EP1559478A1 - Contamination shield - Google Patents
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- EP1559478A1 EP1559478A1 EP04001498A EP04001498A EP1559478A1 EP 1559478 A1 EP1559478 A1 EP 1559478A1 EP 04001498 A EP04001498 A EP 04001498A EP 04001498 A EP04001498 A EP 04001498A EP 1559478 A1 EP1559478 A1 EP 1559478A1
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Definitions
- the present invention relates to a contamination barrier and a method for Avoiding contamination of aqueous solutions, which in particular by Carrying out and / or aerosol formation, for example when pipetting on open Systems arise.
- hoods or, as in the Gebrausmusterschrift DE 200 06 546 U1 shown covering mats to protect multiple in a plate-shaped body trained and upwardly open reaction vessels disclosed. This kind of cover protects only the samples of a rack, for example, during transport and / or in the Bearing condition. However, when editing the individual samples on the rack occur continue to contaminate.
- sterile consumables known in the art may also be used such as specially coated disposable pipettes and / or disposable filter tips the cross-contamination rate is reduced only, but not completely eliminated. So contaminations are still mainly in the ppm range also continue (for example in the field PCR diagnostics, where single molecules are detected) is a fundamental problem.
- Closure options such as various lids, septa and / or filters etc. developed for single or multiple sample vessels.
- these have disadvantages in the Handling, especially in the field of automation on, for example, the opening and closing of caps, etc., especially individual samples, very time consuming and depending on the closure system is hardly feasible by machine.
- sample vessels with septa and / or thin filter materials are not in each Robotic or automatic pipetting variable, since only few pipette tips and / or pipette needles for the use of such sample containers suitable.
- the present invention has the object to enable an efficient and reproducible processing of a high number of samples while avoiding contamination in the solutions to be analyzed in open and / or automated systems.
- This object is achieved by providing a contamination barrier to avoid contamination of aqueous solutions in open and / or automated systems, which has at least one water-immiscible hydrocarbon and / or a hydrocarbon mixture.
- the object of the present invention is achieved by providing a method for preventing contamination in that, for processing aqueous solutions in open and / or automated systems, they are overcoated with at least one water-immiscible hydrocarbon or a hydrocarbon mixture.
- the contamination barrier according to the invention is characterized in particular by its flexible use in a wide variety of sample vessels. It is particularly advantageous that the contamination barrier of the invention easily and quickly even in very small Sample vessels formed and can be removed again. In particular, can on a increased time-consuming and costly, manual or even mechanical use of Caps and / or septa etc. are dispensed with.
- Another advantage of Contamination barrier according to the invention is their flexible introduction into the Sample vessel, which, in contrast to the use of septa and / or filter materials, which are fixed in the sample vessel, the volume of the aqueous solution at any time can be varied without forming a cavity in which it is a Contamination-induced aerosol formation comes. Very particularly advantageous is the Use in very small volumes of aqueous solutions (eg in the ppm range and smaller).
- the inventive Contamination barrier preferably at least one substituted or unsubstituted, branched or unbranched hydrocarbon.
- the inventive Contamination barrier of a cyclic, saturated or unsaturated Hydrocarbon such as cyclohexane, etc.
- an aromatic hydrocarbon such as benzene or toluene, etc.
- hydrocarbons used according to the invention as substituents for example, one or more halogen atom (s), nitro group (s) and / or amino group (s).
- hydrocarbon compounds can be used individually or else in Mixtures (eg a hydrocarbon mixture such as mineral oil) are present.
- mineral oil is understood as meaning the liquid distillation products obtained from mineral raw materials, such as, for example, crude oil, lignite and hard coal, wood or peat, which consist essentially of mixtures of long-chain, aliphatic and saturated hydrocarbons.
- mineral raw materials such as, for example, crude oil, lignite and hard coal, wood or peat, which consist essentially of mixtures of long-chain, aliphatic and saturated hydrocarbons.
- Particularly suitable are distillation products or hydrocarbon mixtures, such as white oil and / or other paraffin oils containing mainly long-chain alkanes, preferably having 13 to 20, particularly preferably 14 to 16 carbon atoms.
- hydrocarbons are, in the first place, branched or branched understood unbranched hydrocarbons, the 5 to 20, preferably 6 to 16, more preferably 8 to 12 carbon atoms.
- Very particularly preferred branched or unbranched alkanes having 8 to 12 carbon atoms are used, including, in turn, octane, nonane, decane and / or dodecane and mixtures thereof particularly preferred.
- the Contamination barrier according to the invention preferably for the coating of aqueous Solutions in open and / or automated systems with biological sample material used.
- biological sample material is used Biopolymers understood that, on the one hand, naturally occurring macromolecules, such as For example, nucleic acids, proteins or polysaccharides, on the other hand may be synthetically prepared polymers, as long as they are the same or similar Blocks contain, like the natural macromolecules.
- FIGS. 1 and 3 It can clearly be seen from the prior art shown in FIGS. 1 and 3 that, for example by means of a pipetting device 6 or the like, by mechanical action during pipetting operations and / or mixing of the sample, etc., in a commercially available reaction vessel 1 a pipetting plate 2 (such as a microtiter plate, etc.) on a biological sample containing aqueous solution 3, the aerosols 4 form.
- a pipetting plate 2 such as a microtiter plate, etc.
- Such aerosol formation can, as soon as the aerosol 4 flows out of the reaction vessel 1, easily lead to contamination of adjacent reaction vessels.
- the contamination barrier 5 shown in FIGS. 2, 4 and 5 By the contamination barrier 5 shown in FIGS. 2, 4 and 5 according to the invention Such a contamination-related aerosol formation is avoided because the aqueous Aerosols 4 can not penetrate the contamination barrier 5.
- the water-insoluble Contamination barrier 5 is in the reaction vessel 1 as a film on the aqueous Solution 3 in which the biological sample material is in dissolved form.
- the contamination barrier 5 as opposed to firmly introduced into reaction vessels Filters and / or septa, also very flexible, can at any time by means of a Pipetting device 6 the reaction vessel 1 variable amounts of aqueous solution. 3 taken or added without being between the surface of the aqueous solution 3 and the contamination barrier 5 forms a cavity, whereby in addition, the formation of aerosols 4 is avoided.
- Kits eg QIAamp 96 Virus BioRobot Kit / QIAGEN GmbH
- the purified nucleic acid was finally eluted from the filter system under vacuum for one minute with 50 ⁇ l and once with 100 ⁇ l of at least one commercially available elution buffer (eg Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) (KQ 9!).
- the collected eluate was processed outside the automated pipetting system for the subsequent amplification process.
- a commercially available enzyme mix eg Mastermix / QIAGEN GmbH
- An RT-PCR was carried out to determine the nucleic acid contamination and the results were evaluated.
