EP1664886A1 - Multiphoton fluorescence microscope with plane array detector - Google Patents

Multiphoton fluorescence microscope with plane array detector

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Publication number
EP1664886A1
EP1664886A1 EP04765183A EP04765183A EP1664886A1 EP 1664886 A1 EP1664886 A1 EP 1664886A1 EP 04765183 A EP04765183 A EP 04765183A EP 04765183 A EP04765183 A EP 04765183A EP 1664886 A1 EP1664886 A1 EP 1664886A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
radiation
sample
excitation
detector
lurninescence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04765183A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Dan Davidovici
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jenoptik AG
Original Assignee
Carl Zeiss Jena GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Jena GmbH filed Critical Carl Zeiss Jena GmbH
Publication of EP1664886A1 publication Critical patent/EP1664886A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00Microscopes
    • G02B21/16Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00Microscopes
    • G02B21/36Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements

Definitions

  • the invention relates to a multi-photon luminescence microscope with an excitation beam path that has an objective that bundles excitation radiation in a focal point in the sample, a scanning device that adjusts the focal point at least one-dimensionally, and a detector device that in the sample luminescent radiation stimulated by multi-photon excitation.
  • the invention further relates to a method for multi-photon luminescence microscopy, in which excitation radiation is concentrated in a focus point lying in a sample, thereby stimulating luminescence radiation in the sample by multi-phone excitation, the focus point is adjusted for scanning the sample and the Luminescence radiation is detected.
  • a bundled excitation radiation usually laser radiation, which is matched to maximum luminescence, is usually used for this purpose.
  • the excitation takes place in the focus area, luminescence also being stimulated in the incident or emerging light cone of the focused beam.
  • the luminescence radiation is recorded by confocal detection only from the area of the focus of the excitation radiation. An image is created by scanning a sample.
  • the excitation radiation is selected spectrally in such a way that at least two photons are required to effect an excitation. Since the probability of excitation is thus greatly reduced, effective excitation can only take place at a very high flux density, which is only given exactly in the focus of the bundled excitation radiation. Therefore, emission of luminescence or fluorescence radiation is only stimulated at the focal point.
  • the confocal detection required in conventional luminescence microscopy can be dispensed with, since it is not necessary to emit lurninescence radiation that was emitted outside the focus of the excitation radiation. Multi-photoneh luminescence microscopy works with it without confocal stray light suppression during detection.
  • the detectors used are called direct detectors.
  • the document http: Wmicroscopy.bio- rad.com/faqs/multophotone/faqs2.htm available on the Internet proposes as a direct detector a photomultiplier unit that is also customary for confocal microscopy, which is coupled into the excitation beam path via a chromatic beam splitter and absorbs fluorescent radiation, which runs in the opposite direction to the radiation of the excitation radiation.
  • a corresponding converging lens is connected upstream of the photomultiplier tube used in the unit, which together with an objective lens present in the excitation beam path completely images the sample field onto the relatively small window of the highly sensitive photomultiplier tube.
  • the invention has for its object to develop a multi-photon luminescence microscope of the type mentioned and a corresponding method for multi-photon luminescence microscopy so that radiation detection is possible with reduced effort.
  • This object is achieved with a microscope of the type mentioned at the outset, in which the detector device has an area detector which is located on the side of the sample opposite the objective.
  • the object is further achieved by a method of the type mentioned at the outset, in which the luminescent radiation is areally detected on the side opposite the radiation of the excitation radiation.
  • a so-called “direct” detector is used, which is now designed as an area detector that is located on the side of the sample opposite the objective.
  • Area detector is understood to mean any detector whose detector area is larger than the light path to the sample in The arrangement of such an area detector in the transmit mode makes it possible, on the one hand, to dispense with chromatic beam splitters which reduce the intensity, and on the other hand, the area detector can be arranged at an extremely short distance from the sample, so that it has a large clearing angle with respect to the Covers the sample of lurninescence radiation
  • Area detector used in transmisive operation receives much more luminescence radiation intensity and thus achieves a better signal / noise ratio; this is particularly so because there are no losses through intermediary optics, such as imaging optics or dichroic beam splitters, which are also used for irradiation of the excitation radiation. The detection of the lurninescence radiation no longer has to take place through the objective of the excitation beam path.
  • the area detector In order to cover the largest possible solid angle, it is advantageous for the area detector to be at a distance from the focal point that is very much smaller than the extent of the area detector, for example only one tenth of it.
  • the optical element can be designed as a grating, preferably as a holographic grating.
  • such an optical element can also be attached directly to the underside of a sample carrier that is used in the luminescence microscope.
  • luminescence microscopy it is possible to identify biological samples on the basis of their own luminescence spectrum. This procedure is also possible in the luminescence microscope according to the invention if a spatially resolving surface detector is used and a spectral analyzer is connected between the surface detector and the sample, which spectrally decomposes the radiation emanating from the sample.
