EP1222464A1 - Diagnostic des pathologies des cellules mononuclees du sang - Google Patents

Diagnostic des pathologies des cellules mononuclees du sang

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EP1222464A1
EP1222464A1 EP00967973A EP00967973A EP1222464A1 EP 1222464 A1 EP1222464 A1 EP 1222464A1 EP 00967973 A EP00967973 A EP 00967973A EP 00967973 A EP00967973 A EP 00967973A EP 1222464 A1 EP1222464 A1 EP 1222464A1
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EP
European Patent Office
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harp
cells
lymphocytes
polypeptide
derivative
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00967973A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Denis Barritault
Ammar Achour
José COURTY
Françoise BAUDOUIN
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57505—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the blood, e.g. leukaemia
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Definitions

  • the present invention relates to a method using the growth factor HARP to detect certain mononucleic cells of the blood, and thus useful for the diagnosis of proliferative pathologies of this type of cells, such as for example chronic lymphoid leukemias.
  • Lymphoproliferative syndromes include a set of diverse lymphoid pathologies characterized by an increase in the number of circulating lymphocytes or by morphological abnormalities of pathological lymphocytes.
  • the possibility of specific therapies for certain types of lymphoproliferative syndromes imperatively requires a precise diagnosis that clinical examination or cytological study does not always allow. However, there are currently no specific immunological markers for the various lymphoproliferative syndromes.
  • the diagnosis often remains difficult to make despite the efforts of recent years to arrive at a classification that can be used for all cases.
  • the diagnostic approach is therefore based on the analysis of a set of markers, some of which have proven their relevance in discriminating between the two major classes of lymphoproliferative syndromes, chronic lymphoid leukemia (CLL) and non-Hodgkin's lymphoma (NHL). .
  • CLL chronic lymphoid leukemia
  • NHL non-Hodgkin's lymphoma
  • markers are CD5, CD23, FMC7, CD22 and the surface munoglobulins.
  • CLLs The characteristic immunological phenotyping of CLLs, many of which are indolent, (CD5 +, CD23 +, FMC7-, weak CD20, weak CD22, weak surface immunoglobulins (Igs)) distinguishes them from another CD5 + lymphoproliferative syndrome much more aggressive, coat NHL (CD5 +, CD23-, FMC7 +, CD20 strong, Igs strong).
  • Hairy cell leukemia has the following typical phenotype: CD5-, strong CDllc, CD25 +, CD103 +, which differentiates it from other B lymphoid hemopathies CD5- as well as splenic NHL with villous lymphocytes, which is morphologically very close to it.
  • an unusual immunophenotype may be associated with trisomy 12 or mixed cell morphology (1).
  • angiogenic growth factors are known in the prior art, such as the factors HARP, MK, FGF-1, FGF-2, VEGF, HIV-tat, HIV2-tat, HGF, HB-EGF or even angiogenin.
  • HARP Heparin Affin Regulatory Peptide
  • PTN Pleiotrophin
  • HB-GAM heparin binding-gro th associated molecule
  • the growth factor HARP is a polypeptide of 168 amino acids containing a hydrophobic N-terminal motif of 32 amino acids corresponding to a signal peptide.
  • HARP is a protein secreted from 136 (in its short form) or 139 (in its long form) amino acids whose apparent molecular weight, determined in SDS-PAGE under reducing conditions, is 18 kDa.
  • HARP was originally isolated from the brains of newborn rats as a molecule inducing neuritic growth in vitro (5) suggesting that this polypeptide is involved in the maturation of neuronal cells (6).
  • HARP is able to stimulate the growth of fibroblastic, epithelial and endothelial cells in vi tro (8) (9). This mitogenic activity has since been confirmed by the use of recombinant proteins produced from eukaryotic expression systems.
  • HARP also induces in vitro the formation of pseudo-capillaries (10). In vivo, in different tissue models, the localization of HARP is notably associated with the endothelial cells of the blood capillaries (11).
  • HARP data suggest that this polypeptide plays a role in the complex mechanisms involved in angiogenesis and neoangiogenesis. tumor.
  • a great deal of research has been carried out in this direction in order to determine the involvement of HARP in tumor progression, in particular in hormone-dependent tumors such as the breast or the prostate.
  • Studies relating to the biological properties of HARP have been carried out by numerous laboratories (4) and despite controversial results, it appears to be accepted that HARP, like MK, is involved in the control of cell proliferation (4) (9) (12).
  • the purified recombinant human HARP protein hrHARP
  • HARP is therefore known and used for its angiogenic and neurotrophic properties.
