EP1583521A1 - Verwendung von hypericin und/oder dessen derivaten zur prävention primärer tumore - Google Patents

Verwendung von hypericin und/oder dessen derivaten zur prävention primärer tumore

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EP1583521A1
EP1583521A1 EP03795961A EP03795961A EP1583521A1 EP 1583521 A1 EP1583521 A1 EP 1583521A1 EP 03795961 A EP03795961 A EP 03795961A EP 03795961 A EP03795961 A EP 03795961A EP 1583521 A1 EP1583521 A1 EP 1583521A1
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EP
European Patent Office
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hypericin
derivatives
prevention
john
cypiai
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03795961A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ivar Roots
Dieter Schwarz
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
Original Assignee
Charite Universitaetsmedizin Berlin
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Publication date
Application filed by Charite Universitaetsmedizin Berlin filed Critical Charite Universitaetsmedizin Berlin
Publication of EP1583521A1 publication Critical patent/EP1583521A1/de
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
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    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/38—Clusiaceae, Hypericaceae or Guttiferae (Hypericum or Mangosteen family), e.g. common St. Johnswort
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants

Definitions

  • the present invention relates to the use of hypericin and / or its derivatives for the manufacture of a medicament for the prevention of primary tumors.
  • the invention also relates to the use of hypericin and / or its derivatives for the production of a functional food or food supplement for tumor prevention and the food or food supplement comprising hypericin in a nutritionally effective amount.
  • Hypericin can preferably be used in the form of a hypericin-rich vegetable dry extract, preferably from St. John's wort.
  • Drug compositions contain enormous potential for life improvement. It is known that, for example, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are disease-triggering substances. PAHs can be ingested from the environment (exhaust gases) or when smoking, but polycyclic aromatic hydrocarbons are also formed when barbecuing. In particular, they are held responsible for the development of mutagenic changes and malignant tumors.
  • the metabolism of these substances in the body has been the subject of numerous research work and is illustrated in FIG. 1 using the example of one of the most important representatives, benzo [a] pyrene (B [a] P). From Figure 1 it is clear that the human enzyme cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) plays an important role in the development of the disease.
  • the first stage of bioactivation of B [a] P leads to the CYP1A1-catalyzed formation of B [a] P-7, 8-epoxide and its hydrolysis by epoxy hydrolase (EH) to B [a] P-7,8-dihydrodiol (7, 8-diol-B [a] P).
  • the resulting 7, 8-diol-B [a] P is transformed by CYP1A1 to the genotoxic ( ⁇ ) -B [a] P-r-7, t-8-dihydro-diol-t-9, 10-epoxide
  • P450 1A1 thus catalyzes both epoxidation steps in the
  • CYP1A1 is the most important enzyme involved in chemical carcinogenesis. It is induced by PAHs such as benzo [a] pyrene and activates these and many other environmental toxins and precarcinogens to the actual carcinogens (Guengerich, FP, Cancer Res. 48 (1988) 2946-2954). CYP1A1 is essentially an extrahepatic enzyme. In addition to the lungs, it is mainly found in the entire gastrointestinal tract (esophagus, stomach, thin and Large intestine), expressed in the placenta, brain and lymphocytes.
  • CYP1A1 also catalyzes the hydroxylation of B [a] P, which leads to the phenols, mainly to 3-OH-B [a] P, which are not carcinogenic products and characterize the detoxification pathway.
  • Quercetin is an important chemopreventive compound that prevents the formation of DNA adducts, as a naturally occurring flavonoid component of many fruits and vegetables, e.g. is also contained in St. John's wort.
  • Kang et al. in "Nutrition and Cancer” 35 (2) (1999), 175-179 that quercetin inhibits the formation of benzo [a] pyrene-induced DNA adducts in human Hep G2 cells by influencing the CYP1A1 gene expression.
  • quercetin can have a long-term preventive effect on the chemical cancerogenesis of people who eat foods rich in vegetables and fruits.
  • Naturally occurring plant phenols such as tannic acid, quercetin, myricetin and anthraflavonic acid are described by Das, M. et al. in "Cancer Res. 47 (3) (1987), 767-73” as potent inhibitors of PAH DNA adduct formation in the epidermis and lungs of SENCAR mice. The authors conclude that these plant-based phenols may prove suitable for modifying the risk of tumor induction by PAHs.
  • the object of the present invention was to find highly effective compounds for tumor prevention, in particular for the prevention of tumors which are caused by polycyclic aromatic hydrocarbons.
  • hypyricin and its derivatives are highly potent chemopreventive compounds for the prophylaxis of any diseases which are associated with mutagenic changes, such as e.g. neoplastic transformations, and in particular for cancer prevention.
  • Hypericin belongs to the naphthodian thrones and has the following structural formula:
  • Hypericin is a component of plants belonging to the species Hypericum (St. John's wort) [cf. A. Nahrstedt et al., Phar acopsychiat. 30 (1997) (supplement) 129-134].
  • the Pure substance hypericin can be isolated from plants or also chemically synthesized. A whole series of synthetic routes have been described (see, for example, US Pat. No. 2,707,704, EP 0 432 496). It has now been found that hypericin is a potent inhibitor of the epoxidation of 7, 8-diol-B [a] P to the diolepoxides, that is to say the terminal step leading to the ultimately genotoxic and carcinogenic products. In addition, hypericin has little or no influence on the hydroxylation of B [a] P, which leads to the phenols and is the detoxification pathway (cf. FIG. 1).
  • Hypericin is thus superior, for example, to the resveratrol described as a cancer prophylactic, which does not inhibit the hydroxylation of B [a] P, but on the other hand only slightly inhibits the epoxidation of 7, 8-diol-B [a] P to the genotoxic diols (see Fig. 2).
  • FIG. 3 shows that hypericin, on the other hand, inhibits epoxidation extremely strongly, without having any significant influence on the hydroxylation pathway, at least not at concentrations up to 5 ⁇ M, which are well above the IC 50 value of 0.5 ⁇ M for the inhibition of epoxidation lie.
