EP1282825A1 - Immunoessai pour les proteines de reserve de cereales - Google Patents

Immunoessai pour les proteines de reserve de cereales

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EP1282825A1
EP1282825A1 EP01921439A EP01921439A EP1282825A1 EP 1282825 A1 EP1282825 A1 EP 1282825A1 EP 01921439 A EP01921439 A EP 01921439A EP 01921439 A EP01921439 A EP 01921439A EP 1282825 A1 EP1282825 A1 EP 1282825A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substrate
peptide
antibodies
gluten
hydrolysis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01921439A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sandra Denery-Papini
Yves Popineau
Jacques Gueguen
Colette Larre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP1282825A1 publication Critical patent/EP1282825A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a new method for the detection and immunochemical determination of grain reserve proteins in a raw material or in a processed product.
  • This dosage is of particular interest for people with celiac disease, since the symptoms of this disease (nausea, diarrhea, weight loss 7) are linked to the ingestion of reserve proteins (called prolamins) certain cereals, especially wheat, barley or rye proteins.
  • prolamins reserve proteins
  • gliadins which are monomeric proteins
  • glutenins which form polymers.
  • the prolamins of other cereals have homologous types.
  • cereal prolamins can be carried out by immunochemical type techniques, in particular ELISA type assays ("Enzyme Linked Immunosorbent Assay", see for example the Practical Guide to analyzes in the cereal industries; B. GODON and W.LOISEL coordinators - Agrifood Sciences and Techniques collection - Publisher Lavoisier Paris - 1997 pages 488 to 518).
  • ELISA type assays Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • Biochemical assay techniques can also be used, in particular by HPLC chromatography (High Performance Liquid Chromatography).
  • Gliadins in flour are easily extractable in alcoholic solutions (ethanol in particular).
  • ethanol ethanol in particular
  • the reliability of the ethanolic extraction protocol is not optimal, in particular this reliability is strongly affected by the heating of food; on the other hand, depending on the percentage of ethanol in the extraction solution (which may vary depending on the protocol used and according to the manipulators), the extraction of gliadins is more or less quantitative and selective, which results in thereafter variability of the dosage.
  • gliadins As an indication, an immunochemical assay for gliadins has been developed by SKERRITT and HILL (Monoclonal antibody sandwich enzyme immunoassays for determination of gluten in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, 1771-1778; and: Enzyme immunoassay for determination of gluten in foods: collaborative study, Journal of the Association of Officiai Analytical Chemistry 1991, 74, 257-264) for the control of foods intended for celiac patients. The corresponding test is based on the detection of ⁇ -gliadins by monoclonal antibodies, after ethanolic extraction. As ⁇ -gliadins are thermostable proteins the dosage can be carried out not only from raw products, but also from processed products having undergone cooking.
  • ⁇ -gliadins represent only a small percentage of total gliadins and their content varies greatly from one variety to another (from 6 to 20% of total gliadins); thus, depending on the composition of the product compared to that of the calibration control, there is a risk of over or under-evaluation of the total gliadin content of the product.
  • the anti- ⁇ -gliadin monoclonal antibody gives cross-reactions with glutenins and its affinity differs for prolamins from wheat, rye and barley, which results in important differences in the dosage of these proteins not tolerated by celiac patients (in particular, the anti- ⁇ -gliadin antibody only weakly detects barley prolamins).
  • the present invention provides a new method for detecting and dosing grain reserve proteins in a raw or cooked substrate, and this more reliably than current techniques.
  • the process according to the present invention consists in subjecting the basic substrate dispersed in a liquid medium to a partial hydrolysis operation suitable for fragmenting the proteins into peptide or polypeptide elements, then in carrying out an immunochemical assay using at least one antibody on the soluble fraction of the hydrolyzate obtained.
  • Partial hydrolysis is carried out under conditions suitable for cutting the prolamins into smaller soluble fragments, on the one hand in the solution used for said hydrolysis, and on the other hand in solutions compatible with the subsequent carrying out of the immunochemical assay selected.
  • This hydrolysis operation consequently ensures the extraction, from the base substrate, of peptide or polypeptide fragments derived from prolamins, and it ensures a high rate of extraction of said prolamins due to this fragmentation.
  • the corresponding conditions for partial hydrolysis must also be adapted to keep intact the epitopes recognized by the antibody or antibodies used in the type of immunochemical assay chosen.
  • the extraction method can cover all types of cleavage, but preferably an enzymatic type hydrolysis technique is used.
  • the immunochemical assay method used is preferably an ELISA method of the competitive or sandwich type using monoclonal or polyclonal anti-peptide antibodies (antibodies obtained against synthetic peptides or against peptides resulting from a hydrolysis of prolamines), capable of recognizing the fragments generated by the preliminary extraction of prolamines.
