EP1668123A1 - Utilisation de la proteine pks 13 codant pour la condensase d' acides mycoliques des mycobacteries et genres apparentes comme cible d' antibiotiques. - Google Patents

Utilisation de la proteine pks 13 codant pour la condensase d' acides mycoliques des mycobacteries et genres apparentes comme cible d' antibiotiques.

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Publication number
EP1668123A1
EP1668123A1 EP04787312A EP04787312A EP1668123A1 EP 1668123 A1 EP1668123 A1 EP 1668123A1 EP 04787312 A EP04787312 A EP 04787312A EP 04787312 A EP04787312 A EP 04787312A EP 1668123 A1 EP1668123 A1 EP 1668123A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
acyl
protein
pksl3
molecule
coa
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04787312A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Christophe Guilhot
Mamadou Daffe
Christine Houssin
Damien Portevin
Célia DE SOUSA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Sud
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Sud
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Sud filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1668123A1 publication Critical patent/EP1668123A1/fr
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it

Definitions

  • the present invention relates to a new enzyme involved in the biosynthesis of mycolic acids, and to its use for the screening of antibiotics, in particular anti-mycobacterials.
  • Mycolic acids are long chain fatty acids, ⁇ -al ylés and ⁇ -hydroxylés, present in the form of esters in the cell walls of bacteria of a phylogenetic line particular of actinomycetes, the suborder Corynebacterineae, also called "Mycolatas", including the bacterial genera: Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia, Gordona and Tsukamurella.
  • mycolatas there are major pathogens, notably the mycobacteria Mycobacteri um tuberculosis, agent of tuberculosis, and Mycoba cterium leprae, agent of leprosy.
  • mycolic motif -CHOH-CHR 2 - COOH
  • mycolatas The ⁇ and ⁇ chains of mycolic acids vary in length and structure ( Figure 1A), but have a common motif (mycolic motif: -CHOH-CHR 2 - COOH), which suggests that an enzymatic step involved in the formation of this motif is common to all mycolatas.
  • the mycolic motif would probably be formed during the Claisen or malonic condensation reaction. However, so far the enzyme responsible for this condensation has not been identified.
  • This condensation reaction appears similar to the condensation of acyl-CoA with methylmalonyl-CoA which is involved in the formation of branched polymethyl fatty acids in mycobacteria (MATHUR et al., J. Biol. Chem. 267: 19388-19395 , 1996; SIRAKOVA et al., J. Biol, Chem. 276: 16833-16839, 2001; DUBEY et al., Mol. Microbiol. 45: 1451-1459, 2000), where it is catalyzed by type I polyketide synthases (Pks).
  • Pks type I polyketide synthases
  • the inventors have hypothesized that the condensation reaction leading to mycolic acids in mycolatas could be catalyzed by a type I Pks having an unusual substrate specificity. To verify this hypothesis, they first sought, from sequences of mycolatas present in the databases, if there existed a Pks common to these bacteria and comprising the functional domains necessary for the condensation reaction, namely: an acyl transferase domain (AT), a ketosynthase domain (KS), a "cyl carrier protein” domain (ACP), and a thioesterase domain (TE). They thus identified in M.
  • AT acyl transferase domain
  • KS ketosynthase domain
  • ACP a "cyl carrier protein” domain
  • TE thioesterase domain
  • tuberculosis a gene called pksl3 coding for a type I Pks, as well as orthologs of this gene in other mycobacteria, as well as in corynebacteria.
  • These proteins have strong sequence similarities (70 to 80% of identity over the entire length of the protein for the different mycobacterial Pksl3 and 40 to 50% of identity between Pksl3 of M. tuberculosis and Pksl3 of C. gl utamicum or C. diphteriae), and also have the above-mentioned domains which are necessary for the condensation reaction and the release of the product.
  • Pksl3 proteins will therefore be designated below under the general term “Pksl3”.
  • the inventors have further shown that the inactivation of the gene coding for Pksl3 leads to blockage of the synthesis of mycolic acids, and to a loss of bacterial viability. In addition, they produced and purified the Pksl3 protein in recombinant form.
  • the results obtained by the inventors show that Pksl3 is the condensase involved in the synthesis of mycolic acids, and that it is a key enzyme in the assembly of the envelope of mycolatas, and essential for the viability of mycobacteria.
  • the subject of the present invention is a purified protein, called Pksl3, involved in the biosynthesis of mycolic acids and having the following characteristics: a) it has at least 40% identity, preferably at least 50% identity, and most preferably at least 60% identity over its entire sequence, with the protein Pksl3 from M.
  • tuberculosis b) it has an acyl transferase domain (pfam00698), a ketoacylsynthase domain (pfam02801 or pfam00109), at least one acyl carrier protein domain (COG0331 or COG0304,), and a thioesterase domain (COG3319 or pfam00975)
  • said protein Pksl3 catalyzes a Claisen condensation between: a) an acyl-CoA molecule of formula I, or an acyl-AMP molecule of formula Ibis: OO
  • R 2 is a linear alkane comprising from 10 to 24 carbon atoms; to form a ⁇ -keto acyl intermediate of formula III, or a ⁇ -keto ester of formula Illbis:
  • Ri and R 2 are as defined above, and Xi is an acceptor molecule.
  • Specific provisions of this embodiment are the following: - said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which Ri comprises from 6-16 carbon atoms and R 2 comprises from 12 to 16 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Coryneba cterium; - Said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which R 1 comprises 28-48 carbon atoms and R 2 comprises from 14 to 16 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Gordona; - Said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which Ri comprises from 42 to 68 carbon atoms and R 2 comprises from 18 to 24 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Mycobacterium; - Said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which Ri comprises from 24 to 46 carbon atoms and R 2 comprises from 10 to 16 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Nocardia; - Said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which Ri comprises from 14 to 34 carbon atoms and R 2 comprises from 10 to 16 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Rhodoccocus; - Said protein Pksl3 catalyzes the formation of a ⁇ -keto acyl of formula III or of ⁇ -keto ester of formula Illbis in which R 1 comprises from 40 to 56 carbon atoms and R 2 comprises from 18 to 20 carbon atoms.
  • Said protein can in particular be obtained from the genus Tsukamurella.
  • said protein Pksl3 has at least 70% identity with the protein Pksl3 of M. tuberculosis (SEQ ID NO: 1).
  • said Pksl3 protein has at least 50% identity, preferably at least 60%, and very preferably at least 70% identity with the Pksl3 protein.
  • Corynebacterium glutamicum SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to an expression vector, comprising a polynucleotide sequence coding for a Pksl3 protein according to the invention, as well as a host cell, prokaryotic or eukaryotic, transformed by said expression vector.
  • the present invention also relates to a process for the production of a Pksl3 protein according to the invention, characterized in that it comprises the cultivation of a host cell according to the invention, and the purification of the Pksl3 protein from said culture.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting the biosynthesis of the envelope of mycolatas, characterized in that it comprises the inhibition of the expression or of the activity of the protein Pksl3 in said bacteria. Because of its essential character for viability, and its specificity of action, condensase
  • Pksl3 constitutes an excellent potential target for the design of new drugs, in particular new anti-tuberculosis drugs.
  • the present invention therefore relates to the use of a Pksl3 condensase according to the invention, for the screening of antibiotics active on mycolatas, and in particular on mycobacteria.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples illustrating the identification, production, and purification of the Pksl3 condensase, as well as the effects of its inactivation on the viability. mycolatas.
  • M. tuberculosis contains 16 Pks of type I among which 9 are also found in M. leprae.
  • 7 are already known for their involvement in the biosynthesis of other lipid groups in M. tuberculosis (AZAD et al., J. Biol. Chem. 272: 16741-16745, 1997; CONSTANT et al. , J. Biol. Chem. 277: 38148-38158, 2002).
  • ML1229 has the same domain organization as well as strong sequence similarities with the type I Pks of M.
  • tuberculosis involved in the biosynthesis of branched polymethyl fatty acids.
  • the second candidate is named Pksl3 in M. tuberculosis and ML0101 in M. leprae. Analysis of the deduced sequence of Pksl3 (Accession number NP_338459; 1733 amino acids) of M.
  • tuberculosis CDC1551 reveals the presence of the various catalytic domains necessary and sufficient for the catalysis of the Claisen type condensation involved in the formation of acids mycolics: two "Acyl carrier protein” (ACP) domains (amino acids 39 to 107 and 1237 to 1287), a “ketosynthase” (KS) domain (amino acids 119 to 543), an “acyl transferase” (AT) domain ( amino acids 640 to 1045), and a “thioesterase” (TE) domain (amino acids 1464 to 1543).
  • ACP Acyl carrier protein
  • KS ketosynthase domain
  • AT acyl transferase
  • TE thioesterase domain
  • Pksl3 has also been demonstrated in other bacterial species producing mycolic acids, by amplifying by PCR an internal fragment of 1 kb of pksl3 from the genome of Nocardia asteroids ATCC19243, Rhodococcus rhodochrous ATCC13808 and
  • Tsukamurella paurometabolum CIP100753T using the following degenerate primers: pksl3a: 5 '-GCTGGARCTVACVTGGGARGC-3' (SEQ ID NO: 3) pksl3b: 5 '-GTGSGCGTTGGYDCCRAAVCCGAA-3' (SEQ ID NO: 2): , 5 units of Taq polymerase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), 1 mM of dNTP and 4 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l, under the conditions recommended by the supplier (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS).
  • the amplification program is: 5 min at 94 ° C, then 35 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 58 ° C, 1 min 30 sec at 72 ° C, then 1 cycle of 10 min at 72 ° vs.