  • IC 50 values were determined for hypericin and comparatively for quercetin and ⁇ -naphthoflavone.
  • the IC 50 value is the inhibitor concentration which leads to 50% inhibition of the reaction.
  • the IC 50 value of the hypericin was determined to be 0.5 ⁇ M, while, for example, that of quercetin, also a plant phenol, which has a preventive effect on chemical cancerogenesis, is 1.5 ⁇ M.
  • Even the IC 50 value of ⁇ -naphthoflavone ( ⁇ -NF, Alpha-NF), a well-known selective CYPIAI inhibitor is 0.8 ⁇ M.
  • FIG. 4 shows the reciprocal IC 50 values for hypericin, quercetin and ⁇ -naphthoflavone for comparison of the relative inhibitory potential of these substances.
  • hypericin and / or its derivatives can be used advantageously for the prevention of PAH-induced tumors, in particular for the prevention of lung carcinoma, breast carcinoma,. Portiocarcinoma, colorectal carcinoma, skin carcinoma and brain carcinoma.
  • the substances can also be used for the prevention of other diseases induced by PAHs, e.g. for the prevention of neoplastic transformations.
  • hypericin and / or its derivatives for inhibiting the epoxidation activity of the enzyme CYPIAI is also an object of the present invention.
  • pseudohypericin, protohypericin, pseudoprotohypericin, cyclopseudohypericin and emodinanthron are particularly suitable as hypericin derivatives.
  • Hypericin and its derivatives are preferably used in the form of their salts with organic or inorganic acids, e.g. as acetates or phosphates ,, used.
  • these compounds or mixtures of these compounds are formulated in a manner known per se with suitable auxiliaries and / or carriers and / or diluents to give solid or liquid dosage forms, for injection or infusion solutions or for topical dosage forms , Oral administration of the active compounds according to the invention is preferred. Parenteral administration is of course also possible.
  • the preparation of the pharmaceutical formulations is not a problem for the person skilled in the art.
  • a process for the pharmaceutical preparation of infusion or injection solutions of hypericin or hypericin derivatives is described for example in DE 39 12 433 AI.
  • Pharmaceutical formulations (especially in combination with vitamins) can using the guidelines of "Vademecum for vitamin Formulations" (2 nd ed., Ed .: Volker Buhler, Wiss. Verlagsges. Stuttgart, 2002) are manufactured.
  • hypericin-rich means that at least 0.3 to 0.35% by weight of hypericin is contained in the dry extract.
  • St. John's wort hypericin and pseudohypericin occur side by side, so hypericin-rich St. John's wort extracts next to the .
  • Hypericin always contain the pseudohypericin, which also acts in the sense of the invention.
  • the present invention also relates to a method for tumor prevention in which the pharmaceutical preparations described above are applied to the human or animal body in an amount which is sufficient and effective, the epoxidation activity of the
  • Plasma concentrations of approx. 13 ⁇ g hypericin / L which are reached in the steady state with the usual administration of 900 mg St. John's wort dry extract / day (Johne et al., In Clin. Pharmacol. Ther.
  • Hypericin derivative dose should therefore usually be about 10 to 500 ⁇ g / day, preferably 70-500 ⁇ g / day, particularly preferably from 200 to 400 ⁇ g / day.
  • the present invention furthermore relates to the use of hypericin and / or its derivatives for producing a food or nutritional supplement which promotes the breakdown of toxic and procarcinogenic substances, and the food or nutritional supplement which contains hypericin and / or its derivatives in a nutritionally effective amount , It is a functional nutritional or nutritional supplement for tumor prevention that inhibits the epoxidation activity of the enzyme CYPIAI.
  • the hypericin can preferably also be present in the form of a dry extract rich in hypericin, preferably from St. John's wort, in the food or nutritional supplement according to the invention.
  • the food or nutritional supplement according to the invention can, for example, be a food powder, it can also be pressed into tablets (swallowing and chewable tablets), filled into capsules, in liquid form or as an emulsion.
  • the food or nutritional supplement can contain milk powder, carbohydrates, vitamins, minerals, trace elements, lipids and optionally antioxidants (eg lycopene) and plant extracts.
  • the hypericin, its derivatives or the hypericin-rich extract can be added to a tried-and-tested standard vitamin formulation (eg vit. A, E, C) or prepared on the basis thereof.
  • the required daily dose can be achieved, for example, with a formulation for a tablet which contains 0.1 to 0.17 mg hypericin / hyp derivative (at a dosage of three tablets / day). If a hypericin-rich dry extract (0.3% by weight) is used, one tablet must contain at least 100 mg of the extract. It is of course possible to enrich any food or food supplement with hypericin / hypericin derivatives.
  • a simple production route can be, for example, adding a hypericin-rich St. John's wort extract.
  • the invention therefore also relates to the use of hypericin or its derivatives as an additive to known foods.
  • Figure 1 Activation of Benz [a] pyrene by CYPIAI to its ultimately carcinogenic form
  • Figure 2 Inhibition of human CYPIAI activities by resveratrol
  • Figure 3 Inhibition of human CYPIAl activities by hypericin
  • Quercetin, B [a] P, 7-ethoxyresorufin, resorufin, alpha-naphthoflavone, dilaurylphosphatidylcholine (DLPC) were purchased from SIGMA (Deisenhofen, Germany).
  • Human CYPIAI and P450 reductase were heterologously expressed in Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells using the baculovirus expression system and then isolated and purified.
  • the cDNAs were cloned into baculovirus transfer vectors pBlueBac4.5 (Invitrogen, Netherlands) as described by Schwarz et al. in Pharmacogenetics 10 (2000) 519-530.
  • An N-terminal 72 bp Sphl-SexAI fragment was then replaced by the same with the following modifications: the coding sequence upstream of the stop codon was expanded by a coding sequence for a thrombin cleavage site and 6xHis residues.
