EP1446490A1 - Plasmide chimere comprenant un genome retroviral replicatif et utilisations - Google Patents

Plasmide chimere comprenant un genome retroviral replicatif et utilisations

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EP1446490A1
EP1446490A1 EP02793243A EP02793243A EP1446490A1 EP 1446490 A1 EP1446490 A1 EP 1446490A1 EP 02793243 A EP02793243 A EP 02793243A EP 02793243 A EP02793243 A EP 02793243A EP 1446490 A1 EP1446490 A1 EP 1446490A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
envelope
galv
sequence
plasmid
mlv
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02793243A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Muriel Audit
François-Loic COSSET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Genethon
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Genethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Genethon filed Critical Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Publication of EP1446490A1 publication Critical patent/EP1446490A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to a chimeric plasmid comprising a replicative retroviral genome containing gag, pol and env nucleotide sequences from retroviruses of distinct species. It also relates to a retrovirus type MLV (Murine Leukemia Virus) and type GaLV (Gibbon Ape
  • Leukemia Virus produced by a cell line expressing said plasmid. It also relates to a bacterium producing the plasmid. It also relates to a virion containing a replicative retroviral genome originating from retroviruses of distinct species. The invention also relates to the use of the virion as a positive control in a test intended to detect the replicative capacity of a retroviral vector of the MLV GaLV type, in particular a mobilization test.
  • the invention finally relates to a kit for implementing said test.
  • the main objective of gene therapy is to introduce, in vitro, in vivo or ex vivo, a gene of interest into cells to produce, for example, a recombinant protein or peptide.
  • the introduction of the gene of interest into the cell is carried out via vectors either viral (in practice, AAV, adeno virus or retrovirus ...), or synthetic (in particular, synthetic lipid ”) in the structure of which the gene of interest is inserted.
  • the present invention relates exclusively to the field of gene therapy using retroviral vectors.
  • gag codes for structural proteins (capsid, matrix and nucleocapsid)
  • pol gene codes for enzymatic functions
  • env gene codes for envelope proteins.
  • LTR long terminal repeats
  • PSI séquence sequence
  • retroviral vector One of the essential conditions for a retroviral vector to be used in gene therapy is that it has no ability to replicate. Indeed, retroviruses competent for replication (RCR) can induce a massive invasion of the organism and consequently various pathologies. Donahue's work (1) has shown that RCRs that have been generated during the production of retroviral vectors induce leukemia in rhesus immunosuppressed monkeys.
  • the 1st generation of retroviral vectors derived from MLV was constituted in the following way: the gene to be introduced into the target cells was placed in a transfer vector comprising in particular the LTR (Long Terminal Repeat) and the séquence sequence of the MLV virus.
  • This vector was introduced into a cell called “packaging” expressing, from a single molecular construction in which the ⁇ sequence had been deleted, the gag, pol and env genes of MLV.
  • a number of packaging lines on this model have been proposed such as for example the ⁇ 2, ⁇ -Am and PA 12 lines.
  • RCRs could be generated in such packaging lines following recombinations between the transfer vector (containing the gene of interest) and the viral sequences of the packaging line (molecular construction allowing the expression of the viral genes gag, pol and env) (2).
  • the major modification made with respect to packaging lines of the PA 317 type is as follows: the gag and pol genes are provided by a first plasmid and the env gene by a second plasmid. Such lines correspond for example to the GP + Env Aml2 line (4).
  • the most widely used to test vector-producing cells and viral supernatants is a mobilization test.
  • This test consists in incubating the test sample with a mobilization line which is permissive to infection by the vector produced by the cells or contained in the supernatant.
  • the mobilization line carries a vector comprising in particular the LTRs and the ⁇ sequence of MLV as well as a gene for resistance to an antibiotic.
  • This mobilization vector is a kind of decoy.
  • RCRs the mobilization cells are infected with RCRs, these provide the viral proteins necessary for the production of infectious particles and these particles indifferently integrate their own genome or the mobilization vector.
  • the supernatant of the mobilization cells is then transferred to indicator cells which are treated with the antibiotic corresponding to the resistance gene carried by the mobilization vector.
  • the existence of indicator cells resistant to the antibiotic indicates the presence of RCR in the supernatant or the producer cells tested.
  • the document MILLER (6) describes a plasmid called “pAM”, the expression product of which (the virus) is used as a positive control for the search for RCR in preparations of retroviral vectors of the amphotropic MLV type.
  • This virus can be used as a control because it is similar to RCR which can be generated in preparations of amphotropic MLV vectors.
  • the use of this positive control is now made mandatory by the FDA. It is marketed by the ATCC (American Type Culture Collection) in the form of a viral supernatant (ref VR-1450) and in the form of a NIH3T3 cell line producing this virus (ref VR-1448).
  • the plasmid pAM was obtained by replacing the ecotropic env gene of MLV Moloney with the amphotropic env gene of MLV 4070A.
  • the sequence of pAM is listed in GENBANK under the accession number AF 010170.
  • This sequence comprises in particular a cloning vector, pBR322, and the genome of the virus composed as follows: LTR 5 '(bases 145 to 736), gene gag (bases 1212 to 2828), pol gene (bases 2829 to 6428), env gene (bases 6368 to 8332) and LTR 3 '(bases 8374 to 8967).
  • the molecular construction of pAM was relatively easy due to the strong homologies of sequence and of function of the genomes of the two MLVs used to carry out this construction. Indeed, thanks to the presence of allelic restriction sites (same restriction sites in the same places of the 2 genomes considered), this construction was carried out by a simple enzymatic digestion of the recipient plasmid and the donor plasmid followed by the ligation of the 2 fragments to associate.
  • the most widely used retroviral vectors derived from MLV are those which carry an envelope allowing infection of human cells, for example an amphotropic envelope (derived from the MLV mouse virus) or a GaLV envelope (derived from a monkey virus). Using a GaLV envelope rather than an amphotropic envelope has several advantages.
  • the GaLV envelope allows the infection of more human cell types than the amphotropic envelope (7).
  • the use of vectors carrying structural genes and an envelope gene from different species reduces the probability of reconstitution, following recombinations.
  • a functional viral genome capable of producing RCR a functional viral genome capable of producing RCR.
  • the problem which the invention proposes to solve is therefore to develop a positive control for the search for CPR in the preparations of MLV GaLV vectors.
  • the invention firstly provides a plasmid comprising a replicative retroviral genome.
  • This plasmid is characterized in that it contains: a ⁇ sequence, gag and pol sequences originating from the genome of an MLV virus, a chimeric env sequence comprising a region corresponding to a part of the envelope originating from the genome of a MLV virus and a region corresponding to part of the envelope from the genome of a GaLV virus.
  • the expression “replicative retroviral genome” denotes a genome composed of all the elements necessary for the production of viral particles competent for replication, in particular a psi sequence, at minus an LTR sequence, the gag, pol and env genes and more generally all the genes present in the wild-type MLV virus.
  • the invention consists in having constructed a single plasmid carrying retroviral genomes of distinct origins, in other words of different species.
  • the plasmid is constructed by juxtaposing three retroviral sequences, respectively a first region comprising the gag and pol genes of an MLV virus, mie second region comprising a part of the envelope of an MLV virus, and a third region comprising a part of the envelope of a GaLV virus.
  • the COSSET document WO 00/71578 describes the construction of retroviral vectors containing an envelope originating from an MLV virus in which the binding receptor (RBD) is replaced by a specific antico ⁇ s.
  • the chimeric nature of the envelope therefore does not come from the association of two viral envelopes of different species, but from the substitution of a part of given viral envelope (MLV) by a synthetic molecule, in this case im specific antibody.
  • the document CFLRISTODOULOPOULOS (11) describes a method of preparation of retroviral vectors whose genome consists of the gag and pol genes of MLV and of a chimeric envelope resulting from the association of an envelope part originating from MLV and from part of the envelope from GaLV.
  • the LANDAU document (12) describes a process for producing MLV viruses provided with an MLV or RSV envelope. In other words, the envelope is not a chimera resulting from the association of two parts of viral envelopes of different species.
  • gag-pol or env plasmids contains a ⁇ sequence essential for packaging the genome. Therefore, the separate gag-pol and env plasmids are only able to produce the proteins encoded by the gag, pol and env genes in the transfected cells. The particles will be able to infect the target cells, but the latter not containing the gag, pol and env genes, will not in turn be able to produce viral particles.
  • gag-pol and env genes being carried by different plasmids, this implies that to be replicative, the virions carry at least two distinct genomes (corresponding to the two plasmids), an improbable phenomenon.
  • the difficulty of the invention was therefore to prepare a single plasmid carrying a complete replicative retroviral genome starting from an entire genome in which a gene derived from another species providing an analogous function is taken.
  • the MLV envelope used can have different tropisms, in particular, xenotropic, ecotropic, polytropic, 10A1, advantageously amphotropic.
  • the gag sequence codes for the gag polyprotein corresponding to the amino acid sequence SEQ ID 1, or a sequence having at least 70%, advantageously at least 80% of homology with the sequence SEQ ID 1.
  • sequence having a certain percentage of homology with a given sequence is meant an amino acid or nucleotide sequence identical with the given sequence at the height of said The identity or homology is generally determined using sequence analysis software, for example Pairwise BLAST, NCBI.
  • the percentage of homology with the sequence SEQ ID 1 was sought by comparing the amino acids coded by the gag sequence of the plasmid pAMS with those of the gag sequence of different strains of MLV type viras. The results are shown in the table below. The references indicated are those of GENBANK.
  • the pol sequence codes for the viral enzymes corresponding to the amino acid sequence SEQ ID 2, or a sequence having at least 80%, preferably at least 85% advantageously at least 90% homology with the sequence SEQ ID 2.
