EP1476542A1 - Agent for inducing or inhibiting an angiogenesis - Google Patents

Agent for inducing or inhibiting an angiogenesis

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EP1476542A1
EP1476542A1 EP03742565A EP03742565A EP1476542A1 EP 1476542 A1 EP1476542 A1 EP 1476542A1 EP 03742565 A EP03742565 A EP 03742565A EP 03742565 A EP03742565 A EP 03742565A EP 1476542 A1 EP1476542 A1 EP 1476542A1
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angiogenesis
protein
agent
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EP03742565A
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Hans-Günther Machens
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Abstract

The invention relates to an agent for inducing or inhibiting an angiogenesis, to a method for the production thereof and to its use.

Description

Mittel zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese. Agents for inducing or inhibiting angiogenesis.
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese (Blutgefäßneubildung) , ein Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung.The invention relates to an agent for inducing or inhibiting angiogenesis (new blood vessel formation), a method for its production and its use.
Ein Grundprinzip allen Lebens ist die Aufrechterhaltung eines intra- und extrazellulären Steady-State-Zustandes sowie eines physiologischen Fließgleichgewichtes. Jegliche Unterbrechung und Störung in der Erhaltung dieses Gleichgewichtes gefährdet und zerstört schließlich das Leben der Zelle. In allen höher entwickelten Organismen spielt der Blutfluß eine zentrale Rolle zur Sicherung der Zellfunktion. Die Versorgung mit Sauerstoff und energiereichen Substraten sowie der Abtransport von Metaboliten muß den sich ständig verändernden Bedingungen angepaßt werden. Physiologische Veränderungen der Gewebedurchblutung, gleich, ob es sich um eine Erhöhung oder Verminderung handelt, müssen den veränderten energetischen Anforderungen der Zelle äquivalent sein und dürfen auf keinen Fall unterbrochen werden. Geschieht dies dennoch, führt eine solche Veränderung über kurz oder lang zum Zelluntergang. Eine Möglichkeit des Organismus, dem erhöhten Energiebedarf der Zellen gerecht zu werden, besteht neben der Öffnung zuvor noch von der Durchblutung ausgeschalteten Gefäßen in der Ausbildung neuer mikrozirkulatorischer Bahnen. Dieser letztere Prozess wird dann in Gang gesetzt, wenn keine abrupte Unterbrechung des Steady-State erfolgt, sondern der vermehrte E- nergiebedarf langsam genug einsetzt, so daß dem Organismus noch Zeit zur Ausbildung neuer Kapillaren verbleibt. Dieser Vorgang wird Angiogenese genannt und erfolgt, wie jede andere Zellteilung im Organismus auch, vom ersten Moment des embryonalen Lebens an bis zum Tode des Gesamtorganismus. Es handelt sich dabei um einen biologischen Mechanismus, bei dem neue Kapillaren gebildet werden durch Aktivierung, Migration und Proliferation von Endothelzellen aus vorbestehenden Endothel- Perizytenverbänden. Aussprossungen der aktivierten Endothelzellen dringen dabei in das Bindegewebsstroma ein durch eine partielle Desintegration der Basalmembran im Muttergefäß als ersten Schritt. Die Migration der Endothelzelle wird normalerweise richtungsbestimmt durch einen angiogenetischen Sti- mulus und unterstützt durch eine Proliferation der benachbarten Endothelzellen. Nach Ausbildung eines Lumens und Fusion zweier benachbarter aussprossender Endothelzellen beginnt der Blutfluß durch die neu gebildete Kapillare. Werden die beschriebenen angiogenetischen Prozesse rechtzeitig vom Körper initiiert, so kann eine drohende Ischämie, also eine Mangelversorgung der abhängigen Gewebeanteile des Körpers durch Blut, vermieden werden. In vielen Fällen jedoch ist dieser Mechanismus nicht ausreichend, so dass das ischämisch gefährdete Gewebe abstirbt (z.B. Herzinfarkt/akute Ischämie oder diabetisches Ulkus/chronische Ischämie) . Im Zeitalter der Gentechnologie ergibt sich hier ein völlig neuer therapeutischer Zugang zu diesem Problem, nämlich durch Induktion einer Neovaskularisation mittels Zelltransduktion zur Produktion angiogenetisch wirksamer Faktoren im betroffe- nen Gewebe.A basic principle of all life is the maintenance of an intra- and extracellular steady state as well as a physiological steady state. Any interruption and disturbance in maintaining this balance endangers and ultimately destroys the life of the cell. In all highly developed organisms, blood flow plays a central role in ensuring cell function. The supply of oxygen and high-energy substrates as well as the removal of metabolites must be adapted to the constantly changing conditions. Physiological changes in tissue blood flow, whether it is an increase or decrease, must be equivalent to the changed energetic requirements of the cell and must under no circumstances be interrupted. If this happens anyway, such a change will sooner or later lead to cell death. One possibility for the organism to meet the increased energy requirements of the cells is, in addition to opening vessels previously switched off by the blood flow, by forming new microcirculatory pathways. This latter process is started when there is no abrupt interruption of steady state, but the increased energy requirement begins slowly enough so that the organism still has time to form new capillaries. This process is called angiogenesis and, like every other cell division in the organism, takes place from the first moment of embryonic life until the death of the whole organism. It is a biological mechanism in which new capillaries are formed through activation, migration and proliferation of endothelial cells from pre-existing endothelial-pericyte clusters. Sprouts of the activated endothelial cells penetrate into the connective tissue stroma through partial disintegration of the basement membrane in the mother vessel as the first step. The migration of the endothelial cell is normally determined by an angiogenic stimulus and supported by a proliferation of the neighboring endothelial cells. After formation of a lumen and fusion of two neighboring sprouting endothelial cells, the blood flow through the newly formed capillary begins. If the described angiogenic processes are initiated by the body in good time, an impending ischemia, that is, a deficiency supply of the dependent tissue parts of the body through blood can be avoided. In many cases, however, this mechanism is not sufficient so that the ischemically endangered tissue dies (e.g. heart attack / acute ischemia or diabetic ulcer / chronic ischemia). In the age of genetic engineering, there is a completely new therapeutic approach to this problem, namely by induction of neovascularization by means of cell transduction for the production of angiogenetically active factors in the affected tissue.
Überraschenderweise gibt es in der Plastischen Chirurgie bisher nur wenig experimentelle Ansätze, um überhaupt die Möglichkeiten des Gentransfers für diesen Bereich zu nutzen. In den bisher erschienenen Arbeiten zur experimentellen und klinischen Transduktion von Zellen zur Produktion angiogenetisch wirksamer Faktoren war bisher noch keine direkte Relevanz für den Bereich der Plastischen Chirurgie aufgezeigt worden. Dabei dürfte die mögliche therapeutische Bedeutung solcher an- giogenetisch wirksamer Substanzen gerade in diesem Bereich der Chirurgie unbestritten sein. Eine gesteuerte Einflußnahme auf die Wundheilung und das Überleben von Gewebe durch Gefäßinduktion würde nicht nur direkte klinische Bedeutung haben, sondern auch ein neues wissenschaftliches Feld zum Studium und besseren Verständnis mikrozirkulatorischer Phänomene im Gewebe unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eröffnen.Surprisingly, there are only a few experimental approaches in plastic surgery to use the possibilities of gene transfer for this area. In the previously published work on the experimental and clinical transduction of cells for the production of angiogenetically active factors, no direct relevance for the field of plastic surgery has been shown. The possible therapeutic importance of such angiogenetically active substances should be undisputed, particularly in this area of surgery. Controlled influence on wound healing and tissue survival through vascular induction would not only have direct clinical significance, but would also open up a new scientific field for the study and better understanding of microcirculatory phenomena in tissue under physiological and pathophysiological conditions.
Andererseits lassen sich durch die Gentechnologie auch anti- angiogenetische Therapieansätze finden, nämlich dann wenn es gilt, die Durchblutung im Gewebe zu reduzieren, ja sogar zu unterbrechen. Das kann jedoch nur der Fall sein, wenn das entstehende Gewebe nicht erwünscht ist, wie im Falle der Bildung benigner und maligner Tumoren. In diesem Fall kann durch antiangiogenetische Maßnahmen die Durchblutung solcher Tumoren derart verschlechtert werden, dass die Tumoren schließlich kleiner werden oder sogar ganz absterben. In der Onkolo- gie liegen dazu sehr viele therapeutische Ansätze vor, die sich aber von dem hier beschriebenen unterscheiden.On the other hand, genetic engineering can also be used to find anti-angiogenic therapeutic approaches, namely when it is a matter of reducing or even interrupting blood circulation in the tissue. However, this can only be the case if the resulting tissue is not desired, as in the case of the formation of benign and malignant tumors. In this case, anti-angiogenic measures can impair the blood flow to such tumors in such a way that the tumors eventually become smaller or even die off. In the oncological There are many therapeutic approaches to this, but they differ from the one described here.
