EP1706495A1 - Procede de production de carotenoides et bacteries mises en oeuvre - Google Patents

Procede de production de carotenoides et bacteries mises en oeuvre

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Publication number
EP1706495A1
EP1706495A1 EP05717392A EP05717392A EP1706495A1 EP 1706495 A1 EP1706495 A1 EP 1706495A1 EP 05717392 A EP05717392 A EP 05717392A EP 05717392 A EP05717392 A EP 05717392A EP 1706495 A1 EP1706495 A1 EP 1706495A1
Authority
EP
European Patent Office
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bacteria
carotenoid
carotene
photosynthetic
crty
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05717392A
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German (de)
English (en)
Inventor
Joël FARDOUX
Eric Giraud
Laure Hannibal
André VERMEGLIO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut de Recherche pour le Developpement IRD filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1706495A1 publication Critical patent/EP1706495A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a process for the synthesis of carotenoids, in particular, of non-photosynthetic carotenoids, by photosynthetic bacteria, in particular, by Rhodopseudomonas palustris and to the bacteria used in the process.
  • carotenoids in particular, of non-photosynthetic carotenoids
  • photosynthetic bacteria in particular, by Rhodopseudomonas palustris
  • Rhodopseudomonas palustris to the bacteria used in the process.
  • Over 600 carotenoids have been identified in nature. They are widespread in very many living organisms but are synthesized de novo only by a limited number of organisms (plants, bacteria, yeasts).
  • carotenoids lycopene, ⁇ -carotene, canthaxanthin, astaxanthin
  • lycopene, ⁇ -carotene, canthaxanthin, astaxanthin are used intensively and very differently in the food industry for their coloring property (red for lycopene, yellow for ⁇ -carotene, orange for canthaxanthin, pink-orange for astaxanthin).
  • astaxanthin and canthaxanthin in aquaculture for the breeding of salmon and trout in order to reinforce the pink-orange color of the flesh fish and poultry farming to accentuate the yellow-orange color of the eggs, which in both cases is appreciated by consumers.
  • ⁇ -carotene can thus be carried out from lycopene thanks to the enzyme CrtY, that of canthaxanthin thanks to the enzymes CrtY and CrtW and that of astaxanthin thanks to the enzymes CrtY, CrtW and CrtZ.
  • Several bacteria have been described for their ability to produce one of these 4 carotenoids (Brevijbacterium, Agrobacterium auriantiacum, Erwinia uredovora, Erwini. Herbicola, Myxococcus xanthus, Flavobacterium, Alcaligenes r Bradyrhizobium ).
  • the high photosynthetic activity is accompanied by the synthesis in large quantities of photosynthetic carotenoids associated with the establishment of abundant intracytoplasmic membranes constituting an important storage area for carotenoids.
  • these bacteria generally only synthesize a single pigment, spirilloxanthin or spheroidene, which are not of industrial interest at present.
  • the inventors exploited the potential presented by photosynthetic bacteria by diverting the endogenous synthesis pathway from photosynthetic carotenoid towards the synthesis of non-photosynthetic carotenoids.
  • the present invention therefore relates to a method of synthesizing carotenoid nonphotosynthetic selected from ⁇ -carotene, canthaxanthin or astaxanthin putting out photosynthetic bacteria producing at least one photosynthetic carotenoid which one of the synthetic intermediates is lycopene, characterized in that it comprises the following stages: i. Deletion, in bacteria, of at least part of one or more genes involved in the endogenous synthetic pathway which follows that of lycopene so as to stop said synthesis in lycopene, ii.
  • a bacterium synthesizing a photosynthetic carotenoid (that is to say involved in photosynthesis) remained photosynthesized when the endogenous synthesis pathway of said carotenoid was diverted towards the synthesis of non-carotenoids photosynthetic. •
  • the bacteria continue to synthesize lycopene, a photosynthetic carotenoid, which allows it to maintain its photosynthetic activity by replacing endogenously synthesized photosynthetic carotenoid in the photosystem.
  • the genes to be deleted at least partially are in general, crtC, crtD and / or crtF.
  • the crtC and crtD genes will be at least partially deleted. These genes are in fact the first to be used in the synthesis of spirilloxanthin from lycopene. (see
  • the photosynthetic bacteria are the following:. Rubrivivax 'gela tinosus, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum moliscianum, Rhodospirillum salinarum,
  • Rhodospirillum ediosalinum Rhodospirillum sodomense, Rhodocista centenaria, Rhodospira trueperi, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas acidophila Rhodopseudomonas julia, Rhodopseudomonas cryptolactis r Rhodomicrobium vannielii, Rhodoplanes roseus Rhodoplanes elegans r Rhodobium orientis, Rhodobium marinum ... More particularly, the method according to the invention provides culture conditions ensuring production at a satisfactory level of these different carotenoids.
  • steps a and b of the culture conditions' it possible to preferentially obtain canthaxanthin or astaxanthin are repeated successively. Such an iteration allows the accumulation of carotenoids in the cells.
  • the process according to the invention allows the production of ⁇ -carotene if the culture conditions are modified. These photosynthetic conditions for cultivation are then as follows: a. Cultivation of said bacteria thus modified under anaerobic conditions.
  • the percentage of oxygen is preferably between 1 and 10%, more particularly, 3 to 8%, limits included.
  • the invention also provides a process for the synthesis of non-photosynthetic carotenoids chosen from ⁇ -carotene, canthaxanthin or astaxanthin, using photosynthetic bacteria producing at least one carotenoid photosynthetic, one of the synthetic intermediates of which is lycopene, characterized in that the process comprises the following stages: i. Use of mutants of photosynthetic bacteria whose photosynthesis is no longer repressed by dioxygen, ii.
  • the bacteria used in the process are of the genus Rhodopseudomonas, preferably of the species, Rhodopseudomonas palustris. Some bacteria do not synthesize lycopene, but an intermediary further up the synthesis pathway.
  • the photosynthetic bacteria of the process according to the invention are then obtained from photosynthetic bacteria producing at least one photosynthetic carotenoid of which one of the synthesis intermediates is
  • Rhodobacter capsula tus Rhodobacter veldka pii, Rhodobacter sphaeroides r Rhodobacter azotoformans, Rhodobacter blasticus, Rhodovulum sulfidophilum, Rhodovulum adria ticum, Rhodovulum euryhalinum, Rhodovulum strictum ...
  • the spheroidene derivatives are obtained from neurosporene (the endogenous crtl codes for a phytoene desaturase ensuring only 3 successive stages of desaturation of the phytoene).
  • the genes coding for the first enzymes subsequently implemented are crtC, crtD and / or CrtF. (see figure 1)
  • crtC crtC
  • crtD / or CrtF
  • the insertion of the crtY, crtZ and / or crtW genes of the method according to the invention is carried out in the region of the genes at least partially deleted.
  • the crtY, crtZ and / or crtW genes can also be inserted into a plasmid.
  • the invention also covers photosynthetic bacteria producing, alternatively or concomitant, at least lycopene, ⁇ -carotene and canthaxanthin or astaxanthin, characterized in that said bacteria are capable of being obtained by the process according to the invention.
  • photosynthetic bacteria synthesizing at least one carotenoid whose synthesis intermediate is lycopene are characterized in. what they include the following mutations -: i. Deletion of at least part of one or more genes involved in the endogenous synthetic pathway which follows that of lycopene so as to stop said • synthesis in lycopene, ii.