  • mRNA corresponding to the HARP protein has been observed by the inventors in cells of blood vessels, both in endothelial cells and in smooth muscle cells, but also in smooth muscle cells of human mammary glands ( 11).
  • HARP is an angiogenic growth factor and that it is synthesized and localized in vascular endothelial cells has led the inventors to work on a potential function of HARP on blood cells. They therefore investigated whether HARP could bind to these blood cells, in particular the newly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the inventors have been able to show that HARP binds specifically to B cells characterized by the presence of the CD19 marker. The presence of HARP binding sites on circulating cells has never been described until now.
  • HARP receptors are very little known.
  • Kd 600pM
  • HARP binding sites have also been found in several cell types, including rat kidney cells, human mammary adenocarcinoma cells, human epidermal carcinoma cells, human hepatocarcinoma cells, neuroblasts mouse, and pheochromocytoma cells.
  • the growth factor HARP a molecule known as an angiogenic and neurogenic factor, stimulates the production of cytokines of inflammation (IL1, IL6, IL8, IFN gamma and TNF alpha) and increases the incorporation of tritiated thymidine.
  • IL1, IL6, IL8, IFN gamma and TNF alpha cytokines of inflammation
  • TNF alpha TNF alpha
  • HARP is able to bind specifically to B lymphocyte cells and thus allows the diagnosis of pathologies in which these cells are involved, and in which the number of B lymphocytes is considerably increased, such as chronic lymphoid leukemias. .
  • the invention therefore relates to a method for detecting B lymphocytes comprising the following steps:
  • a blood sample can be taken from healthy subjects or from subjects suffering from proliferative pathologies of the mononuclear blood cells. This sample is brought into contact with the HARP polypeptide under conditions favoring the peptide binding reaction.
  • the blood sample can be brought into contact with: the HARP polypeptide, ie a protein whose amino acid sequence corresponds to the amino acid sequence given in the literature ( 3, 5, 8),
  • HARP fragment either a protein or a peptide capable of binding to B lymphocytes and whose amino acid sequence corresponds to a part of the amino acid sequence represented in the annex under the number SEQ ID No. 1.
  • HARP derivative that is to say a peptide or a polypeptide capable of binding to B lymphocytes and whose amino acid sequence is close to the amino acid sequence identified in the appendix under the number SEQ ID No. 1 .
  • the term “HARP derivative” also means a protein capable of binding to B lymphocytes and comprising part or all of the amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence represented in the appendix under the associated SEQ ID No. 1 number. to another element of protein or non-protein nature.
  • this element allows the detection of the binding of the HARP derivative on the B lymphocytes.
  • This element can for example be a radioactive element, an amino acid sequence coding for an enzyme of which a chromogenic substrate can also be added in the medium. of reaction.
  • Another possibility is, for example, the covalent association of biotin with HARP, allowing the revelation of the HARP - B lymphocyte interaction by the addition of streptavidin.
  • the method according to the invention can be applied by bringing the HARP polypeptide, a fragment or a derivative of HARP into contact with a whole blood sample.
  • a step during which the mononuclear blood cells are separated from the whole blood sample is carried out before the cells are brought into contact with the HARP polypeptide, a fragment or a derivative of HARP. .
  • the method according to the invention can be carried out in such a way that the binding to the surface of the mononucleic cells of the blood of the HARP polypeptide, of a fragment or of a derivative of HARP, is directly detected.
  • Direct detection of the binding of HARP, a fragment or a derivative of HARP can be carried out using, for example, the radioactively labeled HARP polypeptide. It is also possible to use the HARP polypeptide coupled to an enzyme or to biotin, and in this case the binding of HARP to B lymphocytes will be detected by the addition of a corresponding chromogenic substrate or of streptavidin. It is also possible to react a blood sample with the HARP polypeptide, a fragment or derivative of HARP, then a fluorescent antibody specifically recognizing the HARP polypeptide, the fragment or the derivative of HARP used in the reaction. The binding of the anti-HARP antibody to the cells can then be detected by flow cytofluorimetry. The method according to the invention can be carried out in such a way that the binding to the surface of the mononucleic cells of the blood of the HARP polypeptide, of a fragment or of a derivative of HARP, is detected indirectly.
  • a blood sample is brought into contact with the HARP polypeptide, a fragment or a derivative of HARP, then is added an antibody specifically binding the HARP polypeptide, a fragment or derivative of HARP, finally a fluorescent antibody specifically binding the first antibody is added.