Erfindungsgemäß wird ein Mittel zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese vorgeschlagen, das isogene oder autologe Körperzellen umfaßt, die mindestens ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein exprimieren. Isogene (=syngene) Zellen im Sinne der Erfindung sind genetisch identische Zellen, die zu keiner Immuninkompatibilität nach Retransplanta- tion in einen isogenen Organismus führen. Beim Menschen sind isogene Zellen als artgleiche und genetisch identisch von eineiigen Zwillingen bekannt. Die Transplantationsmedizin geht bei einer isogenen (=isogenetischen) Transplantation von der eher seltenen genetischen Identität von Spender und Emp- fänger aus, die z.B. ebenfalls bei eineiigen Zwillingen vorliegt. Im Tierreich, insbesondere bei Versuchstieren, wie Mäusen und Ratten, die aus echten Inzuchtstämmen hervorgehen, sind isogene Zellen dagegen häufig. Autologe Zellen sind solche Körperzellen, bei denen Spender und Empfänger ein und derselbe Organismus sind.According to the invention, an agent for inducing or inhibiting angiogenesis is proposed which comprises isogenic or autologous body cells which express at least one angiogenic or anti-angiogenic protein. For the purposes of the invention, isogenic (= syngeneic) cells are genetically identical cells which do not lead to any immunocompatibility after retransplantation into an isogenic organism. In humans, isogenic cells are known to be identical and genetically identical to identical twins. In the case of isogenic (= isogenetic) transplantation, transplantation medicine is based on the rather rare genetic identity of donor and recipient, which e.g. is also present in identical twins. In contrast, isogenic cells are common in the animal kingdom, particularly in experimental animals such as mice and rats, which are derived from real inbred strains. Autologous cells are body cells in which the donor and recipient are one and the same organism.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Mittel das mindestens eine angiogenetische Protein unter PDGF-A (platelet derived growth factor A) , PDGF-B (platelet derived growth factor B) , VEGF (vascular endotheli- al growth factor) , bFGF (basic fibroblast growth factor) , TGFbeta (tumor growth factor beta) , Angiopoetin 1 und Angio- poetin ausgewählt.According to one embodiment of the invention, in the agent according to the invention the at least one angiogenic protein is PDGF-A (platelet derived growth factor A), PDGF-B (platelet derived growth factor B), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF ( basic fibroblast growth factor), TGFbeta (tumor growth factor beta), angiopoietin 1 and angiopoietin were selected.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist in dem erfindungsgemäßen Mittel das mindestens eine antiangiogeneti- sche Protein unter VEGFR-1 (vascular endothelial growth fac- tor receptor 1) , Angiostatin, Endostatin sowie Rezeptorenblo- ckern für VEGFR1 und VEGFR2 ausgewählt.According to a further embodiment of the invention, the at least one antiangiogenic protein under VEGFR-1 (vascular endothelial growth fac- tor receptor 1), angiostatin, endostatin and receptor blocks for VEGFR1 and VEGFR2 were selected.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung ei- nes erfindungsgemäßen Mittels bereit, bei dem a) in einem Körper durch Implantation von biologisch inertem Material, z.B. Silastik, die Bildung von isogenen oder autologen Zellen ausgelöst wird, b) die in Schritt a) gebildeten Zellen aus dem Körper ge- wonnen werden, c) die in Schritt b) gewonnenen Zellen gentechnisch, z.B. durch retroviralen, insbesondere adenoviralen, Gentransfer, so verändert werden, daß sie im Falle einer gewünschten Induktion einer Angiogenese mindestens ein angiogenetisches Protein oder im Falle einer gewünschten Inhibition einer Angiogenese mindestens ein antiangiogenetisches Protein expri- mieren.The invention further provides a method for producing an agent according to the invention, in which a) in a body by implantation of biologically inert material, e.g. Silastic, the formation of isogenic or autologous cells is triggered, b) the cells formed in step a) are extracted from the body, c) the cells obtained in step b) are genetically engineered, e.g. are modified by retroviral, in particular adenoviral, gene transfer such that they express at least one angiogenic protein in the event of a desired induction of angiogenesis or at least one antiangiogenic protein in the case of a desired inhibition of angiogenesis.
Ein biologisch inertes oder metabolisch inertes Material ist ein Material, welches nicht an den Stoffwechselprozessen des Körpers teilnimmt, aber trotzdem eine zelluläre Reaktion auslösen kann (Ansammlung von Fibroblasten) . Wenn ein solches Material (z.B. Silastik) implantiert wird, dann bildet sich innerhalb von wenigen Tagen (5-7) eine bindegewebige Kapsel um das Implantat, welche die gewünschten Fibroblasten enthält. Diese Kapsel mitsamt Fibroblasten kann man entnehmen und nach Trypsinisierung des Materials die Fibroblasten isolieren und kultivieren. Diese Fibroblasten können isogen sein. Das heißt, sie stammen von einem isogenen Spendertier, welches die gleichen genetischen Eigenschaften hat wie die Tiere, in die dann später die genetisch modifizierten isogenen Fibroblasten retransplantiert werden. Die Alternative (und das ist klinisch am sinnvollsten) besteht darin, dass man die Fibroblasten aus dem Patienten gewinnt, dem man später diese Zellen nach genetischer Modifikation auch wieder retransplantieren möchte. In diesem Falle würde es sich um autologe Zellen handeln, also Zellen, bei dem Spender und Empfänger identisch sind.A biologically inert or metabolically inert material is a material that does not participate in the body's metabolic processes, but can still trigger a cellular reaction (accumulation of fibroblasts). If such a material (eg silastic) is implanted, a connective tissue capsule that contains the desired fibroblasts will form around the implant within a few days (5-7). This capsule together with fibroblasts can be removed and, after trypsinizing the material, the fibroblasts can be isolated and cultivated. These fibroblasts can be isogenic. This means that they come from an isogenic donor animal which has the same genetic properties as the animals, into which the genetically modified isogenic fibroblasts are later retransplanted. The alternative (and this makes the most sense clinically) consists in getting the fibroblasts from the patient, to whom one would later like to retransplant these cells after genetic modification. In this case, the cells would be autologous, i.e. cells in which the donor and recipient are identical.
Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens exprimieren die in Schritt c) gewonnenen Zellen ein unter un- ter PDGF-A (platelet derived growth factor A) , PDGF-B (platelet derived growth factor B) , VEGF (vascular endothelial growth factor) , bFGF (basic fibroblast growth factor) , TGFbe- ta (tumor growth factor beta) , Angiopoetin 1 und Angiopoetin ausgewähltes angiogenetisches Protein.According to one embodiment of the method according to the invention, the cells obtained in step c) express one under PDGF-A (platelet derived growth factor A), PDGF-B (platelet derived growth factor B), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), TGFbeta (tumor growth factor beta), angiopoietin 1 and angiopoietin selected angiogenic protein.
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens exprimieren die in Schritt c) gewonnenen Zellen ein unter VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor recep- tor 1) , Angiostatin, Endostatin sowie Rezeptorenblockern für VEGFR1 und VEGFR2 ausgewähltes antiangiogenetisches Protein.According to a further embodiment of the method according to the invention, the cells obtained in step c) express an antiangiogenic protein selected from VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), angiostatin, endostatin and receptor blockers for VEGFR1 and VEGFR2.
Die Erfindung gibt ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mittels oder eines nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Mittels zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese an.The invention further specifies the use of an agent according to the invention or an agent produced by a method according to the invention for inducing or inhibiting angiogenesis.
Nach einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein erfindungsgemäßes Mittel oder ein nach einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestelltes Mittel in isogenes oder autologes Gewebe des Körpers eingeführt, in dem eine Angiogenese induziert oder inhibiert werden soll. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung des Mittels umfassend isogene oder autologe Körperzellen, die mindestens ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein exprimieren, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese.According to one embodiment of the use according to the invention, an agent according to the invention or an agent produced by a method according to the invention is introduced into isogenic or autologous tissue of the body in which angiogenesis is to be induced or inhibited. The invention further relates to the use of the composition comprising isogenic or autologous body cells which express at least one angiogenic or anti-angiogenic protein for the production of a medicament for inducing or inhibiting angiogenesis.
Das Arzneimittel kann an verschiedene Darreichungsformen an- gepasst sein und weitere Zusatz- und/oder Hilfsstoffe wie beispielsweise Arzneistoffträger, Stabilisatoren, Konservie- rungs ittel und/oder Farbstoffe enthalten. Beispielhafte Darreichungsformen betreffen Transplantate, Implantate, Infusionslösungen, Salben, Tropfen und/oder Tabletten, wobei Implantate, Transplantate und Infusionslösungen bevorzugt sind.The medicament can be adapted to various dosage forms and can contain further additives and / or auxiliary substances such as, for example, medicament carriers, stabilizers, preservatives and / or dyes. Exemplary dosage forms relate to grafts, implants, infusion solutions, ointments, drops and / or tablets, with implants, grafts and infusion solutions being preferred.
Darüber hinaus umfasst die Erfindung eine Zelle bzw. Zellen, insbesondere Fibroblasten, die gentechnisch derart modifiziert sind, dass sie mindestens ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein exprimieren. Diese Zellen eignen sich zur Herstellung von Transplantaten und Implantaten zur Einbringung in den menschlichen oder tierischen Körper, um eine Angiogenese zu induzieren oder zu inhibieren. Mit Hilfe des Transplantates oder Implantates lässt sich gegenüber herkömmlichen Gaben von angiogenetischen bzw. antiangiogeneti- schen Proteinen ein gesteigerter Therapieerfolg in Form von gesteigerter bzw. verminderter Angiogenese beobachten.In addition, the invention comprises a cell or cells, in particular fibroblasts, which are genetically modified in such a way that they express at least one angiogenic or anti-angiogenic protein. These cells are suitable for the production of grafts and implants for insertion into the human or animal body in order to induce or inhibit angiogenesis. With the help of the transplant or implant, an increased therapeutic success in the form of increased or reduced angiogenesis can be observed compared to conventional administration of angiogenic or antiangiogenic proteins.
Ferner umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem eine Angiogenese induziert oder inhibiert werden soll, wobei das Verfahren den Schritt umfasst: (a) Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Mittels zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese, das isogene oder autologe Körperzellen umfasst, die mindestens ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein exprimieren.The present invention further comprises a method of treating a patient in whom angiogenesis is to be induced or inhibited, the method comprising the step of: (a) administering a therapeutically effective amount of the agent for inducing or inhibiting angiogenesis, which is isogenic or autologous Includes body cells, which express at least one angiogenic or antiangiogenic protein.
Die therapeutisch wirksame Menge des Mittels kann mehrmals, beispielsweise über mehrere Behandlungszyklen, mit Pausen zwischen den Anwendungen, verabreicht werden.The therapeutically effective amount of the agent can be administered several times, for example over several treatment cycles, with breaks between uses.