  • the percentage of homology with the sequence SEQ ID 2 was sought by comparing the amino acids coded by the pol sequence of the plasmid pAMS with those of the pol sequence of different strains of MLV type viras. The results are shown in the table below. The references indicated are those of GENBANK.
  • gag and pol sequences come from the genome of a virus
  • the Moloney strain is used although other strains can be used because of the strong homology of the gag and pol genes between the different known strains, as demonstrated above.
  • the env sequence is a chimeric sequence originating partly from the envelope of an MLV virus and partly from the envelope of a GaLV viras.
  • the part of the envelope of the GaLV virus, cloned into the plasmid comprises at least the region which has the function of defining the specificity of infection or the tropism of the viral envelope.
  • the part of the envelope of the GaLV viras codes for the part of the env protein located between amino acids No. 32 and No.
  • domain ID3-GaLV domain ID3-GaLV 644 (hereinafter referred to as "domain ID3-GaLV”) of the sequence SEQ ID 3 , that is to say overlapping the SU and TM subunits of the envelope protein or a sequence having at least 70%, preferably at least 75%, advantageously at least 80% homology with the LD3 domain -GaLV.
  • the percentage of homology with the ID3-GaLV domain was sought by comparing the amino acids coded by the env sequence of a GaLV virus, strain SEATO with those of the env sequence of different strains of virus of the type GaLV. The results are shown in the table below. The references indicated are those of GENBANK.
  • the GaLV envelope fragment comes from the SEATO strain (GENBANK, ref M26927).
  • the chimeric env sequence comprises a region corresponding to a part of the envelope of an MLV viras exhibiting a tropism of choice, amphotropic, xenotropic, ecotropic, polytrope or 10A1.
  • the MLV virus exhibits an amphotropic tropism.
  • the envelope part of the amphotropic virus cloned into the plasmid is that which is necessary to allow, in association with the region of the substituted GaLV envelope, the obtaining of infectious viral particles and therefore the conformation of an envelope. functional viral. No specific region of the amphotropic envelope would therefore be required in the case where the segregation of the entire GaLV envelope gives rise to
  • the part of the envelope of the amphotropic MLV virus codes for the regions of the env polyprotein situated on the one hand between amino acids No. 1 and 31 "domain ID 3-ampho-1" and d on the other hand between amino acids No. 645 and 676 "domain ID 3-ampho-2") of the sequence SEQ ID 3, i.e. respectively at the beginning of the SU subunit and at the end of the TM subunit of the envelope protein or a sequence having at least 70%, preferably at least 80 % advantageously at least 85% homology with the domains ID 3-ampho-1 and ID 3-ampho-2.
  • the amphotropic envelope fragment comes from the strain 4070 A.
  • the invention also relates to a chimeric env sequence coding for the env protein corresponding to the amino acid sequence SEQ LO 3 or a sequence having at least 95%, advantageously 98% homology with the sequence SEQ ID3.
  • This chimeric env sequence contains part of the envelope of a GaLV virus encoding the part of the env protein located between amino acids No. 32 and No. 644 of SEQ ID3 and part of the envelope of a viras Amphotropic MLV coding for the regions of the env polyprotein situated on the one hand between amino acids No. 1 and 31 of the sequence SEQ ID3 and on the other hand between amino acids No. 645 and 676 of the sequence SEQ ID3.
  • the invention relates to a plasmid comprising the viral genome corresponding to the nucleotide sequence SEQ ID 4 or a sequence having at least 80%, preferably 85%, advantageously 90% of homology with the sequence SEQ ID 4.
  • such a plasmid is obtained from the plasmid pAM comprising the gag and pol genes as well as an amphotropic envelope and from a part of a plasmid comprising the GaLV envelope and corresponds to the nucleotide sequence SEQ ID5.
  • the plasmids covered by the invention can be obtained by all the usual techniques of molecular biology such as enzymatic digestions, PCR (Polymerase Chain Reaction), ligations, amplification, cloning, etc.
  • the invention also relates to a bacterium producing the chimeric plasmid of the invention, in particular a plasmid comprising the viral genome corresponding to the nucleotide sequence SEQ ID 4 previously described, more particularly the plasmid corresponding to the nucleotide sequence SEQ ID 5.
  • a advantageous bacteria corresponds to E. coli DH10B.
  • the viral genome contained in the chimeric plasmid of the invention can be expressed in any suitable cell line such as for example, and without limitation, human or monkey, rat, hamster, chicken cells and particularly the lines. fibroblasts.
  • the invention also relates to a virion produced by one of the cell lines described above.
  • the invention relates to a virion containing the viral genome corresponding to the nucleotide sequence SEQ ID 4 or a sequence having at least 60%, preferably at least 70%, advantageously at least 80%, or even 85 or 90% of homology with the sequence SEQ ID 4.
  • the retrovirus thus produced finds particular application as a positive control in any test intended to detect RCR or other types of non-replicative recombinants in preparations of retroviral vectors of the MLV GaLV type.
  • these tests required by the FDA aim to test not only the supernatant containing the retroviral vector produced by the cell line, but also the cell line itself and the patients treated with the gene therapy vectors considered.
  • the detection of RCRs must be preceded by a step of amplification of any RCRs present in the sample to be tested. If the sample considered is a supernatant, its amplification is carried out by bringing it into contact with a cell line permissive to the GaLV envelope. If the sample considered is the vector producing line, its amplification is carried out by co-cultivating it with the permissive line.
  • the FDA requires that a test using a positive control be carried out in parallel, the virus produced by the cell line expressing the plasmid which is the subject of the invention.
  • Different types of methods, applying this protocol are known under the names XC (7), PG4 S + L " (8), PCR or mobilization test.
  • the mobilization test is the preferred test among the aforementioned tests.
  • the invention relates to a mobilization test intended to detect
  • RCR in preparations of retroviral vectors of the MLV GaLV type, which consists: first of all in infecting or co-cultivating a permissive cell line with the GaLV envelope with respectively the retroviral vector or the producing line to be tested, said permissive line containing a mobilization vector itself comprising a gene for resistance to a given antibiotic, then recovering the culture supernatant or co-culture for transferring it to indicator cells, also permissive to the GaLV envelope and treated with said antibiotic, to seek possible resistance of the indicator cells to the antibiotic, the resistance to the antibiotic revealing the presence of CPR in the sample tested, to conduct in parallel the same test with the positive control ' corresponding to the virion of the invention .
  • the expression mobilization vector designates a vector including in particular the LTR and the ⁇ sequence of MLV as well as a gene for resistance to an antibiotic.
  • the mobilization tests are carried out on permissive cells, human fibroblasts for example (HT1080 or HCT116 in particular) containing the mobilization vector providing resistance to hygromycin B.
  • the invention also relates to a kit for implementing the mobilization test which contains: the virion of the invention as described above, a cell line permissive to the GaLV envelope, in particular the above-mentioned lines, the reagents required.
  • Figure 1 shows the restriction map of plasmid pAMS
  • Figure 2 shows the restriction map of plasmid phCIv ⁇ V GaLN
  • Figure 3 shows the restriction map of plasmid pRCR-GaLN-1
  • Figure 4 shows the restriction map of plasmid pRCR- GaLN-2 (plasmid of the invention)
  • This example reflects a possible embodiment of the construction of the plasmid of the invention (pRCR-GaLV-2) whose sequence coixesponds to the sequence SEQ ID 5.
  • the first step consists in constructing a first plasmid called pRCR-GaLV-1 resulting from the ligation of 3 fragments, respectively: a first Cla I - Sal I fragment of 7392 bp, located between nucleotides 8232 and 4296 of pAMS (FIG. 1) and therefore containing the gag genes and part of the pol gene of an MLN virus strain Moloney (paragraph 1-1 ci after). - a second free end fragment - Cla I of 1810 bp, located between nucleotides 2499 and 4309 of the plasmid phCMN-GaLN (FIG.
  • the digestion of the plasmid pAMS (FIG. 1) with the enzymes Cla I and Sal I generates 3 fragments of 1275, 2661 and 7392 bp.
  • This digestion is carried out in 2 stages: a first digestion of 15 ⁇ g of plasmid per 100 units of the enzyme Sal I followed by precipitation of the digested AD ⁇ and a second digestion with 80 units of the enzyme Cla I
  • the recovery of the 7392 bp fragment is carried out as follows: after migration of the product of the double enzymatic digestion in a 0.8% agarose gel, the piece of gel containing the 7392 bp fragment is cut out with a scalpel then its DNA is extracted by filtration at 0.2 ⁇ m.
  • a filter (Acrodisc 0.2 ⁇ m, Ref. 4192, Gelman Sciences) is placed at the end of a 5 ml syringe before being moistened with 200 ⁇ l of TE 0J X.
  • the piece of agarose is then passed through the filter and the filter is rinsed with 400 ⁇ l of 0.1 X TE.
  • the DNA collected is precipitated with isopropanol and rinsed with 70% ethanol.
  • a PCR is carried out on the plasmid phCMV-GaLV (FIG. 2) whose sequence corresponds to the sequence SEQ ID 6 using the ohgonucleotides 1 (SEQ ID 7) and 2 (SEQ ID 8).
  • SEQ ID 8 CAGCCCATGACCCTCACTTGG (21 sea)
  • the amplification is carried out with 40 ng of plasmid, 1.25 units of the pfu Turbo polymerase (Stratagene, Ref. 600250), 0.2 mM of dNTP, 0.5 ⁇ M of each oligonucleotide in a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions are as follows: 5 min at 91 ° C + 30 * (1 min at 91 ° C + 45 sec at 71.6 ° C + 2 min at 72 ° C) + 10 min at 72 ° C.