  • bacteria or mutants can be obtained from bacteria or mutants producing at least one carotenoid, one of the synthetic intermediates of which is phytoene, phytofluene, ⁇ -carotene or neurosporene, said bacteria or mutants having possibly undergone a deletion or disruption of the endogenous crtl gene, followed by insertion of an exogenous crtl gene encoding a phytoene desaturase ensuring
  • FIG. 1 represents the diagram of synthesis of the various carotenoids aimed by the invention
  • FIG. 2 presents the diagram of synthesis of the construction strategy of the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY :: crtW :: apha3
  • FIG. 1 represents the diagram of synthesis of the various carotenoids aimed by the invention
  • FIG. 2 presents the diagram of synthesis of the construction strategy of the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY :: crtW :: apha3
  • FIG. 1 represents the diagram of synthesis of the various carotenoids aimed by the invention
  • FIG. 2 presents the diagram of synthesis of the construction strategy of the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY :: crtW :: apha3
  • FIG 3 presents the diagram of synthesis of the construction strategy of the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY :: crtZ:: crtW :: apha3, and, - the figure 4 is an analysis by HPLC of the carotenoids synthesized by the mutant strain R. palustris CEAOOl ⁇ crtDC:: crtY:: crtW under different culture conditions.
  • Example 1 Construction of a mutant strain of Rhodopseudomonas palustris producing lycopene
  • the sequence of the cluster. of crt R genes. palustris involved in the synthesis of 'spirilloxanthin is available on the Internet at the following address http: // ww .ncbi. nlm.nih. gov (Ace Number: BX572597).
  • the genes crtE, crtl, crtB, ' crtC, crtD, crtF are present and organized into 3 operons
  • the general strategy for constructing this mutant strain will consist in disrupting the crtD and crtC genes by inserting a cassette encoding a kanamycin resistance gene (apha3 gene) into it.
  • l st step isolation and cloning of genes crtDC R.
  • palustris A region corresponding to a portion of crtDC R gene.
  • palustris was amplified using the pair of primers: crtD.R.palu.XhoI.f: GAGCTCGAGTTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N ° 1) CrtC.R.palu.XhoI.r: CTGCTCGAGAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (SEQ)
  • the primers were designed to insert an Xhol restriction site on either side of the PCR product.
  • the amplifications are carried out with a high fidelity DNA polymerase marketed by Invitrogen® (Platinium Pfx DNA Polymerase).
  • the amplification conditions are as follows: after an initial step of denaturing the DNA at 95 ° C. for 5 min, 35 cycles of PCR are carried out .
  • This plasmid contains the suicide gene sacB which makes it possible to select on sucrose the clones for which a double “crossing over” event has indeed taken place (Quandt, J. & Hynes, M. F. “Versa tile suicide vectors
  • the aphA-3 gene coding for resistance to kanamycin is released from the plasmid pUC4K sold by the company Amersham® by digestion with the enzyme Sali. It is. then inserted into the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC linearized by Sali. It should be noted that this last Sali digestion leads to a
  • the conjugating clones are selected on Hutner medium (RK Clayton “Towards the isolation of a photochemical reca tion center in Rhodopseudomonas sphaeroides”; Biochim. Biophys.- Acta 75: 312-318, 1963) containing kanamycin 150 ⁇ g / ml and carbenicillin 50 ⁇ g / ml.
  • Hutner medium RK Clayton “Towards the isolation of a photochemical reca tion center in Rhodopseudomonas sphaeroides”; Biochim. Biophys.- Acta 75: 312-318, 1963
  • the double recombinant clones are selected after subculturing of the conjugating clones on Hutner medium containing 5% sucrose and kanamycin (150 ⁇ g / ml).
  • Verification by PCR is carried out on several recombinant clones in order to ensure that the insertion of the apha3 cassette at the level of the crtD and crtC genes of R. palustris.
  • the production of lycopene in large quantities has been observed in the bacteria thus mutated.
  • the photosynthetic nature of the bacteria is preserved.
  • Example 2 Construction of a mutant strain of Rhodopseudomonas palustris producing ⁇ -carotene or can thaxan thine Construction scheme
  • the strategy for construction of this mutant strain is summarized in FIG. 2.
  • the legends of the stages are the following: l st step: Amplification and crtY genes crtW Bradyrhizobium ORS278, as well as crtDC R gene. pal ustris. Cloning of the PCR products in the plasmid p-GEMT (Promega). 2 ⁇ eme step: release of the aphA3 SalI cassette of plasmid pUC4K sold by Amersham. Insertion at the level of the unique Xhol site present downstream of crtW.
  • A. Construction Strategy The overall strategy for building a mutant strain of R. palustris producing either ⁇ -carotene or canthaxanthin consisted of disrupting the crtD, crtC genes of R. palustris by inserting the crtY and crtW genes of Bradyrhizobium ORS278 as well as an aphA-3 gene coding for resistance to kanamycin.
  • the CrtW enzyme transforming ⁇ -carotene into canthaxanthin is functional or not, which leads to the choice of an accumulation of ⁇ -carotene or canthaxanthin.
  • 'L st step isolation and cloning of genes crtDC A.
  • palustris, crtY and crtW Bradyrhizobium ORS278 A region corresponding to a portion of crtDC R gene. palustris was amplified using the pair of primers: crtD.R.palu.Xbal.f: GAGTCTAGATTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N ° 3) CrtC. R.palu. XbaI. r: CTGTCTAGAAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (SEQ ID N ° 4) The primers were designed to insert an Xbal restriction site on either side of the PCR product. The Bradyrhizobium ORS278 crtY gene was amplified using the following primer pair: crtY.278. f:
  • crtY.278. r GTTGAATTCCTGGTACCTCATGGGGTCTTGAAGGCGCTCGCCTCA (SEQ ID No. 6)
  • the primers were designed to insert a ribosome binding site RBS and a restriction site BglII in 5 'as well as a restriction site Kpnl and EcoRI in 3' of the product of PCR.
  • the crtW gene of Bradyrhizobium ORS278 was amplified using the following pair of primers: crtW.ORS278.f:
  • crtW.ORS278.r GTGAATTCCATGCTCGAGCGGGTTTAGTCACGCCTTTCCAG (Primers were designed so as to insert a site for fixation of the ribosome K and RBS '' RBS ''a restriction site Xho I and EcoR I in 3' of the PCR product.
  • the amplifications are carried out with a high fidelity DNA polymerase marketed by Invitrogen® (Platinium Pfx DNA Polymerase).
  • the amplification conditions are as follows: after an initial step of denaturing the DNA at 95 ° C for 5 min, 35 PCR cycles are carried out (94 ° C for 15 s then 55 ° C for 30 s then 68 ° C for 3 min), followed by a final elongation step (68 ° C for 7 min) during which l ⁇ l of classic Taq polymerase (GoTaq, Promega®) is added to the PCR tube in order to insert a residue of deoxyadenosine at the 3 'ends of the amplification fragments (this step is essential to allow cloning into the vector pGEM-T used later).
  • l ⁇ l of classic Taq polymerase GoTaq, Promega®
  • the 3 PCR products thus obtained are cloned into the cloning vector pGEM-T (marketed by the company Promega®) according to the • supplier's protocol.
  • the plasmids obtained are named pGEM-T / crtDC. Xbal; pGEM-T / crtY; pGEM
  • T / crtDC : crtY:: crtW • :; ap A-3
  • the previous construction containing the crtY, crtW and aphA-3 genes is released by double digestion BglII / EcoRI and then inserted into the plasmid pGEM-T / crtDC linearized by the same pair of restriction enzymes. Digestion of pGEM-T / crtDC with BglII / EcoRI results in the deletion of a 1232 bp fragment corresponding to an important part of the crtl? and crtC.
  • crtZ:: crtW:: aphA-3 is finally transferred by electroporation into the conjugative strain Escherichia coli S1 7.
  • 6th step Construction of a mutant strain of R. palustris containing the crtY and crtW genes of Bradyrhizobium ORS278.
  • the previous plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY:: crtW:: aphA-3 is delivered in the strain of R. palustris CEA001 by conjugation with the previous strain E. coli S1 7. 1 containing the construct.
  • the conjugating clones are selected on Hutner medium containing kanamycin 150 ⁇ g / ml and carbenicillin 50 ⁇ g / ml.
  • the double recombinant clones are selected after subculturing of the conjugating clones on Hutner medium containing 5% sucrose and kanamycin (150 ⁇ g / ml).
  • PCR verification is carried out on several recombinant clones in order to ensure that the crtY, and crtW genes have indeed been inserted at the level of the crtD and crtC genes.