Das erfindungsgemäße Mittel eignet sich z.B. bei Diabetikern zur Behandlung von schlecht heilendem Ulkus oder zur Behand- lung von Patienten mit peripherer arterieller Verschlußkrankheit (pAVK) durch Vermehrung der Blutgefäßneubildung. In akuten Fällen von Mangeldurchblutung (z.B. beim Herzinfarkt) kann das Mittel ebenfalls eingesetzt werden. Zur Behandlung von Tumoren, besonders auch solchen, die auf einer Entartung der blutgefäßbildenden Zellen beruhen, kann das erfindungsgemäße Mittel antiangiogenetisch eingesetzt werden. Weiterhin ist das antiangiogenetische Mittel überall dort einsetzbar, wo eine lokale antiangiogenetische Behandlung von Tumoren sinnvoll und möglich erscheint (z.B. noch nicht metastasierte Malignome) .The agent according to the invention is suitable e.g. in diabetics for the treatment of poorly healing ulcer or for the treatment of patients with peripheral arterial occlusive disease (PAD) by increasing the formation of new blood vessels. The agent can also be used in acute cases of poor blood circulation (e.g. heart attack). The agent according to the invention can be used antiangiogenetically for the treatment of tumors, particularly also those based on a degeneration of the blood vessel-forming cells. Furthermore, the antiangiogenic agent can be used wherever local antiangiogenic treatment of tumors seems reasonable and possible (e.g. not yet metastatic malignancies).
Im folgenden wird die Erfindung ohne Beschränkung des Anspruchswortlauts unter Bezugnahme auf konkrete Ausführungsformen und Arbeitsbeispiele detaillierter beschrieben.In the following, the invention is described in more detail without restricting the wording of the claims with reference to specific embodiments and working examples.
In einer Reihe von experimentellen Untersuchungen hat der Erfinder festgestellt, daß nach beispielsweise retroviralem o- der adenoviralem Gentransfer einer Nukleinsäure, die für ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein kodiert, in isogene Fibroblasten der Ratte (GMFB) diese in vitro eine stabile Integration zum Beispiel des humanen Gens PDGF-A aufweisen. In vitro konnte dadurch eine bis zu 560-fach höhere Konzentration von zum Beispiel PDGF-AA, verglichen mit nicht genetisch modifizierten Fibroblasten (NMFB) erreicht werden.In a series of experimental investigations, the inventor has found that after, for example, retroviral or adenoviral gene transfer of a nucleic acid which codes for an angiogenic or antiangiogenic protein into isogenic fibroblasts of the rat (GMFB), this stable integration in vitro, for example of the human one Show gene PDGF-A. In vitro, this was up to 560 times higher Concentration of, for example, PDGF-AA can be achieved compared to non-genetically modified fibroblasts (NMFB).
Weiterhin konnte erstmals in vivo gezeigt werden, daß GMFB wie auch NMFB nach Transplantation in einem epigastrischen Insellappenmodell der Ratte nachweisbar vital bleiben. Das durch GMFB produzierte PDGF-AA führte dann unter ischämischen Bedingungen in dem beschriebenen Modell zu einer sich innerhalb von 7 Tagen nach Transplantation manifestierenden Angio- genese und damit zu einer signifikant höheren Überlebensrate von ischämisch gefährdetem Lappengewebe.Furthermore, it was shown for the first time in vivo that GMFB as well as NMFB remain demonstrably vital after transplantation in an epigastric island flap model of the rat. The PDGF-AA produced by GMFB then led under ischemic conditions in the described model to an angiogenesis manifesting itself within 7 days after transplantation and thus to a significantly higher survival rate of ischemically endangered flap tissue.
In einem weiteren Versuch konnte gezeigt werden, daß die beschriebenen angiogenetischen Effekte von PDGF-AA ischämieab- hängig sind und unter Normalbedingungen im nicht ischämisch gefährdeten Gewebe nicht auszulösen sind. Weitere Untersuchungen, in denen auf gentechnologische Zellmanipulationen verzichtet und statt dessen einmalige Bolusgaben von zum Beispiel VEGF165 sowie des selektiven VEGFlβδ-Antagonisten sFLT- 1 D1-D6 verwendet wurden, erbrachten zwar angiogenetische Effekte, die jedoch weit hinter den Ergebnissen der PDGF-AA- Effekte durch retroviral modifizierte Fibroblasten zurückblieben. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, daß der in vom im Labor des Erfinders produzierte Antagonist sFLT-1 Dl-Dβ klinisch eine inhibitorische Wirkung auf VEGF165 hat.In a further experiment it was possible to show that the angiogenic effects of PDGF-AA described are ischemia-dependent and cannot be triggered under normal conditions in non-ischemically endangered tissue. Further investigations, in which genetic engineering manipulations were dispensed with, and instead, single bolus doses of, for example, VEGF165 and the selective VEGFlβδ antagonist sFLT-1 D1-D6 were used, yielded angiogenic effects, which, however, are far behind the results of the PDGF-AA effects remained after retrovirally modified fibroblasts. At the same time, it was shown that the antagonist sFLT-1 Dl-Dβ produced by the inventor's laboratory has an inhibitory effect on VEGF165.
Die bisher gefundenen Ergebnissezeigen, daß in ischämischen Zuständen eine funktioneile Angiogenese am ehesten durch eine temporäre Genexpression in vivo sinnvoll ist, wobei zunächst eine Induktion von VEGF165 und kombiniert mit sFLT-1 D1-D6 als selektiver Antagonist zur Negativkontrolle erfolgen soll. Die nur zeitweilige Genexpression in vivo kann beispielsweise durch die Wahl geeigneter induzierbarer oder reprimierbarer Promotoren im Expressionskonstrukt erreicht werden. Der Vorteil solcher Promotoren liegt in ihrer Regulierbarkeit, so dass der Zeitpunkt wann das angiogenetische bzw. antiangiogenetische Protein exprimiert wird, von außen durch die entsprechende Gabe von den Promotor induzierenden oder reprimie- renden Substanzen individuell gesteuert werden kann. The results found so far show that in ischemic conditions functional angiogenesis is most useful by temporary gene expression in vivo, with VEGF165 and combined with sFLT-1 D1-D6 as a selective antagonist for negative control. The only temporary gene expression in vivo can, for example can be achieved by choosing suitable inducible or repressible promoters in the expression construct. The advantage of such promoters is that they can be regulated, so that the time at which the angiogenic or antiangiogenic protein is expressed can be individually controlled from the outside by appropriate administration of substances which induce or repress the promoter.
Material und Methodenmaterial and methods
Zellkulturen und deren genetische Modifikation Fibroblasten: aus autologen Inbred-Rattenstämmen (weibliche Lewis-CRL-Ratten, Gewicht 200-215 Gramm; Charles River Laboratorien) gewonnene FibroblastenkulturenCell cultures and their genetic modification Fibroblasts: Fibroblast cultures obtained from autologous Inbred rat strains (female Lewis CRL rats, weight 200-215 grams; Charles River Laboratories)
Virusproduzierende Zellinie: amphotrophe psi-CRIP-Ver- packungszellinie, die von murinen NIH-3T3-Fibroblasten ab- stammt, welche die retroviralen Genprodukte gag, pol und env exprimieren (R.Mulligan, Whitehead Institute of Biomedical Research, Cambridge, Mass. sowie W. Lindenmaier, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung/Baunschweig) . Transduktion der psi-CRIP Verpackungszellinie mit MFG Plasmid DNS, Klonie- rung derselben und Screening der Zellinie, welche die höchsten Virionentiter produziert (J.R.Morgan, Shriners Burns Research Laboratories, Cambridge, Mass . sowie W. Lindenmaier, Gesellschaft für Biotechnologische Forschung/Baunschweig) Fibroblasten-Zellkulturmedium: Dulbecco' s modifiziertes Ea- gle-Medium (DMEM, hochprozentige Glucose, L-Glutamin, Natri- umpyruvat 110 mg/L von Gibco BRL/ USA) , FBS (fetal bovine serum = fetales Rinderkalbserum) 10 % (Fa. HtClone/ USA), Pe- nicillin-Streptomycin lOOlU/ml-lOOmicrol/ml (Fa. Boehringer) , BCS (bovine calf serum = bovines Rinderkalbserum) 10 % (Fa. HtClone/USA)Virus-producing cell line: amphotrophic psi-CRIP packaging cell line, which is derived from murine NIH-3T3 fibroblasts which express the retroviral gene products gag, pol and env (R.Mulligan, Whitehead Institute of Biomedical Research, Cambridge, Mass. And W. Lindenmaier, Society for Biotechnological Research / Baunschweig). Transduction of the psi-CRIP packaging cell line with MFG plasmid DNA, cloning of the same and screening of the cell line which produces the highest virion titers (JRMorgan, Shriners Burns Research Laboratories, Cambridge, Mass. And W. Lindenmaier, Society for Biotechnological Research / Baunschweig) Fibroblast cell culture medium: Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, high-percentage glucose, L-glutamine, sodium pyruvate 110 mg / L from Gibco BRL / USA), FBS (fetal bovine serum = fetal bovine calf serum) 10% (Fa HtClone / USA), Penicillin-Streptomycin lOOlU / ml-lOOmicrol / ml (Boehringer), BCS (bovine calf serum = bovine calf serum) 10% (HtClone / USA)
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) bestehend aus 138 mM NaCl, 2,7 M KC1, 8,1 mM Na2HP04, 1,5 mM KH2P04, sterilisiert über einen 0, 45-Mikrometer-Filter EDTA - Lösung (genannt Versene' ) (= (ethylendinitriol) - tetraacetic acid disodium Salz, Fa. Boehringer) : 5 mM in PBS aufgelöst und über einen 0, 45-Mikrometer-Filter sterilisiertPBS (phosphate-buffered saline) consisting of 138 mM NaCl, 2.7 M KC1, 8.1 mM Na 2 HP0 4 , 1.5 mM KH 2 P0 4 , sterilized via a 0.45-micron filter EDTA solution (called Versene ') (= (ethylenedinitriol) - tetraacetic acid disodium salt, from Boehringer): 5 mM dissolved in PBS and sterilized using a 0.45-micron filter
Trypsinlösung (Trypsin 1-300, Fa. ICN Biochemicals) , bestehend aus 0,1 % D-Dextrose (w/v) und Trypsin 0,1 % (w/v) in PBS bei einem pH von 7,5Trypsin solution (Trypsin 1-300, ICN Biochemicals), consisting of 0.1% D-dextrose (w / v) and trypsin 0.1% (w / v) in PBS at a pH of 7.5
Aufbewahrungsflasche für Trypsin (25 ml , Fa. Wheaton Scien- tific)Storage bottle for trypsin (25 ml, Wheaton Scientific)
Polybrene (Fa. Sigma/USA)Polybrene (Sigma / USA)
DMSO (Dimethyl-Sulphoxid; Fa Sigma-Aldrich; Irvine/England)DMSO (dimethyl sulphoxide; Sigma-Aldrich; Irvine / England)
Versuchstiere und operatives VorgehenLaboratory animals and surgical procedure
400 autologe Lewis-Ratten (Inbred-Stämme; weiblich) aus den Charles River Laboratories (Pittsfield NH/USA) . Alle Tierver- suche erfolgen streng nach den hierfür vorgesehenen Protokollarien des Universitätsklinikums Lübeck.400 autologous Lewis rats (Inbred strains; female) from Charles River Laboratories (Pittsfield NH / USA). All animal experiments are carried out strictly in accordance with the protocol arenas provided by the Lübeck University Hospital.