- Run 1bIII was followed after, in Run 1bII, Row B due to the lack of PP task could not be evaluated. During the experiment could however, no specific incidents due to carryover of sample material during pipetting operations or aerosol formation.
- the filters loaded with the nucleic acid were subsequently under vacuum in each case with 800 ⁇ l of a commercially available washing buffer (eg Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) And then in a second washing step with 930 ⁇ l ethanol (pa or at least 96%) (KQ 7!) and then dried the membranes to remove ethanol under vacuum and 60 ° C in an automated vacuum device (eg RoboVac / QIAGEN GmbH) (KQ 8!).
- a commercially available washing buffer eg Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH
- the purified nucleic acid was finally eluted under vacuum for one minute with 50 ⁇ l and once with 100 ⁇ l of at least one elution buffer (eg Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) from the filter system (KQ 9!).
- the collected eluate was processed outside the automated pipetting system for the subsequent amplification process.
- a commercially available enzyme mix eg Mastermix / QIAGEN GmbH
- KQ 10! An RT-PCR was carried out to determine the nucleic acid contamination and the results were evaluated.
- the contamination barrier according to the invention in other Modules of sample processing, in which (cross) contamination occur, used become.
- the use of the contamination barrier according to the invention prevents For example, in an equally advantageous manner, cross-contamination caused by aerosol formation, when overturning with wash buffers, by dispensing with a dispenser he follows.
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kontaminationsbarriere sowie ein Verfahren zur Vermeidung von Verunreinigungen wässriger Lösungen, welche insbesondere durch Verschleppungen und/oder Aerosolbildung beispielsweise beim Pipettieren auf offenen Systemen entstehen.The present invention relates to a contamination barrier and a method for Avoiding contamination of aqueous solutions, which in particular by Carrying out and / or aerosol formation, for example when pipetting on open Systems arise.
Gerade im Bereich der Biotechnologie wurde in den letzten Jahren verstärkt nach Automationslösungen, zum sicheren und effizienten Abarbeiten, insbesondere bei einer großen Anzahl von Proben, wie sie beispielsweise beim HIV-Virus-Monotoring anfallen, gesucht. Vorzugsweise sind hierbei mehr und mehr vollautomatische Hochdurchsatz-Arbeitsstationen gefragt, die in kürzester Zeit eine sehr hohe Probenanzahl abarbeiten, wobei zudem immer mehr auf einen zusätzlichen manuellen Einsatz verzichtet wird, zugleich aber auch geringste Mengen an biologischem Material nachgewiesen werden sollen.In the field of biotechnology in particular, automation solutions, for safe and efficient processing, especially for a large one Number of samples, such as those incurred in HIV virus monotoring, searched. Preferably, this more and more fully automatic high-throughput workstations asked, which work in a very short time a very high number of samples, and always is dispensed with an additional manual use, but at the same time least Quantities of biological material to be detected.
Derzeit gängige Robotersysteme weisen jedoch beim Arbeiten mit biologischem Material speziell im Bereich der Molekularbiologie und/oder der Diagnostik ein grundlegendes Problem auf. Da die Proben üblicherweise in einem plattenförmigen Körper (wie beispielsweise einem Rack) aufgearbeitet werden, wobei die einzelnen Probengefäße offen nebeneinander stehen, kommt es, vornehmlich durch Aerosolbildung, aber auch immer wieder durch mechanische Verschleppung von Probenmaterial, bei der Bearbeitung zu Kontaminationen vorwiegend benachbarter Proben.However, currently common robot systems exhibit when working with biological material especially in the field of molecular biology and / or diagnostics a fundamental Problem on. Since the samples are usually in a plate-shaped body (such as For example, a rack), the individual sample containers open standing side by side, it comes, mainly by aerosol formation, but always again by mechanical carryover of sample material, during processing too Contamination of predominantly adjacent samples.
Zur Vermeidung derartiger (Kreuz-) Kontaminationen sind im Stand der Technik bereits einige Zusatzmodule und/oder Verbrauchsmaterialien für Robotersysteme bekannt. So werden beispielsweise Hauben oder, wie in der Gebrausmusterschrift DE 200 06 546 U1 dargestellt, Abdeckmatten zum Schutz mehrerer in einem plattenförmigen Körper ausgebildeter und nach oben offener Reaktionsgefäße offenbart. Diese Art der Abdeckung schützt jedoch nur die Proben eines Racks beispielsweise beim Transport- und/oder im Lagerzustand. Bei der Bearbeitung der einzelnen Proben auf dem Rack treten jedoch weiterhin Kontaminationen auf.To avoid such (cross) contamination are already in the art some add-on modules and / or consumables for robotic systems known. So For example, hoods or, as in the Gebrausmusterschrift DE 200 06 546 U1 shown covering mats to protect multiple in a plate-shaped body trained and upwardly open reaction vessels disclosed. This kind of cover protects only the samples of a rack, for example, during transport and / or in the Bearing condition. However, when editing the individual samples on the rack occur continue to contaminate.
Ferner kann auch durch die im Stand der Technik bekannte Verwendung von sterilem Verbrauchsmaterial wie beispielsweise speziell beschichteten Einmalpipetten und/oder Einmalfiltertips die Kreuzkontaminationsrate nur reduziert, nicht jedoch vollständig beseitigt werden. So sind Kontaminationen vor allem im ppm-Bereich auch weiterhin (zum Beispiel im Bereich der PCR-Diagnostik, wo Einzelmoleküle nachgewiesen werden) ein grundlegendes Problem.Further, the use of sterile consumables known in the art may also be used such as specially coated disposable pipettes and / or disposable filter tips the cross-contamination rate is reduced only, but not completely eliminated. So contaminations are still mainly in the ppm range also continue (for example in the field PCR diagnostics, where single molecules are detected) is a fundamental problem.
Des weiteren sind Verfahren bekannt, bei denen, wie beispielsweise in der europäischen Patentschrift EP 0011327 B1 dargestellt, der wässrigen Lösung wasserlösliche Verbindungen zur Vermeidung von Aerosolbildung einverleibt werden. Da diese sich jedoch mit der Probenflüssigkeit vermischen und diese gegebenenfalls sogar verändern bzw. zu unerwünschten Nebenreaktionen führen könnten, ist deren Einsatz äußerst nachteilig und insbesondere in der PCR-Diagnostik nicht denkbar.Furthermore, methods are known in which, such as in the European Patent EP 0011327 B1, the aqueous solution of water-soluble compounds be incorporated to avoid aerosol formation. Since these, however, with the Mix sample liquid and this may even change or to could cause undesirable side reactions, their use is extremely disadvantageous and especially conceivable in PCR diagnostics.