  • the entire modified CYPIAI sequence was then cloned into the vector pAcMP3 (Pharmingen, USA) (under the control of the 'late basic protein promoter "P CO ⁇ ) - the pAcMP3 plasmid modified in this way was amplified in E. coli and prepared recombinant baculoviruses (according to the manufacturer's protocol Pharmingen) was used.
  • the expression ' was carried out in 400 ml of Sf9 spinner cultures for about 55 h, after which the cells were harvested, lysed and the protein as CYPIAI
  • CYPIAI was electrophoretically homogeneous with a specific P450 content of 11 nmol / mg protein.
  • the expression of the reductase was carried out analogously, its purification was carried out according to the method described by Tamura et al. in Arch. Biochem. Biophys 293 (1992) 219-223.
  • This test (epoxidation of 7, 8-diol-B [a] P) serves to detect the terminal epoxidation when B [a] P is activated to give the B [a] P diol epoxides 1 and 2 (DE1 and DE2), where DE2 is the ultimate carcinogenic metabolite that leads to cancerogenesis through DNA adduct formation.
  • the 7,8-diol-B [a] P epoxidation was detected by HPLC separation and spectrophotometric detection of the products in accordance with published methodology (Yang et al., In Cancer Res. 35 (1975) 3642-3650; Schwarz et al.
  • a reconstituted enzyme system consisting of the purified enzymes (CYPIAI and P450 reductase) and lipid (DLPC).
  • the reconstituted system consisting of 200 pmol purified CYPIAI (28 nmol / ml), 900 pmol purified " reductase (56 nmol / ml) and 0.5 mg DLPC (5 mg / ml), was in 200 ul buffer (50 mM Tris / HCl , 100 mM NaCl, pH 7.5) incubated on ice for 10 min
  • 10 ⁇ l aliquots of this enzyme-lipid mix (corresponding to 10 pmol CYPIAI) per reaction with the substrate 7, 8-diol-B [a ] P (final concentration: 2 ⁇ M) and the corresponding inhibitor concentration in 200 ⁇ l buffer, then diluted to 990 ⁇ l and preincubated again for 1 min at
  • the reaction was carried out by adding 10 ⁇ l NADPH (16.6 mg / 200 ⁇ l ) was started and carried out in a water bath at 37 ° C. for 15 minutes, after which the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of IM K-phosphate buffer (pH 3.5) and the suspension was left for hydrolysis at 4 ° C. for 1 hour. After addition of 10 ⁇ g 1, 1 "-bi ⁇ 2-naphthol (10 ⁇ g / lO ⁇ l methanol) as an internal HPLC standard, the products and substrate were extracted twice using ethyl acetate.
  • This test (aryl hydrocarbon hydroxylation, AHH) is an assay to quantify the CYPIAI-catalyzed hydroxylation of B [a] P to 3-OH-B [a] P.
  • the reaction characterizes the detoxification path (see FIG. 1).
  • the B [a] P hydroxylation was quantified by fluorescence detection of the products according to the classic AHH test (Nebert and Gelboin in J. Biol. Chem. 243 (1968) 6242-6249).
  • the reconstituted CYPIAl system enzyme-lipid mix
  • This test (7-ethoxyresorufin-O-deethylation, EROD). is the well-known standard assay to characterize the activity of CYPIAI, which measures the conversion of the substrate to resorufin using fluorescence spectroscopy
  • the reconstituted CYPIAI system was as under example
  • the inhibition constants for hypericin and quercetin were determined by analyzing the inhibitor kinetics, ie by measuring the enzyme kinetics for different inhibitor concentrations. For hypericin, the analyzes were carried out with a substrate concentration of 2 ⁇ M for four inhibitor concentrations (0, 1, 2 and 5 ⁇ M). For quercetin, the measurements were carried out at the same substrate concentration for the following inhibitor concentrations: 0, 1, 5 and 10 ⁇ M.
  • the conversion rates were first analyzed by Lineweaver-Burk plots and the type of inhibition (competitive, non-competitive, uncompetitive or mixed type) before the kinetic constants, including the inhibition constants Ki, by non-linear regression using SIGMA-PLOT-2001 and ENZYME - KINETICS module 1.1 (software from SPSS Science Software, Erkrath, BR Germany) were determined.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention primärer Tumoren. Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels zur Tumorprävention und das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, umfassend Hypericin, in einer ernährungswirksamen Menge. Bevorzugt kann Hypericin in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, eingesetzt werden.

Description

Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Prävention primärer Tumore
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention primärer Tumore . Gegenstand der Erfindung sind auch die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines funktionellen Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels zur Tumorprävention und das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, umfassend Hypericin, in einer ernährungswirksamen Menge. Bevorzugt kann Hypericin in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, eingesetzt werden.
In Anbetracht der bis heute begrenzten therapeutischen Möglichkeiten besteht unter Fachleuten die Ansicht, dass die Chemoprävention der Krebserkrankungen durch spezifische Nahrung, funktionelle Nahrungsmittel,
Nahrungsergänzungsmittel und spezifische
Arzneimittelzusammensetzungen enormes Potential zur Lebensverbesserung beinhaltet. Es ist bekannt, dass beispielsweise polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAKs) krankhei sauslösende Substanzen sind. PAKs können aus der Umgebung (Abgase) oder beim Rauchen aufgenommen werden, aber auch beim Grillen entstehen polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe. Sie werden insbesondere für die Entstehung mutagener Veränderungen und maligner Tumore verantwortlich gemacht. Die Metabolisierung dieser Substanzen im Körper war Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten und ist am Beispiel eines der wichtigsten Vertreter, dem Benzo [a] pyren (B [a] P) , in Figur 1 dargestellt. Aus Figur 1 wird deutlich, dass das humane Enzym Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1) in der Krankheitsentstehung eine wichtige Rolle spielt.