  • the steps at 58 ° C are replaced by steps at 50 ° C.
  • the sequences of these fragments have 40% identity over their entire length with the Pksl3 from M. tuberculosis, also suggesting the presence of pksl3 in these bacteria.
  • the strain of C. gl utamicum ATCC13032 (DUSCH et al., Appl. Environ. Microbiol. 65: 1530-1539, 1999) is cultured on a BHI medium (DIFCO).
  • the M. tuberculosis H37Rv strain is cultured on a Middlebrook 7H9 liquid medium (DIFCO) supplemented with 10% ADC (DIFCO) and 0.05% Tween 80.
  • the culture media are supplemented with kanamycin, hygromycin, chloramphenicol and sucrose when necessary at a final concentration of 40 ⁇ g / l, 50 ⁇ g / ml, 15 ⁇ g / ml and 10% (w / v), respectively.
  • the total bacterial DNA is extracted from 5 ml of saturated liquid cultures as described in BELISLE et al. , 1998.
  • tuberculosis is amplified by PCR from the total DNA of the strain H37Rv and the primers 13Rtb 5 '-GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO: 5) and 13Stb 5 '-CGGTGATGTGTACTGTCTGCTGCTGCTGCT -3 '(SEQ ID NO: 6), with 2.5 units of Pfu DNA polymerase (PROMEGA, Lyon, France), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), and 1 ⁇ M of each primer in a final volume 50 ⁇ l, under the conditions recommended by the supplier (PROMEGA, Lyon, France).
  • the amplification program is: 5 min at 94 ° C, then 30 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 57 ° C, 5 min at 72 ° C, then 10 min at 72 ° C.
  • the amplification product is purified using the Qiaquick kit (QIAGEN, Courtaboeuf, France), then digested with the restriction enzymes NdeI / HindIII.
  • the fragment obtained is inserted into the vector pET26b (NOVAGEN), itself cut with the restriction enzymes NdeI / HindIII.
  • the resulting plasmid, called pWM35 contains the pks13 gene fused 3 'to the gene with a label formed by 18 nucleotides coding for a sequence of 6 histidines.
  • the pksl3 gene of M. tuberculosis is amplified by PCR from the total DNA of the H37Rv strain and the primers 13Rtb 5 '-GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO: 5) and 13Ttb 5 '-GCTCGGGGATCCTCACTGCTTGCCTACCT SEQ ID NO: 7), under the same conditions as those described above.
  • the amplification product is purified as described above and then digested with the restriction enzymes NdeI / BamHI.
  • the fragment obtained is inserted into the vector pET15b (NOVAGEN) previously cut with the restriction enzymes NdeI / BamHI.
  • the resulting plasmid, pWM36 has the pksl 3 gene fused 5 'to the gene with an 18-nucleotide tag coding for a sequence of 6 histidines.
  • Plasmid pWM38 The pksl 3 gene of C. gl utami cum ATCC13032 is amplified by PCR from the total DNA of this strain and the primers 13Ccg 5'-AATATGACTAGTAGCCAATCGTCGGATCAGAAG- 3 '(SEQ ID NO: 8) and 13Dcg 5'- AGCTCTAGATCTCTAATTCTTCCGAGAAATCTCAT-3 '(SEQ ID NO: 9), under the same conditions as those described above.
  • the amplification product is purified as above and then digested with the Spel / BglII restriction enzymes.
  • the fragment obtained is inserted into the vector pET15b modified by insertion of a Spel site in place of the Xhol site, then cut with the Spel / BamHI restriction enzymes.
  • the resulting plasmid, pWM38 has the pksl3 gene from C. glutami cum fused to a tag of 18 nucleotides 5 'to the gene coding for a sequence of 6 histidines.
  • the cells are frozen at -20 ° C for 15 h, then they undergo 3 thaw-freeze cycles in liquid nitrogen. They are then sonicated 3 times for 30 sec (Vibra-cell, BIOBLOCK SCIENTIFIC) (50% active cycle and power output 5), then centrifuged for 30 min at 20,000 g.
  • the supernatant is filtered on a microfilter (pore diameter: 0.2 ⁇ m) and then loaded onto a “Chela ting Sepharose Fast Flow” column (AMERSHAM) in FPLC (BIORAD HP duoflow).
  • the protein is eluted by gradient of 5 to 150 mM Imidazole with an elution peak at 90 mM.
  • the protein-enriched fractions are mixed, concentrated by filtration on centripep 30 (AMICON), and the protein is separated from the residual contaminants by exclusion chromatography (S-200 16/60 mm, AMERSHAM) in FPLC.
  • S-200 16/60 mm, AMERSHAM exclusion chromatography
  • the culture media are added with kanamycin, hygromycin, chloramphenicol and sucrose when necessary at a final concentration of 40 ⁇ g / ml, 50 ⁇ g / ml, 15 ⁇ g / ml and 10% (w / v), respectively.
  • the total bacterial DNA is extracted from 5 ml of saturated liquid culture as described in BELISLE et al. , 1998. The DNA pellet is re-suspended in 100 ⁇ l of 10 mM Tris (pH 8).
  • PCR conditions are: 1 unit of Taq polymerase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP and 0.5 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l, in the conditions recommended by the supplier (ROCHE MO
  • the amplification program is: 2 min at 94 ° C, then 35 cycles of 1 min at 94 ° C, 30 sec at 54 ° C, 1 min 30 sec at 72 ° C, then 1 cycle of 10 min at 72 ° vs.
  • These fragments are inserted into the plasmid pMCS5 (MOBITEC, Gôttingen, Germany).
  • a kanamycin resistance cassette is inserted between these two PCR fragments to give the plasmid pCMS5 :: peaks.
  • This plasmid is transferred into the C. glutami cum strain and the transformants are selected on an agar medium containing kanamycin.
  • Figure 3A schematically shows the genetic structure of the pksl3 locus in the wild type strain (WT) and in the mutant strain ⁇ pksl3 of C. glutami cum.
  • WT wild type strain
  • ⁇ pksl3 of C. glutami cum the wild type allele of pksl3 present on the chromosome is replaced by a mutated allele containing an internal deletion of 4.3 kb into which the km gene coding for kanamycin is inserted.
  • the boxes indicate the various genes of the pks13 locus.
  • the location and the name of the primers used for the PCR analysis of the mutant strains are indicated by arrow heads.
  • the PCR amplification products expected for the different strains are indicated under each genetic structure.
  • the ⁇ pksl3 transformants in which allelic replacement took place between the pksl3 gene wild-type chromosome and the mutated plasmid allele show (1) a change in colony morphology from a smooth, smooth to rough appearance (2) a considerably reduced growth curve (doubling of division time) compared to the wild-type (3) thermosensitivity which makes them incapable of growing at temperatures above 30 ° C unlike the wild type which produces colonies on agar medium up to
  • Mutant strain _pJcsl3 pCGL2308 from C. glutamicum
  • a complementing plasmid, pCGL2308, is produced by the insertion into the vector pCGL482 (PEYRET et al., Mol. Microbiol. 9: 97-109, 1993) of a fragment of 5 , 3 kb of C. glutamicum, comprising the pksl3 gene and the region of 417 bp upstream of this gene, obtained by PCR from the total DNA of C.
  • the resulting plasmid pCGL2308 is transferred by electroporation into the ⁇ pksl3 strain of C. glutamicum and the ⁇ pksl3 transformants : pCGL2308 are selected on agar medium containing kanamycin.
  • the transformants 4pJcs23: pCGL2308 have a bright and smooth morphology, an intermediate growth rate between the wild strain and the mutant strain, an inability to grow at temperatures above 32 ° C (while the wild strain grows at 37 ° C) , as well as a much lower mycolic acid content than that of the wild strain. It therefore appears that complementation with the plasmid induces a partial reversion to the wild-type phenotype.
  • the PCR conditions are: 3 units of Pfu polymerase (PROMEGA, Lyon, France), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), 1 mM dNTP and 1 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l, under the conditions recommended by the supplier (PROMEGA, Lyon, France).
  • the amplification program is: 5 min at 94 ° C, then 30 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 58 ° C, 3 min at 72 ° C, then 1 cycle of 10 min at 72 ° C. These fragments are inserted into the plasmid pJQ200 (QUANDT et al., Gene 127: 15-21, 1993).
  • a hygromycin resistance cassette is inserted between these two PCR fragments to give the plasmid pDP28.
  • This non-replicating plasmid containing the sacB marker and a copy of the mutated allele pksl3:: hyg is transferred into the M. smegma strain strain by electroporation and the transformants are selected on agar medium containing hygromycin.
  • the transformants having integrated the plasmid pDP28 by simple recombination between the wild type and mutated copies of the pksl3 gene are characterized by PCR using the following primers: 13J: 5'-CTTCCACGACATGGTCTGAT-3 '(SEQ ID NO: 26) 13K: 5 '-CACGATCGAGTCGAGCTCGA-3' (SEQ ID NO: 27) Hl: 5'-AGCACCAGCGGTTCGCCGT-3 '(SEQ ID NO: 28) H2: 5'-TGCACGACTTCGAGGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 29)
  • the PCR conditions are : 2.5 units of Taq polymerase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), 1 mM of dNTP and 1 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l, under the conditions recommended by the supplier (ROC MOLECULAR BIOCHEMICALS).
  • the amplification program is: 5 min at 94 ° C, then 30 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 62 ° C, 2 min 30 sec at 72 ° C, then 1 cycle of 10 min at 72 ° C.