Silastikfolie (0,0127 mm Durchmesser; PharmElast, SF Medical Hudson MA/USA)Silica film (0.0127 mm diameter; PharmElast, SF Medical Hudson MA / USA)
Halskragen für Ratten als Autokannibalismusschutz (Fa. Kent Scientific/Litchfield, CT/USA)Neck collar for rats as autocannibalism protection (Kent Scientific / Litchfield, CT / USA)
Operationsinstrumentarium incl. MikrobesteckSurgical instruments including micro cutlery
Aethyläther (Fisher Scientific, Fair Lawn,NJ/USA) Ketamin (Ketanest 100 mg/ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA)Ethyl ether (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ / USA) Ketamine (Ketanest 100 mg / ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa / USA)
Xylazin (Rampun 20 mg/ml; Bayer Corporation, Kansas/USA) .Xylazine (Rampun 20 mg / ml; Bayer Corporation, Kansas / USA).
BetadineBetadine
Immunoassays und ELISAImmunoassays and ELISA
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (R&D Systems, Min- neapolis/USA) .ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (R&D Systems, Minneapolis / USA).
ELISA für VEGF-165, sFLT-1, PDGF-B und bFGF aus dem Labor Dr. Weich/GBFBraunschweigELISA for VEGF-165, sFLT-1, PDGF-B and bFGF from the laboratory of Dr. Soft / GBFBraunschweig
Histologiefärbungen und ImmunhistochemieHistology staining and immunohistochemistry
Haematoxylin-EosinHematoxylin-eosin
Anti-Human von Willebrand Factor, IgG Fraction (Fa. Sigma,Anti-Human from Willebrand Factor, IgG Fraction (Sigma,
St. Louis, MO/USA)St. Louis, MO / USA)
FITC Conjugate, Anti-IgG (Fa. Sigma, St. Louis, MO/USA)FITC Conjugate, Anti-IgG (Sigma, St. Louis, MO / USA)
VEGF165-mRNS-AnalyseVEGF165 mRNA analysis
Die Methoden zur VEGF-mRNA - Quantifizierung sind ansich bekannt (kompetitive RT-PCR, Northern blot) .The methods for VEGF-mRNA quantification are known per se (competitive RT-PCR, Northern blot).
Fibroblastenproduktionfibroblast production
Autologe Rattenfibroblasten werden in 5 Tieren des oben genannten Rattenstammes gezüchtet als spätere Trägerzellen zur Expression des gewünschten Gen. Die Tiere werden hierfür a- nästhesiert durch intraperitoneale Injektion z.B. einer Kombination aus 0,05 mg/gm Ketamin (Ketanest 100 mg/ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA) und 0,0013 mg/gm Xylazin (Ram- pun 20 mg/ml; Bayer Corporation, Kansas/USA) . Die spontan atmenden Tiere werden vom Xyphoid bis zur Leistenregion rasiert und auf einen Operationstisch plaziert.Autologous rat fibroblasts are grown in 5 animals of the above-mentioned rat strain as later carrier cells for the expression of the desired gene. For this purpose, the animals are anesthetized by intraperitoneal injection, for example a combination of 0.05 mg / gm ketamine (Ketanest 100 mg / ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa / USA) and 0.0013 mg / gm xylazine (Ram- pun 20 mg / ml; Bayer Corporation, Kansas / USA). The spontaneously breathing animals are shaved from the xyphoid to the groin region and placed on an operating table.
Die Körpertemperatur wird während eines jeden Experimentes mittels eines digitalen Rektalthermometers gemessen und über eine Wärmematte bei 36 - 37 Grad Celsius konstant gehalten. Nach sterilem Abwaschen des Operationsgebietes erfolgt vom Xyphoid entlang der Linea alba nach caudal hin ein Schnitt mit dem 10er Skalpell, wobei nur die Haut und das subcutane Fettgewebe durchtrennt und die Faszie der Rektusmuskulatur belassen wird, um anschließend unter sorgfältiger Schonung der epigastrischen Hautgefäße nach beidseits lateral hin eine ungefähr 4 x 5 cm große Wundtasche zu schaffen.Body temperature is measured during each experiment using a digital rectal thermometer and kept constant at 36 - 37 degrees Celsius using a warming mat. After the surgical area has been sterile washed, a cut is made with the scalpel from the xyphoid along the linea alba towards the caudal end, only the skin and the subcutaneous adipose tissue are severed and the fascia of the rectus muscles is left to then laterally with careful care of the epigastric skin vessels on both sides to create an approximately 4 x 5 cm wound bag.
In diese Tasche hinein wird eine ebenso große Silastikmembran (Silastik ist nur ein Beispiel für ein geeignetes Material, das nach der Implantation die Bildung von isogenen Fibroblasten bewirkt und sonst keine weiteren Nebenwirkungen hat) (PharmElast; SF Medical) plaziert und durch subcutane Ecknähte (6-0 Ethilon) fixiert. Diese Membran hat eine Dicke von z.B. 0,0127 mm, ist besonders weich, äußerst flexibel und wird steril verpackt geliefert. Vor Implantation der Folie wird diese sterilgewaschen. Nach Fixieren der Folie in situ erfolgt der Wundverschluß durch eine intracutane laufende 6-0 Ethilonnaht mit Versenken der Eckknoten.An equally large silastic membrane is placed in this pocket (silastic is only one example of a suitable material that causes the formation of isogenic fibroblasts after implantation and has no other side effects) (PharmElast; SF Medical) and through subcutaneous corner sutures (6 -0 Ethilon) fixed. This membrane has a thickness of e.g. 0.0127 mm, is particularly soft, extremely flexible and is supplied sterile packed. Before the film is implanted, it is washed sterile. After the film has been fixed in situ, the wound is closed by an intracutaneous 6-0 ethilon suture with countersinking the corner knots.
Die Tiere werden über 7 Tage täglich beobachtet bei freiem Zugang zu Wasser und Nahrung, um frühzeitig Probleme in der Wundheilung aufdecken zu können. Nach diesem Zeitraum werden die Tiere wie zuvor beschrieben betäubt und die Silastikmembran, die als Fremdkörper die lokale Fibroblastenprodukti- on anregen sollte, mitsamt dem sich darum gebildeten Narbengewebe entfernt. Die Tiere werden eingeschläfert mittels einer intraperitonealen Überdosis des genannten Anästhesiegemisches .The animals are observed daily for 7 days with free access to water and food in order to be able to uncover problems in wound healing at an early stage. After this period, the animals are anesthetized as described above and the silastic membrane, which acts as a foreign body on the local fibroblast product. should stimulate, together with the scar tissue formed around it. The animals are euthanized by means of an intraperitoneal overdose of the anesthetic mixture mentioned.
Fibroblastenseparation und -ZüchtungFibroblast separation and cultivation
Das operativ gewonnene Fibroblastenkonglomerat wird sofort in DMEM bei 4 Grad Celsius bewahrt und einer möglichst raschen Verarbeitung unterzogen. Das Material wird unter sterilen Be- dingungen von der Silastikmembran abgelöst. Sämtliche Arbeiten mit der Fibroblastenkultur finden in einem Labor gentechnische Sicherheitsstufe 2 statt mit Luftabzug an jedem sterilen Arbeitsplatz.The surgically obtained fibroblast conglomerate is immediately stored in DMEM at 4 degrees Celsius and processed as quickly as possible. The material is detached from the silastic membrane under sterile conditions. All work with the fibroblast culture takes place in a laboratory with genetic engineering level 2 instead of air extraction at every sterile workplace.
Das Material wird nun einer ausgiebigen Waschung unterzogen in insgesamt 10 Plastikbehältern mit jeweils 10 ml PBS (phos- hatgepuffertes Kochsalz 0,9 %) . Jeder Behälter kann steril verschlossen werden, so daß das Fibrozytenkonglomerat 10 x 60 Sekunden lang kräftig im PBS geschüttelt werden kann. Nach zweimaligem Waschen wird das Gewebe noch einmal entnommen, um letzte Bindegewebsreste und Silasikanteile, die sich demarkiert haben, unter sterilen Kautelen zu entfernen.The material is now subjected to extensive washing in a total of 10 plastic containers, each with 10 ml PBS (phosphate-buffered table salt 0.9%). Each container can be closed sterile so that the fibrocyte conglomerate can be shaken vigorously in the PBS for 10 x 60 seconds. After washing twice, the tissue is removed again in order to remove any remaining connective tissue residues and portions of silica that have been demarcated under sterile cauldrons.
