EP1252174A2 - Oligonucleotides for specific amplification and specific detection of 16s rrna genes from bacteria - Google Patents

Oligonucleotides for specific amplification and specific detection of 16s rrna genes from bacteria

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Publication number
EP1252174A2
EP1252174A2 EP01913774A EP01913774A EP1252174A2 EP 1252174 A2 EP1252174 A2 EP 1252174A2 EP 01913774 A EP01913774 A EP 01913774A EP 01913774 A EP01913774 A EP 01913774A EP 1252174 A2 EP1252174 A2 EP 1252174A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
dna
pcr
oligonucleotide
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01913774A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Hans-Jürgen BACH
Michael Schloter
Jean-Charles Munch
Jitka Tomanova
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Publication of EP1252174A2 publication Critical patent/EP1252174A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/101—Taqman

Definitions

  • the invention relates to specific oligonucleotides
  • bacteria play an important role as function carriers in natural ecosystems
  • diseases are caused by a large number of microorganisms.
  • limit values were set for many natural products (food, drinking water, etc.) as to how many bacteria may be in a sample in order to classify the sample as hygienically harmless.
  • the 16S rRNA is a bacterial-specific ribosomal component and has therefore been used in the past for methods that should be used to demonstrate the presence of bacteria in sample materials.
  • the oligonucleotides previously used as primers and probes differ from the oligonucleotides disclosed according to the invention.
  • the oligonucleotides described here can be used particularly advantageously in the context of a TaqMan PCR.
  • Several papers have already been published, including the TaqMan PCR for quantitative and qualitative Detection of bacteria was used.
  • One example is Kimura et al, 1999, Journal of Food Protection. 62: 329- 335.
  • probes and primers were presented in these 'works that were suitable for quantitative and qualitative detection of specific organisms and groups of organisms.
  • oligonucleotides presented here are suitable in the form of an oligonucleotide set (forward primer, reverse primer and probe) for quantitative bacterial detection and, with regard to annealing temperatures, length of the generated amplicon and the position of the internal probe, they fulfill the optimal conditions for carrying out a TaqMan in particular PCR.
  • oligonucleotides described here for the first time can be used in a wide range of different technologies. These include:
  • This method represents a new means of quantifying bacterial populations in ecological research.
  • TaqMan-PCR contains, this PCR assay is suitable for a
  • oligonucleotides described here can be used as probes and primers and are designed in such a way that they can be used in hybridization methods and PCR methods, in particular in TaqMan PCR.
  • the invention also encompasses its complementary sequences and the reverse and reverse complementary sequences and the R A sequences derived therefrom.
  • derivatives of the oligonucleotides described here are also included.
  • “Derivatives and” modifications * are understood to mean those sequences in which at least one nucleotide, but also two or three nucleotides, at one or both ends of the oligonucleotides or inside the oligonucleotides, have been replaced or deleted by other oligonucleotides.
  • the prerequisite here is that specific binding to the 16S rDNA or 16S rRNA of bacteria can take place.
  • oligonucleotides described can also be incorporated into larger DNA and RNA units, for example in vectors and plasmids, and further oligonucleotides can be attached to one or both of the ends of the oligonucleotides. for example with specific restriction enzyme recognition parts.
  • DNA and RNA-directed probes are used for the specific detection of a microorganism are known per se.
  • DNA-directed probe Bach et al. 1999, Appl. And Environ. Microbiol .
  • RNA Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods.
  • the person skilled in the art can use these methods known per se with the present oligonucleotides.
  • the DNA or the RNA of a sample to be examined for the presence of said bacterial genes is brought into contact with at least one of the oligonucleotides which have been described in more detail above.
  • the detection of the hybridization of the oligonucleotides with the RNA or the DNA of the sample is then carried out by means of PCR techniques or by hybridization reactions in order to show the presence of specific DNA and / or RNA sequences. All of the disclosed oligonucleotides can also be used as primers for reverse transcription of mRNA.
  • probes and primers here also called oligonucleotides for short.
  • oligonucleotides for short.
  • a label for example a radioactive label, digoxigenin, peroxidase or alkaline phosphatase-detectable label, or a fluorescent label to detect a specific hybridization.
  • Primers and probes can also be labeled with biotin, for example, and used for sequence-specific isolation of DNA or RNA by means of magnetic capture hybridization.
  • all labels are possible that do not interfere with the detection methods, for example labels that can be detected by enzymatic methods, for example the above-mentioned detection by alkaline phosphatase.
  • probes are e.g. PNAs in which the heterocyclic bases are bound to a protein backbone and not to a sugar-phosphate backbone.
  • the oligonucleotides are bound to a matrix (reverse hybridizations), and hybridization is carried out with, for example, fluorescence-labeled DNA or a PCR amplifier.
  • matrices are microchips and microtiter plates.
  • Figure 1 shows a calibration curve, the creation of which is explained in more detail below under the heading “TaqMan-PCR for the quantification of the -16S rDNA genes from bacteria in liquid culture *.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined is either isolated from the sample organisms or the organisms are suitably digested or made permeable so that direct contact of the probes with the DNA and / or the RNA of the sample organisms is made possible without extensive and time-consuming cleaning procedures have to be carried out.
  • the oligonucleotides of the invention can be used for in situ hybridizations and in situ PCR.
  • the hybridization of the oligonucleotides with the DNA and / or the RNA of the sample organisms takes place under stringent conditions, preferably highly stringent conditions. These conditions are detailed below.
  • reaction buffer and wash buffer are composed of the following functional components:
  • Buffer system for adjusting and stabilizing the pH between 7 and 8 e.g. Tris / HCl
  • Components e) and f) influence the binding strengths of nucleic acid duplex molecules. Increasing the monovalent cations in the reaction or washing solution stabilizes the duplex molecules formed, while with an increasing content of e.g. Formamide the duplex bonds are weakened.
  • a suitable oligonucleotide concentration must be used.
  • the hybridization must take place at a suitable temperature (the higher the temperature, the weaker the binding of the hybrids).
  • Stringent hybridization and washing conditions are the reaction conditions (the right choice of the four factors), among which only duplex molecules between oligonucleotides and desired target molecules (perfect hybrids) are created or only the desired target organism is detected.
  • Stringent reaction conditions are understood to mean, for example, a hybridization temperature of approximately 5-10 ° C. below the respective oligonucleotide melting point.
  • the stability of the DNA / DNA or RNA / DNA hybrids must be guaranteed even at low salt concentrations corresponding to 0.1 x SSC / 0.5% SDS. In this way, undesirable cross-reactions with other genes can be prevented.
  • the respective temperature conditions can differ depending on the selected test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined and must then be adapted accordingly.
  • the hybridization product can be detected, for example, by autoradiography in the case of radioactively labeled primer molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled oligonucleotides.
  • stringent conditions are listed in the examples below.
  • the person skilled in the art can adapt the conditions to the selected examination method in a manner known per se, in order to actually achieve stringent conditions and to enable a specific detection method.
  • Suitable stringency conditions can be determined, for example, using reference hybridizations.
  • the oligonucleotides are used as forward and reverse primers for a PCR reaction.
  • the PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected.
  • the temperature conditions and the cycle numbers of the PCR have to be modified.
  • the optimal reaction conditions can be determined by hand tests in a manner known per se.
  • An example of a PCR is as follows:
  • the characteristic, species-specific DNA marker fragments formed in the course of the PCR amplification by extending the primer sequences can be detected, for example, by gel electrophoresis or fluorimetry using fluorescence-labeled oligonucleotides. Of course, other detection methods known to the person skilled in the art can also be used.
  • the probes with the DNA or RNA sample to be examined are used Hybridization brought, whereby stringent hybridization conditions are chosen. Stringent conditions must be determined empirically for the respective application. The conditions described below can serve as guidelines.
  • the DNA or RNA of the sample to be examined can be present either in the PCR reaction or RT-PCR or in the hybridization reaction either in extracted form or in the form of complex mixtures in which the microorganism DNA or RNA to be examined is present forms only a very small fraction of the fraction of the special biological sample.
  • the cells to be examined can thus either be in a purified form or, for example, contaminated with other constituents. Both in situ PCR and in situ RT-PCR can be carried out with the oligonucleotides described here.
  • the oligonucleotides of the present invention are used for the PCR amplification of fragments on cDNA matrices, which are generated after reverse transcription with oligo (dT) or with these oligonucleotides at the 3 V end.
  • the expression can then be evaluated qualitatively, in conjunction with suitable standards and techniques, such as an internal standard and in particular with a quantitative PCR.
  • oligonucleotides can also be used as probes on DOT BLOTS or
  • the oligonucleotides of the invention are produced in a manner which is customary and known per se.
  • the probes can for example inserted into vectors and cut out again after propagation or they can be produced in the form of a template by PCR or synthetically.
  • oligonucleotides described in this application are outstandingly suitable for use in TaqMan PCR.
  • TaqMan * is a registered trademark.
  • the basics of TaqMan-PCR are described below.
  • the specific application of the oligonucleotides according to the invention in the context of a TaqMan PCR is described in the context of an example.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a special fluorogenic probe which consists of an oligonucleotide, the 5 ⁇ end of which carries a quencher dye (rhodamine derivative) and is also blocked with a phosphate residue. Modifications to these configurations are of course possible.
  • the fluorescence of the reporter dye is suppressed by a fluorescence energy transfer (FET) due to the spatial proximity to the quencher.
  • FET fluorescence energy transfer
  • the probe first hybridizes with the primers to the template strand. Hits in the extension phase the Taq polymerase now on this probe and begins to displace it. A Y-shaped secondary structure is formed, which activates the 5 ⁇ -3 ⁇ exonuclease activity of the AmpliTaq DNA polymerase and cuts the probe. Free, non-hybridized probe, however, is not hydrolyzed.
  • a TaqMan PCR probe has the following characteristics:
  • the fluorescent reporter dye is covalently linked to the 5 ⁇ end of the probe.
  • FAM is used as a reporter.
  • Table 1 These different reporter dyes, which also allow a multiplex application of the TaqMan PCR system, are each quenched by the quencher dye TAMRA.
  • TAMRA is bound to the 3 ⁇ end of the probe via a linker-modified nucleotide (LAN).
  • LAN linker-modified nucleotide
  • the probe is chemically phosphorylated to avoid extension of the 3 end during the PCR. Further refinements by Use of other reporters and quencher dyes or 'other polymerases are possible and are within the skills and knowledge of the skilled person.
  • the T m of the probe should be at least 5 ° C above that the PCR
  • Primers are, preferably not a 72 ° C extension step, but better 2-
  • the TaqMan TM probe is usually used in concentrations in the range of 50-200 nM / 50 ⁇ l reaction.
  • the optimal probe concentration depends on the fluorescence background and the primer concentration.
  • the reporter fluorescence signal of the without template controls should be at least three times as high as the signal of the buffer blank.
  • the usual primer concentrations in the TaqMan TM -PCR are 0.2 to 0.5 ⁇ M. However, it is recommended to determine the actual optimal concentration by testing the primers in the range of 0.1 to 1.0 ⁇ M.
  • the number of PCR cycles required to obtain a sufficient signal depends on the amount of template molecules used at the start of the PCR. Around 10,000 start copies and 25-30 cycles are sufficient to start optimization.
  • PCR additives such as glycerin and / or formamide
  • annealing temperatures of the primers and the probe should first be determined according to the nearest neighbor method. When optimizing the reaction, the actual annealing temperature must then be e.g. 2 ° C intervals are determined empirically.
  • the duration of the extension depends on the length of the PCR product to be generated:
  • the extension rate of the AmpliTaq-Gold is between 2000 and 4000 bases per minute at temperatures from 70 ° C to 80 ° C.
  • the extension temperature ⁇ 70 ° C in order not to additionally destabilize the hybridization of the probe and thus to achieve higher R n + values.
  • 16S rDNA sequences were obtained from the NCBI database. Alignments were made using the Geno atix DiAlign program (http: // genomatix. Gsf. De / cgi-bin / dialign / dialign.pl). Comparison of the degenerate oligonucleotides designed in this way with known DNA sequences using the Genotamix Matinspektor program
  • DNA from bacteria and fungi to determine the specificity of the oligonucleotides directed against the 16S rDNA was extracted using standard methods (Marmur 1961; Henrion et al. 1994) or obtained from Sigma, Deisenhofen, Germany. DNA from pure cultures for a subsequent TaqMan PCR quantification was extracted using the QIAamp tissue kit (Quiagen, Hilden, Germany). DNA from Pseudomonas fluorescens was extracted according to the instructions from Quiagen. In order to achieve efficient lysis, the method was used using Bacillus spp.
