EP1256000A2 - Verfahren zur diagnose bilio-pankreatischer karzinome - Google Patents

Verfahren zur diagnose bilio-pankreatischer karzinome

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Publication number
EP1256000A2
EP1256000A2 EP01903698A EP01903698A EP1256000A2 EP 1256000 A2 EP1256000 A2 EP 1256000A2 EP 01903698 A EP01903698 A EP 01903698A EP 01903698 A EP01903698 A EP 01903698A EP 1256000 A2 EP1256000 A2 EP 1256000A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pancreatic
bilio
activating peptide
tap
diagnosis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01903698A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jens Brockmann
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Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1256000A2 publication Critical patent/EP1256000A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney

Definitions

  • the invention relates to a method for diagnosing diseases of the bilio-pancreatic system, in particular carcinomas, and claims the priority of German patent application 100 04 919, to which reference is made in terms of content.
  • the organs of the so-called bilio-pancreatic system namely the pancreas, the gallbladder with the bile ducts, and the papilla vateri as the common mouth of the coledochal duct leading from the liver and the gallbladder and the duct of the pancreatic duct leading from the pancreas Duodenum, arise during embryogenesis from a bud of the duodenum system.
  • Malignant tumors can develop in these organs, which - with increasing incidence - represent a common cause of death for humans. Every fourth death due to malignant neoplasms is due to pancreatic cancer (pancreatic cancer).
  • FIG. 1 shows the characteristic age distribution of the incidence of pancreatic cancer.
  • the Bile duct carcinoma is still the fifth most common cause of cancer-related deaths.
  • papillary cancer i.e. of the Papilla Vateri tumor
  • carcinomas of the bilio-pancreatic system have in common that they are due to less specific symptoms such as a general decrease in performance, weight loss, or painless symptoms - e.g. Painless jaundice (jaundice) - can only be diagnosed late and therefore only recognized late.
  • papillary cancer can be recognized earlier. This exceptional position of papillary carcinoma may be due to the exposed anatomical position of the papilla Vateri, which causes the symptoms that are conspicuous at an early stage in the formation of a tumor and thus allows a quicker diagnosis and better prognosis.
  • pancreatic carcinoma the so-called screening of carcinomas.
  • this is due to the often unspecific fishing or painless symptoms very difficult.
  • pancreatic carcinoma the difficulty of differentiating between the pancreatic carcinoma and chronic pancreatitis, since both pancreatic diseases show similar clinical symptoms.
  • a distinction can often not be made even after surgery and a pathohistological examination and can only be assessed on the basis of the further clinical course (death / survival).
  • the dignity assessment i.e. The differentiation between an inflammatory benign and a malignant pancreatic disease is also important because of the suspected - but not yet finally confirmed - causal relationship between chronic pancreatitis and the pathogen of pancreatic cancer. Studies have shown that hereditary pancreatitis carries a standardized risk of degeneration of 53.
  • carcinoma of the bile duct or gallbladder is often associated with chronic inflammatory bowel disease (ulcerative colitis).
  • gallstones which in turn can trigger chronic inflammation.
  • the object of the invention is to provide a method for the early detection of carcinomas of the bilio-pancreatic system.
  • the invention is based on the idea of quantifying the trypsinogen-activating peptide (hereinafter TAP) in the body's own fluids to detect malignant tumors in the bilio-pancreatic system. Accordingly, the method according to the invention is based on the function of an increased TAP concentration as a marker for bilipancreatic carcinomas and thus presupposes a connection between an increased TAP concentration and the occurrence of malignant tumors.
  • TAP trypsinogen-activating peptide
  • the trypsinogen is formed in the pancreas as an inactive precursor (zymogen) of the protein-digesting enzyme trypsin.
  • the trypsinogen is secreted into the duodenum via the pancreatic duct at the common mouth with the coledochus duct coming from the gallbladder and liver. This is where the trypsinogen in trypsin is activated by the hydrolytically active enterokinase (enteropeptidase) produced in the intestinal mucosa.
  • trypsinogen-activating peptide (TAP) due to its trypsinogen-activating property.
  • TAP trypsinogen-activating peptide
  • This previously recognized model thus attributes acute pancreatitis to the backflow of bile juice into the pancreas, which in some cases is associated with zymogen activation.