  • the extraction solution will then be chosen compatible with carrying out an ELISA type assay; it is possible to use water or saline solutions of neutral or weakly acidic or basic pH, not containing, or in very small quantity, organic solvent, reducing or dissociating agent.
  • the originality of the process according to the present invention is to combine the partial hydrolysis of the prolamins, to ensure and improve their extraction (by fragments), and the use of antibodies capable of recognizing the hydrolysed prolamins.
  • the partial hydrolysis of prolamins makes it possible to control their extraction; anti-peptide antibodies are preferably used in order to control the recognition of these proteins.
  • the controlled hydrolysis of native or cooked prolamins, into smaller peptides or poly-peptides makes it possible to increase the solubility of proteins.
  • the extraction of all prolamins is carried out quantitatively, which ensures good reliability of the assay.
  • anti-peptide antibodies improves the specificity of the antibodies. Indeed, this strategy makes it possible to select, from the protein sequences available in the databases, the peptides or the regions used for the immunizations and therefore to better control the reaction of the antibodies vis-à-vis the various prolamins.
  • the assay methodology in accordance with the present invention may be of interest in various sectors, in particular varietal selection, quality control in the food industry, or specialized analyzes.
  • Various applications are possible such as:
  • An industrial gluten in powder form (500 mg) is dispersed in a solution of acetic acid (10 ml) using a homogenizer (12,000 rpm for 1 minute); the pH of the dispersion is adjusted to the optimum pH of the enzyme used (ie pH 2 for pepsin) and the dispersion is placed in a water bath at 38 ° C.
  • Pepsin (2 FIP U / mg) is added in an enzyme / substrate ratio of 1/100 mass by mass. After 2 to 3 hours of hydrolysis with continuous stirring, the enzyme is inactivated by heating (3 minutes in a water bath at 100 ° C.) then the hydrolyzate is lyophilized.
  • the reserve proteins present in the sample are determined by a
  • the antigen immobilized on the microtiter plate is a gluten hydrolyzate obtained by pepsin (see a)); the hydrolyzate is adsorbed on the plate at a concentration of 1 ⁇ g / ml for 2 hours at 37 ° C. after three washes, the free sites of the microtitration plate are saturated with a protein solution (skimmed milk powder at 2%) for 1 hour at 37 ° C., then the plate is again washed three times. To obtain a calibration curve the sample (gluten hydrolyzate) is diluted in a saline buffer from 200 to 50,000 times.
  • the hydrolyzate at different dilutions is then preincubated with the antibodies for 1 hour at 37 ° C, then this mixture is added to the wells of the plate (incubation for 1 hour at 37 ° C).
  • the antibodies used in this example are rabbit polyclonal antibodies directed against a synthetic peptide corresponding to a repeating motif in the ⁇ -gliadin sequence, namely: PQQPYPQQPC; the antibodies are diluted to 1/1000 , è e .
  • the reaction of the antibodies with the immobilized antigens is revealed by the addition of a second type of polyclonal antibodies directed against rabbit antibodies and labeled with alkaline phosphatase (dilution 1/3000, incubation of one hour at 37 ° C).
  • alkaline phosphatase paranitrophenylphosphate
  • the alkaline phosphatase substrate is added and the absorbance is read at 405 nm after 30 minutes of incubation.
  • the results are expressed as a percentage of inhibition: (1-A / Ao) x 100, where A corresponds to the absorbance measured for a given dilution of the antigen to be assayed and Ao to the absorbance measured in the absence of the antigen to be assayed.
  • This example applies to the same industrial gluten as in Example 1 but is additionally subjected to cooking for one hour in a water bath (100 ° C.), after dispersion in water.
  • the cooked gluten 500 mg
  • a solution of acetic acid (10 ml) using a homogenizer the pH of the dispersion is adjusted to pH 2 and the dispersion is placed in a water bath.
  • the pepsin is added in an enzyme / substrate ratio of 1/100 mass by mass.
  • the pepsin is inactivated by heating (3 minutes in a water bath at 100 ° C.) then the hydrolyzate is lyophilized.
  • the hydrolyzate is dissolved at 1 mg / ml in a basic buffer containing
  • the reserve proteins present in the sample are assayed by a competitive ELISA with polyclonal rabbit antibodies directed against a synthetic peptide corresponding to a repeating motif of the ⁇ -gliadin sequence (here: PQQPYPQQPC), according to the same protocol as that described in Example 1.