  • PCR is carried out with the Mastercycler gradient (Eppendorf).
  • the PCR product is digested with 100 units of the enzyme Cla I. This digestion is deposited in a 0.8% agorose gel and the gel piece containing the digested PCR fragment (1810 bp) is recovered.
  • the DNA is extracted from the agarose gel according to the method described at the end of paragraph 1-1. 1-3- Production of the free end fragment - Sal I of 2162 bp from the plasmid pAMS.
  • a PCR is carried out on the Xho I - Xho I fragment (4773 bp) of the plasmid pAMS using the ohgonucleotides 3 (SEQ ID 9) and 4 (SEQ ID 10).
  • Amplification is carried out with 20 ng of the digested plasmid, 1.25 units of the pfu Turbo polymerase (Stratagene, Ref. 600250), 0.2 mM of dNTP, 0.5 ⁇ M of each oligonucleotide in a final volume of 50 ⁇ l .
  • the amplification conditions are as follows: 5 min at 91 ° C + 30 * (1 min at 91 ° C + 45 sec at 60, 1 ° C + 2 min at 72 ° C) + 10 min at 72 ° C.
  • PCR is carried out with the Mastercycler gradient (Eppendorf).
  • the PCR product is digested with 80 units of the enzyme Sal I. This digestion is deposited in a 0.8% agorose gel and the piece of gel containing the digested PCR fragment (2162 bp) is recovered.
  • the DNA is extracted from the agarose gel according to the method described at the end of paragraph 1-1. 1-4- Ligation of the 3 fragments (Cla I - Sal I of 7392 bp + free end - Cla I of 1810 bp + free end - Sal I of 2162 bp) and production of the plasmid pRCR-GaLV-
  • the 3 fragments to be assembled are quantified using Bio Rad software (Bio
  • the ligation is carried out with a proportion of 1/6 of the fragment of 7392 bp (which contains the plasmid vector) and an equivalent proportion of each of the 2 other fragments.
  • the ligation is carried out with 40 units of T4 DNA ligase (Biolabs, Ref. 202S); it is used to transform E. coli DH10B bacteria (Life Technology, Ref. 182979-010) which are spread on a box of LB supplemented with ampicillin (the plasmid vector contained in the fragment of 7392 bp indeed contains a gene resistance to ampicillin).
  • the dish After a night at 37 ° C., the dish has 7 colonies which are used to produce the 7 corresponding minipreps. These minipreps are analyzed by enzyme restriction. A single clone exhibits the expected profile, it is named pRCR-GaLV-1 (FIG. 3) and corresponds to the sequence SEQ ID 11.
  • pRCR-GaLV-1 the pAMS gag gene from MLV viras located between nucleotides 1212 and 2828, the pAMS pol gene from MLV virus located between nucleotides 2829 and 6428, a first part of the amphotropic envelope of pAMS from MLV virus located between nucleotides 6368 and 6457, part of the GaLV envelope located between nucleotides 6458 and 8269 and a second part of the amphotropic envelope of pAMS located between nucleotides 8270 and 8332.
  • the tests carried out with the plasmid pRCR-GaLV-1 have shown that it corresponds to a viral genome giving rise to functional Gag and Pol proteins and to a nonfunctional viral envelope.
  • a small region additional GaLN envelope is added to pRCR-GaLN-1 to construct pRCR-GaLN-2.
  • a PCR is carried out on the plasmid pRCR-GaLN-1 using the ohgonucleotides 5 (SEQ ID 12), 6 (SEQ ID 13), 7 (SEQ ID 14) and 8 (SEQ ID 15).
  • amplification is carried out with 40 ng of the plasmid, 1 unit of the DyNazyme polymerase (Ozyme, Ref. F505L), 0.2 mM of dNTP, 0.5 ⁇ M of each oligonucleotide, 4% of DMSO in a final volume of 50 .mu.l.
  • the amplification conditions are as follows: 5 min at 91 ° C + 35 * (1 min at 91 ° C + 45 sec at 60.7 ° C + 1 min 30 sec at 72 ° C) + 10 min at 72 ° vs.
  • PCR is carried out with the Mastercycler gradient (Eppendorf). An aliquot of the PCR product is deposited on a 1.5% agarose gel, several bands appear having approximately the following sizes: 1.6, 1J and 0.6 kb. The rest of the PCR product is digested for 2 hours at 37 ° C. with 20 units of Dpn I (Ozyme, Ref. R0176L) to remove any traces of matrix. The product of this digestion is deposited in a 1.0% agarose gel and after migration, the bands of 1J and 0.6 kb are cut and extracted according to the method described at the end of paragraph 1-1.
  • Dpn I Ozyme, Ref. R0176L
  • Amplification is carried out with 50 ng of the 0.6 kb fragment and 50 ng of the 1J kb fragment, 1 unit of the DyNazyme polymerase (Ozyme, Ref. F505L), 0.2 mM of dNTP, 0.5 ⁇ M of each oligonucleotide , 4% DMSO in a final volume of 50 ⁇ l.
  • the amplification conditions are as follows: 4 min at 94 ° C + 35 * (1 min at 94 ° C + 45 sec at 57.8 ° C + 1 min 30 sec at 72 ° C) + 10 min at 72 ° vs. PCR is carried out with the Mastercycler gradient (Eppendorf).
  • Digestion of the plasmid pRCR-GaLV-1 with the enzyme Nco I generates 2 fragments of 1405 and 9959 bp. This digestion is carried out with 10 ⁇ g of plasmid per 40 units of the Nco I enzyme. After migration of the product of the enzymatic digestion in a 0.8% agarose gel, the piece of gel containing the fragment of 9959 bp is cut with a scalpel then its DNA is extracted according to the method described at the end of paragraph I-1.
  • the 2 fragments to be assembled are quantified with the PicoGreen kit
  • the ligation product is used to transfer E. coli DH10B bacteria (Life Teclmology, Ref. 182979-010) which are spread on a box of LB supplemented with ampicillin (the plasmid vector contained in the 9959 bp fragment indeed contains an ampicillin resistance gene). After one night at 37 ° C., the dish presents several tens of colonies which are analyzed by PCR. Of the 80 colonies analyzed, 56 carry the insert. Three positive colonies are selected for the continuation of the experiments, the corresponding plasmids are named: pRCR-GaLV-2-Cl, pRCR-GaLV-2-Dl and pRCR-GaLN-2-Hl.
  • Human cell lines 293 and HT1080 are transfected with the plasmids pRCR-GaLN-2-Cl, pRCR-GaLN-2-Dl and pRCR-GaLV-2-Hl. These cells are cultured in DMEM (Gibco BRL, Ref. 31966-021) containing 10% fetal calf serum (Hyclone, Ref. SH 30071.03) and 1% penicillin / streptomycin (Gibco BRL, Ref. 15070-063) . The cells are seeded the day before transfection into 6-well plates at the rate of 6 ⁇ 5 5 cells / well for 293 cells and 3 ⁇ 5 5 cells / well for HT 1080 cells.
  • transfections are carried out with calcium phosphate with 4.2 ⁇ g of plasmid / well. Subsequently, human HCT116 cells were also used to produce the viral supernatant corresponding to the plasmid pRCR-GaLN-2.
  • the transfected cells are maintained in culture and the reverse transcriptase (enzyme produced by retroviruses; detection of this enzyme makes it possible to demonstrate the presence of retroviruses) is sought in their supernatant 3 weeks after transfection.
  • the supernatant intended for the measurement of reverse transcriptase is filtered at 0.45 ⁇ m (Sartorius, Ref. 16555) and stored at -20 ° C.
  • the measurement of reverse transcriptase activity is carried out with the following mix: Tris 50 mM pH 7.8; 7.5 mM KCl; 5 ⁇ g / ml polyA; 1.57 mg / ml oligodT; 0.05% ⁇ P40. Just before use, this mix is added with 5 mM MnCl 2 and 1 ml dTTP 32 / ml of mix. This final mix is distributed in the wells of a 96-well plate at a rate of 25 ⁇ l / well. To each well are added 5 ⁇ l of each of the supernatants to be tested. The plate is then incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the mobilization line HT1080-pLHL was constituted by infection of HT1080 cells with the supernatant of an amphotropic packaging line transfected with the mobilization vector pLHL (10) then selection of the cells with rhygromycin B (Gibco BRL, Ref. 10687- 010) then cloning.
  • HT1080-pLHL cells are seeded in 12-well plates at the rate of 6 ⁇ 4 4 cells / well. The following day these cells are infected, in the presence of 8 ⁇ g / ml of bromide hexadimethrine (Sigma, Ref. H-9268), with serial dilutions of the positive RCR-amphotropic control (ATCC, Ref. VR-1450) or serial dilutions of the supernatant formed following the transfection of 293 cells with the plasmid pRCR-GaLV-2-Cl (see above).
  • the dilution range of the RCR-amphotropic control is from 2J0 4 RCR / well to 2 RCR well.
  • the same dilutions are made for the RCR-GaLV control, which will make it possible to compare its titer with that of the RCR-amphotropic control.
  • the day after infection the supernatant from each well is removed and replaced with new culture medium.
  • human indicator cells, HCT116, and murine, Mus dunni are seeded in 12-well plates at the rate of 5J0 and 5J0 3 cells / well respectively.
  • the supernatant of these cells is removed, filtered 0.45 ⁇ m and used to infect the indicator cells in the presence of 8 ⁇ g / ml of hexadimethrine bromide (Sigma, Ref. H- 9268).