  • a mutant is retained for the rest of the experiments: R. palustris CEAOOl ⁇ crtDC:: crY:: crtW.
  • A 120 ml bottle containing 100 ml of Hutner medium, 30 ° C - degassed to remove all traces of oxygen, and placed under a 100 watt incandescent lamp (light, anaerobic conditions)
  • B 250 ml bottle filled with 50 ml of Hutner medium, 30 ° C - stirring 170 RPM - placed in an atmosphere where the oxygen content can be adjusted to 1, 5, 8% (Light conditions, microaerobic conditions) or 21% (Light conditions, aerobic conditions)
  • C After anaerobic culture for 2 days according to conditions A, 50 ml are transferred to a baffle Erlenmeyer flask and then stirred 170 rpm in the dark overnight to strongly oxygenate the culture. After 3 days of culture under the different conditions tested, the carotenoids produced are analyzed by HPLC. The results obtained are presented in Table 1 below.
  • the amount of ⁇ -carotene convertible into canthaxanthin should be close to 5 mg / l, i.e. 6 times more than the amount of canthaxanthin (0.8 mg / l) obtained in liquid culture with the Bradyrhizobium ORS278 strain.
  • the cultivation time was divided by a factor greater than 2, an increase in the same productivity ratio.
  • Example 3 Strategy for the construction of a mutant strain of Rhodopseudomonas palustris producing astaxanthin Construction diagram
  • the strategy for construction of this mutant strain is summarized in FIG. 3.
  • the legends of the stages are as follows: st step: Amplification crtZ gene of Pseudomonas putida. Cloning of the PCR product in the plasmid p-GEMT (Promega). 2 ⁇ eme step: Release by KpnI 'crtZ gene. Plasmid pGEM-T / crt Y:: crtW:: apha3 is inserted into the unique KpnI site.
  • 3 ⁇ eme step Release of crtY, crtZ, crtW and aphA3 by BglII / EcoRI. Insertion into the plasmid pGEM-T / crtDC linearized by the same enzymes. 4 ⁇ eme step: Release of crtDC genes crtY, crtZ, aphA3 crtW and XbaI. Insertion into the plasmid pJQ200mpl8 linearized by the same enzyme
  • the general strategy is to insert the crtZ gene of Pseudomonas putida strain in the mutant R previously constructed. palustris containing the crtY and crtW genes of Bradyrizobium ORS278. The insertion is made at the unique Kpnl restriction site present between the crtY and crtW genes.
  • Step 1 Construction of plasmid pGEM-T / crtZ
  • the genome of Pseudomonas putida was completely sequence.
  • the sequence of the crtZ gene is available in gene banks (Genbank ACC: NC_00297).
  • the gene is amplified from the genomic DNA of Pseudomonas putida using the ' pair of primers: crtZ.
  • f CCTTTTGGTACCGGAGGACCGTTCCATGCTGTTCAATCTCGCCATATT (SEQ ID N ° 9) crtZ.Ps. putida.
  • r GGGGTACCTCACGATTGGCTGCGCCTGCTGCGCAATTG (SEQ ID No.
  • the primers were designed to insert a 5 'RBS ribosome binding site and a 5' and 3 'Kpn I restriction site of the PCR product.
  • the amplification is carried out with a high fidelity DNA polymerase marketed by Invitrogen® (Platinium Pfx DNA
  • the amplification conditions are as follows: after an initial step of denaturing the DNA at 95 ° C. for 5 min, 35 PCR cycles are carried out (94 ° C. for 15 s, then
  • telomere sequence 55 ° C for 30s, then 68 ° C for 1 min), followed by a final elongation step (68 ° C for 7 min) during which l ⁇ l of classic Taq polymerase (GoTaq, Promega®) is added in the PCR tube in order to insert a deoxyadenosine residue at the 3 'ends of the amplification fragments (this step is essential to allow cloning in the vector pGEM-T used later).
  • the PCR product thus obtained is cloned into the cloning vector pGEM-T according to the supplier's protocol.
  • the plasmid obtained is named pGEM-T / crtZ.
  • 3rd step Construction " of the plasmid pJQ200mpl8 / crtDC:: crtY:: crtZ:: crtW:: aphA-3
  • the previous construction containing the genes crtDC, crtY, crtZ, crtW and aphA-3 is released by Xbal digestion then inserted by ligation in the suicide plasmid pJQ200 mpl8- linearized by Xbal
  • the plasmid pJQ200mpl 8 / crtDC:: crtY:: crtZ:: crtW:: aphA-3 is transferred by electroporation into the conjugative strain Escherichia coli S1 7. 1.
  • the double recombinant clones are selected after subculturing of the conjugate clones on Hutner medium containing 5% sucrose and kanamycin (150 ⁇ g / ml). PCR verification is carried out on several recombinant clones in order to ensure that the crtY, crtZ and crtW genes have indeed been inserted at the level of the crtD and crtC genes. Under microaerobic culture, the production of astaxanthin was observed in the bacteria thus mutated.
  • Example 4 Alternative strategy for building a mutant strain of Rhodopseudomonas palustris producing astaxanthin.
  • the crtZ gene essential for producing astaxanthin was isolated from a strain of Erwinia uredovora and not Pseudomonas putida.
  • the construction strategy remains identical to that described in Example 3 with the exception of the pair of primers - used to isolate the crtZ gene by PCR.
  • New primers crtZ. Er. uredovora.
  • f GACGGTACCACCGGAGAAATTATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGATC crtZ. crtZ.Er. uredovora.
  • r GTCGGTACCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCATCCT
  • the primers used were also defined to insert a 'RBS binding site 5' and a KpnI restriction site at the 5 'and 3' Product- PCR.

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Abstract

La présente invention est relative à un procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques mettant en œuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène caractérisé en ce qu'il comporte plusieurs étapes parmi lesquelles : délétion et insertion de gènes spécifiques, mise en culture des bactéries modifiées et extraction des caroténoïdes. L'invention couvre également les bactéries ou mutants mis en œuvre dans le procédé.

