EP1476566A2 - Method for detecting bacteria associated with parodontitis and tooth decay - Google Patents

Method for detecting bacteria associated with parodontitis and tooth decay

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Publication number
EP1476566A2
EP1476566A2 EP02787569A EP02787569A EP1476566A2 EP 1476566 A2 EP1476566 A2 EP 1476566A2 EP 02787569 A EP02787569 A EP 02787569A EP 02787569 A EP02787569 A EP 02787569A EP 1476566 A2 EP1476566 A2 EP 1476566A2
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EP
European Patent Office
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complementary
sequences
nucleic acid
fragment
sequence
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Withdrawn
Application number
EP02787569A
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German (de)
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Inventor
Michael Weizenegger
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Hain Lifescience GmbH
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Hain Lifescience GmbH
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme Another possibility is the introduction of labels using the T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme.
  • radioactive or fluorescent labels See Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
  • the corresponding bacteria can be identified and differentiated either from primary material (e.g. tooth smears, blood, etc.) or from bacterial liquid or solid media.

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  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

The invention relates to the diagnosis of microorganisms, especially the detection of microorganisms which are associated with the disease known as parodontitis or tooth decay. The information relates to hybridization and amplification methods in particular, in addition to coupled amplification/hybridization methods with sequence-specific probes or primers.

Description

Verfahren zum Nachweis Parodontitis und Karies assoziierter Bakterien Procedure for the detection of periodontitis and caries associated bacteria
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Mikroorganismen, insbesondere den Nachweis von Bakterien, die mit der Erkrankung einer Parodontitis beziehungsweise Karies assoziiert sind. Die Erfindung betrifft insbesondere Hybridisierungsverfahren und Amplifikationsverfahren, sowie gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Sonden beziehungsweise Primern.The present invention relates to the field of diagnostics of microorganisms, in particular the detection of bacteria which are associated with the disease of periodontitis or caries. The invention relates in particular to hybridization methods and amplification methods, as well as coupled amplification / hybridization methods with sequence-specific probes or primers.
Der Nachweis von Bakterien und ihre genaue Identifizierung spielen eine sehr wichtige Rolle in der Parodontologie, damit eine entsprechende Behandlung eingeleitet werden kann. Die Parodontitis ist eine Infektionserkrankung des Zahnhalteapparats. Im Übergang von den Hartgeweben des Zahns zu den Weichgeweben des Parodontiums ergeben sich ideale Voraussetzungen für mikrobielle Infektionen. Die funktionierende Immunabwehr schützt das Par- odontium gegen die schädigende Wirkung pathogener Substanzen, die von Mikroorganismen ausgeschieden werden. Der immunkompetente Wirt ist in der Lage, die alltäglichen mikro- biellen Angriffe erfolgreich abzuwehren. Somit wird eine Infektion, d.h. eine Vermehrung im Parodontium, verhindert. Die parodontale Entzündung ist die örtliche Reaktion auf durch Mikroorganismen freigesetzte Toxine. In der ersten Phase der Infektion verändern Enzyme und zytotoxische Metaboliten aus der mikrobiellen Plaque und der Mundflüssigkeit das Gewebe. Die Gewebeimmunantwort erfolgt mit einer Anzahl von Mechanismen, die, obwohl sie in erster Linie eine Abwehr gegen gewebszerstörende Stoffe darstellen, zur Destruktion der gin- givalen Gewebsanteile führen. Eine große Bedeutung für die Entstehung der Parodontitis wird den drei mit Parodontitis hochassoziierten Bakterienspezies Actinobacillus actinomycetem- comitans, Porphyromonas gingivalis und Bacteroides forsythus zuerkannt. Andere Bakterien wie Campylobacter rectus, Fusobakterium nucleatum, Prevotella intermedius, Eikonella cor- rodens, Streptococcus intermedius-Komplsx und Treponema denticola werden als weniger Parodontitis hochassoziierte Bakterien betrachtet. Parodontopathogene Mikroorganismen kommen in hohen Keimzahlen in den progressiven Taschen, nicht aber oder nur in geringen Mengen im gesunden Gewebe vor. Die Eliminierung der Keime oder deren Toxine (z.B. Pro- teasen, Kollagenasen u.a.) führt zu einer klinischen Verbesserung des Krankheitsbildes. Deshalb besitzt die mikrobiologische Diagnostik einen hohen Stellenwert für die Therapieplanung, insbesondere dann, wenn eine Antibiotikagabe vorgesehen ist. Auch für die Therapie- kontrolle kann der Nachweis parodontopathogener Bakterien mitunter der einzige Indiz für den Behandlungserfolg sein.The detection of bacteria and their precise identification play a very important role in periodontology so that appropriate treatment can be initiated. Periodontitis is an infectious disease of the tooth structure. In the transition from the hard tissues of the tooth to the soft tissues of the periodontium, there are ideal conditions for microbial infections. The functioning immune defense protects the periodontium against the damaging effects of pathogenic substances that are excreted by microorganisms. The immune-competent host is able to successfully ward off everyday microbial attacks. This prevents infection, ie an increase in the periodontium. Periodontal inflammation is the local reaction to toxins released by microorganisms. In the first phase of the infection, enzymes and cytotoxic metabolites from the microbial plaque and oral fluid change the tissue. Tissue immune response occurs through a number of mechanisms which, although primarily a defense against tissue-destroying substances, lead to the destruction of the gingival parts of the tissue. The three bacterial species Actinobacillus actinomycetem-comitans, Porphyromonas gingivalis and Bacteroides forsythus, which are highly associated with periodontitis, are of great importance for the development of periodontitis. Other bacteria such as Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedius, Eikonella cor- rodens, Streptococcus intermedius-Komplsx and Treponema denticola are regarded as less periodontitis-associated bacteria. Periodontopathogenic microorganisms are found in high numbers of bacteria in the progressive pockets, but not or only in small quantities in healthy tissue. The elimination of the germs or their toxins (eg proteases, collagenases, etc.) leads to a clinical improvement in the clinical picture. That is why microbiological diagnostics are of great importance for therapy planning, especially when antibiotics are planned. Also for therapy control, the detection of periodontopathogenic bacteria can sometimes be the only indication of the success of the treatment.
Eine weitere medizinisch bedeutsame Infektion der Zähne wird durch Zucker vergärende Bakterien hervorgerufen. Hier sind insbesondere wichtig die Streptokokken mit den Spezies Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus. Beide Organismen können sich durch Ausbildung von klebrigen Zuckerpolymeren gut auf den glatten Zahnoberflächen festsetzen und dort durch Säurebildung den Dentinschmelz zerstören. Dieser Prozess wird zusätzlich durch den hohen Saccharosekonsum in den Industrieländern gefördert.Another medically significant infection of the teeth is caused by sugar-fermenting bacteria. Streptococci with the species Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus are particularly important here. Both organisms can adhere well to the smooth tooth surfaces due to the formation of sticky sugar polymers and destroy the dentine enamel there by acid formation. This process is further promoted by the high sucrose consumption in the industrialized countries.
