EP1319075A2 - The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein - Google Patents

The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein

Info

Publication number
EP1319075A2
EP1319075A2 EP01984654A EP01984654A EP1319075A2 EP 1319075 A2 EP1319075 A2 EP 1319075A2 EP 01984654 A EP01984654 A EP 01984654A EP 01984654 A EP01984654 A EP 01984654A EP 1319075 A2 EP1319075 A2 EP 1319075A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
catecl
protein
acid molecule
tecl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01984654A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Klaus SCHRÖPPEL
Brad N. Taylor
Anja Schweizer
Steffen Rupp
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Friedrich Alexander Univeritaet Erlangen Nuernberg FAU
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Friedrich Alexander Univeritaet Erlangen Nuernberg FAU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10045123A external-priority patent/DE10045123B8/en
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV, Friedrich Alexander Univeritaet Erlangen Nuernberg FAU filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP1319075A2 publication Critical patent/EP1319075A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/40—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Candida
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acid molecules which encode proteins modulating the virulence of pathogenic fungal strains, vectors which contain these molecules, host cells which have these nucleic acid molecules or vectors, proteins which modulate the virulence of pathogenic fungal strains, inhibitors of the proteins and the nucleic acid molecules which code for the proteins , in particular antibodies which are directed against these virulence-modulating proteins, methods for producing the proteins and antibodies and diagnostic and pharmaceutical compositions which contain these nucleotide sequences, proteins, host cells and / or antibodies.
  • Yeasts are fungi that multiply vegetatively through sprouting or splitting.
  • the shoot fungi or yeasts also include species which are pathogenic to humans, for example Candida albicans.
  • Candida albicans is a thin-walled, gram-positive, capsule-free yeast of oval to rounded shape that is optionally pathogenic for humans, guinea pigs, mice, rats and poultry.
  • Candida albicans is the most common cause of superficial Caüdida mycoses in humans.
  • Candida albicans often causes opportunistic infections due to normally relatively unproblematic germs in immunosuppressed patients.
  • transcription factors that control the expression of genes that are specific for certain developmental stages.
  • These transcription factors include the TEA / ATTS transcription factor family, which has been detected in mammals, birds, nematodes, insects and fungi. All members of this transcription factor family have a conserved TEA domain.
  • This TEA domain (Bürglin, Cell, 66 (1991), 11-12) represents a DNA binding region which consists of 66 to 76 conserved amino acids in the N-terminal region of the proteins.
  • the TEA consensus sequence (TCS) in the target promoters of fungal TEA / ATTS transcript tion factors is defined by the sequence 5'-CATTCY-3 '(Adrianopoulos and Timberlake, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2503-2515).
  • TCS TEA consensus sequence
  • For all members of this transcription factor family from different species is striking that they play a vital role in • the development and organogenesis.
  • the mammalian enhancer factor TEF-1 is involved in myogenesis and cardiogenesis (Jacquemin et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 21775-21785).
  • the Drosophila melanograster protein "scalloped” is involved in the regulation of cell-specific gene expression during the development of the wings and the nervous system (Campbell et al., Genes Dev., 6 (1992), 367-379).
  • the regulatory protein "abacus "(AbaAp) of ⁇ spergillus nidulans is involved in the regulation of conidia
  • the transacting factor Teclp from Saccharomyces cerevisiae is involved in the activation of the tyl retrotransposon (Laloux et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990), 3541-3550). This factor is also involved in the regulation of fila ent formation and the invasive growth of haploid and diploid strains of yeast (Baur et al., Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 4330-4337).
  • TEA / ATTS transcription factors Due to the importance of the TEA / ATTS transcription factors for the morphological development, that is, the spatial and temporal development of organisms or their organs or tissues, and their widespread use in a wide variety of species, it appears possible that such transcription factors or the genes on which they are based also in pathogenic microorganisms men, in particular human pathogenic fungi, and to use them as targets for the identification of substances which act specifically on these transcription factors or on the nucleotide sequences coding them.
  • the invention solves the technical problem on which it is based by providing nucleic acid molecules which are suitable for cloning a gene for a transcription factor, in particular for a protein from Candida, in particular Candida albicans, which modifies the virulence of human pathogenic fungi, and / or allow the recombinant production of such a protein, these nucleic acid molecules being selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule defined in SEQ ID No. 1, 2, 3 or 7 and / or a complementary strand or part thereof;
  • nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence defined in SEQ ID No. 4 or a complementary strand or part thereof; c) a nucleic acid molecule obtainable from a Candida albicans gene bank using the primers shown in SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 using the PCR method; and
  • nucleic acid molecule that hybridizes due to its homology with one of the mentioned under a) to c) nucleic acid molecules under appropriate conditions, wherein the homology at the nucleotide level (sequence identity) in particular '' ⁇ at least 65%, preferably at least 70%, more preferably at least 80% and most preferably is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • the gene represented by the nucleic acid molecule of SEQ ID No. 1 according to the invention is also referred to below as the CaTECl gene.
  • the CaTECl gene according to the invention is expressed in vivo both in the yeast form and in mycelia from C. albicans.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are particularly characterized in that after introduction into Candida albicans catecl mutants, for example with the aid of a vector in which they are integrated in the sense orientation under the control of suitable regulatory elements, they can revert the phenotype of such yeast mutants.
  • the phenotype of catecl mutants differs from the phenotype of wild-type cells in particular in that the filamentous growth in vitro is impaired, the formation of germ tubes and true hyphae is suppressed, the expression of S ⁇ P4-6 genes is not can be induced and the mutant shows reduced virulence in a systemic model of mouse Candida mycoses.
  • the aforementioned phenotypes thus characterize the biological activity of the CaTECl-encoded protein (CaTeclp).
  • the proteins encoded by the novel nucleic acid molecules proteins represent transcription factors that lung expression of developmental genes and thus the morphological development of Candida albicans cells control and regulate '.
  • Acid sequences are therefore excellent tools for reducing and / or eliminating the virulence of pathogenic Candida albicans strains.
  • the nucleic acid and amino acid molecules according to the invention therefore prove to be particularly valuable for the development of medicaments for combating Candida mycoses.
  • the nucleic acid molecules according to the invention and the proteins according to the invention coded by them can be used, for example, as targets for the identification of substances which act specifically on the nucleotide sequences according to the invention or the proteins according to the invention.
  • substance libraries can be analyzed for the interaction of the substances present in them with the proteins according to the invention or their effect on the expression of the nucleic acid molecules according to the invention.
  • Monoclonal or polyclonal antibodies directed against the proteins according to the invention can also be developed, on the one hand for the detection of Caüdida-specific proteins and thus can be used to detect Candida infections and, on the other hand, can be used directly to combat such infections if, for example, they are functionalized using cytotoxic groups, such as cytotoxic proteins or cytotoxic peptides, so that the target organisms are killed in this way and Therapy of the disease states caused by these organisms is made possible.
  • cytotoxic groups such as cytotoxic proteins or cytotoxic peptides
  • a preferred embodiment of the invention therefore relates to an inventive one shown in SEQ ID No. 1.
  • Nucleic acid molecule this nucleic acid molecule comprising, in addition to 5'- and 3'-regulatory elements, a protein-coding nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequences according to the invention encode the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are particularly helpful in the development of new therapeutic agents in that they allow the production of the proteins or derivatives encoded by them by means of recombinant DNA techniques.
  • nucleic acid molecules according to the invention can be used in antisense constructs or as complementary strands of the coding nucleotide sequences or as parts thereof in order to inhibit or reduce the endogenous expression of the nucleotide sequence according to the invention in Candida cells. In this way it is possible to reduce or eliminate the virulence of such Candida cells.
  • Candida cells which contain, for example, antisense constructs of the nucleotide sequences according to the invention, can be used, for example, as live vaccinations. substance in the context of a vaccination, for example as part of an active immunization, to counteract later infections with pathogenic Candida species, in particular Candida albicans.
  • nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof into Candida cells in order to mutate endogenously present CaTEC1 genes there by means of homologous recombination, in particular to switch them off, and thus to produce, for example, zero mutants.
  • the invention therefore relates to the use of the nucleic acid molecules according to the invention for producing mutant phenotypes of yeast cells, in particular Candida cells.
  • the invention also relates to these mutant Candida cells themselves and to the mutant catecl or CaTECl genes present in these cells.
  • Such mutated CaTECl or catecl genes can prove to be particularly helpful in the development of pharmaceuticals and diagnostics for combating diseases caused by Candida.
  • the invention also relates to plasmids deposited on September 6, 2000 at the DSMZ in Braunschweig, Germany, under No. DSM 13716 in Escherichia coli, containing the CaTECl gene (SEQ ID No. 1).
  • the invention also relates to catecl mutants, in particular the Candida alJbicans mutant CaASl ⁇ , deposited on September 6, 2000 with the DSMZ in Braun- schweig, Germany under the number DSM 13722.
  • the invention relates to the aforementioned nucleic acid molecules, these preferably being in completely or partially isolated and purified form, in a particularly preferred embodiment as DNA or RNA sequences.
  • the invention also includes modifications of the nucleic acid molecules according to the invention, which lead to the synthesis of proteins with changed biological properties, in particular a changed activity for modulating the virulence properties of pathogenic fungi, preferably Candida cells.
  • the modifications or mutations of the nucleotide sequences according to the invention can be both naturally occurring modifications or mutations and also those which have been generated with the aid of standard microbiology / molecular biology methods known in the art (see Sambrook et al., Molecular Kloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA).
  • the mutations or modifications detected by the present invention can be insertions, deletions, duplications, inversions, additions, exchanges or the like, in particular also of unusual nucleotides.
  • the invention also includes mutations or modifications of the nucleotide sequences according to the invention which are caused by fusion with genes or components of genes from other sources.
  • the invention also includes shortened nucleotide sequences of the aforementioned type, provided that these encode proteins or protein parts which can modulate the virulence of Candida cells.
  • the invention also includes mutations or modifications of nucleotide sequences which lead to pro- lead lines that have a changed stability, specificity, a 'modified temperature, pH value and / or concentration profile, a changed activity and / or a changed effector pattern,. as well as those whose conformations have changed, or those which have other subunits or other pre- and / or post-translational modifications.
  • the invention also relates to nucleotide sequences which can hybridize with the above-mentioned nucleotide sequences according to the invention.
  • hybridization means the attachment of two single-stranded nucleic acid molecules under conditions as described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press , NY, USA), which are preferably stringent conditions.
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleic acid molecule according to a) to c) used in connection with the present invention therefore refers to a nucleic acid molecule which preferably stringent, conditions hybridized with a nucleic acid according to a) to c).
  • Such hybridization is characterized in that after washing for one hour with 1 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably 62 ° C and particularly preferably at 68 C C, in particular for one hour with 0.2 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably at 62 ° C and particularly preferably at 68 ° C, a positive hybridization signal can still be observed.
  • a nucleotide sequence according to the invention is therefore one under such washing conditions with that in the sequence listing specified nucleotide sequence hybridizing nucleotide sequence.
  • the molecules hybridizing with the nucleotide sequences according to the invention also include fragments, derivatives, functional equivalents and / or allelic variants of the above-described nucleotide sequences which encode a protein according to the invention.
  • parts are "fragments" understood by nucleotide sequences which have a sufficient length "to encode the above-described protein or an equivalent protein having an activity for modulating virulence of Candida cells.
  • the terms “derivative”, “functional equivalent” or “variant” mean that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleotide sequences described above in at least one position, but at a high degree Homology to these sequences at the nucleic acid level Homology means in particular a sequence identity of at least 40%, in particular at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%, 95%, 97% or 99% at the nucleic acid level.
  • amino acid sequences of the proteins encoded by these nucleic acid molecules are homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4, the homology being at least 65%, preferably at least 70%, 80% and further preferably at least 85%, and particularly preferably at least more than 90%, 95%, 97% and 99%.
  • differences from the amino acid sequences according to the invention may have arisen, for example, from mutations such as deletions, substitutions, insertions, additions, exchanges and / or recombinations of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequences.
  • mutations such as deletions, substitutions, insertions, additions, exchanges and / or recombinations of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequences.
  • these can also be naturally occurring sequence variations, for example sequences from another organism or sequences that have been mutated in a natural manner, or mutations that can be achieved using conventional means known in the art, for example chemical agents and / or physical agents specifically introduced into the sequences.
  • the present invention therefore also comprises a polypeptide or protein with a biological activity which, in particular in Candida albicans cells in vivo, influences the filamentous growth of the cells and / or the formation of germ tubes and true hyphae, the expression of the proteinase isogens SAP4-6 induces or inhibits and / or can modulate the virulence of the Candida albicans cells containing them.
  • the present invention relates to the Candida albicans transcription factor Teclp, which is also referred to below as Ca TECl protein.
  • the terms “protein or polypeptide modulating the virulence of pathogenic fungal strains” or “activity for modulating virulence or virulence properties” mean that a protein or polypeptide has an activity which has the degree of aggressiveness of an infectious microorganism in a macro-organism can change, for example reduce.
  • the activity of the amino acid sequences according to the invention can, for example, be examined and quantified using the systemic model of mouse Candida mycoses described below.
  • the present invention also relates to a, preferably isolated and completely purified, protein which can be obtained by expression of a nucleic acid molecule according to the invention or a fragment thereof in a host cell and which has the aforementioned biological activity.
  • isolated protein encompasses proteins that are essentially free of other proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates or others Are materials with which it is naturally associated. Such proteins include not only recombinantly produced proteins but also isolated naturally occurring proteins, synthetically produced proteins or proteins which are produced with the aid of a combination of these methods.
  • a recombinantly produced variant of Ca TECl including the secreted protein can be purified using the one-step process described in Smith and Johnson, Gene, 67 (1988), 31-40.
  • the protein preferably has the same properties, in particular the same activity, as the protein that is encoded by a nucleotide sequence with a sequence shown in SEQ ID No. 1 or 2 and whose amino acid sequence is shown in SEQ ID No. 4.
  • the invention further relates to vectors which contain the nucleotide sequences according to the invention.
  • the vectors are preferably plasmids. Cosmids, viruses, bacteriophages, shuttle vectors and other vectors commonly used in genetic engineering.
  • the vectors according to the invention can have further functional units which bring about or at least contribute to stabilization and / or replication of the vector in a host organism.
  • the present invention comprises vectors in which the nucleotide sequences according to the invention are functionally linked to at least one regulatory element.
  • regulatory element understood those elements which ensure the transcription and / or translation of nucleic acid molecules in prokaryotic and / or eukaryotic host cells. Regulatory elements can be promoters, enhancers, operators, silencers and / or transcription termination signals. Regulatory elements which include a nucleotide sequence according to the invention, in particular the protein-coding sections of this nucleotide sequence, are functionally linked can be nucleotide sequences which originate from organisms or genes other than the protein-coding nucleotide sequence itself.
  • T7, T3, SP6 and others common regulatory elements for in vitro transcription P AO ttet and other common regulatory elements for expression in E. coli, GAL1-10, MET25; CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEFl, PMA1 and other regulatory elements for expression in S. cerevisiae ; GAPl, YPT1, AOXl and other common regulat ion elements for expression in P. pastoris; Polyhedrin for expression in baculovirus systems as well as P CMV> P SV4O and other common regulatory elements for expression in mammalian cells.
  • the regulatory elements used according to the invention can also originate from Candida albicans.
  • these can be the regulatory elements of the nucleotide sequences according to the invention which encode a protein according to the invention, shown for example in SEQ ID No. 3, which represents the 5 'regulatory element including the promoter and transcription start site of the CaTEC gene or in SEQ ID No. 7, which the 3'- Represents the region of the coding region of the CaTECl gene.
  • the nucleotide sequence according to the invention or a fragment thereof can be present in the vector both in the antisense orientation and in the sense orientation to the regulatory element (s). If a nucleotide sequence according to the invention is in antisense orientation to the regulatory element (s), the vector can, for example, be introduced into a Candida albicans cell and, after the transcription of the nucleotide sequence according to the invention, the expression of the endogenous CaTEC1- Inhibit or reduce GenS / genes from Candida albicans.
  • the fragments of the present nucleotide sequences according to the invention used in antisense orientation can have a length sufficient to enable hybridization to the endogenous CaTEC1 sequences and thus translation inhibition, for example a length of at least 100 base pairs. Of course, this fragment must have sufficient specificity for the nucleotide sequence to be inhibited.
  • the vectors according to the invention can also contain further elements. These can be, for example, antibiotic resistance genes, stabilizing elements and selection markers or affinity epitopes, for example HA, Myc and etc.
  • the invention naturally also includes vectors which contain not only one but more than one of the nucleotide sequences according to the invention.
  • This Sequences can be arranged in such a way that one, two or more of the protein-coding regions of SEQ ID No. 1 or 2 according to the invention are controlled by a single set of regulatory elements.
  • the present invention relates to host cells which comprise one or more of the nucleic acid molecules according to the invention or one or more of the vectors according to the invention and which are capable of expressing the proteins according to the invention.
  • the host cells according to the invention can be both prokaryotic and eukaryotic cells.
  • prokaryotic cells are bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis.
  • eukaryotic host cells preferred according to the invention include yeast cells, plant cells, insect cells and mammalian cells, in particular human cells.
  • the host cell according to the invention can be characterized in that the introduced nucleotide sequence according to the invention is heterologous with respect to the transformed cell, that is to say that the introduced nucleotide sequence according to the invention does not naturally occur in these cells or else at a different location or a different number of copies or orientation is located in the genome of these cells as the corresponding naturally occurring sequence.
  • the cell is a gram-negative cell, for example an Escherichia coli cell. In a further advantageous embodiment, it can also be a gram act positive cell, for example Bacillus subtilis.
  • the nucleotide sequence according to the invention is introduced into a gram-positive cell, the nucleotide sequences according to the invention are preferably linked to a signal peptide which allows the translated gene product to be discharged from the cell into the medium.
  • the host cell according to the invention is a eukaryotic host cell.
  • These can be cells that already contain one or more such genes on their chromosomes.
  • Eukaryotic cells offer the advantage that the transcription and translation of a nucleotide sequence encoding a heterologous eukaryotic protein takes place in the same way as in the cells from which the eukaryotic nucleotide sequence originates. This means that in eukaryotic host cells the transcripts are subjected to correct splicing and the translation product is subjected to the post-translational modifications typical in eukaryotic cells, such as glycosylation.
  • the host cell according to the invention can be a fungal cell, for example a cell from the genus Candida, in particular a Candida albicans cell, a Saccharomyces cell or an animal cell, such as an insect cell.
  • suitable Candida host cells are descendants of the strain SC5314 (Fonzi and Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728).
  • Preferred examples of suitable host cells from Saccharomyces cerevisiae are descendants of the S1278b strain.
  • Other preferred cells include the IPLB-Sf21 insect cell line human HeLa cell line, Jurkat cells or CHO cells.
  • the invention therefore also relates to cell cultures which at least. have one of the host cells according to the invention, a cell line according to the invention having the ability to produce a protein according to the invention with the activity for modulating the virulence of Candida albicans cells or a fragment thereof.
  • the invention also relates to a method for producing a virulence-modifying protein, in particular a virulence-modifying protein from Candida albicans, host cells according to the invention being cultivated in a suitable culture medium under conditions which permit the formation of the virulence-modifying protein and this in After cultivation, either from the culture medium or from the cells can be obtained and isolated.
  • the present invention relates to an antisense iRNA sequence, characterized in that it is complementary to an mRNA which has been transcribed by a nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof and can bind selectively to the mRNA, whereby this Sequence can inhibit the synthesis of the CaTEC1 proteins encoded by the nucleic acid molecules.
  • the present invention relates to a ribozyme, characterized in that it leads to an mRNA which of a nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof has been transcribed, is complementary and can bind selectively to this mRNA and can cleave it, so that it can inhibit the synthesis of the CaTEC1 proteins encoded by the nucleic acid molecules.
  • Ribozymes that consist of a single RNA chain are RNA enzymes, that is, catalytic RNAs, that can cleave a target RNA intermolecularly. If you look at it in the literature (see for example Tanner et al., In:
  • ribozymes Able to cleave target RNA at a specific location.
  • the two main requirements for such ribozymes are the catalytic domain and regions that are complementary to the target RNA and allow them to bind to their substrate, which is a prerequisite for cleavage.
  • the invention also relates to triplex-forming oligonucleotides. These are limited to certain target sequences (Barre et al., Nucleic Acids Res 27 (1999), 743-749).
  • the invention also includes chemical modifications of nucleic acids. Suitable modifications of triplex-forming oligonucleotides are described, for example, in Baba et al., Int J Cancer 72 (1997), 815-820.
  • oligonucleotides include antisense oligonucleotides. Unlike the triplex-forming oligonucleotides, the design of such 0-ligonucleotides is based on the fact that a sequence is selected which is complementary to part of the mRNA of the transcription factor according to the invention. tors is. The design of such oligonucleotides and possible target sequences are described, for example, in Nucleic Acids Res., 26 (9) (1998), 2179-2183; Helene, C, Anti-Cancer Drug Des., 6 (1991), 569-584, and Mower, LJ, Cancer Invest. 14: 66-82 (1996).
  • Oligonucleotides are often necessary to identify the oligonucleotide with the greatest effectiveness.
  • Software-based methods are also used for the design of antisense oligonucleotides (Eckstein F., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 24; Matveeva et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 1374-1375 ).
  • a method for finding effective triplex-forming oligonucleotides, antisense nucleotides or ribozymes is described in US Pat. No. 6,013,447.
  • Oligonucleotides can be chemically modified, for example to increase certain properties, such as stability and binding strength. Such modifications are also part of the invention. Examples of such modifications which are suitable for antisense oligonucleotides are described in Shchepinov et al., Nucleic Acids Res., 25 (1997), 4447-4454; Tortora et al. , Clin. Cancer Res., 5 (1999), 875-881, and Zhou et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 (1998), 3269-74.
  • the invention also includes other structures that can bind to the nucleic acids of the invention.
  • An example of such structures are peptide nucleic acids (see Kuhn et al., J. Mol. Biol. Mar., 12, 286 (5) (1999), 1337-1345, and Nielsen et al., Curr. Opin. Biotechnol ., 1999, 10: 71-75).
  • the person skilled in the art knows, for example, Yadava, Molecular Biology Today, 1 (1) (2000), 1-16, for further information on the design and use of various oligonucleotides and derivatives thereof.
  • the aforementioned complementary sequences are suitable for the repression of the CaTSCl expression, for example in the case of treatment of a Candida infection.
  • the RNA according to the invention and the ribozyme according to the invention are preferably complementary to the coding region of the mRNA, for example to the 5 ′ part of the coding region.
  • the person skilled in the art, to whom the sequences of the nucleic acid molecules according to the invention are available, can produce and use the antisense RNAs or ribozymes described above.
  • the region of the antisense RNA or of the ribozyme which shows complementarity with the mRNA which has been transcribed by the nucleic acid molecules according to the invention preferably has a length of at least 10, in particular at least 15 and particularly preferably at least 25 nucleotides.
  • the present invention relates to inhibitors of Ca TECl which have a similar purpose to the above-mentioned antisense RNAs or ribozymes, that is to say the reduction or elimination of biologically active CaTECl protein molecules.
  • Such inhibitors can be, for example, structural analogs of the corresponding protein, which act as antagonists.
  • Such inhibitors also include molecules that are identified using the recombinantly produced proteins.
  • the recombinantly produced pro- tein can be used to screen and identify inhibitors by utilizing the ability of potential inhibitors to bind to the protein under appropriate conditions.
  • the inhibitors can be identified, for example, by producing a test mixture in which the potential inhibitor is incubated with CaTECl under suitable conditions, under which CaTECl is preferably in a native conformation.
  • a test mixture in which the potential inhibitor is incubated with CaTECl under suitable conditions, under which CaTECl is preferably in a native conformation.
  • Such an in vitro test system can be constructed using methods that are well known in the art.
  • Inhibitors can be identified, for example, by screening synthetic or naturally occurring molecules that bind to the recombinantly produced CaTECl protein in a first step, and then in a second step the selected molecules in in vitro test systems or cellular tests with regard to the Inhibition of the Ca TECl protein can be tested, which can be demonstrated by the inhibition of at least one of the biological activities described below.
  • Screen for molecules that bind CaTECl can easily be carried out on a larger scale, for example by screening potentially bindable molecules from substance libraries of synthetic and / or natural molecules.
  • Such an inhibitor can be, for example, a synthetic, organic or chemical substance, a natural fermentation product, a substance extracted from a microorganism, a plant or an animal or a peptide.
  • nucleic acid sequences according to the invention and the proteins encoded by them can be used to identify further factors which are involved in the virulence of Candida, for example a CaTEC1-dependent virulence factor.
  • the proteins according to the invention can be used, for example, to identify further (unrelated) proteins which are related to the virulence of Candida, screening methods based on proteins / protein interactions, for example the two-hybrid system , be used.
  • the present invention therefore also includes isolated and completely purified onoclonal or polyclonal antibodies or fragments thereof, which react with a protein according to the invention so specifically and with such an affinity that using these monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments with the aid of conventional immunological methods for example, detection of a protein according to the invention is possible.
  • a preferred embodiment of the invention therefore comprises monoclonal and polyclonal antibodies which can specifically identify and / or bind to a structure of a virulence-modulating protein according to the invention.
  • This structure can be a protein, peptide, carbohydrate, proteoglycan and / or a lipid complex which is part of or has a specific relationship with the protein according to the invention.
  • the invention also encompasses antibodies which are directed against structures which result from post-translational modifications of the according protein.
  • the invention also includes fragments of such antibodies, such as Fc or F (ab ') 2 or Fab fragments.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to proteins or parts thereof according to the invention, antibodies or parts thereof directed against the proteins and nucleotide sequences according to the invention which are present in immobilized form.
  • the nucleotide sequences, proteins and / or antibodies according to the invention which are present in immobilized form can be used as carrier-bound screening devices in order to identify substances which interact with the immobilized molecules.
  • the immobilization can be carried out on any suitable carrier material, for example on inert or electrically charged, inorganic or organic carrier materials, such as for example glass materials, aluminum oxide, cellulose, starch, dextran, polyacrylic acid and so on.
  • the carrier materials used can also have functional groups which, for example, enable a covalent bond. Immobilization can take place in such a way that the above-mentioned nucleotide sequences, proteins or antibodies are integrated into a three-dimensional network.
  • a further advantageous embodiment of the present invention comprises methods for the diagnosis and / or therapy of infections or disease states caused by Candida species, in particular infections caused by Candida albicans, such as Candida mycoses, for example Candiose of the body folds, the male urethra Oral mucosa, fingernails or toenails (onchycosis), infant skin, vagina etc., or candida granuloma.
  • Candida albicans such as Candida mycoses
  • Candiose of the body folds for example Candiose of the body folds, the male urethra Oral mucosa, fingernails or toenails (onchycosis), infant skin, vagina etc., or candida granuloma.
  • the organisms to be tested are examined for the presence of agents according to the invention, in particular nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, antibodies or fragments thereof, and their presence is detected. This means that the presence of the agents according to the invention indicates
  • the present invention therefore also provides a method for diagnosing a 'Candida infection, particularly a Candida albicans infection, comprising contacting a target sample suspected that CaTECl protein and / or to contain a Ca TeCl encoding nucleic acid, with a reagent that reacts with CaTECl and / or a Ca TECl-encoding nucleic acid and the detection of CaTECl and / or the Ca TECl-encoding nucleic acid.
  • the above-mentioned agents according to the invention can be detected by means of corresponding substances, ie agents specifically recognizing according to the invention.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be detected with the aid of hybridizing sequences, these being preferably marked.
  • the hybridizing sequences can have fluorescent, enzyme or radioactive markers.
  • the target molecule is a nucleic acid
  • the reagent is typically a CaTECl-specific nucleic acid probe or a PCR primer.
  • the person skilled in the art is able to develop suitable nucleic acid probes on the basis of the Ca TEC1 nucleotide sequence.
  • the probes / primers comprise nucleic acid molecules which are ole- specific with the nucleic acid according to the invention. cool hybridize.
  • the probes / primers are oligonucleotides which hybridize preferably under stringent conditions with at least 10, in particular at least 15 and particularly preferably with at least 25 adjacent nucleotides of the CaTEC1 nucleic acid sequence.
  • the Ca TECl-specific nucleic acid probes / primers preferably comprise the nucleic acid sequence: 5'-TTT AGG ATC CAA TGA TGT CGC AAG CTA CTC C-3 'and 5'-TTT AGG ATC CAC TAA AAC TCA CTA GTA AAT CCT TCT G-3 '. If the target molecule is the CaT £ C2 protein, an antibody directed against CaTECl is typically used as the reagent.
  • an antibody relates to antibodies which essentially consist of pooled monoclonal antibodies with different epitope specificities, as well as distinct monoclonal antibody preparations.
  • Monoclonal antibodies are produced using methods which are well known to the person skilled in the art (compare, for example, Köhler et al. , Nature, 256 (1975), 495) on the basis of an antigen which contains fragments of the Ca TEC1 protein according to the invention.
  • the term “antibody” (Ab) or “monoclonal antibody” (Mab) is intended to mean both intact molecules and Antibody fragments (e.g., Fab and F (ab ') 2 fragments) that can specifically bind to the protein.
  • Fab and F (ab') 2 fragments lack the Fc fragment of an intact antibody. They become faster excreted from the bloodstream and may have less non-specific tissue binding than an intact antibody (Wahl et al., J.
  • the antibodies according to the invention also include chimeras, single-chain and humanized antibodies.
  • the CaTECl protein and / or a CaTECl-encoding nucleic acid for example in biological fluids or tissues, can be detected directly in situ, for example by in situ hybridization, or can be obtained from other cellular components using methods known to the person skilled in the art, be isolated before contact with a probe.
  • Detection methods include Northern blot analysis, RNase protection tests, in situ methods, for example in situ hybridization, in vitro amplification methods such as PCR, RT-PCR, LCR, QRNA replicase or RNA transcription / amplification, reverse dot blot Methods such as that disclosed in EP-Bl 0 237 362, immunoassays, Western blot methods and other detection tests.
  • Products which are obtained using in vitro amplification methods can be detected by known methods, for example by separating the products on agarose gels and then staining them with ethidine promide.
  • the amplified products can be detected using labeled amplification primers or labeled dNTPs.
  • the probes / primers according to the invention can be detected by labeling with a radioisotope, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a fluorescent compound, a metal chelate or an enzyme.
  • Proteins or antibodies according to the invention are preferably detected with the aid of antibodies which are directed against the aforementioned proteins.
  • the expression of CaTECl in tissues can be examined using classic immunohistological methods (Jalkanen et al., J. Cell. Biol., 101 (1985), 976-985; Jalkanen et al., J Cell. Biol., 105 (1987), 3087-3096; Sobol et al., Clin. Immunpathol., 24 (1982), 139-144; Sobol et al., Cancer, 65 (1985), 2005-2010).
  • antibody-based methods useful for detecting gene expression include immunoassays, such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Suitable labels are known in the art and include enzyme labels such as glucose oxidase and radioisotopes such as iodine ( 125 I, 121 I) carbon ( 14 C), sulfur
  • Rhodamine and biotin The protein can also be detected in vivo using imaging techniques.
  • Antibody labels or markers for imaging the protein include those that can be detected using X-ray radiography, NMR or ESR.
  • Markers suitable for X-ray radiography include radioisotopes such as barium or cesium, which emit suitable radiation, but are not harmful to a subject.
  • Markers suitable for NMR and ESR methods include those with a detectable characteristic spin, for example deuterium.
  • a protein-specific antibody or antibody fragment which has a suitable detectable unit for imaging such as a radioisotope, for example 131 I, 112 In, "mTc, a substance that is opaque to X-rays or a material that can be detected by means of nuclear magnetic resonance methods, is introduced into a mammal, for example, parenterally, subcutaneously or intraperitoneally.
  • a radioisotope for example 131 I, 112 In, "mTc
  • the size of the individual and the imaging system used determine the amount of the unit used for imaging, which is required to produce suitable imaging for diagnosis.
  • the amount of radioactivity injected into a human subject is usually in the range of about 5 to 20 millicurie "mTc.
  • the labeled antibody or antibody fragment then preferably accumulates at the sites of a cell that contain the specific protein contain.
  • the present invention therefore also relates to the use of nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, antibodies and / or parts thereof according to the invention as diagnostics.
  • diagnostic agents are understood to mean any substances which can specifically recognize the presence of conditions, processes or substances or their absence and which in particular can give conclusions about diseases. Diagnostics often have recognizing and marking functions.
  • the invention of course also encompasses diagnostic kits, that is, the nucleotide sequences, proteins, antibodies or parts thereof and the diagnosis of 'by Candida species, especially Candida albicans, allow agents according to the invention, diseases caused.
  • diseases in particular, include conditions such as unnatural ones Understand moods, signs of aging, developmental disorders and the like.
  • the invention also encompasses methods for the therapy of diseases caused by Candida species, in particular Candida albicans, preferably a systemic infection, the organism to be treated being treated with the agents according to the invention over a period of time with a dose which is sufficient for the clinical picture stabilize or improve or cure the disease.
  • the method according to the invention for the treatment of a Candida infection therefore comprises the administration of a therapeutically effective amount of a reagent which reduces or inhibits the Ca TECl activity.
  • reagents are the antisense RNAs, ribozymes or inhibitors described above, for example an antibody directed against Ca TECl.
  • the invention therefore also relates to the use of the nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, inhibitors, antisense RNAs, ribozymes, antibodies and fragments thereof according to the invention as therapeutic agents.
  • therapeutic agent is understood to mean in particular those substances which can be used either prophylactically or accompanying the disease in order to avoid, alleviate or eliminate disease states. This includes, for example, vaccines.
  • therapeutic agents are also understood to mean those substances which have only or also cosmetic effects.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains a reagent. holds that decreases or inhibits Ca TECl expression or the activity of the Ca TECl protein.
  • administration of an antibody directed against the protein can also reduce or eliminate the activity of the protein.
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions which contain the agents according to the invention, that is to say the nucleic acid molecules according to the invention, proteins, host cells, vectors, inhibitors, antisense RNAs, ribozymes, antibodies or fragments thereof, if appropriate together with one pharmaceutically acceptable carriers and, if appropriate, other additives, such as stabilizers, thickeners, mold release agents, lubricants, colorants, fragrances, flavorings, emulsifiers or the like.
  • agents according to the invention that is to say the nucleic acid molecules according to the invention, proteins, host cells, vectors, inhibitors, antisense RNAs, ribozymes, antibodies or fragments thereof, if appropriate together with one pharmaceutically acceptable carriers and, if appropriate, other additives, such as stabilizers, thickeners, mold release agents, lubricants, colorants, fragrances, flavorings, emulsifiers or the like.
  • these agents can preferably be combined with suitable pharmaceutical carriers.
  • suitable pharmaceutical carriers are well known in the art and include phosphate-buffered physiological saline, water, emulsions such as oil-in-water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions, etc.
  • Such carriers can be formulated by conventional methods and administered to the patient at an appropriate dose.
  • Suitable compositions can be administered in various ways, for example by intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, topical or intradermal administration. The route of administration naturally depends on the type of Candida infection (for example systemic or vaginal Infection) and the type of compound contained in the pharmaceutical composition. The dosing schedule is determined by the examining doctor.
  • the dosage for a particular patient depends on many factors, including the size, age and sex of the patient, the specific compound to be administered, the duration and route of administration, the type and stage of the infection, the general state of health and the simultaneous administration of other drugs.
  • the antisense RNAs or ribozymes according to the invention can be applied directly or preferably administered using a recombinant expression vector, for example a chimeric virus which contains these compounds, or a colloidal dispersion system.
  • a recombinant expression vector for example a chimeric virus which contains these compounds, or a colloidal dispersion system.
  • a direct application at the target site can take place, for example, with the aid of a ballistic delivery system, such as a colloidal dispersion system, or by means of a catheter in an artery.
  • a ballistic delivery system such as a colloidal dispersion system
  • the colloidal dispersion systems which can be used to deliver the nucleic acids mentioned above include macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads and systems based on lipids including oil-in-water emulsions, (mixed) micelles, liposomes and lipoplexes.
  • a preferred colloidal system is a liposome.
  • the liposome is usually out Phospholipids and steroids, especially cholesterol. The person skilled in the art can select those liposomes which are suitable for delivering the desired nucleic acid molecule.
  • Organ-specific or cell-specific liposomes can be used to achieve delivery only to the desired site, for example a tumor.
  • those skilled in the art can make liposomes that are specific to a target.
  • Such targeting methods include passive targeting, in which the natural tendency of the liposomes to distribute in cells of the reticuloendothelial system (RES) in organs which contain sinusoid capillaries is used, or active targeting, for example by coupling the liposomes to a specific ligand, for example an antibody, a receptor, a sugar, a glycolipid, a protein, etc. using well known methods.
  • a specific ligand for example an antibody, a receptor, a sugar, a glycolipid, a protein, etc.
  • monoclonal antibodies are preferably used to target liposomes via specific cell surface ligands to specific organs or tissues.
  • Preferred recombinant vectors which are suitable for gene therapy are viral vectors, for example vectors based on adenoviruses, herpes viruses, vaccinia viruses or more preferably based on RNA viruses such as a retrovirus. More preferably, the retroviral vector is a descendant of a retrovirus derived from rodents or birds. Examples of such retroviral vectors that can be used in the present invention are: Moloney leukemia Rodent Virus (MoMuLV), Rodent Harvey Sarcoma Virus (HaMuSV), Rodent Breast Tumor Virus (MuMTV) and Rous Sarcoma Virus (RSV).
  • MoMuLV Moloney leukemia Rodent Virus
  • HaMuSV Rodent Harvey Sarcoma Virus
  • MoMTV Rodent Breast Tumor Virus
  • RSV Rous Sarcoma Virus
  • a retroviral vector from a non-human primate is preferably used, such as the gibbon leukemia virus (GaLV), which has a broader host range than the murine vectors.
  • GaLV gibbon leukemia virus
  • helper cells are required so that infectious particles can be produced.
  • helper cell lines can be used which contain plasmids which encode all structural genes of the retrovirus under the control of regulatory sequences within the LTR range. Suitable helper cell lines are well known to the person skilled in the art.
  • the vectors can additionally contain a gene which encodes a selectable marker so that transduced cells can be identified.
  • the retroviral vectors can be modified so that they become target-specific.
  • a polynucleotide region which encodes a sugar, a glycolipid or a protein, preferably an antibody.
  • a polynucleotide region which encodes a sugar, a glycolipid or a protein, preferably an antibody.
  • the person skilled in the art knows other methods for generating target-specific vectors. Further suitable vectors and methods for in vitro or in vivo gene therapy are described in the literature and are known to the person skilled in the art (compare, for example, WO 94/29469 or WO 97/00957).
  • kits that can be used in diagnostic research. Such kits are suitable for the detection of Candida on the basis of the CaTECl protein or a Ca TECl-encoding nucleic acid.
  • a kit according to the invention comprises a probe for detecting the Ca TECl protein and / or a CaTECl-coding nucleic acid. The probe can be marked for verification.
  • the probe is preferably a specific antibody or a specific nucleic acid probe or primer.
  • the kit contains a monoclonal antibody against CaTECl and enables diagnosis, for example by means of ELISA, and contains the antibody which is bound to a solid support, for example a polystyrene microtiter plate or nitrocellulose, using methods known in the art ,
  • the kits are based on an RIA test and contain an antibody which is labeled with a radioactive isotope ' .
  • the kit of the invention is the antibody with enzymes, fluorescent compounds. Luminance compounds, ferromagnetic probes or. radioactive compounds marked.
  • the kit according to the invention can also comprise one or more containers which, for example, contain one or more probes according to the invention.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention relates to methods for screening, that is to say for finding and identifying substances which are suitable for the treatment of diseases caused by Candida species.
  • the substances to be tested for their therapeutic effect are mixed in a suitable medium such as, for example, a solution, suspension or also in a cell, with a appropriate agent, in particular a nucleotide sequence according to the invention or a protein or fragment thereof according to the invention and a possible interaction, for example a binding, has been detected.
  • a preferred substance screening method of the present invention comprises an assay which is structured as follows:
  • the promoters of the isogens of the secreted aspartyl proteinase types 4, 5 and 6 contain a "head interspersed with separating elements to tail "arrangement of TCS motifs, which represents the binding site for fungal TEA / ATTS transcription factors, in particular the CaTECl factor according to the invention. Since it could be shown in accordance with the invention that the Ca-TEC1 protein can induce the expression of the SAP4-6 ⁇ genes by binding to the promoter, the promoter region of these SAP4-6 genes is combined with a reporter gene.
  • the expression of the reporter gene can be induced either by the addition of the purified Ca-TECl protein or by the expression of the nucleotide sequences according to the invention encoding the Ca-TECl protein, the CaTECl protein binding to the promoter region under suitable conditions and the expression of the reporter gene induced.
  • the inducibility of the system used in the test system for the expression of the reporter gene is then checked in the absence or presence of substances to be tested. With the help of natural product and substance libraries, suitable inhibitors can thus be detected which inhibit the function of the CaTECl protein or the expression of the nucleotide sequences according to the invention which encode the CaTECl protein. In this way So substances can be identified that represent potential medicines for combating Candida infections.
  • the proteins according to the invention can likewise be used in the form of hybrid proteins in conventional “two-hybrid systems” in order to identify proteins which interact with the proteins according to the invention, a first hybrid protein comprising a protein according to the invention and for example a domain transactivating the transcription of a reporter gene is produced and is incubated together with a reporter gene and a second hybrid protein from a first portion, which represents the protein to be examined, and a second portion, which is a DNA binding domain of the transcription-activating portion of the first hybrid protein, with interactions of the protein to be examined with The protein according to the invention now has an association of the transactivating and the DNA binding domains, which in turn induces the expression of the reporter gene and permits the detection of the binding Combinations possible.
  • the proteins according to the invention are therefore effective agents for screening pharmacologically interesting substances for the treatment of diseases caused by Candida species.
  • the proteins according to the invention can be used in isolated form, in medical devices, in drug delivery devices, matrices for drug screening libraries, microtiter plates, applicable catalysis devices or the like.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to a mutated Candida albicans cell, which is characterized in that the nucleotide sequences according to the invention or their regulatory regions are changed in such a way that no transcript of the nucleotide sequence according to the invention can be detected.
  • the Candida modified according to the invention albicans cell can be both a haploid cell, the nucleotide sequence according to the invention present in only one copy being changed or mutated, and a " diploid cell, in which both copies of the nucleotide sequence according to the invention are changed or mutated in such a way that it is a homozygous one
  • This can be both a natural cell mutant and a mutant generated using technical means, for example a mutant produced using homologous recombinations, antisense methods or the like.
  • the present invention relates to homozygous ura3 / ura3 catecl / ca tecl (pVEC) zero mutant CaASl ⁇ , which was generated by means of sequential homologous recombination and was deposited with the DSMZ in Braunschweig on September 6, 2000 under the number DSM 13722.
  • the mutated Candida albicans cell according to the invention is characterized in that its viability, colony size and doubling time are not or only slightly changed compared to the wild-type cell.
  • a Candida albicans cell mutated according to the invention is particularly characterized in that its filamentous growth is impaired, the formation of germ tubes and true hyphae in particular presses. Instead, mutated cells according to the invention form curved tubular structures which have constrictions at the cell-cell boundaries and thus represent morphological pseudohyphae.
  • such mutated Candida albicans cells are characterized in that the expression of the SAP4-6 genes cannot be induced in them.
  • a systemic infection in a mouse model for systemic Candida mycoses shows that the virulence of the homozygous catecl cell mutant of Candida albicans according to the invention is significantly suppressed in comparison to wild-type cells.
  • a preferred embodiment of the present invention therefore relates to the use of living mutated or modified Candida albicans cells, in particular the catecl / catecl zero mutant CaAS18, " with a mutation in the nucleotide sequences according to the invention, so that these nucleotide sequences cannot generate a transcript under transcription conditions - And the cells show a significantly reduced virulence compared to wild-type strains, as a vaccine or vaccine as part of a protective vaccination to produce a resilient disease immunity against infections of wild-type Candida strains, in particular Candida albicans.
  • the live vaccines are preferably with the help Other suitable agents are weakened in such a way that, for example, their ability to reproduce is eliminated
  • the administration of such a weakened live vaccine can take place, for example, parenterally, locally, in particular orally, nasally, cutaneously or by inhalation hung pursues the goal of local infection control, in particular Mucous membranes through the formation of secretory antibodies and by increasing macrophage activity.
  • FIG. 1 shows the results of a Northern blot analysis of the CaTECl expression in C. albicans.
  • the blots were hybridized with CaTECl and ACT1, which served as a control.
  • FIG. 2 shows that the CaTECl gene from C. albicans is a functional homologue of the TECl gene from S. ce-revisiae.
  • (A) shows that Ca TECl can restore pseudohyphal growth in diploid S. cerevisiae cells that have a TECI deletion.
  • the pseudohyphal growth of the strains on SLAD medium with uracil is shown after 48 hours of incubation at 30 ° C.
  • the strains were L5791 (TEC1 / TEC1, pRS425, pRS313), L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425) and L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425 CaTECl).
  • FIG. B shows that CaTECl is the invasive growth of haploid and diploid S. can restore cerevisiae cells with TECl deletions.
  • the invasive growth of strains that occur 24 hours at 30 ° C YPID medium was shown before (A) and after washing (B).
  • the strains in the top row are the haploid strains (MAT a) 10560-2B (TECl), pRS425, pRS313), L6149 (TECl, pRS425) and L6149 (TECl, pRS425 CaTECl).
  • the strains in the bottom row are the diploid strains (MAT a / ⁇ ) L5791 (TEC1 / TEC1, PRS425, pRS313), L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425) and L6146 (TEC1 / TEC1, PRS425 CaTECl).
  • C shows the CaTECl induced FLOll-lacZ expression in haploid and diploid S. cerevisiae cells with TECl deletions.
  • the strains were grown in SC medium at 30 ° C for 48 hours. Then ⁇ -galactosidase tests were carried out.
  • the strains used are the haploid (MAT a) strains 10560-2B (TECl, pRS425, pRS313, B3782), L6149 (TECl ,.
  • TECl pRS425, B3782 and L6149 (TECl, pRS425 CaTECl, B3782) and the diploid (MAT a / ⁇ ) strains L5791 (TECl / TECl, pRS425, pRS313, B3782), 6146 (TECl / TECl, pRS425, B3782) and L6146 (TECl / TECl, pRS425 Ca TECl, B3782).
  • the units were normalized with regard to the haploid wild type and the diploid wild type.
  • Figure 3 shows how the Ca TECl gene was inactivated in C. albicans.
  • FIG. 3A shows a Southern blot of stepwise produced isogenic mutants with a CaTECl fragment as a probe (probe, Figure 3A).
  • (C) shows the Northern analysis of the Ca TECl expression of the revertant CaAS20 ⁇ CaTECl / CaTECl pVEC-CaTECl) and the mutant CaAS18 (Ca TECl / CaTECl pVEC) during the growth in the log phase in YPD medium at 28 ° C. (Lanes 1, 5) and after 45 minutes (lanes 2, 6), 90 minutes (lanes 3, 7) and 300 minutes (lanes 4, 8) of growth in liquid culture medium that had been enriched with serum 37 ° C. The ACT1 expression was analyzed as a control and is shown in the two lower images.
  • FIG. 4 shows the suppression of the formation of hyphae by a mutation of the Ca TECl gene.
  • the strain CaAS20 ⁇ CaTECl / CaTECl pVEC-CaTEClJ (left picture) and the mutant CaAS18 ⁇ CaTECl / Ca TECl pVEC) (right picture) were transferred in RPMl-1640 liquid medium, which had been enriched with serum, at 37 ° C. vaccinated and checked for the development of hyphae after 90 minutes (a, d), 3 hours (b, e) and 12 hours (c, f).
  • the arrows in (e) show examples of le for cell wall constrictions between pseudo-hyphal cells.
  • Figure 5 shows the interaction between C. albicans and primary M ⁇ cells.
  • CaAS20 bypasses the M ⁇ and forms germ tubes and long filaments, while CaAS18 accumulates in M ⁇ (arrows in d).
  • FIG. 6 shows the results of a Northern analysis of the SAP4-6 and EFG1 expression in the wild-type strain SC5314, in CaAS20 and in the mutant CaAS18 during the log growth phase in YPD medium at 28 ° C. (lanes 1, 5, 9) and after 45 minutes (tracks 2, 6, 10), 90 minutes (tracks 3, 7, 11) and 300 minutes (tracks 4, ⁇ , 12) growth in liquid culture media enriched with serum at 30 ° C.
  • the ACT1 hybridization as a control is shown in FIGS. 1 and 3C.
  • FIG. 7 shows the results of virulence tests of BALB / c mice which were carried out either with the mutant strain CaAS18 Ca TECl / Ca TECl (pVEC) (open squares or circles) or with the revertant CaAS20 CaTECl / CaTECl (pVEC-CaTECl) ( black squares or circles).
  • pVEC mutant strain CaAS18 Ca TECl / Ca TECl
  • pVEC-CaTECl revertant CaAS20 CaTECl / CaTECl
  • FIG. 8 shows two microscopic fluorescence images of C. al.hica.ns cells after staining with Calcofluor white, which had been purified from KOH-solubilized vaginal douches (vag.) And kidneys (iv.).
  • FIG. 9 shows the results of Northern blot analyzes of RNA, the avirulent mutant Can61 ⁇ CaTECl) (CaASl ⁇ ) and the virulent mutant Can62 (CaAS20), which were cultured in RPM1-1640 medium containing 10% FCS over different periods of time were.
  • the Northern blots were hybridized with probes for the C. albicans-specific genes HWP1 and ALS 1, 3, 8. A hybridization with a CaTECl probe and with an ACTl probe followed as a control.
  • SEQ ID No. 1 shows the 4216 nucleotide DNA sequence of a genomic clone of the CaTECl gene from Candida albicans.
  • SEQ ID No. 2 shows the 2229 nucleotide protein coding region of the genomic clone from SEQ ID No. 1 (bp 953 to 3181, based on SEQ ID No. 1 ATG-Start: 953-955, stop codon: 3182-3184).
  • SEQ ID No. 3 shows the 5 'regulatory element of the CaTECl gene from SEQ ID No. 1 (bp 1 to 952 based on SEQ ID No. 1).
  • SEQ ID No. 4 shows the amino acid sequence of the CaTEC1 protein according to the invention comprising 743 amino acids derived from an open reading frame (SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 1.
  • SEQ ID No. 5 shows the sequence of the primer TEClgenPCR.01, which was used to isolate the DNA sequence according to the invention of the CaTECl gene.
  • SEQ ID No. 6 shows the sequence of the primer TEClgenPCR.02, which was used to isolate the DNA sequence according to the invention of the CaTECl gene.
  • SEQ ID No. 7 shows the 3 'regulatory element of the CaTEC1 protein according to the invention from SEQ ID No. 1 (bp 3185-4216 based on SEQ ID No. 1).
  • SEQ ID No. 8 shows the sequence of a CaTECl-specific nucleic acid probe suitable for the diagnosis of Candida infections.
  • SEQ ID No. 9 shows the sequence of a further nucleic acid probe suitable for the diagnosis of Candida infections.
  • a 4.2 kb fragment was obtained from genomic DNA of the CA1-4 strain (Fonzi and Irwin, Genetics (1993) 134, 717-728) using the LongRange-PCR-Kit (Boehringer, Germany). The PCR product was subcloned into the EcoRV site of the vector pGEM-T-Easy (Promega, Germany), whereby the plasmid p275 deposited with DSMZ was obtained.
  • the BglII-EcoRV fragment of plasmid p275 which contained the CaTECl-ORF (open reading frame, 2229 bp in length, SEQ ID No. 2), was against the 3.5 kb BglII-Sall fragment of a hisG-URA3-hisG- Replaced cassette obtained from the plasmid pMB7 (Fonzi and Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728), where plasmid p277 was obtained. This plasmid was cleaved with NotI and transformed into the ura ⁇ - C.
  • albicans strain CA1-4 so as to replace the coding region of one of the chromosomal CaTECl alleles with the hisG-URA3-hisG cassette by means of homologous recombination.
  • Ura + transformants were selected on a selective ura ⁇ medium.
  • the integration of the cassette into the CaTECl locus was confirmed by means of Southern blot analysis. Spontaneously generated ura ⁇ derivatives were selected on a medium containing 5-fluoroorotic acid.
  • These clones were screened by Southern blot hybridization to identify the clones that had lost the URA3 gene by intrachromosomal recombination mediated by the hisG repeat sequences. This procedure was repeated to delete the other functional allele from CaTECl.
  • the homozygous catecl:: hisG / catecl:: hisG mutant (one of these homozygous mutants was designated as CaAS15) was obtained.
  • the mutant CaASl ⁇ was transformed either with the vector pVEC to give the strain CaASl ⁇ or with the vector pVEC-CaTECl containing the CaTECl gene to give the strain CaAS20.
  • the C. alhicans plasmid pVEC-CaTECl was constructed by inserting an Ncol-Sacl fragment of plasmid p275, which contains the CaTECl gene, into the plasmid pVEC ⁇ Candida albicans, Navarro-Garcia et al. , J. Med. Vet. Mycol 33 (1995), 361-366), which contains a replication origin of Candida albicans and a selectable CaURA3 marker and which had been cleaved with the restriction enzymes Smal and Sacl.
  • Yeast tecl mutants have a pseudohyphal defect in diploid and an invasion defect in haploid strains.
  • CaTECl was in the diploid S. cerevisiae-Sta m L6146 (tecl / tecl) introduced. L6146-pRS425CaTECl was obtained. This strain was tested for pseudohyphal growth on SLAD agar. It could be shown that CaTECl could complement the pseudohyphal growth defect of L6146, the strain L6146 containing the plasmid without CaTECl insert.
  • the invasive growth defect of the haploid S. cerevisiae strain L6149 (tecl) on YPD agar was also complemented after transformation with pRS425CaTECl.
  • CaTECl is able to transcribe FLOll in the absence of TECl in S. to activate cerevisiae. Flollp namely requires Teclp for activation and is essential for the growth of pseudohyphae and invasions (Lambrechts et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8419-8424).
  • the isogenic catecl / catecl mutants could neither be induced by serum induction nor by interaction with murine phagocytes to form hyphae.
  • mutant CaASl ⁇ strain 24 hours after induction, the majority of the mutant cells formed short filaments. A smaller fraction of the cells developed into branched mycelia. The same morphology of the mutant CaASl ⁇ strain was obtained by inducing hyphal growth in modified Lee's medium at neutral pH. These defects in liquid medium could be reversed by reintroducing the CaTECl gene on the plasmid pVEC-CaTECl in the revertant strain CaAS20.
  • albi cans cells per infected M ⁇ This indicates that CaASl ⁇ is constantly growing within the host cells. Occasionally, a small number of mycelia could be be taken care of. The majority of the cells of the CaAS20 strain developed into typical mycelia. Hyphal growth was not inhibited by M ⁇ . CaTEClp is therefore necessary for the growth of C. albicans from M ⁇ .
  • the gene defect in the CaTECl gene therefore has serious consequences not only in vitro for the formation of hyphae, but also in vivo for the virulence of C. albicans.
  • a catecl / oatecl mutant calls for an infected dose of infected Balb / c mice 5 x 10 5 cells showed only moderate clinical signs of systemic candidiasis.
  • Candida albicans strains Can ⁇ l ⁇ CaTECl and Can62 ⁇ pCaTECl were taken from the strain collection, "spread on SC-ura agar plates and incubated for two days in an incubator at 30 ° C. Then 5 ml of precultures from each of the colonies thus grown were in SC-ura liquid medium was inoculated and incubated overnight in a shaking incubator at 30 ° C. and 37 ° C. The primary cultures were converted from these precultures in a ratio of 1: 100 in 5 ml YPD medium, RPMI-1640 medium 10 % FCS and ⁇ -Mem medium, which in turn were shaken at 30 ° C. and 37 ° C.
  • the strains Can61 ⁇ CaTECl) and Can62 ⁇ pCa TECl) and the wild type Canl4 were streaked out SC-ura agar plates and storage in an incubator for two days at 30 ° C.
  • 50 ml of SC-ura liquid medium were inoculated as a preculture and only at 30 ° C. in a shaker incubator overnight
  • the main culture of the Can ⁇ l ⁇ CaTECl) and Can62 ⁇ pCa TECl) strains resulted from a 1: 100 batch from the corresponding preculture in 600 ml of RMI-1,640 medium with an addition of 10% FCS.
  • FIG. 9 The results of this Northern blot analysis are shown in FIG. 9.
  • the gene HWPl is not expressed in the avirulent mutant Can61, in which the CaTECl has been deleted, even after 22 hours of incubation.
  • HWPl is expressed in the virulent mutant 62 after two hours of cultivation, the expression level not increasing even after prolonged cultivation.
  • the ALS 1, 3, 8 gene is also not expressed in the avirulent mutant Can61 ( ⁇ Ca TECl). In the virulent mutant Can62 ⁇ CaTECl), the expression of ALS 1, 3, 8 is highest after four hours of cultivation and decreases during further cultivation.
  • a chip was produced which contained nucleic acids from Candida albicans which either had homologies to cell wall genes from Saccharomyces cerevisiae or which were known cell wall genes from Candida albicans. These probes were amplified by PCR on a 96-well plate scale and then purified. The probes were then printed on the coated south.
  • RNAs to be compared on a chip were analyzed as described below using oligo (dT) primers from an r . subjected to inverse transcription with Superscript II, in which differently fluorescence-labeled nucleotides (Cy3-dCTP and Cy5-dCTP) were incorporated into the resulting cDNA. Nucleotides that were not incorporated were then separated off using Microcon 30 filters. After combining the two individual samples, they were concentrated. Large particles were then eliminated using a Millipore filter (0.45 ⁇ m).
  • Hybridization then took place. This was done as follows. After a Petri dish with moist Whatman paper was prepared as a hybridization chamber and the sample to be applied was briefly denatured at 100 ° C, the sample was applied between the markings on the DNA chip. Air bubbles created in the process could be destroyed with a hot needle. A coverslip was then placed without air bubbles and the chamber was carefully sealed with parafilm. Hybridization was carried out overnight in a 65 ° C water bath, wherein the coated fluorescently labeled cDNA v in complementary DNA on the chip with that interact and Wasserstoffmaschinenbin- 'could form fertil.
  • the samples bound on the slide could be detected using a special array scanner.
  • two lasers of different wavelengths were emitted, which excited the two different fluorescent dyes.
  • the scanner delivered two single images of the same array, one scanned in the red laser channel and one in the green, with the probes on which the sample hybridized, each fluorescing.
  • ImaGene software a so-called 0-verlay could be created. Both individual images, which had been superimposed by the computer, provided an image in which the same gene expressions appeared as yellow data points, while different gene expressions appeared either as red or green data points. This visual representation of the results was expanded by a further evaluation of the raw data table delivered via the computer.
  • fluorescence was the data point on the array is represented by its own fluorescence intensity and the associated background intensity.
  • the computer determined these on the basis of the pixels that were calculated over an area around the data point. On the basis of this table, further evaluation using common PC software such as Excel was possible. Based on the evaluations, results were obtained which confirmed the results of the Northern blot analysis.
  • Canl4 • wild type, clinical isolate SC5341 [6]
  • Can62 (pCaTECl; virulent mutant CaAS20 [26] ura3:: imm43 / ura3:: imm43 catecl:: hisG / catecl:: hisG plasmid pVEC-CaTECl (ARS-URA3)
  • RNA loading buffer 50% glycerol 1 mM EDTA pH 8.0 0.25% bromophenol blue 25% xylene cyanol FF
  • Electrophoresis Amersham Pharmacia Biotech EPS 301 power supply
  • Hybridizing oven GFL 7601
  • Orbital shaker Belly Dancer, Stovall Life
  • pH meter Greisinger Electronics measurement and control technology
  • Phosphoimager Molecular Dynamics Storm 660 Molecular Dynamics Phosphor Screen and Exposure Cassette
  • UV crosslinker Stratagene UV stratalinker I ⁇ OO
  • Centrifuges Heraeus Megafuge 1.0R, refrigerated centrifuge
  • YPD Medium Complete medium for yeast extract (Difco) 10 g / 1 Bacto-Peptone (Difco) 20 g / 1 glucose solution ⁇ 40%) 50 ml / 1
  • Ammonium sulfate 5.0 g / 1 glucose solution (40%) 50 ml / 1 amino acids, nucleotides SC-ura Medium: Selection medium for yeasts like SC medium but without uracil
  • Aicon Microcon-30 filter
  • Millipore filter Millipore filter, 0.45 ⁇
  • the acid phenol extraction method at 65 ° C was used for RNA isolation.
  • the cultured cells were centrifuged at 1500 ⁇ g and 4 ° C. for 15 minutes, media residues were washed out twice with ice-cold ddH 2 0 and the cells were resuspended in a 1: 1 mixture of TES and phenol. The amount of this mixture corresponded to the volume of the cell pellet. After an incubation of 60 minutes at 65 ° C, during which it was mixed more often to increase the RNA yield, two phases were formed by centrifugation again at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes.
  • the subsequent phase separation was carried out as already described.
  • Another centrifugation at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes led to two clearly separated phases, again the upper aqueous phase in a mixture of 100% ice-cold ethanol and 0.1 Vo. 3 M sodium acetate pH 5.3 was added.
  • RNA precipitated after 2 to 24 hours and could be centrifuged at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes. While remaining salts dissolved out by washing once in ice-cold 70% ethanol, the RNA remained in its undissolved pellet form. The supernatant was discarded and residual amounts of ethanol were removed by subsequent air drying. The RNA was finally resuspended in sufficient DEPC-H 2 0 to give a final concentration of 5 to 10 ⁇ g / ⁇ l.
  • RNA concentrations were determined by photometric absorbance measurement at 260 nm and subsequent calculation. The calculation was made using the dilution used and a conversion factor based on an RNA concentration of 40 ⁇ g / ml for an extinction of 1.0. The quotient from E 26 o / E 28 o could be used to determine the purity. For sufficiently pure RNA, the quotient must be between 1.8 and 2.0.
  • the sample preparation was prepared as follows:
  • the DNA gel electrophoresis was carried out with 1% agarose gels prepared in 1 x TBE buffer.
  • the ethidium bromide was added to the gels in a ratio of 1: 15000 from a 10 ⁇ g / ⁇ l stock solution.
  • the sample was prepared in a ratio of 1: 1 with the sample buffer.
  • the electrophoresis conditions were as follows:
  • a 1.2% agarose gel was used to test the PCR products during chip production, the batch being made in 1 x TAE buffer.
  • the ethidium bromide was added to the gel as in point b) DNA gels and the sample was mixed with the sample buffer in a ratio of 1: 1.
  • the conditions were chosen as follows:
  • restriction digest with Nsil was carried out in a volume of 30 ⁇ l with 3 ⁇ l P275-DNA (approx. 1 ⁇ g) and 4 U enzyme at 37 ° C. The incubation took place overnight.
  • the DNA fragments used for the experiments were amplified via polymerase chain reaction (PCR).
  • the batches each contained 10 ng DNA, 1 ⁇ PCR buffer (Gibco), 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each nucleotide, 20 pmol each primer and 2 U Taq polymerase in a volume of 50 ⁇ l.
  • the program flow of the cycler differed depending on the primer pair used in the annealing temperature. The following was true for the PCR amplification used for chip production on a 96-well plate scale:
  • the DNA fragments from PCR and restriction digestion were generally purified according to the protocol of the Qiagen QIAquick PCR Purification Kit.
  • the DNA obtained was eluted in 30-50 ⁇ l of microbiologically pure water.
  • the S probes used for the Northern blots, radioactively labeled with [ ⁇ - 32 P] -dCTP, were produced according to the protocol of the Stratagene Prime-It II Random Primer Labeling Kit.
  • [ ⁇ - 32 P] - dCTP was incorporated into the synthesis chain as a radioactive nucleotide. Subsequent separation of unincorporated radioactive nucleotides was carried out according to the protocol of the Amersham ProbeQuant G-50 Micro Columns.
  • the oligo (dT) probe used for the mRNA detection and radioactively labeled with [ ⁇ - 32 P] -ATP was produced by converting oligo (dT) primers with T4 polynucleotide kinase according to the instructions from New England Biolabs.
  • the radioactive ⁇ - 32 P was transferred from ATP to the oligo (dT) primer by the T4 polynucleotide kinase.
  • Hybridization was carried out at 62 to 65 ° C. with radiolabelled DNA fragments, the membranes were then treated and autoradiography was carried out as usual (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 1991-1995 ).
  • Northern blots were quantified using a Fuji BAS 3000 phosphor IMAGER device using the associated software.
  • the ether blot analyzes were carried out as described by Schröppel et al. (J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 2646-2654). Genomic DNA digested with restriction enzymes was separated on 0.7% agarose gels and blotted on Biodyne B nylon membranes. Hybridization and stringent washes were performed as described (Church and Gilbert (1984) supra) followed by autoradiography.
  • an Nsil fragment from p275 was labeled with random primers.
  • an equimolar mixture of p206, p207 and p208 was labeled, which was obtained by subcloning BglII fragments of the SAP4, SAP5 and SAP6 ORFs (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994) , 357-368) into the BamHI site of pGEM3Z (Lengths of the inserts: 755, 677 and 660 bp). Plasmids for the detection of ACTl and EFGl mRNA were kindly provided by Prof. J. Ernst, Heinrich Heine University, Düsseldorf.
  • RNA isolation dye 15 ⁇ g of the RNA isolated from the strains were mixed in a ratio of 1: 3 with RNA loading dye and separated on a 1% RNA gel overnight at 10 V in 1 x MOPS.
  • the gel was photographed under UV light and then placed upside down on a suitably cut blot block made of Whatman paper, which had previously been placed in a
  • RNA in the gel could be transferred to the nylon membrane overnight and, after air drying, fixed twice in the UV crosslinker via "auto cross link". Subsequent washing of the blot in 2x SSC should reduce the high salt concentration on the membrane. After drying again in air the blot was wrapped in foil The membrane was blocked at 65 ° C. in the hybridization furnace. The actual hybridization then took place with the radioactively labeled probe, which had previously been placed in 10 ml of Church buffer. To ensure optimal hybridization, hybridization was carried out overnight at 65 ° C.
  • the duration of the exposure varied, but at least it took place overnight. It was then welded in and stored at -70 ° C until further processing in the isotope laboratory.
  • the cells for the ⁇ -galactosidase tests of FL011 :: lacZ or FG :: TyA-lacZ were grown in SC liquid medium and according to Mösch et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), 5352-5356).
  • Cells for the quantification of FL011 :: lacZ or FG :: TyA-lacZ expression in the exponential growth phase were inoculated 1:20 from confluent 20-hour cultures in fresh medium and allowed to grow for 4-6 hours.
  • the cells for the quantification of FL011 :: lacZ and FG:: TyA-lacZ expressions after the post-diauxic shift were grown for 48 hours.
  • C. albicans was investigated using M ⁇ obtained from peritoneal exudate, which was essentially as described in Bogdan et al. (Eur. J. Im unol., 20 (1990), 1131-1135, Gessner et al ., Infect. Immun., 61 (1993), 4008-4012).
  • M ⁇ was in a density of 8 x 10 5 cells on eight different wells (Nunc, Germany) and " formed a monolayer of adherent cells.
  • C. ' albicans was added with an multiplicity of infection (MOI, Multiplicity of infection) of 1:16 (C. albicans: M ⁇ ratio) and the plates were incubated with 5% CO 2 for 8 or 24 hours at 37 ° C. The plates were fixed (Histo Choice, Amresco) and stained with periodic acid Schiff's reagent (Sigma), followed by microscopic examinations using a Zeiss -Axiophot microscope " (Zeiss, Goettingen).
  • mice Eight to ten week old female BALB / c mice (Charles Rivers Breeding Laboratories, Sulzfeld, Germany, 5 to 8 per group) were used in the in vivo studies. Mucosal colonization of the vaginal canal was initiated by inoculating BALB / c mice intravaginally with 5 x 10 4 blastoconidia of the stationary phase in 20 ⁇ l PBS (Fidel, Jr. et al., Infect Immun (1993) 61, 1990-1995) were. 72 hours before inoculation, the mice were injected subcutaneously with 0.02 mg / mouse estradiol valerate (Sigma) in 0.1 ml of sesame oil. Estrogen treatments were continued at weekly intervals.
  • CFU colony-forming units
  • the fungal cells were isolated from the vaginal canal (day 21) or from the kidneys (day 12). The samples were dissolved using a 20% KOH solution at room temperature. Samples were centrifuged at 1500 x g for 10 minutes and the sediment was applied to slides in the presence of fluorescent brighteners (Calcofluor-Weiss, Sigma, Germany) for epifluorescence microscopy (Zeiss Axiophot, Zeiss, Germany).
  • the chip was produced using the protocols from Stanford University [31]
  • the selection criteria for the probes to be printed on this chip were homologies in Candida albicans to cell wall genes in Saccharomyces cerevisiae and known cell wall genes in Candida albicans. These probes were amplified by PCR on a 96-well plate scale and then purified. Running a 1.2% agarose gel at 150 V for 1.5 hours gave information about the quality of the probes. The coated slides were printed on the spotter.
  • the printing area had to be marked with a glass pen before each further work step in order to be able to precisely position the cover slip for hybridization later.
  • the probes were allowed to swell briefly over 1 ⁇ SSC and then dried again at 80 ° C. for 3 seconds. Subsequent fixation the covalent DNA on the slide on training l 'enter bonds was carried out by UV irradiation in a UV crosslinker.
  • the slides were treated for 20 minutes with a blocking solution containing succinic anhydride, sodium borate and N-methylpyrrolidinone as described in the protocol [33] included.
  • the DNA on the slide was then denatured by leaving the slides in a 95 ° C water bath for 2 minutes.
  • the slides were dried by washing in 95% ethanol and then centrifuging at 150 ⁇ g for 5 minutes.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