  • the last dilution of the positive control RCR-GaLV-2-Cl giving cells resistant to hygromycin B is the same as the last dilution of the positive RCR-amphotropic control dominating cells resistant to hygromycin B.
  • this dilution corresponds to 1 RCR.
  • the title of the control RCR-GaLV-2-Cl would be comparable to that of the control RCR-amphotropic, (title of the latter control 3JU0 6 infectious particles per ml).
  • This observation is correlated with the titer measured by quantitative RCR TAQMAN which shows that the positive control RCR-GaLV2 comprises approximately 2J0 E 6 infectious particles per ml.
  • the control RCR-GaLV-2-Cl is capable of mobilizing the vector pLHL (since colonies resistant to hygromycin B are obtained on the indicator cells HCT 116).
  • the RCR-GaLV-2-Cl witness would not have a replication problem, since its title is comparable to that of the RCR-amphotropic witness manufactured by ATCC (according to comparison of the last dilution of each of the witnesses giving a positive result when the mobilization test is revealed on HCT116 indicator cells).
  • the control RCR-GaLV-2-Cl would have the same tropism (specificity of infection) as the GaLV envelope, indeed this envelope allows the infection of human cells (example HCT116) but not, or much less, the infection of mouse cells (example AS dunni).

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Abstract

Plasmide comprenant un génome rétroviral réplicatif caractérisé en ce qu'il contient : une séquence psi ( DOLLAR G(C)), des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV.

Description

PLASMIDE CHIMERE COMPRENANT UN GENOME RETROVIRAL REPLICATIF ET UTILISATIONS
L'invention concerne un plasmide chimère comprenant un génome retroviral réplicatif contenant des séquences nucleotidiques gag, pol et env provenant -de rétrovirus d'espèces distinctes. Elle se rapporte également à un rétrovirus de type MLV (Murine Leukemia Virus) et de type GaLV (Gibbon Ape
Leukemia Virus) produit par une lignée cellulaire exprimant ledit plasmide. Elle concerne aussi une bactérie productrice du plasmide. Elle a par ailleurs pour objet un virion contenant un génome retroviral réplicatif provenant de rétrovirus d'espèces distinctes. L'invention a également pour objet l'utilisation du virion comme témoin positif dans un test destiné à détecter la capacité réplicative d'un vecteur retroviral du type MLV GaLV, en particulier un test de mobilisation.
L'invention concerne enfin un kit pour la mise en œuvre dudit test.
La thérapie génique a pour principal objectif d'introduire in vitro, in vivo ou ex vivo, un gène d'intérêt dans des cellules pour produire par exemple une protéine ou un peptide recombinant. L'introduction du gène d'intérêt dans la cellule est effectuée par le biais de vecteurs soit viraux (en pratique, AAV, adéno virus ou rétrovirus...), soit synthétiques (en particulier, lipide synthétique...) dans la structure desquels est inséré le gène d'intérêt. La présente invention relève exclusivement du domaine de la thérapie génique mettant en œuvre des vecteurs rétroviraux.
' Tous les génomes rétroviraux possèdent la même structure de base, dont notamment les gènes gag, pol et env. Le gène gag code pour les protéines de structure (capside, matrice et nucléocapside), le gène pol code pour les fonctions enzymatiques, tandis que le gène env code pour les protéines d'enveloppe. Chaque extrémité du génome présente de longues répétitions terminales (LTR, Long Terminal Repeat) contribuant à la réplication, à l'intégration dans la cellule et à l'expression du génome viral, de même qu'une séquence ψ (PSI) responsable de l'encapsidation du génome retroviral dans l'enveloppe protéique.
L'une des conditions incontournables pour qu'un vecteur retroviral puisse être utilisé en thérapie génique est qu'il ne présente aucune capacité à se répliquer. En effet, des rétrovirus compétents pour la réplication (RCR) peuvent induire une invasion massive de l'organisme et consécutivement diverses pathologies. Les travaux de Donahue (1) ont montré que des RCR qui avaient été générés au cours de la production de vecteurs rétroviraux induisaient des leucémies chez les singes rhésus immunodéprimés.
La lere génération de vecteurs rétroviraux dérivés de MLV était constituée de la façon suivante : le gène à introduire dans les cellules cibles était placé dans un vecteur de transfert comprenant notamment les LTR (Long Terminal Repeat) et la séquence ψ du virus MLV. Ce vecteur était introduit dans une cellule dite « packaging » exprimant, à partir d'une seule construction moléculaire dans laquelle la séquence ψ avait été délétée, les gènes gag, pol et env de MLV. Un certain nombre de lignées packaging sur ce modèle ont été proposées telles que par exemple les lignées ψ 2, ψ-Am et PA 12. Cependant, il a été montré que des RCR pouvaient être générés dans de telles lignées packaging suite à des recombinaisons entre le vecteur de transfert (contenant le gène d'intérêt) et les séquences virales de la lignée packaging (construction moléculaire permettant l'expression des gènes viraux gag, pol et env) (2).
D'autres modèles de lignées packaging MLV ont été proposés dans lesquels, outre l'absence du signal d'encapsidation ψ, les LTR étaient délétées partiellement ou totalement. Ces délétions supplémentaires avaient pour objectif de diminuer la probabilité de reconstitution, par recombinaisons, d'un génome retroviral capable de produire des RCR. De telles lignées correspondent par exemple à la lignée PA 317. Toutefois il a été montré que ces lignées étaient, comme les précédentes, susceptibles de générer des RCR (3).
Pour diminuer la probabilité des recombinaisons pouvant se produire entre le vecteur de transfert et le vecteur de la lignée packaging de nouvelles modifications ont été apportées dans la production des vecteurs MLV. Les séquences virales de la lignée packaging ont été placées sur 2 vecteurs distincts au lieu d'un seul (des recombinaisons supplémentaires étaient alors nécessaires pour que des RCR émergent). En pratique, la modification majeure apportée par rapport aux lignées packaging de type PA 317 est la suivante : les gènes gag et pol sont apportés par un premier plasmide et le gène env par un second plasmide. De telles lignées correspondent par exemple à la lignée GP + Env Aml2 (4).
Compte tenu du risque subsistant de recombinaisons entre les séquences virales des lignées packaging et les vecteurs de transfert rétroviraux et des conséquences possibles de telles recombinaisons, la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLV a été rendue obligatoire par la FDA (Food and Drug Administration) pour les lots de vecteurs MLV destinés à des essais cliniques (5). Les tests requis par la FDA doivent être réalisés sur les cellules productrices de vecteurs, sur leur surnageant ainsi que sur les patients qui ont subi la thérapie génique.
Différentes méthodes peuvent être mises en œuvre pour la détection des RCR. La plus utilisée pour tester les cellules productrices de vecteurs et les surnageants viraux est un test de mobilisation. Ce test consiste à incuber l'échantillon à tester avec une lignée de mobilisation qui est permissive à l'infection par le vecteur produit par les cellules ou contenu dans le surnageant. La lignée de mobilisation porte un vecteur comprenant notamment les LTR et la séquence Ψ de MLV ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique. Ce vecteur de mobilisation est une sorte de leurre. Lorsque les cellules de mobilisation sont infectées par des RCR, ceux-ci fournissent les protéines virales nécessaires à la production de particules infectieuses et ces particules intègrent indifféremment leur propre génome ou le vecteur de mobilisation. Le surnageant des cellules de mobilisation est ensuite transféré sur des cellules indicatrices qui sont traitées avec l'antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le vecteur de mobilisation. L'existence de cellules indicatrices résistantes à l'antibiotique indique la présence de RCR dans le surnageant ou les cellules productrices testés.
Le document MILLER (6) décrit un plasmide dénommé « pAM » dont le produit d'expression (le virus) est utilisé comme témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV amphotrope. Ce virus peut être utilisé comme témoin parce qu'il est semblable aux RCR qui peuvent être générés dans les préparations de vecteurs MLV amphotropes. L'utilisation de ce témoin positif est aujourd'hui rendue obligatoire par la FDA. Il est commercialisé par l'ATCC (American Type Culture Collection) sous la forme d'un surnageant viral (ref VR-1450) et sous la fonne d'une lignée cellulaire NIH3T3 produisant ce virus (ref VR-1448). Le plasmide pAM a été obtenu en remplaçant le gène env écotrope du MLV Moloney par le gène env amphotrope du MLV 4070A. La séquence du pAM est répertoriée dans GENBANK sous le numéro d'accession AF 010170. Cette séquence comprend notamment un vecteur de clonage, pBR322, et le génome du virus composé de la façon suivante : LTR 5' (bases 145 à 736), gène gag (bases 1212 à 2828), gène pol (bases 2829 à 6428), gène env (bases 6368 à 8332) et LTR 3' (bases 8374 à 8967).
La construction moléculaire de pAM était relativement aisée du fait des fortes homologies de séquence et de fonction des génomes des deux MLV utilisés pour réaliser cette construction. En effet, grâce à la présence de sites de restriction alléliques (mêmes sites de restriction aux mêmes endroits des 2 génomes considérés), cette construction a été réalisée par une simple digestion enzymatique du plasmide receveur et du plasmide donneur suivi de la ligation des 2 fragments à associer. Les vecteurs rétroviraux dérivés de MLV les plus utilisés sont ceux qui portent une enveloppe permettant l' infection des cellules humaines, par exemple une enveloppe amphotrope (issue du virus de souris MLV) ou une enveloppe GaLV (issue d'un virus de singe). L'utilisation d'une enveloppe GaLV plutôt que d'une enveloppe amphotrope présente différents avantages. D'une part, l'enveloppe GaLV permet l'infection de plus de types cellulaires humains que l'enveloppe amphotrope (7). D'autre part, l'utilisation de vecteurs portant des gènes de structures et un gène d'enveloppe issus d'espèce différentes, comme c'est le cas pour les vecteurs MLV-GaLV, diminue la probabilité de reconstitution, suite à des recombinaisons, d'un génome viral fonctiomiel capable de produire des RCR.