Weiterhin wurden zum Schutz vor Kontamination der Proben die unterschiedlichsten Verschlussmöglichkeiten, wie beispielsweise verschiedene Deckel, Septen und/oder Filter etc. für einzelne oder mehrere Probengefäße entwickelt. Diese weisen jedoch Nachteile im Handling, insbesondere im Bereich der Automatisierung auf, da beispielsweise das Öffnen und Schließen von Verschlussdeckeln etc., insbesondere einzelner Proben, sehr zeitaufwendig und je nach Verschlusssystem maschinell kaum realisierbar ist. Zudem besteht weiterhin die Gefahr, dass die im Probengefäß entstandenen Aerosole beim Bearbeiten entweichen und dadurch im nachfolgenden Schritt beim Öffnen des nebenstehenden Probengefäßes dessen Probe mit Probenmaterial kontaminiert werden kann.Furthermore, the most diverse were to protect against contamination of the samples Closure options, such as various lids, septa and / or filters etc. developed for single or multiple sample vessels. However, these have disadvantages in the Handling, especially in the field of automation on, for example, the opening and closing of caps, etc., especially individual samples, very time consuming and depending on the closure system is hardly feasible by machine. In addition, there is still the risk that the aerosols produced in the sample vessel escape during processing and thereby in the subsequent step when opening the adjacent sample vessel whose sample can be contaminated with sample material.
Zudem sind Probengefäße mit Septen und/oder dünnen Filtermaterialien nicht in jedem Roboter- beziehungsweise automatischen Pipetiersystem variabel einsetzbar, da sich nur wenige Pipettenspitzen und/oder Pipettennadeln für den Gebrauch derartiger Probengefäße eignen.In addition, sample vessels with septa and / or thin filter materials are not in each Robotic or automatic pipetting variable, since only few pipette tips and / or pipette needles for the use of such sample containers suitable.
Da der Stand der Technik keine bekannten Vorrichtungen und/oder kein bekanntes Verfahren, die/das in befriedigender Weise zur Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere im Bereich der automatisierten PCR-Diagnostik, eingesetzt werden könnte, offenbart und sich eine solche Vorrichtung beziehungsweise ein solches Verfahren auch nicht daraus herleiten lässt, liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine effiziente und reproduzierbare Abarbeitung einer hohen Probenanzahl unter Vermeidung von Kontaminationen in den zu analysierenden Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen zu ermöglichen. Since the state of the art does not disclose any known devices and / or a known method which could be used satisfactorily to avoid contamination, in particular in the field of automated PCR diagnostics, such a device or such a method is also disclosed can not derive from this, the present invention has the object to enable an efficient and reproducible processing of a high number of samples while avoiding contamination in the solutions to be analyzed in open and / or automated systems.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung einer Kontaminationsbarriere zur Vermeidung von Verunreinigungen wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisieren Systemen gelöst, die zumindest einen mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff und/oder ein Kohlenwasserstoffgemisch aufweist. Mithin wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zu Vermeidung von Kontaminationen dadurch gelöst, dass zur Bearbeitung wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen, diese mit zumindest einem mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoff oder einem Kohlenwasserstoffgemisch überschichtet werden.This object is achieved by providing a contamination barrier to avoid contamination of aqueous solutions in open and / or automated systems, which has at least one water-immiscible hydrocarbon and / or a hydrocarbon mixture. Thus, the object of the present invention is achieved by providing a method for preventing contamination in that, for processing aqueous solutions in open and / or automated systems, they are overcoated with at least one water-immiscible hydrocarbon or a hydrocarbon mixture.
Die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere zeichnet sich insbesondere durch ihren flexiblen Einsatz in den unterschiedlichsten Probengefäßen aus. Besonders vorteilhaft ist, dass die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere einfach und schnell auch in sehr kleinen Probengefäßen ausgebildet und wieder entfernt werden kann. Insbesondere kann auf einen erhöhten zeit- und kostenaufwendigen, manuellen oder gar maschinellen Einsatz von Verschlusskappen und/oder Septen etc. verzichtet werden. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ist deren flexible Einbringung in das Probengefäß, wodurch im Gegensatz zum Einsatz von Septen und/oder Filtermaterialien, die fest im Probengefäß angeordnet sind, das Volumen der wässrigen Lösung jederzeit variiert werden kann, ohne dass sich ein Hohlraum bildet, in dem es zu einer kontaminationsbedingenden Aerosolbildung kommt. Ganz besonders vorteilhaft ist auch der Einsatz bei sehr kleinen Volumina der wässrigen Lösungen (z. B. im ppm-Bereich und kleiner).The contamination barrier according to the invention is characterized in particular by its flexible use in a wide variety of sample vessels. It is particularly advantageous that the contamination barrier of the invention easily and quickly even in very small Sample vessels formed and can be removed again. In particular, can on a increased time-consuming and costly, manual or even mechanical use of Caps and / or septa etc. are dispensed with. Another advantage of Contamination barrier according to the invention is their flexible introduction into the Sample vessel, which, in contrast to the use of septa and / or filter materials, which are fixed in the sample vessel, the volume of the aqueous solution at any time can be varied without forming a cavity in which it is a Contamination-induced aerosol formation comes. Very particularly advantageous is the Use in very small volumes of aqueous solutions (eg in the ppm range and smaller).
Ferner ergibt sich für die Überschichtung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere aufgrund der mit Wasser nicht mischbaren Kohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffgemische ein vorteilhaftes Einsatzgebiet auf nahezu jeglichen wässrigen Lösungen.Furthermore, results for the overlay of the contamination barrier according to the invention due to the water-immiscible hydrocarbons or hydrocarbon mixtures an advantageous field of use on almost any aqueous solution.
Um bei der Bearbeitung wässriger Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen Kontaminationen zu vermeiden wird auf die zu analysierende Lösung zumindest ein mit Wasser nicht mischbarer Kohlenwasserstoff, durch Überschichtung aufgebracht. Die derart auf die wässrige Lösung aufgebrachte erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere legt sich wie ein Film vollständig auf die wässrige Lösung und verhindert somit das Durchdringen sowie die Bildung von wässrigen Aerosolen. Vorteilhafterweise weist die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere vorzugsweise zumindest einen substituierten oder unsubstituierten, verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoff auf. Des weiteren kann die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere aus einem cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff (wie z. B. Cyclohexan etc.) oder aus einem aromatischen Kohlenwasserstoff (wie z. B. Benzol oder Toluol etc.) bestehen beziehungsweise gebildet werden, wobei jedoch ausschließlich solche Kohlenwasserstoffe verwendet werden, die nicht mit Wasser mischbar sind. Zudem können die erfindungsgemäß eingesetzten Kohlenwasserstoffe als Substituenten beispielsweise ein oder mehrere Halogenatom(e), Nitrogruppe(n) und/oder Aminogruppe(n) tragen.To process aqueous solutions in open and / or automated systems To avoid contamination is at least one solution to be analyzed Water immiscible hydrocarbon, applied by overcoating. The like The contamination barrier according to the invention applied to the aqueous solution settles like a film completely on the aqueous solution, thus preventing the penetration as well as the formation of aqueous aerosols. Advantageously, the inventive Contamination barrier preferably at least one substituted or unsubstituted, branched or unbranched hydrocarbon. Furthermore, the inventive Contamination barrier of a cyclic, saturated or unsaturated Hydrocarbon (such as cyclohexane, etc.) or from an aromatic hydrocarbon (such as benzene or toluene, etc.) exist or are formed, however, only those hydrocarbons are used which are not with Water are miscible. In addition, the hydrocarbons used according to the invention as substituents, for example, one or more halogen atom (s), nitro group (s) and / or amino group (s).
