à l'exemple 3, on a étudié avec la soucheCorrelation between AN and cells According to the protocol established in Example 3, we studied with the strain
Arthrobacter NS48 l'évolution du rapport AN/cellule en fonction de la durée de culture de cette souche, la population bactérienne étant au départ de 5.106 cellules/ml et de 3,5.108 cellules/ml.Arthrobacter NS48 the evolution of the ratio AN / cell depending on the culture time of this strain, the bacterial population being from 5.10 6 cells / ml and 3.5.10 8 cells / ml.
Les résultats obtenus sont consignés dans la Figure 1, ci-après dans le diagramme femtogramme (1 fg = 10'15 g) de AN par cellule bactérienne (en ordonnées), en fonction de la durée de culture en heures (en abscisses), en l'absence de NaCl (courbe 1) et en présence de 7 % (p/v) de NaCl (courbe 2). On constate que la variation de AN est de 2,2 à 2,5 fg par cellule entre les courbes 1 et 2 : ces deux courbes sont pratiquement équivalentes et sensiblement horizontales. Exemple 5The results obtained are shown in Figure 1, below in the femtogram diagram (1 fg = 10 '15 g) of AN per bacterial cell (ordinate), depending on the culture time in hours (as abscissa), in the absence of NaCl (curve 1) and in the presence of 7% (w / v) NaCl (curve 2). It can be seen that the variation of AN is 2.2 to 2.5 fg per cell between curves 1 and 2: these two curves are practically equivalent and substantially horizontal. Example 5
Comparaison des rapports ATP/cellule et AN/cellule Selon ledit protocole établi à l'exemple 3, on a procédé à la corrélation entre le rapport ATP/cellule [où la teneur en ATP est variable dans le temps, seule la teneur en AN totaux pour une espèce bactérienne donnée est constante eu égard à l'équation (2) précitée].Comparison of the ATP / cell and AN / cell ratios According to said protocol established in Example 3, the ATP / cell ratio was correlated [where the ATP content is variable over time, only the total AN content for a given bacterial species is constant with respect to equation (2) above].
Les résultats statistiques obtenus sont consignés dans le tableau I qui suit. Ils mettent en évidence qu'il y a une meilleure corrélation pour les valeurs du rapport AN/cellule que pour le rapport ATP/cellule. Cette corrélation est constante dans le cas des AN quel que soit l'état physiologique de la cellule et de son environnement. Il n'est pas nécessaire de faire des abaques, il suffit en première approximation de tenir compte pour les AN et le rapport AN/cellule d'une valeur moyenne obtenue après de nombreuse cultures de l'organisme souhaité. Par exemple pour E. coli, la valeur moyenne est de 5,27 fg de Na/cellule quelle que soit la phase de croissance, alors que dans le même temps la teneur en ATP varie de 0,1 à 1,5 fg/cellule.The statistical results obtained are recorded in Table I which follows. They show that there is a better correlation for the values of the AN / cell ratio than for the ATP / cell ratio. This correlation is constant in the case of NA regardless of the physiological state of the cell and its environment. It is not necessary to make charts, it suffices as a first approximation to take into account for the NAs and the AN / cell ratio of an average value obtained after numerous cultures of the desired organism. For example, for E. coli, the average value is 5.27 fg Na / cell regardless of the growth phase, while at the same time the ATP content varies from 0.1 to 1.5 fg / cell.
Tableau ITable I

Claims

REVENDICA TIONS
1. Utilisation de la bioluminescence selon la réaction (1) :1. Use of bioluminescence according to reaction (1):
55
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons
pour détecter et dénombrer les cellules vivantes d'une espèce donnée pouvant être présentes dans un échantillon liquide, ladite utilisation étant 0 caractérisée en ce qu'elle met en œuvre la mesure de la teneur en nucléotides adényliques (AN) intracellulaires libres totaux, exprimée sous forme d'ATP, de cellules vivantes d'une espèce non virale donnée, en tenant compte du fait que la somme des ATP, ADP et AMP intracellulaires libres de ladite famille est constante selon la relation (2) : 5for detecting and counting living cells of a given species that may be present in a liquid sample, said use being characterized in that it implements the measurement of the total free intracellular adenyl nucleotide (AN) content, expressed as ATP form, of living cells of a given non-viral species, taking into account that the sum of the free intracellular ATP, ADP and AMP of said family is constant according to (2):
(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte(2) [AN] = [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cate
après avoir transformé les ADP et AMP intracellulaires libres en ATP au moyen de myokinase et de pyruvate kinase, ladite mesure étant réalisée (i) 0 sans ajout d'ATP et (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP.after converting free intracellular ADP and AMP to ATP using myokinase and pyruvate kinase, said measurement being performed (i) 0 without addition of ATP and (ii) after addition of a known amount of ATP.