  • FIG. 1 An assay by the Kjeldahl method of the total proteins on the basic substrate and on the soluble fraction of the hydrolyzate prepared shows that the controlled hydrolysis of the cooked gluten makes it possible to obtain a solubility of 94% of the gluten in the basic buffer containing
  • Example 2 presents the comparison of the response obtained vis-à-vis a sample of. native gluten (example 1) and a cooked gluten sample (according to example 2) in a competitive ELISA, after careful hydrolysis of these samples. Note that the ELISA dosage curves obtained for native gluten and cooked gluten are superimposed. These results indicate that the cooking of gluten has no influence on the extraction and recognition of prolamines, which constitutes an important progress compared to already existing methods, and which allows the application of this method to products. subjected to a heat treatment (cooking, sterilization ).
  • Example 3
  • This example shows the feasibility of the determination of the reserve proteins of wheat when they are incorporated in a food matrix containing meat proteins.
  • 0.16% by mass of the industrial gluten from Example 1 was incorporated into a freeze-dried industrial cooked dish based on carrots and chicken intended for infant feeding.
  • the sample (1 g) is dispersed in 15 ml of acetic acid solution using a homogenizer (12,000 rpm for 2 minutes); the pH of the dispersion is adjusted to pH 2 and the dispersion is placed in a water bath.
  • Pepsin (2 FIP U / mg) is added in an enzyme / substrate ratio 1/100 calculated by mass of enzyme by mass of total proteins of the product. After two hours of hydrolysis with continuous stirring, the enzyme is inactivated by heating in a microwave (1 min. 600 w, then 1 min. 440 w, then 1 min. 100 w).
  • the hydrolyzate is then diluted by 2 in a basic buffer containing 0.1% of SDS and the solution is stirred overnight. After centrifugation (2400 g for 15 minutes) the soluble fraction is used for the assay.
  • the reserve proteins present in the sample are assayed by a competitive ELISA with rabbit polyclonal antibodies directed against a synthetic peptide corresponding to a repeating motif of the ⁇ -gliadin sequence, according to the same protocol as that described in the example. 1, with dilutions of the sample ranging from 20 th to 5000 th .
  • Figure 3 shows the comparison of the response obtained vis-à-vis the control gluten (Example 1) and a food product enriched in gluten in a competitive ELISA test, after gentle enzymatic hydrolysis of these samples.
  • the curves obtained for the native gluten and the gluten contained in the carrot-chicken dish are superimposed, which shows that the incorporation of gluten into a complex food matrix has no influence on the hydrolysis of gluten, its extraction and its dosage by the ELISA test.
  • Example 4 This example applies to the same industrial gluten as in Example 1.
  • the same mild hydrolysis treatment as in Example 1 is used.
  • the hydrolyzate is dissolved at 1 mg / ml in a basic buffer containing 0.1% SDS and the solution is stirred overnight.
  • the soluble fraction is used for the assay.
  • the reserve proteins present in the sample are assayed by a competitive ELISA according to a protocol similar to that described in Example 1.
  • the antigen immobilized on the microtitration plate is a gluten hydrolyzate obtained with pepsin (adsorbed on the microtiter plate at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml).
  • the sample is diluted from 50 th to 1000 th .
  • the antibody used for this assay is a monoclonal antibody directed against a synthetic peptide corresponding to the repeating motif of the ⁇ -gliadin sequence (here: PQQPFPQGC); the culture supernatant is diluted to 100% .
  • the binding of the antibodies to the immobilized antigen is revealed by the addition of antibodies directed against the mouse antibodies and labeled with alkaline phosphatase (dilution 1/3000). Results "• The obtained dosage curve is shown in FIG. 4. A competitive ELISA assay is possible with the corresponding monoclonal antibody since this assay curve has a linearity zone (located between 1 and 20 ⁇ g / ml of gluten) .
  • Example 5 A similar protocol was used to detect and measure different industrially modified glutens (hydrolyzed or deamidated glutens). The results obtained show that these products are generally recognized similarly to an unmodified gluten serving as a reference.
  • Example 5 A similar protocol was used to detect and measure different industrially modified glutens (hydrolyzed or deamidated glutens). The results obtained show that these products are generally recognized similarly to an unmodified gluten serving as a reference.
  • Example 1 This example applies to the same industrial gluten as in Example 1.
  • the same mild hydrolysis treatment as in Example 1 is used.
  • the hydrolyzate is dissolved in 50 mg / ml in a basic buffer and the solution is stirred overnight. After centrifugation (2400 g for 15 min) the soluble fraction is used for the assay.
  • the reserve proteins present in the sample are assayed by a competitive ELISA according to a protocol similar to that described in Example 1.
  • the antigen immobilized on the microtitration plate is a gluten hydrolyzate obtained with pepsin (adsorbed on the microtiter plate at a concentration of 0.25 ⁇ g / ml).