In den letzten Jahren sind wichtige Erfindungen gemacht worden, um mit sehr speziesspezifische Primern in einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion Organismen nachzuweisen. Die Detektion erfolgt dabei meist über Gelelektrophorese oder analog der ELI SA-Technik über immobilisierte Sonden in Mikrotiterplatten. Unglücklicherweise eignen sich diese Methoden nicht, wenn es darum geht aus vielen möglichen pathogenen Organismen einen oder mehrere nachzuweisen. Gerade Bakteriengruppen von hoher Komplexität, großer Diversität und schwierigen Wachstumsbedingungen (z.B. strikt anaerobe Bakterien) sind der klassischen Kulturdifferenzierung schwer zugänglich und/oder verzögern durch ihr langsames Wachstum die Diagnostik erheblich. Revolutionierend sind hier nukleinsäurebasierende Verfahren, die sich durch hohe Spezifität und Sensitivität auszeichnen.In recent years, important inventions have been made to detect organisms with very species-specific primers in a nucleic acid amplification reaction. Detection is usually carried out using gel electrophoresis or, analogously to the ELI SA technique, using immobilized probes in microtiter plates. Unfortunately, these methods are not suitable when it comes to detecting one or more of many possible pathogenic organisms. Bacteria groups of high complexity, great diversity and difficult growth conditions (e.g. strictly anaerobic bacteria) are difficult to access for classical culture differentiation and / or slow down the diagnosis considerably due to their slow growth. Nucleic acid-based processes that are characterized by high specificity and sensitivity are revolutionary here.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung eines hoch spezifischen und hoch sensitiven Verfahrens zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien.The object of the present invention was therefore to provide a highly specific and highly sensitive method for the detection of periodontitis or caries associated bacteria.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nu- kleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist, an eine sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Diese Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden kurz Hybridisierungsverfahren genannt. Der Begriff Hybridisierungsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen ein.This object was achieved according to the invention by a method for the detection of periodontitis or caries-associated bacteria, in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or is complementary thereto, to a sequence and / or species-specific nucleic acid probe is hybridized under stringent conditions and then the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence-specific nucleic acid probe is detected, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or complementary to these Sequences, or represents a fragment thereof or complementary to this Is a fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. This embodiment of the invention is briefly called hybridization method in the following. The term hybridization method includes all preferred embodiments.
Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsäure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyri- midinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyri- midinbase. Eingeschlossen sind erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin- /Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsäure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.In the context of the present invention, the term nucleic acid and oligonucleotide refers to primers, samples, probes and oligomer fragments which are detected. The term nucleic acid and oligonucleotide is also generic to polydeoxyribonucleotides (containing 2-deoxy-D-ribose) and polyribonucleotides (containing D-ribose) or to any other type of polynucleotide that is an N-glycoside of a purine base or a pyridine base , or a modified purine base or a modified pyrimidine base. PNAs are also included according to the invention, i. H. Polyamides with purine / pyrimidine bases. The terms nucleic acid and oligonucleotide are not considered to be different within the meaning of the present invention; in particular, the use of the terms is not intended to mean any differentiation in terms of length. These terms include double-stranded or single-stranded DNA as well as double-stranded or single-stranded RNA.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert. Prinzipiell ist es möglich, durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsäure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsäure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.According to the invention, a composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof is hybridized with one or more probes. In principle, it is possible to determine the nucleic acid to be detected and thus, for example, the bacterial species by hybridization with a single specific probe. However, it is also possible to hybridize the composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof with more than one probe. This increases the informative value of the method. An exact profile is then obtained and the nucleic acid to be detected and thus, for example, the bacterial species can be determined with a high degree of certainty.
Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1-28 am 5 '-und/oder 3 '-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert werden. Das schließt ein, daß bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.The person skilled in the art is aware that, based on the teaching of the present invention, it is also possible to design probes which differ slightly from the probes according to the invention, but still work. It is also conceivable to use probes that have the sequences SEQ ID no. 1-28 at the 5 'and / or 3' end have extensions or truncations by at least one, two or three nucleotides. It is also conceivable that single or a few nucleotides of a probe by other nucleotides are interchangeable as long as the specificity of the probe and the melting point of the probe are not changed too much. This includes that when modified, the melting temperature of the modified probe does not deviate too much from the melting temperature of the original probe. The melting temperature is determined according to the G (= 4 ° C) + C (= 2 ° C) rule. It is clear to the person skilled in the art that, in addition to the usual nucleotides A, G, C, T, modified nucleotides such as inosine etc. can also be used. The teaching of the present invention enables such modifications based on the subject matter of the claims.
Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäu- ren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur Tm. Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.The term hybridization refers to the formation of duplex structures by two single-stranded nucleic acids due to complementary base pairing. Hybridization can take place between complementary nucleic acid strands or between nucleic acid strands that have smaller regions of mismatch. The stability of the nucleic acid duplex is measured by the melting temperature T m . The melting temperature T m is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the base pairs are dissociated.
Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbe- dingungen sind dem Fachmann bekannt ( z.B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.Conditions in which only completely complementary nucleic acids hybridize are referred to as stringent hybridization conditions. Stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art (for example Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). In general, stringent conditions are selected so that the melting temperature is 5 ° C lower than the T m for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. If the hybridization is performed under less stringent conditions, then sequence mismatches are tolerated. The extent of sequence mismatches can be controlled by changing the hybridization conditions.
Die Durchführung des Hybridisierungsverfahrens ist dem Fachmann an sich bekannt. So werden üblicherweise die festen Phasen nach Inkubation mit der Lösung, die den Hybridisie- rungspartner enthalten kann, stringenten Bedingungen ausgesetzt, um unspezifisch gebundene Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Die Hybridisierung kann in herkömmlicher Weise auf einer Nylon- oder Nitrocellulosemembran durchgeführt werden (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Die darin genannten Prinzipien lassen sich vom Fachmann auf weitere Ausführungsformen übertragen. Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zuläßt. Die Stringenz der Hybridisierung kann durch folgende Maßnahmen verbessert werden: Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.The implementation of the hybridization method is known per se to the person skilled in the art. For example, after incubation with the solution, which may contain the hybridization partner, the solid phases are usually subjected to stringent conditions in order to remove non-specifically bound nucleic acid molecules. Hybridization can be carried out in a conventional manner on a nylon or nitrocellulose membrane (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). The principles mentioned therein can be transferred to further embodiments by the person skilled in the art. Carrying out the hybridization under stringent conditions is particularly important for the method according to the invention. Stringent in the sense of the present invention means that the detection method allows a clear distinction between a positive reaction and a negative reaction in the reaction field of the strip. The stringency of the hybridization can be improved by the following measures: structure of the probe: by the length of the structure of the probe complementary to the target sequence; 15 to 20 mers are preferred.
Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflußt. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen 100-500 mM, insbesondere bevorzugt bei 250 mM.Running buffer: The stringency is influenced by the salinity. The ionic strength is preferably between 100-500 mM, particularly preferably 250 mM.
Weiterhin kann durch mild denaturierende Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden. Die Stringenz wird auch durch den pH-Wert des Laufpuffers beeinflußt.Furthermore, the stringency can be individually adjusted and optimized using mildly denaturing substances in the running buffer (DMSO, formamide, urea). The stringency is also influenced by the pH value of the running buffer.