Description

"Procédé de production de caroténoïdes et bactéries mises en œuvre . "
La présente invention est relative à un procédé de synthèse de caroténoïdes, en particulier, de caroténoïdes non photosynthétiques, par des bactéries photosynthétiques, en particulier, par Rhodopseudomonas palustris et aux bactéries mises en œuvre dans le procédé. Plus de 600 caroténoïdes ont été identifiés dans la nature. Ils sont répandus chez de très .nombreux organismes vivants mais ne sont synthétisés de novo que par un nombre restreint d'organismes (plantes, bactéries, levures). -Certains de ces caroténoïdes (lycopène, β-carotène, canthaxanthine, astaxanthine) sont utilisés de façon intensive et très diverse dans l'industrie agro-alimentaire pour leur propriété colorante (rouge pour le lycopène, jaune pour le β-carotène, orange pour la canthaxanthine, rose-orange pour l' astaxanthine) .. On retrouve en particulier l'utilisation de 1' astaxanthine et de la canthaxanthine en aquaculture pour l'élevage des saumons et des truites afin de renforcer la couleur rose- orange de la chair du poisson et en aviculture pour accentuer la couleur jaune-orange des œufs qui, dans les 2 cas, est appréciée par les consommateurs. De plus, de par leurs propriétés antioxydantes et leur rôle de photo protection, ils sont utilisés dans l'industrie pharmaceutique et cosmétique pour l'obtention entre autre de crème solaire protectrice et de produits bronzants. Il existe déjà dans certains pays toute une série de produits dérivés de la canthaxanthine, du β-carotène et du lycopène, commercialisés dans les instituts de beauté et de bodybuilding. Ces caroténoïdes ' ont également , été décrits - comme possédant des propriétés anti-cancéreuses. En effet, ces molécules peuvent réduire l'activité des radicaux libres, supposés contribuer à la formation de cellules cancéreuses. La synthèse actuelle de ces caroténoïdes est principalement réalisée par voie chimique. Etant donné la tendance du consommateur à préférer les produits ayant une origine naturelle, il existe donc un marché potentiel pour des caroténoïdes de provenance végétale ou microbienne. De plus, il apparaît que les configurations isomériques de certains caroténoïdes produits par voie chimique ne correspondent pas aux ' principaux isomères retrouvés dans la nature. Cette différence peut s'avérer très importante car elle est susceptible d'entraîner une bio-assimilation supérieure des caroténoïdes d'origine naturelle par rapport à ceux issus de la synthèse chimique. La voie de biosynthèse de ces 4 principaux caroténoïdes (lycopène, β-carotène, astaxanthine, canthaxanthine) est présentée dans la figure 1. Le lycopène synthétisé grâce à l'action successive des enzymes CrtE, CrtB et CrtI est un intermédiaire commun aux 3 autres caroténoïdes. La synthèse du β-carotène peut être ainsi réalisée à partir du lycopène grâce à l'enzyme CrtY, celle de la canthaxanthine grâce aux enzymes CrtY et CrtW et celle de l' astaxanthine grâce aux enzymes CrtY, CrtW et CrtZ . Plusieurs bactéries ont été décrites pour leur capacité à produire l'un de ces 4 caroténoïdes (Brevijbacterium, Agrobacterium auriantiacum, Erwinia uredovora , Erwini . herbicola , Myxococcus xanthus, Flavobacterium, Alcaligenes r Bradyrhizobium ...) . En particulier, des travaux antérieurs des inventeurs, qui ont fait l'objet d'un dépôt aux Etats-Unis sous le numéro US 60/297,247, ont porté sur la souche Bradyrhizobium ORS278. Ces travaux ont démontré l'existence d'un cluster de gènes (crtE, crtY, crtl, crtB, crtW) intervenant dans la voie de biosynthèse de la. canthaxanthine. ' Ces différents gènes, une fois introduit chez E. coli , se sont avérés fonctionnel. À l'exception de Bradyrhizobium , qui synthétise une faible quantité de photosystème, ces bactéries sont généralement des bactéries non-photosynthétiques qui accumulent de faibles quantités de produits et qui ont bien souvent un taux de croissance limité.. La nature de la souche productrice constitue donc un ' obstacle majeur pour assurer une productivité suffisamment intéressante pour un industriel. Par ailleurs, ces bactéries ne produisent en général qu'un seul de ces 4 caroténoïdes. Ceci implique pour un industriel voulant produire un panel de ces 4 principaux caroténoïdes d'utiliser différentes souches bactériennes qui vont chacune exiger des conditions bien particulières de culture et de production. D'autre part, la culture de différentes souches sur un même site peut entraîner ' de nombreuses difficultés logistiques liées aux problèmes^ de contamination. Enfin, les caroténoïdes sont des composés hydrophobes qui ne peuvent être stockés dans la cellule que dans un environnement lipophilique, généralement des compartiments membranaires . Les bactéries produisant des caroténoïdes d'intérêt industriel . possèdent en général une membrane interne faiblement développée. Cette propriété, qui- limite donc la quantité de caroténoïdes que l'on peut accumuler dans ces cellules, constitue l'un des problèmes majeurs pour une utilisation industrielle de ces bactéries. Les travaux des inventeurs les ont donc amenés à rechercher une bactérie pouvant synthétiser suivant les conditions de cultures et/ou suivant les gènes caroténoïdes introduits dans celle-ci, l'ensemble de ces 4 principaux caroténoïdes e't ceci en palliant les défauts des autres bactéries. Les bactéries photosynthétiques présentent des avantages majeurs : une vitesse de croissance très rapide et une très forte capacité photosynthétique. Les caroténoïdes chez les bactéries photosynthétiques sont associés aux photosystèmes et jouent un rôle essentiel dans son fonctionnement. La forte activité photosynthétique est accompagnée de la synthèse en- grande quantité de caroténoïdes photosynthétiques associée à la mise en place de membranes intracytoplasmiques en abondance constituant une zone de stockage importante pour les caroténoïdes. Néanmoins, ces bactéries ne synthétisent en général qu'un seul pigment, la spirilloxanthine ou le sphéroïdène, qui ne présentent pas, à l'heure actuelle, d'intérêt industriel. Afin d'obtenir un microorganisme producteur de lycopène, β-carotène, canthaxanthine ou astaxanthine, les inventeurs ont exploité le potentiel que présentent les bactéries photosynthétiques en détournant la voie de synthèse endogène du caroténoïde photosynthétique vers la synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques c'est à dire non associé au photosystème, chez ces bactéries: β-carotène, canthaxanthine ou astaxanthine . La présente invention est donc relative à un procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis parmi le β-carotène, la canthaxanthine ou l' astaxanthine mettant en œuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins ' un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : i. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs .gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine. ou le β-carotène, iii. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées, et, iv. Extraction du ou des caroténoïde (s) contenu (s) dans les bactéries. ~ • De manière surprenante, il a été constaté qu'une bactérie synthétisant un caroténoïde photosynthétique (c'est-à-dire impliqué dans la photosynthèse) restait photosynthétiqué lorsque la voie de synthèse endogène dudit -caroténoïde était détourné vers la synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques . • En effet, la bactérie continue de synthétiser de manière résiduelle du lycopène, caroténoïde photosynthétique, qui permet à celle-ci de maintenir son activité de photosynthèse en remplaçant dans le photosystème le caroténoïde photosynthétiqué synthétisé de manière endogène. Les gènes à déléter au moins partiellement sont en général, les crtC, crtD et/où crtF. De préférence, les gènes crtC et crtD seront au moins partiellement délétés. Ces gènes sont en effet les premiers à être mis en œuvre dans la synthèse de la spirilloxanthine à partir du lycopène. (voir
•figure 1) En outre, il peut également être nécessaire de déléter dans certaines bactéries le crtA. Ce sera le cas' pour les bactéries synthétisant du lycopène-2-one. (voir figure 1) De préférence, les bactéries photosynthétiques sont les suivantes :. Rubrivivax ' gela tinosus , Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum moliscianum, Rhodospirillum salinarum,
