EP1212437A2 - Procede de modification genetique de lactobacillus delbrueckii - Google Patents

Procede de modification genetique de lactobacillus delbrueckii

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Publication number
EP1212437A2
EP1212437A2 EP00964297A EP00964297A EP1212437A2 EP 1212437 A2 EP1212437 A2 EP 1212437A2 EP 00964297 A EP00964297 A EP 00964297A EP 00964297 A EP00964297 A EP 00964297A EP 1212437 A2 EP1212437 A2 EP 1212437A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
plasmid
bacteria
chromosome
delbrueckii
vector
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00964297A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pascale Serror
Golnar Ilami-Nespoulous
Maarten Van De Guchte
Christian Chervaux
Christophe Fremaux
Laurent Benbadis
Emmanuelle Maguin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique
Rhodia Food SAS
Original Assignee
Gervais Danone SA
Institut National de la Recherche Agronomique
Rhodia Food SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gervais Danone SA, Institut National de la Recherche Agronomique, Rhodia Food SAS filed Critical Gervais Danone SA
Publication of EP1212437A2 publication Critical patent/EP1212437A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome

Definitions

  • the present invention relates to the genetic modification of Lactobacillus delbrueckii.
  • Lactic acid bacteria are widely used in the food industry, particularly for the manufacture of various fermented products; moreover, their harmlessness made recommend their use for the production by genetic engineering of various substances intended in particular for a therapeutic use.
  • lactic acid bacteria makes it possible to adapt their characteristics according to the intended use, whether by the introduction and expression of foreign DNA, or by overexpression or, on the contrary, the inactivation of genes naturally present in said bacteria.
  • bacteria For a modification to be stable, it must be integrated into the bacterial chromosome.
  • the desired modification is inserted into a non-replicating plasmid carrying a selection marker.
  • the vector thus obtained is introduced into the bacteria; the bacteria expressing the selection marker are then recovered, which are those which have integrated the vector into their chromosome.
  • the modification results from 2 low frequency events: 1) the introduction of the plasmid into the bacteria; 2) integration of said plasmid into the chromosome.
  • Lactobacillus delbrueckii which notably comprises the subspecies Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis, and Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii.
  • delbrueckii is described in the prior art: it is the conjugative plasmid pAM ⁇ 1, described as non-replicative in Lb. delbrueckii.
  • Application EP 0603416 in the name of MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD reports the use of this plasmid to integrate a modification into the Lb chromosome.
  • delbrueckii. a selection marker (resistance to erythromycin) has been inserted into a fragment homologous to a region of the Lb chromosome. delbrueckii, and the whole was introduced into the plasmid pAM ⁇ 1.
  • the integrative plasmid thus constructed was multiplied in Lactococcus lactis, then transferred by conjugation to Lb. delbrueckii, - the transconjugants / integrants are then selected on the basis of the resistance to erythromycin resulting from the integration, by homologous recombination, of the insert of the plasmid into the chromosomal DNA.
  • conditional plasmids as vectors.
  • a vector for example a plasmid, of which at least one of the functions of replication, of partition, or of stability is only active under certain conditions (for example temperature, pH, concentration of mineral salts, presence in the culture medium of a particular compound, etc.) or the fact that one or more of the proteins involved in this function contain (s) one or more mutations making the activity conditional, either because one or more of the proteins involved in this function are placed under the control of an inducible promoter.
  • the modification can thus be carried out in two stages: in the first, the plasmid is introduced at permissive temperature into the bacteria, which allows a first selection of those in which it is established; in the second, these bacteria are cultivated at non-permissive temperature for the replication of the plasmid, which makes it possible to select those in which the introduced sequences are integrated into the chromosome.
  • PCT Application WO 93/18164 describes the use of these plasmids in various species of lactic acid bacteria, including Lb. delbruckii subsp. bulgaricus.
