EP1352053A2 - Method for processing dendritic cells and for activating macrophages with ru 41740 - Google Patents
Method for processing dendritic cells and for activating macrophages with ru 41740Info
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- EP1352053A2 EP1352053A2 EP02710965A EP02710965A EP1352053A2 EP 1352053 A2 EP1352053 A2 EP 1352053A2 EP 02710965 A EP02710965 A EP 02710965A EP 02710965 A EP02710965 A EP 02710965A EP 1352053 A2 EP1352053 A2 EP 1352053A2
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Abstract
The invention concerns methods for processing dendritic cells by contacting them with RU 41740 or a compound analogous to RU 41740. The processing of dendritic cells contacted with RU 41740 can be evidenced by their functional properties and their phenotypic properties.
Description
PROCEDE DE MATURATION DES CELLULES DENDRITIQUES ET
D'ACTIVATION DES MACROPHAGES AVEC LE RU 41740
DESCRIPTION
La présente invention se situe dans le domaine de la thérapie cellulaire.
Elle a pour objet un procédé capable de générer des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés de mammifères à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques.
Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans l'émergence de la réponse immunitaire antitumorale, anti-infectieuse et auto-immune. En effet, les cellules dendritiques sont les seules cellules capables d'induire une réponse primaire à partir des lymphocytes T. Elles ont donc un rôle clef dans l'initiation de la réponse immunitaire. Une telle fonction est à rapprocher de nombreuses propriétés morphologiques et des molécules de surface des cellules dendritiques. En effet, grâce à de larges expansions de leur membrane cytoplasmique, les cellules dendritiques ont une surface de contact avec leur environnement particulièrement importante. De plus, elles possèdent à leur surface de très nombreux antigènes d'histocompatibilité de classe I et de classe Il qui permettent la présentation antigénique.
Après sa prise en charge par la cellule dendritique, l'antigène subit un apprêtement (processing en anglais) avant d'être présenté au lymphocyte T. L'apprêtement (remaniement), qui nécessite un métabolisme cellulaire actif, comporte quatre étapes : la captation de l'antigène, sa dégradation enzymatique en petits fragments peptidiques dans un compartiment intracellulaire, l'association de ces fragments aux molécules de classe Il du CMH, et la migration des complexes peptides molécules de classe Il à la surface de la cellule présentatrice de l'antigène (CPA) pour la présentation au récepteur des cellules T (RcT) du lymphocyte T auxiliaire (Th). La première étape (captation), qui est indépendante de la température, s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs non spécifiques ou par d'autres mécanismes encore mal connus.
Plus les molécules sont de taille importante, mieux elles sont captées. La deuxième étape, qui est dépendante de la température (elle est bloquée à 4 degrés), est l'internalisation de l'antigène dans les phagosomes qui, ensuite, fusionnent avec les lysosomes (organites intracytoplasmiques riches en protéases), donnant ainsi naissance aux endosomes à pH acide. La protéolyse de l'antigène en fragments peptidiques s'effectue, dans ces vésicules, sous l'action, notamment, des cathepsines B, puis D. Cette étape peut être bloquée par les ions ammonium, qui inhibent la liaison phagosome-lysosome, ou par la chloroquine, qui élève le pH des lysosomes.
La troisième étape est un processus complexe encore mal connu dans ses détails, qui aboutit à l'association entre la molécule de classe Il du CMH, et certains fragments particuliers de l'antigène dégradé constitués généralement de neuf à vingtcinq acides aminés. La quatrième étape implique la migration du complexe molécule de classe 11-peptide (dite forme C3) à la surface de la CPA. Le complexe ainsi formé peut alors interagir avec le RcT approprié à la surface du lymphocyte Th sous réserve que les molécules du Complexe
Majeur d'Histocompatibilité (CMH) du lymphocyte appartiennent au même haplotype que celles de la cellule présentatrice (restriction allogénique).
Les cellules dendritiques sont par ailleurs très riches en molécules de costimulation de la réponse immunitaire, telles que les molécules CD80,
CD86, CD40 qui activent respectivement les molécules CD28, CTLA-4 et
CD40L des lymphocytes T en initiant la réponse immunitaire. Elles possèdent aussi de très nombreuses molécules de l'adhésion, comme la molécule CD54 ou la molécule CD11a/CD18, ce qui facilite la coopération entre les cellules dendritiques et les cellules T. Une autre caractéristique particulière des cellules dendritiques est de déployer des fonctions différentes en fonction de leur stade de différenciation.
Ainsi, la capture de l'antigène et sa transformation sont les deux fonctions principales de la cellule dendritique immature, tandis que ses capacités à présenter l'antigène pour stimuler les cellules T augmentent au fur et à mesure que les cellules dendritiques migrent dans les tissus et les ganglions lymphatiques. Ce changement de fonctionnalité correspond à une maturation de la cellule dendritique. Ainsi, le passage de la cellule dendritique immature à la cellule dendritique mature représente une étape fondamentale dans l'initiation de la réponse immunitaire. Cette maturation peut être facilement suivie grâce à l'évolution des marqueurs de surface durant ce processus. Les marqueurs de surface caractéristiques des différents stades de maturation des cellules dendritiques sont résumés dans le tableau ci-après.
EMI3.1
<tb>
<SEP> Type <SEP> cellulaire <SEP> Marqueurs <SEP> de <SEP> surface
<tb> Monocytes <SEP> CD14++, <SEP> DR+, <SEP> CD86+, <SEP> CD16+/-, <SEP> CD54+, <SEP> CD40+
<tb> Cellule <SEP> dendritique <SEP> immature <SEP> CD14-, <SEP> CD16-, <SEP> CD80+/-, <SEP> CD83-, <SEP> CD86+,
<tb> <SEP> CD1a+, <SEP> CD54+, <SEP> DQ+, <SEP> DR++
<tb> Cellule <SEP> dendritique <SEP> mature <SEP> CD14-, <SEP> CD83++, <SEP> CD86++, <SEP> CD80++,
<tb> <SEP> DR+++, <SEP> DQ++, <SEP> CD40++, <SEP> CD54++, <SEP> CD1a-.
<tb>
Tableau 1
L'isolement des cellules dendritiques du sang périphérique est très difficile puisque moins de 1 % des globules blancs appartiennent à cette catégorie.
De la même façon, l'extraction à partir des tissus est impossible chez l'homme et fort complexe chez l'animal. C'est pourquoi une avance importante a été réalisée lorsque l'on a pu générer des cellules dendritiques à partir de précurseurs hématopoïétiques et des monocytes en présence de différentes cytokines. La production de cellules dendritiques à partir de monocytes peut se faire en présence de GM-CSF et d'IL-4 pour obtenir des cellules dendritiques immatures, qui matureront après contact avec du TNF-a ou avec d'autres agents tels que le CD40ligand, le LPS ou des milieux conditionnés à partir de macrophages.
Ces derniers agents sont des substances toxiques ou complexes. De même, l'activation des macrophages in vivo est complexe et difficilement contrôlable. C'est pourquoi l'activation ex vivo représente un moyen approprié pour des études expérimentales et des. applications thérapeutiques.
Les macrophages activés sont des cellules que l'on rencontre dans les tissus après une activation du processus inflammatoire par des inducteurs spécifiques ou non spécifiques. Ces cellules interviennent dans l'élimination des agents toxiques, pathogènes ou des cellules altérées ou cancéreuses.
Le RU 41740, commercialisé sous la marque Biostim par les Laboratoires
Cassenne (France), est un médicament composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir d'une souche de Klebsiella pneumoniae K2O, (souche 01 K2 NCTC 5055). II est obtenu après lyse des parois bactériennes, extraction organique, centrifugation et ultrafiltration.
II se compose de :-80 % de glycoprotéines - d'acides aminés, de lipides et d'acides nucléiques.
La partie glycoprotéique est divisée en 3 fractions : P1, F1, F2.
P1, d'origine capsulaire, représente environ 50 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 95 kD,
F1 est d'origine membranaire et représente environ 20 % du RU 41740, et a un poids moléculaire moyen de 350 kD
F2 semble être une partie de P1.
Le RU 4170 ne provoque pas d'effet pyrogène, comme en atteste la négativité du test au Limulus effectué avec ce composé.
La présente invention décrit un nouveau procédé de maturation des cellules dendritiques en utilisant, comme agent inducteur de cette maturation, le RU 41740 ou un analogue de celui-ci tel que défini ci-après.
Parmi les agents permettant la maturation des cellules dendritiques, le TNF-a est celui dont l'activité a été le mieux caractérisée.
Malheureusement, cette lymphokine est très toxique et peut déclencher des réponses extrêmement violentes in vivo, ce qui présente un obstacle majeur à son utilisation en thérapie cellulaire. Le LPS est un autre composé capable d'induire la maturation des cellules dendritiques. Il présente aussi une toxicité importante et induit un effet pyrogène puissant, ce qui est attesté par la positivité du test au Limulus effectué avec le LPS.
Il produit en outre des résultats variables suivant le lot utilisé. Le LPS présente enfin l'inconvénient de se dégrader très rapidement. Quant au ligand du CD40 (CD40L), il oriente la différenciation des cellules dendritiques de façon variable selon la concentration et la période d'incubation, ce qui le rend difficilement utilisable en thérapie cellulaire.
Comme cela est illustré dans les exemples expérimentaux ci-après, le RU 41740 permet d'induire la maturation des cellules dendritiques avec une efficacité comparable ou supérieure aux agents de référence cités cidessus. Il présente en outre plusieurs avantages importants par rapport à ces agents. En particulier, le RU 41740, commercialisé sous la marque
Biostim, est utilisé depuis 1982 comme médicament pour stimuler le système immunitaire lors d'infections chroniques (bronchite chronique, otite, rhinite,...), à titre curatif ou préventif. Sa parfaite tolérance par l'organisme a été démontrée. De plus, le RU 41740 est un composé extrêmement stable, et les inventeurs ont montré qu'il induisait la maturation des cellules dendritiques de façon très reproductible et dépendante de la dose utilisée.
Dans une perspective de thérapie cellulaire nécessitant des cellules dendritiques matures, le RU 41740 est donc particulièrement intéressant, de par son innocuité et sa simplicité d'utilisation liée à sa stabilité et à la reproductibilité des résultats obtenus.
L'utilisation de tout composé analogue du RU 41740 et présentant des propriétés comparables à celui-ci, dans des procédés tels que ceux décrits ci-dessous, entre bien évidemment dans le cadre de la présente invention.
Dans la suite, on appellera analogue du RU 41740 un composé comportant 60 à 90 % de glycoprotéines, et capable d'induire, lors de sa mise en contact de cellules dendritiques immatures, à des concentrations inférieures ou égales à 1 mg/ml, une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86 et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques. Des exemples d'analogues du RU 41740 sont le LCOS 1013 et le LCOS 1014, dont les procédés de fabrication sont décrits à l'exemple 10. Dans la suite du texte, et sauf indication contraire, le terme RU 41740 désignera aussi bien le RU 41740 proprement dit, constituant le principe actif du Biostim, qu'un analogue de celui-ci.
Un analogue du RU 41740 est défini ici comme un composé d'extraits glycoprotéiques obtenus à partir d'une souche de Klebsiella (par exemple, la souche O1 K2 NC TC 5055 de Klebsiella pneumoniae), par au moins les étapes suivantes : 'culture de la souche lyse des parois bactériennes 'extraction organique 'centrifugation ultrafiltration séchage
L'exemple 10 ci-dessous présente deux procédés de productions d'analogues du RU 41740, désignés sous les références LCOS 1013 et
LCOS 1014.
La structure chimique d'un analogue du RU 41740 est majoritairement composée de : hydrate de carbone = 70% 12 protéines = 20% 6.
Des lipides, nucléosides et acides aminés sont présents à l'état de traces.
Le RU 41470 ou un analogue de celui-ci présentent un taux d'endotoxines bactériennes indétectable (à 10 pg/ml).
Le RU 41740 est actif dans tous les procédés utilisant les monocytes, des précurseurs des monocytes, ou les cellules souches hématopoïétiques chez l'homme et l'animal. De plus, le RU 41740 permet d'obtenir en même temps des macrophages activés à partir des mêmes cellules de départ.
La maturation des cellules dendritiques par leur mise en présence de RU 41740 peut être attestée par leurs propriétés phénotypiques ou par leurs propriétés fonctionnelles.
Ainsi, l'invention porte sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures (Monocyte Dendritic Cells, ou MODC) ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à : - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ;
- induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique.
Les exemples 6,7 9,11 et 12 sont une illustration de ce procédé.
L'invention porte également sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui-ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40, CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1a par lesdites cellules dendritiques.
Les exemples 1 à 3 sont une illustration de ce procédé.
Par ailleurs, les propriétés physico-chimiques naturelles du RU 41740 permettent d'y adsorber des molécules, en particulier des molécules antigéniques. Ceci permet donc de réaliser de façon simple un couplage non covalent entre le RU41740 et des molécules antigéniques. Il sera alors possible d'obtenir des cellules dendritiques matures spécifiques des antigènes adsorbés au RU 41740 ou à un analogue de celui-ci, en incubant des cellules dendritiques immatures avec un produit de couplage entre le RU 41740 ou son analogue et les molécules antigéniques choisies.
Le couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et les molécules antigéniques peut être réalisé par n'importe quel procédé connu de l'homme du métier. De façon préférée, les antigènes seront adsorbés à la surface du RU 41740 ou de son analogue, mais d'autres moyens de couplage (liaison covalente, affinité, etc...) peuvent aussi être envisagés.
Le procédé de couplage le plus simple, par adsorption à la surface du
RU41740, présente en outre l'avantage de permettre un couplage avec des molécules antigéniques essentiellement non protéiques.
Le produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages, fait partie de la présente invention. Dans une réalisation préférée des produits de couplage de l'invention, le couplage est assuré par une liaison non covalente. Un produit de couplage particulier est celui du RU41740 ou d'un analogue de celui-ci, avec une molécule antigénique de nature essentiellement non protéique.
L'invention porte aussi sur un procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes.
Dans une réalisation préférée de l'invention, les procédés décrits ci-dessus permettent d'obtenir des cellules dendritiques matures ou des macrophages activés par la mise en contact de monocytes, précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques avec le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques.
Dans une mise en oeuvre préférée des procédés de l'invention, le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des cellules à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10 Ng/ml.
Dans une autre mise en oeuvre préférée des procédés de l'invention, les monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec un analogue du RU 41740 obtenu à partir de la souche O1 K2 NCTC 5055 de
Klebsiella pneumoniae. Un tel analogue est par exemple le LCOS 1013 ou le LCOS 1014, qui est ajouté au milieu de culture des cellules à une concentration finale comprise de préférence entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, et, de manière encore préférée, entre 100 ng/ml et 50 ug/ml.
Dans les procédés de l'invention, la durée d'incubation des monocytes, précurseurs des monocytes, ou des cellules souches hématopoïétiques en présence de RU 41740 ou d'un composé analogue de-celui-ci est préférentiellement de 1 à 15 jours.
La thérapie cellulaire est une approche récente consistant à administrer à un patient des cellules modifiées ex vivo de façon à leur conférer des propriétés susceptibles d'avoir un effet bénéfique pour le patient. Les propriétés naturelles des cellules dendritiques en font un excellent candidat pour des approches de thérapie cellulaire dans plusieurs domaines de pathologie, de par leur capacité à induire une réponse immunitaire primaire à partir des lymphocytes T. En particulier, l'immunothérapie anti-tumorale par administration de cellules dendritiques présentant un ou plusieurs antigènes tumoraux, est une approche de thérapie cellulaire particulièrement prometteuse.
Le principe de cette approche est de présenter au système immunitaire des antigènes tumoraux, de façon particulièrement efficace, afin de stimuler une réponse contre les cellules présentant ces antigènes. Cette approche est illustrée dans l'exemple 6 ciaprès.
L'exemple 7 présenté ci-après démontre que l'administration de cellules dendritiques présentant des antigènes de micro-organismes permet d'obtenir une immunisation primaire vis-à-vis de ces micro-organismes, et peut donc être utilisée dans la lutte anti-infectieuse.
Une autre approche de thérapie cellulaire utilisant des cellules dendritiques consiste à orienter les cellules dendritiques vers une réaction de tolérance de l'hôte vis-à-vis d'antigènes particuliers. Ceci peut être utile par exemple pour induire une tolérance vis-à-vis d'alloantigènes lors d'une greffe allogénique, d'autoantigènes lors d'une maladie autoimmune, ou d'allergènes lors d'une maladie allergique.
En effet, les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie, c'est-à-dire l'inactivation fonctionnelle des lymphocytes T au lieu de leur activation. La culture des cellules dendritiques en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporine ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane, qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. Cette constatation pourrait avoir des implications importantes dans le cadre des greffes d'organes d'une part, et des traitements des maladies auto-immunes d'autre part, comme la polyarthrite rhumatoïde, la myasthénie, le diabète insulinodépendant, la sclérose en plaques, l'eczéma, le psoriasis, etc. et les maladies allergiques.
L'exemple 8 illustre cette approche en montrant l'influence de la cyclosporine A en présence de RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques.
Quel que soit le type de pathologie concerné, la thérapie cellulaire peut être réalisée en administrant au patient humain ou animal des cellules autologues, homologues ou xénologues après leur modification ex vivo.
La présente invention porte ainsi sur un procédé têt que ceux décrits cidessus, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo et administrées après maturation à un patient, humain ou animal, de façon autologue, homologue ou xénologue, pour la prophylaxie, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques, ou autoimmunes.
L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés et/ou des cellules de Langerhans de la peau, entre aussi dans le cadre de la présente invention.
Les inventeurs ont montré que le RU 41740 permettait d'induire in vitro la maturation des cellules de Langerhans (exemple 4). Cette propriété pourrait donc être avantageusement utilisée pour favoriser une réponse immunitaire au niveau de la peau ou des muqueuses, par administration topique d'une composition comportant du RU 41740. Des exemples d'indication d'une telle composition sont notamment les gingivites et les parodontites. L'utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique ou systémique, fait donc également partie de cette invention.
Dans un autre aspect de l'invention, le RU 41740 ou un analogue de celuici est couplé à un ou plusieurs antigènes d'intérêts, puis administré directement in vivo pour induire la production par l'organisme de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes. Dans cette réalisation de l'invention, le RU 41740 ou son analogue sert en fait de vecteur pour les antigènes d'intérêt, et permet la présentation de ces antigènes au système immunitaire d'une façon telle qu'il induit la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes.
L'invention porte donc sur un procédé tel que ceux décrits ci-dessus, dans lequel les cellules dendritiques matures ou les macrophages activés sont produits directement in vivo.
L'utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes, entre aussi dans le cadre de cette invention.
Les cellules dendritiques matures obtenues par des procédés tels que ceux décrits ci-dessus peuvent être utilisées dans le traitement de divers types de pathologies, notamment en immunothérapie anti-tumorale, dans la lutte anti-infectieuse, ou pour augmenter la tolérance de l'organisme vis-à-vis de certains antigènes particuliers. Dans une mise en oeuvre préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont utilisées dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale.
De même, l'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de la présente invention, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un microorganisme, est partie intégrante de l'invention.
Dans une autre réalisation préférée de l'invention, les cellules dendritiques obtenues par un procédé tel que décrit ci-dessus sont incubées en présence d'un immunosuppresseur, et utilisées dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance.
Les cellules dendritiques matures produites par les procédés de l'invention peuvent aussi être utilisées pour identifier des antigènes mineurs d'histocompatibilité. Cette technique consiste à récupérer les monocytes en les faisant différencier en cellules dendritiques matures, puis en les utilisant comme des cellules stimulantes dans une réaction de culture mixte lymphocytaire entre individus de la même famille HLA compatible. Ce système permet de détecter des disparités concernant les antigènes mineurs d'histocompatibilité et de pouvoir approfondir la compatibilité ou les incompatibilités entre personnes d'une même famille, ce qui présente des avantages certains dans le domaine des greffes de tissus et d'organes en intra familial ou même extra familial.