  • the grating already mentioned is arranged between the sample and the area detector for spectral decomposition.
  • the grating or the area detector is coupled with a suitable mechanism which carries out a one- or two-dimensional transverse displacement (in relation to the areal formation of the specimen to be examined).
  • Fig. 1 is a schematic representation of a section of a microscope for multi-photon fluorescence microscopy
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the laser beam which excites a multi-photon fluorescence.
  • a microscope M is shown schematically, which allows multi-photon fluorescence or luminescence microscopy. 1 shows only the area of the microscope in which the sample is located.
  • the microscope M has a beam source (not shown) which emits a laser beam 1 with a wavelength around 700 nm.
  • the laser beam 1 passes through an objective 2, which emits a focused beam 3.
  • the focus 4 lies in a sample 5, which is located under the lens 2 behind a cover glass 6 on a sample holder 7.
  • the laser beam 1 focused in this way in the sample 5, as shown in FIG. 2, causes a multi-photon excitation in the sample 5.
  • Either an inherent fluorescence of the biological material of the sample 5 or a fluorescence specifically provided in the sample 5 can be provided Fluorophores are stimulated.
  • the laser beam 1, which is focused in a beam waist T by the objective 2, which is only shown schematically in FIG. 2, only reaches a beam density in the area of the focus 4, which is sufficient to excite multi-photon fluorescence. No more photon fluorescence can be excited with sufficient probability outside the beam waist T. Therefore, fluorescence radiation only arises in the area of focus 4. No fluorescence occurs at other points in the focused beam 3.
  • a grating 8 is arranged under the sample carrier 7, which redirects radiation emanating within a beam cone K to a CCD sensor 9 in such a way that the radiation falls as perpendicularly as possible onto the sensor 9 ,
  • the optional grating is located at a very small distance d below the focus 4, so that in combination with the comparatively large extent of the in FIG. 1 only as The sectional view shown sensor 9 covers a very large solid angle based on the focus 4.
  • the unit comprising the grating 8 and the sensor 9, which embodies the area detector, collects almost all fluorescence radiation emitted in a half space. This greatly improves the signal-to-noise ratio.
  • the CCD sensor 9 which in the present example is designed as a back-illuminated CCD sensor, supplies the corresponding image information to a control device 10. This carries out the signal evaluation.
  • the reading of the sensor 9 can be limited to periods in which no excitation radiation 1 is emitted. It is also possible to hide the relatively small area of the area detector in which excitation radiation falls on the sensor 9. Either a spatially resolving detector can be used for this, which is not read out in the area concerned, or sensor 9 becomes a suitable one
  • a filter for excitation radiation is attached to the underside of the sample carrier 7 and / or to the grating 8. It is an infrared cut filter that blocks at 700 nm.
  • the control device 10 reads out the (location-detecting) sensor 9 in a suitable manner and identifies a sample 5 on the basis of its own fluorescence spectrum.
  • the spectral activity of the grating 8 also opens up an additional spectral possibility of masking the excitation radiation 1, since it differs significantly from the fluorescence radiation. As a rule, the grating 8 will generate an interference pattern on the sensor 9.
  • control device 10 effects a relative shift of the grating 8 and the sensor 9, so that the interference pattern, which indicates the spectral composition of the fluorescent radiation entering the beam cone K (optionally together with excitation radiation 1), changes.
  • the change then enables the control unit 10 to make a statement about the spectral composition of the fluorescent radiation from the focus 4 using known algorithms.
  • the distance d should of course be as small as possible.
  • the grid 8 is therefore attached directly to the underside of the sample carrier 7. Without the grating 8, the distance d (now between the focus 4 and the sensor 9) should be minimized by the sensor being as close as possible to the sample carrier 7.

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Abstract

A multiphoton fluorescence microscope (M) is disclosed, comprising an excitation beam path, with a lens (2) which collects the excitation beam (1) at a focal point (4) in the sample (5), a scan device, which adjusts the focal point (4) at least one-dimensionally, and a detector device which records fluorescence radiation stimulated in the sample by multiphoton excitation, whereby the detector device comprises a plane array detector (9), located on the opposite side of the sample (5) to the lens (2).