Rhodospirillum ediosalinum, Rhodospirillum sodomense, Rhodocista centenaria , Rhodospira trueperi , Rhodopseudomonas palustris , Rhodopseudomonas acidophila , Rhodopseudomonas julia, Rhodopseudomonas cryptolactis r Rhodomicrobium vannielii , Rhodoplanes roseus, Rhodoplanes elegans r Rhodobium orientis , Rhodobium marinum ... Plus particulièrement, le procédé selon l'invention propose des conditions de culture assurant une production à un niveau satisfaisant de ces différents caroténoïdes. En particulier, . il s'agit d'un procédé de synthèse de canthaxanthine ou d' astaxanthine, caractérisé en ce que les conditions de la mise en .culture des bactéries sont séquentielles et comportent les étapes, suivantes : a. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées dans un premier temps en anaérobiose sous éclairement, b. Puis, dans un second temps en aérobiose ou en microaérobiose, à l'obscurité. En effet, chez les bactéries photosynthétiques, les gènes photosynthétiques, incluant les gènes crtE, crtB, et crtl de la voie de biosynthèse du lycopène sont sous le contrôle de l'oxygène et de la lumière. En particulier, chez certaines souches ces gènes ne s'expriment pas à l'obscurité et sont inh.ibés par la présence d'oxygène (> à 8%) . Cette répression par l'oxygène résulte d'un facteur de transcription appelé PpsR qui à forte pression partielle en oxygène se fixe sur les régions promotrices des gènes photosynthétiques, dont les gènes crt, empêchant ainsi leur transcription. En revanche, l'absence de dioxygène est défavorable à la production de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine. En effet, la réaction enzymatique catalysée par les enzymes CrtW (β-carotene' kétolase) ou CrtZ (β-carotène hydroxylase) intervenant dans la voie de biosynthèse de ces 2 caroténoïdes nécessite de l'oxygène (voir Figure 1) . Il est donc nécessaire pour permettre la synthèse de canthaxanthine et d' astaxanthine de trouver un compromis au niveau des conditions de culture afin d'assurer d'une part la synthèse de -l'intermédiaire lycopène et d'autre part sa transformation en canthaxanthine ou en astaxanthine. Avantageusement, les étapes a et b des conditions de culture' permettant d'obtenir préférentiellement de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine sont réitérées successivement. Une telle itération permet l'accumulation des caroténoïdes dans les cellules. Alternativement, le procédé selon- l'invention permet la production de β-carotène si l'on modifie les conditions de culture. Ces conditions photosynthétiques, de mise en culture sont alors les suivantes : a. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en anaérobiose sous éclairement. En effet, le fonctionnement de l'enzyme CrtY (lycopène cyclase) qui permet la transformation de lycopène en β- carotène n'étant, pas oxygène-dépendante, l'absence de l'étape b des conditions de culture pour la canthaxanthine ou 1' astaxanthine permet d'arrêter la, synthèse au stade du β- carotène. Une seule bactérie permet donc de synthétiser à la fois du lycopène et préférentiellement, soit du β-carotène, soit de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine selon les gènes introduits et les conditions de culture. Alternativement, les conditions de culture permettant d'obtenir préférentiellement de la canthaxanthine ou de 1' astaxanthine peuvent être réalisées en conditions de microaérobiose sous éclairement en une seule étape. En condition de microaérobiose, le pourcentage de dioxygène est de préférence compris entre 1 et 10%, plus particulièrement, 3 à 8%, bornes incluses. Afin de s'affranchir des limitations dues à la régulation de. l.a synthèse par le dioxygène, l'invention propose également un procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis parmi le β-carotène, la canthaxanthine ou 1' astaxanthine, mettant en œuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce que le procédé comporte les étapes suivantes : i. Mise en œuvre de mutants de bactéries photosynthétiques dont la photosynthèse n' est plus réprimée par le dioxygène, ii. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène,' iv. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en aérobiose ou microaérobiose. afin de synthétiser de la . canthaxanthine ou de l' astaxanthine ou mise en culture en condition d' anaérobiose afin de synthétiser du β- carotène, et, v. Extraction du ou des caroténoïde (s) contenu (s) dans les bactéries . Les mutants dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène sont obtenus en particulier par délétion du gène codant pour le facteur de transcription PpsR, ledit facteur réprimant l'expression de certains gènes crt à forte pression partielle en dioxygène. Avantageusement, les bactéries mises en œuvre dans le procédé sont du genre Rhodopseudomonas, de préférence de l'espèce, Rhodopseudomonas palustris . Certaines bactéries ne synthétisent pas de lycopène, mais un intermédiaire plus en amont dans la voie de synthèse des caroténoïdes. Il est. alors possible de modifier ces bactéries de manière à les faire synthétiser du lycopène. Les bactéries photosynthetiques du procédé selon l'invention sont- alors obtenues à partir de bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est
' le phytoene, le phytofluène, le ζ-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtl endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoene desaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoene. Les. bactéries sont préférentiellement : Rhodobacter capsula tus , Rhodobacter veldka pii , Rhodobacter sphaeroides r Rhodobacter azotoformans , Rhodobacter blasticus, Rhodovulum sulfidophilum, Rhodovulum adria ticum, Rhodovulum euryhalinum , Rhodovulum strictum ... Dans une telle hypothèse, les gènes à déléter sont identiques à ceux cités précédemment. En effet, les dérivés du sphéroïdène sont obtenus à partir du neurosporène (le crtl endogène code pour une phytoene desaturase assurant seulement 3 étapes successives de désaturation du phytoene) . Les gènes codant pour les premières enzymes mises en œuvre par la suite sont le crtC, le crtD ët/ou le CrtF. (voir figure 1) En outre, il peut également être nécessaire de déléter dans certaines bactéries le crtA. Ce sera le cas pour les bactéries synthétisant du ζ-carotène-2-one ou du neurosporène- 2-one. (voir figure 1) De manière avantageuse, l'insertion des gènes crtY, crtZ et/ou crtW du procédé selon l'invention est réalisée dans la zone des gènes au moins partiellement délétés . Alternativement, les gènes crtY, crtZ et/ou crtW peuvent également être insérés dans un plasmide. L'invention couvre également les bactéries photosynthétiques produisant, de manière alternative ou concomitante, au moins du lycopène, du β-carotène et de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine, caractérisées en ce que lesdites bactéries sont susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention. En particulier, ces .bactéries photosynthétiques synthétisant au moins un caroténoïde dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, sont caractérisées en. ce qu'elles comportent les mutations suivantes -: i. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite • synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β-carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène. Alternativement, il s'agit d'un mutant de bactéries photosynthétiques synthétisant au moins un caroténoïde dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, dont la synthèse du photosystème n'est plus réprimée par le dioxygène, produisant de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine, caractérisé en ce qu'il comporte les mutations suivantes: i. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants : soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β- carotène, soit, le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène. Ces bactéries ou mutants peuvent être obtenus à partir de bactéries ou de mutants produisant au moins un caroténoïde dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoene, le phytofluène, le ζ-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ou mutants ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtl endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoene desaturase assurant
4 étapes successives de désaturation du phytoene. De manière surprenante, il a été constaté que ces bactéries ou mutants de bactéries photosynthétiques, bien qu'ayant leur voie de synthèse du caroténoïde photosynthétique endogène détournée vers la synthèse d'un caroténoïde non photosynthétique d' intérêt ont leur activité photosynthétique maintenue. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples avec références aux figures suivantes : la figure 1 représente le schéma de synthèse des différents caroténoïdes visés par l'invention, la figure 2 présente le schéma de synthèse de la stratégie de construction du plasmide pJQ200mpl8/crtDC : : crtY ::crtW ::apha3 la figure 3 présente le schéma de synthèse de la stratégie de construction du plasmide pJQ200mpl8/crtDC : : crtY ::crtZ : : crtW ::apha3, et, - la figure 4 est une analyse par HPLC des caroténoïdes synthétisés par la souche mutante R . palustris CEAOOlΔcrtDC : : crtY : : crtW sous différentes conditions de culture.
Exemple 1 : construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant du lycopène La séquence du cluster. de gènes crt de R . palustris impliqué dans la synthèse de ' la spirilloxanthine est accessible sur Internet à l'adresse suivante http: //ww .ncbi . nlm.nih. gov (Ace Number : BX572597) . Comme dans Bradyrhizobium ORS"278, les gènes crtE, crtl, crtB,' crtC, crtD, crtF sont présents et organisés en 3 opérons
La stratégie générale de construction de cette souche mutante va consister à disrupter les gènes crtD et crtC en y insérant une cassette codant un gène de résistance à la kanamycine (gène apha3) . lere étape : isolement et clonage des gènes crtDC de R. palustris , : Une région correspondant à une partie des gènes crtDC de R . palustris a été amplifiée à l'aide du couple d'amorces : crtD.R.palu.XhoI.f : GAGCTCGAGTTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N°l) CrtC.R.palu.XhoI.r : CTGCTCGAGAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (SEQ ID N°2) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de restriction Xhol de part et d'autre du produit de PCR. Les amplifications sont réalisées avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen® (Platinium Pfx DNA Polymérase) . Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués. (94°C pendant 15s puis 55°C pendant 30s puis 68°C pendant 3 min),- suivis d'une étape finale d' élongation (68°C pendant 7 min) au cours de laquelle lμl de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega®) est rajouté dans le tube de PCR afin d' insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape 5 est- indispensable pour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement). Le produit de PCR ainsi obtenu est clone dans le vecteur • de clonage pGEM-T (commercialisé par la société Promega®) suivant le protocole du fournisseur. Le plasmide obtenu est 10 nommé pGEM-T/ crtDC. Xhol) .
