EP1558925A1 - Device for separating and method for separating a biomolecular substance sample - Google Patents

Device for separating and method for separating a biomolecular substance sample

Info

Publication number
EP1558925A1
EP1558925A1 EP03810966A EP03810966A EP1558925A1 EP 1558925 A1 EP1558925 A1 EP 1558925A1 EP 03810966 A EP03810966 A EP 03810966A EP 03810966 A EP03810966 A EP 03810966A EP 1558925 A1 EP1558925 A1 EP 1558925A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
separating
separation
separating device
plane
sample components
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03810966A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Albert RÖDER
Alois Rainer
Hans-Joachim HÖLTKE
Carlo Effenhauser
Peter Berndt
Hanno Langen
Remo Hochstrasser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Roche Diagnostics GmbH filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of EP1558925A1 publication Critical patent/EP1558925A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

Definitions

  • the invention relates to a separation device and a separation method for biomolecular sample material, in particular protein mixtures according to the preamble of patent claims 1 and 18, respectively.
  • proteomics should provide new insights into the function, regulation and interaction of the proteins.
  • quantifiable differences between normal cells and "degenerate”, cancer cells or differences in the protein repertoire should of "sick” and “healthy” are shown. This in turn allows a targeted search for therapeutically active substances.
  • the total amount of proteins is first separated into their individual components, i.e. the many thousands of individual proteins are physically separated from the mixture. This is usually done by so-called two-dimensional (2-D) electrophoresis.
  • the total proteins from a cell population or a tissue are isolated as quantitatively as possible. If necessary, certain fractionation steps are also carried out if one wishes to examine only a specific fraction of the total proteins, e.g. Proteins from certain cell organelles such as the mitochondria.
  • an isoelectric focusing takes place in the first dimension.
  • the proteins are separated in a special gel or on a solid support in a pH gradient on the basis of their isoelectric point p1.
  • the proteins migrate in the electric field and are focused on their pI, which is characteristic of each protein.
  • This first step of isoelectric focusing requires certain electrophoresis devices to hold membranes or "strips" with immobilized pH gradients or gels with ampholyte buffers.
  • the process of isoelectric focusing usually takes many hours (24 to 48 hours).
  • the gels or membranes are usually removed from the first apparatus and equilibrated in an electrophoresis buffer containing SDS (sodium dodecyl sulfate). Then each gel, each membrane is applied to a new, second gel in a second gel apparatus. These second gels are made of SDS / polyacrylamide. After applying an electrical voltage perpendicular to the IEF gel, the focused proteins migrate into the second gel and are separated there based on their molecular weight. This electrophoretic separation can also take many hours (> 16 h). In the next step, the proteins separated in this way are made visible.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the stained protein spots are isolated from the gel in the smallest possible volume. This is done manually or with automatic, software-controlled spot pickers.
  • the small protein-containing gel pieces (a few ⁇ l volume) are then incubated with a buffer, which ensures that SDS and the dye are removed from the gel.
  • the gel pieces are then dried, taken up in a buffer suitable for protease digestion and incubated with a protease (usually trypsin). This cleaves the proteins contained in the gel into defined fragments.
  • the protein fragments (peptides) are then washed out or eluted from the gel with ammonium bicarbonate.
  • the peptides isolated from the individual gel pieces are then applied separately to a support for mass spectrometry and, after drying and optionally recrystallization, subjected to the mass spectrometer
  • MALDI-TOF mass spectrometer
  • IEF electrophoresis A large number of devices are required (IEF electrophoresis, SDS-PAGE electrophoresis, stainer, imager, spot picker, gel piece incubator, dryer, automatic pipetting device, etc.). It only allows the separation of proteins that are accessible to the IEF. Many and particularly interesting protein classes, e.g. Membrane proteins / receptors, cell nucleus or DNA-associated proteins cannot or cannot be separated with the IEF. The overall process is not easily reproducible.
  • the invention is based on the object of avoiding the disadvantages encountered in the prior art and of a device and to improve a method of the type specified at the outset so that even very small sample quantities can be processed and analyzed reliably and with high accuracy with little handling effort in an automated process.
  • the invention is based on the idea of creating a three-dimensional transport structure for the sample material integrated in a component in order to enable not only the separation of sample components but also their targeted further processing. Accordingly, it is proposed according to the invention that the separating element has a channel structure for discharging separated sample components onto a carrier surface in a transport direction running transversely to the separating plane. In terms of the method, it is accordingly provided that the separated sample components are discharged from the separating element onto a carrier surface transversely to the parting plane.
  • the invention allows a rapid, easily automatable separation of the proteins as well as the direct, spatially resolved discharge onto a carrier surface or a substrate in a single three-dimensional basic element. This makes it possible to transfer the information content of a two-dimensional protein separation into the third dimension without loss of information.
  • the entire process chain which is otherwise carried out in separate devices, is combined in a single element.
  • the manual steps are reduced to the application of the sample.
  • the amount of biological material required can be reduced by several orders of magnitude, so that microgram amounts are sufficient for an analysis.
  • the overall process can be reduced to a few hours.
  • the substances deposited on a free surface of the separating element can be analyzed directly, for example by mass spectroscopy. If necessary, a separate target plate for mass spectroscopy is provided as the carrier substrate. In principle, other uses are also conceivable, for example functional assays for activity or binding tests of the separated proteins or peptides.
  • 1 and 2 a device for separating and further processing of proteins comprising a plate-shaped separating element in perspective and vertically broken representation;
  • FIG. 3 shows a vertical section through the separating element according to FIG. 1;
  • FIG. 4 is a perspective view of a central or separating plate of the separating element
  • FIG. 5a is a partial plan view of the partition plate of FIG.
  • FIG. 5b shows a section along the line bb of FIG. 5a with the carrier plate connected to the channel structure;
  • Fig. 5c an embodiment with a support surface directly on the
  • FIG. 8 shows a positioning frame for connecting a plurality of separating elements to a mass-spectroscopic carrier plate in a diagrammatic representation
  • Fig. 9 a recording unit for storage and processing of
  • the plate-shaped separating elements 10 shown in the drawing essentially consist of a separating plate 12 for the two-dimensional separation of protein material, a transport or channel structure 14 acting transversely thereto for the accurate removal of the separated sample components onto a support surface 16 suitable for mass spectroscopic examinations and a cover plate 18 and a base plate 20 for delimiting the partition plate 12 on both sides.
  • the cover plate 18 has a slit-like, continuous sample application opening 22, a cover chamber 24 which is open towards the separating plate 12, a lateral inlet opening 26 opening into the cover chamber 24, and a central valve opening 28.
  • the separating plate 12 forms two above one another lying areas a three-dimensional channel system, an upper two-dimensional separating area 30 lying in the plate or parting plane being delimited on the bottom side by the channel structure 14 running in the third dimension.
  • the base plate 20 serves to support and stabilize the plate arrangement and contains a collection chamber 32 which is open towards the channel structure 14.
  • the base material for the separating element 10 designed as a composite chip can consist of silicon, polypropylene, polycarbonate, other polymers (for example polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polystyrene, polydimethylsiloxane), synthetic resin, ceramic or a metal or various of these materials. It is important that the base material allows the shaping with the necessary precision and is compatible with the materials used for sample processing.
  • the base material should expediently be electrically insulating and thermally conductive in order to enable electrophoretic separations and, if appropriate, efficient cooling.
  • the separating element 10 has, for example, a base area of 6 ⁇ 4 cm (corresponding to 1/4 of a conventional microtiter plate).
  • the separating plate 12 shown separately in FIG. 4 has orthogonal separating paths 34, 36 running in the plane of the plate for sequential 2D electrophoresis.
  • two pairs of electrodes 38, 40 are provided, which can be supplied with a suitable direct voltage via electrical connection lugs.
  • the separation path 34 of the first dimension between the electrodes 38 is formed by an elongated recess 42, in which a gel or membrane strip (not shown) with a preformed pH gradient for isoelectric focusing (IEF) of the protein molecules is arranged.
  • An electrophoresis buffer can be placed in storage zones 44 in the area of the electrodes 38.
  • the separating paths of the second dimension are formed by a family of channels 36 which run parallel to one another between the electrodes 40 and are arranged distributed along the recess 42 and branch off at right angles therefrom.
  • the number of channels depends on the desired and achievable resolution or separation performance of the first dimension. It can be between 10 and several thousand, preferably 50 to 500.
  • the molecular These channels are separated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in an electrophoresis buffer containing sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the cutouts 46, 48 in the region of the electrodes 40 can serve as a buffer reservoir.
  • the SDS-PAGE separating gel is first introduced into the channels 36 of the second dimension and into the buffer reservoirs 46, 48 and photopolymerized.
  • the recess 42 for the IEF gel strip can be mechanically separated (separator 50) in order to prevent mixing of the gel types. It is also advantageous if the channels 36 are filled in their initial part with a collecting gel which is connected upstream of the separating gel. In the later separation, the collection gel enables the proteins to be collected and compressed at the boundary zone to the separation gel, so that sharper zones of the individual protein bands are formed.
  • the channel structure 14 is formed by discharge channels 52 lined up at the bottom of the separation channels 36. These run perpendicular to the separating plane spanned by the separating channels 36 and form a channel matrix distributed over the separating area 30 in order to enable the 2D pattern obtained during the molecular separation to be discharged true to the image, as will be explained in more detail below.
  • the number of discharge channels 52 per separation channel 36 in turn depends on the desired and achievable resolution of the separation in the second dimension. It can be between 10 and 1000, preferably 30 to 400.
  • the discharge channels 52 are advantageously designed to taper conically, for example with an upper inlet diameter of 100 ⁇ m and a lower mouth cross section of 50 ⁇ m (FIG. 5b). However, other channel geometries are also conceivable in order to process the proteins in the third dimension as loss-free as possible after separation.
  • the base plate 20 can be removed and the underside 54 of the separating plate can be used for a mass spectrometric examination.
  • support plate 56 specifically a target plate designed for matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF).
  • the carrier plate can consist of different materials (metals, plastics, polymers). It is important that the material is compatible with the following mass spectrometer, especially for MALDI-TOF.
  • hydrophilic anchor zones 58 for the substances to be transferred can be arranged on an inherently hydrophobic surface of the carrier plate 56. The position and size of these anchor zones are adapted to the discharge channels, so that the eluted molecular fragments are collected directly and the geometric resolution achieved on the target plate during the separation process is essentially retained.
  • the carrier surface 16 is itself formed by a free surface of the separating plate 12. It is advantageous if the support surface 16 has annular hydrophilic anchor zones 58 for the sample material around the mouths 59 of the discharge channels 52, but is otherwise hydrophobic. This can be achieved by appropriate chemical derivatization or coating. Cup-shaped depressions around the outlet openings of the discharge channels 52 can also ensure better deposition of the discharged peptides on the surface 16 (not shown). The geometric resolution achieved during the separation process should also be retained here.
  • the separating plate 12 with the peptides deposited on its surface 16 is then inserted into a suitable receptacle for mass spectroscopy and subjected to the mass spectroscopic examination. Here, the peptides are desorbed directly from the surface 16 of the separating element by means of a laser.
  • the channels 34, 36, 52 of the three dimensions can be in direct contact all the time, or can be separated by barriers or valves, which are only opened when changing from one dimension to the other.
  • the contact can be made mechanically, by moving or rotating the channels, or mechanical barriers can be provided.
  • the channels can also be separated chemically, for example by polymers that are dissolved at the desired time. It is also conceivable to separate the channels of the different dimensions by means of semipermeable membranes, the permeability of which can be controlled.
  • the separation channels 36 of the second dimension, filled with SDS-PAGE separating gel 60 are bounded at the bottom by a porous bottom layer or frit 62, which forms a channel structure 14 through which the micropores communicate fluidly with one another.
  • a porous bottom layer or frit 62 which forms a channel structure 14 through which the micropores communicate fluidly with one another.
  • the many closely spaced pores of the bottom layer 62 are to be understood as microscopic discharge channels.
  • the exemplary embodiment shown in FIG. 7 additionally differs in that, instead of discrete separation channels for the separation in the second dimension, an ultra-thin polyacrylamide gel layer 64 is provided, which optionally adjoins the IEF gel strip laterally via an intermediate strip from a collecting gel and an SDS -PAGE electrophoresis enables.
  • four separating elements 10 can be jointly positioned and processed in a positioning frame 66 on a mass-spectroscopic carrier plate 56 the size of a microtiter plate.
  • the carrier plate 56 is positioned in parallel at a predetermined distance from the exit side of the respective channel structure 14, so that the molecules to be transferred can be transferred directly to the hydrophilic anchor zones 58.
  • the separating elements 10 can be inserted into a storage container 68 for storage and preparation and enclosed therein in an airtight manner by means of a detachable cover film 70 (FIG. 9).
  • the transfer into the positioning frame 66 with removal of the base plates 20 can be simplified or automated by a suitable sliding mechanism (not shown).
  • the entire separating device comprises further units for controlling the process sequence, which are known per se to the person skilled in the art and are not explained in detail here.
  • a suitable amount of the sample material is introduced into the first separating path 34 via the feed opening 22.
  • 1 ⁇ g total protein is added in a volume of approx. 50 nl to 1 ⁇ l carrier liquid.
  • the proteins migrate in the electrical field and pH gradients to a point corresponding to their isoelectric point.
  • the isoelectric focusing is ended by switching off the electrical voltage.
  • the buffer which was used for the separation in the first dimension may be removed from the proteins and for these to be re-equilibrated in a buffer which is suitable for the separation in the second dimension.
  • This can be done directly in the channel 42 by overlaying, the new buffer being fed in via the cover plate 18.
  • the SDS-PAGE buffer is then also filled into the two buffer reservoirs 46, 48.
  • voltage is applied to the two electrodes 40 and the IEF-focused proteins migrate from the IEF strip into a corresponding channel 36 of the second dimension in accordance with the position reached.
  • the proteins in the SDS-polyacrylamide-filled channels 36 of the second dimension are then separated electrophoretically, the various proteins being separated according to their molecular weight.
  • This SDS-PAGE gel electrophoresis which can be followed by adding suitable marker substances, is complete after about an hour. Then the electrical voltage is switched off.
  • the separation principles of the first dimension (IEF, hydrophobic interaction, affinity, ionic interaction) described above can of course also be used for the separation in the second dimension.
  • the further processing of the proteins until they are discharged onto the carrier surface 16 takes place in a liquid flow via the channel structure 14.
  • the required liquids are introduced via the cover chamber 24, while the valve opening 28 allows the displaced air to flow away.
  • the liquid flow is passed perpendicular to the parting plane and in a uniform distribution through the parting region 30, the floating pressure difference being able to be increased, for example, by applying a supporting vacuum to the collecting chamber 32 of the base plate 20.
  • Gege- if necessary, the homogeneous surface distribution can be improved by a perforated plate, not shown, which covers the channels 36.
  • SDS-free buffer solution is directed through the gel in the channels 36 of the second dimension. This removes SDS from the gel and from the separated proteins without changing the position of the proteins.
  • the buffer solution is discharged via the channel structure 14 into the lower collecting chamber 32 of the base plate 20.
  • a precisely metered amount of trypsin solution is then added in the same way.
  • the trypsin cleaves the proteins into defined polypeptides. The concentration and flow of trypsin are controlled so that the proteins are cleaved as completely as possible without significant amounts of the cleavage products being eluted from the gel.
  • the bottom plate 20 with the waste eluates is removed by a sliding mechanism.
  • the protein fragments generated by the protease cleavage are then eluted by adding a defined volume of elution buffer through the cover plate and targeted flow through the separating gel through the discharge channels 52.
  • the volume is controlled in such a way that the peptides generated from the separated proteins by the protease cleavage are deposited as completely as possible through the channel structure on the support surface 16, specifically localized in the region of the outlet openings of the discharge channels 52.
  • the invention relates to a separation device and a separation method for biomolecular sample material, in particular protein mixtures.
  • a separating element 10 is provided for the two-dimensional, preferably electrophoretic, separation of components of the sample material in the region 30 of a separating plane.
  • the separating element 10 has a channel or transfer structure 14 for the spatially resolved discharge of separated sample components in a transport direction running transversely to the separating plane onto a carrier surface 16 which is preferably suitable for mass-spectroscopic examinations.