Die erste Stufe der Bioaktivierung des B [a] P führt über die CYP1A1-katalysierte Bildung des B [a] P-7, 8-Epoxids und dessen Hydrolyse durch Epoxidhydrolase (EH) zum B[a]P-7,8- Dihydrodiol (7, 8-diol-B [a] P) . In einem zweiten Schritt wird dann das entstandene 7, 8-diol-B [a] P durch CYP1A1 zum genotoxischen (±) -B [a] P-r-7, t-8-dihydro-diol-t-9, 10-Epoxid
(Diolepoxid 2, DE2) metabolisiert . Das Enzym Cytochrom
P450 1A1 katalysiert also beide Epoxidationsschritte der
Aktivierung von Benzpyrenen zu den Diolepoxiden, deren DNA- Addukte als die eigentlichen Krankheitsauslöser angesehen werden. Shimada et al . beschreiben in Drug Metab. Dispos.
29 (2001) 1176-1182, dass das humane Cytochrom P450 1A1
(CYP1A1) das wichtigste in die chemische Carcinogenese involvierte Enzym ist. Es wird durch PAKs wie z.B. Benzo [a] pyren induziert und aktiviert diese und viele andere Umweltgifte und Prόcarcinogene zu den eigentlichen Carcinogenen (Guengerich, F. P., Cancer Res . 48 (1988) 2946-2954) . CYP1A1 ist im Wesentlichen ein extrahepatisch.es Enzym, neben der Lunge wird es vor allem im gesamten gastro-intestinalen Trakt (Speiseröhre, Magen, Dünn- und Dickdarm) , in der Placenta, dem Gehirn und den Lymphozyten exprimiert .
Aus Figur 1 wird allerdings auch deutlich, dass CYP1A1 daneben die Hydroxylierung des B[a]P, die zu den Phenolen führt, hauptsächlich zu 3-OH-B[a]P, die keine carcinogenen Produkte darstellen und den Detoxifikationsweg charakterisieren, katalysiert.
Als eine wichtige chemopräventive Verbindung, die die Bildung von DNA-Addukten verhindert, gilt Quercetin, als natürlich vorkommendes Flavonoid Bestandteil vieler Früchte und Gemüse, das z.B. auch im Johanniskraut enthalten ist. So beschreiben Kang et al . in "Nutrition and Cancer" 35(2) (1999), 175-179, dass Quercetin die Entstehung Benzo [a] pyren-induzierter DNA-Addukte in humanen Hep G2- Zellen durch Beeinflussung der CYP1A1-Genexpression inhibiert. Die Autoren schluss olgern, dass Quercetin eine langanhaltende präventive Wirkung auf die chemische Cancerogenese von Menschen haben kann, die eine an Gemüse und Früchten reiche Nahrung zu sich nehmen.
Natürlich vorkommende pflanzliche Phenole wie Tanninsäure, Quercetin, Myricetin und Anthraflavonsäure werden von Das, M. et al. in "Cancer Res . 47 (3) (1987), 767-73" als potente Inhibitoren der PAK-DNA- ddukt-Bildung in der Epi- dermis und der Lunge von SENCAR-Mäusen beschrieben. Die Autoren schlussfolgern, dass sich diese pflanzlichen Phenole als geeignet erweisen könnten, das Risiko der Tumorinduktion durch PAKs zu modifizieren.
DE 100 16 771 AI beschreibt Quercetin und strukturell ähnliche Verbindungen zur Chemoprävention von Darmerkrankungen, insbesondere von Colonkarzinomen. US 6,008,260 offen- bart Resveratrol (Stilben-3, ' , 5-triol) als Mittel zur Cancerprophylaxe .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, hochwirksame Verbindungen zur Tumorprävention aufzufinden, insbesondere zur Prävention von Tumoren, die durch polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe hervorgerufen werden.
Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass Hype- ricin und seine Derivate hochpotente chemopräventive Verbindungen zur Prophylaxe jeglicher Erkrankungen sind, die mit mutagenen Veränderungen einhergehen, wie z.B. neoplastische Transformationen, und insbesondere zur Cancerprophylaxe .
Bisher wird Hypericin in der Literatur zur Behandlung vira- ler Infektionen (EP 0 332 679) , zur photodynamischen Diagnose/Therapie von malignen Erkrankungen (WO 00/53170, WO 01/89576) und in kombinierter Gabe mit Hyperforin zur Behandlung von Hautkrebs (WO 00/30660 A2) beschrieben.
Hypericin gehört zu den Naphthodianthronen und hat folgende Strukturformel :
Hypericin ist ein Bestandteil von Pflanzen, die zur Art Hypericum (Johanniskraut) gehören [vgl. A. Nahrstedt et al., Phar acopsychiat . 30 (1997) (supplement) 129-134]. Die Reinsubstanz Hypericin kann aus Pflanzen isoliert werden oder auch chemisch synthetisiert werden. Eine ganze Reihe von Synthesewegen sind beschrieben (vgl. z.B. US 2,707,704, EP 0 432 496) . Es wurde nun festgestellt, dass Hypericin ein potenter Inhibitor der Epoxidation des 7, 8-diol-B [a] P zu den Diolepoxiden ist, also des terminalen, zu den letztendlich genotoxischen und carcinogenen Produkten führenden Schrittes . Daneben hat Hypericin keinen oder einen nur sehr geringen Einfluss auf die Hydroxylierung des B[a]P, die zu den Phenolen führt und den Detoxifikationsweg darstellt (vgl. Fig. 1) .
Damit ist Hypericin beispielsweise dem als Cancerprophylak- tikum beschriebenen Resveratrol überlegen, das zwar die Hydroxylierung des B [a] P nicht hemmt, aber andererseits auch die Epoxidation des 7, 8-diol-B [a] P zu den genotoxischen Diolen nur leicht inhibiert (vgl. Fig. 2) . Figur 3 zeigt, dass Hypericin dagegen die Epoxidation außerordentlich stark inhibiert, ohne einen wesentlichen Einfluss auf den Hydroxylierungsweg zu nehmen, zumindest nicht bei Konzentrationen bis zu 5 μM, die weit über dem IC50-Wert von 0,5 μM für die Hemmung der Epoxidation liegen.