  • the binding of the anti-antibody to the cells can then be detected by flow cytofluorimetry.
  • the subject of the invention is in particular a method for diagnosing proliferative pathologies of mononuclear blood cells.
  • This method is characterized in that one detects B lymphocytes in a blood sample of a patient then in that one measures the rate of fixation of HARP on B lymphocytes and one compares this rate with a value control obtained in a healthy subject, so as to associate an increase in binding of HARP with an increase in B lymphocytes and with a proliferative pathology of the mononuclear blood cells.
  • the factor HARP is advantageously used for the diagnosis of proliferative pathologies of the mononuclear cells of the blood, like the chronic lymphoid leukemias.
  • Another aspect of the invention relates to an element of the mononuclear blood cells allowing the fixation of the HARP factor on said cells.
  • This element can in particular be a receptor binding, exclusively or not exclusively, the HARP factor.
  • FIG. 1 represents the binding of HARP to PBMCs originating from healthy individuals or suffering from chronic lymphoid leukemia.
  • the black bars correspond to cells from healthy blood donors, the white bars correspond to cells from patients with chronic lymphocytic leukemia.
  • FIG. 2 represents the conditioned biparametric fluorescence histograms, obtained using a flow cytometer on the acquisition window for lymphocytes of normal subjects, obtained from a cytogram representing the cell size as a function of the structure cellular.
  • a double CD19-PE marking on the ordinate against HARP-FITC on the abscissa in the absence of hrHARP.
  • b double marking CD2-PC5 in ordinates against
  • HARP-FITC on the abscissa in the absence of hrHARP.
  • c double CD19-PE marking on the ordinate against HARP-FITC on the abscissa in the presence of hrHARP.
  • d double marking CD2-PC5 on the ordinate against HARP-FITC on the abscissa in the presence of hr HARP.
  • FIG. 3 represents fluorescence histograms conditioned on lymphoid cells malignant (LLC): in the absence of recombinant human HARP (hrHARP) (fig.3a) and in the presence of hrHARP (fig.3b).
  • Example 1 Use of HARP as a marker for lymphocytes in patients with chronic lymphocytic leukemia.
  • the mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of normal subjects, blood donors, or of subjects carrying various hemopathies: 30 subjects suffering from CLL, 6 suffering from NHL B, 4 suffering from Sézary's diseases, 2 suffering from acute leukemias myeloids (LAM2 and LAM3) and 1 with chronic myeloid leukemia (CML).
  • the blood was taken from a Vacutainer tube containing EDTA.
  • the mononuclear cells were separated by Ficoll gradient, counted and adjusted to 10 6 cells per ml.
  • the HARP growth factor used was the recombinant human protein HARP (hrHARP) of 139 amino acids, supplied by the CRRET laboratory (ESA CNRS 7053) at Cruteil united Paris 12 (France).
  • the anti-HARP (goat anti-HARP human immunoglobulin) antibody comes from the company R&D Systems Minneapolis (Minesota USA) was used at the final dilution of 1/250.
  • An anti goat IgG antibody coupled to FITC from Caltag, Burlingame, CA, USA
  • the anti-HARP was replaced by goat serum (from the company Jackson, West Grove, PE, USA).
  • CD19-PE CD2-PC5, CD10-FITC, CD45Ra-FITC, CD45Ro-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3- FITC, CD16 / 56-PE , CD25-FITC (all of these antibodies are from Beckman Coulter-Immunotech, Hialeah, FL, USA).
  • the mononuclear cells were previously incubated with recombinant HARP (hrHARP) at a concentration of 1 ⁇ g / ml for 1 h at room temperature, then washed, before being labeled according to the previous technique.
  • hrHARP recombinant HARP
  • the effect of hrHARP on normal mononuclear cells after 5 days of culture was studied in a humid atmosphere at 37 ° C. enriched with 5% CO 2, in the absence and in the presence of 1 ⁇ g / ml of hrHARP.
  • the cells were labeled with anti-CD19, CD2, CD4, CD8 monoclonal antibodies as well as with anti-HARP.
  • the cytofluorimeter reading was performed using a 488 nm laser beam.