  • the sample is diluted by 50 QQ iè m e a (J 20,000 , é e .
  • the antibody used for this assay is a monoclonal antibody directed against a fraction of a pepsic hydrolyzate of ⁇ -gliadine corresponding to the repetitive domain of the protein (the culture supernatant is diluted 10 th).
  • the binding of the antibodies to the immobilized antigen is revealed by adding antibodies directed against the mouse antibody and labeled with alkaline phosphatase (GA -PAL, dilution 1 / 3000).
  • This dosage can be applied to rye and barley prolamins for which they have obtained in this test an equivalent or even higher recognition than that of wheat gluten prolamins.

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Abstract

Le procédé conforme à la présente invention consiste à soumettre le substrat dispersé dans un milieu liquide à une opération d'hydrolyse partielle adaptée pour fragmenter les protéeines en éléments peptidiques ou polypeptidiques, puis à effectuer un dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps sur la fraction soluble de l'hydrolysat obtenu. L'hydrolyse partielle est menée dans des conditions adaptées pour libérer des fragments peptidiques pou polypeptidiques qui sont solubles, d'une part dans la solution utilisée pour ladite hydrolyse, et d'autre part dans des solutions compatibles avec le type de dosage immunochimique utilisé et qui conservent intacts les épitopes reconnus par le ou les anticorps utilisés. Les anticorps utilisés sont de préférence des anticorps anti-peptide.

Description

IMMUNOESSAI POUR LES PROTEINES DE RESERVE DE CEREALES
La présente invention concerne un nouveau procédé permettant la détection et le dosage immunochimique des protéines de réserve de céréales dans une matière première ou dans un produit transformé.
La détection ou le dosage des protéines de réserve de céréales dans un substrat présente un intérêt dans de nombreux secteurs techniques, et même dans le domaine médical.
Ce dosage présente en particulier de l'intérêt pour les personnes atteintes de la maladie cœliaque, puisque les symptômes de cette maladie (nausées, diarrhées, pertes de poids ...) sont liés à l'ingestion de protéines de réserve (appelées prolamines) de certaines céréales, notamment de protéines de blé, d'orge ou de seigle.
Parmi les prolamines de blé (gluten) on distingue les gliadines qui sont des protéines monomériques et les gluténines qui forment des polymères. Les prolamines des autres céréales comportent des types homologues.
Le dosage des prolamines de céréales peut être réalisé par des techniques de type immunochimique, en particulier des dosages de type ELISA (« Enzyme Linked Immunosorbent Assay », voir par exemple le Guide pratique d'analyses dans les industries des céréales ; B.GODON et W.LOISEL coordonnateurs - collection Sciences et Techniques Agroalimentaires - Editeur Lavoisier Paris - 1997 pages 488 à 518).
On peut aussi mettre en oeuvre des techniques de dosage biochimique, en particulier par chromatographie HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Les dosages par ELISA des protéines de céréales présentent de nombreux avantages par rapport aux dosages biochimiques ; en particulier ils assurent :
- une spécificité de la détection, qui évite une extraction sélective des différentes classes de prolamines avant le dosage, et qui permet un dosage à partir de matrices complexes (par exemple des aliments) ;
- une rapidité et une simplicité opératoires qui rendent possible le traitement de nombreux échantillons simultanément ; - une bonne sensibilité.
Les principaux problèmes pour le dosage immunochimique des gliadines et/ou des gluténines dans les farines ou les produits dérivés sont liés aux difficultés d'extraction des protéines et à l'obtention d'anticorps de spécificité adaptée.
Les gluténines de la farine ou les gliadines agrégées par chauffage (dans un aliment par exemple) ne sont extractibles qu'en présence d'agents réducteurs ou dissociants ; cependant ces agents affectent la réactivité des anticorps et ils ne sont pas compatibles avec la réalisation de dosages ELISA de type compétitif ou sandwich.
Les gliadines de la farine sont facilement extractibles dans les solutions alcooliques (éthanol en particulier). Mais la fiabilité du protocole d'extraction éthanolique n'est pas optimale, en particulier cette fiabilité est fortement affectée par le chauffage des aliments ; d'autre part, en fonction du pourcentage en éthanol de la solution d'extraction (qui peut varier selon le protocole mis en œuvre et selon les manipulateurs), l'extraction des gliadines est plus ou moins quantitative et sélective, ce qui entraîne par la suite une variabilité du dosage.