Auch die Länge der Zielnukleinsäure spielt eine wichtige Rolle für die Sensitivität der Hybridisierung. Bevorzugt sind Nukleinsäurenstränge mit einer Länge von 100 - 500 Basenpaaren. Bevorzugt muß die Doppelstrang-Zielnukleinsäure vor der Hybridisierung denaturiert werden. Dies geschieht in der Regel durch basische Chemikalien oder Erwärmung, wobei die für die Doppelstrangstruktur verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen aufgeschmolzen werden. Bevorzugt als basische Chemikalie ist NaOH in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M. Besonders bevorzugt ist eine Konzentration von 0,25 M NaOH. Durch Erhitzen einer wäßrigen Nukleinsäurelösung auf mindestens 95°C und anschließendem raschen Abkühlen auf 4°C können ebenfalls Einzelstrangstrukturen erreicht werden. Einzelstrangampli- fikate z. B. als Produkte der NASBA-Reaktion sollten vor der Hybridisierung ebenfalls denaturiert werden, um intramolekulare Strukturen aufzulösen. Dies kann wegen der Empfindlichkeit der RNS gegenüber hohen pH- Werten bevorzugt durch mild denaturierende Chemikalien wie z.B. DMSO oder Formamid erfolgen.The length of the target nucleic acid also plays an important role in the sensitivity of the hybridization. Nucleic acid strands with a length of 100-500 base pairs are preferred. The double-stranded target nucleic acid must preferably be denatured before hybridization. This is usually done using basic chemicals or heating, whereby the hydrogen bonds responsible for the double-strand structure are melted. NaOH in a concentration of 0.1 to 0.5 M is preferred as the basic chemical. A concentration of 0.25 M NaOH is particularly preferred. Single strand structures can also be achieved by heating an aqueous nucleic acid solution to at least 95 ° C. and then rapidly cooling to 4 ° C. Single strand amplicons e.g. B. as products of the NASBA reaction should also be denatured before hybridization in order to resolve intramolecular structures. Because of the sensitivity of the RNA to high pH values, this can preferably be caused by mildly denaturing chemicals such as DMSO or formamide.
Die gewünschte Stringenz der Hybridisierung wird neben der Struktur von Zielsequenz und Sonde durch die Zusammensetztung von Hybridisierungs- und Stringenzwaschpuffer bestimmt. Als Hybridisierungspuffer werden in der Regel wäßrige Puffer mit einem Salzgehalt zwischen 0,1 und 0,5 M, und einem pH- Wert von 7,5 - 8,0 verwendet. Für eine gute Benetzung der sondentragenden Phase werden Detergenzien verwendet. Bevorzugt ist Natriumlau- rylsultat (SDS) in einer Konzentration von 0,1 - 7%. In der besonders bevorzugten hohen Konzentration von 7% wirkt SDS zudem günstig auf Signal-/Hintergrundverhältnisse, indem unspezifische Bindungen des Enzymkomplexes unterdrückt werden. Bevorzugt wird nach erfolgter Hybridisierung mit einem Stringenzwaschpuffer inkubiert. Dieser destabilisiert durch eine geringere Ionenstärke den Doppelstrang. So werden nicht 100% komplementäre Hybride wieder getrennt. Durch Zusätze von Chemikalien (z.B. Tetramethylammoniumchlorid), welche die Wasserstoffbrückenbindungen des Hybrids beeinflussen, lassen sich die Bindungsstärke von G/C und A/T Paarungen angleichen, was bei Multiplexsondensysteme vorteilhaft sein kann.In addition to the structure of the target sequence and probe, the desired stringency of the hybridization is determined by the composition of the hybridization and stringency washing buffer. Aqueous buffers with a salt content of between 0.1 and 0.5 M and a pH of 7.5-8.0 are generally used as hybridization buffers. Detergents are used to ensure good wetting of the probe-carrying phase. Sodium lauryl sulfate (SDS) is preferred in a concentration of 0.1-7%. In the particularly preferred high concentration of 7%, SDS also has a favorable effect on signal / background conditions by non-specific bonds of the enzyme complex are suppressed. After hybridization, incubation with a stringency wash buffer is preferred. This destabilizes the double strand through a lower ionic strength. This means that hybrids that are not 100% complementary are separated again. By adding chemicals (eg tetramethylammonium chloride) that influence the hydrogen bonds of the hybrid, the bond strength of G / C and A / T pairs can be adjusted, which can be advantageous in multiplex probe systems.
Erfindungsgemäß wird nach der Hybridisierung das Ausmaß der Hybridisierung bestimmt. Das erfolgt üblicherweise dadurch, daß die Menge der Markierung bestimmt wird, die an eine feste Phase gebunden ist, wobei die Markierung entweder an die Sonden oder die nachzuweisende Nukleinsäure gebunden ist . Derartige Nachweisreaktionen und Detektionsverfahren sind dem Fachmann an sich bekannt.According to the invention, the extent of the hybridization is determined after the hybridization. This is usually done by determining the amount of label that is bound to a solid phase, the label being bound to either the probes or the nucleic acid to be detected. Such detection reactions and detection methods are known per se to the person skilled in the art.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment oder enthält eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz.In a preferred embodiment of the method, the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 14-28 or complementary to these sequences, or a fragment thereof or complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wurde. Insbesondere ist bevorzugt, daß wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Am meisten bevorzugt ist, daß wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Die Amplifikationsprimer sollten so ausgewählt sein, daß das Amplifikationsprodukt gute sterische Verhältnisse in Kombination mit der immobilisierten Sonde aufweist. Pallindrom- strukturen, die zu intramolekularen Faltungen führen, können durch geeignete Primerauswahl vermieden werden. Im Falle der Markierung mit Hapten ist die räumliche Anordnung des Haptens (z.B. Biotin) im Hybrid Sonde/Zielnukleinsäure wichtig. Das Hapten sollte für den Antikörper-Enzymkomplex gut zugänglich sein.A preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the nucleic acid to be detected is an amplification product, the amplification being carried out with sequence-specific amplification primers. In particular, it is preferred that at least one amplification primer is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence , It is most preferred that at least one amplification primer is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-13 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. The amplification primers should be selected so that the amplification product has good steric ratios in combination with the immobilized probe. Pallindrome structures that lead to intramolecular foldings can be avoided by selecting suitable primers. In the case of labeling with hapten, the spatial arrangement of the hapten (eg biotin) in the hybrid probe / target nucleic acid is important. The hapten should be easily accessible to the antibody-enzyme complex.
Eine Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäureson- den immobilisiert sind. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist. In einer anderen Form des Verfahrens sind die Nukleinsäuresonden markiert. In diesem Falle ist es vorteilhaft, wenn die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist.One embodiment of the method is characterized in that the nucleic acid probes are immobilized. In this case it is advantageous if the nucleic acid to be detected is marked. In another form of the method, the nucleic acid probes are labeled. In this case it is advantageous if the nucleic acid to be detected is immobilized.
Gegenstand der Erfindung ist daher des weiteren ein Verfahren zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien, - bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, von denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, - und bei welchem anschließend die amplifizierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Diese Ausfuhrungsform der Erfindung wird im folgenden kurz Amplifikationsverfahren genannt. Der Begriff Amplifikationsverfahren schließt alle bevorzugten Ausführungsformen ein.The invention therefore also relates to a method for the detection of periodontitis or caries-associated bacteria, in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or is complementary thereto, is amplified, the amplification using primers carried out, at least one of which has a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, and in which the amplified nucleic acid to be detected is subsequently detected, characterized in that the sequence of this primer is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. This embodiment of the invention is briefly called the amplification method below. The term amplification method includes all preferred embodiments.
Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Primer entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Primern abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Primer denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Primern am 5 '-und/oder 3 '-Ende Verlängerungen oder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Insbesondere Verlängerungen oder Ver- kürzungen am 5 '-Ende der Primer können immer noch funktionsfähige Primer liefern, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide eines Primers durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Primer nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Primer nicht zu stark verändert wird. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.The person skilled in the art is aware that, based on the teaching of the present invention, it is also possible to design primers which differ slightly from the primers according to the invention, but still work. Thus, primers are also conceivable which have extensions or truncations by at least one, two or three nucleotides at the 5 'and / or 3' end compared to the primers according to the invention. In particular extensions or extensions Reductions at the 5 'end of the primers can still provide functional primers that can be used according to the invention. It is also conceivable that individual or a few nucleotides of a primer can be replaced by other nucleotides, as long as the specificity of the primers is not changed too much and the melting point of the primers is not changed too much. It is clear to the person skilled in the art that, in addition to the usual nucleotides A, G, C, T, modified nucleotides such as inosine etc. can also be used. The teaching of the present invention enables such modifications based on the subject matter of the claims.
