EP1313852A2 - Dna binding peptide domains and a method for providing domains of this type - Google Patents

Dna binding peptide domains and a method for providing domains of this type

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Publication number
EP1313852A2
EP1313852A2 EP01971927A EP01971927A EP1313852A2 EP 1313852 A2 EP1313852 A2 EP 1313852A2 EP 01971927 A EP01971927 A EP 01971927A EP 01971927 A EP01971927 A EP 01971927A EP 1313852 A2 EP1313852 A2 EP 1313852A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
biomorphic
seq
transcription
peptides
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01971927A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Andreas Kappel
Norbert Windhab
Thomas Wagner
Stefan Kienle
Karsten Kuhn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xzillion GmbH and Co KG
Original Assignee
Xzillion GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xzillion GmbH and Co KG filed Critical Xzillion GmbH and Co KG
Publication of EP1313852A2 publication Critical patent/EP1313852A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • DNA binding peptide domains and a method for providing such domains.
  • the present invention relates to easily synthetically accessible peptide domains that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences, and to a method for finding and providing specifically DNA-binding peptide domains, and biomorphic factors derived therefrom, in particular transcription factors and repressors.
  • RNA Transcription of DNA into RNA is the first step in gene expression.
  • the strength of the transcription of a gene and thus the amount of RNA formed is determined by regulatory promoter elements and enhancer elements associated with the genes, to which transcription factors bind.
  • these proteins bind sequence-specifically to short DNA sections in the regulatory elements of the genes.
  • transcription factors contain one or more activator or repressor domains. Activator domains increase the transcription of the gene belonging to the regulatory element bound by the transcription factor, while repressor domains weaken the transcription of the gene. Both are done by recruiting additional proteins through the activator or repressor domains via protein-protein interactions.
  • the DNA sequence of the regulatory elements of a gene and the protein domains that bind specifically to this sequence therefore act as complementary addresses which, when interacting, locate activator and repressor domains, which ultimately determine the transcriptional strength of a gene.
  • Another method involves introducing relatively large amounts of short double-stranded DNA molecules into cells that contain a binding site for a transcription factor that is responsible for the deregulated transcription of the respective gene.
  • the selected transcription factor is competitively intercepted and can therefore no longer bind to the binding sites in the regulatory elements of its target genes, as a result of which the transcription of these genes is indirectly inhibited (overview in Suda et al., Endocr. Rev., 1999 , 20, 345-357; S. Yla-Hertttuala and JF Martin, The Lancet 355, 213-222, 2000).
  • a relatively new method for regulating transcription is represented by synthetic transcription factors from the class of zinc finger proteins from Cys 2 -His 2 (DJ. Segall, B. Dreier, RRBeerli, C, F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 1999, 96, 2758-2763). These factors bind to the large groove of the DNA by means of a finger-like structure in which a short ⁇ -helix and an antiparallel ⁇ -sheet are complexed together by a zinc atom (D. Rhodes, A. Klug, Sei. Am., 1993, 268 , 32-39).
  • the DNA binding activity of the zinc finger proteins has a modular structure.
  • multifinger proteins are usually encoded in a phage library, which is why the members of the library that bind to a specific DNA sequence of the target gene can be isolated using the phage display methodology.
  • the cDNA of the DNA-binding polypeptide is then fused with the cDNA of an activator or repressor domain; the resulting fusion protein thus represents a specific regulator of the target gene (overview of the methodology in DJ. Segal and CF Barbas III, Curr. Opin Chem. Biol., 2000, 4, 34-39; A. Klug, J. Mol. Biol. , 1999, 293, 215-218).
  • the task is to provide short peptide biomorphic factors that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences and to provide a method for the discovery of such biomorphic factors.
  • Any two peptides are preferably selected from this group, which form a homo- or heterodimeric molecule or a mixture of homo- and heterodimeric molecules via a suitable linker.
  • Structural variants are understood to be amino acid sequences which have at least a homology of 75%, preferably a homology of more than 90%, to the Seq. Have ID No.1. Functional variants are preferred which can enter into a sequence-specific DNA binding.
  • linkers All compounds which dimerize two peptides from the group with the Seq are suitable as linkers. ID No. 1 or their structural variants in solution.
  • the linkers can be free organic or inorganic substances that can be added to the peptides according to the invention. Examples of this are e.g. B. complexing agents that can form coordinative bonds with the free amino or carboxy termini of peptides.
  • the linkers and peptides can also be covalently linked by chemical modification of at least one of the peptides.
  • Peptide linkers can also be fused directly to at least one of the peptides. Fusion proteins are preferred which, in addition to a DNA-binding domain according to Seq ID No. 1 or a structural variant have a leucine zipper amino acid domain.
  • Seq. ID No. 2 exemplifies the amino acid sequence of such a fusion protein.
  • the peptides according to the invention can be prepared synthetically using methods known to the person skilled in the art (for example after Merryfield synthesis), the peptides can also be obtained by molecular biological methods, such as expression in cell culture or in fermenters.
  • the short dimers the peptides with Seq. ID No. 1 or its variants contain specific DNA sequences and can therefore regulate the activity of genes in living cells. Due to the shortness of the amino acid sequence, the peptides are easily accessible synthetically, and due to the shortness of the peptides, the transport through cell membranes is facilitated.
  • the high stability of the conformation of the peptides according to the invention ensures that their function, that is to say the ability to bind DNA in a sequence-specific manner, is retained during transport through cell membranes. Due to the different structure of the peptides compared to other artificial transcription factors, certain DNA sequence motifs can also be better bound.
  • the dimers according to the invention are suitable as a module for the construction of artificial activating or repressing transcription factors.
  • the DNA binding domains are fused with known nuclear transport signal domains, transcription activation domains or transcription inhibition domains such as, for example, the core localization signal of the SV40 T antigen, the transcription activator domain of the viral VP16 protein, or the KRAB repressor domain.
  • the artificial biomorphic factors generated in this way can be used to control transcription and thus also to regulate the expression of genes.
  • the artificial biomorphic factors according to the invention thus enable the investigation of phenotypic effects of expression changes of individual genes in vivo. Above all, the use of such biomorphic factors to combat diseases that are based on misregulated gene transcription, such as. B. cancer, inflammatory reactions or addictions is of great interest.
  • the biomorphic factors are used as biopharmaceuticals, their easy physiological degradability is also advantageous.
  • the present invention therefore furthermore also relates to a medicament which contains the peptide monomers or dimers according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, and to a process for the preparation of a medicament for the treatment of diseases which result from misregulated or from the expression of mutated genes , in which a peptide monomer or dimer according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and / or auxiliaries.
  • the invention further relates to the peptides according to the invention according to Seq ID No. 1 or DNA sequences encoding their structural variants (Seq. ID No. 3) or nucleic acids comprising these sequences.
  • Structural variants are understood to be nucleic acids with a different sequence, the proteins according to Seq ID No. 1 or code their structural variants. Preference is given to nucleic acids which encode functional variants of these proteins.
  • DNA sequences which code for fusion proteins from the DNA-binding domains according to the invention and a leucine zipper domain are preferred.
  • nucleic acids according to the invention can encoding areas such. B. for Kemtspragsignaldomainen (nuclear localization signals), transcription activation domains (z. B. from transcription factors) or transcription inhibition domains.
  • the nucleic acids according to the invention can for example be chemically based on the sequences disclosed in SEQ ID No 3 or 4 or on the basis of the peptide sequences disclosed in SEQ ID No 1 or 2 or their structural variants using the genetic code z.
  • B. can be synthesized by the phosphotriester method (see e.g. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).
  • deoxyribonucleic acids according to the invention can be used for gene therapy purposes but also for the investigation of phenotypic effects by changing the expression of individual genes in vivo. For this, DNA fragments must be introduced into suitable expression vectors.
  • pro- or eukaryotic expression vectors can be used as vectors.
  • virus vectors preferably adenovirus vectors, in particular replication-deficient adenovirus vectors, or adeno-associated virus vectors, for example an adeno-associated virus vector which consists exclusively of two inserted terminal repeat sequences (ITR).
  • adenovirus vectors are described, for example, in McGrory, WJ. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in ⁇ ukaryotic Viral Vectors "(Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J .. 5, 2377 or WO95 / 00655.
  • Suitable adeno-associated virus vectors are described, for example, in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO95 / 23867; Samulski, RJ. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95 / 23867; Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 or Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793.
  • Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes.
  • Lipid mixtures such as those from Feigner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Be. USA 86, 6982; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 or Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195.
  • the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the DNA is completely complexed by the liposomes.
  • nucleic acids according to the invention are therefore in an expression vector, preferably in an expression vector which is suitable for gene therapy use or for the production of transgenic microorganisms, plants or animals.
  • the present invention therefore furthermore also relates to a medicament which, using the nucleic acids according to the invention, is suitable, if appropriate, using further additives or auxiliaries for gene therapy use in diseases which are due to misregulated or to the expression of mutated genes.
  • a medicament is suitable which contains the nucleic acids according to the invention in naked form or in the form of one of the above contains described gene therapy vectors or in complexed form with liposomes.
  • Suitable additives and / or auxiliary substances are e.g. a physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors, nuclease inhibitors etc.
  • Another object of the invention is a library which contains deoxyribonucleic acids, the sequences according to Seq. ID No. 3 or have a structural variant thereof and the coding regions of which contain a transcription activation domain (AD) and optionally a core transport sequence domain (NLS) in the open reading frame. It is also preferred if the DNAs additionally contain a linker-coding region, particularly preferably a leucine zipper (FIG. 1).
  • the components of the library encoding peptide monomers form, in solution, preferably under physiological conditions, homo- and / or heterodimeric biomorphic transcription factors.
  • An example is the structural structure of the members of a library containing deoxyribonucleic acids, comprising regions coding for NLS and AD, in Seq. ID No 5 and Fig. 1 shown.
  • the library contains DNA sequences which code for the individual monomers of the biomorphic transcription factors and whose peptide monomers after expression in a transformed expression system, such as. B. in e. coli or in yeast, via suitable linker dimerization.
  • pro- and / or eukaryotic expression vectors can be used as vectors.
  • the expression vectors also contain suitable regulatory sequences for the host cell, such as e.g. B. the trp promoter for expression in e. coli or the ADH-2 promoter for expression in yeast, the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells.
  • Libraries are preferred which contain all possible cDNA sequences according to Seq. ID No 3 or a structural variant contained one or more times.
  • the DNA sequences of the library can be present and stored in sequential form, in the form of a suitable vector or in the form of a cellular expression system transformed with these vectors.
  • the invention further encompasses the biomorphic transcription factors expressible with the aid of these libraries.
  • biomorphic transcription factors expressible with the aid of these libraries.
  • pure peptide libraries can also be obtained from biomorphic transcription factors.
  • the artificial synthesis of biomorphic transcription factors to create a peptide library can also be carried out.
  • An example is the structural structure of the members of a library containing peptides in Seq. ID No 6 shown.
  • Another object is a method for finding peptidic biomorphic factors that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences.
  • a cellular expression system is chosen in which an essential gene is defective.
  • the cellular expression system is transformed with a corresponding wild-type gene that is controlled by a promoter that allows basal transcription (insertion element).
  • the transforming construct contains a DNA sequence which is to be tested for sequence-specific binding biomorphic factors (response element).
  • Regulatory DNA sequences such as promoters or operators are of particular interest as the response element.
  • gene-specific DNA sequences of the coding region of a gene in particular specific DNA sequences of a mutated region of a gene, are also preferred objects of investigation. All lethal defect mutants which can be cultivated via an inhibitable basal transcription of an introduced wild-type gene or via a directly lethally inhibitable gene product can be used as the cellular expression system. Easily cultivable microorganisms, such as. B. e. coli or yeasts are used, but cell cultures from higher organisms can also be used as an expression system.
  • known HIS - yeast cells can be used as an expression system.
  • the yeast cells are transformed with a construct that a DNA sequence with a wild-type binding site, e.g. B. contains for transcription factors, enhancers or repressors in one or more versions.
  • the double-stranded sequences to be tested for binding biomorphic factors can be inserted into a vector containing a wild-type HIS gene, such as the pHISi vector (Clontech, Heidelberg).
  • the HIS gene of the pHISi vector is under the control of a minimal promoter.
  • the method according to the invention for finding sequence-specific DNA-binding biomorphic transcription factors and thus suitable binding domains comprises the following method steps:
  • Promoters and a response element with a bank of expression vectors containing the invention
  • Binding site (Fig. 2A) highlighted in gray) contains three (3xE2Fwt sequence, Seq. ID
  • each of the single-stranded 10 ⁇ M oligonucleotides 3xE2F wtsense Seq. ID No 7 and 3xE2F wtas Seq. ID No 8 were in 100 ⁇ l 10mM Tris-HCI pH7.9, 50mM NaCI,
  • the 3xE2Fwt sequence is cloned into the Kpnl and Sacl restriction sites of the pGL-2 vector (Promega, Madison, Wl USA).
  • 3 ⁇ g pGL-2 with 20u Kpnl and Sacl each were completely digested and purified using an agarose gel.
  • the DNA was freed from agarose residues using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) and taken up in 50 ⁇ l water.
  • 10 ⁇ l of the purified vector were ligated with 1 ⁇ l of the double-stranded oligo using the T4 DNA ligase in a 20 ⁇ l mixture for 2 h at 25 ° C.
  • the E.coli k12 strain "Goldstar” (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) was shaken and grown overnight at 37 ° C. and 200 RPM in LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin. The next morning, 1 ml the bacterial culture was inoculated into 200 ml of fresh medium and shaken to an optical density of 0.565 at 595 nm at 37 ° C. and 200 RPM, the culture was then cooled to 4 ° C.