The invention relates to nucleotide sequences which code for proteins which modulate the virulence of pathogenic fungal strains, to vectors containing these sequences, to host cells having these nucleotide sequences or these vectors, to proteins which modulate the virulence of pathogenic fungal strains, especially the transcription factor CaTEC1 of Candida albicans, to inhibitors thereof, especially antibodies which target these virulence-modifying proteins, to methods for producing the proteins and inhibitors, to methods for the diagnosis and therapy of diseases which are associated with a Candida infection and to diagnostic and pharmaceutical compositions containing the nucleotide sequences, proteins, host cells and/or antibodies.

Description

Das C. albicans TECl GEN (CaTECl) und das kodierte Teclp ProteinThe C. albicans TECl GEN (CaTECl) and the encoded Teclp protein
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremo- leküle, die die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierende Proteine kodieren, Vektoren, die diese Moleküle enthalten, Wirtzellen, die diese Nuklein- säuremoleküle oder Vektoren aufweisen, die Virulenz pathogener Pilzstämme modulierende Proteine, Inhibitoren der Proteine und der Proteine kodierenden Nukleinsäuremoleküle, insbesondere Antikörper, die gegen diese virulenzmodulierenden Proteine gerichtet sind, Verfahren zur Herstellung der Proteine und Antikörper sowie diagnostische und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Nukleotidsequenzen, Proteine, Wirtzellen und/oder Antikörper enthalten.The present invention relates to nucleic acid molecules which encode proteins modulating the virulence of pathogenic fungal strains, vectors which contain these molecules, host cells which have these nucleic acid molecules or vectors, proteins which modulate the virulence of pathogenic fungal strains, inhibitors of the proteins and the nucleic acid molecules which code for the proteins , in particular antibodies which are directed against these virulence-modulating proteins, methods for producing the proteins and antibodies and diagnostic and pharmaceutical compositions which contain these nucleotide sequences, proteins, host cells and / or antibodies.
Bei Hefen handelt es sich um Pilze, die sich vege- tativ durch Sprossung oder Spaltung vermehren. Neben kommerziell genutzten Hefen der Familie Saccha- romycetaceae umfassen die Sprosspilze oder Hefen auch humanpathogene Arten, beispielsweise Candida albicans . Bei Candida albicans handelt es sich um eine dünnwandige, grampositive, kapsellose Hefe von ovaler bis rundlicher Form, die fakultativ pathogen für Mensch, Meerschweinchen, Maus, Ratte und Geflügel ist. Candida albicans ist der häufigste Erreger von oberflächlichen Caüdida-Mykosen beim Menschen. Darüber hinaus verursacht Candida albicans häufig opportunistische Infektionen, also Infektionen durch normalerweise relativ unproblematische Keime, bei immunsuppri ierten Patienten. Bei solchen im- unsupprimierten Patienten können derartige Infektionen einen schweren Verlauf nehmen und die Über- lebenszeit, beispielsweise von HlV-Infizierten oder Krebspatienten, die mittels Che o- oder Radiotherapie behandelt werden, entscheidend verkürzen. Durch Candida albicans hervorgerufene systemische Infektionen werden derzeit hauptsächlich mit Hilfe von Azolen oder Polyenen behandelt. Während Polyene starke Nebenwirkungen aufweisen, entwickeln sich gegen Azole zunehmend Resistenzen (DiDomenico, Curr. Opin. Microbiol., 2 (1999), 509-515; Georgo- papadakou, Curr. Opin. Microbiol., 1 (1998), 547- 557).Yeasts are fungi that multiply vegetatively through sprouting or splitting. In addition to commercially used yeasts from the Saccharomycetaceae family, the shoot fungi or yeasts also include species which are pathogenic to humans, for example Candida albicans. Candida albicans is a thin-walled, gram-positive, capsule-free yeast of oval to rounded shape that is optionally pathogenic for humans, guinea pigs, mice, rats and poultry. Candida albicans is the most common cause of superficial Caüdida mycoses in humans. In addition, Candida albicans often causes opportunistic infections due to normally relatively unproblematic germs in immunosuppressed patients. In such unsuppressed patients, such infections can take a severe course and significantly shorten the survival time, for example of HIV-infected people or cancer patients who are treated with chemotherapy or radiotherapy. Systemic infections caused by Candida albicans are currently mainly treated with azoles or polyenes. While polyenes have strong side effects, resistance to azoles is developing increasingly (DiDomenico, Curr. Opin. Microbiol., 2 (1999), 509-515; Georgopadadakou, Curr. Opin. Microbiol., 1 (1998), 547-557 ).
Es ist daher dringend erforderlich, weitere verbesserte Antimycotica zur Behandlung von Infektionen, die durch Vertreter der Familie Candida hervorgerufen werden, zu entwickeln.There is therefore an urgent need to develop further improved antimycotics to treat infections caused by members of the Candida family.
Bekanntlich wird die morphologische Entwicklung von Pilzen und höheren Eukaryonten von Transkriptionsfaktoren reguliert, die die Expression von Genen kontrollieren, die spezifisch für bestimmte Entwicklungsstadien sind. Zu diesen Transkriptions- faktoren gehört die TEA/ATTS-Transkriptionsfaktor- Fa ilie, die bei Säugern, Vögeln, Nematoden, Insekten und Pilzen nachgewiesen wurde. Alle Vertreter dieser Transkriptionsfaktor-Familie besitzen eine konservierte TEA-Domäne. Diese TEA-Domäne (Bürglin, Cell, 66 (1991), 11-12) stellt, einen DNA- Bindungsbereich dar, der aus 66 bis 76 konservierten Aminosäuren im N-terminalen Bereich der Proteine besteht. Die TEA-Konsensussequenz (TCS) in den Zielpromotoren von pilzlichen TEA/ATTS-Transkrip- tionsfaktoren ist durch die Sequenz 5'-CATTCY-3' definiert (Adrianopoulos und Timberlake, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2503-2515). Bei allen Vertretern dieser Transkriptionsfaktor-Familie aus unter- schiedlichen Arten ist auffällig, dass sie bei der Entwicklung und Organogenese eine entscheidende • Rolle spielen. Beispielsweise ist der Säuger- Enhancer-Faktor TEF-1 an der Myogenese und Cardio- genese beteiligt (Jacquemin et al . , J. Biol. Chem. , 271 (1996), 21775-21785). Das Drosophila melano- graster-Protein „scalloped" ist an der Regulation der zellspezifischen Genexpression während der Entwicklung der Flügel und des Nervensystems beteiligt (Campbell et al . , Genes Dev., 6 (1992), 367-379). Das Regulationsprotein „abacus" (AbaAp) von Äsper- gillus nidulans ist an der Regulation der Konidien-As is known, the morphological development of fungi and higher eukaryotes is regulated by transcription factors that control the expression of genes that are specific for certain developmental stages. These transcription factors include the TEA / ATTS transcription factor family, which has been detected in mammals, birds, nematodes, insects and fungi. All members of this transcription factor family have a conserved TEA domain. This TEA domain (Bürglin, Cell, 66 (1991), 11-12) represents a DNA binding region which consists of 66 to 76 conserved amino acids in the N-terminal region of the proteins. The TEA consensus sequence (TCS) in the target promoters of fungal TEA / ATTS transcript tion factors is defined by the sequence 5'-CATTCY-3 '(Adrianopoulos and Timberlake, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2503-2515). For all members of this transcription factor family from different species is striking that they play a vital role in • the development and organogenesis. For example, the mammalian enhancer factor TEF-1 is involved in myogenesis and cardiogenesis (Jacquemin et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 21775-21785). The Drosophila melanograster protein "scalloped" is involved in the regulation of cell-specific gene expression during the development of the wings and the nervous system (Campbell et al., Genes Dev., 6 (1992), 367-379). The regulatory protein "abacus "(AbaAp) of Äspergillus nidulans is involved in the regulation of conidia
• bildung beteiligt, das heißt seine Expression führt zur Beendigung der vegetativen Wachstumsphase. Der in trans wirkende Faktor Teclp von Saccharomyces cerevisiae ist an der Aktivierung des Tyl- Retrotransposons beteiligt (Laloux et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990), 3541-3550). Ebenso ist dieser Faktor an der Regulation der Fila ent-Bildung und des invasiven Wachstums haploider und diploider Stämme der Hefe beteiligt (Baur et al., Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 4330-4337).• Education involved, that is, its expression leads to the end of the vegetative growth phase. The transacting factor Teclp from Saccharomyces cerevisiae is involved in the activation of the tyl retrotransposon (Laloux et al., Mol. Cell. Biol., 10 (1990), 3541-3550). This factor is also involved in the regulation of fila ent formation and the invasive growth of haploid and diploid strains of yeast (Baur et al., Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 4330-4337).
Aufgrund der Bedeutung der TEA/ATTS-Transkriptions- faktoren für die morphologische Entwicklung, das heißt die räumliche und zeitliche Entwicklung von Organismen beziehungsweise deren Organe oder Gewebe, und ihrer weiten Verbreitung in unterschiedlichsten Arten erscheint es möglich, solche Transkriptionsfaktoren beziehungsweise die ihnen zugrunde liegenden Gene auch in pathogenen Mikroorganis- men, insbesondere humanpathogenen Pilzen, zu identifizieren und sie als Targets für die Identifizierung von Substanzen einzusetzen, die spezifisch auf diese Transkriptionsfaktoren beziehungsweise die sie kodierenden Nukleotidsequenzen wirken.Due to the importance of the TEA / ATTS transcription factors for the morphological development, that is, the spatial and temporal development of organisms or their organs or tissues, and their widespread use in a wide variety of species, it appears possible that such transcription factors or the genes on which they are based also in pathogenic microorganisms men, in particular human pathogenic fungi, and to use them as targets for the identification of substances which act specifically on these transcription factors or on the nucleotide sequences coding them.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Mittel zur Entwicklung von diagnostisch und therapeutisch wirksamen Substanzen, insbesondere von Substanzen, die spezifisch gegen TEA/ATTS-Transkri'p'tionsfak- toren der Hefe Candida albicans gerichtet sind, sowie auf diesen Mitteln beruhende weitere Mittel und Verfahren bereitzustellen, die zur Diagnose und Therapie von durch Candida albicans hervorgerufenen Infektionen oder Krankheitszuständen verwendet werden können.That the present invention underlying technical problem therefore is central to the development of diagnostic and therapeutically effective substances, in particular substances that are specific 'p' against TEA / ATTS Transkri tionsfak- factors of the yeast Candida albicans directed, and on this To provide agent-based further agents and methods which can be used for the diagnosis and therapy of infections or disease states caused by Candida albicans.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung von Nuk- leinsäure olekülen, welche für die Klonierung eines Gens für einen Transkriptionsfaktor, insbesondere für ein die Virulenz humanpathogener Pilze modifizierendes Protein aus Candida, insbesondere Candida albicans, geeignet sind und/oder die die rekombi- nante Herstellung eines solchen Proteins erlauben, wobei diese Nukleinsäuremoleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:The invention solves the technical problem on which it is based by providing nucleic acid molecules which are suitable for cloning a gene for a transcription factor, in particular for a protein from Candida, in particular Candida albicans, which modifies the virulence of human pathogenic fungi, and / or allow the recombinant production of such a protein, these nucleic acid molecules being selected from the group consisting of:
a) einem Nukleinsäuremolekül, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 7 und/oder eines komplementären Stranges oder Teils davon;a) a nucleic acid molecule defined in SEQ ID No. 1, 2, 3 or 7 and / or a complementary strand or part thereof;
b) einem Nukleinsäuremolekül, kodierend eine Aminosäuresequenz definiert in SEQ ID Nr. 4 oder eines komplementären Stranges oder Teils davon; c) einem Nukleinsäuremolekül, erhältlich aus einer Genbank von Candida albicans unter Verwendung der in SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 dargestellten Primer mit Hilfe des PCR-Verfahrens; undb) a nucleic acid molecule encoding an amino acid sequence defined in SEQ ID No. 4 or a complementary strand or part thereof; c) a nucleic acid molecule obtainable from a Candida albicans gene bank using the primers shown in SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6 using the PCR method; and
d) einem Nukleinsäuremolekül, das aufgrund seiner Homologie mit einem der unter a) bis c) genannten Nukleinsäuremoleküle unter geeigneten Bedingungen hybridisiert, wobei die Homologie auf Nukleotidebene (Sequenzidentität) insbesondere ' '■ mindestens 65%, vorzugsweise mindestens 70%, bevorzugter mindestens 80% und am bevorzugtesten mindestens 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% beträgt.d) a nucleic acid molecule that hybridizes due to its homology with one of the mentioned under a) to c) nucleic acid molecules under appropriate conditions, wherein the homology at the nucleotide level (sequence identity) in particular '' ■ at least 65%, preferably at least 70%, more preferably at least 80% and most preferably is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
Das durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül der SEQ ID Nr. 1 dargestellte Gen wird im Folgenden auch als CaTECl-Gen bezeichnet. Das erfindungsgemäße CaTECl-Gen wird in vivo sowohl in der Hefeform als auch in Myzelien von C. albicans exprimiert.The gene represented by the nucleic acid molecule of SEQ ID No. 1 according to the invention is also referred to below as the CaTECl gene. The CaTECl gene according to the invention is expressed in vivo both in the yeast form and in mycelia from C. albicans.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass sie nach Einführung in Candida albicans-catecl-Mutanten, beispielsweise mit Hilfe eines Vektors, in dem sie in Sense-Orientierung unter Kontrolle geeigneter Regulationselemente integriert sind, den Phänotyp solcher Hefe-Mutanten revertieren können.The nucleic acid molecules according to the invention are particularly characterized in that after introduction into Candida albicans catecl mutants, for example with the aid of a vector in which they are integrated in the sense orientation under the control of suitable regulatory elements, they can revert the phenotype of such yeast mutants.
Der Phänotyp von catecl-Mutanten, beispielsweise der der erfindungsgemäßen homozygoten ura3/ura3 ca - tecl/ca ecl-Nullmutante CaAS15 (Null-mutanter Phänotyp) , unterscheidet sich vom Phänotyp von Wildtyp-Zellen insbesondere insofern, als das filamen- tose Wachstum in vitro beeinträchtigt ist, die Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen unterdrückt ist, die Expression von SΛP4-6-Genen nicht induziert werden kann und die Mutante in einem systemischen Modell von Maus-Candida-Mykosen eine verminderte Virulenz zeigt. Die vorgenannten Phänoty- pen charakterisieren also die biologische Aktivität des CaTECl-kodierten Proteins (CaTeclp) .The phenotype of catecl mutants, for example that of the homozygous ura3 / ura3 ca - tecl / ca ecl null mutant CaAS15 (zero mutant phenotype), differs from the phenotype of wild-type cells in particular in that the filamentous growth in vitro is impaired, the formation of germ tubes and true hyphae is suppressed, the expression of SΛP4-6 genes is not can be induced and the mutant shows reduced virulence in a systemic model of mouse Candida mycoses. The aforementioned phenotypes thus characterize the biological activity of the CaTECl-encoded protein (CaTeclp).
Die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine stellen Transkriptionsfaktoren dar, die die Expression von entwicklungsspezifischen Genen und damit die morphologische Entwick- lung von Candida albicans-Zellen ' kontrollieren und regulieren.The proteins encoded by the novel nucleic acid molecules proteins represent transcription factors that lung expression of developmental genes and thus the morphological development of Candida albicans cells control and regulate '.
Die insbesondere in pathogenen Wildtyp-Formen vonThe particularly in pathogenic wild-type forms of
Candida albicans vorkommenden Nukleotid- und Amino-Candida albicans occurring nucleotide and amino
• Säuresequenzen stellen daher ausgezeichnete Hilfs- mittel dar, um die Virulenz pathogener Candida albicans-Stämme zu vermindern und/oder zu beseitigen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuremoleküle erweisen sich daher als besonders wertvoll für die Entwicklung von Medikamenten zur Bekämpfung von Candida-Mykosen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle und die von ihnen kodierten erfindungsgemäßen Proteine können beispielsweise als Targets für die Identifizierung von Substanzen eingesetzt werden, die spezifisch auf die erfindungs- gemäßen Nukleotidsequenzen oder die erfindungsgemäßen Proteine wirken. So können beispielsweise Substanzbibliotheken auf die Wechselwirkung der in diesen vorhandenen Substanzen mit den erfindungsgemäßen Proteinen oder ihre Wirkung auf die Expressi- on der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle hin analysiert werden. Ebenso können gegen die erfindungsgemäßen Proteine gerichtete monoklonale oder polyklonle Antikörper entwickelt werden, die einerseits zum Nachweis Caüdida-spezifischer Proteine und damit zum Nachweis von Candida-Infektionen verwendet werden können und andererseits direkt zur Bekämpfung solcher Infektionen eingesetzt werden können, wenn sie beispielsweise unter Verwendung cytotoxischer Gruppen, wie cytotoxischer Proteine oder cytotoxischer Peptide, funktionalisiert werden, so dass auf diese Weise die Zielorganismen abgetötet werden und eine Therapie der durch diese Organismen hervorgerufenen Krankheitszustände er- möglicht wird. • Acid sequences are therefore excellent tools for reducing and / or eliminating the virulence of pathogenic Candida albicans strains. The nucleic acid and amino acid molecules according to the invention therefore prove to be particularly valuable for the development of medicaments for combating Candida mycoses. The nucleic acid molecules according to the invention and the proteins according to the invention coded by them can be used, for example, as targets for the identification of substances which act specifically on the nucleotide sequences according to the invention or the proteins according to the invention. For example, substance libraries can be analyzed for the interaction of the substances present in them with the proteins according to the invention or their effect on the expression of the nucleic acid molecules according to the invention. Monoclonal or polyclonal antibodies directed against the proteins according to the invention can also be developed, on the one hand for the detection of Caüdida-specific proteins and thus can be used to detect Candida infections and, on the other hand, can be used directly to combat such infections if, for example, they are functionalized using cytotoxic groups, such as cytotoxic proteins or cytotoxic peptides, so that the target organisms are killed in this way and Therapy of the disease states caused by these organisms is made possible.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft daher ein in SEQ ID Nr. 1 dargestelltes erfindungsgemäßes. Nukleinsäuremolekül, wobei dieses Nukleinsäuremolekül neben 5'- und 3'-regula- torischen Elementen eine proteinkodierende Nukleo- tidsequenz umfasst. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kodieren die in SEQ ID Nr. 4 dargestellte Aminosäuresequenz. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle sind insofern besonders hilf- reich bei der Entwicklung neuer Therapeutika, als sie die Herstellung der von ihnen kodierten Proteine oder Derivate davon mittels DNA-Rekombinationstechniken erlauben. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in Anti- sense-Konstrukten oder als komplementäre Stränge der kodierenden Nukleotidsequenzen oder als Teile davon verwendet werden, um in Candida-Zellen die endogene Expression der erfindungsgemäßen Nukleo- tidsequenz zu inhibieren oder zu vermindern. Auf diese Weise ist es möglich, die Virulenz solcher Candida-Zellen zu vermindern oder zu beseitigen. Candida-Zellen, die beispielsweise Antisense-Kon- strukte der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten, können beispielsweise als Lebendimpf- stoff im Rahmen einer Schutzimpfung, beispielsweise im Rahmen einer aktiven Immunisierung, verwendet werden, um späteren Infektionen mit pathogenen Can- dida-Arten, insbesondere Candida albicans, entge- genzuwirken.A preferred embodiment of the invention therefore relates to an inventive one shown in SEQ ID No. 1. Nucleic acid molecule, this nucleic acid molecule comprising, in addition to 5'- and 3'-regulatory elements, a protein-coding nucleotide sequence. The nucleotide sequences according to the invention encode the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4. The nucleic acid molecules according to the invention are particularly helpful in the development of new therapeutic agents in that they allow the production of the proteins or derivatives encoded by them by means of recombinant DNA techniques. In addition, the nucleic acid molecules according to the invention can be used in antisense constructs or as complementary strands of the coding nucleotide sequences or as parts thereof in order to inhibit or reduce the endogenous expression of the nucleotide sequence according to the invention in Candida cells. In this way it is possible to reduce or eliminate the virulence of such Candida cells. Candida cells, which contain, for example, antisense constructs of the nucleotide sequences according to the invention, can be used, for example, as live vaccinations. substance in the context of a vaccination, for example as part of an active immunization, to counteract later infections with pathogenic Candida species, in particular Candida albicans.
Ebenso ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon in Candida- Zellen einzuführen, um dort mittels homologen Rekombination endogen vorhandene CaTECl-Gene zu mu- tieren, insbesondere auszuschalten, und so beispielsweise Nullmutanten herzustellen. Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Herstellung mutanter Phänotypen von Hefepilz-Zellen, insbesondere Candida-Zellen. Ebenso betrifft die Erfindung diese mutanten Candida-Zellen selbst sowie die in diesen Zellen vorhandenen mutierten catecl- oder CaTECl- Gene. Derartige mutierte CaTECl- oder catecl-Gene können sich als besonders hilfreich bei der Ent- wicklung von Pharmazeutika und Diagnostika zur Bekämpfung von durch Candida hervorgerufene Krankheiten erweisen.It is also possible to introduce the nucleic acid molecules according to the invention or parts thereof into Candida cells in order to mutate endogenously present CaTEC1 genes there by means of homologous recombination, in particular to switch them off, and thus to produce, for example, zero mutants. The invention therefore relates to the use of the nucleic acid molecules according to the invention for producing mutant phenotypes of yeast cells, in particular Candida cells. The invention also relates to these mutant Candida cells themselves and to the mutant catecl or CaTECl genes present in these cells. Such mutated CaTECl or catecl genes can prove to be particularly helpful in the development of pharmaceuticals and diagnostics for combating diseases caused by Candida.
Die Erfindung betrifft auch am 6.9.2000 bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13716 in Escherichia coli hinterlegte Plasmide, enthaltend das CaTECl-Gen (SEQ ID Nr.l).The invention also relates to plasmids deposited on September 6, 2000 at the DSMZ in Braunschweig, Germany, under No. DSM 13716 in Escherichia coli, containing the CaTECl gene (SEQ ID No. 1).
Die Erfindung betrifft ebenfalls catecl-Mutanten, insbesondere die Candida alJbicans-Mutante CaASlδ, hinterlegt am 6.9.2000 bei der DSMZ in Braun- schweig, Deutschland unter der Nr. DSM 13722.The invention also relates to catecl mutants, in particular the Candida alJbicans mutant CaASlδ, deposited on September 6, 2000 with the DSMZ in Braun- schweig, Germany under the number DSM 13722.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die vorgenannten Nukleinsäure- moleküle, wobei diese vorzugsweise in vollständig oder partiell isolierter und gereinigter Form vorliegen, in besonders bevorzugter Ausführungsform als DNA- oder RNA-Sequenzen.In a further preferred embodiment, the invention relates to the aforementioned nucleic acid molecules, these preferably being in completely or partially isolated and purified form, in a particularly preferred embodiment as DNA or RNA sequences.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Modifikationen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die zu der Synthese von Proteinen mit veränderten biologischen Eigenschaften, insbesondere einer veränderten Aktivität zur Modulation der Virulenzeigenschaften pa- thogener Pilze, vorzugsweise von Candida-Zellen, führen. Bei den Modifikationen oder Mutationen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen kann es sich sowohl um natürlich vorkommende Modifikationen oder Mutationen handeln als auch um solche, die mit Hil- fe üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie erzeugt wurden (vergleiche Sambrook et al., Molecular Kloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) . Bei den von der vorliegenden Erfindung erfassten Mutationen oder Modifikationen kann es sich um Inserti- onen, Deletionen, Duplikationen, Inversionen, Anlagerungen, Austausche oder ähnliches, insbesondere auch von ungewöhnlichen Nukleotiden, handeln. Des Weiteren umfasst die Erfindung auch Mutationen oder Abwandlungen der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, die durch Fusion mit Genen oder Bestandteilen von Genen aus anderen Quellen hervorgerufen werden. Die Erfindung umfasst insbesondere auch verkürzte Nukleotidsequenzen der vorgenannten Art, sofern diese Proteine oder Proteinteile kodieren, die die Virulenz von Candida-Zellen modulieren können. Die Erfindung umfasst insbesondere auch Mutationen oder Modifikationen von Nukleotidsequenzen, die zu Pro- teinen führen, die eine veränderte Stabilität, Spe- zifität, ein ' modifiziertes Temperatur-, pH-Wert- und/oder Konzentrationsprofil, eine veränderte Aktivität und/oder ein verändertes Effektorenmuster aufweisen, . sowie solche, deren Konformationen verändert sind, beziehungsweise solche, die andere Untereinheiten beziehungsweise andere prä- und/oder posttranslationale Modifikationen aufweisen.The invention also includes modifications of the nucleic acid molecules according to the invention, which lead to the synthesis of proteins with changed biological properties, in particular a changed activity for modulating the virulence properties of pathogenic fungi, preferably Candida cells. The modifications or mutations of the nucleotide sequences according to the invention can be both naturally occurring modifications or mutations and also those which have been generated with the aid of standard microbiology / molecular biology methods known in the art (see Sambrook et al., Molecular Kloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). The mutations or modifications detected by the present invention can be insertions, deletions, duplications, inversions, additions, exchanges or the like, in particular also of unusual nucleotides. Furthermore, the invention also includes mutations or modifications of the nucleotide sequences according to the invention which are caused by fusion with genes or components of genes from other sources. In particular, the invention also includes shortened nucleotide sequences of the aforementioned type, provided that these encode proteins or protein parts which can modulate the virulence of Candida cells. In particular, the invention also includes mutations or modifications of nucleotide sequences which lead to pro- lead lines that have a changed stability, specificity, a 'modified temperature, pH value and / or concentration profile, a changed activity and / or a changed effector pattern,. as well as those whose conformations have changed, or those which have other subunits or other pre- and / or post-translational modifications.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleotidsequen- zen, die mit den 'vorstehend genannten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen hybridisieren können. Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet eine „Hybridisierung" die Aneinanderlagerung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen unter Bedin- gungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular Klon- ing: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) beschrieben sind, wobei es sich vorzugsweise um stringente Bedingungen handelt. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff „Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül nach a) bis c) hybridisiert" verweist daher auf ein Nukleinsäuremolekül, das unter, vorzugsweise strin- genten, Bedingungen mit einer Nukleinsäure nach a) bis c) hybridisiert. Eine solche Hybridisierung ist dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Waschen für eine Stunde mit 1 x SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise 62 °C und besonders bevorzugt bei 68 CC, insbesondere für eine Stunde mit 0,2 x SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68 °C, noch ein positives Hybridisie- rungssignal zu beobachten ist. Eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ist daher eine unter derartigen Waschbedingungen mit der in den Sequenzprotokollen angegebenen Nukleotidsequenz hybridisierende Nukle- otidsequenz .The invention also relates to nucleotide sequences which can hybridize with the above-mentioned nucleotide sequences according to the invention. In connection with the invention, “hybridization” means the attachment of two single-stranded nucleic acid molecules under conditions as described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press , NY, USA), which are preferably stringent conditions. The term “nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleic acid molecule according to a) to c) used in connection with the present invention therefore refers to a nucleic acid molecule which preferably stringent, conditions hybridized with a nucleic acid according to a) to c). Such hybridization is characterized in that after washing for one hour with 1 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably 62 ° C and particularly preferably at 68 C C, in particular for one hour with 0.2 x SSC and 0.1% SDS at 55 ° C, preferably at 62 ° C and particularly preferably at 68 ° C, a positive hybridization signal can still be observed. A nucleotide sequence according to the invention is therefore one under such washing conditions with that in the sequence listing specified nucleotide sequence hybridizing nucleotide sequence.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und/oder alleli- sche Varianten der vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter „Fragmenten" Teile von Nukleotid- Sequenzen verstanden, die eine ausreichende Länge" besitzen, um das vorstehend beschriebene Protein oder ein äquivalentes Protein zu kodieren, das eine Aktivität zur Modulation von Virulenzeigenschaften von Candida-Zellen aufweist. Die Begriffe „Deri- vat", „funktionelles Äquivalent" oder „Variante" bedeuten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle von den Sequenzen der vorstehend beschriebenen Nukleotidsequenzen an mindestens einer Position un- terscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen auf der Nukleinsäureebene aufweisen. Homologie bedeutet insbesondere eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere von mindestens 60%, vorzugsweise von über 80% und beson- ders bevorzugt über 90%, 95%, 97% oder 99% auf Nukleinsäureebene .The molecules hybridizing with the nucleotide sequences according to the invention also include fragments, derivatives, functional equivalents and / or allelic variants of the above-described nucleotide sequences which encode a protein according to the invention. In connection with the present invention, parts are "fragments" understood by nucleotide sequences which have a sufficient length "to encode the above-described protein or an equivalent protein having an activity for modulating virulence of Candida cells. In connection with the present invention, the terms “derivative”, “functional equivalent” or “variant” mean that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleotide sequences described above in at least one position, but at a high degree Homology to these sequences at the nucleic acid level Homology means in particular a sequence identity of at least 40%, in particular at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%, 95%, 97% or 99% at the nucleic acid level.
Die Aminosäuresequenzen der von diesen Nukleinsäu- remolekülen kodierten Proteine sind zu der in SEQ ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz homolog, wobei die Homologie mindestens 65 %, vorzugsweise mindestens 70%, 80% und weiter vorzugsweise mindestens 85%, und besonders bevorzugt mindestens mehr als 90 %, 95 %, 97 % und 99 % beträgt. Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich der Ausdruck „zu indes- tens 80 %, vorzugsweise zu mindestens 85 %, und besonders bevorzugt zu mindestens mehr als 90 %, 95 %, 97 % und 99 % homolog" auf eine Sequenzübereinstimmung auf der Aminosäuresequenz-Ebene, die mit Hilfe bekannter Verfahren, zum Beispiel computergestützter Sequenzvergleiche (Basic local alignment tool, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann. Der dem Fachmann bekannte Ausdruck der "Homologie" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Po- lypeptid-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird, wobei Übereinstimmung sowohl eine identische Übereinstimmung als auch ein konservativer Aminosäureaustausch be- deuten kann. Der Prozentsatz der Homologie ergibt sich aus dem Prozentsatz übereinstimmender Bereiche zwischen zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.The amino acid sequences of the proteins encoded by these nucleic acid molecules are homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4, the homology being at least 65%, preferably at least 70%, 80% and further preferably at least 85%, and particularly preferably at least more than 90%, 95%, 97% and 99%. In connection with the invention, the term “to at least 80%, preferably at least 85%, and particularly preferably at least more than 90%, 95%, 97% and 99% homologous "to a sequence match at the amino acid sequence level which can be carried out using known methods, for example computer-aided sequence comparisons ( Basic local alignment tool, Altschul et al., J. Mol. Biol., 215 (1990), 403-410) The term "homology" known to the person skilled in the art denotes the degree of relationship between two or more positions. lypeptide molecules determined by the match between the sequences, where match can mean both an identical match and a conservative amino acid exchange. The percentage of homology results from the percentage of matching regions between two or more sequences taking gaps into account or other sequence peculiarities.
Die Unterschiede zu den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen können beispielsweise durch Mutationen, wie zum Beispiel Deletionen, Substitutionen, Inser- tionen, Anlagerung, Austausche und/oder Rekombinationen der die Aminosäuresequenzen kodierenden Nukleotidsequenzen entstanden sein. Selbstverständlich kann es sich dabei auch um natürlicherweise auftretende Sequenzvariationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus einem anderen Organismus o- der um Sequenzen, die auf natürliche Weise mutiert wurden, oder Mutationen, die mit Hilfe üblicher, auf dem Fachgebiet bekannter Mittel, beispielsweise chemische Agenzien und/oder physikalische Agenzien, gezielt in die Sequenzen eingeführt wurden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher ebenfalls ein Polypeptid oder Protein mit einer biologischen Aktivität, die insbesondere in Candida albicans- Zellen in vivo das filamentöse Wachstum der Zellen und/oder die Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen beeinflusst, die Expression der Proteinase- Isogene SAP4-6 induziert oder hemmt und/oder die Virulenz der sie enthaltenden Candida albicans- Zellen modulieren kann. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den Candida albicans- Transkriptionsfaktor Teclp, der im Folgenden auch als Ca TECl-Protein bezeichnet wird. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeuten die Begriffe „die Virulenz pathogener Pilzstämme modulieren- des Protein oder Polypeptid" oder „Aktivität zur Modulation der Virulenz oder von Virulenzeigenschaften", dass ein Protein oder Polypeptid eine Aktivität aufweist, die den Grad der Aggressivität eines infektiösen Mikroorganismus in einem Makroor- ganismus verändern, beispielsweise vermindern kann. Die Aktivität der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen kann beispielsweise mit Hilfe des nachstehend beschriebenen systemischen Modells von Maus- Candida-Mykosen untersucht und quantitativ bestimmt werden.The differences from the amino acid sequences according to the invention may have arisen, for example, from mutations such as deletions, substitutions, insertions, additions, exchanges and / or recombinations of the nucleotide sequences encoding the amino acid sequences. Of course, these can also be naturally occurring sequence variations, for example sequences from another organism or sequences that have been mutated in a natural manner, or mutations that can be achieved using conventional means known in the art, for example chemical agents and / or physical agents specifically introduced into the sequences. The present invention therefore also comprises a polypeptide or protein with a biological activity which, in particular in Candida albicans cells in vivo, influences the filamentous growth of the cells and / or the formation of germ tubes and true hyphae, the expression of the proteinase isogens SAP4-6 induces or inhibits and / or can modulate the virulence of the Candida albicans cells containing them. In particular, the present invention relates to the Candida albicans transcription factor Teclp, which is also referred to below as Ca TECl protein. In connection with the present invention, the terms “protein or polypeptide modulating the virulence of pathogenic fungal strains” or “activity for modulating virulence or virulence properties” mean that a protein or polypeptide has an activity which has the degree of aggressiveness of an infectious microorganism in a macro-organism can change, for example reduce. The activity of the amino acid sequences according to the invention can, for example, be examined and quantified using the systemic model of mouse Candida mycoses described below.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein, vorzugsweise isoliertes und vollständig gereinigtes, Protein, das durch Expression eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder eines Frag- mentes davon in einer Wirtzelle erhältlich ist und die vorgenannte biologische Aktivität aufweist.The present invention also relates to a, preferably isolated and completely purified, protein which can be obtained by expression of a nucleic acid molecule according to the invention or a fragment thereof in a host cell and which has the aforementioned biological activity.