Abstract

The invention concerns a device for separating and a method for separating a biomolecular substance sample, in particular protein mixtures. Said device comprises a separating element (10) designed to ensure a two-dimensional separation, preferably electrophoretic of constituents of the substance sample in the region (20) of a separation plane. The invention is characterized in that the separating element (10) has a channel or transfer structure (14) for locally accurate transfer of the separated sample constituents in a transport direction transverse to the separation plane onto a support surface (16) adapted to mass spectroscopy research.

Description

Trennvorrichtung und Trennverfahren für biomolekulares ProbenmaterialSeparation device and separation method for biomolecular sample material
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft eine Trennvorrichtung und ein Trennverfahren für biomolekulares Probenmaterial, insbesondere Proteingemische nach dem O- berbegriff des Patentanspruchs 1 bzw. 18.The invention relates to a separation device and a separation method for biomolecular sample material, in particular protein mixtures according to the preamble of patent claims 1 and 18, respectively.
Ein Meilenstein der molekularbiologischen Forschung war die Entschlüsselung des menschlichen Genoms, d.h. die Sequenzierung der gesamten Erbinformation des Menschen. Nun fokussiert sich die Forschung auf die Entschlüsselung der Funktion des Genoms und auf die Genprodukte, die Proteine. Hier möchte man möglichst ein Gesamtbild aller in einer bestimmten Zellpopulation bzw. einem bestimmten Gewebe exprimierten Proteine. Die Identität und Quantität der Proteine soll korreliert werden mit einem bestimmten Entwicklungszustand oder mit dem physiologischen Zustand der Zelle bzw. des Gewebes. So möchte man, um einer funktioneilen Beschreibung näher zu kommen, ein möglichst genaues und quantitatives Bild aller Protei- ne gewinnen. Diese Forschung der „Post-Genom"-Ära bezeichnet man auch als Proteomik. Während es sich beim Genom um eine prinzipiell statische Größe handelt, zeichnet sich das Proteom eines Lebewesens durch seine von Temperatur, Nährstoffmilieu, Einwirkung von Stress oder Medikamenten abhängige Veränderlichkeit aus. Es umfasst demnach die Gesamtheit der Proteine, die von den Genen einer Zelle oder eines Organismus unter bestimmten Umweltbedingungen in verschiedenen Wachstumsphasen synthetisiert werden.A milestone in molecular biological research was the decoding of the human genome, i.e. the sequencing of all human genetic information. Research is now focusing on decoding the function of the genome and on the gene products, the proteins. Here, one would like to have an overall picture of all the proteins expressed in a particular cell population or tissue. The identity and quantity of the proteins should be correlated with a certain developmental state or with the physiological state of the cell or tissue. In order to get a functional description, you want to get the most accurate and quantitative picture of all proteins. This research of the "post-genome" era is also known as proteomics. While the genome is basically a static variable, the proteome of a living being is characterized by its variability, which is dependent on temperature, nutrient environment, exposure to stress or medication. It therefore encompasses the entirety of the proteins that are synthesized by the genes of a cell or an organism under certain environmental conditions in different growth phases.
Die Proteomik soll durch die Identifizierung und Quantifizierung aller Proteine neue Erkenntnisse zur Funktion, Regulation und Interaktion der Proteine liefern. Insbesondere sollen quantifizierbare Unterschiede zwischen normalen Zellen und „entarteten", Krebs-Zellen bzw. Unterschiede im Proteinrepertoire von „krank" und „gesund" aufgezeigt werden. Dies wiederum erlaubt eine gezielte Suche nach therapeutisch wirksamen Substanzen.By identifying and quantifying all proteins, proteomics should provide new insights into the function, regulation and interaction of the proteins. In particular, quantifiable differences between normal cells and "degenerate", cancer cells or differences in the protein repertoire should of "sick" and "healthy" are shown. This in turn allows a targeted search for therapeutically active substances.
Um ein Proteom analysieren zu können, wird zunächst die Gesamtmenge der Proteine in ihre einzelnen Komponenten aufgetrennt, d.h. es werden die vielen Tausend einzelnen Proteine aus dem Gemisch physikalisch separiert. Dies geschieht in der Regel durch die so genannte zweidimensionale (2-D) Elektrophorese. Hierbei werden die Gesamtproteine aus einer Zellpopulation oder einem Gewebe möglichst quantitativ isoliert. Gegebenenfalls werden auch bestimmte Fraktionierungsschritte vorgenommen, wenn man gezielt nur eine bestimmte Fraktion der Gesamtproteine untersuchen möchte, z.B. Proteine aus bestimmten Zellorganellen wie den Mitochondrien.In order to be able to analyze a proteome, the total amount of proteins is first separated into their individual components, i.e. the many thousands of individual proteins are physically separated from the mixture. This is usually done by so-called two-dimensional (2-D) electrophoresis. The total proteins from a cell population or a tissue are isolated as quantitatively as possible. If necessary, certain fractionation steps are also carried out if one wishes to examine only a specific fraction of the total proteins, e.g. Proteins from certain cell organelles such as the mitochondria.
Dann erfolgt in der ersten Dimension eine isoelektrische Fokussierung (IEF). Dabei werden die Proteine in einem speziellen Gel bzw. auf einem festen Träger in einem pH-Gradienten anhand ihres isoelektrischen Punktes pl aufgetrennt. Die Proteine wandern im elektrischen Feld und werden an ihrem pl, der für jedes Protein charakteristisch ist, fokussiert. Dieser erste Schritt der isoelektrischen Fokussierung erfordert bestimmte Elektrophorese-Geräte zur Aufnahme von Membranen bzw. „Strips" mit immobilisierten pH Gradienten bzw. Gele mit Ampholyt-Puffem. Der Prozess der isoelektrischen Fokussierung dauert in der Regel viele Stunden (24 bis 48h).Then an isoelectric focusing (IEF) takes place in the first dimension. The proteins are separated in a special gel or on a solid support in a pH gradient on the basis of their isoelectric point p1. The proteins migrate in the electric field and are focused on their pI, which is characteristic of each protein. This first step of isoelectric focusing requires certain electrophoresis devices to hold membranes or "strips" with immobilized pH gradients or gels with ampholyte buffers. The process of isoelectric focusing usually takes many hours (24 to 48 hours).
Nach erfolgter isoelektrischer Fokussierung werden die Gele bzw. die Memb- ranen üblicherweise aus der ersten Apparatur entnommen und in einem SDS (Natriumdodecylsulfat)-haltigen Elektrophorese-Puffer äquilibriert. Sodann wird jedes Gel, jede Membran in einer zweiten Gelapparatur auf je ein neues, zweites Gel aufgebracht. Diese zweiten Gele bestehen aus SDS/Polyacrylamid. Nach Anlegen einer elektrischen Spannung senkrecht zu dem lEF-Gel wandern die fokussierten Proteine in das zweite Gel ein und werden dort aufgrund Ihres Molekulargewichtes aufgetrennt. Diese elektro- phoretische Auftrennung kann ebenfalls viele Stunden dauern (> 16 h). lm nächsten Schritt werden die so aufgetrennten Proteine sichtbar gemacht. Dies geschieht durch einen Färbeschritt mit Coomassie Brilliant Blue, kolloidalem Coomassie, Silbernitrat oder Fluoreszenz-Farbstoffen (SYPRO Red, SYPRO Ruby). Anschließend wird das gefärbte Gel - meist mit einem digitalen Bildaufnahmesystem - photographiert bzw. die gefärbten Spots dokumentiert. Um eine genauere wissenschaftliche Aussage machen zu können, müssen entweder alle angefärbten Proteine oder bestimmte, interessierende Proteine (z.B. solche, die gegenüber einer Referenz verändert sind in Positi- on und/oder Quantität) identifiziert und charakterisiert werden. Dies geschieht normalerweise durch Massenspektroskopische Verfahren. Am gebräuchlichsten hierfür ist die Analyse der Peptidfragmente eines bestimmten Spots durch MALDI-TOF(Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation- Flugzeit)-Massenspektrometrie. Dazu wird wiederum eine vielstufige Prozes- sierung der einzelnen angefärbten Proteinspots durchgeführt.After isoelectric focusing, the gels or membranes are usually removed from the first apparatus and equilibrated in an electrophoresis buffer containing SDS (sodium dodecyl sulfate). Then each gel, each membrane is applied to a new, second gel in a second gel apparatus. These second gels are made of SDS / polyacrylamide. After applying an electrical voltage perpendicular to the IEF gel, the focused proteins migrate into the second gel and are separated there based on their molecular weight. This electrophoretic separation can also take many hours (> 16 h). In the next step, the proteins separated in this way are made visible. This is done by a coloring step with Coomassie Brilliant Blue, colloidal Coomassie, silver nitrate or fluorescent dyes (SYPRO Red, SYPRO Ruby). Then the colored gel - usually with a digital image recording system - is photographed or the colored spots are documented. In order to be able to make a more precise scientific statement, either all stained proteins or certain proteins of interest (for example those which have been changed in relation to a reference in terms of position and / or quantity) must be identified and characterized. This is usually done by mass spectroscopic methods. The most common for this is the analysis of the peptide fragments of a particular spot by MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization-flight time) mass spectrometry. For this purpose, a multi-stage processing of the individual stained protein spots is carried out.
Im ersten Schritt werden die angefärbten Protein-Spots in möglichst kleinem Volumen aus dem Gel isoliert. Dies geschieht manuell oder mit automatischen, Software-gesteuerten Spot-Pickern. Die kleinen Protein-haltigen Gelstückchen (wenige μl Volumen) werden dann mit einem Puffer inkubiert, der dafür sorgt, dass SDS und der Farbstoff aus dem Gel entfernt werden. Dann werden die Gelstückchen getrocknet, in einem für Protease-Verdau geeignetem Puffer aufgenommen und mit einer Protease (in der Regel Trypsin) inkubiert. Diese spaltet die im Gel enthaltenen Proteine in definierte Fragmente. Anschließend werden die Proteinfragmente (Peptide) mit Am- moniumbicarbonat aus dem Gel ausgewaschen bzw. eluiert.In the first step, the stained protein spots are isolated from the gel in the smallest possible volume. This is done manually or with automatic, software-controlled spot pickers. The small protein-containing gel pieces (a few μl volume) are then incubated with a buffer, which ensures that SDS and the dye are removed from the gel. The gel pieces are then dried, taken up in a buffer suitable for protease digestion and incubated with a protease (usually trypsin). This cleaves the proteins contained in the gel into defined fragments. The protein fragments (peptides) are then washed out or eluted from the gel with ammonium bicarbonate.