  • a connection between the zymogen activation and the pathogenesis of gallbladder and biliary tract inflammation as well as corresponding carcinomas is excluded because - according to the model - the pancreatic juice containing the zymogens does not come into contact with these organs. The same applies to papillary cancer.
  • pancreatic cancer does not involve activation of the zymogens contained in the pancreas. This also applies to the hydrolysis of the trypsinogen to active trypsin and TAP.
  • TAP is suitable as an indicator of the presence of bilio-pancreatic carcinomas.
  • the teaching according to the invention thus initially requires a departure from the long-recognized theory.
  • the teaching according to the invention is based on the assumption that, when the papilla Vateri is closed, the pancreatic secretions flow back into the bile ducts and not - as previously assumed - only bile secretions flow into the pancreas. Due to the entero-hepatic circulation, the enterokinases are in the bile contain that activate the trypsinogen and can thus release TAP. The activated pancreatic enzymes can thus induce inflammation in the gallbladder and bile ducts, which causes local damage to healthy cells. As a result, the inflamed cells can transform into malignant cells, so that malignancies can develop in the bile ducts, the gallbladder and in the area of the papilla Vateri.
  • pancreatic carcinoma can also be derived from this new model.
  • the basis for this is the phenomenon that the pressure in the bile duct system is usually higher than that in the execution duct of the pancreas. This is due to the stronger muscular system of the biliary tract. If the papilla Vateri is narrowed or occluded, there may be a short-term increase in pressure in the pancreatic duct system, since in this organ with 3000 ml daily about four times the amount of secretion compared to the bile formed in the liver (800 ml / day ) arises. This allows trypsinogen to enter the bile ducts, be activated there and flow back into the pancreas - now in its active form. There it can initially cause proteolytic damage, which can be followed by a transformation of the cells into malignant cells.
  • the method according to the invention thus enables a highly specific and sensitive diagnosis of bilio-pancreatic carcinomas. These can be clearly differentiated from other bilio-pancreatic diseases, such as inflammation.
  • the teaching according to the invention therefore offers the possibility of early detection of the carcinomas and correspondingly earlier surgical interventions.
  • the method according to the invention can also advantageously be used to differentiate bilio-pancreatic carcinomas from other gastrointestinal carcinomas.
  • the TAP is preferably quantified by immunological detection in a quantitative solid-phase immunoassay.
  • Other biochemical or physical quantitative detection methods are also suitable.
  • the patient samples to be examined for their TAP content can be taken from a variety of bodily fluids.
  • samples from the blood, bile or urine are suitable. This possibility is among others also due to the low molecular weight of TAP. This can happen, especially in the case of a stasis in the biliary tract, in the bloodstream. It can be filtered renally from the blood and is therefore easily detectable in the urine.
  • the patients listed under 7 also suffered from malignant diseases of the digestive system, but the tumor was not localized in the biliopancreatic system.
  • gall bladder juice was aspirated perioperatively from surgically removed (ectomized) gall bladders. An 18 G puncture needle was used for this.
  • the samples were centrifuged at 3000 G for 10 minutes within the first two hours after collection to separate living cells such as leukocytes or gallbladder epithelial cells.
  • the aliquoted samples were kept at -80 ° C until examined.
  • the gallbladder samples were previously examined both macroscopically and microscopically for pathological symptoms. Only tumor-free gall bladders were used for the following examinations.
  • the TAPKIT test for quantifying the TAP is a quantitative solid-phase enzyme immunoassay which is based on the competitive binding between free and immobilized peptides to an anti-TAP antibody.
  • the antibody used has a specificity against the carboxy terminus of the TAP and was generated by immunizing a rabbit with the TAP coupled to thyroglobulin via the amino terminus.
  • the TAP contained in the sample is immobilized on a solid phase (plate) via a carrier molecule and incubated with rabbit anti-peptide antibodies with biotinylated IgG and streptavidin-horseradish peroxidase additive.
  • the plate is then developed with tetramethylbenzidine (TMB) and the TAP concentration is quantified.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the specified measuring range is 0.45 - 1000 nM. If the TAP contents in the original samples went beyond this measuring range, the samples were diluted.