Description

MEHR-PHOTONEN-FLUORESZENZMIKROSKOP MIT FLÄCHENDETEKTOR MULTI-PHOTON FLUORESCENCE MICROSCOPE WITH SURFACE DETECTOR
Die Erfindung bezieht sich auf ein Mehr-Photbnen-Lumineszenzmikrpskop mit einem Anregungsstrahlengang, der ein Objektiv aufweist, das Anregungsstrahlung in einem Fokuspunkt in der Probe bündelt, einer Scan-Einrichtung, die den Fokuspunkt zumindest eindimensional verstellt, und einer Detektoreinrichtung, die in der Probe durch Mehr-Photonen- Anregung stimulierte Lumineszenzstrahlung aufnimmt. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur Mehr-Photonen-Lumineszenzmikroskopie, bei dem Anregungsstrahlung in einem in einer Probe liegenden Fokuspunkt gebündelt, dadurch in der Probe durch Mehr-Phόtonen- Anregung Lumineszenzstrahlung stimuliert wird, der Fokuspunkt zum Abscannen der Probe verstellt und die Lumineszenzstrahlung detektiert wird.The invention relates to a multi-photon luminescence microscope with an excitation beam path that has an objective that bundles excitation radiation in a focal point in the sample, a scanning device that adjusts the focal point at least one-dimensionally, and a detector device that in the sample luminescent radiation stimulated by multi-photon excitation. The invention further relates to a method for multi-photon luminescence microscopy, in which excitation radiation is concentrated in a focus point lying in a sample, thereby stimulating luminescence radiation in the sample by multi-phone excitation, the focus point is adjusted for scanning the sample and the Luminescence radiation is detected.
Bei herkömmlicher Lumineszenzmikroskopie werden Fluorophore oderIn conventional luminescence microscopy, fluorophores or
Eigenlumineszenzeffekte in einer Probe angeregt. Dazu wird üblicherweise eine gebündelte, auf maximale Lumineszenz abgestimmte Anregungsstrahlung, meist Laserstrahlung, verwendet. Die Anregung erfolgt dabei im Fokusbereich, wobei auch im einfallenden bzw. ausfallenden Lichtkegel des fokussierten Strahlenbündels Lumineszenz stimuliert wird. Zur Bilderzeugung wird die Lumineszenzstrahlung durch eine konfokale Detektion nur aus dem Bereich des Fokus der Anregungsstrahlung aufgenommen. Durch Abrastern einer Probe entsteht ein Bild.Self-luminescent effects stimulated in a sample. A bundled excitation radiation, usually laser radiation, which is matched to maximum luminescence, is usually used for this purpose. The excitation takes place in the focus area, luminescence also being stimulated in the incident or emerging light cone of the focused beam. For image generation, the luminescence radiation is recorded by confocal detection only from the area of the focus of the excitation radiation. An image is created by scanning a sample.
Bei Mehr-Photonen-Lumineszenzmikroskopie wird die Anregungsstrahlung spektral so gewählt, daß mindestens zwei Photonen nötig sind, um eine Anregung zu bewirken. Da die Anregungswahrscheϊnlichkeit damit stark vermindert ist, kann eine effektive Anregung nur bei einer sehr hohen Flußdichte erfolgen, die nur exakt im Fokus der gebündelten Anregungsstrahlung gegeben ist. Deshalb wird nur im Fokuspunkt eine Emission von Lumineszenz- oder Fluoreszenzstrahlung angeregt. Die bei herkömmlicher Lumineszenzmikroskopie erforderliche konfokale Detektion kann entfallen, da eine Ausblehdung von Lurnineszenzstrahlung, die außerhalb des Fokus der Anregungsstrahlung emittiert wurde, nicht nötig ist. Die Mehr-Photoneh-Lumineszenz ikroskopie arbeitet damit ohne konfokale Streulichtunterdrückung bei der Detektion. Die verwendeten Detektoren werden als direkte Detektoren bezeichnet. Es wird diesbezüglich auf die Mikroskope der BIO-RAD Microscience, USA, verwiesen. Das im Internet verfügbare Dokument http:Wmicroscopy.bio- rad.com/faqs/multophotone/faqs2.htm schlägt als direkten Detektor eine auch für die konfokale Mikroskopie übliche Photomultipliereinheit vor, die über einen chromatischen Strahlteiler in den Anregungsstrahlengang eingekoppelt ist und Fluoreszenzstrahlung aufnimmt, die in zur Einstrahlung der Anregungsstrahlung entgegengesetzter Richtung zurückläuft. Der in der Einheit verwendeten Photomultiplierröhre ist eine entsprechende Sammellinse vorgeschaltet, die zusammen mit einer im Anregungsstrahlengang vorhandenen Objektivlinse das Probenfeld auf das relativ kleine Fenster der hochempfindlichen Photomultiplierröhre vollständig abbildet. Da dies für die gesamte Abtastung der Probe erfolgen muß, ist dabei ein gewisser optischer Aufwand unvermeidlich, insbesondere da die zur Abbildung verwendete Objektivlinse auch Teil der Fokussierung des die Mehr-Photonen-Fluoreszenz anregenden Laserstrahls ist. W. Denk et al., „Twö-photon melecular excitation in laser scanning microscopy" in „Handbook of Biological Confoeal Microscopy", Plenum Press, New York, 1995 offenbart, eine Photomultiplierröhre im Druchlichtbetrieb zu verwenden. Auch die 1998 eingereichte DE 198 01 139 sieht dies vor, wobei zusätzlich noch ein Kondensor zum Einsatz kommt, wie er bei BIO-RAD im Auflichtbetrieb verwendet wird.In multi-photon luminescence microscopy, the excitation radiation is selected spectrally in such a way that at least two photons are required to effect an excitation. Since the probability of excitation is thus greatly reduced, effective excitation can only take place at a very high flux density, which is only given exactly in the focus of the bundled excitation radiation. Therefore, emission of luminescence or fluorescence