EP1658496A1 - Photochromic relaxation kinetic method - Google Patents

Photochromic relaxation kinetic method

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Publication number
EP1658496A1
EP1658496A1 EP04763779A EP04763779A EP1658496A1 EP 1658496 A1 EP1658496 A1 EP 1658496A1 EP 04763779 A EP04763779 A EP 04763779A EP 04763779 A EP04763779 A EP 04763779A EP 1658496 A1 EP1658496 A1 EP 1658496A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fret
photochromic
state
light
fret acceptor
Prior art date
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Ceased
Application number
EP04763779A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Thomas Jovin
Elizabeth A. Jares-Erijman
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1658496A1 publication Critical patent/EP1658496A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

Definitions

  • the invention relates to a method for determining a characteristic kinetic size of a chemical reaction between a plurality of chemical species in a sample, wherein at least one species contains at least one fluorophore, comprising the following steps: generating an imbalance state of the chemical reaction by exposing the sample to light and time-resolved observation of at least a portion of the relaxation of the concentrations of the species involved using a fluorescence signal of at least one fluorophore.
  • Such methods represent special forms of the methods generally known as relaxation spectroscopic methods with fluorescence detection.
  • the classic relaxation kinetic methods as described, for example, in Eigen, M .; DeMaeyer, L .: “Theoretical basis of relaxation kinetics” in “Investigations of rotes and mechanisms of reactions", Part III, 3, 3rd edition (G. Hammes, ed.), Techniques ofChem., Vol. 6, p.
  • Time-resolved fluorescence spectroscopy has proven to be a suitable method of observation. If at least one species involved in the reaction to be examined has a flurophor (be it that the species itself is fluorescent or that it is labeled with a suitable fluorophore), the fluorescence of which varies depending on the binding state of the species, the relaxation process can suitable excitation can be observed very precisely based on the fluorescence.
  • a disadvantage of the known method is that an intensive thermodynamic variable must be changed in each case, which on the one hand involves a comparatively great technical outlay and on the other hand represents a possible load on the chemical species. Sensitive biological material in particular can easily be damaged. Repetitive methods are known in which small changes in the relevant intensive thermodynamic variable are repeated many times in order to build up a low-noise signal. Although the strain on the species involved can be reduced compared to a one-time strong deflection, these reduced loads can already be too great for particularly sensitive material, in particular when examining living cells, etc. In addition, the repetitive methods usually require the balance to be restored before each deflection.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FRET experiments are due to The strong dependence on distance, for example, is used in the investigation of the attachment of certain substances to biological structures, where certain areas of the structures to be examined and the attached substance each comprise a partner species of a FRET pair, and the FRET donor is then excited with a light of a suitable wavelength , its excitation energy can at least partially transfer to the FRET acceptor without radiation.
  • Such a chromophore can be used as a switchable FRET acceptor, namely if there is a suitable FRET donor whose emission spectrum overlaps in a very different way with the excitation spectra of the different conformations of the chromophore,
  • the FRET efficiency can be varied by irradiation with the conformation-changing light
  • irradiation of the sample with light of different wavelengths, in particular UV light and visible light can be carried out as desired between two photochromic Switch states back and forth.
  • At least one product of the chemical reaction to be investigated comprises a compound of two species, each of which contains a partner of a FRET pair consisting of FRET donor and FRET acceptor, wherein the FRET acceptor is a photochrome, the absorption spectrum of which can be changed by exposure to light of a suitable wavelength, the FRET donor is a fluorophore, the Emission spectrum with the absorption spectrum of the FRET acceptor has an overlap area, the size of which depends on the photochromic state of the FRET acceptor and the light used to generate the imbalance state of the chemical reaction has a wavelength switching the photochromic state of the FRET acceptor.
  • An imbalance state arises because, as will be explained in more detail below with the aid of an example, an FRET-mediated de-excitation channel is available in the bound state, which is not given for the free ligand. At the end of the switching process, therefore, the proportion of the bound state with the FRET acceptor in the changed photochromic state is too low compared to the free ligand.
  • the system can return to its equilibrium state in different ways by time-resolved fluorescence measurement, since the photochromic states in the bound state can be distinguished from one another on the basis of the different FRET efficiency.
  • the term “free ligand” encompasses all states in which the distance between the FRET partners is too large for a significant FRET to take place; in contrast, “bound state” or “complex” means any state in which the FRET partners are arranged sufficiently close to one another, in particular these terms should not be understood as restricting them to certain chemical bond forms.
  • a first species includes a FRET donor and is generally referred to as D.
  • a second species comprises a photochromic FRET acceptor and is generally referred to as A.
  • Short-term irradiation with an intense UV light pulse triggers a change in the conformation of the photochromic acceptor, the photochromic acceptor is "switched on”.
  • the spectra of D and A are matched to one another in such a way that D with A in the "switched on” state (A + ) forms an efficient FRET pair, whereas in the "switched off” state (A.) only a minimal FRET is possible between D and A.
  • the chemical reaction of interest involves the complex formation of species D and A to complex DA, where DA + and DA denote in each case the switched-on or switched-off state of the FRET acceptor in the bound state
  • DA + and DA denote in each case the switched-on or switched-off state of the FRET acceptor in the bound state
  • the reaction scheme is illustrated below, which illustrates the entire system when it is exposed to a wavelength that switches the photochromic state of A (eg in the UV range).
  • k f and k r are the rate constants of the forward and reverse reactions of the complex formation. For the sake of simplicity, they are assumed to be the same for the on and off state of A, although this is not essential for the basic idea of the present invention.
  • the method according to the invention has the advantage over the conventional relaxation methods that it is technically particularly simple to implement, since only a controllable light source of a suitable wavelength has to be available to set the imbalance state. Due to the simplicity of its construction, the method is also suitable for use in portable devices for quick on-site Measurement, for example when detecting special chemical substances that influence the kinetics of a reaction.
  • the faster applicability of a radiation flash compared to a change in temperature or pressure enables a better temporal resolution of the e-electronics to be measured.
  • the method is suitable for use on very small volumes and can therefore also e.g. to be used for imaging kinetic measurements in a microscope. living cells are also possible.
  • the fluorescence of the FRET donor can be measured to observe the relaxation.
  • the product to be examined comprises a further flurophor, which is a further FRET acceptor to the FRET donor.
  • This additional FRET acceptor can be present, for example, on the same molecule that also comprises the first, photochromic FRET acceptor.
  • the further FRET acceptor it is also possible for the further FRET acceptor to be encompassed by a third party molecule involved in the reaction.
  • the further FRET acceptor need not necessarily be a chromophore. Based on this experimental constellation, the FRET donor can be isolated in order to observe the relaxation and the fluorescence of the further FRET acceptor can be measured.
  • the Another FRET acceptor competes with the first photochromic acceptor in terms of energy transfer from the FRET donor.
  • fluorescence therefore depends on the one hand on the spatial constellation to the FRET donor and on the other hand on the photochromic state of the first FRET acceptor.
  • the required kinetic information can thus also be obtained from the fluorescence of the further FRET acceptor.
  • the first, photochromic FRET acceptor itself is not fluorescent and if the reaction to be investigated, for example DNA hybridization, it attaches itself much closer to the FRET donor than the other, fluorescent FRET acceptor, the and switching off the photochromic FRET acceptor of the energy transfer to the further, fluorescent FRET acceptor and thus switching its fluorescence on or off.
  • Monitoring only the fluorescence of the further, fluorescent FRET acceptor is therefore a particularly sensitive measurement method, since only complexes are detected in the switched-off state, the relaxation of which can therefore be observed in isolation.
  • the photochromic FRET acceptor it is possible to change its photochromic state in a first direction by irradiating the sample with light of a first wavelength, while changing its photochromic state in a second direction by irradiating it with light of a second wavelength.
  • This behavior is particularly favorable, since the switching direction, ie. H. from “On” to "Off” or from "Off” to "On".
  • the photochromic molecule can assume more than two photochromic states that can be switched with different wavelengths.
  • the change in the photochromic state of the FRET acceptor to take place in at least one direction by irradiation with ultraviolet light.
  • This light can also be used to excite the FRET donor, since most fluorophores can be excited in the ultraviolet spectral range.
  • the opposite circuit can, like also the case with diheteroarylethenes, for example by excitation with visible light.
  • the FRET donor can advantageously also be excited in the visible spectral range. This enables, for example, the simultaneous excitation of the donor together with the photochromic switching of the FRET acceptor regardless of the switching direction. This also enables targeted excitation of the FRET donor without simultaneously triggering the UV-mediated switching of the photochromic acceptor.
  • the latter is possible in particular if, as provided for in a preferred embodiment, the irradiation intensity for changing the photochromic state of the FRET acceptor is substantially stronger than the irradiation intensity for generating the fluorescence to be observed.
  • Such an experimental constellation is generally possible, since with conventional flurophores for the excitation of fluorescence, significantly lower irradiation intensities are required than for the switching of common photochromes.
  • the sample is irradiated in a time-modulated manner to change the photochromic state of the FRET acceptor. This means that radiation intensities change over time.
  • the circuit is then preferably according to. a repetitive "forcing function".
  • the detected signal will then be a convolution of the forcing function with the actual relaxation signal.
  • a special case of modulated radiation can be used if the photochromic FRET acceptor is switched on and off by means of light of two different wavelengths, namely it can be provided that to change the photochromic state of the FRET acceptor, the sample alternating with light of the first and the second wavelength is irradiated.
  • any switching pattern can be implemented. The most favorable choice of a switching pattern has to be made in coordination with the other experimental conditions and the experimental goal.
  • the specific choice of the radiation pattern also depends on the Properties of the photochrome used, which can show, for example, a different stability of its photochromic states, so that a return to one of the photochromic states based on thermal de-excitation can take place even without active switching back.
  • a device for carrying out the method explained above it is basically only necessary to take a sample, at least one controllable light source for the temporally and spectrally controlled irradiation of the sample in the sample, at least one light detector suitable for time-resolved measurement for detecting fluorescent light, which from the sample is emitted as a result of the radiation, and to provide a control unit which, as a rule, in terms of programming, is set up to control the at least one light source and the at least one light detector according to the inventive method.
  • a correspondingly programmed evaluation unit can preferably also be provided for the automated evaluation.