  • the pellets were resuspended in 1 ml lysis buffer and transferred into 2 ml glass tubes, each containing 2 g of glass beads with a diameter of 0.17-0.18 ⁇ (Braun, Melsungen, Germany). During the 30 minute incubation at 37 ° C., the suspensions were homogenized 3 times 90 seconds after 0, 15 and 30 minutes in a Bead Beater (homogenizer) (Braun, Melsungen, Germany) at 2000 rpm. DNA from the soil was extracted and purified using the FastDN ⁇ SPIN kit for soils (Bio 101, Vista, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Plasmid standards were prepared as follows The corresponding 16S rDNA gene fragment was prepared by conventional PCR using the primers shown in Table 2, with sticky ends being added to the primers at the 5 ⁇ ends, namely the restriction recognition sequence for BamHI with the overhang CGC forward primer and restriction recognition sequence for Xbal with overhang -GC- to the reverse primer. Genomic DNA from E. coli was used as a template. The fragment thus obtained was digested and cloned into the high copy vector Triple Helix TM pHelix TM vector 1 (+) (Röche, Mannheim, Germany) and transformed into E.coli JM 105. The plasmid DNA was purified using the plasmid midi kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the quantitative determination of the plasmid DNA was estimated by comparing the bands with Lambda DNA / EcoRI + HindIII marker 3 (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania) on agarose gel after ethidium bromide staining. 10-fold dilutions were made and used as external standards in TaqMan-PCR.
  • the primers and probes used are given in Table 2.
  • the amplification was carried out using the ABI 7700 sequence detection system (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA) in 50 ⁇ l final volumes with 5 ⁇ l template DNA, 200 nM per primer, 150 nM TaqMan probe, 200 pM deoxynucleotide triphosphate, 5 ml 10 ⁇ reaction buffer , 4.5 mM MgCl 2 and 1.25 U ⁇ mpli Taq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer).
  • the PCR program was as follows: a stop at 95 ° C for 10 minutes to denature the DNA and activate the polymerase, 35 cycles at 95 ° C for 15 seconds and 62 ° C for 60 seconds. Results
  • DSMZ 1048 Escherichia coli (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Clostridi um perfrigens (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Micrococcus l uteus (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany).
  • genomic DNA from calf thymus, Mucor mucedo DSMZ. 809, Aspergill ⁇ s niger DSMZ 1988, Penicilli u funiculosum DSMZ 1960 or Irpex lacteus DSMZ 1183 no products were obtained.
  • Standard plasmid DNA with 2 x 10 7 - 1 x 10 3 copies of the 16S rDNA fragment from E. coli in 10-fold and simple dilutions were used to set up the calibration curve shown in Fig. 1. Two replicates were measured for each sample.
  • the preferred oligonucleotides of the invention are listed in Table 2, along with the preferred reaction conditions under which these oligonucleotides. can be used to quantify bacteria in TaqMan PCR. Temperature program:
  • the reagents and tubes used come from Applied Biosystems, with the exception of the dNTPs used, which were obtained from Röche.
  • the DNA fragment to be amplified from Escherichia coli was inserted into the high copy number pUC19 vector (DNA plasmid, pHelix 1 (+), Röche Mannheim, Germany) inserted and cloned.
  • a PCR was carried out with the primers listed in Table 2, but each was extended at the 5 'end by sticky ends (forward primer: overhang (5 "CGC) and restriction site for SamHI (5 V GGATCC); reverse primer: overhang ( 5 N GC) and restriction site for Xhal (5 "TCTAGA).
  • the product from this PCR and the vector were digested with the two restriction enzymes and combined in a ligation.
  • the vector thus modified was then multiplied and extracted in E. coli exact determination of the concentration of this vector, which contains a copy of the DNA section to be amplified, dilutions were made, of which the number of copies was known and which were used as standards for the TaqMan PCR.
  • the crucial parameter when quantifying DNA copies is the Ct value. This indicates the number of the PCR cycle in which the fluorescence signal rises above the background signal for the first time.
  • Fig. 1 shows the standard curve generated from the standards (black points) and the sample values (red points) entered on them. Due to the high reproducibility of the approach, the individual points for the replicas are fused together and therefore not all are visible.
  • the bacterial concentrations determined via the PCR correspond exactly to those from the DAPI counts.
  • the KBE values are somewhat lower at all sampling times, which is due to the fact that this determination method is fraught with some uncertainties. It could be that either not all organisms grow on agar plates or that bacterial chains, which are particularly common in the exponential growth phase, form only one colony at a time.
  • Oligonucleotides which were used as primers or as probes for the detection and quantification of the bacterial 16S rDNA copies.

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Abstract

The invention concerns oligonucleotides that can be used, especially in TaqMan PCR, for quantitative detection of bacteria.

Description

Oligonukleotide zur spezifischen Amplifikation und zum spezifischen Nachweis von lβS-rRNA-Genen von Bakterien Oligonucleotides for the specific amplification and for the specific detection of lβS rRNA genes of bacteria
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide zur spezifischenThe invention relates to specific oligonucleotides
Amplifikation und zum spezifischen qualitativen und quantitativen Nachweis von 16r-rRNA-Genen, 'Genfragmenten und hiervon abgeleiteter RNA aus Bakterien.Amplification and for the specific qualitative and quantitative detection of 16r rRNA genes, gene fragments and RNA derived therefrom from bacteria.
Bakterien spielen einerseits als Funktionsträger in natürlichen Ökosystemen eine wichtige Rolle, andererseits werden durch eine Vielzahl von Mikroorganismen Krankheiten hervorgerufen. Aus dem letzteren Grund wurden für viele natürliche Produkte (Lebensmittel, Trinkwasser etc.) Grenzwerte festgelegt, wieviele Bakterien sich in einer Probe befinden dürfen, um die Probe als hygienisch unbedenklich einzustufen.On the one hand, bacteria play an important role as function carriers in natural ecosystems, on the other hand, diseases are caused by a large number of microorganisms. For the latter reason, limit values were set for many natural products (food, drinking water, etc.) as to how many bacteria may be in a sample in order to classify the sample as hygienically harmless.
Die bis dato zur Überprüfung angewandten Methoden beruhen meist auf der Kultivierung von Bakterien. Dieses Verfahren hat zwei gravierende Nachteile. Einerseits ist eine sichere Überprüfung der festgelegten Grenzwerte durch Kultivierung von Bakterien sehr langwierig (teilweise liegen die Ergebnisse erst 1 Woche nach der Untersuchung des jeweiligen Probenmaterials vor) , andererseits ist es nicht möglich, alle unterschiedlichen Mikroorganismen, die teils sehr komplexe Ansprüche an Kulturbedingungen haben, als „colony forming units1* zu isolieren. Die Quantifizierung durch Kulturmethoden ist daher immer mit erheblichen Unsicherheiten behaftet. In einigen Fällen (vor allem bei flüssigen Proben) ist es möglich, nach einer DAPI-Färbung die Mikroorganismen mikroskopisch auszuzählen und relativ zuverlässig zu bestimmen. Dies ist jedoch mit einem erheblichen Zeitaufwand verbunden und bei festen Proben wie z.B. Lebensmitteln wiederum sehr ungenau oder nicht möglich.The methods used to date for checking are mostly based on the cultivation of bacteria. This process has two serious disadvantages. On the one hand, a reliable check of the specified limit values by cultivating bacteria is very lengthy (in some cases the results are only available 1 week after the examination of the respective sample material), on the other hand, it is not possible to use all different microorganisms, some of which have very complex demands on culture conditions, as "colony forming isolate units 1 *. The quantification by culture methods is therefore always subject to considerable uncertainties. In some cases (especially with liquid samples) it is possible to count the microorganisms microscopically after DAPI staining and to determine them relatively reliably. However, this takes a considerable amount of time and is again very imprecise or not possible with solid samples such as food.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Oligonukleotide bereitzustellen, mit deren Hilfe in schneller, einfacher und reproduzierbarer Weise durch Hybridisierungsund PCR-Techniken nicht nur die Anwesenheit spezifischer Bakterien nachweisbar ist, sondern von Bakterien allgemein und die insbesondere eine quantitative Bestimmung ermöglichen.It is an object of the present invention to provide oligonucleotides with the aid of which hybridization and PCR techniques can be used to detect not only the presence of specific bacteria, but also of bacteria in general and which in particular enable quantitative determination in a quick, simple and reproducible manner.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 1 näher gekennzeichneten Oligonukleotide gelöst, die im beiliegenden Sequenzprotokoll mit SEQ ID-No.l, 2 und 3 gekennzeichnet sind. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie der nachfolgenden Beschreibung mit den Ausführungsbeispielen.This object is achieved according to the invention by the oligonucleotides characterized in more detail in claim 1, which are identified in the enclosed sequence listing with SEQ ID No. 1, 2 and 3. Preferred embodiments of the invention result from the subclaims and the following description with the exemplary embodiments.
Die 16S-rRNA ist eine für Bakterien spezifische ribosomale Komponente und wurde deshalb bereits in der Vergangenheit für Verfahren benutzt, mit denen die Anwesenheit von Bakterien in Probenmaterialien aufgezeigt werden sollte. Die bisher als Primer und Sonden benutzten Oligonukleotide unterscheiden sich jedoch von den erfindungsgemäß offenbarten Oligonukleotiden. Insbesondere vorteilhaft können die hier beschriebenen Oligonukleotide im Rahmen einer TaqMan-PCR eingesetzt werden. Es wurden zwar bereits mehrere Arbeiten veröffentlicht, in den auch die TaqMan-PCR zum quantitativen und qualitativen Nachweis von Bakterien eingesetzt wurde. Ein Beispiel hierfür ist Kimura et al., 1999, Journal of Food Protection 62:329- 335. In diesen' Arbeiten wurden jedoch ausschließlich Sonden und Primer vorgestellt, die sich zum quantitativen und qualitativen Nachweis spezieller Organismen und Organismengruppen eigneten.The 16S rRNA is a bacterial-specific ribosomal component and has therefore been used in the past for methods that should be used to demonstrate the presence of bacteria in sample materials. However, the oligonucleotides previously used as primers and probes differ from the oligonucleotides disclosed according to the invention. The oligonucleotides described here can be used particularly advantageously in the context of a TaqMan PCR. Several papers have already been published, including the TaqMan PCR for quantitative and qualitative Detection of bacteria was used. One example is Kimura et al, 1999, Journal of Food Protection. 62: 329- 335. However, only probes and primers were presented in these 'works that were suitable for quantitative and qualitative detection of specific organisms and groups of organisms.
Das der Erfindung zugrunde liegende Problem, nicht nur einzelne bekannte Bakterienspezies, sondern alle, auch unbekannte Bakterien unterschiedlichster phylogenetischer Gruppen zu erfassen, wurde durch die aus dem Stand der Technik beschriebenen Oligonukleotidsequenzen nicht .gelöst. Durch den Einsatz der hier vorgestellten Oligonukleotide, insbesondere in Verbindung mit der TaqMan-PCR, kann die absolute Anzahl aller bakterieller 16S-rDNA Kopien in einem zu untersuchenden DNA-Extrakt nachgewiesen werden. Hierunter fallen auch unbekannte Bakteriengattungen und -arten und sogar die nicht kultivierbaren Bakterien, die damit unabhängig von ihrem physiologischen Status erfaßbar sind. Die hier vorgestellten Oligonukleotide eignen sich in Form eines Oligonukleotid-Sets (Forward Primer, Reverse Primer und Sonde) zu einem quantitativen bakteriellen Nachweis und erfüllen hinsichtlich Annealingtemperaturen, Länge des generierten Amplicons und der Position der internen Sonde die optimalen Bedingungen zur Durchführung insbesondere einer TaqMan-PCR.The problem on which the invention is based, not only to detect individual known bacterial species, but also all, also unknown bacteria of the most varied phylogenetic groups, was not solved by the oligonucleotide sequences described in the prior art. By using the oligonucleotides presented here, especially in connection with the TaqMan-PCR, the absolute number of all bacterial 16S-rDNA copies can be detected in a DNA extract to be examined. This also includes unknown bacterial genera and species and even the non-cultivable bacteria, which can thus be detected regardless of their physiological status. The oligonucleotides presented here are suitable in the form of an oligonucleotide set (forward primer, reverse primer and probe) for quantitative bacterial detection and, with regard to annealing temperatures, length of the generated amplicon and the position of the internal probe, they fulfill the optimal conditions for carrying out a TaqMan in particular PCR.
Die hier erstmals beschriebenen Oligonukleotide können in einer breiten Palette unterschiedlichster Technologien eingesetzt werden. Hierzu gehören:The oligonucleotides described here for the first time can be used in a wide range of different technologies. These include:
a) Lebensmittelindustrie . Quantifizierung von Bakterien, die: Verderben verursachen können, humanpathogen sein können, Produkte veredeln können. b) Gewässerschutz . Ermittlung von Keimtitern in Trinkwasser, natürlichen Gewässern, Badeanstalten. c) Klinische Mikrobiologie. Unspezifische Infektionen bei Mensch und Tier. d) Labordiagnosti .a) Food industry. Quantification of bacteria that can: cause spoilage, can be pathogenic to humans, can ennoble products. b) water protection. Determination of germ titers in drinking water, natural waters, bathing establishments. c) Clinical microbiology. Nonspecific infections in humans and animals. d) Laboratory diagnostics.