2. Procédé pour détecter et dénombrer les cellules d'une espèce non virale donnée susceptibles d'être présentes dans un échantillon liquide (E), notamment des bactéries, par une méthode de bioluminescence selon la réaction (1) 52. Method for detecting and counting the cells of a given non-viral species likely to be present in a liquid sample (E), in particular bacteria, by a bioluminescence method according to the reaction (1) 5
(1) luciférine + ATP + O2 + Mg2+ + luciférase -> oxyluciférine + photons(1) luciferin + ATP + O 2 + Mg 2+ + luciferase -> oxyluciferin + photons
ledit procédé, qui s'appuie sur le fait que pour une cellule vivante d'une espèce non virale donnée, la somme des nucléotides adényliques (AN) O intracellulaires est constante selon la relation (2) :said method, which is based on the fact that for a living cell of a given non-viral species, the sum of the intracellular adenyl nucleotides (AN) O is constant according to relation (2):
(2) [AN] - [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes consistant à : (1°) isoler et concentrer les cellules de ladite espèce donnée susceptibles d'être présentes dans l'échantillon (E), après avoir 5 éliminer les AN extracellulaires pouvant être contenus dans ledit échantillon ;(2) [AN] - [ATP] + [ADP] + [AMP] = Cte being characterized in that it comprises the following steps: (1) isolating and concentrating the cells of said given species susceptible to be present in the sample (E), after eliminating extracellular ANs that may be contained in said sample;
(2°) lyser la paroi des cellules ;(2) lysing the cell wall;
(3°) traiter le milieu liquide résultant pour transformer les ADP et AMP intracellulaires contenus dans ledit milieu liquide en ATP ;(3) treating the resulting liquid medium to transform the intracellular ADP and AMP contained in said liquid medium into ATP;
(4°) introduire dans le milieu résultant de l'étape (3°) une luciférine et une luciférase, d'abord (i) sans ajout d'ATP, puis (ii) après ajout d'une quantité connue d'ATP ;(4 °) introducing into the medium resulting from step (3 °) a luciferin and a luciferase, first (i) without adding ATP, and then (ii) after adding a known amount of ATP;
(5°) mesurer le signal amplifié de la lumière émise par la réaction (1) sans ajout d'ATP, puis après ajout d'une quantité connue d'ATP ; et(5) measuring the amplified signal of the light emitted by the reaction (1) without the addition of ATP, then after adding a known quantity of ATP; and
(6°) déterminer la teneur en AN totaux intracellulaires libres sous la forme d'ATP, par comparaison avec la reproduction des étapes (1°) à (5°) avec une population connue desdites cellules. (6) determine the total free intracellular AN content in the form of ATP, compared with the reproduction of steps (1 °) to (5 °) with a known population of said cells.
3. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (1°) d'isolation et de concentration est effectuée par filtration sur membrane, évaporation-centrifugation, notamment sous vide, et/ou immunocapture.3. Method according to claim 2, in particular for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that the step (1 °) of isolation and concentration is carried out by membrane filtration, evaporation centrifugation, in particular under vacuum, and / or immunocapture.
4. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (2°) de la lyse de la paroi cellulaire est réalisée dans le milieu résultant de l'étape (1°) par addition d'un tampon aqueux contenant (i) Tris plus EDTA, et/ou4. Method according to claim 2, in particular intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that the step (2 °) of lysis of the cell wall is carried out in the medium resulting from step (1 °) by addition of an aqueous buffer containing (i) Tris plus EDTA, and / or
(ii) DMSO, puis (a) traitement au micro-onde pour ouvrir les cellules, (b) refroidissement rapide et, si nécessaire, (c) centrifugation pour recueillir le milieu liquide résultant. (ii) DMSO, then (a) microwave treatment to open the cells, (b) rapid cooling and, if necessary, (c) centrifugation to collect the resulting liquid medium.
5. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (3°) de la transformation des ADP et AMP en ATP est réalisée au moyen de myokinase et de pyruvate kinase.5. Process according to claim 2, in particular intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that step (3 °) of the transformation of ADP and AMP into ATP is carried out by means of myokinase and pyruvate kinase.
6. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (3°) est mise en œuvre en même temps que l'étape (2°).6. Process according to claim 2, in particular intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that step (3 °) is implemented at the same time as step (2 °).
7. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que : l'étape (4°) est mise en œuvre avec la luciférine et la luciférase de luciole (Ph otin us py redis) .7. Process according to claim 2, in particular intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said process being characterized in that: step (4 °) is carried out with luciferin and firefly luciferase ( Ph otin us py redis).
8. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape (5°) de mesure de la lumière émise par la réaction (1) est réalisée en présence d'une substance stabilisant l'émission de photons à une valeur sensiblement constante pendant au moins 10 minutes.8. Process according to claim 2, in particular intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that the step (5 °) of measuring the light emitted by the reaction (1) is carried out in the presence of a substance stabilizing the emission of photons to a substantially constant value for at least 10 minutes.
9. Procédé suivant la revendication 2, notamment destiné à la détection quantitative d'une bactérie (B), ledit procédé étant caractérisé en ce que : l'étape (6°) est mise en œuvre par comparaison avec un système d'abaques établi à partir de plusieurs populations connues desdites cellules et de leurs teneurs en AN totaux intracellulaires libres exprimées sous forme d'ATP.9. Process according to claim 2, especially intended for the quantitative detection of a bacterium (B), said method being characterized in that: step (6 °) is carried out by comparison with a system of abacuses established from several known populations of said cells and their total free intracellular AN values expressed as ATP.
10. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que le seuil de sensibilité est de 0,5 à 1 attomole d'ATP.10. Process according to any one of claims 2 to 9, characterized in that the sensitivity threshold is from 0.5 to 1 attomole of ATP.
11. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10 pour la numération des bactéries sous forme de spores. 11. Use of the method according to any one of claims 2 to 10 for the counting of bacteria in the form of spores.
12. Nécessaire de dosage mettant en œuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'ensemble luciférine/luciférase de luciole, de l'ATP pour l'ajout dosé, de la myokinase, de la pyruvate kinase, et le cas échéant, de la pyruvate orthophosphate dikinase. 12. Dosing kit implementing the method according to any one of claims 2 to 10, characterized in that it comprises the firefly luciferin / luciferase assembly, ATP for the metered addition of myokinase. , pyruvate kinase, and where appropriate, pyruvate orthophosphate dikinase.
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