radiation is only stimulated at the focal point. The confocal detection required in conventional luminescence microscopy can be dispensed with, since it is not necessary to emit lurninescence radiation that was emitted outside the focus of the excitation radiation. Multi-photoneh luminescence microscopy works with it without confocal stray light suppression during detection. The detectors used are called direct detectors. In this regard, reference is made to the microscopes from BIO-RAD Microscience, USA. The document http: Wmicroscopy.bio- rad.com/faqs/multophotone/faqs2.htm available on the Internet proposes as a direct detector a photomultiplier unit that is also customary for confocal microscopy, which is coupled into the excitation beam path via a chromatic beam splitter and absorbs fluorescent radiation, which runs in the opposite direction to the radiation of the excitation radiation. A corresponding converging lens is connected upstream of the photomultiplier tube used in the unit, which together with an objective lens present in the excitation beam path completely images the sample field onto the relatively small window of the highly sensitive photomultiplier tube. Since this must be done for the entire scanning of the sample, a certain amount of optical effort is inevitable, especially since the objective lens used for imaging is also part of the focusing of the laser beam that excites the multi-photon fluorescence. W. Denk et al., "Twö-photon melecular excitation in laser scanning microscopy" in "Handbook of Biological Confoeal Microscopy", Plenum Press, New York, 1995, disclosed using a photomultiplier tube in transmitted light mode. DE 198 01 139, which was submitted in 1998, also provides for this, in addition to which a condenser is used, as is used in BIO-RAD in reflected light mode.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mehr-Photonen-Lumineszenzmikroskop der eingangs genannten Art sowie ein entsprechendes Verfahren zur Mehr-Photonen- Lumineszenzmikroskopie so weiterzubilden, daß die Strahlungsdetektion mit verringertem Aufwand möglich ist.The invention has for its object to develop a multi-photon luminescence microscope of the type mentioned and a corresponding method for multi-photon luminescence microscopy so that radiation detection is possible with reduced effort.
Diese Aufgabe wird mit einem Mikroskop der eingangs genannten Art gelöst, bei dem die Detektoreinrichtung einen Flächendetektor aufweist, der sich auf der dem Objektiv gegenüberliegenden Seite der Probe befindet. Die Aufgabe wird weiter gelöst durch ein Verfahren der eingangs genannten Art, bei dem die Lurnineszenzstrahlung auf der der Einstrahlung der Anregungsstrahlung gegenüberliegenden Seite flächenhaft detektiert wird.This object is achieved with a microscope of the type mentioned at the outset, in which the detector device has an area detector which is located on the side of the sample opposite the objective. The object is further achieved by a method of the type mentioned at the outset, in which the luminescent radiation is areally detected on the side opposite the radiation of the excitation radiation.
Erfindungsgemäß wird also ein sogenannter „direkter" Detektor verwendet, der nun als Flächendetektor ausgebildet ist, der sich auf der dem Objektiv gegenüberliegenden Seite der Probe befindet. Unter Flächendetektor wird dabei jeder Detektor verstanden, dessen Detektorfläche größer ist, als der Lichtweg zur Probe, in der die Lurnineszenzstrahlung entsteht. Durch die Anordnung eines solchen Flächendetektors im transmitiven Betrieb ist es zum einen möglich, auf intensitätsmindemde chromatische Strahlteiler zu verzichten. Zum andern kann der Flächendetektor mit äußerst geringem Abstand zur Probe angeordnet werden, so daß er einen großen Räumwinkel bezüglich in der Probe entstandener Lurnineszenzstrahlung abdeckt. Der im transmisiven Betrieb verwendete Flächendetektor empfängt sehr viel mehr Lumineszenz- Strahlungsintensität und erzielt damit ein besseres Signal/Rauschverhältnis; dies insbesondere auch, weil keine Verluste durch zwischengeschaltete, auch zur Einstrahlung der Anregungsstrahlung verwendete Optiken, wie Abbildungsoptiken oder dichroitische Strahlteiler, erfolgen. Die Detektion der Lurnineszenzstrahlung muß nicht mehr durch das Objektiv des Anregungsstrahlengangs erfolgen.According to the invention, a so-called “direct” detector is used, which is now designed as an area detector that is located on the side of the sample opposite the objective. Area detector is understood to mean any detector whose detector area is larger than the light path to the sample in The arrangement of such an area detector in the transmit mode makes it possible, on the one hand, to dispense with chromatic beam splitters which reduce the intensity, and on the other hand, the area detector can be arranged at an extremely short distance from the sample, so that it has a large clearing angle with respect to the Covers the sample of lurninescence radiation Area detector used in transmisive operation receives much more luminescence radiation intensity and thus achieves a better signal / noise ratio; this is particularly so because there are no losses through intermediary optics, such as imaging optics or dichroic beam splitters, which are also used for irradiation of the excitation radiation. The detection of the lurninescence radiation no longer has to take place through the objective of the excitation beam path.