A titre indicatif, un test de dosage immunochimique des gliadines a été développé par SKERRITT et HILL (Monoclonal antibody sandwich enzyme immunoassays for détermination of gluten in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1990, 38, 1771-1778 ; et : Enzyme immunoassay for détermination of gluten in foods : collaborative study, Journal of the Association of Officiai Analytical Chemistry 1991, 74, 257-264) pour le contrôle des aliments destinés aux malades coeliaques. Le test correspondant est basé sur la détection des ω-gliadines par des anticorps monoclonaux, après extraction éthanolique. Comme les ω-gliadines sont des protéines thermostables le dosage peut être réalisé non seulement à partir de produits crus, mais également à partir de produits transformés ayant subi une cuisson. Ce test présent cependant différents inconvénients. En effet, comme on vient de le voir ci-dessus, le protocole d'extraction éthanolique présente des défauts de fiabilité relativement importants. En outre, même si les ω-gliadines présentent des propriétés de thermostabilité, leur extractibilité peut être affectée par l'insolubilisation des autres protéines présentes dans l'aliment.
Egalement, les ω-gliadines ne représentent qu'un faible pourcentage des gliadines totales et leur teneur varie beaucoup d'une variété à l'autre (de 6 à 20 % des gliadines totales) ; ainsi, selon la composition du produit par rapport à celle du témoin de calibration, il existe un risque de sur ou de sous-évaluation de la teneur en gliadines totales du produit. D'autre part, l'anticorps monoclonal anti-ω-gliadines donne des réactions croisées avec les gluténines et son affinité diffère pour les prolamines de blé, du seigle et de l'orge, ce qui entraîne des différences importantes dans le dosage de ces protéines non tolérés par les malades cceliaques (en particulier, l'anticorps anti-ω- gliadines ne détecte que faiblement les prolamines de l'orge).
La présente invention propose une nouvelle méthode pour détecter et doser les protéines de réserve des céréales dans un substrat cru ou ayant subi une cuisson, et ceci de manière plus fiable que les techniques actuelles.
Le procédé conforme à la présente invention consiste à soumettre le substrat de base dispersé dans un milieu liquide à une opération d'hydrolyse partielle adaptée pour fragmenter les protéines en éléments peptidiques ou polypeptidiques, puis à effectuer un dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps sur la fraction soluble de l'hydrolysat obtenu. L'hydrolyse partielle est menée dans des conditions adaptées pour découper les prolamines en fragments de plus petite taille solubles, d'une part dans la solution utilisée pour ladite hydrolyse, et d'autre part dans des solutions compatibles avec la réalisation ultérieure du dosage immunochimique choisi. Cette opération d'hydrolyse assure en conséquence l'extraction, à partir du substrat de base, de fragments peptidiques ou polypeptidiques issus des prolamines, et elle assure un taux d'extraction important desdites prolamines du fait de cette fragmentation. Les conditions correspondantes d'hydrolyse partielle doivent aussi être adaptées pour conserver intacts les épitopes reconnus par le ou les anticorps utilisés dans le type de dosage immunochimique choisi. La méthode d'extraction peut recouvrir tous types de clivage mais on utilise de préférence une technique d'hydrolyse de type enzymatique.
La méthode de dosage immunochimique utilisée est de préférence une méthode ELISA de type compétitif ou sandwich utilisant des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-peptide (anticorps obtenus contre des peptides synthétiques ou contre des peptides issus d'une hydrolyse des prolamines), capables de reconnaître les fragments générés par l'extraction préalable des prolamines.
La solution d'extraction sera alors choisie compatible avec la réalisation d'un dosage de type ELISA ; on peut utiliser de l'eau ou des solutions salines de pH neutre ou faiblement acide ou basique, ne contenant pas, ou en très faible quantité, de solvant organique, d'agent réducteur ou dissociant.
L'originalité du procédé conforme à la présente invention est de combiner l'hydrolyse partielle des prolamines, pour assurer et améliorer leur extraction (par fragments), et l'utilisation d'anticorps capables de reconnaître les prolamines hydrolysées. L'hydrolyse partielle des prolamines permet de maîtriser leur extraction ; on utilise de préférence des anticorps anti-peptide afin de maîtriser la reconnaissance de ces protéines.
L'hydrolyse ménagée des prolamines natives ou cuites, en peptides ou poly-peptides de plus petite taille permet d'augmenter la solubilité des protéines. L'extraction de l'ensemble des prolamines (gliadines et gluténines) est réalisée de façon quantitative ce qui assure une bonne fiabilité du dosage.
L'utilisation d'anticorps anti-peptide améliore la spécificité des anticorps. En effet, cette stratégie permet de sélectionner, parmi les séquences protéiques disponibles dans les bases de données, les peptides ou les régions utilisées pour les immunisations et donc de mieux maîtriser la réaction des anticorps vis-à-vis des différentes prolamines.