Der Begriff „isoliertes Protein" umfasst Proteine, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden, Kohlenhydraten oder anderen Materialien sind, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Solche Proteine umfassen nicht nur rekombinant hergestellte Proteine, sondern auch i- solierte natürlicherweise vorkommende Proteine, synthetisch hergestellte Proteine oder Proteine, die mit Hilfe einer Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Eine rekombinant hergestellte Variante von Ca TECl einschließlich des sezernierten Proteins kann mit Hilfe des in Smith und Johnson, Gene, 67 (1988), 31-40, beschriebenen Einschrittverfahrens aufgereinigt werden.The term "isolated protein" encompasses proteins that are essentially free of other proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates or others Are materials with which it is naturally associated. Such proteins include not only recombinantly produced proteins but also isolated naturally occurring proteins, synthetically produced proteins or proteins which are produced with the aid of a combination of these methods. A recombinantly produced variant of Ca TECl including the secreted protein can be purified using the one-step process described in Smith and Johnson, Gene, 67 (1988), 31-40.
Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Eigenschaften, insbesondere die gleiche Aktivität, wie das Protein, dass von einer Nukleotidsequenz mit einer in SEQ ID Nr. 1 oder 2 dargestellten Sequenz kodiert wird und dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 4 gezeigt ist.The protein preferably has the same properties, in particular the same activity, as the protein that is encoded by a nucleotide sequence with a sequence shown in SEQ ID No. 1 or 2 and whose amino acid sequence is shown in SEQ ID No. 4.
Die Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten. Bei den Vektoren handelt es sich vorzugsweise um Plasmide. Cosmide, Viren, Bakteriophagen, Shuttle-Vektoren und andere in der Gentechnik üblicherweise verwendete Vektoren. Die erfindungsgemäßen Vektoren können weitere Funktionseinheiten besitzen, die ei- ne Stabilisierung und/oder Replikation des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken oder zumindest dazu beitragen.The invention further relates to vectors which contain the nucleotide sequences according to the invention. The vectors are preferably plasmids. Cosmids, viruses, bacteriophages, shuttle vectors and other vectors commonly used in genetic engineering. The vectors according to the invention can have further functional units which bring about or at least contribute to stabilization and / or replication of the vector in a host organism.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Vektoren, bei denen die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit mindestens einem regulatorischen Element funktioneil verbunden sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff "regulatori- sches Element" solche Elemente verstanden, welche die Transkription und/oder Translation von Nuklein- säuremolekülen in prokaryotischen und/oder eukaryo- tischen Wirtszellen gewährleisten. Regulatorische Elemente können Promotoren, Enhancer, Operatoren, Silencer und/oder Transkriptionsterminationssignale sein. Regulatorische Elemente, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, insbesondere den Protein-kodierenden Abschnitten dieser Nukleotidse- quenz, funktionell verbunden sind, können Nukleotidsequenzen sein, die aus anderen Organismen oder anderen Genen stammen als die Protein-kodierende Nukleotidsequenz selbst. Beispiele dafür sind: T7, T3, SP6 und weitere gebräuchliche Regulationsele- mente zur in vitro-Transkription; P AO ttet und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in E. coli , GAL1-10, MET25; CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEFl, PMA1 und andere Regulationselemente zur Expression in S . cerevisiae; GAPl, YPT1, AOXl und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in P. pastoris; Polyhedrin zur Expression in Baculovirussystemen sowie PCMV> PSV4O und weitere gebräuchliche Regulationselemente zur Expression in Säugerzellen.In a particularly preferred embodiment, the present invention comprises vectors in which the nucleotide sequences according to the invention are functionally linked to at least one regulatory element. In connection with the present invention, the term "regulatory element "understood those elements which ensure the transcription and / or translation of nucleic acid molecules in prokaryotic and / or eukaryotic host cells. Regulatory elements can be promoters, enhancers, operators, silencers and / or transcription termination signals. Regulatory elements which include a nucleotide sequence according to the invention, in particular the protein-coding sections of this nucleotide sequence, are functionally linked can be nucleotide sequences which originate from organisms or genes other than the protein-coding nucleotide sequence itself. Examples of these are: T7, T3, SP6 and others common regulatory elements for in vitro transcription; P AO ttet and other common regulatory elements for expression in E. coli, GAL1-10, MET25; CUP1, ADH1, AFH1, GDH1, TEFl, PMA1 and other regulatory elements for expression in S. cerevisiae ; GAPl, YPT1, AOXl and other common regulat ion elements for expression in P. pastoris; Polyhedrin for expression in baculovirus systems as well as P CMV> P SV4O and other common regulatory elements for expression in mammalian cells.
Ebenso können die erfindungsgemäß eingesetzten Regulationselemente auch aus Candida albicans stammen. Insbesondere kann es sich dabei um die regulatorischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, die ein erfindungsgemäßes Protein kodie- ren, handeln, dargestellt zum Beispiel in SEQ ID Nr. 3, welche das 5' -Regulationselement inclusive Promotor und Transkriptionsstartstelle des CaTEC- Gens darstellt oder in SEQ ID Nr. 7, welche den 3'- Bereich der kodierenden Region des CaTECl-Gens darstellt.The regulatory elements used according to the invention can also originate from Candida albicans. In particular, these can be the regulatory elements of the nucleotide sequences according to the invention which encode a protein according to the invention, shown for example in SEQ ID No. 3, which represents the 5 'regulatory element including the promoter and transcription start site of the CaTEC gene or in SEQ ID No. 7, which the 3'- Represents the region of the coding region of the CaTECl gene.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz oder ein Fragment davon in dem Vektor sowohl in Antisense- Orientierung als auch in Sense-Orientierung zu dem/den regulatorischen Element (en) vorliegen. Wenn eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in Anti- sense-Orientierung zu dem/den regulatorischen Ele- ment(en) vorliegt, kann der Vektor beispielsweise in eine Candida albicans-Zelle eingeführt werden und nach der Transkription der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz die Expression des/der endogenen CaTECl-GenS/Gene von Candida albicans inhibieren oder reduzieren. Die in Antisense-Orientierung verwendeten Fragmente der vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können dabei eine Länge aufweisen, die ausreicht, um eine Hybridisierung an die endogenen CaTECl-Sequenzen und damit eine Translationsinhibierung zu ermöglichen, beispielsweise eine Länge von mindestens 100 Basenpaaren. Selbstverständlich muss dieses Fragment eine ausreichende Spezifität für die zu inhibierende Nukleotidsequenz aufweisen.In a particularly preferred embodiment, the nucleotide sequence according to the invention or a fragment thereof can be present in the vector both in the antisense orientation and in the sense orientation to the regulatory element (s). If a nucleotide sequence according to the invention is in antisense orientation to the regulatory element (s), the vector can, for example, be introduced into a Candida albicans cell and, after the transcription of the nucleotide sequence according to the invention, the expression of the endogenous CaTEC1- Inhibit or reduce GenS / genes from Candida albicans. The fragments of the present nucleotide sequences according to the invention used in antisense orientation can have a length sufficient to enable hybridization to the endogenous CaTEC1 sequences and thus translation inhibition, for example a length of at least 100 base pairs. Of course, this fragment must have sufficient specificity for the nucleotide sequence to be inhibited.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können darüber hinaus weitere Elemente enthalten. Hier kann es sich beispielsweise um Antibiotika-Resistenzgene, stabilisierende Elemente sowie Selektionsmarker oder Af- finitäts-Epitope, beispielsweise HA, Myc und etc., handeln.The vectors according to the invention can also contain further elements. These can be, for example, antibiotic resistance genes, stabilizing elements and selection markers or affinity epitopes, for example HA, Myc and etc.
Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch Vektoren, die nicht nur eine, sondern mehrere der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen enthalten. Diese Sequenzen können dabei so angeordnet sein, dass gegebenenfalls ein, zwei oder mehrere der erfindungsgemäßen Protein-kodierenden Bereiche der SEQ ID Nr. 1 oder 2 von einem einzigen Satz regulatorischer Elemente kontrolliert wird.The invention naturally also includes vectors which contain not only one but more than one of the nucleotide sequences according to the invention. This Sequences can be arranged in such a way that one, two or more of the protein-coding regions of SEQ ID No. 1 or 2 according to the invention are controlled by a single set of regulatory elements.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Vek- toren umfassen und die fähig sind, die erfindungsgemäßen Proteine zu exprimieren. Bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen kann es sich sowohl um prokaryotische als auch um eukaryotische Zellen handeln. Beispiele für prokaryotische Zellen sind Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli oder Bacillus subtilis . Erfindungsgemäß bevorzugte Beispiele für eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, insbesondere menschliche Zellen. Die erfin- dungsgemäße Wirtszelle kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nukleotidsequenz heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, das heißt, dass die eingeführte erfindungsgemäße Nukleotidsequenz natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt oder aber an einem anderen Ort oder einer anderen Kopiezahl oder Orientierung im Genom dieser Zellen lokalisiert ist, als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.In a preferred embodiment, the present invention relates to host cells which comprise one or more of the nucleic acid molecules according to the invention or one or more of the vectors according to the invention and which are capable of expressing the proteins according to the invention. The host cells according to the invention can be both prokaryotic and eukaryotic cells. Examples of prokaryotic cells are bacteria such as Escherichia coli or Bacillus subtilis. Examples of eukaryotic host cells preferred according to the invention include yeast cells, plant cells, insect cells and mammalian cells, in particular human cells. The host cell according to the invention can be characterized in that the introduced nucleotide sequence according to the invention is heterologous with respect to the transformed cell, that is to say that the introduced nucleotide sequence according to the invention does not naturally occur in these cells or else at a different location or a different number of copies or orientation is located in the genome of these cells as the corresponding naturally occurring sequence.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Zelle um eine gramnegative Zelle, beispielsweise um eine Escherichia coli-Zelle . In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann es sich aber auch um eine gram- positive Zelle, beispielsweise Bacillus subtilis handeln. Bei Einführung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz in eine grampositive Zelle sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen vorzugs- weise mit einem Signalpeptid verbunden, das ein Ausschleußen des translatierten Genproduktes aus der Zelle in das Medium erlaubt.In an advantageous embodiment of the present invention, the cell is a gram-negative cell, for example an Escherichia coli cell. In a further advantageous embodiment, it can also be a gram act positive cell, for example Bacillus subtilis. When the nucleotide sequence according to the invention is introduced into a gram-positive cell, the nucleotide sequences according to the invention are preferably linked to a signal peptide which allows the translated gene product to be discharged from the cell into the medium.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle um eine eukaryotische Wirtszelle. Dabei kann es sich um Zellen handeln, die bereits ein oder mehrere solcher Gene auf ihren Chromosomen enthalten. Eukaryotische Zellen bieten den Vorteil, dass die Transkription und Translation einer Nukleotidse- quenz, die ein heterologens eukaryotisches Protein kodiert, so erfolgt wie in den Zellen, aus denen die eukaryotische Nukleotidsequenz stammt. Das heißt, in eukaryotischen Wirtszellen werden die Transkripte einem korrekten Splicing unterworfen und das Translationsprodukt wird den in eukaryotischen Zellen typischen posttranslationalen Modifikationen unterworfen, wie zum Beispiel einer Glyco- sylierung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Wirtszelle eine Pilzzelle, zum Beispiel eine Zelle aus der Gattung Candida , insbesondere eine Candida albi cans-Zelle , eine Saccharomyces-Zelle oder eine- tierische Zelle, wie eine Insektenzelle, sein. Beispiele für geeignete Candida-Wirtszellen sind Abkömmlinge des Stam- mes SC5314 (Fonzi und Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728). Bevorzugte Beispiele für geeignete Wirtszellen von Saccharomyces cerevisiae sind Abkömmlinge des Stammes S1278b. Weitere bevorzugte Zellen umfassen die Insektenzelllinie IPLB-Sf21, die menschliche HeLa-Zelllinie, Jurkat-Zellen oder CHO- Zellen.In a further preferred embodiment, the host cell according to the invention is a eukaryotic host cell. These can be cells that already contain one or more such genes on their chromosomes. Eukaryotic cells offer the advantage that the transcription and translation of a nucleotide sequence encoding a heterologous eukaryotic protein takes place in the same way as in the cells from which the eukaryotic nucleotide sequence originates. This means that in eukaryotic host cells the transcripts are subjected to correct splicing and the translation product is subjected to the post-translational modifications typical in eukaryotic cells, such as glycosylation. In a particularly preferred embodiment, the host cell according to the invention can be a fungal cell, for example a cell from the genus Candida, in particular a Candida albicans cell, a Saccharomyces cell or an animal cell, such as an insect cell. Examples of suitable Candida host cells are descendants of the strain SC5314 (Fonzi and Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728). Preferred examples of suitable host cells from Saccharomyces cerevisiae are descendants of the S1278b strain. Other preferred cells include the IPLB-Sf21 insect cell line human HeLa cell line, Jurkat cells or CHO cells.
Die Erfindung betrifft daher auch Zellkulturen, die mindestens . eine der erfindungsgemäßen Wirtszellen aufweisen, wobei eine erfindungsgemäße Zelllinie die Fähigkeit aufweist, ein erfindungsgemäßes Protein mit der Aktivität zur Modulation der Virulenz von Candida albicans-Zellen oder ein Fragment davon zu produzieren.The invention therefore also relates to cell cultures which at least. have one of the host cells according to the invention, a cell line according to the invention having the ability to produce a protein according to the invention with the activity for modulating the virulence of Candida albicans cells or a fragment thereof.
Die Erfindung betrifft insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung eines Virulenzmodifizierenden Proteins, insbesondere eines Viru- lenz-modifizierenden Proteins aus Candida albicans, wobei erfindungsgemäße Wirtszellen in einem geeig- neten Kulturmedium unter solchen Bedingungen kultiviert werden, die die Bildung des Virulenzmodifizierenden Proteins erlauben und dieses im An- schluss an die Kultivierung entweder aus dem Kulturmedium oder aus den Zellen gewonnen und isoliert werden kann.In particular, the invention also relates to a method for producing a virulence-modifying protein, in particular a virulence-modifying protein from Candida albicans, host cells according to the invention being cultivated in a suitable culture medium under conditions which permit the formation of the virulence-modifying protein and this in After cultivation, either from the culture medium or from the cells can be obtained and isolated.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Antisense- iRNA-Sequenz, dadurch charakterisiert, dass sie zu einer mRNA komplementär ist, die von einem erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder einem Teil davon transkripiert wurde und selektiv an die mRNA binden kann, wobei diese Sequenz die Synthese der von den Nukleinsäuremolekülen kodierten CaTECl- Proteine inhibieren kann.In a further preferred embodiment, the present invention relates to an antisense iRNA sequence, characterized in that it is complementary to an mRNA which has been transcribed by a nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof and can bind selectively to the mRNA, whereby this Sequence can inhibit the synthesis of the CaTEC1 proteins encoded by the nucleic acid molecules.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Ribozym, dadurch charakterisiert, dass es zu einer mRNA, die von einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül o- der einem Teil davon transkripiert wurde, komplementär ist und selektiv an dieser mRNA binden und diese spalten kann, wobei es so die Synthese der von den Nukleinsäuremolekülen kodierten CaTECl- Proteine inhibieren kann. Ribozyme, die aus einer einzelnen RNA-Kette bestehen, sind RNA-Enzyme, das heißt katalytische RNAs, die eine Ziel-RNA intermolekular spalten können. Wenn man den in der Litera- tur (vergleiche beispielsweise Tanner et al., in:In another preferred embodiment, the present invention relates to a ribozyme, characterized in that it leads to an mRNA which of a nucleic acid molecule according to the invention or a part thereof has been transcribed, is complementary and can bind selectively to this mRNA and can cleave it, so that it can inhibit the synthesis of the CaTEC1 proteins encoded by the nucleic acid molecules. Ribozymes that consist of a single RNA chain are RNA enzymes, that is, catalytic RNAs, that can cleave a target RNA intermolecularly. If you look at it in the literature (see for example Tanner et al., In:
Antisense Research and Applications, CRC Press Inc.Antisense Research and Applications, CRC Press Inc.
(1993) , 415-426) beschriebenen Strategien folgt, ist es möglich, Ribozyme zu konstruieren, die die(1993), 415-426) described strategies, it is possible to construct ribozymes that the
Ziel-RNA an einer spezifischen Stelle spalten kön- nen. Die zwei Haupterfordernisse für solche Ribozyme sind die katalytische Domäne und Bereiche, die zu der Ziel-RNA komplementär sind und ihnen die Bindung an ihr Substrat erlauben, was eine Voraussetzung für die Spaltung ist.Able to cleave target RNA at a specific location. The two main requirements for such ribozymes are the catalytic domain and regions that are complementary to the target RNA and allow them to bind to their substrate, which is a prerequisite for cleavage.
Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung auch Triplex-formende Oligonukle- otide. Diese sind auf bestimmte Target-Sequenzen beschränkt (Barre et al., Nucleic Acids Res 27 (1999) , 743-749) . Die Erfindung schließt auch chemi- sehe Modifikationen von Nukleinsäuren ein. Geeigneten Modifikationen von Triplex-formenden Oligo- nukleotiden sind beispielsweise in Baba et al., Int J Cancer 72 (1997), 815-820, beschrieben.In a further preferred embodiment, the invention also relates to triplex-forming oligonucleotides. These are limited to certain target sequences (Barre et al., Nucleic Acids Res 27 (1999), 743-749). The invention also includes chemical modifications of nucleic acids. Suitable modifications of triplex-forming oligonucleotides are described, for example, in Baba et al., Int J Cancer 72 (1997), 815-820.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung schließen An- tisense-Oligonukleotide ein. Das Design solcher 0- ligonukleotide beruht, anders als das der Triplex- formenden Oligonukleotide, darauf, dass eine Sequenz gewählt wird, die komplementär zu einem Teil der mRNA des erfindungsgemäßen Transkriptionsfak- tors ist. Das Design solcher Oligonukleotide und mögliche Target-Sequenzen sind beispielsweise in Nucleic Acids Res., 26(9) (1998), 2179-2183; Helene, C, Anti-Cancer Drug Des., 6 (1991), 569-584, und Mäher, L.J., Cancer Invest. 14 (1996), 66-82, beschrieben. Ein Screening verschiedener Antisense •Oligonukleotide ist oft notwendig, um das Oligo- nukleotid mit der größten Effektivität zu identifizieren. Für das Design von Antisense Oligonukleoti- den werden auch Software-gestützte Methoden verwandt (Eckstein F., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 24; Matveeva et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 1374-1375) . Eine Methode zum Auffinden von wirksamen Triplex-formenden Oligonukleotiden, Antisense- Nukleotiden oder Ribozymen ist in der US 6,013,447 beschrieben.Further refinements of the invention include antisense oligonucleotides. Unlike the triplex-forming oligonucleotides, the design of such 0-ligonucleotides is based on the fact that a sequence is selected which is complementary to part of the mRNA of the transcription factor according to the invention. tors is. The design of such oligonucleotides and possible target sequences are described, for example, in Nucleic Acids Res., 26 (9) (1998), 2179-2183; Helene, C, Anti-Cancer Drug Des., 6 (1991), 569-584, and Mower, LJ, Cancer Invest. 14: 66-82 (1996). Screening of different antisense • Oligonucleotides are often necessary to identify the oligonucleotide with the greatest effectiveness. Software-based methods are also used for the design of antisense oligonucleotides (Eckstein F., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 24; Matveeva et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 1374-1375 ). A method for finding effective triplex-forming oligonucleotides, antisense nucleotides or ribozymes is described in US Pat. No. 6,013,447.
Oligonukleotide können chemisch modifiziert werden, um beispielsweise bestimmte Eigenschaften, wie Stabilität und Bindungsstärke, zu erhöhen. Solche Mo- difikationen sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. Beispiele für solche Modifikationen, die für Antisense-Oligonukleotide geeignet sind, sind in Shchepinov et al., Nucleic Acids Res., 25 (1997), 4447-4454; Tortora et al . , Clin. Cancer Res., 5 (1999), 875-881, und Zhou et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 (1998), 3269-74, beschrieben.Oligonucleotides can be chemically modified, for example to increase certain properties, such as stability and binding strength. Such modifications are also part of the invention. Examples of such modifications which are suitable for antisense oligonucleotides are described in Shchepinov et al., Nucleic Acids Res., 25 (1997), 4447-4454; Tortora et al. , Clin. Cancer Res., 5 (1999), 875-881, and Zhou et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 (1998), 3269-74.
Die Erfindung schließt auch andere Strukturen ein, die an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren binden können. Ein Beispiel für solche Strukturen sind Peptide Nucleic Acids (siehe Kuhn et al., J. Mol. Biol. Mar., 12, 286(5) (1999), 1337-1345, und Nielsen et al., Curr. Opin. Biotechnol., 10 (1999), 71- 75) . Weitere Informationen zu Design und Anwendung verschiedener Oligonukleotide und Derivate davon kennt der Fachmann beispielsweise aus Yadava, Molecular Biology Today, 1(1) (2000), 1-16.The invention also includes other structures that can bind to the nucleic acids of the invention. An example of such structures are peptide nucleic acids (see Kuhn et al., J. Mol. Biol. Mar., 12, 286 (5) (1999), 1337-1345, and Nielsen et al., Curr. Opin. Biotechnol ., 1999, 10: 71-75). The person skilled in the art knows, for example, Yadava, Molecular Biology Today, 1 (1) (2000), 1-16, for further information on the design and use of various oligonucleotides and derivatives thereof.
Die vorgenannten komplementären Sequenzen, das heißt die Antisense-RNA oder das Ribozym, eignen sich zur Repression der CaTSCl-Expression, beispielsweise im Fall einer Behandlung einer Candida- Infektion. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäße RNA und das erfindungsgemäße Ribozym komplementär zu dem kodierenden Bereich der mRNA, beispielsweise zum 5' -Teil des kodierenden Bereiches. Der Fachmann, dem die Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung stehen, kann die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme herstellen und nutzen. Der Bereich der Antisense-RNA beziehungsweise des Ribozyms, der zu der mRNA, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremo- lekülen transkripiert wurde, Komplementarität zeigt, weist vorzugsweise eine Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und besonders bevorzugt von mindestens 25 Nukleotiden auf.The aforementioned complementary sequences, that is to say the antisense RNA or the ribozyme, are suitable for the repression of the CaTSCl expression, for example in the case of treatment of a Candida infection. The RNA according to the invention and the ribozyme according to the invention are preferably complementary to the coding region of the mRNA, for example to the 5 ′ part of the coding region. The person skilled in the art, to whom the sequences of the nucleic acid molecules according to the invention are available, can produce and use the antisense RNAs or ribozymes described above. The region of the antisense RNA or of the ribozyme which shows complementarity with the mRNA which has been transcribed by the nucleic acid molecules according to the invention preferably has a length of at least 10, in particular at least 15 and particularly preferably at least 25 nucleotides.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Inhibitoren von Ca TECl , die ei- nen ähnlichen Zweck wie die vorstehend erwähnten Antisense-RNAs oder Ribozyme erfüllen, das heißt die Verminderung oder Eliminierung biologisch aktiver CaTECl-Proteinmoleküle. Bei solchen Inhibitoren kann es sich beispielsweise um strukturelle Analoge des entsprechenden Proteins handeln, die als Anta- gonisten wirken. Außerdem umfassen solche Inhibitoren Moleküle, die unter Verwendung der rekombinant hergestellten Proteine identifiziert werden. Beispielsweise kann das rekombinant hergestellte Pro- tein verwendet werden, um Inhibitoren zu screenen und zu identifizieren, indem die Fähigkeit potentieller Inhibitoren zur Bindung an das Protein unter geeigneten Bedingungen ausgenutzt wird. Die In- hibitoren können beispielsweise identifiziert werden, indem ein Test-Gemisch hergestellt wird, in dem der potentielle Inhibitor mit CaTECl unter geeigneten Bedingungen, unter denen vorzugsweise CaTECl in nativer Konformation vorliegt, inkubiert wird. Ein solches in vitro-Testsystem kann nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind, aufgebaut werden.In a further embodiment, the present invention relates to inhibitors of Ca TECl which have a similar purpose to the above-mentioned antisense RNAs or ribozymes, that is to say the reduction or elimination of biologically active CaTECl protein molecules. Such inhibitors can be, for example, structural analogs of the corresponding protein, which act as antagonists. Such inhibitors also include molecules that are identified using the recombinantly produced proteins. For example, the recombinantly produced pro- tein can be used to screen and identify inhibitors by utilizing the ability of potential inhibitors to bind to the protein under appropriate conditions. The inhibitors can be identified, for example, by producing a test mixture in which the potential inhibitor is incubated with CaTECl under suitable conditions, under which CaTECl is preferably in a native conformation. Such an in vitro test system can be constructed using methods that are well known in the art.
Inhibitoren können beispielsweise identifiziert werden, indem in einem ersten Schritt synthetische oder natürlich vorkommende Moleküle gescreent werden, die an das rekombinant hergestellt CaTECl- Protein binden, und danach in einem zweiten Schritt die selektierten Moleküle in in vitro-Testsystemen oder zellulären Tests im Hinblick auf die Inhibiti- on des Ca TECl-Proteins getestet werden, was sich anhand der Inhibition mindestens einer der nachstehend beschriebenen biologischen Aktivitäten nachweisen lässt. Ein solches Screening im Hinblick auf Moleküle, die CaTECl binden, kann leicht in einem größeren Maßstab durchgeführt werden, beispielsweise durch Screenen von potentiell bindefähigen Molekülen aus Substanzbibliotheken synthetischer und/oder natürlicher Moleküle. Bei einem solchen Inhibitor kann es sich beispielsweise um eine syn- thetische, organische oder chemische Substanz, ein natürliches Fermentationsprodukt, eine aus einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder einem Tier extrahierte Substanz oder ein Peptid handeln. Weitere Beispiele für Inhibitoren sind spezifische Antikörper. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und die von ihnen kodierten Proteine zur Identifizierung weiterer Fak- toren verwendet werden, die an der Virulenz von Candida beteiligt sind, beispielsweise ein CaTECl- abhängiger Virulenzfaktor. Die erfindungsgemäßen Proteine können beispielsweise zur Identifizierung weiterer (nicht-verwandter) Proteine verwendet wer- den, die mit der Virulenz von Candida im Zusammenhang stehen, wobei Screening-Verfahren auf der Basis von Proteinen/Protein-Interkationen, beispielsweise das Two-Hybrid-System, verwendet werden.Inhibitors can be identified, for example, by screening synthetic or naturally occurring molecules that bind to the recombinantly produced CaTECl protein in a first step, and then in a second step the selected molecules in in vitro test systems or cellular tests with regard to the Inhibition of the Ca TECl protein can be tested, which can be demonstrated by the inhibition of at least one of the biological activities described below. Such screening for molecules that bind CaTECl can easily be carried out on a larger scale, for example by screening potentially bindable molecules from substance libraries of synthetic and / or natural molecules. Such an inhibitor can be, for example, a synthetic, organic or chemical substance, a natural fermentation product, a substance extracted from a microorganism, a plant or an animal or a peptide. Specific antibodies are further examples of inhibitors. In addition, the nucleic acid sequences according to the invention and the proteins encoded by them can be used to identify further factors which are involved in the virulence of Candida, for example a CaTEC1-dependent virulence factor. The proteins according to the invention can be used, for example, to identify further (unrelated) proteins which are related to the virulence of Candida, screening methods based on proteins / protein interactions, for example the two-hybrid system , be used.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher auch iso- lierte und vollständig gereinigte onoklonale oder polyklonale Antikörper oder deren Fragmente, die mit einem erfindungsgemäßen Protein so spezifisch und mit einer solchen Affinität reagieren, dass unter Verwendung dieser monoklonalen oder polyklonlen Antikörper oder deren Fragmente mit Hilfe üblicher immunologischer Verfahren beispielsweise ein Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteins möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst daher monoklonale und polyklonle Antikörper, die spezifisch eine Struktur eines erfindungsgemäßen Virulenz-modulierenden Proteins identifizieren und/oder daran binden können. Bei dieser Struktur kann es sich um ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Proteoglycan und/oder einen Lipidkomplex handeln, das/der ein Teil des erfindungsgemäßen Proteins ist oder mit diesem in spezifischer Beziehung steht. Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die gegen Strukturen gerichtet sind, die im Ergebnis posttranslationaler Modifikationen des erfindungs- gemäßen Proteins entstanden sind. Die Erfindung umfasst auch Fragmente derartiger Antikörper, wie beispielsweise Fc- oder F(ab')2- beziehungsweise Fab-Fragmente .The present invention therefore also includes isolated and completely purified onoclonal or polyclonal antibodies or fragments thereof, which react with a protein according to the invention so specifically and with such an affinity that using these monoclonal or polyclonal antibodies or their fragments with the aid of conventional immunological methods for example, detection of a protein according to the invention is possible. A preferred embodiment of the invention therefore comprises monoclonal and polyclonal antibodies which can specifically identify and / or bind to a structure of a virulence-modulating protein according to the invention. This structure can be a protein, peptide, carbohydrate, proteoglycan and / or a lipid complex which is part of or has a specific relationship with the protein according to the invention. The invention also encompasses antibodies which are directed against structures which result from post-translational modifications of the according protein. The invention also includes fragments of such antibodies, such as Fc or F (ab ') 2 or Fab fragments.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft erfindungsgemäße Proteine oder Teile davon, gegen die Proteine gerichtete Antikörper oder Teile davon sowie erfindungsgemäße Nukleotidsequenzen, die in immobilisierter Form vorliegen. Die in immobilisierter Form vorliegenden erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, Proteine und/oder Antikörper lassen sich als trägergebundene Screening-Vorrichtungen verwenden, um Substanzen zu identifizieren, die mit den immobilisierten Molekü- len in Wechselwirkung treten. Die Immobilisierung kann an ein beliebiges geeignetes Trägermaterial erfolgen, zum Beispiel an inerte oder elektrisch geladene, anorganische oder organische Trägermaterialien, wie zum Beispiel Glasmaterialien, Alumini- umoxid, Cellulose, Stärke, Dextran, Polyacryla id und so weiter. Die verwendeten Trägermaterialien können darüber hinaus funktionelle Gruppen aufweisen, die beispielsweise eine kovalente Bindung ermöglichen. Eine Immobilisierung kann derart erfol- gen, dass die vorstehend genannten Nukleotidsequenzen, Proteine oder Antikörper in ein dreidimensionales Netzwerk eingebunden sind.A further preferred embodiment of the present invention relates to proteins or parts thereof according to the invention, antibodies or parts thereof directed against the proteins and nucleotide sequences according to the invention which are present in immobilized form. The nucleotide sequences, proteins and / or antibodies according to the invention which are present in immobilized form can be used as carrier-bound screening devices in order to identify substances which interact with the immobilized molecules. The immobilization can be carried out on any suitable carrier material, for example on inert or electrically charged, inorganic or organic carrier materials, such as for example glass materials, aluminum oxide, cellulose, starch, dextran, polyacrylic acid and so on. The carrier materials used can also have functional groups which, for example, enable a covalent bond. Immobilization can take place in such a way that the above-mentioned nucleotide sequences, proteins or antibodies are integrated into a three-dimensional network.