Alle vorgenannten (Kohlenwasserstoff-) Verbindungen können einzeln oder auch in Mischungen (z. B. ein Kohlenwasserstoffgemisch wie Mineralöl) vorliegen.All of the abovementioned (hydrocarbon) compounds can be used individually or else in Mixtures (eg a hydrocarbon mixture such as mineral oil) are present.
Unter Mineralöl im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die aus mineralischen
Rohstoffen, wie beispielsweise Erdöl, Braun- und Steinkohlen, Holz oder Torf gewonnenen
flüssigen Destillationsprodukte verstanden, die im wesentlichen aus Gemischen von
langkettigen, aliphatischen und gesättigten Kohlenwasserstoffen bestehen.
Besonders geeignet sind Destillationsprodukte beziehungsweise Kohlenwasserstoffgemische,
wie beispielsweise Weißöl und/oder andere Paraffinöle, die hauptsächlich
langkettige Alkane, mit vorzugsweise 13 bis 20, besonders bevorzugt 14 bis 16
Kohlenstoffatome enthalten.For the purposes of the present invention, mineral oil is understood as meaning the liquid distillation products obtained from mineral raw materials, such as, for example, crude oil, lignite and hard coal, wood or peat, which consist essentially of mixtures of long-chain, aliphatic and saturated hydrocarbons.
Particularly suitable are distillation products or hydrocarbon mixtures, such as white oil and / or other paraffin oils containing mainly long-chain alkanes, preferably having 13 to 20, particularly preferably 14 to 16 carbon atoms.
Unter Kohlenwasserstoffen werden im Sinne der Erfindung in erster Linie verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffe verstanden, die 5 bis 20, vorzugsweise 6 bis 16, besonders bevorzugt 8 bis 12 Kohlenstoffatome aufweisen. Ganz besonders bevorzugt werden verzweigte oder unverzweigte Alkane mit 8 bis 12 Kohlenstoffatomen verwendet, worunter wiederum Oktan, Nonan, Dekan und/oder Dodekan sowie Mischungen daraus besonders bevorzugt werden.For the purposes of the invention, hydrocarbons are, in the first place, branched or branched understood unbranched hydrocarbons, the 5 to 20, preferably 6 to 16, more preferably 8 to 12 carbon atoms. Very particularly preferred branched or unbranched alkanes having 8 to 12 carbon atoms are used, including, in turn, octane, nonane, decane and / or dodecane and mixtures thereof particularly preferred.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere vorzugsweise zur Überschichtung von wässrigen Lösungen in offenen und/oder automatisierten Systemen mit biologischem Probenmaterial verwendet. Unter biologischem Probenmaterial werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Biopolymere verstanden, welche zum einen natürlich vorkommende Makromoleküle, wie beispielsweise Nukleinsäuren, Proteine oder Polysacharide, zum anderen aber auch synthetisch hergestellte Polymere sein können, solange diese die gleichen oder ähnliche Bausteine enthalten, wie die natürlichen Makromoleküle. According to an advantageous embodiment of the present invention, the Contamination barrier according to the invention preferably for the coating of aqueous Solutions in open and / or automated systems with biological sample material used. For the purposes of the present invention, biological sample material is used Biopolymers understood that, on the one hand, naturally occurring macromolecules, such as For example, nucleic acids, proteins or polysaccharides, on the other hand may be synthetically prepared polymers, as long as they are the same or similar Blocks contain, like the natural macromolecules.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass durch eine Überschichtung wässriger Lösungen, welche vorzugsweise biologisches Probenmaterial enthalten, mit Kohlenwasserstoffen der vorgenannten Art, insbesondere in Form der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere, speziell in offenen, automatisierten Systemen eine effiziente und reproduzierbare Vermeidung von vor allem aerosolbedingten Kontaminationen erfolgt.Surprisingly, it turned out that by a coating of aqueous Solutions containing preferably biological sample material with Hydrocarbons of the aforementioned type, in particular in the form of the invention Contamination barrier, especially in open, automated systems an efficient and reproducible avoidance of mainly aerosol contamination takes place.
Nachfolgend soll nun die vorliegende Erfindung anhand von beigefügten Zeichnungen sowie Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.Hereinafter, the present invention with reference to the accompanying drawings and Embodiments will be explained in more detail.
Es zeigt:
- Fig. 1
- die Bildung von Aerosolen aus einer wässrigen Lösung bei im Stand der Technik bekannten offenen Probengefäßen;
- Fig. 2
- eine auf eine wässrige Lösung überschichtete erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere in einem offenen Probengefäß;
- Fig. 3
- einen schematischen aus dem Stand der Technik bekannten Pipetiervorgang aus einem offenen Probengefäß, bei dem ein Teil einer wässrigen Lösung unter Aerosolbildung entnommen wird;
- Fig. 4
- einen schematischen Pipetiervorgang aus einem offenen Probengefäß, bei dem ein Teil einer wässrigen Lösung unterhalb einer erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ohne Aerosolbildung entnommen wird;
- Fig. 5
- einen schematischen Pipetiervorgang aus einem offenen Probengefäß, bei dem einer wässrigen Lösung unterhalb einer erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere ohne Aerosolbildung ein weiterer wasserlöslicher Teil hinzugegeben wird.
- Fig. 1
- the formation of aerosols from an aqueous solution in open sample vessels known in the art;
- Fig. 2
- a contamination barrier superimposed on an aqueous solution according to the invention in an open sample vessel;
- Fig. 3
- a schematic pipetting process known from the prior art from an open sample vessel, wherein a portion of an aqueous solution is taken under aerosol formation;
- Fig. 4
- a schematic Pipetiervorgang from an open sample vessel, in which a portion of an aqueous solution is removed below a contamination barrier according to the invention without aerosol formation;
- Fig. 5
- a schematic Pipetiervorgang from an open sample vessel, in which an aqueous solution below a contamination barrier according to the invention without aerosol formation, a further water-soluble part is added.