  • a strain called PMM47 of M. smegma tis is selected, in which the plasmid pDP28 is inserted at the locus pksl3 by simple recombination.
  • the pksl3 gene is amplified by PCR from the total DNA of M. smegma tis using the primers 13R 5'-ATGAGATCTGATGAAAACCACAGCGAT-3 '( SEQ ID NO: 30) and 13P 5'-GGACTAGTCTTGGCGACGGCCTTCTCAC-3 '(SEQ ID NO: 31).
  • the PCR conditions are: 3 units of Pfu DNA polymerase (PROMEGA, Lyon, France), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), 1 mM of DNTP, and 1 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l , under the conditions recommended by the supplier (PROMEGA, Lyon, France).
  • the amplification program is: 5 min at 94 ° C, then 30 cycles of 1 min at 94 ° C, 1 min at 58 ° C, 5 min at 72 ° C, then 10 min at 72 ° C.
  • the pksl3 gene is inserted into a thermosensitive mycobacterial plasmid derived from plasmid pCG63 (GUILHOT et al., FEMS Microbiol.
  • PCR conditions are: 2.5 units of Taq polymerase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% of dimethyl sulfoxide (Me 2 SO), 1 mM of dNTP and 1 ⁇ M of each primer in a final volume of 50 ⁇ l, under the conditions recommended by the supplier (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS).
  • FIG. 4A schematically shows the genetic structure of the pksl3 locus obtained during the construction of the conditional mutant PMM48: pDP32 of M. smegma tis.
  • the boxes indicate the different genes of the pksl3 locus.
  • the location and the names of the primers used for the PCR analysis of the mutant strains are indicated by arrow heads.
  • the PCR amplification products expected for the different strains are indicated under each genetic structure.
  • Figure 4B presents the results of PCR analysis of the conditional mutant PMM48: pDP32 of M. smegma tis and its parental strains PMM47 and me 2 155 (T). Using these conditions, 8% of the selected colonies Hyg R , Km R , Suc R are the result of an allelic exchange; the other clones being the result of a mutation in the sa cB gene.
  • Biochemical analysis of the ⁇ pksl3 mutants of C grlufcamictim and PMM48: pDP32 of M. smegmatis Analysis protocol The strains of C. glutami cum are cultured until the exponential phase and labeled with acetate [ 14 C] 0.5 ⁇ Ci / ml (specific activity of 54 mCi / mol; ICN, Orsay, France) for 3 h.
  • PMM48 pDP32 and the wild type strain mc 2 155 are cultured at 30 ° C.
  • Results ⁇ pksl3 and ⁇ pksl3 mutants pCG 230Q of c - glutami cum
  • Figure 3C illustrates the result of the analysis of the fatty acids released after saponification from the wild type strain (WT) and of the mutants ⁇ pksl3 and ⁇ pksl 3: PCGL2308 from C. glutamicum. Analysis by thin layer chromatography of these products reveals that the spots corresponding to mycolic acids or palmitone, a degradation product of the ⁇ -keto acyl intermediate resulting from the condensation reaction, are no longer detectable in mutants . This observation is confirmed by analysis in GC-MS which demonstrates that the ⁇ pksl3 mutant of C.
  • glutamicum no longer synthesizes mycolic acids but produces a similar amount of fatty acids C16-C18, the precursor of mycolate, as that of the wild type strain (data not shown).
  • This production of mycolic acids is partially restored following the transfer into the mutant strain ⁇ pksl3 of a plasmid carrying the functional pksl3 gene from C. glutamicum; which demonstrates that these phenotypes are actually due to the deletion of pksl3.
  • the partial restoration suggests either that the expression of pksl3 by the plasmid is not of the same level as that in the wild-type strain, or that the chromosomal insertion of the kanamycin cassette exerts a polar effect on the expression of the gene.
  • PMM48 mutant pDP32 of M. smegma tis
  • Figure 4D illustrates the result of the analysis of the fatty acids released after saponification from the wild-type strain of M. smegma tis and the conditional mutant PMM48: pDP32, after growth at temperature permissive (30 ° C) or non-permissive (42 ° C).
  • the mycolates / short-chain fatty acids ratio is quantified for the PMM48: pDP32 mutant and divided by that obtained for the wild-type strain cultivated under the same conditions.
  • the graph shows that after transfer at 42 ° C, the average mycolate content in the PMM48: pDP32 mutant is reduced by more than 60%.
  • Pksl3 Screening of xenobiotics inhibiting condensation by Pksl3, directly or indirectly As illustrated in FIG. 5, Pksl3 allows the condensation of two substrates, which themselves result from two independent reactions. The absence of mycolic acids in mycolatas can therefore result from the inhibition of Pksl3 and / or the inhibition of FadD32, and / or the inhibition of the carboxylase complex in which the AccD4 protein intervenes.
  • Several tests make it possible to screen the action of a xenobiotic on the synthesis of mycolic acids by mycolatas.
  • the transformants ⁇ pksl3 in which the pksl3 gene has been inactivated show a change in colony morphology, which changes from a smooth glossy appearance to a rough appearance.
  • C. glutamicum bacteria in which the accD4 or fadD32 gene is mutated see Figure 6.
  • a first test to determine the impact of a xenobiotic on the synthesis of mycolic acids therefore consists in spreading mycolatas capable of surviving without producing mycolic acids, for example bacteria C. glutamicum (for example, the strain ATCC13032), on an agar culture medium containing the xenobiotic to be tested. Visual observation of the colonies obtained makes it possible to identify potential antibiotics.
  • Another test consists of growing C. glutami cum bacteria in a liquid medium, as described above, in. presence or absence of the xenobiotic to be tested.
  • Acetate [ 14 C] 0.5 ⁇ Ci / ml (specific activity of 54 mCi / mmol; ICN, Orsay, France) is added during the exponential growth phase, for at least 3 hours, before carrying out the analysis biochemical of fatty acids contained in bacteria by thin layer chromatography, as described above and in Portevin et al, PNAS 2004, Vol.101, p314-319 (see in particular the first paragraph on page 316).
  • a second step of analysis is necessary to more precisely determine the target of a xenobiotic inhibiting the synthesis of mycolic acids, that is to say to determine s 'it acts on Pksl3 or on an enzyme involved in the activation of one of its substrates. This can be done by analyzing the fatty acids present in C. glutamicum bacteria grown in the presence of the xenobiotic (candidate antibiotic), for example by gas chromatography followed by mass spectrometry (GC-MS).
  • GC-MS mass spectrometry
  • methyl esters of fatty acids can be obtained by saponification of the cells, followed by methylation with diazomethane, as described by Laval et al (Annal. Chem., 2001, Vol. 73, p. 4537- 4544). They are then fractionated on a Florisil column irrigated with petroleum ether containing 0, 1, 2, 3 and 100% diethyl ether. The methyl esters of polar fatty acids are contained in the last eluted fraction. Alternatively, it is possible to obtain trimethylsilylated derivatives by the method described by Constant et al (J. Biol. Chem. 2002, Vol. 277, p. 38148-38158).
  • the analyzes by gas chromatography and by gas chromatography followed by mass spectrometry can be carried out as described by Portevin et al (PNAS 2004, supra). These analyzes of the fatty acid content of bacteria cultivated in the presence and in the absence of the xenobiotic inhibiting the synthesis of mycolic acids make it possible to determine whether the xenobiotic acts on Pksl3 or FadD32, or on the acyl carboxylase containing AccD4. The inhibition of condensation by Pksl3 or of the formation of acyl-AMP by FadD32 leads to the accumulation of intermediates resulting from carboxylation by acyl-CoA carboxylase, such as tetradecylmalonic acid.
  • a test can be carried out by purifying the FadD32 protein and by measuring the formation of acyl-AMP in vi tro, as described by Trivedi et al,
  • glutamicum whose accD4 gene or fadD32 gene has been mutated, makes it possible to determine whether the inhibition of the synthesis of mycolic acids by xenobiotic is linked to its action on Pksl3, or on an enzyme located upstream in the biosynthesis of mycolic acids.

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Abstract

La présente invention est relative à une nouvelle enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, et à son utilisation pour le criblage d'antibiotiques, notamment d'anti-mycobactériens. La présente invention concerne en particulier la protéine Pks13, qui catalyse, chez les mycolatas, une condensation de Claisen ou malonique entre une molécule d'acyl-CoA ou une molécule d'acyl-AMP et une molécule d'acylmalonyl-CoA, pour former un intermédiaire ß-céto acyle ou ß-céto ester.