Alors que le témoin positif pour la recherche des RCR dans les préparations de vecteurs MLV amphotropes est disponible depuis 1985 (6), aucun témoin positif semblable aux RCR qui peuvent être générés dans les préparations de vecteurs MLN GaLV n'est actuellement disponible.
Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc de développer un témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLV GaLV.
Pour ce faire, l'invention propose tout d'abord un plasmide comprenant un génome retroviral réplicatif.
Ce plasmide se caractérise en ce qu'il contient : une séquence ψ, des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV. Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression « génome retroviral réplicatif», on désigne un génome composé de tous les éléments nécessaires à la production de particules virales compétentes pour la réplication, en particulier, une séquence psi, au moins une séquence LTR, les gènes gag, pol et env et plus généralement tous les gènes présents dans le virus MLV sauvage.
En d'autres termes, l'invention consiste à avoir construit un plasmide unique portant des génomes rétroviraux d'origines distinctes, autrement dit d'espèces différentes. Le plasmide est construit en juxtaposant trois séquences rétrovirales, respectivement une première région comprenant les gènes gag et pol d'un virus MLV, mie seconde région comprenant une partie de l'enveloppe d'un virus MLV, et une troisième région comprenant une partie de l'enveloppe d'un virus GaLV.
Le document COSSET WO 00/71578 décrit la construction de vecteurs rétroviraux contenant une enveloppe provenant d'un virus MLV dans laquelle le récepteur liant (RBD) est remplacé par un anticoφs spécifique. Le caractère chimérique de l'enveloppe ne provient donc pas de l'association de deux enveloppes virales d'espèces différentes, mais de la substitution d'une partie d'enveloppe virale donnée (MLV) par une molécule synthétique, en l'espèce im anticorps spécifique.
Le document CFLRISTODOULOPOULOS (11) décrit une méthode de préparation de vecteurs rétroviraux dont le génome est constitué des gènes gag et pol de MLV et d'une enveloppe chimère résultant de l'association d'une partie d'enveloppe provenant de MLV et d'une partie d'enveloppe provenant de GaLV. Le document LANDAU (12) décrit un procédé de production de virus MLV munis d'une enveloppe MLV ou RSV. En d'autres termes, l'enveloppe n'est pas une chimère résultant de l'association de deux parties d'enveloppes virales d'espèces différentes.
Les procédés décrits dans les trois documents qui précèdent ne peuvent conduire à obtenir des particules virales réplicatives. En effet, aucun des deux plasmides gag-pol ou env ne contient de séquence ψ indispensable à l'empaquetage du génome. Dès lors, les plasmides distincts gag-pol et env sont seulement aptes à produire les protéines codées par les gènes gag, pol et env dans les cellules transfectées. Les particules pourront infecter les cellules cibles, mais ces dernières ne comportant pas les gènes gag, pol et env, ne pourront pas produire à leur tour des particules virales.
Par ailleurs, les gènes gag-pol et env étant portés par des plasmides différents, cela implique que pour être réplicatifs, les virions emportent au moins deux génomes distincts (correspondant aux deux plasmides), phénomène improbable.
La difficulté de l'invention était donc de préparer un plasmide unique portant un génome retroviral réplicatif complet en partant d'un génome entier dans lequel on subtitue un gène issu d'une autre espèce apportant ime fonction analogue.
' Selon l'invention, l'enveloppe MLV utilisée peut présenter différents tropismes, en particulier, xénotrope, écotrope, polytrope, 10A1, avantageusement amphotrope.
Selon une première caractéristique de l'invention, la séquence gag code pour la polyprotéine gag correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 1, ou une séquence présentant au moins 70%, avantageusement au moins 80% d'homologie avec la séquence SEQ ID 1.
Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression "séquence présentant un certain pourcentage d'homologie avec une séquence donnée », on désigne une séquence d'acides aminés ou de nucléotides identique avec la séquence donnée à la hauteur dudit pourcentage. L'identité ou homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de la séquence , par exemple Pairwise BLAST, NCBI.
Le pourcentage d'homologie avec la séquence SEQ ID 1 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence gag du plasmide pAMS avec ceux de la séquence gag de différentes souches de viras de type MLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.
De même et selon une autre caractéristique de l'invention, la séquence pol code pour les enzymes virales correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 2, ou une séquence présentant au moins 80%, de préférence au moins 85% avantageusement au moins 90% d'homologie avec la séquence SEQ ID 2.
Le pourcentage d'homologie avec la séquence SEQ ID 2 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence pol du plasmide pAMS avec ceux de la séquence pol de différentes souches de viras de type MLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.
Comme déjà dit, les séquences gag et pol proviennent du génome d'un virus
MLV. En pratique, on utilise la souche Moloney bien que d'autres souches puissent être utilisées du fait de la forte homologie des gènes gag et pol entre les différentes souches connues, comme démontré ci-avant.
Selon une autre caractéristique du plasmide de l'invention, la séquence env est une séquence chimère provenant pour partie de l'enveloppe d'un virus MLV et pour partie de l'enveloppe d'un viras GaLV. En pratique, la partie de l'enveloppe du virus GaLV, clonée dans le plasmide, comprend au minimum la région qui a pour fonction de définir la spécificité d'infection ou le tropisme de l'enveloppe virale. En particulier, la partie de l'enveloppe du viras GaLV code pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 (ci-après dénommé "domaine ID3-GaLV") de la séquence SEQ ID 3, c'est-à-dire chevauchant les sous-unités SU et TM de la protéine d'enveloppe ou une séquence présentant au moins 70%, de préférence au moins 75%, avantageusement au moins 80% d'homologie avec le domaine LD3-GaLV.
Le pourcentage d'homologie avec le domaine ID3-GaLV a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence env d'un virus GaLV, souche SEATO avec ceux de la séquence env de différentes souches de virus de type GaLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.
Dans un exemple avantageux de réalisation du plasmide de l'invention, le fragment d'enveloppe GaLV provient de la souche SEATO (GENBANK, ref M26927) .
Selon une autre caractéristique du plasmide de l'invention, la séquence env chimère comprend une région correspondant à une partie de l'enveloppe d'un viras MLV présentant un tropisme au choix, amphotrope, xénotrope, écotrope, polytropes ou 10A1. Dans un mode de réalisation avantageux, le virus MLV présente un tropisme amphotrope. En pratique, la partie d'enveloppe du virus amphotrope clonée dans le plasmide est celle qui est nécessaire pour permettre, en association avec la région de l'enveloppe GaLV substituée, l'obtention de particules virales infectieuses et donc la conformation d'une enveloppe virale fonctionnelle. Aucune région spécifique de l'enveloppe amphotrope ne serait donc requise dans le cas où la sribstitution de l'enveloppe GaLV entière donnerait lieu à
'la production de particules virales réplicatives, ce qui n'est pas le cas d'après les expériences de complémentation conduites par le Demandeur.
Dans un mode de réalisation avantageux, la partie de l'enveloppe du virus MLV amphotrope code pour les régions de la polyprotéine Env situées d'une part entre les acides aminés No. 1 et 31 « domaine ID 3-ampho-l » et d'autre part entre les acides aminés No. 645 et 676 « domaine ID 3-ampho-2 ») de la séquence SEQ ID 3, c'est-à-dire respectivement au début de la sous-unité SU et à la fin de la sous-unité TM de la protéine d'enveloppe ou une séquence présentant au moins 70%, de préférence au moins 80% avantageusement au moins 85% d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-l et ID 3-ampho-2.
Le pourcentage d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-l et ID 3- ampho-2 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence env d'un virus MLV amphotrope, souche 4070A avec ceux de la séquence env de différentes souches de viras de type MLV amphotrope. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.
Dans un exemple avantageux de réalisation du plasmide de l'invention, le fragment d'enveloppe amphotrope provient de la souche 4070 A.
L'invention concerne également une séquence env chimère codant pour la protéine env correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ LO 3 ou une séquence présentant au moins au moins 95 %, avantageusement 98 % d'homologie avec la séquence SEQ ID3. Cette séquence env chimère contient une partie d'enveloppe d'un virus GaLV codant pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 de la SEQ ID3 et une partie de l'enveloppe d'un viras MLV amphotrope codant pour les régions de la polyprotéine env située d'une part entre les acides aminés No. 1 et 31 de la séquence SEQ ID3 et d'autre part entre les acides aminés No. 645 et 676 de la séquence SEQ ID3.
Comme il ressort de ce qui précède, le Demandeur a constaté que pour construire un plasmide RCR du type MLV GaLV, la simple substitution du gène env d'un plasmide MLV amphotrope par le gène env d'un plasmide GaLV, ne donnait pas lieu à la production de particules virales réplicatives (des expériences de complémentation ont permis de montrer que ce défaut provenait de l'absence de fonctionnalité de l'enveloppe virale). Au vu de ces observations, il n'était pas évident, non seulement de proposer une séquence chimère associant avantageusement une enveloppe amphotrope avec une enveloppe GaLV, mais au surplus de sélectionner la partie amphotrope et la partie GaLV nécessaires à la réalisation d'un plasmide codant pour un virus réplicatif ayant la même spécificité d'infection que l'enveloppe GaLV.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un plasmide comprenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 85 %, avantageusement 90 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.
Dans un mode de réalisation particulier, un tel plasmide est obtenu à partir du plasmide pAM comprenant les gènes gag et pol ainsi qu'une enveloppe amphotrope et d'une partie d'un plasmide comprenant l'enveloppe GaLV et correspond à la séquence nucléotidique SEQ ID5.