  • the simplifications that result from the inventive method compared to. conventional relaxation processes can, in a particularly preferred embodiment, e.g. All device components for mobile use can be integrated in a portable housing.
  • Figure 1 a circuit diagram of a photochromic FRET acceptor as a free ligand.
  • Figure 2 a circuit diagram of a photochromic FRET acceptor in the bound state with a FRET donor.
  • Figure 3 three simulated concentration curves as a result of the inventive method.
  • Figure 4 a schematic representation of a complex formation reaction with two FRET acceptors.
  • FIG. 1 shows the circuit diagram of a photochromic FRET acceptor A as a free ligand in the broad sense explained above.
  • large biological molecules are also included, which are labeled with the photochromic acceptor A and which, for example, attach themselves to other biological structures in the course of the reaction to be investigated.
  • A. denotes the FRET acceptor when it is switched off.
  • A. * represents the photochromic FRET acceptor when switched off, energetically excited.
  • a + denotes the FRET acceptor in the switched-on ground state
  • a + * denotes the FRET acceptor in the switched-on, photonically excited state.
  • Molecules in state A + can also be energetically excited by the incident light. There is therefore an excitation in parallel to state A + , namely with the velocity constant ke X ⁇ + . Similar to the case described above, some of the molecules in state A + return to the basic state A4- with the rate constant k d A + , while other parts use the absorbed excitation energy to switch to the switched-off state A.
  • the circuit diagram can be represented as a simple reaction with monoexponential kinetics and the speed constants k-4- 2 and k + - 2 for the switch-on and switch-off process.
  • FIG. 2 shows the same circuit diagram as FIG. 1, but for the case in which the photochromic FRET acceptor is present in the form bound to the FRET donor.
  • the term “bound” in the sense explained above is to be understood broadly here.
  • reaction partners of a DNA hypothesis can be labeled with the corresponding flurophores.
  • the “bound” state is generally referred to as complex DA.
  • the inner circle of the circuit diagram corresponds to that in Figure 1.
  • the radiation stimulates the FRET donor, so that a state D A results. This arises with the velocity constant ke X D. A large number of the molecules excited in this way return to the ground state DA. with the speed constant kd D. This includes the fluorescence emission.
  • FRET leads to a transition to state DA.
  • the FRET acceptor is switched off (A.), the efficiency of this transition is very low.
  • molecules in the DA + state are also brought into the energetically excited state DA + by the irradiation with the rate constant ke X D.
  • a partial return to the basic state DA with the speed constant k d D Another part of the molecules in the state D A + undergoes an energy transition via FRET to the state DA +. Since the FRET acceptor (A +) is switched on with a high FRET efficiency, there is an asymmetry of the entire system, which leads to an under-occupation of the state DA + of the bound FRET pair compared to the occupation of the state A + of the free FRET acceptor.
  • FIG. 3 shows three simulated concentration curves as a result of the method according to the invention.
  • Figure 3a shows the total concentration of the bound FRET pair in arbitrary units.
  • the steep rise 10 in the left area of the diagram represents the behavior during a UV radiation pulse.
  • the area 12 following on the right which is shown enlarged in FIG. 3b, shows the relaxation into the equilibrium state. Due to the asymmetry explained above, the state DA + is understaffed. There is therefore a relaxation in favor of this state.
  • FIG. 3c shows the concentration of the donor and the FRET pair in the switched-off state. It is exactly the opposite of the curve previously explained.
  • the excitation irradiation of the sample is carried out with considerably less intensity.
  • the wavelength of this detection radiation is generally selected so that the FRET donor is energetically excited, but without this being associated with any noteworthy switching of the photochromic FRET acceptor.
  • the fluorescence of the FRET donor itself can be measured. This will decrease with increasing concentration of bound FRET pairs in the switched-on state, since the overall FRET efficiency increases and thus a growing competitive channel for donor fluorescence arises.
  • the fluorescence of the FRET acceptor can also be measured, provided that it is a fluorescent photochrome. This is exactly the opposite of donor fluorescence. It is also possible to measure the fluorescence of a third fluorophore, which is also present in the reaction product that contains the bound FRET Contains pair, and which acts as a further, non-photochromic, but fluorescent FRET acceptor to the specially chosen FRET donor.
  • This additional FRET acceptor represents an excitation channel that competes with the donor fluorescence and the fluorescence of the first FRET acceptor.
  • a diagram of a corresponding exemplary complex formation reaction for example a DNA hybridization with two FRET acceptors, is shown in FIG. "D” here denotes the FRET donor, "pc" the first photochromic FRET acceptor and "A” the further, non-photochromic, fluorescent FRET acceptor.
  • D and pc are arranged close to each other.
  • A is at a greater distance arranged to D.
  • the examples described here and shown in the drawings represent only particularly advantageous embodiments of the method according to the invention, which can be varied in many ways within the scope of the teaching disclosed.
  • the special choice of the species used, the wavelengths and intensities of the light used to switch the photochrome and / or to excite the FRET donor can be modified to a large extent.
  • the method according to the invention allows, since essentially only reversible processes are involved, repetitive method variants to improve the signal / noise ratio. Spatially meandering suggestions by moving the sample (e.g. in a microscope) and / or the stimulating light beam can also be used depending on the specific experimental goal.

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Abstract

The invention relates to a method for determining a characteristic kinetic variable of a chemical reaction between a plurality of chemical species in a sample, at least one species comprising at least one fluorophore. According to said method, an imbalance state of the chemical reaction is generated by exposing the sample to light and by temporally resolved observation of at least one section of the relaxation of the concentrations of the species involved, by means of a fluorescence signal of at least one fluorophore. According to the invention, at least one product of the chemical reaction to be examined comprises a compound of two species, that respectively contain a partner of a FRET pair consisting of a FRET donor and a FRET acceptor. The invention is characterised by further steps: the FRET acceptor is a photochrome having an absorption spectrum that can be modified by means of exposition to light of a suitable wavelength; the FRET donor is a fluorophore having an emission spectrum which overlaps with the absorption spectrum of the FRET acceptor, the size of said region depending on the photochromic state of the FRET acceptor; and the light used for generating the imbalance state of the chemical reaction has a wavelength which changes the photochromic state of the FRET acceptor.

Description

Anmelder: Max-Planck-Gesellschaft; Jovin; Jares-ErijmanApplicant: Max Planck Society; Jovin; Jares-Erijman
Anwaltsakte: P-MPG 12 PCTAttorney's file: P-MPG 12 PCT
Photochrom es relaxationskinetisches VerfahrenPhotochromic relaxation kinetic process
Be s chre ibungDescription
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung einer charakteristischenkinetischen Größe einer chemischen Reaktion zwischen einer Mehrzahl chemischer Spezies in einer Probe, wobei wenigstens eine Spezies wenigstens einen Fluorophor enthält, umfassend die folgenden Schritte: Erzeugen eines Ungleichgewichtszustandes der chemischen Reaktion durch Beaufschlagung der Probe mit Licht und zeitaufgelöste Beobachtung wenigstens eines Abschnitts der Relaxation der Konzentrationen der beteiligten Spezies anhand eines Fluoreszenzsignals wenigstens eines Fluorophors.The invention relates to a method for determining a characteristic kinetic size of a chemical reaction between a plurality of chemical species in a sample, wherein at least one species contains at least one fluorophore, comprising the following steps: generating an imbalance state of the chemical reaction by exposing the sample to light and time-resolved observation of at least a portion of the relaxation of the concentrations of the species involved using a fluorescence signal of at least one fluorophore.
Derartige Verfahren, z.B. sogenannte Blitzlicht- (Flash-Photolysis) Verfahren, stellen spezielle Formen der allgemein als relaxationsspektroskopische Verfahren mit Fluoreszenzdetektion bekannten Verfahren dar. Den klassischen relaxationskinetischen Verfahren, wie sie beispielsweise beschrieben sind in Eigen, M.; DeMaeyer, L.: „Theoretical basis of relaxation kinetics" in „ Investigations of rotes and mechanisms of reactions", Teil III, 3, 3. Aufl. (G. Hammes, Hsg), Techniques ofChem., Bd. 6, S. 63-148b (1974), liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Geschwindigkeitskonstanten kf und kr für die Hin- bzw. Rückreaktion und damit die Gleichgewichtslage einer chemischen (Teil-) Reaktion eine Funktion intensiver thermodynamischer Größen ist, insbesondere der Temperatur T und / oder des Drucks P. Eine entsprechende Offenbarung in der Patentliteratur findet sich in DE-OS 24 08 646. Durch plötzliche Veränderung einer intensiven thermodynamischen Größe wird daher die Gleichgewichtslage der chemischen Reaktion schnell verschoben, ohne dass die Konzentrationen der beteiligten Spezies instantan folgen könnten. Vielmehr relaxieren die Konzentrationen der beteiligten Spezies zeitverzögert in den neuen Gleichgewichtszustand. Form und Geschwindigkeit derSuch methods, for example so-called flash photolysis methods, represent special forms of the methods generally known as relaxation spectroscopic methods with fluorescence detection. The classic relaxation kinetic methods as described, for example, in Eigen, M .; DeMaeyer, L .: "Theoretical basis of relaxation kinetics" in "Investigations of rotes and mechanisms of reactions", Part III, 3, 3rd edition (G. Hammes, ed.), Techniques ofChem., Vol. 6, p. 63-148b (1974), is based on the knowledge that the rate constants k f and k r for the forward and backward reaction and thus the equilibrium position of a chemical (partial) reaction is a function of intensive thermodynamic variables, in particular the temperature T and / or the pressure P. A corresponding disclosure in the patent literature can be found in DE-OS 24 08 646. Sudden changes in an intensive thermodynamic variable therefore quickly shift the equilibrium position of the chemical reaction without the concentrations of the species involved being able to follow immediately. Rather, the concentrations of the species involved relax into the new equilibrium state with a time delay. Shape and speed of
BES1ÄTIGÜNGSKDPIE Relaxationsprozesse sind abhängig von der Komplexität der Gesamtreaktion sowie von den konkreten Werten der Reaktionskonstanten kf und kr der Reaktion bzw. ihren einzelnen Teilreaktionen. Durch geeignete spektroskopische Beobachtung des Relaxationsprozesses lassen sich daher Rückschlüsse auf die -Kinetik der untersuchten chemischen Reaktion ziehen. Je nach speziell verwendeter Technik spricht man von P-Sprung- Verfahren, T- Sprung- Verfahren, Blitzlichtverfahren, etc.BES1ÄTIGÜNGSKDPIE Relaxation processes depend on the complexity of the overall reaction as well as on the concrete values of the reaction constants k f and k r of the reaction or its individual partial reactions. Appropriate spectroscopic observation of the relaxation process allows conclusions to be drawn about the kinetics of the chemical reaction under investigation. Depending on the specific technology used, one speaks of P-jump method, T-jump method, flashing light method, etc.