L'utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé de l'invention, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité, fait aussi partie de la présente invention.
Les exemples et figures présentés ci-dessous à titre non limitatif permettront de mettre en évidence certains avantages et caractéristiques de la présente invention.
Légende des figures
La figure 1 représente l'évolution des marqueurs cellulaires au cours de la différenciation des monocytes en cellules dendritiques à JO (courbes en pointillés = marqueurs monocytaires avant traitement), J6 (courbes en traits fins = cellules dendritiques immatures), et J8 (courbes en traits gras = cellules dendritiques matures), après ajout du RU 41740 à 25 pg/ml à partir de J6.
La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine. En abscisse est indiqué le ratio effecteur/cible utilisé, tandis qu'en ordonnée est indiqué le pourcentage de lyse des cellules cibles.
La figure 3 démontre la présentation de la toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM
CSF, IL-4 et RU 41740. L'ordonnée indique l'incorporation de thymidine tritiée, mesurée en coups par minutes (cpm).
La figure 4 illustre l'influence de la cyclosporine A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivés en présence de
GM-CSF, d'IL-4 et de RU 41740. Les courbes, obtenues en cytométrie de flux, montrent l'expression du CD83 en absence de CsA (4A) et en présence de CsA à 5 pg/ml (4B). Les figures 4C et 4D montrent les mêmes courbes pour un autre marqueur des cellules dendritiques, l'antigène DC
Lamp. Les courbes en pointillé ont été obtenues avec un anticorps primaire anti-KLH, non pertinent pour les cellules dendritiques.
La figure 5 montre l'orientation de la réponse immune vers une réponse immune de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporine A (CsA). L'ordonnée représente respectivement la sécrétion d'IL-12 (figure 5A) et le rapport de sécrétion de cytokines IFN-y/IL-10 (Th1/Th2) (Figure 5B) par des cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740, et traitées par la cylosporine A à 5 Hg/ml (colonne noires) ou non (colonnes blanches). Trois expériences sont représentées pour chaque condition.
Les résultats sont présentés en pourcentage par rapport aux cellules monocytaires non traitées par la cyclosporine, dont les mesures ont été ramenées à 100.
La figure 6 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires allogéniques, réalisées avec des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes purifiés de trois donneurs différents. Deux types de cellules dendritiques ont été comparés, dont la maturation a été induite soit par le TNF-a (200 U/ml), soit par le LCOS 1013 (25 pg/ml) (courbe notée LCOS ), pendant 48 heures. L'axe horizontal correspond au nombre de cellules dendritiques irradiées déposées dans chaque puits, pour une quantité constante de 105 lymphocytes T par puits. La prolifération des lymphocytes T, stimulée par les cellules dendritiques, est déterminée après 4 jours de culture par incorporation de thymidine tritiée (axe vertical).
La figure 7 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires autologues, réalisées avec des cellules dendritiques obtenues à partir de monocytes purifiés de trois donneurs différents. Deux types de cellules dendritiques ont été comparés, dont la maturation a été induite soit par le
TNF-a (200 u/ml), soit par le LCOS 1013 (25 llg/ml) (courbe notée LCOS ), pendant 48 heures. L'axe horizontal correspond au nombre de cellules dendritiques irradiées déposées dans chaque puits, pour une quantité constante de 105 lymphocytes T par puits. La prolifération des lymphocytes T, stimulée par les cellules dendritiques, est déterminée après 5 jours de culture par incorporation de thymidine tritiée (axe vertical).
La figure 8 montre les résultats de réactions mixtes lymphocytaires allogéniques et autologues, réalisées avec des cellules dendritiques dont la maturation a été induite soit par le TNF-a (200 u/ml), soit par le LCOS 1013 à 5,10 ou 25 Hg/ml (courbes notée LCO ), pendant 48 heures. Les graphes ont été obtenus de la même façon que les graphes des figures 6 et 7, respectivement.
L'ensemble des techniques de culture cellulaire, de marquage de cellules, de phénotypage par fluorométrie, etc..., ainsi que les réactifs (anticorps, toxine tétanique,...) utilisés dans les expériences décrites dans les exemples suivants, ont été détaillés dans un article de Karine Duperrier et a/., Journal of Immunological Methods 238 (2000), p. 119-131.
Exemple 1 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des monocytes humains avec le RU 41740
Le sang périphérique est prélevé chez le sujet concerné. Ce sang est ensuite centrifugé 20 minutes à 200 g de façon à diminuer la contamination des cellules du sang périphérique par les plaquettes. La partie supérieure contenant la plupart des plaquettes et le plasma est éliminée soigneusement avant de purifier les cellules mononuclées en les centrifugeant sur un gradient de séparation de Ficoll dont la densité est de 1,077. La couche de cellules mononuclées est récupérée puis lavée deux fois dans un tampon PBS et déposée sur un gradient contenant 4 densités discontinues de Percoll pour isoler les monocytes.
Ce gradient est constitué par des dilutions d'une solution isotonique de percoll à raison de 75 % (6, 5 ml), 50.5 % (15 ml), 40 % (3,5 ml) et 30 % (3 ml) dans un milieu de Dulbecco sans magnésium ni calcium et contenant 5 % de sérum humain. 75 à 100 millions de cellules sont ainsi déposées sur chaque tube et centrifugées à 1000 g pendant 25 minutes à 4 C. Les cellules de faible densité, principalement les monocytes, sont récoltées à l'interface entre la dilution 40 % et 50.5 %, et lavées deux fois dans du PBS.
Elles sont ensuite resuspendues dans un milieu de culture, puis déposées dans des plaques à culture contenant 6 puits à une densité de 5 x 106 cellules par puits dans un volume final de 3 ml et laissées adhérer pendant 1 heure à 37 C. On peut substituer cette étape d'adhérence par une purification complémentaire des monocytes en utilisant un système de purification négatif utilisant un mélange d'anticorps monoclonaux associant un anti
CD3, CD7, CD19, CD45A, CD56 et anti-IgG à l'aide d'un. système de microbilles de type Macs (Miltenyi Biotec). Cette purification complémentaire permet d'obtenir des concentrations de monocytes ayant une pureté supérieure à 90 %.
Les cellules sont ensuite mises en culture dans des puits de culture à 37 C sous 5 % de C02. Le milieu qui comporte du RPMI, contient 200 UI/ml de
GM-CSF humain recombinant, 500 UI/ml de IL-4 humaine recombinante dans un volume final de 6 ml. Au jour 3 et au jour 5, les cultures sont renouvelées en éliminant 3 ml et en ajoutant 3 ml de milieu frais avec les cytokines. Au 6ème jour, les cellules sont transférées dans des pots en
Teflon et cultivées à une densité de 5 x 105 cellules par pots sous 3 ml en présence de RU 41740 à différentes concentrations ou de TNF-a humain recombinant à raison de 200 UI/ml pendant 2 jours.
Les cellules sont récoltées au 8ème jour, lavées et cultivées en l'absence de stimulation pendant 3 jours supplémentaires.
Au terme de la culture, la qualité de la maturation est évaluée par l'expression des molécules CD80,83,86,14,1a, HLA-DR à la surface des cellules. Les marquages révèlent que plus de 80 % des monocytes viables ont maturé en cellules dendritiques caractérisées par le phénotype suivant : CD83+, CD86++, CD80++, HLA-DR+++, CD1a-, CD14-,
CD40+++, CD54++, ce qui les place dans le groupe des cellules dendritiques tissulaires très différenciées.
La figure n 1 montre en effet que les molécules HLA-DR, HLA-DQ, CD40,
CD54, CD80, et CD86 sont présentes sur la majorité des cellules à J8, après ajout du RU 41740 à 25 pg/ml, alors que la molécule CD14 n'est quasiment plus exprimée.
Afin d'étudier l'action du RU 41740 sur la maturation des cellules dendritiques (DC), différentes concentrations de la molécule ont été testées et comparées à l'action du TNF.
Les 3 expériences suivantes (a, b, c) ont été réalisées à partir de monocytes d'un même donneur. a) Les concentrations de RU 41740 testées ici sont 0.1 Ng/ml, 1pg/ml, et 10, ug/ml.
Le tableau 2 présente les résultats obtenus, en ce qui concerne le pourcentage de cellules marquées et l'intensité moyenne de fluorescence (IFM).
EMI19.1
<tb>
<SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb> <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-alpha
<tb> <SEP> Monocytes <SEP> dendritiques
<tb> <SEP> indifférenciées
<tb> <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 98,9 <SEP> 275 <SEP> 98,3 <SEP> 552 <SEP> 98,7 <SEP> 978 <SEP> 99,1 <SEP> 1164 <SEP> 98,9 <SEP> 1195 <SEP> 98,9 <SEP> 1225
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97,5 <SEP> 464 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 1340 <SEP> 98 <SEP> 1205 <SEP> 98,2 <SEP> 1328 <SEP> 98,4 <SEP> 1603
<tb> CD54 <SEP> 98,6 <SEP> 41 <SEP> 95,6 <SEP> 85 <SEP> 96,4 <SEP> 220 <SEP> 96 <SEP> 210 <SEP> 95, <SEP> 6 <SEP> 282 <SEP> 97,4 <SEP> 295
<tb> CD86 <SEP> 96,5 <SEP> 52 <SEP> 69,9 <SEP> 77 <SEP> 98,8 <SEP> 310 <SEP> 98,5 <SEP> 290 <SEP> 98 <SEP> 303 <SEP> 98,8 <SEP> 326
<tb> CD83 <SEP> 0,
2 <SEP> 325 <SEP> 5,5 <SEP> 119 <SEP> 82,1 <SEP> 156 <SEP> 76,1 <SEP> 165 <SEP> 84,7 <SEP> 184 <SEP> 84,5 <SEP> 173
<tb> HLA-DQ <SEP> 24, <SEP> 2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 86,4 <SEP> 160 <SEP> 88,8 <SEP> 153 <SEP> 84,1 <SEP> 174 <SEP> 84, <SEP> 3 <SEP> 157
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 60,5 <SEP> 173 <SEP> 50,1 <SEP> 187 <SEP> 70 <SEP> 250 <SEP> 62, <SEP> 1 <SEP> 129
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 1,55 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> nd <SEP> 1,06 <SEP> nd <SEP> 0,87 <SEP> nd
<tb>
Tableau 2 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) du marqueur considéré.
Ces résultats sont exprimés avec une marge d'erreur de +/-2,5 %.
Après 8 jours de culture, l'expression de la molécule CD14 a disparu (pourcentage inférieur à 1,5 %), quelles que soient les conditions de culture.
L'intensité moyenne de fluorescence (IFM) des marquages des molécules
HLA-DR, CD40, CD54 et CD86 apparaît plus faible en présence des doses de RU 41740 utilisées qu'en présence du TNF-a.
En revanche, les molécules CD83 et HLA-DQ sont légèrement plus exprimées en présence d'une concentration de RU 41740 de 10 ug/ml qu'avec le TNF-a.
De plus, l'IFM de la molécule CD80 apparaît toujours supérieure en présence de RU 41740.
D'après ces résultats, on voit que le RU 41740 induit la maturation des cellules dendritiques, même à de faibles concentrations. L'IFM des différents marqueurs apparaît cependant augmentée pour les plus fortes concentrations de RU 41740 testées, avoisinant les résultats obtenus en présence de TNF-a.
L'action du RU 41740 sur les cellules dendritiques à de plus fortes concentrations a donc été investiguée dans une deuxième série d'expériences. b) Les concentrations de RU 41740 testées pour cela sont 5 g/ml, lOpg/mI, et 50Ng/ml.
Les résultats sont présentés dans le tableau n 3.
L'IFM des différentes molécules d'adhésion, de costimulation, molécules
HLA de classe Il apparaît augmentée de façon dépendante de la concentration de RU 41740 ajoutée au milieu de culture. La molécule
CD40 présente toujours une IFM inférieure en présence de RU 41740 par rapport à la concentration obtenue en présence de TNF-alpha.
Le CD83, qui est le marqueur spécifique de la maturation, a un pourcentage et une intensité de fluorescence qui augmentent également en fonction de la quantité de RU 41740.
La molécule HLA-DQ présente un maximum d'expression avec 10 ug/ml de
RU 41740.
EMI21.1
<tb>
<SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb> <SEP> Monocytes <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF
<tb> <SEP> dendritiques <SEP> 5Ng/ml <SEP> 10pg/mi <SEP> 50pg/ml <SEP> alpha
<tb> <SEP> indifférenciées <SEP> 200 <SEP> UI/ml
<tb> <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99,2 <SEP> 275 <SEP> 98,3 <SEP> 552 <SEP> 98,9 <SEP> 1207 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> nd <SEP> 99,3 <SEP> nd <SEP> 99,1 <SEP> 946
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97,5 <SEP> 464 <SEP> 99,8 <SEP> 1417 <SEP> 99, <SEP> 4 <SEP> 1441 <SEP> 99,8 <SEP> 1507 <SEP> 99, <SEP> 6 <SEP> 1728
<tb> CD54 <SEP> 98,6 <SEP> 41 <SEP> 95,6 <SEP> 85 <SEP> 97,1 <SEP> 195 <SEP> 97 <SEP> 216 <SEP> 98,2 <SEP> 255 <SEP> 95,6 <SEP> 255
<tb> CD86 <SEP> 96, <SEP> 5 <SEP> 52 <SEP> 69, <SEP> 9 <SEP> 77 <SEP> 98,
9 <SEP> 267 <SEP> 98, <SEP> 7 <SEP> 271 <SEP> 99, <SEP> 7 <SEP> 248 <SEP> 99,5 <SEP> 273
<tb> CD83 <SEP> 0,2 <SEP> 325 <SEP> 5,5 <SEP> 119 <SEP> 67,9 <SEP> 132 <SEP> 74, <SEP> 6 <SEP> 147 <SEP> 84,8 <SEP> 159 <SEP> 89,5 <SEP> 196
<tb> HLA-DQ <SEP> 24,2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 68,5 <SEP> 189 <SEP> 85,9 <SEP> 191 <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 143 <SEP> 84,2 <SEP> 183
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 63 <SEP> 86, <SEP> 7 <SEP> 64,6 <SEP> 101 <SEP> 76,1 <SEP> 95, <SEP> 8 <SEP> 70,5 <SEP> 93, <SEP> 5
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 0,47 <SEP> nc <SEP> 1,1 <SEP> n <SEP> 0,66 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 1 <SEP> a <SEP> 2, <SEP> 52 <SEP> nd <SEP> 1,55 <SEP> nd <SEP> 2, <SEP> 9 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 21 <SEP> nd
<tb> Tableau n 3 :
Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) de ce marqueur (nd = non déterminable).
Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %.
Avec une concentration plus importante (50 pg/ml) de RU 41740, par rapport à l'expérience du tableau 2, l'IFM des molécules CD40 et CD54 a augmenté, alors que d'autres IFM ont diminué (molécules CD86 et HLA
DQ). Quelques marqueurs, comme le CD80 et CD54, sont exprimés avec la même intensité après une maturation avec 50 lug/ml de RU 41740 ou avec le TNF-a.
Des concentrations de RU 41740 encadrant 50 g/ml ont alors été testées, dans une troisième série d'expériences. c) Les concentrations de RU 41740 testées sont 25 g/ml, 50 pg/ml, et 100 , ug/ml.
Les résultats sont présentés dans le tableau n 4.
EMI22.1
<tb>
<SEP> JO <SEP> J6 <SEP> J8
<tb> <SEP> Monocytes <SEP> Cellules <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-alpha
<tb> <SEP> dendritiques <SEP> 25Ng/ml <SEP> 50Ng/ml <SEP> 1OOpg/ml <SEP> 200 <SEP> UI/ml
<tb> <SEP> indifférenciées
<tb> <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99,2 <SEP> 275 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 552 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 630 <SEP> 97,5 <SEP> 823 <SEP> 99,4 <SEP> 682 <SEP> 99,4 <SEP> 694
<tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97,8 <SEP> 128 <SEP> 97, <SEP> 5 <SEP> 464 <SEP> 99,7 <SEP> 1592 <SEP> 99,1 <SEP> 1958 <SEP> 99, <SEP> 8 <SEP> 2088 <SEP> 99, <SEP> 3 <SEP> 1480
<tb> CD54 <SEP> 98, <SEP> 6 <SEP> 41 <SEP> 95, <SEP> 6 <SEP> 85 <SEP> 98, <SEP> 5 <SEP> 280 <SEP> 97,2 <SEP> 321 <SEP> 98,9 <SEP> 361 <SEP> 98,2 <SEP> 249
<tb> CD86 <SEP> 96,5 <SEP> 52 <SEP> 69,
9 <SEP> 77 <SEP> 99, <SEP> 3 <SEP> 284 <SEP> 98,3 <SEP> 291 <SEP> 99,6 <SEP> 295 <SEP> 99, <SEP> 5 <SEP> 284
<tb> CD83 <SEP> 0,2 <SEP> 325 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> 119 <SEP> 86, <SEP> 6 <SEP> 192 <SEP> 91,2 <SEP> 227 <SEP> 92,8 <SEP> 213 <SEP> 89 <SEP> 166
<tb> HLA-DQ <SEP> 24, <SEP> 2 <SEP> 48 <SEP> 63,2 <SEP> 61 <SEP> 79 <SEP> 109 <SEP> 84, <SEP> 8 <SEP> 123 <SEP> 78, <SEP> 8 <SEP> 118 <SEP> nd <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0,1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 74 <SEP> 128 <SEP> 82, <SEP> 4 <SEP> 165 <SEP> 90, <SEP> 8 <SEP> 196 <SEP> nd <SEP> nd
<tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96,2 <SEP> 5395 <SEP> 1,9 <SEP> 199 <SEP> 1,03 <SEP> nd <SEP> 4,07 <SEP> nd <SEP> 1,75 <SEP> nd <SEP> 3, <SEP> 27 <SEP> nd
<tb> Tableau n 4 : Pourcentage (%) de cellules marquées et intensité moyenne de fluorescence (IFM) de ce marqueur (nd = non déterminable).
Ces résultats comportent une marge d'erreur de +/-2,5 %.
Les molécules CD40, CD54, CD86 et HLA-DR sont présentes sur plus de 97 % des cellules avec les trois concentrations. RU 41740. Leurs IFM sont comparables à celles obtenues avec du TNF-a, pour une concentration de 25 pg/ml de RU 41740. Cependant, dans cette expérience, elles continuent d'augmenter avec des concentrations supérieures de RU 41740.
Le CD 83 est présent sur un pourcentage très élevé de cellules à 100 pg/ml et à 50 ug/ml, supérieur aux résultats obtenus avec du TNF-a. Son IFM apparaît plus importante avec 50 pg/ml.
A 100 ug/ml de RU 41740, les intensités de fluorescence des molécules
HLA-classe Il ont tendance à diminuer, ce qui peut suggérer que cette concentration est une concentration limite de RU 41740.
L'ensemble des expériences suggère que la dose optimale de RU 41740 se situe entre 10 et 50 pg/ml.
Exemple 2 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules souches CD34+ hématopoïétiques humaines avec le RU 41740
Conditions expérimentales :
Purification : Après ficoll, les CD34+ représentaient 4.2 % des cellules mono nucléées (CMN).
Après purification par sélection positive avec le procédé MAC System (Miltenyi Biotec) avec des billes recouvertes d'un anticorps anti CD34,90 % des cellules sont CD34+.
Mise en culture : -milieu de culture : RPMI contenant 10 % de SVF, 2 % de pénicilline/streptomycine, 1 % de glutamin, et 1 % de bicarbonate de sodium.
Culture dans des puits de 2 mi avec 5.105 cellules par puits.
- cytokines présentes dans le milieu de culture : de JO à J5 : SCF à 25 ng/ml, GM-CSF à 100 ng/ml et soit du TNF-a à 2.5 ng/ml, soit du RU 41740 à 6.25ng/ml, de J5 à J14 : GM-CSF à 100 ng/ml.