  • the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated with shaking at 37 ° C. for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. Individual clones were isolated and grown in 3 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. overnight. The plasmid DNA was isolated and purified from the bacteria using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • Positive clones were identified by PCR as follows: 1 ⁇ l DNA, 0.5 ⁇ l corresponding to 5U Taq polymerase (Promega, Madison, USA), 5 ⁇ l 10 ⁇ reaction buffer (Promega, Madison, USA), 0.4 ⁇ l deoxynucleotide triphosphate (jelO ⁇ M), 4 ⁇ l 12.5mM MgCI 2 , as well as 0.3 ⁇ l of 100 ⁇ M oligonucleotides and distilled water ad 50 ⁇ l were heated to 94 ° C for 3min. This was followed by 30 cycles at 94 ° C. for 20 seconds, 50 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 45 seconds, followed by an incubation at 72 ° C. for 5 minutes.
  • PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and thus their size was determined.
  • Bacterial colonies whose plasmid DNA had a PCR product of the expected size were shaken in 50 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicilin for 13 hours at 37 ° C. and 250 RPM.
  • the plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Midi Prep Kit (Qiagen / Hilden).
  • the DNA was resuspended in distilled water.
  • the 3xE2Fwt sequence thus amplified was then isolated from the vector. For this purpose, 3 ⁇ g of the plasmid with 20U Xmal and Mlul were digested completely for 3 hours.
  • the mixture was then separated on an agarose gel, and the 3xE2Fwt insertion sequence migrating at 68 bp was cut out with a scalpel.
  • 3 ⁇ g pHISi (Clontech, Heidelberg), each with 20U Xmal and Mlul, were completely digested for 3 hours and cleaned using an agarose gel.
  • the DNA samples were then freed of agarose using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions and taken up in 50 ⁇ l water.
  • the culture was then cooled to 4 ° C. and centrifuged at 2500 ⁇ g, the supernatant was discarded and the pelleted bacteria were removed in 7.5 ml LB medium with 10% (w / v) polyethylene glycol-6000, 5% dimethyl sulfoxide, 10mM MgSO 4 , 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8, incubated for one hour on ice, snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C.
  • 10 ⁇ l of the ligation mixture was taken up in 100 ⁇ l 100 mM KCI, 30 mM CaCl 2 , 50 mM MgCl 2 and incubated with 100 ⁇ l of the thawed bacteria for 20 min on ice
  • the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated with shaking at 37 ° C. for one hour.
  • the mixture was then spread on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight.
  • Individual clones were isolated and grown in 3 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. overnight.
  • the plasmid DNA was isolated and purified from the bacteria using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions. Positive clones were identified by digestion with Xmal and Mlul. The corresponding bacteria were shaken in 50 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicilin for 13 hours at 37 ° C. and 250 RPM. The plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Midi Prep Kit (Qiagen / Hilden). The DNA was resuspended in distilled water. The resulting plasmid is called pHISi3xE2Fwt (Seq. ID. No. 9).
  • the HIS3 gene of the vector is placed under the control of the insertion element in addition to the basal HIS3 promoter present in the vector.
  • the yeast strain YM 4271 (Clontech, Heidelberg) is treated with the pHISi-3xE2Fwt vector thus prepared according to the manufacturer's instructions (Yeast Protocols Handbook, Clontech, Heidelberg pp.
  • This culture was incubated with shaking at 30 ° C until it had an optical density at 600 nm of 0.4-0.6. The culture was then centrifuged at 1000xg for 5 minutes and the cells were taken up in 1.5 ml of 100 mM lithium acetate pH 7.5, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA.
  • 100 ⁇ l of the cells, 50 ⁇ l of the linearized plasmid and 100 ⁇ g of heat-denatured salmon sperm DNA were mixed with 600 ⁇ l of a PEG / LiAc solution (100mM lithium acetate pH 7.5, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 40% (w / v) polyethylene glycol) 4000) and shaken at 30 ° C for 30 min. After the addition of 70 ⁇ l dimethyl sulfoxide, the mixture was incubated at 42 ° C. for 15 min.
  • a PEG / LiAc solution 100mM lithium acetate pH 7.5, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 40% (w / v) polyethylene glycol
  • the cells were then centrifuged off, washed in 1 ml of 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA and completely plated onto a minimal medium agar plate without histidine addition, on which 12 colonies had grown after 7 days at 30 ° C.
  • HIS3 The low basal expression of HIS3 allows the selection of transformed YM 4271 yeasts which have inserted the insertion element into their chromosomal DNA by dislodging the cell cultures on SD agar plates with histidine-free medium. The YM 4271 yeast strains growing under these conditions are isolated.
  • the increasing amounts of the HIS3 antagonist 3-aminotriazole (3-AT) contained OmM, 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 6mM, 9mM , 12mM, 15mM, 18mM, 30mM, 45mM; one clone was already evident at 0.5mM and completely suppressed at 2mM; this and another clone no longer grew at 3mM, while the 10 others were only inhibited in growth at> 30mM.
  • yeast3xE2Fwt The growth of one of these colonies, designated as yeast3xE2Fwt, was already completely suppressed at a concentration of 2mM 3-AT (FIG. 2D) without antagonists (FIG. 2C)). This colony was isolated and used for further investigations.
  • the selected strain yeast3xE2Fwt has an advantageous very low basal expression level of HIS3, which is competitively inhibited even by small amounts of 3-AT.
  • the strain is called YM 4271 3xE2Fwt
  • 3 ⁇ g pGADD424 (Clontech / Heidelberg, Seq. ID No 11) were completely digested with 20u EcoRl and BamHI each and purified using an agarose gel. 1 ⁇ g of the double-stranded peptide domain encoding oligonucleotide Seq ID No 10 was synthesized and digested for 3 h with 10 ⁇ EcoRI and Bam HI in each case and purified using an agarose gel. Subsequently, the DNA was freed from agarose residues using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) and taken up in 50 ⁇ l water.
  • QiaQuick Gel Extraction Kit Qiagen / Hilden
  • 3 ⁇ l of the vector were ligated with 0.1 ⁇ l, 0.3 ⁇ l and 1 ⁇ l of the oligonucleotide for 3 h at room temperature in 20 ⁇ l batches using the T4-DNA ligase. The batches were then shaken with 200 ⁇ l each of n-butanol and centrifuged for 10 minutes at 13000 rpm in a table centrifuge. The supernatants were discarded and the DNA was removed from butanol residues by evaporation in vacuo and taken up in 10 ⁇ l water each. For the transformation, 500 ml of an exponentially growing bacterial culture of the E.
  • coli K12 strain TOP10 was centrifuged for 10 min at 4000xg, resuspended in 500 ml of cold water and centrifuged again. This procedure was repeated twice. The bacteria were then taken up in 7.5 ml of 10% glycerol (v / v) and snap-frozen as 40 ⁇ l aliquots in liquid nitrogen. For the actual transformation, 5 ⁇ l each of the purified ligation batches described above were mixed with an aliquot of the bacteria thawed on ice and transferred to a cold electroporation cuvette.
  • the bacteria were made for shaken for 1 hour in 1 ml LB medium at 37 ° C and 250 RPM and then incubated on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicilin at 37 ° C overnight. The following day, the clones of the densely overgrown plates were scraped off and shaken in 250 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicilin for 3 hours at 37 ° C. and 250 RPM. The plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Maxi prep kit (Qiagen / Hilden). The DNA was resuspended in distilled water and had a concentration of 1.3 ⁇ g / ⁇ l.
  • the generated cDNA library is transformed into the yeast strain yeast3xE2Fwt according to the manufacturer (Yeast protocols handbook, Clontech, Heidelberg) as follows:
  • the cells were then centrifuged, washed in 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA and completely on 6 minimal medium agar plates without the addition of JHistidine and leucine and 2mM 3- Aminotriazole plated on which 153 colonies had grown after 7 days at 30 ° C.
  • yeast strains which contain both the insertion element and a library component including the pGAD424 vector Leu2 marker is carried out simply by plating on SD agar plates without histidine and leucine.
  • the yeast colonies growing under the given selection conditions are transformed with library components which code for expressible biomorphic transcription factors, the action of which is specifically directed towards the HIS3 gene and the E2F binding site, the only multiply occurring sequence of the HIS3 promoter (the HIS3 expression can be regulate only by factors that bind to multiple repetitions of the sequence, since only the binding of several transcription factors leads to a cooperative and thus steep increase in transcription initiation.
  • These colonies therefore have library members whose expression products specifically bind to the trimerized E2F binding site of the HIS3 gene construct.
  • the plasmids were isolated from 32 of the yeast cell cultures, transformed into E. coli and propagated (Yeast protocols handbook, Clontech, Heidelberg).
  • yeast colonies were shaken in 0.5 ml SD minimal medium without addition of histidine and leucine at 30 ° C. overnight. The next day the cells Pellettiert by centrifugation and removed so much from the medium that about 50 ⁇ l remained. In this medium residue, the cells were resuspended by vortexing and a spatula tip of the cell wall-destroying enzyme lyticase was added. The cells were incubated for one hour at 37 ° C. while shaking, and 10 ⁇ l of a 20% sodium dodecyl sulfate solution were then added. For lysing, the cells were vortexed for 1 min, briefly frozen at -20 ° C. and thawed quickly.
  • the cell debris was separated by centrifugation at 14,000 rpm, and the plasmid DNA present in the supernatant was freed of impurities using the QiaQuick PCR Purification Kit and taken up in 50 ⁇ l water.
  • the plasmid DNA was then transformed into bacteria and expanded in order to obtain larger amounts of the plasmids.
  • the E.coli k12 strain “Goldstar” (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) was shaken and grown overnight at 37 ° C. and 200 RPM in LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the isolated plasmid DNA was taken up in 100 ⁇ l 100 mM KCI, 30 mM CaCl 2 , 50 mM MgCI 2 and incubated with 100 ⁇ l of the thawed bacteria for 20 min on ice, after a 10-minute period incubation at room temperature, the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated at 37 ° C. with shaking for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. A single clone was grown from each transformation in 3 ml LB medium overnight at 37 ° C. The plasmids were then prepared and purified using the Qiagen Tip20 kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Hilden).
  • the domains have amino acids with very similar properties at the positions crucial for sequence-specific binding, e.g. B. valine and isoleucine (shaded).
  • a consensus sequence (Seq. ID No. 13) can be derived from the individual sequences.
  • a consensus sequence of the recognition amino acids (item X-1: G or C, item X-2: V, item X-3: V, item X-4: G) of the novel peptides can be derived from the comparison of the amino acid sequence of the binders which, however, did not appear as a separate sequence among the analyzed library members. However, this can be justified by the fact that with an estimated library transformation efficiency of approximately 200,000 transformation events and a ratio vector (with insert vector (without insert) of 1: 5, only approximately 40,000 different library members were transformed. With a complexity of the library of 104,000 coding Members were therefore transformed into yeast with a probability of 0.38.

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Abstract

The invention relates to peptidic domains, which are made available in a slightly synthetic manner, and which can specifically identify and bind nucleic acid sequences. The invention also relates to a method for discovering and providing specifically DNA-binding peptide domains, and to biomorph factors derived therefrom, in particular, transcription factors and repressors.

Description

DNA-bindende Peptiddomänen und ein Verfahren zur Bereitstellung solcher Domänen.DNA binding peptide domains and a method for providing such domains.
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft leicht synthetisch zugängliche peptidische Domänen, die Nukleinsäuresequenzen spezifisch erkennen und binden können, sowie ein Verfahren zur Auffindung und Bereitstellung spezifisch DNA-bindender Peptiddomänen, und davon abgeleiteter biomorpher Faktoren, insbesondere Transkriptionsfaktoren und Repressoren.The present invention relates to easily synthetically accessible peptide domains that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences, and to a method for finding and providing specifically DNA-binding peptide domains, and biomorphic factors derived therefrom, in particular transcription factors and repressors.
Die Transkription von DNA in RNA ist der erste Schritt der Genexpression. Die Stärke der Transkription eines Gens und damit die Menge der gebildeten RNA wird durch mit den Genen assoziierte regulatorische Promotorelemente- und Enhancerelemente determiniert, an welche Transkriptionsfaktoren binden. Diese Proteine binden mittels einer DNA-bindenden Domäne sequenzspezifisch an kurze DNA-Abschnitte in den regulatorischen Elementen der Gene. Neben der DNA- bindenden Domäne enthalten Transkriptionsfaktoren eine oder mehrere Aktivatoroder Repressordomänen. Aktivatordomänen verstärken die Transkription des dem vom Transkriptionsfaktor gebundenen regulatorischen Element zugehörigen Gens, während Repressordomänen die Transkription des Gens abschwächen. Beides geschieht durch die Rekrutierung von weiteren Proteinen durch die Aktivator- oder Repressordomänen über Protein-Protein-Interaktionen. Die DNA-Sequenz der regulatorischen Elemente eines Gens und die spezifisch an diese Sequenz bindenden Proteindomänen wirken daher als komplementäre Adressen, die im Zusammenspiel Aktivator- und Repressordomänen lokalisieren, welche letztendlich die Transkriptionsstärke eines Gens festlegen.Transcription of DNA into RNA is the first step in gene expression. The strength of the transcription of a gene and thus the amount of RNA formed is determined by regulatory promoter elements and enhancer elements associated with the genes, to which transcription factors bind. Using a DNA-binding domain, these proteins bind sequence-specifically to short DNA sections in the regulatory elements of the genes. In addition to the DNA-binding domain, transcription factors contain one or more activator or repressor domains. Activator domains increase the transcription of the gene belonging to the regulatory element bound by the transcription factor, while repressor domains weaken the transcription of the gene. Both are done by recruiting additional proteins through the activator or repressor domains via protein-protein interactions. The DNA sequence of the regulatory elements of a gene and the protein domains that bind specifically to this sequence therefore act as complementary addresses which, when interacting, locate activator and repressor domains, which ultimately determine the transcriptional strength of a gene.