In der ökologischen Forschung stellt diese Methode ein neues Mittel zur Quantifizierung von Bakterienpopulationen dar.This method represents a new means of quantifying bacterial populations in ecological research.
In Form eines Kits, welcher alle Ingredienzen für dieIn the form of a kit, which contains all the ingredients for the
TaqMan-PCR enthält, eignet sich dieser PCR-Assay für eineTaqMan-PCR contains, this PCR assay is suitable for a
DIN-Vorschrift zur Ermittlung von bakteriellen Keimtitern.DIN regulation for the determination of bacterial germ titers.
Die hier beschriebenen Oligonukleotide können als Sonden und Primer eingesetzt werden, und sie sind so gestaltet, daß sie in Hybridisierungsverfahren und PCR-Verfahren, insbesondere bei der TaqMan-PCR, Verwendung finden können. Die Erfindung umfaßt auch ihre komplementären Sequenzen und die reversen und revers-komplementären Sequenzen sowie die hiervon abgeleiteten R A-Sequenzen .The oligonucleotides described here can be used as probes and primers and are designed in such a way that they can be used in hybridization methods and PCR methods, in particular in TaqMan PCR. The invention also encompasses its complementary sequences and the reverse and reverse complementary sequences and the R A sequences derived therefrom.
Erfindungsgemäß umfaßt werden auch Derivate der hier beschriebenen Oligonukleotide. Unter „Derivate und „Abwandlungen* werden solche Sequenzen verstanden, bei denen zumindest ein Nukleotid, aber auch zwei oder drei Nukleotide, an einem oder an beiden Enden der Oligonukleotide oder im Innern der Oligonukleotide durch andere Oligonukleotide ersetzt oder deletiert wurden. Voraussetzung hierbei ist immer, daß eine spezifische Bindung an die 16S-rDNA oder 16S- rRNA von Bakterien stattfinden kann. Die beschriebenen Oligonukleotide können auch in größere, DNA- und RNA- Einheiten, beispielsweise in Vektoren und Plasmide, eingebaut werden, und an eines oder beide der Enden der Oligonukleotide können weitere Oligonukleotide angehängt werden, beispielsweise mit spezifischen Restriktionsenzym- erkennungssteilen.According to the invention, derivatives of the oligonucleotides described here are also included. "Derivatives and" modifications * are understood to mean those sequences in which at least one nucleotide, but also two or three nucleotides, at one or both ends of the oligonucleotides or inside the oligonucleotides, have been replaced or deleted by other oligonucleotides. The prerequisite here is that specific binding to the 16S rDNA or 16S rRNA of bacteria can take place. The oligonucleotides described can also be incorporated into larger DNA and RNA units, for example in vectors and plasmids, and further oligonucleotides can be attached to one or both of the ends of the oligonucleotides. for example with specific restriction enzyme recognition parts.
Ausgehend von den beschriebenen Oligonukleotiden kann der Fachmann durch Austesten feststellen, welche Derivate bzw. Abwandlungen für spezielle Anwendungsbedingungen, insbesondere PCR- und Hybridisierungsreaktionen, geeignet sind und welche nicht.On the basis of the oligonucleotides described, the person skilled in the art can determine by testing which derivatives or modifications are suitable for particular application conditions, in particular PCR and hybridization reactions, and which are not.
Verfahren, bei denen DNA und RNA gerichtete Sonden zum spezifischen Nachweis eines Mikroorganismus eingesetzt werden, sind an sich bekannt. (DNA gerichtete Sonde: .Bach et al. 1999, Appl. and Environ. Microbiol.; RNA: Bach et al . 1999, J. Microbiol. Methods) . Der Fachmann kann diese an sich bekannten Verfahren mit den vorliegenden Oligonukleotiden zur Anwendung bringen. Hierbei wird die DNA oder die RNA einer auf die Anwesenheit der genannten bakteriellen Gene zu untersuchenden Probe mit zumindest einem der Oligonukleotide, die vorstehend näher beschrieben wurden, in Kontakt gebracht. Anschließend erfolgt der Nachweis über die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder der DNA der Probe durch PCR- Techniken oder durch Hybridisierungsreaktionen, um das Vorliegen spezifischer DNA und/oder RNA-Sequenzen aufzuzeigen. Alle offenbarten Oligonukleotide sind auch als Primer für eine reverse Transkription von mRNA einsetzbar.Methods in which DNA and RNA-directed probes are used for the specific detection of a microorganism are known per se. (DNA-directed probe: Bach et al. 1999, Appl. And Environ. Microbiol .; RNA: Bach et al. 1999, J. Microbiol. Methods). The person skilled in the art can use these methods known per se with the present oligonucleotides. Here, the DNA or the RNA of a sample to be examined for the presence of said bacterial genes is brought into contact with at least one of the oligonucleotides which have been described in more detail above. The detection of the hybridization of the oligonucleotides with the RNA or the DNA of the sample is then carried out by means of PCR techniques or by hybridization reactions in order to show the presence of specific DNA and / or RNA sequences. All of the disclosed oligonucleotides can also be used as primers for reverse transcription of mRNA.
Erfindungsgemäß sind vielfältige Abwandlungen möglich, um die Sonden und Primer , hier je kurz auch Oligonukleotide genannt, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit einer Markierung versehen werden, beispielsweise einer radioaktiven Markierung, Digoxigenin-, Peroxidase- oder durch Alkalische-Phosphatase- nachweisbare Markierung, oder einer fluoreszierenden Markierung, um eine spezifische Hybridisierung nachzuweisen. Primer und Sonden können auch z.B. mit Biotin markiert werden und für eine sequenzspezifische Isolierung von DNA oder RNA durch Magnetic-capture-hybridization eingesetzt werden. Selbstverständlich sind alle Markierungen möglich, die mit den Nachweisverfahren nicht interferieren, also beispielsweise Markierungen, die durch enzymatische Verfahren nachweisbar sind, zum Beispiel der obengenannte Nachweis durch Alkalische- Phosphatase .According to the invention, various modifications are possible in order to use the probes and primers, here also called oligonucleotides for short. These can be provided, for example, with a label, for example a radioactive label, digoxigenin, peroxidase or alkaline phosphatase-detectable label, or a fluorescent label to detect a specific hybridization. Primers and probes can also be labeled with biotin, for example, and used for sequence-specific isolation of DNA or RNA by means of magnetic capture hybridization. Of course, all labels are possible that do not interfere with the detection methods, for example labels that can be detected by enzymatic methods, for example the above-mentioned detection by alkaline phosphatase.
Weitere Abwandlungen bzw. Derivatisierungen der Sonden sind z.B. PNAs, bei denen die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat und nicht an ein Zucker-Phosphat-Rückgrat gebunden sind.Further modifications or derivatizations of the probes are e.g. PNAs in which the heterocyclic bases are bound to a protein backbone and not to a sugar-phosphate backbone.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Oligonukleotide an eine Matrix gebunden (reverse Hybridisierungen) , und es wird mit beispielsweise fluoreszenzmarkierter DNA oder einem PCR-Amplifikator hybridisiert. Beispiele für derartige Matrices sind Mikrochips und Mikrotiterplatten.In a further embodiment of the invention, the oligonucleotides are bound to a matrix (reverse hybridizations), and hybridization is carried out with, for example, fluorescence-labeled DNA or a PCR amplifier. Examples of such matrices are microchips and microtiter plates.
Vorstehend wurden bestimmte Derivatisierungen der Oligonukleotide beschrieben. Von der Erfindung umfaßt werden auch hier nicht gesondert beschriebene Derivate, beispielsweise chemische Änderungen an den Oligonukleotiden, die das Nachweisverfahren erleichtern. Derartige Abwandlungen sind dem Fachmann bekannt, und sie können auf die erfindungsgemäß bereitgestellten Oligonukleotide angewandt werden. Derartige Modifikationen sind beispielsweise Phosphorylierungen, das Anfügen von Aminolinkern oder von Thiolinkern. Die nachfolgend beschriebenen Nachweismethoden, insbesondere PCR-Verfahren sowie Southern- und Northern-Hybridisierungsver- fahren, gehören an sich zum Stand der Technik. Beispielsweise sei hier hingewiesen auf die Veröffentlichung von Cornel Mülhardt, Der Experimentator: Molekularbiologie, 1. und 2. Aufl., Spektrum Akad. Verlag, 1999, 2000.Certain derivatizations of the oligonucleotides have been described above. The invention also encompasses derivatives not separately described here, for example chemical changes to the oligonucleotides, which facilitate the detection method. Such modifications are known to the person skilled in the art and can be applied to the oligonucleotides provided according to the invention. Such modifications are, for example, phosphorylation, the addition of amino linkers or of thiolinkers. The detection methods described below, in particular PCR methods and Southern and Northern hybridization methods, are inherently state of the art. For example, reference is made to the publication by Cornel Mülhardt, The Experimentator: Molecular Biology, 1st and 2nd ed., Spektrum Akad. Verlag, 1999, 2000.
Nachfolgend wird die Erfindung auch anhand einer Abbildung näher beschrieben. Die Abbildung 1 zeigt eine Kalibrierungskurve, deren Erstellung nachfolgend unter der Überschrift „TaqMan-PCR zur Quantifizierung der -16S-rDNA-Gene aus Bakterien in Flüssigkultur* näher erläutert wird.The invention is also described in more detail below with the aid of an illustration. Figure 1 shows a calibration curve, the creation of which is explained in more detail below under the heading “TaqMan-PCR for the quantification of the -16S rDNA genes from bacteria in liquid culture *.
Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe wird entweder aus den Probenorganismen isoliert oder die Organismen werden in geeigneter Weise aufgeschlossen oder durchlässig gemacht, so daß ein direkter Kontakt der Sonden mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen ermöglicht wird, ohne daß vorher umfangreiche und zeitraubende Reinigungsprozeduren durchgeführt werden müssen. Die Oligonukleotide der Erfindung sind in einer Ausgestaltungsform bei in situ Hybridisierungen und in situ PCR einsetzbar.The DNA or RNA of the sample to be examined is either isolated from the sample organisms or the organisms are suitably digested or made permeable so that direct contact of the probes with the DNA and / or the RNA of the sample organisms is made possible without extensive and time-consuming cleaning procedures have to be carried out. In one embodiment, the oligonucleotides of the invention can be used for in situ hybridizations and in situ PCR.
Die Hybridisierung der Oligonukleotide mit der DNA und/oder der RNA der Probenorganismen erfolgt unter stringenten Bedingungen, bevorzugt hoch-stringenten Bedingungen. Diese Bedingungen werden nachfolgend näher ausgeführt.The hybridization of the oligonucleotides with the DNA and / or the RNA of the sample organisms takes place under stringent conditions, preferably highly stringent conditions. These conditions are detailed below.
Bei der Hybridisierung sind Reaktionspuffer und Waschpuffer aus folgenden funktionellen Komponenten zusammengesetzt:In hybridization, the reaction buffer and wash buffer are composed of the following functional components:
a) Puffersystem zur Einstellung und Stabilisierung des pH- Wertes zwischen 7 und 8 (z.B Tris/HCl) b) Wasser als Lösungsmittel' c) Eventuell Chelatbildner, die bei niedrigen Konzentrationen monovalenter Kationen den Einfluß zweiwertiger Kationena) Buffer system for adjusting and stabilizing the pH between 7 and 8 (e.g. Tris / HCl) b) Water as solvent 'c) Possibly chelating agents, which at low concentrations of monovalent cations have the influence of divalent cations
(z.B. Ca2+) , die als Verunreinigung in Chemikalien enthalten sein können, verhindern. Wird insbesondere im Waschpuffer eingesetzt . d) Detergenz zur Erniedrigung der Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen e) Nichtionische, aprotische Detergenzien (z.B. Formamid) schwächen die Bindungsenergie von Nukleinsäure- Duplex olekülen . f) Salz (funktioneile Einheit sind Kationen, 'die die negativen Ladungen der Nukleinsäure - Phosphatgruppen neutralisieren und dadurch die Duplexbildung von zwei einzelsträngigen Nukleinsäuren erleichtern (z.B. Na+ in NaCl) ) .(eg Ca 2+ ), which can be contained in chemicals as an impurity. Especially used in the wash buffer. d) detergent for lowering the surface tension of aqueous solutions e) nonionic, aprotic detergents (eg formamide) weaken the binding energy of nucleic acid duplex molecules. f) Salt (functional units are cations which neutralize the negative charges of the nucleic acid phosphate groups and thereby facilitate the duplex formation of two single-stranded nucleic acids (eg Na + in NaCl)).