Als eine geeignete Beobachtungsmethode hat sich die zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie bewährt. Weist nämlich wenigstens eine an der zu untersuchenden Reaktion beteiligte Spezies einen Flurophor auf (sei es, dass die Spezies selbst fluoreszent ist oder dass sie mit einem geeigneten Fluorophor markiert ist), dessen Fluoreszenz in Abhängigkeit von dem Bindungszustand der Spezies variiert, kann der Relaxationsvorgang bei geeigneter Anregung anhand der Fluoreszenz sehr genau beobachtet werden.Time-resolved fluorescence spectroscopy has proven to be a suitable method of observation. If at least one species involved in the reaction to be examined has a flurophor (be it that the species itself is fluorescent or that it is labeled with a suitable fluorophore), the fluorescence of which varies depending on the binding state of the species, the relaxation process can suitable excitation can be observed very precisely based on the fluorescence.
Nachteilig bei dem bekannten Verfahren ist, dass jeweils eine intensive thermodynamische Größe verändert werden muss, was einerseits mit vergleichsweise großem technischen Aufwand verbunden ist und andererseits eine mögliche Belastung der chemischen Spezies darstellt. Insbesondere empfindliches biologisches Material kann dabei leicht geschädigt werden. Es sind zwar repetitive Verfahren bekannt, bei denen kleine Änderungen der relevanten intensiven thermodynamischen Größe zum Aufbau eines rauscharmen Signals vielfach wiederholt werden. Die Belastung der beteiligten Spezies kann dadurch zwar gegenüber einer einmaligen starken Auslenkung reduziert werden, für besonders empfindliches Material, insbesondere bei Untersuchungen an lebenden Zellen etc., können jedoch auch diese reduzierten Belastungen bereits zu groß sein. Zudem erfordern es die repetitive Verfahren in der Regel, vor jeder Auslenkung das Gleichgewicht wieder herzustellen.A disadvantage of the known method is that an intensive thermodynamic variable must be changed in each case, which on the one hand involves a comparatively great technical outlay and on the other hand represents a possible load on the chemical species. Sensitive biological material in particular can easily be damaged. Repetitive methods are known in which small changes in the relevant intensive thermodynamic variable are repeated many times in order to build up a low-noise signal. Although the strain on the species involved can be reduced compared to a one-time strong deflection, these reduced loads can already be too great for particularly sensitive material, in particular when examining living cells, etc. In addition, the repetitive methods usually require the balance to be restored before each deflection.
Aus einem völlig anderen Gebiet der Fluoreszenzspektroskopie ist das Phänomen des sog. Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers, kurz FRET genannt, bekannt. Dabei handelt es sich um einen strahlungslosen Energieübergang durch langreichweitige Dipol-Dipol- Wechselwirkung von einem Partner eines FRET-Paares, nämlich dem sog. FRET-Donor, auf den anderen Partner, nämlich den sog. FRET-Akzeptor. Zwei Fluorophore können ein FRET-Paar bilden, wenn das Emissionsspektrum des FRET-Donors einen Überlappungsbereich mit dem Anregungsspektrum des FRET-Akzeptors aufweist. FRET weist eine sehr starke Abhängigkeit von der Distanz zwischen FRET-Donor und FRET- Akzeptor auf, nämlich R"6 , wo R der Abstand zwischen den Partnern eines FRET-Paares ist. Zu den theoretischen Grundlagen von FRET siehe z.B. Förster, T.: „Naturwissenschaften", Bd. 6, S. 166-175 (1946), Stryer, L.: „Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler" Ann. Rev. Biochem. 1978, 47. 819-846. FRET-Experimente finden aufgrund der starken Abstandsabhängigkeit zum Beispiel Anwendung bei der Untersuchung der Anlagerung bestimmter Stoffe an biologische Strukturen, wobei bestimmte Bereiche der zu untersuchenden Strukturen sowie der sich anlagernde Stoff jeweils eine Partnerspezies eines FRET-Paares umfassen. Wird dann der FRET-Donor mit einem Licht geeigneter Wellenlänge angeregt, kann seine Anregungsenergie wenigstens teilweise strahlungslos auf den FRET-Akzeptor übergehen. Die Wahrscheinlichkeit eines solchen Übergangs ist, wie oben erläutert, stark vom Abstand der wechselwirkenden Moleküle abhängig. Vergleich der Donorfluoreszenz vor und nach Anlagerung des den FRET-Akzeptor umfassenden Stoffs kann Rückschlüsse auf das Ausmaß der Anlagerung erlauben. Es sind bildgebende FRET- Verfahren im Mikroskop sowie nicht-bildgebende Verfahren bekannt. Etwa bei der Strukturanalyse biologischer Moleküle oder bei DNA- Hybridisierungsexperimenten finden FRET- Verfahren zum Beispiel zur Nachbarschaftsoder Abstandsbestimmung vielfach Anwendung. EP 0 668 498 A2 offenbart eine zur Messung von FRET geeignete Apparatur und ein entsprechendes Messverfahren. Eine Verwendung von FRET zur Detektion bestimmter Moleküle ist beispielsweise bekannt aus DE 39 38 598 A2, in der ein auf FRET basierender Biosensor offenbart wird, sowie aus EP 1 271 133 AI, in der ein auf FRET basierendes Nachweisverfahren offenbart wird.The phenomenon of so-called fluorescence resonance energy transfer, FRET for short, is known from a completely different field of fluorescence spectroscopy. This is a radiation-free energy transfer through long-range dipole-dipole Interaction from one partner of a FRET pair, namely the so-called FRET donor, to the other partner, namely the so-called FRET acceptor. Two fluorophores can form a FRET pair if the emission spectrum of the FRET donor has an overlap area with the excitation spectrum of the FRET acceptor. FRET has a very strong dependence on the distance between the FRET donor and FRET acceptor, namely R "6 , where R is the distance between the partners of a FRET pair. For the theoretical foundations of FRET see, for example, Förster, T .: "Naturwissenschaften", Vol. 6, pp. 166-175 (1946), Stryer, L .: "Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler" Ann. Rev. Biochem. 1978, 47. 819-846. FRET experiments are due to The strong dependence on distance, for example, is used in the investigation of the attachment of certain substances to biological structures, where certain areas of the structures to be examined and the attached substance each comprise a partner species of a FRET pair, and the FRET donor is then excited with a light of a suitable wavelength , its excitation energy can at least partially transfer to the FRET acceptor without radiation. As explained above, the probability of such a transition is strongly dependent on the distance between the interactions dependent molecules. Comparison of the donor fluorescence before and after attachment of the substance comprising the FRET acceptor can allow conclusions to be drawn about the extent of the attachment. Imaging FRET methods in the microscope as well as non-imaging methods are known. For example, in the structural analysis of biological molecules or in DNA hybridization experiments, FRET methods are widely used, for example, for determining neighborhoods or distances. EP 0 668 498 A2 discloses an apparatus suitable for measuring FRET and a corresponding measuring method. The use of FRET for the detection of certain molecules is known, for example, from DE 39 38 598 A2, in which a FRET-based biosensor is disclosed, and from EP 1 271 133 AI, in which a FRET-based detection method is disclosed.
Aus dem Gebiet der organisch- / synthetischen Chemie sind seit kurzem photochromeOrganic / synthetic chemistry has recently become photochromic
Moleküle bekannt, die als schaltbare FRET-Akzeptoren eingesetzt werden können. Siehe hierzu zum Beispiel: Giordano, Jovin, Irie und Jares-Erijman „Diheteroarylethenes asKnown molecules that can be used as switchable FRET acceptors. See for example: Giordano, Jovin, Irie and Jares-Erijman “Diheteroarylethenes as
Thermally Stable Photoswitchable Acceptors in Photochromic Fluorescence Resonance Energy Transfer (pcFRET)", J.AM.CHEM.SOC. 2002, 124, 7481-7489. Darin werden verschiedene Moleküle aus der Familie der Diheteroarylethene offenbart, die bei geeigneter Lichteinwirkung eine reversible Konformationsänderung zwischen einer offenen und einer geschlossenen Ringkonfiguration zeigen. Mit der Strukturänderung geht eine erhebliche Änderung des Anregungsspektrums des Moleküls einher. Ein derartiges Chromophor kann Anwendung finden als schaltbarer FRET-Akzeptor. Ist nämlich ein geeigneter FRET- Donor vorhanden, dessen Emissionsspektrum in stark unterschiedlicher Weise mit den Anregungsspektren der unterschiedlichen Konformationen des Chromophors überlappt, kann die FRET-Effizienz durch Bestrahlung mit dem konformationsändernden Licht variiert werden. Bei den in der genannten Druckschrift offenbarten Molekülen lässt sich durch Bestrahlung der Probe mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen, insbesondere UV- Licht und sichtbares Licht, beliebig zwischen zwei photochromen Zuständen hin- und herschalten. Man kann salopp von einem An- und Ausschalten von FRET sprechen, wobei der angeschaltete Zustand einem größeren Überlappungsbereich des Emissionsspektrums des FRET-Donors mit dem Anregungsspektrum des FRET-Akzeptors entspricht - somit einer größeren FRET-Effizienz - und der ausgeschaltete Zustand einem kleineren Überlappungsbereich - somit einer geringeren FRET-Effizienz. Obwohl photochrome Moleküle in der Regel nicht fluoreszent sind, sind auch einige photochrome Fluorophore bekannt.Thermally Stable Photoswitchable Acceptors in Photochromic Fluorescence Resonance Energy Transfer (pcFRET) ", J.AM.CHEM.SOC. 2002, 124, 7481-7489. Various molecules from the family of diheteroarylethenes are disclosed therein which, when exposed to suitable light, show a reversible conformational change between an open and a closed ring configuration. The structure change is accompanied by a considerable change in the excitation spectrum of the molecule. Such a chromophore can be used as a switchable FRET acceptor, namely if there is a suitable FRET donor whose emission spectrum overlaps in a very different way with the excitation spectra of the different conformations of the chromophore, The FRET efficiency can be varied by irradiation with the conformation-changing light In the case of the molecules disclosed in the cited publication, irradiation of the sample with light of different wavelengths, in particular UV light and visible light, can be carried out as desired between two photochromic Switch states back and forth. One can speak casually of switching FRET on and off, whereby the switched on state corresponds to a larger overlap area of the emission spectrum of the FRET donor with the excitation spectrum of the FRET acceptor - thus a greater FRET efficiency - and the switched off state corresponds to a smaller overlap area - thus a lower FRET efficiency. Although photochromic molecules are usually not fluorescent, some photochromic fluorophores are also known.