  • An acquisition window was drawn around the lymphocytes on a biparametric histogram representing the cell size according to a linear mode as a function of the logarithm of the particle size. Histograms representing the intensity of fluorescence in logarithmic mode as a function of the number of cells were thus obtained from this selected population of cells. Results were acquired in percentages of cells
  • Pleiotrophin stimulates fibroblasts and endothelial and epithelial cells and is expressed in human cancer. J. Biol. Chem. 267: 25889).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé utilisant le facteur de croissance HARP pour détecter les cellules mononucléées du sang, permettant ainsi le diagnostic des pathologies prolifératives de ce type de cellules, comme les leucémies lymphoïdes chroniques. Le procédé de détection des lymphocytes B comprend, d'une part, la mise en contact d'un échantillon sanguin et du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP et, d'autre part, la détection de la fixation à la surface des lymphocytes B du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP. Le procédé de diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucléées du sang comprend en outre la comparaison des taux de fixation de HARP sur les lymphocytes B d'un échantillon provenant d'un patient et sur les lymphocytes B d'un échantillon provenant d'un sujet sain.

Description

DIAGNOSTIC DES PATHOLOGIES DES CELLULES MONONUCLÉÉES DU SANG.
La présente invention concerne un procédé utilisant le facteur de croissance HARP pour détecter certaines cellules mononuclees du sang, et utile ainsi pour le diagnostic des pathologies prolifératives de ce type de cellules, comme par exemple les leucémies lymphoïdes chroniques . Les syndromes lymphoprolifératifs regroupent un ensemble de pathologies lymphoïdes diverses caractérisées par une augmentation du nombre de lymphocytes circulants ou par des anomalies morphologiques des lymphocytes pathologiques. La possibilité de thérapeutiques spécifiques pour certains types de syndromes lymphoprolifératifs impose impérativement un diagnostic précis que l'examen clinique ou l'étude cytologique ne permet pas toujours. Or, il n'existe pas à l'heure actuelle de marqueurs immunologiques spécifiques des différents syndromes lymphoprolifératifs . Le diagnostic reste bien souvent difficile à faire malgré les efforts de ces dernières années pour parvenir à une classification utilisable pour tous les cas. La démarche diagnostique repose donc sur l'analyse d'un ensemble de marqueurs dont certains ont prouvé leur pertinence dans la discrimination entre les deux grandes classes de syndromes lymphoprolifératifs que sont les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) et les lymphomes malins non hodgkiniens (LNH) . Ces marqueurs sont les CD5 , CD23, FMC7 , CD22 et les i munoglobulines de surface. Le phénotypage immunologique caractéristique des LLC, dont beaucoup d'entre elles sont indolentes, (CD5+, CD23+, FMC7-, CD20 faible, CD22 faible, immunoglobulines de surface (Igs) faibles) les distingue d'un autre syndrome lymphoprolifératif B CD5+ beaucoup plus agressif, le LNH du manteau (CD5+, CD23-, FMC7+, CD20 fort, Igs fortes) .
La leucémie à tricholeucocyte présente quant à elle le phénotypique typique suivant : CD5-, CDllc fort, CD25+, CD103+, qui la différencie des autres hemopathies lymphoïdes B CD5- ainsi que du LNH splénique à lymphocytes villeux, qui lui est morphologiquement très proche. En outre, chez les patients porteurs de LLC, un immunophénotype peu typique peut être associé à une trisomie 12 ou à une morphologie des cellules mixtes (1) . Ces marqueurs ont finalement permis l'établissement de scores, somme de points attribués en fonction de leur expression, en perpétuelle observation (2).
Malgré ces progrès et la confrontation avec les différents aspects, cliniques, cytologiques , histologiques et cytogénétiques , bien des cas restent encore litigieux. De nombreux travaux de recherche sont en cours pour découvrir de nouvelles molécules qui permettraient de mieux discriminer les LLC, qui sont les leucémies les plus fréquentes de notre monde occidental, des autres syndromes lymphoprolifératifs plus agressifs.
On connaît dans 1 ' art antérieur de nombreux facteurs de croissance angiogéniques comme les facteurs HARP, MK, FGF-1, FGF-2 , VEGF, HIVl-tat, HIV2-tat, HGF, HB- EGF ou encore 1 ' angiogenine . HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) , aussi appelé PTN ( Pleiotrophin) ou encore HB-GAM (heparin binding-gro th associated molécule) constitue avec MK
(Midkine) une famille de ces facteurs de croissance/différenciation structurellement apparentés qui se lient à l'héparine, présentant 50% d'homologie en acides aminés (3 ) (4) .
Le facteur de croissance HARP est un polypeptide de 168 acides aminés contenant un motif N- terminal hydrophobe de 32 acides aminés correspondant à un peptide signal. Sous sa forme mature, HARP est une protéine sécrétée de 136 (sous sa forme courte) ou 139 (sous sa forme longue) acides aminés dont le poids moléculaire apparent, déterminé en SDS-PAGE en conditions réductrices, est de 18 kDa.