Description

UTILISATION DE LA PROTEINE PKS 13 CODANT POUR LA CONDENSASE DES ACIDES MYCOLIQUES DES MYCOBACTERIES ET GENRES APPARENTES COMME CIBLE D'ANTIBIOTIQUES. La présente invention est relative à une nouvelle enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, et à son utilisation pour le criblage d'antibiotiques, notamment d'anti-mycobactériens. Les acides mycoliques sont des acides gras à longue chaîne, α-al ylés et β-hydroxylés, présents sous forme d'esters dans les parois cellulaires de bactéries d'une lignée phylogénétique particulière des actinomycètes, le sous-ordre des Corynebacterineae, également dénommés « mycolatas », comprenant les genres bactériens : Mycobacterium, Corynebacterium, Rhodococcus, Nocardia , Gordona et Tsukamurella . Parmi les mycolatas, on trouve des pathogènes majeurs, notamment les mycobactéries Mycobacteri um tuberculosis , agent de la tuberculose, et Mycoba cterium leprae, agent de la lèpre. Depuis une quinzaine d'années, on observe une recrudescence de la tuberculose, 'notamment dans les pays industrialisés. Ce phénomène est en partie lié à l'apparition de souches du bacille tuberculeux résistantes aux antibiotiques existants. Ainsi, la conception de nouveaux médicaments antituberculeux est redevenue une priorité importante. Parmi les médicaments anti-tuberculeux les plus efficaces, se trouvent ceux qui interfèrent avec la biosynthèse de l'enveloppe des mycobactéries, tels que l' isoniazide, l' éthionamide et l'ethambutol ( EBB et al., Molecular Biology and Virulence 1 : 287-307 (eds. Ratledge, C. & Dale, J.) (Blackwell Science Ltd, Oxford), 1999). Les acides mycoliques représentent un constituant majeur de cette enveloppe. Il a été rapporté qu'ils intervenaient dans des fonctions biologiques importantes, participant notamment à la virulence bactérienne (GLICKMAN et al., Mol. Cell 5 : 717-727, 2000). Ils sont également impliqués dans la faible perméabilité de l'enveloppe des mycolatas, qui leur confère une résistance naturelle à de nombreux antibiotiques (JARLIER et al., J. Bacteriol. 172 : 1418-1423, 1990 ; BRENNAN et al., Annu. Rev. Biochem. 64 : 29-63, 1995 ; DAFE et DRAPER, Adv. Microb. Physiol. 39 : 131-203, 1998). Les chaînes α et β des acides mycoliques varient en longueur et en structure (Figure 1A) , mais présentent un motif commun (motif mycolique : -CHOH-CHR2- COOH) , ce qui suggère qu'une étape enzymatique impliquée dans la formation de ce motif est commune à toutes les mycolatas . Selon un modèle généralement accepté actuellement (GASTAMBIDE-ODIER et al., Bioche ische Zeitschift 333 : 285-295, 1960), les dernières étapes de la biosynthèse des acides mycoliques consisteraient en une cascade de réactions (Figure 1B) : (1) activation de l' acyle pour former une molécule d' acyl-CoA catalysée par une acyl-CoA synthase ; (2) carboxylation d'une molécule d' acyl-CoA pour former une molécule d' acylmalonyl-CoA catalysée par une acyl-CoA carboxylase ; (3) condensation de type Claisen ou malonique d' une molécule d' acyl-CoA ou acyl-AMP et d'une molécule d' acylmalonyl-CoA pour former l'intermédiaire β-céto acyle, catalysée par une condensase ; (4) réduction de l'intermédiaire β-céto acyle pour former l'acide mycolique catalysée par une réductase. Le motif mycolique serait probablement formé lors de la réaction de condensation de type Claisen ou malonique. Toutefois, jusqu'à présent l'enzyme responsable de cette condensation n'avait pas été identifiée. Cette réaction de condensation apparaît similaire à la condensation d'acyl-CoA avec le methylmalonyl-CoA qui intervient dans la formation d'acides gras ramifiés polymethyles chez les mycobactéries (MATHUR et al., J. Biol . Chem. 267 : 19388-19395, 1996 ; SIRAKOVA et al., J. Biol. Chem. 276 : 16833-16839, 2001 ; DUBEY et al., Mol. Microbiol. 45: 1451-1459, 2000), où elle est catalysée par des polykétides synthases (Pks)de type I . Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que la réaction de condensation conduisant aux acides mycoliques chez les mycolatas pourrait être catalysée par une Pks de type I ayant une spécificité de substrat inhabituelle. Pour vérifier cette hypothèse, ils ont d'abord recherché, à partir de séquences de mycolatas présentes dans les bases de données, s'il existait une Pks commune à ces bactéries et comprenant les domaines fonctionnels nécessaires à la réaction de condensation, à savoir : un domaine acyl transférase (AT) , un domaine kétosynthase (KS) , un domaine « a cyl carrier protein » (ACP) , et un domaine thioestérase (TE) . Ils ont ainsi identifié chez M. tuberculosis , un gène dénommé pksl3 codant pour une Pks de type I, ainsi que des orthologues de ce gène chez les autres mycobactéries, ainsi que chez les corynébactéries . Ces protéines possèdent de fortes similarités de séquence (70 à 80% d'identité sur toute la longueur de la protéine pour les différentes Pksl3 mycobactériennes et 40 à 50% d'identité entre Pksl3 de M. tuberculosis et Pksl3 de C. gl utamicum ou C. diphteriae) , et possèdent en outre les domaines, mentionnés ci-dessus, qui sont nécessaires à la réaction de condensation et au relargage du produit. Ces protéines seront donc désignées ci-après sous le terme général « Pksl3 » Les Inventeurs ont en outre montré que 1' inactivation du gène codant pour Pksl3 conduisait au blocage de la synthèse des acides mycoliques, et à une perte de la viabilité bactérienne. En outre, ils ont produit et purifié la protéine Pksl3 sous forme recombinante. Les résultats obtenus par les Inventeurs montrent que Pksl3 est la condensase intervenant dans la synthèse des acides mycoliques, et qu'il s'agit d'une enzyme clé dans l'assemblage de l'enveloppe des mycolatas, et essentielle pour la viabilité des mycobactéries. La présente invention a pour objet une protéine purifiée, dénommée Pksl3, impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques et possédant les caractéristiques suivantes : a) elle possède au moins 40% d'identité, de préférence au moins 50% d'identité, et de manière tout à fait préférée au moins 60% d'identité sur la totalité de sa séquence, avec la protéine Pksl3 de M. tuberculosis ; b) elle possède un domaine acyl transférase (pfam00698), un domaine kétoacylsynthase (pfam02801 ou pfam00109) , au moins un domaine acyl carrier protein (COG0331 ou COG0304,), et un domaine thioestérase (COG3319 ou pfam00975) c) elle catalyse une condensation de Claisen ou malonique entre une molécule d' acyl-CoA ou acyl-AMP et une molécule d' acylmalonyl-CoA. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine Pksl3 catalyse une condensation de Claisen entre : a) une molécule d'acyl-CoA de formule I, ou une molécule d' acyl-AMP de formule Ibis : O O
^CH2 S CoA (mD ^CπH22 ™AMv,rP (ibis; dans laquelle Ri est une chaîne comprenant de 6 à 68 atomes de carbone, pouvant contenir une ou plusieurs doubles liaisons -C=C-, et/ou un ou plusieurs cycles cis/trans-cyclopropane, et/ou un ou plusieurs groupes CH3 o
—C IH-o—C I I— et/ou pouvant porter un ou plusieurs groupes latéraux choisis parmi -CH3, =0, -0-CH3 ; et b) une molécule d' acylmalonyl-CoA de formule II :
dans laquelle R2 est un alcane linéaire comprenant de 10 à 24 atomes de carbone ; pour former un intermédiaire β-céto acyle de formule III, ou un β-céto ester de formule Illbis :
dans laquelle Ri et R2 sont tels que définis ci-dessus, et Xi est une molécule acceptrice. Des dispositions particulières de ce mode de réalisation sont les suivantes : - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 6-16 atomes de carbone et R2 comprend de 12 à 16 atomes de carbones. Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Coryneba cterium ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 28-48 atomes de carbone et R2 comprend de 14 à 16 atomes de carbones.
Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Gordona ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 42 à 68 atomes de carbone et R2 comprend de 18 à 24 atomes de carbones. Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Mycobacterium ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 24 à 46 atomes de carbone et R2 comprend de 10 à 16 atomes de carbones. Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Nocardia ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 14 à 34 atomes de carbone et R2 comprend de 10 à 16 atomes de carbones. Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Rhodoccocus ; - ladite protéine Pksl3 catalyse la formation d'un β-céto acyle de formule III ou de β-céto ester de formule Illbis dans laquelle Ri comprend de 40 à 56 atomes de carbone et R2 comprend de 18 à 20 atomes de carbones. Ladite protéine peut notamment être obtenue à partir du genre Tsukamurella . Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite protéine Pksl3 possède au moins 70% d'identité avec la protéine Pksl3 de M. tuberculosis (SEQ ID NO: 1) . Selon encore un autre mode de réalisation de la présente invention, ladite protéine Pksl3 possède au moins 50% d'identité, de préférence au moins 60%, et de manière tout à fait préférée au moins 70% d'identité avec la protéine Pksl3 de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 2) . La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression, comprenant une séquence polynucléotidique codant pour une protéine Pksl3 conforme à l'invention, ainsi qu'une cellule-hôte, procaryote ou eucaryote, transformée par ledit vecteur d'expression. La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine Pksl3 conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'une cellule-hôte conforme à l'invention, et la purification de la protéine Pksl3 à partir de ladite culture . La présente invention a également pour objet un procédé pour inhiber la biosynthèse de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition de l'expression ou de l'activité de la protéine Pksl3 chez lesdites bactéries. Du fait de son caractère essentiel pour la viabilité, et de sa spécificité d'action, la condensase
Pksl3 constitue une excellente cible potentielle pour la conception de nouveaux médicaments, notamment de nouveaux antituberculeux . La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'une condensase Pksl3 conforme à l'invention, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les mycolatas, et notamment sur les mycobactéries. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples illustrant l'identification, la production, et la purification de la condensase Pksl3, ainsi que les effets de son inactivation sur la viabilité des mycolatas .