Dem in Fig. 1 und Fig. 3 dargestellten Stand der Technik ist deutlich zu entnehmen, dass
sich durch mechanische Einwirkung beim Pipetiervorgängen und/oder Mixen der Probe etc.,
beispielsweise mittels einer Pipetiervorrichtung 6 o. ä., in einem handelsüblichen Reaktionsgefäß
1 auf einer Pipetierplatte 2 (wie beispielsweise einer Mikrotiterplatte etc.) auf einer
biologisches Probenmaterial aufweisenden, wässrigen Lösung 3, die Aerosole 4 bilden.
Eine derartige Aerosolbildung kann, sobald das Aerosol 4 aus dem Reaktionsgefäß 1
ausströmt, leicht zu Kontaminationen benachbarter Reaktionsgefäße führen. It can clearly be seen from the prior art shown in FIGS. 1 and 3 that, for example by means of a
Such aerosol formation can, as soon as the aerosol 4 flows out of the
Durch die in den Fig. 2, 4 und 5 dargestellte erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere 5
wird eine derartige kontaminationsbedingende Aerosolbildung vermieden, da die wässrigen
Aerosole 4 die Kontaminationsbarriere 5 nicht durchdringen können. Die wasserunlösliche
Kontaminationsbarriere 5 liegt hierbei im Reaktionsgefäß 1 wie ein Film auf der wässrigen
Lösung 3 in der sich das biologische Probenmaterial in gelöster Form befindet.By the
Beim Pipetiervorgang wird, wie in Fig. 4 und 5 gezeigt, die im Reaktionsgefäß 1 befindliche
wässrige Lösung 3 beziehungsweise die Probe jeweils unter der Kontaminationsbarriere 5
bearbeitet. Durch die wasserunlösliche Zusammensetzung der Kontaminationsbarriere 5
wird die Bildung von Aerosolen 4 sowohl beim Eintauchen und Zurückziehen der
Pipetiervorrichtung 6 aus der wässrigen Lösung 3 als auch beim Mischen ausgeschlossen.During the pipetting process, as shown in FIGS. 4 and 5, the one located in the
Auch beim in Fig. 5 dargestellten Hinzufügen einer weiteren wässrigen Lösung zur Probe,
kommt es beim Mischen der vorgelegten wässrigen Lösung 3 mit der zusätzlichen Lösung
aufgrund der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere 5 nicht zur Aerosolbildung der
wässrigen Mischung 7.Also in the addition of a further aqueous solution to the sample shown in FIG. 5,
when mixing the submitted
Da die Kontaminationsbarriere 5, im Gegensatz zu fest in Reaktionsgefäßen eingebrachten
Filtern und/oder Septen, zudem sehr flexibel ist, können jederzeit mittels einer
Pipetiervorrichtung 6 dem Reaktionsgefäß 1 variable Mengen an wässriger Lösung 3
entnommen oder hinzugefügt werden, ohne dass sich zwischen der Oberfläche der
wässrigen Lösung 3 und der Kontaminationsbarriere 5 ein Hohlraum ausbildet, wodurch
zusätzlich die Bildung von Aerosolen 4 vermieden wird.Since the
- 11
- offenes Reaktionsgefäßopen reaction vessel
- 22
- PipetierplattePipetierplatte
- 33
- wässrige Lösungaqueous solution
- 44
- Aerosolmoleküleaerosol molecules
- 55
- Kontaminationsbarrierecontamination barrier
- 66
- Pipetiervorrichtungpipetting
- 77
- wässrige Mischung (aus vorgelegter und hinzugefügter Probenlösung)aqueous mixture (from sample solution added and added)
Anhand der nachstehenden Versuchsdurchführungen werden die wesentlichen Kontaminationsquellen (KQ) offener, automatisierter Pipetiersysteme, insbesondere in vollautomatischen Hochdurchsatz-Arbeitsstationen, sog. Robotersystemen (wie z. B. BioRobot Mdx/ QIAGEN GmbH), aufgezeigt und Kontaminationen (K), die vornehmlich durch Aerosolbildung, aber auch immer wieder durch mechanische Verschleppung von Probenmaterial entstehen, nachgewiesen sowie die deutliche Verringerung derartiger Kontaminationen durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere dargestellt.On the basis of the following experimental procedures, the essential Contaminant sources (KQ) of open, automated pipetting systems, especially in fully automatic High-throughput workstations, so-called robotic systems (such as BioRobot Mdx / QIAGEN GmbH), and contaminations (K), mainly due to aerosol formation, but again and again by mechanical carryover of sample material arise, proven as well as the significant reduction of such contamination represented by the use of the contamination barrier according to the invention.
Zum Nachweis wurden Kreuzkontaminationstests anhand von Proben mit biologischem Probenmaterial im ppm-Bereich und kleiner, wie sie in gängigen Verfahren im Bereich der PCR-Diagnostik verwendet werden, durchgeführt. Die Versuche basierten hierbei auf einem gängigen im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere von viraler RNA (verwendetes Protokoll: QIAamp 96 Virus Mdx V1.1/QIAGEN GmbH).As evidence, cross-contamination tests were performed on samples with biological Sample material in the ppm range and smaller, as in common processes in the field of PCR diagnostics are used. The experiments were based on one common methods known in the art for the isolation and purification of Nucleic acids, in particular of viral RNA (used protocol: QIAamp 96 Virus Mdx V1.1 / QIAGEN GmbH).
Als Systemzubehör, Reagenzien, Verbrauchsmaterial etc. wurden ebenfalls handelsübliche Kits (z. B. QIAamp 96 Virus BioRobot Kit / QIAGEN GmbH) etc., die sich besonders für den Einsatz in Robotersystemen eignen, verwendet.As system accessories, reagents, consumables, etc. were also commercially available Kits (eg QIAamp 96 Virus BioRobot Kit / QIAGEN GmbH) etc., which are especially for the Use in robot systems are used.
Für die Versuchsdurchführung mit Alkanvorlage (Beispiele 1b und 2b) wurde in gängigen 96-well-Deepwellplatten (im Folgenden S-Blocks genannt) manuell jeweils 100 µl Dodekan vorgelegt.For the experiment with alkane template (Examples 1b and 2b) was in common 96-well deepwell plates (hereinafter referred to as S-blocks) manually each 100 ul of dodecane submitted.
Der Nachweis erfolgte nicht nur durch bloße Beobachtungen während der einzelnen Pipetierschritte im Aufreinigungsprozess, sondern ebenso durch die zusätzliche Bestimmung von tatsächlichen Nukleinsäure-Verunreinigungen in den Negativproben in einer anschließenden Downstream-Analyse (z. B. PCR, RT-PCR etc.). Neben den wesentlichen Kontaminationsquellen derartiger Systeme zeigen die nachstehenden Beispiele anhand der ermittelten Kontaminationsraten (KR) deutlich die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere.Evidence was not provided by mere observations during the individual Pipetting steps in the purification process, but also by the additional determination of actual nucleic acid contaminants in the negative samples in one subsequent downstream analysis (eg PCR, RT-PCR etc.). In addition to the essential Contamination sources of such systems show the following examples with reference to determined contamination rates (KR) significantly the effectiveness of the invention Contamination barrier.