Dédoublement des cultures :-les cellules sont homogénéisées dans le puits, puis 1 ml est prélevé et déposé dans un nouveau puits. 1 ml de milieu de culture est ensuite ajouté dans le nouveau puits et dans l'ancien, ainsi que du GM-CSF en fonction du milieu ajouté.
Marqueurs : CD34-CD45-CD14-HLA-D. R-CD40-CD54-CD83- CD86-CD1a.
Un anticorps primaire anti-KLH marqué à la fluorescence, a été utilisé comme contrôle pour soustraire la fluorescence non spécifique des signaux obtenus.
# Résultats :
EMI25.1
<tb> <SEP> J8 <SEP> J12 <SEP> J14
<tb> <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> CD14 <SEP> 40 <SEP> 37 <SEP> 63,2 <SEP> 47,4 <SEP> 54,1 <SEP> 52,5
<tb> CD34 <SEP> 0,7 <SEP> 17
<tb> CD45 <SEP> 96 <SEP> 96
<tb> CD83 <SEP> 0,5 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 1,3 <SEP> 1,3 <SEP> 0,8 <SEP> 1
<tb> CD86 <SEP> 13 <SEP> 11 <SEP> 7,4 <SEP> 10,8 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 4,7
<tb> CD1a <SEP> 87 <SEP> 17 <SEP> 8,4 <SEP> 17,5 <SEP> 10,3 <SEP> 28, <SEP> 9
<tb> CD40 <SEP> 44 <SEP> 38 <SEP> 64,3 <SEP> 59,4
<tb> CD54 <SEP> 33 <SEP> 56 <SEP> 61,8 <SEP> 57,9
<tb> HLA <SEP> DR <SEP> 88 <SEP> 80 <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 65, <SEP> 3 <SEP> 69,9 <SEP> 69, <SEP> 54
<tb> HLA <SEP> DQ <SEP> 54, <SEP> 1 <SEP> 52, <SEP> 3
<tb> CD80 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 16
<tb> Tableau n 5 :
pourcentage de cellules exprimant un marqueur cellulaire à différents temps de culture.
Le CD1a est plus exprimé avec le RU 41740 (17.5% de cellules à J12) qu'avec le TNF-a, à l'inverse du CD14, qui est plus exprimé avec le TNF-a à la surface cellulaire.
Les niveaux d'expression en présence de RU 41740 du CD40, CD54 ou
HLA-DR sont quasiment identiques aux niveaux d'expressions en présence de TNF-a.
Le CD83 n'est pas exprimé quelles que soient les conditions.
Exemple 3 : Procédé de production des cellules dendritiques à partir des cellules CD34+ du sang de cordon humain avec le RU
41740
Les conditions expérimentales sont similaires à l'exemple 2, hormis le fait que les cellules sont issues de sang de cordon :
Purification : Après ficoll, les cellules CD34+ représentent 0.83 % des cellules mononucléées (CMN).
Après purification par sélection positive, on obtient 18.1 % de CD34+.
2.106 cellules ont été obtenues.
Dédoublement : à J6, J7, J8, J10 et J12 * Résultats : Les résultats sont présentés dans le tableau n 6.
EMI27.1
J7 <SEP> J9 <SEP> J10 <SEP> J12 <SEP> J13 <SEP> J14
<tb> TNF-α <SEP> RU <SEP> 414740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> (200 <SEP> Ul/min) <SEP> (10 <SEP> g/ml)
<tb> CD14 <SEP> 32 <SEP> 20,39 <SEP> 59,6 <SEP> 43,52 <SEP> 60 <SEP> 50,05 <SEP> 66,77 <SEP> 59,23 <SEP> 57,73 <SEP> 52,28 <SEP> 46,77 <SEP> 30,88
<tb> CD34 <SEP> 19,79 <SEP> 19,92 <SEP> 2,53 <SEP> 2,94 <SEP> 2,26 <SEP> 2,08 <SEP> 0,69 <SEP> 1,25 <SEP> 0,45 <SEP> 0,61 <SEP> 0,38 <SEP> 0,57
<tb> CD45 <SEP> 99,84 <SEP> 97,57 <SEP> 99,96 <SEP> 99,76 <SEP> 99,97 <SEP> 99,86 <SEP> 99,85 <SEP> 99,92 <SEP> 99,69 <SEP> 99,82 <SEP> 99,93 <SEP> 99,91
<tb> CD16 <SEP> 2,24 <SEP> 3,68 <SEP> 2,16 <SEP> 2,78 <SEP> 2,11 <SEP> 4,89
<tb> CD83 <SEP> 1,09 <SEP> 0,39 <SEP> 4,
24 <SEP> 4,9 <SEP> 2,46 <SEP> 1,19 <SEP> 0,71 <SEP> 1,35 <SEP> 3,19 <SEP> 3,41 <SEP> 1,22 <SEP> 0,83
<tb> CD86 <SEP> 11,61 <SEP> 11,97 <SEP> 22,23 <SEP> 13,69 <SEP> 9,23 <SEP> 7,48 <SEP> 13,94 <SEP> 11,91 <SEP> 12,78 <SEP> 17,1 <SEP> 19,33 <SEP> 10,56
<tb> CD1a <SEP> 4,41 <SEP> 13,95 <SEP> 23,75 <SEP> 20,32 <SEP> 20,63 <SEP> 22,68 <SEP> 27,9 <SEP> 20,14 <SEP> 36,13 <SEP> 23,67 <SEP> 34,2 <SEP> 16,63
<tb> CD40 <SEP> 75,91 <SEP> 55,23 <SEP> 63,35 <SEP> 56,02 <SEP> 64,56 <SEP> 41,47
<tb> CD54 <SEP> 74,66 <SEP> 65,62 <SEP> 61,7 <SEP> 58,57 <SEP> 64,4 <SEP> 41,69
<tb> HLA <SEP> DR <SEP> 81,34 <SEP> 73,8 <SEP> 73,04 <SEP> 63,28 <SEP> 57,84 <SEP> 37,69
<tb> Tableau n 6
POURCENTAGE DE CELLULES MARQUEES cellules CD34+ de sang de cordon mises en culture jusqu'à J6 avec du GM-CSF, SCF et du RU 41740 (10 g/ml) ou du
TNF-α
(200 U?ml), puis de J6 à J14 avec du GM-CSF
Dans les deux protocoles de culture, l'expression des molécules de surface évolue avec les mêmes tendances : - augmentation du CD14 jusqu'à J12 puis diminution - diminution puis disparition de la molécule CD34 à J12 - très faible expression du CD83 et CD16 qui reste stable.
Le CD1a est exprimé précocement à J7 sur les cellules avec le RU 41740 puis se stabilise autour de 23 % à J14, ce qui révèle une cinétique plus rapide avec le RU 41740 qu'avec le TNF-a.
Après J12, les molécules CD40, CD54 et HLA-DR sont moins exprimées en présence de RU 41740 qu'en présence de TNF-a.
Exemple 4 : Procédé de différenciation des cellules de Langerhans.
Les cellules souches sont obtenues après un passage à travers un gradient de ficoll du sang de cordon. Les cellules mononuclées CD34+ sont purifiées par sélection positive avec un anticorps monoclonal anti
CD34 (Immu 133.3, Immunotech Marseille, France). Après purification, les cellules sont à plus de 90% CD34+.
Ces cellules CD 34+ sont ensuite cultivées en présence de GM-CSF (100 ng/ml), et de TNF-a (2.5ng/ml) ou de RU 41740 (10 lig/ml) durant 12 jours dans un milieu RPMI-SVF 10 %-pénicilline streptomycine 2 %, glutamin 1 %-bicarbonate de sodium 1 % et 10 mM d'HEPES. Au terme de la culture à J12, les cellules sont marquées avec les anticorps anti
CD1a, CD14, Lag, E-Cadherin, DR et DQ de façon à identifier les cellules de Langerhans qui sont Lag+, CD1a+, CD14-, DR+ et DQ+.
Les résultats, présentés dans le tableau n 7, montrent une meilleure efficacité du RU 41740 par rapport au TNF-a pour la différenciation des cellules de Langerhans.
EMI29.1
<SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740
<tb> CD1a+ <SEP> DR+ <SEP> 8 <SEP> % <SEP> 17 <SEP> %
<tb> Lag+ <SEP> DR+ <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> %
<tb>
Tableau n 7
Exemple 5 : Procédé de production des cellules dendritiques matures à partir des cellules mononuclées de chien avec le RU
41740
Un élutriateur est un appareil qui permet de soumettre des cellules à deux forces opposées, l'une centrifuge et l'autre centripète, en milieu liquide.
Ceci permet de séparer les cellules suivant leur taille et leur densité, tout en les maintenant dans leur milieu physiologique. Ce procédé est particulièrement avantageux pour séparer les cellules de chien (monocytes/lympocytes) qui forment des agrégats dans des gradients de type ficoll.
MILIEU D'ELUTRIATION :
PBS 1X-SVF 2%-EDTA 0. 01%
PREPARATION DES CELLULES MONONUCLEES :
La poche de sang est prélevée sur CPD (citrate phosphate dextrose), le sang est dilué avec du chlorure de sodium, centrifugé à 800 tr/min pendant 15 min sans frein pour éliminer un maximum de plaquettes.
On réalise un ficoll à 1600 tr/min pendant 25 min sans frein.
Les CMN sont récupérées, et lavées deux fois au PBS (la première pour déplaquetter).
La concentration cellulaire est de 5. 106 cellules/ml dans du PBS ou dans le milieu d'élutriation.
PROTOCOLE D'OBTENTION DES MONOCYTES :
Débit : 25 ml/min (réglage à la pompe selon la droite de calibration)
Faire varier la vitesse de centrifugation : chargement des cellules à 3200 tr/min à 300 ml 3000 tr/min à 250 mi 2700 tr/min à 200 ml 2500 tr/min à 200 ml 2300 tr/min à 200 ml 2100 tr/min à 200 ml
Rotor off à 200 ml
RESULTATS
La fraction obtenue à 2700 tr/min contient des monocytes avec une pureté supérieure à 80 %.
CULTURE
Les monocytes de chien sont cultivés de la même façon que les monocytes humains et avec les mêmes facteurs de différenciation humains : GM-CSF,
TNF ou RU 41740. En revanche, l'IL4 est spécifique de l'espèce canine.
Les cellules dendritiques ainsi obtenues possèdent la même morphologie avec des dendrites, mais les marqueurs de surface ne sont pas comparables à ceux de l'homme bien qu'elles soient CD14-, DR+ et DQ+, car nous ne disposons pas des anticorps spécifiques dans cette espèce.
Le RU 41740 a les mêmes effets que le TNFa.
Exemple 6 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'émergence d'une réponse antitumorale.
La thyrocalcitonine est un antigène tumoral relativement peu immunogène s'exprimant fortement dans les cancers médullaires de la thyroïde. Dans le système utilisé, les inventeurs ont pu faire produire des clones lymphocytaires T dirigés contre la thyrocalcitonine. II s'agit de clones cytotoxiques susceptibles d'avoir une activité antitumorale dans les cancers à thyrocalcitonine.
La figure 2 illustre la génération de lignées T cytotoxiques spécifiques du peptide de la thyrocalcitonine.
Des cellules dendritiques dérivées de monocytes après culture en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740, sont incubées avec le peptide de la thyrocalcitonine, puis mises en culture en présence de lymphocytes T autologues afin d'induire l'activation de lymphocytes T spécifiques du peptide.
Après plusieurs stimulations des lymphocytes T à l'aide de cellules dendritiques puis de cellules EBV incubées avec le peptide, des lignées de cellules T cytotoxiques (H10 et B7) capables de lyser spécifiquement des cellules EBV cibles incubées avec le peptide de la thyrocalcitonine, ont pu être générées.
Exemple 7 : Utilisation des DC matures dans les activités antiinfectieuses
En utilisant l'anatoxine tétanique comme antigène présenté par les MODC (Monocyte Dentritic Cells), il a été possible de générer des lignées cytotoxiques anti-anatoxines tétaniques, ce qui démontre à l'évidence que ce système permet d'avoir une immunisation primaire vis-à-vis d'antigènes de type infectieux.
La figure 3 représente une réponse secondaire des lignées anti-toxine tétanique par les cellules dendritiques dérivées de monocytes humains cultivés en présence de GM-CSF, IL-4 et RU 41740.
Exemple 8 : Utilisation des cellules dendritiques matures dans l'induction d'une réponse de tolérance.
Les cellules dendritiques, dans certaines conditions de culture, peuvent provoquer une réaction d'anergie. La culture de ces cellules en présence d'immunosuppresseurs comme la cyclosporine ou l'histamine, entraîne une modification des antigènes de membrane qui va induire une réponse de tolérance et non une réponse cytotoxique. De cette façon, il est donc possible d'éduquer les cellules dendritiques pour les orienter vers une réaction de tolérance.
A titre d'exemple nous donnons l'influence de la Cyclosporine A (CsA) sur la maturation des cellules dendritiques.
Des monocytes purifiés ont été cultivés en présence de GM-CSF et d'IL-4 pendant 6 jours et en présence de RU 41740 pendant 2 jours de plus, dans un milieu contenant 10% de sérum humain type AB. 1 g/ml ou 5 g/ml de
CsA ont été ajoutés ou non dès le début de la culture.
L'expression des molécules HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CD40 et CD1a a été analysée par cytométrie en flux (tableau n 8).
EMI32.1
<SEP> sans <SEP> CsA <SEP> CsA <SEP> (1 <SEP> pg/ml) <SEP> CsA <SEP> (5pg/ml)
<tb> <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM
<tb> HLA-DR <SEP> 99 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1605 <SEP> 98.8 <SEP> 0. <SEP> 9 <SEP> 1504 <SEP> 99.2 <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 1101
<tb> CD40 <SEP> 98.9 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 1697 <SEP> 98.4 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1314 <SEP> 99 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 1278
<tb> CD86 <SEP> 97.7 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP> 373 <SEP> 98.6 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> 318 <SEP> 96.4 <SEP> ¯ <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 253
<tb> CD83 <SEP> 77.1 <SEP> ¯ <SEP> 8. <SEP> 5 <SEP> 169 <SEP> 64.2 <SEP> 20 <SEP> 170 <SEP> 49.9 <SEP> ¯ <SEP> 6.
<SEP> 2 <SEP> 132
<tb> CD80 <SEP> 78.1 <SEP> ¯ <SEP> 5. <SEP> 6 <SEP> 216 <SEP> 68.9 <SEP> ¯ <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 162 <SEP> 58.3 <SEP> 17 <SEP> 143
<tb> CD1a <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP> ¯ <SEP> 9. <SEP> 5 <SEP> 45. <SEP> 5 <SEP> 27 <SEP> ¯ <SEP> 7 <SEP> 74 <SEP> 25.9 <SEP> 6.5 <SEP> 78
<tb>
Tableau n 8
Cette étude démontre que la cyclosporine provoque une diminution nette de l'expression des molécules CD83 et CD80 ainsi qu'une augmentation de l'expression du CD1a. Une analyse graphique (figure 4) révèle en réalité l'existence de deux populations cellulaires, l'une CD83+ et l'autre
CD83-qui est douée de propriétés immunorégulatrices.
En effet les cellules dendritiques en présence de CsA (CsA-MODC) sont capables d'orienter la réponse des lymphocytes T vers une réponse de type TH2 qui favorise une réaction commune suppressive.
La figure 5 illustre cette polarisation de la réponse immune vers une réponse de type Th2 par des cellules dendritiques dérivées de monocytes et traitées par la cyclosporine A.
Les cellules dendritiques dérivées de monocytes cultivées en présence de
GM-CSF, IL-4 et RU 41740, et traitées par la cylosporine A, sécrètent moins d'IL-12 que les cellules dendritiques non traitées (figure 5A).
De plus, le rapport de sécrétion de cytokines IFN-y/IL-10 (Th1/Th2) par des cellules T est diminué lorsque les cellules T sont stimulées par des cellules dendritiques traitées par cyclosporine A (Figure 5B).
Exemple 9 : Utilisation des DC matures pour induire une culture mixte lymphocytaire allogénique ou autologue.
En présence de MODC matures, les lymphocytes T allogéniques, au 6ème et même au 8ème jour, sont doués d'une prolifération extrêmement importante, très largement supérieure à ce que l'on constate avec l'utilisation des lymphocytes T allogéniques et des monocytes allogéniques. Il en est de même pour une culture mixte autologue.
Des cultures mixtes lymphocytaires autologues ont donc été induites par des cellules dérivées de monocytes (MODCs) générées en présence de
GM-CSF (200 UI/ml), d'IL-4 (500 UI/ml) et de RU 41740 (10 pg/ml)
Dix mille MODCs, irradiées à 30 Grays, sont cultivées avec différentes sous-populations lymphocytaires triées soit par billes magnétiques Dynal (CD4+ et CD8+), soit avec le module de tri du FACS Calibur (CD8
CD28-, et CD8bri9h', CD28+ autos). Dans le tableau 8, les valeurs indiquées représentent l'incorporation de Thymidine tritiée après culture mixte autologue, sauf (**).
Les expériences sont réalisées en triplicate, sauf (*), en duplicate.
EMI35.1
Condition <SEP> Valeurs <SEP> Test <SEP> Student <SEP> par <SEP> rapport <SEP> Condition <SEP> Moyenne <SEP> Ecart-type
<tb> au <SEP> contrôle <SEP> nägatif
<tb> p=
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 7898 <SEP> 10720 <SEP> 8613 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 9077 <SEP> 692
<tb> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> + <SEP> 119066 <SEP> 193392 <SEP> 206319 <SEP> 3,827E-03 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> + <SEP> 172926 <SEP> 22198
<tb> (35.000 <SEP> CD4+) <SEP> allos) <SEP> (**) <SEP> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> (**)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 37808 <SEP> 45223 <SEP> 42027 <SEP> 1,458E-04 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 41686 <SEP> 1753
<tb> (35.000 <SEP> CD28- <SEP> autos)
<SEP> (35.000 <SEP> CD8bright <SEP> CD28autos)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 32990 <SEP> 54800 <SEP> 2,394E-02 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 43895 <SEP> 7711
<tb> (35.000 <SEP> CD28+ <SEP> autos) <SEP> (35.000 <SEP> CD8bright
<tb> CD28+ <SEP> autos)(*)
<tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 13985 <SEP> 12941 <SEP> 13573 <SEP> 3,978E-03 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 13500 <SEP> 248
<tb> (100.000 <SEP> CD8+ <SEP> autos) <SEP> (100.000 <SEP> CD8+ <SEP> autos)
<tb> (*)
<tb> Tableau n 9
Exemple 10 : Procédés de production du LCOS 1013 et du LCOS
1014.
A. PRESENTATION GENERALE DU LCOS 1013
Le LCOS 1013 est un analogue du RU 41740, constitué par un ensemble de substances extraites à partir d'un lysat de culture de Klebsiella pneumoniae. Son mode de fabrication repose sur la succession d'étapes ou stades, dont le schéma général est présenté ci-dessous. Des milieux utilisables pour les cultures, ainsi qu'une présentation indicative du déroulement de chaque étape, sont décrits plus en détail après ce diagramme.
La technique de fabrication décrite ci-après, à titre purement illustratif, correspond à une unité opératoire basée sur un volume de culture bactérienne obtenue dans un fermenteur de 600 litres.