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DE LA CONDENSASE PKS13 M. tuberculosis contient 16 Pks de type I parmi lesquelles 9 se retrouvent également chez M. leprae . Parmi ces 9 enzymes putatives, 7 sont déjà connues pour leur implication dans la biosynthèse d' autres groupes de lipides chez M. tuberculosis (AZAD et al., J. Biol. Chem. 272 : 16741-16745, 1997 ; CONSTANT et al., J. Biol. Chem. 277 : 38148-38158, 2002) . Parmi les deux protéines candidates restantes, celle dénommée ML1229 présente la même organisation de domaine ainsi que de fortes similarités de séquences avec les Pks de type I de M. tuberculosis impliquées dans la biosynthèse des acides gras polyméthyl ramifiés. Le second candidat est dénommé Pksl3 dans M. tuberculosis et ML0101 dans M. leprae . L'analyse de la séquence déduite de Pksl3 (Numéro d'accession NP_338459 ; 1733 acides aminés) de M. tuberculosis CDC1551 révèle la présence des différents domaines catalytiques nécessaires et suffisants pour la catalyse de la condensation de type Claisen intervenant dans la formation des acides mycoliques : deux domaines « Acyl carrier protein » (ACP) (acides aminés 39 à 107 et 1237 à 1287), un domaine « kétosynthase » (KS) (acides aminés 119 à 543) , un domaine « acyl transférase » (AT) (acides aminés 640 à 1045), et un domaine « thioestérase » (TE) (acides aminés 1464 à 1543) . Des orthologues de ML1229 et Pksl3 ont été recherchés chez différentes espèces en utilisant le programme BLAST (ALTSCHUL et al., Nuceic Acid Res. 25 : 3389-3402, 1997). Les séquences de différentes condensases putatives Pksl3 codées par le gène pksl3, « acyl-CoA synthase » FadD32 et « sous-unité de l'acyl-CoA carboxylase » AccD4 (codées respectivement par deux gènes fadD32 et accD4 flanquant le gène pskl3 chez toutes les corynébactéries et mycobactéries analysées, comme illustré dans la Figure 2) , ont été comparées en utilisant le programme Needleman-Wunsh disponible sur le site web de 1' Institut Pasteur http: //www. pasteur. fr . Aucun orthologue de ML1229 n'a été identifié chez trois espèces de corynébactéries (C. glutamicum, C. efficiens et C. diphteriae) alors que des orthologues de Pksl3 (ML0101) ont été retrouvés chez les trois espèces de corynébactéries susmentionnées et chez trois autres espèces de mycobactéries {M. smegma tis, M. marinum et M. avium) . Ces protéines Pksl3 contiennent les domaines catalytiques requis pour la condensation conduisant à la synthèse de l'acide mycolique, et les gènes correspondants sont localisés en aval de gènes connus pour leur implication dans le transfert de l'acide mycolique sur l'arabinogalactane (PUECH et al., Mol. Microbiol. 44 : 1109-1122, 2002) . Les identités des séquences des protéines Pksl3 par rapport à la séquence complète de la Pksl3 de M. tuberculosis sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1
La présence de Pksl3 a également été mise en évidence dans d' autres espèces bactériennes produisant des acides mycoliques, en amplifiant par PCR un fragment interne de 1 kb de pksl3 à partir du génome de Nocardia astéroïdes ATCC19243, Rhodococcus rhodochrous ATCC13808 et
Tsukamurella paurometabolum CIP100753T, en utilisant les amorces dégénérées suivantes : pksl3a : 5' -GCTGGARCTVACVTGGGARGC-3' (SEQ ID NO : 3) pksl3b : 5' -GTGSGCGTTGGYDCCRAAVCCGAA-3' (SEQ ID NO : 4) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) , 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , 1 mM de dNTP et 4 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 35 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 1 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. Pour T. paurometabolum, les étapes à 58 °C sont remplacées par des étapes à 50°C. Les séquences de ces fragments présentent 40% d' identité sur toute leur longueur avec la Pksl3 de M. tuberculosis, suggérant également la présence de pksl3 chez ces bactéries. L'ensemble de ces résultats suggère que la protéine Pksl3 est retrouvée chez toutes les mycolatas produisant des acides mycoliques, et que parmi les Pks de type I, elle est la seule enzyme susceptible de catalyser la condensation des chaînes α et β d'acides gras pour former les acides mycoliques.
EXEMPLE 2 : CLONAGE, SUREXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES PKS13 DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ET CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
Construction des plasmides La souche de C. gl utamicum ATCC13032 (DUSCH et al., Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1530-1539, 1999) est mise en culture sur un milieu BHI (DIFCO) . La souche de M. tuberculosis H37Rv est mise en culture sur un milieu liquide Middlebrook 7H9 (DIFCO) additionné de 10% ADC (DIFCO) et de 0,05% Tween 80. Les milieux de culture sont additionnés de kanamycine, d' hygromycine, de chloramphénicol et de sucrose quand nécessaire à une concentration finale de 40 μg/ l, 50 μg/ml, 15 μg/ml et 10% (p/v) , respectivement. L'ADN bactérien total est extrait à partir de 5 ml de cultures liquides saturées comme décrit dans BELISLE et al . , 1998. Les culots d'ADN sont re-suspendus dans 100 μl de Tris 10 mM (pH 8). Plasmides pWM35 et pWM36 Le gène pksl3 de M. tuberculosis est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de la souche H37Rv et des amorces 13Rtb 5' -GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO : 5) et 13Stb 5' -CGGTGAAAGCTTCTGCTTGCCTACCTCACTTG-3' (SEQ ID NO : 6), avec 2,5 unités d'ADN polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , et 1 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 57°C, 5 min à 72°C, puis 10 min à 72°C. Le produit d' amplification est purifié en utilisant le kit Qiaquick (QIAGEN, Courtaboeuf, France) , puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel/HindIII . Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET26b (NOVAGEN) , lui-même coupé avec les enzymes de restriction Ndel/HindIII . Le plasmide résultant, dénommé pWM35, contient le gène pksl3 fusionné en 3' du gène à une étiquette formée de 18 nucléotides codant pour une séquence de 6 histidines. Le gène pksl3 de M. tuberculosis est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de la souche H37Rv et des amorces 13Rtb 5' -GAGGACATATGGCTGACGTAGCGGAATC-3' (SEQ ID NO : 5) et 13Ttb 5' -GCTCGGGGATCCTCACTGCTTGCCTACCTCAC-3' (SEQ ID NO : 7), dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le produit d'amplification est purifié comme décrit ci-dessus puis digéré avec les enzymes de restriction Ndel/BamHI . Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET15b (NOVAGEN) préalablement coupé avec les enzymes de restriction Ndel/BamHI . Le plasmide résultant, pWM36, possède le gène pksl 3 fusionné en 5' du gène à une étiquette de 18 nucléotides codant pour une séquence de 6 histidines .
Plasmide pWM38 Le gène pksl 3 de C. gl utami cum ATCC13032 est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de cette souche et des amorces 13Ccg 5'-AATATGACTAGTAGCCAATCGTCGGATCAGAAG- 3' (SEQ ID NO : 8) et 13Dcg 5'- AGCTCTAGATCTCTAATTCTTCCGAGAAATCTCAT-3' (SEQ ID NO : 9), dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Le produit d'amplification est purifié comme précédemment puis digéré avec les enzymes de restriction Spel/BglII. Le fragment obtenu est inséré dans le vecteur pET15b modifié par insertion d'un site Spel à la place du site Xhol, puis coupé avec les enzymes de restriction Spel/BamHI . Le plasmide résultant, pWM38, possède le gène pksl3 de C. glutami cum fusionné à une étiquette de 18 nucléotides en 5' du gène codant pour une séquence de 6 histidines. Surexpression des protéines Pksl3 de Myco.bacfce.rxum tuberculosis et CoryneJbacfce-cium glutamicum chez Escherichia coli Les plasmides pWM35, pWM36 et pWM38 sont transférés dans la souche d' Escherichia coli BL21 (DE3) :pLysS (NOVAGEN) . Les trois souches sont inoculées dans 3 ml de milieu LB contenant du chloramphénicol (30 μg/ml) et de la kanamycine (40 μg/ml) ou de l' ampicilline (100 μg/ml) en fonction des plasmides. Les cultures sont incubées à 37 °C sous agitation (250 tr/min) jusqu'à saturation. Une dilution au l/100eme de ces cultures est réalisée dans 200 ml de milieu LB contenant de la kanamycine ou de l' ampicilline . Ces nouvelles cultures sont incubées sous agitation à 37 °C pendant 2h30 (D06oonm = 0,7-0,8). De l' isopropyl-thio-β-D-galactoside (IPTG) est ajouté à une concentration finale de 0,5 mM et la culture est incubée 3h à 30°C sous agitation.