  • the subject of the present invention is therefore the use of a plasmid comprising the theta replication system of pIP501 or a related replication system, as a conditional, heat-sensitive, integration vector enabling a modification of the genetic information of a bacteria of the species Lb. delbrueckii. This modification is introduced into the chromosome via one or more homologous transposition and / or recombination events.
  • replication system related to the theta replication system of pIP501 any theta replication system having the functional characteristics, and in particular the thermosensitivity in Lb delbrueckii, of pIP501.
  • the percentage identity of a sequence with a reference sequence is defined here as the percentage of residues of this sequence which are identical with those of the reference sequence on an alignment of the 2 sequences ensuring maximum correspondence between the positions of the residues .
  • the present invention relates in particular to a method for modifying the genetic information carried by the chromosome of a bacterium of the species Lb delbrueckii, characterized in that it comprises: a) the construction of an integrative plasmid, by insertion of at least one DNA sequence capable of integrating into the bacterial chromosome, into a conditional vector comprising the thIP replication system of pIP501 or a related replication system, said vector further carrying at least one selection marker ; b) the introduction of the plasmid into said bacterium and the multiplication of the latter, in permissive conditions for the replication and the maintenance in stable form of said plasmid; c) the multiplication of bacteria expressing at least one plasmid selection marker at the end of step b), under non-permissive conditions for replication and / or maintenance in stable form of the plasmid; and optionally, d) recovering the bacteria expressing at least one selection marker originating from the plasmid, at the end of step c).
  • the step of multiplying the bacteria under permissive conditions can be omitted for the replication and the maintenance of the plasmid in stable form; in this case, after the introduction of the plasmid into the bacterium, the multiplication of the latter is carried out directly under non-permissive conditions for the replication and / or maintenance in stable form of the plasmid.
  • the method according to the invention further comprises the following steps: e) excision of the sequences originating from the vector, by multiplication of the bacteria expressing, at the end of step c), at least one marker for selection from the plasmid, and advantageously, f) elimination of the excised DNA, by multiplication of the bacteria obtained in step e) under non-permissive conditions for replication and maintenance of the vector in stable plasmid form.
  • Conditional vectors including the thIP replication system of pIP501, or a related system, used in Lb. delbrueckii for setting work of the present invention are thermosensitive plasmids capable of replicating and maintaining themselves at 35-37 ° C in this bacterial species, and whose replication and / or maintenance in stable form are inhibited from approximately 42 ° C.
  • These plasmids also carry at least one selection marker, namely a gene which can be expressed in Lb. delbrueckii and whose expression confers on the bacteria harboring a distinctive phenotype allowing their selection. It may be, for example, a resistance marker, conferring a character of resistance to a substance usually toxic to the bacterium, for example an antibiotic, or else an auxotrophy marker conferring the ability to grow in it. lack of a nutrient usually essential for the bacteria. The bacteria expressing these markers are for example easily selected by their survival on a selective medium, namely in the presence of said toxic substance or in the absence of said nutrient.
  • the bacteria in which the plasmid is present can be selected on the basis of the expression of a selection marker originating from the plasmid.
  • the bacteria in which the DNA of the plasmid has been integrated into the chromosome can be selected on the basis of the expression of a selection marker coming from the plasmid constructed at 1 'step a).
  • Another possibility of selection at the end of step c) consists in using a property of the strain which results from the integration of the plasmid and / or from the excision of the vector sequences.
  • conditional plasmid comprising a selection marker M (for example a resistance marker), and a DNA sequence capable of integrating by homologous recombination into a bacterial gene X, said gene X being essential under certain conditions for the bacterium (for example a gene essential for its growth on a given medium), the integration of the plasmid inactivating the gene X, and the excision of the sequences of the vector restoring its activity.
  • a selection marker M for example a resistance marker
  • the bacteria in which the plasmid DNA has been integrated can be selected on the basis of the expression of the selection marker M, under conditions in which the X gene is not essential, and the bacteria in which the sequences of the integrated vector have been excised can be selected, under conditions in which the X gene is essential, on the basis of the restoration of its activity.