Am meisten bevorzugt ist das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren, wenn mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.The amplification method according to the invention is most preferred if at least two primers have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or complementary to these Sequences are or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
Insbesondere bevorzugt ist, daß der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die Primer markiert sind.It is particularly preferred that the primer (s) have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-13 or being complementary to these sequences , or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. It is preferred according to the invention that the primers are labeled.
Die folgenden Ausführungen gelten sowohl für das erfindungsgemäße Hybridisierungsverfahren als auch für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren als auch für das gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren. Gekoppelte Amplifikations-/ Hybridisierungsverfahren sind besonders bevorzugt. In diesem Fall wird die Amplifikation mit den erfindungsgemäßen sequenzspezifischen Primern durchgeführt und das so erhaltene Amplifikationspro- dukt mit den erfindungsgemäßen sequenzspezifischen Sonden detektiert. Gerade für die Identifizierung und Differenzierung von Bakterien ist dieser sogenannte „Multiplexansatz" von großem Nutzen. Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind "nucleic acid strand-based amplification" (NASBA), "transcriptase mediated amplification" (TMA), "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR), "Q-ß replicase amplification" (ß-Q-Replicase) und die "single Strand displacement amplification" (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.The following statements apply both to the hybridization method according to the invention and to the amplification method according to the invention as well as to the coupled amplification / hybridization method. Coupled amplification / hybridization methods are particularly preferred. In this case, the amplification is carried out with the sequence-specific primers according to the invention and the amplification product thus obtained is detected with the sequence-specific probes according to the invention. This so-called "multiplexing approach" is of great benefit especially for the identification and differentiation of bacteria. Various reactions can be used as the nucleic acid amplification reaction. The polymerase chain reaction (PCR) is preferably used. The various configurations of the PCR technique are known to the person skilled in the art, see for example Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48 (8), 579-582. Other amplification techniques that can be used are "nucleic acid strand-based amplification" (NASBA), "transcriptase mediated amplification" (TMA), "reverse transcriptase polymerase chain reaction" (RT-PCR), "Q-ß replicase amplification "(β-Q replicase) and the" single strand displacement amplification "(SDA). NASBA and other transcription-based amplification methods are discussed in Chan and Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196.
In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäure wird das Amplifi- kat z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen ethidiumbromidgefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybri- disierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden.In the simplest form of detection of the nucleic acid to be detected, the amplify is e.g. cut specifically by digestion with a restriction enzyme and the resulting ethidium bromide-stained fragments were analyzed on an agarose gel. Hybridization systems are also widespread. The hybridization usually takes place in such a way that either the composition containing the amplification product or a part thereof or the probe is immobilized on a solid phase and brought into contact with the other hybridization partner in each case. A wide variety of materials are conceivable as solid phases, for example nylon, nitrocellulose, polystyrene, silicate materials, etc. It is also conceivable that a microtiter plate is used as the solid phase. The target sequence can also hybridize with a capture probe beforehand in solution and then the capture probe is bound to a solid phase.
In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure markiert.As a rule, at least one probe or at least one primer is labeled during the amplification of the nucleic acid to be detected.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Nukleinsäureson- den auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein. Durch Inkubation des Amplifikationsprodukts beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon mit einer derart vorbereiteten festen Phase mit immobilisierten Sonden kann durch einen einzigen Hybridisierungsschritt eine Aussage über die Hybridisierung des Amplifikationsprodukts mit allen immobilisierten Sonden gewonnen werden. Die feste Phase ist daher bevorzugt ein Mikroarray von immobilisierten Sonden auf einer festen Phase. Derartige "DNA-Chips" erlauben es, daß auf einem kleinen Bereich eine hohe Anzahl verschiedener Oligonukleotide immobilisiert werden. Die festen Phasen, die für DNA-Chips geeignet sind, bestehen vorzugsweise aus silikatischen Materialien wie Glas usw. Die Markierung der Primer ist in dieser Ausführungsform vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung. Der DNA-Chip kann nach Inkubation mit dem Amplifikations- produkt beziehungsweise der Probe enthalten die nachzuweisende Nukleinsäure oder eines Teils davon durch eine Scanvorrichtung rasch analysiert werden. Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Eine Übersicht über die Chip-Technologie gibt McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics. Clin Chem 47(3), 393-402.In one embodiment of the method according to the invention, the nucleic acid probes are immobilized on the solid phase, and then this solid phase is brought into contact with the composition which contains the labeled nucleic acids to be detected or a part thereof. Preferably at least two probes are immobilized on the solid phase, more preferably at least five probes, more preferably at least ten probes. Different probes can be immobilized in different zones. By incubating the amplification product or the sample, the nucleic acid to be detected contains or a part thereof with a solid phase prepared in this way With immobilized probes, a statement about the hybridization of the amplification product with all immobilized probes can be obtained in a single hybridization step. The solid phase is therefore preferably a microarray of immobilized probes on a solid phase. Such "DNA chips" allow a large number of different oligonucleotides to be immobilized in a small area. The solid phases which are suitable for DNA chips are preferably composed of silicate materials such as glass etc. The labeling of the primers in this embodiment is preferably a fluorescent label. After incubation with the amplification product or the sample, the DNA chip, the nucleic acid to be detected or a part thereof can be quickly analyzed by a scanning device. Such devices are known to the person skilled in the art. McGlennen (2001) Miniaturization technologies for molecular diagnostics provides an overview of chip technology. Clin Chem 47 (3), 393-402.
In dieser Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die nachzuweisende Nukleinsäure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin.In this embodiment of the method according to the invention, the nucleic acid to be detected is marked. Various markings are conceivable, such as Fluorescent dyes, biotin or digoxigenin.
Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine, RhodaminöööR-phycoerythrin, Texas Red usw.Known fluorescent labels are fluorescein, FITC, cyanine dyes, rhodamines, rhodamine ööö R-phycoerythrin, Texas Red, etc.
Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z.B. I, S, P, P. Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z.B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.A radioactive marking is also conceivable, e.g. I, S, P, P. Particle marking such as e.g. with latex. Such particles are usually dry, in the micron range and uniform.
Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als beispielsweise Bio- tin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten-Systeme, Bio- tin/Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M. N. Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989). Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun;5(3):223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998).The labels are usually covalently linked to the oligonucleotides. For example, while a fluorescent label can be detected directly, biotin and digoxigenin labels can be detected after incubation with suitable binding molecules or conjugate partners. Other binding partners than, for example, bio-tin / streptavidin are antigen / antibody systems, hapten / anti-hapten systems, bio-tin / avidin, folic acid / folate-binding proteins, complementary nucleic acids, proteins A, G and immunoglobulin etc. (MN Bobrov, et al., J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989). For example, a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution containing streptavidin coupled to an enzyme, the enzyme , eg peroxidase or alkaline phosphatase, converts a substrate which produces a dye or leads to chemical luminescence. Possible enzymes for this use are hydrolases, lyases, oxido-reductases, transferases, isomerases and ligases. Further examples are peroxidases, glucose oxidases, phosphatases, esterases , and Glycosidases. Such methods are known per se to the person skilled in the art (Wetmur JG. Crit Rev Biochem Mol Biol 1991; (3-4): 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun; 5 (3): 223-32). For some methods where enzymes act as conjugate partners, color-changing substances must be present (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. RH Burton and PH van Knippenberg (1998).
Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich, die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z.B. Sulfhydryl- reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.Another preferred conjugate comprises an enzyme which is coupled to an antibody (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). It is also customary to label the nucleic acid to be detected with a gold streptavidin conjugate, in which case a biotin Labeled oligonucleotide can be detected, but also binding partners that form covalent bonds with one another, such as sulfhydryl-reactive groups such as maleimides and haloacetyl derivatives and amine-reactive groups such as isothiocyanates, succinimidyl esters and sulfonyl halides.
Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (US 6,037,127).If the nucleic acids to be detected are labeled, the probes are usually not labeled. The nucleic acids to be detected are essentially labeled using methods described in the prior art (US Pat. No. 6,037,127).
Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsäure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsäure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer-Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden.The labeling can be introduced into the nucleic acid to be detected by chemical or enzymatic methods or by direct incorporation of labeled bases into the nucleic acid to be detected. In a preferred embodiment, sequences to be detected which have incorporated labels are produced by labeled bases or labeled primers during the amplification of the nucleic acid to be detected. Labeled primers can be made by chemical synthesis e.g. by means of the phosphoramidite method by substituting bases of the primer with labeled phosphoramidite bases during the primer synthesis. Alternatively, primers can be prepared with modified bases to which labels are chemically bound after the primer synthesis.
Denkbar sind auch Verfahren zur Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ohne daß die zu detektierende Nukleinsäure amplifiziert und/oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS-spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.Methods for labeling the nucleic acid to be detected are also conceivable without the nucleic acid to be detected being amplified and / or provided with a modification. For example, ribosomal RNA species can hybridize specifically with a DNA probe and can be detected as an RNA / DNA hybrid with an RNA / DNA-specific antibody.
Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleoti- de-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).Another possibility is the introduction of labels using the T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme. The introduction of radioactive or fluorescent labels (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsäure können auch mehrere Markierungen eingebracht werden.Markers can be introduced into one or both ends of the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be detected. Markers can also be introduced within the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be detected. Several markings can also be introduced into a nucleic acid to be detected.
In einer anderen Ausführungsform weist wenigstens eine der Sonden eine Markierung auf. Die Markierung der Sonden erfolgt nach den gleichen im Stand der Technik beschriebenen Verfahren wie schon oben für die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäure ausgeführt. Üblicherweise wird dann die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, auf einer festen Phasen immobilisiert und mit einer Zusammensetzung in Kontakt gebracht, die wenigstens eine Sonde enthält. Auch in dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, eine Hybridisierung mit mehr als einer Sonde durchzuführen. Dazu können mehrere feste Phasen bereitgestellt werden, auf denen das Amplifikationsprodukt beziehungsweise die Probe enthaltend die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist. Es ist aber auch möglich, auf einer festen Phase an mehreren räumlich voneinander getrennten Bereichen kleine Mengen des Amplifikationsprodukts zu immobilisieren. Diese verschiedenen Spots werden dann mit jeweils verschiedenen Sonden in Kontakt gebracht (Hybridisierung).In another embodiment, at least one of the probes has a label. The probes are labeled using the same methods described in the prior art as described above for the labeling of the nucleic acid to be detected. The composition containing the amplification product or a part thereof is then usually immobilized on a solid phase and brought into contact with a composition which contains at least one probe. In this embodiment too, it is preferred to carry out hybridization with more than one probe. For this purpose, several solid phases can be provided on which the amplification product or the sample containing the nucleic acid to be detected is immobilized. However, it is also possible to immobilize small amounts of the amplification product on a solid phase in several spatially separated areas. These different spots are then brought into contact with different probes (hybridization).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Wenn mehrere Oligonukleotide immobilisiert sind, sind diese auf der festen Phase räumlich voneinander getrennt. Vorzugsweise ist die feste Phase als DNA-Chip ausgebildet.The present invention furthermore relates to a device for detecting periodontitis or caries-associated bacteria, comprising a solid phase on which one or more sequence- and / or species-specific nucleic acid probes are immobilized, characterized in that the sequence- and / or species-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence. It is preferred according to the invention that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 14-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these sequences or the complementary sequence contains. If several oligonucleotides are immobilized, they are on the fixed one Phase separated from each other. The solid phase is preferably designed as a DNA chip.
Die feste Phase der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein chromatographisches Material sein. Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrocellulose, Zelluloseacetat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat u.s.w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrocellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z.B. Nitrocellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.The solid phase of the device according to the invention can be a chromatographic material. Since the analyte is mainly hydrophilic in nature, hydrophilic properties of the chromatographic material of the test strip are important for carrying out the method according to the invention. The chromatographic material may include inorganic powders such as silicate materials, magnesium sulfate and aluminum, may further comprise synthetic or modified naturally occurring polymers such as nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose, polyvinyl chloride or acetate, polyacrylamide, nylon, cross-linked dextran, agarose, polyacrylate, etc. include coated materials such as ceramic and glass. Most preferred is the use of nitrocellulose as the chromatographic material. In addition, the introduction of positively charged ion groups in e.g. Nitrocellulose or nylon membranes improve the hydrophilic properties of the chromatographic material.
Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigid und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, daß das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, daß das Gehäuse Testkomponenten nicht unspezifisch bindet, und daß das Gehäuse nicht mit dem Detektions- system interferiert.The chromatographic material can be mounted in a housing or the like. As a rule, this housing is water-insoluble, rigid and can consist of a large number of organic and inorganic materials. It is important that the housing does not interfere with the capillary properties of the chromatographic material, that the housing does not bind test components non-specifically, and that the housing does not interfere with the detection system.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt, wenn die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil der Sonde am 5'- oder 3 '-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nicht- kodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z.B. Polyether, Polyester u.a. Der Linker muß so beschaffen sein, daß er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflußt wird. Dies kann dadurch vermieden werden, daß keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u.a. sein.The device according to the invention is preferred if the sequence- and / or species-specific nucleic acid probes are bound to the solid phase of the device via a linker. The linker acts as a spacer between the probe and the membrane. In the present case, these are mostly polymers which extend the part of the probe which is complementary to the target sequence at the 5 'or 3' end, but are not themselves coding. These can be base sequences of a non-coding nucleic acid structure or other polymer units such as, for example, polyethers, polyesters, etc. The linker must be such that it does not affect the hybridization properties of the probe or only has a slightly negative effect on it. This can be avoided by the fact that there are no self-complementary structures. The chemical prerequisites for the irreversible coupling of the probe to the carrier material must also be met. Chemistry is a crucial prerequisite for the probe to function well beyond its properties of forming a stable hybrid with the target sequence coupling to the surface. There must be chemical groups that allow irreversible binding in the immobilization techniques used. These can be amines, thiol groups, carboimides, succinimides and others.
Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktio- nellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z.B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin- Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktio- nellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem he- terobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz sind die Carbodiimide, die Carbonylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminomodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut.However, other possibilities are known to the person skilled in the art to create spacers or linkers between the probe and the membrane. Probe oligonucleotides can be bound to the membrane surface via proteins, for example. The proteins loaded with the probe can then be bound to the porous membrane using standard methods. Standard methods are, for example, coupling via homobifunctional coupling reagents or heterobifunctional coupling reagents. In the case of homobifunctional ones, the reactive groups are the same. Typically these are amines and / or thiols. Thiols can be synthetically coupled directly to oligonucleotides and, under oxidative conditions, with e.g. Cysteine residues react to form disulfide bridges. For the amine-amine coupling, amines as homobifunctional coupling reagents can be directly synthetically coupled to oligonucleotides and bound to the surface or the protein via imido esters or succinimide esters. With heterobifunctional coupling reagents, the reactive groups are different and allow the coupling of different functional groups. The formation of amino-thiol couplings is preferred. Thiolated oligonucleotides can be coupled with a heterobifunctional coupling reagent which contains both a succinimide ester maleimide or iodoacetimide. Another important coupling agent are the carbodiimides, which couple carbonyl residues to amines. The most important representative here is l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC). Here amino modified oligonucleotides can be coupled to membranes with carbonyl residues. With this chemistry, the coupling reagent is not incorporated into the compound.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure welche ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Zusammensetzung beziehungsweise ein Kit zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Insbesondere ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis be- ziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.Another object of the present invention is a nucleic acid which is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof, or is complementary to this fragment or one of these sequences or contains complementary sequence. The present invention furthermore relates to a composition or a kit for the detection of periodontitis or caries associated bacteria containing one or more of the nucleic acids according to the invention. In particular, the subject of the present invention is a kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which comprises a fragment from the genome of a periodontitis. or caries-associated bacterium or complementary to it, containing one or more of the nucleic acids according to the invention.
Zusätzlich zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält der Kit alle für die Amplifikati- on der Zielsequenz notwendigen Komponenten, wie Primer, Puffersysteme, Enzyme.In addition to the nucleic acids according to the invention, the kit contains all components necessary for the amplification of the target sequence, such as primers, buffer systems, enzymes.
Am meisten bevorzugt ist ein Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.Most preferred is a kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or complementary to it, containing one or more nucleic acids selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-13 or is complementary to these sequences, or a fragment thereof, or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure beziehungsweise des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien.The invention also relates to the use of the device according to the invention for the detection of periodontitis or caries of associated bacteria. The invention further relates to the use of the nucleic acid according to the invention or the kit according to the invention for the detection of periodontitis or caries of associated bacteria.
Die nachzuweisende Nukleinsäure kann sich in jeder Zusammensetzung befinden, die im Verdacht steht, Bakterien zu enthalten, insbesondere parodontopathogene beziehungsweise Karies assoziierte Bakterien. Es kann sich um Primärmaterial handeln, z.B. Sekrete, Sulkus- flüssigkeit, Abstriche und Blut. Es kann sich um Kulturen von Mikroorganismen handeln, die bereits in Flüssig- oder Festmedien angezogen wurden.The nucleic acid to be detected can be in any composition that is suspected of containing bacteria, in particular periodontopathogenic or caries-associated bacteria. It can be primary material, e.g. Secretions, sulcus fluid, smears and blood. They can be cultures of microorganisms that have already been grown in liquid or solid media.
Figurenbeschreibungfigure description
Abbildung 1: SEQ ID No. 1-13Figure 1: SEQ ID No. 1-13
Abbildung 2; SEQ ID No: 14-28Figure 2; SEQ ID No: 14-28
Abbildung 3, Densitometrische Auswertung einer Dorblothybridisierung zur Bestimmung derFigure 3, Densitometric evaluation of a Dorothy hybridization to determine the
Spezifität der Sonden SEQ ID No: 15,19,21,22,25,28,27Specificity of the probes SEQ ID No: 15,19,21,22,25,28,27
Die Abkürzungen haben folgende Bedeutungen: Aa = Actinobacillus actinomycetemcomitans;The abbreviations have the following meanings: Aa = Actinobacillus actinomycetemcomitans;
Pg= Porphyromonas gingivalis, Pi =Prevotella intermedia; Bf= Bacteroides forsythus; Td=Pg = Porphyromonas gingivalis, Pi = Prevotella intermedia; Bf = Bacteroides forsythus; td =
Treponema denticola; Smut=Streptococcus mutans; Ssob=Streptococcus sobrinus; E.col=Escherichia coli; hDNA= humane DNS; N-Kon=Negativkontrolle (Amphfikation ohne Zielnukleinsäure)Treponema denticola; Smut = Streptococcus mutans; Ssob = Streptococcus sobrinus; E.col = Escherichia coli; hDNA = human DNA; N-Kon = negative control (amphfication without target nucleic acid)
Die Amplifikationsprodukte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben auf eine Membran aufgebracht, gegen die Sonden SEQ ID No: 15,19,21,22,25,28,27 hybridisiert und autoradiographisch mit einem Densitometer (Vilber Lourmat, Bio-Profil, Fröbel Laborgeräte, Lindau, Deutschland) ausgewertet. The amplification products were applied to a membrane as described in Example 1, hybridized against the probes SEQ ID No: 15,19,21,22,25,28,27 and autoradiographically with a densitometer (Vilber Lourmat, Bio-Profil, Fröbel Laborgeräte, Lindau, Germany).
BeispieleExamples
Beispiel 1example 1
DNA/RNA-Isolierung:DNA / RNA isolation:
Bakterielle Nukleinsäure wurde entweder von Festnährmedien, Flüssigmedien oder aus Primärmaterial nach entsprechender Vorbehandlung gewonnen.Bacterial nucleic acid was obtained either from solid nutrient media, liquid media or from primary material after appropriate pretreatment.
Folgende Bakterienspezies wurden untersucht actinomycetemcomitans, Por- phyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsyt us; Treponema denticola, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus;The following bacterial species were examined actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsyt us; Treponema denticola, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus;
Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impfose bakterielles Material entnommen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1ml entnommen, 5min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Primärmaterial wurde mit „paperpoints" aus Zahntaschen entnommen. Die so erhaltenen Abstriche wurden 15min bei 95 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin) beschallt und 10min bei 13.000rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5μl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.For this purpose, bacterial material was removed from solid media with a sterile vaccination and suspended in 300 μl 10 mM Tris / HCl pH 7.5. 1 ml was removed from liquid cultures, centrifuged for 5 min at 13,000 rpm in a table centrifuge, the supernatant was discarded and resuspended in 300 μl lOmM Tris / HCl pH 7.5. Primary material was removed from tooth pockets with "paperpoints". The smears thus obtained were incubated for 15 minutes at 95 ° C. in a thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Germany), sonicated for 15 minutes in an ultrasonic bath (bandelin) and centrifuged for 10 minutes at 13,000 rpm in a table centrifuge. 5 μl of the supernatant were used in the amplification reaction.
Amplifikation:amplification:
Alle Primer wurden kommerziell synthetisiert.(Interactiva, Ulm, Deutschland). Als Primer zur Amplifikation von Zielsequenzen der oben angegebenen Organismen wurden die Seq ID No. 1 -bis 13 verwendet.All primers were synthesized commercially (Interactiva, Ulm, Germany). Seq ID No. was used as a primer for the amplification of target sequences of the above-mentioned organisms. 1 to 13 used.