Um die Aktivität des CYP1A1 bei der Hydroxylierung des B [a] P zum 3-OH-B[a]P zu charakterisieren, wurde der AHH-
Test (aryl hydrocarbon hydroxylase assay) angewendet
(Nebert, D.W. et al . , J. Biol . Che . 243 (1968) 6242-6249).
Die Durchführung des Tests ist in Beispiel 1 beschrieben.
Um die Epoxidationsaktivität des CYP1A1 zu untersuchen, wurde erfindungsgemäß dessen Effekt auf die Epoxidation des 7, 8-diol-B [a] P zu den Diolepoxiden bestimmt, also der zweite, terminale Epoxidationsschritt untersucht. Die Durchführung dieses Epoxidationstests ist in Beispiel 2 beschrieben. Vergleichende Untersuchungen wurden zum EROD- Test vorgenommen, einem klassischen Test unter Verwendung eines (unphysiologischen) Modellsubstrates, zur Bestimmung der CYPIAI-Aktivität. Hierbei wird die O-Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin untersucht. Die Durchführung des EROD- Tests ist in Beispiel 3 beschrieben.
Es hat sich gezeigt, dass die alleinige Anwendung des EROD- Tests zu einer falschen Einschätzung der inhibitorischen Potenz einer Substanz führen kann. So wurde Resveratrol auf der Basis von EROD-Studien als ein starker selektiver Inhibitor des humanen CYPIAI identifiziert (Chun et al., Biochem. Biophys . Res. Commun. 262 (1999), 20-24), während sich im hier erstmalig angewendeten Epoxidationstest zeigt, dass Resveratrol die Epoxidation des 7, 8-diol-B [a] P nur leicht hemmt (vgl. Fig. 2.).
IC50-Werte wurden für Hypericin und vergleichsweise für Quercetin und α-Naphthoflavon bestimmt. Der IC50-Wert ist definitionsgemäß diejenige Inhibitorkonzentration, die zur 50%-igen Hemmung der Reaktion führt. Der IC50-Wert des Hypericins wurde zu 0,5 μM bestimmt, während z.B. der von Quercetin, auch einem pflanzlichen Phenol, das präventiv auf die chemische Cancerogenese wirkt, bei 1,5 μM liegt. Selbst der IC50-Wert des α-Naphthoflavons (α-NF, Alpha-NF) , einem gut bekannten selektiven CYPIAI-Inhibitor, liegt bei 0,8 μM. Letzterer Wert wurde von den Erfindern erstmalig für die Hemmung der CYPIAI-abhängigen Epoxidation von 7,8- diol-B[a]P bestimmt. In Figur 4 sind die reziproken IC50- Werte für Hypericin, Quercetin und α-Naphthoflavon zum Vergleich des relativen inhibitorischen Potentials dieser Substanzen dargestellt .
Enzymkinetische Studien (Inhibitorkinetik) haben gezeigt, dass Hypericin ein potenter nicht-kompetitiver Inhibitor der CYPIAl-Epoxidationsaktivität ist, mit einer Hemmungskonstante (Ki-Wert) von ca. 0,6 μM. Dagegen ist Quercetin ein Inhibitor vom Mischtyp (kompetitive plus nicht-kompetitive Hemmung) mit einem Ki = 2,4 μM.
Es wurde somit gefunden, dass Hypericin und/oder seine Derivate vorteilhaft zur Prävention PAK-induzierter Tumore eingesetzt werden können, insbesondere zur Prävention von Lungenkarzinom, Mammakarzinom, . Portiokarzinom, Darmkarzinom, Hautkarzinom und Hirnkarzinom. Die Substanzen sind auch zur Prävention anderer, durch PAK induzierte Erkrankungen einsetzbar, z.B. zur Prävention von neoplastischen Transformationen.
Basierend auf den oben dargelegten Ergebnissen ist auch die Verwendung von Hypericin uήd/oder dessen Derivaten zur Hemmung der Epoxidationsaktivität des Enzyms CYPIAI Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Als Hypericin-Derivate kommen erfindungsgemäß insbesondere Pseudohypericin, Protohyperi- cin, Pseudoprotohypericin, Cyclopseudohypericin und Emodi- nanthron in Frage. Vorzugsweise werden Hypericin und seine Derivate in Form ihrer Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, z.B. als Acetate oder Phosphate,, eingesetzt.
Zur Herstellung eines Arzneimittels werden diese Verbindun- gen oder Gemische dieser Verbindungen in an und für sich bekannter Art und Weise mit geeigneten Hilfs- und/oder Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln zu festen oder flüssigen Darreichungsformen, zu Injektions- oder Infusionslösungen oder zu topischen Darreichungsformen formuliert. Die orale Gabe der erfindungsgemäßen Wirkstoffe ist bevorzugt. Die parenterale Gabe ist selbstverständlich auch möglich. Die Herstellung der galenischen Formulierungen stellt für den Fachmann kein Problem dar. Ein Verfahren zur galenischen Zubereitung von Infusions- oder Injektionslösungen von Hypericin oder Hypericinderivaten ist beispielsweise in DE 39 12 433 AI beschrieben. Galenische Formulierungen (speziell in Kombination mit Vitaminen) können anhand der Richtlinien aus „Vademecum for Vitamin Formulations" (2nd ed., ed.: Volker Bühler, Wiss. Verlagsges. Stuttgart, 2002) hergestellt werden.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, anstelle des reinen Hypericins/Hypericinderivats einen hypericinreichen pflanzlichen Extrakt, insbesondere aus Johanniskraut, besonders bevorzugt aus Hypericum perforatum, einzusetzen. Die Herstellung eines solchen Extraktes ist beispielsweise in DE 39 35 772 AI beschrieben. Aber auch kommerziell erhältliche Johanniskraut-Trockenextrakte, beispielsweise Esbericum®-Kapseln (Schaper und Brummer, Salzgitter Deutschland) , sind hypericinreich. Hypericinreich bedeutet im Sinne der Erfindung, dass mindestens 0,3 bis 0,35 Gew% Hypericin im Trockenextrakt enthalten sind. Im Johanniskraut kommen Hypericin und Pseudohypericin nebeneinander vor, so dass hypericinreiche Johanniskrautextrakte neben dem. Hypericin auch immer das Pseudohypericin enthalten, das ebenfalls im erfindungsgemäßen Sinne wirkt.