  • This selection mode also also makes it possible to select, in a single step, bacteria in which the integration of the plasmid DNA and the excision of the vector sequences have taken place; in this case, the bacteria are cultured directly under conditions in which the X gene is essential, and which are also selective for the M marker.
  • the bacteria selected will be those in which the integration of the plasmid and the excision of the vector sequences (including including marker M) restored the activity of the X gene.
  • DNA sequences capable of integrating into the chromosome of a bacteria of the species capable of integrating into the chromosome of a bacteria of the species
  • Lb. delbrueckii include in particular: sequences chosen on the basis of their homology with a portion of the chromosome where one wishes to introduce a modification, that is to say having sufficient homology with this portion of the chromosome to be able to recombine with it; transposable sequences, in particular transposons or insertion sequences (IS); such sequences can to be inserted at random or with a certain specificity in the bacterial chromosome.
  • the modifications which it is wished to integrate into the bacterial chromosome can be made by the simple integration of these sequences, which can for example lead to the inactivation of a gene inside which it takes place. It is also possible to use these sequences to integrate a DNA fragment, in particular a gene of interest of heterologous origin, or a DNA fragment of Lb. delbrueckii previously modified, in the bacterial chromosome.
  • step a) of the method according to the invention in a conditional vector in Lb. delbrueckii, comprising the thIP replication system of pIP501 or a related system, as defined above. Integration takes place by recombination (simple crossmg-over) between the fragment of cloned chromosomal DNA and the homologous region of the bacterial chromosome.
  • sequences which can be integrated by homologous recombination makes it possible in particular: to inactivate one (or more) bacterial gene (s), - to modify the expression of the genes and / or the activity of the coded products by these genes; - to introduce, in a stable way, new functions in the chromosome, - to study and use the expression of genes in si tu; - to mutate the chromosome by integration via random chromosomal fragments;
  • the transposable sequence will be inserted into the plasmid; integration into the chromosome makes it possible to carry out the modification, thus to obtain mutants having interesting characteristics and to characterize more easily the mutated gene (s).
  • the structure transposed into the chromosome can be made up of the vector sequences framed on either side by a copy of the transposable sequence.
  • transposable sequences can come from bacteria belonging to the Lb species. delbrueckii, or come from other bacterial species, especially other lactic acid bacteria. They can be transposons or insertion sequences.
  • Functional transposable sequences in Lb. delbrueckii can be identified by inserting a transposable sequence to be tested (transposon or insertion sequence), in a vector with conditional replication in Lb. delbrueckii comprising the thIP replication system of pIP501 or a related system, as defined above, by implementing steps b) and c) of the process according to the invention, and by looking for the presence of transposants in the from these steps.
  • the inventors have thus demonstrated 2 functional insertion sequences in Lb. delbrueckii.
  • the present invention also relates to the use of one or other of these sequences to modify the Lb chromosome. delbrueckii.
  • the present invention also relates to any integrative plasmid resulting from the insertion of one of these 2 sequences into a vector with conditional replication in Lb. delbrueckii, and in particular in a vector comprising the replication system of pVE6002, such as those described in PCT Application WO 93/18164 or in a vector comprising the theta replication system of pIP501 or a related system, as defined above .
  • said vector is a non-conjugative vector.
  • Integrative plasmids in accordance with the invention are in particular illustrated by the plasmid pVI49 and the plasmid pVI52.
  • the excision of the sequences originating from the vector can be carried out, during step e) of the method. according to the invention, by recombination between the homologous sequences flanking the sequences of the vector.
  • a second recombination event (double crossing-over) can take place between the homologous regions duplicated on either side of the sequences of the vector. This event leads to the excision of the vector sequences, and makes it possible, for a fraction of the clones, to replace the wild chromosomal form by the modified plasmid form as shown in FIG. 1.
  • A, B chromosomal DNA cloned into the vector
  • NP non-permissive conditions.
  • these also constitute, on either side of the vector sequences, homologous regions favorable to recombination events which lead to the excision of the vector sequences , and one copy of the SI, the other remaining in the bacterial chromosome at the transposition site.