Die aus den einzelnen Gelstücken isolierten Peptide werden dann separat auf einen Träger für Massenspektrometne aufgebracht und nach Trocknen und gegebenenfalls Rekristallisation der Massenspektrometne unterworfenThe peptides isolated from the individual gel pieces are then applied separately to a support for mass spectrometry and, after drying and optionally recrystallization, subjected to the mass spectrometer
(MALDI-TOF). Die Daten aus der Massenspektrometne erlauben durch Ver- gleich mit geeigneten Datenbanken die eindeutige Identifizierung des Proteins sowie die relative Quantifizierung der Menge an Protein.(MALDI-TOF). The data from the mass spectrometer allow through the unique identification of the protein as well as the relative quantification of the amount of protein with suitable databases.
Das oben geschilderte Verfahren der „klassischen" 2-D-Elektrophorese mit Prozessierung für Massenspektrometne hat eine Reihe von Nachteilen:The above-described process of "classic" 2-D electrophoresis with processing for mass spectrometry has a number of disadvantages:
- Es braucht relativ große Mengen an Gesamtprotein (Milligramm). Diese Mengen sind bei besonders interessanten Fragestellungen oft nicht verfügbar, z.B. bei der Untersuchung von Tumorgewebe.- It takes a relatively large amount of total protein (milligrams). These quantities are often not available for particularly interesting questions, e.g. when examining tumor tissue.
- Es ist sehr zeitaufwendig und langwierig. - Es beinhaltet sehr viele, zum Teil nur manuell ausführbare Teilschritte.- It is very time consuming and lengthy. - It contains a large number of steps, some of which can only be carried out manually.
Es bedarf einer Vielzahl von Geräten (lEF-Elektrophorese, SDS- PAGE Elektrophorese, Stainer, Imager, Spot-Picker, Gelstück- Imkubierer, Trockner, Pipettierautomat etc.) Es erlaubt nur die Auftrennung von Proteinen, die der IEF zugänglich sind. Viele, und gerade besonders interessante Proteinklassen, z.B. Membranproteine/Rezeptoren, Zellkern- oder DNA-assoziierte Proteine können mit der IEF nicht oder nicht gut aufgetrennt werden. Der Gesamtprozess ist nicht gut reproduzierbar.A large number of devices are required (IEF electrophoresis, SDS-PAGE electrophoresis, stainer, imager, spot picker, gel piece incubator, dryer, automatic pipetting device, etc.). It only allows the separation of proteins that are accessible to the IEF. Many and particularly interesting protein classes, e.g. Membrane proteins / receptors, cell nucleus or DNA-associated proteins cannot or cannot be separated with the IEF. The overall process is not easily reproducible.
Bisher nicht als Produkt oder Prototypen verfügbar und testbar, jedoch in der Literatur oder in Patentanmeldungen beschrieben (US 6214191 , US 5599432, EP 977030, WO 0058721 ; Becker et al., J. Micromech. Microeng. 1988, 8, 24) wurden Elektrophorese-Chips zum zweidimensionalen Auftren- nen von Proteinen. Zur Weiterverarbeitung wurden Möglichkeiten der optischen Detektion beschrieben, jedoch keine dabei erhaltenen Daten gezeigt. Solche Chips bieten zwar den Vorteil, sehr geringe Proteinmengen auftrennen zu können. Dem Fachmann ist aber klar, dass diese sehr kleinen Mengen optisch kaum noch detektierbar sein werden.So far not available and testable as a product or prototype, but described in the literature or in patent applications (US 6214191, US 5599432, EP 977030, WO 0058721; Becker et al., J. Micromech. Microeng. 1988, 8, 24) have been electrophoresis Chips for two-dimensional separation of proteins. Possibilities of optical detection were described for further processing, but no data obtained was shown. Such chips offer the advantage of being able to separate very small amounts of protein. However, it is clear to the person skilled in the art that these very small amounts will hardly be detectable optically.
Ausgehend hiervon liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die im Stand der Technik aufgetretenen Nachteile zu vermeiden und eine Vorrichtung und ein Verfahren der eingangs angegebenen Art zu verbessern, so dass auch sehr kleine Probenmengen mit geringem Handhabungsaufwand in einem automatisierbaren Ablauf zuverlässig und mit hoher Genauigkeit verarbeitet bzw. analysiert werden können.Proceeding from this, the invention is based on the object of avoiding the disadvantages encountered in the prior art and of a device and to improve a method of the type specified at the outset so that even very small sample quantities can be processed and analyzed reliably and with high accuracy with little handling effort in an automated process.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird die in den unabhängigen Patentansprüchen angegebene Merkmalskombination vorgeschlagen.To achieve this object, the combination of features specified in the independent patent claims is proposed.
i Die Erfindung geht von dem Gedanken aus, eine in einem Bauteil integrierte dreidimensionale Transportstruktur für das Probenmaterial zu schaffen, um neben der Trennung von Probenkomponenten auch deren gezielte Weiterverarbeitung zu ermöglichen. Dementsprechend wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß das Trennelement eine Kanalstruktur zum Ausschleusen von separierten Probenkomponenten in einer quer zu der Trennebene ver- laufenden Transportrichtung auf eine Trägerfläche aufweist. Entsprechend ist es in verfahrensmäßiger Hinsicht vorgesehen, dass die separierten Probenkomponenten quer zur Trennebene aus dem Trennelement auf eine Trägerfläche ausgeschleust werden.i The invention is based on the idea of creating a three-dimensional transport structure for the sample material integrated in a component in order to enable not only the separation of sample components but also their targeted further processing. Accordingly, it is proposed according to the invention that the separating element has a channel structure for discharging separated sample components onto a carrier surface in a transport direction running transversely to the separating plane. In terms of the method, it is accordingly provided that the separated sample components are discharged from the separating element onto a carrier surface transversely to the parting plane.
Die Erfindung erlaubt eine schnelle, leicht automatisierbare Auftrennung der Proteine sowie das direkte, ortsaufgelöste Ausschleusen auf eine Trägerfläche bzw. ein Substrat in einem einzigen dreidimensionalen Grundelement. Dadurch ist es möglich, den gewonnenen Informationsgehalt einer zweidi- mensionalen Proteintrennung ohne Informationsverlust in die dritte Dimensi- on zu überführen. Erfindungsgemäß wird die gesamte Prozesskette, die sonst in separaten Geräten durchgeführt wird, in einem einzigen Element zusammengefasst. Insbesondere werden die manuellen Schritte auf das Aufbringen der Probe reduziert. Die Menge an benötigtem biologischem Material kann um mehrere Größenordnungen reduziert werden, so dass Mikro- gramm-Mengen für eine Analyse genügen. Durch Integration von Teilschritten in einem einzigen Bauelement und durch das Wegfallen manueller Zwischenschritte wird der Gesamtprozess deutlich besser reproduzierbar und kontrollierbar. Außerdem lässt sich die Gesamtprozessdauer auf wenige Stunden reduzieren. Dies erlaubt ganz neue Arten von Fragestellungen zu bearbeiten, die bisher aufgrund der relativ großen notwendigen Materialmenge nicht zugänglich waren und ermöglicht eine sehr viel feinere Diskri- minierung biologischer Vorgänge. Die auf einer freien Oberfläche des Trennelements deponierten Substanzen (z.B. Peptide) können direkt, beispielsweise durch Massenspektroskopie analysiert werden. Gegebenenfalls ist als Trägersubstrat eine gesonderte Targetplatte für die Massenspektroskopie vorgesehen. Grundsätzlich sind auch andere Einsatzzwecke denkbar, beispielsweise funktioneile Assays für Aktivitäts- oder Bindungstests der separierten Proteine bzw. Peptide.The invention allows a rapid, easily automatable separation of the proteins as well as the direct, spatially resolved discharge onto a carrier surface or a substrate in a single three-dimensional basic element. This makes it possible to transfer the information content of a two-dimensional protein separation into the third dimension without loss of information. According to the invention, the entire process chain, which is otherwise carried out in separate devices, is combined in a single element. In particular, the manual steps are reduced to the application of the sample. The amount of biological material required can be reduced by several orders of magnitude, so that microgram amounts are sufficient for an analysis. By integrating sub-steps in a single component and by eliminating manual intermediate steps, the overall process is much more reproducible and controllable. In addition, the total process time can be reduced to a few hours. This allows completely new types of questions to be dealt with that were previously not accessible due to the relatively large amount of material required and enables much more precise discrimination against biological processes. The substances deposited on a free surface of the separating element (for example peptides) can be analyzed directly, for example by mass spectroscopy. If necessary, a separate target plate for mass spectroscopy is provided as the carrier substrate. In principle, other uses are also conceivable, for example functional assays for activity or binding tests of the separated proteins or peptides.
Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie der Zeichnung. Es zeigen in schemati- scher WeiseAdvantageous refinements and developments of the invention result from the dependent claims and the following description of exemplary embodiments and the drawing. They show in a schematic way
Fig. 1 und 2 eine Vorrichtung zum Trennen und Weiterverarbeiten von Proteinen umfassend ein plattenförmiges Trennelement in per- spektivischer und vertikal abgebrochener Darstellung;1 and 2 a device for separating and further processing of proteins comprising a plate-shaped separating element in perspective and vertically broken representation;
Fig. 3 einen Vertikalschnitt durch das Trennelement nach Fig. 1 ;3 shows a vertical section through the separating element according to FIG. 1;