2-.eme éta e : Construction du plasmide pJQ200m.pl8 /crtDC La région correspondant aux gènes crtDC de R . pal ustris est libérée par digestion Xhol du plasmide pGEM-T/ crtDC. Xhol
15 puis ligaturée dans le vecteur suicide pJQ200mpl8 linéarisé par digestion Sali . Ce plasmide contient le gène suicide sacB qui permet de sélectionner sur saccharose les clones pour lesquels un événement de double « crossing over » a bien eu lieu (Quandt, J. & Hynes, M. F. « Versa tile suicide vectors
20 which allow direct sélection for gène replacement in gram- nega tive bacteria » ; Gène 127, 15-21, 1993).
3ιeme étape: Construction du plasmide pJQ200m.pl8 /crtDC: : aphA-3
25. Le gène aphA-3 codant une résistance à la kanamycine est libéré du plasmide pUC4K commercialisé par la société Amersham® par digestion avec l'enzyme Sali. Il est. alors inséré dans le plasmide pJQ200mpl8 / crtDC linéarisé par Sali. Il est à noter -que cette dernière digestion Sali entraîne une
30 délétion d'un fragment de 618pb correspondant à l' extrémité 5' du gène crtD et l'extrémité 3' du gène crtC. Le plasmide pJQ200mpl8 /crtDC : : aphA-3 est enfin transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli S1 7. 1 . 4ième étape : Construction d'une souche mutante de R. palustris contenant la cassette apha3 au niveau des gènes crtD, cr tC. Le plasmide précédent pJQ200mpl8 / crtDC: : aphA-3- est délivré dans la souche sauvage de R . palustris (CEA001) par
•conjugaison avec la souche précédente E. coli S17.1 contenant la contruction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner (R. K. Clayton « Towards the isola tion of a photochemical reca tion center in Rhodopseudomonas sphaeroides » ; Biochim. Biophys.- Acta 75 : 312-318, 1963) contenant de la kanamycine 150μg/ml et de la carbenicilline 50μg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguant sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (150μg/ml) . Une vérification, par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que l'insertion de la cassette apha3 au niveau des gènes crtD et crtC de R . palustris . La production de lycopène en grande quantité a été constatée chez les .bactéries ainsi mutées. Par ailleurs, le caractère photosynthétique de la bactérie est conservé.
Exemple 2 : Construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant du β-carotène ou de la can thaxan thine Schéma de construction La stratégie de construction de- cette souche mutante est résumée dans la figure 2. Dans cette figure, les légendes des étapes sont les suivantes : lere étape : Amplification des gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278, ainsi que des gènes crtDC de R . pal ustris . Clonage des produits de PCR dans le plasmide p- GEMT (Promega) . 2ιeme étape : Libération par Sali de la cassette apha3 du plasmide puc4K commercialisé par Amersham. Insertion au niveau du site Xhol unique présent en aval de crtW. • 3ιeme étape : Libération des gènes crtW et apha3 par Kpnl/EcoRI . .Insertion dans le plasmide pGEM-T/crtY linéarisé par les mêmes enzymes. 4lème étape : Libération des gènes crtY, crtW et apha3 par BglII/EcoRI . Insertion dans le plasmide pGEM-T/crt C linéarisé par les mêmes enzymes. ςieme étape : Libération des gènes crtDC, crtY, . crtW et apha3 par Xbal. Insertion dans le plasmide pJQ200mpl8 linéarisé par la même enzyme
A. Stratégie de Construction La stratégie globale pour construire une souche mutante de R . palustris produisant soit du β-carotène soit de la canthaxanthine a consisté à disrupter les gènes crtD, crtC de R . palustris en y insérant les gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278 ainsi qu'un gène aphA-3 codant pour une résistance à la kanamycine. Suivant les conditions d' oxygénation de la culture (voir exemple 3) l'enzyme CrtW transformant le β-carotène en- canthaxanthine est fonctionnelle ou pas, ce qui conduit au choix à une accumulation de β-carotène ou de canthaxanthine. ' lere étape : isolement et clonage des gènes crtDC de R. palustris , crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278 : Une région correspondant à une partie des gènes crtDC de R . palustris a été amplifiée à l'aide du couple d'amorces : crtD.R.palu.Xbal.f : GAGTCTAGATTCGCCGGCATCGGCCTGAACTTCTC (SEQ ID N°3) CrtC. R.palu. Xbal. r : CTGTCTAGAAGGAGTATTACGGACTGATCGAAC (SEQ ID N°4) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de restriction Xbal de part et d'autre du produit de PCR. Le gène crtY de Bradyrhizobium ORS278 a été amplifié à l'aide du couple d'amorces suivant: crtY.278. f :
TGAGATCTGGAGGCTGTCGTCATGAGTCGAGATGCCGACGTCATCGTC (SEQ ID N°5) crtY.278. r : GTTGAATTCCTGGTACCTCATGGGGTCTTGAAGGCGCTCGCCTCA (SEQ ID N°6) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS et un site de restriction BglII en 5' ainsi qu'un site de restriction Kpnl et EcoRI en 3' du produit de PCR. Le gène crtW de Bradyrhizobium ORS278 a été amplifié à l'aide du couple d'amorces suivant : crtW.ORS278.f :
CGGTACCGGGAGCTTTGCCAATGCATGCAGCAACCGCCAAGGCTAC (SEQ ID N°7) crtW.ORS278.r : GTGAATTCCATGCTCGAGCGGGTTTAGTCACGCCTTTCCAG (SEQ ID N°8) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS et un site de restriction Kpn I en 5' ainsi qu'un site de restriction Xho I et EcoR I en 3' du produit de PCR. Les amplifications sont réalisées avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen® (Platinium Pfx DNA Polymérase) . Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués (94°C pendant 15s puis 55 °C pendant 30s puis 68 °C pendant 3 min), suivi d'une étape finale d' élongation (68°C pendant 7 min) au cours de laquelle lμl de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega®) est rajouté dans le tube de PCR afin d'insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape est indispensable pour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement) . Les 3 produits de PCR ainsi obtenus sont clones dans le vecteur de clonage pGEM-T (commercialisé par la société Promega®) suivant le • protocole du fournisseur. Les plasmides obtenus sont nommés pGEM-T/ crtDC. Xbal ; pGEM-T/crtY ; pGEM-
T/ crtW
2ιeme étape : Construction du plasmide pGEM-T/car W ; : aphA- 3 Le gène aphA-3 codant une résistance à la kanamycine est libéré du plasmide pUC4K commercialisé par la société Amersham par digestion avec l'enzyme Sali. Il est alors inséré dans le plasmide pGEM-T/crtfV linéarisé par Xhol .
3xeme étape : Construction du plasmide pGEM- 1/crtY : : crtW : : aphA-3 La construction . précédente contenant les - gènes crtW et aphA~3 est libérée -par double digestion Kpnl/EcoRI puis insérée dans le plasmide pGEM-T/crtY" linéarisé par le même couple d'enzymes de restriction.
4ιeme étape : Construction du plasmide pGEM-
T/ crtDC : : crtY : : crtW •: ; ap A-3 La construction précédente contenant les gènes crtY, crtW et aphA-3 est libérée par double digestion BglII/EcoRI puis insérée dans le plasmide pGEM-T/ crtDC linéarisé par le même couple d'enzyme de restriction. La digestion de pGEM- T/ crtDC par BglII/EcoRI entraîne une délétion d'un fragment de 1232 pb correspondant à une partie importante des gènes crtl? et crtC. gieme étape : Construction du plasmide pJQ200mpl8 /crtDC : : crtY : : crtW : : aphA-3 La construction précédente contenant les gènes crtDC, crtY, crtW et aphA-3 est libérée par digestion Xbal puis insérée dans le plasmide suicide pJQ200mpl8 linéarisé par Xbal . Le plasmide pJQ200mρl8 /crtDC : : crtY : :
• crtZ : : crtW : : aphA-3 est enfin transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli S1 7. 1 . 6ième étape : Construction d'une souche mutante de R. palustris contenant les gènes crtY et crtW de Bradyrhizobium ORS278. Le plasmide précédent pJQ200mpl8 / crtDC: : crtY : : crtW : : aphA-3 est délivré dans la souche de R . palustris CEA001 par conjugaison avec la souche précédente E. coli S1 7. 1 contenant la construction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner contenant de la kanamycine 150μg/ml et de la carbénicilline 50μg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguant sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (150μg/ml). Une vérification par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que les gènes crtY, et crtW ont bien été insérés au niveau des gènes crtD et crtC. Un mutant est retenu pour la suite des expériences : R. palustris CEAOOlΔcrtDC : : crY : : crtW .