Danach wird das Material in eine sterile 25 ml Monovette ge- geben und mit 5 ml Trypsin und 5 ml EDTA über 5 Minuten enzy- matisch behandelt, um die Fibroblasten aus dem Kollagenverband zu lösen. Die Zellen werden durch sterile Gaze gefiltert und anschließend in DMEM mit 20 %igem FBS gewaschen, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren. Die so gewonnene Sus- pension wird bei 800 U/min über 5 Minuten zentrifugiert. Die Fibroblasten setzen sich am Boden ab und werden mit 10 ml DMEM aufgemischt. 20 Mikroliter der Suspension werden in einem Zellzähler (Hä- mocytometer) ausgezählt und der Überstand anschließend abpi- pettiert. Die Zellen werden dann in Brutkammern mit 75 cm2 Bodenfläche mit einer Aussaat von 5 x 104 Zellen/cm2 gezüchtet. Die Züchtung erfolgt in einem Medium aus DMEM, versetzt mit 100 Mikrogramm/ml Streptomycin, 100 IU/ml Penicillin, 3 Mikroliter/ml Amphotericin, 5 % FBS und 10 Mikrogramm/ml As- corbinsäure, welche täglich zu dem Nährmedium dazugegeben wird. Das Nährmedium selbst wird alle 3 Tage gewechselt, da die Fibroblasten sich durchschnittlich einmal pro 16-18 Stunden teilen und einen entsprechenden Energiemetabolismus haben.The material is then placed in a sterile 25 ml Monovette and treated with 5 ml trypsin and 5 ml EDTA for 5 minutes to detach the fibroblasts from the collagen bandage. The cells are filtered through sterile gauze and then washed in DMEM with 20% FBS to neutralize the trypsin activity. The suspension obtained in this way is centrifuged at 800 rpm for 5 minutes. The fibroblasts settle on the bottom and are mixed with 10 ml DMEM. 20 microliters of the suspension are counted in a cell counter (hemocytometer) and the supernatant is then pipetted off. The cells are then grown in brood chambers with a floor area of 75 cm 2 with a seeding of 5 × 10 4 cells / cm 2 . The cultivation is carried out in a medium from DMEM, mixed with 100 micrograms / ml streptomycin, 100 IU / ml penicillin, 3 microliters / ml amphotericin, 5% FBS and 10 micrograms / ml ascorbic acid, which is added daily to the nutrient medium. The nutrient medium itself is changed every 3 days because the fibroblasts divide on average once every 16-18 hours and have a corresponding energy metabolism.
Wenn die Fibroblasten nahezu konfluieren, wird eine erneute Zellseparation durchgeführt. Die solchermaßen gewonnenen Zellen können anschließend neu ausgesät werden zur weiteren Züchtung neuer Zellen oder auch asserviert und eingefroren werden. Dies erfolgt durch Zellseparation und anschließende Suspension in DMEM mit 10 % FBS und entsprechendem Antibiotikazusatz. Im Falle einer Asservierung von CRIP - Zellen werden diese allerdings mit BCS-Medium suspensiert. Dem Medium wird als Kryoprotektivum die Substanz DMSO in einem Mischungsverhältnis von 1:10 beigefügt. Pro ml Medium sollten dann zwischen 1 x 105 Zellen enthalten sein. Anschließend werden jeweils 1-2 ml Medium/Container abgefüllt und für 24 Stunden bei - 20 Grad Celsius eingefroren. Am folgenden Tage werden die Container dann in - 80 Grad Celsius tiefgefroren, um wiederum 24 Stunden später in flüssigem Stickstoff bei - 196 Grad Celsius zu verbleiben. Durch dieses schrittweise Einfrieren wird die Ausbildung von Eiskristallen in der Suspension mit daraus folgender Zellschädigung vermieden. Produktion rekombinanter Retro- und Adenoviren und Gentransfer in die FibroblastenkulturenWhen the fibroblasts almost conflate, another cell separation is performed. The cells obtained in this way can then be re-sown for further cultivation of new cells or can also be preserved and frozen. This is done by cell separation and subsequent suspension in DMEM with 10% FBS and appropriate antibiotic addition. If CRIP cells are preserved, they are suspended with BCS medium. The substance DMSO is added to the medium as a cryoprotectant in a mixing ratio of 1:10. Between 1 x 10 5 cells should then be contained per ml of medium. Then 1-2 ml of medium / container are filled and frozen for 24 hours at - 20 degrees Celsius. The following day, the containers are deep-frozen at - 80 degrees Celsius, in order to remain in liquid nitrogen at - 196 degrees Celsius 24 hours later. This gradual freezing prevents the formation of ice crystals in the suspension with consequent cell damage. Production of recombinant retro and adenoviruses and gene transfer to the fibroblast cultures
Sämtliche gentechnischen Arbeiten werden in den dafür vorgesehenen Räumlichkeiten der Sicherheitsstufe 1 und 2 nach den entsprechenden gentechnologischen Laborprotokollen durchgeführt und sind von der zuständigen Behörde für gentechnische Sicherheit genehmigt.All genetic engineering work is carried out in the designated security level 1 and 2 premises in accordance with the relevant genetic engineering laboratory protocols and is approved by the competent authority for genetic engineering safety.
Der erste Schritt beim Gentransfer besteht in der Produktion eines rekombinanten Virus, welcher das zu transferierende Gen kodiert. In diesen Experimenten wird eine cDNS, welche das interessierende Protein kodiert, mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert . Die entsprechenden Primer pro- duzieren z.B. einen BspHl-Locus am Translations-Startercodon und z.B. einen BamHl-Locus am Translations-Stopcodon. Das Produkt der PCR kann dann isoliert werden durch Auftrennen des Genproduktes an den genannten Stellen und Insertion des gewonnenen Genes in die Ncol/BamHl Loci eines viralen Vek- tors, genannt MFG. Die erfolgreiche Übertragung wird anschließend durch DNS-Sequenzierung überprüft.The first step in gene transfer is the production of a recombinant virus that encodes the gene to be transferred. In these experiments, a cDNA encoding the protein of interest is amplified by means of PCR (polymerase chain reaction). The corresponding primers produce e.g. a BspHl locus on the translation starter codon and e.g. a BamHI locus at the translation stop codon. The product of the PCR can then be isolated by separating the gene product at the sites mentioned and inserting the gene obtained into the Ncol / BamHl loci of a viral vector, called MFG. Successful transmission is then checked by DNA sequencing.
Dieser Vektor (MFG-Plasmid DNS) stammt z.B. aus dem murinen Moloney Leukämie-Virus, enthält selbst keine viralen Gene au- ßer denen, die zur Transkription, Verpackung, reversen Transkription, Integration und Expression des viralen Vektors mit dem darin befindlichen modifizierenden Gen notwendig sind. Um nun Virionen produzieren zu können, die diesen Vektor in Zielzellen genetisch verankern können, muß der Vektor in eine spezielle Verpackungszellinie, welche z.B. von murinen 3T3 Fibroblasten stammt, integriert werden. Die Transduktion des Vektors in die entsprechende Verpackungszellinie wird durch wird durch die Zugabe von Calciumphosphat erleichtert, da dadurch die Zellmembranen des Verpackungszellinien temporär porös werden und dem viralen Vektor leichter Zugang zur Zelle verschaffen. Diese Verpackungszellinie (Psi- CRI) wurde spe- ziell produziert, um die retroviralen Proteine pol, env und gag zu liefern, welche ihrerseits Virionen herstellen können, die den Vektor mit dem darin befindlichen modifizierenden Gen kodieren und übertragen. Die Verpackungszellinie selbst kann keine Viren herstellen , die ^wild type' Replikanten entspre- chen und damit virulent sind. Stattdessen transkribiert sie die DNS des rekombinanten viralen Vektors in RNS, welche dann in die RNS des Virions integriert wird. Die Psi- CRP- Verpackungszellinie scheidet dann das Virion, also den rekombinanten Virus mitsamt modifizierendem Gen in das Zellmedium aus.- Eine Transfektion der Zielzellen gelingt effektiv bei einer Menge von 1,0 - 10,0 Mio. Virionen/ml Medium. Es wird deshalb jede transfizierte Zellinie nach der höchsten Titerproduktion überprüft, um diese dann für den Gentransfer zu selektieren. Für den adenoviralen Gentransfer wird als Cos- midvektorfragment ein padcos46 RESeGFP (39155 bp) verwendet und mit der entsprechenden gewünschten Gensequenz bestückt. Selbstverständlich kann der Vektor so konstruiert werden, daß eine Genexpression nur unter gleichzeitiger Gabe einer weiteren Substanz erfolgt. Damit ist eine zeitlich gesteuerte Ex- pression möglich. Geeignete Vektoren mit sog. "on/off"- Genfunktionen sind im Stand der Technik bekannt.This vector (MFG plasmid DNA) comes, for example, from the murine Moloney leukemia virus and does not itself contain any viral genes other than those which are necessary for the transcription, packaging, reverse transcription, integration and expression of the viral vector with the modifying gene therein are. In order to be able to produce virions that can genetically anchor this vector in target cells, the vector must be integrated into a special packaging cell line, which comes, for example, from murine 3T3 fibroblasts. The transduction of the vector into the corresponding packaging cell line is carried out by is facilitated by the addition of calcium phosphate, since this makes the cell membranes of the packaging cell lines temporarily porous and gives the viral vector easier access to the cell. This packaging cell line (Psi-CRI) was specially produced to deliver the retroviral proteins pol, env and gag, which in turn can produce virions that code and transmit the vector with the modifying gene contained therein. The packaging cell line itself cannot produce viruses that correspond to ^ wild type 'replicants and are therefore virulent. Instead, it transcribes the DNA of the recombinant viral vector into RNA, which is then integrated into the RNA of the virion. The Psi-CRP packaging cell line then secretes the virion, i.e. the recombinant virus together with the modifying gene, into the cell medium. - The target cells can be transfected effectively with a quantity of 1.0-10.0 million virions / ml medium. Each transfected cell line is therefore checked for the highest titer production in order to then select it for gene transfer. For the adenoviral gene transfer, a padcos46 RESeGFP (39155 bp) is used as the cosmid vector fragment and is equipped with the corresponding desired gene sequence. Of course, the vector can be constructed in such a way that gene expression takes place only with the simultaneous administration of another substance. This enables a time-controlled expression. Suitable vectors with so-called "on / off" gene functions are known in the prior art.