  • TAP concentrations in the gallbladder juice clearly show higher concentrations for carcinomas of the bilio-pancreatic system.
  • Table 1 Mathematical characterization of the different disease groups.
  • Table 2 Comparison of the TAP concentrations in the bile juice of patients with benign and malignant bilio-pancreatic diseases
  • Fig. 2 Linear distribution of the TAP bile juice concentrations
  • Fig. 3 Logarithmic (Iog10) distribution of the TAP bile juice concentrations
  • Fig. 4 Distribution of the TAP gallbladder juice concentrations in a linear representation
  • Fig. 5 Distribution of the TAP gallbladder juice concentrations in a logarithmic (log 10) representation
  • the occurrence of a false positive result can be avoided by increasing the cut-off value - in the present example to 100 nM. This means that no patient with a benign disease would be diagnosed with a malignant tumor, so that the specificity of the method would be 100%.
  • the sensitivity of the test is 93.75%, i.e. the patients identified as having a tumor actually have such a malignant tumor. This result surpasses all previously published results of other tumor marker examinations.
  • the results show the suitability of the method according to the invention for the differentiation between pancreatitis and pancreatic carcinoma.
  • Terada T Nakamuna Y. Expression of Pancreatic Enzymes ( ⁇ -amylase, trypsinogen and lipase) During Human Liver Development and Matuation. Gastroenterol 1995; 108: 1236-1245 12. Ewe K, Karbach U In: Schmidt / Thews (ed.) Human Physiology; Springer-Verlag Heidelberg-London - Paris-Tokyo; 23rd edition 1986

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Abstract

Trypsin aktivierendes Peptid als Diagnosemittel für maligne bilio-pankreatische Erkrankungen.

Description

"Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen des
bilio-pankreatischen Systems"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen des bilio-pankreatischen Systems, insbesondere von Karzinomen und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldung 100 04 919 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Die Organe des sogenannten bilio-pankreatischen Systems, nämlich die Bauchspeicheldrüse (Pankreas), die Gallenblase mit den Gallengängen sowie die Papilla vateri als gemeinsame Mündung des aus der Leber und der Gallenblase führenden Ductus coledochus und des aus der Bauchspei- cheldrüse führenden Ductus pancreaticus in den Zwölffingerdarm, entstehen während der Embryogenese gemeinsam aus einer Knospe der Zwölffingerdarmanlage. In diesen Organen können bösartige Tumore entstehen, die - mit steigender Inzidenz - eine häufige Todesursache des Menschen darstellen. So geht jeder vierte Todesfall durch bösartige Neubildungen auf das Pankreaskarzinom (Bauchspeicheldrüsenkrebs) zurück. Zwar wurden Pan- kreaskarzinome schon bei Neugeborenen beschrieben, typischerweise ist der Tumor eine Erkrankung des alten Menschen (7,8). Die Figur 1 zeigt die charakteristische Altersverteilung der Inzidenz des Pankreaskarzinoms. Das Gallengangskarzinom gilt noch als fünft häufigste Ursache für auf Tumorleiden zurückzuführende Todesfälle.
Mit Ausnahme des Papillenkarzinoms, d.h. des Tumors der Papilla Vateri, ist den Karzinomen des bilio-pankreatischen Systems gemein, daß sie aufgrund wenig spezifischer Krankheitszeichen, wie beispielsweise eines allgemeinen Leistungsabfalls, eines Gewichtsverlusts, oder schmerzloser Symptome - z.B. einer schmerzlosen Gelbsucht (Ikterus) - erst spät diagnostizierbar sind und somit erst spät erkannt werden. Dagegen läßt sich das Papillenkarzinom früher erkennen. Diese Ausnahmestellung des Papillenkarzinoms geht möglicherweise auf die exponierte anatomische Lage der Papilla Vateri zurück, die die bei einer Tumorbildung früh auffällige Symptome verursacht und damit eine raschere Diagnose und bessere Prognose erlaubt. Bei den übrigen Karzinomen des bilio-pankreatischen Systems besteht zu dem späteren Diagnosezeitpunkt meist bei nur noch wenigen Patienten die Möglichkeit einer kurativen Operation. So sind zu diesem Zeitpunkt nur 5-20 % der Patienten mit Pankreaskarzinom und nur 30 % der unter einem Gallengangskarzinom Leidenden operabel (9). Nur 20 % der Gallenblasenkarzinome sind zum Diagnosezeitpunkt in ihrem Wachstum auf dieses Organ beschränkt, so daß hier auch nur 20 % der Patienten kurativ operiert werden können.