Vier Faktoren haben Einfluß auf das Zustandekommen von spezifischen Hybriden aus den Oligonukleotiden und Zielmolekül :Four factors influence the formation of specific hybrids from the oligonucleotides and target molecule:
Die Komponenten e) und f) beeinflussen die Bindungsstärken von Nukleinsäure-Duplexmolekülen. Erhöhung der monovalenten Kationen in der Reaktions- bzw. Waschlösung stabilisiert die gebildeten Duplexmoleküle, während mit zunehmendem Gehalt an z.B. Formamid die Duplexbindungen geschwächt werden.Components e) and f) influence the binding strengths of nucleic acid duplex molecules. Increasing the monovalent cations in the reaction or washing solution stabilizes the duplex molecules formed, while with an increasing content of e.g. Formamide the duplex bonds are weakened.
Eine geeignete Oligonukleotidkonzentration muß eingesetzt werden. Die Hybridisierung muß bei geeigneter Temperatur stattfinden (je höher die Temperatur, um so schwächer die Bindung der Hybride) .A suitable oligonucleotide concentration must be used. The hybridization must take place at a suitable temperature (the higher the temperature, the weaker the binding of the hybrids).
Unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen versteht man die Reaktionsbedingungen (die richtige Wahl der vier Faktoren) , unter denen nur noch Duplexmoleküle zwischen Oligonukleotiden und gewünschten Zielmolekülen (perfekte Hybride) entstehen bzw. nur noch der gewünschte Zielorganismus nachgewiesen wird.Stringent hybridization and washing conditions are the reaction conditions (the right choice of the four factors), among which only duplex molecules between oligonucleotides and desired target molecules (perfect hybrids) are created or only the desired target organism is detected.
Unter stringenten Reaktionsbedingungen wird beispielsweise eine Hybridisierungstemperatur von ca. 5-10°C unter dem jeweiligen Oligonukleotidschmelzpunkt verstanden. Die Stabilität der DNA/DNA oder RNA/DNA-Hybriden muß selbst bei niedrigen Salzkonzentrationen entsprechend 0,1 x SSC/0,5% SDS gewährleistet sein. Auf diese Weise kann der Ablauf unerwünschter Kreuzreaktionen mit anderen Genen verhindert werden. Die jeweiligen Temperaturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von den gewählten Versuchsbedingungen und in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Nukleinsäure-Probe unterschiedlich sein und müssen dann entsprechend angepaßt werden. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts kann beispielsweise durch Autoradiographie im Falle radioaktiv markierter Primermoleküle oder durch Fluorimetrie bei Verwendung von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden erfolgen.Stringent reaction conditions are understood to mean, for example, a hybridization temperature of approximately 5-10 ° C. below the respective oligonucleotide melting point. The stability of the DNA / DNA or RNA / DNA hybrids must be guaranteed even at low salt concentrations corresponding to 0.1 x SSC / 0.5% SDS. In this way, undesirable cross-reactions with other genes can be prevented. However, the respective temperature conditions can differ depending on the selected test conditions and depending on the nucleic acid sample to be examined and must then be adapted accordingly. The hybridization product can be detected, for example, by autoradiography in the case of radioactively labeled primer molecules or by fluorimetry when using fluorescence-labeled oligonucleotides.
Weitere Beispiele für stringente Bedingungen sind in den nachfolgenden Beispielen aufgeführt. Der Fachmann kann in an sich bekannter Weise die Bedingungen an das gewählte Untersuchungsverfahren anpassen, um tatsächlich stringente Bedingungen zu erzielen und ein spezifisches Nachweisverfahren zu ermöglichen. Geeignete Stringenzbedingungen lassen sich beispielsweise anhand von Referenzhybridisierungen ermitteln.Further examples of stringent conditions are listed in the examples below. The person skilled in the art can adapt the conditions to the selected examination method in a manner known per se, in order to actually achieve stringent conditions and to enable a specific detection method. Suitable stringency conditions can be determined, for example, using reference hybridizations.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Oligonukleotide als Vorwärts- und Rückwärts-Primer für eine PCR-Reaktion eingesetzt. Das PCR-Verfahren hat den Vorteil, daß sehr kleine DNA-Mengen nachweisbar sind. In Abhängigkeit von dem nachzuweisenden Material sind die Temperaturbedingungen und die Zykluszahlen der PCR abzuwandeln. Die optimalen Reaktionsbedingungen können durch Handversuche in an sich bekannter Weise ermittelt werden. Ein Beispiel für eine PCR ist wie folgt:In one embodiment of the invention, the oligonucleotides are used as forward and reverse primers for a PCR reaction. The PCR method has the advantage that very small amounts of DNA can be detected. Depending on the material to be detected, the temperature conditions and the cycle numbers of the PCR have to be modified. The optimal reaction conditions can be determined by hand tests in a manner known per se. An example of a PCR is as follows:
Denaturierung der zu untersuchenden DNA-Probe bei 94°C mindestens 3 Minuten lang;Denaturation of the DNA sample to be examined at 94 ° C for at least 3 minutes;
Bindung der als Primer fungierenden Oligonukleotide 1 Minute lang bei 60°C an die beiden komplementären Einzelstränge der zu untersuchenden DNA; zweiminütige Verlängerungsreaktion der einzelnen Primer entlang der DNA-Matrize bei 72°C durch Verknüpfung von Desoxyribonukleosidtriphosphaten mittels einer thermostabilen DNA-Polymerase;Binding of the oligonucleotides acting as primers for 1 minute at 60 ° C. to the two complementary single strands of the DNA to be examined; two-minute extension reaction of the individual primers along the DNA template at 72 ° C. by linking deoxyribonucleoside triphosphates using a thermostable DNA polymerase;
30 bis 40 Reaktionszyklen jeweils bestehend aus: DNA- Denaturierung bei 94°C (30 Sekunden lang) , gefolgt von Primerbindung bei 60°C (1 Minute lang), und Primerverlängerung bei 72°C (2 Minuten lang) ;30 to 40 reaction cycles each consisting of: DNA denaturation at 94 ° C (30 seconds) followed by primer binding at 60 ° C (1 minute) and primer extension at 72 ° C (2 minutes);
Endreaktion zur Auffüllung der beiden 3 λ-Enden am Reaktionsprodukt bei 72°C (ca. 5-8 Minuten lang) .Final reaction to fill up the two 3 λ ends of the reaction product at 72 ° C (for about 5-8 minutes).
Die im Verlauf der PCR-Amplifikation durch die Verlängerung der Primersequenzen entstandenen, charakteristischen, spezies- spezifischen DNA-Markerfragmente können beispielsweise gel- elektrophoretisch oder fluorimetrisch unter Verwendung fluoreszenz-markierter Oligonukleotide nachgewiesen werden. Selbstverständlich sind auch andere, dem Fachmann bekannte Nachweisverfahren einsetzbar.The characteristic, species-specific DNA marker fragments formed in the course of the PCR amplification by extending the primer sequences can be detected, for example, by gel electrophoresis or fluorimetry using fluorescence-labeled oligonucleotides. Of course, other detection methods known to the person skilled in the art can also be used.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Sonden mit der zu untersuchenden DNA- oder RNA-Probe zur Hybridisierung gebracht, wobei stringente Hybridisierungs- bedingungen gewählt werden. Stringente Bedingungen müssen für die jeweilige Anwendung empirisch ermittelt werden. Die nachfolgend beschriebenen Bedingungen können als Anhaltspunkte dienen.In an alternative embodiment of the invention, the probes with the DNA or RNA sample to be examined are used Hybridization brought, whereby stringent hybridization conditions are chosen. Stringent conditions must be determined empirically for the respective application. The conditions described below can serve as guidelines.
Die DNA oder RNA der zu untersuchenden Probe kann sowohl bei der PCR-Reaktion bzw. RT-PCR als auch bei der Hybridisierungs- reaktion entweder in extrahierter Form vorliegen oder in Form von komplexen Gemischen, bei denen die zu untersuchende Mikroorganismus-DNA oder -RNA nur einen sehr kleinen Anteil an der Fraktion der speziellen biologischen Probe bildet. Die zu untersuchenden Zellen können somit entweder in gereinigter Form vorliegen oder beispielsweise verunreinigt mit weiteren Bestandteilen. Sowohl in situ PCR oder in situ RT-PCR sind mit den hier beschriebenen Oligonukleotiden durchführbar.The DNA or RNA of the sample to be examined can be present either in the PCR reaction or RT-PCR or in the hybridization reaction either in extracted form or in the form of complex mixtures in which the microorganism DNA or RNA to be examined is present forms only a very small fraction of the fraction of the special biological sample. The cells to be examined can thus either be in a purified form or, for example, contaminated with other constituents. Both in situ PCR and in situ RT-PCR can be carried out with the oligonucleotides described here.
Bei der RT-PCR werden die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung zur PCR-Amplifikation von Fragmenten an cDNA- Matrizen eingesetzt, die nach reverser Transkription mit oligo (dT) oder mit diesen Oligonukleotiden am 3 V-Ende erzeugt werden. Die Expression kann dann qualitativ, in Verbindung mit geeigneten Standards und Techniken, wie einem internen Standard und insbesondere, mit einer quantitativen PCR, auch quantitativ ausgewertet werden.In the RT-PCR, the oligonucleotides of the present invention are used for the PCR amplification of fragments on cDNA matrices, which are generated after reverse transcription with oligo (dT) or with these oligonucleotides at the 3 V end. The expression can then be evaluated qualitatively, in conjunction with suitable standards and techniques, such as an internal standard and in particular with a quantitative PCR.
Die Oligonukleotide können auch als Sonden auf DOT BLOTS oderThe oligonucleotides can also be used as probes on DOT BLOTS or
DNA-Microarrays zur qualitativen und/oder quantitativenDNA microarrays for qualitative and / or quantitative
Analyse auf das Vorliegen der 16S-rDNA von Bakterien eingesetzt werden.Analysis for the presence of 16S rDNA from bacteria can be used.
Die Herstellung der Oligonukleotide der Erfindung erfolgt in an sich üblicher und bekannter Weise. Die Sonden können beispielsweise in Vektoren insertiert und nach Vermehrung wieder herausgeschnitten werden oder sie können in Form einer Matrize durch PCR oder synthetisch hergestellt werden. Auch eine Herstellung in Form von nicht-Nukleinsäuren, z.B. PNA oder derivatisierten Nukleinsäuren, um die Stabilität, die Hybridisierungseigenschaften oder Bindungseigenschaften an feste Träger zu verändern, ist möglich.The oligonucleotides of the invention are produced in a manner which is customary and known per se. The probes can for example inserted into vectors and cut out again after propagation or they can be produced in the form of a template by PCR or synthetically. Production in the form of non-nucleic acids, for example PNA or derivatized nucleic acids, in order to change the stability, the hybridization properties or binding properties to solid supports, is also possible.
Die in dieser Anmeldung beschriebenen Oligonukleotide eignen sich in hervorragender Weise zum Einsatz bei der TaqMan-PCR. „TaqMan* ist eine registrierte Marke. Nachfolgend werden die Grundlagen der TaqMan-PCR beschrieben. Weiterhin wird im Rahmen eines Beispiels die konkrete Anwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide im Rahmen einer TaqMan-PCR beschrieben. Wie bereits oben ausgeführt ist es aber auch möglich, die hier vorgestellten Primer und Sonden, allgemein Oligonukleotide, oder Abwandlungen μnd Derivate dieser Oligonukleotide in den anderen, an sich bekannten Hybridisierungsund PCR-Verfahren einzusetzen.The oligonucleotides described in this application are outstandingly suitable for use in TaqMan PCR. “TaqMan * is a registered trademark. The basics of TaqMan-PCR are described below. Furthermore, the specific application of the oligonucleotides according to the invention in the context of a TaqMan PCR is described in the context of an example. As already stated above, it is also possible to use the primers and probes presented here, generally oligonucleotides, or modifications and derivatives of these oligonucleotides in the other hybridization and PCR methods known per se.