Für die Transduktion werden die gewonnenen Fibroblasten in Brutkammern mit 75 cm2 Bodenfläche ausgesät und mit einem Me- diu aus DMEM, versetzt mit 100 Mikrogramm/ml Streptomycin, 100 IU/ l Penicillin, 3 Mikroliter/ml Amphotericin und 5% FBS. Die Aussaat der Fibroblasten erfolgt in einer niedrigen Dichte (5 x 105 Zellen) , um eine möglichst große Effektivität der Transduktion zu erreichen.For the transduction, the fibroblasts obtained are sown in incubators with a floor area of 75 cm 2 and with a medium of DMEM, mixed with 100 micrograms / ml streptomycin, 100 IU / l penicillin, 3 microliters / ml amphotericin and 5% FBS. The fibroblasts are sown at a low rate Density (5 x 10 5 cells) in order to achieve the greatest possible effectiveness of the transduction.
Am Folgetag, wenn alle Fibroblasten Kontakt mit der Bodenflä- ehe der Brutkammer bekommen haben und sich langsam ausbreiten, wird ein Mediumwechsel vorgenommen mit Medium aus der Psi-CRIP Zellinie. In diesem Medium befinden sich 1,0 - 10,0 Mio Virionen/ml Medium, welche frisch aus dem Medium der Verpackungszellinie (Psi-CRIP) abpipettiert sind. Das Medium wird hierfür zunächst durch einen Porenfilter mit einem Porendurchmesser von 0,45 Mikrometern gefiltert, um es von Zelldebris und möglichen Kontaminantien zu befreien. Anschließend wird dem Medium die Substanz Polybrene in einer Konzentration von 8 Mikrogramm/ml beigemischt.The following day, when all fibroblasts have come into contact with the bottom of the brood chamber and are slowly spreading, a medium change is made with medium from the Psi-CRIP cell line. This medium contains 1.0-10.0 million virions / ml medium, which are freshly pipetted off from the medium of the packaging cell line (Psi-CRIP). For this purpose, the medium is first filtered through a pore filter with a pore diameter of 0.45 micrometers in order to free it from cell debris and possible contaminants. The substance polybrene is then added to the medium in a concentration of 8 micrograms / ml.
Polybrene ist wie Protamin und DEAE-Dextran ein kationisches Polymer, bestehend aus 1, 5-Dimethyl-l, 5-Diaxadecamethylen- Polymethobromid, und entfaltet seine transfektionsunterstüt- zende Wirkung dadurch, daß es an die Viruspartikel adsorbiert und gleichermaßen auch an die Oberfläche der Zielzelle, um so die elektrostatischen Abstoßungskräfte dieser beiden negativ geladenen Stoffe abzuschwächen. Zur Gewinnung ausreichend großer Mengen an Viruspartikeln müssen die Zellen der Psi - CRIP Zellinie bereits konfluent sein und ein Mediumwechsel am Vortag der Transduktion stattfinden, um eine möglichst hohe Anzahl von aktiven Viren/ml Medium zu gewährleisten. Die Viren haben bei 37 Grad Celsius im Brutschrank eine durchschnittliche halbzeitliche Lebensdauer von 6-8 Stunden. Die Lebenszeit der Viren kann durch Senken der Brutschranktempe- ratur auf 32 Grad Celsius bis zum Zehnfachen verlängert und damit die Effektivität der Transduktion erheblich gesteigert werden. Wenn die rekombinanten Viren im Medium mit Zielzellen zusammenkommen, wird das Virion an der Zelloberfläche der Fibroblasten durch spezielle Rezeptoren gebunden und entläßt das verpackte RNS Genom in das Zellinnere. Diese wird revers transkribiert und die entstehende DNS gelangt in den Zellnuk- leus, wo sie in das Genom der Zielzelle stabil integriert wird. Diese integrierte Kopie des rekombinanten viralen Vektors mit dem modifizierenden Gen wird an die Tochterzellen weitergegeben wie jedes andere autosomale Gen. Zudem erfolgt eine stabile regelmäßige Expression des Gens, so daß die Zielzellen nunmehr große Mengen des gewünschten Protein se- zernieren.Like protamine and DEAE-dextran, polybrene is a cationic polymer consisting of 1,5-dimethyl-1,5-diaxadecamethylene polymethobromide and exerts its transfection-supporting effect by adsorbing it onto the virus particles and equally onto the surface of the Target cell in order to weaken the electrostatic repulsive forces of these two negatively charged substances. In order to obtain sufficiently large quantities of virus particles, the cells of the Psi-CRIP cell line must already be confluent and the medium changed on the day before the transduction in order to ensure the highest possible number of active viruses / ml medium. The viruses have an average half-life of 6-8 hours at 37 degrees Celsius in the incubator. By lowering the incubator temperature to 32 degrees Celsius, the lifespan of the virus can be extended up to ten times and the effectiveness of the transduction can be increased considerably. When the recombinant viruses come together with target cells in the medium, the virion is bound to the cell surface of the fibroblasts by special receptors and releases the packaged RNA genome into the interior of the cell. This is reverse transcribed and the resulting DNA reaches the cell nucleus, where it is stably integrated into the genome of the target cell. This integrated copy of the recombinant viral vector with the modifying gene is passed on to the daughter cells like any other autosomal gene. In addition, the gene is stable and regularly expressed, so that the target cells now secrete large amounts of the desired protein.
Bei Verwendung adenoviraler Vektoren wird man eine nur temporäre Genexpression erwarten können, welche nach einigen Zellgenerationen wieder aus dem Zellgenom eliminiert werden wird. Das Medium sollte für 24 Stunden mit den Zielzellen zusammen belassen werden, um den Transduktionsvorgang in allen Zellen abgeschlossen zu haben.When using adenoviral vectors, only temporary gene expression can be expected, which will be eliminated from the cell genome again after a few cell generations. The medium should be left with the target cells for 24 hours to complete the transduction process in all cells.
Das virusenthaltende Medium kann auch asserviert werden, um es zu einem späteren Zeitpunkt für eine Transduktion von Fibroblasten zu verwenden. Hierzu wird das Medium abpipet- tiert und auf Trockeneis schockgefroren, bis es eine gelbliche Färbung annimmt. Anschließend wird das Medium bei - 80 Grad Celsius gelagert. Man muß allerdings mit einem Verlust von 30 - 50 % Viren durch diesen Vorgang rechnen.The virus-containing medium can also be preserved for later use for transduction of fibroblasts. The medium is pipetted off and snap frozen on dry ice until it takes on a yellowish color. The medium is then stored at - 80 degrees Celsius. However, you have to expect a loss of 30 - 50% viruses through this process.
Das Wachstum der genetisch modifizierten gegenüber den unbe- handelten Fibroblasten wird untersucht durch Aussaat von jeweils 5 x 105 Zellen auf 60 mm durchmessende Petrischalen und Auszählen des Zellen in 12 - stündigem Abstand über insgesamt 4 Tage nach dem oben genannten Verfahren. Hieraus lassen sich Rückschlüsse auf die biologische Aktivität des se- zernierten Proteins ziehen, da die verwendeten Substanzen mit Ausnahme von sFLTl D1-D6 auch autokrin mitogen wirken, also die Fibroblasten, welche selbst das Protein sezernieren, zur Zellteilung anregt. Die Anzahl der Fibroblasten wird anschließend unter dem Fluoreszenzmikroskop mittels einer Zählkammer gemessen und die Vitalität der Zellen durch Evans-Blue bestimmt und mit den Kontrollen, welche aus unbehandelten Fibroblasten bestehen, verglichen.The growth of the genetically modified compared to the untreated fibroblasts is examined by sowing 5 × 10 5 cells each on Petri dishes with a diameter of 60 mm and counting the cells 12 hours apart for a total of 4 days according to the above-mentioned procedure. This enables conclusions to be drawn about the biological activity of the secreted protein, since the substances used, with the exception of sFLTl D1-D6, also have an autocrine mitogenic effect, that is to say the fibroblasts, which themselves secrete the protein, stimulate cell division. The number of fibroblasts is then measured under the fluorescence microscope using a counting chamber and the vitality of the cells is determined by Evans-Blue and compared with the controls, which consist of untreated fibroblasts.
Die Proteinexpression wird außerdem in vitro mittels ELISA- Techniken bestimmt werden. Es wird dabei eine wesentlich hö- here Proteinproduktion durch die genetisch modifizierten Fibroblasten erwartet.Protein expression will also be determined in vitro using ELISA techniques. A significantly higher protein production due to the genetically modified fibroblasts is expected.
Die solchermaßen vorbereiteten Zellpopulationen werden nach Quantifizierung in Medium transportiert zur Durchführung der sich daran anschließenden Operation.The cell populations prepared in this way are transported after quantification in medium to carry out the subsequent operation.