Fig. 4 eine Mittel- bzw. Trennplatte des Trennelements in perspekti- vischer Ansicht;4 is a perspective view of a central or separating plate of the separating element;
Fig. 5a eine ausschnittsweise Draufsicht auf die Trennplatte nach Fig.5a is a partial plan view of the partition plate of FIG.
4 und die bodenseitig daran anschließende Kanalstruktur;4 and the channel structure adjoining it at the bottom;
Fig. 5b einen Schnitt entlang der Linie b-b der Fig. 5a mit an die Kanalstruktur angeschlossener Trägerplatte; Fig. 5c eine Ausführungsform mit einer Trägerfläche direkt auf der5b shows a section along the line bb of FIG. 5a with the carrier plate connected to the channel structure; Fig. 5c an embodiment with a support surface directly on the
Trennplatte in teils geschnittener perspektivischer Ansicht;Partition plate in a partially cut perspective view;
Fig. 6 und 7 weitere Ausführungsformen von Trennelementen in aus- schnittsweiser perspektivischer Ansicht;6 and 7 further embodiments of separating elements in a perspective view in section;
Fig. 8 einen Positionierrahmen zur Verbindung mehrerer Trennelemente mit einer massenspektroskopischen Trägerplatte in schaubildlicher Darstellung; und8 shows a positioning frame for connecting a plurality of separating elements to a mass-spectroscopic carrier plate in a diagrammatic representation; and
Fig. 9 eine Aufnahmeeinheit zur Lagerung und Prozessierung vonFig. 9 a recording unit for storage and processing of
Trennelementen in einem Vertikalschnitt.Separating elements in a vertical section.
Die in der Zeichnung dargestellten plattenförmigen Trennelemente 10 bestehen im wesentlichen aus einer Trennplatte 12 zur zweidimensionalen Separation von Proteinmaterial, einer quer dazu wirksamen Transport- bzw. Kanalstruktur 14 zum positionsgetreuen Ausschleusen der separierten Probenkomponenten auf eine für massenspektroskopische Untersuchungen geeig- nete Trägerfläche 16 und einer Deckelplatte 18 sowie einer Bodenplatte 20 zur beidseitigen Begrenzung der Trennplatte 12.The plate-shaped separating elements 10 shown in the drawing essentially consist of a separating plate 12 for the two-dimensional separation of protein material, a transport or channel structure 14 acting transversely thereto for the accurate removal of the separated sample components onto a support surface 16 suitable for mass spectroscopic examinations and a cover plate 18 and a base plate 20 for delimiting the partition plate 12 on both sides.
Wie in Fig. 1 bis 3 dargestellt, besitzt die Deckelplatte 18 eine schlitzförmig durchgehende Probenaufgabeöffnung 22, eine zur Trennplatte 12 hin offene Deckelkammer 24, eine in die Deckelkammer 24 mündende seitliche Einlassöffnung 26 und eine zentrale Ventilöffnung 28. Die Trennplatte 12 bildet in zwei übereinander liegenden Bereichen ein dreidimensionales Kanalsystem, wobei ein in der Platten- bzw. Trennebene liegender oberer zweidimen- sionaler Trennbereich 30 bodenseitig durch die in der dritten Dimension ver- laufende Kanalstruktur 14 begrenzt ist. Die Bodenplatte 20 dient zur Stützung und Stabilisierung der Plattenanordnung und enthält eine zu der Kanalstruktur 14 hin offene Sammelkammer 32. Der Grundwerkstoff für das als Verbundchip ausgebildete Trennelement 10 kann aus Silizium, Polypropylen, Polycarbonat, anderen Polymeren (z.B. Po- lymethylmethacrylat, Polyethylenterephtalat, Polystyrol, Polydimethylsiloxan), Kunstharz, Keramik oder einem Metall oder verschiedener dieser Materialien bestehen. Wichtig ist, dass der Grundwerkstoff die Formgebung mit der notwendigen Präzision erlaubt und vereinbar ist mit den zur Probenverarbeitung eingesetzten Materialien. Zweckmäßig sollte der Grundwerkstoff elektrisch isolierend und thermisch leitend sein, um elektrophoretische Trennungen und gegebenenfalls eine effiziente Kühlung zu ermöglichen. Das Trennelement 10 besitzt beispielsweise eine Grundfläche von 6 x 4 cm (entsprechend 1/4 einer üblichen Mikrotiterplatte).As shown in FIGS. 1 to 3, the cover plate 18 has a slit-like, continuous sample application opening 22, a cover chamber 24 which is open towards the separating plate 12, a lateral inlet opening 26 opening into the cover chamber 24, and a central valve opening 28. The separating plate 12 forms two above one another lying areas a three-dimensional channel system, an upper two-dimensional separating area 30 lying in the plate or parting plane being delimited on the bottom side by the channel structure 14 running in the third dimension. The base plate 20 serves to support and stabilize the plate arrangement and contains a collection chamber 32 which is open towards the channel structure 14. The base material for the separating element 10 designed as a composite chip can consist of silicon, polypropylene, polycarbonate, other polymers (for example polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polystyrene, polydimethylsiloxane), synthetic resin, ceramic or a metal or various of these materials. It is important that the base material allows the shaping with the necessary precision and is compatible with the materials used for sample processing. The base material should expediently be electrically insulating and thermally conductive in order to enable electrophoretic separations and, if appropriate, efficient cooling. The separating element 10 has, for example, a base area of 6 × 4 cm (corresponding to 1/4 of a conventional microtiter plate).
Die in Fig. 4 gesondert gezeigte Trennplatte 12 weist in der Plattenebene verlaufende orthogonale Trennpfade 34, 36 zur sequentiellen 2D- Elektrophorese auf. Zu diesem Zweck sind zwei Elektrodenpaare 38, 40 vorgesehen, die über elektrische Anschlussfahnen mit einer geeigneten Gleichspannung beaufschlagbar sind.The separating plate 12 shown separately in FIG. 4 has orthogonal separating paths 34, 36 running in the plane of the plate for sequential 2D electrophoresis. For this purpose, two pairs of electrodes 38, 40 are provided, which can be supplied with a suitable direct voltage via electrical connection lugs.
Der Trennpfad 34 der ersten Dimension zwischen den Elektroden 38 wird durch eine langgestreckte Ausnehmung 42 gebildet, in welcher ein Gel- oder Membranstreifen (nicht gezeigt) mit einem präformierten pH-Gradienten zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) der Proteinmoleküle angeordnet ist. Dabei kann in Speicherzonen 44 im Bereich der Elektroden 38 ein Elektropho- rese-Puffer vorgelegt werden.The separation path 34 of the first dimension between the electrodes 38 is formed by an elongated recess 42, in which a gel or membrane strip (not shown) with a preformed pH gradient for isoelectric focusing (IEF) of the protein molecules is arranged. An electrophoresis buffer can be placed in storage zones 44 in the area of the electrodes 38.
Die Trennpfade der zweiten Dimension sind durch eine Schar von zwischen den Elektroden 40 parallel zueinander verlaufenden Kanälen 36 gebildet, die entlang der Ausnehmung 42 verteilt angeordnet sind und rechtwinklig davon abzweigen. Die Anzahl der Kanäle hängt von der gewünschten und erreichbaren Auflösung bzw. Trennleistung der ersten Dimension ab. Sie kann zwischen 10 und mehreren Tausend liegen, bevorzugt 50 bis 500. Die Molekül- trennung in diesen Kanälen erfolgt durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) in einem Natriumdodecylsulfat (SDS)-haltigen Elektrophorese- Puffer. Die Aussparungen 46, 48 im Bereich der Elektroden 40 können dabei als Pufferreservoir dienen.The separating paths of the second dimension are formed by a family of channels 36 which run parallel to one another between the electrodes 40 and are arranged distributed along the recess 42 and branch off at right angles therefrom. The number of channels depends on the desired and achievable resolution or separation performance of the first dimension. It can be between 10 and several thousand, preferably 50 to 500. The molecular These channels are separated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in an electrophoresis buffer containing sodium dodecyl sulfate (SDS). The cutouts 46, 48 in the region of the electrodes 40 can serve as a buffer reservoir.
Bei der Herstellung wird zunächst das SDS-PAGE Trenngel in die Kanäle 36 der zweiten Dimension und in die Pufferreservoirs 46, 48 eingebracht und photopolymerisiert. Dabei kann die Ausnehmung 42 für den lEF-Gelstreifen mechanisch (Separator 50) abgetrennt sein, um eine Vermischung der Gel- Sorten zu verhindern. Vorteilhaft ist es auch, wenn die Kanäle 36 in ihrem Anfangsteil mit einem Sammelgel befüllt werden, welches dem Trenngel vorgeschaltet ist. Durch das Sammelgel können in der späteren Trennung die Proteine an der Grenzzone zum Trenngel gesammelt und komprimiert werden, so dass schärfere Zonen der einzelnen Proteinbanden entstehen.During production, the SDS-PAGE separating gel is first introduced into the channels 36 of the second dimension and into the buffer reservoirs 46, 48 and photopolymerized. The recess 42 for the IEF gel strip can be mechanically separated (separator 50) in order to prevent mixing of the gel types. It is also advantageous if the channels 36 are filled in their initial part with a collecting gel which is connected upstream of the separating gel. In the later separation, the collection gel enables the proteins to be collected and compressed at the boundary zone to the separation gel, so that sharper zones of the individual protein bands are formed.
Wie am besten aus Fig. 5a, b ersichtlich, wird die Kanalstruktur 14 durch am Boden der Trennkanäle 36 aufgereihte Ausschleuskanäle 52 gebildet. Diese verlaufen senkrecht zu der durch die Trennkanäle 36 aufgespannten Trennebene und bilden eine über den Trennbereich 30 verteilte Kanalmatrix, um ein abbildungsgetreues Ausschleusen des bei der Molekültrennung erhaltenen 2D-Musters zu ermöglichen, wie es weiter unten näher erläutert wird. Die Anzahl der Ausschleuskanäle 52 pro Trennkanal 36 hängt wiederum von der gewünschten und erreichbaren Auflösung der Trennung in der zweiten Dimension ab. Sie kann zwischen 10 und 1000 liegen, bevorzugt 30 bis 400. Vorteilhaft sind die Ausschleuskanäle 52 konisch verjüngend ausgebildet, beispielsweise mit einem oberen Einlassdurchmesser von 100 μm und einem unteren Mündungsquerschnitt von 50 μm (Fig. 5b). Es sind aber auch andere Kanalgeometrien denkbar, um die Proteine nach erfolgter Trennung möglichst verlustfrei in der dritten Dimension zu prozessieren.As best seen in FIGS. 5 a, b, the channel structure 14 is formed by discharge channels 52 lined up at the bottom of the separation channels 36. These run perpendicular to the separating plane spanned by the separating channels 36 and form a channel matrix distributed over the separating area 30 in order to enable the 2D pattern obtained during the molecular separation to be discharged true to the image, as will be explained in more detail below. The number of discharge channels 52 per separation channel 36 in turn depends on the desired and achievable resolution of the separation in the second dimension. It can be between 10 and 1000, preferably 30 to 400. The discharge channels 52 are advantageously designed to taper conically, for example with an upper inlet diameter of 100 μm and a lower mouth cross section of 50 μm (FIG. 5b). However, other channel geometries are also conceivable in order to process the proteins in the third dimension as loss-free as possible after separation.