Da viele Krankheiten wie z. B. Krebs durch die deregulierte Expression bestimmter Gene verursacht werden, wurden verschiedene Methoden entwickelt, durch welche die Transkription dieser Gene beeinflußt und somit vom pathologischen in den physiologischen Zustand überführt werden kann. Neben Substanzen, welche spätere Stufen der Genexpression inhibieren wie z. B. Antisense-RNA oder Ribozyme, wurden auch Methoden und Substanzen entwickelt, die mit den frühen Stufen der Genexpression, d. h. der Bindung von Transkriptionsfaktoren und der Transkription interferieren. So wurden z. B. Substanzen aus der Stoffklasse der Polyamide entwickelt, welche an regulatorische Elemente ausgewählter Gene binden können. Polyamide binden an die kleine Furche der DNA und verhindern somit die Bindung der meist aktivierenden Transkriptionsfaktoren an die regulatorischen Elemente (Ü.M. Gottesfeld et al., Nature, 1997, 387, 202-205) Damit können Polyamide indirekt die Transkription des jeweiligen Gens vermindern. Die DNA-Bindung der Polyamid ist allerdings wenig spezifisch, so daß ein therapeutischer Einsatz dieser Substanzen nicht in Frage kommt. Darüber hinaus kann mit Polyamiden keine Erhöhung der Transkriptionsrate erreicht werden.Since many diseases such as B. cancer caused by the deregulated expression of certain genes, various methods have been developed by which the transcription of these genes is influenced and thus from the pathological in the physiological state can be transferred. In addition to substances that inhibit later stages of gene expression such. As antisense RNA or ribozymes, methods and substances have also been developed which interfere with the early stages of gene expression, ie the binding of transcription factors and transcription. So z. B. Developed substances from the class of polyamides that can bind to regulatory elements of selected genes. Polyamides bind to the small furrow of DNA and thus prevent the mostly activating transcription factors from binding to the regulatory elements (U.M. Gottesfeld et al., Nature, 1997, 387, 202-205). Polyamides can thus indirectly transcribe the respective gene Reduce. However, the DNA binding of the polyamide is not very specific, so that therapeutic use of these substances is out of the question. In addition, no increase in the transcription rate can be achieved with polyamides.
Bei einer weiteren Methode werden relativ große Mengen kurzer doppelsträngiger DNA-Moleküle in Zellen eingebracht, welche eine Bindungsstelle für einen Transkriptionsfaktor enthalten, der für die deregulierte Transkription des jeweiligen Gens verantwortlich ist. Bei dieser "decoy" Strategie wird der ausgewählte Transkriptionsfaktor kompetitiv abgefangen und kann somit nicht mehr an die Bindungsstellen in den regulatorischen Elemente seiner Zielgenene binden, wodurch die Transkription dieser Gene indirekt inhibiert wird (Übersicht in Suda et al., Endocr. Rev., 1999, 20, 345-357; S. Yla-Hertttuala und J.F. Martin, The Lancet 355, 213-222, 2000).Another method involves introducing relatively large amounts of short double-stranded DNA molecules into cells that contain a binding site for a transcription factor that is responsible for the deregulated transcription of the respective gene. With this "decoy" strategy, the selected transcription factor is competitively intercepted and can therefore no longer bind to the binding sites in the regulatory elements of its target genes, as a result of which the transcription of these genes is indirectly inhibited (overview in Suda et al., Endocr. Rev., 1999 , 20, 345-357; S. Yla-Hertttuala and JF Martin, The Lancet 355, 213-222, 2000).
In den vergangenen Jahren wurden synthetische Proteine und Peptide entwickelt, die DNA mittels anderer struktureller Motive wie z.B. dem Helix-tum-Helix, dem Basic Leucin Zipper oder dem α-Helix Motiv binden. Diese Peptide und Proteine leiten sich von natürlich vorkommenden Transkriptionsfaktoren ab und behalten die DNA-Bindespezifität des jeweiligen Faktors. Diese Peptide haben gewöhnlich eine sehr schwache Affinität zu DNA und können daher unter physiologischen Bedingungen nicht an das jeweilige DNA-Element binden. In manchen Fällen wird jedoch durch Mutagenese und chemische Modifikation eine Verstärkung der Bindung gegenüber dem unmodifizierten Protein oder Peptid erreicht (Z. Shang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, 91 , 8373-8377). Solche künstlich optimierten DNA-bindenden Proteine sind allerdings nur zur Beeinflussung der Regulation der Gene geeignet, die auch auf den Transkriptionsfaktor ansprechen aus dem sie hervorgegangen sind.In recent years, synthetic proteins and peptides have been developed that bind DNA using other structural motifs such as the helix-tum-helix, the basic leucine zipper or the α-helix motif. These peptides and proteins are derived from naturally occurring transcription factors and retain the DNA binding specificity of the respective factor. These peptides usually have a very weak affinity for DNA and therefore cannot bind to the respective DNA element under physiological conditions. In some cases, however, mutagenesis and chemical modification increase the binding to the unmodified protein or peptide (Z. Shang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, 91, 8373-8377). Such artificially optimized However, DNA-binding proteins are only suitable for influencing the regulation of the genes, which also respond to the transcription factor from which they originated.
Eine relativ neue Methode zur Regulation der Transkription stellen synthetische Transkriptionsfaktoren aus der Klasse der Zinkfingerproteine vom Cys2-His2 dar (DJ. Segall, B. Dreier, R.R.Beerli, C, F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, 96, 2758-2763). Diese Faktoren binden an die große Furche der DNA mittels einer fingerartigen Struktur, in welcher eine kurze α-Helix und ein antiparalleles ß-Faltblatt durch ein Zinkatom miteinander komplexiert werden (D. Rhodes, A. Klug, Sei. Am., 1993, 268, 32-39). Die DNA-bindende Aktivität der Zinkfingerproteine ist modular aufgebaut. Individuelle Finger, welche jeweils an eine unterschiedliche Trinukleotidsequenz (gewöhnlich 5'-GNN-3', wobei N jedes der 4 Nukleotide sein kann) spezifisch binden, können in einem größeren Polypeptid miteinander kombiniert werden, so daß auch längere, für das zu regulierende Zielgen einzigartige DNA-Sequenzen spezifisch gebunden werden können (Q. Liu, D . Segal, J.B. Ghiara, C.F. Barbas IM, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, 94, 5525-5530; R.R. Beerli, DJ. Segal, B. Dreier, C.F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95, 14628-14633). Diese Multifingerproteine werden gewöhnlich in einer Phagenbibliothek kodiert, weshalb die an eine spezifische DNA-Sequenz des Zielgens bindenden Mitglieder der Bibliothek mit der Phage Display Methodik isoliert werden können. Anschließend wird die cDNA des DNA-bindenden Polypeptids mit der cDNA einer Aktivator- oder Repressordomäne fusioniert; das resultierende Fusionsprotein stellt damit einen spezifischen Regulator des Zielgens dar (Übersicht der Methodik in DJ. Segal und C.F. Barbas III, Curr. Opin Chem. Biol., 2000, 4, 34- 39; A. Klug, J.Mol. Biol., 1999, 293, 215-218). Kürzlich konnte erstmals gezeigt werden, daß diese Fusionsproteine prinzipiell die Transkription von chromosomal lokalisierten Genen regulieren können (R.R. Beerli, B. Dreier, C.F. Barbas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97, 1495-1500). Nachteilig ist jedoch, daß relativ große Proteine wie die Zinkfingerproteine nur schwer durch Zellmembranen transportiert werden können und dabei häufige ihre ursprüngliche Konformation verlieren. Im Gegensatz zu Polyamiden und Oligonukleotiden sind die C2H2 Zinkfingerproteine wegen ihrer Größe darüber hinaus kaum synthetisch zugänglich, so daß die Proteine nur in relativ kleinen Mengen durch Überexpression in Mikroorganismen erzeugt werden können. Weitehin ist das Auffinden spezifisch bindender künstlicher Zinkfingerproteine sehr aufwendig , da aufgrund der potentiellen Proteinstrukturvielfalt große Proteinbanken durchsucht werden müssen.A relatively new method for regulating transcription is represented by synthetic transcription factors from the class of zinc finger proteins from Cys 2 -His 2 (DJ. Segall, B. Dreier, RRBeerli, C, F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 1999, 96, 2758-2763). These factors bind to the large groove of the DNA by means of a finger-like structure in which a short α-helix and an antiparallel β-sheet are complexed together by a zinc atom (D. Rhodes, A. Klug, Sei. Am., 1993, 268 , 32-39). The DNA binding activity of the zinc finger proteins has a modular structure. Individual fingers, each of which specifically binds to a different trinucleotide sequence (usually 5 ' -GNN-3 ' , where N can be any of the 4 nucleotides) can be combined in a larger polypeptide, so that longer, for the target gene to be regulated unique DNA sequences can be specifically bound (Q. Liu, D. Segal, JB Ghiara, CF Barbas IM, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, 94, 5525-5530; RR Beerli, DJ. Segal, B Dreier, CF Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 14628-14633). These multifinger proteins are usually encoded in a phage library, which is why the members of the library that bind to a specific DNA sequence of the target gene can be isolated using the phage display methodology. The cDNA of the DNA-binding polypeptide is then fused with the cDNA of an activator or repressor domain; the resulting fusion protein thus represents a specific regulator of the target gene (overview of the methodology in DJ. Segal and CF Barbas III, Curr. Opin Chem. Biol., 2000, 4, 34-39; A. Klug, J. Mol. Biol. , 1999, 293, 215-218). It has recently been shown for the first time that these fusion proteins can regulate the transcription of chromosomally localized genes in principle (RR Beerli, B. Dreier, CF Barbas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, 97, 1495-1500). However, it is disadvantageous that relatively large proteins such as zinc finger proteins are difficult to transport through cell membranes and frequently lose their original conformation. In contrast to polyamides and oligonucleotides, the C 2 H 2 zinc finger proteins are also hardly accessible synthetically because of their size, so that the proteins can only be produced in relatively small amounts by overexpression in microorganisms. Finding specifically binding synthetic zinc finger proteins is also very time-consuming because large protein banks have to be searched due to the potential variety of protein structures.
Vor diesem Hintergrund stellt sich die Aufgabe kurze peptidische biomorphe Faktoren bereitzustellen, die Nukleinsäuresequenzen spezifisch erkennen und binden können sowie ein Verfahren zur Auffindung solcher biomorpher Faktoren bereitzustellen.Against this background, the task is to provide short peptide biomorphic factors that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences and to provide a method for the discovery of such biomorphic factors.
Die Aufgabe wird durch Peptide enthaltend folgende Aminosäuresequenz oder einer strukturellen Variante davon gelöst:The task is solved by peptides containing the following amino acid sequence or a structural variant thereof:
DPAALKRARXTEXXRRXRARKLQ (Seq. ID No. 1)DPAALKRARXTEXXRRXRARKLQ (Seq. ID No. 1)
Bevorzugt sind jeweils zwei beliebige Peptide ausgewählt aus dieser Gruppe, die über einen geeigenten Linker ein homo- oder heterodimeres Molekül oder eine Mischung aus homo- und heterodimeren Molekülen bilden.Any two peptides are preferably selected from this group, which form a homo- or heterodimeric molecule or a mixture of homo- and heterodimeric molecules via a suitable linker.
Als strukturelle Varianten werden Aminosäuresequenzen verstanden die mindestens eine Homologie von 75%, bevorzugt eine Homologie von über 90% zur Seq. ID No.1 aufweisen. Bevorzugt sind funktioneile Varianten die eine sequenzspezifische DNA- Bindung eingehen können.Structural variants are understood to be amino acid sequences which have at least a homology of 75%, preferably a homology of more than 90%, to the Seq. Have ID No.1. Functional variants are preferred which can enter into a sequence-specific DNA binding.
Als Linker kommen alle Verbindungen in Betracht die eine Dimerisierung zweier Peptide aus der Gruppe mit der Seq. ID No. 1 oder deren strukturelle Varianten in Lösung gewährleisten. Die Linker können freie organische oder anorganische Substanzen sein, die den erfindungsgemäßen Peptiden zugesetzt werden können. Beispiele dafür sind z. B. Komplexbildner, die mit den freien Amino- oder Carboxytermini von Peptiden koordinative Bindungen eingehen können. Die Linker und Peptide können darüber hinaus durch chemische Modifikation mindestens eines der Peptide kovalent verknüpft sein. Peptidische Linker können auch direkt mit mindestens einem der Peptide fusioniert sein. Bevorzugt sind Fusionsproteine die neben einer DNA-bindenden Domäne gemäß Seq ID No. 1 oder einer strukturellen Variante eine Leucin-Zipper- Aminosäuredomäne besitzen. Seq. ID No. 2 gibt die Aminosäuresequenz eines solchen Fusionsproteins beispielhaft wieder.. All compounds which dimerize two peptides from the group with the Seq are suitable as linkers. ID No. 1 or their structural variants in solution. The linkers can be free organic or inorganic substances that can be added to the peptides according to the invention. Examples of this are e.g. B. complexing agents that can form coordinative bonds with the free amino or carboxy termini of peptides. The linkers and peptides can also be covalently linked by chemical modification of at least one of the peptides. Peptide linkers can also be fused directly to at least one of the peptides. Fusion proteins are preferred which, in addition to a DNA-binding domain according to Seq ID No. 1 or a structural variant have a leucine zipper amino acid domain. Seq. ID No. 2 exemplifies the amino acid sequence of such a fusion protein. ,
DPAALKRARXTEXXRRXRARKLQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGERDPAALKRARXTEXXRRXRARKLQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER
Seq. ID No. 2Seq. ID No. 2
Die erfindungsgemäßen Peptide können über dem Fachmann bekannte Verfahren synthetisch hergestellt werden (z. B. nach der Merryfield-Synthese), die Peptide sind auch mit molekularbiologischen Verfahren, wie der Expression in Zellkultur oder in Fermentern erhältlich.The peptides according to the invention can be prepared synthetically using methods known to the person skilled in the art (for example after Merryfield synthesis), the peptides can also be obtained by molecular biological methods, such as expression in cell culture or in fermenters.