Selbst nach einer kurativen Operation sind die Überlebenschancen der Patienten gering. So liegt die Überlebensrate der Patienten mit einem Gal- lenblasenkarzinom in den ersten 5 Jahren nach der Operation bei unter 5 %. Bei Gallengangskarzinomen liegt die 5-Jahres-Überlebensrate zwischen 0 und 58 %.
Da die operative Tumorentfernung (Tumorresektion) gegenwärtig die einzige kurative Threapiemöglichkeit darstellt, kommt der Tumorfrüherkennung
(dem sogenannten Screening) der Karzinome eine maßgebliche Bedeutung zu. Diese ist jedoch - wie bereits ausgeführt - aufgrund der oft unspezi- fischen oder schmerzlosen Symptome sehr schwierig. Bei der Tumorfrüherkennung des Pankreaskarzinoms besteht zudem insbesondere die Schwierigkeit der Differenzierung zwischen dem Pankreaskarzinom und einer chronischen Pankreatitis, da beide Bauchspeicheldrüsenerkrankungen ähnliche klinische Symptome zeigen. Häufig ist selbst nach einer Operation und einer pathohistologischen Untersuchung eine Unterscheidung nicht zu treffen und nur durch den weiteren klinischen Verlauf (Tod/Überleben) beurteilbar.
Die Dignitätsbeurteilung, d.h. die Differenzierung zwischen einer entzündlichen gutartigen und einer malignen Bauchspeicheldrüsenerkrankung, ist zudem aufgrund des vermuteten - jedoch noch nicht endgültig bestätigten - kausalen Zusammenhangs zwischen einer chronischen Pankreatitis und der Pathogense des Pankreaskarzinoms wichtig. So haben Untersuchungen gezeigt, daß die hereditäre Pankreatitis ein standansiertes Entartungsrisiko von 53 birgt.
Auch die Pathogenese der übrigen Karzinome des bilio-pankreatischen Systems wird vermutlich durch chronische Entzündungen begünstigt. So ist das Gallengangs- oder Gallenblasenkarzinom oft mit einer chronisch entzündlichen Dickdarmerkrankung (Colitis ulcerosa) assoziiert. Des weiteren leiden mehr als 80% der Patienten mit bösartigen Tumoren an Gallensteinen, die ihrerseits wieder chronische Entzündungen auslösen können.
Es ist bekannt, zur möglichen Früherkennung des Pankreaskarzinoms Blutanalysen von Tumormarkern wie CA 19-9, CA 242, CEA, CA 72-5, CA 125 oder CA 50 durchzuführen. Diese Tests können Sensitivitäten von bis zu 80% und Spezifitäten bis maximal 90% aufweisen. Die Sensitivität der bisherigen Tumormarkeranalysen wird jedoch durch andere Erkrankungen, welche mit einem Ikterus einhergehen, negativ beeinflußt (3-5). Des weiteren ist bei dem Fehlen eines bestimmen Blutgruppenantigens - nämlich des Lewis-Blutgruppenantigen a - der bislang gebräuchlichste Tumormarker CA 19-9 nicht nachweisbar (6).
Andere Ansätze zur Verbesserung der Frühdiagnostik beruhen auf der Ver- wendung der Dünnschicht-Computertomographie oder der Endosonogra- phie, d.h. des Ultraschalls im Inneren des Körpers. Diese vermögen jedoch lediglich einen Beitrag zur Bestätigung der Diagnose und der Operationseinschätzung zu liefern, stellen jedoch kein geeignetes Screeningverfahren dar. Selbst in Multicenterstudien von bereits identifizierten Patienten konnte keine Empfehlung für eine Früherkennung abgeleitet werden (2).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren für die Früherkennung von Karzinomen des bilio-pankreatischen Systems bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand entsprechender Unteransprüche.
Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, über eine Quantifizierung des Trypsinogen aktivierenden Peptids (nachfolgend TAP) in körpereigenen Flüssigkeiten den Nachweis maligner Geschwulste in dem bilio-pankreatischen System zu führen. Demnach basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Funktion einer erhöhten TAP-Konzentration als Marker für bilio- pankreatische Karzinome und setzt somit einen Zusammenhang zwischen einer erhöhten TAP-Konzentration und dem Auftreten maligner Tumore voraus.
Ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten maligner bilio-pankreatischer Karzinome und einer erhöhten TAP-Konzentration wurde bisher in den maßgeblichen Fachkreisen nicht nur nicht erkannt, sondern teilweise sogar ausdrücklich verneint, da ein solcher Zusammenhang mit den einschlägigen und seit fast einem Jahrhundert gemeinhin als anerkannt geltenden Theo- rien über die Pathogenese des Pankreaskarzinoms aus folgenden Gründen unvereinbar erscheint:
In der Bauchspeicheldrüse wird für die spätere enzymatische Verdauung von Proteinen und Polypeptiden im Dünndarm das Trypsinogen als inaktive Vorstufe (Zymogen) des eiweißverdauenden Enzyms Trypsin gebildet. Das Trypsinogen wird dabei über den Ductus pancreaticus an der gemeinsamen Mündung mit dem von der Gallenblase und der Leber kommenden Ductus coledochus in den Zwöffingerdarm sezemiert. Hier findet die Aktivierung des Trypsinogens in Trypsin durch die in der Darmmukosa produzierte hydrolytisch aktive Enterokinase (Enteropeptidase) statt.
Durch die Hydrolyse des Trypsinogens entsteht neben Trypsin das tetra-L- Aspartil-L-Lysin, das aufgrund seiner Trypsinogen aktivierenden Eigenschaft "Trypsinogen aktivierendes Peptid" (TAP) genannt wird. Dies ist ein Penta- peptid mit einem Molekulargewicht von 0,606 KDa, dem bei der Entstehung einer schweren akuten nekrotischen Pankreatitis die nachfolgend dargestellte Rolle zukommt.
Bei einem Gallenblasensteinabgang wandert ein kleiner Gallenblasenstein aus der Gallenblase in die Gallengänge und verklemmt sich an der Papilla Vateri, d.h. dem gemeinsamen Ausgang für die Galle und das Bauchspeicheldrüsensekret. Es kommt also zum Verschluß der Ausführungsmündung in den Zwölffingerdarm, der - nach den bisherigen Vorstellungen - einen Rückfluß des sich stauenden Gallensafts in die Bauchspeicheldrüse induziert (14). In der Bauchspeicheldrüse verbleiben die inaktiven Enzymvorstufen - also auch das Trypsinogen - im wesentlichen in ihren inaktiven Formen. Die jedoch ebenso in dem Gallensaft enthaltenen Amylasen und Lipasen erzeugen das Bild der ödematösen Pankreatitis. Sofern jedoch auch die inaktiven Vorstufen der Enzyme aktiviert werden, d.h. in den Fällen der Zymogen-Aktivierung, kommt es zu der schweren akuten nekrotischen Pankreatitis. Auf der Grundlage dieses Modells wurde das aus der US-Patentschrift 4, 948, 723 bekannte Verfahren zur Unterscheidung der ödematösen und der nekrotischen Pankreatitis entwickelt. Dieses basiert auf einem immunologi- sehen Nachweis des TAP in körpereignen Flüssigkeiten, das im Falle der ödematösen Pankreatitis nicht vorhanden ist, während es bei nekrotischen Bauchspeicheldrüsenentzündungen in höheren Mengen nachzuweisen ist.
Dieses bisher anerkannte Modell führt somit die akute Pankreatitis auf den Rückfluß des Gallensaftes in die Bauchspeicheldrüse zurück, die in einigen Fällen mit einer Zymogenaktivierung einhergeht. Ein Zusammenhang zwischen der Zymogenaktivierung und der Pathogenese von Gallenblasen- und Gallengangsentzündung sowie entsprechenden Karzinomen wird somit ausgeschlossen, da - nach dem Modell - der die Zymogene enthaltende Pankreassaft mit diesen Organen nicht in Berührung kommt. Gleiches gilt für das Papillenkarzinom.