Die Mitte der Achtziger Jahre entwickelte Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ist zwar eine schnelle und sehr sensitive Methode in der DNA-Analytik, bei der durch sich wiederholende Zyklen eine annähernd exponentielle Amplifikation der Zielsequenz erreicht wird. Trotz der wesentlichen Erleichterungen in der täglichen Laborarbeit, die diese verhältnismäßig leicht zu automatisierende Methode mit sich gebracht hat, bedeutet der sensitive, reproduzierbare und spezifische Nachweis der PCR-Produkte noch immer einen hohen Zeit- und Arbeitsaufwand: Methoden, wie Southern-, Dot- und reverse Dot Blotting bestehen aus mehreren Fixierungs- und Waschschritten. Andere Techniken wiederum, wie z.B. Restriktionsanalysen, erfordern zusätzliche Inkubations- sowie gelelektrophoretische Arbeiten. Neben dem hohen Zeitaufwand dieser und anderer Techniken, sind außerdem zum Teil sehr hohe Reagenzienkosten sowie die Gefahr der Carry-Over-Kontamination zu berücksichtigen.The polymerase chain reaction (PCR) developed in the mid-1980s is a fast and very sensitive method in DNA analysis, in which the exponential amplification of the target sequence is achieved by repeating cycles. Despite the significant simplifications in daily laboratory work that this relatively easy-to-automate method has brought with it, the sensitive, reproducible and specific detection of the PCR products still means a great deal of time and effort: methods such as Southern, dot, and reverse dot blotting consist of several fixation and washing steps. Other techniques, such as restriction analysis, require additional incubation as well gel electrophoretic work. In addition to the high expenditure of time of these and other techniques, very high reagent costs and the risk of carry-over contamination must also be taken into account.
Um das Automatiserungsniveau der PCR zu erhöhen, wurde ein sogenannter homogener Assay entwickelt, bei dem Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produkts simultan in einem Reaktionsgefäß ermöglicht werden.In order to increase the level of automation of the PCR, a so-called homogeneous assay was developed, in which amplification and detection of the PCR product are made possible simultaneously in one reaction vessel.
Dies gelang erstmals 1991 mit dem von HOLLAND et al (1991) beschriebenen 5λ-Nuclease PCR-Assay unter Ausnützung der 5λ- Exonukleaseaktivität der Taq Polymerase zur Detektion der sequenzspezifischen Amplifikation. Allerdings erforderte diese Technik noch ein aufwendiges Post-PCR-Processing. Erst mit den von Lee et al. (1993) entwickelten fluorogenen Sonden wurde es möglich, den Abbau der Sonde ohne aufwendige Post-PCR-Schritte zu detektieren. Dieses sogenannte TaqMan™ PCR-Assay basiert auf dem ursprünglichen 5 -Nuclease-Assay und macht sich zunächst ebenfalls die 5 λ-3 -Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq-DNA-Polymerase zu Nutze. Hierfür wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt, die aus einem Oligonukleotid besteht, dessen 5λ-Ende einen Quencher-Farbstoff (Rhodamin- Derivat) trägt und außerdem mit einem Phosphatrest blockiert ist. Abwandlungen dieser Ausgestaltungen sind selbstverständlich möglich.This was achieved for the first time in 1991 with the 5 λ nuclease PCR assay described by HOLLAND et al (1991) using the 5 λ - exonuclease activity of Taq polymerase to detect the sequence-specific amplification. However, this technique still required extensive post-PCR processing. Only with the Lee et al. (1993) developed fluorogenic probes, it was possible to detect the degradation of the probe without complex post-PCR steps. This so-called TaqMan ™ PCR assay is based on the original 5 nuclease assay and initially also makes use of the 5 λ -3 exonuclease activity of the AmpliTaq DNA polymerase. For this purpose, a special fluorogenic probe is used, which consists of an oligonucleotide, the 5 λ end of which carries a quencher dye (rhodamine derivative) and is also blocked with a phosphate residue. Modifications to these configurations are of course possible.
Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher durch einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Während der PCR hybridisiert die Sonde mit den Primern zunächst an den Matrizen-Strang. In der Extensionsphase trifft die Taq Polymerase nun auf diese Sonde und beginnt sie zu verdrängen. Es entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur, wodurch die 5 Λ-3 λ-Exonuklease Aktivität der AmpliTaq DNA Polymerase aktiviert und die Sonde geschnitten wird. Freie, nicht-hybridisierte Sonde wird hingegen nicht hydrolisiert . Kommt es jedoch zur Sondenhydrolyse, so wird die räumliche Nähe - und damit auch der FET - zwischen Reporter und Quencher unterbrochen. Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkt steigt die Fluoreszenz des Reporters also mit jedem PCR-Zyklus an. Das dabei gebildete Signal ist strikt sequenzspezifisch, da nicht 100%ig bindende Sondenmoleküle verdrängt werden noch bevor die Exonukleaseaktivität der Taq-Polymerase aktiviert wird. Die Veränderung der Fluoreszenz der verschiedenen Farbstoffe kann schließlich mit Hilfe geeigneter Detektoren im geschlossenen Reaktionsgefäß Zyklus für Zyklus erfaßt werdenIf the intact probe is excited to fluoresce at a specific wavelength (488 nm), the fluorescence of the reporter dye is suppressed by a fluorescence energy transfer (FET) due to the spatial proximity to the quencher. During the PCR, the probe first hybridizes with the primers to the template strand. Hits in the extension phase the Taq polymerase now on this probe and begins to displace it. A Y-shaped secondary structure is formed, which activates the 5 Λ -3 λ exonuclease activity of the AmpliTaq DNA polymerase and cuts the probe. Free, non-hybridized probe, however, is not hydrolyzed. However, if probe hydrolysis occurs, the spatial proximity - and thus also the FET - between the reporter and quencher is interrupted. According to the accumulation of PCR product, the fluorescence of the reporter increases with each PCR cycle. The signal formed is strictly sequence-specific, since probe molecules that do not bind 100% are displaced even before the exonuclease activity of the Taq polymerase is activated. The change in the fluorescence of the various dyes can finally be detected cycle by cycle with the aid of suitable detectors in the closed reaction vessel
Wie bereits beschrieben, besitzt eine TaqMan-PCR Sonde die folgenden Charakteristika:As already described, a TaqMan PCR probe has the following characteristics:
5 λ-Reporter-Farbstoff, 3 λ-Quencher-Farbstoff, 3 -OH-blockierendes Phosphat.5 λ reporter dye, 3 λ quencher dye, 3 -OH blocking phosphate.
Der fluoreszente Reporterfarbstoff ist kovalent an das 5Λ-Ende der Sonde geknüpft. Standardmäßig wird FAM als Reporter eingesetzt. Weitere Optionen können Tabelle 1 entnommen werden. Diese verschiedenen Reporterfarbstoffe, die auch eine Multiplex-Anwendung des TaqMan-PCR-Systems erlauben, werden jeweils durch den Quencher-Farbstoff TAMRA .gequenchet. TAMRA wird über ein Linker-Arm-modifiziertes Nukleotid (LAN) an das 3Λ-Ende der Sonde gebunden. Schließlich wird die Sonde noch chemisch phosphoryliert, um eine Extension des 3 -Endes während der PCR zu vermeiden. Weitere Ausgestaltungen durch Einsatz anderer Reporter und Quencher-Farbstoffe oder' anderer Polymerasen sind möglich und liegen im Bereich des Könnens und Wissens des Fachmanns.The fluorescent reporter dye is covalently linked to the 5 Λ end of the probe. By default, FAM is used as a reporter. Further options can be found in Table 1. These different reporter dyes, which also allow a multiplex application of the TaqMan PCR system, are each quenched by the quencher dye TAMRA. TAMRA is bound to the 3 Λ end of the probe via a linker-modified nucleotide (LAN). Finally, the probe is chemically phosphorylated to avoid extension of the 3 end during the PCR. Further refinements by Use of other reporters and quencher dyes or 'other polymerases are possible and are within the skills and knowledge of the skilled person.
Reak ionsbedingungenReaction conditions
Da die Hybridisierung der Sonde im Gegensatz zu den PCR- Primern während der Extensionsphase nicht zusätzlich durch die AmpliTaq-DANN-Polymerase stabilisiert wird, hat dies folgende Konsequenzen für die TaqMan™-Reaktion: der Tm der Sonde sollte mindestens 5°C über dem der PCR-Since the hybridization of the probe, in contrast to the PCR primers, is not additionally stabilized by the AmpliTaq-DANN polymerase during the extension phase, this has the following consequences for the TaqMan ™ reaction: the T m of the probe should be at least 5 ° C above that the PCR
Primer liegen, möglichst keinen 72 °C Extensionsschritt, sondern besser 2-Primers are, preferably not a 72 ° C extension step, but better 2-
Schritt-PCR mit kombiniertem Annealing/Extensions-Schritt (>Step PCR with combined annealing / extension step (>
55°C) bei einer Temperatur unter dem Tm der Sonde, höhere MgCl2-Konzentrationen (3,5-6 mM) um die Anbindung der55 ° C) at a temperature below the T m of the probe, higher MgCl 2 concentrations (3.5-6 mM) around the binding of the
Sonde zu stabilisieren und so die Anwendung höhererStabilize probe and thus the application of higher
Temperaturen beim kombinierten Annealing/ExtensionsschrittCombined annealing / extension step temperatures
(höhere Extensionsrate der AmpliTaq-DNA-Polymerase) zu ermöglichen.(higher amplification rate of the AmpliTaq DNA polymerase).
Es empfiehlt sich den tatsächlichen Tm, bei dem optimale Ergebnisse erzielt werden, empirisch zu bestimmen (wobei größere Abweichungen vom berechneten Tm auftreten können) . Der TaqMan™-Sonde wird üblicherweise in Konzentrationen im Bereich von 50-200 nM/50 μl Reaktion eingesetzt. Die optimale Sondenkonzentration ist vom Fluoreszenz-Hintergrund sowie der Primer Konzentration abhängig. Das Reporter-Fluoreszenz-Signal der Ohne-Template-Kontrollen sollte mindestens dreimal so hoch sein, wie das Signal der Buffer-Blank. Für die Auswahl der PCR-Primer gelten die allgemein gültigen Regeln:It is advisable to empirically determine the actual T m at which optimal results are achieved (although larger deviations from the calculated T m can occur). The TaqMan ™ probe is usually used in concentrations in the range of 50-200 nM / 50 μl reaction. The optimal probe concentration depends on the fluorescence background and the primer concentration. The reporter fluorescence signal of the without template controls should be at least three times as high as the signal of the buffer blank. The generally applicable rules apply to the selection of the PCR primers:
Länge 18-30 Basen - G+C-Gehalt: ca 50% möglichst keine Poly (T) -Bereiche (unspezifische Bindungen) möglichst keine palindromischen Sequenzabschnitte keine 3 Λ-Komplementarität (Primer-Dimer-Gefährdung) HPLC-AufreinigungLength 18-30 bases - G + C content: approx. 50% if possible no poly (T) regions (unspecific bonds) if possible no palindromic sequence sections no 3 Λ complementarity (risk of primer dimer) HPLC purification
Übliche Primerkonzentrationen in der TaqMan™-PCR liegen bei 0,2 bis 0,5 μM. Es empfiehlt sich jedoch,, die tatsächliche optimale Konzentration durch Austesten der Primer im Bereich von 0,1 bis 1,0 μM zu ermitteln.The usual primer concentrations in the TaqMan ™ -PCR are 0.2 to 0.5 μM. However, it is recommended to determine the actual optimal concentration by testing the primers in the range of 0.1 to 1.0 μM.
Von der Menge der zu Beginn der PCR eingesetzten Matrizen- Moleküle hängt die Zahl der PCR-Zyklen ab, die benötigt werden, um ein ausreichendes Signal zu erhalten. Etwa 10.000 Startkopien und 25-30 Zyklen sind für den Beginn einer Optimierung ausreichend.The number of PCR cycles required to obtain a sufficient signal depends on the amount of template molecules used at the start of the PCR. Around 10,000 start copies and 25-30 cycles are sufficient to start optimization.
Denaturierungdenaturation
Es empfiehlt sich, vor der PCR eine einleitende Denaturierung von > 1 min bei 94-96°C durchzuführen, um sicherzustellen, daß die DNA auch tatsächlich aufgeschmolzen wird. Dies gilt insbesondere dann, wenn ein hoher GC-Gehalt der ,DNA- Doppelhelix zusätzliche Stabilität verleiht. In diesem Fall kann es sogar nützlich sein, in den ersten PCR-Zyklen eine Denaturierungstemperatur' von 95°C oder 9β°C zu wählen, um sicherzustellen, daß die Strangtrennung effizient verläuft. Nach wenigen Zyklen sollte die Denaturierungstemperatur jedoch wieder auf > 94 °C reduziert werden, da dann genügend PCR- Produkt angereichert worden ist, welches kürzer ist als die genomische DNA und daher auch effizienter denaturiert. Ein weiterer Grund hierfür ist, daß die Halbwertszeit der Taq-DNA- Polymerase bei 95°C 40 min beträgt und bei 97,5°C sogar auf nur 10 min sinkt. Eine zu hohe Denaturierungstemperatur über die ganze PCR würde also die Effizienz der Reaktion und damit auch die Signalintensität negativ beeinflussen. Für die Amplifikation GC-reicher Sequenzen sollten daher folgende Punkte berücksichtigt werden:It is advisable to carry out an initial denaturation of> 1 min at 94-96 ° C before the PCR to ensure that the DNA is actually melted. This is especially true when a high GC content gives the DNA double helix additional stability. In this case it may even be useful to choose a denaturation temperature of 95 ° C or 9 ° C in the first PCR cycles to ensure that strand separation is efficient. After a few cycles, the denaturation temperature should, however be reduced again to> 94 ° C, since enough PCR product has then been enriched, which is shorter than the genomic DNA and therefore denatured more efficiently. Another reason for this is that the half-life of Taq DNA polymerase is 40 min at 95 ° C and even drops to only 10 min at 97.5 ° C. Too high a denaturation temperature throughout the PCR would negatively affect the efficiency of the reaction and thus the signal intensity. The following points should therefore be considered for the amplification of GC-rich sequences:
1. Erhöhte Denaturierungstemperatur in den ersten PCR-Zyklen;1. Increased denaturation temperature in the first PCR cycles;
2. Höhere Annealing-Temperaturen (> 65°);2. Higher annealing temperatures (> 65 °);
3. Einsatz von PCR-Additiven wie Glyzerin und/oder Formamid;3. Use of PCR additives such as glycerin and / or formamide;
4. u.U. Einsatz von 7-Deaza-2 -desoxy-GTP neben dGTP.4. may Use of 7-deaza-2-deoxy-GTP in addition to dGTP.