  • FIG. 2 represents the excision of the sequences of a vector by homologous recombination between ISs.
  • NP non-permissive conditions.
  • the bacteria selected at non-permissive temperature during step c) (> 42 ° C), are cultivated without selection pressure to allow the recombination between homologous regions flanking the vector sequences.
  • step f) of the method according to the invention After elimination of the excised sequences, in accordance with step f) of the method according to the invention, the following is thus obtained: in the case of a plasmid comprising a sequence capable of integrating by homologous recombination, a bacterium different from the bacterium -Original host by the presence, in its chromosome, of the modification brought about by this sequence; in the case of a plasmid comprising a transposable sequence, a bacterium which differs from the original host bacterium by the presence, in its chromosome, of a copy of said transposable sequence.
  • pVI1055 This plasmid, called pVI1055, is shown in FIG. 3. It carries an ery gene for resistance to erythromycin (Ery).
  • electroporation buffer 0.4 M sucrose, 1 mM MgCl 2 , 5 mM KH 2 P0 4 , pH 6.0
  • the suspension is incubated for 20 min at 45 ° C. and then cooled on ice.
  • An 80 ⁇ l aliquot of the suspension is mixed with the plasmid DNA (-1.5 ⁇ g) and the mixture is transferred to a 0.2 cm electroporation tank.
  • the electroporation is carried out at 1 kV, 800 ⁇ , and 25 ⁇ F.
  • the mixture is diluted in 2 ml of expression medium (0.2 M sucrose, 5% skimmed milk powder, 0.1% yeast extract, 1% casamino acids, 25 mM MgCl 2 ). After incubation for 3 h at 37 ° C.
  • the cells are spread on dishes of selective medium (MRS Agar with 10 ⁇ g / ml of erythromycin); the dishes are incubated in an anaerobic jar at 37 ° C. for 48 h, and the colonies resistant to erythromycin are selected.
  • MRS Agar with 10 ⁇ g / ml of erythromycin
  • thermosensitivity of pGB305 ⁇ and pVI1055 was first evaluated by Lb transformation tests.
  • delbrueckii (ATCC 11842 or VI104) according to the protocol described above, with spreading on selective medium at 37 ° C and 42 ° C.
  • transformants are obtained at 37 ° C but not at 42 ° C.
  • thermosensitivity of pVI1055 was then confirmed by comparison of its stability at 37 ° C and 44 ° C.
  • a culture in MRS / Ery (10 ⁇ g / ml) at 37 ° C was diluted in MRS without Ery and then incubated in parallel at 37 ° C and 44 ° C. Samples are taken at different times, and the cells are spread after dilution on MRS and MRS / Ery, in order to determine the proportion of cells which have lost the plasmid.
  • Isolated insertion sequences of lactic acid bacteria were cloned into pVI1055.
  • the multiplication of a transformant generates a bacterial population containing the plasmid.
  • the SI present on the plasmid in the bacterial population can transpose into the chromosome.
  • the transposed structure present in the chromosome can correspond to the plasmid vector, framed on both sides by a copy of the SI, as shown in Figure 4.
  • non-permissive temperature 44 ° C
  • the plasmids containing the ISs lead to obtaining Ery R clones with a frequency higher than that observed for pVI1055, the plasmid without IS.
  • the structural analysis of the chromosomal DNA by Southern Blot with a probe corresponding to the IS tested makes it possible to verify that the integration does indeed result from a transposition event. Highlighting the transposition;
  • IS 1223 WALKER and KLAENHAMMER, 1994, cited reference
  • 1201 TAILLEZ et al., 1994, cited reference
  • the strains containing the plasmids carrying the ISs to be tested were cultured at 37 ° C. in MRS / Ery (10 ⁇ g / ml). Then the cells are diluted in MRS and incubated at 44 ° C. At different times, samples are taken and spread on MRS dishes (to determine the count of viable cells) and on MRS / Ery (Ery R cell count).