B. Analyse des caroténoïdes produit par la souche mutante R. palustris CEAOOlΔcrtDC : : crY : : crtW - essai dans différentes conditions de culture Afin de déterminer le potentiel de la souche mutante de R . palustris CEAOOlΔcrtDC : : crY : : crtW à surproduire du β- carotène et de la canthaxanthine, une série d'essais préliminaires a été réalisée dans laquelle différentes conditions de culture ont été testées . A : Flacon de 120 ml contenant 100 ml de milieu Hutner, 30 °C - dégazé pour éliminer toute trace d'oxygène, et placé sous une lampe à incandescence de 100 Watts (conditions lumière, anaérobiose) B : Flacon de 250 ml rempli de 50 ml de milieu Hutner, 30 °C - agitation 170 RPM - placé dans une atmosphère où la teneur en oxygène peut être ajustée à 1, 5, 8 % (Conditions lumière, microaérobiose) ou 21% (Conditions lumière, aérobiose) C : Après culture en anaérobiose pendant 2 jours suivant les conditions A, 50 ml sont transférés dans un erlenmeyer à baffles puis mis à agiter 170rpm à l'obscurité pendant une nuit pour fortement oxygéner la culture. Après 3 jours de culture dans les différentes conditions testées, les caroténoïdes produits sont analysés par HPLC. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 suivant.
Tableau 1 : production de caroténoïdes selon les conditions de culture chez le mutant R . palustris CEAOOlΔcrtDC : : crY : : crtW
Il apparaît clairement que les conditions d'aération et de lumière ont des effets très importants sur la production des caroténoïdes et la croissance de la souche. De fortes quantités de. β-carotène peuvent être obtenues en anaérobiose sous lumière (4.7 mg/1) , par contre seules de faibles concentrations de caroténoïdes (lycopène et β-carotène) sont obtenues lorsque la bactérie est cultivée en condition aérobie (21%) en raison de la répression de la synthèse de l'appareil photosynthétique par l'oxygène. La présence d'importantes quantités de β-carotène en conditions lumière, anaérobiose montre bien que le gène crtY d'ORS278 qui permet la transformation du lycopène en β-carotène est parfaitement fonctionnel. Par contre, on observe l'absence de production de canthaxanthine dans ces mêmes conditions. Ceci résulte du fait que l'enzyme CrtW qui permet la transformation du β-carotène en canthaxanthine est une oxygénase qui a donc besoin d'oxygène pour fonctionner. En accord avec cette explication, la concentration de canthaxanthine augmente progressivement (de 0,32 à 0,41 mg/1) lorsque la teneur en oxygène passe de 5 à 8% avec une baisse concomitante de β-carotène (tableau I). Cette expérience démontre, d'une part la nécessité de la présence d'oxygène pour la formation de canthaxanthine à partir de β-carotène, d'autre part que l'enzyme- CrtW d'ORS278 est également fonctionnelle chez ce mutant. La transformation de β-carotène en canthaxanthine en fonction de la teneur en oxygène est aussi démontrée par le chromatogramme présenté sur la figure 4. Un autre - argument en faveur d'une transformation du β-carotène en canthaxanthine de façon équimolaire en présence - d' oxygène est présenté dans les conditions C, c'est- à-dire en oxygénant la culture après croissance en anaérobiose, où il est possible de transformer une partie de ce β-carotène en canthaxanthine. Ces premiers essais montrent bien qu'il- est possible de produire de la canthaxanthine chez R . palustris . Par ailleurs, en jouant sur les conditions d'aération, la quantité de β- carotène transformable en canthaxanthine devrait être proche de 5mg/l soit 6 fois plus que la quantité de canthaxanthine (0,8mg/l) obtenue en culture liquide avec la souche Bradyrhizobium ORS278. De plus, le temps de culture a été divisé par un facteur supérieur à 2 soit une augmentation du même rapport de la productivité.
Exemple 3 : Stratégie de construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant de l' astaxanthine Schéma de construction La stratégie de construction de cette souche mutante est résumée en figure 3. • Dans cette figure, les légendes des étapes sont les suivantes : lere étape : Amplification du gène crtZ de Pseudomonas putida . Clonage du produit de PCR dans le plasmide p-GEMT (Promega) . 2ιeme étape : Libération par Kpnl du' gène crtZ . Insertion dans le site Kpnl unique du plasmide pGEM-T / crt Y: : crtW: : apha3. 3ιeme étape : Libération des gènes crtY, crtZ , crtW et apha3 par BglII /EcoRI . Insertion dans le plasmide pGEM-T/crtDC linéarisé par les mêmes enzymes. 4ιeme étape : Libération des gènes crtDC, crtY, crtZ , crtW et apha3 par Xbal. Insertion dans le plasmide pJQ200mpl8 linéarisé par la même enzyme
Construction La stratégie générale consiste à insérer le gène crtZ de Pseudomonas putida dans la souche ' mutante précédemment construite de R . palustris contenant les gènes crtY et crtW de Bradyrizobium ORS278. L'insertion est faite au niveau du site unique de restriction Kpnl présent entre les gènes crtY et crtW.
1er étape : Construction du plasmide pGEM-T/ crtZ Le génome de Pseudomonas putida a été entièrement séquence. La séquence du gène crtZ est disponible dans les banques de gènes (Genbank ACC : NC_00297) . Le gène est amplifié à partir de l'ADN génomique de Pseudomonas putida à l'aide du 'couple d'amorces : crtZ . Ps .putida. f : CCTTTTGGTACCGGAGGACCGTTCCATGCTGTTCAATCTCGCCATATT (SEQ ID N°9) crtZ.Ps. putida. r : GGGGTACCTCACGATTGGCTGCGCCTGCTGCGCAATTG (SEQ ID N°10) Les amorces ont été conçues de façon à insérer un site de fixation du ribosome RBS en 5' et un site de restriction Kpn I en 5' et en 3' du produit de PCR. L'amplification est réalisée avec une ADN polymérase haute fidélité commercialisée par Invitrogen® (Platinium Pfx DNA
Polymérase) . Les conditions d'amplification sont les suivantes: après une étape initiale de dénaturation de l'ADN à 95°C pendant 5 min, 35 cycles de PCR sont effectués (94°C pendant 15s, puis
55°C pendant 30s, puis 68°C pendant 1 min), suivi d'une étape finale d' élongation (68°C pendant 7 min ) au cours de laquelle lμl de Taq polymérase classique (GoTaq, Promega®) est rajouté dans le tube de PCR afin d' insérer un résidu de déoxyadénosine aux extrémités 3' des fragments d'amplification (cette étape est indispensable pour permettre le clonage dans le vecteur pGEM-T utilisé ultérieurement) . Le produit de PCR ainsi obtenu est clone dans le vecteur de clonage pGEM-T suivant le protocole du fournisseur. Le plasmide obtenu est nommé pGEM-T/crtZ.
2ιsme étape : Construction du plasmide pGEM- T/ crtDC : : crtY : : crtZ : : crtW : : aphA-3 La construction précédemment obtenue pGEM- 1/ crtDC : : crtY : : crtW : : aphA-3 contenant les gènes crtW, crtY de Bradyrhizobium ORS278 et le gène de résistance à la kanamycine aphA-3 inséré dans les gènes crtDC de R . palustris est linéarisée par l'enzyme Kpnl dont le site de restriction est situé entre les gènes crtW et crtY. Le gène crtZ clone dans le vecteur pGEM-T/crtZ est libéré par Kpnl , puis inséré par ligation dans la construction précédente linéarisée.