Initialement, HARP a été isolé à partir de cerveaux de rats nouveaux nés comme une molécule induisant in vi tro une croissance neuritique (5) suggérant que ce polypeptide est impliqué dans la maturation des cellules neuronales ( 6) .
Plus tard, des études ont montré que ce polypeptide était aussi présent dans des tissus non- neuronaux, dont le cœur (7), l'utérus (8), les cartilages (9) et les extraits d'os (10), démontrant que la fonction de HARP n'est pas limitée à une activité promotrice d'une croissance neuritique comme précédemment rapporté (5).
HARP est capable de stimuler la croissance de cellules fibroblastiques , épithéliales et endothéliales in vi tro (8) (9) . Cette activité mitogène a été depuis confirmée par l'utilisation de protéines recombinantes produites à partir de systèmes d'expression eucaryote
(9) (10) (11) . HARP induit également in vi tro la formation de pseudo-capillaires (10). In vivo , dans différents modèles tissulaires, la localisation de HARP est notamment associée aux cellules endothéliales des capillaires sanguins (11) .
A l'heure actuelle, les données concernant HARP suggèrent que ce polypeptide joue un rôle dans les mécanismes complexes impliqués dans 1 ' angiogénèse et la néoangiogénèse tumorale. De nombreuses recherches ont été effectuées dans cette voie afin de déterminer l'implication de HARP dans la progression tumorale, notamment dans les tumeurs hormono- dépendantes comme le sein ou la prostate. Des études relatives aux propriétés biologiques de HARP ont été effectuées par de nombreux laboratoires (4) et en dépit de résultats controversés, il apparaît admis que HARP, tout comme MK, est impliqué dans le contrôle de la prolifération cellulaire (4) (9) (12) . De plus, il a été démontré que la protéine HARP humaine recombinante (hrHARP) purifiée est mitogénique pour les cellules endothéliales (9) (10) et exerce in vi tro une activité angiogénique (10).
HARP est donc connue et utilisée pour ses propriétés angiogéniques et neurotrophiques .
La présence d'ARNm correspondant à la protéine HARP a été observée par les inventeurs dans les cellules des vaisseaux sanguins, à la fois dans les cellules endothéliales et les cellules des muscles lisses, mais aussi dans les cellules des muscles lisses des glandes mammaires humaines (11) .
Les données rapportant que HARP est un facteur de croissance angiogénique et qu'il est synthétisé et localisé dans les cellules endothéliales vasculaires ont conduit les inventeurs à travailler sur une fonction potentielle de HARP sur les cellules du sang. Ils ont donc recherché si HARP pouvait se fixer sur ces cellules du sang notamment les cellules mononucléées humaines du sang périphérique (PBMC) fraîchement isolées. Les inventeurs ont pu montrer que HARP se fixait spécifiquement sur les cellules B caractérisées par la présence du marqueur CD19. La présence de sites de fixation de HARP sur les cellules circulantes n'a jamais été décrite jusqu'à maintenant.
A ce jour, les récepteurs de HARP sont très peu connus. La présence de site de liaison de très forte affinité (Kd = 600pM) avec HARP dans les cellules NIH 3T3 a déjà été rapporté (13). Ces sites de liaison de HARP ont aussi été retrouvés dans plusieurs types cellulaires, incluant les cellules de rein de rats, cellules de 1 ' adénocarcinome mammaire d'homme, cellules du carcinome épider ique d'homme, cellules de 1 ' hépatocarcinome humain, neuroblastes de souris, et cellules du phéochromocytome .
Les inventeurs ont récemment montré que le facteur de croissance HARP, molécule connue comme facteur angiogénique et neurogénique , stimule la production de cytokines de l'inflammation (ILl, IL6, IL8, IFN gamma et TNF alpha) et augmente l'incorporation de thymidine tritiée par les cellules mononucleees du sang circulant de sujets normaux après 7 jours de culture, et ceci d'autant plus fortement que les cellules sont quiescentes au départ. C'est à la suite de ces constatations que les inventeurs se sont intéressés aux relations de cette molécule avec les cellules hématopoïétiques , et plus spécialement sur les lymphocytes de sujets normaux et de patients porteurs d'hémopathies malignes.
Les inventeurs ont maintenant montré que HARP est capable de se fixer spécifiquement sur les cellules lymphocytaires B et permett ainsi le diagnostic des pathologies dans lesquelles ces cellules sont impliquées, et au cours desquelles le nombre de lymphocytes B est considérablement augmenté, comme les leucémies lymphoïdes chroniques .