  • IS1223 (pVI48 / pVI49): The plasmids pVI48 or pVI49 were introduced into VI104. In the presence of IS1223, the frequency of Ery R cells is higher than with pVI1055 alone. After digestion, the chromosomal DNAs of the Ery R clones obtained are hybridized with IS1223. In all cases, the Ery R clones result from transposition events.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de modification de l'information génétique chromosomique de <i>Lactobacillus delbrueckii</i>, mettant en oeuvre un plasmide intégratif conditionnel. L'invention concerne également des plasmides intégratifs utilisables pour la mise en oeuvre dudit procédé.

Description

PROCEDE DE MODIFICATION GENETIQUE DE LACTOBACILLUS
DELBRUEC II
La présente invention est relative à la modification génétique de Lactobacillus delbrueckii . Les bactéries lactiques sont très utilisées en industrie agroalimentaire, particulièrement pour la fabrication de divers produits fermentes ; en outre, leur innocuité a fait préconiser leur utilisation pour la production par génie génétique de diverses substances destinées notamment à une utilisation thérapeutique.
La modification génétique des bactéries lactiques permet d'adapter leurs caractéristiques selon l'utilisation envisagée, que ce soit par l'introduction et l'expression d'ADN étranger, ou par la surexpression ou au contraire 1 ' inactivation de gènes naturellement présents chez lesdites bactéries. Pour qu'une modification soit stable, elle doit être intégrée dans le chromosome bactérien. Dans ce but, la modification souhaitée est insérée dans un plasmide non-réplicatif portant un marqueur de sélection. Le vecteur ainsi obtenu est introduit dans les bactéries ; on récupère ensuite les bactéries exprimant le marqueur de sélection, qui sont celles qui ont intégré le vecteur dans leur chromosome . La modification résulte de 2 événements de faible fréquence : 1) l'introduction du plasmide dans les bactéries ; 2) l'intégration dudit plasmide dans le chromosome. Le taux de modification que l'on peut espérer est le produit des probabilités de ces deux événements ,- il est donc très faible, surtout dans le cas de bactéries appartenant à des espèces dites « réfractaires » à la transformation, ce qui est le cas de nombreuses espèces de bactéries lactiques. Parmi celles-ci on mentionnera en particulier l'espèce Lactobacillus delbrueckii , qui comprend notamment les sous-espèces Lb . delbrueckii subsp . bulgaricus , Lb . delbrueckii subsp . lactis, et Lb . delbrueckii subsp. delbrueckii .
Un seul exemple de vecteur permettant l'intégration dans le chromosome de Lb . delbrueckii est décrit dans l'art antérieur : il s'agit du plasmide conjugatif pAMβl, décrit comme non-réplicatif chez Lb . delbrueckii . La Demande EP 0603416 au nom de MEIJI MILK PRODUCTS CO LTD rapporte l'utilisation de ce plasmide pour intégrer une modification dans le chromosome de Lb . delbrueckii . - un marqueur de sélection (résistance à 1 ' érythromycine) , a été inséré dans un fragment homologue à une région du chromosome de Lb . delbrueckii , et l'ensemble a été introduit dans le plasmide pAMβl . Le plasmide intégratif ainsi construit a été multiplié chez Lactococcus lactis, puis transféré par conjugaison chez Lb . delbrueckii , - les transconjugants/intégrants sont ensuite sélectionnés sur la base de la résistance à l' érythromycine résultant de l'intégration, par recombinaison homologue, de l' insert du plasmide dans l'ADN chromosomique.
Ces modifications étant obtenues à très faible fréquence, il est souhaitable de disposer d'autres vecteurs integratifs adaptés à Lb . delbrueckii et facilitant l'obtention des souches modifiées et la sélection des intégrants.