Purification des protéines Pksl3 de Mycobacterium tuberculosis et Corynebacteriυm glutamicum Les cellules exprimant les différentes protéines Pksl3 sont culottées par centrifugation à 2500 g pendant 15 min, puis reprises dans 40 ml de tampon de charge (Tris-HCl 50 mM pH=7,5, Imidazole 5 mM, NaCl 300 mM) . Les cellules sont congelées à -20°C pendant 15h, puis elles subissent 3 cycles de décongélation-congélation dans l'azote liquide. Elles sont ensuite soniquées 3 fois pendant 30 sec (Vibra-cell, BIOBLOCK SCIENTIFIC) (50% cycle actif et puissance de sortie 5) , puis centrifugées pendant 30 min à 20000 g. Le surnageant est filtré sur microfiltre (diamètre des pores : 0,2 μm) puis chargé sur une colonne « Chela ting Sepharose Fast Flow » (AMERSHAM) en FPLC (BIORAD HP duoflow) . La protéine est éluée par gradient de 5 à 150 mM d' Imidazole avec un pic d' élution à 90 mM. Les fractions enrichies en protéines sont mélangées, concentrées par filtration sur centripep 30 (AMICON) , et la protéine est séparée des contaminants résiduels par chromatographie d'exclusion (S-200 16/60 mm, AMERSHAM) en FPLC. En suivant cette procédure, environ 20 g de protéines Pksl3 de M. tuberculosis ou de C. gl utamicum sont obtenus. EXEMPLE 3 : ANALYSE BIOCHIMIQUE DE MUTANTS Apksl3 DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ET MYCOBACTERIUM SMEGMATIS La souche de C. glutamicum ATCC13032 est mise en culture comme précédemment décrit. La souche de M. smeg a tis me2155 de type sauvage (SNAPPER et al., Mol. Microbiol. 4 : 1911-1919,
1990) est mise en culture sur un milieu LB (DIFCO) supplémenté par 0,05% de Tween 80 afin d'éviter
1' agrégation. Les milieux de culture sont additionnés de kanamycine, d' hygromycine, de chloramphénicol et de sucrose quand nécessaire à une concentration finale de 40 μg/ml, 50 μg/ml, 15 μg/ml et 10% (p/v) , respectivement. L'ADN bactérien total est extrait à partir de 5 ml de culture liquide saturée comme décrit dans BELISLE et al . , 1998. Le culot d'ADN est re-suspendu dans 100 μl de Tris 10 mM (pH 8) .
Construction d' un mutant de C. glutamicum Souche mutante Apksl3 de C. glutamicum Deux fragments d'ADN de 0, 9 kb et 0,7 kb chevauchant le gène pksl3 sur ses extrémité 5' et 3' sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN total de C. glutamicum en utilisant respectivement les couples d' amorces suivants : pkdelδ : 5' -GAAATCTCGAGCCACGGCGAAA-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 10) pkdel2 : 5' -ACGATTGCCGCGGTTCCATATTG-3' (Tm=54°C) ( SEQ I D NO : 11 ) et pkdel3: 5' -CATCCTGTTCCGCGGAACGCATGC-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 12) pkdel4: 5' -CAGCATGATGGAGATCTGAGGGC-3' (Tm=54°C) (SEQ ID NO : 13) Les conditions de PCR sont : 1 unité de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 2 mM MgCl2, 0,2 mM de dNTP et 0,5 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) . Le programme d'amplification est : 2 min à 94 °C, puis 35 cycles de 1 min à 94°C, 30 sec à 54°C, 1 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. Ces fragments sont insérés dans le plasmide pMCS5 (MOBITEC, Gôttingen, Allemagne) . Une cassette de résistance à la kanamycine est insérée entre ces deux fragments PCR pour donner le plasmide pCMS5::pics. Ce plasmide est transféré dans la souche C. glutami cum et les transformants sont sélectionnés sur un milieu gélose contenant de la kanamycine. La Figure 3A présente schématiquement la structure génétique du locus pksl3 dans la souche de type sauvage (WT) et dans la souche mutante Δpksl3 de C. glutami cum . Dans cette dernière, l'allele de type sauvage de pksl3 présent sur le chromosome est remplacé par un allèle muté contenant une délétion interne de 4,3 kb dans laquelle le gène km codant pour la kanamycine est inséré. Les boîtes indiquent les différents gènes du locus pksl 3. La localisation et le nom des amorces utilisées pour 1' analyse par PCR des souches mutantes sont indiqués par des têtes de flèche. Les produits d'amplification PCR attendus pour les différentes souches sont indiqués sous chaque structure génétique. Les transformants Δpksl3 dans lesquels le remplacement allélique est intervenu entre le gène pksl3 chromosomique de type sauvage et l'allele plasmidique muté présentent (1) un changement de morphologie des colonies passant d'un aspect brillant lisse à rugueux (2) une courbe de croissance considérablement diminuée (doublement du temps de division) par rapport au type sauvage (3) une thermosensibilité qui les rend incapables de croître à des températures supérieures à 30 °C contrairement au type sauvage qui produit des colonies sur milieu gélose jusqu'à
37 °C (4) une forte agrégation en culture liquide en absence de détergent. Ces transformants sont caractérisés par PCR en utilisant les amorces suivantes : fa2 : 5'-TCTGACCACCTTCCGTGAAGC-3' (Tm=55°C ou 62°C) (SEQ ID NO : 14) ac2 : 5' -GAACGAGTTCAGAGCTTC-3' (Tm=55°C ou 62 °C) (SEQ ID NO : 15)
K10 : 5'-TATTTCGAATGGTTCGCTGGGTTTATC-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 16)
K7 : 5'-TAAAAAGCTTATCGATACCG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO : 17) pkl : 5'-GCCGTGACGGTATCTCGG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO: 18) pk2 : 5'-CCAGGGCAGTTGCTTCAATG-3' (Tm=55°C) (SEQ ID NO: 19) La Figure 3B présente les résultats d'analyse par PCR du mutant Δpksl3 et de la souche de type sauvage
(WT) de C. glutami cum .
Souche mutante _pJcsl3:pCGL2308 de C. glutamicum Un plasmide de complémentation, pCGL2308, est produit par l'insertion dans le vecteur pCGL482 (PEYRET et al., Mol. Microbiol. 9 : 97-109, 1993) d'un fragment de 5,3 kb de C. glutamicum, comprenant le gène pksl3 et la région de 417 pb en amont de ce gène, obtenu par PCR à partir de l'ADN total de C. glutami cum en utilisant le couple d' amorces suivant : pk3 : 5'-TCCGGAAAGATCTCACGCCGCG-3' (Tm=62°C) ( SEQ I D NO : 20 ) pk4 : 5'-GCGTGCGCGCAGATCTGCTAGC-3' (Tm=62°C) (SEQ ID NO : 21) Le plasmide pCGL2308 résultant est transféré par électroporation dans la souche Δpksl3 de C. glutamicum et les transformants Δpksl3:pCGL2308 sont sélectionnés sur milieu gélose contenant de la kanamycine. Les transformants 4pJcs23:pCGL2308 présentent une morphologie brillante et lisse, une vitesse de croissance intermédiaire entre la souche sauvage et la souche mutante, une incapacité à pousser à des températures supérieures à 32 °C (alors que la souche sauvage pousse à 37 °C), ainsi qu'une teneur en acide mycolique beaucoup plus faible que celle de la souche sauvage. Il apparaît donc que la complémentation par le plasmide induit une réversion partielle vers le phénotype sauvage .
Construction d'un mutant conditionnel de M. sm.egma.tis Souche mutante PMM47 de M. smegmatis Deux fragments d'ADN d'environ 1 kb chevauchant le gène pkslS sur ses extrémités 5' et 3' sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN total de M. smegma tis en utilisant respectivement les couples d'amorces suivants :
13F : 5'-GCTCTAGAGTTTAAACGCTGGACCTGTCCAACGTCAAGG-3'
(SEQ ID NO : 22)
13G : 5'-GGACTAGTCGTCGAAACCGACCGTCACCAG-3'
(SEQ ID NO : 23) et
13H : 5'-GGACTAGTCGGCATCTTCAACGAGTTGC-3'
(SEQ ID NO : 24)
131 : 5'-CCCAAGCTTGTTTAAACTTGTCGAAGTGGTTCGACGG-3'
(SEQ ID NO : 25) Les conditions de PCR sont : 3 unités de polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , 1 mM de dNTP et 1 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France) . Le programme d'amplification est : 5 min à 94 °C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 3 min à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. Ces fragments sont insérés dans le plasmide pJQ200 (QUANDT et al., Gène 127 : 15-21, 1993). Une cassette de résistance à l' hygromycine est insérée entre ces deux fragments PCR pour donner le plasmide pDP28. Ce plasmide non réplicatif contenant le marqueur sacB et une copie de l'allele muté pksl3 : : hyg est transféré dans la souche M. smegma tis par électroporation et les transformants sont sélectionnés sur milieu gélose contenant de l' hygromycine . Les transformants ayant intégré le plasmide pDP28 par simple recombinaison entre les copies du type sauvage et muté du gène pksl3 sont caractérisés par PCR en utilisant les amorces suivantes : 13J : 5'-CTTCCACGACATGGTCTGAT-3' (SEQ ID NO : 26) 13K : 5'-CACGATCGAGTCGAGCTCGA-3' (SEQ ID NO : 27) Hl : 5'-AGCACCAGCGGTTCGCCGT-3' (SEQ ID NO : 28) H2 : 5'-TGCACGACTTCGAGGTGTTCG-3' (SEQ ID NO : 29) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , 1 mM de dNTP et 1 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS) . Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C, 2 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C.Une souche dénommée PMM47 de M. smegma tis est sélectionnée, dans laquelle le plasmide pDP28 s'est inséré au locus pksl3 par simple recombinaison. Des étalements à différentes températures (25°C, 32°C ou 37°C) d'une culture de PMM47, sur un milieu contenant 10% de sucrose et de l' hygromycine produit des clones avec une mutation dans le gène sacB mais aucun événement de seconde recombinaison pouvant produire une souche portant seulement l'allele muté pksl 3 : :hyg n'est sélectionné. Ce résultat indique que le gène pks! 3 est essentiel pour la croissance des mycobactéries. Afin de confirmer cette hypothèse, une seconde copie du gène pksl3 de type sauvage est transférée dans PMM47 clonée sur un vecteur mycobactérien thermosensible. Souche mutante thermosensible PMM48:pDP32 de M. smegmatis Pour produire le plasmide de complémentation pDP32, le gène pksl3 est amplifié par PCR à partir de l'ADN total de M. smegma tis en utilisant les amorces 13R 5'-ATGAGATCTGATGAAAACCACAGCGAT-3' (SEQ ID NO : 30) et 13P 5'-GGACTAGTCTTGGCGACGGCCTTCTCAC-3' (SEQ ID NO : 31). Les conditions de PCR sont : 3 unités d'ADN polymérase Pfu (PROMEGA, Lyon, France), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , 1 mM de DNTP, et 1 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (PROMEGA, Lyon, France). Le programme d'amplification est : 5 min à 94 °C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 58°C, 5 min à 72°C, puis 10 min à 72°C. Le gène pksl3 est inséré dans un plasmide mycobactérien thermosensible dérivé du plasmide pCG63 (GUILHOT et al., FEMS Microbiol. Letter 98 : 181-186, 1992) et contenant une cassette d'expression mycobactérienne, avec un promoteur mycobactérien, pBlaF*, en amont d'un site multiple de clonage lui-même en amont d'un terminateur de transcription (LE DANTEC et al., J. Bacteriol. 183 : 2157-2164, 2001). Le plasmide pDP32 résultant est transféré par électroporation dans la souche PMM47 de M. smegma tis et les transformants sont sélectionnés sur milieu gélose contenant de la kanamycine et de l' hygromycine . La seconde recombinaison au locus chromosomique pksl3 est sélectionnée par étalement d'une culture liquide de ces transformants à 30°C sur milieu gélose contenant de la kanamycine, de l' hygromycine et du sucrose à 30°C. Les colonies sont criblées par PCR en utilisant les amorces suivantes :
13J : 5'-CTTCCACGACATGGTCTGAT-3' (SEQ ID NO : 26) 13K : 5'-CACGATCGAGTCGAGCTCGA-3' (SEQ ID NO : 27) Hl : 5'-AGCACCAGCGGTTCGCCGT-3' (SEQ ID NO : 28) H2 : 5'-TGCACGACTTCGAGGTGTTCG-3' (SEQ ID NO : 29) Les conditions de PCR sont : 2,5 unités de Taq polymérase (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS), 10% de diméthyl sulfoxyde (Me2SO) , 1 mM de dNTP et 1 μM de chaque amorce dans un volume final de 50 μl, dans les conditions recommandées par le fournisseur (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS). Le programme d'amplification est : 5 min à 94°C, puis 30 cycles de 1 min à 94°C, 1 min à 62°C, 2 min 30 sec à 72°C, puis 1 cycle de 10 min à 72°C. La Figure 4A présente schématiquement la structure génétique du locus pksl3 obtenu au cours de la construction du mutant conditionnel PMM48:pDP32 de M. smegma tis . Les boîtes indiquent les différents gènes du locus pksl3. La localisation et le nom des amorces utilisées pour l'analyse par PCR des souches mutantes sont indiqués par des têtes de flèche. Les produits d' amplification PCR attendus pour les différentes souches sont indiqués sous chaque structure génétique. La Figure 4B présente les résultats d'analyse par PCR du mutant conditionnel PMM48:pDP32 de M. smegma tis et de ses souches parentales PMM47 et me2155 ( T) . En utilisant ces conditions, 8% des colonies sélectionnées HygR, KmR, SucR sont le résultat d'un échange allélique ; les autres clones étant le résultat d'une mutation du gène sa cB. La souche dénommée PMM48:pDP32, dans laquelle la copie chromosomique de type sauvage du gène pksl3 est remplacée par l'allele muté pks : :hyg et une copie du gène pksl3 fonctionnelle se trouve sur un plasmide thermosensible, est sélectionnée pour une analyse phénotypique . Les résultats sont représentés dans la Figure 4C. Légende de la Figure 4C : π = souche recombinante PMM48:pDP32 de M. smegma tis 4 = souche de type sauvage ( T) Des étalements de cette souche recombinante sur milieu gélose contenant de l' hygromycine à 32°C ou 42°C révèlent qu'elle est incapable de former des colonies à température élevée. En culture liquide à 32°C, cette souche croît aussi vite que la souche de type sauvage, une température permissive pour le plasmide pDP32. Cependant, lorsque la culture est placée à 42 °C, une température non permissive pour le plasmide pDP32, le nombre de bactéries viables augmente jusqu'au temps 12h à 24h post- inoculation, puis demeure stable au cours des 24 heures suivantes avant de décroître ; les seules bactéries viables sont celles qui ont conservé une copie du plasmide de complémentation. Ces résultats montrent que le gène pksl3 est essentiel pour la survie de M. smegmatis, comme attendu d' un gène codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques.
Analyse biochimique des mutants Δpksl3 de C grlufcamictim et PMM48:pDP32 de M. smegmatis Protocole d'analyse Les souches de C. glutami cum sont mises en culture jusqu'en phase exponentielle et marquées avec de l'acétate [14C] 0,5 μCi/ml (activité spécifique de 54 mCi/ mol ; ICN, Orsay, France) pendant 3h. Pour le radiomarquage du mutant conditionnel de M. smegma tis à température non permissive, PMM48:pDP32 et la souche de type sauvage mc2155 sont mises en culture à 30°C. Ces cultures sont ensuite diluées dans du milieu frais à une Dθ6oonm= 0,005 et incubées à 42°C jusqu'à une Dθ6oonm= 0,3. Les cellules sont ensuite marquées pendant 3h avec de l'acétate [14C] 0,5 μCi/ml. Les acides gras sont préparés à partir des cellules marquées et séparés par chromatographie sur couche mince sur Durasil 25 en utilisant du dichlorométhane ou un mélange éther/diéthyléther (9:1) comme éluant comme décrit dans LAVAL et al. (Anal. Chem. 73 : 4537-4544, 2001). Les composés marqués sont quantifiés sur un Phosphomalger (AMERSHAM BIOSCIENCES) . Pour les analyses par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une analyse par spectromètre de masse (GC-MS), des dérivés triméthylsilyl d'acides gras sont obtenus comme décrit dans CONSTANT et al. (J. Biol. Chem. 277 : 38148-38158, 2002) et analysés sur un spectromètre de masse Hewlett-Packard 5889 X (énergie d'électron, 70eV) travaillant en modes capture électronique (El) en utilisant du NH3 comme gaz de réaction (C1/NH3) , couplé avec un chromatographe en phase gazeuse Hewlett-Packard 5890 séries II associé à une colonne OV1 similaire (0,30 mm x 12 m) .
Résultats Mutants Δpksl3 et Δpksl3 : pCG 230Q de c- glutami cum La Figure 3C illustre le résultat de l'analyse des acides gras libérés après saponification à partir de la souche de type sauvage (WT) et des mutants Δpksl3 et Δpksl 3 : PCGL2308 de C. glutamicum . L'analyse par chromatographie sur couche mince de ces produits révèle que les spots correspondant aux acides mycoliques ou à la palmitone, un produit de dégradation de l'intermédiaire β- céto acyle résultant de la réaction de condensation, ne sont plus détectables chez les mutants. Cette observation est confirmée par l'analyse en GC-MS qui démontre que le mutant Δpksl3 de C. glutamicum ne synthétise plus d'acides mycoliques mais produit une quantité similaire d'acides gras C16-C18, le précurseur de mycolate, de celle de la souche de type sauvage (données non représentées). Cette production d'acides mycoliques est partiellement restaurée suite au transfert dans la souche mutante Δpksl3 d'un plasmide portant le gène pksl3 fonctionnel de C. glutamicum ; ce qui démontre que ces phénotypes sont effectivement dus à la délétion de pksl3. La restauration partielle suggère soit que l'expression de pksl3 par le plasmide n'est pas du même niveau que celle dans la souche de type sauvage, soit que l'insertion chromosomique de la cassette kanamycine exerce un effet polaire sur l'expression du gène accD4, ou les deux. En outre, dans les Mycolatas, les acides mycoliques sont supposés contribuer à la bicouche lipidique qui forme un homologue fonctionnel à la membrane externe des bactéries Gram-négative . Chez les corynébactéries et les mycobactéries, un plan de cryofracture se propage entre les deux couches de cette pseudo membrane externe. Comme attendu, la Figure 3D montre la perte de ce plan de fracture dans la souche mutant Δpksl3 de C. glutami cum alors qu'il est clairement visible dans la souche de type sauvage, ce qui suggère que la bicouche lipidique composée majoritairement d'acides mycoliques n'est plus présente dans le mutant. Ces résultats montrent que le mutant Δpksl3 de C. glutamicum est bien dépourvu d'une enzyme essentielle dans la biosynthèse les acides mycoliques.
Mutant PMM48:pDP32 de M. smegma tis La Figure 4D illustre le résultat de l'analyse des acides gras libérés après saponification à partir de la souche de type sauvage de M. smegma tis et du mutant conditionnel PMM48:pDP32, après croissance à température permissive (30°C) ou non permissive (42°C). Le rapport mycolates/acides gras à chaîne courte est quantifié pour le mutant PMM48:pDP32 et divisé par celui obtenu pour la souche de type sauvage cultivée dans les mêmes conditions. Le graphe montre qu'après transfert à 42 °C, le contenu moyen en mycolate dans le mutant PMM48:pDP32 est diminué de plus de 60%. Comme attendu, cette synthèse n'est pas complètement stoppée dans la culture du fait que la population bactérienne restante conservant le plasmide de complémentation non réplicatif produit des acides mycoliques . Ces résultats montrent que le gène pksl3 est impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques chez M. smegmatis .