EMI37.1
<tb>
<SEP> STADE <SEP> 1 <SEP> : <SEP> Préparation <SEP> de <SEP> l'inoculum
<tb> <SEP> STADE <SEP> 2 <SEP> : <SEP> Préculture
<tb> <SEP> v
<tb> <SEP> STADE <SEP> 3 <SEP> : <SEP> Culture <SEP> en <SEP> fermenteur
<tb> <SEP> v
<tb> STADE <SEP> 4 <SEP> : <SEP> Fin <SEP> de <SEP> culture <SEP> et <SEP> addition <SEP> des <SEP> agents <SEP> lysants
<tb> <SEP> y
<tb> <SEP> STADE <SEP> 5 <SEP> : <SEP> Lyse
<tb> STADE <SEP> 6 <SEP> : <SEP> Tamisage <SEP> moléculaire <SEP> avec <SEP> Concentration
<tb> <SEP> STADE <SEP> 7 <SEP> Lyophilisation <SEP> du <SEP> lysat
<tb> <SEP> STADE <SEP> 8 <SEP> : <SEP> Extraction <SEP> par <SEP> l'acétone
<tb> <SEP> i
<tb> <SEP> STADE <SEP> 9 <SEP> : <SEP> Extraction <SEP> par <SEP> le <SEP> méthanol
<tb> <SEP> STADE <SEP> 10 <SEP> :
<SEP> Remise <SEP> en <SEP> solution
<tb> <SEP> r
<tb> <SEP> STADE <SEP> 11 <SEP> Centrifugation
<tb> <SEP> STADE <SEP> 12 <SEP> : <SEP> Ultrafiltration
<tb> <SEP>
<tb> <SEP> STADE <SEP> 13 <SEP> : <SEP> Filtration
<tb> <SEP> STADE <SEP> 14 <SEP> : <SEP> Lyophilisation
<tb> <SEP> STADE <SEP> 15 <SEP> : <SEP> Mélange
<tb>
B.
DESCRIPTION DE DIFFÉRENTS MILIEUX UTILISABLES POUR
LA CULTURE DES BACTERIES
La culture des bactéries, en vue de produire du LCOS 1013 suivant la succession d'étapes précisées ci-dessus, peut être effectuée en utilisant les milieux de culture contenant les composants suivants :
Bouillon Nutritif
Peptone Papaïnique de Soja 4 +/-2 g/1
Autolysat de levure 4 +/-2 g/1
Chlorure de Sodium 5 +/-2 g/l
Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,4 0,
2
Boite de Roux
Chlorure de Sodium 5 +/-2 g/1
Glucose anhydre 5 +/-2 g/1
Autolysat de levure 12 +/-3 g/1
Peptone Papaïnique de Soja 5 +/-2 g/1
Gélose 30 +/-4 g/1
Hydroxyde de Sodium qsp pour pH 7,5 0,2
Phosphate Dipotassique 4 +/-2 g/l
Phosphate Monopotassique 0,5 à 0,9 g/1
Milieu de préculture
Peptone Papaïnique de Soja 20+/-3 g/1
Autolysat de levure 10+/-2 g/1
Chlorure de Sodium 5 +/-2 g/1
Phosphate Dipotassique 3,
5 +/-1 g/1
Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/1
Milieu de culture pour fermenteur
Autolysat de levure de boulangerie 10 +/-2 g/1
Chlorure de Sodium 5+/-2 g/l
Peptone Papaïnique de Soja 20+/-3 g/1
Phosphate Dipotassique 3,5+/-1 gel
Phosphate Monopotassique 1 à 2 g/1
C. DESCRIPTION DETAILLÉE DES DIFFÉRENTS STADES DE
PRODUCTION DU LCOS 1013
STADE 1 : Préparation de l'inoculum
Ce stade a pour but de réaliser, sur milieu gélosé en boîte de Roux, la culture de Klebsiella pneumoniae nécessaire à l'inoculation d'une préculture en milieu liquide, à partir d'un cryotube ou d'un lyophilisat issu de la banque de travail.
La banque de travail est réalisée par exemple à partir d'une souche de
Klebsiella pneumoniae de l'Institut Pasteur de référence CIP 52.145.
Pour cela, la souche est revivifiée en réalisant une suspension bactérienne dans le bouillon nutritif, à partir duquel on ensemence des boîtes de Roux, qui sont ensuite incubées à 37 C 0,5 pendant 20 à 24 heures.
STADE 2 : Précultures
A partir de l'inoculum préparé au stade 1, une préculture est effectuée en flacon de 3 litres, destinée à ensemencer un fermenteur de 35 I, lui-même destiné dans un deuxième temps à ensemencer un fermenteur de 600 I.
La première préculture est réalisée dans le milieu de préculture décrit cidessus, auquel on ajoute une solution stérile de glucose, à raison de 30g de glucose pour 3 litres. La deuxième préculture, de 35 litres, est effectuée dans le milieu de culture pour fermenteur décrit plus haut, auquel on ajoute 400 g de glucose.
Des flacons satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N, une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au 1/2, et une solution stérile d'anti-mousse, peuvent être utilisés pour la deuxième préculture, en fermenteur, afin notamment de maintenir le pH aux alentours de 6,5, pendant toute la durée de la préculture, soit environ 5 heures à environ 37 C, sous agitation.
STADE 3 : Culture en fermenteur
L'objet de cette étape est de réaliser en fermenteur, dans des conditions définies, une culture bactérienne de teneur supérieure ou égale à 1,7.10' germes/ml, pour permettre l'extraction ultérieure d'une quantité de produit satisfaisante.
Pour cela, la suspension de germes contenue dans le fermenteur de 35 1 est transférée dans un fermenteur de 600 litres contenant le milieu de culture en fermenteur décrit plus haut, auquel on a ajouté 5 kg de glucose.
Comme pour la préculture de 35 litres, des cuves satellites contenant respectivement une solution stérile d'hydroxyde de sodium 10 N et une solution stérile d'acide orthophosphorique dilué au 1/2 sont utilisées pour la régulation du pH aux alentours de 6,5, ainsi qu'une cuve satellite contenant une solution stérile d'anti-mousse. La culture est réalisée pendant environ 7 heures, à 37 C 1 C, sous agitation.
STADE 4 : Fin de culture et addition des agents lysants
Ce stade a pour but d'inactiver la culture par l'action d'agents lysants et chauffage de 55 à 75 C pendant une durée supérieure ou égale à 40 minutes. Pour cela, les agents lysants utilisés sont les suivants : solution stérile de polysorbate 80, solution stérile d'EDTA, solution stérile de chlorydrate de lysozyme.
En fin de culture, le pH est amené à 5,8 0,3 à l'aide d'une solution stérile d'acide orthophosphorique, puis les agents lysants ci-dessus sont transférés dans la culture.
Le contenu du fermenteur est ensuite porté à la température de 65 C 10 C et maintenu pendant au moins 40 minutes à cette température sous agitation.
Le biolysat obtenu est alors transféré dans une cuve de lyse industrielle (préchauffée à 65 C 10 C), et maintenu à cette température pendant au moins 20 minutes, avant d'être ramené à 37 C 2 C.
STADE 5 : Lyse
L'étape de lyse consiste à rompre la paroi des bactéries par voie enzymatique, ce qui entraîne la libération des constituants cytoplasmiques des cellules microbiennes. Elle est effectuée en maintenant la suspension prélysée du stade précédent, à 37 C 2 C, dans la cuve de lyse au moins pendant 6 jours
STADE 6 : Tamisage moléculaire et concentration
Dans cette étape, le volume de lysat brut est réduit de moitié pour diminuer la quantité à traiter aux stades suivants. La concentration s'effectue par exemple sur un ultrafiltre équipé de cartouche filtrante de type CARBOSEP d'un seuil de coupure < 100 KD, éliminant ainsi les petites molécules non liées.
STADE 7 : Lyophilisation du lysat
Afin d'obtenir le lysat brut issu du stade 6 sous forme solide permettant les extractions ultérieures aux solvants, une opération de lyophilisation est réalisée immédiatement après le stade de concentration. On obtient ainsi une poudre brune, collante au toucher.
STADE 8 : Extraction par l'acétone :
Le lysat de LCOS 1013 lyophilisé, issu du stade 7, contient des lipides que l'on élimine partiellement par l'extraction solide-liquide, en utilisant de l'acétone à température ambiante.
Le volume d'acétone utilisé est proportionnel à la masse de lyophilisat. Ce volume est obtenu selon le calcul suivant : 10 x masse mise en oeuvre < V solvant < 20 x masse mise en oeuvre, avec de préférence (V solvant/masse mise en oeuvre)-15.
Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.
STADE 9 : Extraction par le méthanol :
Après extraction à l'acétone, le produit obtenu au stade 8 contient encore des lipides résiduels et des pigments que l'on élimine par extraction solideliquide, en utilisant du méthanol à température ambiante.
Le volume de méthanol utilisé est proportionnel à la masse de lyophilisat.
Ce volume est obtenu selon le calcul suivant : 10 x masse mise en oeuvre < V solvant < 20 x masse mise en oeuvre, avec de préférence (V solvant/masse mise en oeuvre)-15.
Le produit est récupéré par centrifugation, puis séché.
STADE 10 : Remise en solution "L'extrait méthanol"issu du stade 9 est remis en solution aqueuse, pour permettre l'isolement ultérieur du produit par centrifugation et ultrafiltration.
STADE 11 : Centrifugation
L'extrait brut en suspension issu du stade 10 contient des protéines dénaturées et des matières insolubles dans l'eau que l'on élimine par centrifugation entre 14000 et 18000 g.
Le produit centrifugé est d'aspect légèrement colloïdal et de couleur beige à brun.
STADE 12 : Ultrafiltration
Ce stade représente l'étape essentielle de l'isolement du produit.
Le produit issu du stade 11 contient des substances de différentes tailles moléculaires : sels minéraux, protéines, glycoprotéines, etc...
Les macromolécules de PM : 300000 constituant le produit sont isolées par ultrafiltration sur une membrane de seuil de coupure de 300 KD.
Le produit, une fois introduit dans la cuve de l'appareil, est véhiculé en permanence au moyen d'une pompe, dans un circuit fermé comportant un ultrafiltre. Le milieu est maintenu homogène au moyen d'une agitation. La pression créée par la pompe sur la membrane filtrante, oblige une partie du soluté à traverser cette membrane (perméat).
La partie retenue (rétentat), reste en circulation. Sachant que l'on opère à volume constant, la perte de volume est compensée en permanence par l'apport d'un même volume d'eau.
En fin d'opération la solution est ultrafiltrée.
L'ultrafiltrat obtenu est une solution liquide translucide légèrement jaune.
STADE 13 : Filtration
La clarification du surnageant de centrifugation obtenu au stade 11 est affinée par filtration sur membrane de rétention nominale de 1,2 um.
On obtient ainsi une"solution de glycoprotéines"opalescente, de couleur beige clair à crème.
STADE 14 : Lyophilisation
Afin de permettre une bonne conservation du produit, la solution issue du stade 13 est ensuite lyophilisée, par un procédé comportant une étape de congélation, puis la lyophilisation proprement dite.
Les glycoprotéines lyophilisées ont l'aspect d'une poudre floconneuse de couleur blanche à crème, hygroscopique.
STADE 15 : Mélange
Cette dernière étape a pour but d'homogénéiser les glycoprotéines lyophilisées issues du stade 14.
L'atomisation peut se substituer avantageusement à la lyophilisation et au mélange (LCOS 1014).
Exemple 11 : Etude de l'effet de la molécule LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains.
L'effet du LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains, a été étudié sur des cellules provenant de 3 donneurs différents, par comparaison avec le TNF-a.
A. Protocole - Les monocytes purifiés (plus de 90%) ont été mis en culture dans du milieu RPMI contenant 10% de sérum humain AB, en présence de facteurs de croissance GM-CSF (200U/ml) et 11-4 (500U/ml) pendant 6 jours afin d'induire la différenciation des monocytes en cellules dendritiques immatures. La maturation des cellules a été induite par addition de TNF-a (200U/ml) ou du composé LCOS 1013 (25 pg/ml) pendant 48H.
- Le phénotype des cellules ainsi générées (après 8 jours de culture) a été examiné par cytométrie en flux. L'expression du marqueur spécifique de maturation des cellules dendritiques (CD83), des molécules de costimulation CD80, CD86, CD40, de la molécule d'adhésion CD54, de la molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe Il HLA-DR, a été analysée. L'expression de la molécule CD1a, marqueur spécifique des cellules de Langerhans, cellules dendritiques immatures, a également été testée.
- Les propriétés fonctionnelles des cellules ont été étudiées à l'aide de réactions mixtes lymphocytaires (MLR). Pour ce faire, une gamme de concentrations de cellules dendritiques a été mise en présence d'une concentration définie de lymphocytes T allogéniques (réaction mixte allogénique) ou de lymphocytes T autologues (réaction mixte autologue), pendant 4 et 5 jours respectivement. La prolifération des lymphocytes T a été déterminée par incorporation de thymidine tritiée. Les protocoles expérimentaux de ces réactions mixtes lymphocytaires sont décrits plus en détail dans l'article de K. Duperrier et al. mentionné plus haut.
B. Résultats
Phénotype des cellules dendritiques
Les tableaux 10 à 12 ci-dessous résument les pourcentages d'expression des différents marqueurs ainsi que l'intensité moyenne de fluorescence (IFM) de chaque marqueur (entre parenthèses).
EMI45.1
<SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1 <SEP> a
<tb> <SEP> 1
<tb> TNF-a <SEP> 91 <SEP> % <SEP> 69.7% <SEP> 99.5% <SEP> 99.4% <SEP> 98.4% <SEP> 99.5% <SEP> 13.2%
<tb> <SEP> (132) <SEP> (85) <SEP> (209) <SEP> (1084) <SEP> (195) <SEP> (803) <SEP> (28)
<tb> LCOS1013 <SEP> 84.6% <SEP> 93.2% <SEP> 99.7% <SEP> 99.7% <SEP> 99.2% <SEP> 99.7% <SEP> 10.8%
<tb> <SEP> (157) <SEP> (134) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (306) <SEP> (502) <SEP> (20)
<tb> Tableau n"10
EMI45.2
<SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1 <SEP> a
<tb> <SEP> 2
<tb> TNF-a <SEP> 88% <SEP> 55.1 <SEP> % <SEP> 99.1 <SEP> % <SEP> 99.2% <SEP> 97.8% <SEP> 98.6% <SEP> 20.6%
<tb> <SEP> (221) <SEP> (89) <SEP> (299) <SEP> (1104) <SEP> (355) <SEP> (1108) <SEP> (215)
<tb> LCOS1013 <SEP> 81.4% <SEP> 81.8% <SEP> 98.1 <SEP> % <SEP> 99.3% <SEP> 97.5% <SEP> 98.8% <SEP> 11.1 <SEP> %
<tb> <SEP> (242) <SEP> (169) <SEP> (298) <SEP> (1441) <SEP> (416) <SEP> (1102) <SEP> (299)
<tb>
Tableau n 11
EMI46.1
<SEP> donneur <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <SEP> CD54 <SEP> HLA-DR <SEP> CD1a
<tb> <SEP> 3
<tb> TNF-a91. <SEP> 8% <SEP> 48.7% <SEP> 98.5% <SEP> 98.7% <SEP> 95.9% <SEP> 98.9% <SEP> neg.
<tb>
<SEP> (108) <SEP> (65) <SEP> (209) <SEP> (918) <SEP> (154) <SEP> (768)
<tb> LCOS1013 <SEP> 92.3% <SEP> 89.4% <SEP> 98.2% <SEP> 98.7% <SEP> 98.4% <SEP> 97.5% <SEP> neg.
<tb>
<SEP> (118) <SEP> (104) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (288) <SEP> (588)
<tb> Tableau n'12
Les cellules dendritiques générées en présence de la molécule LCOS 1013 présentent un phénotype caractéristique des cellules dendritiques matures, de par l'expression des molécules CD83, des molécules de co-stimulation et d'adhésion, ainsi que la faible expression du CD1a.
II apparaît cependant que le pourcentage d'expression, ainsi que l'IFM de la molécule CD80, sont augmentés en présence de la molécule
LCOS 1013, par rapport au TNF-a, de même que l'IFM des molécules
CD40 et CD54.
Ces résultats suggèrent un effet différentiel de la molécule LCOS 1013 par rapport au TNF-a, quant à la maturation des cellules dendritiques.
Fonctions des cellules dendritiques
Les résultats des réactions mixtes lymphocytaires allogéniques sont illustrés à la figure 6. Ils montrent que les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité allostimulatrice élevée, comparable à celle des cellules générées en présence de TNF-a.
Les résultats des réactions mixtes lymphocytaires autologues sont présentés à la figure 7. De façon remarquable, les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité de stimulation des lymphocytes T autologues beaucoup plus importante que les cellules générées en présence de TNF-a (au moins 5 fois supérieure).
C. Conclusion
Les résultats ci-dessus montrent que la molécule LCOS 1013 induit de façon efficace la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains, aux niveaux phénotypique et fonctionnel.
Il est intéressant de noter cependant que l'expression de la molécule CD80 est fortement augmentée en présence de LCOS 1013, et que les cellules induisent une forte réponse autologue, par comparaison avec le TNF-a, ceci pour les 3 donneurs testés.
Ceci est en accord avec les résultats présentés par Scheinecker et al.
(Journal of Immunology, 1998,161 : 3966-3973), qui suggèrent que la molécule CD80 jouerait un rôle essentiel dans l'initiation de la réaction mixte autologue.
Exemple 12 : Etude de l'effet de différentes concentrations de
LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques.
L'effet de différentes concentrations de LCOS 1013 sur la maturation des cellules dendritiques générées à partir de monocytes humains d'un seul donneur, a été étudié, par comparaison avec le TNF-a.
Les concentrations testées pour le LCOS 1013 sont 5,10 et 25 Lg/mI, et 200 u/ml pour le TNF-a.
Les résultats de l'étude phénotypique sont résumés dans le tableau suivant :
EMI48.1
donneur <SEP> 1 <SEP> HLA-DR <SEP> CD <SEP> 83 <SEP> CD54 <SEP> CD <SEP> 40 <SEP> CD <SEP> 86 <SEP> CD <SEP> 80
<tb> <SEP> TNF-α <SEP> 92,12 <SEP> % <SEP> 70,02% <SEP> 87,12% <SEP> 83,44% <SEP> 94,44% <SEP> 0,49%
<tb> (200 <SEP> U/ml) <SEP> 877,54 <SEP> 65,55 <SEP> 137, <SEP> 49 <SEP> 289,54 <SEP> 180,81 <SEP> 95, <SEP> 04
<tb> LCOS1013 <SEP> 81,69% <SEP> 76, <SEP> 35% <SEP> 89,39% <SEP> 75,02% <SEP> 93,33% <SEP> 3,26%
<tb> <SEP> (5 <SEP> pg/ml) <SEP> 545,30 <SEP> 119, <SEP> 62 <SEP> 229,59 <SEP> 454,18 <SEP> 197 <SEP> 90,79
<tb> LCOS1013 <SEP> 87,17% <SEP> 68,20% <SEP> 90, <SEP> 66% <SEP> 79,99% <SEP> 94, <SEP> 47% <SEP> 2,92%
<tb> (10 <SEP> pg/ml) <SEP> 500,55 <SEP> 93,85 <SEP> 229,17 <SEP> 411,53 <SEP> 184, <SEP> 14 <SEP> 91,01
<tb> LCOS1013 <SEP> 94,52% <SEP> 66,
35% <SEP> 93, <SEP> 15% <SEP> 91,22% <SEP> 91, <SEP> 07% <SEP> 1,07%
<tb> (25 <SEP> pg/ml) <SEP> 504, <SEP> 84 <SEP> 105,29 <SEP> 237,68 <SEP> 394,41 <SEP> 191, <SEP> 62 <SEP> 99, <SEP> 64
<tb> Tableau n 13
La fonctionnalité des cellules obtenues a été étudiée par des réactions mixtes lymphocytaires allogéniques et autologues, dont les résultats sont présentés à la figure 8.
Les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013, aux trois concentrations testées, présentent une capacité allostimulatrice élevée, comparable à celle des cellules générées en présence de TNF-a.
Là encore, et quelle que soit la concentration de LCOS 1013 utilisée, on observe que les cellules dendritiques cultivées en présence de LCOS 1013 présentent une capacité de stimulation des lymphocytes T autologues beaucoup plus importante que les cellules générées en présence de TNF a.