Kreuzkontaminationstests, durchgeführt
Der automatisierte Prozess wurde mit der Identifizierung der Proben, dem sog. Loadcheck,
gestartet. Als positives Probenmaterial (PP) wurde Hepatitis-C-Virenmaterial (arHCV) mit
einer durchschnittlichen Konzentration von 108 - 109 RNA copies/ ml und als negatives
Probenmaterial (NP) Negativplasma (z. B. Citratplasma / Breitscheid) eingesetzt. Nach dem
Loadcheck wurden jeweils 40 µl einer handelsüblichen Protease (z. B. QIAGEN Protease /QIAGEN
GmbH) in den S-Block pipettiert, und das System auf 56°C hochgeheizt.
Die Zugabe von jeweils 285 µl Probenmaterial erfolgte, wie nachfolgend schematisch dargestellt,
im "Schachbrett-Muster". Neben jeder PP (+) wurde alternierend eine NP (-) in den
S-Block pipettiert (KQ 1!).
The addition of 285 .mu.l of sample material took place, as shown schematically below, in the "checkerboard pattern". In addition to each PP (+), an NP (-) was alternately pipetted into the S block (
Nachfolgend wurden den einzelnen Reaktionslösungen 305 µl eines handelsüblichen Lysepuffers
(z. B. Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) zugegeben, diese dann durch auf und ab
pipettieren gemischt (KQ 2!) und nachfolgend für 10 Minuten inkubiert. Abschließend wurden
im Abstand von ca. einer Minute pro Reihe jeder Reaktionslösung jeweils zweimal 360 µl
Ethanol (p.a. oder min. 96 %) zu pipettiert (KQ 3!).Subsequently, the individual reaction solutions 305 .mu.l of a commercially available lysis buffer
(eg Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) added, this then by up and down
Pipette mixed (
Zur Trennung bzw. Aufreinigung der so isolierten Nukleinsäuren wurden jeweils 910 µl Lysat
automatisch in entsprechende Filtersysteme (z. B. QIAamp 96 plate/ QIAGEN GmbH)
überführt (KQ 4!) und unter Vakuum 5 Minuten bei 25°C filtriert (KQ 5!).For the separation or purification of the nucleic acids isolated in this way, in each case 910 μl of lysate
automatically into appropriate filter systems (eg QIAamp 96 plate / QIAGEN GmbH)
transferred (KQ 4!) and under vacuum for 5 minutes at 25 ° C filtered (
Gemäß dem Versuchsprotokoll (s.o.) wurden die mit der Nukleinsäure beladenen Filter
nachfolgend unter Vakuum mit jeweils 800µl eines handelsüblichen Waschpuffers (z. B.
Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) und dann in einem zweiten Waschschritt mit
930µl Ethanol (p.a. oder min. 96 %) (KQ 7!) gewaschen und anschließend die Membranen
zur Beseitigung von Ethanol unter Vakuum und 60°C in einer automatisierten
Vakuumvorrichtung (z. B. RoboVac/ QIAGEN GmbH) getrocknet (KQ 8!).According to the experimental protocol (see above) loaded with the nucleic acid filters (B. Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH z.) Were subsequently under vacuum with 800 μ l of a commercially available wash buffer (KQ 6) and then in a second washing step with 930 μ l of ethanol (pa or min 96%) (
Die aufgereinigte Nukleinsäure wurde abschließend unter Vakuum eine Minute lang einmal mit 50µl und einmal mit 100µl mindestens eines kommerziell erhältlichen Elutionspuffers (z. B. Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) vom Filtersystem eluiert (KQ 9!). Das aufgefangene Eluat wurde für den nachfolgenden Amplifikationsprozess außerhalb des automatisierten Pipetiersystems aufbereitet. Dem für die RT-PCR aufbereiteten Eluat wurde ein handelsüblicher Enzymmix (z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) hinzu pipettiert (KQ 10!), zur Bestimmung der Nukleinsäure-Kontaminationen eine RT-PCR durchgeführt und die Ergebnisse ausgewertet.The purified nucleic acid was finally eluted from the filter system under vacuum for one minute with 50 μl and once with 100 μl of at least one commercially available elution buffer (eg Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) (KQ 9!). The collected eluate was processed outside the automated pipetting system for the subsequent amplification process. To the eluate prepared for the RT-PCR, a commercially available enzyme mix (eg Mastermix / QIAGEN GmbH) was pipetted (KQ 10!), An RT-PCR was carried out to determine the nucleic acid contamination and the results were evaluated.
Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 1al und 1all) ohne Vorlage von Dodekan wurden mit
folgender ar HCV-Verdünnung durchgeführt:
Bis hin zur Zugabe des Elutionspuffers konnten weder im Lauf 1al noch im Lauf 1all
Beobachtungen gemacht werden, die insbesondere an den Kontaminationsquellen (KQ) 1-4
auf Kontaminationen hingewiesen hätten.
Erst im Verlauf der Elution (KQ 7) konnten diesbezüglich Beobachtungen gemacht werden.
So war beispielsweise eine deutliche Blasenbildung bei der Zugabe des Elutionspuffers
insbesondere in Reihe 12 zu beobachten. Teilweise zerplatzten die Blasen beim Eintauchen
und Herausziehen der Pipettenspitzen.
Nach der Elution waren in Reihe 1 bei den NP-Positionen B, D, F (sowie im Lauf 1al auch H)
die Auslassöffnungen des Filtersystems (Nozzles) ebenso gelb wie die der PP.Up to the addition of the elution buffer no observations could be made either in run 1al or in run 1all, which would have pointed to contamination in particular at the sources of contamination (KQ) 1-4.
Only in the course of the elution (KQ 7) could observations be made in this regard. Thus, for example, a distinct blistering was observed in the addition of the elution buffer, especially in row 12. Partially the bubbles burst when immersing and pulling out the pipette tips.
After elution, the outlet openings of the filter system (Nozzles) were as yellow as those of the PP in
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 11,46 %.This results in an average contamination rate (CR) of 11.46%.
Die drei Versuchsdurchläufe (Lauf 1bl, 1bII und 1bIII) mit Vorlage von Dodekan wurden
ebenfalls mit der vorgenannten ar HCV-Verdünnung durchgeführt:
Lauf 1bIII wurde nachgeschaltet, nachdem in Lauf 1bII die Reihe B aufgrund der fehlenden PP-Aufgabe nicht mitgewertet werden konnte. Während der Versuchsdurchführung konnten jedoch keine besonderen Vorkommnisse, die auf Verschleppung von Probenmaterial während der Pipetiervorgänge oder Aerosolbildung hinweisen, beobachtet werden. Run 1bIII was followed after, in Run 1bII, Row B due to the lack of PP task could not be evaluated. During the experiment could however, no specific incidents due to carryover of sample material during pipetting operations or aerosol formation.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 4,96 %.This results in an average contamination rate (CR) of 4.96%.