Zu diesem Zweck kann die Bodenplatte 20 abgenommen und die Trennplatte mit ihrer Unterseite 54 mit einer für massenspektroskopische Untersu- chungen vorgesehenen Trägerplatte 56, speziell einer für Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ausgebildeten Targetplatte in Anlage gebracht werden. Die Trägerplatte kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen (Metalle, Kunststoffe, Po- lymere). Wichtig ist, dass das Material mit der folgenden Massenspektrometne kompatibel ist, insbesondere für MALDI-TOF leitfähig ist. Entsprechend der flächigen Verteilung der Ausschleuskanäle 52 können auf einer an sich hydrophoben Oberfläche der Trägerplatte 56 hydrophile Ankerzonen 58 für die zu übertragenden Substanzen angeordnet sein. Die Position und Größe dieser Ankerzonen sind an die Ausschleuskanäle angepasst, so dass die eluierten Molekülfragmente direkt aufgefangen werden und die beim Trennvorgang erreichte geometrische Auflösung auf der Targetplatte im wesentlichen erhalten bleibt.For this purpose, the base plate 20 can be removed and the underside 54 of the separating plate can be used for a mass spectrometric examination. provided support plate 56, specifically a target plate designed for matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF). The carrier plate can consist of different materials (metals, plastics, polymers). It is important that the material is compatible with the following mass spectrometer, especially for MALDI-TOF. Corresponding to the areal distribution of the discharge channels 52, hydrophilic anchor zones 58 for the substances to be transferred can be arranged on an inherently hydrophobic surface of the carrier plate 56. The position and size of these anchor zones are adapted to the discharge channels, so that the eluted molecular fragments are collected directly and the geometric resolution achieved on the target plate during the separation process is essentially retained.
In der in Fig. 5c gezeigten, besonders einfachen Ausführung ist die Trägerfläche 16 durch eine freie Oberfläche der Trennplatte 12 selbst gebildet. Vorteilhaft ist, wenn die Trägerfläche 16 um die Mündungen 59 der Ausschleuskanäle 52 herum ringförmige hydrophile Ankerzonen 58 für das Probenmaterial aufweist, ansonsten aber hydrophob ist. Dies kann durch entsprechende chemische Derivatisierung oder Beschichtung erreicht werden. Ebenfalls können napfförmige Vertiefungen um die Austrittsöffnungen der Ausschleuskanäle 52 herum eine bessere Ablage der ausgeschleusten Peptide auf der Oberfläche 16 gewährleisten (nicht gezeigt). Auch hier sollte die beim Trennvorgang erreichte geometrische Auflösung erhalten bleiben. Die Trennplatte 12 mit den auf ihrer Oberfläche 16 deponierten Peptiden wird dann in eine geeignete Aufnahme für die Massenspektroskopie eingesetzt und der mas- senspektroskopischen Untersuchung unterworfen. Hierbei werden die Peptide mittels eines Lasers direkt von der Oberfläche 16 des Trennelements de- sorbiert.In the particularly simple embodiment shown in FIG. 5c, the carrier surface 16 is itself formed by a free surface of the separating plate 12. It is advantageous if the support surface 16 has annular hydrophilic anchor zones 58 for the sample material around the mouths 59 of the discharge channels 52, but is otherwise hydrophobic. This can be achieved by appropriate chemical derivatization or coating. Cup-shaped depressions around the outlet openings of the discharge channels 52 can also ensure better deposition of the discharged peptides on the surface 16 (not shown). The geometric resolution achieved during the separation process should also be retained here. The separating plate 12 with the peptides deposited on its surface 16 is then inserted into a suitable receptacle for mass spectroscopy and subjected to the mass spectroscopic examination. Here, the peptides are desorbed directly from the surface 16 of the separating element by means of a laser.
Die Kanäle 34, 36, 52 der drei Dimensionen können durchgehend in direktem Kontakt stehen, oder aber durch Barrieren oder Ventile getrennt sein, die nur bei Übergang von der einen Dimension in die andere geöffnet werden. Der Kontakt kann mechanisch, durch Bewegen oder Drehen der Kanäle, hergestellt werden, oder es können mechanische Barrieren vorgesehen sein. Die Kanaltrennung kann auch chemisch erfolgen, z.B. durch Polymere, die zum gewünschten Zeitpunkt aufgelöst werden. Denkbar ist es auch, die Kanäle der verschiedenen Dimensionen durch semipermeable Membranen, deren Permeabilität gesteuert werden kann, zu trennen.The channels 34, 36, 52 of the three dimensions can be in direct contact all the time, or can be separated by barriers or valves, which are only opened when changing from one dimension to the other. The contact can be made mechanically, by moving or rotating the channels, or mechanical barriers can be provided. The channels can also be separated chemically, for example by polymers that are dissolved at the desired time. It is also conceivable to separate the channels of the different dimensions by means of semipermeable membranes, the permeability of which can be controlled.
Bei der in Fig. 6 gezeigten Ausführungsform sind die mit SDS-PAGE- Trenngel 60 gefüllten Trennkanäle 36 der zweiten Dimension nach unten durch eine poröse Bodenschicht bzw. Fritte 62 begrenzt, welche mit fluidisch miteinander kommunizierenden Mikroporen eine quer zur Trennebene durchströmbare Kanalstruktur 14 bildet. In diesem Sinne sind die vielen eng beieinander liegenden Poren der Bodenschicht 62 als mikroskopische Aus- schleuskanäle zu verstehen.In the embodiment shown in FIG. 6, the separation channels 36 of the second dimension, filled with SDS-PAGE separating gel 60, are bounded at the bottom by a porous bottom layer or frit 62, which forms a channel structure 14 through which the micropores communicate fluidly with one another. In this sense, the many closely spaced pores of the bottom layer 62 are to be understood as microscopic discharge channels.
Das in Fig. 7 gezeigte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich zusätzlich dadurch, dass anstelle diskreter Trennkanäle für die Trennung in der zweiten Dimension eine ultradünne Polyacrylamid-Gelschicht 64 vorgesehen ist, die gegebenenfalls über einen Zwischenstreifen aus einem Sammelgel an den lEF-Gelstreifen seitlich angrenzt und eine SDS-PAGE-Elektrophorese ermöglicht.The exemplary embodiment shown in FIG. 7 additionally differs in that, instead of discrete separation channels for the separation in the second dimension, an ultra-thin polyacrylamide gel layer 64 is provided, which optionally adjoins the IEF gel strip laterally via an intermediate strip from a collecting gel and an SDS -PAGE electrophoresis enables.
Wie in Fig. 8 dargestellt, können vier Trennelemente 10 in einem Positionier- rahmen 66 auf einer massenspektroskopischen Trägerplatte 56 in der Größe einer Mikrotiterplatte gemeinsam positioniert und verarbeitet werden. Die Trägerplatte 56 wird dabei in vorbestimmtem Abstand zu der Austrittsseite der jeweiligen Kanalstruktur 14 parallel positioniert, so dass die zu übertragenden Moleküle direkt auf die hydrophilen Ankerzonen 58 übertragen wer- den können. Entsprechend dieser Anordnung lassen sich die Trennelemente 10 zur Lagerung und Voπ/erarbeitung in ein Vorratsbehältnis 68 einsetzen und darin mittels einer lösbaren Deckfolie 70 luftdicht einschließen (Fig. 9). Die Übergabe in den Positionierrahmen 66 unter Entfernung der Bodenplatten 20 kann durch einen geeigneten Schiebemechanismus (nicht dargestellt) vereinfacht bzw. automatisiert werden. Die gesamte Trennvorrichtung umfasst weitere Einheiten zur Steuerung des Prozessablaufs, die dem Fachmann an sich bekannt sind und hier nicht im einzelnen erläutert werden.As shown in FIG. 8, four separating elements 10 can be jointly positioned and processed in a positioning frame 66 on a mass-spectroscopic carrier plate 56 the size of a microtiter plate. The carrier plate 56 is positioned in parallel at a predetermined distance from the exit side of the respective channel structure 14, so that the molecules to be transferred can be transferred directly to the hydrophilic anchor zones 58. According to this arrangement, the separating elements 10 can be inserted into a storage container 68 for storage and preparation and enclosed therein in an airtight manner by means of a detachable cover film 70 (FIG. 9). The transfer into the positioning frame 66 with removal of the base plates 20 can be simplified or automated by a suitable sliding mechanism (not shown). The entire separating device comprises further units for controlling the process sequence, which are known per se to the person skilled in the art and are not explained in detail here.
Zur Verarbeitung in dem Trennelement bzw. Chip 10 wird eine geeignete Menge des Probenmaterials über die Aufgabeöffnung 22 in den ersten Trennpfad 34 eingebracht. Für eine typische Trennung wird 1 μg Gesamtprotein in einem Volumen von ca. 50 nl bis 1 μl Trägerflüssigkeit zugegeben. In Gegenwart geeigneter Puffer und nach Anlegen einer elektrischen Span- nung an die Elektroden 38 wandern die Proteine im elektrischen Feld und pH-Gradienten bis zu einer ihrem isoelektrischen Punkt entsprechenden Stelle. Nach erfolgter Trennung in der ersten Dimension, die zeitlich gesteuert und nach ca. einer Stunde abgeschlossen ist, wird die isoelektrische Fokussierung durch Abschalten der elektrischen Spannung beendet.For processing in the separating element or chip 10, a suitable amount of the sample material is introduced into the first separating path 34 via the feed opening 22. For a typical separation, 1 μg total protein is added in a volume of approx. 50 nl to 1 μl carrier liquid. In the presence of suitable buffers and after applying an electrical voltage to the electrodes 38, the proteins migrate in the electrical field and pH gradients to a point corresponding to their isoelectric point. After separation in the first dimension, which is time-controlled and completed after about an hour, the isoelectric focusing is ended by switching off the electrical voltage.