Der PCR- Ansatz enthielt 1 x Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je l μM Primer, 200μM dNTP (Röche) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR- Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15min 95°C, 10 Zyklen mit 30sek 95°C und 2min 60°C und mit 20 Zyklen lOsek 95°C, 50sek 55°C und 30sek 70°C durchgeführt. Für die RNA-Amplifikation mit der NASBA-Technik wurde das NucliSens Amplifikationskit (Organon Technika, Boxtel, Niederlande) nach Angaben des Herstellers verwendet:The PCR approach contained 1 x Taq buffer (Qiagen, Hilden, Germany), 1 μM primer each, 200μM dNTP (Röche) and 1U Hotstar Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). The PCR amplification was carried out on a thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Germany) with 15min 95 ° C, 10 cycles with 30sec 95 ° C and 2min 60 ° C and with 20 cycles 10sec 95 ° C, 50sec 55 ° C and 30sec 70 ° C carried out. The NucliSens amplification kit (Organon Technika, Boxtel, Netherlands) was used for the RNA amplification with the NASBA technique according to the manufacturer:
1. Herstellung des Amplifikationsmixes: 8μl "reagent sphere" in "reagent dilution"- Puffer gelöst (enthält die für die Reaktion benötigten Enzyme), 5μl KCl-Lösung, Endkonzentration 70mM KC1 und 2μl Primerlösung, Endkonzentration 0,5 μM Primer;1. Preparation of the amplification mix: 8μl "reagent sphere" dissolved in "reagent dilution" buffer (contains the enzymes required for the reaction), 5μl KCl solution, final concentration 70mM KC1 and 2μl primer solution, final concentration 0.5μM primer;
2. 5μl RNA-Lösung zugeben und 60min bei 41°C im Wasserbad inkubieren.2. Add 5μl RNA solution and incubate for 60min at 41 ° C in a water bath.
DNA/RNA-Amplifikat wurde entweder mit einem ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel oder durch Hybridisierung nachgewiesen.DNA / RNA amplificate was detected either with an ethidium bromide stained agarose gel or by hybridization.
Detektion der Amplifikate durch Sondenhybridisierung.Detection of the amplificates by probe hybridization.
Alle Sonden wurden am 5 '-Ende biotiniliert, um Zielsequenz/Sonden-Hybride über an Streptavidin gekoppelte Reporterenzyme nachweisen zu können. Als Sonden werden Oligonukleotide mit den Sequenzen SEQ ID NO 14 bis 28 eingesetzt, (siehe Figur 2).All probes were biotinylated at the 5 'end in order to be able to detect target sequence / probe hybrids via reporter enzymes coupled to streptavidin. Oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO 14 to 28 are used as probes (see FIG. 2).
Saugfahiges Papier (Blotting Papier GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland), und eine Nylonmembran (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) wurden auf die Größe der Blo- tapparatur (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) geschnitten und mit 10 x SSC getränkt. In die Öffnungen der zusammengebauten Apparatur wurden 250μl Denaturierungs- lösung (50 mM NaOH; 1,5 M NaCl) vorgelegt und 20 μl Amplifikat zupipettiert. Nach Anlegen eines Vakuums wurde gewartet, bis alle Flüssigkeit vollständig durchgesaugt war. Anschließend wurde mit 10 x SSC-Puffer nachgespült. Die Membran wurde, nachdem sie vollständig getrocknet war in einem UV-Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert und mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.Absorbent paper (blotting paper GB002, Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and a nylon membrane (Biodyne A, Pall, Portsmouth, England) were cut to the size of the blotting apparatus (Minifold Schleicher & Schüll, Dassel, Germany) and cut with 10 x SSC soaked. 250 μl of denaturing solution (50 mM NaOH; 1.5 M NaCl) were placed in the openings of the assembled apparatus and 20 μl of amplificate were pipetted in. After applying a vacuum, it was waited until all the liquid had been sucked through completely. It was then rinsed with 10 × SSC buffer. After it had dried completely, the membrane was fixed in a UV crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm 2 and washed with distilled water and dried.
Alle Hybridisierungen wurden bei 45°C in einem Hybridisierungsofen (Hybaid Mini Oven Mkll, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) in Glasröhren durchgeführt. Die mit DNA/RNA-Amplifikat beschichtete Membran wurde in trockenem Zustand eingerollt und in eine Glasröhre gegeben. Anschließend wurde die Membran unter ständiger Rotation 5min mit vorgewärmten Hybridisierungspuffer inkubiert. Nach Zugabe von 2 pmol biotinilierter Sonde erfolgte für eine Stunde die Hybridisierungsreaktion. Nichtgebundene oder nur partial gebundene Sonde wurde durch 30min Inkubation mit Stringent-Puffer bei 45°C mit einmaligem Tausch des vorgewärmten Stringent-Puffers entfernt. Anschließend wurde Blocking-Reagens zugegeben und 15min bei 37°C weiterinkubiert. Die Hybride wurden durch ein Streptavidin- Alkalische Phosphatase-Konjugat durch Zugabe von NBT/BCIP kolorimetrisch oder durch Aufsprühen von Chemielumineszenzsubstrat (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abin- don, England) autoradiographisch detektiert. Dazu wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15min mit Substratpuffer gewaschen. Die Membran wurde dann entnommen, Lumi- Phos-Reagens wurde aufgesprüht, gefolgt von 2h Exposition eines Röntgenfilms. Alternativ dazu wurde Substratpuffer mit NBT/BCIP zugegeben und die Farbentwicklung abgewartet.All hybridizations were carried out at 45 ° C. in a hybridization oven (Hybaid Mini Oven Mkll, MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) in glass tubes. The membrane coated with DNA / RNA amplificate was rolled up in a dry state and placed in a glass tube. The membrane was then incubated for 5 minutes with preheated hybridization buffer while rotating continuously. After the addition of 2 pmol of biotinylated probe, the hybridization reaction was carried out for one hour. Unbound or only partially bound probe was incubated for 30 min with stringent buffer at 45 ° C with a single Replacement of the preheated stringent buffer removed. Blocking reagent was then added and incubation continued at 37 ° C. for 15 min. The hybrids were autoradiographically detected by a streptavidin-alkaline phosphatase conjugate by adding NBT / BCIP or by spraying on chemiluminescent substrate (Lumi-Phos 530, Cellmark Diagnostics, Abindon, England). Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate was added and incubated at 37 ° C for 30 min. The membrane was then washed twice with substrate buffer for 15 min. The membrane was then removed, Lumi-Phos reagent was sprayed on, followed by 2 h exposure to an X-ray film. Alternatively, substrate buffer with NBT / BCIP was added and the color development awaited.
Verwendete Lösungen:Solutions used:
10 x SSC-Lösung (Standard-Saline-Citrat): 1,5M NaCl, 0,15M Trinatriumcitrat;10 x SSC solution (standard saline citrate): 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate;
Hybridisierungspuffer:Hybridization buffer:
7% SDS (Na-dodecylsulfat), 0,25M Phosphatpuffer pH 7,5;7% SDS (Na-dodecyl sulfate), 0.25M phosphate buffer pH 7.5;
Stringentwaschlösung (Stringent-Puffer) :String washing solution (Stringent buffer):
3M TMCL (Tetramethylammoniumchlorid), 50mM Tris/Cl, 2mM EDTA, 0,1% SDS;3M TMCL (tetramethylammonium chloride), 50mM Tris / Cl, 2mM EDTA, 0.1% SDS;
Lösung zur Absättigung der Membranbindungsstellen:Solution for saturating the membrane connection points:
5g/l Blockingreagenz (Röche) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (4,13g NaCl und 5,53g Maleinsäure in 500ml Wasser, pH mit 5M NaOH auf 7,5 eingestellt);5 g / l blocking reagent (Röche) in maleic acid buffer pH 7.5 (4.13 g NaCl and 5.53 g maleic acid in 500 ml water, pH adjusted to 7.5 with 5M NaOH);
Substratpuffer:Substrate buffer:
274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na3Citrat, 200mM NaCl, 27,4 mM MgCl2 * 6 H20;274mM Tris / Cl pH 7.5, 68.6mM Na 3 citrate, 200mM NaCl, 27.4mM MgCl 2 * 6H 2 0;
BCIP:BCIP:
50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100% Dimethylformamid;50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate toluidinium salt in 100% dimethylformamide;
NBT:NBT:
75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid; Die Autoradiogramme wurden densitometrisch ausgewertet. Als 100%- Wert wurde der Am- plifikatdot der Spezies, aus der die Sondensequenz abgeleitet wurde, zugrundegelegt. Als Kontrollen wurden immer eine Probe, der statt Nukleinsäurelösung Wasser zugegeben wurde und eine Probe mit lOOng isolierter humaner DNS als Dots auf der Membran mitgefühlt.75 mg / ml nitro blue tetrazolium salt in 70% dimethylformamide; The autoradiograms were evaluated densitometrically. The amplified dot of the species from which the probe sequence was derived was used as the 100% value. As controls, a sample to which water was added instead of a nucleic acid solution and a sample with 100 ng of isolated human DNA were always sensed as dots on the membrane.