Es hat sich überraschend gezeigt, daß die kurzen Dimere die Peptide mit Seq. ID No. 1 oder deren Varianten enthalten spezifisch DNA-Sequenzen erkennen und somit die Aktivität von Genen in lebenden Zellen regulieren können. Durch die Kürze der Aminosäuresequenz sind die Peptide leicht synthetisch zugänglich, darüber hinaus ist aufgrund der kürze der Peptide der Transport durch Zellmembranen erleichtert. Durch die hohe Stabilität der Konformation der erfindungsgemäßen Peptide ist gewährleistet, daß deren Funktion, also die Fähigkeit sequenzspezifisch DNA zu binden beim Transport durch Zellmembranen erhalten bleibt. Durch die unterschiedliche Struktur der Peptide gegenüber anderen künstlichen Transkriptionsfaktoren können zudem bestimmte DNA-Sequenzmotive besser gebunden werden.It has surprisingly been found that the short dimers the peptides with Seq. ID No. 1 or its variants contain specific DNA sequences and can therefore regulate the activity of genes in living cells. Due to the shortness of the amino acid sequence, the peptides are easily accessible synthetically, and due to the shortness of the peptides, the transport through cell membranes is facilitated. The high stability of the conformation of the peptides according to the invention ensures that their function, that is to say the ability to bind DNA in a sequence-specific manner, is retained during transport through cell membranes. Due to the different structure of the peptides compared to other artificial transcription factors, certain DNA sequence motifs can also be better bound.
Aus diesen Gründen sind die erfindungsgemäßen Dimere als Modul zur Konstruktion von künstlichen aktivierenden oder reprimierenden Transkriptionsfaktoren geeignet. Dazu werden die DNA- Bindungsdomänen mit bekannten Kerntransportsignaldomänen, Transkriptionsaktivierungsdomänen oder Transkriptionsinhibierungsdomänen wie z.B. dem Kemlokalisationssignal des SV40 T-Antigens, der Transkriptionsaktivatordomäne des viralen VP16 Proteins, oder der KRAB-Repressordomäne fusioniert. Die so erzeugten künstlichen biomorphen Faktoren können zur Transkriptionskontrolle und damit auch zur Regulierung der Expression von Genen verwendet werden. Somit ermöglichen die erfindungsgemäßen künstlichen biomorphen Faktoren die Untersuchung von phänotypischen Effekten der Expressionsänderung einzelner Gene in vivo. Vor allem die Verwendung solcher biomorpher Faktoren zur Bekämpfung von Krankheiten, die auf einer fehlregulierten Transkription von Genen beruhen, wie z. B. Krebs, Entzündungsreaktionen oder Suchtkrankheiten ist von großem Interesse. Bei der Verwendung der biomorphen Faktoren als Biopharmaka ist weiterhin deren leichte physiologische Abbaubarkeit vorteilhaft.For these reasons, the dimers according to the invention are suitable as a module for the construction of artificial activating or repressing transcription factors. For this purpose, the DNA binding domains are fused with known nuclear transport signal domains, transcription activation domains or transcription inhibition domains such as, for example, the core localization signal of the SV40 T antigen, the transcription activator domain of the viral VP16 protein, or the KRAB repressor domain. The artificial biomorphic factors generated in this way can be used to control transcription and thus also to regulate the expression of genes. The artificial biomorphic factors according to the invention thus enable the investigation of phenotypic effects of expression changes of individual genes in vivo. Above all, the use of such biomorphic factors to combat diseases that are based on misregulated gene transcription, such as. B. cancer, inflammatory reactions or addictions is of great interest. When the biomorphic factors are used as biopharmaceuticals, their easy physiological degradability is also advantageous.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Peptidmonomere oder -dimere und gegebenenfalls geeignete Zusatz- oder Hilfsstoffe enthält, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten die auf fehlregulierte oder auf die Expression von mutierten Genen zurückgehen, bei dem ein erfindungsgemäßes Peptidmonomer oder -dimer mit pharmazeutisch annehmbaren Zusatz- und/oder Hilfsstoffen formuliert wird.The present invention therefore furthermore also relates to a medicament which contains the peptide monomers or dimers according to the invention and, if appropriate, suitable additives or auxiliaries, and to a process for the preparation of a medicament for the treatment of diseases which result from misregulated or from the expression of mutated genes , in which a peptide monomer or dimer according to the invention is formulated with pharmaceutically acceptable additives and / or auxiliaries.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die die erfindungsgemäßen Peptide gemäß Seq ID No. 1 oder deren strukturelle Varianten codierenden DNA- Sequenzen (Seq. ID No. 3 ) bzw. Nukleinsäuren die diese Sequenzen umfassen.The invention further relates to the peptides according to the invention according to Seq ID No. 1 or DNA sequences encoding their structural variants (Seq. ID No. 3) or nucleic acids comprising these sequences.
GATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNAGGCGTNNNCG TGCGAGAAAGTTGCAAGATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNAGGCGTNNNCG TGCGAGAAAGTTGCAA
(Seq. ID No.3)(Seq. ID No.3)
Als strukturelle Variante werden Nukleinsäuren mit abweichender Sequenz verstanden, die Proteine gemäß Seq ID No. 1 oder deren strukturelle Varianten codieren. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die funktioneile Varianten dieser Proteine codieren.Structural variants are understood to be nucleic acids with a different sequence, the proteins according to Seq ID No. 1 or code their structural variants. Preference is given to nucleic acids which encode functional variants of these proteins.
Bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die für Fusionsproteine aus den erfindungsgemäßen DNA-bindenden Domänen und einer Leucin-Zipper-Domäne codieren (Seq. ID. No. 4). GATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNAGGCGTNNNCG TGCGAGAAAGTTGCAACTTGAAGACAAGGTTG GMTTGCTTTCGAAAAATTA TCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCDNA sequences which code for fusion proteins from the DNA-binding domains according to the invention and a leucine zipper domain (Seq. ID. No. 4) are preferred. GATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNGGCGTNNNCG TGCGAGAAAGTTGCAACTTGAAGACAAGGTTG GMTTGCTTTCGAAAAATTA TCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGA
(Seq. ID No. 4)(Seq. ID No. 4)
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren weitere codierende Bereiche wie z. B. für Kemtansprotsignaldomänen (Kernlokalisationssignale), Transkriptionsaktivierungsdomänen (z. B. aus Transkriptionsfaktoren) oder Transkriptionsinhibierungsdomänen enthalten.In addition, the nucleic acids according to the invention can encoding areas such. B. for Kemtspragsignaldomainen (nuclear localization signals), transcription activation domains (z. B. from transcription factors) or transcription inhibition domains.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der in SEQ ID No 3 oder 4 offenbarten Sequenzen oder anhand der in SEQ ID No 1 oder 2 oder deren strukturelle Varianten offenbarten Peptidsequenzen unter Heranziehen des genetischen Codes z. B. nach der Phosphotriester-Methode synthetisiert werden (siehe z.B. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).The nucleic acids according to the invention can for example be chemically based on the sequences disclosed in SEQ ID No 3 or 4 or on the basis of the peptide sequences disclosed in SEQ ID No 1 or 2 or their structural variants using the genetic code z. B. can be synthesized by the phosphotriester method (see e.g. Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, No. 4).
Die erfindungsgemäßen Desoxyribonukleinsäuren können zu gentherapeutischen Zwecken aber auch zur Untersuchung von phänotypischen Effekten durch Änderung der Expression einzelner Gene in vivo eingesetzt werden. Dazu müssen DNA- Fragmente in geeignete Expressionsvektoren eingbracht sein.The deoxyribonucleic acids according to the invention can be used for gene therapy purposes but also for the investigation of phenotypic effects by changing the expression of individual genes in vivo. For this, DNA fragments must be introduced into suitable expression vectors.
Als Vektoren können je nach Expressionsorganismus alle geeigneten pro- oder eukaryontischen Expressionsvektoren verwendet werden. Bevorzugt sind kommerziell erhältliche Expressionsvektoren, die für die Wirtszelle geeignete regulatorische Sequenzen, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in e. coli oder den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin- Promotor für die Expression in Insektenzellen.Depending on the expression organism, all suitable pro- or eukaryotic expression vectors can be used as vectors. Preferred are commercially available expression vectors, the regulatory sequences suitable for the host cell, such as. B. the trp promoter for expression in e. coli or the ADH-2 promoter for expression in yeasts, the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells.
Beispiele von gentherapeutisch wirksamen Vektoren sind Virusvektoren, vorzugsweise Adenovirusvektoren, insbesondere replikationsdefiziente Adenovirusvektoren, oder Adenoassoziierte Virusvektoren, z.B. ein Adenoassoziierter Virusvektor, der ausschließlich aus zwei insertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR) besteht. Geeignete Adenovirusvektoren sind beispielsweise in McGrory, WJ. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in Εukaryotic Viral Vectors" (Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J.. 5, 2377 oder WO95/00655 beschrieben.Examples of vectors which are active in gene therapy are virus vectors, preferably adenovirus vectors, in particular replication-deficient adenovirus vectors, or adeno-associated virus vectors, for example an adeno-associated virus vector which consists exclusively of two inserted terminal repeat sequences (ITR). Suitable adenovirus vectors are described, for example, in McGrory, WJ. et al. (1988) Virol. 163, 614; Gluzman, Y. et al. (1982) in Εukaryotic Viral Vectors "(Gluzman, Y. ed.) 187, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, New York; Chroboczek, J. et al. (1992) Virol. 186, 280; Karlsson, S. et al. (1986) EMBO J .. 5, 2377 or WO95 / 00655.
Geeignete Adeno-assoziierte Virusvektoren sind beispielsweise in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO95/23867; Samulski, RJ. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95/23867; Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 oder Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793 beschrieben.Suitable adeno-associated virus vectors are described, for example, in Muzyczka, N. (1992) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97; WO95 / 23867; Samulski, RJ. (1989) J. Virol, 63, 3822; WO95 / 23867; Chiorini, J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1531 or Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5, 793.
Gentherapeutisch wirksame Vektoren lassen sich auch dadurch erhalten, daß man die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Liposomen komplexiert. Hierzu eignen sich Lipidmischungen wie bei Feigner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6982; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 oder Gao, X. & Huang, L. (1991 ) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195 beschrieben. Bei der Herstellung der Liposomen wird die DNA ionisch auf der Oberfläche der Liposomen gebunden, und zwar in einem solchen Verhältnis, daß eine positive Nettoladung verbleibt und die DNA vollständig von den Liposomen komplexiert wird.Vectors with gene therapy effects can also be obtained by complexing the nucleic acid according to the invention with liposomes. Lipid mixtures such as those from Feigner, P.L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei, USA 84, 7413; Behr, J.P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Be. USA 86, 6982; Feigner, J.H. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550 or Gao, X. & Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1189, 195. In the preparation of the liposomes, the DNA is ionically bound to the surface of the liposomes in such a ratio that a positive net charge remains and the DNA is completely complexed by the liposomes.
In einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren daher in einem Expressionsvektor, vorzugsweise in einem Expressionsvektor der zur gentherapeutischen Verwendung oder zur Herstellung von transgenen Mikroorganismen, Pflanzen oder Tieren geeignet ist.In a further embodiment, the nucleic acids according to the invention are therefore in an expression vector, preferably in an expression vector which is suitable for gene therapy use or for the production of transgenic microorganisms, plants or animals.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Arzneimittel, das unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Zusatz- oder Hilfsstoffe zur gentherapeutische Anwendung bei Krankheiten, die auf fehlregulierte oder auf die Expression von mutierten Genen zurückgehen, geeignet ist. Vor allem ist ein Arzneimittel geeignet, das die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in nackter Form oder in Form eines der oben beschriebenen gentherapeutisch wirksamen Vektoren oder in mit Liposomen komplexierter Form enthält.The present invention therefore furthermore also relates to a medicament which, using the nucleic acids according to the invention, is suitable, if appropriate, using further additives or auxiliaries for gene therapy use in diseases which are due to misregulated or to the expression of mutated genes. Above all, a medicament is suitable which contains the nucleic acids according to the invention in naked form or in the form of one of the above contains described gene therapy vectors or in complexed form with liposomes.
Als geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe eignen sich z.B. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinaseinhibitoren, Nukleaseinhibitoren etc. Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist eine Bibliothek die Desoxyribonukleinsäuren umfassen die Sequenzen gemäß Seq. ID No. 3 oder eine strukturelle Variante davon besitzen und deren codierenden Bereiche eine Transkriptionsaktivierungsdomäne (AD) und gegebenenfalls eine Kerntansportsequenzdomäne (NLS) im offenen Leseraster enthält. Bevorzugt ist darüber hinaus, wenn die DNAs zusätzlich einen Linker, besonders bevorzugt einen Leucin-Zipper codierenden Bereich enthalten (Fig. 1).Suitable additives and / or auxiliary substances are e.g. a physiological saline, stabilizers, proteinase inhibitors, nuclease inhibitors etc. Another object of the invention is a library which contains deoxyribonucleic acids, the sequences according to Seq. ID No. 3 or have a structural variant thereof and the coding regions of which contain a transcription activation domain (AD) and optionally a core transport sequence domain (NLS) in the open reading frame. It is also preferred if the DNAs additionally contain a linker-coding region, particularly preferably a leucine zipper (FIG. 1).
Die Peptid-Monomere codierenden Bestandteile der Bibliothek bilden in Lösung , bevorzugt unter physiologischen Bedingungen, homo- und/oder heterodimere biomorphe Transkriptionsfaktoren.The components of the library encoding peptide monomers form, in solution, preferably under physiological conditions, homo- and / or heterodimeric biomorphic transcription factors.
Beispielhaft ist der strukturelle Aufbau der Mitglieder einer Desoxyribonukleinsäuren, umfassend NLS und AD codierende Bereiche, enthaltende Bibliothek in Seq. ID No 5 und Fig. 1 dargestellt.An example is the structural structure of the members of a library containing deoxyribonucleic acids, comprising regions coding for NLS and AD, in Seq. ID No 5 and Fig. 1 shown.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Bibliothek DNA-Sequenzen, die für die einzelnen Monomere der biomorphen Transkriptionsfaktoren codieren und deren Peptidmonomere nach der Expression in einem transformierten Expressionssystem, wie z. B. in e. coli oder in Hefen, über geeignete Linker Dimerisieren.In a preferred embodiment, the library contains DNA sequences which code for the individual monomers of the biomorphic transcription factors and whose peptide monomers after expression in a transformed expression system, such as. B. in e. coli or in yeast, via suitable linker dimerization.