Zudem herrscht die Vorstellung, daß die Entwicklung eines Pankreaskarzinoms nicht mit einer Aktivierung der im Pankreas enthaltenen Zymogene einhergeht. Dies gilt somit auch für die Hydrolyse des Trypsinogens zu aktivem Trypsin und TAP.
Auf der Grundlage des bekannten Modells war daher nicht davon auszugehen, daß sich das TAP als Indikator für das Vorliegen bilio-pankreatischer Karzinome eignet. Die erfindungsgemäße Lehre setzt damit zunächst eine Abkehr von der lange anerkannten Theorie voraus.
Die erfindungsgemäße Lehre geht dagegen von der Annahme aus, daß bei einem Verschluß der Papilla Vateri ein Rückfluß des Bauchspeicheldrüsen- sekrets in die Gallengänge erfolgt und nicht - wie bisher angenommen - ausschließlich Gallensekret in die Bauchspeicheldrüse fließt. Durch den entero-hepatischen Kreislauf sind in der Gallenflüssigkeit die Enterokinasen enthalten, die das Trypsinogen aktivieren und damit TAP freisetzen können. Die aktivierten Pankreas-Enzyme können somit in der Gallenblase und in den Gallengängen eine Entzündung induzieren, welche eine lokale Schädigung der gesunden Zellen verursacht. Als Folge davon können die entzün- deten Zellen zu malignen Zellen transformieren, so daß es zur Entstehung von Malignomen in den Gallengängen, der Gallenblase und im Bereich der Papilla Vateri kommen kann.
Mit diesem neuen Modell läßt sich auch die Entstehung des Pankreaskarzi- noms herleiten. Grundlage dafür ist das Phänomen, daß der Druck im Gallengangssystem in der Regel höher ist als der in dem Ausführungsgang der Bauchspeicheldrüse. Dies ist durch das stärkere Muskelsystem der Gallenwege begründet. Bei Engen oder einem Verschluß im Bereich der Papilla Vateri kann kurzfristig ein höherer Druck im Gangsystem der Bauchspei- cheldrüse vorkommen, da in diesem Organ mit 3000 ml täglich etwa die vierfache Menge an Sekret im Vergleich zu der in der Leber gebildeten Galle (800ml/die) entsteht. So kann Trypsinogen in die Gallenwege gelangen, dort aktiviert werden und wieder - nun in seiner aktiven Form - in die Bauchspeicheldrüse zurückfließen. Dort kann es zunächst einen proteolyti- sehen Schaden verursachen, dem eine Transformation der Zellen zu malignen Zellen folgen kann.
Neben der Diagnose von Entzündungen der Gallenblase, der Gallengänge und der Papilla Vateri ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren somit eine hoch spezifische und sensitive Diagnose bilio-pankreatischer Karzinome. Diese lassen sich deutlich von anderen bilio-pankreatischen Erkrankungen, beispielsweise von Entzündungen, differenzieren. Daher bietet die erfindungsgemäße Lehre die Möglichkeit einer Früherkennung der Karzinome und entsprechend früher operativer Eingriffe. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich zudem vorteilhafterweise auch bilio-pankreatische Karzinome von anderen gastro-intestinalen Karzinomen unterscheiden.
Die Quantifizierung des TAP erfolgt vorzugsweise über einen immunologischen Nachweis in einem quantitativen Fest-Phasen-Immunoassay. Auch andere biochemische oder physikalische quantitative Nachweismethoden sind geeignet.
Die auf ihren TAP-Gehalt zu untersuchenden Patientenproben können aus einer Vielzahl von körpereignen Flüssigkeiten entnommen werden. So eignen sich beispielsweise Proben aus dem Blut, der Gallenflüssigkeit oder dem Urin. Diese Möglichkeit geht u.a. auch auf das niedrige molekularen Gewichtes von TAP zurück. Dies kann nämlich, insbesondere bei einer Stauung (Stase) im Bereich der Gallenwege, in die Blutbahn übertreten. Aus dem Blut kann es renal filtriert werden und ist somit einfach im Urin nachweisbar.