L'invention se rapporte donc à un procédé de détection des lymphocytes B comprenant les étapes suivantes :
- la mise en contact d'un échantillon sanguin d'un sujet, ou d'une fraction de cet échantillon sanguin, avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP - la détection de la fixation à la surface des lymphocytes B du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP par tout moyen approprié.
Un échantillon sanguin peut être prélevé sur des sujets sains ou sur des sujets atteints de pathologies prolifératives des cellules mononucleees du sang. Cet échantillon est mis en contact avec le polypeptide HARP dans des conditions favorisant la réaction de fixation du peptide. Dans le procédé de détection selon l'invention, l'échantillon sanguin peut être mis en contact avec : le polypeptide HARP, c'est à dire une protéine dont la séquence en acides aminés répond à la séquence en acides aminés donnée dans la littérature (3, 5, 8) ,
- un fragment de HARP, soit une protéine ou un peptide capable de se fixer sur les lymphocytes B et dont la séquence en acides aminés répond à une partie de la séquence en acides aminés représentée en annexe sous le numéro SEQ ID N°l.
- un dérivé de HARP, c'est à dire un peptide ou un polypeptide capable de se fixer sur les lymphocytes B et dont la séquence en acides aminés est proche de la séquence en acides aminés identifiée en annexe sous le numéro SEQ ID N°l. Par dérivé de HARP, on entend également une protéine capable de se fixer sur les lymphocytes B et comprenant une partie ou la totalité de la séquence en acides aminés répondant à la séquence en acides aminés représentée en annexe sous le numéro SEQ ID N°l associée à un autre élément de nature protéique ou non protéique. Avantageusement, cet élément permet la détection de la fixation du dérivé de HARP sur les lymphocytes B. Cet élément peut par exemple être un élément radioactif, une séquence en acides aminés codant pour une enzyme dont un substrat chromogène peut aussi être ajouté dans le milieu de réaction. Une autre possibilité est, par exemple, l'association covalente de biotine à HARP, permettant la révélation de l'interaction HARP - lymphocytes B par l'ajout de streptavidine .
Le procédé selon l'invention peut être appliqué en mettant en contact le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP avec un échantillon de sang total.
Selon une autre possibilité de réalisation du procédé, une étape au cours de laquelle les cellules sanguines mononucleees sont séparées de l'échantillon de sang total est effectuée préalablement à la mise en contact des cellules avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP.
Le procédé selon 1 ' invention peut être mis en oeuvre de telle façon que la fixation à la surface des cellules mononucleees du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée directement.
La détection directe de la fixation de HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP peut être réalisée en utilisant, par exemple, le polypeptide HARP marqué radioactivement . Il est également possible d'utiliser le polypeptide HARP couplé à une enzyme ou à de la biotine, et dans ce cas la fixation de HARP aux lymphocytes B sera détectée par l'ajout d'un substrat chromogène correspondant ou de la streptavidine. Il est aussi possible de faire réagir un échantillon sanguin avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, puis un anticorps fluorescent reconnaissant spécifiquement le polypeptide HARP, le fragment ou le dérivé de HARP mis en œuvre dans la réaction. La fixation de l'anticorps anti-HARP sur les cellules peut ensuite être détectée par cytofluorimétrie en flux. Le procédé selon 1 ' invention peut être mis en oeuvre de telle façon que la fixation à la surface des cellules mononucleees du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée indirectement.
Dans l'une des mises en œuvre du procédé selon 1 ' invention pour la détection indirecte de la fixation de HARP sur les lymphocytes B, un échantillon sanguin est mis en contact avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, puis est ajouté un anticorps fixant spécifiquement le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP, enfin un anticorps fluorescent liant spécifiquement le premier anticorps est ajouté. La fixation de l'anticorps anti-anticorps sur les cellules peut ensuite être détectée par cytofluorimétrie en flux.
L'invention a en particulier pour objet un procédé de diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucleees du sang. Ce procédé est caractérisé en ce que 1 ' on détecte les lymphocytes B dans un échantillon sanguin d'un patient puis en ce que l'on mesure le taux de fixation de HARP sur les lymphocytes B et l'on compare ce taux à une valeur témoin obtenue chez un sujet sain, de façon à associer une augmentation de fixation de HARP à une augmentation des lymphocytes B et à une pathologie proliferative des cellules mononucleees du sang.