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von durch Candida-Arten verursachten Infektionen oder Krankheitszuständen, insbesondere durch Candida albicans verursachte Infektionen, wie Candida-Mykosen, beispielsweise Candi- dose der Körperfalten, der männlichen Urethra, der Mundschleimhaut, der Finger- oder Fussnägel (Onchy- ykose) , der Säuglingshaut, der Vagina usw., oder Candida-Granulom. Dabei werden die zu testenden Organismen auf die Anwesenheit von erfindungsgemäßen Agenzien, insbesondere Nukleinsäuremoleküle, Proteinen, Wirtszellen, Vektoren, Antikörpern oder Fragmenten davon untersucht und deren Anwesenheit nachgewiesen. Das heißt, die Anwesenheit der erfindungsgemäßen Agenzien weist auf die Krankheit hin. Die vorliegende Erfindung stellt daher auch ein Verfahren zur Diagnose einer' Candidainfektion, insbesondere einer Candida albicans-Infektion, bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer Zielprobe, die im Verdacht steht, das CaTECl-Protein und/oder eine Ca TECl codierende Nukleinsäure zu enthalten, mit einem Reagenz, das mit CaTECl und/oder einer Ca TECl kodierenden Nukleinsäure reagiert und das Nachweisen von CaTECl und/oder der Ca TECl kodierenden Nukleinsäure. Der Nachweis der vorgenannten erfin- dungsgemäßen Agenzien kann mittels entsprechender, das heißt erfindungsgemäße Agenzien spezifisch erkennender Substanzen erfolgen. Beispielsweise kann ein Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit Hilfe von hybridisierenden Sequenzen erfol- gen, wobei diese vorzugsweise markiert sind. Beispielsweise können die hybridisierenden Sequenzen Fluoreszenz-, Enzym- oder radioaktive Marker aufweisen. Wenn das Zielmolekül also eine Nukleinsäure ist, handelt es sich bei dem Reagenz typischerweise um eine CaTECl-spezifische Nukleinsäuresonde oder einen PCR-Primer. Der Fachmann ist in der Lage, auf der Basis der Ca TECl-Nukleotidsequenz geeignete Nukleinsäure-Sonden zu entwickeln. Die Sonden/Primer umfassen Nukleinsäuremoleküle, die spe- zifisch mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure ole- külen hybridisieren. Die Sonden/Primer sind Oligonukleotide, die vorzugsweise unter stringenten Bedingungen mit mindestens 10, insbesondere mindestens 15 und besonders bevorzugt mit mindestens 25 benachbarten Nukleotiden der CaTECl - Nukleinsäuresequenz hybridisieren. Vorzusweise umfassen die Ca TECl-spezifischen Nukleinsäuresonden/- primer die Nukleinsäuresequenz : 5'-TTT AGG ATC CAA TGA TGT CGC AAG CTA CTC C-3' und 5'-TTT AGG ATC CAC TAA AAC TCA CTA GTA AAT CCT TCT G-3' . Wenn das Zielmolekül das CaT£C2-Protein ist, wird als Reagenz typischerweise ein gegen CaTECl gerichteter Antikörper verwendet. Der Begriff „Antikörper" betrifft Antikörper, die im Wesentlichen aus gepool- ten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen Epitop-Spezifitäten bestehen, ebenso wie distinkte monoklonale Antikörper-Präparate. Monoklonale Antikörper werden unter Verwendung von dem Fachmann wohl bekannten Verfahren (vergleiche beispielsweise Köhler et al . , Nature, 256 (1975), 495) auf der Basis eines Antigens, das Fragmente des erfindungsgemäßen Ca TECl-Proteins enthält, hergestellt. Der Begriff „Antikörper" (Ab) oder „monoklonaler Antikörper" (Mab) soll sowohl intakte Moleküle als auch Antikörper-Fragmente (beispielsweise Fab- und F (ab' ) 2-Fragmente) umfassen, die spezifisch an das Protein binden können. Fab- und F (ab' ) 2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers. Sie werden schneller aus dem Blutkreislauf ausge- schieden und können eine geringere nichtspezifische Gewebebindung aufweisen als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24 (1983), 316-325). Darüber hinaus umfassen die erfindungsgemäßen Antikörper auch Chimäre, Einzelket- ten- und humanisierte Antikörper. Das CaTECl-Protein und/oder eine CaTECl kodierende Nukleinsäure, beispielsweise in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben, kann direkt in situ nachgewiesen werden, beispielsweise durch in situ- Hybridisierung, oder kann aus anderen zellulären Bestandteilen unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, vor dem Inkontaktbringen mit einer Sonde isoliert werden. Nachweisverfahren umfassen Northern Blot-Analyse, RNase-Schutztests, in situ-Verfahren, beispielsweise in situ- Hybridisierung, in vitro-Amplifikationsverfahren wie PCR, RT-PCR, LCR, QRNA-Replikase oder RNA- Transkription/Amplifikation, reverse Dot-Blot- Verfahren wie das in EP-Bl 0 237 362 offenbarte, Immuntests, Western-Blot-Verfahren und andere Nachweistests. Produkte, die unter Verwendung von in vitro-Amplifikationsverfahren erhalten werden, können nach bekannten Verfahren nachgewiesen werden, beispielsweise durch Trennung der Produkte auf Aga- rosegelen und anschließendes Anfärben mit Ethidi- umpromid. In einer anderen Ausführungsform können die amplifizierten Produkte unter Verwendung markierter Amplifikationsprimer oder markierter dNTPs nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäßen Son- den/Primer können durch Markierungen mit einem Radioisotop, einer Bioluminiszenz-Verbindung, einer Chemiluminiszenz-Verbindung, einer Fluoreszenzverbindung, eines Metallchelats oder eines Enzymes nachgewiesen werden.A further advantageous embodiment of the present invention comprises methods for the diagnosis and / or therapy of infections or disease states caused by Candida species, in particular infections caused by Candida albicans, such as Candida mycoses, for example Candiose of the body folds, the male urethra Oral mucosa, fingernails or toenails (onchycosis), infant skin, vagina etc., or candida granuloma. The organisms to be tested are examined for the presence of agents according to the invention, in particular nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, antibodies or fragments thereof, and their presence is detected. This means that the presence of the agents according to the invention indicates the disease. The present invention therefore also provides a method for diagnosing a 'Candida infection, particularly a Candida albicans infection, comprising contacting a target sample suspected that CaTECl protein and / or to contain a Ca TeCl encoding nucleic acid, with a reagent that reacts with CaTECl and / or a Ca TECl-encoding nucleic acid and the detection of CaTECl and / or the Ca TECl-encoding nucleic acid. The above-mentioned agents according to the invention can be detected by means of corresponding substances, ie agents specifically recognizing according to the invention. For example, the nucleotide sequences according to the invention can be detected with the aid of hybridizing sequences, these being preferably marked. For example, the hybridizing sequences can have fluorescent, enzyme or radioactive markers. If the target molecule is a nucleic acid, the reagent is typically a CaTECl-specific nucleic acid probe or a PCR primer. The person skilled in the art is able to develop suitable nucleic acid probes on the basis of the Ca TEC1 nucleotide sequence. The probes / primers comprise nucleic acid molecules which are ole- specific with the nucleic acid according to the invention. cool hybridize. The probes / primers are oligonucleotides which hybridize preferably under stringent conditions with at least 10, in particular at least 15 and particularly preferably with at least 25 adjacent nucleotides of the CaTEC1 nucleic acid sequence. The Ca TECl-specific nucleic acid probes / primers preferably comprise the nucleic acid sequence: 5'-TTT AGG ATC CAA TGA TGT CGC AAG CTA CTC C-3 'and 5'-TTT AGG ATC CAC TAA AAC TCA CTA GTA AAT CCT TCT G-3 '. If the target molecule is the CaT £ C2 protein, an antibody directed against CaTECl is typically used as the reagent. The term “antibody” relates to antibodies which essentially consist of pooled monoclonal antibodies with different epitope specificities, as well as distinct monoclonal antibody preparations. Monoclonal antibodies are produced using methods which are well known to the person skilled in the art (compare, for example, Köhler et al. , Nature, 256 (1975), 495) on the basis of an antigen which contains fragments of the Ca TEC1 protein according to the invention. The term “antibody” (Ab) or “monoclonal antibody” (Mab) is intended to mean both intact molecules and Antibody fragments (e.g., Fab and F (ab ') 2 fragments) that can specifically bind to the protein. Fab and F (ab') 2 fragments lack the Fc fragment of an intact antibody. They become faster excreted from the bloodstream and may have less non-specific tissue binding than an intact antibody (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24 (19 83), 316-325) In addition, the antibodies according to the invention also include chimeras, single-chain and humanized antibodies. The CaTECl protein and / or a CaTECl-encoding nucleic acid, for example in biological fluids or tissues, can be detected directly in situ, for example by in situ hybridization, or can be obtained from other cellular components using methods known to the person skilled in the art, be isolated before contact with a probe. Detection methods include Northern blot analysis, RNase protection tests, in situ methods, for example in situ hybridization, in vitro amplification methods such as PCR, RT-PCR, LCR, QRNA replicase or RNA transcription / amplification, reverse dot blot Methods such as that disclosed in EP-Bl 0 237 362, immunoassays, Western blot methods and other detection tests. Products which are obtained using in vitro amplification methods can be detected by known methods, for example by separating the products on agarose gels and then staining them with ethidine promide. In another embodiment, the amplified products can be detected using labeled amplification primers or labeled dNTPs. The probes / primers according to the invention can be detected by labeling with a radioisotope, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a fluorescent compound, a metal chelate or an enzyme.
Der Nachweis von erfindungsgemäßen Proteinen oder Antikörpern erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von Antikörpern, die gegen die vorgenannten Proteine gerichtet sind. Darüber hinaus kann die Expression von CaTECl in Geweben (im Falle einer systemischen Infektion) mit klassischen immunhistologischen Verfahren untersucht werden (Jalkanen et al., J. Cell. Biol., 101 (1985), 976-985; Jalkanen et al., J Cell. Biol., 105 (1987), 3087-3096; Sobol et al., Clin. Immunpathol . , 24 (1982), 139-144 ; Sobol et al., Cancer, 65 (1985), 2005-2010). Andere auf Antikörpern basierende Verfahren, die sich zum Nachweis der Genexpression eignen, umfassen Immuntests, wie den Enzym-gebundenen Immunadsorptions-Test (enzy e linked immunosorbens assay (ELISA) ) und den Radioimmuntests (RIA) . Geeignete Markierungen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Enzym- Markierungen wie Glucoseoxidase, und Radioisotope, wie Iod (125I, 121I) Kohlenstoff (14C) , SchwefelProteins or antibodies according to the invention are preferably detected with the aid of antibodies which are directed against the aforementioned proteins. In addition, the expression of CaTECl in tissues (in the case of a systemic infection) can be examined using classic immunohistological methods (Jalkanen et al., J. Cell. Biol., 101 (1985), 976-985; Jalkanen et al., J Cell. Biol., 105 (1987), 3087-3096; Sobol et al., Clin. Immunpathol., 24 (1982), 139-144; Sobol et al., Cancer, 65 (1985), 2005-2010). Other antibody-based methods useful for detecting gene expression include immunoassays, such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA). Suitable labels are known in the art and include enzyme labels such as glucose oxidase and radioisotopes such as iodine ( 125 I, 121 I) carbon ( 14 C), sulfur
(35S) , Tritium (3H) , Indium (u2In) und Technetiu( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( u2 In) and technetiu
(99mTc) , und Fluoreszenzmarker, wie Fluorescein und( 99 mTc), and fluorescent markers such as fluorescein and
Rhodamin, sowie Biotin. Das Protein kann auch in vivo mittels bildgebender Verfahren nachgewiesen werden. Antikörper-Markierungen oder Marker zur bildlichen Darstellung des Proteins umfassen solche, die unter Verwendung von Röntgen-Radiographie, NMR oder ESR nachweisbar sind. Für die Röntgen- Radiographie geeignete Marker umfassen Radioisotope wie Barium oder Cäsium, die eine geeignete Strahlung emittieren, für einen Probanden jedoch nicht schädlich sind. Für NMR- und ESR-Verfahren geeige- nete Marker umfassen solche mit einem nachweisbaren charakteristischen Spin, beispielsweise Deuterium. Ein Protein-spezifischer Antikörper beziehungsweise Antikörperfragment, das mit einer geeigneten nachweisbaren Einheit zur bildlichen Darstellung, wie einem Radioisotop, beispielsweise 131I, 112In, "mTc, einer für Röntgenstrahlen undurchlässigen Substanz oder einem Material, das mittels Kernmagnetresonanz-Verfahren nachweisbar ist, wird beispielsweise parenteral, subkutan oder intraperitoneal in ein Säugetier eingeführt. Dabei bestimmen die Größe des Individuums und das verwendete bildgebende System die Menge der zur bildlichen Darstellung verwendeten Einheit, die erforderlich ist, um zur Diagnose geeignete bildliche Darstellungen herzustellen. Im Falle einer Radioisotop-Einheit liegt die Menge der injizierten Radioaktivität bei einem menschlichen Probanden üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis 20 Millicurie "mTc. Der markierte Antikörper oder das markierte Antikörperfragment reichert sich dann vorzugsweise an den Stellen einer Zelle an, die das spezifische Protein enthalten.Rhodamine and biotin. The protein can also be detected in vivo using imaging techniques. Antibody labels or markers for imaging the protein include those that can be detected using X-ray radiography, NMR or ESR. Markers suitable for X-ray radiography include radioisotopes such as barium or cesium, which emit suitable radiation, but are not harmful to a subject. Markers suitable for NMR and ESR methods include those with a detectable characteristic spin, for example deuterium. A protein-specific antibody or antibody fragment which has a suitable detectable unit for imaging, such as a radioisotope, for example 131 I, 112 In, "mTc, a substance that is opaque to X-rays or a material that can be detected by means of nuclear magnetic resonance methods, is introduced into a mammal, for example, parenterally, subcutaneously or intraperitoneally. The size of the individual and the imaging system used determine the amount of the unit used for imaging, which is required to produce suitable imaging for diagnosis. In the case of a radioisotope unit, the amount of radioactivity injected into a human subject is usually in the range of about 5 to 20 millicurie "mTc. The labeled antibody or antibody fragment then preferably accumulates at the sites of a cell that contain the specific protein contain.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Proteinen, Wirtszellen, Vektoren, Antikörpern und/oder Teilen davon als Diagnostika. Im Zusa men- hang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Diagnostika jedwede Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Abwesenheit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheiten geben können. Diagnostika weisen dabei häufig erkennende, und markierende Funktionen auf.The present invention therefore also relates to the use of nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, antibodies and / or parts thereof according to the invention as diagnostics. In connection with the present invention, diagnostic agents are understood to mean any substances which can specifically recognize the presence of conditions, processes or substances or their absence and which in particular can give conclusions about diseases. Diagnostics often have recognizing and marking functions.
Die Erfindung umfasst selbstverständlich auch Diagnostik-Kits, die die erfindungsgemäßen Agenzien, das heißt Nukleotidsequenzen, Proteine, Antikörper oder Teile davon enthalten und die die Diagnose von' durch Candida-Arten, insbesondere Candida albicans, verursachten Krankheiten erlauben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Krankheiten insbesondere auch Zustände, wie unnatürliche Gemütszustände, Alterserscheinungen, Entwicklungsstörungen und ähnliches verstanden.The invention of course also encompasses diagnostic kits, that is, the nucleotide sequences, proteins, antibodies or parts thereof and the diagnosis of 'by Candida species, especially Candida albicans, allow agents according to the invention, diseases caused. In connection with the present invention, diseases, in particular, include conditions such as unnatural ones Understand moods, signs of aging, developmental disorders and the like.
Die Erfindung erfasst auch Verfahren zur Therapie von durch Candida-Arten, insbesondere Candida albi- cans, verursachten Krankheiten, vorzugsweise einer systemischen Infektion, wobei der zu behandelnde Organismus mit den erfindungsgemäßen Agenzien über einen Zeitraum mit einer Dosis behandelt wird, die ausreicht, das Krankheitsbild zu stabilisieren oder zu verbessern oder die Krankheit zu heilen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Can- dida-Infektion umfasst daher die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Reagenz, das die Ca TECl-Aktivität vermindert oder hemmt. Beispiele solcher Reagenzien sind die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs, Ribozyme oder Inhibitoren, beispielsweise eines gegen Ca TECl gerichteten Antikörpers. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- moleküle, Proteine, Wirtszellen, Vektoren, Inhibitoren, Antisense-RNAs, Ribozyme, Antikörper und Fragmente davon als Therapeutika. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff "Therapeutika" insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder prophylaktisch oder krank- heitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krank- heitszustände zu vermeiden, zu lindern oder zu beseitigen. Dazu gehören zum Beispiel auch Impfstoffe. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Therapeutika auch solche Stoffe verstanden, die ausschließlich oder auch kosmetische Wirkungen aufweisen.The invention also encompasses methods for the therapy of diseases caused by Candida species, in particular Candida albicans, preferably a systemic infection, the organism to be treated being treated with the agents according to the invention over a period of time with a dose which is sufficient for the clinical picture stabilize or improve or cure the disease. The method according to the invention for the treatment of a Candida infection therefore comprises the administration of a therapeutically effective amount of a reagent which reduces or inhibits the Ca TECl activity. Examples of such reagents are the antisense RNAs, ribozymes or inhibitors described above, for example an antibody directed against Ca TECl. The invention therefore also relates to the use of the nucleic acid molecules, proteins, host cells, vectors, inhibitors, antisense RNAs, ribozymes, antibodies and fragments thereof according to the invention as therapeutic agents. In connection with the present invention, the term “therapeutic agent” is understood to mean in particular those substances which can be used either prophylactically or accompanying the disease in order to avoid, alleviate or eliminate disease states. This includes, for example, vaccines. In connection with the present invention, therapeutic agents are also understood to mean those substances which have only or also cosmetic effects.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Reagenz ent- hält, das die Ca TECl-Expression oder die Aktivität des Ca TECl-Proteins vermindert oder hemmt. Beispielsweise kann auch die Verabreichung eines Antikörpers, der gegen das Protein gerichtet ist, die Aktivität des Proteins reduzieren oder beseitigen.The present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains a reagent. holds that decreases or inhibits Ca TECl expression or the activity of the Ca TECl protein. For example, administration of an antibody directed against the protein can also reduce or eliminate the activity of the protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Agenzien, also die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, Protei- ne," Wirtszellen, Vektoren, Inhibitoren, Antisense- RNAs, Ribozyme, Antikörper oder Fragmente davon enthalten,- gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen, wie Stabilisatoren, Verdi- ckungsmitteln, Trennmitteln, Gleitmitteln, Farbstoffen, Geruchsstoffen, Geschmacksstoffen, Emulga- toren oder ähnlichem.In a preferred embodiment, the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions which contain the agents according to the invention, that is to say the nucleic acid molecules according to the invention, proteins, host cells, vectors, inhibitors, antisense RNAs, ribozymes, antibodies or fragments thereof, if appropriate together with one pharmaceutically acceptable carriers and, if appropriate, other additives, such as stabilizers, thickeners, mold release agents, lubricants, colorants, fragrances, flavorings, emulsifiers or the like.
Zur Verabreichung können diese Agenzien vorzugsweise mit geeigneten pharmazeutischen Trägern ko bi- niert werden. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und umfassen Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie Öl-inWasser-Emulsionen, verschiedene Typen von Benet- zungsmitteln, sterile Lösungen usw.. Solche Träger können mittels herkömmlicher Verfahren formuliert und an den Patienten mit einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung geeigneter Zusammensetzungen kann in unterschiedlicher Weise erfolgen, beispielsweise durch intravenöse, intra- peritoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Der Verabreichungsweg hängt natürlich von der Art der Candida- Infektion (beispielsweise systemische oder vaginale Infektion) und der Art der Verbindung, die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, ab. Das Dosierungsschema wird von dem untersuchenden Arzt bestimmt. Bekanntlich hängt die Dosierung für einen bestimmten Patienten von vielen Faktoren ab, wozu die Größe, das Alter und das Geschlecht des Patienten, die spezifische zu verabreichende Verbindung, die Zeitdauer und der Weg der Verabreichung, die Art und das Stadium der Infektion, der allgemeine Gesundheitszustand und die gleichzeitige Verabreichung anderer Medikamente gehören.For administration, these agents can preferably be combined with suitable pharmaceutical carriers. Examples of suitable pharmaceutical carriers are well known in the art and include phosphate-buffered physiological saline, water, emulsions such as oil-in-water emulsions, various types of wetting agents, sterile solutions, etc. Such carriers can be formulated by conventional methods and administered to the patient at an appropriate dose. Suitable compositions can be administered in various ways, for example by intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, topical or intradermal administration. The route of administration naturally depends on the type of Candida infection (for example systemic or vaginal Infection) and the type of compound contained in the pharmaceutical composition. The dosing schedule is determined by the examining doctor. As is known, the dosage for a particular patient depends on many factors, including the size, age and sex of the patient, the specific compound to be administered, the duration and route of administration, the type and stage of the infection, the general state of health and the simultaneous administration of other drugs.
Die erfindungsgemäßen Antisense-RNAs oder Ribozyme können direkt angewendet oder vorzugsweise unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, beispielsweise eine Chimären Virus, der diese Verbindungen enthält, oder eines kolloidalen Dispersionssystems verabreicht werden. Durch die Abgabe dieser Nucleinsäuren an das gewünschte Ziel kann die intrazelluläre Expression von CaTECl und daher auch die Menge des CaTECl-Proteins verringert werden, was zur Hemmung der Virulenz von Candida führt .The antisense RNAs or ribozymes according to the invention can be applied directly or preferably administered using a recombinant expression vector, for example a chimeric virus which contains these compounds, or a colloidal dispersion system. By delivering these nucleic acids to the desired target, the intracellular expression of CaTECl and therefore the amount of CaTECl protein can be reduced, which leads to the inhibition of the virulence of Candida.
Eine direkte Anwendung an der Zielstelle kann beispielsweise mit Hilfe eines ballistischen Abgabe- Systems, wie eines kolloidalen Dispersionssystems oder mittels eines Katheders in einer Arterie erfolgen. Die kolloidalen Dispersionssysteme, die zur Abgabe der vorstehend erwähnten Nukleinsäuren verwendet werden können, umfassen makromolekulare Kom- plexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Perlen und Systeme auf der Basis von Lipiden einschließlich Öl-inWasser-Emulsionen, (gemischte) Micellen, Liposomen und Lipoplexe. Ein bevorzugtes kolloidales System ist ein Liposom. Das Liposom ist normalerweise aus Phospholipiden und Steroiden, insbesondere Choles- terin zusammengesetzt. Der Fachmann kann solche Liposomen auswählen, die zur Abgabe des gewünschten Nukleinsäuremoleküls geeignet sind. Um die Abgabe nur an die gewünschte Stelle, beispielsweise einen Tumor zu erreichen, können organspezifische oder zellspezifische Liposomen verwendet werden. Unter Anwendung üblicherweise verwendeter Verfahren kann der Fachmann Liposomen herstellen, die spezifisch auf ein Ziel gerichtet sind. Solche Targeting- Verfahren umfassen ein passives Targeting, wobei die- natürliche Neigung der Liposomen zur Verteilung in Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) in Organen, die Sinusoid-Kapillaren enthalten, aus- genutzt wird, oder ein aktives Targeting, beispielsweise durch Kopplung der Liposomen an einen spezifischen Liganden, beispielsweise einen Antikörper, einen Rezeptor, einen Zucker, ein Glycoli- pid, ein Protein usw. unter Anwendung wohlbekannter Verfahren. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise monoklonale Antikörper verwendet, um Liposomen über spezifische Zelloberflächen-Liganden spezifischen Organen oder Geweben zielgerichtet zuzuführen.A direct application at the target site can take place, for example, with the aid of a ballistic delivery system, such as a colloidal dispersion system, or by means of a catheter in an artery. The colloidal dispersion systems which can be used to deliver the nucleic acids mentioned above include macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads and systems based on lipids including oil-in-water emulsions, (mixed) micelles, liposomes and lipoplexes. A preferred colloidal system is a liposome. The liposome is usually out Phospholipids and steroids, especially cholesterol. The person skilled in the art can select those liposomes which are suitable for delivering the desired nucleic acid molecule. Organ-specific or cell-specific liposomes can be used to achieve delivery only to the desired site, for example a tumor. Using commonly used methods, those skilled in the art can make liposomes that are specific to a target. Such targeting methods include passive targeting, in which the natural tendency of the liposomes to distribute in cells of the reticuloendothelial system (RES) in organs which contain sinusoid capillaries is used, or active targeting, for example by coupling the liposomes to a specific ligand, for example an antibody, a receptor, a sugar, a glycolipid, a protein, etc. using well known methods. According to the invention, monoclonal antibodies are preferably used to target liposomes via specific cell surface ligands to specific organs or tissues.
Bevorzugte rekombinante Vektoren, die zur Genthera- pie (insbesondere im Fall einer systemischen Infektion) geeignet sind, sind virale Vektoren, beispielsweise Vektoren auf der Basis von Adenoviren, Herpes-Viren, Vakziniaviren oder bevorzugter auf Basis von RNA-Viren, wie eines Retrovirus. Bevor- zugter handelt es sich bei dem retroviralen Vektor um einen Abkömmling eines aus Nagern oder Vögeln stammenden Retrovirus. Beispiele solcher retrovira- ler Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können sind: das Moloney-Leukämie- Virus von Nagern (MoMuLV) , das Harvey-Sarkom-Virus von Nagern (HaMuSV) , das Nager-Mamma-Tumorvirus (MuMTV) und das Rous-Sarkom-Virus (RSV) . Bevorzugt wird ein retroviraler Vektor aus einem nicht- menschlichen Primaten eingesetzt, wie das Leukämie- Virus vom Gibbon (GaLV) , das im Vergleich zu den murinen Vektoren -einen breiteren Wirtsbereich aufweist. Da rekombinante Retroviren Defekte aufweisen, sind beispielsweise Helferzellen erforderlich, damit infektiöse Partikel produziert werden können. Beispielsweise können Helferzelllinien eingesetzt werden, die Plasmide enthalten, die alle Strukturgene des Retrovirus unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen innerhalb des LTR-Bereiches kodie- ren. Geeignete Helferzelllinien sind dem Fachmann wohl bekannt. Die Vektoren können zusätzlich ein Gen enthalten, das. einen selektierbaren Marker kodiert, so dass transduzierte Zellen identifiziert werden können. Darüber hinaus können die retrovira- len Vektoren so modifiziert werden, dass sie zielspezifisch werden. Dies kann beispielsweise durch Insertion eines Polynukleotidbereiches erreicht werden, der einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein, vorzugsweise einen Antikörper, kodiert. Der Fachmann kennt weitere Verfahren zur Erzeugung zielspezifischer Vektoren. Weitere geeignete Vektoren und Verfahren zur in vitro- oder in vivo- Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann bekannt (vergleiche beispielsweise WO 94/29469 oder WO 97/00957).Preferred recombinant vectors which are suitable for gene therapy (in particular in the case of a systemic infection) are viral vectors, for example vectors based on adenoviruses, herpes viruses, vaccinia viruses or more preferably based on RNA viruses such as a retrovirus. More preferably, the retroviral vector is a descendant of a retrovirus derived from rodents or birds. Examples of such retroviral vectors that can be used in the present invention are: Moloney leukemia Rodent Virus (MoMuLV), Rodent Harvey Sarcoma Virus (HaMuSV), Rodent Breast Tumor Virus (MuMTV) and Rous Sarcoma Virus (RSV). A retroviral vector from a non-human primate is preferably used, such as the gibbon leukemia virus (GaLV), which has a broader host range than the murine vectors. Since recombinant retroviruses have defects, for example helper cells are required so that infectious particles can be produced. For example, helper cell lines can be used which contain plasmids which encode all structural genes of the retrovirus under the control of regulatory sequences within the LTR range. Suitable helper cell lines are well known to the person skilled in the art. The vectors can additionally contain a gene which encodes a selectable marker so that transduced cells can be identified. In addition, the retroviral vectors can be modified so that they become target-specific. This can be achieved, for example, by inserting a polynucleotide region which encodes a sugar, a glycolipid or a protein, preferably an antibody. The person skilled in the art knows other methods for generating target-specific vectors. Further suitable vectors and methods for in vitro or in vivo gene therapy are described in the literature and are known to the person skilled in the art (compare, for example, WO 94/29469 or WO 97/00957).
Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die in der diagnostischen Forschung verwendet werden können. Solche Kits eignen sich zum Nachweis von Candida auf der Basis des CaTECl-Proteins oder einer Ca TECl-codlerenden Nukleinsäure. Ein erfindungsgemäßer Kit umfasst eine Sonde zum Nachweis des Ca TECl-Proteins und/oder einer CaTECl - kodierenden Nukleinsäure. Zum Nachweis kann die Sonde markiert sein. Vorzugsweise handelt es sich bei der Sonde um einen spezifischen Antikörper oder ein spezifische Nukleinsäuresonde beziehungsweise - primer. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Kit einen monoklonalen Antikörper gegen CaTECl und ermöglicht die Diagnose, beispielsweise mittels ELISA, und enthält den Antikörper, der an einem festen Träger gebunden ist, beispielsweise eine Polystyrol-Mikrotiterplatte oder Nitrozellulose, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform basieren die Kits auf einem RIA-Test und enthalten einen Antikörper, der mit einem radioaktiven Isotop' markiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist der Antikörper mit Enzymen, Fluoreszenz-Verbindungen, . Luminiszenz- Verbindungen, ferromagnetischen Sonden oder . radioaktiven Verbindungen markiert. Der erfindungsgemäße Kit kann auch einen oder mehrere Behälter umfassen, die beispielsweise eine oder mehrere erfindungsge- mäße Sonden enthalten.The present invention also provides kits that can be used in diagnostic research. Such kits are suitable for the detection of Candida on the basis of the CaTECl protein or a Ca TECl-encoding nucleic acid. A kit according to the invention comprises a probe for detecting the Ca TECl protein and / or a CaTECl-coding nucleic acid. The probe can be marked for verification. The probe is preferably a specific antibody or a specific nucleic acid probe or primer. In a preferred embodiment, the kit contains a monoclonal antibody against CaTECl and enables diagnosis, for example by means of ELISA, and contains the antibody which is bound to a solid support, for example a polystyrene microtiter plate or nitrocellulose, using methods known in the art , In another embodiment, the kits are based on an RIA test and contain an antibody which is labeled with a radioactive isotope ' . In a preferred embodiment of the kit of the invention is the antibody with enzymes, fluorescent compounds. Luminance compounds, ferromagnetic probes or. radioactive compounds marked. The kit according to the invention can also comprise one or more containers which, for example, contain one or more probes according to the invention.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zum Screenen, das heißt zum Auffinden und Identifizieren von Substanzen, die für die Behandlung von durch Candi- da-Arten verursachten Krankheiten geeignet sind. Dabei werden die auf ihre therapeutische Wirkung hin zu testenden Substanzen in einem geeigneten Medium wie beispielsweise einer Lösung, Suspension oder auch bei einer Zelle, mit einem erfindungsge- mäßen Agens, insbesondere einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz oder einem erfindungsgemäßen Protein oder Fragment davon in Kontakt gebracht und eine gegebenenfalls stattfindende Wechselwirkung, beispielsweise eine Bindung, nachgewiesen.A particularly preferred embodiment of the present invention relates to methods for screening, that is to say for finding and identifying substances which are suitable for the treatment of diseases caused by Candida species. The substances to be tested for their therapeutic effect are mixed in a suitable medium such as, for example, a solution, suspension or also in a cell, with a appropriate agent, in particular a nucleotide sequence according to the invention or a protein or fragment thereof according to the invention and a possible interaction, for example a binding, has been detected.
Ein bevorzugtes Substanz-Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst einen Assay, der wie folgt aufgebaut ist: Die Promotoren der Isogene der sezernierten Aspartyl-Proteinase vom Typ 4, 5 und 6 { SAP5- 6-Gene ) enthalten eine mit Trennelementen durchsetzte "head to tail"-Anordnung von TCS- Motiven, die die Bindungsstelle für pilzliche TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren, insbesondere den erfindungsgemäßen CaTECl-Faktor darstellt. Da er- findungsge äß gezeigt werden konnte, dass das Ca- TECl-Protein die Expression der SAP4-6~Gene durch Bindung an den Promotor induzieren kann, wird der Promotorbereich dieser SAP4-6-Gene mit einem Reportergen kombiniert. Die Expression des Reportergens kann entweder durch die Zugabe des gereinigten Ca- TECl-Proteins oder durch die Expression der das Ca- TECl-Protein kodierenden erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen induziert werden, wobei das CaTECl- Protein unter geeigneten Bedingungen an den Promo- torbereich bindet und die Expression des Reportergens induziert. Die Induzierbarkeit des in dem Testsystem verwendeten Systems zur Expression des Reportergens wird dann in Ab- oder Anwesenheit von zu testenden Substanzen überprüft. Mit Hilfe von Naturstoff- und Substanzbibliotheken können somit geeignete Inhibitoren detektiert werden, die die Funktion des CaTECl-Proteins oder die Expression der erfindungsgemäßen, das CaTECl-Protein kodierenden Nukleotidsequenzen inhibieren. Auf diese Weise lassen sich also Substanzen identifizieren, die potentielle Medikamente zur Bekämpfung von Candida- Infektionen darstellen.A preferred substance screening method of the present invention comprises an assay which is structured as follows: The promoters of the isogens of the secreted aspartyl proteinase types 4, 5 and 6 (SAP5-6 genes) contain a "head interspersed with separating elements to tail "arrangement of TCS motifs, which represents the binding site for fungal TEA / ATTS transcription factors, in particular the CaTECl factor according to the invention. Since it could be shown in accordance with the invention that the Ca-TEC1 protein can induce the expression of the SAP4-6 ~ genes by binding to the promoter, the promoter region of these SAP4-6 genes is combined with a reporter gene. The expression of the reporter gene can be induced either by the addition of the purified Ca-TECl protein or by the expression of the nucleotide sequences according to the invention encoding the Ca-TECl protein, the CaTECl protein binding to the promoter region under suitable conditions and the expression of the reporter gene induced. The inducibility of the system used in the test system for the expression of the reporter gene is then checked in the absence or presence of substances to be tested. With the help of natural product and substance libraries, suitable inhibitors can thus be detected which inhibit the function of the CaTECl protein or the expression of the nucleotide sequences according to the invention which encode the CaTECl protein. In this way So substances can be identified that represent potential medicines for combating Candida infections.
Ebenso können die erfindungsgemäßen Proteine in Form von Hybridproteinen in herkömmlichen „Two- Hybrid-Systemen" eingesetzt werden, um mit den erfindungsgemäßen Proteinen in Wechselwirkung tretende Proteine zu identifizieren, wobei ein erstes Hybridprotein aus einem erfindungsgemäßen Protein und beispielsweise einer die Transkription eines Reportergens transaktivierenden Domäne hergestellt wird und zusammen mit einem Reportergen und einem zweiten Hybridprotein aus einem ersten Anteil, der das zu untersuchende Protein darstellt und einem zweiten Anteil, der eine DNA-Bindedomäne des transkriptionsaktivierenden Anteils des ersten Hybridproteins darstellt, inkubiert wird. Bei Interaktionen des zu untersuchenden Proteins mit dem erfindungsgemäßen Protein kommt es nun zu einer Asso- ziation der transaktivierenden und der DNA- Bindedomäne, die wiederum die Expression des Reportergens induziert und den Nachweis der Bindung erlaubt. Selbstverständlich sind auch beliebige andere Kombinationen möglich.The proteins according to the invention can likewise be used in the form of hybrid proteins in conventional “two-hybrid systems” in order to identify proteins which interact with the proteins according to the invention, a first hybrid protein comprising a protein according to the invention and for example a domain transactivating the transcription of a reporter gene is produced and is incubated together with a reporter gene and a second hybrid protein from a first portion, which represents the protein to be examined, and a second portion, which is a DNA binding domain of the transcription-activating portion of the first hybrid protein, with interactions of the protein to be examined with The protein according to the invention now has an association of the transactivating and the DNA binding domains, which in turn induces the expression of the reporter gene and permits the detection of the binding Combinations possible.
Die erfindungsgemäßen Proteine sind daher wirksame Mittel zum Screenen pharmakologisch interessanter Substanzen zur Behandlung von Krankheiten, die durch Candida-Arten verursacht werden. Die erfindungsgemäßen Proteine können dabei in isolierter Form, in medizinischen Vorrichtungen, in Drug- Delivery-Vorrichtungen, Matrizen für Drug- Screening-Bibliotheken, Mikrotiterplatten, appli- zierbaren Katalyse-Vorrichtungen oder ähnlichem Anwendung finden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine mutierte Candida albicans-Zelle , die dadurch gekennzeichnet ist, dass in ihr die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen o- der deren regulatorische Bereiche so verändert sind, dass kein Transkript der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nachweisbar ist.. Die erfindungsgemäß modifizierte Candida albicans-Zelle kann sowohl eine haploide Zelle, wobei die in nur einer Kopie vorliegende erfindungsgemäße Nukleotidsequenz verändert oder mutiert ist, als auch eine" diploide Zelle sein, bei der beide Kopien der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz so verändert oder mutiert sind, dass es sich um eine homozygote Nullmutante handelt. Dabei kann es sich sowohl um eine natürliche Zellmutante als auch eine mit Hilfe technischer Mittel erzeugte Mutante, beispielsweise eine mit Hilfe von homologen Rekombinationen, Antisense- Verfahren oder ähnlichem hergestellte Mutante han- dein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung homozygote ura3/ura3 catecl/ca tecl (pVEC) -Nullmutante CaASlδ, die mittels sequentieller homologer Rekombination erzeugt wurde und bei der DSMZ in Braunschweig un- ter der Nr. DSM 13722 am 6.9.2000 hinterlegt wurde.The proteins according to the invention are therefore effective agents for screening pharmacologically interesting substances for the treatment of diseases caused by Candida species. The proteins according to the invention can be used in isolated form, in medical devices, in drug delivery devices, matrices for drug screening libraries, microtiter plates, applicable catalysis devices or the like. A further preferred embodiment of the present invention relates to a mutated Candida albicans cell, which is characterized in that the nucleotide sequences according to the invention or their regulatory regions are changed in such a way that no transcript of the nucleotide sequence according to the invention can be detected. The Candida modified according to the invention albicans cell can be both a haploid cell, the nucleotide sequence according to the invention present in only one copy being changed or mutated, and a " diploid cell, in which both copies of the nucleotide sequence according to the invention are changed or mutated in such a way that it is a homozygous one This can be both a natural cell mutant and a mutant generated using technical means, for example a mutant produced using homologous recombinations, antisense methods or the like. In a particularly preferred one In the embodiment, the present invention relates to homozygous ura3 / ura3 catecl / ca tecl (pVEC) zero mutant CaASlδ, which was generated by means of sequential homologous recombination and was deposited with the DSMZ in Braunschweig on September 6, 2000 under the number DSM 13722.