Ausgehend von den bekannten relaxationskinetischen Verfahren ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungsgemäßes Verfahren derart weiter zu bilden, dass relaxationskinetische Messungen bei verminderter Belastung der an der Reaktion beteiligten Spezies ermöglicht werden.Starting from the known relaxation kinetic methods, it is the object of the present invention to further develop a generic method in such a way that relaxation kinetic measurements are made possible with a reduced load on the species involved in the reaction.
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass wenigstens ein zu untersuchendes Produkt der chemischen Reaktion eine Verbindung zweier Spezies umfasst, die jeweils einen Partner eines aus FRET-Donor und FRET-Akzeptor bestehenden FRET-Paares enthalten, wobei der FRET-Akzeptor ein Photochrom ist, dessen Absorptionsspektrum durch Beaufschlagung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge änderbar ist, der FRET-Donor ein Fluorophor ist, dessen Emissionsspektrum mit dem Absorptionsspektrum des FRET-Akzeptors einen Überlappungsbereich aufweist, dessen Größe von dem photochromen Zustand des FRET- Akzeptors abhängt und das zur Erzeugung des Ungleichgewichtszustandes der chemischen Reaktion verwendete Licht eine den photochromen Zustand des FRET-Akzeptors schaltende Wellenlänge aufweist.This object is achieved in connection with the features of the preamble of claim 1 in that at least one product of the chemical reaction to be investigated comprises a compound of two species, each of which contains a partner of a FRET pair consisting of FRET donor and FRET acceptor, wherein the FRET acceptor is a photochrome, the absorption spectrum of which can be changed by exposure to light of a suitable wavelength, the FRET donor is a fluorophore, the Emission spectrum with the absorption spectrum of the FRET acceptor has an overlap area, the size of which depends on the photochromic state of the FRET acceptor and the light used to generate the imbalance state of the chemical reaction has a wavelength switching the photochromic state of the FRET acceptor.
Dem liegt zunächst die Idee der Umkehrung des Anwendungsprinzips herkömmlicher relaxationskinetischer Messungen zugrunde. Wie erläutert, wird bei diesen durch Änderung einer intensiven thermodynamischen Größe die Gleichgewichtslage der Reaktion verändert und die Relaxation der Konzentrationen in den neuen Gleichgewichtszustand beobachtet. Bei der vorliegenden Erfindung werden dagegen die relativen Konzentrationen der beteiligten Spezies plötzlich verändert, und deren Rückkehr in den (thermodynamisch unveränderten) Gleichgewichtszustand beobachtet. Man beachte, dass zur Änderung der relativen Konzentrationen hier keine Stoffzugabe, wie etwa bei Titrationsexperiementen erforderlich ist. Die Konzentrationsänderung erfolgt durch Schalten des photochromen FRET-Akzeptors von seinem ersten in einen zweiten photochromen Zustand. Von diesem Schaltvorgang ist die den FRET-Akzeptor umfassende Spezies sowohl als freier Ligand wie auch in gebundenem Zustand betroffen. Ein Ungleichgewichtszustand entsteht, da, wie nachfolgend anhand eines Beispiels detaillierter erläutert werden soll, im gebundenen Zustand ein FRET-vermittelter Abregungskanal zur Verfügung steht, der für den freien Liganden nicht gegeben ist. Am Ende des Schaltvorgangs liegt daher im Vergleich zu dem freien Liganden ein zu geringer Anteil des gebundenen Zustandes mit dem FRET-Akzeptor in geändertem photochromen Zustand vor. Die Rückkehr des Systems in seinen Gleichgewichtszustand kann auf unterschiedliche Weise durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung erfolgen, da die photochromen Zustände im gebundenen Zustand anhand der unterschiedlichen FRET-Effizenz von einander unterschieden werden können.This is based on the idea of reversing the application principle of conventional relaxation kinetic measurements. As explained, by changing an intensive thermodynamic quantity, the equilibrium position of the reaction is changed and the relaxation of the concentrations in the new equilibrium state is observed. In contrast, in the present invention the relative concentrations of the species involved are suddenly changed and their return to the (thermodynamically unchanged) equilibrium state is observed. It should be noted that there is no need to add substances to change the relative concentrations, as is the case with titration experiments. The change in concentration takes place by switching the photochromic FRET acceptor from its first to a second photochromic state. The species encompassing the FRET acceptor is affected by this switching process both as a free ligand and in the bound state. An imbalance state arises because, as will be explained in more detail below with the aid of an example, an FRET-mediated de-excitation channel is available in the bound state, which is not given for the free ligand. At the end of the switching process, therefore, the proportion of the bound state with the FRET acceptor in the changed photochromic state is too low compared to the free ligand. The system can return to its equilibrium state in different ways by time-resolved fluorescence measurement, since the photochromic states in the bound state can be distinguished from one another on the basis of the different FRET efficiency.
Obgleich in vielen Anwendungsfällen die Interaktion mehrerer an einer Reaktion beteiligter Spezies untersucht werden soll, sie jeweils mit einem als FRET-Donor oder FRET-Akzeptor wirkenden Huorophors bzw. Photochroms markiert sind, umfasst dieAlthough in many applications the interaction of several species involved in a reaction is to be investigated, each of which is labeled with a Huorophors or photochromes acting as a FRET donor or FRET acceptor, this includes
Erfindung auch Fälle, in denen das Fluorophor bzw. Photochrom selbst als Reaktand beteiligt ist. Der Begriff „freier Ligand" umfasst im Rahmen dieser Beschreibung alle Zustände, in denen der Abstand zwischen den FRET-Partnern zu groß ist, als dass ein nennenswerter FRET stattfinden könnte; mit „gebundener Zustand" oder „Komplex" ist im Gegensatz dazu jeder Zustand gemeint, in dem die FRET-Partner hinreichend nahe zueinander angeordnet sind. Insbesondere sollen diese Begriffe nicht als Einschränkung auf bestimmte chemische Bindungsformen verstanden werden.Invention also cases in which the fluorophore or photochrome itself as a reactant is involved. In the context of this description, the term “free ligand” encompasses all states in which the distance between the FRET partners is too large for a significant FRET to take place; in contrast, “bound state” or “complex” means any state in which the FRET partners are arranged sufficiently close to one another, in particular these terms should not be understood as restricting them to certain chemical bond forms.
Zum besseren Verständnis sei nachfolgend ein Beispiel einer besonders einfachen Reaktion erläutert, auf die die Erfindung jedoch keineswegs beschränkt ist und die allein der Illustration dienen soll.For better understanding, an example of a particularly simple reaction is explained below, to which the invention is by no means restricted, however, and which is only intended to serve as an illustration.
Eine erste Spezies umfasst einen FRET-Donor und wird allgemein mit D bezeichnet. Eine zweite Spezies umfasst erfindungsgemäß einen photochromen FRET-Akzeptor und wird allgemein als A bezeichnet. Durch kurzfristige Bestrahlung mit einem intensiven UV- Lichtpuls wird eine Konformationsänderung des photochromen Akzeptors ausgelöst, der photochrome Akzeptor wird „eingeschaltet". Die Spektren von D und A sind derart auf einander abgestimmt, dass D mit A im „eingeschalteten" Zustand (A+) ein effizientes FRET-Paar bildet, während im „ausgeschalteten" Zustand (A.) nur ein minimaler FRET zwischen D und A möglich ist. Die interessierende chemische Reaktion umfasst die Komplexbildung der Spezies D und A zu dem Komplex DA, wobei DA+ und DA. jeweils den ein- bzw. ausgeschalteten Zustand des FRET-Akzeptors in gebundenem Zustand bezeichnen. Nachfolgend ist ein Reaktionsschema dargestellt, welches das Gesamtsystem bei Beaufschlagung mit einer den photochromen Zustand von A schaltenden Wellenlänge (z.B. im UV-Bereich) illustriert.A first species includes a FRET donor and is generally referred to as D. According to the invention, a second species comprises a photochromic FRET acceptor and is generally referred to as A. Short-term irradiation with an intense UV light pulse triggers a change in the conformation of the photochromic acceptor, the photochromic acceptor is "switched on". The spectra of D and A are matched to one another in such a way that D with A in the "switched on" state (A + ) forms an efficient FRET pair, whereas in the "switched off" state (A.) only a minimal FRET is possible between D and A. The chemical reaction of interest involves the complex formation of species D and A to complex DA, where DA + and DA denote in each case the switched-on or switched-off state of the FRET acceptor in the bound state The reaction scheme is illustrated below, which illustrates the entire system when it is exposed to a wavelength that switches the photochromic state of A (eg in the UV range).
k+. k+' - k + . k + '-
D + A+ ^ DA+ (i) kf und kr sind die Geschwindigkeitskonstanten der Hin- bzw. Rückreaktion der Komplexbildung. Sie seien der Einfachheit halber als für den ein- und den ausgeschalteten Zustand von A gleich angenommen, obwohl dies für den Grundgedanken der vorliegenden Erfindung nicht zwingend ist. k-+ sei die Geschwindigkeitskonstante für den photochromen Übergang von dem ausgeschalteten Zustand des Akzeptors (A.) zum eingeschalteten Zustand des Akzeptors (A+), während k+_ die Geschwindigkeitskonstante für den photochromen Übergang vom eingeschalteten zum ausgeschalteten Zustand des Akzeptors darstellt. Wie im Rahmen der speziellen Beschreibung anhand von Figur 1 und 2 näher erläutert werden soll, unterscheiden sich die Geschwindigkeitskonstante für den photochromen Ausschaltvorgang des freien Liganden A (k+.) und diejenige des Komplexes DA (k'+-). Grund hierfür ist ein FRET-vermittelter Anregungskanal, der den Ausschaltvorgang für den Komplex DA effizienter ausfallen lässt als für den freien Liganden A (k'+. > k+_).D + A + ^ DA + (i) k f and k r are the rate constants of the forward and reverse reactions of the complex formation. For the sake of simplicity, they are assumed to be the same for the on and off state of A, although this is not essential for the basic idea of the present invention. Let k- + be the rate constant for the photochromic transition from the off state of the acceptor (A.) to the on state of the acceptor (A + ), while k + _ represents the rate constant for the photochromic transition from the on state to the off state of the acceptor. As will be explained in more detail in the context of the special description with reference to FIGS. 1 and 2, the rate constant for the photochromic switching-off process of the free ligand A (k + .) And that of the complex DA (k ' + -) differ. The reason for this is a FRET-mediated excitation channel, which makes the switching-off process for the complex DA more efficient than for the free ligand A (k '+.> K + _).