Selon l'une des applications possibles de l'invention, le facteur HARP est avantageusement utilisé pour le diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucleees du sang, comme les leucémies lymphoïdes chroniques .
Un autre aspect de 1 ' invention concerne un élément des cellules mononucleees du sang permettant la fixation du facteur HARP sur lesdites cellules. Cet élément peut notamment être un récepteur liant, exclusivement ou non exclusivement, le facteur HARP.
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtront des exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 représente la fixation de HARP sur des PBMCs issus d'individus sains ou atteints de leucémie lymphoïde chronique. Les barres noires correspondent aux cellules issues d'individus sains donneur de sang, les barres blanches correspondent aux cellules issues de patients souffrant de leucémie lymphoïde chronique.
La figure 2 représente les histogrammes de fluorescence biparamétriques conditionnés, obtenus à l'aide d'un cytomètre de flux sur la fenêtre d'acquisition des lymphocytes de sujets normaux, obtenue à partir d'un cytogramme représentant la taille cellulaire en fonction de la structure cellulaire. a =double marquage CD19-PE en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en absence de hrHARP. b =double marquage CD2-PC5 en ordonnées contre
HARP-FITC en abscisses en absence de hrHARP. c= double marquage CD19-PE en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en présence de hrHARP. d= double marquage CD2-PC5 en ordonnées contre HARP-FITC en abscisses en présence de hr HARP.
La figure 3 représente des histogrammes de fluorescence conditionnés sur des cellules lymphoïdes malignes (LLC) : en l'absence de HARP humain recombinant (hrHARP) (fig.3a) et en présence de hrHARP (fig.3b) .
Exemple 1 : Utilisation de HARP comme marqueur des lymphocytes des patients présentant une leucémie lymphoïde chronique .
Les cellules mononucleees ont été isolées du sang périphérique de sujets normaux, donneurs de sang, ou de sujets porteurs d'hémopathies variées : 30 sujets atteints de LLC, 6 atteints de LNH B, 4 atteints de maladies de Sézary, 2 atteints de leucémies aiguës myeloïdes (LAM2 et LAM3 ) et 1 atteint de leucémie myéloïde chronique (LMC) . Le sang a été prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les cellules mononucleees ont été séparées par gradient de Ficoll, comptées et ajustées à IO6 cellules par ml. Le facteur de croissance HARP utilisé a été la protéine humaine recombinante HARP (hrHARP) de 139 acides aminés, fournie par le laboratoire CRRET (ESA CNRS 7053) à Créteil Université Paris 12 (France) . L'anticorps anti-HARP ( Immunoglobuline de chèvre anti-HARP humain) provient de la société R&D Systems Minneapolis (Minesota USA) a été utilisé à la dilution finale de 1/250. Un anticorps anti IgG de chèvre couplé au FITC (provenant de Caltag, Burlingame, CA, USA) à la dilution de 1/50 a été utilisé comme anticorps secondaire. Pour réaliser le contrôle négatif, l' anti-HARP a été remplacé par du sérum de chèvre (provenant de la société Jackson, West Grove, PE, USA) .
D'autres anticorps ont été utilisés pour identifier les populations cellulaires : CD19-PE, CD2-PC5, CD10-FITC, CD45Ra-FITC, CD45Ro-FITC, CD4-PE, CD8-ECD, CD3- FITC, CD16/56-PE, CD25-FITC (tous ces anticorps proviennent de la société Beckman Coulter-Immunotech, Hialeah, FL, USA) .
Afin de mesurer le contenu endogène en facteur de croissance HARP des cellules circulantes, celles-ci ont été séparées sur ficoll puis lavées en PBS-0.1% BSA. Ces cellules ont été ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-HARP pendant 30 minutes à température ambiante, puis lavées en PBS-0.1% BSA et remises en incubation avec l'anticorps secondaire pendant 30 minutes. Après lavage et fixation en formol 1% les cellules ont été analysées au cytofluorimètre XL (Beck an-Coulter Hialeah, FL, USA) .