Die erfindungsgemäße mutierte Candida albicans- Zelle ist dadurch gekennzeichnet, dass ihre Lebensfähigkeit, Koloniegröße und Verdopplungszeit im Vergleich zur Wildtyp-Zelle nicht oder nur unwe- sentlich verändert sind. Eine erfindungsgemäß mutierte Candida albicans-Zelle ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass ihr filamentöses Wachstum beeinträchtigt ist, wobei insbesondere die Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen unter- drückt ist. Erfindungsgemäß mutierte Zellen bilden stattdessen gebogene tubuläre Strukturen, die an den Zell-Zell-Grenzen Einschnürungen aufweisen und somit morphologische Pseudohyphen darstellen. Neben den morphologischen Veränderungen sind solche mutierten Candida albicans-Zellen dadurch charakterisiert, dass in ihnen die Expression der SAP4-6-Gene nicht induzierbar ist. Bei einer systemischen Infektion in einem Maus-Modell für systemische Candi- da-Mykosen zeigt sich, dass die Virulenz der erfindungsgemäßen homozygoten catecl-Zellmutante von Candida albicans im Vergleich zu Wildtyp-Zellen signifikant unterdrückt ist.The mutated Candida albicans cell according to the invention is characterized in that its viability, colony size and doubling time are not or only slightly changed compared to the wild-type cell. A Candida albicans cell mutated according to the invention is particularly characterized in that its filamentous growth is impaired, the formation of germ tubes and true hyphae in particular presses. Instead, mutated cells according to the invention form curved tubular structures which have constrictions at the cell-cell boundaries and thus represent morphological pseudohyphae. In addition to the morphological changes, such mutated Candida albicans cells are characterized in that the expression of the SAP4-6 genes cannot be induced in them. A systemic infection in a mouse model for systemic Candida mycoses shows that the virulence of the homozygous catecl cell mutant of Candida albicans according to the invention is significantly suppressed in comparison to wild-type cells.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung von lebenden mutierten oder veränderten Candida albicans- Zellen, insbesondere der catecl/catecl-Nullmutante CaAS18," mit einer Mutation in den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, so dass diese Nukleotidsequen- zen unter Transkriptionsbedingungen kein Transkript erzeugen können- und die Zellen gegenüber Wildtyp- Stämmen eine erheblich reduzierte Virulenz zeigen, als Impfstoff oder Vakzine im Rahmen einer Schutzimpfung zur Erzeugung einer belastbaren Krankheits- immunität gegen Infektionen von Candida-Wildtyp- Stämmen, insbesondere von Candida albicans . Dabei sind die Lebendvakzine vorzugsweise mit Hilfe weiterer geeigneter Mittel so abgeschwächt, dass beispielsweise ihre Vermehrungsfähigkeit beseitigt ist. Die Verabreichung einer derart abgeschwächten Lebendvakzine kann beispielsweise parenteral, lokal, insbesondere oral, nasal, kutan oder mittels Inhalation, erfolgen. Die Verabreichung verfolgt das Ziel einer insbesondere lokalen Infektabwehr an Schleimhäuten durch Bildung sekretorischer Antikörper und durch Erhöhung der Makrophagen-Aktivität .A preferred embodiment of the present invention therefore relates to the use of living mutated or modified Candida albicans cells, in particular the catecl / catecl zero mutant CaAS18, " with a mutation in the nucleotide sequences according to the invention, so that these nucleotide sequences cannot generate a transcript under transcription conditions - And the cells show a significantly reduced virulence compared to wild-type strains, as a vaccine or vaccine as part of a protective vaccination to produce a resilient disease immunity against infections of wild-type Candida strains, in particular Candida albicans. The live vaccines are preferably with the help Other suitable agents are weakened in such a way that, for example, their ability to reproduce is eliminated The administration of such a weakened live vaccine can take place, for example, parenterally, locally, in particular orally, nasally, cutaneously or by inhalation hung pursues the goal of local infection control, in particular Mucous membranes through the formation of secretory antibodies and by increasing macrophage activity.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren erläutert.The invention is illustrated by the following examples and figures.
Figur 1 zeigt die Ergebnisse einer Northern Blot- Analyse der CaTECl-Expression in C. albicans .FIG. 1 shows the results of a Northern blot analysis of the CaTECl expression in C. albicans.
Zur Northern-Blot-Anlayse wurde RNA aus dem Wildtypstamm SC5314 während der log-Wachstumsphase in YPD-Medium bei 28 °C (Laufspur 1) oder nach 45-, 90- und 300-minütigem Wachstum bei 37 °C in RPM1-1640- Flüssigkulturmedium, das mit Serum angereichert worden war, extrahiert (Laufspuren 2-4). Die Blots wurden mit CaTECl und ACT1, das als Kontrolle diente, hybridisiert.For Northern blot analysis, RNA from the wild-type strain SC5314 during the log growth phase in YPD medium at 28 ° C. (lane 1) or after 45, 90 and 300 minutes of growth at 37 ° C. in RPM1-1640- Liquid culture medium, which had been enriched with serum, extracted (running tracks 2-4). The blots were hybridized with CaTECl and ACT1, which served as a control.
Figur 2 zeigt, dass das CaTECl-Gen von C. albicans ein funktionelles Homolog des TECl-Gens von S. ce- revisiae ist.FIG. 2 shows that the CaTECl gene from C. albicans is a functional homologue of the TECl gene from S. ce-revisiae.
(A) zeigt, dass Ca TECl das pseudohyphale Wachstum in diploiden S. cerevisiae-Zellen, die eine TECI- Deletion aufweisen, wiederherstellen kann. Das pseudohyphale Wachstum der Stämme auf SLAD-Medium mit Uracil ist nach 48-stündiger Inkubation bei 30 °C gezeigt. Bei den Stämmen handelte es sich um L5791 (TEC1/TEC1, pRS425, pRS313), L6146 (TEC1/TEC1, pRS425) und L6146 (TEC1/TEC1, pRS425 CaTECl).(A) shows that Ca TECl can restore pseudohyphal growth in diploid S. cerevisiae cells that have a TECI deletion. The pseudohyphal growth of the strains on SLAD medium with uracil is shown after 48 hours of incubation at 30 ° C. The strains were L5791 (TEC1 / TEC1, pRS425, pRS313), L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425) and L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425 CaTECl).
(B) zeigt, dass CaTECl das invasive Wachstum von haploiden und diploiden S . cerevisiae-Zellen mit TECl-Deletionen wiederherstellen kann. Das invasive Wachstum von Stämmen, die 24 Stunden bei 30 °C auf YPID-Medium inkubiert wurden, ist vor (A) und nach Waschen (B) gezeigt. Bei den Stämmen in der oberen Reihe handelt es sich um die haploiden Stämme (MAT a) 10560-2B (TECl), pRS425, pRS313) , L6149 (TECl, pRS425) und L6149 (TECl, pRS425 CaTECl) . Bei den Stämmen in der unteren Reihe handelt es sich um die diploiden Stämme (MAT a/α) L5791 (TEC1/TEC1, PRS425, pRS313), L6146 (TEC1/TEC1, pRS425) und L6146 (TEC1/TEC1, PRS425 CaTECl) .(B) shows that CaTECl is the invasive growth of haploid and diploid S. can restore cerevisiae cells with TECl deletions. The invasive growth of strains that occur 24 hours at 30 ° C YPID medium was shown before (A) and after washing (B). The strains in the top row are the haploid strains (MAT a) 10560-2B (TECl), pRS425, pRS313), L6149 (TECl, pRS425) and L6149 (TECl, pRS425 CaTECl). The strains in the bottom row are the diploid strains (MAT a / α) L5791 (TEC1 / TEC1, PRS425, pRS313), L6146 (TEC1 / TEC1, pRS425) and L6146 (TEC1 / TEC1, PRS425 CaTECl).
(C) zeigt das CaTECl die FLOll-lacZ-Expression in haploiden und diploiden S. cerevisiae-Zellen mit TECl-Deletionen induziert. Die Stämme wurden 48 Stunden bei 30 °C in SC-Medium gezüchtet. Anschließend wurden ß-Galaktosidase-Tests durchgeführt. Bei den verwendeten Stämmen handelt es sich um die haploiden (MAT a) -Stämme 10560-2B (TECl, pRS425, pRS313, B3782), L6149 (TECl,. pRS425, B3782) und L6149 (TECl, pRS425 CaTECl , B3782) und die diploiden (MAT a/α) -Stämme L5791 (TECl/TECl, pRS425, pRS313, B3782), 6146 (TECl/TECl, pRS425, B3782) und L6146 (TECl/TECl, pRS425 Ca TECl , B3782) . Die Einheiten wurden bezüglich des haploiden Wildtyps beziehungsweise des diploiden Wildtypes normalisiert .(C) shows the CaTECl induced FLOll-lacZ expression in haploid and diploid S. cerevisiae cells with TECl deletions. The strains were grown in SC medium at 30 ° C for 48 hours. Then β-galactosidase tests were carried out. The strains used are the haploid (MAT a) strains 10560-2B (TECl, pRS425, pRS313, B3782), L6149 (TECl ,. pRS425, B3782) and L6149 (TECl, pRS425 CaTECl, B3782) and the diploid (MAT a / α) strains L5791 (TECl / TECl, pRS425, pRS313, B3782), 6146 (TECl / TECl, pRS425, B3782) and L6146 (TECl / TECl, pRS425 Ca TECl, B3782). The units were normalized with regard to the haploid wild type and the diploid wild type.
Figur 3 zeigt, wie das Ca TECl -Gen in C. albicans inaktiviert wurde.Figure 3 shows how the Ca TECl gene was inactivated in C. albicans.
(A ) Der offene Leserahmen für Ca TECl zwischen den Bglll und EcoRV-Schnittstellen wurde durch eine hisG-URA3-hisG-Deletionskassette ersetzt. Pl und P2 sind Oligonukleotid-Bindungsstellen für TECE- genPCR.01 beziehungsweise TEClgenPCR.02, die zur PCR-Amplifikation des CaTECl-Gens verwendet wurden. Sonde: Position des Nsil-Fragmentes, das als Sonde zur Hybridisierung verwendet wurde.(A) The open reading frame for Ca TECl between the Bglll and EcoRV interfaces was replaced by a hisG-URA3-hisG deletion cassette. PI and P2 are oligonucleotide binding sites for TECEgenPCR.01 and TEClgenPCR.02, respectively, which were used for the PCR amplification of the CaTECl gene. Probe: Location of the Nsil fragment used as a hybridization probe.
(B) zeigt einen Southern-Blot von schrittweise hergestellten isogenen Mutanten mit einem CaTECl- Fragment als Sonde (Sonde, Figur 3A) . Die Nsil- verdaute DNA stammte aus den folgenden Stämmen: CA1-4 { Ca TECl/CaTECl) = Laufspur 1; CaASl, CaAS3, CaAS4 (allesamt Ca TECl/CaTECl : : hisG-URA3-hisG) = Laufspuren 2-4; CaAS12, CaAS13, CaAS14 (allesamt Ca TECl : : hisG/ CaTECl : :hisG~URA3-hisG) = Laufspuren 5-7; CaASl5 { Ca TECl : : hisG/ Ca TECl : : hisG) = Laufspur(B) shows a Southern blot of stepwise produced isogenic mutants with a CaTECl fragment as a probe (probe, Figure 3A). The Nsil digested DNA was from the following strains: CA1-4 {Ca TECl / CaTECl) = lane 1; CaASl, CaAS3, CaAS4 (all Ca TECl / CaTECl:: hisG-URA3-hisG) = tracks 2-4; CaAS12, CaAS13, CaAS14 (all Ca TECl:: hisG / CaTECl:: hisG ~ URA3-hisG) = lanes 5-7; CaASl5 {Ca TECl:: hisG / Ca TECl:: hisG) = lane
(C) zeigt die Northern-Analyse der Ca TECl - Expression der Revertante CaAS20 { CaTECl/CaTECl pVEC-CaTECl) und der Mutante CaAS18 { Ca TECl/CaTECl pVEC) während des Wachstums in der Log-Phase in YPD Medium bei 28 °C (Laufspuren 1, 5) und nach 45- minütigem (Laufspuren 2, 6) , 90-minütigen (Laufspuren 3, 7) und 300-minütigen (Laufspuren 4, 8) Wachstum in flüssigem Kulturmedium, das mit Serum angereichert worden war, bei 37 °C. Die ACT1- Expression wurde zur Kontrolle analysiert und ist in den beiden unteren Bildern gezeigt.(C) shows the Northern analysis of the Ca TECl expression of the revertant CaAS20 {CaTECl / CaTECl pVEC-CaTECl) and the mutant CaAS18 (Ca TECl / CaTECl pVEC) during the growth in the log phase in YPD medium at 28 ° C. (Lanes 1, 5) and after 45 minutes (lanes 2, 6), 90 minutes (lanes 3, 7) and 300 minutes (lanes 4, 8) of growth in liquid culture medium that had been enriched with serum 37 ° C. The ACT1 expression was analyzed as a control and is shown in the two lower images.
Figur 4 zeigt die Suppression der Hyphenbildung durch eine Mutation des Ca TECl-Gens. Der Stamm CaAS20 { CaTECl/CaTECl pVEC-CaTEClJ (linkes Bild) und die Mutante CaAS18 { CaTECl/Ca TECl pVEC) (rechtes Bild) wurden in RPMl-1640-Flüssigmedium, das mit Serum angereichert worden war, bei 37 °C über- impft und nach 90 Minuten (a, d) , 3 Stunden (b, e) , und 12 Stunden (c, f) auf die Entwicklung von Hyphen überprüft. Die Pfeile in (e) zeigen Beispie- le für Zellwand-Konstriktionen zwischen pseudo- hyphalen Zellen.FIG. 4 shows the suppression of the formation of hyphae by a mutation of the Ca TECl gene. The strain CaAS20 {CaTECl / CaTECl pVEC-CaTEClJ (left picture) and the mutant CaAS18 {CaTECl / Ca TECl pVEC) (right picture) were transferred in RPMl-1640 liquid medium, which had been enriched with serum, at 37 ° C. vaccinated and checked for the development of hyphae after 90 minutes (a, d), 3 hours (b, e) and 12 hours (c, f). The arrows in (e) show examples of le for cell wall constrictions between pseudo-hyphal cells.
Figur 5 zeigt die Wechselwirkung zwischen C. albicans und primären MΦ-Zellen. Die Revertante CaAS20. { Ca TECl/Ca TECl pVEC-Ca TECl ) (linkes Bild) und die Mutante CaASl8 { Ca TECl/CaTECl pVEC) (rechtes Bi_ld) wurden zu primären MΦ-Zellkulturen für 8 Stunden (a, b) und 24 Stunden (c, d) hinzugegeben. CaAS20 umgeht die MΦ und bildet Keimschläuche und lange Filamente, während CaAS18 sich in MΦ anreichert (Pfeile in d) .Figure 5 shows the interaction between C. albicans and primary MΦ cells. The revertante CaAS20. {Ca TECl / Ca TECl pVEC-Ca TECl) (left picture) and the mutant CaASl8 {Ca TECl / CaTECl pVEC) (right picture) became primary MΦ cell cultures for 8 hours (a, b) and 24 hours (c, d) added. CaAS20 bypasses the MΦ and forms germ tubes and long filaments, while CaAS18 accumulates in MΦ (arrows in d).
Figur 6 zeigt die Ergebnisse einer Northern Analyse der SAP4-6 und EFGl Expression in dem Wildtypstamm SC5314, in CaAS20 und in der Mutante CaAS18 während der log-Wachstumsphase in YPD-Medium bei 28 °C (Laufspuren 1, 5, 9) und nach 45 Minuten (Laufspuren 2, 6, 10), 90 Minuten (Laufspuren 3, 7, 11) und 300 Minuten (Laufspuren 4, δ, 12) Wachstum in flüssigen Kulturmedien, die mit Serum angereichert wa- ren, bei 30°C. Die ACTl-Hybridisierung als Kontrolle ist in den Figuren 1 und 3 C gezeigt.FIG. 6 shows the results of a Northern analysis of the SAP4-6 and EFG1 expression in the wild-type strain SC5314, in CaAS20 and in the mutant CaAS18 during the log growth phase in YPD medium at 28 ° C. (lanes 1, 5, 9) and after 45 minutes (tracks 2, 6, 10), 90 minutes (tracks 3, 7, 11) and 300 minutes (tracks 4, δ, 12) growth in liquid culture media enriched with serum at 30 ° C. The ACT1 hybridization as a control is shown in FIGS. 1 and 3C.
Figur 7 zeigt die Ergebnisse von Virulenz-Tests von BALB/c-Mäusen, die entweder mit dem Mutantenstamm CaAS18 Ca TECl/Ca TECl (pVEC) (nicht ausgefüllte Quadrate oder Kreise) oder der Revertante CaAS20 CaTECl/CaTECl (pVEC-CaTECl) (schwarze Quadrate oder Kreise) infiziert worden waren.FIG. 7 shows the results of virulence tests of BALB / c mice which were carried out either with the mutant strain CaAS18 Ca TECl / Ca TECl (pVEC) (open squares or circles) or with the revertant CaAS20 CaTECl / CaTECl (pVEC-CaTECl) ( black squares or circles).
(A) zeigt die Pilzbelastung (log CFU) in Vaginalspülungen von Mäusen nach vaginaler Inokulation mit 5 x 104 C. al-bicans-Zellen (n=5) . Dargestellt sind die Daten aus zwei unabhängigen Experimenten. (B) zeigt die Überlebenskurven von Mäusen (n=10) , deneh 5 x 105 C. albicans-Zellen injiziert worden waren.(A) shows the fungal load (log CFU) in vaginal douches of mice after vaginal inoculation with 5 x 10 4 C. al-bicans cells (n = 5). The data from two independent experiments are shown. (B) shows the survival curves of mice (n = 10) after 5 x 10 5 C. albicans cells had been injected.
Figur 8 zeigt zwei mikroskopische Fluoreszenzauf- nahmen von C. al.hica.ns-Zellen nach Anfärbung mit Calcofluor white, die aus KOH-solubilisierten Vaginalspülungen (Vag.) und Nieren (i.v.) aufgereinigt worden waren.FIG. 8 shows two microscopic fluorescence images of C. al.hica.ns cells after staining with Calcofluor white, which had been purified from KOH-solubilized vaginal douches (vag.) And kidneys (iv.).
Bilder a und c : - ,Revertante CaAS20 { CaTECl/Ca TECl pVEC-CaTECl; .Figures a and c: -, revertant CaAS20 {CaTECl / Ca TECl pVEC-CaTECl; ,
Bilder b, d und e: Mutante CaASlδ { CaTECl/CaTECl pVEC) .Pictures b, d and e: mutant CaASlδ {CaTECl / CaTECl pVEC).
Figur 9 zeigt die Ergebnisse von Northern-Blot- Analysen von RNA, der avirulenten Mutante Can61 {ΔCaTECl) (CaASlδ) und der virulenten Mutante Can62 (CaAS20), die in 10% FCS enthaltendem RPM1-1640- Medium über unterschiedlich lange Zeiträume kultiviert worden waren. Die Northern-Blots wurden mit Sonden für die C. albicans-spezifischen Gene HWP1 und ALS 1, 3, 8 hybridisiert. Zur Kontrolle folgte eine Hybridisierung mit einer CaTECl-Sonde und mit einer ACTl-Sonde.FIG. 9 shows the results of Northern blot analyzes of RNA, the avirulent mutant Can61 {ΔCaTECl) (CaASlδ) and the virulent mutant Can62 (CaAS20), which were cultured in RPM1-1640 medium containing 10% FCS over different periods of time were. The Northern blots were hybridized with probes for the C. albicans-specific genes HWP1 and ALS 1, 3, 8. A hybridization with a CaTECl probe and with an ACTl probe followed as a control.
Das zu dieser Lehre gehörende Sequenzprotokoll umfasst:The sequence listing for this teaching includes:
SEQ ID Nr. 1 zeigt die 4216 Nukleotide umfassende DNA-Sequenz eines genomischen Klons des CaTECl-Gens aus Candida albicans .SEQ ID No. 1 shows the 4216 nucleotide DNA sequence of a genomic clone of the CaTECl gene from Candida albicans.
SEQ ID Nr. 2 zeigt den 2229 Nukleotide umfassenden proteinkodierenden Bereich des genomischen Klons aus SEQ ID Nr. 1 (bp 953 bis 3181, bezogen auf SEQ ID Nr. 1 ATG-Start: 953-955, Stopcodon: 3182-3184).SEQ ID No. 2 shows the 2229 nucleotide protein coding region of the genomic clone from SEQ ID No. 1 (bp 953 to 3181, based on SEQ ID No. 1 ATG-Start: 953-955, stop codon: 3182-3184).
SEQ ID Nr. 3 zeigt das 5' -Regulationselement des CaTECl-Gens von SEQ ID Nr. 1 (bp 1 bis 952 bezogen auf SEQ ID Nr. 1) .SEQ ID No. 3 shows the 5 'regulatory element of the CaTECl gene from SEQ ID No. 1 (bp 1 to 952 based on SEQ ID No. 1).
SEQ ID Nr. 4 zeigt die aus einem offenen Leseraster (SEQ ID Nr. 2) von SEQ ID Nr. 1 abgeleitete 743 A- minosäuren umfassende Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen CaTECl-Proteins .SEQ ID No. 4 shows the amino acid sequence of the CaTEC1 protein according to the invention comprising 743 amino acids derived from an open reading frame (SEQ ID No. 2) of SEQ ID No. 1.
SEQ ID Nr. 5 zeigt die Sequenz des Primers TEClgenPCR.01, der zur Isolierung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz des CaTECl-Gens verwendet wurde.SEQ ID No. 5 shows the sequence of the primer TEClgenPCR.01, which was used to isolate the DNA sequence according to the invention of the CaTECl gene.
SEQ ID Nr. 6 zeigt die Sequenz des Primers TEClgenPCR.02, der zur Isolierung der erfindungsge- mäßen DNA-Sequenz des CaTECl-Gens verwendet wurde.SEQ ID No. 6 shows the sequence of the primer TEClgenPCR.02, which was used to isolate the DNA sequence according to the invention of the CaTECl gene.
SEQ ID Nr. 7 zeigt das 3 ' -Regulationselement des erfindungsgemäßen CaTECl-Proteins von SEQ ID Nr. 1 (bp 3185-4216 bezogen auf SEQ ID Nr. 1) .SEQ ID No. 7 shows the 3 'regulatory element of the CaTEC1 protein according to the invention from SEQ ID No. 1 (bp 3185-4216 based on SEQ ID No. 1).
SEQ ID Nr. 8 zeigt die Sequenz einer zur Diagnose von Candida-Infektionen geeigneten CaTECl- spezifischen Nukleinsäuresonde.SEQ ID No. 8 shows the sequence of a CaTECl-specific nucleic acid probe suitable for the diagnosis of Candida infections.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die Sequenz einer weiteren zur Diagnose von Candida-Infektionen geeigneten Nukleinsäuresonde . Beispiel 1SEQ ID No. 9 shows the sequence of a further nucleic acid probe suitable for the diagnosis of Candida infections. example 1
Klonierung und Expression des Ca!EEC2-GensCloning and expression of the Ca! EEC2 gene
Zur Amplifizierung der CaTECl-Gens mit Hilfe des PCR-Verfahrens wurden die Primer TEClgenPCR.01 mit " der Sequenz:To amplify the CaTECl gene using the PCR method, the primers TEClgenPCR.01 with " the sequence:
5'-TTTTCTATTCTAACCACCCTCTGC-3' (SEQ ID Nr. 5)5'-TTTTCTATTCTAACCACCCTCTGC-3 '(SEQ ID No. 5)
sowie der'-Primer TEClgenPCR.02 mit der folgenden Sequenz:and the 'primer TEClgenPCR.02 with the following sequence:
5'-CCCGCCTTGCCCCTCTT-3' (SEQ ID Nr. 6)5'-CCCGCCTTGCCCCTCTT-3 '(SEQ ID No. 6)
verwendet. Mittels dieser Primer wurde ein 4.2 kb- Fragment aus genomischer DNA des Stammes CA1-4 (Fonzi und Irwin, Genetics (1993) 134, 717-728) unter Verwendung des LongRange-PCR-Kits (Boehringer, Deutschland) gewonnen. Das PCR-Produkt wurde in die EcoRV-Stelle des Vektors pGEM-T-Easy (Promega, Deutschland) subkloniert, wobei das bei DSMZ hinterlegte Plasmid p275 erhalten wurde. Das Notl- Fragment des Plasmids p275, das die CaTECl-Sequenz enthielt, wurde in die Notl-Stelle des Vektors pRS425 (Christiansen et al., Gene, 110 (1992), 119- 122) kloniert, wobei der Vektor pRS425CaTECl zur Komplementationsanalyse in S. cerevisiae erhalten wurde.used. Using these primers, a 4.2 kb fragment was obtained from genomic DNA of the CA1-4 strain (Fonzi and Irwin, Genetics (1993) 134, 717-728) using the LongRange-PCR-Kit (Boehringer, Germany). The PCR product was subcloned into the EcoRV site of the vector pGEM-T-Easy (Promega, Germany), whereby the plasmid p275 deposited with DSMZ was obtained. The NotI fragment of plasmid p275, which contained the CaTEC1 sequence, was cloned into the NotI site of the vector pRS425 (Christiansen et al., Gene, 110 (1992), 119-122), the vector pRS425CaTECl for complementation analysis in S. cerevisiae was obtained.
Das Bglll-EcoRV-Fragment des Plasmids p275, das den CaTECl-ORF (offenen Leserahmen, 2229 bp Länge, SEQ ID Nr. 2) enthielt, wurde gegen das 3,5 kb Bglll- Sall-Fragment einer hisG-URA3-hisG-Kassette ausgetauscht, die von dem Plasmid pMB7 (Fonzi und Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728) erhalten wurde, wo- bei das Plasmid p277 erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit Notl gespalten und In den ura~ - C. albi- cans-Stamm CA1-4 transformiert, um so den kodierenden Bereich eines der chromosomalen CaTECl-Allele mit der hisG-URA3-hisG-Kassette mittels homologer Rekombination zu ersetzen. Auf einem selektiven ura~-Medium wurden Ura+-Tranformanten ausgewählt. Mittels Southern-Blot-Analyse wurde die Integration der Kassette in den CaTECl-Locus bestätigt. Auf ei- nem Medium, das 5-Fluoroorotsäure enthielt, wurden spontan entstandene ura~~-Derivate selektiert. Diese Klone wurden mittels Southern-Blot-Hybridisierung durchmustert, um die Klone zu identifizieren, die das URA3-Gen mittels intrachromosomaler Rekombina- tion verloren hatten, die durch die hisG- Wiederholungssequenzen vermittelt worden war. Dieses Verfahren wurde wiederholt, um das andere funktioneile Allel von CaTECl zu deletieren. Dabei wurde die homozygote catecl : :hisG/catecl: :hisG-Mutante (eine dieser homozygoten Mutanten wurde als CaAS15 bezeichnet) erhalten. Die Mutante CaASlδ wurde entweder mit dem Vektor pVEC transformiert, wobei der Stamm CaASlδ erhalten wurde, oder mit dem Vector pVEC-CaTECl, der das CaTECl-Gen .enthielt, wobei der Stamm CaAS20 erhalten wurde.The BglII-EcoRV fragment of plasmid p275, which contained the CaTECl-ORF (open reading frame, 2229 bp in length, SEQ ID No. 2), was against the 3.5 kb BglII-Sall fragment of a hisG-URA3-hisG- Replaced cassette obtained from the plasmid pMB7 (Fonzi and Irwin, Genetics, 134 (1993), 717-728), where plasmid p277 was obtained. This plasmid was cleaved with NotI and transformed into the ura ~ - C. albicans strain CA1-4 so as to replace the coding region of one of the chromosomal CaTECl alleles with the hisG-URA3-hisG cassette by means of homologous recombination. Ura + transformants were selected on a selective ura ~ medium. The integration of the cassette into the CaTECl locus was confirmed by means of Southern blot analysis. Spontaneously generated ura ~~ derivatives were selected on a medium containing 5-fluoroorotic acid. These clones were screened by Southern blot hybridization to identify the clones that had lost the URA3 gene by intrachromosomal recombination mediated by the hisG repeat sequences. This procedure was repeated to delete the other functional allele from CaTECl. The homozygous catecl:: hisG / catecl:: hisG mutant (one of these homozygous mutants was designated as CaAS15) was obtained. The mutant CaASlδ was transformed either with the vector pVEC to give the strain CaASlδ or with the vector pVEC-CaTECl containing the CaTECl gene to give the strain CaAS20.
Das C. alhicans-Plasmid pVEC-CaTECl wurde konstruiert, indem ein Ncol-Sacl-Fragment des Plasmids p275, das das CaTECl-Gen enthält, in das Plasmid pVEC { Candida albicans, Navarro-Garcia et al . , J. Med. Vet. Mycol 33 (1995), 361-366), das einen Replikationsstartpunkt von Candida albicans und einen selektierbaren CaURA3-Marker enthält und das mit den Restriktionsenzymen Smal und Sacl gespalten worden war, kloniert wurde. Beispiel 2The C. alhicans plasmid pVEC-CaTECl was constructed by inserting an Ncol-Sacl fragment of plasmid p275, which contains the CaTECl gene, into the plasmid pVEC {Candida albicans, Navarro-Garcia et al. , J. Med. Vet. Mycol 33 (1995), 361-366), which contains a replication origin of Candida albicans and a selectable CaURA3 marker and which had been cleaved with the restriction enzymes Smal and Sacl. Example 2
Funktionsanalysen in S. cerevisiaeFunctional analyzes in S. cerevisiae
Hefe-tecl-Mutanten weisen einen Pseudohyphen-Defekt in diploiden und einen Invasionsdefekt in haploiden Stämmen auf. CaTECl wurde in den diploiden S . cere- visiae-Sta m L6146 (tecl/tecl) eingeführt. Es wurde L6146-pRS425CaTECl erhalten. Dieser Stamm wurde auf pseudohyphales Wachstum auf SLAD-Agar getestet. Es konnte gezeigt werden, dass CaTECl den pseudohypha- len Wachstumsdefekt von L6146 komplementieren konnte, wobei der Stamm L6146 das Plasmid ohne CaTECl- Insert enthielt. Ebenso konnte der Invasionswachstumsdefekt des haploiden S. cerevisiae-Stamπxs L6149 (tecl) auf YPD-Agar nach Transformation mit pRS425CaTECl komplementiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass in der Gegenwart von CaTECl nicht nur haploide (MATa) , sondern auch diploide (MATa/α) Mutanten zur Invasion in die Oberfläche des Agars induziert werden konnten. Dies könnte auf eine Überaktivität der TECl-reaktiven Elemente in S . cerevisiae aufgrund hoher CaTECl-Kopienzahl zurückzuführen sein. CaTECl ist in der Lage, die FLOll-Transkription in Abwesenheit von TECl in S . cerevisiae zu aktivieren. Flollp erfordert nämlich Teclp zur Aktivierung und ist wesentlich für das Pseudohyphen- und Invasionswachstum (Lambrechts et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8419- 8424) . In der Gegenwart von CaTECl wurde ein FLOll- lacZ Reporter (Rupp et al., EMBO J (1999) 18, 1257- 1269) sowohl in diploiden (L6146 tecl/tecl pRS425CaTECl) als auch in haploiden (L6149 tecl pRS425CaTECl) S . cerevisiae-Stämmen 7- oder 4-fach induziert. In der Gegenwart von CaTECl wurde ein FG: : TyA-lacZ-Reporter nicht aktiviert, was darauf hindeutet, dass eine Interaktion mit Stecl2p nicht stattfindet, die notwendig wäre, FRE-Elemente zu aktivieren.Yeast tecl mutants have a pseudohyphal defect in diploid and an invasion defect in haploid strains. CaTECl was in the diploid S. cerevisiae-Sta m L6146 (tecl / tecl) introduced. L6146-pRS425CaTECl was obtained. This strain was tested for pseudohyphal growth on SLAD agar. It could be shown that CaTECl could complement the pseudohyphal growth defect of L6146, the strain L6146 containing the plasmid without CaTECl insert. The invasive growth defect of the haploid S. cerevisiae strain L6149 (tecl) on YPD agar was also complemented after transformation with pRS425CaTECl. It could be shown that in the presence of CaTECl not only haploid (MATa) but also diploid (MATa / α) mutants could be induced to invade the surface of the agar. This could be due to an overactivity of the TECl-reactive elements in S. cerevisiae due to high CaTECl copy number. CaTECl is able to transcribe FLOll in the absence of TECl in S. to activate cerevisiae. Flollp namely requires Teclp for activation and is essential for the growth of pseudohyphae and invasions (Lambrechts et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1996) 93, 8419-8424). In the presence of CaTECl, a FLOll-lacZ reporter (Rupp et al., EMBO J (1999) 18, 1257-1269) was found in both diploid (L6146 tecl / tecl pRS425CaTECl) and haploid (L6149 tecl pRS425CaTECl) S. cerevisiae strains induced 7- or 4-fold. In the presence of CaTECl, an FG:: TyA-lacZ reporter was not activated, indicating this indicates that there is no interaction with Stecl2p that would be necessary to activate FRE elements.
Beispiel 3Example 3
Funktionsanalysen in C. albicansFunctional analyzes in C. albicans
Eine sequenzielle homologe Rekombinationen (Fonzi und Irwin, (1993) a.a.O.) wurden durchgeführt, um die beiden CaTECl Allele in C. albicans zu deletie- ren und die homozygote ura3/ura3 catecl/catecl Nullmutante CaASl5 zu erhalten. Die erhaltenen Genotypen wurden durch Southern-Blot-Analyse bestätigt. Northern-Blots zeigten, dass das CaTECl- Transript im Stamm CaASlδ nicht vorhanden war, der durch Transformation eines leeren Plasmids pVEC (Navarro-Garcia et al., (1995) a.a.O.) in CaAS15 erhalten wurde. CaTECl mRNA wurde in dem Stamm CaAS20, der durch Transformation des Plasmids pVEC- CaTECl in CaAS15 erhalten wurde, in Mengen detek- tiert, die denen in Wildtypstämmen entsprechen.Sequential homologous recombinations (Fonzi and Irwin, (1993) op. Cit.) Were carried out in order to delete the two CaTECl alleles in C. albicans and to obtain the homozygous ura3 / ura3 catecl / catecl zero mutant CaASl5. The genotypes obtained were confirmed by Southern blot analysis. Northern blots showed that the CaTECl transript was not present in the CaASlδ strain, which was obtained by transforming an empty plasmid pVEC (Navarro-Garcia et al., (1995) cited above) into CaAS15. CaTECl mRNA was detected in the CaAS20 strain, which was obtained by transforming the plasmid pVEC-CaTECl into CaAS15, in amounts which correspond to those in wild-type strains.
Die Lebensfähigkeit, Koloniegröße und Generationszeit von C. albicans-Zellen in vitro wurde nicht wesentlich dadurch beeinflusst, dass entweder eines oder beide Allele von CaTECl deletiert wurden. Die Deletion beider CATEC1 Allele beeinflusste jedoch das filamentöse Wachstum in vitro negativ. Wenn Hyphenbildung in flüssigem Medium durch Serum bei 37 °C für 1,5 oder 3 Stunden induziert wurde, konnte beobachtet werden, dass die Mutante CaASlδ eine supprimierte Bildung von Keimschläuchen und echten Hyphen aufwies. Statt dessen bildeten diese Zelle gekrümmte tubuläre Strukturen mit Einschnürungen an den Zell-Zellgrenzen aus, die auf eine pseudohyphale Morphologie deuten.The viability, colony size and generation time of C. albicans cells in vitro were not significantly influenced by the fact that either or both alleles were deleted from CaTECl. However, deletion of both CATEC1 alleles negatively affected filamentous growth in vitro. When hyphae formation in liquid medium was induced by serum at 37 ° C for 1.5 or 3 hours, it could be observed that the mutant CaASlδ had suppressed formation of germ tubes and true hyphae. Instead, these cells formed curved tubular structures with constrictions the cell-cell boundaries, which indicate a pseudohyphal morphology.
Die isogenen catecl/catecl Mutanten konnten weder durch Seruminduktion noch durch Interaktion mit mu- rinen Phagozyten zur Hyphenbildung angeregt werden.The isogenic catecl / catecl mutants could neither be induced by serum induction nor by interaction with murine phagocytes to form hyphae.
24 Stunden nach der Induktion bildete die Mehrheit der mutanten Zellen kurze Filamente. Eine kleinere Fraktion der Zellen entwickelte sich in verzweigte Myzelien. Die gleiche Morphologie des mutanten CaASlδ-Stamms wurde erhalten durch Induktion des hyphalen Wachstums in modifiziertem Lee's Medium bei neutralem pH. Diese Defekte in flüssigem Medium konnten durch Wiedereinführung des CaTECl-Gens auf dem Plasmid pVEC-CaTECl in dem revertanten Stamm CaAS20 revertiert werden.24 hours after induction, the majority of the mutant cells formed short filaments. A smaller fraction of the cells developed into branched mycelia. The same morphology of the mutant CaASlδ strain was obtained by inducing hyphal growth in modified Lee's medium at neutral pH. These defects in liquid medium could be reversed by reintroducing the CaTECl gene on the plasmid pVEC-CaTECl in the revertant strain CaAS20.
Die Interaktion der Mutanten CaAS18 und der Revertanten CaAS20 Zellen mit inflammatorischen Phagozyten in vitro wurde ebenfalls untersucht. Während einer 8-stündigen Interaktion mit Mφ verlängerten sich CaAS20-Keimschläuche in hyphale Zellen, die offensichtlich dazu dienen, daß sich C. albicans durch Auswachsen der Wirkung von Phagozyten entziehen kann. CaASlδ war nicht in der Lage, sich durch Auswachsen Mφ zu entziehen, wahrscheinlich aufgrund der unterdrückten Bildung verlängerter und filamen- töser Zellen. Cluster von CaASlδ wurden mit Mφ co- localisiert, wahrscheinlich aufgrund der Phagozyto- se durch Mφ. Nach 24 Stunden war die Zahl der C. alhicans-Zellen bei den CaASlδ infizierten Mφ von 1,8 auf 3,9 C. albi cans-Zellen pro infiziertem Mφ angestiegen. Dies deutet darauf hin, dass CaASlδ innerhalb der Wirtszellen ständig wächst. Gelegentlich konnten einige Myzelien in geringer Anzahl be- obachtet werden. Die Mehrzahl der Zellen des Stammes CaAS20 entwickelte sich in typische Myzelien. Hyphales Wachstum wurde durch Mφ nicht inhibiert. CaTEClp ist daher für das Auswachsen von C. albi- cans von Mφ notwendig.The interaction of the mutants CaAS18 and the revertants CaAS20 cells with inflammatory phagocytes in vitro was also investigated. During an 8-hour interaction with Mφ, CaAS20 germ tubes were lengthened in hyphal cells, which obviously serve to allow C. albicans to evade the action of phagocytes by growing out. CaASlδ was unable to evade Mφ by growth, probably due to the suppressed formation of elongated and filamentous cells. Clusters of CaASlδ were co-localized with Mφ, probably due to the phagocytosis by Mφ. After 24 hours, the number of C. alhicans cells in the CaASlδ infected Mφ had increased from 1.8 to 3.9 C. albi cans cells per infected Mφ. This indicates that CaASlδ is constantly growing within the host cells. Occasionally, a small number of mycelia could be be taken care of. The majority of the cells of the CaAS20 strain developed into typical mycelia. Hyphal growth was not inhibited by Mφ. CaTEClp is therefore necessary for the growth of C. albicans from Mφ.
Überdies konnte eine Expression der mutmaßlichen Zielgene SAP4-6 in CaASlδ Mutanten nicht induziert werden, während der Wildtypstamm SC5314 und der revertante Stamm CaAS20 in vergleichbaren Mengen SAP4-6 mRNA produzierte. 'Ein unterschiedliches Resultat wurde erhalten, wenn eine EFGl-Sonde für eine Northern-Hybridisierung der gleichen RNA-Proben verwendet wurde. Alle drei isogenen Stämme expri- mierten das EFGl Gen. Dies zeigt, dass Teclp nicht erforderlich für die EFGl-Transkription ist. Überdies ist die Wildtypexpression von Efglp nicht ausreichend, ein normales hyphales Wachstum in Abwesenheit von CaTEClp zu gewährleisten, was auf weitere Funktionen von CaTeclp bei der Hyphenbildung hindeutet. Furthermore, expression of the putative target genes SAP4-6 in CaASlδ mutants could not be induced, while the wild-type strain SC5314 and the revertant strain CaAS20 produced SAP4-6 mRNA in comparable amounts. A different result was obtained when an EFG1 probe was used for Northern hybridization of the same RNA samples. All three isogenic strains expressed the EFGl gene. This shows that Teclp is not required for EFGl transcription. Furthermore, the wild-type expression of Efglp is not sufficient to ensure normal hyphal growth in the absence of CaTEClp, which indicates further functions of CaTeclp in the formation of hyphae.
Beispiel 4Example 4
Virulenzanalysen in C. albicansVirulence analysis in C. albicans
Zur Untersuchung der Bedeutung von CaTECl für die Virulenz von C. albicans wurden Mucosa- und systemi- sehe Modelle muriner Candidosen verwendet. BALB/c- Mäuse wurden intravaginal oder intravenös mit CaASlδ- und CaAS20-C. alhicans-Zellen inokuliert. Die Replikation des Pilzes auf der vaginalen Mucosa beziehungsweise die Überlebensrate wurden unter- sucht. Die Deletion beider Allele von CaTECl hatte keine signifikante Auswirkung auf die Zahl der C. al icans-Kolonien-bildenden-Einheiten (CFU) , die aus dem vaginalen Bereich entnommen wurden: Die Kolonisation sowohl mit CaAS20-als auch mit CaASlδ- Zellen führte zu vergleichbaren CFU-Werten an den Tagen 7 und 21. Eine genauere mikroskopische Untersuchung von mit Calcofluor-Weiß gefärbten C. albi cans-Zellen aus vaginalen Spülungen zeigte, dass beide Stämme in vergleichbarer filamentöser Form wuchsen. Offensichtlich ist C. albicans in Abwesenheit von CATEC1 in der Lage, auf der vaginalen Mucosa der Maus zu überleben und sich zu vermehren.Mucosa and systemic models of murine candidiasis were used to investigate the importance of CaTECl for the virulence of C. albicans. BALB / c mice were intravaginally or intravenously with CaASlδ- and CaAS20-C. alhicans cells inoculated. The replication of the fungus on the vaginal mucosa and the survival rate were examined. Deletion of both CaTECl alleles had no significant effect on the number of C. al icans colony-forming units (CFU) removed from the vaginal area: Colonization with both CaAS20 and CaASlδ cells resulted in comparable CFU values on days 7 and 21. A closer microscopic examination of C. albi cans cells stained with calcofluor white from vaginal douching showed that both strains grew in a comparable filamentous form. Obviously, in the absence of CATEC1, C. albicans is able to survive and reproduce on the vaginal mucosa of the mouse.
In einem Mausmodell für systemische Candidose (Csank et al., Mol Biol Cell (1997) 8, 2539-2547, Csank et al . , Infect Immun (1998) 66, 2713-2721, Timpel et al., J. Bacteriol (2000) 162, 3063-3071) führte die Inokulation mit CAS20-Zellen nach 13 Tagen zu 100%-tiger Mortalität. Demgegenüber überlebten 70 % der mit den mutanten CaASlβ-Zellen infi- zierten Mäuse wenigstens 50 Tage, wobei die überlebenden Tiere keine klinischen Krankheitssymptome zeigten. Eine statistische Untersuchung unter Ver- endung des log-rank-Tests der Überlebens urven zeigte sehr hohe statistische Relevanz (p<0, 0001). 100 x 105 CaAS18-Zellen mussten injiziert werden, um einen vergleichbaren klinischen Verlauf zu erzeugen, wie er bei 5 x 105 CaAS20-Zellen beobachtet wurde .In a mouse model for systemic candidiasis (Csank et al., Mol Biol Cell (1997) 8, 2539-2547, Csank et al., Infect Immun (1998) 66, 2713-2721, Timpel et al., J. Bacteriol (2000 ) 162, 3063-3071) the inoculation with CAS20 cells led to 100% mortality after 13 days. In contrast, 70% of the mice infected with the mutant CaASlβ cells survived at least 50 days, the surviving animals showing no clinical symptoms of the disease. A statistical investigation under The end of the log-rank test of survival urves showed very high statistical relevance (p <0, 0001). 100 x 10 5 CaAS18 cells had to be injected to produce a clinical course comparable to that observed with 5 x 10 5 CaAS20 cells.
Der Gendefekt im CaTECl-Gen hat also nicht nur in vitro für die Hyphenbildung, sondern auch in vivo für die Virulenz von C. albicans schwerwiegende Fol- gen. Eine catecl/oatecl-Mutante ruft bei infizierten Balb/c-Mäusen bei einer Infektionsdosis von 5 x 105 Zellen nur mäßige klinische Zeichen einer systemischen Candidose hervor. Im Gegensatz hierzu verursacht ein isogener Wildtyp-Kontrollstamm be- reits nach 15 Tagen eine 100%-ige Mortalität (mittlere Überlebenszeit = 10 Tage) .The gene defect in the CaTECl gene therefore has serious consequences not only in vitro for the formation of hyphae, but also in vivo for the virulence of C. albicans. A catecl / oatecl mutant calls for an infected dose of infected Balb / c mice 5 x 10 5 cells showed only moderate clinical signs of systemic candidiasis. In contrast, an isogenic wild-type control strain causes 100% mortality after 15 days (mean survival = 10 days).