Ausführunsgbeispiel
1. Patienten
Von 7/99-11/99 wurde der Gallenblasensaft von 44 Patienten, welche kon- sekutiv cholecystektomiert wurden, analysiert. Die Patienten wiesen folgende Erkrankungen auf:
Pankreaskarzinom; n = 13 (30%) Gallengangskarzinom; n = 1 (2%) Papillenkarzinom; n = 2 (5%) chronische Cholecystolithiasis; n = 14 (32%) akute Cholecystolithiasis; n = 2 (5%) chronische Pankreatitis; n = 6 (13%) andere Tumorerkrankungen mit gleichzeitiger Cholecystolithiasis; n = 6
(13%)
Insgesamt wurden somit 16 Patienten mit einem bilio-pankreatischen Karzinom untersucht.
Die unter 7. aufgeführten Patienten litten zwar ebenfalls an einer bösartigen Erkrankung des Verdauungssystems, aber der Tumor war nicht im bilio- pankreatischen System lokalisiert.
2. Probenentnahme
Für die Bestimmung von TAP wurde Gallenblasensaft perioperativ aus ope- rativ entfernten (ektomierten) Gallenblasen aspiriert. Dazu wurde eine 18 G Punktionsnadel verwendet. Die Proben wurden innerhalb der ersten zwei Stunden nach der Entnahme bei 3000 G über 10 Minuten zentrifugiert, um lebende Zellen wie Leukocyten oder Gallenblasenepithelzellen abzutrennen. Die aliquotierten Proben wurden bis zur Untersuchung bei -80°C aufbe- wahrt. Die Gallenblasenproben wurden zuvor sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch auf pathologische Erscheinungen untersucht. Für die nachfolgenden Untersuchungen wurden nur tumorfreie Gallenblasen verwendet.
Die Ergebnisse wurden mit den intraoperativen Befund und dem histopa- thologischen Ergebnissen korreliert.
3. Quantifizierung des TAP
Für die vorliegenden Untersuchungen wurde der kommerziell erhältliche Test TAPKIT der Firma Biotrin International Ltd., Dublin, Irland, verwendet. Dieser ist aus der US-Patentschrift 5, 356, 781 bekannt, die - gemeinsam mit der parallelen deutschen Offenlegungsschrift 37 89 584 zu Zwecken der Offenbarung vollumfänglich in Bezug genommen wird.
Der Test TAPKIT zur Quantifizierung des TAP ist ein quantitativer Fest-Pha- sen-Enzym-lmmunoassay, der auf der konkurrierenden Bindung zwischen freien und immobilisierten Peptiden an einem anti-TAP-Antikörper basiert. Der eingesetzte Antikörper weist eine Spezifität gegen den Carboxy-Termi- nus des TAP auf und wurde durch die Immunisierung eines Kaninchens mit dem über den Aminoterminus an Thyreoglobulin gekoppelten TAP erzeugt.
Das in der Probe enthaltene TAP wird über ein Trägermolekül an einer festen Phase (Platte) immobilisiert und mit Kaninchen-Anti-Peptid-Antikör- pern mit biotinyliertem IgG und Streptavidin-horseradish-Peroxidase-Zusatz inkubiert. Anschließend erfolgt die Entwicklung der Platte mit Tetramethyl- benzidin (TMB) und die Quantifizierung der TAP-Konzentration. Die resultierende Farbintensität ist indirekt proportional zu der TAP-Menge in der Probe.
Der angegebene Messbereich beträgt 0,45 - 1000 nM. Sofern die TAP- Gehalte in den ursprünglichen Proben über diesen Meßbereich hinausgingen, wurden die Proben verdünnt.
4. Ergebnisse
Die TAP-Konzentrationen im Gallenblasensaft weisen eindeutig höhere Konzentrationen für Karzinome des bilio-pankreatischen Systems auf. Tabelle 1 : Mathematische Charakterisierung der unterschiedlichen Erkrankungsgruppen.
Für den Vergleich der gutartigen versus der bösartigen Erkrankungen des bilio- pankreatischen Systems fanden sich folgende Ergebnisse.