Um einen möglichst großen Raumwinkel abzudecken, ist es vorteilhaft, daß der Flächendetektor in einem Abstand zum Fokuspunkt liegt, der sehr viel kleiner als die Ausdehnung des Flächendetektors ist, beispielsweise nur ein Zehntel davon beträgt.In order to cover the largest possible solid angle, it is advantageous for the area detector to be at a distance from the focal point that is very much smaller than the extent of the area detector, for example only one tenth of it.
Bei vielen Detektoren mit einem flächig ausgedehnten Detektionsbereich ist es vorteilhaft, die Strahlung möglichst senkrecht zum flächenhaften Detektionsbereich einfallen zu lassen, da dann die Nachweiswahrscheinlichkeit maximal ist. Es ist deshalb zur Signalhomogenisierung bevorzugt, zwischen Flächendetektor und Probe ein optisches Element anzuordnen, das in der Probe entstehende Lurnineszenzstrahlung auf den Flächendetektor richtet. Es dient insbesondere nicht zur Einbringung der Anregungsstrahlung. Das optische Element kann in einer besonders einfachen Ausführungsform als Gitter ausgebildet werden, vorzugsweise als holographisches Gitter.In the case of many detectors with a large detection area, it is advantageous to let the radiation fall as perpendicularly as possible to the flat detection area, since the detection probability is then maximum. For signal homogenization, it is therefore preferred to arrange an optical element between the surface detector and the sample, which directs lurninescence radiation which arises in the sample onto the surface detector. In particular, it is not used to introduce the excitation radiation. In a particularly simple embodiment, the optical element can be designed as a grating, preferably as a holographic grating.
In einer besonders einfach zu realisierenden Bauweise kann ein solches optisches Element auch direkt auf der Unterseite eines Probenträgers, der im Lumineszenz-Mikroskop verwendet wird, angebracht werden.In a construction that is particularly easy to implement, such an optical element can also be attached directly to the underside of a sample carrier that is used in the luminescence microscope.
Bei der Lumineszenzmikroskopie ist es möglich, biologische Proben anhand ihres Eigenlumineszenzspektrums zu identifizieren. Auch dieses Vorgehen ist im erfindungsgemäßen Lumineszenzmikroskop möglich, wenn ein ortsauflösender Flächendetektor verwendet und zwischen Flächendetektor und Probe ein Spektralanalysator geschaltet wird, der von der Probe ausgehende Strahlung spektral zerlegt. In einer sehr einfachen Gestaltung wird zur spektralen Zerlegung das bereits erwähnte Gitter zwischen Probe und Flächendetektor angeordnet. Das Gitter oder der Flächendetektor ist dazu mit einer geeigneten Mechanik gekoppelt, die eine ein- oder zweidimensionale Querverschiebung (bezögen auf die flächenhafte Ausbildung des zu untersuchenden Präparats) vornimmt. Ein Verschieben des Gitters oder des Flächendetektors bewirkt eine Verschiebung des vom Eigenlumineszenzspektrum abhängigen Interferenzmusters und erlaubt so eine Probenidentifikatiön. Alternativ oder zusätzlich kann das Signal/Rauschverhältnis gesteigert werden, wenn eine bekannte spektrale Verteilung gesucht wird. Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:With luminescence microscopy it is possible to identify biological samples on the basis of their own luminescence spectrum. This procedure is also possible in the luminescence microscope according to the invention if a spatially resolving surface detector is used and a spectral analyzer is connected between the surface detector and the sample, which spectrally decomposes the radiation emanating from the sample. In a very simple design, the grating already mentioned is arranged between the sample and the area detector for spectral decomposition. For this purpose, the grating or the area detector is coupled with a suitable mechanism which carries out a one- or two-dimensional transverse displacement (in relation to the areal formation of the specimen to be examined). Moving the grating or the surface detector causes a shift in the interference pattern, which is dependent on the intrinsic luminescence spectrum, and thus permits sample identification. Alternatively or additionally, the signal / noise ratio can be increased if a known spectral distribution is sought. The invention is explained in more detail below by way of example with reference to the drawings. In the drawings:
Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines Mikroskops zur Mehr-Photonen- Fluoreszenzmikroskopie undFig. 1 is a schematic representation of a section of a microscope for multi-photon fluorescence microscopy and
Fig. 2 eine schematische Darstellung des eine Mehr-Photonen-Fluoreszenz anregenden Laserstrahls.2 shows a schematic representation of the laser beam which excites a multi-photon fluorescence.
In Fig. 1 ist schematisch ein Mikroskop M dargestellt, das Mehr-Photonen-Fluoreszenz- oder Lumineszenzmikroskopie erlaubt. Dabei ist in Fig. 1 nur der Bereich des Mikroskops, in dem sich die Probe befindet, dargestellt.In Fig. 1, a microscope M is shown schematically, which allows multi-photon fluorescence or luminescence microscopy. 1 shows only the area of the microscope in which the sample is located.