Annealing-TemperaturAnnealing temperature
Auch für die TaqMan™-PCR gilt, daß mit höheren Annealing- Temperaturen (> 55°C) generell spezifischeres Produkt generiert werden kann. Die Annealing-Temperaturen der Primer sowie der Sonde sollten zunächst nach der Nearest-Neighbour- Methode bestimmt werden. Bei der Optimierung der Reaktion muß die tatsächliche Annealing-Temperatur dann in z.B. 2°C- Intervallen empirisch ermittelt werden.It also applies to the TaqMan ™ -PCR that generally more specific product can be generated with higher annealing temperatures (> 55 ° C). The annealing temperatures of the primers and the probe should first be determined according to the nearest neighbor method. When optimizing the reaction, the actual annealing temperature must then be e.g. 2 ° C intervals are determined empirically.
Extensions-TemperaturExtend temperature
Die Dauer der Extension ist von der Länge des zu generierenden PCR-Produkts abhängig: Die Extensionsrate der AmpliTaq-Gold beträgt zwischen 2000 und 4000 Basen pro Minute bei Temperaturen von 70°C bis 80°C.The duration of the extension depends on the length of the PCR product to be generated: The extension rate of the AmpliTaq-Gold is between 2000 and 4000 bases per minute at temperatures from 70 ° C to 80 ° C.
Bei der Extension muß berücksichtigt werden, daß nicht nur die PCR-Primer stabil hybridisieren, sondern auch insbesondere die TaqMan™-Sonde. Aus diesem Grund sollte der Tm der Sonde um > 5°C dem Tm der Primer liegen. Eine höhere Mg-Ionenkonzentration wirkt stabilisierend auf die Hybridisierung der Sonde. Soll eine 3-Schritt-PCR etabliert werden, so empfiehlt es sich die Extensions-Temperatur < 70 °C zu wählen, um die Hybridisierung der Sonde nicht zusätzlich zu destabilisieren und somit höhere Rn+-Werte zu erzielen. " During the extension it must be taken into account that not only the PCR primers hybridize stably, but also in particular the TaqMan ™ probe. For this reason the T m of the probe should be> 5 ° C the T m of the primers. A higher concentration of Mg ions has a stabilizing effect on the hybridization of the probe. If a 3-step PCR is to be established, it is advisable to choose the extension temperature <70 ° C in order not to additionally destabilize the hybridization of the probe and thus to achieve higher R n + values. "
Auswahl der PCR-Primer und -SondenSelection of the PCR primers and probes
16S-rDNA-Sequenzen wurden aus der NCBI-Datenbank bezogen. Alignments wurden unter Verwendung des Geno atix DiAlign- Programms (http : //genomatix . gsf . de/cgi-bin/dialign/dialign.pl) durchgeführt. Der Vergleich der so gestalteten degenerierten Oligonukleotide mit bekannten DNA-Sequenzen unter Verwendung des Genotamix Matinspektor Programms16S rDNA sequences were obtained from the NCBI database. Alignments were made using the Geno atix DiAlign program (http: // genomatix. Gsf. De / cgi-bin / dialign / dialign.pl). Comparison of the degenerate oligonucleotides designed in this way with known DNA sequences using the Genotamix Matinspektor program
(http : //genomatix. gsf.de/cgi-bin/matinspector/matinspector .pl) zeigte, daß das Nachweissystem für bakterielle 16S-rDNA-Gene spezifisch und auch in der Lage ist, die bakteriellen Gene von Pilzgenen und mitochόndrialen Genen zu diskriminieren. Die so ausgewählten Oligonukleotide ' sind in der Tabelle 2 beschrieben. Abänderungen dieser Oligonukleotide sind, bei gleicher Spezifität, dem Fachmann möglich. Die 16S-rDNA- und 18S-rDNA-Sequenzen der nachfolgenden Spezies wurden für die Alignments berücksichtigt:(http: // genomatix. gsf.de/cgi-bin/matinspector/matinspector .pl) showed that the detection system is specific for bacterial 16S rDNA genes and is also able to detect the bacterial genes of fungal and mitochondrial genes discriminate. The thus selected oligonucleotides' are described in Table 2. Modifications of these oligonucleotides are possible for the person skilled in the art with the same specificity. The 16S rDNA and 18S rDNA sequences of the following species were taken into account for the alignments:
Azospirill um sp. X92464, Escherichia coli J01859, Burkholderia cepacia M2251, Bacillus clausii X76440, Clostridium paxadoxum L06838, Corynebacterium flavescens X84441, Desυlfobacter postgatei M26633, Enterobacter agglomerans Z96082, Flavobateri um salegens M92279, Basidiosporogene Hefe M2Azospirill um sp. X92464, Escherichia coli J01859, Burkholderia cepacia M2251, Bacillus clausii X76440, Clostridium paxadoxum L06838, Corynebacterium flavescens X84441, Desυlfobacter postgatei M26633, Enterobacter agglomerans Z96082, Flavobateri um salegens M92279, Basidiosporogene yeast M2
D86910, Zoophthora radicans D61381, mitochondriale 16S-rDNA von Toxoneuron abdominalis AF029113.D86910, Zoophthora radicans D61381, mitochondrial 16S rDNA from Toxoneuron abdominalis AF029113.
DNA-GewinnungDNA recovery
DNA aus Bakterien und Pilzen zur Bestimmung der Spezifität der gegen die 16S-rDNA gerichteten Oligonukleotide wurde mit Standardverfahren extrahiert (Marmur 1961; Henrion et al. 1994) oder von der Firma Sigma, Deisenhofen, Deutschland, bezogen. DNA aus Reinkulturen für eine nachfolgende TaqMan- PCR-Quantifizierung wurde unter Verwendung des QIAamp Tissue Kits (Quiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. DNA aus Pseudomonas fluorescens wurde entsprechend der Angaben der Firma Quiagen extrahiert. Um eine effiziente Lysis zu erreichen, wurde das Verfahren bei Verwendung von Bacillus spp . leicht modifiziert eingesetzt: Die Pellets wurden in 1 ml Lysispuffer resuspendiert und in 2 ml Glasröhrchen überführt, die je 2 g an Glaskügelchen mit einem Durchmesser von 0,17- 0,18 μ (Braun, Melsungen, Deutschland) enthielten. Während der 30 minütigen Inkubation bei 37 °C wurden die Suspensionen 3 mal 90 Sek. lang nach 0, 15 und 30 Min in einem Bead Beater (Homogenisator) (Braun, Melsungen, Deutschland) bei 2000 UpM homogenisiert. DNA aus Boden wurde unter Verwendung des FastDNÄ SPIN Kits für Böden (Bio 101, Vista, USA) entsprechend, den Herstellerangaben extrahiert und gereinigt.DNA from bacteria and fungi to determine the specificity of the oligonucleotides directed against the 16S rDNA was extracted using standard methods (Marmur 1961; Henrion et al. 1994) or obtained from Sigma, Deisenhofen, Germany. DNA from pure cultures for a subsequent TaqMan PCR quantification was extracted using the QIAamp tissue kit (Quiagen, Hilden, Germany). DNA from Pseudomonas fluorescens was extracted according to the instructions from Quiagen. In order to achieve efficient lysis, the method was used using Bacillus spp. slightly modified used: The pellets were resuspended in 1 ml lysis buffer and transferred into 2 ml glass tubes, each containing 2 g of glass beads with a diameter of 0.17-0.18 μ (Braun, Melsungen, Germany). During the 30 minute incubation at 37 ° C., the suspensions were homogenized 3 times 90 seconds after 0, 15 and 30 minutes in a Bead Beater (homogenizer) (Braun, Melsungen, Germany) at 2000 rpm. DNA from the soil was extracted and purified using the FastDNÄ SPIN kit for soils (Bio 101, Vista, USA) according to the manufacturer's instructions.
Plasmid-Standard zur absoluten Quantifizierung.Plasmid standard for absolute quantification.
Plasmid-Standards wurden wie nachfolgend hergestellt Das entsprechende 16S-rDNA-Genfragment wurde durch herkömmliche PCR mit in der Tabelle 2 angegebenen Primern hergestellt, wobei an die Primer an den 5λ-Enden sticky ends angefügt wurden, und zwar die Restriktions-Erkennungssequenz für BamHI mit dem Überhang-CGC- an den Vorwärtsprimer und die Restriktions-Erkennungssequenz für Xbal mit dem Überhang -GC- an den reversen Primer. Genomische DNA aus E.coli wurde als Template eingesetzt. Das so erhaltene Fragment wurde verdaut und in den high copy-Vektor Triple Helix™pHelix™Vektor 1(+) (Röche, Mannheim, Deutschland) kloniert und in E.coli JM 105 transformiert. Die Reinigung der Plasmid DNA wurde mit dem Plasmid Midi Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) ausgeführt. Die quantitative Bestimmung der Plasmid DNA wurde durch Vergleich der Banden mit Lambda DNA/EcoRI+Hindlll Marker 3 (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen) auf Agarosegel nach Ethidiumbromid Färbung geschätzt. Es wurden 10-fach Verdünnungen hergestellt und als externe Standards bei der TaqMan-PCR eingesetzt.Plasmid standards were prepared as follows The corresponding 16S rDNA gene fragment was prepared by conventional PCR using the primers shown in Table 2, with sticky ends being added to the primers at the 5 λ ends, namely the restriction recognition sequence for BamHI with the overhang CGC forward primer and restriction recognition sequence for Xbal with overhang -GC- to the reverse primer. Genomic DNA from E. coli was used as a template. The fragment thus obtained was digested and cloned into the high copy vector Triple Helix ™ pHelix ™ vector 1 (+) (Röche, Mannheim, Germany) and transformed into E.coli JM 105. The plasmid DNA was purified using the plasmid midi kit (Qiagen, Hilden, Germany). The quantitative determination of the plasmid DNA was estimated by comparing the bands with Lambda DNA / EcoRI + HindIII marker 3 (MBI Fermentas, Vilnius, Lithuania) on agarose gel after ethidium bromide staining. 10-fold dilutions were made and used as external standards in TaqMan-PCR.