Grundsätzlich sind auch andere Trennmethoden möglich, z.B. aufgrund der Hydrophobizität der Proteine (hydrophobe Interaktion) oder aufgrund der Affinität zu bestimmten Substanzen (Affinitätstrennung). Durch die Realisierung verschiedener Trennverfahren für die erste Dimension neben der isoe- lektrischen Fokussierung wird die Analyse von Proteinklassen ermöglicht, die bisher nicht oder nur sehr ungenügend zugänglich waren. So lassen sich durch hydrophobe Interaktion Membranproteine analysieren, während durch Affinitätstrennung oder durch ionische Interaktionen andere Klassen, z.B. DNA-bindende Proteine, trennbar sind. Bei chromatographischen Methoden wandern die Proteine in einem Flüssigkeitsstrom und werden aufgrund ihrer Interaktion mit chromatographischen Material unterschiedlich stark zurückgehalten. Bei dieser Interaktion entsteht kein stabiler Gleichgewichtszustand, sondern die Auftrennung ist dynamisch und muss nach einer bestimmten Zeit gestoppt werden.In principle, other separation methods are also possible, for example on the basis of the hydrophobicity of the proteins (hydrophobic interaction) or on the basis of the affinity for certain substances (separation of affinity). The implementation of various separation methods for the first dimension in addition to isoelectric focusing enables the analysis of protein classes that were previously not or only inadequately accessible. Membrane proteins can be analyzed by hydrophobic interaction, while other classes, eg DNA-binding proteins, can be separated by affinity separation or ionic interactions. In chromatographic methods, the proteins migrate in a liquid stream and are held back to different extents due to their interaction with chromatographic material. This interaction does not create a stable state of equilibrium, the separation is dynamic and has to be stopped after a certain time.
Für die Auftrennung in der zweiten Dimension kann es erforderlich sein, dass der Puffer, der für die Trennung in der ersten Dimension verwendet wurde, von den Proteinen entfernt und diese in einem für die Trennung der zweiten Dimension geeigneten Puffer umäquilibriert werden. Dies kann direkt im Kanal 42 durch Überschichten erfolgen, wobei der neue Puffer über die Deckelplatte 18 zugeführt wird. Ebenfalls wird dann der SDS-PAGE-Puffer in die beiden Pufferreservoirs 46, 48 eingefüllt. Anschließend wird Spannung an die beiden Elektroden 40 angelegt und die lEF-fokussierten Proteine wandern aus dem lEF-Streifen entsprechend der erreichten Position in einen korrespondierenden Kanal 36 der zweiten Dimension. Die Auftrennung der Proteine in den SDS-Polyacrylamid-gefüllten Kanälen 36 der zweiten Dimen- sion erfolgt dann elektrophoretisch, wobei die verschiedenen Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Diese SDS-PAGE- Gelelektrophorese, die durch Zugabe geeigneter Markersubstanzen verfolgt werden kann, ist nach ca. einer Stunde beendet. Dann wird die elektrische Spannung abgeschaltet. Alternativ können für die Trennung in der zweiten Dimension natürlich auch die oben bereits geschilderten Trennprinzipien der ersten Dimension (IEF, hydrophobe Interaktion, Affinität, ionische Interaktion) zur Anwendung kommen.For the separation in the second dimension it may be necessary for the buffer which was used for the separation in the first dimension to be removed from the proteins and for these to be re-equilibrated in a buffer which is suitable for the separation in the second dimension. This can be done directly in the channel 42 by overlaying, the new buffer being fed in via the cover plate 18. The SDS-PAGE buffer is then also filled into the two buffer reservoirs 46, 48. Subsequently, voltage is applied to the two electrodes 40 and the IEF-focused proteins migrate from the IEF strip into a corresponding channel 36 of the second dimension in accordance with the position reached. The proteins in the SDS-polyacrylamide-filled channels 36 of the second dimension are then separated electrophoretically, the various proteins being separated according to their molecular weight. This SDS-PAGE gel electrophoresis, which can be followed by adding suitable marker substances, is complete after about an hour. Then the electrical voltage is switched off. Alternatively, the separation principles of the first dimension (IEF, hydrophobic interaction, affinity, ionic interaction) described above can of course also be used for the separation in the second dimension.
Die weitere Verarbeitung der Proteine bis zum Ausschleusen auf die Träger- fläche 16 erfolgt in einem Flüssigkeitsstrom über die Kanalstruktur 14. Die erforderlichen Flüssigkeiten werden über die Deckelkammer 24 eingeleitet, während die Ventilöffnung 28 das Abströmen der verdrängten Luft ermöglicht. Der Flüssigkeitsstrom wird senkrecht zur Trennebene und in gleichmäßiger Verteilung durch den Trennbereich 30 hindurchgeleitet, wobei die trei- bende Druckdifferenz beispielsweise durch Anlegen eines Stützvakuums an der Sammelkammer 32 der Bodenplatte 20 vergrößert werden kann. Gege- benenfalls kann die homogene Flächenverteilung durch eine nicht gezeigte Lochplatte, welche die Kanäle 36 überdeckt, verbessert werden.The further processing of the proteins until they are discharged onto the carrier surface 16 takes place in a liquid flow via the channel structure 14. The required liquids are introduced via the cover chamber 24, while the valve opening 28 allows the displaced air to flow away. The liquid flow is passed perpendicular to the parting plane and in a uniform distribution through the parting region 30, the floating pressure difference being able to be increased, for example, by applying a supporting vacuum to the collecting chamber 32 of the base plate 20. Gege- if necessary, the homogeneous surface distribution can be improved by a perforated plate, not shown, which covers the channels 36.
In einem ersten Aufbereitungsschritt für die spätere massenspektroskopi- sehe Untersuchung wird SDS-freie Pufferlösung durch das Gel in den Kanälen 36 der zweiten Dimension gelenkt. Diese entfernt SDS aus dem Gel und von den separierten Proteinen, ohne die Position der Proteine zu verändern. Die Pufferlösung wird über die Kanalstruktur 14 in die untere Sammelkammer 32 der Bodenplatte 20 abgeleitet. Anschließend wird auf dieselbe Weise eine genau dosierte Menge an Trypsin-Lösung zugeführt. Das Trypsin spaltet die Proteine in definierte Polypeptide. Konzentration und Fluss des Trypsins werden dabei so gesteuert, dass die Proteine möglichst vollständig gespalten werden, ohne dass bereits signifikante Mengen der Spaltprodukte aus dem Gel eluiert werden.In a first preparation step for the later mass spectroscopic examination, SDS-free buffer solution is directed through the gel in the channels 36 of the second dimension. This removes SDS from the gel and from the separated proteins without changing the position of the proteins. The buffer solution is discharged via the channel structure 14 into the lower collecting chamber 32 of the base plate 20. A precisely metered amount of trypsin solution is then added in the same way. The trypsin cleaves the proteins into defined polypeptides. The concentration and flow of trypsin are controlled so that the proteins are cleaved as completely as possible without significant amounts of the cleavage products being eluted from the gel.
Nach diesem Schritt wird durch einen Schiebemechanismus die Bodenplatte 20 mit den Abfall-Eluaten entfernt. Sodann werden die durch die Protease- Spaltung erzeugten Proteinfragmente durch Zugabe eines definierten Volumens an Elutionspuffer durch die Deckelplatte und gezielten Strom durch das Trenngel hindurch über die Ausschleuskanäle 52 eluiert. Das Volumen wird so gesteuert, dass die durch die Protease-Spaltung aus den getrennten Proteinen erzeugten Peptide möglichst vollständig durch die Kanalstruktur hindurch auf der Trägerfläche 16 deponiert werden, und zwar lokalisiert im Bereich der Austrittsöffnungen der Ausschleuskanäle 52.After this step, the bottom plate 20 with the waste eluates is removed by a sliding mechanism. The protein fragments generated by the protease cleavage are then eluted by adding a defined volume of elution buffer through the cover plate and targeted flow through the separating gel through the discharge channels 52. The volume is controlled in such a way that the peptides generated from the separated proteins by the protease cleavage are deposited as completely as possible through the channel structure on the support surface 16, specifically localized in the region of the outlet openings of the discharge channels 52.
Dadurch entsteht auf der Trägerfläche 16 gleichsam ein Abziehbild der Molekülverteilung im Trennbereich. Die Trennung der Proteine und die vorbereitende Prozessierung für die Massenspektrometne kann somit in einem Chip integriert mit minimalen Stoffmengen erfolgen, ohne dass ein externer Ein- griff mit Transferinstrumenten wie Mikropipetten erforderlich wäre. Zusammenfassend ist folgendes festzuhalten: Die Erfindung betrifft eine Trennvorrichtung und ein Trennverfahren für biomolekulares Probenmaterial, insbesondere Proteingemische. Hierfür ist ein Trennelement 10 zur zweidi- mensionalen vorzugsweise elektrophoretischen Separation von Komponen- ten des Probenmaterials im Bereich 30 einer Trennebene vorgesehen. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, dass das Trennelement 10 eine Kanaloder Transferstruktur 14 zum ortsaufgelösten Ausschleusen von separierten Probenkomponenten in einer quer zu der Trennebene verlaufenden Transportrichtung auf eine vorzugsweise für massenspektroskopische Untersu- chungen geeignete Trägerfläche 16 aufweist. As a result, a decal of the molecular distribution in the separation area is formed on the carrier surface 16. The separation of the proteins and the preparatory processing for the mass spectrometer can thus be integrated in a chip with minimal amounts of substance, without the need for external intervention with transfer instruments such as micropipettes. In summary, the following can be stated: The invention relates to a separation device and a separation method for biomolecular sample material, in particular protein mixtures. For this purpose, a separating element 10 is provided for the two-dimensional, preferably electrophoretic, separation of components of the sample material in the region 30 of a separating plane. It is proposed according to the invention that the separating element 10 has a channel or transfer structure 14 for the spatially resolved discharge of separated sample components in a transport direction running transversely to the separating plane onto a carrier surface 16 which is preferably suitable for mass-spectroscopic examinations.