Ein Vergleich der Morphologie mutanter und rever- tanter Zellen, die aus Nieren infizierter Tiere stammten und mit Calcoflour-Weiß gefärbt worden a- ren zeigte, dass CaAS20 und CaAS18 das gleiche Potential für die Hyphenbildung in vivo aufweisen, d.h., dass Signale des Wirtes, die von C. albicans während der mucosalen oder sytemischen Infektion abgegeben werden, das filamentöse Wachstum in der Abwesenheit von CaTECl induzieren. Überraschenderweise ist die Virulenz in catecl/catecl-Mutanten während der systemischen Infektion signifikant unterdrückt, obgleich eine Hyphenbildung zu beobachten ist. Dies zeigt, dass CaTeclp wichtig für die systemische C. alhicans-Infektion ist, da dieses eine Virulenz-Determinante durch einen Mechanismus reguliert, der sich an die morphologische Umwandlung der Hefeform in die Hyphenform anschließt. Die Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Gen CaTECl sowohl die Hyphenbildung als auch' die Virulenz von C. albicans reguliert.' Die Virulenz scheint durch CaTeclp auf zwei Ebenen reguliert zu sein. Einerseits ist die Expression der Typ 4,5 und 6-Isogene der sezernierten Aspartyl-Proteinasen (SAP 4-6) reguliert, wobei sap4-6 Tripeliriutanten in vivo avirulent zu sein scheinen (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994), 357-368). Zweitens reguliert CaTeclp die Hyphenbildung in vitro und ist notwendig für das schnelle Auswachsen von C. albicans vor' MΦ.A comparison of the morphology of mutant and revertant cells derived from kidneys of infected animals and stained with Calcoflour white showed that CaAS20 and CaAS18 have the same potential for hyphae formation in vivo, ie that signals from the host, that are released by C. albicans during mucosal or systemic infection induce filamentous growth in the absence of CaTECl. Surprisingly, the virulence in catecl / catecl mutants during the systemic infection is significantly suppressed, although hyphal formation can be observed. This shows that CaTeclp is important for systemic C. alhicans infection because it regulates a virulence determinant through a mechanism that follows the morphological conversion of the yeast form to the hyphae form. The results show that gene of the invention CaTECl both the hyphae regulated and 'virulence of C. albicans. ' CaTeclp seems to regulate virulence on two levels. On the one hand, the expression of the type 4,5 and 6 isogens of the secreted aspartyl proteinases (SAP 4-6) is regulated, whereby sap4-6 triple mutants seem to be avirulent in vivo (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 ( 1994), 357-368). Second, CaTeclp regulates hyphae formation in vitro and is necessary for the rapid growth of C. albicans before 'M alb.
Die dargestellten Experimente lassen CaTeclp als ein interessantes Zielmolekül für die Entwicklung neuer Antimycotika, insbesondere pathostatischer Medikamente, erscheinen, insbesondere in Hinblick auf die Entwicklung sytemischer und topischer fungizider Chemotherapien. The experiments shown make CaTeclp an interesting target for the development of new antimycotics, especially pathostatic drugs, especially with regard to the development of systemic and topical fungicidal chemotherapy.
Beispiel 5Example 5
Untersuchung der von CaTECl regulierten GeneInvestigation of the genes regulated by CaTECl
Die Candida albicans-Stämme Canδl {ΔCaTECl ) und Can62 {pCaTECl) wurden der Stammsammlung entnommen, "auf SC-ura-Agarplatten ausgestrichen und zwei Tage im Brutschrank bei 30 °C inkubiert. Danach wurden von den so gewachsenen Kolonien jeweils 5 ml Vorkulturen in SC-ura-Flüssigmedium angeimpft und über Nacht jeweils bei 30 °C und bei 37 °C im Schüttelin- kubator inkubiert. Aus diesen Vorkulturen wurden im Verhältnis 1:100 die Hauptkulturen in je 5 ml YPD- Medium, RPMI-1640 Medium enthaltend 10% FCS und α- Mem-Medium angesetzt, die wiederum bei 30 °C beziehungsweise 37 °C geschüttelt wurden. Beim Hauptver- such erfolgte wie im Vorversuch ein Ausstreichen der Stämme Can61 { ΔCaTECl ) und Can62 {pCa TECl) sowie des Wildtyps Canl4 auf SC-ura-Agarplatten und eine Lagerung bei 30°C für zwei Tage im Brutschrank. Im Unterschied zu den Vorversuchen wurden jeweils 50 ml SC-ura-Flüssigmedium als Vorkultur angeimpft und ausschließlich bei 30 °C im Schüttelinkubator über Nacht geschüttelt. Die Hauptkultur der Canδl {ΔCaTECl) und Can62 {pCa TECl ) -Stämme ergab sich aus einem 1:100 Ansatz aus der entspre- chenden Vorkultur in jeweils 600 ml RMI-1,640- Mediu mit einem Zusatz von 10% FCS. Die Kultivierung erfolgte über einen Zeitraum von 2 bis 16 Stunden sowie über Nacht bei ebenfalls 30 °C im Schüttelinkubator. Zusätzlich wurden 50 ml YPD- Medium mit einer gleichermaßen in SC-ura gewachsenen Übernachtkultur des Wildtypes Canl4 im Verhältnis 1:100 angeimpft. Diese Kultivierung erfolgte ausschließlich über Nacht bei 30 °C im Schüttelinku- bator. Aus den so kultivierten Stämmen wurde Ge- samt-RNA wie nachstehend beschrieben isoliert. Nach LiCl-Fällung wurde die isolierte RNA-Konzentration bestimmt. Die isolierte RNA wurde einer Gele- lektrophorese unterworfen und anschließend zur Durchführung einer Northern-Blot-Analyse auf eine Nylonmembran übertragen.The Candida albicans strains Canδl {ΔCaTECl) and Can62 {pCaTECl) were taken from the strain collection, "spread on SC-ura agar plates and incubated for two days in an incubator at 30 ° C. Then 5 ml of precultures from each of the colonies thus grown were in SC-ura liquid medium was inoculated and incubated overnight in a shaking incubator at 30 ° C. and 37 ° C. The primary cultures were converted from these precultures in a ratio of 1: 100 in 5 ml YPD medium, RPMI-1640 medium 10 % FCS and α-Mem medium, which in turn were shaken at 30 ° C. and 37 ° C. In the main test, as in the previous test, the strains Can61 {ΔCaTECl) and Can62 {pCa TECl) and the wild type Canl4 were streaked out SC-ura agar plates and storage in an incubator for two days at 30 ° C. In contrast to the preliminary tests, 50 ml of SC-ura liquid medium were inoculated as a preculture and only at 30 ° C. in a shaker incubator overnight The main culture of the Canδl {ΔCaTECl) and Can62 {pCa TECl) strains resulted from a 1: 100 batch from the corresponding preculture in 600 ml of RMI-1,640 medium with an addition of 10% FCS. The cultivation was carried out over a period of 2 to 16 hours and overnight at 30 ° C. in a shaking incubator. In addition, 50 ml of YPD medium were inoculated with an overnight culture of the wild type Canl4 grown equally in SC-ura in a ratio of 1: 100. This cultivation was carried out exclusively overnight at 30 ° C. in a shaking bator. Total RNA was isolated from the strains cultivated in this way as described below. After LiCl precipitation, the isolated RNA concentration was determined. The isolated RNA was subjected to gel electrophoresis and then transferred to a nylon membrane for Northern blot analysis.
Anschließend erfolgte eine Hybridisierung mit DNA- Sonden für die Gene Ca TECl, HWPl, ACT1 und ALS 1, 3, 8. Die Ergebnisse dieser Northern-Blot-Analyse sind in Figur 9 dargestellt. Wie aus Figur 9 ersichtlich, wird das Gen HWPl in der avirulenten Mutante Can61, bei der das CaTECl deletiert ist, selbst nach 22-stündiger Inkubation nicht expri- miert. Im Gegensatz dazu wird HWPl in der virulenten Mutante 62 schon nach zweistündiger Kultivierung exprimiert, wobei sich das Expressionsniveau auch nach längerer Kultivierung nicht erhöht. Auch das Gen ALS 1, 3, 8 wird in der avirulenten Mutante Can61 { ΔCa TECl) nicht exprimiert. In der virulenten Mutante Can62 { CaTECl) ist die Expression von ALS 1, 3, 8 nach vierstündiger Kultivierung am höchsten und nimmt während der weiteren Kultivierung ab. Zur Kontrolle wurde die Expression des Aktingenes in den beiden Mutanten überprüft, wobei sich zeigte, dass ACTl sowohl in der avirulenten als auch in der virulenten Mutante bereits nach zwei Stunden exprimiert wird. Aus den Ergebnissen ergibt sich, dass die Expression der Gene HWPl und ALS 1, 3, 8 unter der Kontrolle des Transkriptionsfaktors CaTECl steht, wohingegen die Expression des Aktingenes nicht durch CaTECl reguliert wird. Beispiel 6This was followed by hybridization with DNA probes for the Ca TECl, HWPl, ACT1 and ALS 1, 3, 8 genes. The results of this Northern blot analysis are shown in FIG. 9. As can be seen from FIG. 9, the gene HWPl is not expressed in the avirulent mutant Can61, in which the CaTECl has been deleted, even after 22 hours of incubation. In contrast, HWPl is expressed in the virulent mutant 62 after two hours of cultivation, the expression level not increasing even after prolonged cultivation. The ALS 1, 3, 8 gene is also not expressed in the avirulent mutant Can61 (ΔCa TECl). In the virulent mutant Can62 {CaTECl), the expression of ALS 1, 3, 8 is highest after four hours of cultivation and decreases during further cultivation. As a control, the expression of the actin gene was checked in the two mutants, it being shown that ACT1 is expressed in the avirulent and in the virulent mutant after only two hours. The results show that the expression of the genes HWPl and ALS 1, 3, 8 is under the control of the transcription factor CaTECl, whereas the expression of the actin gene is not regulated by CaTECl. Example 6
Untersuchung von Genen, die durch CaTECl reguliert werden, unter Verwendung eines ChipsExamination of genes regulated by CaTECl using a chip
Wie nachstehend beschrieben, wurde ein Chip herge- stellt, der Nukleinsäuren von Candida albicans enthielt, die entweder Homologien zu Zellwandgenen von Saccharomyces cerevisiae aufwiesen, oder bei denen es sich um bekannte Zellwandgene von Candida albicans handelte. Diese Sonden wurden im 96-Well- Platten-Maßstab mittels PCR amplifiziert und anschließend aufgereinigt . Anschließend wurden die Sonden auf die beschichteten Südes aufgedruckt.As described below, a chip was produced which contained nucleic acids from Candida albicans which either had homologies to cell wall genes from Saccharomyces cerevisiae or which were known cell wall genes from Candida albicans. These probes were amplified by PCR on a 96-well plate scale and then purified. The probes were then printed on the coated south.
25 μg von zwei auf einem Chip zu vergleichenden RNAs wurden wie nachstehend beschrieben unter Ver- Wendung von Oligo (dT) -Primern einer r.eversen Transkription mit Superscript II unterzogen, bei der jeweils unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Nukleotide (Cy3-dCTP und Cy5-dCTP) in die entstehende cDNA eingebaut wurden. Nicht eingebaute Nukleotide wurden anschließend über Microcon-30- Filter abgetrennt. Nach Vereinigung beider Einzelproben erfolgte eine Aufkonzentrierung. Anschließend wurden unter Verwendung von Millipore-Filter (0,45 μm) große Partikel eliminiert.25 μg of two RNAs to be compared on a chip were analyzed as described below using oligo (dT) primers from an r . subjected to inverse transcription with Superscript II, in which differently fluorescence-labeled nucleotides (Cy3-dCTP and Cy5-dCTP) were incorporated into the resulting cDNA. Nucleotides that were not incorporated were then separated off using Microcon 30 filters. After combining the two individual samples, they were concentrated. Large particles were then eliminated using a Millipore filter (0.45 μm).
Anschließend erfolgte eine Hybridisierung. Diese wurde wie folgt durchgeführt. Nachdem eine Petri- schale mit feuchtem Whatman-Papier als Hybridisierkammer vorbereitet und die aufzutragende Probe kurz bei 100 °C denaturiert worden war, wurde die Probe zwischen die Markierungen auf dem DNA-Chip aufgetragen. Dabei entstandene Luftblasen konnten mit einer heißen Nadel zerstört werden. Anschließend wurde ein Deckglas luftblasenfrei aufgelegt und die Kammer vorsichtig mit Parafilm verschlossen. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht in einem 65 °C- Wasserbad, wobei die aufgetragene fluoreszenzmarkierte cDNA bei komplementärer DNA auf dem Chip mit dieser in Wechselwirkung vund Wasserstoffbrückenbin-' düng ausbilden konnte.Hybridization then took place. This was done as follows. After a Petri dish with moist Whatman paper was prepared as a hybridization chamber and the sample to be applied was briefly denatured at 100 ° C, the sample was applied between the markings on the DNA chip. Air bubbles created in the process could be destroyed with a hot needle. A coverslip was then placed without air bubbles and the chamber was carefully sealed with parafilm. Hybridization was carried out overnight in a 65 ° C water bath, wherein the coated fluorescently labeled cDNA v in complementary DNA on the chip with that interact and Wasserstoffbrückenbin- 'could form fertil.
Nicht mittels Hybridisierung auf dem Chip gebundene Probe wurde unter Verwendung von drei Waschschritten bei jeweils niedrigerer Salzkonzentration entfernt. Nach anschließendem Zentrifugieren bei 150 x g über 5 Minuten waren die Chips trocken und konnten im Array-Scanner eingescannt werden.Sample not bound on-chip by hybridization was removed using three washes at lower salt concentrations. After subsequent centrifugation at 150 x g for 5 minutes, the chips were dry and could be scanned in the array scanner.
Die auf dem Objektträger gebundenen Proben konnten über einen speziellen Array-Scanner detektiert werden. Hierbei wurde über zwei Laser Licht unterschiedlicher Wellenlängen ausgesandt, welches die beiden unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffe an- regte. Als Ergebnis lieferte der Scanner zwei Ein-, zelbilder des gleichen Arrays, einmal im roten Laserkanal gescannt und einmal im grünen, wobei die Sonden, an denen durch die Probe, eine Hybridisierung stattfand, jeweils fluoreszierten. Über die Software ImaGene konnte daraus ein sogenannter 0- verlay erzeugt werden. Beide Einzelbilder, die vom Computer übereinandergelegt worden waren, lieferten so ein Bild, bei dem gleiche Genexpressionen als gelbe Datenpunkte erschienen, während unterschied- liehe Genexpressionen entweder als rote oder grüne Datenpunkte erschienen. Diese bildliche Darstellung der Ergebnisse wurde durch eine weitere Auswertung der über den Computer gelieferten Rohdatentabelle ausgeweitet. Hierbei wurde zu jedem fluoreszieren- den Datenpunkt auf dem Array dessen eigene Fluoreszenzintensität und die dazugehörige Hintergrundintensität dargestellt. Der Computer ermittelte diese anhand der Pixel, die über eine um den Datenpunkt gelegte Fläche berechnet wurden. Auf der Grundlage dieser Tabelle war eine weitere Auswertung mittels gängiger PC-Software, beispielsweise Excel, möglich. Anhand der Auswertungen wurden Ergebnisse erhalten, die die Ergebnisse der Northern-Blot- Analyse bestätigten. The samples bound on the slide could be detected using a special array scanner. Here, two lasers of different wavelengths were emitted, which excited the two different fluorescent dyes. As a result, the scanner delivered two single images of the same array, one scanned in the red laser channel and one in the green, with the probes on which the sample hybridized, each fluorescing. Using the ImaGene software, a so-called 0-verlay could be created. Both individual images, which had been superimposed by the computer, provided an image in which the same gene expressions appeared as yellow data points, while different gene expressions appeared either as red or green data points. This visual representation of the results was expanded by a further evaluation of the raw data table delivered via the computer. Here, fluorescence was the data point on the array is represented by its own fluorescence intensity and the associated background intensity. The computer determined these on the basis of the pixels that were calculated over an area around the data point. On the basis of this table, further evaluation using common PC software such as Excel was possible. Based on the evaluations, results were obtained which confirmed the results of the Northern blot analysis.
MATERIALIEN und METHODENMATERIALS and METHODS
1 . Material1 . material
1.1 Biologische Materialien1.1 Biological materials
Canl4: •Wildtyp, klinisches Isolat SC5341[6]Canl4: • wild type, clinical isolate SC5341 [6]
Canδl (Δcatecl) avirulente Mutante CaAS18[26] ura3: : imm43"4/ura3 : : imm434 catecl: :hisG/catecl: :hisG Plasmid pVEC (ARS-URA3)Canδl (Δcatecl) avirulent mutant CaAS18 [26] ura3:: imm43 "4 / ura3:: imm434 catecl:: hisG / catecl:: hisG plasmid pVEC (ARS-URA3)
Can62 (pCaTECl; virulente Mutante CaAS20[26] ura3: : imm43 /ura3: : imm43 catecl: :hisG/catecl : :hisG Plasmid pVEC-CaTECl (ARS-URA3)Can62 (pCaTECl; virulent mutant CaAS20 [26] ura3:: imm43 / ura3:: imm43 catecl:: hisG / catecl:: hisG plasmid pVEC-CaTECl (ARS-URA3)
1.2. Chemikalien, Puffer und Lösungen1.2. Chemicals, buffers and solutions
Wenn nicht anders vermerkt, wurden die verwendeten Chemikalien in p.a. Qualität von der Carl Roth GmbH in Karlsruhe bezogen und das Wasser einer Millipo- re-Anlage entnommen (ddH20) . Alle Lösungen, die zur RNA-Isolation verwendet wurden, wurden mit DEPC-H20 angesetzt.Unless otherwise noted, the chemicals used were purchased in pa quality from Carl Roth GmbH in Karlsruhe and the water was taken from a Millipore system (ddH 2 0). All solutions that were used for RNA isolation were prepared with DEPC-H 2 0.
a) bezogene Puffer und Lösungena) related buffers and solutions
Aldrich: N-Methyl-2-pyrrolidinon wasserfrei 99,5% Bernsteinsäureanhydrid 99+%Aldrich: N-methyl-2-pyrrolidinone anhydrous 99.5% succinic anhydride 99 +%
Eppendorf : Mikrobiologisch reines WasserEppendorf: Microbiologically pure water
Gibco Life Technologies: PBS (lOx) , pH 7 , 4 Sig a Diagnostics: Poly-L-Lysine SolutionGibco Life Technologies: PBS (lOx), pH 7.4 Sig a Diagnostics: Poly-L-Lysine Solution
b) angesetzte Puffer und Lösungenb) prepared buffers and solutions
Churchbuffer: 7% (W/v) SDSChurchbuffer: 7% (w / v) SDS
1% (w/v) BSA1% (w / v) BSA
1 mM EDTA1mM EDTA
250 M Natrium-Phosphat-Puffer pH 7,2250 M sodium phosphate buffer pH 7.2
DEPC-H20 1 ml DEPC in 1 1 ddH0 autoklavierenAutoclave DEPC-H 2 0 1 ml DEPC in 1 1 ddH0
DNA-Ladepuffer (6x) 0,25% BromphenolblauDNA loading buffer (6x) 0.25% bromophenol blue
0,25% Xylene Cyanol FF 30% Glycerol in Wasser0.25% xylene cyanol FF 30% glycerol in water
MOPS (10x) 0,4 M MOPS pH 7,0 0,1 M Natriumacetat 0,5 M EDTA pH 8,0MOPS (10x) 0.4 M MOPS pH 7.0 0.1 M sodium acetate 0.5 M EDTA pH 8.0
Natriumborat 1 M Borsäure mit NaOH auf pH 8,0 einstellenAdjust sodium borate 1 M boric acid to pH 8.0 with NaOH
Phenol festes Phenol in ddH20 lösen bis gesättigtDissolve phenol solid phenol in ddH 2 0 until saturated
RNA-Ladepuffer 50% Glycerol 1 mM- EDTA pH 8,0 0,25% Bromphenolblau 25% Xylene Cyanol FFRNA loading buffer 50% glycerol 1 mM EDTA pH 8.0 0.25% bromophenol blue 25% xylene cyanol FF
SSC (20x) 3 M NaClSSC (20x) 3 M NaCl
300 mM Natrium-Citrat300 mM sodium citrate
TAE (50x) 2 M Tris-Acetat 50 mM EDTA TBE (lOx) 1 M Tris-Borat 10 mM EDTATAE (50x) 2M Tris acetate 50mM EDTA TBE (10x) 1 M Tris-borate 10 mM EDTA
TE 10 mM Tris HCl, pH 7,4 1 M EDTATE 10 mM Tris HCl, pH 7.4 1 M EDTA
TES 10 -mM Tris HCl pH 7 , 5 10 mM EDTA 0,5% SDSTES 10 -mM Tris HCl pH 7.5, 5 10 mM EDTA 0.5% SDS
1.3. EDV-Programme1.3. IT programs
ImaGene ImageQuant ExcelImaGene ImageQuant Excel
1.4. Enzyme1.4. enzymes
Restriktionsenzyme: Boehringer Mannheim EcoRV Gibco Life Technologies BglllRestriction enzymes: Boehringer Mannheim EcoRV Gibco Life Technologies Bglll
New England Biolabs ■ NsilNew England Biolabs ■ Nsil
Modifikationsenzyme: Gibco Life TechnologiesModification enzymes: Gibco Life Technologies
Taq-Polymerase SuperScriptIITaq polymerase SuperScriptII
New England BiolabsNew England Biolabs
(rev. Transkriptase T4-Polynukleotidkinase(Rev. T4 polynucleotide kinase transcriptase
1.5. Fluoreszenzfarbstoffe1.5. fluorescent dyes
Amersha : Cy 3-dCTP, Cy 5-dCTPAmersha: Cy 3-dCTP, Cy 5-dCTP
1.6. Geräte Array-Scanner: Genetic Micro Systems 418 Cambridge, MA, USA '1.6. equipment Array scanner: Genetic Micro Systems 418 Cambridge, MA, USA '
Array-Spotter: Genetic Micro Systems 417 Cambridge, MA, USAArray spotter: Genetic Micro Systems 417 Cambridge, MA, USA
Brutschränke : Heraeus FunktionLine B12 Memmert BF40Incubators: Heraeus FunktionLine B12 Memmert BF40
Elektrophorese : Amersham Pharmacia Biotech EPS 301 NetzteilElectrophoresis: Amersham Pharmacia Biotech EPS 301 power supply
Easy-Cast Electrophoresis System #B1AEasy-Cast Electrophoresis System # B1A
Hoefer Max Submarine Unit HE 99XHoefer Max Submarine Unit HE 99X
Geldokumentation: Fröbel LabortechnikGel documentation: Fröbel Labortechnik
Heizblöcke : Laboratory Devices DigiblockHeating blocks: Laboratory Devices Digiblock
Hybridisierofen: GFL 7601Hybridizing oven: GFL 7601
Orbitalschüttler: Belly Dancer, Stovall LifeOrbital shaker: Belly Dancer, Stovall Life
Scienesciene
pH-Meter: Greisinger Electronics Mess- und RegeltechnikpH meter: Greisinger Electronics measurement and control technology
Phosphoimager : Molecular Dynamics Storm 660 Molecular Dynamics Phosphor Screen und Exposure CassettePhosphoimager: Molecular Dynamics Storm 660 Molecular Dynamics Phosphor Screen and Exposure Cassette
Photometer: Beckman DU-62Photometer: Beckman DU-62
Schüttelinkubator: HAT Infors GmbH Ther ocycler: Hybaid TouchDownShake incubator: HAT Infors GmbH Ther ocycler: Hybaid TouchDown
UV-Crosslinker: Stratagene UV-Stratalinker IδOOUV crosslinker: Stratagene UV stratalinker IδOO
Vortexer : Gemmy Industries VM-300Vortexer: Gemmy Industries VM-300
Waagen: Sartorius BP 410 Sartorius BP '121SScales: Sartorius BP 410 Sartorius BP ' 121S
Wasserbäder: Medingen W 12Water baths: Medingen W 12
Zentrifugen: Heraeus Megafuge 1.0R, KühlzentrifugeCentrifuges: Heraeus Megafuge 1.0R, refrigerated centrifuge
Heraeus Megafuge 1.0 Heraeus Biofuge pico Heraeus Biofuge fresco, TischkühlzentrifugeHeraeus Megafuge 1.0 Heraeus Biofuge pico Heraeus Biofuge fresco, table top centrifuge
1.7. Isotope1.7. isotope
Amershan: tγ- 3J2P]-ATP 18,5 MBq Amershan: tγ- 3 J 2P] -ATP 18.5 MBq
1.8. Medien1.8. media
YPD Medium: Vollmedium für Hefen Hefeextrakt (Difco) 10 g/1 Bacto-Pepton (Difco) 20 g/1 Glucoselösung {40% ) 50 ml/1YPD Medium: Complete medium for yeast extract (Difco) 10 g / 1 Bacto-Peptone (Difco) 20 g / 1 glucose solution {40%) 50 ml / 1
SC Medium: synthetisches Medium für Hefen Difco YNB 1,5 g/1SC Medium: synthetic medium for yeast Difco YNB 1.5 g / 1
Ammoniumsulfat 5,0 g/1 Glucoselösung (40%) 50 ml/1 Aminosäuren, Nukleotide SC-ura Medium: Selektionsmedium für Hefen wie SC-Medium aber ohne UracilAmmonium sulfate 5.0 g / 1 glucose solution (40%) 50 ml / 1 amino acids, nucleotides SC-ura Medium: Selection medium for yeasts like SC medium but without uracil
Fertigmedien: RPMI-1640 (Gibco Life Technologies) α-MEM (Gibco Life Technologies)Finished media: RPMI-1640 (Gibco Life Technologies) α-MEM (Gibco Life Technologies)
SC-ura Agarplatten: Zugabe von gleichem Volumen 4%SC-ura agar plates: addition of the same volume 4%
Agar zu dem SC-ura MediumAgar to the SC-ura medium
1.9. Plasmide1.9. plasmids
- pGEM-T [Promega]- pGEM-T [Promega]
- p275 [26]- p275 [26]
1.10. Primer1.10. primer
Zur Herstellung des DNA-Chips wurden Gensequenzen von Zellwandgenen in Saccharomyces cerevisiae mit der Candida-Datenbank [41] geblastet und so dazu homologe Sequenzen in Candida albicans gefunden. Diese Sequenzen, sowie Sequenzen bekannter Zellwandgene in Candida albicans bildeten die Grundlage für die Pri erauswahl . Die verwendeten Primer sind im Anhang 6.3 auf den Seiten 63-65 vermerkt.To produce the DNA chip, gene sequences from cell wall genes in Saccharomyces cerevisiae were blasted with the Candida database [41] and homologous sequences were found in Candida albicans. These sequences, as well as sequences of known cell wall genes in Candida albicans, formed the basis for the selection. The primers used are noted in Appendix 6.3 on pages 63-65.
1.11. Verbrauchsmaterialien11.1. consumables
Amersham: Hybond-N NylonmembranAmersham: Hybond-N nylon membrane
ProbeQuant G-50 Micro Columns ProbeQuant G-25 Micro ColumnsProbeQuant G-50 Micro Columns ProbeQuant G-25 Micro Columns
Eppendorf: 1,5 ml Reaktionsgefäpe (RNÄse frei)Eppendorf: 1.5 ml reaction vial (RNÄse free)
Greiner: PP-Röhrchen 15 oder 50 ml, steril Qiagen: QIAquick Gel Extraction KitGreiner: PP tubes 15 or 50 ml, sterile Qiagen: QIAquick Gel Extraction Kit
QIAquick PCR Purification KitQIAquick PCR Purification Kit
Roth: Whatman Papier, 190g/m2,Roth: Whatman paper, 190g / m 2 ,
Dicke 0,37 mmThickness 0.37mm
Sig a Diagnostics: Glas microscope slidesSig a Diagnostics: Glass microscope slides
Stratagene: Prime-It II Random Primer Labeling KitStratagene: Prime-It II Random Primer Labeling Kit
Gibco BRL: Superscript II RT KitGibco BRL: Superscript II RT Kit
Aicon: Microcon-30 FilterAicon: Microcon-30 filter
Millipore: Millipore Filter, 0.45 μMillipore: Millipore filter, 0.45 μ
2. Methoden2. Methods
2.1. RNA Isolation aus Candida albicans2.1. RNA isolation from Candida albicans
Für die RNA-Isolation kam hier die Methode der sauren Phenolextraktion bei 65°C zum Einsatz. Die ku- tivierten Zellen wurden bei 1500x g und 4°C für 15 Minuten abzentrifugiert, Medienrückstände zweimal mit eiskaltem ddH20 herausgewaschen und die Zellen in einem 1:1 Gemisch aus TES und Phenol resuspendiert. Die Menge dieses Gemisches entsprach dem Vo- lumen des Zellpellets. Nach einer Inkubation von 60 Minuten bei 65 °C , während derer zur Erhöhung der RNA-Ausbeute öfter gemischt wurde, erfolgte durch erneute Zentrifugation bei 1500x g und 4°C für 15 Minuten die Ausbildung zweier Phasen. Die wässrige obere Phase, in der sich die RNA angesammelt hatte, wurde von der unteren Phenolphase abgenommen, in eine gleiche Menge vorgelegtes Phenol pipettiert und noch einmal für 15 Minuten bei 65°C inkubiert. Die anschließende Phasentrennung erfolgte wie bereits beschrieben. Um aus der wässrigen Phase restliche Mengen Phenol zu entfernen, wurde sie in ein gleiches Volumen vorgelegtes Chloroform pipettiert und kräftig gemischt. Erneutes Zentrifugieren bei 1500x g und 4°C für 15 Minuten führte zu zwei klar voneinander getrennten Phasen, wobei wiederum die obere wässrige Phase in ein vorgelegtes Gemisch aus 100%igem eiskalten Ethanol und 0,1 Vo. 3 M Natrium- acetat pH 5,3 gegeben wurde. Unter diesen Bedingungen fiel die RNA nach 2 bis 24 Stunden aus und konnte bei 1500x g und 4°C für 15 Minuten abzentrifugiert werden. Während sich restliche Salze durch einmaliges Waschen in eiskaltem 70%igem Ethanol herauslösten, blieb die RNA in ihrer ungelösten Pelletform. Der Überstand wurde verworfen und restliche Ethanolmengen durch anschließende Lufttrocknung entfernt. Die RNA wurde schließlich in soviel DEPC-H20 resuspendiert, dass sich eine Endkonzent- ration von 5 bis 10 μg/μl ergab.The acid phenol extraction method at 65 ° C was used for RNA isolation. The cultured cells were centrifuged at 1500 × g and 4 ° C. for 15 minutes, media residues were washed out twice with ice-cold ddH 2 0 and the cells were resuspended in a 1: 1 mixture of TES and phenol. The amount of this mixture corresponded to the volume of the cell pellet. After an incubation of 60 minutes at 65 ° C, during which it was mixed more often to increase the RNA yield, two phases were formed by centrifugation again at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes. The aqueous upper phase, in which the RNA had accumulated, was removed from the lower phenol phase, pipetted into an equal amount of the phenol initially charged and incubated again at 65 ° C. for 15 minutes. The subsequent phase separation was carried out as already described. In order to remove residual amounts of phenol from the aqueous phase, it was pipetted into an equal volume of chloroform and mixed vigorously. Another centrifugation at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes led to two clearly separated phases, again the upper aqueous phase in a mixture of 100% ice-cold ethanol and 0.1 Vo. 3 M sodium acetate pH 5.3 was added. Under these conditions the RNA precipitated after 2 to 24 hours and could be centrifuged at 1500x g and 4 ° C for 15 minutes. While remaining salts dissolved out by washing once in ice-cold 70% ethanol, the RNA remained in its undissolved pellet form. The supernatant was discarded and residual amounts of ethanol were removed by subsequent air drying. The RNA was finally resuspended in sufficient DEPC-H 2 0 to give a final concentration of 5 to 10 μg / μl.
2.2. LiCl-Fällung2.2. LiCl precipitation
Isolierte RNA wurde für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff im Verhältnis 1:1 mit 4 M LiCl über Nacht umgefällt. Nach Abzentrifugieren der ausge- fallenen RNA bei 1500x g und 4°C für 45 Minuten erfolgte dreimaliges Waschen mit 70%igem Ethanol, um restliche Salzmengen abzutrennen, die die reverse Transkiption stören könnten. Anschließendes Lufttrocknen beseitigte restliche Ethanolspuren. Hier- nach wurde die RNA erneut in DEPC-H0 bis zu einer Endkonzentration von 5 bis 10 μg/μl resuspendiert. 2.3. RNA-KonzentrationsbestimmungIsolated RNA was reprecipitated overnight with 4 M LiCl for labeling with fluorescent dye in a ratio of 1: 1. After the precipitated RNA had been centrifuged off at 1500 × g and 4 ° C. for 45 minutes, the mixture was washed three times with 70% ethanol in order to remove residual amounts of salt which could interfere with the reverse transcription. Subsequent air drying removed traces of ethanol. The RNA was then resuspended in DEPC-H0 to a final concentration of 5 to 10 μg / μl. 2.3. RNA concentration determination
Durch photometrische Extinktionsmessung bei 260 nm und anschließender Berechnung wurden die RNA- Konzentrationen bestimmt. Die Berechnung erfolgte über die eingesetzte Verdünnung und einen Umrechnungsfaktor, bei dem für eine Extinktion von 1,0 eine RNA-Konzentration von 40 μg/ml zugrunde gelegt wurde. Zur Reinheitsbestimmung konnte der Quotient aus E26o/E28o herangezogen, werden. Für ausreichend reine RNA musst der Quotient zwischen 1,8 und 2,0 liegen.The RNA concentrations were determined by photometric absorbance measurement at 260 nm and subsequent calculation. The calculation was made using the dilution used and a conversion factor based on an RNA concentration of 40 μg / ml for an extinction of 1.0. The quotient from E 26 o / E 28 o could be used to determine the purity. For sufficiently pure RNA, the quotient must be between 1.8 and 2.0.
2.4. Gelelektrophores2.4. Gelelektrophores
a) RNA-Gelea) RNA gels
Für die RNA-Gelelektrophorese wurden Agarosegele folgender Zusammensetzung verwendet:Agarose gels of the following composition were used for the RNA gel electrophoresis:
1% Agarose 72% ddH20 10% MOPS (lOx) 18% Formaldehyd (12,3 M) lμl Ethidiumbromid (10 μg/μl)1% agarose 72% ddH 2 0 10% MOPS (lOx) 18% formaldehyde (12.3 M) lμl ethidium bromide (10 μg / μl)
Der Probenansatz wurde folgendermaßen vorbereitet:The sample preparation was prepared as follows:
RNA (15μg 5,0 μlRNA (15 μg 5.0 μl
MOPS (lOx) 1,5 μlMOPS (lOx) 1.5 μl
Formaldehyd (12,3 M) 2,5 μl Formamid 7,5 μlFormaldehyde (12.3 M) 2.5 ul formamide 7.5 ul
RNA Ladepuffer 2,5 μlRNA loading buffer 2.5 μl
DEPC-H20 0,8 μlDEPC-H 2 0 0.8 μl
Für die Elektrophorese galten folgende Bedingungen: Gellauf : bei 10 V, 400 mA über Nach 14 bis 16 StundenThe following conditions apply to electrophoresis: Gel run: at 10 V, 400 mA over after 14 to 16 hours
oder bei 70 V, 400 mA für 4 Stunden Laufpuffer: 1 x MOPSor at 70 V, 400 mA for 4 hours running buffer: 1 x MOPS
b) DNA-Geleb) DNA gels
Die DNA-Gelelektrophorese wurde mit in 1 x TBE- Puffer angesetzten, ebenfalls l%igen Agarosegelen durchgeführt. Das Ethidiumbromid wurde in einem Verhältnis von 1:15000 aus einer 10 μg/μl Stammlö- sung den Gelen zugesetzt. Der Probenansatz erfolgte in einem Verhältnis von 1:1 mit dem Probenpuffer. Die Elektrophoresebedingungen waren folgendermaßen:The DNA gel electrophoresis was carried out with 1% agarose gels prepared in 1 x TBE buffer. The ethidium bromide was added to the gels in a ratio of 1: 15000 from a 10 μg / μl stock solution. The sample was prepared in a ratio of 1: 1 with the sample buffer. The electrophoresis conditions were as follows:
Gellauf: bei 100-120 V, 400 mA für 45 Minuten bis 1 Stunde Laufpuffer: 1 x TBE-PufferGel run: at 100-120 V, 400 mA for 45 minutes to 1 hour Running buffer: 1 x TBE buffer
Probenpuffer: DNA-Ladepuffer (2x)Sample buffer: DNA loading buffer (2x)
c) DNA-Gel zur Überprüfung der Sonden für DNA-Chipc) DNA gel for checking the probes for DNA chip
Für die Prüfung der PCR-Produkte bei der Chipherstellung wurde ein l,2%iges Agarosegel verwendet, wobei der Ansatz in 1 x TAE-Puffer erfolgte. Das Ethidiumbromid wurde wie bei Punkt b) DNA-Gele dem Gel zugesetzt und die Probe im Verhältnis von 1:1 mit dem Probenpuffer versetzt. Die Bedingungen wurden folgendermaßen gewählt:A 1.2% agarose gel was used to test the PCR products during chip production, the batch being made in 1 x TAE buffer. The ethidium bromide was added to the gel as in point b) DNA gels and the sample was mixed with the sample buffer in a ratio of 1: 1. The conditions were chosen as follows:
Gellauf: bei 150 V, 400 mA für 1,5 Stunden Laufpuffer: 1 x TAE-Puffer Probenpuffer: DNA-Ladepuffer (2x) 2.5. RestriktionsverdauGel run: at 150 V, 400 mA for 1.5 hours Running buffer: 1 x TAE buffer Sample buffer: DNA loading buffer (2x) 2.5. restriction
Der Restriktionsverdau mit Nsil erfolgte in einem Volumen von 30 μl mit 3 μl P275-DNA (ca. 1 μg) und 4 U Enzym bei 37°C. Die Inkubation erfolgte über Nacht.The restriction digest with Nsil was carried out in a volume of 30 μl with 3 μl P275-DNA (approx. 1 μg) and 4 U enzyme at 37 ° C. The incubation took place overnight.
2.6. PCR2.6. PCR
Die für die Versuche verwendeten DNA-Fragmente wurden über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifi- ziert. Die Ansätze enthielten jeweils 10 ng DNA, 1 x PCR Puffer (Gibco), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM jedes Nukleotids, 20 pmol jedes Primers und 2 U Taq- Polymerase in einem Volumen von 50 μl .The DNA fragments used for the experiments were amplified via polymerase chain reaction (PCR). The batches each contained 10 ng DNA, 1 × PCR buffer (Gibco), 1.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM each nucleotide, 20 pmol each primer and 2 U Taq polymerase in a volume of 50 μl.
Der Programmablauf des Cyclers unterschied sich je nach eingesetztem Primerpaar in der Annealingtempe- ratur. Für die PCR-A plifizierung, wie sie für die Chipherstellung im 96-Well-Platten Maßstab genutzt wurde, galt folgendes:The program flow of the cycler differed depending on the primer pair used in the annealing temperature. The following was true for the PCR amplification used for chip production on a 96-well plate scale:
Sonden:probes:
Denaturierung bei 95 °C: 1 min Annealing Primer bei 52 °C: 1 minDenaturation at 95 ° C: 1 min Annealing Primer at 52 ° C: 1 min
Elongation bei 72°C: 1 min erneute Denaturierung bei 95°C: 1 min 30 ZyklenElongation at 72 ° C: 1 min renewed denaturation at 95 ° C: 1 min 30 cycles
Abkühlung auf 4°C: bis Entnahme aus dem GerätCooling down to 4 ° C: until removed from the device
Ausnahmen bildeten dabei ASLl, PHR1, PHR2 , pl8b. Für die Amplifizierung dieser Sonden mussten die Annealingtemperaturen folgendermaßen verändert werden: ASL1 1 min bei 55 °CExceptions were ASL1, PHR1, PHR2, pl8b. In order to amplify these probes, the annealing temperatures had to be changed as follows: ASL1 1 min at 55 ° C
PHR1, PHR, plδb 1 min bei 50°CPHR1, PHR, plδb 1 min at 50 ° C
Für die Amplifizierung von ACTl, 2436 (HWPl) und 2343 (ALS1, 3, 8), die als Template-DNA bei der Herstellung der radioaktiven Sonden genutzt wurden, wurde eine PCR -ohne radioaktive Markierung durchgeführt (siehe 2.2.10). Es galten folgende Bedingungen:For the amplification of ACTl, 2436 (HWPl) and 2343 (ALS1, 3, 8), which were used as template DNA in the production of the radioactive probes, a PCR was carried out without radioactive labeling (see 2.2.10). The following conditions apply:
Denaturierung bei 95°C: ' 10 min Annealing Primer bei 50 °C: 1 minDenaturation at 95 ° C: '10 min annealing primers at 50 ° C: 1 min
Elongation bei 72°C: 1 min (_ 30 Zyklen erneute Denaturierung bei 95°C: 1 min Abkühlung auf 4°C: bis Entnahme aus dem Geräte Elongation at 72 ° C: 1 min (_ 30 cycles of renewed denaturation at 95 ° C: 1 min cooling to 4 ° C: until removed from the device e
2.7. Au reinigung von DNA-Fragmenten2.7. Purification of DNA fragments
Die Aufreinigung der DNA-Fragmente aus PCR und Restriktionsverdau erfolgte im allgemeinen nach dem Protokoll des Qiagen QIAquick PCR Purification Kits. Die erhaltene DNA wurde in jeweils 30 - 50 μl mikrobiologisch reinem Wasser eluiert. The DNA fragments from PCR and restriction digestion were generally purified according to the protocol of the Qiagen QIAquick PCR Purification Kit. The DNA obtained was eluted in 30-50 μl of microbiologically pure water.
2.8. Herstellung radioaktiver Sonden2.8. Manufacture of radioactive probes
a) Markierung mit [α-32P] -dCTPa) Labeling with [α- 32 P] -dCTP
Die Herstellung der für die Northern Blots eingesetzten, mit [α-32P]-dCTP radioaktiv markierten S -Sonden erfolgte nach dem Protokoll des Stratagene Prime-It II Random Primer Labeling Kit. [α-32P]- dCTP wurde hierbei als radioaktives Nukleotid in die Synthesekette eingebaut. Eine anschließende Abtrennung nicht eingebauter radioaktiver Nukleotide wurde gemäß des Protokolls der Amersham ProbeQuant G-50 Micro Columns durchgeführt.The S probes used for the Northern blots, radioactively labeled with [α- 32 P] -dCTP, were produced according to the protocol of the Stratagene Prime-It II Random Primer Labeling Kit. [α- 32 P] - dCTP was incorporated into the synthesis chain as a radioactive nucleotide. Subsequent separation of unincorporated radioactive nucleotides was carried out according to the protocol of the Amersham ProbeQuant G-50 Micro Columns.
b) Markierung mit [γ-32P] -ATPb) Labeling with [γ- 32 P] -ATP
Die Herstellung der zum mRNA-Nachweis eingesetzten, mit [γ-32P]-ATP radioaktiv markierten, Oligo (dT)- Sonde erfolgte durch Umsatz von Oligo (dT) -Primern mit T4-Polynukleotidkinase nach Vorschrift von New England Biolabs. Hierbei erfolgte eine Übertragung des radioaktiven γ-32P von ATP auf den Oligo (dT)- Primer durch die T4-Polynukleotidkinase. Der Ansatz enthielt folgendes:The oligo (dT) probe used for the mRNA detection and radioactively labeled with [γ- 32 P] -ATP was produced by converting oligo (dT) primers with T4 polynucleotide kinase according to the instructions from New England Biolabs. The radioactive γ- 32 P was transferred from ATP to the oligo (dT) primer by the T4 polynucleotide kinase. The approach included the following:
0,5 μl Oligo (dT) Primer (2μg/μl)0.5 μl oligo (dT) primer (2μg / μl)
12,5 μl [γ-32P]-ATP (10 mCi/ml)12.5 μl [γ- 32 P] -ATP (10 mCi / ml)
5,0 μl Polynukleotidkinase Puffer (lOx)5.0 μl polynucleotide kinase buffer (lOx)
2.0 μl T4-Polynukleotidkinase (10000 U/ml) 30,0 μl DEPC-H202.0 ul T4 polynucleotide kinase (10000 U / ml) 30.0 ul DEPC-H 2 0
Inkubationszeit waren 30 Minuten bei 37 °C. Die Abtrennung nicht umgesetzter radiaoaktiver Nukleotide erfolgte über G-25 Micro Columns nach dem Protokoll von Amersham ProbeQuant. 2.9. Northern Blot-AnalysenIncubation time was 30 minutes at 37 ° C. The unreacted radioactive nucleotides were separated using G-25 micro columns according to the Amersham ProbeQuant protocol. 2.9. Northern blot analyzes
Northern-Blot-Analysen wurden, wie von Srikantha et al. (Mol. Gen. Genet . (1995) 246, 342-352) beschrieben, durchgeführt. 10 mg Gesamt-RNA wurde auf einem 1,1 % Agarose-Gel aufgetrennt, welches 2,2 M Formaldehyd und 0,5 x MOPS, pH s 7,0, enthielt. Nach Färbung mit Ethidiumbromid wurden die Gele auf Bio- dyne B-Nylonmembranen (PALL FILTRON, Deutschland) geblottet .Northern blot analyzes were carried out as described by Srikantha et al. (Mol. Gen. Genet. (1995) 246, 342-352). 10 mg of total RNA was separated on a 1.1% agarose gel which 2.2 M formaldehyde and 0.5 x MOPS, pH s 7.0, contained. After staining with ethidium bromide, the gels were blotted on Bodyne B nylon membranes (PALL FILTRON, Germany).