PCR-BedingungenPCR conditions
Die eingesetzten Primer und Sonden sind in der Tabelle 2 angegeben. Die Amplifikation wurde mit dem ABI 7700 Sequenz- Nachweis-System (Perkin Eimer, Norwalk, Connecticut, USA) in 50 μl Endvolumina mit 5μl Template DNA, 200 nM pro Primer, 150 nM TaqMan Sonde, 200 pM Desoxynukleotidtriphosphate, 5 ml 10 x Reaktionspuffer, 4,5 mM MgCl2 und 1,25 U Ämpli Taq Gold DNA Polymerase (Perkin Eimer), durchgeführt. Das PCR-Programm war wie folgt: Ein Stop bei 95°C für 10 Min zur Denaturierung der DNA und Aktivierung der Polymerase, 35 Zyklen bei 95°C für 15 Sek. und 62°C für 60 Sek. ErgebnisseThe primers and probes used are given in Table 2. The amplification was carried out using the ABI 7700 sequence detection system (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA) in 50 μl final volumes with 5 μl template DNA, 200 nM per primer, 150 nM TaqMan probe, 200 pM deoxynucleotide triphosphate, 5 ml 10 × reaction buffer , 4.5 mM MgCl 2 and 1.25 U Ämpli Taq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer). The PCR program was as follows: a stop at 95 ° C for 10 minutes to denature the DNA and activate the polymerase, 35 cycles at 95 ° C for 15 seconds and 62 ° C for 60 seconds. Results
Spezifität der 16S-rDNA gerichteten Pri erSpecificity of the 16S rDNA directed primer
Herkömmliche PCR wurde durchgeführt, um empirisch die Eignung der erfindungsgemäß beschriebenen Primer zur spezifischen Amplifikation bakterieller 16S-rDNA-Sequenzen und ihre Fähigkeit, rDNA-Genen aus Pilzen zu diskriminieren, zu bestätigen. Mit der genomischen DNA der nachfolgenden Spezies wurde je ein einzelnes PCR-Produkt mit der erwarteten Länge erhalten: Burkholderia cepacia DSMZ 7288, Pseudomonas fluorescens DSMZ 50090τ, Ochrobactrum anthropi LMG 2136, Alcaligenes faecalis DSMZ 30030τ, Azospirillum brasiliense IBOE Sp7, Agrobacterium tυmefaciens DSMZ 30205τ, Herbaspirillum seropedicae IBOE Z 67, Cytophaga xantha DSMZ 3661, Sinorhizobium meliloti DSMZ 1981, Bacillus thuringiensis DSMZ 2046T, Arthrobacter ci treυs IBOE BI 90, Streptomyces anυlatus DSMZ 40361τ, Corynebacteri um glutamicum DSMZ 20300τ, Nocardia carnea DSMZ 43397τ, Flavobacteri υm sp. DSMZ 1048, Escherichia coli (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany) , Clostridi um perfrigens (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Micrococcus l uteus (genomische DNA, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) . Bei Verwendung genomischer DNA aus Kälbertymus, Mucor mucedo DSMZ . 809, Aspergill υs niger DSMZ 1988, Penicilli u funiculosum DSMZ 1960 oder Irpex lacteus DSMZ 1183 wurden keine Produkte erhalten. Die Amplifizierbarkeit eukaryotischer DNA-Proben wurde durch Inter-LINE-PCR (Smida et al., 1996) mit Random-Primern bestätigt. Aufgrund dieser Versuche kann geschlossen werden, daß die hier beschriebenen Oligonukleotide (Primer) eine spezifische Amplifikation der bakeriellen 16S-rDNA-Gene ermöglichen. TaqMan-PCR zur Quantifizierung der 16S-rDNA-Gene aus Bakterien in Flüssigkultur.Conventional PCR was carried out to empirically confirm the suitability of the primers according to the invention for the specific amplification of bacterial 16S rDNA sequences and their ability to discriminate rDNA genes from fungi. A single PCR product with the expected length was obtained with the genomic DNA of the following species: Burkholderia cepacia DSMZ 7288, Pseudomonas fluorescens DSMZ 50090 τ , Ochrobactrum anthropi LMG 2136, Alcaligenes faecalis DSMZ 30030 τ , Azospirillum brasiliefrobacterium DSOE Sp7 30205 τ, herbaspirillum seropedicae IBOE Z 67, Cytophaga xantha DSMZ 3661, Sinorhizobium meliloti DSMZ 1981 Bacillus thuringiensis DSMZ 2046 T, Arthrobacter ci treυs IBOE BI 90, Streptomyces anυlatus DSMZ 40361 τ, Corynebacteri τ to glutamicum DSMZ 20300, Nocardia carnea DSMZ 43397 τ , Flavobacteri υm sp. DSMZ 1048, Escherichia coli (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Clostridi um perfrigens (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany), Micrococcus l uteus (genomic DNA, Sigma, Deisenhofen, Germany). When using genomic DNA from calf thymus, Mucor mucedo DSMZ. 809, Aspergill υs niger DSMZ 1988, Penicilli u funiculosum DSMZ 1960 or Irpex lacteus DSMZ 1183 no products were obtained. The amplifiability of eukaryotic DNA samples was confirmed by inter-LINE-PCR (Smida et al., 1996) with random primers. On the basis of these experiments it can be concluded that the oligonucleotides (primers) described here enable specific amplification of the bakerial 16S rDNA genes. TaqMan PCR for the quantification of the 16S rDNA genes from bacteria in liquid culture.
Standardplasmid DNA mit 2 x 107 - 1 x 103 Kopien des 16S-rDNA Fragments aus E. coli in 10-fachen und einfachen Verdünnungen wurden eingesetzt, um die in der Abb. 1 gezeigte Kalibrierungskurve aufzustellen. Für jede Probe wurden 2 Replikate gemessen. Die log-Kopienanzahl des 16S-rDNA (x) kann wie folgt berechnet werden: Ct = -3,503x + 40,679. Der Korrelationskoeffizient betrug 0,997. Ct-Werte in Abhängigkeit von der Anzahl der Startkopien bei der TaqMan-PCR; von allen Proben wurden zwei Replikate gemessen..Standard plasmid DNA with 2 x 10 7 - 1 x 10 3 copies of the 16S rDNA fragment from E. coli in 10-fold and simple dilutions were used to set up the calibration curve shown in Fig. 1. Two replicates were measured for each sample. The log copy number of the 16S rDNA (x) can be calculated as follows: C t = -3.503x + 40.679. The correlation coefficient was 0.997. C t values as a function of the number of start copies in the TaqMan PCR; Two replicates of all samples were measured.
Wenn man davon ausgeht, daß bei einer 100% PCR-Effizienz der Ct-Wert bei einer Verdoppelung der Ausgangskopienanzahl um 1,0 abnehmen sollte, zeigt der berechnete Delta Ct-Wert von 1,055 pro einfacher Verdünnung der Standard DNA eine sehr hohe Effizienz der vorliegenden PCR-Amplifikation an.If one assumes that with a 100% PCR efficiency the C t value should decrease by 1.0 when the number of original copies is doubled, the calculated Delta Ct value of 1.055 per simple dilution of the standard DNA shows a very high efficiency of the present PCR amplification.
Nachfolgend wird ein Beispiel beschrieben, in welchem die Oligonukleotide der Erfindung eingesetzt und die Reaktionsbedingungen, unter denen diese Oligonukleotide zur Quantifizierung von Bakterien in der TaqMan-PCR verwendet wurden, erläutert werden. Primer und Sondendesign:An example is described below in which the oligonucleotides of the invention are used and the reaction conditions under which these oligonucleotides were used to quantify bacteria in the TaqMan PCR are explained. Primer and probe design:
Die bevorzugten Oligonukleotide der Erfindung sind in Tabelle 2 aufgeführt, zusammen mit den bevorzugten Reaktionsbedingungen, unter denen diese Oligonukleotide . zur Quantifizierung von Bakterien in der TaqMan-PCR eingesetzt werden können. Temperaturprogramm:The preferred oligonucleotides of the invention are listed in Table 2, along with the preferred reaction conditions under which these oligonucleotides. can be used to quantify bacteria in TaqMan PCR. Temperature program:
1 x 95°C, 10 min1 x 95 ° C, 10 min
35 x 95°C, 15 sec; 62°C, 1 min35 x 95 ° C, 15 sec; 62 ° C, 1 min
Reaktionslösung:Reaction solution:
Volumen EndkonzentrationVolume final concentration
TaqMan-Puffer (lOx) 5 μl IxTaqMan buffer (lOx) 5 μl Ix
MgCl2 (25mM) 9 μl 4,5 mM dNTP (lOmM) 1 μl 200 pmolMgCl 2 (25mM) 9 ul 4.5mM dNTP (10mm) 1 ul 200pmol
Vorwärts Primer (10 μM) 1 μl 200 nMForward primer (10 µM) 1 µl 200 nM
Rückwärts Primer (10 μM) 1 μl 200 nMReverse primer (10 μM) 1 μl 200 nM
TaqMan-Sonde (2,5 μM) 3 μl 150 nMTaqMan probe (2.5 μM) 3 μl 150 nM
AmpliTaqGold-Poly erase 0,25 μl 0,025 U/μlAmpliTaqGold-Poly erase 0.25 μl 0.025 U / μl
Template-DNATemplate DNA
(102-107 Kopien) 5 μl(10 2 -10 7 copies) 5 µl
Aqua dest. ad 50 μlAqua dest. ad 50 μl
Die verwendeten Reagenzien und Röhrchen stammen von der Fa. Applied Biosystems, mit Ausnahme der verwendeten dNTPs, die von der Fa. Röche bezogen wurden.The reagents and tubes used come from Applied Biosystems, with the exception of the dNTPs used, which were obtained from Röche.
Herstellung eines externen Standards für die Real Time TaqMan- PCRProduction of an external standard for the Real Time TaqMan PCR
Zur Konstruktion eines stabilen Standards, der als Referenz für die Quantifizierung der Kopienanzahl in einer Probe dient, wurde das zu amplifizierende DNA-Fragment aus Escherichia coli in den high copy number pUC19-Vektor (DNA plasmid, pHelix 1(+), Röche Mannheim, Deutschland) inseriert und kloniert. Für die. Vorbereitung des Inserts wurde eine PCR mit den in Tabelle 2 aufgeführten Primern durchgeführt, die jedoch jeweils am 5 'Ende durch sticky ends verlängert waren (Vorwärtsprimer : Überhang (5"CGC) und Restriktionsschnittstelle für SamHI (5VGGATCC); Rückwärtsprimer: Überhang (5NGC) und Restriktionsschnittstelle für Xhal (5"TCTAGA) . Das Produkt aus dieser PCR sowie der Vektor wurden mit den beiden Restriktionsenzymen verdaut und in einer Ligation vereinigt. Der so veränderte Vektor wurde anschließend in E. coli vervielfältigt und extrahiert. Nach einer genauen Bestimmung der Konzentration dieses Vektors, der je eine Kopie des zu a plifizierenden DNA-Abschnitts enthält, wurden nun Verdünnungen hergestellt, von denen die Kopienanzahl bekannt war und die als Standards für die TaqMan-PCR eingesetzt wurden.To construct a stable standard that serves as a reference for quantifying the number of copies in a sample, the DNA fragment to be amplified from Escherichia coli was inserted into the high copy number pUC19 vector (DNA plasmid, pHelix 1 (+), Röche Mannheim, Germany) inserted and cloned. For the. In preparation for the insert, a PCR was carried out with the primers listed in Table 2, but each was extended at the 5 'end by sticky ends (forward primer: overhang (5 "CGC) and restriction site for SamHI (5 V GGATCC); reverse primer: overhang ( 5 N GC) and restriction site for Xhal (5 "TCTAGA). The product from this PCR and the vector were digested with the two restriction enzymes and combined in a ligation. The vector thus modified was then multiplied and extracted in E. coli exact determination of the concentration of this vector, which contains a copy of the DNA section to be amplified, dilutions were made, of which the number of copies was known and which were used as standards for the TaqMan PCR.
Validierung:validation:
Der entscheidende Parameter bei der Quantifizierung von DNA- Kopien ist der Ct-Wert. Dieser gibt die Nummer des PCR-Zyklus an, bei dem das Fluoreszenzsignal zum ersten mal über das Hintergrundsignal ansteigt.The crucial parameter when quantifying DNA copies is the Ct value. This indicates the number of the PCR cycle in which the fluorescence signal rises above the background signal for the first time.
Abb. 1 zeigt die aus den Standards (schwarze Punkte) generierte Standardkurve und die darauf eingetragenen Probenwerte (rote Punkte) . Durch die hohe Reproduzierbarkeit des Ansatzes sind die einzelnen Punkte für die Replikate miteinander verschmolzen und daher nicht alle sichtbar. Die sehr genaue Eichgerade (R2 = 0,997) erlaubt einen zuverlässigen Meßbereich von 103 bis 2 x 107 Kopien pro PCR-Ansatz. Bestimmung der Bakterienkonzentration in einer Reinkultur von Bacillus subtilis während des Kul turverlaufsFig. 1 shows the standard curve generated from the standards (black points) and the sample values (red points) entered on them. Due to the high reproducibility of the approach, the individual points for the replicas are fused together and therefore not all are visible. The very precise calibration line (R 2 = 0.997) allows a reliable measuring range of 10 3 to 2 x 10 7 copies per PCR batch. Determination of the bacterial concentration in a pure culture of Bacillus subtilis during the course of the culture
Aus einer Flüssigkultur von B . subtilis wurden zu bestimmten Zeiten Proben entnommen. Zur Validierung der PCR- Quantifizierung wurden folgende Keimzahlbestimmungen durchgeführt:From a liquid culture from B. Subtilis samples were taken at certain times. The following bacterial count determinations were carried out to validate the PCR quantification:
-KBE (Kolonie-bildende Einheiten)-KBE (colony-forming units)
-Mikroskopische Auszählung der Bakterien nach DAPI-Färbung -Quantifizierung der Kopienzahlen nach der Extraktion genomischer DNA mit dem QIAamp Tissue Kit (Quiagen, Hilden) . Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.-Microscopic counting of the bacteria after DAPI staining -Quantification of the number of copies after the extraction of genomic DNA with the QIAamp Tissue Kit (Quiagen, Hilden). Table 3 shows the results.