PROCESS FOR MATURATION OF DENDRITIC CELLS AND ACTIVATION OF MACROPHAGES WITH RU 41740 DESCRIPTION The present invention lies in the field of cell therapy. It relates to a method capable of generating mature dendritic cells and/or activated mammalian macrophages from monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells. Dendritic cells play a critical role in the emergence of the antitumor, anti-infectious and autoimmune immune response. Indeed, dendritic cells are the only cells capable of inducing a primary response from T lymphocytes. They therefore have a key role in the initiation of the immune response. Such a function is related to many morphological properties and surface molecules of dendritic cells. Indeed, thanks to large expansions of their cytoplasmic membrane, dendritic cells have a particularly large contact surface with their environment. In addition, they have a large number of class I and class II histocompatibility antigens on their surface which allow antigenic presentation. After its uptake by the dendritic cell, the antigen undergoes processing before being presented to the T lymphocyte. Processing (reworking), which requires active cellular metabolism, involves four stages: of the antigen, its enzymatic degradation into small peptide fragments in an intracellular compartment, the association of these fragments with class II molecules of the MHC, and the migration of the class II molecule peptide complexes to the surface of the cell presenting the antigen. antigen (CPA) for presentation to the T cell receptor (TcT) of the T helper (Th) lymphocyte. The first step (uptake), which is independent of temperature, is carried out via non-specific receptors or by other mechanisms that are still poorly understood. The larger the molecules, the better they are captured. The second step, which is temperature dependent (it is blocked at 4 degrees), is the internalization of the antigen in the phagosomes which, then, fuse with the lysosomes (intracytoplasmic organelles rich in proteases), thus giving rise to the endosomes at acidic pH. The proteolysis of the antigen into peptide fragments takes place, in these vesicles, under the action, in particular, of cathepsins B, then D. This stage can be blocked by ammonium ions, which inhibit phagosome-lysosome binding, or by chloroquine, which raises the pH of lysosomes. The third step is a complex process still poorly understood in its details, which results in the association between the class II molecule of the MHC, and certain specific fragments of the degraded antigen generally consisting of nine to twenty-five amino acids. The fourth step involves the migration of the class 11 molecule-peptide complex (known as the C3 form) to the surface of the APC. The complex thus formed can then interact with the appropriate RcT on the surface of the Th lymphocyte provided that the molecules of the Major Histocompatibility Complex (MHC) of the lymphocyte belong to the same haplotype as those of the presenting cell (allogeneic restriction). Dendritic cells are also very rich in molecules that co-stimulate the immune response, such as the CD80, CD86, CD40 molecules which respectively activate the CD28, CTLA-4 and CD40L molecules of the T lymphocytes by initiating the immune response. They also have a large number of adhesion molecules, such as the CD54 molecule or the CD11a/CD18 molecule, which facilitates cooperation between dendritic cells and T cells. Another particular characteristic of dendritic cells is to deploy different functions depending on their stage of differentiation. Thus, antigen uptake and processing are the two main functions of the immature dendritic cell, while its ability to present antigen to stimulate T cells increases as dendritic cells migrate into tissues. and the lymph nodes. This change in functionality corresponds to a maturation of the dendritic cell. Thus, the passage from the immature dendritic cell to the mature dendritic cell represents a fundamental step in the initiation of the immune response. This maturation can be easily followed thanks to the evolution of surface markers during this process. The surface markers characteristic of the different stages of dendritic cell maturation are summarized in the table below. EMI3.1 <tb> <SEP> Type <SEP> cellular <SEP> Markers <SEP> of <SEP> surface <tb> Monocytes <SEP> CD14++, <SEP> DR+, <SEP> CD86+, <SEP> CD16+/ -, <MS> CD54+, <MS> CD40+ <tb> Immature <MS> Dendritic Cell <MS> <MS> CD14-, <MS> CD16-, <MS> CD80+/-, <MS> CD83-, <MS > CD86+, <tb> <SEP> CD1a+, <SEP> CD54+, <SEP> DQ+, <SEP> DR++ <tb> Cell <SEP> dendritic <SEP> mature <SEP> CD14-, <SEP> CD83++, <SEP > CD86++, <SEP> CD80++, <tb> <SEP> DR+++, <SEP> DQ++, <SEP> CD40++, <SEP> CD54++, <SEP> CD1a-. <tb> Table 1 The isolation of dendritic cells from peripheral blood is very difficult since less than 1% of white blood cells belong to this category. Similarly, extraction from tissues is impossible in humans and very complex in animals. This is why an important advance was made when it was possible to generate dendritic cells from hematopoietic precursors and monocytes in the presence of different cytokines. The production of dendritic cells from monocytes can be done in the presence of GM-CSF and IL-4 to obtain immature dendritic cells, which will mature after contact with TNF-a or with other agents such as CD40ligand , LPS or media conditioned from macrophages. The latter agents are toxic or complex substances. Similarly, the activation of macrophages in vivo is complex and difficult to control. This is why ex vivo activation represents a suitable means for experimental studies and. therapeutic applications. Activated macrophages are cells found in tissues after activation of the inflammatory process by specific or non-specific inducers. These cells are involved in the elimination of toxic agents, pathogens or altered or cancerous cells. RU 41740, marketed under the Biostim brand by Cassenne Laboratories (France), is a medicinal product composed of glycoprotein extracts obtained from a strain of Klebsiella pneumoniae K2O, (strain 01 K2 NCTC 5055). It is obtained after lysis of the bacterial walls, organic extraction, centrifugation and ultrafiltration. It consists of: -80% glycoproteins - amino acids, lipids and nucleic acids. The glycoprotein part is divided into 3 fractions: P1, F1, F2. P1, of capsular origin, represents approximately 50% of RU 41740, and has an average molecular weight of 95 kD, F1 is of membrane origin and represents approximately 20% of RU 41740, and has an average molecular weight of 350 kD F2 seems to be part of P1. RU 4170 does not cause a pyrogenic effect, as evidenced by the negativity of the Limulus test carried out with this compound. The present invention describes a novel process for the maturation of dendritic cells using, as agent inducing this maturation, RU 41740 or an analogue thereof as defined below. Among the agents allowing the maturation of dendritic cells, TNF-α is the one whose activity has been best characterized. Unfortunately, this lymphokine is very toxic and can elicit extremely violent responses in vivo, which presents a major obstacle to its use in cell therapy. LPS is another compound capable of inducing the maturation of dendritic cells. It also has significant toxicity and induces a powerful pyrogenic effect, which is attested by the positivity of the Limulus test carried out with LPS. It also produces variable results depending on the batch used. Finally, LPS has the disadvantage of degrading very quickly. As for the CD40 ligand (CD40L), it directs the differentiation of dendritic cells in a variable way according to the concentration and the incubation period, which makes it difficult to use in cell therapy. As illustrated in the experimental examples below, RU 41740 makes it possible to induce the maturation of dendritic cells with an efficacy comparable to or greater than the reference agents cited above. It also has several important advantages over these agents. In particular, RU 41740, marketed under the Biostim brand, has been used since 1982 as a drug to stimulate the immune system during chronic infections (chronic bronchitis, otitis, rhinitis, etc.), for curative or preventive purposes. Its perfect tolerance by the body has been demonstrated. In addition, RU 41740 is an extremely stable compound, and the inventors have shown that it induces the maturation of dendritic cells in a very reproducible and dose-dependent manner. From the perspective of cell therapy requiring mature dendritic cells, RU 41740 is therefore particularly interesting, due to its harmlessness and its simplicity of use linked to its stability and the reproducibility of the results obtained. The use of any analogous compound of RU 41740 and exhibiting properties comparable to the latter, in processes such as those described below, obviously falls within the scope of the present invention. In the following, analog of RU 41740 will be called a compound containing 60 to 90% glycoproteins, and capable of inducing, when brought into contact with immature dendritic cells, at concentrations less than or equal to 1 mg/ml, a significant increase in the expression of the CD40, CD83, CD86 and HLA-DR molecules and a very marked decrease in the expression of the CD14 and CD1a molecules by said dendritic cells. Examples of analogues of RU 41740 are LCOS 1013 and LCOS 1014, the manufacturing processes of which are described in example 10. In the rest of the text, and unless otherwise indicated, the term RU 41740 will designate both RU 41740 itself, constituting the active principle of Biostim, than an analogue thereof. An analogue of RU 41740 is defined here as a compound of glycoprotein extracts obtained from a strain of Klebsiella (for example, the strain O1 K2 NC TC 5055 of Klebsiella pneumoniae), by at least the following steps: 'culture of the strain lyses the bacterial walls organic extraction centrifugation ultrafiltration drying Example 10 below presents two processes for producing analogues of RU 41740, designated under the references LCOS 1013 and LCOS 1014. The chemical structure of an analogue of RU 41740 is mainly composed of: carbohydrate = 70% 12 proteins = 20% 6. Lipids, nucleosides and amino acids are present in trace amounts. RU 41470 or an analog thereof has an undetectable bacterial endotoxin level (at 10 pg/ml). RU 41740 is active in all processes using monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells in humans and animals. In addition, RU 41740 makes it possible to obtain activated macrophages from the same starting cells at the same time. The maturation of the dendritic cells by bringing them into the presence of RU 41740 can be attested by their phenotypic properties or by their functional properties. Thus, the invention relates to a process for obtaining mature dendritic cells (Monocyte Dendritic Cells, or MODC) or activated macrophages from monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells, characterized in that said monocytes , precursors or stem cells are brought into contact with RU 41740 or an analogous compound thereof, this compound being chosen such that the contacting of immature dendritic cells with said compound allows the functional maturation of the dendritic cells, attested by their capacity to: - trigger in vitro a primary response against an infectious or tumoral antigen brought into contact with the dendritic cells beforehand and/or during their culture with the T lymphocytes; - induce the proliferation of T lymphocytes in mixed autologous or allogeneic culture. Examples 6, 7, 9, 11 and 12 are an illustration of this process. The invention also relates to a method for obtaining mature dendritic cells or activated macrophages from monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells, characterized in that said monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with RU 41740 or an analogous compound thereof, this compound being chosen such that bringing immature dendritic cells into contact with said compound allows the phenotypic maturation of the dendritic cells, evidenced by a significant increase in the expression of CD40, CD83, CD86, and HLA-DR molecules and a very marked decrease in the expression of the CD14 and CD1a molecules by said dendritic cells. Examples 1 to 3 are an illustration of this process. Furthermore, the natural physico-chemical properties of RU 41740 make it possible to adsorb molecules therein, in particular antigenic molecules. This therefore makes it possible to carry out in a simple manner a non-covalent coupling between the RU41740 and antigenic molecules. It will then be possible to obtain mature dendritic cells specific for antigens adsorbed to RU 41740 or an analogue thereof, by incubating immature dendritic cells with a coupling product between RU 41740 or its analogue and the chosen antigenic molecules . The coupling between RU 41740 or an analog thereof and the antigenic molecules can be carried out by any method known to those skilled in the art. Preferably, the antigens will be adsorbed on the surface of RU 41740 or its analog, but other means of coupling (covalent bond, affinity, etc.) can also be envisaged. The simplest coupling method, by adsorption on the surface of RU41740, has the additional advantage of allowing coupling with essentially non-protein antigenic molecules. The coupling product between RU 41470 or an analog thereof and antigenic molecules, to induce the maturation of dendritic cells or the activation of macrophages, forms part of the present invention. In a preferred embodiment of the coupling products of the invention, the coupling is ensured by a non-covalent bond. A particular coupling product is that of RU41740 or an analogue thereof, with an antigenic molecule which is essentially non-protein in nature. The invention also relates to a process for obtaining mature dendritic cells presenting selected antigens, from monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells, characterized in that said monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with RU 41740 or an analog thereof, coupled to molecules comprising said antigens. In a preferred embodiment of the invention, the methods described above make it possible to obtain mature dendritic cells or activated macrophages by bringing monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells into contact with RU 41740, coupled or not to antigenic molecules. In a preferred implementation of the methods of the invention, the RU 41740 is added to the cell culture medium at a final concentration of between 1 ng/ml and 1 mg/ml, preferentially between 100 ng/ml and 10 ng/ml. ml. In another preferred implementation of the methods of the invention, the monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with an analogue of RU 41740 obtained from the O1 K2 NCTC 5055 strain of Klebsiella pneumoniae. Such an analog is, for example, LCOS 1013 or LCOS 1014, which is added to the cell culture medium at a final concentration preferably between 1 ng/ml and 1 mg/ml, and, even more preferably, between 100 ng/ml and 50 µg/ml. In the methods of the invention, the incubation period of monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells in the presence of RU 41740 or an analogous compound thereof is preferably from 1 to 15 days. Cell therapy is a recent approach consisting in administering to a patient cells modified ex vivo so as to confer on them properties likely to have a beneficial effect for the patient. The natural properties of dendritic cells make them an excellent candidate for cell therapy approaches in several areas of pathology, due to their ability to induce a primary immune response from T lymphocytes. In particular, anti-tumor immunotherapy by administration dendritic cells presenting one or more tumor antigens, is a particularly promising cell therapy approach. The principle of this approach is to present tumor antigens to the immune system, in a particularly effective way, in order to stimulate a response against the cells presenting these antigens. This approach is illustrated in Example 6 below. Example 7 presented below demonstrates that the administration of dendritic cells presenting antigens of microorganisms makes it possible to obtain primary immunization against these microorganisms, and can therefore be used in the fight against -infectious. Another cell therapy approach using dendritic cells is to direct the dendritic cells to a host tolerance response to particular antigens. This can be useful, for example, for inducing tolerance with respect to alloantigens during an allogeneic transplant, to autoantigens during an autoimmune disease, or to allergens during an allergic disease. Indeed, the dendritic cells, under certain culture conditions, can cause an anergy reaction, that is to say the functional inactivation of the T lymphocytes instead of their activation. The culture of dendritic cells in the presence of immunosuppressants such as cyclosporine or histamine leads to a modification of the membrane antigens, which will induce a tolerance response and not a cytotoxic response. This finding could have important implications in the context of organ transplants on the one hand, and treatments for autoimmune diseases on the other hand, such as rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, insulin-dependent diabetes, multiple sclerosis, eczema, psoriasis, etc. and allergic diseases. Example 8 illustrates this approach by showing the influence of cyclosporin A in the presence of RU 41740 on the maturation of dendritic cells. Whatever the type of pathology concerned, cell therapy can be carried out by administering to the human or animal patient autologous, homologous or xenologous cells after their modification ex vivo. The present invention thus relates to a method head than those described above, in which the dendritic cells are treated ex vivo and administered after maturation to a patient, human or animal, in an autologous, homologous or xenologous way, for the prophylaxis, the attenuation or the treatment of cancerous, infectious, allergic, or autoimmune diseases. The use of RU 41740 or of an analogue thereof, for the preparation of a composition comprising mature dendritic cells and/or activated macrophages and/or Langerhans cells of the skin, also falls within the scope of the present invention. The inventors have shown that RU 41740 makes it possible to induce the maturation of Langerhans cells in vitro (Example 4). This property could therefore be advantageously used to promote an immune response in the skin or mucous membranes, by topical administration of a composition comprising RU 41740. Examples of indications for such a composition are in particular gingivitis and periodontitis. . The use of RU 41740 or an analogue thereof, for the preparation of a pharmaceutical composition for topical or systemic administration, therefore also forms part of this invention. In another aspect of the invention, RU 41740 or an analog thereof is coupled to one or more antigens of interest, then administered directly in vivo to induce the production by the organism of mature dendritic cells or activated macrophages presenting said antigens. In this embodiment of the invention, RU 41740 or its analog actually serves as a vector for the antigens of interest, and allows the presentation of these antigens to the immune system in such a way that it induces the production of dendritic cells. mature or activated macrophages presenting said antigens. The invention therefore relates to a method such as those described above, in which the mature dendritic cells or the activated macrophages are produced directly in vivo. The use of a coupling product between RU 41470 or an analog thereof and one or more antigens, for the preparation of a composition