Pour augmenter le taux de modification et faciliter le criblage des bactéries modifiées, il a été proposé d'utiliser comme vecteurs des plasmides conditionnels. On qualifie ici de « conditionnel » un vecteur, par exemple un plasmide, dont au moins l'une des fonctions de réplication, de partition, ou de stabilité n'est active que dans certaines conditions (par exemple de température, de pH, de concentration en sels minéraux, de présence dans le milieu de culture d'un composé particulier, etc.) soit du fait qu'une ou plusieurs des protéines intervenant dans cette fonction comporte (nt) une ou des mutatio (s) rendant l'activité conditionnelle, soit du fait qu'une ou plusieurs des protéines intervenant dans cette fonction sont placées sous contrôle d'un promoteur inductible. BISWAS et al., J. Bacteriol . , 175, 3628-3635,
(1993) ; MAGUIN et al., J. Bacteriol., 178, 931-935, (1996) et la Demande PCT WO 93/18164 décrivent ainsi des vecteurs integratifs qui comprennent le système de réplication du réplicon mutant pVE6002 (CNCM 1-1179) également dénommé pG+host, dérivé thermosensible (Ts) du plasmide p VOl, du fait d'une mutation au niveau de la séquence codant la protéine RepA.
La modification peut ainsi être effectuée en deux étapes : dans la première, le plasmide est introduit à température permissive dans les bactéries, ce qui permet une première sélection de celles dans lesquelles il s'est établi ; dans la seconde, ces bactéries sont cultivées à température non-permissive pour la réplication du plasmide, ce qui permet de sélectionner celles dans lesquelles les séquences introduites sont intégrées dans le chromosome.
La Demande PCT WO 93/18164 décrit l'utilisation de ces plasmides chez diverses espèces de bactéries lactiques, dont Lb . delbruckii subsp. bulgaricus .
En poursuivant leurs recherches, les
Inventeurs ont à présent constaté que d'autres plasmides utilisés dans les bactéries lactiques étaient capables de se répliquer dans Lb . delbrueckii à des températures pouvant atteindre jusqu'à 37°C environ, qui permettent la croissance de cette espèce, mais étaient thermosensibles à des températures plus élevées, généralement à partir de
42 °C, température optimale de croissance de cette espèce.
Il s'agit notamment de dérivés du plasmide pIP501 ; il a été montré que ce plasmide peut être transféré par conjugaison chez Lb . delbrueckii subsp. bulgaricus et s'y répliquer [LANGELLA et CHOPIN, FEMS
Microbiol. Lett . , 60, 149-152, (1989). Il a été décrit comme thermosensible chez B . subtilis et plusieurs lactobacilles dont L. helveticus [BHOWMICK et STEELE, J. Gen. Microbiol., 139, 1433-1439, (1993)], L. plantarum
[RIXON et al., FEMS Microbiol. Lett., 71, 105-110,
(1990)] et L . acidophilus [LUCHANSKI et al., Mol.
Microbiol., 2, 637-646, (1988)] mais pas chez Lb . delbrueckii . Les Inventeurs ont établi que des dérivés de pIP501 sont thermosensibles chez Lb . delbrueckii ; ils peuvent en effet se répliquer et se maintenir à 35-37°C environ dans cette espèce bactérienne, mais leur réplication et/ou leur maintien sous forme stable sont inhibés à partir de 42 °C environ. Ces dérivés de pIP501 ont été utilisés par les
Inventeurs pour transformer Lb . delbrueckii et ont permis à température non-permissive, d'obtenir des intégrants.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un plasmide comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système de réplication apparenté, en tant que vecteur conditionnel, thermosensible, d'intégration permettant d'introduire une modification de l'information génétique d'une bactérie de l'espèce Lb . delbrueckii . Cette modification est introduite dans le chromosome via un ou plusieurs événements de transposition et/ou de recombinaison homologue.
On définit ici comme « système de réplication apparenté au système de réplication thêta de pIP501 » tout système de réplication thêta possédant les caractéristiques fonctionnelles, et notamment la thermosensibilité chez Lb delbrueckii , de pIP501. Ceci englobe en particulier tout système de réplication thêta comprenant : - une origine de réplication ori possédant au moins 80% d'identité, de préférence au moins 85% d'identité, et avantageusement au moins 90% d'identité, au niveau de la séquence nucléotidique, avec l'origine de réplication ori de pIP501 et/ou ;
- une séquence codant une protéine rep dont la séquence peptidique possède au moins 85% d'identité, de préférence au moins 90% d'identité, et avantageusement au moins 95% d'identité, avec celle de la protéine repR de pIP501.