Als Vektoren können je nach Expressionssytem alle geeigneten pro- und/oder eukaryontischen Expressionsvektoren verwendet werden. Bevorzugt sind kommerziell erhältliche Expressionsvektoren, die einen konstitutiven oder induzierbaren Promotor besitzen, wie z. B. den pGADD424-Vektor von Clontech Laboratories GmbH, Tullastrasse 4, 69126 Heidelberg . Im allgemeinen enthalten die Expressionsvektoren auch für die Wirtszelle geeignete regulatorische Sequenzen, wie z. B. den trp-Promotor für die Expression in e. coli oder den ADH-2-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen.Depending on the expression system, all suitable pro- and / or eukaryotic expression vectors can be used as vectors. Preferred are commercially available expression vectors which have a constitutive or inducible promoter, such as. B. the pGADD424 vector from Clontech Laboratories GmbH, Tullastrasse 4, 69126 Heidelberg. In general, the expression vectors also contain suitable regulatory sequences for the host cell, such as e.g. B. the trp promoter for expression in e. coli or the ADH-2 promoter for expression in yeast, the baculovirus polyhedrin promoter for expression in insect cells.
Bevorzugt sind Bibliotheken, die alle möglichen cDNA-Sequenzen gemäß Seq. ID No 3 oder einer strukturellen Variante ein oder mehrfach enthalten. Die DNA-Sequenzen der Bibliothek können in sequenzieller Form, in Form eines geeigneten Vektors oder in Form eines zellularen, mit diesen Verktoren transformierten Expressionssystems vorliegen und gelagert werden.Libraries are preferred which contain all possible cDNA sequences according to Seq. ID No 3 or a structural variant contained one or more times. The DNA sequences of the library can be present and stored in sequential form, in the form of a suitable vector or in the form of a cellular expression system transformed with these vectors.
Die Erfindung umfaßt weiterhin die mit Hilfe dieser Bibliotheken expremierbaren biomorphen Trankriptionsfaktoren. Auf diese weise können auch reine Peptidbibliotheken aus biomorphen Transkriptionsfaktoren erhalten werden. Auch die künstliche Synthese von biomorphen Transkriptionsfaktoren zum erstellen einer Peptidbibliothek kann durchgeführt werden. Beispielhaft ist der strukturelle Aufbau der Mitglieder einer Peptide enthaltende Bibliothek in Seq. ID No 6 dargestellt.The invention further encompasses the biomorphic transcription factors expressible with the aid of these libraries. In this way, pure peptide libraries can also be obtained from biomorphic transcription factors. The artificial synthesis of biomorphic transcription factors to create a peptide library can also be carried out. An example is the structural structure of the members of a library containing peptides in Seq. ID No 6 shown.
Ein weiterer Gegenstand ist ein Verfahren zum Auffinden von peptidischen biomorphen Faktoren, die spezifisch Nukleinsäuresequenzen erkennen und binden können.Another object is a method for finding peptidic biomorphic factors that can specifically recognize and bind nucleic acid sequences.
Dazu wird ein zellulares Expressionssystem gewählt, bei dem ein essentielles Gen defekt ist. Das zellulare Expressionssystem ist mit einem entsprechenden Wildtypgen transformiert, daß von einem eine basale Transkription erlaubenden Promotor kontrolliert wird (Insertionselement). Zum anderen enthält das transformierende Konstrukt eine DNA-Sequenz die auf sequenzspezifisch bindende biomorphe Faktoren getestet werden soll (Responseelement).For this purpose, a cellular expression system is chosen in which an essential gene is defective. The cellular expression system is transformed with a corresponding wild-type gene that is controlled by a promoter that allows basal transcription (insertion element). On the other hand, the transforming construct contains a DNA sequence which is to be tested for sequence-specific binding biomorphic factors (response element).
Als Responseelement sind vor allem regulatorische DNA-Sequenzen, wie Promotoren oder Operatoren von Interesse. Aber auch genspezifische DNA- Sequenzen des codierenden Bereichs eines Gens, insbesondere spezifische DNA- Sequenzen eines mutierten Bereichs eines Gens sind bevorzugte Untersuchungsobjekte. Als zellulares Expressionssystem kommen alle lethalen Defektmutanten in Frage, die über eine hemmbare basale Transkription eines eingeschleusten Wildtypgens oder über ein direkt lethal hemmbares Genprodukt kultiviert werden können. Bevorzugt werden leicht kultivierbare Mikroorganismen, wie z. B. e. coli oder Hefen verwendet, aber auch Zellkulturen von höheren Organismen sind als Expressionssystem verwendbar.Regulatory DNA sequences such as promoters or operators are of particular interest as the response element. However, gene-specific DNA sequences of the coding region of a gene, in particular specific DNA sequences of a mutated region of a gene, are also preferred objects of investigation. All lethal defect mutants which can be cultivated via an inhibitable basal transcription of an introduced wild-type gene or via a directly lethally inhibitable gene product can be used as the cellular expression system. Easily cultivable microorganisms, such as. B. e. coli or yeasts are used, but cell cultures from higher organisms can also be used as an expression system.
Beispielhaft können bekannte HIS- - Hefezellen als Expressionssystem verwendet werden. Die Hefezellen sind mit einem Konstrukt transformiert, daß eine DNA- Sequenz mit einer Wildtypbindungsstelle, z. B. für Transkriptionsfaktoren, Enhancer oder Repressoren in ein oder mehrfacher Ausführung enthält. Die auf bindende biomorphe Faktoren zu testenden doppelsträngigen Sequenzen können in einen ein Wildtyp-HIS-Gen enthaltenden Vektor, wie dem pHISi-Vektor (Clontech, Heidelberg), eingefügt werden. Das H IS-Gen des pHISi-Vektors steht unter der Kontrolle eines Minimalpromoters.For example, known HIS - yeast cells can be used as an expression system. The yeast cells are transformed with a construct that a DNA sequence with a wild-type binding site, e.g. B. contains for transcription factors, enhancers or repressors in one or more versions. The double-stranded sequences to be tested for binding biomorphic factors can be inserted into a vector containing a wild-type HIS gene, such as the pHISi vector (Clontech, Heidelberg). The HIS gene of the pHISi vector is under the control of a minimal promoter.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Auffinden sequenzspezifisch DNA bindenden biomorphen Transkriptionsfaktoren und damit geeigneter Bindungsdomänen umfaßt folgende Verfahrensschritte:The method according to the invention for finding sequence-specific DNA-binding biomorphic transcription factors and thus suitable binding domains comprises the following method steps:
a) Transformierung eines Expressionssystems umfassend einen Mikroorganismus mit einem lethalen Defekt in einem essentiellen Gen, ein chromosomal integriertes Insertionselement mit einem Wildytpkopie diesesa) Transformation of an expression system comprising a microorganism with a lethal defect in an essential gene, a chromosomally integrated insertion element with a wild type copy of this
Gens unter der Kontrolle eines inhibierbaren basale Transkription erlaubendenAllowing gene under the control of an inhibitable basal transcription
Promoters und einem Responselement, mit einer Bank aus Expressionsvektoren, enthaltend die erfindungsgemäßenPromoters and a response element, with a bank of expression vectors containing the invention
Desoxyribonukleinsäurefragmente und einen Aktivierungsdomäne, b) Ausplattieren der Expressionssyteme auf einem das essentielle Genprodukt fehlenden Medium, c) Inhibierung der Funktion des essentiellen Wildtypgens im Insertionselement, d) Isolierung der wachsenden Zellkulturen und Sequenzierung des erfindungsgemäßen DNA-Fragments bzw. der entsprechenden Peptidsequenz Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des Verfahrens, ohne dieses darauf zu beschränken:Deoxyribonucleic acid fragments and an activation domain, b) plating the expression systems onto a medium lacking the essential gene product, c) inhibiting the function of the essential wild-type gene in the insertion element, d) isolating the growing cell cultures and sequencing the DNA fragment according to the invention or the corresponding peptide sequence The following examples serve to explain the process without restricting it to this:
Herstellung eines Insertionselementes mit einem ResponseelementProduction of an insertion element with a response element
Die Herstellung einer doppelsträngige DNA-Sequenz, die die Wildtyp-E2F-The preparation of a double-stranded DNA sequence that the wild-type E2F
Bindungsstelle (Fig. 2A) grau unterlegt) dreifach enthält (3xE2Fwt-Sequenz, Seq. IDBinding site (Fig. 2A) highlighted in gray) contains three (3xE2Fwt sequence, Seq. ID
No. 7) wurde wie folgt durchgeführt:No. 7) was carried out as follows:
Je 10μl der einzelsträngigen 10μM Oligonukleotide 3xE2F wtsense Seq. ID No 7 und 3xE2F wtas Seq. ID No 8 wurden in 100μl 10mM Tris-HCI pH7.9, 50mM NaCI,10μl each of the single-stranded 10μM oligonucleotides 3xE2F wtsense Seq. ID No 7 and 3xE2F wtas Seq. ID No 8 were in 100μl 10mM Tris-HCI pH7.9, 50mM NaCI,
10mM MgCI2, 1 mM Dithiothreitol für 5 min bei 95°C erhitzt und langsam (innerhalb von 3h) auf Raumtemperatur abgekühlt.10mM MgCl 2 , 1mM dithiothreitol heated for 5 min at 95 ° C and slowly (within 3h) cooled to room temperature.
AAAGCGCGCGAAACTAAAGCGCGCGAAACTAAAGCGCGCGAAACTAGCTAAAGCGCGCGAAACTAAAGCGCGCGAAACTAAAGCGCGCGAAACTAGCT
Seq. ID No 7Seq. ID No 7
AGTTTCGCGCGCTTTGATTTCGCGCGCTTTGATTTCGCGCGCTTTGATCAGTTTCGCGCGCTTTGATTTCGCGCGCTTTGATTTCGCGCGCTTTGATC
Seq. ID No 8Seq. ID No 8
Die 3xE2Fwt-Sequenz wird in die Kpnl und Sacl Restriktionsschnittstellen des pGL- 2-Vektor (Promega, Madison, Wl USA) einkloniert Dazu wurden 3μg pGL-2 mit je 20u Kpnl und Sacl komplett verdaut und über ein Agarosegel aufgereinigt. Anschließend wurde die DNA unter Verwendung des QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers von Agaroseresten befreit und in 50μl Wasser aufgenommen. 10μl des gereinigten Vektors wurden mit 1 μl des doppelsträngigen Oligo mit Hilfe der T4 DNA Ligase in einem 20μl-Ansatz für 2h bei 25°C ligiert.The 3xE2Fwt sequence is cloned into the Kpnl and Sacl restriction sites of the pGL-2 vector (Promega, Madison, Wl USA). For this purpose, 3μg pGL-2 with 20u Kpnl and Sacl each were completely digested and purified using an agarose gel. Subsequently, the DNA was freed from agarose residues using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) and taken up in 50 μl water. 10 μl of the purified vector were ligated with 1 μl of the double-stranded oligo using the T4 DNA ligase in a 20 μl mixture for 2 h at 25 ° C.