Das Mikroskop M weist eine (nicht dargestellte) Strahlquelle auf, die einen Laserstrahl 1 mit einer Wellenlänge um 700 nm abgibt. Der Laserstrahl 1 fällt durch ein Objektiv 2, das einen fokussierten Strahl 3 abgibt. Der Fokus 4 liegt dabei in einer Probe 5, die sich unter dem Objektiv 2 hinter einem Deckglas 6 auf einem Probenträger 7 befindet.The microscope M has a beam source (not shown) which emits a laser beam 1 with a wavelength around 700 nm. The laser beam 1 passes through an objective 2, which emits a focused beam 3. The focus 4 lies in a sample 5, which is located under the lens 2 behind a cover glass 6 on a sample holder 7.
Der derart in die Probe 5 fokussierte Laserstrahl 1 bewirkt, wie in Fig. 2 dargestellt ist, eine Mehr-Photonen-Anregung in der Probe 5. Dabei kann entweder eine Eigenfluoreszeπz des biologischen Materials der Probe 5 oder eine Fluoreszenz speziell in der Probe 5 vorgesehener Fluorophore angeregt werden. Der durch das in Fig. 2 nur schematisch gezeichnete Objektiv 2 in einer Strahltaille T fokussierte Laserstrahl 1 erreicht lediglich im Bereich des Fokus 4 eine Strahldichte, die zur Anregung von Mehr-Photonen-Fluoreszenz ausreicht. Außerhalb der Strahltaille T kann keine Mehr-Photonen-Fluoreszenz mit ausreichender Wahrscheinlichkeit angeregt werden. Es entsteht deshalb lediglich im Bereich des Fokus 4 Fluoreszenzstrahlung. An anderen Stellen im fokussierten Strahl 3 tritt keine Fluoreszenz auf.The laser beam 1 focused in this way in the sample 5, as shown in FIG. 2, causes a multi-photon excitation in the sample 5. Either an inherent fluorescence of the biological material of the sample 5 or a fluorescence specifically provided in the sample 5 can be provided Fluorophores are stimulated. The laser beam 1, which is focused in a beam waist T by the objective 2, which is only shown schematically in FIG. 2, only reaches a beam density in the area of the focus 4, which is sufficient to excite multi-photon fluorescence. No more photon fluorescence can be excited with sufficient probability outside the beam waist T. Therefore, fluorescence radiation only arises in the area of focus 4. No fluorescence occurs at other points in the focused beam 3.
Beim Mikroskop M kann also davon ausgegangen werden, daß Fluoreszenzstrahlung ausschließlich aus dem Fokus 4 stammt. Eine ortsauflösende Detektion der Fluoreszenzstrahlung ist deshalb nicht erforderlich. Um die homogen im Fokus 4 abgestrahlte Fluoreszenzstrahlung möglichst vollständig aufnehmen zu können, ist unter dem Probenträger 7 ein Gitter 8 angeordnet, das innerhalb eines Strahlkegels K ausgehende Strahlung so auf einen CCD-Sensor 9 umleitet, daß die Strahlung möglichst senkrecht auf den Sensor 9 fällt.With microscope M it can therefore be assumed that fluorescence radiation originates exclusively from focus 4. A spatially resolving detection of the fluorescent radiation is therefore not necessary. In order to be able to absorb the fluorescence radiation emitted homogeneously in the focus 4 as completely as possible, a grating 8 is arranged under the sample carrier 7, which redirects radiation emanating within a beam cone K to a CCD sensor 9 in such a way that the radiation falls as perpendicularly as possible onto the sensor 9 ,
Das optionale Gitter befindet sich in einem sehr geringen Abstand d unterhalb des Fokus 4, so daß in Kombination mit der vergleichsweise großen Ausdehnung des in der Fig. 1 nur als Schnittdarstellung dargestellten Sensors 9 ein sehr großer Raumwinkel bezogen auf den Fokus 4 abdeckt, ist.The optional grating is located at a very small distance d below the focus 4, so that in combination with the comparatively large extent of the in FIG. 1 only as The sectional view shown sensor 9 covers a very large solid angle based on the focus 4.
Da die Darstellung in Fig. 1 bezüglich der Dicken der Probe 5, des Probenträgers 7 und des Gitters 8, insbesondere. bezüglich des Abstandes d, nicht maßgeblich, sondern stark vergrößert ist, sammelt die den Flächendetektor verkörpernde Einheit aus Gitter 8 und Sensor 9 nahezu alle in einen Halbraum emittierte Fluoreszenzstrahlung auf. Das Signal/Rausch-Verhältnis ist dadurch stark verbessert.Since the representation in Fig. 1 with respect to the thicknesses of the sample 5, the sample carrier 7 and the grid 8, in particular. With regard to the distance d, which is not significant, but is greatly enlarged, the unit comprising the grating 8 and the sensor 9, which embodies the area detector, collects almost all fluorescence radiation emitted in a half space. This greatly improves the signal-to-noise ratio.