Dadurch entsteht ein Konzentrationsverhältnis, das mit der thermodynamischen Gleichgewichtslage nicht in Einklang steht. Ausgehend von diesem erzeugten Ungleichgewicht kommt es zum Konzentrationsausgleich, d.h. zur Relaxation mit - im vorliegenden, einfachen Fall - einer Relaxationszeit τ = l/( kf[D] + kr), die von den klassischen Relaxationsverfahren her wohlbekannt ist. Bei komplexerer Reaktion ist ein multiexponentiales Relaxationsverhalten zu erwarten, das ebenfalls über bekannte Gleichungen mit den beteiligten Geschwindigkeitskonstanten in Beziehung steht. Der Relaxationsvorgang kann anhand der Fluoreszenz wenigstens einer der beteiligten Fluorophore beobachtet werden.This creates a concentration ratio that is not in line with the thermodynamic equilibrium position. Based on this generated imbalance, there is a concentration equalization, ie relaxation with - in the present, simple case - a relaxation time τ = l / (k f [D] + k r ), which is well known from the classic relaxation methods. In the case of a more complex reaction, a multi-exponential relaxation behavior is to be expected, which is also related to the involved rate constants via known equations. The relaxation process can be observed using the fluorescence of at least one of the fluorophores involved.
Neben dem bereits erwähnten Vorteil der sehr schonenden Auslenkung der Konzentrationen hat das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den herkömmlichen Relaxationsverfahren den Vorzug, technisch besonders einfach realisierbar zu sein, da zur Einstellung des Ungleichgewichtszustandes lediglich eine steuerbare Lichtquelle geeigneter Wellenlänge zur Verfügung stehen muss. Durch die Einfachheit seines Aufbaus eignet sich das Verfahren auch zur Verwendung in tragbaren Vorrichtungen zur schnellen Vor-Ort- Messung, etwa beim Aufspüren spezieller, die Kinetik einer Reaktion beeinflussender chemischer Substanzen.In addition to the already mentioned advantage of the very gentle deflection of the concentrations, the method according to the invention has the advantage over the conventional relaxation methods that it is technically particularly simple to implement, since only a controllable light source of a suitable wavelength has to be available to set the imbalance state. Due to the simplicity of its construction, the method is also suitable for use in portable devices for quick on-site Measurement, for example when detecting special chemical substances that influence the kinetics of a reaction.
Zudem ermöglicht die schnellere Anwendbarkeit eines Strahlungsblitzes im Vergleich zu einer Temperatur- oder Druckänderung eine bessere zeitliche Auflösung der zu messenden E-inetiken.In addition, the faster applicability of a radiation flash compared to a change in temperature or pressure enables a better temporal resolution of the e-electronics to be measured.
Darüber hinaus ist das Verfahren zur Anwendung auf sehr geringe Volumina geeignet und kann daher auch z.B. zu bildgebenden Kinetik-Messungen im Mikroskop eingesetzt werden, wobei als Proben u.a. auch lebende Zellen in Frage kommen.In addition, the method is suitable for use on very small volumes and can therefore also e.g. to be used for imaging kinetic measurements in a microscope. living cells are also possible.
Selbstverständlich können jedoch auch Untersuchungen an Lösungen o.a. vorgenommen werden, wobei sich durch vorgenannten Vorteile Anwendungsmöglichkeiten im Rahmen von miniaturisierten Screening- Verfahren mit hohem Probendurchsatz ergeben (Mikro- (Nano-) well-assays, Mikro- (Nano-) array-assays etc.).Of course, investigations of solutions or the like can also be carried out. are carried out, whereby the aforementioned advantages result in possible applications in the context of miniaturized screening methods with high sample throughput (micro (nano) well assays, micro (nano) array assays etc.).
Zur Beobachtung der Relaxation kann die Fluoreszenz des FRET-Donors gemessen werden. Alternativ ist es auch möglich, zur Beobachtung der Relaxation die Fluoreszenz des FRET-Akzeptors zu messen, sofern es sich hierbei um ein fluoreszentes Photochrom handelt. Selbstverständlich ist es ebenso möglich, über verschiedene Messkanäle beide Arten von Fluoreszenz zu erfassen.The fluorescence of the FRET donor can be measured to observe the relaxation. Alternatively, it is also possible to measure the fluorescence of the FRET acceptor to observe the relaxation, provided that this is a fluorescent photochrome. Of course, it is also possible to detect both types of fluorescence via different measuring channels.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das zu untersuchende Produkt einen weiteren Flurophor, der einen weiteren FRET-Akzeptor zu dem FRET-Donor darstellt. Dieser zusätzliche FRET-Akzeptor kann beispielsweise an demselben Molekül vorliegen, das auch den ersten, photochromen FRET-Akzeptor umfasst. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass der weitere FRET-Akzeptor von einem Dritten an der Reaktion beteiligten Molekül umfasst wird. Der weitere FRET- Akzeptor muss nicht notwendig ein Chromophor sein. Ausgehend von dieser experimentellen Konstellation, kann zur Beobachtung der Relaxation der FRET-Donor isoliert angeregt und die Fluoreszenz des weiteren FRET-Akzeptors gemessen werden. Der weitere FRET-Akzeptor steht in Bezug auf die Energieübertragung von dem FRET-Donor in Konkurrenz zu dem ersten, photochromen Akzeptor. Seine Fluoreszenz ist daher zum einen von der räumlichen Konstellation zu dem FRET-Donor und zum anderen von dem photochromen Zustand des ersten FRET-Akzeptors abhängig. Somit lassen sich die erforderlichen kinetischen Informationen auch aus der Fluoreszenz des weiteren FRET- Akzeptors gewinnen. Ist etwa der erste, photochrome FRET-Akzeptor selbst nicht fluoreszent und lagert er sich bei der zu untersuchenden Reaktion, z.B. einer DNA- Hybridisierung, wesentlich näher an den FRET-Donor an als der weitere, fluoreszente FRET-Akzeptor, wird mit dem Ein- und Ausschalten des photochromen FRET-Akzeptors der Energietransfer zu dem weiteren, fluoreszenten FRET-Akzeptor und damit dessen Fluoreszenz aus- bzw. eingeschaltet. Beobachtung nur der Fluoreszenz des weiteren, fluoreszenten FRET-Akzeptors stellt daher ein besonders sensitives Messverfahren dar, da hierbei nur Komplexe im ausgeschalteten Zustand detektiert werden, deren Relaxation also isoliert beobachtet werden kann.In another embodiment of the method according to the invention, the product to be examined comprises a further flurophor, which is a further FRET acceptor to the FRET donor. This additional FRET acceptor can be present, for example, on the same molecule that also comprises the first, photochromic FRET acceptor. Of course, it is also possible for the further FRET acceptor to be encompassed by a third party molecule involved in the reaction. The further FRET acceptor need not necessarily be a chromophore. Based on this experimental constellation, the FRET donor can be isolated in order to observe the relaxation and the fluorescence of the further FRET acceptor can be measured. The Another FRET acceptor competes with the first photochromic acceptor in terms of energy transfer from the FRET donor. Its fluorescence therefore depends on the one hand on the spatial constellation to the FRET donor and on the other hand on the photochromic state of the first FRET acceptor. The required kinetic information can thus also be obtained from the fluorescence of the further FRET acceptor. If, for example, the first, photochromic FRET acceptor itself is not fluorescent and if the reaction to be investigated, for example DNA hybridization, it attaches itself much closer to the FRET donor than the other, fluorescent FRET acceptor, the and switching off the photochromic FRET acceptor of the energy transfer to the further, fluorescent FRET acceptor and thus switching its fluorescence on or off. Monitoring only the fluorescence of the further, fluorescent FRET acceptor is therefore a particularly sensitive measurement method, since only complexes are detected in the switched-off state, the relaxation of which can therefore be observed in isolation.
Bei einer günstigen Wahl des photochromen FRET-Akzeptors ist die Änderung seines photochromen Zustandes in eine erste Richtung durch Bestrahlung der Probe mit Licht einer ersten Wellenlänge möglich, während die Änderung seines photochromen Zustandes in eine zweite Richtung durch Bestrahlung mit Licht einer zweiten Wellenlänge erfolgt. Dieses Verhalten ist besonders günstig, da damit durch spezielle Wahl der Bestrahlungswellenlänge die Schaltrichtung, d. h. von „Ein" nach „Aus" bzw. von „Aus" nach „Ein" bestimmen lässt. Selbstverständlich ist es grundsätzlich auch möglich, dass das photochrome Molekül mehr als zwei photochrome Zustände einnehmen kann, die mit unterschiedlichen Wellenlängen schaltbar sind..In a favorable choice of the photochromic FRET acceptor, it is possible to change its photochromic state in a first direction by irradiating the sample with light of a first wavelength, while changing its photochromic state in a second direction by irradiating it with light of a second wavelength. This behavior is particularly favorable, since the switching direction, ie. H. from "On" to "Off" or from "Off" to "On". Of course, it is in principle also possible that the photochromic molecule can assume more than two photochromic states that can be switched with different wavelengths.