Une sélection judicieuse des épitopes reconnus par les anticorps permet en conséquence de développer un dosage plus fiable de la ou des protéines recherchées.
Dans le cadre de la maladie cœliaque notamment, on peut sélectionner les séquences répétitives présentes dans toutes les céréales non tolérées (blé, seigle, orge ...) et il est possible d'obtenir des anticorps dirigés spécifiquement contre ces peptides répétitifs, qui ne reconnaissent pas les prolamines des céréales tolérées (maïs, riz ...).
La méthodologie de dosage conforme à la présente invention peut présenter un intérêt dans différents secteurs, notamment la sélection variétale, le contrôle qualité en industrie alimentaire, ou les analyses spécialisées. Diverses applications sont envisageables telles que :
- la détection et dosage du gluten dans les aliments destinés aux malades coeliaques (et dans certains cas aux personnes allergiques à la farine de blé). - le contrôle des protéines résiduelles en amidonnerie.
- le contrôle de la composition des produits et de l'étiquetage (par exemple pour des produits carnés, contrôle de la substitution des protéines animales par du gluten pour des raison de coût, pour ses propriétés texturantes ou autre ...).
- le dosage des différentes classes de prolamines (gliadines, sous-unités gluténines) dans les grains (sélection variétale) ou la farine pour estimer la qualité technologique des blés.
Les exemples ci-après permettent de mettre en évidence l'intérêt du procédé conforme à la présente invention.
Exemple 1 a) Préρajati jτ.de_ hydrolysa_t
Un gluten industriel sous forme de poudre (500 mg) est dispersé dans une solution d'acide acétique (10 ml) à l'aide d'un homogénéisateur (12000 tours/min. pendant 1 minute) ; le pH de la dispersion est ajusté au pH optimum de l'enzyme utilisée (à savoir pH 2 pour la pepsine) et la dispersion est placée dans un bain- marie à 38°C. La pepsine (2 FIP U/mg) est rajoutée dans un rapport enzyme/substrat de 1/100 masse pour masse. Après 2 à 3 heures d'hydrolyse sous agitation continue l'enzyme est inactivée par chauffage (3 minutes au bain- marie à 100°C) puis l'hydrolysat est lyophilisé.
L'hydrolysat est ensuite solubilisé à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. b) Dosag.e _ELLSA ρréparation_d'u_ne c j rbe de_ calibration
Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un
ELISA de type compétitif. Dans ce test l'antigène à doser est en compétition pour la liaison à l'anticorps avec un antigène immobilisé sur la plaque de microtitration. La réponse observée est inversement proportionnelle à la quantité d'antigène à doser.
L'antigène immobilisé sur la plaque de microtitration est hydrolysat de gluten obtenu par la pepsine (voir a)) ; l'hydrolysat est adsorbé sur la plaque à une concentration de 1 μg/ml pendant 2 heures à 37°C. après trois lavages, les sites libres de la plaque de microtitration sont saturés avec une solution protéique (lait écrémé en poudre à 2 %) pendant 1 heure à 37°C, puis la plaque est de nouveau lavée trois fois. Pour obtenir une courbe de calibration l'échantillon (hydrolysat de gluten) est dilué dans un tampon salin de 200 à 50.000 fois. L'hydrolysat à différentes dilutions est ensuite préincubé avec les anticorps 1 heure à 37°C, puis ce mélange est rajouté dans les puits de la plaque (incubation 1 heure à 37°C). Les anticorps utilisés dans cet exemple sont des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des αβ-gliadines , à savoir : PQQPYPQQPC ; les anticorps sont dilués au 1/1000,è e. Après trois lavages, la réaction des anticorps avec les antigènes immobilisés est révélée par ajout d'un second type d'anticorps polyclonaux dirigés contre les anticorps de lapin et marqués à la phosphatase alcaline (dilution 1/3000, incubation d'une heure à 37°C). Après trois lavages, le substrat de la phosphatase alcaline (paranitrophénylphosphate) est rajouté et l'absorbance est lue à 405 nm après 30 minutes d'incubation. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition : (1-A/Ao) x 100, où A correspond à l'absorbance mesurée pour une dilution donnée de l'antigène à doser et Ao à l'absorbance mesurée en absence de l'antigène à doser. On obtient la courbe d'étalonnage illustrée sur la figure 1. c) Ré_s_u_ltats Un dosage par la méthode classique de Kjeldahl des protéines totales sur le substrat de base et sur la fraction soluble de l'hydrolysat préparé selon a) montre que l'hydrolyse ménagée du gluten permet d'obtenir une solubilité de 95 % du gluten dans le tampon basique contenant 0,1 % de SDS.