Bei 62 bis 65 °C wurde mit radioaktiv markierten DNA-Fragmenten hybridisiert, anschließend wurden die Membranen behandelt und wie üblich wurde eine Autoradiographie durchgeführt (Church und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 (1984), 1991-1995). Die Northern-Blots wurden mittels einer Fuji BAS 3000 Phosphor IMAGER-Vorrichtung unter Verwendung der zugehörigen Software quantifiziert. Die Sou- thern-Blot-Analysen wurden, wie von Schröppel et al., (J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 2646-2654) beschrieben durchgeführt. Mit Restriktionsenzymen gespaltene genomische DNA wurde auf 0,7% Agarose- Gelen getrennt, und auf Biodyne B-Nylonmembranen geblottet. Die Hybridisierung und stringenten Waschschritte wurden, wie beschrieben (Church und Gilbert (1984), a.a.O.), durchgeführt, gefolgt von Autoradiographie.Hybridization was carried out at 62 to 65 ° C. with radiolabelled DNA fragments, the membranes were then treated and autoradiography was carried out as usual (Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 1991-1995 ). Northern blots were quantified using a Fuji BAS 3000 phosphor IMAGER device using the associated software. The ether blot analyzes were carried out as described by Schröppel et al. (J. Clin. Microbiol., 32 (1994), 2646-2654). Genomic DNA digested with restriction enzymes was separated on 0.7% agarose gels and blotted on Biodyne B nylon membranes. Hybridization and stringent washes were performed as described (Church and Gilbert (1984) supra) followed by autoradiography.
Zum Nachweis von CaTECl wurde mit Zufallsprimern ein Nsil-Fragment von p275 markiert. Zum Nachweis von SAP4-6 wurde eine äquimolares Gemisch von p206, p207 und p208 markiert, die durch Subklonierung von Bglll-Fragmenten der SAP4-, SAP5- und SAP6- ORFs (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994), 357-368) in die BamHI-Stelle von pGEM3Z hergestellt wurden (Längen der Inserts : 755, 677 und 660 bp) . Plasmide zum Nachweis von ACTl- und EFGl-mRNA wurden freundlicherweise von Prof. J. Ernst, Heinrich-Heine- Universität, Düsseldorf zur Verfügung gestellt.To detect CaTECl, an Nsil fragment from p275 was labeled with random primers. To detect SAP4-6, an equimolar mixture of p206, p207 and p208 was labeled, which was obtained by subcloning BglII fragments of the SAP4, SAP5 and SAP6 ORFs (Monod et al., Mol. Microbiol., 13 (1994) , 357-368) into the BamHI site of pGEM3Z (Lengths of the inserts: 755, 677 and 660 bp). Plasmids for the detection of ACTl and EFGl mRNA were kindly provided by Prof. J. Ernst, Heinrich Heine University, Düsseldorf.
Northern Blots zum Nachweis von Ca TECl regulierten Gene wurden wie folgt durchgeführt.Northern blots for the detection of Ca TECl regulated genes were carried out as follows.
a) Transfer und Immobilisierung der RNAa) Transfer and immobilization of the RNA
Für die Northern Blots wurden 15 μg der jeweils von den Stämmen isolierten RNA in einem Verhältnis von 1:3 mit RNA-Loading-Dye versetzt und auf einem l%igen RNA Gel über Nacht bei 10 V in lx MOPS aufgetrennt. Zur Kontrolle wurde das Gel unter UV- Licht fotografiert und dann mit seiner Oberseite nach unten auf einen passend zugeschnittenen Blot- Block aus Whatman Papier gelegt, der zuvor in eineFor the Northern blots, 15 μg of the RNA isolated from the strains were mixed in a ratio of 1: 3 with RNA loading dye and separated on a 1% RNA gel overnight at 10 V in 1 x MOPS. As a control, the gel was photographed under UV light and then placed upside down on a suitably cut blot block made of Whatman paper, which had previously been placed in a
Blotschale mit 20x SSC als Transferpuffer gegeben wurde. Um eine Wirkung der Kapillarkräfte durch dasBlot dish with 20x SSC as transfer buffer was given. To have an effect of the capillary forces through the
Gel und nicht durch eventuell überhängende Papier-Gel and not through any overhanging paper
' tücher zu gewährleisten, wurde der Rand des Gels mit Parafilm abgedeckt. Eine exakt auf die Gelgröße zugeschnittene, zuvor in 2x SSC gewässert, Nylonmembran wurde luftblasenfrei auf das Gel gelegt und mit 3 Lagen Whatman Papier bedeckt. Ein darüber aufgelegter 5 cm hoher Stapel Papiertücher wurde mit einer flachen Schale und einem Gewicht beschwert. Dies sorgte für eine optimale Kapillarwirkung. So konnte die in dem Gel befindliche RNA über Nacht auf die Nylonmembran übertragen und nach Lufttrocknung zweimal über „auto cross link" im UV- Crosslinker fixiert werden. Anschließendes Waschen des Blots in 2x SSC sollte die hohe Salzkonzentration auf der Membran verringern. Nach nochmaligem Trocknen an der Luft wurde der Blot in Folie bei 65 °C im Hybridisierofen war die Membran blockiert. Anschließend erfolgte die eigentliche Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde, die zuvor in 10 ml Church-Puffer gegeben wurde. Um eine opti- male Hybridisierung zu gewährleisten, wurde über Nacht bei 65°C hybridisiert.To ensure towels, the edge of the gel was covered with parafilm. A nylon membrane cut exactly to the size of the gel, previously washed in 2x SSC, was placed on the gel without air bubbles and covered with 3 layers of Whatman paper. A 5 cm high stack of paper towels placed on top was weighted with a flat bowl and a weight. This ensured an optimal capillary effect. The RNA in the gel could be transferred to the nylon membrane overnight and, after air drying, fixed twice in the UV crosslinker via "auto cross link". Subsequent washing of the blot in 2x SSC should reduce the high salt concentration on the membrane. After drying again in air the blot was wrapped in foil The membrane was blocked at 65 ° C. in the hybridization furnace. The actual hybridization then took place with the radioactively labeled probe, which had previously been placed in 10 ml of Church buffer. To ensure optimal hybridization, hybridization was carried out overnight at 65 ° C.
c) Waschschrittec) washing steps
Nach dreimaligem Waschen in lx SSC mit 0,1% SDS für je 15 Minuten bei 65 °C wurde die .Membran in feuch- tem Zustand in Folie eingeschweißt und auf einen Phosphor Screen (Molecular Dynamics) gelegt.After washing three times in 1 × SSC with 0.1% SDS for 15 minutes each at 65 ° C., the. Membrane was sealed in foil in a moist state and placed on a phosphor screen (Molecular Dynamics).
d) Detektion und Dokumentationd) detection and documentation
Die Dauer der Exposition war unterschiedlich, mindestens aber erfolgte sie über Nacht. Anschließend wurde eingeschweißt und bei -70 °C bis zur Weiterbearbeitung im Isotopenlabor gelagert.The duration of the exposure varied, but at least it took place overnight. It was then welded in and stored at -70 ° C until further processing in the isotope laboratory.
b) Prähybridisierung und Hybridisierungb) Prehybridization and hybridization
Um die freien Bindungsstellen auf der Blot Membran abzusättigen und damit eine spezifische Hybridisie- rung der Sonde zu garantieren, usste mit Church Puffer prähybridisiert werden. Nach 1 bis 2 Stunden Inkubation der Screen am Phosphoimager eingescannt. Eine Quantifizierung über die Software ImageQuant lieferte die Rohdaten, die für die weitere Auswer- tung Voraussetzung waren.In order to saturate the free binding sites on the blot membrane and thus guarantee a specific hybridization of the probe, it had to be pre-hybridized with Church buffer. After 1 to 2 hours of incubation, the screen was scanned on the phosphoimager. A quantification using the ImageQuant software provided the raw data, which were a prerequisite for further evaluation.
2.10. Invasionstests und pseudohyphales Wachstum in S. cerevisiae2.10. Invasion tests and pseudohyphal growth in S. cerevisiae
Invasive und pseudohyphale Wachstumstests wurden wie beschrieben durchgeführt (Gi eno und Fink, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2100-2112, Robertson und Fink, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95 (1998), 13783- 13787) . Das invasive Wachstum wurde getestet, indem auf selektivem Medium gewachsene Zellen auf YPD- Platten überführt wurden und anschließend nach 24- stündiger oder 48-stündiger Inkubation bei 30 °C gewaschen wurden. Pseudohyphales Wachstum diploider Stämme wurde getestet, indem die Stämme als Einzelkolonien auf SLAD-Agar ausplattiert und diese Plat- ten zwei Tage bei 30°C inkubiert wurden.Invasive and pseudohyphal growth tests were performed as described (Gi eno and Fink, Mol. Cell. Biol., 14 (1994), 2100-2112, Robertson and Fink, Proc. Natl. Acad. Be. USA, 95: 13783-13787 (1998)). The invasive growth was tested by transferring cells grown on selective medium to YPD plates and then washing after incubation for 24 hours or 48 hours at 30 ° C. Pseudohyphal growth of diploid strains was tested by plating the strains as single colonies on SLAD agar and incubating these plates at 30 ° C for two days.
2.11. Herstellung von Extrakten und Enzymtests11.2. Manufacture of extracts and enzyme tests
Die Zellen für die ß-Galaktosidase-Tests von FL011::lacZ oder FG::TyA-lacZ wurden in SC flüssigem Medium wachsen gelassen und gemäß Mösch et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93 (1996), 5352-5356) quantifiziert. Zellen für die Quantifizierung der FL011::lacZ oder FG::TyA-lacZ Expression in der ex- ponentiellen Wachstumsphase wurden aus konfluenten 20-Stunden-Kulturen 1:20 in frisches Medium inoku- liert und 4-6 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen für die Quantifizierung von FL011::lacZ und FG: :TyA-lacZ Expressionen nach dem post-Diauxic- shift wurden 48 Stunden wachsen gelassen.The cells for the β-galactosidase tests of FL011 :: lacZ or FG :: TyA-lacZ were grown in SC liquid medium and according to Mösch et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996), 5352-5356). Cells for the quantification of FL011 :: lacZ or FG :: TyA-lacZ expression in the exponential growth phase were inoculated 1:20 from confluent 20-hour cultures in fresh medium and allowed to grow for 4-6 hours. The cells for the quantification of FL011 :: lacZ and FG:: TyA-lacZ expressions after the post-diauxic shift were grown for 48 hours.
2.12. Interaktion von C . albicans und Makrophagen12.2. Interaction of C. albicans and macrophages
Die Interaktion zwischen C. albicans und Mφ wurde untersucht, indem aus peritonealem Exudat erhaltene Mφ eingesetzt wurden, die im Wesentlichen wie bei Bogdan et al.(Eur. J. Im unol . , 20 (1990), 1131- 1135, Gessner et al., Infect. Immun., 61 (1993), 4008-4012) beschrieben, hergestellt wurden. Mφ wurde in einer Dichte von 8 x 105 Zellen auf acht Ver- tiefungen aufweisende Platten (Nunc, Deutschland) ausgesät und" bildeten eine Monolayer adhärenter Zellen. C. 'albicans wurde mit einer Infektions ul- tiplizität (MOI, Multiplicity of infection) von 1:16 (C. albicans:Mφ-Verhältnis) hinzugegeben und die Platten wurden bei 37 °C mit 5% C02 für 8 oder 24 Stunden inkubiert. Die Platten wurden fixiert (Histo Choice, Amresco) und mit Periodsäure- Schiffs-Reagenz (Sigma) gefärbt. Anschließend wur- den mikroskopische Untersuchungen mittels eines Zeiss-Axiophot-Mikroskops "(Zeiss, Göttingen) durchgeführt .The interaction between C. albicans and Mφ was investigated using Mφ obtained from peritoneal exudate, which was essentially as described in Bogdan et al. (Eur. J. Im unol., 20 (1990), 1131-1135, Gessner et al ., Infect. Immun., 61 (1993), 4008-4012). Mφ was in a density of 8 x 10 5 cells on eight different wells (Nunc, Germany) and " formed a monolayer of adherent cells. C. ' albicans was added with an multiplicity of infection (MOI, Multiplicity of infection) of 1:16 (C. albicans: Mφ ratio) and the plates were incubated with 5% CO 2 for 8 or 24 hours at 37 ° C. The plates were fixed (Histo Choice, Amresco) and stained with periodic acid Schiff's reagent (Sigma), followed by microscopic examinations using a Zeiss -Axiophot microscope " (Zeiss, Goettingen).
2.13. VirulenzStudien13.2. virulence
Acht bis zehn Wochen alte weibliche BALB/c Mäuse (Charles Rivers Breeding Laboratories, Sulzfeld, Deutschland, 5 bis 8 pro Gruppe) wurden in den in vivo Studien eingesetzt. Die Mucosa-Kolonisation des vaginalen Kanals wurde initiiert, indem BALB/c Mäuse intravaginal mit 5 x 104 Blastoconidien der stationären Phase in 20 μl PBS (Fidel, Jr. et al., Infect Immun (1993) 61, 1990-1995) inokuliert wurden. 72 Stunden vor Inokulation wurde den Mäusen subkutan 0,02 mg/pro Maus östradiolvalerat (Sigma) in 0,1 ml Sesamöl injiziert. Die Östrogen- Behandlungen wurden in wöchentlichen Intervallen fortgesetzt. An den Tagen 10 und 24 nach der Östro- gen-Behandlung, die den Tagen 7 und 21 nach Inokulation entsprachen, wurden die Tiere getötet und die Vagina jeder Maus mit 100 μl PBS gespült. Das Pilzvorkommen in der Vagina wurde mittels einer Va- ginal-Spülkultur wie bei Fidel Jr. et al.,Eight to ten week old female BALB / c mice (Charles Rivers Breeding Laboratories, Sulzfeld, Germany, 5 to 8 per group) were used in the in vivo studies. Mucosal colonization of the vaginal canal was initiated by inoculating BALB / c mice intravaginally with 5 x 10 4 blastoconidia of the stationary phase in 20 μl PBS (Fidel, Jr. et al., Infect Immun (1993) 61, 1990-1995) were. 72 hours before inoculation, the mice were injected subcutaneously with 0.02 mg / mouse estradiol valerate (Sigma) in 0.1 ml of sesame oil. Estrogen treatments were continued at weekly intervals. On days 10 and 24 after estrogen treatment, which corresponded to days 7 and 21 after inoculation, the animals were sacrificed and the vagina of each mouse was rinsed with 100 μl PBS. The fungal occurrence in the vagina was determined using a vaginal rinsing culture as in Fidel Jr. et al.,
( (1993) a. a.O. ) beschrieben bestimmt und ein Teil der gewonnenen Flüssigkeit für die mikroskopische((1993) op. Cit.) And determined a part of the liquid obtained for the microscopic
Untersuchung verwendet. Nach Inkubation bei Raum- temperatur über 48 bis 72 Stunden wurden die koloniebildenden Einheiten (CFU) bestimmt. Für systemischen Infektionen wurden Gruppen von 10 Mäusen mit 5 x 105 lebenden Zellen durch intravenöse Injektion inokuliert und die Überlebensrate bestimmt (Csank et. al., (1997 und 1998), a.a.O., Ti pel et al., J. Bacteriol., 162 (2000), 3063-3071). Die Lebensfähigkeit der infizierenden Population wurde durch Ausplattieren und Zählen der CFU bestimmt. Überle- benskurven wurden mittels der Kaplan-Meier-Methode unter Verwendung des PRISM-Programms (GraphPAD Software, San Diego, USA) erstellt und mit dem Log- Rank-Test verglichen.Investigation used. After incubation at room The colony-forming units (CFU) were determined over a temperature of 48 to 72 hours. For systemic infections, groups of 10 mice with 5 x 10 5 living cells were inoculated by intravenous injection and the survival rate was determined (Csank et. Al., (1997 and 1998), loc. Cit., Ti pel et al., J. Bacteriol., 162 (2000), 3063-3071). The viability of the infecting population was determined by plating and counting the CFU. Survival curves were created using the Kaplan-Meier method using the PRISM program (GraphPAD software, San Diego, USA) and compared with the log rank test.
Für die mikroskopische Untersuchung der zellulären Morphologie von C. albicans während der Infektion wurden die Pilzzellen aus dem vaginalen Kanal (Tag 21) oder aus den Nieren (Tag 12) isoliert. Die Proben wurden unter Verwendung einer 20%igen KOH- Lösung bei Raumtemperatur gelöst. Proben wurden 10 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und das Sediment wurde auf Objektträger in Gegenwart von Fluoreszenzaufhellern (Calcofluor-Weiss, Sigma, Deutschland) zur Epifluoreszens-Mikroskopie (Zeiss Axi- ophot, Zeiss, Deutschland) aufgebracht.For microscopic examination of the cellular morphology of C. albicans during infection, the fungal cells were isolated from the vaginal canal (day 21) or from the kidneys (day 12). The samples were dissolved using a 20% KOH solution at room temperature. Samples were centrifuged at 1500 x g for 10 minutes and the sediment was applied to slides in the presence of fluorescent brighteners (Calcofluor-Weiss, Sigma, Germany) for epifluorescence microscopy (Zeiss Axiophot, Zeiss, Germany).
2.14. Herstellung Chip2.14. Manufacturing chip
Die Chipherstellung erfolgte anhand der Protokolle der Stanford University [31]The chip was produced using the protocols from Stanford University [31]
a) Slidepräparationa) Slide preparation
Objektträger aus Glas (im Folgenden Südes genannt) wurden wie im Protokoll [32] beschrieben mit einer Lösung bestehend aus 95%igem Ethanol und NaOH für 2 Stunden auf einem Orbitalschüttler gereinigt. Anschließendes fünfmaliges Waschen in jeweils frischem ddH20 sollte restliches NaOH vollständig entfernen. Die weitere Beschichtung mit einer Poly-L- Lysin Lösung, die kurz zuvor frisch angesetzt wurde, erfolgte für eine Stunde wiederum auf dem Orbitalschüttler. Nach nochmaligem Waschen in ddH20 wurden die Slides durch Zentrifugation bei 150x g für 5 Minuten und anschließende Inkubation bei 45 °C getrocknet.Glass slides (hereinafter referred to as south) were, as described in the protocol [32], with a solution consisting of 95% ethanol and NaOH for 2 Hours on an orbital shaker. Subsequent washing five times in fresh ddH 2 0 should completely remove residual NaOH. The further coating with a poly-L-lysine solution, which had been freshly prepared shortly before, was again carried out on the orbital shaker for one hour. After washing again in ddH 2 0, the slides were dried by centrifugation at 150 × g for 5 minutes and subsequent incubation at 45 ° C.
b) Drucken der Sondenb) printing the probes
Auswahlkriterium für die Sonden, die auf diesen Chip gedruckt werden sollten, waren Homologien in Candida albicans zu Zellwandgenen in Saccharomyces cerevisiae, sowie bekannte Zellwandgene in Candida albicans. Diese Sonden wurden im 96-Well-Platten Maßstab über PCR amplifiziert und anschließend aufgereinigt. Ein Gellauf eines l,2%igen Agarosegels bei 150 V für 1,5 Stunden gab Aufschluss über die Qualität der Sonden. Das Drucken auf die beschichteten Slides erfolgte am Spotter.The selection criteria for the probes to be printed on this chip were homologies in Candida albicans to cell wall genes in Saccharomyces cerevisiae and known cell wall genes in Candida albicans. These probes were amplified by PCR on a 96-well plate scale and then purified. Running a 1.2% agarose gel at 150 V for 1.5 hours gave information about the quality of the probes. The coated slides were printed on the spotter.
c) Post-Processing der Slidesc) Post-processing of the slides
Nach dem Drucken der Slides musste der Druckbereich vor jedem weiteren Arbeitsschritt mit einem Glas- schreiber markiert werden, um das Deckglas für die Hybridisierung auch später noch genau positionieren zu können. Damit eine gleichmäßige Verteilung der DNA in jedem einzelnen Spot gewährleistet werden konnte, wurde sie auf dem Objektträger rehydrati- siert. Hierbei ließ man die Sonden über lx SSC kurz aufquellen, um sie anschließend bei 80 °C für 3 Sekunden wieder zu trocknen. Anschließendes Fixieren der DNA auf dem Objektträger über Ausbildung kova- l'enter Bindungen erfolgte durch UV-Bestrahlung im UV-Crosslinker . Um die noch verbleibenden freien Lysingruppen zu blockieren und so unspezifische Bindungen der zu untersuchenden Proben auf der 0- berfläche zu vermeiden, wurden die Slides für 20 Minuten mit einer Blockierungslösung behandelt, die wie im Protokoll [33] beschrieben Bernsteinsäureanhydrid, Natriumborat und N-Methylpyrrolidinon ent- hielt. Danach wurde die DNA auf dem Objektträger denaturiert, indem man die Slides für 2 Minuten in einem 95°C Wasserbad beließ. Das Trocknen der Slides wurde durch Waschen in 95%igem Ethanol und anschließendem Zentrifugieren bei 150x g für 5 Minu- ten erreicht. After printing the slides, the printing area had to be marked with a glass pen before each further work step in order to be able to precisely position the cover slip for hybridization later. To ensure an even distribution of the DNA in every single spot, it was rehydrated on the slide. Here, the probes were allowed to swell briefly over 1 × SSC and then dried again at 80 ° C. for 3 seconds. Subsequent fixation the covalent DNA on the slide on training l 'enter bonds was carried out by UV irradiation in a UV crosslinker. In order to block the remaining free lysine groups and thus avoid unspecific binding of the samples to be examined on the surface, the slides were treated for 20 minutes with a blocking solution containing succinic anhydride, sodium borate and N-methylpyrrolidinone as described in the protocol [33] included. The DNA on the slide was then denatured by leaving the slides in a 95 ° C water bath for 2 minutes. The slides were dried by washing in 95% ethanol and then centrifuging at 150 × g for 5 minutes.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, welches für die Klonierung eines einen Transkriptionsfaktor kodierenden Gens geeignet ist und/oder ein Protein mit der biologischen Aktivität eines Transkriptionsfaktors kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:1. A nucleic acid molecule comprising a nucleic acid molecule which is suitable for cloning a gene encoding a transcription factor and / or encoding a protein with the biological activity of a transcription factor, selected from the group consisting of:
(a) einem Nukleinsäuremolekül, definiert in SEQ ID Nr. 1, 2, 3 oder 7, einem komplementären Strang oder Teil davon,(a) a nucleic acid molecule defined in SEQ ID No. 1, 2, 3 or 7, a complementary strand or part thereof,
(b) einem Nukleinsäuremolekül, kodierend die Aminosäuresequenz definiert in SEQ ID Nr. 4, einem komplementären Strang oder Teil davon,(b) a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence defined in SEQ ID No. 4, a complementary strand or part thereof,
(c) Nukleinsäuremolekül, das ein Derivat, eine allelische Variation und/oder ein Homolog des Nukleinsäuremoleküls von (b) darstellt .(c) Nucleic acid molecule which is a derivative, an allelic variation and / or a homologue of the nucleic acid molecule of (b).
(d) einem Nukleinsäuremolekül, erhältlich aus einer Genbank von Candida albicans un- ter Verwendung der in SEQ ID Nr. 5 und SEQ(d) a nucleic acid molecule obtainable from a Candida albicans gene bank using the ones in SEQ ID No. 5 and SEQ
ID Nr. 6 dargestellten Primer mit Hilfe des PCR-Verfahrens und (e) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem der unter (a) , ("b) , (c) oder (d) genannten Nukleinsäuremoleküle hybridisiert.ID No. 6 shown primers using the PCR method and (e) a nucleic acid molecule which hybridizes with one of the nucleic acid molecules mentioned under (a), ( " b), (c) or (d).
2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches ein regulatorisches Element ist und in SEQ ID Nr. 3 o- der 7 definiert ist.2. Nucleic acid molecule according to claim 1, which is a regulatory element and is defined in SEQ ID No. 3 or 7.
3. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches eine proteinkodierende Nukleotidsequenz enthält, die in SEQ ID Nr. 4 definiert ist.3. The nucleic acid molecule according to claim 1, which contains a protein-coding nucleotide sequence, which is defined in SEQ ID No. 4.
4. Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ein DNA- oder RNA-Molekül ist.4. Nucleic acid molecule according to one of the preceding claims, which is a DNA or RNA molecule.
5. Nukleinsäuremolekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das für die Klonierung und/oder Expression eines fungalen Transkriptionsfaktors ge- eignet ist.5. Nucleic acid molecule according to one of the preceding claims, which is suitable for the cloning and / or expression of a fungal transcription factor.
6. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei der Pilz Candida albicans ist.6. The nucleic acid molecule of claim 5, wherein the fungus is Candida albicans.
7. Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6.7. Vector comprising a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6.
8. Vektor nach Anspruch 7, wobei das Nukleinsäuremolekül unter der operativen Kontrolle mindestens eines regulatorischen Elementes steht, das die Expression einer translatierbaren RNA in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleistet.8. The vector of claim 7, wherein the nucleic acid molecule is under the operative control of at least one regulatory element which ensures the expression of a translatable RNA in pro- or eukaryotic cells.
9. Vektor nach Anspruch 8, wobei das regulatorische Element ein Promoter, Enhancer, Silencer oder 3'- Transkriptionsterminator ist. 9. The vector of claim 8, wherein the regulatory element is a promoter, enhancer, silencer or 3'-transcription terminator.
10. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das regulatorische Element eine Signalsequenz zur Lokalisierung des von dem Nukleinsäuremolekül kodierten Proteins innerhalb bestimmter Zellorganel- len, Kompartimente oder im extrazellulären Raum ist.10. Vector according to one of claims 7 to 9, wherein the regulatory element is a signal sequence for localization of the protein encoded by the nucleic acid molecule within certain cell organs, compartments or in the extracellular space.
11. Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage oder Virus ist.11. Vector according to one of claims 7 to 10, wherein the vector is a plasmid, cosmid, bacteriophage or virus.
12. Plasmid nach Anspruch 11, hinterlegt in Esche- richia coli bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13716.12. Plasmid according to claim 11, deposited in Escherichia coli at the DSMZ in Braunschweig, Germany, under the number DSM 13716.
13. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12.13. Host cell containing a vector according to one of claims 7 to 12.
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine pro- oder eukaryotische Wirtszelle ist.14. The host cell of claim 13, wherein the host cell is a pro- or eukaryotic host cell.
15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugerzelle ist.15. The host cell according to claim 14, wherein the host cell is a bacterial cell, yeast cell, insect cell or mammalian cell.
16. Escherichia coli-Zellen nach Anspruch 15, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 12, hinterlegt bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr. DSM 13716.16. Escherichia coli cells according to claim 15, containing a plasmid according to claim 12, deposited with the DSMZ in Braunschweig, Germany, under the number DSM 13716.
17. Candida albicans-Zellen, hinterlegt bei der DSMZ in Braunschweig, Deutschland, unter der Nr.17. Candida albicans cells, deposited with the DSMZ in Braunschweig, Germany, under the no.
DSM 13722.DSM 13722.
18. Verfahren zur Herstellung eines Transkriptionsfaktors, wobei eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17 in einem geeigneten Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expression des Transkriptionsfaktors erlauben und dieser gewonnen wird.18. A method for producing a transcription factor, wherein a host cell according to any one of claims 13 to 17 in a suitable culture medium is cultivated under conditions which allow expression of the transcription factor and this is obtained.
19. Protein mit den biologischen Aktivitäten von CaTECl und einer Aminosäuresequenz dargestellt in19. Protein with the biological activities of CaTECl and an amino acid sequence shown in
SEQ ID Nr. 4.SEQ ID No. 4.
20. Protein, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 18.20. Protein produced by the method according to claim 18.
21. Antisense-RNA-Sequenz, die komplementär zu ei- ner mRNA ist, die von einer Nukleinsäure • nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transkribiert ist, und selektiv an die mRNA oder einen Teil davon binden kann, wobei die Antisense-RNA-Sequenz die Synthese des von den Nukleinsäuremolekülen kodierten Proteins inhibieren kann.21, antisense RNA sequence which is complementary to a mRNA transcribed from a nucleic acid • according to one of claims 1 to 6, and can selectively bind to the mRNA or a portion thereof, wherein said antisense RNA Sequence can inhibit the synthesis of the protein encoded by the nucleic acid molecules.
22. Ribozym, das selektiv an die mRNA, die von einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transkribiert ist, oder einen Teil davon binden und diese spalten kann, wobei die Synthese des von dem Nukleinsäuremolekül kodierten Proteins inhibiert wird.22. Ribozyme which can selectively bind to the mRNA which is transcribed from a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6, or can bind a part thereof and cleave it, the synthesis of the protein encoded by the nucleic acid molecule being inhibited.
23. Inhibitor, der die Aktivität eines Proteins nach Anspruch 19 oder 20 supprimieren kann.23. An inhibitor which can suppress the activity of a protein according to claim 19 or 20.
24. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach An- spruch 19 oder 20 erkennt und bindet.24. Antibody which specifically recognizes and binds a protein according to claim 19 or 20.
25. Antikörper nach Anspruch 24, der ein monoklona- ler, polyklonler und/oder modifizierter Antikörper ist. 25. Antibody according to claim 24, which is a monoclonal, polyclonal and / or modified antibody.
26. Antikörper, der gegen einen Antikörper nach Anspruch 25 gerichtet ist.26. Antibody directed against an antibody according to claim 25.
27. Verfahren zur Diagnose eine Caπdida-Infektion, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, die im Verdacht steht, das CaTECl-Protein und/oder eine Ca TECl kodierende Nukleinsäure zu enthalten, mit einer Substanz, die mit Ca TECl und/oder einer CaTECl kodierenden Nukleinsäure reagiert und das Nachweisen von CaTECl und/oder der CaTECl kodieren- den Nukleinsäure.27. A method for diagnosing a Caπdida infection, comprising contacting a sample suspected of containing the CaTECl protein and / or a Ca TECl-encoding nucleic acid with a substance encoding Ca TECl and / or a CaTECl Nucleic acid reacts and the detection of CaTECl and / or the CaTECl-encoding nucleic acid.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Substanz eine CaTECl-spezifische Nukleinsäuresonde ist.28. The method according to claim 27, wherein the substance is a CaTECl-specific nucleic acid probe.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die CaTECl- spezifische Nukleinsäuresonde die Nukleinsäurese- quenzen 5'-TTT AGG ATC CAA TGA TGT CGC AAG CTA CTC C-3' und 5'-TTT AGG ATC CAC TAA AAC TCA CTA GTA AAT CCT TCT G-3' umfasst.29. The method according to claim 28, wherein the CaTECl-specific nucleic acid probe has the nucleic acid sequences 5'-TTT AGG ATC CAA TGA TGT CGC AAG CTA CTC C-3 'and 5'-TTT AGG ATC CAC TAA AAC TCA CTA GTA AAT CCT TCT G-3 'includes.
30. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Substanz ein gegen Ca TECl gerichteter Antikörper ist.30. The method of claim 27, wherein the substance is an antibody directed against Ca TECl.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei die Substanz nachweisbar markiert ist.31. The method according to any one of claims 27 to 30, wherein the substance is detectably marked.
32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Radioisotop, einer Bioluminiszenz-Verbindung, einer Chemiluminiszenz-Verbindung, einer Fluoreszenz-Verbindung, einem Metallchelat oder einem Enzym.32. The method according to claim 31, wherein the label is selected from the group consisting of a radioisotope, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a fluorescent compound, a metal chelate or an enzyme.
33. Verfahren zur Behandlung einer Candida- Infektion, umfassend die Verabreichung einer thera- peutisch wirksamen Menge einer Substanz, die die Expression von CaTECl oder die Aktivität von Ca TECl verringert oder inhibiert, an ein Säugetier.33. A method of treating a Candida infection, comprising administering a therapeutically effective amount of a substance that Expression of CaTECl or the activity of Ca TECl decreased or inhibited in a mammal.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Candida- Infektion eine Mucosa- oder systemische Infektion ist.34. The method of claim 33, wherein the Candida infection is a mucosal or systemic infection.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Substanz eine Nukleotidsequenz ist, die eine Antisense-RNA umfasst.35. The method of claim 33 or 34, wherein the substance is a nucleotide sequence comprising an antisense RNA.
36. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, wobei die Substanz eine Nukleotidsequenz ist, die ein Ribozym umfasst .36. The method of claim 33 or 34, wherein the substance is a nucleotide sequence comprising a ribozyme.
37. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Substanz ein Inhibitor von Ca TECl ist.37. The method of claim 19 or 20, wherein the substance is an inhibitor of Ca TECl.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Inhibitor ein gegen CaTECl gerichteter Antikörper oder ein38. The method of claim 37, wherein the inhibitor is an anti-CaTECl antibody or
Fragment davon ist.Fragment of it is.
39. Diagnostische Zusammensetzung, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, ein Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 eine Antisense-RNA nach Anspruch 21, ein Ribozym nach Anspruch 22, einen Inhibitor nach Anspruch 23 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26.39. Diagnostic composition containing a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6, a vector according to one of claims 7 to 12, a protein according to one of claims 19 or 20, an antisense RNA according to claim 21, a ribozyme according to claim 22, one Inhibitor according to claim 23 and / or an antibody according to one of claims 24 to 26.
40. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, ein Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 ei- ne Antisense-RNA nach Anspruch 21, ein Ribozym nach Anspruch 22, einen Inhibitor nach Anspruch 23 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26, gegebenenfalls zusammen mit einem' pharmazeutisch verträglichen Träger.40. Pharmaceutical composition containing a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6, a vector according to one of claims 7 to 12, a host cell according to one of claims 13 to 17, a protein according to one of claims 19 or 20, an antisense The RNA of claim 21, a ribozyme after Claim 22, an inhibitor according to claim 23 and / or an antibody according to any one of claims 24 to 26, optionally together with a 'pharmaceutically acceptable carrier.
41. Diagnostischer Kit, geeignet zum Nachweis einer Candida-Infektion, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach . einem der Ansprüche 1 bis 6, einen Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, ein Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20, eine Antisense-RNA nach Anspruch 21, einem Ribozym nach Anspruch 22, einen Inhibitor nach Anspruch 23 und/oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26.41. Diagnostic kit, suitable for the detection of a Candida infection, containing a nucleic acid molecule after. one of claims 1 to 6, a vector according to any one of claims 7 to 12, a host cell according to any one of claims 13 to 17, a protein according to any one of claims 19 or 20, an antisense RNA according to claim 21, a ribozyme according to claim 22 , an inhibitor according to claim 23 and / or an antibody according to any one of claims 24 to 26.
42. Diagnostischer Kit, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welches spezifisch mit Ca TECl Gensequenzen hybridisiert und/oder einen CaTECl spezifischen Antikörper oder ein Ca TECl bindendes Fragment davon.42. Diagnostic kit containing a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6, which hybridizes specifically with Ca TECl gene sequences and / or a CaTECl specific antibody or a Ca TECl binding fragment thereof.
43. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eines Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 12, einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, eines Proteins nach einem der Ansprüche 19 oder 20, einer Antisense-RNA nach Anspruch 21, eines Ribozyms nach Anspruch 22, eines Inhibitors nach Anspruch 23 und/oder eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 24 bis 26 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von durch Arten der Gattung Candida verursachten Krank- heiten.43. Use of a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6, a vector according to one of claims 7 to 12, a host cell according to one of claims 13 to 17, a protein according to one of claims 19 or 20, an antisense RNA according to claim 21 , a ribozyme according to claim 22, an inhibitor according to claim 23 and / or an antibody according to any one of claims 24 to 26 for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases caused by species of the genus Candida.
44. Verfahren zum Auffinden und Identifizieren therapeutisch gegen durch Arten der Gattung Candida verursachten Krankheiten wirksamer Substanzen, wobei eine zu testende Substanz in einem geeigneten Medium mit mindestens einem Agens, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einem Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einem Protein nach einem der Ansprüche 19 oder 20 einer Antisense-RNA nach Anspruch 21, eines Ribozy s nach Anspruch 22, eines Inhibitors nach Anspruch 23 und/oder einem Antikörper nach einem der Ansprüche 24 bis 26 in Kontakt gebracht wird und eine Interaktion zwischen den zu testenden Substanzen und einem der genannten Agenzien nachgewiesen wird.44. Methods of finding and identifying therapeutically against species of the genus Candida caused diseases of effective substances, wherein a substance to be tested in a suitable medium with at least one agent selected from the group consisting of a nucleic acid molecule according to any one of claims 1 to 6, a vector according to any one of claims 7 to 12, a host cell according to one of the Claims 13 to 17, a protein according to one of claims 19 or 20, an antisense RNA according to claim 21, a ribocyte according to claim 22, an inhibitor according to claim 23 and / or an antibody according to one of claims 24 to 26 and an interaction between the substances to be tested and one of the agents mentioned is detected.
45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Bindung der zu testenden Substanz an ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 nachgewiesen wird.45. The method according to claim 44, wherein the binding of the substance to be tested to a double-stranded nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 6 is detected.
46. Verfahren nach Anspruch 44, wobei ' die zu tes- tende Substanz ein Oligonukleotid oder ein Derivat davon ist.46. The method of claim 44, wherein 'the TES to tend substance an oligonucleotide or a derivative thereof.
47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Bindung auf der Bildung einer DNA triple Helix beruht.47. The method of claim 46, wherein the binding is based on the formation of a DNA triple helix.
48. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die zu tes- tende Substanz ein protein nucleic acid (PNA) Molekül ist. 48. The method of claim 45, wherein the substance to be tested is a protein nucleic acid (PNA) molecule.
EP01984654A 2000-09-13 2001-09-13 The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein Withdrawn EP1319075A2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23093600P 2000-09-13 2000-09-13
DE10045123 2000-09-13
US230936P 2000-09-13
DE10045123A DE10045123B8 (en) 2000-09-13 2000-09-13 The C. albicans TEC1 GEN (CaTEC1) and the encoded Tec1p protein
PCT/EP2001/010596 WO2002022825A2 (en) 2000-09-13 2001-09-13 The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1319075A2 true EP1319075A2 (en) 2003-06-18