Bien entendu, et de manière générale, les plasmides couverts par l'invention peuvent être obtenus par toutes les techniques usuelles de biologie moléculaire telle que digestions enzymatiques, PCR (Polymerase Chain Reaction), ligations, amplification, clonage, etc.. L'invention concerne également une bactérie productrice du plasmide chimère de l'invention, notamment d'un plasmide comprenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 précédemment décrite, plus particulièrement le plasmide correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 5. Une bactérie avantageuse correspond à E. coli DH10B.
Le génome viral contenu dans le plasmide chimère de l'invention peut être exprimé dans toute lignée cellulaire adéquate telle que par exemple, et de manière non limitative, les cellules humaines ou de singe, de rat, de hamster, de poulet et particulièrement les lignées de fibroblastes.
L'invention concerne également un virion produit par une des lignées cellulaires précédemment décrites.
Plus particulièrement, l'invention concerne un virion contenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 %, de préférence au moins 70 %, avantageusement au moins 80 %, voire 85 ou 90 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.
Le rétrovirus ainsi produit trouve une application particulière comme témoin positif dans tout test destiné à détecter des RCR ou d'autres types de recombinants non réplicatifs dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV.
Comme déjà dit, ces tests requis par la FDA visent à tester non seulement le surnageant contenant le vecteur retroviral produit par la lignée cellulaire, mais également la lignée cellulaire elle-même et les patients traités avec les vecteurs de thérapie génique considérés. Dans les deux premiers cas, la détection des RCR doit être précédée par une étape d'amplification des éventuels RCR présents dans l'échantillon à tester. Si l'échantillon considéré est un surnageant, son amplification est réalisée en le mettant en contact avec une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV. Si l'échantillon considéré est la lignée productrice de vecteurs, son amplification est réalisée en la co-cultivant avec la lignée permissive. La FDA requiert de conduire en parallèle un test mettant en œuvre un témoin positif en l'espèce, le virus produit par la lignée cellulaire exprimant le plasmide objet de l'invention. Différents types de méthodes, mettant en application ce protocole sont connues sous les dénominations XC (7), PG4 S+ L"(8), PCR ou encore test de mobilisation. Le test de mobilisation est le test préféré parmi les tests précités.
Aussi, l'invention concerne un test de mobilisation destiné à détecter des
RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV, et qui consiste : tout d'abord à infecter ou co-cultiver une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV avec respectivement le vecteur retroviral ou la lignée productrice à tester, ladite lignée permissive contenant un vecteur de mobilisation comprenant lui même un gène de résistance à un antibiotique donné, puis à récupérer le surnageant de la culture ou co-culture pour le transférer sur des cellules indicatrices, également permissive à l'enveloppe GaLV et traitées par ledit antibiotique, à rechercher l'éventuelle résistance des cellules indicatrices à l'antibiotique, la résistance à l'antibiotique révélant la présence de RCR dans l'échantillon testé, à conduire en parallèle le même test avec le témoin positif ' correspondant au virion de l'invention.
En effet chaque échantillon doit être testé d'une part seul et d'autre part additionné du témoin positif pour vérifier que l'échantillon n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la détection des RCR. Dans la suite de la description et dans les revendications, l'expression vecteur de mobilisation désigne un vecteur comprenant notamment les LTR et la séquence Ψ de MLV ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique.
En pratique, les tests de mobilisation sont conduits sur des cellules permissives, des fîbroblastes humains par exemple (HT1080 ou HCT116 notamment) contenant le vecteur de mobilisation apportant la résistance à l'hygromycine B.
L'invention concerne également un kit pour la mise en œuvre du test de mobilisation qui contient : le virion de l'invention tel que décrit ci-avant, une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV, en particulier les lignées précitées, les réactifs nécessaires.
La figure 1 représente la carte de restriction du plasmide pAMS La figure 2 représente la carte de restriction du plasmide phCIvïV GaLN La figure 3 représente la carte de restriction du plasmide pRCR-GaLN-1 La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide pRCR-GaLN-2 (plasmide de l'invention)
A/Construction du plasmide de Pinvention
Cet exemple reflète un mode de réalisation possible de la construction du plasmide de l'invention (pRCR-GaLV-2) dont la séquence coixespond à la séquence SEQ ID 5.
1/ Etape 1 de la construction :
Pour l'essentiel, la première étape consiste à construire un premier plasmide dénommé pRCR-GaLV-1 résultant de la ligation de 3 fragments, respectivement : un premier fragment Cla I - Sal I de 7392 pb, situé entre les nucléotides 8232 et 4296 de pAMS (figure 1) et contenant donc les gènes gag et une partie du gène pol d'un virus MLN souche Moloney (paragraphe 1-1 ci après) .; - un second fragment bout franc - Cla I de 1810 pb, situé entre les nucléotides 2499 et 4309 du plasmide phCMN-GaLN (figure 2) et contenant une partie du gène env d'un viras GaLN souche SEATO (paragraphe 1-2 ci après) ; un troisième fragment bout franc - Sal I de 2162 pb, situé entre les nucléotides 4296 et 6457 de pAMS et contenant la partie manquante du gène pol du virus MLV souche Moloney et une partie de l'enveloppe d'un virus MLV amphotrope souche 4070 A (paragraphe 1-3 ci après).
1-1- Production du fragment Cla I - Sal I de 7392 pb à partir du plasmide pAMS.
La digestion du plasmide pAMS (figure 1) avec les enzymes Cla I et Sal I génère 3 fragments de 1275, 2661 et 7392 pb. Cette digestion est réalisée en 2 temps : une première digestion de 15 μg de plasmide par 100 unités de l'enzyme Sal I suivie d'une précipitation de l'ADΝ digéré et d'une seconde digestion par 80 unités de l'enzyme Cla I. La récupération du fragment de 7392 pb est réalisée de la façon suivante : après migration du produit de la double digestion enzymatique dans un gel d'agarose à 0,8%, le morceau de gel contenant le fragment de 7392 pb est découpé avec un scalpel puis son ADN est extrait par filtration à 0,2 μm. Pour cela, un filtre (Acrodisc 0,2μm, Réf. 4192, Gelman Sciences) est placé à l'extrémité d'une seringue de 5 ml avant d'être humidifié avec 200 μl de TE 0J X. Le morceau d'agarose est ensuite passé à travers le filtre puis le filtre est rincé avec 400 μl de TE 0,1 X. L'ADN recueilli est précipité à l'isopropanol et rincé à l'éthanol 70%. 1-2- Production du fragment bout franc - Cla I de 1810 pb à partir du plasmide phCMV-GaLV.
Une PCR est réalisée sur le plasmide phCMV-GaLV (figure 2) dont la séquence correspond à la séquence SEQ ID 6 à l'aide des ohgonucléotides 1 (SEQ ID 7) et 2 (SEQ ID 8).
Oligo 1 (reverse)
SEQ ID 7 : GGTCAACTTGGCCATGGTGGC (21 mer) 4501->4481 phCMV-GaLV
Oligo 2 (sens)
SEQ ID 8 : CAGCCCATGACCCTCACTTGG (21 mer)
2499->2519 phCMV-GaLV
L'amplification est réalisée avec 40 ng de plasmide, 1,25 unité de la polymérase pfu Turbo (Stratagene, Réf. 600250), 0,2 mM de dNTP, 0,5 μM de chaque oligonucléotide dans un volume final de 50 μl. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91°C + 30*(1 min à 91°C + 45 sec à 71,6 °C + 2 min à 72°C) + 10 min à 72°C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Après vérification de la taille (2002 pb) du fragment amplifié grâce à la migration d'un aliquot sur un gel d'agarose à 0,8%, le produit de la PCR est digéré par 100 unités de l'enzyme Cla I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agorose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (1810 pb) est récupéré. L'ADN est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1. 1-3- Production du fragment bout franc - Sal I de 2162 pb à partir du plasmide pAMS.
Une PCR est réalisée sur le fragment Xho I — Xho I (4773 pb) du plasmide pAMS à l'aide des ohgonucléotides 3 (SEQ ID 9) et 4 (SEQ ID 10).
Oligo 3 (reverse)
SEQ ID 9 : CCCTACTCCTAACAGGACTCC (21 mer) 6457->6437 pAMS
Oligo 4 (sens)
SEQ LD 10 : GTCAGAGATGGCTGACTGAGG (21 mer)
4015->4035 pAMS
L'amplification est réalisée avec 20 ng du plasmide digéré, 1,25 unité de la polymérase pfu Turbo (Stratagene, Réf. 600250), 0,2 mM de dNTP, 0,5 μM de chaque oligonucléotide dans un volume final de 50 μl. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91°C + 30*(1 min à 91°C + 45 sec à 60, 1°C + 2 min à 72°C) + 10 min à 72°C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Après vérification de la taille (2442 pb) du fragment amplifié grâce à la migration d'un aliquot sur un gel d'agarose à 0,8%, le produit de la PCR est digéré par 80 unités de l'enzyme Sal I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agorose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (2162 pb) est récupéré. L'ADN est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1. 1-4- Ligation des 3 fragments (Cla I - Sal I de 7392 pb + bout franc - Cla I de 1810 pb + bout franc - Sal I de 2162 pb) et production du plasmide pRCR-GaLV-
Les 3 fragments à assembler sont quantifiés grâce au logiciel Bio Rad (Bio
Rad, Quantity one SW, MAC, Réf. 1708609) et la ligation est réalisée avec une proportion de 1/6 du fragment de 7392 pb (qui contient le vecteur plasmidique) et une proportion équivalente de chacun des 2 autres fragments. La ligation est faite avec 40 unités de T4 DNA ligase (Biolabs, Réf. 202S) ; elle est utilisée pour transformer des bactéries E. coli DH10B (Life Technology, Réf. 182979-010) qui sont étalées sur une boîte de LB additionnée d'ampicilline (le vecteur plasmidique contenu dans le fragment de 7392 pb contient en effet un gène de résistance à l'ampicilline). Après une nuit à 37°C la boîte présente 7 colonies qui sont utilisées pour produire les 7 minipreps correspondantes. Ces minipreps sont analysées par restriction enzymatique. Un seul clone présente le profil attendu, il est nommé pRCR-GaLV-1 (figure 3) et correspond à la séquence SEQ ID 11.