Zur Transformation wurde der E.coli k12-Stamm „Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) über Nacht bei 37°C und 200 RPM in LB Medium mit 100μg/ml Ampicillin geschüttelt und angezogen. Am nächsten Morgen wurde 1ml der Bakterienkultur in 200ml frisches Medium überimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0.565 bei 595nm bei 37°C und 200 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Kultur auf 4°C abgekühlt und bei 2500xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die pelletierten Bakterien wurden in 7.5ml LB-Medium mit 10% (w/v) Polyethylenglycol-6000, 5% Dimethylsulfoxid, 10mM MgSO4, 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8 aufgenommen, für eine Stunde auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Zur Transformation wurden 10μl des Ligationsansatzes in 100μl 100mM KCI, 30mM CaCI2, 50mM MgCI2 aufgenommen und mit 100μl der aufgetauten Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bakterien mit 1 ml LB-Medium versetzt und unter Schütteln für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten mit 100μg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Klone wurden isoliert und in 3ml LB Medium mit 100μg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C angezogen. Aus den Bakterien wurde die Plasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep- Kits (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und gereinigt. Positive Klone wurden durch PCR wie folgt identifiziert: 1 μl DNA, 0.5μl entspr. 5U Taq- Polymerase (Promega, Madison, USA), 5μl 10xReaktionspuffer (Promega, Madison, USA), 0.4μl Desoxynukleotidtriphosphat (jelOμM), 4μl 12.5mM MgCI2, sowie je 0.3μl der 100μM Oligonukleotide und destilliertes Wasser ad 50μl wurden für 3min auf 94°C erhitzt. Es schlössen sich 30 Zyklen mit 94°C für 20 sec, 50°C für 20sec, und 72°C für 45 sec an, gefolgt von einer Inkubation bei 72°C für 5min. Die PCR- Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und damit ihre Größe bestimmt. Bakterienkolonien, deren Plasmid-DNA ein PCR-Produkt der erwarteten Größe aufwies, wurden in 50 ml LB Medium mit 100μg/ml Ampicilin für 13h bei 37°C und 250 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe des Qiagen Midi Präp Kits (Qiagen/Hilden) aus den Bakterien isoliert und gereinigt. Die DNA wurde in destilliertem Wasser resuspendiert. Anschließend wurde die somit amplifizierte 3xE2Fwt Sequenz aus dem Vektor isoliert. Dazu wurden 3μg des Plasmids mit je 20U Xmal und Mlul für 3 Stunden komplett verdaut. Der Ansatz wurde anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt, und die bei 68bp migrierende 3xE2Fwt Insertionssequenz wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Parallel dazu wurden 3μg pHISi (Clontech, Heidelberg) mit je 20U Xmal und Mlul für 3 Stunden komplett verdaut und über ein Agarosegel gereinigt. Anschließend wurden die DNA- Proben unter Verwendung des QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers von Agarose befreit und in je 50μl Wasser aufgenommen. Zur Ligation wurden 3μl des mit Xmal und Mlul verdauten pHISi Vektors mit 10μl der mit Xmal und Mlul isolierten 3xE2Fwt Insertionssequenz in einem 20μl Ansatz mit 1 ,5μl T4 DNA Ligase für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Transformation wurde der E.coli k12-Stamm „Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) über Nacht bei 37°C und 200 RPM in LB Medium mit 100μg/ml Ampicillin geschüttelt und angezogen. Am nächsten Morgen wurde 1 ml der Bakterienkultur in 200ml frisches Medium überimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0.565 bei 595nm bei 37°C und 200 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Kultur auf 4°C abgekühlt und bei 2500xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die pelletierten Bakterien wurden in 7.5ml LB-Medium mit 10% (w/v) Polyethylenglycol-6000, 5% Dimethylsulfoxid, 10mM MgSO4, 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8 aufgenommen, für eine Stunde auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Zur Transformation wurden 10μl des Ligationsansatzes in 100μl 100mM KCI, 30mM CaCI2, 50mM MgCI2 aufgenommen und mit 100μl der aufgetauten Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bakterien mit 1 ml LB-Medium versetzt und unter Schütteln für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten mit 100μg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Klone wurden isoliert und in 3ml LB Medium mit 100μg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C angezogen. Aus den Bakterien wurde die Plasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep- Kits (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und gereinigt. Positive Klone wurden durch Verdau mit Xmal und Mlul identifiziert. Die entsprechenden Bakterien wurden in 50 ml LB Medium mit 100μg/ml Ampicilin für 13h bei 37°C und 250 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe des Qiagen Midi Präp Kits (Qiagen/Hilden) aus den Bakterien isoliert und gereinigt. Die DNA wurde in destilliertem Wassr resuspendiert. Das resultierende Plasmid wird als pHISi3xE2Fwt (Seq. ID. No. 9) bezeichnet.For transformation, the E.coli k12 strain "Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) was shaken and grown overnight at 37 ° C. and 200 RPM in LB medium with 100 μg / ml ampicillin. The next morning, 1 ml the bacterial culture was inoculated into 200 ml of fresh medium and shaken to an optical density of 0.565 at 595 nm at 37 ° C. and 200 RPM, the culture was then cooled to 4 ° C. and centrifuged at 2500 × g, the supernatant was discarded and the pelleted bacteria were removed in 7.5ml LB medium with 10% (w / v) polyethylene glycol-6000, 5% dimethyl sulfoxide, 10mM MgSO 4 , 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8, incubated for one hour on ice, snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. For the transformation, 10μl of the ligation mixture was taken up in 100μl 100mM KCI, 30mM CaCI 2 , 50mM MgCI 2 and incubated with 100μl of the thawed bacteria for 20 min on ice. After a 10-minute incubation at room temperature, the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated with shaking at 37 ° C. for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. Individual clones were isolated and grown in 3 ml LB medium with 100 μg / ml ampicillin at 37 ° C. overnight. The plasmid DNA was isolated and purified from the bacteria using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions. Positive clones were identified by PCR as follows: 1 μl DNA, 0.5 μl corresponding to 5U Taq polymerase (Promega, Madison, USA), 5 μl 10 × reaction buffer (Promega, Madison, USA), 0.4 μl deoxynucleotide triphosphate (jelOμM), 4 μl 12.5mM MgCI 2 , as well as 0.3μl of 100μM oligonucleotides and distilled water ad 50μl were heated to 94 ° C for 3min. This was followed by 30 cycles at 94 ° C. for 20 seconds, 50 ° C. for 20 seconds, and 72 ° C. for 45 seconds, followed by an incubation at 72 ° C. for 5 minutes. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and thus their size was determined. Bacterial colonies whose plasmid DNA had a PCR product of the expected size were shaken in 50 ml LB medium with 100 μg / ml ampicilin for 13 hours at 37 ° C. and 250 RPM. The plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Midi Prep Kit (Qiagen / Hilden). The DNA was resuspended in distilled water. The 3xE2Fwt sequence thus amplified was then isolated from the vector. For this purpose, 3μg of the plasmid with 20U Xmal and Mlul were digested completely for 3 hours. The mixture was then separated on an agarose gel, and the 3xE2Fwt insertion sequence migrating at 68 bp was cut out with a scalpel. In parallel, 3μg pHISi (Clontech, Heidelberg), each with 20U Xmal and Mlul, were completely digested for 3 hours and cleaned using an agarose gel. The DNA samples were then freed of agarose using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions and taken up in 50 μl water. For ligation, 3μl of the pHISi vector digested with Xmal and Mlul were incubated with 10μl of the 3xE2Fwt insertion sequence isolated with Xmal and Mlul in a 20μl mixture with 1.5μl T4 DNA ligase for 3 hours at room temperature. to Transformation, the E.coli k12 strain "Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) was shaken and grown overnight at 37 ° C. and 200 RPM in LB medium with 100 μg / ml ampicillin. The next morning, 1 ml the bacterial culture was inoculated into 200 ml of fresh medium and shaken to an optical density of 0.565 at 595 nm at 37 ° C. and 200 RPM, the culture was then cooled to 4 ° C. and centrifuged at 2500 × g, the supernatant was discarded and the pelleted bacteria were removed in 7.5 ml LB medium with 10% (w / v) polyethylene glycol-6000, 5% dimethyl sulfoxide, 10mM MgSO 4 , 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8, incubated for one hour on ice, snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. For the transformation, 10 μl of the ligation mixture was taken up in 100 μl 100 mM KCI, 30 mM CaCl 2 , 50 mM MgCl 2 and incubated with 100 μl of the thawed bacteria for 20 min on ice The bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated with shaking at 37 ° C. for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. Individual clones were isolated and grown in 3 ml LB medium with 100 μg / ml ampicillin at 37 ° C. overnight. The plasmid DNA was isolated and purified from the bacteria using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions. Positive clones were identified by digestion with Xmal and Mlul. The corresponding bacteria were shaken in 50 ml LB medium with 100 μg / ml ampicilin for 13 hours at 37 ° C. and 250 RPM. The plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Midi Prep Kit (Qiagen / Hilden). The DNA was resuspended in distilled water. The resulting plasmid is called pHISi3xE2Fwt (Seq. ID. No. 9).
Herstellung transformierter HIS~-HefestämmeProduction of transformed HIS ~ yeast strains
In dem Plasmid pHISi3xE2Fwt wird das HIS3-Gen des Vektors neben dem im Vektor vorhandenen basalen HIS3 Promoter unter die Kontrolle des Insertionselementes gestellt. Der Hefestamm YM 4271 (Clontech, Heidelberg) wird mit dem so hergestellten pHISi-3xE2Fwt-Vektor gemäß den Angaben des Herstellers (Yeast Protocols Handbook, Clontech, Heidelberg S. 20-21 , 1999 , Clontech Laboratories Inc.) mit 1 μg des mit Xho I linearisierten Plasmids wie folgt transformiert: 1 μg pHISi3xE2Fwt wurde für 1 Stunde mit 10U Xhol komplett linearisiert, unter Verwendung des QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt und in 50μl Wasser aufgenommen. Mehrere Kolonien des Hefestammes YM 4271 (Clontech, Heidelberg) wurden in 50 ml YPD Medium bis zu einer optischen Dichte bei 600nm von 1.5 bei 30°C angezogen und so in 300ml YPD Medium überimpft, daß die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 0.2-0.3 hatte. Diese Kultur wurde unter Schütteln bei 30°C inkubiert, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm von 0.4-0.6 hatte. Die Kultur wurde anschließend bei 1000xg für 5 Minuten abzentrifugiert, und die Zellen wurden in 1.5 ml 100 mM Lithiumacetat pH 7.5, 10mM Tris-HCI pH7.5, 1 mM EDTA aufgenommen. 100μl der Zellen, 50μl des linearisierten Plasmids sowie 100μg hitzedenaturierter Lachssperma-DNA wurden mit 600μl einer PEG/LiAc-Lösung (100mM Lithiumacetat pH 7.5, 10 mM Tris-HCI pH7.5, 1mM EDTA, 40% (w/v) Polyethylenglycol-4000) versetzt und für 30 min bei 30°C geschüttelt. Nach Zugabe von 70μl Dimethylsulfoxid wurde der Ansatz für 15 min bei 42°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, in 1 ml 10 mM Tris-HCI pH7.5, 1mM EDTA gewaschen und komplett auf eine Minimalmediumagarplatte ohne Histidinzusatz ausplattiert, auf der nach 7 Tagen bei 30°C 12 Kolonien gewachsen waren.In the plasmid pHISi3xE2Fwt, the HIS3 gene of the vector is placed under the control of the insertion element in addition to the basal HIS3 promoter present in the vector. The yeast strain YM 4271 (Clontech, Heidelberg) is treated with the pHISi-3xE2Fwt vector thus prepared according to the manufacturer's instructions (Yeast Protocols Handbook, Clontech, Heidelberg pp. 20-21, 1999, Clontech Laboratories Inc.) with 1 μg of the Xho I linearized plasmids transformed as follows: 1 μg pHISi3xE2Fwt was completely linearized with 10U Xhol for 1 hour, purified using the QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen / Hilden) according to the manufacturer's instructions and taken up in 50μl water. Several colonies of the yeast strain YM 4271 (Clontech, Heidelberg) were grown in 50 ml of YPD medium to an optical density at 600 nm of 1.5 at 30 ° C. and inoculated in 300 ml of YPD medium so that the culture had an optical density at 600 nm of 0.2 -0.3 had. This culture was incubated with shaking at 30 ° C until it had an optical density at 600 nm of 0.4-0.6. The culture was then centrifuged at 1000xg for 5 minutes and the cells were taken up in 1.5 ml of 100 mM lithium acetate pH 7.5, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA. 100μl of the cells, 50μl of the linearized plasmid and 100μg of heat-denatured salmon sperm DNA were mixed with 600μl of a PEG / LiAc solution (100mM lithium acetate pH 7.5, 10mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 40% (w / v) polyethylene glycol) 4000) and shaken at 30 ° C for 30 min. After the addition of 70 μl dimethyl sulfoxide, the mixture was incubated at 42 ° C. for 15 min. The cells were then centrifuged off, washed in 1 ml of 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA and completely plated onto a minimal medium agar plate without histidine addition, on which 12 colonies had grown after 7 days at 30 ° C.
Die geringe basale Expression von HIS3 erlaubt die Selektion von transformierten YM 4271 -Hefen die das Insertionselement in ihre chromosomale DNA eingebaut haben durch Auspiatieren der Zellkulturen auf SD-Agarplatten mit Histidin freiem Medium. Die unter diesen Bedingungen wachsenden YM 4271 -Hefestämme werden isoliert.The low basal expression of HIS3 allows the selection of transformed YM 4271 yeasts which have inserted the insertion element into their chromosomal DNA by dislodging the cell cultures on SD agar plates with histidine-free medium. The YM 4271 yeast strains growing under these conditions are isolated.
Auswahl eines besonders geeigneten transformierter HIS -HefestammsSelection of a particularly suitable transformed HIS yeast strain
12 aus unabhängigen Rekombinationsereignissen resultierende Kolonien wurden anschließend auf Minimalmedium-Agarplatten ohne Histidin ausgestrichen, die steigende Mengen des HIS3-Antagonisten 3-Aminotriazol (3-AT) enthielten OmM, 0.5mM, 1 mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 6mM, 9mM, 12mM, 15mM, 18mM, 30mM, 45mM; ein Klon wurde bereits bei 0.5mM deutlich und bei 2mM vollständig supprimiert; dieser und ein weiterer Klon wuchsen nicht mehr bei 3mM, während die 10 anderen erst bei>30mM im Wachstum inhibiert wurden. Das Wachstum einer dieser Kolonien, als yeast3xE2Fwt bezeichnet, wurde bereits bei einer Konzentration von 2mM 3-AT vollständig unterdrückt (Fig. 2D) ohne Antagonisten Fig. 2C)). Diese Kolonie wurde isoliert und für die weiteren Untersuchungen herangezogen.12 colonies resulting from independent recombination events were then streaked on minimal medium agar plates without histidine, the increasing amounts of the HIS3 antagonist 3-aminotriazole (3-AT) contained OmM, 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 3mM, 6mM, 9mM , 12mM, 15mM, 18mM, 30mM, 45mM; one clone was already evident at 0.5mM and completely suppressed at 2mM; this and another clone no longer grew at 3mM, while the 10 others were only inhibited in growth at> 30mM. The growth of one of these colonies, designated as yeast3xE2Fwt, was already completely suppressed at a concentration of 2mM 3-AT (FIG. 2D) without antagonists (FIG. 2C)). This colony was isolated and used for further investigations.