Da bekanntermaßen kommerziell erhältliche Johanniskraut- Extrakte, darunter auch die hypericinreichen, zur Behandlung von Verstimmungszuständen und nervöser Unruhe eingesetzt werden, und von großen. Teilen, insbesondere der älteren und kranken (insbesondere AIDS-kranken) Bevölkerung genutzt werden, wird damit erfindungsgemäß gleichzeitig ein tumorpräventiver Effekt erzielt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Tumorprävention, bei dem die oben beschriebenen ■ pharmazeutischen Zubereitungen dem menschlichen oder tierischen Körper in einer Menge appliziert werden, die ausreichend und effektiv ist, die Epoxidationsaktivität des
Enzyms CYPIAI zu inhibieren. Es hat sich gezeigt, dass
Plasmakonzentrationen von ca. 13 μg Hypericin/L, die bei üblicher Verabreichung von 900 mg Johanniskraut- Trockenextrakt/Tag durchschnittlich im stationären Zustand erreicht werden (Johne et al., in Clin. Pharmacol . Ther.
(1999) 338-345) im in- vitro- Experiment zu einer mehr als
90%-igen Hemmung von CYPIAI führen. Die Hypericin- bzw.
Hypericin-Derivat-Dosis sollte deshalb üblicherweise ca. 10 bis 500 μg/Tag betragen, bevorzugt 70-500 μg/Tag, besonders bevorzugt von 200 bis 400 μg/Tag.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin die Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines den Abbau toxischer und procarcinogener Substanzen fördernden Nahrungs- oder Nahrungsergänzungs- mittels sowie das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel, das Hypericin und/oder dessen Derivate in einer ernährungswirksamen Menge enthält . Es handelt sich damit um ein funktionelles Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel zur Tumorprävention, das die Epoxidationsaktivität des Enzyms CYPIAI hemmt . Bevorzugt kann das Hypericin auch in Form eines hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakts, vorzugsweise aus Johanniskraut, im erfindungsgemäßen Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel kann beispielsweise ein Nahrungsmittelpulver sein, es kann auch in Tabletten (Schluck- und Kautabletten) gepresst, in Kapseln abgefüllt, in flüssiger Form oder als Emulsion vorliegen. Beispielsweise kann das Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel Milchpulver, Kohlenhydrate, Vitamine, Mineralien, Spurenelemente, Lipide und gegebenenfalls Antioxidatien (z.B. Lycopin) und Pflanzenextrakte enthalten. Das Hypericin, dessen Derivate oder der hypericinreiche Extrakt kann einer erprobten Standard-Vitamin-Formulierung (z.B. Vit. A, E,C) zugesetzt oder auf deren Basis hergestellt werden. Die erforderliche tägliche Dosis kann beispielsweise erreicht werden mit einer Formulierung für eine Tablette, die 0,1 bis 0,17 mg Hypericin/Hyp.derivat enthält (bei einer Dosierung von drei Tabletten/Tag) . Bei Verwendung eines hypericinreichen Trockenextraktes (0,3 Gew.%) muß eine Tablette mindestens 100mg des Extraktes enthalten.. Es ist selbstverständlich möglich, jedes Nahrungsmittel- oder Nahrungsergänzungsmittel mit Hypericin/Hypericinderivaten anzureichern. Ein einfacher HerStellungsweg kann z.B. das Zusetzen eines hypericinreichen Johanniskrautextraktes sein. Gegenstand der Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von Hypericin oder dessen Derivaten als Zusatz zu bekannten Nahrungsmitteln.
Nachfolgend wird die Erfindung näher beschrieben, ohne sie auf die dargelegten Ausführungsformen einzuschränken.
Es zeigen:
Figur 1: Aktivierung von Benz [a] pyren durch CYPIAI zu seiner letztendlich carcinogenen Form;
Figur 2: Inhibition humaner CYPIAI-Aktivitäten durch Resveratrol ;
Figur 3 : Inhibition humaner CYPIAl-Aktivitäten durch Hypericin;
Die EROD-Aktivität ist aufrund der starken Eigenfluoreszenz von Hypericin nicht bestimmbar. Figur 4 : Inhibitorisches Potential von Hypericin, Quercetin und α-NF;
Wirkung auf die 7, 8-diol-B [a] P-Epoxidations- aktivität des humanen CYPIAI. Die reziproken ICΞ0-Werte wurden für alle drei
Inhibitoren dargestellt .
Ausführungsbeispiele
Materialien
Quercetin, B[a]P, 7-Ethoxyresorufin, Resorufin, Alpha- Naphthoflavon, Dilaurylphosphatidylcholin (DLPC) wurden bei SIGMA (Deisenhofen, BR Deutschland) gekauft . 3-OH-B[a]P, 7,8-dihydrodiol-B[a] P, die Tetrole r-7, t-8, t-9, c-10- tetrahydroxy-7, 8, 9, 10-tetrahydro-B [a] P (RTTC) , r-7, t-8, t- 9, t-10-tetrahydroxy-7, 8, 9, 10-tetrahydro-B [a] P (RTTT) , r- 7, t-8,c-9, t-10-tetrahydroxy-7, 8, 9, 10-tetrahydro-B [a] P (RTCT) , r-7, t-8,c-9,c-10-tetrahydroxy-7, 8, 9, 10-tetrahydro- B[a]P (RTCC) wurden bei NCI Chemical Carcinogen Repository (Midwest Research Institute, Kansas City, MI, USA) gekauft.