On retrouve dans le pRCR-GaLV-1 : le gène gag de pAMS provenant de viras MLV situé entre les nucléotides 1212 et 2828, le gène pol de pAMS provenant de virus MLV situé entre les nucléotides 2829 et 6428, une première partie de l'enveloppe amphotrope de pAMS provenant de virus MLV située entre les nucléotides 6368 et 6457, une partie de l'enveloppe de GaLV située entre les nucléotides 6458 et 8269 et une seconde partie de l'enveloppe amphotrope de pAMS située entre les nucléotides 8270 et 8332.
11/ Etape 2 de la construction
Les tests réalisés avec le plasmide pRCR-GaLV-1 ont montré qu'il correspond à un génome viral donnant lieu à des protéines Gag et Pol fonctionnelles et à une enveloppe virale non fonctiomielle. Une petite région supplémentaire de l'enveloppe GaLN est ajoutée à pRCR-GaLN-1 pour construire pRCR-GaLN-2.
II- 1- Production du fragment Νco I - Νco I de 1435 pb à partir du plasmide pRCR-GaLN-1.
Une PCR est réalisée sur le plasmide pRCR-GaLN-1 à l'aide des ohgonucléotides 5 (SEQ ID 12), 6 (SEQ ID 13), 7 (SEQ ID 14) et 8 (SEQ ID 15).
Oligo 5 (reverse)
SEQ LD12 :
GGGTCATGGGCTGGTGGGGGTTCTTATTTTGCAGACTCGTCATCC
CTACTCCTAACAGGACTCC (64mer)
6500->6437 pRCR-GaLN-2 (la séquence introduite avec cet oligonucléotide est soulignée)
Oligo 6 (sens) SEQ ID 13
GTTAGGAGTAGGGATGACGAGTCTGCAAAATAAGAACCCCCACC AGCCCATGACCCTCACTTGG (64 mer)
6445->6508 pRCR-GaLN-2 (la séquence introduite avec cet oligonucléotide est soulignée)
Oligo 7 (sens) SEQ ID 14
CAACTGGCTCTAGAGACTGG (20 mer) 5908->5927 pRCR-GaLN-2
Oligo 8 (reverse) SEQ ID 15
CCTTTCCTATGCACAACCCG (20 mer) 7553->7534 pRCR-GaLN-2 L'amplification est réalisée avec 40 ng du plasmide, 1 unité de la polymérase DyNazyme (Ozyme, Réf. F505L), 0,2 mM de dNTP, 0,5 μM de chaque oligonucléotide, 4% de DMSO dans un volume final de 50 μl. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91°C + 35*(1 min à 91°C + 45 sec à 60,7°C + 1 min 30 sec à 72°C) + 10 min à 72°C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Un aliquot du produit de la PCR est déposé sur un gel d'agarose à 1,5%, plusieurs bandes apparaissent présentant approximativement les tailles suivantes : 1.6, 1J et 0.6 kb. Le reste du produit de la PCR est digéré 2 heures à 37°C par 20 unités de Dpn I (Ozyme, Réf. R0176L) pour supprimer les éventuelles traces de matrice. Le produit de cette digestion est déposé dans un gel d'agarose à 1,0% et après la migration, les bandes de 1J et 0.6 kb sont découpées et extraites selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1. Ces 2 fragments correspondent respectivement aux amplifications réalisées par les ohgonucléotides 6 et 8 (taille théorique de l'amplification 1108 pb) et par les ohgonucléotides 5 et 7 (taille théorique de l'amplification 592 pb). Nous préférons ces 2 fragments à celui de 1.6 kb parce qu'ils contiennent forcément les 30 nucléotides qui doivent être intégrés par les ohgonucléotides 5 et 6 alors que le fragment de 1.6 kb pourrait avoir été généré par les seuls ohgonucléotides 7 et 8 et donc ne pas contenir ces 30 nucléotides. Une nouvelle PCR avec les seules amorces externes (ohgonucléotides 7 et 8) est réalisée sur les fragments de 1.1 et 0.6 kb extraits du gel d'agarose.
L'amplification est réalisée avec 50 ng du fragment de 0.6 kb et 50 ng du fragment de 1J kb, 1 unité de la polymérase DyNazyme (Ozyme, Réf. F505L), 0,2 mM de dNTP, 0,5 μM de chaque oligonucléotide, 4% de DMSO dans un volume final de 50 μl. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 4 min à 94°C + 35*(1 min à 94°C + 45 sec à 57,8°C + 1 min 30 sec à 72°C) + 10 min à 72°C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Un aliquot du produit de la PCR est déposé sur un gel d'agarose à 1,5%, la taille du fragment amplifié est correcte, environ 1.6 kb (taille théorique 1645 pb). Une fraction (20 μl) du produit de la PCR est alors digérée par 40 unités de l'enzyme Nco I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agarose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (1435 pb) est récupéré. L'ADN est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1.
11-2- Production du fragment Nco I - Nco I de 9959 pb à partir du plasmide pRCR-GaLV-1.
La digestion du plasmide pRCR-GaLV-1 avec l'enzyme Nco I génère 2 fragments de 1405 et 9959 pb. Cette digestion est réalisée avec de 10 μg de plasmide par 40 unités de l'enzyme Nco I. Après migration du produit de la digestion enzymatique dans un gel d'agarose à 0,8%, le morceau de gel contenant le fragment de 9959 pb est découpé avec un scalpel puis son ADN est extrait selon la méthode décrite à la fin du paragraphe I- 1.
π-3- Ligation des 2 fragments (Nco I - Nco I de 1435 pb + Nco I - Nco I de 9959 pb) et production du plasmide pRCR-GaLV-2 (figure 4).
Les 2 fragments à assembler sont quantifiés avec le kit PicoGreen
(Molecular Probes, Réf. P-7589). Pour éviter que le fragment de 9959 pb, qui contient le gène de résistance à l'ampicilline) ne se ligue sur lui-même, il est déphosphorylé avant la ligation. La déphosphorylation est réalisée de la façon suivante : incubation 1 heure à 37°C du fragment d'ADN de 9959 pb avec 1 unité de SAP (Shimp alkaline phosphotase, Amersham Life Science, Réf. 70103) pour 5 pmol. La SAP est ensuite inactivée par une incubation de 15 minutes à 65°C. La ligation est réalisée avec une proportion de 1/6 du fragment de 9959 pb (qui contient le vecteur plasmidique) et de 5/6 du fragment de 1435 pb. Elle est faite avec 40 unités de T4 DNA ligase (Biolabs, Réf. 202S). Le produit de la ligation est utilisé pour transfonner des bactéries E. coli DH10B (Life Teclmology, Réf. 182979-010) qui sont étalées sur une boîte de LB additionnée d'ampicilline (le vecteur plasmidique contenu dans le fragment de 9959 pb contient en effet un gène de résistance à l'ampicilline). Après une nuit à 37°C la boîte présente plusieurs dizaines de colonies qui sont analysées par PCR. Sur les 80 colonies analysées, 56 portent l'insert. Trois colonies positives sont sélectionnées pour la poursuite des expérimentations, les plasmides correspondants sont nommés : pRCR-GaLV-2-Cl, pRCR-GaLV-2-Dl et pRCR-GaLN-2-Hl.
B/ Production du surnageant viral RCR-GaLV-2
1- Transfection des cellules.
Les lignées cellulaires humaines 293 et HT1080 sont transfectées avec les plasmides pRCR-GaLN-2-Cl, pRCR-GaLN-2-Dl et pRCR-GaLV-2-Hl. Ces cellules sont cultivées dans du DMEM (Gibco BRL, Réf. 31966-021) contenant 10% de sérum de veau fœtal (Hyclone, Réf. SH 30071.03) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco BRL, Réf. 15070-063). Les cellules sont ensemencées la veille de la transfection en plaques 6 puits à raison de 6J05 cellules / puits pour les cellules 293 et de 3J05 cellules / puits pour les cellules HT 1080. Les transfections sont réalisées au phosphate de calcium avec 4,2 μg de plasmide / puits. Par la suite, les cellules humaines HCT116 ont également été utilisées pour produire le surnageant viral correspondant au plasmide pRCR-GaLN-2.
2- Collecte du surnageant.
Les cellules transfectées sont maintenues en culture et la reverse- transcriptase (enzyme produite par les rétrovirus ; la détection de cette enzyme permet de mettre en évidence la présence de rétrovirus) est recherchée dans leur surnageant 3 semaines après la transfection. La veille du prélèvement de surnageant, le milieu de culture des cellules transfectées est changé. Le surnageant destiné à la mesure de reverse-transcriptase est filtré à 0,45 μm (Sartorius, Réf.16555) et stocké à-20°C.
C/ Caractérisation du surnageant viral RCR-GaLN-2
1- Mesure de l'activité reverse-transcriptase dans le surnageant des cellules transfectées.