Besonders günstig ist es, wie etwa bei der Familie der Diheteroarylethene, wenn die Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors in wenigstens eine Richtung durch Bestrahlung mit ultravioletem Licht erfolgt. Dieses Licht kann gleichzeitig zur Anregung des FRET-Donors verwendet werden, da die meisten Fluorophore im ultravioletten Spektralbereich anregbar sind. Die entgegengesetzte Schaltung kann, wie ebenfalls bei den Diheteroarylethenen der Fall, z.B. durch Anregung mit sichtbarem Licht erfolgen.It is particularly advantageous, as is the case with the family of diheteroarylethenes, for the change in the photochromic state of the FRET acceptor to take place in at least one direction by irradiation with ultraviolet light. This light can also be used to excite the FRET donor, since most fluorophores can be excited in the ultraviolet spectral range. The opposite circuit can, like also the case with diheteroarylethenes, for example by excitation with visible light.
Günstigerweise ist der FRET-Donor zusätzlich im sichtbaren Spektralbereich anregbar. Dies ermöglicht etwa die gleichzeitige Anregung des Donors zusammen mit der photochromen Schaltung des FRET-Akzeptors unabhängig von der Schaltrichtung. Außerdem wird dadurch eine gezielte Anregung des FRET-Donors ermöglich, ohne gleichzeitig die UV-vermittelte Schaltung des photochromen Akzeptors anzustoßen. Letzteres ist insbesondere möglich, wenn, wie bei einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, die BeStrahlungsintensität zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors wesentlich stärker ist als die Bestrahlungsintensität zur Erzeugung der zu beobachtenden Fluoreszenz. Eine derartige experimentelle Konstellation ist in der Regel möglich, da bei gängigen Flurophoren zur Anregung von Fluoreszenzen wesentlich geringere BeStrahlungsintensitäten erforderlich sind als für die Schaltung gängiger Photochrome.The FRET donor can advantageously also be excited in the visible spectral range. This enables, for example, the simultaneous excitation of the donor together with the photochromic switching of the FRET acceptor regardless of the switching direction. This also enables targeted excitation of the FRET donor without simultaneously triggering the UV-mediated switching of the photochromic acceptor. The latter is possible in particular if, as provided for in a preferred embodiment, the irradiation intensity for changing the photochromic state of the FRET acceptor is substantially stronger than the irradiation intensity for generating the fluorescence to be observed. Such an experimental constellation is generally possible, since with conventional flurophores for the excitation of fluorescence, significantly lower irradiation intensities are required than for the switching of common photochromes.
Bei einer besonders günstigen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors die Probe zeitlich moduliert bestrahlt wird. Darunter sind sich zeitlich ändernde BeStrahlungsintensitäten zu verstehen. Die Schaltung erfolgt dann vorzugsweise gem. einer repetitiven „forcing function". Das detektierte Signal wird dann einer Faltung der forcing function mit dem eigentlichen Relaxationssignal sein.In a particularly favorable development of the method according to the invention, it is provided that the sample is irradiated in a time-modulated manner to change the photochromic state of the FRET acceptor. This means that radiation intensities change over time. The circuit is then preferably according to. a repetitive "forcing function". The detected signal will then be a convolution of the forcing function with the actual relaxation signal.
Ein Sonderfall der modulierten Bestrahlung ist einsetzbar, wenn das Ein- und Ausschalten des photochromen FRET-Akzeptors mittels Licht zweier unterschiedlicher Wellenlängen erfolgt, dann nämlich kann vorgesehen sein, dass zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors die Probe alternierend mit Licht der ersten und der zweiten Wellenlänge bestrahlt wird. Je nach speziellem Anwendungsbereich können so beliebige Schaltmuster realisiert werden. Die jeweils günstigste Wahl eines Schaltmusters hat in Abstimmung auf die sonstigen experimentellen Gegebenheiten sowie das experimentelle Ziel zu erfolgen. Die spezielle Wahl des Bestrahlungsmusters ist auch abhängig von den Eigenschaften des verwendeten Photochroms, welches z.B. eine unterschiedliche Stabilität seiner photochromen Zustände zeigen kann, sodass auch ohne aktives Zurückschalten eine auf thermischer Abregung basierende Rückkehr in einen der photochromen Zustände erfolgen kann.A special case of modulated radiation can be used if the photochromic FRET acceptor is switched on and off by means of light of two different wavelengths, namely it can be provided that to change the photochromic state of the FRET acceptor, the sample alternating with light of the first and the second wavelength is irradiated. Depending on the specific application, any switching pattern can be implemented. The most favorable choice of a switching pattern has to be made in coordination with the other experimental conditions and the experimental goal. The specific choice of the radiation pattern also depends on the Properties of the photochrome used, which can show, for example, a different stability of its photochromic states, so that a return to one of the photochromic states based on thermal de-excitation can take place even without active switching back.
Zum Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des oben erläuterten Verfahrens ist es grundsätzlich nur erforderlich, eine Probenaufnahme, wenigstens eine steuerbare Lichtquelle zur zeitlich und spektral gesteuerten Bestrahlung der in der Probenaufnahme befindlichen Probe, wenigstens einen zur zeitaufgelösten Messung geeigneten Lichtdetektor zur Erfassung von Fluoreszenzlicht, welches von der Probe infolge der Bestrahlung emittiert wird, und eine Steuereinheit, welche - in der Regel progammtechnisch - zur Alisteuerung der wenigstens einen Lichtquelle und des wenigstens einen Lichtdetektors gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingerichtet ist, vorzusehen. Zur automatisierten Auswertung kann vorzugsweise weiter eine entsprechend programmierte Auswerteeinheit vorgesehen sein. Durch die Vereinfachungen, die sich aus dem erfindungsgemäßen Verfahren ggü. herkömmlichen Relaxationsverfahren ergeben, können bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform z.B. zum mobilen Einsatz alle Vorrichtungskomponenten in einem tragbare Gehäuse integriert sein.To set up a device for carrying out the method explained above, it is basically only necessary to take a sample, at least one controllable light source for the temporally and spectrally controlled irradiation of the sample in the sample, at least one light detector suitable for time-resolved measurement for detecting fluorescent light, which from the sample is emitted as a result of the radiation, and to provide a control unit which, as a rule, in terms of programming, is set up to control the at least one light source and the at least one light detector according to the inventive method. A correspondingly programmed evaluation unit can preferably also be provided for the automated evaluation. The simplifications that result from the inventive method compared to. conventional relaxation processes can, in a particularly preferred embodiment, e.g. All device components for mobile use can be integrated in a portable housing.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden, ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen das erfindungsgemäße Prinzip beispielhaft veranschaulicht ist.Further details of the invention will become apparent from the following detailed description and the accompanying drawings, in which the principle according to the invention is illustrated by way of example.
In den Zeichnungen zeigen:The drawings show:
Figur 1: ein Schaltschema eines photochromen FRET-Akzeptors als freier Ligand.Figure 1: a circuit diagram of a photochromic FRET acceptor as a free ligand.
Figur 2: ein Schaltschema eines photochromen FRET-Akzeptors im gebundenen Zustand mit einem FRET-Donor. Figur 3: drei simulierte Konzentrationskurven als Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens.Figure 2: a circuit diagram of a photochromic FRET acceptor in the bound state with a FRET donor. Figure 3: three simulated concentration curves as a result of the inventive method.
Figur 4: eine schematische Darstellung einer Komplexbildungsreaktion mit zwei FRET-Akzeptoren.Figure 4: a schematic representation of a complex formation reaction with two FRET acceptors.
Figur 1 zeigt das Schaltschema eines photochromen FRET-Akzeptors A als freier Ligand im weiter oben erläuterten, weit gefassten Sinn. So sind beispielsweise auch große biologische Moleküle umfasst, die mit dem photochromen Akzeptor A markiert sind und die sich im Rahmen der zu untersuchenden Reaktion zum Beispiel an andere biologische Strukturen anlagern. A. bezeichnet den FRET-Akzeptor im ausgeschalteten Grundzustand. A.* repräsentiert den photochromen FRET-Akzeptor im ausgeschalteten, energetisch angeregten Zustand. A+ bezeichnet den FRET-Akzeptor im eingeschalteten Grundzustand A+ * bezeichnet den FRET-Akzeptor im eingeschalteten, photonisch angeregten Zustand.FIG. 1 shows the circuit diagram of a photochromic FRET acceptor A as a free ligand in the broad sense explained above. For example, large biological molecules are also included, which are labeled with the photochromic acceptor A and which, for example, attach themselves to other biological structures in the course of the reaction to be investigated. A. denotes the FRET acceptor when it is switched off. A. * represents the photochromic FRET acceptor when switched off, energetically excited. A + denotes the FRET acceptor in the switched-on ground state A + * denotes the FRET acceptor in the switched-on, photonically excited state.
Bei Bestrahlung der Probe mit Licht, welches in der Lage ist, einen Übergang des FRET- Akzeptors vom ausgeschalteten zum eingeschalteten Zustand auszulösen, z. B. Licht im ultravioletten Spektralbereich, gehen Anteile der Spezies A vom Zustand A. in den Zustand A. über. Dies erfolgt mit der Geschwindigkeitskonstante keX A". Von dem angeregten Zustand A. erfolgt eine teilweise Rückkehr in den Grundzustand mit der Geschwindigkeitskonstante kdA". Ein anderer Teil geht mit der Geschwindigkeitskonstante k+ über in den eingeschalteten Zustand A+.When the sample is irradiated with light which is able to trigger a transition of the FRET acceptor from the switched off to the switched on state, e.g. B. Light in the ultraviolet spectral range, portions of species A go from state A. to state A. This takes place with the speed constant ke X A " . From the excited state A. there is a partial return to the basic state with the speed constant kd A" . Another part is the rate constant k + than in the ON state A +.