Claims

Patentansprüche claims
1. Trennvorrichtung für biomolekulares Probenmaterial, insbesondere Proteingemische, mit einem Trennelement (10) zur zweidimensionalen ■ vorzugsweise elektrophoretischen Separation von Komponenten des1. Separating device for biomolecular sample material, in particular protein mixtures, with a separating element (10) for two-dimensional ■ preferably electrophoretic separation of components of the
Probenmaterials im Bereich (30) einer Trennebene, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennelement (10) eine Kanalstruktur (14) zum Ausschleusen von separierten Probenkomponenten in einer quer zu der Trennebene verlaufenden Transportrichtung auf eine Trägerfläche (16) aufweist.Sample material in the area (30) of a parting plane, characterized in that the parting element (10) has a channel structure (14) for discharging separated sample components in a transport direction running transversely to the parting plane onto a carrier surface (16).
2. Trennvorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerfläche (16) durch eine freie Fläche des Trennelements (10) oder durch ein gesondertes Trägersubstrat (16) gebildet ist.2. Separating device according to claim 1, characterized in that the carrier surface (16) is formed by a free surface of the separating element (10) or by a separate carrier substrate (16).
3. Trennvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (14) sich über den Trennbereich (30) des Trennelements (10) erstreckt, so dass die gegenseitige Relativposition der separierten Probenkomponenten beim Ausleiten auf die Trägerflä- ehe (16) im wesentlichen erhalten bleibt.3. Separating device according to claim 1 or 2, characterized in that the channel structure (14) extends over the separating area (30) of the separating element (10), so that the mutual relative position of the separated sample components upon discharge onto the support surface (16) essentially remains.
4. Trenn Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (14) eine Vielzahl von raster- o- der matrixförmig über den Trennbereich (30) des Trennelements (10) verteilt angeordneten und senkrecht zur Trennebene verlaufenden4. Separating device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the channel structure (14) a plurality of raster or matrix-shaped over the separation region (30) of the separating element (10) arranged and extending perpendicular to the parting plane
Ausschleuskanälen (52) aufweist.Has discharge channels (52).
5. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (14) durch eine poröse Platte (62) oder Schicht gebildet ist, wobei die Poren senkrecht zu der Trennebene durchströmbare mikroskopische Ausschleuskanäle bilden. 5. Separating device according to one of claims 1 to 4, characterized in that the channel structure (14) is formed by a porous plate (62) or layer, the pores forming microscopic discharge channels which can be flowed through perpendicular to the separation plane.
6. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur (14) an einer freien Transferfläche (54) mit dem Trägersubstrat (16) koppelbar ist.6. Separating device according to one of claims 1 to 5, characterized in that the channel structure (14) on a free transfer surface (54) with the carrier substrate (16) can be coupled.
7. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerfläche (16) für massenspektroskopische Untersuchungen, insbesondere MALDI-TOF-Analytik kompatibel ausgebildet ist.7. Separating device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the carrier surface (16) is designed to be compatible for mass-spectroscopic examinations, in particular MALDI-TOF analysis.
8. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägersubstrat (16) durch eine für massenspektroskopische Untersuchungen ausgebildete Trägerplatte (56), insbesondere eine MALDI-TOF-Targetplatte gebildet ist.8. Separating device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the carrier substrate (16) is formed by a carrier plate (56) designed for mass-spectroscopic examinations, in particular a MALDI-TOF target plate.
9. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerfläche (16) im Mündungsbereich der Ausschleuskanäle (52) hydrophile Ankerzonen (58) für das Probenmaterial aufweist.9. Separating device according to one of claims 1 to 8, characterized in that the carrier surface (16) in the mouth region of the discharge channels (52) has hydrophilic anchor zones (58) for the sample material.
10. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennelement (10) in der Trennebene verlaufende orthogonale Trennpfade (34,36) zur zweidimensionalen Probenseparation aufweist.10. Separating device according to one of claims 1 to 9, characterized in that the separating element (10) has orthogonal separating paths (34, 36) extending in the separating plane for two-dimensional sample separation.
11. Trennvorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennpfade (34,36) zur elektrophoretischen Molekülseparation insbesondere durch isoelektrische Fokussierung (IEF) oder Polyacryla- midgelelektrophorese (PAGE) ausgebildet sind.11. Separating device according to claim 10, characterized in that the separating paths (34, 36) are designed for electrophoretic molecular separation, in particular by isoelectric focusing (IEF) or polyacrylic amide gel electrophoresis (PAGE).
12. Trennvorrichtung nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Schar von nebeneinander verlaufenden Trennpfaden (36) der zweiten Dimension seitlich an einem Trennpfad (34) der ersten Dimension verteilt abzweigt.12. Separating device according to claim 10 or 11, characterized in that a family of juxtaposed separating paths (36) of the second dimension branches off laterally on a separation path (34) of the first dimension.
13. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Trennpfade (34,36) zumindest der zweiten Dimension zum Eluieren von Probenmaterial quer durchströmbar sind.13. Separating device according to one of claims 10 to 12, characterized in that the separating paths (34, 36) can be flowed through transversely at least in the second dimension for eluting sample material.
14. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennelement (10) eine parallel zu der Trenn- ebene ausgerichtete Lochplatte zum flächig verteilten Durchleiten eines14. Separating device according to one of claims 1 to 13, characterized in that the separating element (10) has a perforated plate aligned parallel to the separating plane for the areally passing through
Flüssigkeitsstroms aufweist.Has liquid flow.
15. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennpfade (34,36) durch insbesondere kapil- larartig-mikroskopische Trennkanäle und/oder durch Trennschichten aus Polymer- bzw. Gel-Material, beispielsweise aus Polyacrylamid-Gel gebildet sind.15. Separating device according to one of claims 10 to 14, characterized in that the separating paths (34, 36) are formed, in particular, by capillary-microscopic separating channels and / or by separating layers made of polymer or gel material, for example of polyacrylamide gel are.
16. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Trennpfade (34,36) der ersten und zweiten16. Separating device according to one of claims 10 to 15, characterized in that the separating paths (34, 36) of the first and second
Dimension gegeneinander und/oder gegenüber der Kanalstruktur (14) durch Barrieren oder Ventile wahlweise abtrennbar sind.Dimension against one another and / or against the channel structure (14) by barriers or valves are selectively separable.
17. Trennvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, gekennzeichnet durch einen Positionierrahmen (66) zur Festlegung eines oder mehrerer Trennelemente (10) gegenüber dem Trägersubstrat (16) in definierter Lagebeziehung.17. Separating device according to one of claims 1 to 16, characterized by a positioning frame (66) for fixing one or more separating elements (10) relative to the carrier substrate (16) in a defined positional relationship.
18. Trennverfahren für biomolekulares Probenmaterial, insbesondere Pro- teingemische, bei welchem Probenkomponenten vorzugsweise e- lektrophoretisch in einer Trennebene eines Trennelements (10) zwei- dimensional separiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die se- parierten Probenkomponenten quer zur Trennebene auf eine Trägerfläche (16) ausgeschleust werden.18. Separation process for biomolecular sample material, in particular protein mixtures, in which sample components are preferably separated two-dimensionally electrophoretically in a separating plane of a separating element (10), characterized in that the parried sample components transversely to the parting plane are discharged onto a support surface (16).
19. Trennverfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die separierten Probenkomponenten entsprechend ihrer flächigen Verteilung in der Trennebene vorzugsweise matrix- oder rasterförmig auf die Trägerfläche ausgeleitet werden.19. Separation method according to claim 18, characterized in that the separated sample components are preferably routed to the support surface in a matrix or grid pattern in accordance with their planar distribution in the separation plane.
20. Trennverfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenkomponenten durch eine Vielzahl von über die Trennebene verteilt angeordneten und quer dazu verlaufenden Ausschleuskanälen (52) auf die Trägerfläche (16) übertragen werden.20. Separation method according to claim 18 or 19, characterized in that the sample components are transferred to the support surface (16) through a plurality of discharge channels (52) which are distributed over the separation plane and run transversely thereto.
21. Trennverfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Probenkomponenten nach ihrer zweidimensio- nalen Trennung für eine massenspektroskopische Analyse direkt in dem Trennelement (10) aufbereitet werden.21. Separation method according to one of claims 18 to 20, characterized in that the sample components are processed directly in the separating element (10) after their two-dimensional separation for mass spectrometric analysis.
22. Trennverfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch ge- kennzeichnet, dass die separierten Probenkomponenten in einem quer zu der Trennebene gerichteten Flüssigkeitsstrom verarbeitet, insbesondere gewaschen, gespalten und/oder ausgeschleust werden.22. Separation method according to one of claims 18 to 21, characterized in that the separated sample components are processed, in particular washed, split and / or discharged, in a liquid stream directed transversely to the separation plane.
23. Trennverfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch ge- kennzeichnet, dass die separierten Probenkomponenten auf eine die23. Separation method according to one of claims 18 to 22, characterized in that the separated sample components onto one of the
Trennfläche bildende Oberfläche des Trennelements (10) ausgeschleust werden und dann direkt auf dieser Oberfläche massenspekt- roskopisch insbesondere durch MALDI-TOF-Analyse untersucht werden.Surface of the separating element (10) forming the separating surface can be discharged and then examined directly on this surface by mass spectrometry, in particular by MALDI-TOF analysis.
24. Trennverfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die separierten Probenkomponenten aus dem Trennelement (10) auf eine die Trägerfläche (16) bildende massenspektroskopische Trägerplatte (56), insbesondere eine MALDI-TOF- Platte übertragen werden. 24. Separation method according to one of claims 18 to 22, characterized in that the separated sample components from the Separating element (10) can be transferred to a mass-spectroscopic carrier plate (56) forming the carrier surface (16), in particular a MALDI-TOF plate.
EP03810966A 2002-11-09 2003-11-05 Device for separating and method for separating a biomolecular substance sample Withdrawn EP1558925A1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10252177 2002-11-09
DE10252177A DE10252177A1 (en) 2002-11-09 2002-11-09 Separation device and separation method for biomolecular sample material
PCT/EP2003/012320 WO2004044574A1 (en) 2002-11-09 2003-11-05 Device for separating and method for separating a biomolecular substance sample