Nach dem Vergleich der ermittelten Kontaminationsraten konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz von Dodekan die Kreuzkontaminationsrate für das gesamte Isolierungs- und Trennungsverfahren um mehr als das Doppelte (Faktor 2,3) verringert werden kann.After comparing the determined contamination rates it could be shown that by the use of dodecane the cross-contamination rate for the entire insulation and Separation method can be reduced by more than double (factor of 2.3).
Kreuzkontaminationstests, durchgeführt
Der automatisierte Prozess wurde mit der Identifizierung der Proben, dem sog. Loadcheck,
gestartet. Als positives Probenmaterial (PP) wurde Hepatitis-C-Virenmaterial (arHCV) mit
einer durchschnittlichen Konzentration von 108 - 109 RNA copies/ ml und als negatives
Probenmaterial (NP) Negativplasma (Citratplasma / Breitscheid) eingesetzt. Nach dem
Loadcheck wurden jeweils 80µl einer handelsüblichen Protease (z. B. QIAGEN Protease /QIAGEN
GmbH) in den S-Block pipettiert, und das System auf 56°C hochgeheizt.
Die Zugabe von jeweils 570 µl Probenmaterial erfolgte, wie vorstehend in der Tabelle 1
bereits schematisch dargestellt, im "Schachbrett-Muster". Neben jeder PP (+) wurde
alternierend eine NP (-) in den S-Block pipettiert (KQ 1!).The automated process was started with the identification of the samples, the so-called loadcheck. As positive sample material (PP) hepatitis C virus material (arHCV) with an average concentration of 10 8 - 10 9 RNA copies / ml and as negative sample material (NP) negative plasma (citrated plasma / Breitscheid) was used. After the loadcheck, 80 μl each of a commercially available protease (eg QIAGEN Protease / QIAGEN GmbH) were pipetted into the S block and the system was heated to 56 ° C.
The addition of each 570 .mu.l of sample material was carried out, as already schematically shown in Table 1, in the "checkerboard pattern". In addition to each PP (+), an NP (-) was alternately pipetted into the S block (
Nachfolgend wurden den einzelnen Reaktionslösungen 610 µl eines handelsüblichen
Lysepuffers (z. B. Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) zugegeben, diese dann durch auf und
ab pipettieren gemischt (KQ 2!) und nachfolgend für 10 Minuten inkubiert. Abschließend
wurden im Abstand von einer Minute pro Reihe jeder Reaktionslösung jeweils zweimal
720 µl Ethanol (p.a oder min. 96%) zu pipettiert (KQ 3!). Subsequently, the individual reaction solutions 610 .mu.l of a commercially available
Lysis buffer (eg Lysis Buffer AL / QIAGEN GmbH) was added, this then on and
from pipette mixed (
Zur Trennung bzw. Aufreinigung der so isolierten Nukleinsäuren wurden jeweils zwei mal
910 µI Lysat automatisch in entsprechende Filtersysteme (z. B QIAamp 96 plate/ QIAGEN
GmbH) überführt (KQ 4!) und unter Vakuum 5 Minuten bei 25°C filtriert (KQ 5!).
Gemäß dem Versuchsprotokoll (s.o.) wurden die mit der Nukleinsäure beladene Filter
nachfolgend unter Vakuum jeweils mit 800 µl eines handelsüblichen Waschpuffers (z. B.
Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (KQ 6!) und dann in einem zweiten Waschschritt mit
930 µl Ethanol (p.a. oder min. 96 %) (KQ 7!) gewaschen und anschließend die Membranen
zur Beseitigung von Ethanol unter Vakuum und 60°C in einer automatisierten
Vakuumvorrichtung (z. B. RoboVac/ QIAGEN GmbH) getrocknet (KQ 8!).
Die aufgereinigte Nukleinsäure wurde abschließend unter Vakuum eine Minute lang einmal
mit 50 µl und einmal mit 100 µl mindestens eines Elutionspuffers (z. B. Elution Buffer AVE /QIAGEN
GmbH) vom Filtersystem eluiert (KQ 9!). Das aufgefangene Eluat wurde für den
nachfolgenden Amplifikationsprozess außerhalb des automatisierten Pipetiersystems
aufbereitet. Dem für die RT-PCR aufbereiteten Eluat wurde ein handelsüblicher Enzymmix
(z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) hinzu pipettiert (KQ 10!), zur Bestimmung der
Nukleinsäure-Kontaminationen eine RT-PCR durchgeführt und die Ergebnisse ausgewertet.To separate or purify the nucleic acids isolated in this way, in each case two times 910 μl of lysate were transferred automatically into appropriate filter systems (eg QIAamp 96 plate / QIAGEN GmbH) (KQ 4!) And filtered under vacuum for 5 minutes at 25 ° C. (
According to the experimental protocol (see above), the filters loaded with the nucleic acid were subsequently under vacuum in each case with 800 μl of a commercially available washing buffer (eg Wash Buffer AW2 / QIAGEN GmbH) (
The purified nucleic acid was finally eluted under vacuum for one minute with 50 μl and once with 100 μl of at least one elution buffer (eg Elution Buffer AVE / QIAGEN GmbH) from the filter system (KQ 9!). The collected eluate was processed outside the automated pipetting system for the subsequent amplification process. To the eluate prepared for the RT-PCR, a commercially available enzyme mix (eg Mastermix / QIAGEN GmbH) was pipetted (KQ 10!), An RT-PCR was carried out to determine the nucleic acid contamination and the results were evaluated.
Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 2al und 2all) ohne Vorlage von Dodekan wurden mit
folgender ar HCV-Verdünnung durchgeführt:
Schon bei der Zugabe des Lysepuffers in den S-Block türmen sich bereits die Blasen bis zur Oberkante der einzelnen Reaktionsgefäße auf. Zudem fuhren die Pipetierspitzen (Tips) so schnell wieder aus den Reaktionsgefäßen heraus, dass teilweise die entstandenen Blasen platzen (besonders in Position H5 und H10). Auch beim der zweiten Zugabe des Lysats entstanden beim Mischen im S-Block vermehrt Blasen, die beim Herausfahren der Tips mit hochgezogen wurden und/oder zerplatzten.Already with the addition of the lysis buffer in the S-block, the bubbles are already piling up to the Upper edge of the individual reaction vessels. In addition, the Pipetierspitzen (Tips) drove like that quickly out of the reaction vessels that partially the resulting bubbles burst (especially in position H5 and H10). Also with the second addition of the lysate caused by mixing in the S-block increased bubbles, which when removing the tips with were pulled up and / or burst.