Operationsurgery
Es werden 2 Untergruppen (I und II) mit jeweils 200 Tieren gebildet. Jede Untergruppe wird wiederum in 5 Subgruppen (I.I - I.V, II. I - II.V) zu jeweils 40 Tieren dividiert. Da 4 verschiedene Faktoren getestet werden sollen (VEGF 165, VEGF 165 + sFLT-1, PDFG-B und bFGF) , muß jede Subgruppe wiederum in 4 Untergruppen ä 10 Tieren aufgeteilt werden. Das Körpergewicht der Tiere wird während der Versuchstage regelmäßig mittels einer digitalen Waage bestimmt. In Gruppe I wird 1 Woche vor der eigentlichen Operation jeder Lappen am aetheranästhesierten Tier in einer Ausdehnung von 7 x 7 cm vorgezeichnet und bereits zu diesem Zeitpunkt die Lappenbehandlung vorgenommen.Two subgroups (I and II) with 200 animals each are formed. Each subgroup is divided into 5 subgroups (II - IV, II. I - II.V) of 40 animals each. Since 4 different factors are to be tested (VEGF 165, VEGF 165 + sFLT-1, PDFG-B and bFGF), each subgroup has to be divided into 4 subgroups of 10 animals. The body weight of the animals is regularly determined during the test days using a digital scale. In Group I, each flap on the ether-anesthetized animal is drawn 1 x 7 cm before the actual operation and the flap treatment is already carried out at this time.
Gruppe I.I erhält im vorgezeichneten Lappenbereich eine subcutane Injektion von 10 Mio. genetisch modifizierten Fibroblasten (GMFB) in 2 ml DMEM mit 10 % FBS. Die Injektion selbst erfolgt mittels einer sterilen 2 ml Spritze mit 0,4 mm durchmessender Stahlkanüle in den Panniculus carnosus zwischen äußerem Faszienblatt der Bauchwand und Subcutis. Gruppe I.II erhält im vorgezeichneten Lappenbereich eine subcutane Injektion von 10 x 106 nicht-modifizierter Fibroblasten (NMFB), aufgelöst in 2 ml DMEM mit 10 % FBS. Gruppe I.III er- hält eine subkutane Injektion von 2 ml DMEM mit 10 % FBS ohne Zellzusatz. Gruppe I . IV erhält eine subkutane Injektion von 2 ml NaCl 0,9 % ohne Zellzusatz. Genau eine Woche später wird die chirurgische Hebung der solchermaßen vorbereiteten Lappen durchgeführt.Group II receives a subcutaneous injection of 10 million genetically modified fibroblasts (GMFB) in 2 ml DMEM with 10% FBS in the designated area of the flap. The injection itself is carried out using a sterile 2 ml syringe with a 0.4 mm diameter steel cannula into the panniculus carnosus between the outer fascia leaf of the abdominal wall and the subcutis. Group I.II receives a subcutaneous injection of 10 x 10 6 unmodified fibroblasts (NMFB) in the predetermined area of the flap, dissolved in 2 ml DMEM with 10% FBS. Group I.III receives a subcutaneous injection of 2 ml DMEM with 10% FBS without cell addition. Group I IV receives a subcutaneous injection of 2 ml NaCl 0.9% without cell addition. Exactly a week later, the rags prepared in this way are surgically lifted.
In der Gruppe II erfolgt die Lappenbehandlung am Tage der Lappenhebung. Gruppe I.V und Gruppe II.V werden wie die Gruppen I.I und II. I behandelt und dienen Langzeitexperimenten. Diese Tiergruppen werden erst nach einem Beobachtungszeitraum von 6 Monaten (jeweils 5 Tiere) und 12 Monaten (jeweils 5 Tiere) getötet.In group II, flap treatment takes place on the day of flap lifting. Group I.V and Group II.V are treated like groups I.I and II. I and serve long-term experiments. These groups of animals are only killed after an observation period of 6 months (5 animals each) and 12 months (5 animals each).
Das chirurgische Vorgehen ist in allen Untergruppen identisch. Die Tiere werden anästhesiert durch intraperitoneale Injektion einer Kombination aus 0,05 mg/gm Ratte Ketamin (Ketanest 100 mg/ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa/USA) und 0,0013 mg/gm Ratte Xylazin (Rampun 20 mg/ml; Bayer Corporati- on, Kansas/USA) . Die spontan atmenden Tiere werden vom Xyphoid bis zur Leistenregion rasiert und auf einen Operationstisch plaziert. Die Körpertemperatur wird während eines jeden Experimentes mittels eines digitalen Rektalthermometer gemessen und über eine Wärmematte bei 36 - 37 Grad Celsius konstant gehalten.The surgical procedure is identical in all subgroups. The animals are anesthetized by intraperitoneal injection of a combination of 0.05 mg / gm rat ketamine (Ketanest 100 mg / ml; Fort Dodge Laboratories, Iowa / USA) and 0.0013 mg / gm rat xylazine (Rampun 20 mg / ml; Bayer Corporati- on, Kansas / USA). The spontaneously breathing animals are shaved from the xyphoid to the groin region and placed on an operating table. Body temperature is measured during each experiment using a digital rectal thermometer and kept constant at 36 - 37 degrees Celsius using a warming mat.
In jedem Tier wird ein standartisierter epigastrischer Lappen gehoben mit den Maßen 7 x 7 cm. Zunächst wird dabei die Basis des Lappens vorgeschnitten, die Femoralgefäße auf beiden Seiten aufgesucht und anschließend der Lappen inclusive Haut und Subcutis an den beiden inferioren epigastrischen Gefäßnervenbündeln vollständig gehoben, so daß die Durchblutung des Lappens allein über diese Gefäßstiele gewährleistet bleibt. Die superioren epigastrischen Gefäßstiele werden durchtrennt nach Ligatur mittels 6-0 Ethilonnaht . Ebenso wird auch für jeden Lappen das linksseitige Gefäßnervenbündel unter 2 6-0 Ethi- lonligaturen durchtrennt, so daß der Lappen nunmehr lediglich über die rechtsseitigen Stielgefäße ernährt wird.A standardized epigastric rag measuring 7 x 7 cm is lifted in each animal. First, the base of the flap is pre-cut, the femoral vessels are found on both sides, and then the flap including skin and subcutis on the two inferior epigastric vascular nerve bundles are completely raised, so that the blood supply to the flap is guaranteed solely through these stalks. The superior epigastric stalks are severed after ligation using a 6-0 ethilon suture. Likewise, the left-sided bundle of vascular nerves is cut under 2 6-0 ethiol ligatures for each flap, so that the flap is now only fed via the right-sided pedicle.
Gruppe II. I und Gruppe II.V erhält im vorgezeichneten Lappenbereich eine subcutane Injektion von 10 x 106 genetisch modifizierten Fibroblasten (GMFB) in 2 ml DMEM mit 10 % FBS. Die Injektion selbst erfolgt wie schon für Gruppe I.I beschrie- ben. Gruppe II. II erhält im vorgezeichneten Lappenbereich eine subcutane Injektion von 10 x 106 nicht-modifizierter Fibroblasten (NMFB), aufgelöst in 2 ml DMEM mit 10 % FBS. Gruppe II. III erhält eine subkutane Injektion von 2 ml DMEM mit 10 % FBS ohne Zellzusatz. Gruppe II. IV erhält eine subku- tane Injektion von 2 ml NaCl 0,9 % ohne Zellzusatz. Anschließend wird jeder Lappen wieder in sein Wundbett eingenäht. Hierzu werden zunächst 4 Ecknähte sowie 2 Nähte in der Medi- anlinie mit einer 6-0 Ethilonnaht gesetzt und anschließend der ganze Lappen durch eine laufende 6-0 Ethilonnaht intracu- tan mit Versenken der Knoten eingenäht.Group II. I and Group II.V receive a subcutaneous injection of 10 x 10 6 genetically modified fibroblasts (GMFB) in 2 ml DMEM with 10% FBS in the designated area of the flap. The injection itself is carried out as already described for group II. Group II. II receives a subcutaneous injection of 10 x 10 6 unmodified fibroblasts (NMFB) in the predetermined area of the flap, dissolved in 2 ml DMEM with 10% FBS. Group II. III receives a subcutaneous injection of 2 ml DMEM with 10% FBS without cell addition. Group II. IV receives a subcutaneous injection of 2 ml 0.9% NaCl without cell addition. Each flap is then sewn back into its wound bed. For this, 4 corner seams and 2 seams are first line with a 6-0 ethilon suture and then the entire flap is sewn intracutaneously with a running 6-0 ethilon suture with sinking of the knots.
Alle Tiere erhalten postoperativ einen Halskragen (Fa. Kent Scientific) , um sie vor Autokannibalismus zu schützen. Genau eine Woche nach diesem Eingriff werden die Tiere der Gruppen I.I-I.IV und II.I-II.IV ein letztes Mal operiert. Die Lappen werden auf eine in qmm planimetrisch aufgeteilten Plastikfo- lie nach ihrem Anteil an vitalem und nekrotischem Lappengewebe übertragen zur späteren computergesteuerten Bildanalyse. Nach anschließendem erneuten Heben der Lappen werden die Lappenpräparate abschließend in ihrer Gesamtheit mit der darunter liegenden Muskelschicht zur weiteren histologischen, immunhistochemisehen und m-RNS-analytischen Untersuchung entnommen. Zuletzt werden die Versuchstiere durch eine intrape- ritoneale Überdosis Ketamin getötet.All animals are given a neck collar (Kent Scientific) postoperatively to protect them from autocannibalism. Exactly one week after this procedure, the animals in groups I.I-I.IV and II.I-II.IV undergo one last operation. The flaps are transferred onto a plastic film divided in qmm planimetrically according to their share of vital and necrotic flap tissue for later computer-controlled image analysis. After then lifting the flaps again, the flap preparations are finally removed in their entirety with the underlying muscle layer for further histological, immunohistochemical and m-RNA analysis. Finally, the experimental animals are killed by an intraperitoneal overdose of ketamine.
6 Monate bzw. 12 Monate nach Zelltransplantation erfolgt in den Tieren der Gruppen I.V und II.V die histologische und im- munhistochemische Evaluation der Langzeitergebnisse, um die Dauerfolgen nach einer gentechnologischen Manipulation im Gewebe näher untersuchen zu können.6 months and 12 months after cell transplantation, the histological and immunohistochemical evaluation of the long-term results takes place in the animals of groups I.V and II.V in order to be able to investigate the long-term consequences after a genetic engineering manipulation in the tissue.