Der CCD-Sensor 9, der im vorliegenden Beispiel als back illuminated CCD-Sensor ausgebildet ist, liefert die entsprechende Bildinformation an ein Steuergerät 10. Dieses führt die Signalauswertung durch.The CCD sensor 9, which in the present example is designed as a back-illuminated CCD sensor, supplies the corresponding image information to a control device 10. This carries out the signal evaluation.
Zur Ausblendung der auch auf die Detektoreinheit gerichteten Anregungsstrahlung 1 können verschiedene Ansätze verwendet werden. Zum einen kann ein Sensor 9 zum Einsatz kommen, der bezüglich der Anregungsstrahlung nicht empfindlich ist. Zum andern kann bei derVarious approaches can be used to mask out the excitation radiation 1 which is also directed onto the detector unit. On the one hand, a sensor 9 can be used which is not sensitive to the excitation radiation. On the other hand, with the
Verwendung einer gepulsten Anregungsstfahlung die Auslesung des Sensors 9 auf Zeiträume beschränkt werden, in denen keine Anregungsstrahlung 1 emittiert wird. Auch ist es möglich, den relativ kleinen Bereich des flächenhaften Detektors, in dem Anregungsstrahlung auf den Sensor 9 fällt, auszublenden. Dazu kann entweder ein ortsauflösender Detektor dienen, der im betroffenen Bereich nicht ausgelesen wird, oder es wird dem Sensor 9 eine geeigneteUsing a pulsed excitation radiation, the reading of the sensor 9 can be limited to periods in which no excitation radiation 1 is emitted. It is also possible to hide the relatively small area of the area detector in which excitation radiation falls on the sensor 9. Either a spatially resolving detector can be used for this, which is not read out in the area concerned, or sensor 9 becomes a suitable one
(gegebenenfalls verstellbare) Blendeneinrichtung vorgeschaltet. Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung eines geeigneten Filters oder dichroitischen Reflektors dar, der die(if necessary adjustable) aperture device upstream. Another possibility is the use of a suitable filter or dichroic reflector that the
Anregungsstrahlung vom Detektor fernhält. Diese Möglichkeiten zum Unterdrücken der Anregungsstrahlung durch zeitliches oder örtliches Ausblenden können natürlich allein oder in beliebiger Kombination zum Einsatz kommen.Keeps excitation radiation away from the detector. These options for suppressing the excitation radiation by temporally or locally blanking out can of course be used alone or in any combination.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel ist an der Unterseite des Probenträgers 7 und/oder am Gitter 8 ein Filter für Aήregungsstrahlung angebracht. Es handelt sich dabei um ein Infrarotsperrfilter, das bei 700 nm sperrt.In the present exemplary embodiment, a filter for excitation radiation is attached to the underside of the sample carrier 7 and / or to the grating 8. It is an infrared cut filter that blocks at 700 nm.
Eine weitere Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses bzw. eine weitere Informationsgewinnung ist möglich, wenn das Gitter 8 eine spektrale Zerlegung der in den Strahlkegel K eintretenden Fluoreszenzstrahlung vornimmt. Das Steuergerät 10 liest dazu den (ortsauflösend detektierenden) Sensor 9 geeignet aus und identifiziert eine Probe 5 anhand deren Eigenfluoreszenzspektrum. Die spektrale Aktivität des Gitters 8 erschließt weiter eine zusätzliche, spektrale Möglichkeit, die Anregungsstrahlung 1 auszublenden, da sie sich spektral deutlich von der Fluoreszenzstrahlung unterscheidet. ln der Regel wird das Gitter 8 ein Interferenzmuster auf dem Sensor 9 erzeugen. Zur spektralen Analyse ist es in einer Ausführungsform vorgesehen, daß das Steuergerät 10 eine Relatiwerschiebung von Gitter 8 und Sensor 9 bewirkt, so daß sich das Interferenzmuster, welches die spektrale Zusammensetzung der in den Strahlkegel K eintretenden Fluoreszenzstrahlung (gegebenenfalls zusammen mit Anregungsstrahlung 1) anzeigt, ändert. Die Änderung ermöglicht dann dem Steuergerät 10 über bekannte Algorithmen eine Aussage über die spektrale Zusammensetzung der Fluoreszenzstrahlung aus dem Fokus 4.A further improvement in the signal-to-noise ratio or further information acquisition is possible if the grating 8 spectrally decomposes the fluorescent radiation entering the beam cone K. For this purpose, the control device 10 reads out the (location-detecting) sensor 9 in a suitable manner and identifies a sample 5 on the basis of its own fluorescence spectrum. The spectral activity of the grating 8 also opens up an additional spectral possibility of masking the excitation radiation 1, since it differs significantly from the fluorescence radiation. As a rule, the grating 8 will generate an interference pattern on the sensor 9. For spectral analysis, it is provided in one embodiment that the control device 10 effects a relative shift of the grating 8 and the sensor 9, so that the interference pattern, which indicates the spectral composition of the fluorescent radiation entering the beam cone K (optionally together with excitation radiation 1), changes. The change then enables the control unit 10 to make a statement about the spectral composition of the fluorescent radiation from the focus 4 using known algorithms.