Auch bei der Zugabe des Elutionspuffers konnten sowohl im Lauf 2al als auch im Lauf 2all Beobachtungen hinsichtlich Kontaminationen gemacht werden. So war beispielsweise eine deutliche Blasenbildung während und nach der Zugabe des Elutionspuffers insbesondere in Reihe G sowie auf der Position H6 zu sehen. Teilweise zerplatzten auch hier die Blasen beim Eintauchen und/oder Herausziehen der Tips. Nach der Elution waren in Reihe 1 bei den NP-Positionen B, D, F und H die Nozzles unter der QIAplate ebenfalls gelb wie bei den PP. Even with the addition of the elution buffer, both in the course 2al and in the run 2all Observations regarding contamination are made. For example, one was significant blistering during and after the addition of the elution buffer, in particular Series G as well as in position H6. Partly the bubbles burst here too when dipping and / or pulling out the tips. After elution, there were 1 in series the NP positions B, D, F and H the Nozzles under the QIAplate also yellow as in the PP.
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 67,33 %.This results in an average contamination rate (CR) of 67.33%.
An dieser Stelle zeigt sich deutlich, dass die Pipetierschritte mit steigendem Probevolumen wesentlich anfälliger für Kreuzkontaminationen sind, da hier das S-Block-Volumen vollständig ausgenutzt wird.At this point, it clearly shows that the pipetting steps increase with increasing sample volume are much more susceptible to cross-contamination, since here the S-block volume is fully exploited.
Die zwei Versuchsdurchläufe (Lauf 2bI und 2bII) mit Vorlage von Dodekan wurden ebenfalls
mit der vorgenannten ar HCV-Verdünnung durchgeführt:
Um die Wirkung der Dodekan-Überschichtung in bezug auf eine Verminderung bzw.
Verhinderung von Blasenbildungen etc. besser beobachten zu können, wurde das
eingesetzte Dodekan vorher mit Sudanschwarz eingefärbt.
Während der gesamten Versuchsdurchführung konnten jedoch keine besonderen
Vorkommnisse hinsichtlich Kontaminationen beobachtet werden. Auch wiesen die Nozzles
an der QIAplate wie schon unter Beispiel 1b) aufgeführt nach der Elution keine Rückstände
bzw. Verfärbungen auf.In order to better observe the effect of dodecane coating on the reduction or prevention of blistering, etc., the dodecane used was previously stained with Sudan black.
During the entire experiment, however, no special incidents with regard to contamination could be observed. Also, the Nozzles on the QIAplate had no residues or discoloration after elution as already mentioned under Example 1b).
Nach Durchführung der RT-PCR wurden folgende Kreuzkontaminationen ermittelt:
Das ergibt eine durchschnittliche Kontaminationsrate (KR) von 16,67 %This results in an average contamination rate (CR) of 16.67%
Nach dem Vergleich der ermittelten Kontaminationsraten konnte somit gezeigt werden, dass durch den Einsatz von Dodekan die Kreuzkontaminationsrate für das gesamte Isolierungs- und Trennungsverfahren mit höheren Proben- und Reaktionsvolumina sogar um mindestens den Faktor 4 verringert werden kann. After comparing the calculated contamination rates, it could thus be shown that through the use of dodecane, the cross contamination rate for the entire insulation and separation processes with higher sample and reaction volumes even by at least the factor 4 can be reduced.
Wie bereits vorstehend aufgeführt, weist ein derartiges Gesamtverfahren jedoch etliche
Fehler- bzw. Kontaminationsquellen auf. Um nun die Wirkung der erfindungsgemäßen
Kontaminationsbarriere für einen einzelnen Pipetierschritt zu bestimmen, wurden im Laufe
dieser Versuchsreihen einzelne Proben (vorzugsweise NP) entnommen und mittels RT-PCR
analysiert. Ausgehend von den in den Beispielen 1b und 2b gemachten Beobachtungen,
dass durch die Überschichtung mit Dodekan die Bildung von Blasen beziehungsweise
Aerosolen insbesondere in den ersten Prozessschritten (im Bereich der
Kontaminationsquellen 1 bis 4) durch das Eintauchen und Herausziehen der Pipetierspitzen
verhindert wurde, wurden an diesen Stellen des Gesamtverfahrens Proben entnommen und
analysiert. Keine dieser Proben wies Nukleinsäure-Verunreinigungen auf. Für einzelne
Prozessschritte können somit durch den Einsatz von Dodekan (Kreuz-) Kontaminationen
sogar ganz vermieden werden.However, as already mentioned above, such an overall process has quite a few
Error or contamination sources on. To get the effect of the invention
To determine contamination barrier for a single pipetting step were over
In this series of experiments, individual samples (preferably NP) taken and by RT-PCR
analyzed. Based on the observations made in Examples 1b and 2b,
that by overlaying with dodecane the formation of bubbles respectively
Aerosols in particular in the first process steps (in the field of
Weitere Versuche zeigten, dass durch den Einsatz von Dodekan auch in den Pipetierschritten der Downstream-Analysen (wie z. B. der RT-PCR) gute Erfolge bei der Verminderung von (Kreuz-) Kontaminationen erzielt werden können. So wurden beispielsweise in weiteren Kreuzkontaminationstests die für eine RT-PCR notwendige handelsüblich Enzymmischung (z. B. Mastermix / QIAGEN GmbH) einer mit Dodekan überschichteten Probe zugegeben. Auch hier wiesen die Negativproben in den Versuchsreihen mit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere deutlich weniger bis gar keine Kontaminationen auf.Further experiments showed that the use of dodecane also in the pipetting steps Downstream analyzes (such as RT-PCR) have been successful in reducing this of (cross) contamination can be achieved. For example, in others Cross-contamination tests the commercially available enzyme mixture necessary for an RT-PCR (eg Mastermix / QIAGEN GmbH) to a sample coated with dodecane. Again, the negative samples in the test series with the invention Contamination barrier significantly less to no contamination.
Das Überschichten mit der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere eignet sich jedoch nicht nur für jegliche Art von Pipetiervorgängen. Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann die erfindungsgemäße Kontaminationsbarriere auch in anderen Modulen der Probenbearbeitung, in denen (Kreuz-) Kontaminationen auftreten, eingesetzt werden. So verhindert die Verwendung der erfindungsgemäßen Kontaminationsbarriere beispielsweise in ebenso vorteilhafter Weise eine Kreuzkontamination, die durch Aerosolbildung, beim Überschlagen mit Waschpuffern, durch die Abgabe mit einem Dispenser erfolgt.However, overlaying with the contamination barrier according to the invention is suitable not just for any kind of pipetting. According to a further embodiment of the present invention, the contamination barrier according to the invention in other Modules of sample processing, in which (cross) contamination occur, used become. Thus, the use of the contamination barrier according to the invention prevents For example, in an equally advantageous manner, cross-contamination caused by aerosol formation, when overturning with wash buffers, by dispensing with a dispenser he follows.
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