Sämtliche Operationen finden in den von der UKL dafür vorgesehenen Räumlichkeiten der gentechnischen Sicherheitsstufe 1 statt.All operations take place in the UKL-designated GMO security level 1 facility.
Histologie, Immunhistochemie und GewebeextraktionHistology, immunohistochemistry and tissue extraction
Die histologische Aufarbeitung der Präparate erfolgt nach Fi- xation in Formaldehyd und Färbung in Hämatoxylin/Eosin. Die Präparate werden zuvor in Paraffin eingebettet, mit dem Mikrotommesser in 5 Mikrometer dünne Schichten geschnitten, in Präparateplatten fixiert und einer entsprechenden Färbung unterzogen. Eine Färbung der Präparate erfolgt getrennt nach Hämotoxylin/Eosin als primäre und Gegenfärbung in der Immun- histochemie .The specimens are processed histologically after fixation in formaldehyde and staining in hematoxylin / eosin. The Preparations are first embedded in paraffin, cut into 5 micron thin layers with the microtome knife, fixed in preparation plates and subjected to a corresponding staining. The preparations are stained separately according to hemotoxylin / eosin as primary and counterstaining in immunohistochemistry.
10 weitere Tiere aus den Gruppen I und II, deren Lappengewebe mit GMFB behandelt wurde, werden nach 6 bzw. 12 Monaten sakrifiziert und das noch verbliebene angiogenetisch veränderte Gewebe einer histologischen Untersuchung unterzogen.Another 10 animals from groups I and II, whose flap tissue was treated with GMFB, are sacrified after 6 and 12 months, respectively, and the remaining angiogenetically modified tissue is subjected to a histological examination.
Immunhistochemisch wird eine Färbung mittels Immunperoxidase für Faktor VIII (von Willebrand Faktor) mit Antiserum von Ka- ninchen zur Anfärbung von Endothelzellen sowie eine Chloraze- tatesterasefärbung zur Darstellung polymorphonukleärer Zellen durchgeführt. Zusätzlich wird eine Färbung zum Nachweis des sezernierten Proteins im Lappengewebe vorgenommen.Immunohistochemical staining is carried out using factor VIII immunoperoxidase (from Willebrand factor) with rabbit antiserum for staining endothelial cells and chlorate acetate esterase staining to display polymorphonuclear cells. In addition, staining is carried out to detect the secreted protein in the flap tissue.
Das frisch entnommene Gewebe wird auf seine Produktionsfähigkeit von produziertem Protein mittels m-RNA-Analyse durch quantitative PCR-Analyse untersucht, um einen Anhalt über die Menge und Dauer der Proteinproduktion durch die GMFB zu bekommen.The freshly removed tissue is examined for its production ability of produced protein by means of m-RNA analysis by quantitative PCR analysis in order to get an indication of the amount and duration of the protein production by the GMFB.
Die Produktion autologer Zellen zur Retransplantation in demselben Spenderorganismus geschieht nach exakt den gleichen methodologischen Vorgaben, wie sie zuvor geschildert wurden. LiteraturverzeichnisThe production of autologous cells for retransplantation in the same donor organism takes place according to exactly the same methodological specifications as described above. bibliography
1. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the rat epigastric island flap Machens HG, Morgan JR, Berthiaume F, Stefanovich P and Berger A in: Biological matrices and tissue reconstruction (Ed. : Stark, Horch, Tanczos) pp. 53-59 Springer Verlag/Berlin Heidelberg New York (1997) ISDN 3-54063863-61. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the rat epigastric island flap Machens HG, Morgan JR, Berthiaume F, Stefanovich P and Berger A in: Biological matrices and tissue reconstruction (Ed.: Stark, Horch, Tanczos) pp. 53-59 Springer Verlag / Berlin Heidelberg New York (1997) ISDN 3-54063863-6
2. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the rat epigastric island flap2. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the rat epigastric island flap
Machens HG, Morgan JR, Berthiaume F, Stefanovich P, Reimer R and Berger A Langenbeck's Arch Surg 383: 345-350 (1998)Machens HG, Morgan JR, Berthiaume F, Stefanovich P, Reimer R and Berger A Langenbeck's Arch Surg 383: 345-350 (1998)
3. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the 3 x 6 cm rat epigastric island flap.3. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the 3 x 6 cm rat epigastric island flap.
Machens HG, Morgan J, Weich HE, Berthiaume F, Stefanovich P, Berger AMachens HG, Morgan J, Weich HE, Berthiaume F, Stefanovich P, Berger A
Eur J Plast Surg 22: 203-209 (1999)Eur J Plast Surg 22: 203-209 (1999)
4. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the 3 x 6 cm rat epigastric island flap - authors' reply. Machens HG, Morgan J, Weich HE, Berthiaume F, Stefanovich P, Berger A Eur J Plast Surg 22: 211-212 (1999)4. Genetically modified fibroblasts induce angiogenesis in the 3 x 6 cm rat epigastric island flap - authors' reply. Machens HG, Morgan J, Weich HE, Berthiaume F, Stefanovich P, Berger A Eur J Plast Surg 22: 211-212 (1999)
5. Gentherapeutische Techniken und Anwendungsmöglichkeiten in der Plastischen Chirurgie5. Gene therapy techniques and applications in plastic surgery
Machens HG, Morgan JR, Mailänder P Focus MUL 17: 3-10 (2000) 6. Gentherapeutische Möglichkeiten in der Plastischen ChirurgieMachens HG, Morgan JR, Milanese P Focus MUL 17: 3-10 (2000) 6. Gene therapy options in plastic surgery
Machens HG, Morgan JR, Sachse C, Berger A, Mailänder P Chirurg 70: 176-181 (2000) Machens HG, Morgan JR, Sachse C, Berger A, Milan P Surgeon 70: 176-181 (2000)

Claims

Patentansprüche claims
1. Mittel zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese, das isogene oder autologe Körperzellen umfaßt, die mindestens ein angiogenetisches oder antiangiogenetisches Protein exprimieren.1. An agent for inducing or inhibiting angiogenesis, which comprises isogenic or autologous body cells which express at least one angiogenic or anti-angiogenic protein.
2. Mittel nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine angiogenetische Protein unter PDGF-A (platelet derived growth fac- tor A) , PDGF-B (platelet derived growth factor B) , VEGF (vascular endothelial growth factor) , bFGF (basic fibroblast growth factor) , TGFbeta (tumor growth factor beta) , Angiopoetin 1 und Angiopoetin ausgewählt ist.2. Composition according to claim 1, wherein the at least one angiogenic protein under PDGF-A (platelet derived growth factor A), PDGF-B (platelet derived growth factor B), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), TGFbeta (tumor growth factor beta), angiopoetin 1 and angiopoetin is selected.
3. Mittel nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine antiangiogenetische Protein unter VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor receptor 1) , Angiostatin, Endostatin sowie Re- zeptorenblockern für VEGFR1 und VEGFR2 ausgewählt ist.3. Composition according to claim 1, wherein the at least one antiangiogenic protein is selected from VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), angiostatin, endostatin and receptor blockers for VEGFR1 and VEGFR2.
4. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem a) in einem Körper durch Implantation von biologisch inertem Material die Bildung von isogenen oder autologen Zellen ausgelöst wird, b) die in Schritt a) gebildeten Zellen aus dem Körper gewonnen werden, c) die in Schritt b) gewonnenen Zellen gentechnisch so verändert werden, daß sie im Falle einer gewünschten Induktion einer Angiogenese mindestens ein angiogenetisches Protein o- der im Falle einer gewünschten Inhibition einer Angiogenese mindestens ein antiangiogenetisches Protein exprimieren. 4. A method for producing an agent according to any one of claims 1 to 3, in which a) the formation of isogenic or autologous cells is triggered in a body by implantation of biologically inert material, b) the cells formed in step a) from the body c) the cells obtained in step b) are genetically modified such that they express at least one angiogenic protein in the event of a desired induction of angiogenesis or at least one antiangiogenic protein in the case of a desired inhibition of angiogenesis.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die in Schritt c) gewonnenen Zellen ein unter PDGF-A (platelet derived growth factor A) , PDGF-B (platelet derived growth factor B) , VEGF (vascular endothelial growth factor) , bFGF (basic fibroblast growth factor) , TGFbeta (tumor growth factor beta) , Angiopoetin 1 und Angiopoetin ausgewähltes angiogenetisches Protein exprimieren.5. The method of claim 4, wherein the cells obtained in step c) under PDGF-A (platelet derived growth factor A), PDGF-B (platelet derived growth factor B), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic express fibroblast growth factor), TGFbeta (tumor growth factor beta), angiopoetin 1 and angiopoetin selected angiogenic protein.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die in Schritt c) ge- wonnenen Zellen ein unter VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor receptor 1) , Angiostatin, Endostatin sowie Re- zeptorenblockern für VEGFR1 und VEGFR2 ausgewähltes antiangiogenetisches Protein exprimieren.6. The method according to claim 4, wherein the cells obtained in step c) express an antiangiogenic protein selected from VEGFR-1 (vascular endothelial growth factor receptor 1), angiostatin, endostatin and receptor blockers for VEGFR1 and VEGFR2.
7. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6 hergestellten Mittels zur Induktion oder Inhibition einer Angiogenese.7. Use of an agent according to one of claims 1 to 3 or of an agent produced by a method according to one of claims 4 to 6 for inducing or inhibiting angiogenesis.
8. Verwendung nach Anspruch 7, bei der ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6 hergestelltes Mittel in isogenes oder autologes Gewebe des Körpers eingeführt wird, in dem eine Angiogenese induziert oder inhibiert werden soll. 8. Use according to claim 7, in which an agent according to one of claims 1 to 3 or an agent prepared by a method according to one of claims 4 to 6 is introduced into isogenic or autologous tissue of the body in which angiogenesis is induced or inhibited should.
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