capable of inducing the production of mature dendritic cells or activated macrophages presenting said antigens, also falls within the scope of this invention. The mature dendritic cells obtained by methods such as those described above can be used in the treatment of various types of pathologies, in particular in anti-tumor immunotherapy, in the fight against infection, or to increase the tolerance of the organism. against specific antigens. In a preferred implementation of the invention, the dendritic cells obtained by a method as described above are used in the manufacture of a composition capable of promoting an antitumor immune response. Likewise, the use of dendritic cells obtained by a method of the present invention, in the manufacture of a composition capable of promoting an immune response against an infection by a microorganism, is an integral part of the invention. In another preferred embodiment of the invention, the dendritic cells obtained by a method as described above are incubated in the presence of an immunosuppressant, and used in the manufacture of a composition capable of modifying the immune response in the direction of a tolerance. Mature dendritic cells produced by the methods of the invention can also be used to identify minor histocompatibility antigens. This technique consists of recovering monocytes by differentiating them into mature dendritic cells, then using them as stimulating cells in a mixed lymphocyte culture reaction between individuals of the same compatible HLA family. This system makes it possible to detect disparities concerning minor histocompatibility antigens and to be able to deepen the compatibility or incompatibilities between people of the same family, which has certain advantages in the field of tissue and organ transplants in intra familial or even extra-familial. The use of dendritic cells obtained by a method of the invention, for the detection and/or characterization of histocompatibility antigens, also forms part of the present invention. The examples and figures presented below without limitation will make it possible to highlight certain advantages and characteristics of the present invention. FIG. 1 represents the evolution of cell markers during the differentiation of monocytes into dendritic cells at D0 (dotted curves = monocyte markers before treatment), D6 (thin line curves = immature dendritic cells), and D8 (curves in bold lines=mature dendritic cells), after addition of RU 41740 at 25 pg/ml from D6. Figure 2 illustrates the generation of thyrocalcitonin peptide-specific cytotoxic T lines. The abscissa indicates the effector/target ratio used, while the ordinate indicates the percentage of lysis of the target cells. Figure 3 demonstrates the presentation of tetanus toxin by dendritic cells derived from human monocytes cultured in the presence of GM CSF, IL-4 and RU 41740. The ordinate indicates the incorporation of tritiated thymidine, measured in counts per minute (cpm ). Figure 4 illustrates the influence of cyclosporin A (CsA) on the maturation of dendritic cells derived from monocytes cultured in the presence of GM-CSF, IL-4 and RU 41740. The curves, obtained by flow cytometry, show the expression of CD83 in the absence of CsA (4A) and in the presence of CsA at 5 μg/ml (4B). Figures 4C and 4D show the same curves for another dendritic cell marker, the DC Lamp antigen. The dotted curves were obtained with an anti-KLH primary antibody, irrelevant for dendritic cells. FIG. 5 shows the orientation of the immune response towards a Th2 type immune response by dendritic cells derived from monocytes and treated with cyclosporin A (CsA). The ordinate represents respectively the secretion of IL-12 (FIG. 5A) and the ratio of secretion of cytokines IFN-γ/IL-10 (Th1/Th2) (FIG. 5B) by dendritic cells derived from monocytes cultured in the presence of GM-CSF, IL-4 and RU 41740, and treated with cylosporin A at 5 Hg/ml (black column) or not (white columns). Three experiments are shown for each condition. The results are presented as a percentage relative to monocyte cells not treated with cyclosporine, the measurements of which have been reduced to 100. Figure 6 shows the results of mixed allogeneic lymphocyte reactions, carried out with dendritic cells obtained from purified monocytes of three different donors. Two types of dendritic cells were compared, the maturation of which was induced either by TNF-α (200 U/ml), or by LCOS 1013 (25 pg/ml) (curve denoted LCOS ), for 48 hours. The horizontal axis corresponds to the number of irradiated dendritic cells deposited in each well, for a constant quantity of 105 T lymphocytes per well. The proliferation of T lymphocytes, stimulated by dendritic cells, is determined after 4 days of culture by incorporation of tritiated thymidine (vertical axis). FIG. 7 shows the results of mixed autologous lymphocyte reactions, carried out with dendritic cells obtained from monocytes purified from three different donors. Two types of dendritic cells were compared, the maturation of which was induced either by TNF-α (200 u/ml), or by LCOS 1013 (25 μg/ml) (curve denoted LCOS ), for 48 hours. The horizontal axis corresponds to the number of irradiated dendritic cells deposited in each well, for a constant quantity of 105 T lymphocytes per well. The proliferation of T lymphocytes, stimulated by dendritic cells, is determined after 5 days of culture by incorporation of tritiated thymidine (vertical axis). Figure 8 shows the results of mixed allogeneic and autologous lymphocyte reactions, carried out with dendritic cells whose maturation was induced either by TNF-a (200 u/ml), or by LCOS 1013 at 5, 10 or 25 Hg /ml (curves noted LCO ), for 48 hours. The graphs were obtained in the same way as the graphs of Figures 6 and 7, respectively. All the techniques of cell culture, cell labeling, phenotyping by fluorometry, etc..., as well as the reagents (antibody, tetanus toxin,...) used in the experiments described in the following examples, were detailed in an article by Karine Duperrier et a/., Journal of Immunological Methods 238 (2000), p. 119-131. Example 1 Process for the production of dendritic cells from human monocytes with RU 41740 Peripheral blood is taken from the subject concerned. This blood is then centrifuged for 20 minutes at 200 g so as to reduce the contamination of peripheral blood cells by platelets. The upper part containing most of the platelets and the plasma is carefully removed before purifying the mononuclear cells by centrifuging them on a Ficoll separation gradient whose density is 1.077. The layer of mononuclear cells is recovered then washed twice in a PBS buffer and deposited on a gradient containing 4 discontinuous densities of Percoll to isolate the monocytes. This gradient consists of dilutions of an isotonic solution of percoll at a rate of 75% (6.5 ml), 50.5% (15 ml), 40% (3.5 ml) and 30% (3 ml) in a Dulbecco's medium without magnesium or calcium and containing 5% human serum. 75 to 100 million cells are thus deposited on each tube and centrifuged at 1000 g for 25 minutes at 4 C. Low density cells, mainly monocytes, are harvested at the interface between the 40% and 50.5% dilution, and washed twice in PBS. They are then resuspended in a culture medium, then deposited in culture plates containing 6 wells at a density of 5 x 106 cells per well in a final volume of 3 ml and left to adhere for 1 hour at 37 C. It is possible to substitute this adhesion step by additional purification of the monocytes using a negative purification system using a mixture of monoclonal antibodies combining an anti CD3, CD7, CD19, CD45A, CD56 and anti-IgG using a. Macs-type microbead system (Miltenyi Biotec). This additional purification makes it possible to obtain concentrations of monocytes having a purity greater than 90%. The cells are then cultured in culture wells at 37° C. under 5% C02. The medium, which comprises RPMI, contains 200 IU/ml of recombinant human GM-CSF, 500 IU/ml of recombinant human IL-4 in a final volume of 6 ml. On day 3 and day 5, the cultures are renewed by eliminating 3 ml and adding 3 ml of fresh medium with the cytokines. On the 6th day, the cells are transferred into Teflon pots and cultured at a density of 5 x 105 cells per pot under 3 ml in the presence of RU 41740 at different concentrations or recombinant human TNF-a at a rate of 200 IU/ml for 2 days. The cells are harvested on the 8th day, washed and cultured in the absence of stimulation for an additional 3 days. At the end of the culture, the quality of the maturation is evaluated by the expression of the molecules CD80,83,86,14,1a, HLA-DR on the surface of the cells. The markings reveal that more than 80% of the viable monocytes have matured into dendritic cells characterized by the following phenotype: CD83+, CD86++, CD80++, HLA-DR+++, CD1a-, CD14-, CD40+++, CD54++, which places them in the group of highly differentiated tissue dendritic cells. Figure n 1 indeed shows that the HLA-DR, HLA-DQ, CD40, CD54, CD80, and CD86 molecules are present on the majority of the cells at D8, after addition of RU 41740 at 25 pg/ml, whereas the CD14 molecule is almost no longer expressed. In order to study the action of RU 41740 on the maturation of dendritic cells (DC), different concentrations of the molecule were tested and compared with the action of TNF. The following 3 experiments (a, b, c) were carried out using monocytes from the same donor. a) The concentrations of RU 41740 tested here are 0.1 ng/ml, 1 ug/ml, and 10 ug/ml. Table 2 presents the results obtained, with regard to the percentage of labeled cells and the average intensity of fluorescence (IFM). EMI19.1 <tb> <SEP> JO <SEP> D6 <SEP> D8 <tb> <SEP> Cells <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 < MS> TNF-alpha <tb> <MS> Monocytes <MS> Dendritic <tb> <MS> Undifferentiated <tb> <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <tb> HLA-DR <MS> 98.9 <MS> 275 <MS> 98.3 <MS> 552 <SEP> 98.7 <SEP> 978 <SEP> 99.1 <SEP> 1164 <SEP> 98.9 <SEP> 1195 <SEP> 98.9 <SEP> 1225 <tb> CD <SEP> 40 <SEP > 97.8 <SEP> 128 <SEP> 97.5 <SEP> 464 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 1340 <SEP> 98 <SEP> 1205 <SEP> 98.2 <SEP> 1328 < MS> 98.4 <MS> 1603 <tb> CD54 <MS> 98.6 <MS> 41 <MS> 95.6 <MS> 85 <MS> 96.4 <MS> 220 <MS> 96 <MS> 210 <MS> 95, <MS> 6 <MS> 282 <MS> 97.4 <MS> 295 <tb> CD86 <MS> 96.5 <MS> 52 <MS> 69.9 <MS> 77 <MS > 98.8 <MS> 310 <MS> 98.5 <MS> 290 <MS> 98 <MS> 303 <MS> 98.8 <MS> 326 <tb> CD83 <MS> 0.2 <MS> 325 <MS> 5.5 <MS> 119 <MS> 82.1 <MS> 156 <MS> 76.1 <MS> 165 <MS> 84.7 <MS> 184 <MS> 84.5 <MS> 173 <tb> HLA-DQ <MS> 24, <MS> 2 <MS> 48 <MS> 63.2 <MS> 61 <MS> 86.4 <MS> 160 <MS> 88.8 <MS> 153 < MS> 84.1 <MS> 174 <MS> 84, <MS> 3 <MS> 157 <tb> CD <MS> 80 <MS> 0.1 <MS> 46 <MS> 3, <MS> 1< MS> 112 <MS> 60.5 <MS> 173 <MS> 50.1 <MS> 187 <MS> 70 <MS> 250 <MS> 62, <MS> 1 <MS> 129 <tb> CD <MS > 14 <SEP> 96.2 <SEP> 5395 <SEP> 1.9 <SEP> 199 <SEP> 1.55 <SEP> nd <SEP> 0, <SEP> 97 <SEP> nd <SEP> 1, 06 <SEP> nd <SEP> 0.87 <SEP> nd <tb> Table 2: Percentage (%) of labeled cells and mean fluorescence intensity (IFM) of the marker considered. These results are expressed with a margin of error of +/-2.5%. After 8 days of culture, the expression of the CD14 molecule has disappeared (percentage less than 1.5%), whatever the culture conditions. The average fluorescence intensity (IFM) of the labeling of the HLA-DR, CD40, CD54 and CD86 molecules appears lower in the presence of the doses of RU 41740 used than in the presence of TNF-α. On the other hand, the CD83 and HLA-DQ molecules are slightly more expressed in the presence of a concentration of RU 41740 of 10 μg/ml than with TNF-α. In addition, the IFM of the CD80 molecule always appears to be greater in the presence of RU 41740. From these results, it is seen that RU 41740 induces the maturation of dendritic cells, even at low concentrations. However, the MFI of the various markers appears to be increased for the highest concentrations of RU 41740 tested, approaching the results obtained in the presence of TNF-α. The action of RU 41740 on dendritic cells at higher concentrations was therefore investigated in a second series of experiments. b) The concentrations of RU 41740 tested for this are 5 g/ml, 1 Opg/ml, and 50 Ng/ml. The results are presented in Table No. 3. The IFM of the various adhesion molecules, costimulation molecules, HLA class II molecules appears to be increased depending on the concentration of RU 41740 added to the culture medium. The CD40 molecule always exhibits a lower IFM in the presence of RU 41740 compared with the concentration obtained in the presence of TNF-alpha. CD83, which is the specific marker of maturation, has a percentage and an intensity of fluorescence which also increase according to the quantity of RU 41740. The HLA-DQ molecule shows a maximum of expression with 10 ug/ml of RU 41740. EMI21.1 <tb> <SEP> JO <SEP> D6 <SEP> D8 <tb> <SEP> Monocytes <SEP> Cells <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF <tb> <SEP> dendritic <SEP> 5Ng/ml <SEP> 10pg/mi <SEP> 50pg/ml <SEP> alpha <tb> <SEP> undifferentiated <SEP> 200 < MS> IU/ml <tb> <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <MS > % <MS> IFM <tb> HLA-DR <MS> 99.2 <MS> 275 <MS> 98.3 <MS> 552 <MS> 98.9 <MS> 1207 <MS> 99, <MS> 1 <MS> nd <MS> 99.3 <MS> nd <MS> 99.1 <MS> 946 <tb> CD <MS> 40 <MS> 97.8 <MS> 128 <MS> 97.5 < MS> 464 <MS> 99.8 <MS> 1417 <MS> 99, <MS> 4 <MS> 1441 <MS> 99.8 <MS> 1507 <MS> 99, <MS> 6 <MS> 1728 < tb> CD54 <MS> 98.6 <MS> 41 <MS> 95.6 <MS> 85 <MS> 97.1 <MS> 195 <MS> 97 <MS> 216 <MS> 98.2 <MS> 255 <MS> 95.6 <MS> 255 <tb> CD86 <MS> 96, <MS> 5 <MS> 52 <MS> 69, <MS> 9 <MS> 77 <MS> 98, 9 <MS> 267 <MS> 98, <MS> 7 <MS> 271 <MS> 99, <MS> 7 <MS> 248 <MS> 99.5 <MS> 273 <tb> CD83 <MS> 0.2 <MS> 325 <MS> 5.5 <MS> 119 <MS> 67.9 <MS> 132 <MS> 74, <MS> 6 <MS> 147 <MS> 84.8 <MS> 159 <MS> 89.5 <MS> 196 <tb> HLA-DQ <MS> 24.2 <MS> 48 <MS> 63.2 <MS> 61 <MS> 68.5 <MS> 189 <MS> 85.9 <MS> 191 <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 143 <SEP> 84.2 <SEP> 183 <tb> CD <SEP> 80 <SEP> 0.1 <SEP> 46 <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 112 <SEP> 63 <SEP> 86, <SEP> 7 <SEP> 64.6 <SEP> 101 <SEP> 76.1 <SEP> 95, <SEP> 8 <SEP> 70.5 <SEP > 93, <SEP> 5 <tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96.2 <SEP> 5395 <SEP> 1.9 <SEP> 199 <SEP> 0.47 <SEP> nc <SEP> 1, 1 <MS> n <MS> 0.66 <MS> nd <MS> 0, <MS> 61 <MS> nd <tb> CD <MS> 1 <MS> a <MS> 2, <MS> 52 < MS> nd <MS> 1.55 <MS> nd <MS> 2, <MS> 9 <MS> nd <MS> 0, <MS> 21 <MS> nd <tb> Table 3: Percentage (%) of labeled cells and mean fluorescence intensity (IFM) of this label (nd = not determinable). These results have a margin of error of +/-2.5%. With a higher concentration (50 pg/ml) of RU 41740, compared to the experiment in Table 2, the IFM of the CD40 and CD54 molecules increased, while other IFMs decreased (CD86 and HLA DQ molecules ). Some markers, such as CD80 and CD54, are expressed with the same intensity after maturation with 50 µg/ml of RU 41740 or with TNF-α. Concentrations of RU 41740 bordering 50 g/ml were then tested, in a third series of experiments. c) The concentrations of RU 41740 tested are 25 g/ml, 50 μg/ml, and 100 μg/ml. The results are shown in Table 4. EMI22.1 <tb> <SEP> JO <SEP> D6 <SEP> D8 <tb> <SEP> Monocytes <SEP> Cells <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-alpha <tb> <SEP> Dendritic <SEP> 25Ng/ml <SEP> 50Ng/ml <SEP> 1OOpg/ml <SEP> 200 <SEP > IU/ml <tb> <SEP> undifferentiated <tb> <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <SEP> IFM <SEP> % <MS> IFM <MS> % <MS> IFM <tb> HLA-DR <MS> 99.2 <MS> 275 <MS> 98, <MS> 3 <MS> 552 <MS> 98, <MS> 5 <SEP> 630 <SEP> 97.5 <SEP> 823 <SEP> 99.4 <SEP> 682 <SEP> 99.4 <SEP> 694 <tb> CD <SEP> 40 <SEP> 97.8 <SEP > 128 <SEP> 97, <SEP> 5 <SEP> 464 <SEP> 99.7 <SEP> 1592 <SEP> 99.1 <SEP> 1958 <SEP> 99, <SEP> 8 <SEP> 2088 <SEP >99, <MS> 3 <MS> 1480 <tb> CD54 <MS> 98, <MS> 6 <MS> 41 <MS> 95, <MS> 6 <MS> 85 <MS> 98, <MS> 5 <MS> 280 <MS> 97.2 <MS> 321 <MS> 98.9 <MS> 361 <MS> 98.2 <MS> 249 <tb> CD86 <MS> 96.5 <MS> 52 <MS > 69.9 <MS> 77 <MS> 99, <MS> 3 <MS> 284 <MS> 98.3 <MS> 291 <MS> 99.6 <MS> 295 <MS> 99, <MS> 5 <MS> 284 <tb> CD83 <MS> 0.2 <MS> 325 <MS> 5, <MS> 5 <MS> 119 <MS> 86, <MS> 6 <MS> 192 <MS> 91.2 <MS> 227 <MS> 92.8 <MS> 213 <MS> 89 <MS> 166 <tb> HLA-DQ <MS> 24, <MS> 2 <MS> 48 <MS> 63.2 <MS> 61 <SEP> 79 <SEP> 109 <SEP> 84, <SEP> 8 <SEP> 123 <SEP> 78, <SEP> 8 <SEP> 118 <SEP> nd <SEP> nd <tb> CD <SEP> 80 <MS> 0.1 <MS> 46 <MS> 3, <MS> 1 <MS> 112 <MS> 74 <MS> 128 <MS> 82, <MS> 4 <MS> 165 <MS> 90, <SEP> 8 <SEP> 196 <SEP> nd <SEP> nd <tb> CD <SEP> 14 <SEP> 96.2 <SEP> 5395 <SEP> 1.9 <SEP> 199 <SEP> 1.03 <SEP> nd <SEP> 4.07 <SEP> nd <SEP> 1.75 <SEP> nd <SEP> 3, <SEP> 27 <SEP> nd <tb> Table n 4: Percentage (%) of cells labeled and mean fluorescence intensity (IFM) of this label (nd = not determinable). These results have a margin of error of +/-2.5%. The CD40, CD54, CD86 and HLA-DR molecules are present on more than 97% of the cells with the three concentrations. RU 41740. Their MFIs are comparable to those obtained with TNF-a, for a concentration of 25 pg/ml of RU 41740. However, in this experiment, they continue to increase with higher concentrations of RU 41740. The CD 83 is present on a very high percentage of cells at 100 μg/ml and at 50 μg/ml, higher than the results obtained with TNF-α. Its IFM appears more important with 50 pg/ml. At 100 ug/ml of RU 41740, the fluorescence intensities of HLA-class II molecules tend to decrease, which may suggest that this concentration is a limiting concentration of RU 41740. All the experiments suggest that the optimal dose of RU 41740 is between 10 and 50 pg/ml. Example 2 Process for producing dendritic cells from human hematopoietic CD34+ stem cells with RU 41740 Experimental conditions: Purification: After ficoll, the CD34+ represented 4.2% of the mononuclear cells (CMN). After purification by positive selection with the MAC System method (Miltenyi Biotec) with beads coated with an anti-CD34 antibody, 90% of the cells are CD34+. Cultivation: culture medium: RPMI containing 10% FCS, 2% penicillin/streptomycin, 1% glutamine, and 1% sodium bicarbonate. Culture in 2 ml wells with 5.105 cells per well. - cytokines present in the culture medium: from D0 to D5: SCF at 25 ng/ml, GM-CSF at 100 ng/ml and either TNF-a at 2.5 ng/ml, or RU 41740 at 6.25ng/ml , from D5 to D14: GM-CSF at 100 ng/ml. Doubling of the cultures: - the cells are homogenized in the well, then 1 ml is taken and deposited in a new well. 1 ml of culture medium is then added to the new well and to the old one, as well as GM-CSF depending on the medium added. Markers: CD34-CD45-CD14-HLA-D. R-CD40-CD54-CD83-CD86-CD1a. A fluorescently labeled anti-KLH primary antibody was used as a control to subtract nonspecific fluorescence from the signals obtained. # Results: EMI25.1 <tb> <SEP> D8 <SEP> D12 <SEP> D14 <tb> <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-a <SEP> RU <SEP > 41740 <MS> TNF-a <MS> RU <MS> 41740 <tb> CD14 <MS> 40 <MS> 37 <MS> 63.2 <MS> 47.4 <MS> 54.1 <MS> 52 .5 <tb> CD34 <MS> 0.7 <MS> 17 <tb> CD45 <MS> 96 <MS> 96 <tb> CD83 <MS> 0.5 <MS> 0, <MS> 2 <MS> 1.3 <MS> 1.3 <MS> 0.8 <MS> 1 <tb> CD86 <MS> 13 <MS> 11 <MS> 7.4 <MS> 10.8 <MS> 2, <MS > 2 <MS> 4.7 <tb> CD1a <MS> 87 <MS> 17 <MS> 8.4 <MS> 17.5 <MS> 10.3 <MS> 28, <MS> 9 <tb> CD40 <MS> 44 <MS> 38 <MS> 64.3 <MS> 59.4 <tb> CD54 <MS> 33 <MS> 56 <MS> 61.8 <MS> 57.9 <tb> HLA < MS> DR <MS> 88 <MS> 80 <MS> 80, <MS> 3 <MS> 65, <MS> 3 <MS> 69.9 <MS> 69, <MS> 54 <tb> HLA <MS > DQ <SEP> 54, <SEP> 1 <SEP> 52, <SEP> 3 <tb> CD80 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 16 <tb> Table n 5: percentage of cells expressing a marker cells at different culture times. CD1a is more expressed with RU 41740 (17.5% of cells at D12) than with TNF-a, unlike CD14, which is more expressed with TNF-a at the cell surface. The expression levels in the presence of RU 41740 of CD40, CD54 or HLA-DR are almost identical to the expression levels in the presence of TNF-α. CD83 is not expressed under any conditions. Example 3 Process for the Production of Dendritic Cells from CD34+ Cells of Human Cord Blood with RU 41740 The experimental conditions are similar to Example 2, except that the cells are derived from cord blood: Purification: After ficoll, CD34+ cells represent 0.83% of mononuclear cells (CMN). After purification by positive selection, 18.1% of CD34+ is obtained. 