Um einen möglichst großen Raumwinkel zu erreichen sollte der Abstand d natürlich so gering wie möglich sein. In einer weiteren (nicht in Fig. 1 dargestellten) Ausführungsform ist deshalb das Gitter 8 direkt auf der Unterseite des Probenträgers 7 angebracht. Ohne Gitter 8 sollte der Abstand d (nun zwischen Fokus 4 und Sensor 9) minimiert werden, indem der Sensor möglichst nah am Probenträger 7 liegt. In order to achieve the largest possible solid angle, the distance d should of course be as small as possible. In a further embodiment (not shown in FIG. 1), the grid 8 is therefore attached directly to the underside of the sample carrier 7. Without the grating 8, the distance d (now between the focus 4 and the sensor 9) should be minimized by the sensor being as close as possible to the sample carrier 7.

Claims

Patentansprüche claims
1. Mehr-Photonen-Lumineszenzmikroskop (M) mit einem Anregungsstrahlengang, der ein Objektiv (2) aufweist, das Anregungsstrahlung (1) in einem Fokuspunkt (4) in der Probe (5) bündelt, einer Scan-Einrichtung, die den Fokuspuηkt (4) zumindest eindimensional verstellt und einer Detektoreinrichtung, die in der Probe durch Mehr-Photonen-Anregung stimulierte Lurnineszenzstrahlung aufnimmt, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektoreinrichtung einen Flächendetektor (9) aufweist, der sich auf der dem Objektiv (2) gegenüberliegenden Seite der Probe (5) befindet.1. Multi-photon luminescence microscope (M) with an excitation beam path, which has a lens (2) that bundles excitation radiation (1) at a focal point (4) in the sample (5), a scanning device that measures the focus point ( 4) adjusted at least one dimension and a detector device which receives lurninescence radiation stimulated in the sample by multi-photon excitation, characterized in that the detector device has an area detector (9) which is located on the side of the sample (2) opposite the objective (2) 5) is located.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Flächendetektor (9) in einem Abstand (d) zum Fokuspunkt (4) liegt, der klein gegen die Ausdehnung (b) des Flächendetektors (9) ist, um einen möglichst großen Raumwinkel (K) abzudecken.2. Microscope according to claim 1, characterized in that the area detector (9) lies at a distance (d) from the focal point (4) which is small against the extent (b) of the area detector (9) by as large a solid angle ( K) to cover.
3. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Flächendetektor (9) und Probe (5) ein, vorzugsweise holographisches, Gitter (8) angeordnet ist.3. Microscope according to one of the above claims, characterized in that a, preferably holographic, grating (8) is arranged between the surface detector (9) and the sample (5).
4. Mikroskop nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gitter (8) auf der Unterseite eines Probefitragers (7) aufgebracht ist.4. Microscope according to claim 3, characterized in that the grating (8) is applied to the underside of a sample carrier (7).
5. Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, gekennzeichnet durch einen ortsauflösenden Flächendetektor (9).5. Microscope according to one of the above claims, characterized by a spatially resolving surface detector (9).
6. Mikroskop nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen CCD-Flächendetektor (9), vorzugsweise als rückseitenbeleuchteter CCD-Sensor.6. Microscope according to claim 5, characterized by a CCD area detector (9), preferably as a back-lit CCD sensor.
7. Verfahren zur Mehr-Photonen-Lumineszenzmikroskopie, bei dem Anregungsstrahlung (1) in einem in einer Probe (5) liegenden Fokuspunkt (4) gebündelt, dadurch in der Probe (5) durch Mehr-Photonenanregung Lurnineszenzstrahlung stimuliert wird, der Fokuspunkt (4) zurh Abscannen der Probe (5) verstellt und die Lurnineszenzstrahlung detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Lurnineszenzstrahlung auf der der Einstrahlung der Anregungsstrahlung gegenüberliegenden Seite flächenhaft detektiert wird.7. Method for multi-photon luminescence microscopy, in which excitation radiation (1) is concentrated in a focus point (4) lying in a sample (5), thereby stimulating lurninescence radiation in the sample (5) by multi-photon excitation, the focus point (4 ) back Scanning the sample (5) is adjusted and the lurninescence radiation is detected, characterized in that the lurninescence radiation is areally detected on the side opposite the radiation of the excitation radiation.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Detektion eine spektrale Zerlegung der Lurnineszenzstrahlung erfolgt. 8. The method according to claim 7, characterized in that a spectral decomposition of the lurninescence radiation takes place before the detection.
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