Afin de rechercher le ou les sites de fixation cellulaire de HARP, les cellules mononucleees ont été préalablement incubées avec le HARP recombinant (hrHARP) à la concentration de 1 μg/ml pendant Ih à température ambiante, puis lavées, avant d'être marquées selon la technique précédente. L'effet de hrHARP sur des cellules mononucleees normales après 5 jours de culture a été étudié en atmosphère humide à 37 °C enrichie avec 5% de C02 , en l'absence et en présence de 1 μg/ml de hrHARP. Une fois lavées, les cellules ont été marquées à l'aide d'anticorps monoclonaux anti CD19, CD2 , CD4 , CD8 ainsi qu'avec l' anti- HARP. La lecture au cytofluorimètre a été réalisée à l'aide d'un rayon laser de 488 nm. Une fenêtre d'acquisition a été dessinée autour des lymphocytes sur un histogramme biparamétrique représentant la taille cellulaire selon un mode linéaire en fonction du logarithme de la granulométrie. Des histogrammes représentant l'intensité de fluorescence en mode logarithmique en fonction du nombre de cellules ont été ainsi obtenus à partir de cette population de cellules sélectionnée. Les résultats ont été acquis en pourcentages de cellules
Les cellules mononucleees ont été analysées positives pour l'anticorps concerné. Des histogrammes biparamétriques représentant l'expression de fluorescence de deux antigènes différents marqués par des fluorochromes différents ont permis d'analyser les doubles marquages CD19/HARP.
Les résultats sur la recherche de la présence de HARP endogène ont été négatifs et aucune expression directe de HARP n'a pu être mise en évidence sur les lymphocytes des 10 sujets normaux testés, ni des cellules lymphoïdes et myeloïdes malignes testées, après séparation des cellules mononucleees sur gradient de ficoll. La recherche de sites de fixation cellulaire de HARP a permis de montrer que sur les lymphocytes B de sujets normaux une fixation HARP. Il est à noter que pour 2 sujets sur les 10 analysés, des cellules CD2 positives sont également capables de fixer hrHARP sans que l'on puisse faire une distinction entre les cellules T et NK Ainsi les histogrammes de fluorescence biparamétriques conditionnés sur la fenêtre d'acquisition des lymphocytes de sujets normaux obtenue à partir d'un cytogramme représentant la taille cellulaire en fonction de la structure cellulaire sont présentés dans la figure 2. Un double marquage au CD19-PE contre HARP-FITC (fig2a) et CD2-PC5 contre HARP- FITC (fig.2b) en absence de rhHARP d'une part et les mêmes marquages fig.2c et fig.2d en présence de hrHARP d'autre part montrent une fixation de HARP associée au CD19 chez les sujets sains.
Chez les malades atteints de certaines LLC ou de certains LNH, il a été observé une fixation de HARP sur les lymphocytes. Ceci a été montré par des triples marquages entre un marqueur des cellules lymphoïdes B, le CD19, un marqueur pan T, le CD2 et le HARP. 100% des cellules lymphoïdes B fixent le HARP tandis que les cellules CD2 positives ne le fixent pas. En outre, il semblerait que les cellules exprimant le CD10 ne peuvent fixer le HARP dans nos conditions d'étude. Ces résultats sont présentés dans la figure 3, ce sont des histogrammes de fluorescence conditionnés sur des cellules lymphoïdes malignes : (fig.3a) en l'absence de hrHARP et (fig.3b) en présence de hrHARP. Par ailleurs les cellules myeloïdes pathologiques des deux LAM et de la LMC ainsi que les cellules lymphomateuses de Sézary de phénotype T n'ont pas montré de fixation de hrHARP.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de détection des lymphocytes B caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la mise en contact d'un échantillon sanguin d'un sujet, ou d'une fraction de cet échantillon sanguin, avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP
- la détection de la fixation à la surface des lymphocytes B du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP par tout moyen approprié.
2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP est mis en contact avec un échantillon de sang total.
3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle les cellules sanguines mononucleees sont séparées des autres composants de l'échantillon sanguin préalablement à la mise en contact desdites cellules avec le polypeptide HARP, un fragment ou un dérivé de HARP .
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fixation à la surface des cellules mononucleees du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée directement.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fixation à la surface des cellules mononucleees du sang du polypeptide HARP, d'un fragment ou d'un dérivé de HARP, est détectée indirectement.
6) Procédé de diagnostic des pathologies prol ifératives des cellules mononucleees du sang caractérisé en ce que l'on détecte les lymphocytes B dans un échantillon sanguin d'un patient selon l'une des revendications 1 à 5 puis en ce que l'on mesure le taux de fixation de HARP sur les lymphocytes B et l'on compare ce taux à une valeur témoin obtenue chez un sujet sain, de façon à associer une augmentation de fixation de HARP à une augmentation des lymphocytes B et à une pathologie proliferative des cellules mononucleees du sang.
8) Utilisation du facteur HARP pour le diagnostic des pathologies prolifératives des cellules mononucleees du sang, comme les leucémies lymphoïdes chroniques .
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