2.106 cells were obtained. Doubling: on D6, D7, D8, D10 and D12 * Results: The results are presented in table n 6. EMI27.1 D7 <SEP> D9 <SEP> D10 <SEP> D12 <SEP> D13 <SEP> D14 < tb>TNF-α <SEP> RU <SEP> 414740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <SEP> TNF-α <SEP> RU <SEP> 41740 <tb> (200 <SEP> IU/min) <SEP> (10 <SEP> g/ml) <tb> CD14 <SEP> 32 <SEP> 20.39 <SEP> 59 .6 <MS> 43.52 <MS> 60 <MS> 50.05 <MS> 66.77 <MS> 59.23 <MS> 57.73 <MS> 52.28 <MS> 46.77 <MS > 30.88 <tb> CD34 <MS> 19.79 <MS> 19.92 <MS> 2.53 <MS> 2.94 <MS> 2.26 <MS> 2.08 <MS> 0.69 <MS> 1.25 <MS> 0.45 <MS> 0.61 <MS> 0.38 <MS> 0.57 <tb> CD45 <MS> 99.84 <MS> 97.57 <MS> 99 .96 <MS> 99.76 <MS> 99.97 <MS> 99.86 <MS> 99.85 <MS> 99.92 <MS> 99.69 <MS> 99.82 <MS> 99.93 <MS> 99.91 <tb> CD16 <MS> 2.24 <MS> 3.68 <MS> 2.16 <MS> 2.78 <MS> 2.11 <MS> 4.89 <tb> CD83 <MS> 1.09 <MS> 0.39 <MS> 4.24 <MS> 4.9 <MS> 2.46 <MS> 1.19 <MS> 0.71 <MS> 1.35 <MS > 3.19 <MS> 3.41 <MS> 1.22 <MS> 0.83 <tb> CD86 <MS> 11.61 <MS> 11.97 <MS> 22.23 <MS> 13.69 <MS> 9.23 <MS> 7.48 <MS> 13.94 <MS> 11.91 <MS> 12.78 <MS> 17.1 <MS> 19.33 <MS> 10.56 <tb > CD1a <MS> 4.41 <MS> 13.95 <MS> 23.75 <MS> 20.32 <MS> 20.63 <MS> 22.68 <MS> 27.9 <MS> 20.14 <MS> 36.13 <MS> 23.67 <MS> 34.2 <MS> 16.63 <tb> CD40 <MS> 75.91 <MS> 55.23 <MS> 63.35 <MS> 56 .02 <MS> 64.56 <MS> 41.47 <tb> CD54 <MS> 74.66 <MS> 65.62 <MS> 61.7 <MS> 58.57 <MS> 64.4 <MS > 41.69 <tb> HLA <SEP> DR <SEP> 81.34 <SEP> 73.8 <SEP> 73.04 <SEP> 63.28 <SEP> 57.84 <MS> 37.69 <tb > Table n 6 PERCENTAGE OF LABELED CELLS CD34+ cord blood cells cultured up to D6 with GM-CSF, SCF and RU 41740 (10 g/ml) or TNF-α (200 U?ml), then from D6 to D14 with GM-CSF In the two culture protocols, the expression of surface molecules evolves with the same trends: - increase in CD14 until D12 then decrease - decrease then disappearance of the CD34 molecule on D12 - very low expression of CD83 and CD16 which remains stable. CD1a is expressed early on D7 on the cells with RU 41740 then stabilizes at around 23% on D14, which reveals faster kinetics with RU 41740 than with TNF-a. After D12, the CD40, CD54 and HLA-DR molecules are less expressed in the presence of RU 41740 than in the presence of TNF-a. Example 4: Process for Differentiating Langerhans Cells. Stem cells are obtained after passage through a cord blood ficoll gradient. The CD34+ mononuclear cells are purified by positive selection with an anti-CD34 monoclonal antibody (Immu 133.3, Immunotech Marseille, France). After purification, the cells are more than 90% CD34+. These CD 34+ cells are then cultured in the presence of GM-CSF (100 ng/ml), and TNF-α (2.5 ng/ml) or RU 41740 (10 μg/ml) for 12 days in an RPMI- 10% FCS-2% streptomycin penicillin, 1% glutamine-1% sodium bicarbonate and 10 mM HEPES. At the end of the culture on D12, the cells are labeled with the anti CD1a, CD14, Lag, E-Cadherin, DR and DQ antibodies so as to identify the Langerhans cells which are Lag+, CD1a+, CD14-, DR+ and DQ+. The results, presented in Table No. 7, show a better efficacy of RU 41740 compared to TNF-α for the differentiation of Langerhans cells. EMI29.1 <MS> TNF-a <MS> RU <MS> 41740 <tb> CD1a+ <MS> DR+ <MS> 8 <MS> % <MS> 17 <MS> % <tb> Lag+ <MS> DR+ < SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> % <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> % <tb> Table No. 7 Example 5: Method for producing mature dendritic cells from dog mononuclear cells with the RU 41740 An elutriator is a device that allows cells to be subjected to two opposing forces, one centrifugal and the other centripetal, in a liquid medium. This makes it possible to separate the cells according to their size and their density, while maintaining them in their physiological environment. This method is particularly advantageous for separating dog cells (monocytes/lympocytes) which form aggregates in ficoll-like gradients. ELUTRIATION MEDIUM: PBS 1X-SVF 2%-EDTA 0.01% PREPARATION OF MONONUCLEE CELLS: The blood bag is taken on CPD (citrate phosphate dextrose), the blood is diluted with sodium chloride, centrifuged at 800 rpm /min for 15 min without brake to eliminate a maximum of platelets. A ficoll is carried out at 1600 rpm for 25 min without brake. The CMNs are recovered, and washed twice with PBS (the first to deplate). The cell concentration is 5.106 cells/ml in PBS or in the elutriation medium. PROTOCOL FOR OBTAINING MONOCYTES: Flow rate: 25 ml/min (adjustment at the pump according to the calibration line) Vary the centrifugation speed: loading cells at 3200 rpm at 300 ml 3000 rpm at 250 mi 2700 rpm at 200 ml 2500 rpm at 200 ml 2300 rpm at 200 ml 2100 rpm at 200 ml Rotor off at 200 ml RESULTS The fraction obtained at 2700 rpm contains monocytes with a purity greater than 80 %. CULTURE Dog monocytes are cultured in the same way as human monocytes and with the same human differentiation factors: GM-CSF, TNF or RU 41740. On the other hand, IL4 is specific to the canine species. The dendritic cells thus obtained have the same morphology with dendrites, but the surface markers are not comparable to those of humans although they are CD14-, DR+ and DQ+, because we do not have specific antibodies in this species. RU 41740 has the same effects as TNFα. Example 6: Use of mature dendritic cells in the emergence of an antitumor response. Thyrocalcitonin is a relatively poorly immunogenic tumor antigen that is highly expressed in medullary thyroid cancers. In the system used, the inventors were able to produce T lymphocyte clones directed against thyrocalcitonin. These are cytotoxic clones capable of having an antitumor activity in thyrocalcitonin cancers. Figure 2 illustrates the generation of thyrocalcitonin peptide-specific cytotoxic T lines. Dendritic cells derived from monocytes after culture in the presence of GM-CSF, IL-4 and RU 41740, are incubated with the peptide of thyrocalcitonin, then cultured in the presence of autologous T lymphocytes in order to induce the activation of lymphocytes Peptide-specific T. After several stimulations of T lymphocytes using dendritic cells then EBV cells incubated with the peptide, lines of cytotoxic T cells (H10 and B7) capable of specifically lysing target EBV cells incubated with the thyrocalcitonin peptide, were could be generated. Example 7 Use of Mature DCs in Anti-Infectious Activities By using tetanus toxoid as antigen presented by MODCs (Monocyte Dentritic Cells), it was possible to generate anti-tetanus toxoid cytotoxic lines, which clearly demonstrates that this system makes it possible to have primary immunization against antigens of the infectious type. FIG. 3 represents a secondary response of anti-tetanus toxin lines by dendritic cells derived from human monocytes cultured in the presence of GM-CSF, IL-4 and RU 41740. Example 8: Use of mature dendritic cells in the induction of a tolerance response. Dendritic cells, under certain culture conditions, can cause an anergic reaction. The culture of these cells in the presence of immunosuppressants such as cyclosporine or histamine leads to a modification of the membrane antigens which will induce a tolerance response and not a cytotoxic response. In this way, it is therefore possible to educate the dendritic cells to orient them towards a reaction of tolerance. As an example we give the influence of Cyclosporin A (CsA) on the maturation of dendritic cells. Purified monocytes were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 for 6 days and in the presence of RU 41740 for 2 more days, in a medium containing 10% human type AB serum. 1 g/ml or 5 g/ml of CsA were added or not from the start of the culture. The expression of the HLA-DR, CD83, CD86, CD80, CD40 and CD1a molecules was analyzed by flow cytometry (table no. 8). EMI32.1 <MS> without <MS> CsA <MS> CsA <MS> (1 <MS> pg/ml) <MS> CsA <MS> (5pg/ml) <tb> <MS> % <MS> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <SEP> % <SEP> SD <SEP> IFM <tb> HLA-DR <SEP> 99 <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1605 <SEP> 98.8 <SEP> 0. <SEP> 9 <SEP> 1504 <SEP> 99.2 <SEP> 0. <SEP> 7 <SEP> 1101 <tb> CD40 <SEP> 98.9 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP> 1697 <SEP> 98.4 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 8 <SEP> 1314 <SEP> 99 <SEP> ¯ <SEP> 0. <SEP> 6 <SEP > 1278 <tb> CD86 <SEP> 97.7 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 8 <SEP> 373 <SEP> 98.6 <SEP> ¯ <SEP> 1. <SEP> 2 <SEP> 318 <SEP > 96.4 <SEP> ¯ <SEP> 3. <SEP> 3 <SEP> 253 <tb> CD83 <SEP> 77.1 <SEP> ¯ <SEP> 8. <SEP> 5 <SEP> 169 <SEP> 64.2 <SEP > 20 <SEP> 170 <SEP> 49.9 <SEP> ¯ <SEP> 6. <SEP> 2 <SEP> 132 <tb> CD80 <SEP> 78.1 <SEP> ¯ <SEP> 5. <SEP> 6 <SEP > 216 <SEP> 68.9 <SEP> ¯ <SEP> 2. <SEP> 6 <SEP> 162 <SEP> 58.3 <SEP> 17 <SEP> 143 <tb> CD1a <SEP> 14. <SEP> 3 <SEP > ¯ <SEP> 9. <SEP> 5 <SEP> 45. <SEP> 5 <SEP> 27 <SEP> ¯ <SEP> 7 <SEP> 74 <SEP> 25.9 <SEP> 6.5 <SEP> 78 <tb > Table No. 8 This study demonstrates that cyclosporine causes a clear reduction in the expression of the CD83 and CD80 molecules as well as an increase in the expression of CD1a. A graphic analysis (FIG. 4) actually reveals the existence of two cell populations, one CD83+ and the other CD83- which is endowed with immunoregulatory properties. Indeed, dendritic cells in the presence of CsA (CsA-MODC) are capable of directing the response of T lymphocytes towards a TH2 type response which promotes a common suppressive reaction. Figure 5 illustrates this polarization of the immune response towards a Th2 type response by dendritic cells derived from monocytes and treated with cyclosporin A. The dendritic cells derived from monocytes cultured in the presence of GM-CSF, IL-4 and RU 41740 , and treated with cylosporin A, secrete less IL-12 than untreated dendritic cells (FIG. 5A). In addition, the ratio of IFN-γ/IL-10 (Th1/Th2) cytokine secretion by T cells is decreased when the T cells are stimulated by dendritic cells treated with cyclosporin A (FIG. 5B). Example 9: Use of mature DCs to induce a mixed allogeneic or autologous lymphocyte culture. In the presence of mature MODC, the allogeneic T lymphocytes, on the 6th and even on the 8th day, are endowed with an extremely significant proliferation, very largely superior to what is observed with the use of allogeneic T lymphocytes and allogeneic monocytes . The same is true for an autologous mixed culture. Mixed autologous lymphocyte cultures were therefore induced by monocyte-derived cells (MODCs) generated in the presence of GM-CSF (200 IU/ml), IL-4 (500 IU/ml) and RU 41740 (10 pg /ml) Ten thousand MODCs, irradiated at 30 Grays, are cultured with different lymphocyte subpopulations sorted either by Dynal magnetic beads (CD4+ and CD8+), or with the FACS Calibur sorting module (CD8 CD28-, and CD8bri9h', CD28+ autos). In table 8, the values indicated represent the incorporation of tritiated thymidine after autologous mixed culture, except (**). The experiments are carried out in triplicate, except (*), in duplicate. EMI35.1 Condition <SEP> Values <SEP> Test <SEP> Student <SEP> by <SEP> report <SEP> Condition <SEP> Mean <SEP> Standard deviation <tb> at <SEP> control <SEP> negative <tb> p= <tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 7898 <SEP> 10720 <SEP> 8613 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) < MS> + <MS> 9077 <MS> 692 <tb> (35,000 <MS> CD4+ <MS> autos) <MS> (35,000 <MS> CD4+ <MS> autos) <tb> (100,000 <MS> CD4+ <MS > allos) <SEP> + <SEP> 119066 <SEP> 193392 <SEP> 206319 <SEP> 3,827E-03 <SEP> (100,000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> + <SEP> 172926 <SEP > 22198 <tb> (35.000 <SEP> CD4+) <SEP> allos) <SEP> (**) <SEP> (35.000 <SEP> CD4+ <SEP> allos) <SEP> (**) <tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 37808 <SEP> 45223 <SEP> 42027 <SEP> 1,458E-04 <SEP> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + <SEP> 41686 <SEP> 1753 <tb> (35.000 <SEP> CD28- <SEP> autos) <SEP> (35.000 <SEP> CD8bright <SEP> CD28autos) <tb> (100.000 <SEP> CD4+ <SEP> autos ( 35,000 <SEP> CD28+ <SEP> autos) <SEP> (35,000 <SEP> CD8bright <tb> CD28+ <SEP> autos)(*) <tb> (100,000 <SEP> CD4+ <SEP> autos) <SEP> + < MS> 13985 <MS> 12941 <MS> 13573 <MS> 3.978E-03 <MS> (100,000 <MS> CD4+ <MS> autos) <MS> + <MS> 13500 <MS> 248 <tb> (100,000 < SEP> CD8+ <SEP> autos) <SEP> (100.000 <SEP> CD8+ <SEP> autos) <tb> (*) <tb> Table n 9 Example 10: LCOS 1013 and LCOS 1014 production processes. A. GENERAL PRESENTATION OF LCOS 1013 LCOS 1013 is an analogue of RU 41740, consisting of a set of substances extracted from a culture lysate of Klebsiella pneumoniae. Its method of manufacture is based on the succession of steps or stages, the general diagram of which is presented below. Media that can be used for the cultures, as well as an indicative presentation of the progress of each step, are described in more detail after this diagram. The manufacturing technique described below, purely by way of illustration, corresponds to an operating unit based on a volume of bacterial culture obtained in a 600 liter fermenter. EMI37.1 <tb> <SEP> STAGE <SEP> 1 <SEP>: <SEP> Preparation <SEP> of <SEP> the inoculum <tb> <SEP> STAGE <SEP> 2 <SEP>: <SEP> Preculture <tb> <SEP> v <tb> <SEP> STAGE <SEP> 3 <SEP>: <SEP> Culture <SEP> in <SEP> fermenter <tb> <SEP> v <tb> STAGE <SEP> 4 <SEP>: <SEP> End <SEP> of <SEP> culture <SEP> and <SEP> addition <SEP> of <SEP> lysing agents <SEP> <tb> <SEP> y <tb> <SEP> STAGE <SEP> 5 <SEP>: <SEP> Lysis <tb> STAGE <SEP> 6 <SEP>: <SEP> Sieving <SEP> molecular <SEP> with <SEP> Concentration <tb> <SEP> STAGE <SEP> 7 <SEP> Lyophilization <SEP> of the <SEP> lysate <tb> <SEP> STAGE <SEP> 8 <SEP>: <SEP> Extraction <SEP> by <SEP> acetone <tb> <SEP> i < tb> <SEP> STAGE <SEP> 9 <SEP>: <SEP> Extraction <SEP> by <SEP> the <SEP> methanol <tb> <SEP> STAGE <SEP> 10 <SEP>: <SEP> Discount < SEP> in <SEP> solution <tb> <SEP> r <tb> <SEP> STAGE <SEP> 11 <SEP> Centrifugation <tb> <SEP> STAGE <SEP> 12 <SEP>: <SEP> Ultrafiltration <tb > <SEP> <tb> <SEP> STAGE <SEP> 13 <SEP>: <SEP> Filtration <tb> <SEP> STAGE <SEP> 14 <SEP>: <SEP> Lyophilization <tb> <SEP> STAGE < SEP> 15 <SEP>: <SEP> Mixture <tb> B. DESCRIPTION OF DIFFERENT MEDIUMS USABLE FOR THE CULTURE OF BACTERIA The culture of bacteria, with a view to producing LCOS 1013 according to the succession of steps specified above, can be performed using culture media containing the following components: Soy Papain Peptone Nutrient Broth 4 +/-2 g/1 Yeast Autolysate 4 +/-2 g/1 Sodium Chloride 5 +/-2 g/l Hydroxide of Sodium qsp for pH 7.4 0.2 Box of Roux Sodium Chloride 5 +/-2 g/1 Anhydrous Glucose 5 +/-2 g/1 Yeast Autolysate 12 +/-3 g/1 Soy Papain Peptone 5 +/-2 g/1 Agar 30 +/-4 g/1 Sodium Hydroxide qsp for pH 7.5 0.2 Dipotassium Phosphate 4 +/-2 g/l Monopotassium Phosphate 0.5 to 0.9 g/ 1 Soya Papain Peptone Preculture Medium 20+/-3 g/1 Yeast Autolysate 10+/-2 g/1 Sodium Chloride 5 +/-2 g/1 Dipotassium Phosphate 3, 5 +/-1 g/1 Monopotassium phosphate 1 to 2 g/1 Culture medium for fermenter Baker's yeast autolysate 10 +/-2 g/1 Sodium chloride 5+/-2 g/l Soy papain petone 20+/-3 g/1 Phosphate Dipotassium 3.5+/-1 gel Monopotassium Phosphate 1 to 2 g/1 C. DETAILED DESCRIPTION OF THE DIFFERENT STAGES IN THE PRODUCTION OF LCOS 1013 STAGE 1: Preparation of the inoculum The purpose of this stage is to produce, on agar medium in a box de Roux, the culture of Klebsiella pneumoniae necessary for the inoculation of a preculture in liquid medium, from a cryotube or a lyophilisate from the working bank. The working bank is produced, for example, from a strain of Klebsiella pneumoniae from the Institut Pasteur with reference CIP 52.145. To do this, the strain is revived by making a bacterial suspension in the nutrient broth, from which Roux dishes are inoculated, which are then incubated at 37 C 0.5 for 20 to 24 hours. STAGE 2: Precultures From the inoculum prepared in stage 1, a preculture is carried out in a 3-liter flask, intended to inoculate a 35 I fermenter, itself intended in a second stage to inoculate a 600 I fermenter. The first preculture is carried out in the preculture medium described above, to which a sterile solution of glucose is added, at the rate of 30 g of glucose per 3 liters. The second preculture, of 35 liters, is carried out in the culture medium for fermenter described above, to which 400 g of glucose are added. Satellite bottles containing respectively a sterile solution of 10 N sodium hydroxide, a sterile solution of orthophosphoric acid diluted to 1/2, and a sterile solution of antifoam, can be used for the second preculture, in a fermenter, in particular in order to maintain the pH at around 6.5, throughout the duration of the preculture, that is to say about 5 hours at about 37° C., with stirring. STAGE 3: Culture in a fermenter The object of this stage is to carry out in a fermenter, under defined conditions, a bacterial culture with a content greater than or equal to 1.7.10' germs/ml, to allow the subsequent extraction of a quantity satisfactory product. For this, the suspension of germs contained in the 35 1 fermenter is transferred into a 600 liter fermenter containing the culture medium in the fermenter described above, to which 5 kg of glucose have been added. As for the 35-litre preculture, satellite tanks containing respectively a sterile solution of 10 N sodium hydroxide and a sterile solution of orthophosphoric acid diluted to 1/2 are used for pH regulation around 6.5, as well as a satellite tank containing a sterile anti-foam solution. The culture is carried out for about 7 hours, at 37 C 1 C, with stirring. STAGE 4: End of culture and addition of lysing agents The purpose of this stage is to inactivate the culture by the action of lysing agents and heating from 55 to 75° C. for a period greater than or equal to 40 minutes. For this, the lysing agents used are the following: sterile solution of polysorbate 80, sterile solution of EDTA, sterile solution of lysozyme hydrochloride. At the end of the culture, the pH is brought to 5.8±0.3 using a sterile solution of orthophosphoric acid, then the above lysing agents are transferred into the culture. The content of the fermenter is then brought to a temperature of 65° C. 10 C. and maintained for at least 40 minutes at this temperature with stirring. The biolysate obtained is then transferred to an industrial lysis tank (preheated to 65 C 10 C), and maintained at this temperature for at least 20 minutes, before being brought back to 37 C 2 C. STAGE 5: Lysis The stage Lysis involves enzymatically breaking the bacterial cell wall, resulting in the release of cytoplasmic constituents from the microbial cells. It is carried out by maintaining the prelysed suspension from the previous stage, at 37 C 2 C, in the lysis tank for at least 6 days STAGE 6: Molecular sieving and concentration In this stage, the volume of crude lysate is reduced by half to decrease the quantity to be processed in the following stages. The concentration is carried out for example on an ultrafilter equipped with a CARBOSEP type filter cartridge with a cut-off threshold <100 KD, thus eliminating the small unbound molecules. STAGE 7: Lyophilization of the lysate In order to obtain the crude lysate resulting from stage 6 in solid form allowing subsequent extractions with solvents, a lyophilization operation is carried out immediately after the concentration stage. A