EXEMPLE 4 : CRIBLAGE D'ANTIBIOTIQUES ACTIFS SUR LES MYCOLATAS
Criblage de xénobiotiques inhibant la condensation par la Pksl3, directement ou indirectement Comme illustré à la figure 5, la Pksl3 permet la condensation de deux substrats, qui résultent eux-mêmes de deux réactions indépendantes. L'absence d'acides mycoliques dans des mycolatas peut donc provenir de l'inhibition de la Pksl3 et/ou de l'inhibition de la FadD32, et/ou de l'inhibition du complexe carboxylase dans lequel intervient la protéine AccD4. Plusieurs tests permettent de cribler l'action d'un xenobiotique sur la synthèse des acides mycoliques par les mycolatas. Comme vu à l'exemple 3 ci-dessus, les transformants Δpksl3 dans lesquels le gène pksl3 a été inactivé présentent un changement de morphologie des colonies, qui passent d'un aspect brillant lisse à un aspect rugueux. Ceci est également le cas pour des bactéries C. glutamicum dans lesquelles le gène accD4 ou fadD32 est muté (voir la figure 6) . Un premier test pour déterminer l'impact d'un xenobiotique sur la synthèse des acides mycoliques consiste donc à étaler des mycolatas capables de survivre sans produire d'acides mycoliques, par exemple des bactéries C. glutamicum (par exemple, la souche ATCC13032), sur un milieu de culture gélose contenant le xenobiotique à tester. L'observation visuelle des colonies obtenues permet d'identifier les antibiotiques potentiels. Un autre test consiste à faire pousser des bactéries C. glutami cum en milieu liquide, tel que décrit ci-dessus, en . présence ou en absence du xenobiotique à tester. De l'acétate [14C] 0,5 μCi/ml (activité spécifique de 54 mCi/mmol ; ICN, Orsay, France) est ajouté pendant la phase exponentielle de croissance, pendant au moins 3 heures, avant de faire l'analyse biochimique des acides gras contenus dans les bactéries par chromatographie sur couche mince, comme décrit ci-dessus et dans Portevin et al, PNAS 2004, Vol.101, p314-319 (voir notamment le premier paragraphe de la page 316) . Comme illustré à la figure 3C, il est possible de détecter les acides mycoliques synthétisés par la souche cultivée en l'absence du xenobiotique (témoin) , ainsi que le palmitone, produit de dégradation résultant de la réaction de la condensation par la Pksl3. Une altération de la fonction de la Pksl3, et/ou de la FadD32, et/ou du complexe carboxylase, liée à la présence du xenobiotique, entraînera une diminution, voire une disparition, des bandes correspondant. Bien évidemment, un xenobiotique identifié selon un des deux tests décrits ci-dessus peut ensuite être testé pour son aptitude à inhiber la croissance des mycolatas incapables de survivre sans produire des acides mycoliques, telles que Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae .
Détermination de 1 ' étape de la synthèse des acides mycoliques effectivement inhibée par le xenobiotique Une deuxième étape d'analyse est nécessaire pour déterminer plus finement la cible d'un xenobiotique inhibant la synthèse des acides mycoliques, c'est-à dire pour déterminer s'il agit sur la Pksl3 ou sur une enzyme impliquée dans l'activation d'un de ses substrats. Ceci peut être effectué en analysant les acides gras présents dans les bactéries C. glutamicum cultivées en présence du xenobiotique (candidat antibiotique) , par exemple par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrométrie de masse (GC-MS). Pour cela, des esters méthylés d'acides gras peuvent être obtenus par saponification des cellules, suivie par une méthylation avec du diazométhane, comme cela est décrit par Laval et al (Annal. Chem., 2001, Vol. 73, p. 4537-4544) . Ils sont ensuite fractionnés sur colonne Florisil irriguée avec de 1 ' éther de pétrole contenant 0, 1, 2, 3 et 100% de diéthyléther . Les esters méthylés d'acides gras polaires sont contenus dans la dernière fraction éluée. Alternativement il est possible d'obtenir des dérivés triméthylsilylés par la méthode décrite par Constant et al (J. Biol. Chem. 2002, Vol. 277, p. 38148-38158) . Les analyses par chromatographie en phase gazeuse et par chromatographie en phase gazeuse suivie d'une spectrométrie de masse peuvent être effectuées comme décrit par Portevin et al (PNAS 2004, supra) . Ces analyses du contenu en acides gras des bactéries cultivées en présence et en absence du xenobiotique inhibant la synthèse des acides mycoliques permettent de déterminer si le xenobiotique agit sur la Pksl3ou la FadD32, ou sur 1 ' acyl carboxylase contenant AccD4. L'inhibition de la condensation par la Pksl3 ou de la formation d' acyl-AMP par FadD32 entraîne l'accumulation des intermédiaires résultant de la carboxylation par l'acyl-CoA carboxylase, tel que l'acide tétradécylmalonique . L'absence d'accumulation de ce composé indique que le xenobiotique agit sur la carboxylase contenant AccD4. Pour déterminer si le xenobiotique agit sur FadD32, un test peut être réalisé en purifiant la protéine FadD32 et en mesurant la formation d' acyl-AMP in vi tro, comme décrit par Trivedi et al,
(Nature 2004, Vol. 428, p. 441-445), en présence ou absence du xenobiotique. L'observation d'une absence de formation d' acyl-AMP en présence du xenobiotique indique qu'il agit sur FadD32. Le résultat contraire indique que le xenobiotique agit sur la Pksl3. Une bactérie dont le gène Pksl3 a été muté peut servir de contrôle pour vérifier l'accumulation de ces deux substrats. Pour cela, il est préférable d' inactiver le gène de la Pksl3 par une mutation ponctuelle ou une délétion, plutôt qu'en introduisant une séquence étrangère dans le gène pksl3, comme décrit ci- dessus. En effet, l'introduction de la cassette km dans le gène pksl3 est susceptible d'induire un défaut d'expression du gène accD4 dans le mutant décrit ci- dessus. La comparaison de spectres obtenus avec (i) des bactéries C. glutami cum cultivées en l'absence du xenobiotique, (ii) ces mêmes bactéries, cultivées en présence du xenobiotique, (iii) des bactéries C. glutamicum comportant une mutation non-sens dans le gène pksl3, et, le cas échéant, (iv) des bactéries C. glutamicum dont le gène accD4 ou le gène fadD32 a été muté, permet de déterminer si l'inhibition de la synthèse des acides mycoliques par le xenobiotique est liée à son action sur la Pksl3, ou sur une enzyme située en amont dans la biosynthèse des acides mycoliques.

Claims

REVENDICATIONS 1) Protéine purifiée, caractérisée en ce que : a) elle possède au moins 40% d'identité, sur la totalité de sa séquence, avec la protéine Pksl3 de M. tuberculosis ; b) elle possède un domaine acyl transférase (pfam00698), un domaine kétoacylsynthase (pfam02801 ou pfam00109) , au moins un domaine acyl carrier protein (COG0331 ou COG0304,), et un domaine thioestérase (COG3319 ou pfam00975) c) elle catalyse une condensation de Claisen ou malonique entre une molécule d' acyl-CoA ou d' acyl-AMP et une molécule d' acylmalonyl-CoA. 2) Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle catalyse une condensation de
Claisen ou malonique entre : a) une molécule d' acyl-CoA de formule I, ou une molécule d' acyl-AMP de formule Ibis : O O
R1\ /C\ R1\ , CH2 S- CoA (I) CH2 AMP (Ib-j_s\ dans laquelle Ri est une chaîne comprenant de 6 à 68 atomes de carbone, pouvant comporter une ou plusieurs doubles liaisons C=C, et/ou un ou plusieurs cycles cis/tra/s-cyclopropane, et/ou un ou plusieurs groupes CH3 o
—CH-0—C— et/ou pouvant porter un ou plusieurs groupes latéraux choisis parmi -CH3, =0, -0-CH3 ; et b) une molécule d' acylmalonyl-CoA de formule II : dans laquelle R2 est un alcane linéaire comprenant de 10 à 24 atomes de carbone ; pour former un intermédiaire β-céto acyle de formule III, ou un β-céto ester de formule Illbis :
(iiibis; dans laquelle Ri et R2 sont tels que définis ci-dessus, et Xi est une molécule acceptrice. 3) Protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle présente au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 de Mycobacterium tuberculosis . 4) Protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle présente au moins 70% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 2 de Corynebacterium glutami cum . 5) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu' il comprend une séquence polynucléotidique codant pour une protéine selon une quelconque des revendications 1 à 4. 6) Cellule-hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression selon la revendication 5. 7) Cellule-hôte selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule procaryote. 8) Procédé d'obtention d'une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu' il comprend : la mise en culture d'une cellule hôte selon une quelconque des revendications 6 ou 7 ; et la purification de ladite protéine à partir de ladite culture. 9) Procédé pour inhiber la biosynthèse de l'enveloppe des mycolatas, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition, chez lesdites bactéries, de l'expression ou de l'activité d'une protéine selon une quelconque des revendications 1 à 4. 10) Utilisation d'une protéine selon une quelconque des revendications 1 à 4, pour le criblage d'antibiotiques actifs sur les mycolatas. 11) Utilisation selon la revendication 10, pour le criblage d' antibiotiques actifs sur les mycobactéries .
EP04787312A 2003-09-04 2004-09-06 Utilisation de la proteine pks 13 codant pour la condensase d' acides mycoliques des mycobacteries et genres apparentes comme cible d' antibiotiques. Ceased EP1668123A1 (fr)

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