Der ausgewählte Stamm yeast3xE2Fwt besitzt ein vorteilhaftes sehr geringes basales Expressionsniveau von HIS3, was bereits durch geringe Mengen 3-AT kompetitiv inhibiert wird. Der Stamm wird als YM 4271 3xE2Fwt bezeichnetThe selected strain yeast3xE2Fwt has an advantageous very low basal expression level of HIS3, which is competitively inhibited even by small amounts of 3-AT. The strain is called YM 4271 3xE2Fwt
Erzeugung einer DNA-sequenzspezifische Bindungspartner enthaltende BibliothekGeneration of a library containing DNA sequence-specific binding partners
3μg pGADD424 (Clontech/Heidelberg, Seq. ID No 11) wurden mit je 20u EcoRlund BamHI komplett verdaut und über ein Agarosegel aufgereinigt. 1 μg des doppelsträngigen Peptiddomänen codierenden Oligonukleotids Seq ID No 10 wurde synthetisiert und für 3h mit je 10u EcoRI und BamHI verdaut und über ein Agarosegel aufgereinigt. Anschließend wurde die DNA unter Verwendung des QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers von Agaroseresten befreit und in 50μl Wasser aufgenommen. 3μl des Vektors wurden mit 0.1 μl, 0.3μl und 1 μl des Oligonukleotids für 3h bei Raumtemperatur in 20μl- Ansätzen mit Hilfe der T4-DNA Ligase ligiert. Anschließend wurden die Ansäztze mit je 200μl n-Butanol geschüttelt und für 10 Minuten bei 13000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden verworgen, und die DNA wurde durch Eindampfen im Vakuum von Butanolrestenbefreit sowie in je 10μl Wasser aufgenommen. Zur Transformation wurden 500ml einer exponentiell wachsenden Bakterienkultur des E.coli K12-Stammes TOP10 für 10 min bei 4000xg zentrifugiert, in 500ml kalten Wasser resuspendiert und erneut zentrifugiert. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt. Anschließend wurden die Bakterien in 7.5ml 10% Glycerin (v/v) aufgenommen und als 40μl-Aliquots in flüssigen Stickstoff schockgefroren. Zur eigentlichen Transformation wurden je 5μl der oben beschriebenen gereinigten Ligationsansätze mit einem auf Eis aufgetauten Aliquot der Bakterien vermischt und in eine kalte Elektroporationsküvette überführt. Nach einem elektrischen Puls von 1 ,8 kV bei 200Ω und 25μF wurden die Bakterien für eine Stunde in 1 ml LB-Medium bei 37°C und 250 RPM geschüttelt und anschließend auf LB-Agarplatten mit 100μg/ml Ampicilin über Nacht bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Klone der dicht bewachsenen Platten abgeschabt und in 250 ml LB Medium mit 100μg/ml Ampicilin für 3h bei 37°C und 250 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit Hilfe des Qiagen Maxi Präp Kits (Qiagen/Hilden) aus den Bakterien isoliert und gereinigt. Die DNA wurde in destilliertem Wasser resuspendiert und hatte eine Konzentration von 1.3μg/μl.3μg pGADD424 (Clontech / Heidelberg, Seq. ID No 11) were completely digested with 20u EcoRl and BamHI each and purified using an agarose gel. 1 μg of the double-stranded peptide domain encoding oligonucleotide Seq ID No 10 was synthesized and digested for 3 h with 10 μ EcoRI and Bam HI in each case and purified using an agarose gel. Subsequently, the DNA was freed from agarose residues using the QiaQuick Gel Extraction Kit (Qiagen / Hilden) and taken up in 50 μl water. 3 μl of the vector were ligated with 0.1 μl, 0.3 μl and 1 μl of the oligonucleotide for 3 h at room temperature in 20 μl batches using the T4-DNA ligase. The batches were then shaken with 200 μl each of n-butanol and centrifuged for 10 minutes at 13000 rpm in a table centrifuge. The supernatants were discarded and the DNA was removed from butanol residues by evaporation in vacuo and taken up in 10 µl water each. For the transformation, 500 ml of an exponentially growing bacterial culture of the E. coli K12 strain TOP10 was centrifuged for 10 min at 4000xg, resuspended in 500 ml of cold water and centrifuged again. This procedure was repeated twice. The bacteria were then taken up in 7.5 ml of 10% glycerol (v / v) and snap-frozen as 40 μl aliquots in liquid nitrogen. For the actual transformation, 5 μl each of the purified ligation batches described above were mixed with an aliquot of the bacteria thawed on ice and transferred to a cold electroporation cuvette. After an electrical pulse of 1.8 kV at 200Ω and 25μF, the bacteria were made for shaken for 1 hour in 1 ml LB medium at 37 ° C and 250 RPM and then incubated on LB agar plates with 100μg / ml ampicilin at 37 ° C overnight. The following day, the clones of the densely overgrown plates were scraped off and shaken in 250 ml LB medium with 100 μg / ml ampicilin for 3 hours at 37 ° C. and 250 RPM. The plasmid DNA was then isolated from the bacteria and purified using the Qiagen Maxi prep kit (Qiagen / Hilden). The DNA was resuspended in distilled water and had a concentration of 1.3 μg / μl.
GGGAATTCGATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNAGG CGTNNNCGTGCGAGAAAGTTGCAACTTGAAGACAAGGTTGAAGAATTGCTTTCG AAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAAC GCTGAGGATCCCCGGGAATTCGATCCTGCTGCTCTAAAACGTGCTAGANNCACTGAANNNNNNAGG CGTNNNCGTGCGAGAAAGTTGCAACTTGAAGACAAGGTTGAAGAATTGCTTTCG AAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATCTAGGAAGAGCCT
Seq ID No 10:Seq ID No 10:
Auffinden von sequenzspezifisch bindenden biomorphen TranskriptionsfaktorenFinding sequence-specific binding biomorphic transcription factors
Die erzeugte cDNA-Bibliothek wird in den Hefestamm yeast3xE2Fwt nach Angaben des Herstellers (Yeast protokols handbook, Clontech, Heidelberg) wie folgt transformiert:The generated cDNA library is transformed into the yeast strain yeast3xE2Fwt according to the manufacturer (Yeast protocols handbook, Clontech, Heidelberg) as follows:
Mehrere Kolonien des Hefestammes YM 4271 3xE2Fwt wurden in 50 ml YPD Medium bis zu einer optischen Dichte bei 600nm von 1.5 bei 30°C angezogen und so in 300ml YPD Medium überimpft, daß die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm von 0.2-0.3 hatte. Diese Kultur wurde unter Schütteln bei 30°C inkubiert, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm von 0.4-0.6 hatte. Die Kultur wurde anschließend bei 1000xg für 5 Minuten abzentrifugiert, und die Zellen wurden in 1.5 ml 100 mM Lithiumacetat pH 7.5, 10mM Tris-HCI pH7.5, 1 mM EDTA aufgenommen.1 ml der Zellen, 50μg der Bibliothek sowie 2000μg hitzedenaturierter Lachssperma-DNA wurden mit 6ml einer PEG/LiAc-Lösung (100mM Lithiumacetat pH 7.5, 10 mM Tris- HCI pH7.5, 1 mM EDTA, 40% (w/v) Polyethylenglycol-4000) versetzt und für 30 min bei 30°C geschüttelt. Nach Zugabe von 700μl Dimethylsulfoxid wurde der Ansatz für 15 min bei 42°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert, in 10 mM Tris-HCI pH7.5, 1 mM EDTA gewaschen und komplett auf 6 Minimalmediumagarplatten ohne JHistidin- und Leucinzusatz sowie 2mM 3- Aminotriazol ausplattiert, auf der nach 7 Tagen bei 30°C 153 Kolonien gewachsen waren.Several colonies of the yeast strain YM 4271 3xE2Fwt were grown in 50 ml of YPD medium to an optical density at 600 nm of 1.5 at 30 ° C. and inoculated in 300 ml of YPD medium so that the culture had an optical density at 600 nm of 0.2-0.3. This culture was incubated with shaking at 30 ° C until it had an optical density at 600 nm of 0.4-0.6. The culture was then centrifuged at 1000 × g for 5 minutes and the cells were taken up in 1.5 ml of 100 mM lithium acetate pH 7.5, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA. 1 ml of the cells, 50 μg of the library and 2000 μg of heat-denatured salmon sperm. 6 ml of a PEG / LiAc solution (100 mM lithium acetate pH 7.5, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 40% (w / v) polyethylene glycol 4000) were added to DNA and shaken at 30 ° C. for 30 min , After the addition of 700 μl dimethyl sulfoxide, the mixture was incubated at 42 ° C. for 15 min. The cells were then centrifuged, washed in 10 mM Tris-HCl pH7.5, 1 mM EDTA and completely on 6 minimal medium agar plates without the addition of JHistidine and leucine and 2mM 3- Aminotriazole plated on which 153 colonies had grown after 7 days at 30 ° C.
Die Selektion von Hefestämmen, die sowohl, das Insertionselement als auch einen Bibliothekbestandteil inklusive des pGAD424-Vektor-Leu2-Marker enthalten, wird einfach durch Ausplattieren auf SD-Agarplatten ohne Histidin und Leucin durchgeführt.The selection of yeast strains which contain both the insertion element and a library component including the pGAD424 vector Leu2 marker is carried out simply by plating on SD agar plates without histidine and leucine.
Zur Selektion derjenigen Hefezellen, bei denen das HIS3-Expressionsniveau durch Bindung eines biomorphen Transkriptionsfaktors aus der Bibliothek an die trimerisierte E2F-Bindungsstelle erhöht ist, wird den Agarplatten 2mM 3-Aminotriazol zugesetzt.For the selection of those yeast cells in which the HIS3 expression level is increased by binding a biomorphic transcription factor from the library to the trimerized E2F binding site, 2mM 3-aminotriazole is added to the agar plates.
Während bei der Kontrolltransformation von yeast3xE2Fwt mit 50 μg pGAD424 alleine nur eine Hefekolonie wuchs (Fig. 3A)), vermutlich durch unspezifische Rückmutation, wurden bei der Transformation mit 50μg der Bibliothek 153 Kolonien (Ausschnitt Fig. 3B)) erhalten.While only one yeast colony grew in the control transformation of yeast3xE2Fwt with 50 μg pGAD424 alone (FIG. 3A)), presumably due to unspecific back mutation, 153 colonies (section FIG. 3B) were obtained in the transformation with 50 μg of the library.
Die unter den gegebenen Selektionsbedingungen wachsenden Hefekolonien sind mit Bibliotheksbestandteilen transformiert die für expremierbare biomorphe Transkriptionsfaktoren codieren deren Wirkung spezifisch auf das HIS3-Gen gerichtet ist und die die E2F-Bindungsstelle, die einzige mehrfach vorkommende Sequenz des HIS3-Promotors (die HIS3-Expression läßt sich nur durch an multiple Sequenzwiederholungen bindende Faktoren regulieren, da nur die Bindung mehrerer Transkriptionsfaktoren zu einem kooperativen und somit steilen Anstieg der Transkriptionsinitiation führt, enthalten. Diese Kolonien besitzen demnach Bibliotheksmitglieder, deren Expressionsprodukte spezifisch an die trimerisierte E2F- Bindungsstelle des HIS3-Genkonstrukts binden.The yeast colonies growing under the given selection conditions are transformed with library components which code for expressible biomorphic transcription factors, the action of which is specifically directed towards the HIS3 gene and the E2F binding site, the only multiply occurring sequence of the HIS3 promoter (the HIS3 expression can be regulate only by factors that bind to multiple repetitions of the sequence, since only the binding of several transcription factors leads to a cooperative and thus steep increase in transcription initiation.These colonies therefore have library members whose expression products specifically bind to the trimerized E2F binding site of the HIS3 gene construct.
Um die Sequenz dieser Bibliotheksmitglieder zu bestimmen, wurden die Plasmide aus 32 der Hefezellkulturen isoliert, in E.coli transformiert und vermehrt (Yeast protokols handbook, Clontech, Heidelberg).In order to determine the sequence of these library members, the plasmids were isolated from 32 of the yeast cell cultures, transformed into E. coli and propagated (Yeast protocols handbook, Clontech, Heidelberg).
Dazu wurden einzelne Hefekolonjen in 0.5 ml SD-Minimalmedium ohne Histidin- und Leucinzusatz über Nacht bei 30°C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation pellettiert und soviel von dem Medium entfernt, daß etwa 50μl übrig blieben. In diesem Mediumrest wurden die Zellen durch vortexen resuspendiert und mit einer Spatelspitze des zellwallzerstörenden Enzyms Lyticase versetzt. Unter Schütteln wurden die Zellen für eine Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend mit 10μl einer 20% Sodiumdodecylsulfat-Lösung versetzt. Zum Lysieren wurden die Zellen für 1 min gevortext, kurz bei -20°C eingefroren und schnell aufgetaut. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 14,000 UpM abgetrennt, und die im Überstand vorhandene Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QiaQuick PCR Purification Kit von Verunreinigungen befreit sowie in 50μl Wasser aufgenommen. Anschließend wurde die Plasmid-DNA in Bakterien transformiert und vermehrt, um größere Mengen der Plasmide zu erhalten. Zur Transformation wurde der E.coli k12- Stamm „Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) über Nacht bei 37°C und 200 RPM in LB Medium mit 100μg/ml Ampicillin geschüttelt und angezogen. Am nächsten Morgen wurde 1 ml der Bakterienkultur in 200ml frisches Medium überimpft und bis zu einer optischen Dichte von etwa 0.5 bei 595nm bei 37°C und 200 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Kultur auf 4°C abgekühlt und bei 2500xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die pelletierten Bakterien wurden in 7.5ml LB-Medium mit 10% (w/v) Polyethylenglycol-6000, 5% Dimethylsulfoxid, 10mM MgSO4, 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8 aufgenommen, für eine Stunde auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Zur Transformation wurden 20μl der isolierten Plasmid-DNA in 100μl 100mM KCI, 30mM CaCI2, 50mM MgCI2 aufgenommen und mit 100μl der aufgetauten Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bakterien mit 1 ml LB-Medium versetzt und unter Schütteln für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten mit 100μg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Von jeder Transformation wurde ein einzelner Klon in 3 ml LB-Medium über Nacht bei 37°C angezogen. Anschließend wurden die Plasmide unter Verwendung des Qiagen Tip20 Kits nach Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden ) präpariert und aufgereinigt.For this purpose, individual yeast colonies were shaken in 0.5 ml SD minimal medium without addition of histidine and leucine at 30 ° C. overnight. The next day the cells Pellettiert by centrifugation and removed so much from the medium that about 50μl remained. In this medium residue, the cells were resuspended by vortexing and a spatula tip of the cell wall-destroying enzyme lyticase was added. The cells were incubated for one hour at 37 ° C. while shaking, and 10 μl of a 20% sodium dodecyl sulfate solution were then added. For lysing, the cells were vortexed for 1 min, briefly frozen at -20 ° C. and thawed quickly. The cell debris was separated by centrifugation at 14,000 rpm, and the plasmid DNA present in the supernatant was freed of impurities using the QiaQuick PCR Purification Kit and taken up in 50 μl water. The plasmid DNA was then transformed into bacteria and expanded in order to obtain larger amounts of the plasmids. For transformation, the E.coli k12 strain “Goldstar” (Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) was shaken and grown overnight at 37 ° C. and 200 RPM in LB medium with 100 μg / ml ampicillin. The next morning, 1 Inoculated ml of the bacterial culture in 200 ml of fresh medium and shaken to an optical density of approximately 0.5 at 595 nm at 37 ° C. and 200 RPM, then the culture was cooled to 4 ° C. and centrifuged at 2500 × g, the supernatant was discarded and the pelleted Bacteria were taken up in 7.5 ml LB medium with 10% (w / v) polyethylene glycol-6000, 5% dimethyl sulfoxide, 10mM MgSO 4 , 10mM (Promega, Madison, USA), pH 6.8, incubated for one hour on ice, in liquid Nitrogen flash frozen and stored at -80 ° C. For transformation, 20 μl of the isolated plasmid DNA was taken up in 100 μl 100 mM KCI, 30 mM CaCl 2 , 50 mM MgCI 2 and incubated with 100 μl of the thawed bacteria for 20 min on ice, after a 10-minute period incubation at room temperature, the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and incubated at 37 ° C. with shaking for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 μg / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. A single clone was grown from each transformation in 3 ml LB medium overnight at 37 ° C. The plasmids were then prepared and purified using the Qiagen Tip20 kit according to the manufacturer's instructions (Qiagen, Hilden).