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1558925A1 true EP1558925A1 (en) 2005-08-03

Family

ID=32308504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03810966A Withdrawn EP1558925A1 (en) 2002-11-09 2003-11-05 Device for separating and method for separating a biomolecular substance sample

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7645369B2 (en)
EP (1) EP1558925A1 (en)
JP (1) JP4541894B2 (en)
AU (1) AU2003301992A1 (en)
CA (1) CA2505255C (en)
DE (1) DE10252177A1 (en)
WO (1) WO2004044574A1 (en)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105810B2 (en) 2001-12-21 2006-09-12 Cornell Research Foundation, Inc. Electrospray emitter for microfluidic channel
US7537807B2 (en) 2003-09-26 2009-05-26 Cornell University Scanned source oriented nanofiber formation
CA2612052A1 (en) * 2005-06-18 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method and devices for forming a plurality of wells on a gel
JP2008544233A (en) 2005-06-18 2008-12-04 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ Method and apparatus for adding a reagent to an analyte in a gel
KR100792683B1 (en) * 2006-05-09 2008-01-09 연세대학교 산학협력단 - An Apparatus for Protein Separation Using Capillary Isoelectric Focusing-Hollow Fiber Flow Field Flow Fractionation and Method Thereof
JPWO2008078403A1 (en) * 2006-12-26 2010-04-15 日本電気株式会社 Electrophoresis chip and method of using the same
DE102008020428B3 (en) * 2008-04-24 2009-07-16 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Apparatus and method and gel system for analytical and preparative electrophoresis
US9753008B2 (en) 2015-11-10 2017-09-05 Woodham Biotechnology Holdings, LLC Gel electrophoresis and transfer combination using conductive polymers and method of use
US9702851B1 (en) 2016-06-17 2017-07-11 Woodham Biotechnology Holdings, LLC Gel electrophoresis and transfer combination using conductive polymers and method of use
WO2023248280A1 (en) * 2022-06-20 2023-12-28 株式会社東陽テクニカ Microchip, two-dimensional sample separation system, and method for manufacturing microchip

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3704217A (en) * 1969-09-08 1972-11-28 Samuel T Nerenberg Segmental macromolecular separation method and apparatus
US4181594A (en) * 1979-03-27 1980-01-01 University Of Pittsburgh Matrix recovery electrophoresis apparatus
US4693804A (en) * 1984-12-19 1987-09-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Apparatus for bidimensional electrophoretic separations
GB8523801D0 (en) * 1985-09-26 1985-10-30 Jones K W Vacuum molecular transfer(blotting)apparatus
CA1330966C (en) * 1987-07-24 1994-07-26 Leo G. Woerner Process and apparatus for conducting electrophoresis and transfer
US5039493A (en) * 1990-05-04 1991-08-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Positive pressure blotting apparatus with hydropholic filter means
DE4114611A1 (en) * 1990-05-11 1991-11-14 Sartorius Gmbh Microporous membrane element for multiple filtration unit - for slot or dot blotting analyses is compacted in seal area to avoid cross-contamination
US5279721A (en) * 1993-04-22 1994-01-18 Peter Schmid Apparatus and method for an automated electrophoresis system
DE4408034C1 (en) * 1994-03-10 1995-07-13 Bruker Franzen Analytik Gmbh Mass spectrometric analysis of proteins sepd. by gel electrophoresis
JPH08233799A (en) * 1995-02-24 1996-09-13 Tefuko Kk Membrane for chemical analysis and production thereof
US5580434A (en) * 1996-02-29 1996-12-03 Hewlett-Packard Company Interface apparatus for capillary electrophoresis to a matrix-assisted-laser-desorption-ionization mass spectrometer
US6013165A (en) * 1998-05-22 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Electrophoresis apparatus and method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2004044574A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2505255A1 (en) 2004-05-27
US7645369B2 (en) 2010-01-12
US20060000712A1 (en) 2006-01-05
JP4541894B2 (en) 2010-09-08
WO2004044574A1 (en) 2004-05-27
AU2003301992A1 (en) 2004-06-03
DE10252177A1 (en) 2004-06-09
WO2004044574A8 (en) 2005-12-15
JP2006505786A (en) 2006-02-16
CA2505255C (en) 2010-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7645369B2 (en) Separation method and device for protein mixtures
EP0706646B1 (en) Sample holder and its use
US7094345B2 (en) Implementation of microfluidic components, including molecular fractionation devices, in a microfluidic system
DE19628178C1 (en) Loading matrix-assisted laser desorption-ionisation sample plate for mass spectrometric analysis
DE4438785C2 (en) Microchemical reaction and analysis unit
DE60219040T2 (en) DIELECTROPHORETIC PROCESS AND ARRANGEMENT FOR HIGH-THROUGHPUT SCREENING
JP3103031B2 (en) Method and apparatus for moving molecules by applying an electric field
DE69720505T2 (en) METHOD AND DEVICE FOR IDENTIFYING AND CHARACTERIZING BIOMOLECULES
DE60013848T2 (en) MICROFLUID DEVICES FOR THE CONTROLLED HANDLING OF SMALL VOLUMES
EP0977030A1 (en) Chip for performing an electrophoretic separation of molecules and method using same
DE3630866A1 (en) METHOD AND DEVICE FOR APPLYING LIQUID ON A SLIM SAMPLE
EP2324911A2 (en) Processing of samples in solutions with defined small wall contact area
WO2007136386A2 (en) Droplet-based on-chip sample preparation for mass spectrometry
DE10020704B4 (en) Biochip for archiving and laboratory medical analysis of biological sample material, process for its production and its use in diagnostic procedures
DE102010041579A1 (en) Microfluidic unit with separation columns
DE202016008838U1 (en) Device for characterizing samples
DE4208732A1 (en) Disposable reaction vessel for solid phase immunoanalysis and method for measuring components that can be determined via immune reactions
WO2003056335A2 (en) Micro-recess array for size-dependent sorting or separation of cells suspended in a flowing medium and method for analysing the functional activity of individual cells
WO1995035492A2 (en) Process and device for selectively extracting components from complex mixtures
DE60304259T2 (en) Apparatus and method for sample preparation and direct spotting of eluents for a Maldi-Tof target
DE10018788B4 (en) Processing proteins from gels for mass spectrometric analysis
DE10247896A1 (en) Multi-dimensional separation of mixtures of bio-substances, e.g. for use in biochemistry, involves forming fraction bonds with selected solutions, using pipette robot in micro-titration plate
Zhang et al. Microfluidics Coupled Mass Spectrometry for Single Cell Multi‐Omics
WO2000002039A1 (en) Method and device for separating biomolecules
DE10353985A1 (en) Apparatus for manipulation and analysis of micro-objects, useful particularly for cells or their components, is constructed as a fluidics microsystem and/or microchip

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20050510

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: HOCHSTRASSER, REMO

Inventor name: LANGEN, HANNO

Inventor name: BERNDT, PETER

Inventor name: EFFENHAUSER, CARLO

Inventor name: HOELTKE, HANS-JOACHIM

Inventor name: RAINER, ALOIS

Inventor name: ROEDER, ALBERT

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: HOCHSTRASSER, REMO

Inventor name: LANGEN, HANNO

Inventor name: BERNDT, PETER

Inventor name: EFFENHAUSER, CARLO

Inventor name: HOELTKE, HANS-JOACHIM

Inventor name: RAINER, ALOIS

Inventor name: ROEDER, ALBERT

17Q First examination report despatched

Effective date: 20110215

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20130601