La mesure de l'activité reverse-transcriptase est réalisée avec le mix suivant : Tris 50 mM pH 7,8 ; KCl 7,5 mM ; 5 μg/ml polyA ; 1,57 mg/ml oligodT ; 0,05% ΝP40. Juste avant son utilisation, ce mix est additionné de 5 mM MnCl2 et de 1 ml dTTP32 / ml de mix. Ce mix final est distribué dans les puits d'une plaque 96 puits à raison de 25 μl / puits. A chacun des puits sont ajoutés 5 μl de chacun des surnageants à tester. La plaque est alors incubée 1 heure à 37°C. Après cette incubation, 7 μl de chacun des puits sont déposés sous formes de spots sur du papier DE81 puis ce papier est séché dans une étuve. Le dépôt de 7 μl du contenu de chaque puits (au même endroit que le dépôt précédent) suivi du séchage du papier est renouvelé 2 fois de façon à déposer 21 μl du contenu de chaque puits. Le papier DE81 est ensuite lavé 2 fois 5 minutes dans du SSC 2X à température ambiante puis 1 fois 1 à 2 minutes à l'éthanol absolu. Le papier est séché et mis en exposition dans une cassette durant la nuit. Le lendemain, la révélation de l' autoradiographie fait apparaître que le surnageant des cellules 293 transfectées avec les plasmides pRCR-GaLV-2-Cl ou pRCR-GaLV-2-Hl contient de la reverse-trancriptase. D/ Evaluation du tropisme du surnageant RCR-GaLV-2 et de son aptitude à servir de témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLN pseudotypés avec l'enveloppe GaLV.
Toutes les cellules utilisées dans le test de mobilisation sont cultivées dans du DMEM (Gibco BRL, Réf. 31966-021) contenant 10% de sérum de veau fœtal (Hyclone, Réf. SH 30071.03) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco BRL, Réf. 15070-063). La lignée de mobilisation HT1080-pLHL a été constituée par infection de cellules HT1080 avec le surnageant d'une lignée packaging amphotrope transfectées avec le vecteur de mobilisation pLHL (10) puis sélection des cellules avec de rhygromycine B (Gibco BRL, Réf. 10687-010) puis clonage. Les cellules HT1080-pLHL sont ensemencées en plaques 12 puits à raison de 6J04 cellules / puits. Le lendemain ces cellules sont infectées, en présence de 8 μg/ml d'hexadimethrine bromide (Sigma, Réf. H-9268), avec des dilutions sérielles du témoin positif RCR-amphotrope (ATCC, Réf. VR-1450) ou par des dilutions sérielles du surnageant constitué suite à la transfection de cellules 293 avec le plasmide pRCR-GaLV-2-Cl (voir ci-dessus). La gamme de dilution du témoin RCR-amphotrope va de 2J04 RCR/puits à 2 RCR puits. Les mêmes dilutions sont effectuées pour le témoin RCR-GaLV ce qui permettra de comparer son titre avec celui du témoin RCR-amphotrope. Le lendemain de l'infection, le surnageant de chaque puits est supprimé et remplacé par du milieu de culture neuf. Le même jour des cellules indicatrices humaines, HCT116, et murines, Mus dunni, sont ensemencées en plaques 12 puits à raison respectivement de 5J0 et 5J03 cellules / puits. Quatre jours après l'infection des cellules HT1080-pLHL, le surnageant de ces cellules est prélevé, filtré 0,45 μm et utilisé pour infecter les cellules indicatrices en présence de 8 μg/ml d'hexadimethrine bromide (Sigma, Réf. H-9268). Le lendemain de cette infection, le sumageant de chaque puits de cellules HCT116 et Mus dunni est supprimé et remplacé par du milieu de culture neuf additionné de 0,3 mg/ml d'Hygromycine B (Gibco BRL, Réf. 10687-010). Ce changement de milieu de culture est renouvelé 2 fois par semaine pendant 3 semaines. Au bout des 3 semaines de sélection, le test est terminé et les cellules résistantes à l'hygromycine B sont identifiées.
Sur les cellules HCT116, infectables à la fois par l'enveloppe amphotrope et par l'enveloppe GaLV, la dernière dilution du témoin positif RCR-GaLV-2-Cl donnant des cellules résistantes à l'hygromycine B est la même que la dernière dilution du témoin positif RCR-amphotrope domiant des cellules résistantes à l'hygromycine B. Pour le témoin RCR-amphotrope, dont on connaît précisément le titre, cette dilution correspond à 1 RCR. D'après cette observation, le titre du témoin RCR-GaLV-2-Cl serait comparable à celui du témoin RCR-amphotrope, (titre de ce dernier témoin 3JU06 particules infectieuses par ml). Cette observation est corrélée avec le titre mesuré par RCR quantitative TAQMAN qui fait apparaître que le témoin positif RCR-GaLV2 comprend environ 2J0E6 particules infectieuses par ml.
Sur les cellules Mus dunni, infectables par l'enveloppe amphotrope mais pas par l'enveloppe GaLV, une seule colonie positive est observée pour la plus faible dilution du témoin positif RCR-GaLV-2-Cl alors que pour le témoin RCR-amphotrope une dilution 1000 fois plus forte (correspondant à 20 RCR) donne des cellules résistantes à l'hygromycine B.
D'après ce test de mobilisation on peut conclure que :
- Le témoin RCR-GaLV-2-Cl est capable de mobiliser le vecteur pLHL (puisqu'on obtient des colonies résistantes à l'hygromycine B sur le cellules indicatrices HCT 116).
- Le témoin RCR-GaLV-2-Cl n'aurait pas de problème de réplication, puisque son titre est comparable à celui du témoin RCR-amphotrope fabriqué par l'ATCC (d'après comparaison de la dernière dilution de chacun des témoins donnant un résultat positif lorsque le test de mobilisation est révélé sur des cellules indicatrices HCT116). - Le témoin RCR-GaLV-2-Cl présenterait le même tropisme (spécificité d'infection) que l'enveloppe GaLV, en effet cette enveloppe permet l'infection des cellules humaines (exemple HCT116) mais pas, ou beaucoup moins, l'infection des cellules de souris (exemple AS dunni).
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Plasmide comprenant un génome retroviral réplicatif caractérisé en ce qu'il contient :
- Une séquence psi (ψ), des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV.
2/ Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enveloppe du viras MLV présente un tropisme soit amphotrope, soit ecotrope, soit polytrope, soit 10A1, soit xénotrope.
3/ Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence gag code pour la polyprotéine gag correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 1, ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec la séquence SEQ ID 1.
4/ Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence pol code pour les enzymes virales correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 2, ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence SEQ ID 2.
5/ Plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le virus MLV provient de la souche Moloney. 61 Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du viras GaLV comprend au moins la région qui a pour fonction de définir le tropisme de l'enveloppe virale.
11 Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du viras GaLV code pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 ("domaine ID3-GaLV") de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec le domaine ID3-GaLV.
8/ Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie A de l'env est un fragment d'enveloppe de viras GaLV issu de la souche SEATO.
9/ Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enveloppe du viras MLV présente un tropisme amphotrope.
10/ Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du viras MLV amphotrope est celle qui est nécessaire pour permettre, en association avec la région de l'enveloppe GaLV substituée, l'obtention de particules virales infectieuses.
11/ Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du virus MLV amphotrope code pour les régions de la polyprotéine Env situées d'une part entre les acides aminés No. 1 et 31 « domaine ID 3-ampho- 1 » et d'autre part entre les acides aminés No. 645 et 676 « domaine ID 3-ampho- 2 ») de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-l et LD 3-ampho-2.
12/ Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie d'enveloppe amphotrope provient de la souche 4070 A. 13/ Plasmide comprenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.
14/ Plasmide correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 5.
15/ Bactérie productrice du plasmide objet de l'une des revendications 1 à 14.
16/ Bactérie selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'E. coli DHIOB.
17/ Lignée cellulaire exprimant le génome retroviral contenu dans le plasmide objet de l'une des revendications 1 à 14.
18/ Lignée cellulaire selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules humaines.
19/ Lignée cellulaire, selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit de fîbroblastes.
20/ Virion produit par une lignée cellulaire objet de l'une des revendications 17 à 19.
21/ Virion contenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.
22/ Utilisation du virion objet de l'une des revendications 20 ou 21 comme témoin positif dans un test destiné à détecter des RCR ou d'autres types de recombinants non réplicatifs dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV.
23/ Test de mobilisation destiné à détecter des RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV, et qui consiste : tout d'abord à infecter ou co-cultiver une lignée cellulaire pennissive à l'enveloppe GaLV avec respectivement le vecteur retroviral ou la lignée productrice à tester, ladite lignée pennissive contenant un vecteur de mobilisation comprenant lui même un gène de résistance à un antibiotique donné, puis à récupérer le surnageant de la culture ou co-culture pour le transférer sur des cellules indicatrices, également permissive à l'enveloppe GaLV et traitées par ledit antibiotique, à rechercher l'éventuelle résistance des cellules indicatrices à l'antibiotique, la résistance à l'antibiotique révélant la présence de RCR dans l'échantillon testé, - à conduire en parallèle le même test avec le témoin positif correspondant au virion objet de l'une des revendications 20 ou 21.
24/ Kit pour la mise en œuvre de test de mobilisation objet de la revendication 23, comprenant :
- le virion objet de l'une des revendications 20 ou 21 ,
- des cellules de mobilisation pennissives à l'enveloppe GaLV,
- les réactifs nécessaires.
25/ Kit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les cellules pennissives sont des cellules HT 1080 ou HCT116.
26/ Séquence env chimère codant pour la protéine env correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID3 ou une séquence présentant au moins 95 % d'homologie avec la SEQ ID3.
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