Auch im Zustand A+ befindliche Moleküle sind durch das eingestrahlte Licht energetisch anregbar. Es erfolgt daher parallel eine Anregung in den Zustand A+ , und zwar mit der Geschwindigkeitskonstante keX Λ+. Ähnlich wie im zuvor geschilderten Fall kehrt ein Teil der Moleküle im Zustand A+ mit der Geschwindigkeitskonstante kd A+ zurück zum Grundzustand A4-, während andere Teile die absorbierte Anregungsenergie zum Übergang in den ausgeschalteten Zustand A. nutzen. Insgesamt lässt sich das Schaltschema als einfache Reaktion mit monoexponentieller Kinetik und den Geschwindigkeitskonstanten k-4-2und k+-2 für den Einschalt- und den Ausschaltvorgang darstellen. Figur 2 zeigt das gleiche Schaltschema wie Figur 1, jedoch für den Fall, dass der photochrome FRET-Akzeptor in mit dem FRET-Donor gebundener Form vorliegt. Der Begriff „gebunden" im oben erläuterten Sinn ist hier weit zu verstehen. Beispielsweise können Reaktionspartner einer DNA-Hypretisierung mit den entsprechenden Flurophoren markiert sein. Der „gebundene" Zustand wird allgemein als Komplex DA bezeichnet. Der innere Kreis des Schaltschemas entspricht dem in Figur 1. Allerdings ergeben sich hier zusätzlich Kanäle. Zum einen erfolgt durch die Bestrahlung eine Anregung des FRET- Donors, so dass sich ein Zustand D A. ergibt. Dieser entsteht mit der Geschwindigkeitskonstante keX D. Ein großer Teil der so angeregten Moleküle kehrt zurück in den Grundzustand DA. und zwar mit der Geschwindigkeitskonstante kdD. Diese umfasst u.a. die Fluoreszenzemission. Bei einem anderen Teil der Moleküle im Zustand D A. kommt es durch FRET zu einem Übergang in den Zustand DA. . Da sich der FRET- Akzeptor jedoch im ausgeschalteten Zustand befindet (A.) ist die Effizienz dieses Übergangs sehr gering.Molecules in state A + can also be energetically excited by the incident light. There is therefore an excitation in parallel to state A + , namely with the velocity constant ke X Λ + . Similar to the case described above, some of the molecules in state A + return to the basic state A4- with the rate constant k d A + , while other parts use the absorbed excitation energy to switch to the switched-off state A. Overall, the circuit diagram can be represented as a simple reaction with monoexponential kinetics and the speed constants k-4- 2 and k + - 2 for the switch-on and switch-off process. FIG. 2 shows the same circuit diagram as FIG. 1, but for the case in which the photochromic FRET acceptor is present in the form bound to the FRET donor. The term “bound” in the sense explained above is to be understood broadly here. For example, reaction partners of a DNA hypothesis can be labeled with the corresponding flurophores. The “bound” state is generally referred to as complex DA. The inner circle of the circuit diagram corresponds to that in Figure 1. However, there are additional channels here. On the one hand, the radiation stimulates the FRET donor, so that a state D A results. This arises with the velocity constant ke X D. A large number of the molecules excited in this way return to the ground state DA. with the speed constant kd D. This includes the fluorescence emission. For another part of the molecules in state D A., FRET leads to a transition to state DA. , However, since the FRET acceptor is switched off (A.), the efficiency of this transition is very low.
Ähnlich dem zuvor geschilderten Anregungsweg werden auch Moleküle im Zustand DA+ durch die Bestrahlung mit der Geschwindigkeitskonstante keX D in den energetisch angeregten Zustand D A+ versetzt. Auch hier ergibt sich eine teilweise Rückkehr in den Grundzustand DA mit der Geschwindigkeitskonstante kd D. Ein anderer Teil der Moleküle im Zustand D A+ erfährt einen Energieübergang über FRET in den Zustand DA+ . Da sich hier aufgrund des eingeschalteten Zustande des FRET-Akzeptors (A+) eine hohe FRET- Effizienz ergibt, kommt es zu eine Asymmetrie des gesamten Systems, die zu einer Unterbesetzung des Zustandes DA+ des gebundenen FRET-Paares im Vergleich zu der Besetzung des Zustandes A+ des freien FRET-Akzeptors führt.Similar to the excitation path described above, molecules in the DA + state are also brought into the energetically excited state DA + by the irradiation with the rate constant ke X D. Here too there is a partial return to the basic state DA with the speed constant k d D. Another part of the molecules in the state D A + undergoes an energy transition via FRET to the state DA +. Since the FRET acceptor (A +) is switched on with a high FRET efficiency, there is an asymmetry of the entire system, which leads to an under-occupation of the state DA + of the bound FRET pair compared to the occupation of the state A + of the free FRET acceptor.
Diese Asymmetrie führt zu der oben in Verbindung mit Reaktionsgleichung (1) erwähnten Ungleichheit der Geschwindigkeitskonstanten k+. und k'+-, d.h. zu den unterschiedlichen Auswirkungen der Bestrahlung auf der linken und der rechten Seite der Gleichung der Beispielreaktion. Es ist offensichtlich, dass hierdurch ein Konzentrationsungleichgewicht bei thermodynamisch unveränderter Gleichgewichtslage der Reaktion entsteht. Figur 3 zeigt drei simulierte Konzentrationskurven als Ergebnis des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei zeigt Figur 3a die Gesamtkonzentration des gebundenen FRET-Paares in willkürlichen Einheiten. Der steile Anstieg 10 im linken Bereich des Diagramms repräsentiert das Verhalten während eines UV-Strahlungspulses. Der rechts darauf folgende Bereich 12, der in Figur 3b vergrößert dargestellt ist, zeigt die Relaxation in den Gleichgewichtszustand. Durch die oben erläuterte Asymmetrie ist der Zustand DA+ unterbesetzt. Es erfolgt daher eine Relaxation zugunsten dieses Zustandes.This asymmetry leads to the inequality of the rate constants k + mentioned above in connection with reaction equation (1). and k ' + -, ie on the different effects of the irradiation on the left and the right side of the equation of the example reaction. It is obvious that this results in a concentration imbalance with the thermodynamically unchanged equilibrium position of the reaction. FIG. 3 shows three simulated concentration curves as a result of the method according to the invention. Figure 3a shows the total concentration of the bound FRET pair in arbitrary units. The steep rise 10 in the left area of the diagram represents the behavior during a UV radiation pulse. The area 12 following on the right, which is shown enlarged in FIG. 3b, shows the relaxation into the equilibrium state. Due to the asymmetry explained above, the state DA + is understaffed. There is therefore a relaxation in favor of this state.
Figur 3c zeigt dagegen die Konzentration des Donors und des FRET-Paares im ausgeschalteten Zustand. Sie ist der zuvor erläuterten Kurve genau entgegengesetzt.FIG. 3c shows the concentration of the donor and the FRET pair in the switched-off state. It is exactly the opposite of the curve previously explained.
Man beachte, dass die gezeigten Kurven Konzentrationskurven sind, die nicht mit dem tatsächlich detektierten Fluoreszenzsignal übereinstimmen, das u.a. von den Eigenschaften des hierfür verwendeten Anregungslichtes abhängt.Note that the curves shown are concentration curves that do not match the actually detected fluorescence signal, which i.a. depends on the properties of the excitation light used for this.
Bei einem typischen Experiment wird beispielsweise im Anschluss an die zur Schaltung des Photochroms geeigneten Bestrahlung eine wesentlich intensitätsschwächere Anregungsbestrahlung der Probe durchgeführt. Die Wellenlänge dieser Detektionsbestrahlung ist in der Regel so gewählt, dass der FRET-Donor energetisch angeregt wird, ohne dass jedoch eine nennenswerte Schaltung des photochromen FRET- Akzeptors damit einhergeht.In a typical experiment, for example, after the irradiation suitable for switching the photochrome, the excitation irradiation of the sample is carried out with considerably less intensity. The wavelength of this detection radiation is generally selected so that the FRET donor is energetically excited, but without this being associated with any noteworthy switching of the photochromic FRET acceptor.
Für die Wahl der detektierten Fluoreszenzwellenlänge gibt es verschiedene Möglichkeiten. So kann beispielweise die Fluoreszenz des FRET-Donors selbst gemessen werden. Diese wird mit zunehmender Konzentration von gebundenen FRET-Paaren im eingeschalteten Zustand abnehmen, da die FRET-Effizienz insgesamt ansteigt und somit der Donorfluoreszenz ein wachsender Konkurrenzkanal entsteht. Andererseits kann auch die Fluoreszenz des FRET-Akzeptors gemessen werden, sofern es sich dabei um ein fluoreszentes Photochrom handelt. Diese verhält sich genau umgekehrt zu der Donorfluoreszenz. Weiter ist es auch möglich, die Fluoreszenz eines dritten Fluorophors zu messen, der ebenfalls in dem Reaktionsprodukt vorliegt, welches das gebundene FRET- Paar enthält, und der als ein weiterer, nicht photochromer, jedoch fluoreszenter FRET- Akzeptor zu dem speziell gewählten FRET-Donor wirkt. Dieser zusätzliche FRET- Akzeptor stellt einen Abregungskanal dar, der zu der Donorfluoreszenz und der Fluoreszenz des ersten FRET-Akzeptors in Konkurrenz steht. Ein Schema einer entsprechenden, beispielhaften Komplexbildungsreaktion, z.B. einer DNA-Hybridisierung mit zwei FRET-Akzeptoren ist in Figur 4 dargestellt. „D" bezeichnet hierbei den FRET- Donor, „pc" den ersten photochromen FRET-Akzeptor und „A" den weiteren, nicht photochromen, fluoreszenten FRET-Akzeptor. Im gebundenen Zustand sind D und pc dicht beieinander angeordnet. A ist in größerer Entfernung zu D angeordnet. In eingeschaltetem Zustand von pc ergibt sich daher eine hohe FRET-Effizienz zwischen D und pc, welche diejenige zwischen D und A deutlich übertrifft, d.h. es kann praktisch keine Energie von D auf A übertragen werden. Bei spezifischer Anregung von D kann daher keine Fluoreszenz von A beobachtet werden. Wird pc dagegen durch einen geeigneten Lichtpuls ausgeschaltet, überwiegt FRET zwischen D und A, sodass bei isolierter Beobachtung der Fluoreszenz von A selektiv der Komplex im ausgeschalteten Zustand von pc beobachtet werden kann, was zu einer sehr sensitiven Messung von dessen Relaxation führt.There are various options for choosing the detected fluorescence wavelength. For example, the fluorescence of the FRET donor itself can be measured. This will decrease with increasing concentration of bound FRET pairs in the switched-on state, since the overall FRET efficiency increases and thus a growing competitive channel for donor fluorescence arises. On the other hand, the fluorescence of the FRET acceptor can also be measured, provided that it is a fluorescent photochrome. This is exactly the opposite of donor fluorescence. It is also possible to measure the fluorescence of a third fluorophore, which is also present in the reaction product that contains the bound FRET Contains pair, and which acts as a further, non-photochromic, but fluorescent FRET acceptor to the specially chosen FRET donor. This additional FRET acceptor represents an excitation channel that competes with the donor fluorescence and the fluorescence of the first FRET acceptor. A diagram of a corresponding exemplary complex formation reaction, for example a DNA hybridization with two FRET acceptors, is shown in FIG. "D" here denotes the FRET donor, "pc" the first photochromic FRET acceptor and "A" the further, non-photochromic, fluorescent FRET acceptor. In the bound state, D and pc are arranged close to each other. A is at a greater distance arranged to D. When pc is switched on, this results in a high FRET efficiency between D and pc, which clearly exceeds that between D and A, ie practically no energy can be transferred from D to A. With specific excitation of D. therefore no fluorescence from A is observed. If, on the other hand, pc is switched off by a suitable light pulse, FRET predominates between D and A, so that when the fluorescence of A is observed in isolation, the complex can be observed selectively when pc is switched off, which leads to a very sensitive measurement leads to its relaxation.