Tabelle 2: Vergleich der TAP-Konzentrationen im Gallensaft von Patienten mit gutartigen und bösartigen bilio-pankreatischen Erkrankungen
Diese Ergebnisse werden in den Figuren 2 bis 5 dargestellt:
Fig. 2: Lineare Verteilung der TAP-Gallensaftkonzentrationen
Fig. 3: Logarithmische (Iog10) Verteilung der TAP-Gallensaftkonzentrationen
Fig. 4: Verteilung der TAP-Gallenblasensaftkonzentrationen in linea- rer Darstellung
Fig. 5: Verteilung der TAP-Gallenblasensaftkonzentrationen in logarithmischer (log 10) Darstellung
In der statistischen Auswertung dieser Ergebnisse kann trotz der geringen Patientenzahl ein höchst signifikanter Unterschied für den Gruppenvergleich zwischen bösartigen und gutartigen Erkrankungen des bilio-pankreatischen Systems aufgezeigt werden. Der Mann-Withney Test für eine nicht parame- frische Analyse wies einen P-Wert >0,0001 nach. Gleichermaßen, obwohl keine Gauss'sche Verteilung vorliegt, war das Ergebnis des ungepaarten t- Tests höchst signifikant. Auch der two-way ANOVA Test ergab eine höchst signifikante Diskriminierung der zwei unterschiedlichen Gruppen.
Bei den Ergebnissen findet sich nur ein falsch positiver Wert in der Gruppe der Patienten mit akuter Gallenblasenentzündung (Cholecystitis). Diese Erkrankung unterscheidet sich jedoch klinisch so sehr von Karzinomen des bilio-pankreatischen Systems, daß dieses falsch positive Ergebnis für die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Praxis keine Relevanz hat. Das falsch positive Ergebnis liefert zudem einen Hinweis darauf, daß im Rahmen der akuten Entzündung der Gallenblase ein höherer Wert für TAP im Gangsystem der Gallenblase zu finden ist als bei chroni- scher Entzündung, wie sie zum Beispiel bei dem Gallenblasensteinleiden vorkommt. Aber gerade dies würde die Hypothese eines refluxbedingten Schadens der Gallenwege belegen.
In der Praxis kann das Auftreten eines falsch positiven Ergebnisses durch ein Erhöhen des cut-off Werts - in dem vorliegenden Beispiel auf 100 nM - vermieden werden. Damit läge kein Patient mit einer gutartigen Erkrankung im Bereich der Diagnose eines bösartigen Tumors, so daß die Spezifität des Verfahrens 100% betrüge.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel beträgt die Sensitivität des Tests 93,75%, d.h. die als tumorerkrankt erkannten Patienten haben tatsächlich einen solchen bösartigen Tumor. Dieses Ergebnis übertrifft sämtliche bislang veröffentlichte Ergebnisse anderer Tumormarkeruntersuchungen.
Ebenso zeigen die Ergebnisse die Eignung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Differenzierung zwischen Pankreatitis und Pankreaskarzinom. Die Patientengruppe mit einem Karzinom (n=13, Bereich 83,69-5133 nM) wies einen fast 250-fach höheren Mediän mit 1410 vs. 5,684 nM TAP bei chronischer Pankreatitis (n=6; Bereich 0,0080-22,37 nM) auf. Somit konnte klar zwischen diesen beiden Krankheitsentitäten getrennt werden.
LITERATUR:
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Claims

Patentansprüche:
1. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids zur Diagnose maligner bilio-pankreatischer Erkrankungen.
Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die Diagnose eines der nachfolgend aufgeführten Karzinome: Pankreaskarzinom, Gallenblasenkarzinom, Gallengangskarzinom und Papillenkarzinom.
3. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids zur Diagnose entzündlicher Gallenblasen- oder Gallengangserkrankungen oder Entzündungen der Papilla Vateri.
4. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids zur Dignitätsbeurtei- lung bilio-pankreatischer Erkrankungen.
5. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch einen quantitativen Nach- weis des Trypsin aktivierenden Peptids.
6. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis in Blut, Urin oder Gallensaft erfolgt. Verwendung des Trypsin aktivierenden Peptids nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch eine immunologische Quantifizierung des Trypsin aktivierenden Peptids.
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