Die Sequenzierung der Plasmide mit dem Oligonukleotid 5'- GATGTATATAACTATCTATTCG,-^ (Seq. ID No 12) wird mit dem Fachmann bekannten Standardmethoden (z. B. nach Sanger, apparativ mit Sequenzer) durchgeführt.The sequencing of the plasmids with the oligonucleotide 5 ' - GATGTATATAACTATCTATTCG, - ^ (Seq. ID No 12) is carried out with the person skilled in the art known standard methods (e.g. according to Sanger, apparatus with sequencer).
Die folgenden Peptidsequenzen (Tabelle 1, dargestellt Aminosäuren 1 bis 20) konnten als die 3xE2Fwt-Sequenz spezifisch erkennende Domänen ermittelt werden:The following peptide sequences (Table 1, shown amino acids 1 to 20) could be determined as domains which specifically recognize the 3xE2Fwt sequence:
Tabelle 1 :Table 1 :
Die Domänen weisen an den für die sequenzspezifische Bindung entscheidenden Positionen Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften auf, z. B. Valin und Isoleucin (schattiert dargestellt). Aus den Einzelsequenzen kann eine Konsensussequenz (Seq. ID No. 13) abgeleitet werden.The domains have amino acids with very similar properties at the positions crucial for sequence-specific binding, e.g. B. valine and isoleucine (shaded). A consensus sequence (Seq. ID No. 13) can be derived from the individual sequences.
Der Vergleich der aus den DNA-Sequenzen dieser Bibliotheksmitglieder abgeleiteten Aminosäuresequenz ergibt, daß in allen 4 Positionen, die in Seq. ID No 1 mit X gekennzeichnet sind, Aminosäurereste mit kurzen Seitenketten (G,V,C,S) dominierten (Tabelle 2). Besonders deutlich ist dabei das häufige Auftreten der Aminosäure Glycin in Position X-1 und X-4.The comparison of the amino acid sequence deduced from the DNA sequences of these library members shows that in all 4 positions which are shown in Seq. ID No 1 are marked with X, amino acid residues with short side chains (G, V, C, S) dominated (Table 2). The frequent occurrence of the amino acid glycine in positions X-1 and X-4 is particularly clear.
Tabelle 2Table 2
Aus dem Vergleich der Aminosäuresequenz der Binder kann eine Konsensussequenz der Erkennungsaminosäuren (Pos. X-1 : G oder C, Pos. X-2: V, Pos X-3: V, Pos. X-4: G) der neuartigen Peptide abgeleitet werden, die jedoch nicht als eigenständige Sequenz unter den analysierten Bibliotheksmitgliedern vorkam. Dies kann jedoch dadurch begründet werden, daß bei einer geschätzten Effizienz der Bibliothekstransformation von ca. 200,000 Transformationsereignissen und einem Verhältnis Vektor (mit InsertVVektor (ohne Insert) von 1 :5 nur etwa 40,000 verschiedene Bibliotheksmitglieder transformiert wurden. Bei einer Komplexität der Bibliothek von 104,000 kodierenden Mitgliedern wurde daher jedes Mitglied mit einer Wahrscheinlichkeit von 0.38 in die Hefe transformiert. A consensus sequence of the recognition amino acids (item X-1: G or C, item X-2: V, item X-3: V, item X-4: G) of the novel peptides can be derived from the comparison of the amino acid sequence of the binders which, however, did not appear as a separate sequence among the analyzed library members. However, this can be justified by the fact that with an estimated library transformation efficiency of approximately 200,000 transformation events and a ratio vector (with insert vector (without insert) of 1: 5, only approximately 40,000 different library members were transformed. With a complexity of the library of 104,000 coding Members were therefore transformed into yeast with a probability of 0.38.

Claims

Patentansprüche: claims:
1. Biomorphe Peptide enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 1 oder einer strukturellen Variante davon.1. Biomorphic peptides containing an amino acid sequence according to Seq. ID No. 1 or a structural variant thereof.
2. Biomorphe Peptide gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide in homo- und/oder heterodimerer Form vorliegen.2. Biomorphic peptides according to claim 1, characterized in that the peptides are present in homo- and / or heterodimeric form.
3. Biomorphe Peptide gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Peptide ausgewählt aus der Gruppe gemäß Seq. ID No 1 oder einer strukturellen Variante davon über einen Linker verknüpft sind.3. Biomorphic peptides according to one of the preceding claims, characterized in that at least two peptides selected from the group according to Seq. ID No 1 or a structural variant thereof are linked via a linker.
4. Biomorphe Peptide gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß als Linker Komplexbildner oder Leucin-Zipper enthalten sind.4. Biomorphic peptides according to claim 3, characterized in that are contained as a linker or leucine zipper.
5. Biomorphe Peptide gemäß einem der vorherigen Ansprüche enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 2.5. Biomorphic peptides according to one of the preceding claims containing an amino acid sequence according to Seq. ID No. Second
6. Biomorphe Peptide gemäß einem der vorherigen Ansprüche enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 1, einer strukturellen Variante davon oder Seq. ID No 2 und Kerntransportsignaldomänen, Transkriptionsaktivierungsdomänen oder Transkriptionsinhibierungsdomänen.6. Biomorphic peptides according to one of the preceding claims containing an amino acid sequence according to Seq. ID No. 1, a structural variant thereof or Seq. ID No 2 and core transport signal domains, transcription activation domains or transcription inhibition domains.
7. Verwendung von biomorphen Peptiden enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 1, einer strukturellen Variante davon oder Seq. ID No 2 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von genregulatorischen Störungen.7. Use of biomorphic peptides containing an amino acid sequence according to Seq. ID No. 1, a structural variant thereof or Seq. ID No 2 for the manufacture of pharmaceuticals for the treatment of gene regulatory disorders.
8. Nukleinsäuren umfassend biomorphe Peptide nach den Ansprüchen 1 bis 6 codierende Nukleinsäuresequenzen gemäß Seq. ID No 3 oder einer strukturellen Variante davon. 8. nucleic acids comprising biomorphic peptides according to claims 1 to 6 coding nucleic acid sequences according to Seq. ID No 3 or a structural variant thereof.
9. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Leucin-Zipper-Sequenz enthalten.9. Nucleic acids according to claim 8, characterized in that they contain a leucine zipper sequence.
10. Nukleinsäuren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie Kemtansprotsignaldomänen, Transkriptionsaktivierungsdomänen oder Transkriptionsinhibierungsdomänen codierende Bereiche enthalten.10. Nucleic acids according to claim 8 or 9, characterized in that they contain Kemtan's signal domains, transcription activation domains or transcription inhibition domains coding regions.
11. Vektoren enthalten Nukleinsäuren nach Anspruch 8 oder 9.11. Vectors contain nucleic acids according to claim 8 or 9.
12. Nukleinsäuren gemäß den Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine DNA oder cDNA ist.12. Nucleic acids according to claims 8 to 10, characterized in that the nucleic acid is a DNA or cDNA.
13. Verwendung von Nukleinsäuren oder Vektoren nach den Ansprüchen 8 bis 11 zur Herstellung von gentherapeutischen Arzneimitteln zur Behandlung von genregulatorischen Störungen.13. Use of nucleic acids or vectors according to claims 8 to 11 for the production of gene therapeutic drugs for the treatment of gene regulatory disorders.
14. Bibliotheken umfassend Desoxyribonukleinsäuren die eine Nukleinsäuresequenz gemäß Seq. ID No 3 oder einer strukturellen Variante davon und einen Transkriptionsaktivierungsdomäne codierenden Bereich enthalten.14. Libraries comprising deoxyribonucleic acids which have a nucleic acid sequence according to Seq. ID No 3 or a structural variant thereof and a region encoding a transcription activation domain.
15. Bibliotheken gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Desoxyribonukleinsäuren zusätzlich einen Kerntransprotsignaldomäne und/oder einen Leucin-Zipper codierenden Bereich enthalten.15. Libraries according to claim 14, characterized in that the deoxyribonucleic acids additionally contain a nuclear transcript signal domain and / or a leucine zipper coding region.
16. Peptidbibliotheken umfassend biomorphe Transkriptionsfaktoren die Aminosäuresequenzen gemäß Seq. ID No 1 oder einer strukturellen Variante davon enthalten.16. Peptide libraries comprising biomorphic transcription factors, the amino acid sequences according to Seq. ID No 1 or a structural variant thereof included.
17. Verfahren zum Auffinden sequenzspezifisch DNA bindender biomorpher Transkriptionsfaktoren umfassend folgende Verfahrensschritte:17. A method for finding sequence-specific DNA-binding biomorphic transcription factors comprising the following method steps:
e) Transformierung eines Expressionssystems umfassend einen Mikroorganismus mit einem lethalen Defekt in einem essentiellen Gen, ein chromosomal integriertes Insertionselement mit einer Wildytpkopie dieses Gens unter der Kontrolle eines inhibierbaren basale Transkription erlaubenden Promoters und einem Responselement, mit einer Bibliohek aus Expressionsvektoren, enthaltend die erfindungsgemäßen Desoxyribonukleinsäurefragmente und einen Aktivierungsdomäne, f) Ausplattieren der Expressionssyteme auf einem das essentielle Genprodukt fehlenden Medium, g) Inhibierung der basalen Transkription des essentiellen Wildtypgens im Insertionselement, h) Isolierung der wachsenden Zellkulturen und Sequenzierung des erfindungsgemäßen DNA-Fragments bzw. der entsprechenden Peptidsequenz.e) transformation of an expression system comprising a microorganism with a lethal defect in an essential gene, a chromosomally integrated insertion element with a wild type copy of this gene under the control of an inhibitable basal transcription-promoting promoter and a response element, with a library of expression vectors containing the deoxyribonucleic acid fragments according to the invention and an activation domain, f the expression systems on a medium lacking the essential gene product, g) inhibiting the basal transcription of the essential wild-type gene in the insertion element, h) isolating the growing cell cultures and sequencing the DNA fragment according to the invention or the corresponding peptide sequence.
18. Biomorphes Peptid enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID No. 1 oder einer strukturellen Variante, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure an Position X-1 ein G, C, I, D, N, S, P, H oder R ist, die Aminosäure an Position X-2 ein V, A, N, M, L, E, G, P, S, T, Y oder R ist, die Aminosäure an Position X-3 ein V, S, G, T, L, M, A, I, E, N, C, Q, Y oder D ist, die Aminosäure an Position X-4 ein G, C, I, H, S, T, M, Q, A, L, W, V, D, K oder R ist.18. Biomorphic peptide containing an amino acid sequence according to Seq. ID No. 1 or a structural variant, characterized in that the amino acid at position X-1 is a G, C, I, D, N, S, P, H or R, the amino acid at position X-2 is a V, A, N , M, L, E, G, P, S, T, Y or R, the amino acid at position X-3 is a V, S, G, T, L, M, A, I, E, N, C, Q, Y or D, the amino acid at position X-4 is a G, C, I, H, S, T, M, Q, A, L, W, V, D, K or R.
19. Biomorphes Peptid gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure an Position X-1 ein G, C, I, oder D ist, die Aminosäure an Position X-2 ein V, A, oder N ist, die Aminosäure an Position X-3 ein V oder S ist, die Aminosäure an Position X-4 ein G ist.19. Biomorphic peptide according to claim 18, characterized in that the amino acid at position X-1 is a G, C, I, or D, the amino acid at position X-2 is a V, A, or N, the amino acid at position X-3 is a V or S, the amino acid at position X-4 is a G.
20. Biomorphes Peptid gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure an Position X-1 ein G ist, die Aminosäure an Position X-2 ein V ist, die Aminosäure an Position X-3 ein V ist, die Aminosäure an Position X-4 ein G ist. 20. Biomorphic peptide according to claim 18 or 19, characterized in that the amino acid at position X-1 is a G, the amino acid at position X-2 is a V, the amino acid at position X-3 is a V, the amino acid at Position X-4 is a G.
21. Künstliche biomorphe Faktoren enthaltend ein Peptid mit einer Sequenz gemäß Anspruch 18 bis 20.21. Artificial biomorphic factors containing a peptide with a sequence according to claim 18 to 20.
22. Künstliche biomorphe Transkriptionsfaktoren oder Repressoren gemäß Anspruch 21 die spezifisch die E2Fwt-Sequenz binden. 22. Artificial biomorphic transcription factors or repressors according to claim 21 which specifically bind the E2Fwt sequence.
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