Die über die PCR ermittelten Bakterienkonzentrationen stimmen exakt mit denen aus den DAPI-Zählungen überein. Die KBE-Werte liegen zu allen Probenahmezeiten etwas niedriger, was darauf zurückzuführen ist, daß diese Bestimmungsmethode mit einigen Unsicherheiten behaftet ist. So könnte es sein, daß entweder nicht alle Organismen auf Agarplatten zum Wachstum kommen oder daß Bakterienketten, die vor allem in der exponentiellen Wachtumsphase gehäuft vorkommen, jeweils nur eine Kolonie bilden. The bacterial concentrations determined via the PCR correspond exactly to those from the DAPI counts. The KBE values are somewhat lower at all sampling times, which is due to the fact that this determination method is fraught with some uncertainties. It could be that either not all organisms grow on agar plates or that bacterial chains, which are particularly common in the exponential growth phase, form only one colony at a time.
Tab . 1 :Tab. 1 :
Zusammenfassung der Daten der fluorszenten Farbstoffe, die bei der TaqMan-PCR eingesetzt werden könnenSummary of data on the fluorescent dyes that can be used in TaqMan PCR
R = Reporter) , Q = Quencher, P =P assiver Referenzfarbstoff) .R = reporter), Q = quencher, P = passive reference dye).
Tab 2: Tab 2:
Oligonukleotide, die als Primer bzw. als Sonde für den Nachweis und die Quantifizierung der bakteriellen 16S-rDNA-Kopien verwandt wurden.Oligonucleotides, which were used as primers or as probes for the detection and quantification of the bacterial 16S rDNA copies.
-J-J
^Position im 16S rDNA Gen von Escherichia coli NCBI X80724 ^ Position in the 16S rDNA gene of Escherichia coli NCBI X80724
Tab .Tab.
Quantifizierung von Bacillus subtilis mit verschiedenen MethodenQuantification of Bacillus subtilis using different methods
pro Genom in 10 Kopien vorhanden ist (multiple operons) , wurden die DNA-Kopien-Werte durch den Faktor 10 dividiert (Schmidt, T. M., 1998) . is present in 10 copies per genome (multiple operons), the DNA copy values were divided by the factor 10 (Schmidt, TM, 1998).
Literatur:Literature:
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Claims

PA T E N TAN S P RÜ C H E PA TEN TAN SP RUCHE
1. Oligonukleotide zur Amplifikation und zum qualitativen und quantitativen Nachweis von 16S-rRNA-Genen, -Genfragmenten und hiervon abgeleiteter RNA und der Transkription dieser Gene, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest eines der nachfolgenden Oligonukleotide oder ihre komplementäre oder Oligonukleotide mit reverser oder revers-komplementärer Sequenz oder eine Kombination hiervon sowie die hiervon abgeleitete RNA oder Derivate hiervon umfassen, die je spezifisch an für 16S-rRNA-Gene oder -Genfragmente kodierende DNA oder hiervon abgeleitete RNA binden, wobei die Oligonukleotide die nachfolgenden Nukleotidsequenzen umfassen:1. Oligonucleotides for the amplification and for the qualitative and quantitative detection of 16S rRNA genes, gene fragments and RNA derived therefrom and the transcription of these genes, characterized in that they contain at least one of the following oligonucleotides or their complementary or oligonucleotides with reverse or reverse complementary sequence or a combination thereof and the derived RNA or derivatives thereof, each of which specifically bind to DNA coding for 16S rRNA genes or gene fragments or derived thereof, the oligonucleotides comprising the following nucleotide sequences:
SEQ ID No. 1, 2, 3.SEQ ID No. 1, 2, 3.
2. Oligonukleotide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Oligonukleotid ist, welches unter stringenten Bedingungen, insbesondere 62, 4,5 mM MgCl2 unter TaqMan-PCR-Bedingungen mit einem der Oligonukleotide hybridisiert.2. Oligonucleotides according to claim 1, characterized in that the derivative is an oligonucleotide which hybridizes under stringent conditions, in particular 62, 4.5 mM MgCl 2 under TaqMan PCR conditions with one of the oligonucleotides.
3. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Nukleotid hinzugefügt, deletiert und/oder ausgetauscht wurde, wobei die spezifische Bindung an 16S-RNA-Gene oder -Genfragmente oder hiervon abgeleitete RNA beibehalten bleibt.3. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that at least one nucleotide has been added, deleted and / or exchanged, the specific binding on 16S RNA genes or gene fragments or RNA derived therefrom is retained.
4. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei, drei oder vier der Nukleotide, zusammenhängend oder einzeln, an einem oder beiden Enden oder im Innern der Oligonukleotide durch ein anderes Nukleotid ersetzt oder deletiert ' sind, wobei je die spezifische Bindung an 16S-rRNA-Gene oder -Genfragmente oder davon abgeleitete RNA beibehalten bleibt.4. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that at least two, three or four of the nucleotides contiguous or individually, are replaced or at one or both ends or in the interior of the oligonucleotides by another nucleotide deleted ', where each the specific binding to 16S rRNA genes or gene fragments or RNA derived therefrom is maintained.
5. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierung aufweist.5. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that it has a label.
6. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung, Digoxigenin- markierung, Peroxidasemarkierung oder durch Alkalische- Phosphatase-nachweisbare-Markierung ist .6. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that the label is a radioactive label, fluorescent label, biotin label, digoxigenin label, peroxidase label or by alkaline phosphatase-detectable label.
7. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Sonden, Vorwärtsprimer und/oder Rückwärtsprimer eingesetzt werden. 7. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that they are used as probes, forward primers and / or reverse primers.
8. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Sondenoligonukleotid am 5Λ-Ende mit einem Reporter- Farbstoff und am 3 -Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert ist.8. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that the probe oligonucleotide is marked at the 5 Λ end with a reporter dye and at the 3 end with a quencher dye.
9. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine Festphasenmatrix gebunden vorliegt.9. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that it is present bound to a solid phase matrix.
10. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die heterozyklischen Basen an ein Protein-Rückgrat gebunden vorliegen.10. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that the heterocyclic bases are bound to a protein backbone.
11. Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid durch eine Phosphorylierung, einen11. Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims, characterized in that the oligonucleotide by phosphorylation, one
Aminolinker oder einen Thiolinker modifiziert vorliegt.Amino linker or a thiolinker modified is present.
12. Verfahren zum spezifischen Nachweis oder zur Amplifikation von 16S-rDNA-Genen, Genfragmenten oder hiervon abgeleiteter RNA oder der Expression dieser Gene mit den nachfolgenden Schritten:12. A method for the specific detection or amplification of 16S rDNA genes, gene fragments or RNA derived therefrom or the expression of these genes, with the following steps:
Inkontaktbringen der DNA oder der RNA einer zu untersuchenden Probe mit zumindest einem derBringing the DNA or the RNA of a sample to be examined into contact with at least one of the
Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche; und Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotide mit der RNA oder DNA der Probe, um das Vorliegen 16S-rRNA- spezifischer DNA- und/oder RNA-Sequenzen aus Bakterien aufzuzeigen.Oligonucleotides according to one or more of the preceding claims; and Detection of the hybridization of the oligonucleotides with the RNA or DNA of the sample in order to show the presence of 16S-rRNA-specific DNA and / or RNA sequences from bacteria.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide als Primer und/oder Sonden in PCR- Verfahren oder als Sonden in Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden.13. The method according to claim 12, characterized in that the oligonucleotides are used as primers and / or probes in PCR processes or as probes in hybridization processes.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß entweder a) die zu untersuchende DNA in einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) in Kontakt gebracht wird mit einem der Oligonukleotide nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und im Verlauf der PCR- Amplifikation durch Verlängerung der Oligonukleotid- sequenzen (Primer-Sequenzen) ein charakteristisches DNA-Markerfragment entsteht und dieses Fragment nachgewiesen wird; oder b) zumindest eines der Oligonukleotide mit der zu untersuchenden DNA oder RNA zur Hybridisierung gebracht wird und das Produkt dieser Hybridisierungsreaktion nachgewiesen wird.14. The method according to one or more of the preceding claims, characterized in that either a) the DNA to be examined is brought into contact in a polymerase chain reaction (PCR) with one of the oligonucleotides according to one or more of the preceding claims and in the course of the PCR - Amplification by extension of the oligonucleotide sequences (primer sequences) creates a characteristic DNA marker fragment and this fragment is detected; or b) at least one of the oligonucleotides is brought to hybridization with the DNA or RNA to be examined and the product of this hybridization reaction is detected.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen unter stringenten Bedingungen erfolgt .15. The method according to one or more of the preceding claims, characterized in that that the contacting takes place under stringent conditions.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen bei einer TaqMan-PCR wie folgt definiert sind: 62°C, 4,5 mM MgCl2.16. The method according to claim 15, characterized in that the stringent conditions in a TaqMan PCR are defined as follows: 62 ° C, 4.5 mM MgCl 2 .
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder RNA in isolierter Form eingesetzt wird oder im biologischen Material in für die Hybridi- sierungsreaktion oder Polymerase-Ketten-Reaktion zugänglicher Form vorliegend eingesetzt wird.17. The method according to one or more of the preceding claims, characterized in that the DNA or RNA is used in isolated form or is used in the biological material in a form available for the hybridization reaction or polymerase chain reaction.
18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten; b) das Oligonukleotid an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden wird; c) das Oligonukleotid mittels einer DNA-Polymerase verlängert wird; d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs- und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR-Produkts zu erhalten; und e) das erhaltene PCR-Produkt nachgewiesen wird.18. The method according to one or more of the preceding claims, characterized in that a) the DNA to be examined is denatured in order to obtain single strands; b) the oligonucleotide is bound to the complementary single strand of the DNA to be examined; c) the oligonucleotide is extended by means of a DNA polymerase; d) the heat denaturation oligonucleotide binding and extension cycles are repeated to obtain a detectable amount of the PCR product; and e) the PCR product obtained is detected.
19.. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß a) die zu untersuchende DNA denaturiert wird, um Einzelstränge zu erhalten; b) das als Primer eingesetzte Oligonukleotid und das als Sonde eingesetzte Oligonukleotid, welches am 5Λ-Ende mit einem Reporter-Farbstoff, am 3λ-Ende mit einem Quencher-Farbstoff markiert und am 3Λ OH mit einem blockierenden Phosphat versehen ist, an den komplementären Einzelstrang der zu untersuchenden DNA gebunden werden; c) das Primeroligonukleotid mit einer DNA-Polymerase, bevorzugt einer TaqMan-Polymerase, verlängert wird; d) die Hitze-Denaturierungs-Oligonukleotid-Bindungs-und Verlängerungszyklen wiederholt werden, um eine nachweisbare Menge des PCR-Produkts zu erhalten; und e) das erhaltene PCR-Produkt quantitativ über die Veränderung der Fluoreszenz nachgewiesen wird.19 .. Method according to one or more of the preceding claims, characterized in that a) the DNA to be examined is denatured in order to obtain single strands; b) the oligonucleotide used as the primer and the oligonucleotide used as the probe, which is labeled with a reporter dye at the 5 Λ end, with a quencher dye at the 3 λ end and provided with a blocking phosphate at the 3 Λ OH the complementary single strand of the DNA to be examined is bound; c) the primer oligonucleotide is extended with a DNA polymerase, preferably a TaqMan polymerase; d) the heat denaturation oligonucleotide binding and extension cycles are repeated to obtain a detectable amount of the PCR product; and e) the PCR product obtained is detected quantitatively via the change in fluorescence.
20. Test-Kit zum Nachweis von Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest ein Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche enthält.20. Test kit for the detection of bacteria, characterized in that it contains at least one oligonucleotide according to one or more of the preceding claims.
21. Microarray, dadurch gekennzeichnet, daß er zumindest ein Oligonukleotid nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.21. Microarray, characterized in that it comprises at least one oligonucleotide according to one or more of the preceding claims.
22. Verwendung eines Oligonukleotids nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zum spezifischen qualitativen und/oder quantitativen Nachweis oder zur Amplifikation von 16S-rRNA-Genen oder -Genfragmenten oder hiervon abgeleiteter RNA von Bakterien oder der Transkription von 16S-rRNA-Genen in Bakterien.22. Use of an oligonucleotide according to one or more of the preceding claims for the specific qualitative and / or quantitative detection or for the amplification of 16S rRNA genes or gene fragments or thereof derived RNA from bacteria or the transcription of 16S rRNA genes in bacteria.
23. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 22 in einer TaqMan-PCR.23. Use of an oligonucleotide according to claim 22 in a TaqMan PCR.
24. Verwendung eines Oligonukleotids nach Anspruch 22 zur Quantifizierung bakterieller Kontamination. 24. Use of an oligonucleotide according to claim 22 for the quantification of bacterial contamination.
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