Klonen, heteroloqe Expression und Reinigung des rekombi- nanten-CYPIAI
Humanes CYPIAI und P450-Reductase wurden heterolog in Spodoptera frugiperda (Sf9) -Insektenzellen mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystem exprimiert und anschließend isoliert und gereinigt . Die Klonierung der cDNAs in Baculovirus-Transfervektoren pBlueBac4.5 (Invitrogen, Niederlande) erfolgte wie durch Schwarz et al. in Pharmacogenetics 10 (2000) 519-530 beschrieben. Danach wurde ein N-terminales 72 bp Sphl-SexAI - Fragment ersetzt durch ein gleiches mit folgenden Modifizierungen: die codierende Sequenz upstream des Stop-Codons wurde erweitert durch eine codierende Sequenz für eine Thrombin-Spaltstelle und 6xHis-Reste. Danach wurde die gesamte modifizierte CYPIAI-Sequenz in den Vektor pAcMP3 (Pharmingen, USA) umkloniert (unter Kontrolle des 'late basic protein promotor" PCOχ) - Das auf diese Weise modifizierte pAcMP3- Plasmid wurde in E. coli amplifiziert und zur Präparation rekombinanter Baculoviren (nach dem Protokoll des Herstellers Pharmingen) verwendet . Die Expression' erfolgte in 400 ml-Sf9-Spinnerkulturen über ca. 55 h, danach wurden die Zellen geerntet, lysiert und das CYPIAI-Protein als
6xHis-Fusionsprotein isoliert und gereinigt wie beschrieben durch Modi et al . in Biochemistry 35 (1996) 4540-4550, aber mit der Modifikation, daß eine Mischung von Emulgen 913
(2%)und Cholat (0.2%) für die Solubilisierung der Membranen eingesetzt wurde. CYPIAI war elektrophoretisch homogen mit einem spezifischen P450-Gehalt von 11 nmol/mg Protein. Die Expression der Reductase erfolgte analog, deren Reinigung wurde nach der von Tamura et al . in Arch. Biochem. Biophys 293 (1992) 219-223 beschriebenen Methode durchgeführt.
Beispiel 1
Durchführung des Epoxidationstests
Dieser Test (Epoxidation von 7, 8-diol-B [a] P) dient dem Nachweis der terminalen Epoxidation bei der Aktivierung von B[a]P zu den B [a] P-Diolepoxiden 1 und 2 (DE1 und DE2) , wobei DE2 der ultimativ carcinogene Metabolit ist, der durch DNA-Adduktbildung zur Cancerogenese führt. Die 7,8- diol-B [a] P-Epoxidation wurde durch HPLC-Trennung und spektralphotometrisehen Nachweis der Produkte entsprechend veröffentlichter Methodik nachgewiesen (Yang et al . , in Cancer Res. 35 (1975) 3642-3650; Schwarz et al . , in Carcinogenesis 22 (2001) 453-459) , ausgenommen der Verwendung eines rekonstituierten Enzymsystems bestehend aus den gereinigten Enzymen (CYPIAI und P450-Reductase) und Lipid (DLPC) . Das rekonstituierte System , bestehend aus 200 pmol gereinigtem CYPIAI (28 nmol/ml) , 900 pmol gereinigter " Reductase (56 nmol/ml) und 0.5 mg DLPC (5 mg/ml) , wurde in 200 μl Puffer (50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5) 10 min auf Eis inkubiert. Für den Test wurden 10 μl-Aliquote dieses Enzym-Lipid-Mix (entsprechend 10 pmol CYPIAI) pro Reaktion mit dem Substrat 7, 8-diol-B [a] P (Endkonzentration: 2 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration in 200 μl Puffer inkubiert, danach auf 990 μl verdünnt und nochmals 1 min bei 37 °C präinkubiert . Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 μl NADPH (16,6 mg/200 μl) gestartet und im Wasserbad bei 37 °C für 15 min durchgeführt. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μl IM K-Phosphat-Puffer (pH 3,5) gestoppt und die Suspension für lh bei 4 "C der Hydrolyse überlassen. Nach Zugabe von 10 μg 1, l"-bi~2-Naphthol (10 μg/lOμl Methanol) als internem HPLC-Standard wurden die Produkte und Substrat zweimal mittels Ethylacetat extrahiert . Nach Eindampfen des Lösungsmittels wurden Produkte und Substrat in 100 μl Methanol aufgenommen, in einem Ultraschallbad homogenisiert und in die HPLC-Anlage injiziert. Für die IC50- und die kinetischen Studien wurden Stamm-Lösungen mit geeigneter Inhibitorkonzentration in DMSO präpariert um zu gewährleisten, daß die DMSO- Konzentration < 0.5% war. Die Kontrollen (ohne Inhibitor, 100% Aktivität) wurden mit der entsprechenden Menge DMSO durchgeführt . Trennung und Identifizierung der Produkte und ihre Analyse wurden mittels 'Reversed-Phase"-HPLC nach der durch Schwarz et al., in Carcinogenesis 22 (2001) 453-459 und Shou et al. in Mol. Carcinogenesis 10 (1994) 159-168) publizierten Methodik durchgeführt. Obwohl beide Diolepoxide DE1 und DE2) als Produkte analysiert wurden, beziehen sich alle in der vorliegenden Arbeit aufgeführten und diskutierten Aktivitäten und Bildungsraten, einschließlich der kinetischen Analysen, auf DE2, da es das ultimativ cancerogene Produkt darstellt und mit einer erheblich größeren Rate als DE1 gebildet wird.