Avant hydrolyse le gluten n'était soluble qu'à 70 % dans ce tampon. La courbe d'étalonnage illustrée sur la figure 1 présente une zone de linéarité qui se situe entre 0,1 et 1μg/ml de gluten. On peut donc en tirer la conclusion qu'un dosage par ELISA compétitif est possible.
Remarque : L'étape de lyophilisation de l'hydrolysat n'est pas obligatoire ; les mêmes résultats ont été obtenus sans lyophilisation, dans ce cas l'hydrolysat est dilué directement dans le tampon basique. Exemple 2 :
Cet exemple s'applique au même gluten industriel que dans l'exemple 1 mais soumis en plus à une cuisson d'une heure au bain-marie (100°C), après dispersion dans l'eau. Après lyophilisation, le gluten cuit (500 mg) est dispersé dans une solution d'acide acétique (10 ml) à l'aide d'un homogénéisateur ; le pH de la dispersion est ajusté à pH 2 et la dispersion est placée dans un bain-marie. La pepsine est rajoutée dans un rapport enzyme/substrat de 1/100 masse pour masse. Après 2 à 3 heures d'hydrolyse sous agitation continue la pepsine est inactivée par chauffage (3 minutes au bain-marie à 100°C) puis l'hydrolysat est lyophilisé. L'hydrolysat est solubilisé à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant
0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage.
Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des αβ-gliadines (ici : PQQPYPQQPC), selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1. Résultats : Un dosage par la méthode de Kjeldahl des protéines totales sur le substrat de base et sur la fraction soluble de l'hydrolysat préparé montre que l'hydrolyse ménagée du gluten cuit permet d'obtenir une solubilité de 94 % du gluten dans le tampon basique contenant 0,1 % de SDS, alors qu'avant hydrolyse la solubilité dans ce tampon est de 37 %. La même solubilité est obtenue pour le gluten cuit et pour le gluten natif (Voir exemple 1). La figure 2 présente la comparaison de la réponse obtenue vis-à-vis d'un échantillon de. gluten natif (exemple 1) et d'un échantillon de gluten cuit (selon exemple 2) dans un ELISA compétitif, après hydrolyse ménagée de ces échantillons. On remarque que les courbes de dosage ELISA obtenues pour le gluten natif et le gluten cuit sont superposées. Ces résultats indiquent que la cuisson du gluten n'a pas d'influence sur l'extraction et la reconnaissance des prolamines, ce qui constitue un progrès important par rapport aux méthodes déjà existantes, et ce qui permet l'application de cette méthode aux produits soumis à un traitement thermique (cuisson, stérilisation ...). Exemple 3
Cet exemple montre la faisabilité du dosage des protéines de réserve du blé lorsqu'elles sont incorporées dans une matrice alimentaire contenant des protéines de viande. 0,16 % masse à masse du gluten industriel de l'exemple 1 ont été incorporés dans un plat cuisiné industriel lyophilisé à base de carottes et de poulet destiné à l'alimentation infantile. L'échantillon (1 g) est dispersé dans 15 ml de solution d'acide acétique à l'aide d'un homogénéisateur (12000 tours/min. pendant 2 minutes) ; le pH de la dispersion est ajusté à pH 2 et la dispersion est placée dans un bain-marie. La pepsine (2 FIP U/mg) est ajoutée dans un rapport enzyme/substrat 1/100 calculé en masse d'enzyme par masse de protéines totales du produit. Après deux heures d'hydrolyse sous agitation continue l'enzyme est inactivée par chauffage dans un micro-ondes (1 min. 600 w, puis 1 min. 440 w, puis 1 min. 100 w).
L'hydrolysat est ensuite dilué par 2 dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage.
Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif avec des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre un peptide synthétique correspondant à un motif répétitif de la séquence des αβ-gliadines, selon le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1 , avec des dilutions de l'échantillon allant du 20ième au 5000ième. Résultats :
La figure 3 présente la comparaison de la réponse obtenue vis-à-vis du gluten témoin (exemple 1) et d'un produit alimentaire enrichi en gluten dans un test ELISA compétitif, après hydrolyse enzymatique ménagée de ces échantillons. Les courbes obtenues pour le gluten natif et le gluten contenu dans le plat carottes-poulet sont superposées ce qui montre que l'incorporation du gluten dans une matrice alimentaire complexe n'a pas d'influence sur l'hydrolyse du gluten, son extraction et son dosage par le test ELISA. Exemple 4 : Cet exemple s'applique au même gluten industriel que dans l'exemple 1. Le même traitement d'hydrolyse ménagée que dans l'exemple 1 est utilisé. L'hydrolysat est mis en solution à 1 mg/ml dans un tampon basique contenant 0,1 % de SDS et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 minutes) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif selon un protocole similaire à celui décrit dans l'exemple 1. L'antigène immobilisé sur la plaque de microtitration est un hydrolysat de gluten obtenu avec la pepsine (adsorbé sur la plaque de microtitration à une concentration de 0,5 μg/ml). L'échantillon est dilué du 50ième au 1000iè e. L'anticorps utilisé pour ce dosage est un anticorps monoclonal dirigé contre un peptide synthétique correspondant au motif répétitif de la séquence des γ-gliadines (ici : PQQPFPQGC) ; le surnageant de culture est dilué au lolème. La fixation des anticorps à l'antigène immobilisé est révélée par l'ajout d'anticorps dirigés contre les anticorps de souris et marqués à la phosphatase alcaline (dilution 1/3000). Résultats "• La courbe de dosage obtenue est représentée sur la figure 4. Un dosage par ELISA compétitif est possible avec l'anticorps monoclonal correspondant puisque cette courbe de dosage présente une zone de linéarité (située entre 1 et 20 μg/ml de gluten).