Family

ID=26007032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP01984654A Withdrawn EP1319075A2 (en) 2000-09-13 2001-09-13 The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1319075A2 (en)
AU (1) AU2002218175A1 (en)
WO (1) WO2002022825A2 (en)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2785619B1 (en) * 1998-11-10 2001-01-12 Hoechst Marion Roussel Inc CANDIDA ALBICANS (CatfIIIA) tfIIIA GENE AND CATFIIIA CODED PROTEIN

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0222825A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002022825A3 (en) 2002-12-19
WO2002022825A2 (en) 2002-03-21
AU2002218175A1 (en) 2002-03-26
WO2002022825A9 (en) 2002-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69333110T2 (en) WITH THE CYTOTOXIN OF HELICOBACTER PYLORI ASSOCIATED, IMMUNODOMINANT ANTIGEN USED IN VACCINE AND FOR DIAGNOSIS
Saville et al. Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection
DE69233417T2 (en) Immunogenic, non-toxic mutants of cholera toxin and toxin LT, their preparation and their use in the preparation of vaccines
DE60129202T2 (en) CASPASES ACTIVATORS
DE60318391T2 (en) BACTERIOPHAGES-LYSINE
DE69937694T2 (en) Target of the RNAIII activating protein (TRAP)
DE69634918T2 (en) POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES FROM PATHOGENIC MYCOBACTERIA AND THEIR USE AS DIAGNOSTICS, VACCINES AND AS THE AIM OF CHEMOTHERAPY
DE60132084T2 (en) VIRGIN GENES, PROTEINS AND ITS USE
DE60036555T2 (en) POLYPEPTIDE FRAGMENTS WITH A C-TERMINAL PART OF CATALASE FROM HELICOBACTER
DE19617940A1 (en) Epididymis-specific receptor protein and its use
EP0852623B1 (en) Nucleic acid molecules which code for proteins which mediate the adhesion of neisseria cells to human cells
EP1319075A2 (en) The c. albicans tec1 gene (catec1) and the coded tec1p protein
DE10023130B4 (en) Hypha specific factors from Candida albicans
DE10045123B4 (en) The C. albicans TEC1 GEN (CaTEC1) and the encoded Tec1p protein
EP1727829B9 (en) Hypha-specific cell wall proteins of candida
Matthews et al. The epidemiology and pathogenesis of candidiasis: applications in prevention and treatment
DE10142743B4 (en) Biochips with dimorphism-specific factors from Candida albicans
DE69735885T2 (en) DETECTION OF PYRAZINAMIDE RESISTANT MYCOBACTERIA AND METHOD FOR THE TREATMENT OF MYCOBACTERIAL INFECTIONS
EP1349871A2 (en) Novel marker for the diagnosis and therapy of tumours
DE69730313T2 (en) METHOD OF INACTIVATING PROTEINS OF THE RAS UNDERFAMILY AND COMPOUNDS THEREOF
JP7359366B2 (en) Antifungal agent screening method
DE1617659A1 (en) Polynucleotides which are effective as compounds inducing interferon production in living animal cells
DE69935247T2 (en) MEDICINAL TARGETS IN CANDIDA ALBICANS
DE60127401T2 (en) MILK CATCH IMMUNIZATION WITH MIG PROTEIN
EP1196608A2 (en) Novel antifungal agents and fungicides, method for the production thereof and their use

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

AK Designated contracting states

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO SI

17P Request for examination filed

Effective date: 20030620

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET ERLANGEN-NUERNBER

Owner name: FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DERANGEWAND

RAP1 Party data changed (applicant data changed or rights of an application transferred)

Owner name: FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET ERLANGEN-NUERNBER

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20060718