Natürlich stellen die hier beschriebenen und in den Zeichnungen dargestellten Beispiele lediglich besonders vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, die im Rahmen der offenbarten Lehre auf vielfache Weise variierbar sind. Insbesondere die spezielle Wahl der verwendeten Spezies, der Wellenlängen und Intensitäten des zur Schaltung des Photochroms und / oder zur Anregung des FRET- Donors verwendeten Lichtes können in weitem Umfang abgewandelt werden. Z.B. erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren, da im Wesentlichen nur reversible Prozesse beteiligt sind, repetitive Verfahrensvarianten zur Verbesserung des Signal/Rausch- Verhätnisses. Auch räumlich mäandrierende Anregungen durch Bewegung der Probe (z.B. im Mikroskop) und / oder des anregenden Lichtstrahls sind je nach dem konkreten experimentellen Ziel einsetzbar. Of course, the examples described here and shown in the drawings represent only particularly advantageous embodiments of the method according to the invention, which can be varied in many ways within the scope of the teaching disclosed. In particular, the special choice of the species used, the wavelengths and intensities of the light used to switch the photochrome and / or to excite the FRET donor can be modified to a large extent. For example, The method according to the invention allows, since essentially only reversible processes are involved, repetitive method variants to improve the signal / noise ratio. Spatially meandering suggestions by moving the sample (e.g. in a microscope) and / or the stimulating light beam can also be used depending on the specific experimental goal.

Claims

P atentansprü che Patent claims
1. Verfahren zur Bestimmung einer charakteristischen, kinetischen Größe einer chemischen Reaktion zwischen einer Mehrzahl chemischer Spezies in einer Probe, wobei wenigstens eine Spezies wenigstens einen Fluorophor enthält, umfassend die folgenden Schritte: - Erzeugen eines Ungleichgewichtszustandes der chemischen Reaktion durch Beaufschlagung der Probe mit Licht, - zeitaufgelöste Beobachtung wenigstens eines Abschnitts der Relaxation der Konzentrationen der beteiligten Spezies anhand eines Fluoreszenzsignals wenigstens eines Fluorophors, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein zu untersuchendes Produkt der chemischen Reaktion eine Verbindung zweier Spezies umfasst, die jeweils einen Partner eines aus FRET-Donor und FRET-Akzeptor bestehenden FRET-Paares enthalten, wobei - der FRET-Akzeptor ein Photochrom ist, dessen Absorptionsspektrum durch Beaufschlagung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge änderbar ist, - der FRET-Donor ein Fluorophor ist, dessen Emissionsspektrum mit dem Absorptionsspektrum des FRET-Akzeptors einen Überlappungsbereich aufweist, dessen Größe von dem photochromen Zustand des FRET-Akzeptors abhängt, und - das zur Erzeugung des Ungleichgewichtszustandes der chemischen Reaktion verwendete Licht eine den photochromen Zustand des FRET-Akzeptors schaltende Wellenlänge aufweist.1. A method for determining a characteristic, kinetic size of a chemical reaction between a plurality of chemical species in a sample, wherein at least one species contains at least one fluorophore, comprising the following steps: generating an imbalance state of the chemical reaction by exposing the sample to light, time-resolved observation of at least a portion of the relaxation of the concentrations of the species involved on the basis of a fluorescence signal of at least one fluorophore, characterized in that at least one product of the chemical reaction to be investigated comprises a compound of two species, each of which is a partner of one of FRET donor and FRET Contain acceptor existing FRET pair, wherein - the FRET acceptor is a photochromic whose absorption spectrum can be changed by exposure to light of a suitable wavelength, - the FRET donor is a fluorophore, the emission spectrum of which with de m absorption spectrum of the FRET acceptor has an overlap area, the size of which depends on the photochromic state of the FRET acceptor, and - the light used to generate the imbalance state of the chemical reaction has a wavelength that switches the photochromic state of the FRET acceptor.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beobachtung der Relaxation die Fluoreszenz des FRET-Donors gemessen wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the fluorescence of the FRET donor is measured to observe the relaxation.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der photochrome FRET-Akzeptor ein Fluorophor ist und zur Beobachtung der Relaxation die Fluoreszenz des photochromen FRET-Akzeptors gemessen wird.3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the photochromic FRET acceptor is a fluorophore and the fluorescence of the photochromic FRET acceptor is measured to observe the relaxation.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Produkt einen weiteren Fluorophor umfasst, der einen weiteren FRET-Akzeptor zu dem FRET-Donor darstellt. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the product to be examined comprises a further fluorophore which is a further FRET acceptor to the FRET donor.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere FRET- Akzeptor kein Chromophor ist.5. The method according to claim 4, characterized in that the further FRET acceptor is not a chromophore.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beobachtung der Relaxation die Fluoreszenz des weiteren FRET-Akzeptors gemessen wird.6. The method according to any one of claims 4 or 5, characterized in that the fluorescence of the further FRET acceptor is measured to observe the relaxation.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors in eine erste Richtung durch Bestrahlung der Probe mit Licht einer ersten Wellenlänge erfolgt und die Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors in eine zweite Richtung durch Bestrahlung mit Licht einer zweiten Wellenlänge erfolgt.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the change in the photochromic state of the FRET acceptor in a first direction by irradiating the sample with light of a first wavelength and the change in the photochromic state of the FRET acceptor in a second direction by irradiation with light of a second wavelength.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors in wenigstens eine Richtung durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht erfolgt.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the change in the photochromic state of the FRET acceptor is carried out in at least one direction by irradiation with ultraviolet light.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors in wenigstens eine Richtung durch Bestrahlung mit sichtbarem Licht erfolgt.9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the change in the photochromic state of the FRET acceptor is carried out in at least one direction by irradiation with visible light.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung des FRET-Donors zur Erzeugung der zu beobachtenden Fluoreszenz mit sichtbarem Licht erfolgt.10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the excitation of the FRET donor to generate the fluorescence to be observed is carried out with visible light.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die BeStrahlungsintensität zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET- Akzeptors wesentlich stärker ist als die BeStrahlungsintensität zur Erzeugung der zu beobachtenden Fluoreszenz.11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the radiation intensity for changing the photochromic state of the FRET acceptor is much stronger than the radiation intensity for generating the fluorescence to be observed.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors die Probe zeitlich moduliert bestrahlt wird.12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in order to change the photochromic state of the FRET acceptor, the sample is irradiated in a time-modulated manner.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung des photochromen Zustandes des FRET-Akzeptors die Probe alternierend mit Licht der ersten und der zweiten Wellenlänge bestrahlt wird. 13. The method according to claims 7 and 12, characterized in that to change the photochromic state of the FRET acceptor, the sample is alternately irradiated with light of the first and the second wavelength.
14. Vorrichtung zur Bestimmung einer charakteristischen, kinetischen Größe einer chemischen Reaktion zwischen einer Mehrzahl chemischer Spezies in einer Probe, wobei wenigstens eine Spezies wenigstens einen Fluorophor enthält, umfassend eine Probenaufnahme, wenigstens eine steuerbare Lichtquelle zur zeitlich und spektral gesteuerten Bestrahlung der in der Probenaufnahme befindlichen Probe, wenigstens einen zur zeitaufgelösten Messung geeigneten Lichtdetektor zur Erfassung von Fluoreszenzlicht, welches von der Probe infolge der Bestrahlung emittiert wird, und eine Steuereinheit, welche zur Ansteuerung der wenigstens einen Lichtquelle und des wenigstens einen Lichtdetektors gemäß einem Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche geeignet eingerichtet ist.14. Device for determining a characteristic, kinetic size of a chemical reaction between a plurality of chemical species in a sample, wherein at least one species contains at least one fluorophore, comprising a sample holder, at least one controllable light source for the temporally and spectrally controlled irradiation of those in the sample holder Sample, at least one light detector suitable for time-resolved measurement for detecting fluorescent light which is emitted by the sample as a result of the irradiation, and a control unit which is suitably set up to control the at least one light source and the at least one light detector according to a method according to one of the preceding claims is.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass weiter eine Auswerteeinheit zur automatisierten Auswertung der erfassten Fluoreszenzlicht-Daten zur Berechnung der charakteristischen, kinetischen Größe vorgesehen ist.15. The apparatus according to claim 14, characterized in that an evaluation unit for the automated evaluation of the detected fluorescent light data for calculating the characteristic, kinetic variable is further provided.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass alle Vorrichtungskomponenten in einem tragbaren Gehäuse integriert sind. 16. Device according to one of claims 14 or 15, characterized in that all device components are integrated in a portable housing.
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