brown powder, sticky to the touch, is thus obtained. STAGE 8: Extraction with acetone: The lyophilized LCOS 1013 lysate, resulting from stage 7, contains lipids which are partially removed by solid-liquid extraction, using acetone at ambient temperature. The volume of acetone used is proportional to the mass of lyophilisate. This volume is obtained according to the following calculation: 10×mass used<V solvent<20×mass used, preferably with (V solvent/mass used)−15. The product is recovered by centrifugation and then dried. STAGE 9: Extraction with methanol: After extraction with acetone, the product obtained in stage 8 still contains residual lipids and pigments which are eliminated by solid-liquid extraction, using methanol at room temperature. The volume of methanol used is proportional to the mass of lyophilisate. This volume is obtained according to the following calculation: 10×mass used<V solvent<20×mass used, preferably with (V solvent/mass used)−15. The product is recovered by centrifugation and then dried. STAGE 10: Return to solution "The methanol extract" from step 9 is returned to aqueous solution, to allow subsequent isolation of the product by centrifugation and ultrafiltration. STAGE 11: Centrifugation The crude extract in suspension from stage 10 contains denatured proteins and water-insoluble matter which is removed by centrifugation between 14,000 and 18,000 g. The centrifuged product is slightly colloidal in appearance and beige to brown in color. STAGE 12: Ultrafiltration This stage represents the essential step in the isolation of the product. The product from stage 11 contains substances of different molecular sizes: mineral salts, proteins, glycoproteins, etc. The macromolecules of PM: 300,000 constituting the product are isolated by ultrafiltration on a membrane with a cut-off threshold of 300 KD. The product, once introduced into the tank of the device, is continuously conveyed by means of a pump, in a closed circuit comprising an ultrafilter. The medium is kept homogeneous by means of stirring. The pressure created by the pump on the filtering membrane forces part of the solute to cross this membrane (permeate). The retained part (retentate) remains in circulation. Knowing that we operate at constant volume, the loss of volume is permanently compensated by the addition of the same volume of water. At the end of the operation, the solution is ultrafiltered. The ultrafiltrate obtained is a slightly yellow translucent liquid solution. STAGE 13: Filtration The clarification of the centrifugation supernatant obtained in stage 11 is refined by filtration on a nominal retention membrane of 1.2 μm. An opalescent “glycoprotein solution” of light beige to cream color is thus obtained. STAGE 14: Freeze-drying In order to allow good conservation of the product, the solution resulting from stage 13 is then freeze-dried, by a process comprising a freezing stage, then the actual freeze-drying. Lyophilized glycoproteins appear as a white to cream colored, hygroscopic, fluffy powder. STAGE 15: Mixing The purpose of this last step is to homogenize the freeze-dried glycoproteins from stage 14. Atomization can advantageously replace freeze-drying and mixing (LCOS 1014). Example 11: Study of the effect of the LCOS 1013 molecule on the maturation of dendritic cells derived from human monocytes. The effect of LCOS 1013 on the maturation of dendritic cells generated from human monocytes was studied on cells from 3 different donors, by comparison with TNF-α. A. Protocol - The purified monocytes (over 90%) were cultured in RPMI medium containing 10% AB human serum, in the presence of growth factors GM-CSF (200U/ml) and 11-4 (500U /ml) for 6 days in order to induce the differentiation of monocytes into immature dendritic cells. Maturation of the cells was induced by adding TNF-α (200U/ml) or compound LCOS 1013 (25 μg/ml) for 48 hours. - The phenotype of the cells thus generated (after 8 days of culture) was examined by flow cytometry. Expression of the specific marker of dendritic cell maturation (CD83), costimulation molecules CD80, CD86, CD40, adhesion molecule CD54, major histocompatibility complex class II molecule HLA-DR, a been analyzed. The expression of the CD1a molecule, a specific marker for Langerhans cells, immature dendritic cells, was also tested. - The functional properties of cells have been studied using mixed lymphocyte reactions (MLR). To do this, a range of concentrations of dendritic cells was placed in the presence of a defined concentration of allogeneic T lymphocytes (allogeneic mixed reaction) or of autologous T lymphocytes (autologous mixed reaction), for 4 and 5 days respectively. T cell proliferation was determined by incorporation of tritiated thymidine. The experimental protocols for these mixed lymphocyte reactions are described in more detail in the article by K. Duperrier et al. mentioned above. B. Results Phenotype of the dendritic cells Tables 10 to 12 below summarize the percentages of expression of the various markers as well as the mean fluorescence intensity (IFM) of each marker (in parentheses). EMI45.1 <MS> donor <MS> CD83 <MS> CD80 <MS> CD86 <MS> CD40 <MS> CD54 <MS> HLA-DR <MS> CD1 <MS> a <tb> <MS> 1 <tb > TNF-a <SEP> 91 <SEP> % <SEP> 69.7% <SEP> 99.5% <SEP> 99.4% <SEP> 98.4% <SEP> 99.5% <SEP> 13.2% <tb> <SEP> (132 ) <SEP> (85) <SEP> (209) <SEP> (1084) <SEP> (195) <SEP> (803) <SEP> (28) <tb> LCOS1013 <SEP> 84.6% <SEP> 93.2 % <SEP> 99.7% <SEP> 99.7% <SEP> 99.2% <SEP> 99.7% <SEP> 10.8% <tb> <SEP> (157) <SEP> (134) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (306) <SEP> (502) <SEP> (20) <tb> Table n"10 EMI45.2 <SEP> donor <SEP> CD83 <SEP> CD80 <SEP> CD86 <SEP> CD40 <MS> CD54 <MS> HLA-DR <MS> CD1 <MS> a <tb> <MS> 2 <tb> TNF-a <MS> 88% <MS> 55.1 <MS> % <MS> 99.1 < MS> % <MS> 99.2% <MS> 97.8% <MS> 98.6% <MS> 20.6% <tb> <MS> (221) <MS> (89) <MS> (299) <MS> (1104) <SEP> (355) <SEP> (1108) <SEP> (215) <tb> LCOS1013 <SEP> 81.4% <SEP> 81.8% <SEP> 98.1 <SEP> % <SEP> 99.3% <SEP> 97.5% <SEP> 98.8% <SEP> 11.1 <SEP> % <tb> <SEP> (242) <SEP> (169) <SEP> (298) <SEP> (1441) <SEP> (416) <SEP> ( 1102) <MS> (299) <tb> Table n 11 EMI46.1 <MS> donor <MS> CD83 <MS> CD80 <MS> CD86 <MS> CD40 <MS> CD54 <MS> HLA-DR <MS> CD1a<tb><MS>3<tb>TNF-a91. <SEP> 8% <SEP> 48.7% <SEP> 98.5% <SEP> 98.7% <SEP> 95.9% <SEP> 98.9% <SEP> neg. <tb> <SEP> (108) <SEP> (65) <SEP> (209) <SEP> (918) <SEP> (154) <SEP> (768) <tb> LCOS1013 <SEP> 92.3% <SEP > 89.4% <SEP> 98.2% <SEP> 98.7% <SEP> 98.4% <SEP> 97.5% <SEP> neg. <tb> <SEP> (118) <SEP> (104) <SEP> (214) <SEP> (1270) <SEP> (288) <SEP> (588) <tb> Table no. 12 Dendritic cells generated in the presence of the LCOS 1013 molecule exhibit a phenotype characteristic of mature dendritic cells, due to the expression of CD83 molecules, costimulation and adhesion molecules, as well as the weak expression of CD1a. However, it appears that the percentage of expression, as well as the IFM of the CD80 molecule, are increased in the presence of the LCOS 1013 molecule, relative to TNF-α, as is the IFM of the CD40 and CD54 molecules. These results suggest a differential effect of the LCOS 1013 molecule compared to TNF-α, as regards the maturation of dendritic cells. Functions of the Dendritic Cells The results of the allogeneic lymphocyte mixed reactions are illustrated in FIG. 6. They show that the dendritic cells cultured in the presence of LCOS 1013 exhibit a high allostimulatory capacity, comparable to that of the cells generated in the presence of TNF-α. The results of the autologous lymphocyte mixed reactions are shown in Figure 7. Remarkably, dendritic cells cultured in the presence of LCOS 1013 show a much greater ability to stimulate autologous T cells than cells generated in the presence of TNF-a ( at least 5 times higher). C. Conclusion The above results show that the LCOS 1013 molecule effectively induces the maturation of dendritic cells generated from human monocytes, at the phenotypic and functional levels. It is interesting to note however that the expression of the CD80 molecule is strongly increased in the presence of LCOS 1013, and that the cells induce a strong autologous response, in comparison with TNF-α, this for the 3 donors tested. This is in agreement with the results presented by Scheinecker et al. (Journal of Immunology, 1998,161: 3966-3973), which suggest that the CD80 molecule would play an essential role in the initiation of the autologous mixed reaction. Example 12: Study of the effect of different concentrations of LCOS 1013 on the maturation of dendritic cells. The effect of different concentrations of LCOS 1013 on the maturation of dendritic cells generated from human monocytes from a single donor was studied, in comparison with TNF-α. The concentrations tested for LCOS 1013 are 5.10 and 25 µg/ml, and 200 u/ml for TNF-α. The results of the phenotypic study are summarized in the following table: EMI48.1 donor <MS> 1 <MS> HLA-DR <MS> CD <MS> 83 <MS> CD54 <MS> CD <MS> 40 <MS > CD <SEP> 86 <SEP> CD <SEP> 80 <tb> <SEP> TNF-α <SEP> 92.12 <SEP> % <SEP> 70.02% <SEP> 87.12% <SEP> 83.44% <SEP> 94.44% <SEP> 0.49% <tb> (200 <MS> U/ml) <MS> 877.54 <MS> 65.55 <MS> 137, <MS> 49 <MS> 289.54 <MS> 180.81 <MS> 95, <MS> 04 < tb> LCOS1013 <SEP> 81.69% <SEP> 76, <SEP> 35% <SEP> 89.39% <SEP> 75.02% <SEP> 93.33% <SEP> 3.26% <tb > <MS> (5 <MS> pg/ml) <MS> 545.30 <MS> 119, <MS> 62 <MS> 229.59 <MS> 454.18 <MS> 197 <MS> 90.79 <tb> LCOS1013 <SEP> 87.17% <SEP> 68.20% <SEP> 90, <SEP> 66% <SEP> 79.99% <SEP> 94, <SEP> 47% <SEP> 2, 92% <tb> (10 <SEP> pg/ml) <SEP> 500.55 <SEP> 93.85 <SEP> 229.17 <SEP> 411.53 <SEP> 184, <SEP> 14 <SEP> 91.01 <tb> LCOS1013 <SEP> 94.52% <SEP> 66.35% <SEP> 93, <SEP> 15% <SEP> 91.22% <SEP> 91, <SEP> 07% <SEP > 1.07% <tb> (25 <SEP> pg/ml) <SEP> 504, <SEP> 84 <SEP> 105.29 <SEP> 237.68 <SEP> 394.41 <SEP> 191, < SEP> 62 <SEP> 99, <SEP> 64 <tb> Table No. 13 The functionality of the cells obtained was studied by mixed allogeneic and autologous lymphocyte reactions, the results of which are presented in figure 8. The dendritic cells cultured in presence of LCOS 1013, at the three concentrations tested, exhibit a high allostimulatory capacity, comparable to that of the cells generated in the presence of TNF-a. in the presence of LCOS 1013 exhibit a capacity for stimulation of autologous T lymphocytes much greater than the cells generated in the presence of TNF a.
Claims
REVENDICATIONS 1. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation fonctionnelle des cellules dendritiques, attestée par leur capacité à - déclencher in vitro une réponse primaire contre un antigène infectieux ou tumoral mis en contact avec les cellules dendritiques préalablement et/ou au cours de leur culture avec les lymphocytes T ; - induire la prolifération de lymphocytes T en culture mixte autologue ou allogénique.
CLAIMS 1. Process for obtaining mature dendritic cells or activated macrophages from monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells, characterized in that said monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with RU 41740 or a compound analogous to this one, this compound being chosen such that bringing immature dendritic cells into contact with said compound allows the functional maturation of the dendritic cells, evidenced by their ability to - trigger in vitro a primary response against an antigen infectious or tumorous brought into contact with the dendritic cells beforehand and/or during their culture with the T lymphocytes; - induce the proliferation of T lymphocytes in mixed autologous or allogeneic culture.
2. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés à partir de monocytes, de précurseurs des monocytes, ou de cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec le RU 41740 ou un composé analogue de celui ci, ce composé étant choisi de telle sorte que la mise en contact de cellules dendritiques immatures avec ledit composé permette la maturation phénotypique des cellules dendritiques, attestée par une augmentation significative de l'expression des molécules CD40,
CD83, CD86, et HLA-DR et une diminution très marquée de l'expression des molécules CD14 et CD1 a par lesdites cellules dendritiques.
2. Process for obtaining mature dendritic cells or activated macrophages from monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells, characterized in that said monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with RU 41740 or a compound analogous to this one, this compound being chosen such that bringing immature dendritic cells into contact with said compound allows the phenotypic maturation of the dendritic cells, evidenced by a significant increase in the expression of CD40 molecules,
CD83, CD86, and HLA-DR and a very marked decrease in the expression of the CD14 and CD1 a molecules by said dendritic cells.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les monocytes, précurseurs ou cellules souches sont mis en contact avec un analogue du RU 41740 obtenu à partir de la souche
O1 K2 NCTC 5055 de Klebsiella pneumoniae.
3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the monocytes, precursors or stem cells are brought into contact with an analogue of RU 41740 obtained from the strain
O1 K2 NCTC 5055 from Klebsiella pneumoniae.
4. Procédé d'obtention de cellules dendritiques matures présentant des antigènes choisis, à partir de monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, caractérisé en ce que lesdits précurseurs sont mis en contact avec le RU 41740 ou un analogue de celui-ci, couplé à des molécules comportant lesdits antigènes.
4. Process for obtaining mature dendritic cells presenting selected antigens, from monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells, characterized in that said precursors are brought into contact with RU 41740 or an analogue thereof , coupled to molecules comprising said antigens.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le couplage entre le RU 41740 ou son analogue et les antigènes est non covalent.
5. Method according to claim 4, characterized in that the coupling between RU 41740 or its analogue and the antigens is non-covalent.
6. Procédé selon l'une des revendications 1,2,4 et 5, dans lequel le composé mis au contact des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques est le RU 41740, couplé ou non à des molécules antigéniques.
6. Method according to one of claims 1,2,4 and 5, wherein the compound brought into contact with monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells is RU 41740, coupled or not to antigenic molecules.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel le RU 41740 est ajouté au milieu de culture des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 10 gg/mI.
7. Method according to claim 6, in which the RU 41740 is added to the culture medium of the monocytes, monocyte precursors, or hematopoietic stem cells, at a final concentration of between 1 ng/ml and 1 mg/ml, preferentially between 100 ng/ml and 10 gg/ml.
8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'analogue du RU 41740 est le LCOS 1013 ou le LCOS 1014.
8. Process according to claim 3, characterized in that the analogue of RU 41740 is LCOS 1013 or LCOS 1014.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel le LCOS 1013 ou le
LCOS 1014 est ajouté au milieu de culture des monocytes, précurseurs des monocytes, ou cellules souches hématopoïétiques, à une concentration finale comprise entre 1 ng/ml et 1 mg/ml, préférentiellement entre 100 ng/ml et 50 tg/mI.
9. Method according to claim 8, in which the LCOS 1013 or the
LCOS 1014 is added to the culture medium of monocytes, precursors of monocytes, or hematopoietic stem cells, at a final concentration of between 1 ng/ml and 1 mg/ml, preferably between 100 ng/ml and 50 tg/ml.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel les cellules dendritiques sont traitées ex vivo, pour la préparation d'un médicament destiné à la prophylaxie, l'atténuation ou le traitement de maladies cancéreuses, infectieuses, allergiques ou auto immunes.
10. Method according to one of claims 1 to 9, in which the dendritic cells are treated ex vivo, for the preparation of a medicament intended for the prophylaxis, attenuation or treatment of cancerous, infectious, allergic or autonomic diseases. immune.
11. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition comprenant des cellules dendritiques matures et/ou des macrophages activés.
11. Use of RU 41740 or an analogue thereof, for the preparation of a composition comprising mature dendritic cells and/or activated macrophages.
12. Utilisation du RU 41740 ou d'un analogue de celui-ci, pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour une administration topique, destinée à favoriser la maturation des cellules de Langerhans de la peau.
12. Use of RU 41740 or an analogue thereof, for the preparation of a pharmaceutical composition for topical administration, intended to promote the maturation of Langerhans cells in the skin.
13. Utilisation d'un produit de couplage entre le RU 41470 ou un analogue de celui-ci et un ou plusieurs antigènes, pour la préparation d'une composition apte à induire la production de cellules dendritiques matures ou de macrophages activés présentant lesdits antigènes.
13. Use of a coupling product between RU 41470 or an analog thereof and one or more antigens, for the preparation of a composition capable of inducing the production of mature dendritic cells or activated macrophages presenting said antigens.
14. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire antitumorale.
14. Use of dendritic cells obtained by a method according to one of claims 1 to 10, in the manufacture of a composition capable of promoting an antitumor immune response.
15. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans la fabrication d'une composition apte à favoriser une réponse immunitaire contre une infection par un micro-organisme.
15. Use of dendritic cells obtained by a method according to one of claims 1 to 10, in the manufacture of a composition capable of promoting an immune response against an infection by a microorganism.
16. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10 et incubées en présence d'un immunosuppresseur, dans la fabrication d'une composition apte à modifier la réponse immunitaire dans le sens d'une tolérance.
16. Use of dendritic cells obtained by a method according to one of claims 1 to 10 and incubated in the presence of an immunosuppressant, in the manufacture of a composition capable of modifying the immune response in the direction of tolerance.
17. Utilisation de cellules dendritiques obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, pour la détection et/ou la caractérisation des antigènes d'histocompatibilité.
17. Use of dendritic cells obtained by a method according to one of claims 1 to 10, for the detection and/or characterization of histocompatibility antigens.
18. Produit de couplage entre le RU 41740 ou un analogue de celui-ci et des molécules antigéniques, pour induire la maturation de cellules dendritiques ou l'activation de macrophages.
18. Coupling product between RU 41740 or an analogue thereof and antigenic molecules, to induce the maturation of dendritic cells or the activation of macrophages.
19. Produit de couplage selon la revendication 18, caractérisé en ce que le RU41740 ou son analogue est lié aux molécules antigéniques par des liaisons non covalentes.
19. Coupling product according to claim 18, characterized in that the RU41740 or its analogue is linked to the antigenic molecules by non-covalent bonds.
20. Produit de couplage selon la revendication 18 ou 19, caractérisé en ce que les molécules antigéniques sont de nature non protéique.
20. Coupling product according to claim 18 or 19, characterized in that the antigenic molecules are of non-protein nature.
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