In Abbildung 3 sind die Ergebnisse von Beispiel 1. Dargestellt. Angegeben sind die %- Werte der densitometrischen Auswertung. Der Wert der für die Spezies homologen Sonde wurde 100% gesetzt.Figure 3 shows the results of Example 1. The% values of the densitometric evaluation are given. The value of the probe homologous to the species was set to 100%.
Mit den hier beschriebenen Methoden können die entsprechenden Bakterien entweder aus Primärmaterial (z.B. Zahnabstrichen, Blut u.a.) oder aus bakteriellen Flüssig- oder Festmedien identifiziert und differenziert werden. Using the methods described here, the corresponding bacteria can be identified and differentiated either from primary material (e.g. tooth smears, blood, etc.) or from bacterial liquid or solid media.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verfahren zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien, bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums ist oder komplementär zu diesem ist, an eine sequenz- und oder speziesspezifische Nukleinsäuresonde hybridisiert und anschließend die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde detek- tiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.1. A method for the detection of periodontitis or caries-associated bacteria, in which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or is complementary to this, hybridizes to a sequence- and / or species-specific nucleic acid probe and then the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence-specific nucleic acid probe is characterized, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or is a fragment thereof is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.2. The method according to claim 1, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 14-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these Contains sequences or the complementary sequence.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei die Amplifikation mit sequenzspezifischen Amplifikationsprimern durchgeführt wurde.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the nucleic acid to be detected is an amplification product, wherein the amplification was carried out with sequence-specific amplification primers.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure ein Amplifikationsprodukt ist, wobei wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the nucleic acid to be detected is an amplification product, wherein at least one amplification primer is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or a Represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Amplifikationsprimer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt be- ziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.5. The method according to claim 4, characterized in that at least one amplification primer is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1-13 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof. is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
6. Verfahren gemäß einem Anspruch 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure- sonden immobilisiert sind.6. The method according to claim 1 -5, characterized in that the nucleic acid probes are immobilized.
7. Verfahren Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsäure markiert ist.7. The method claim 6, characterized in that the nucleic acid to be detected is marked.
8. Verfahren gemäß einem Anspruch 1 -5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure- sonden markiert sind und die nachzuweisende Nukleinsäure immobilisiert ist.8. The method according to claim 1 -5, characterized in that the nucleic acid probes are marked and the nucleic acid to be detected is immobilized.
9. Verfahren zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien,9. method for the detection of periodontitis or caries of associated bacteria,
- bei welchem eine nachzuweisende Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, amplifiziert wird, wobei die Amplifikation mit Primern durchgeführt, vom denen mindestens einer eine Sequenz aufweist, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt,- In which a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or complementary to it, is amplified, the amplification being carried out with primers, at least one of which has a sequence which essentially comprises a partial sequence of the one to be detected Represents nucleic acid,
- und bei welchem anschließend die amplifϊzierte nachzuweisende Nukleinsäure detektiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz dieses Primer ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.- And in which the amplified nucleic acid to be detected is subsequently detected, characterized in that the sequence of this primer is selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to is this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält. 10. The method according to claim 9, characterized in that at least two primers have a sequence which is essentially a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der bzw. die Primer eine Sequenz aufweisen, die im wesentlichen eine Teilsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt, wobei die Sequenzen dieser Primer ausgewählt sind aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen sind, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.11. The method according to claim 9 or 10, characterized in that the primer (s) have a sequence which essentially represents a partial sequence of the nucleic acid to be detected, the sequences of these primers being selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1 -13 or are complementary to these sequences, or represent a fragment thereof or are complementary to this fragment or contain one of these sequences or the complementary sequence.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mit der Polymerase-Ketten-Reaktion erfolgt.12. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized in that the amplification is carried out with the polymerase chain reaction.
13. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 9 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß die Primer markiert sind.13. The method according to any one of claims 9 to 12, characterized in that the primers are marked.
14. Vorrichtung zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien umfassend eine feste Phase, auf der eine oder mehrere sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.14. Device for the detection of periodontitis or caries of associated bacteria comprising a solid phase on which one or more sequence- and / or species-specific nucleic acid probes are immobilized, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 1 -28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde ausgewählt ist aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 14 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist, beziehungsweise ein Fragment davon darstellt beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.15. The device according to claim 14, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probe is selected from the sequences with the SEQ ID No .: 14-28 or is complementary to these sequences, or represents a fragment thereof or is complementary to this fragment or one of these Contains sequences or the complementary sequence.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenz- und/oder speziesspezifische Nukleinsäuresonden über einen Linker an die feste Phase der Vorrichtung gebunden ist.16. The device according to claim 14 or 15, characterized in that the sequence and / or species-specific nucleic acid probes is bound to the solid phase of the device via a linker.
17. Nukleinsäure ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -28 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungs- weise komplementär zu diesem Fragment oder enthaltend eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz.17. Nucleic acid selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-28 or complementary to these sequences, or a fragment thereof, or as complementary to this fragment or containing one of these sequences or the complementary sequence.
18. Kit zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.18. Kit for the detection of periodontitis or caries associated bacteria containing one or more nucleic acids according to claim 17.
19. Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren gemäß Anspruch 17.19. Kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or complementary thereto, containing one or more nucleic acids according to claim 17.
20. Kit zur Amplifikation einer nachzuweisenden Nukleinsäure, welche ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierten Bakteriums beziehungsweise komplementär zu diesem ist, enthaltend eine oder mehrere Nukleinsäuren ausgewählt aus den Sequenzen mit den SEQ ID No.: 1 -13 beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen, beziehungsweise ein Fragment davon, beziehungsweise komplementär zu diesem Fragment ist oder eine dieser Sequenzen beziehungsweise die komplementäre Sequenz enthält.20. Kit for the amplification of a nucleic acid to be detected, which is a fragment from the genome of a periodontitis or caries-associated bacterium or complementary to it, containing one or more nucleic acids selected from the sequences with SEQ ID No .: 1-13 or complementary to these Sequences, or a fragment thereof, or is complementary to this fragment or contains one of these sequences or the complementary sequence.
21. Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien21. Use of the device according to one of claims 14 to 16 for the detection of periodontitis or caries associated bacteria
22. Verwendung der Nukleinsäure gemäß Anspruch 17 beziehungsweise des Kits gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 zum Nachweis Parodontitis beziehungsweise Karies assoziierter Bakterien. 22. Use of the nucleic acid according to claim 17 or the kit according to one of claims 18 to 20 for the detection of periodontitis or caries associated bacteria.
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