Un protocole similaire a été utilisé pour détecter et doser différents glutens modifiés industriellement (glutens hydrolyses ou désamidés). Les résultats obtenus montrent que ces produits sont d'une manière générale reconnus de façon similaire à un gluten non modifié servant de référence. Exemple 5 :
Cet exemple s'applique au même gluten industriel que dans l'exemple 1. Le même traitement d'hydrolyse ménagée que dans l'exemple 1 est utilisé. L'hydrolysat est mis en solution à 50 mg/ml dans un tampon basique et la solution est agitée pendant une nuit. Après centrifugation (2400 g pendant 15 min) la fraction soluble est utilisée pour le dosage. Les protéines de réserve présentes dans l'échantillon sont dosées par un ELISA compétitif selon un protocole similaire à celui décrit dans l'exemple 1. L'antigène immobilisé sur la plaque de microtitration est un hydrolysat de gluten obtenu avec la pepsine (adsorbé sur la plaque de microtitration à une concentration de 0.25 μg/ml). L'échantillon est dilué du 50QQième a(J 20.000,è e. L'anticorps utilisé pour ce dosage est un anticorps monoclonal dirigé contre une fraction d'un hydrolysat pepsique de γ-gliadine correspondant au domaine répétitif de la protéine (le surnageant de culture est dilué au 10,ème). La fixation des anticorps à l'antigène immobilisé est révélée par l'ajout d'anticorps dirigés contre les anticorps de souris et marqués à la phosphatase alcaline (GA -PAL, dilution 1/3000).
Résultats : La courbe de dosage (moyenne à partir de 8 tests) obtenue avec cet anticorps est présentée sur la figure 5. Un dosage par ELISA compétitif est possible avec cet anticorps monoclonal puisque la courbe de dosage présente une zone de linéarité (située entre 0.3 et 3 μg/ml de gluten.
Ce dosage peut être appliqué aux prolamines du seigle et de l'orge pour lesquelles ont obtient dans ce test une reconnaissance équivalente ou même supérieure à celle des prolamines du gluten de blé.

Claims

- REVENDICATIONS - 1- Procédé pour détecter et doser les protéines de réserve de céréales dans un substrat, caractérisé en ce qu'il consiste :
- à soumettre le substrat dispersé dans un milieu liquide à une opération d'hydrolyse partielle adaptée pour fragmenter les protéines en éléments peptidiques ou polypeptidiques, puis
- à effectuer un dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps sur la fraction soluble de l'hydrolysat obtenu, l'hydrolyse partielle étant menée dans des conditions adaptées pour libérer des fragments peptidiques ou polypeptidiques qui sont solubles, d'une part dans la solution utilisée pour ladite hydrolyse, et d'autre part dans des solutions compatibles avec le type de dosage immunochimique utilisé et qui consentent intacts les épitopes reconnus par le ou les anticorps utilisés.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer le dosage immunochimique au moyen d'au moins un anticorps anti- peptide.
3.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse de type enzymatique.
4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il consiste à disperser le substrat dans un milieu liquide adapté à l'enzyme utilisé, avant de soumettre ledit substrat à l'opération d'hydrolyse enzymatique.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA après l'opération d'hydrolyse partielle du substrat.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse enzymatique par la pepsine, puis à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA au moyen d'anticorps dirigés contre un peptide correspondant à un motif répétitif de la séquence des αβ-gliadines.
1.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre le substrat à une opération d'hydrolyse enzymatique par la pepsine, puis à effectuer un dosage immunochimique de type ELISA au moyen d'anticorps dirigés contre un peptide correspondant à un motif répétitif de la séquence des γ-gliadines.
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