3ième étape : Construction" du plasmide pJQ200mpl8 /crtDC : : crtY : : crtZ : : crtW : : aphA-3 La construction précédente contenant les gènes crtDC, crtY, crtZ, crtW et aphA-3 est libérée par digestion Xbal puis insérée par ligation dans le plasmide suicide pJQ200 mpl8- linéarisé par Xbal . Le plasmide pJQ200mpl 8 /crtDC : : crtY : : crtZ : : crtW : : aphA-3 est transféré par électroporation dans la souche conjugative Escherichia coli S1 7. 1 .
4ième étape : Construction d'une souche mutante de JR. palustris CEAOOl contenant les gènes crtY et crtW de Bradyx ïzoJbïum ORS278 et crtZ de Pseudomonas putida . Le plasmide précédent pJQ200mpl8 / crtDC : : crtY : : crtZ : : crtW : : ' aphA-3 est délivré dans la souche R . palustris CEAOOl par ' conjugaison avec la souche précédente E . coli S1 7. 1 contenant la construction. Les clones conjuguants sont sélectionnés sur milieu Hutner contenant de la kanamycine 150μg/ml et de la carbénicilline 50μg/ml. Les clones double recombinants sont sélectionnés après repiquage des clones conjuguants sur milieu Hutner contenant du saccharose 5% et de la kanamycine (150μg/ml) . Une vérification par PCR est effectuée sur plusieurs clones recombinants afin de s'assurer que les gènes crtY, crtZ et crtW ont bien été insérés au niveau des gènes crtD et crtC. En condition de culture en microaérobiose, la production - d' astaxanthine a été constatée chez les bactéries ainsi mutées . Exemple 4 : Alternative de stratégie de construction d'une souche mutante de Rhodopseudomonas palustris produisant de l' astaxanthine .
Par rapport à la stratégie de construction décrite dans l'exemple 3, le gène crtZ indispensable pour produire de l' astaxanthine a été isolé à partir d'une souche d' Erwinia uredovora et non Pseudomonas putida . La stratégie de- construction reste identique à celle décrite dans l'exemple 3 à l'exception du couple d'amorces - utilisées pour isoler le gène crtZ par PCR. Nouvelles amorces : crtZ . Er. uredovora. f : GACGGTACCACCGGAGAAATTATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGATC crtZ. crtZ.Er. uredovora. r : GTCGGTACCTTACTTCCCGGATGCGGGCTCATCCT
Les amorces utilisées ont été également définies de façon à insérer un ' site de fixation RBS en 5' et un site de restriction Kpnl en 5' et en 3' du produit- de PCR.
Après construction, la capacité de la souche mutante R . palustris CEAOOlΔcrtCD : : crtY ::crtZ : : crtW ::apha3 à produire de l' astaxanthine a été vérifiée par HPLC après culture sous différentes conditions d'oxygène [Flacon de 250 ml rempli de 50 ml de milieu Hutner, 30°C - agitation 170 RPM - placé dans une atmosphère où la teneur en oxygène peut être ajustée à 1, 5, 8 % (Conditions lumière, microaérobiose) ou 21% (Conditions lumière, aérobiose)- Temps de culture 3 jours].
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous Tableau 2 : production de caroténoïdes selon les conditions de culture chez le mutant R . palustris ' CEAOOlΔcrtCD : : crtY ::crtZ : : crtW : : apha3
Comme déjà décrit, un effet très important de la teneur en oxygène sur les quantités et les variétés de caroténoïdes produits est constaté. Lorsque la teneur en oxygène est fixée à 5%, le caroténoïde majeur produit est l' astaxanthine. Ces essais montrent ainsi qu'il est possible de surproduire de l' astaxanthine chez R . palustris .

Claims

REVEND I CAT I ON S
1. Procédé de synthèse de caroténoïdes non photosynthétiques choisis ' parmi le β-carotène, la canthaxanthine ou l' astaxanthine mettant en œuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : i. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, ii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β- carotène, soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène, iii. Mise en culture des bactéries ainsi modifiées, et, iv. Extraction du ou des caroténoïde (s) contenu (s) dans les bactéries. 2. Procédé selon la revendication 1, de synthèse de canthaxanthine ou d' astaxanthine, caractérisé en ce que les conditions de mise en culture sont séquentielles et comportent les étapes suivantes : c. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées dans un premier temps en anaérobiose sous éclairement, d. • Puis, dans un second temps en aérobiose en obscurité . 3.. Procédé selon la revendication 1 de synthèse de β- carotène, caractérisé en ce que les conditions de mise en culture sont les suivantes : b. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en anaérobiose sous éclairement. '4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que les étapes a et/ou b sont réalisées en conditions de microaérobiose sous éclairement. 5. 'Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'en conditions de microaérobiose, le pourcentage de dioxygène est compris entre 1 et 10%, de préférence, 3 à 8%, bornes incluses. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que l'on réitère les étapes a et b successivement. 7. Procédé de synthèse de caroténoïdes choisis parmi le β- carotène, la canthaxanthine ou l' astaxanthine, mettant en œuvre des bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène, caractérisé en ce que le procédé comporte les étapes suivantes : i. Mise en œuvre de mutants de bactéries photosynthétiques dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène, ii. Délétion, chez les bactéries, d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, O 2005/071087
- soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β- carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène, iv.. Mise en culture desdites bactéries ainsi modifiées en aérobiose ou microaérobiose afin de synthétiser de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine ou mise en culture en condition d' anaérobiose afin de synthétiser du β-carotène, - et, v. Extraction du ou des caroténoïde (s) contenu (s) dans les bactéries. 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les mutants dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène sont obtenus par délétion du gène codant pour le facteur de transcription PpsR. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les bactéries sont du genre
Rhodopseudomonas, de préférence de l'espèce, Rhodopseudomonas palustris . 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1-8, caractérisé en ce que les bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le lycopène sont obtenues à partir de bactéries photosynthétiques produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoene, le phytofluène, le ζ-carotène ou le neurosporène, lesdites bactéries ayant subi éventuellement - une délétion ou disruption du gène crtl endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoene desaturase assurant 4 étapes successives de désaturation du phytoene .
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'insertion des gènes crtY, crtZ et/ou - crtW est réalisée dans la zone des gènes au moins partiellement délétés. 12. Bactérie photosynthétique produisant, de manière alternative ou concomitante, au moins du lycopène, du β- carotène et de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine, caractérisée en ce que ladite bactérie est susceptible d' être obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 9 dans son rattachement à la revendication 1. 13. Bactérie photosynthétique caractérisée en ce qu'elle est obtenue selon le procédé suivant : i. Mise en œuvre d'une bactérie photosynthétique synthétisant au moins un caroténoïde photosynthétique , dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, ii . Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β- carotène, soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène. 14. Mutant de bactérie photosynthétique caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé suivant : i. Mise en œuvre d'un mutant de bactérie photosynthétique synthétisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'intermédiaire de synthèse est le lycopène, dont la photosynthèse n'est plus réprimée par le dioxygène, produisant de la canthaxanthine ou de l' astaxanthine, ' ii. Délétion d'au moins une partie d'un ou plusieurs gènes impliqués dans la voie de synthèse endogène qui suit celle du lycopène de manière à arrêter ladite synthèse au niveau du lycopène, iii. Insertion des gènes suivants : - soit le crtY si le caroténoïde à synthétiser est le β-carotène, - soit le crtY et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est la canthaxanthine ou le β- carotène, - soit le crtY, le crtZ et le crtW si le caroténoïde à synthétiser est l' astaxanthine ou le β-carotène. 15. Bactérie selon les revendications 12 ou 13, ou mutant selon la revendication 14, caractérisé en, ce qu'il est respectivement obtenu à partir de bactérie ou de mutant produisant au moins un caroténoïde photosynthétique dont l'un des intermédiaires de synthèse est le phytoene, le phytofluène, le ζ-carotène ou le neurosporène, lesdits bactérie ou mutant ayant subi éventuellement une délétion ou disruption du gène crtl endogène, suivie d'une insertion d'un gène crtl exogène codant pour une phytoene 'desaturase assurant 4 étapes
'successives de désaturation du phytoene.
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