Beispiel 2
Durchführung des AHH-Tests
Dieser Test (Aryl Hydrocarbon Hydroxylation, AHH) ist ein Assay zur Quantifizierung der CYPIAI-katalysierten Hydroxylierung von B [a] P zu 3-OH-B[a]P. Die Reaktion charakterisiert den Entgiftungsweg (vgl. Figur 1). Die B [a] P-Hydroxylierung wurde durch Fluoreszenznachweis der Produkte entsprechend dem klassischen AHH-Test quantifiziert (Nebert und Gelboin in J. Biol. Chem. 243 (1968) 6242-6249) . Das rekonstituierte CYPIAl-System (Enzym-Lipid-Mix) wurde, wie für den Epoxidations-Test (Beispiel 1) beschrieben, präpariert. Jedoch wurden hier 20 μl-Aliquote (entsprechend 20 pmol CYPIAI) pro Assay eingesetzt und in 250 μl Endvolumen zusammen mit dem Substrat B[a]P (Endkonzentration: 5 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration gelöst. Präinkubation und Reaktion erfolgten wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Reaktion wurde mit 1 ml Aceton (kalt) gestoppt und die Produkte und Substrat mit 3,25 ml n-Hexan extrahiert. 1 ml- Aliquote der organischen Phase wurden gemischt mit 3 ml IN NaOH und das gebildete 3-OH-B[a]P fluorimetrisch nachgewiesen (Anregung: 396 nm, Emission: 519 nm, Spektralfluorimeter RF5000-PC, Shimadzu, Japan) . Die Quantifizierung erfolgte mittels einer Eichkurve, die unter gleichen Bedingungen mit authentischem 3-OH-B[a]P aufgenommen wurde . Beispiel 3
Durchführung des EROD-Tests
Dieser Test (7-Ethoxyresorufin-O-Deethylierung, EROD) . ist der bekannte Standard-Assay zur Charakterisierung der Aktivität von CYPIAI, der die Umsetzung des Substrates zu Resorufin mit Hilfe der FluoreszenzSpektroskopie misst
(Burke und Mayer in Chem. Biol. Int. 45 (1983) 243-258) .
Das rekonstituierte CYPIAI-System wurde wie unter Beispiel
1 beschrieben präpariert. 10 μl-Aliqote (entsprechend 10 pmol CYPIAI) wurden mit dem Substrat (Endkonzentration: 0.5 μM) und der entsprechenden Inhibitorkonzentration in 200- μl inkubiert, auf 790 μl verdünnt und 1 min bei 37 °C präinkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 10 μl NADPH gestartet wurde. Nach 15 min bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5 ml Aceton (kalt) gestoppt. Danach wurde die Suspension 5 min bei 3000 U/min zentrifugiert und das gebildete Produkt Resorufin durch Messung seiner Fluoreszenz nachgewiesen (Anregung: 530 nm, Emission: 585 nm) . Die Quantifizierung erfolgte mittels einer Eichkurve, die unter den gleichen Bedingungen mit authentischem Resorufin erstellt wurde.
Beispiel 4
Bestimmung der IC50-Werte, Bestimmung der Hemmungskonstanten für Hypericin und Quercetin
Für die Bestimmung der IC50-Werte wurden die Aktivitäten
(z.B. die Bildungsrate von DE2) in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration, wie in Beispiel 1 - 3 beschrieben, gemessen. Die gemessenen Aktivitäten wurden auf die Kontrollaktivität (100%) in Abwesenheit des Inhibitors bezogen. Danach erfolgte die Bestimmung des IC50-Wertes durch lineare Regression der prozentualen Aktivitäten vs . der logarithmisch transformierten Inhibitorkonzentrationen. Die Bestimmung der Hemmkonstanten für Hypericin und Quercetin erfolgte durch Analyse der Inhibitorkinetik, d.h. durch Messungen der Enzymkinetik für verschiedene Inhibitorkonzentrationen. Für Hypericin wurde die Analysen mit einer Substratkonzentration von 2 μM für vier Inhibitorkonzentrationen durchgeführt (0, 1, 2 und 5 μM) . Für Quercetin erfolgten die Messungen bei der gleichen Substratkonzentration für folgende Inhibitorkonzentrationen: 0, 1, 5 und 10 μM. Danach wurden die Umsatzraten zunächst durch Lineweaver-Burk-Plots analysiert und der Typ der Inhibierung bestimmt (kompetitiv, nicht kompetitiv, unkompetitiv oder Mischtyp) , ehe die kinetischen Konstanten, einschließlich der Hemmkonstanten Ki, durch nichtlineare Regression mittels SIGMA-PLOT-2001 und ENZYME- KINETICS-Modul 1.1 (Software von SPSS Science Software, Erkrath, BR Deutschland) bestimmt wurden.

Claims

Patentansprüche
Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention primärer Tumore .
2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Prävention PAK- induzierter Tumore.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher
Trockenextrakt . eingesetzt wird, vorzugsweise ein Johanniskraut-Extrakt .
4. Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Epoxidationsaktivität des Enzyms CYPIAI (Cytochrom P450 1A1) .
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher Trockenextrakt eingesetzt wird, . vorzugsweise ein Johanniskraut- Extrakt .
6. Verfahren zur Tumorprävention durch Gabe einer präventiven pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge, die ausreichend ist, um die Epoxidationsaktivi- tat des Enzyms CYPIAI zu hemmen, wobei die Zusammenset- zung eine effektive Menge an- Hypericin. und/oder dessen Derivaten umfasst .
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu applizierende Zusammensetzung einen hypericinreichen pflanzlichen Trockenextrakt umfasst, vorzugsweise einen Johanniskraut-Extrakt.
8. Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten zur Herstellung eines funktioneilen Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittels zur Tumorprävention.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein hypericinreicher pflanzlicher Trockenextrakt eingesetzt wird, vorzugsweise ein Johanniskraut- Extrakt .
10. Funktionelles Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel zur Tumorprävention umfassend eine ernährungswirksame Menge an Hypericin und/oder dessen Derivaten.
11. Nahrungs- oder Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch
9, umfassend einen hypericinreichen pflanzlichen
Trockenextrakt, vorzugsweise einen Johanniskraut- Extrakt .
12. Verwendung von Hypericin und/oder dessen Derivaten als Zusatz zu Nahrungsmitteln.
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