La séquence de l'origine de réplication ori de pIP501 est décrite notamment par BRANTL et BEHNKE
[Molecular Microbiology, 6, 3501-3510 (1992)] ; la séquence codant la protéine repR de pIP501 est identifiée notamment dans la séquence complète de pGB3631 (dérivé de pIP501) , publiée par BRANTL et al., [Gène, 142, 155-156, (1994)], et accessible sous le numéro X72021.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence sur un alignement des 2 séquences assurant une correspondance maximale entre les positions des résidus.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé pour modifier l'information génétique portée par le chromosome d'une bactérie de l'espèce Lb delbrueckii , caractérisé en ce qu'il comprend : a) la construction d'un plasmide intégratif, par insertion d'au moins une séquence d'ADN capable de s'intégrer dans le chromosome bactérien, dans un vecteur conditionnel comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système de réplication apparenté, ledit vecteur portant en outre au moins un marqueur de sélection ; b) l'introduction du plasmide dans ladite bactérie et la multiplication de celle-ci, en conditions permissives pour la réplication et le maintien sous forme stable dudit plasmide ; c) la multiplication des bactéries exprimant au moins un marqueur de sélection du plasmide à l'issue de l'étape b) , en conditions non-permissives pour la réplication et/ou le maintien sous forme stable du plasmide ; et optionnellement , d) la récupération des bactéries exprimant au moins un marqueur de sélection provenant du plasmide, à l'issue de 1 ' étape c) .
Selon une variante du procédé conforme à l'invention, on peut omettre l'étape de multiplication de la bactérie en conditions permissives pour la réplication et le maintien du plasmide sous forme stable ; dans ce cas, après l'introduction du plasmide dans la bactérie, on effectue directement la multiplication de celle-ci en conditions non-permissives pour la réplication et/ou le maintien sous forme stable du plasmide.
Avantageusement, on peut, après avoir obtenu des bactéries portant la modification souhaitée, éliminer des séquences provenant du vecteur mis en œuvre à l'étape a), dans les cas où il n'est pas souhaitable de conserver ces séquences, par exemple dans le cas de bactéries destinées à une utilisation industrielle, notamment à la préparation d'aliments.
Dans ce cas le procédé conforme à l'invention comprend en outre les étapes suivantes : e) l'excision des séquences provenant du vecteur, par multiplication des bactéries exprimant, à l'issue de l'étape c) , au moins un marqueur de sélection provenant du plasmide, et avantageusement, f) l'élimination de l'ADN excisé, par multiplication des bactéries obtenues à l'étape e) en conditions non- permissives pour la réplication et le maintien du vecteur sous forme plasmidique stable.
Des vecteurs conditionnels comprenant le système de réplication thêta de pIP501, ou un système apparenté, utilisés chez Lb . delbrueckii pour la mise en œuvre de la présente invention sont des plasmides thermosensibles capables de se répliquer et de se maintenir à 35-37°C dans cette espèce bactérienne, et dont la réplication et/ou le maintien sous forme stable sont inhibés à partir de 42 °C environ.
Ces plasmides portent en outre au moins un marqueur de sélection, à savoir un gêne pouvant s'exprimer chez Lb . delbrueckii et dont l'expression confère aux bactéries l'hébergeant un phénotype distinctif permettant leur sélection. Il peut s'agir par exemple d'un marqueur de résistance, conférant un caractère de résistance à une substance habituellement toxique pour la bactérie, par exemple un antibiotique, ou bien d'un marqueur d' auxotrophie conférant la capacité de croître en l'absence d'un nutriment habituellement indispensable à la bactérie. Les bactéries exprimant ces marqueurs sont par exemple facilement sélectionnées par leur survie sur milieu sélectif, à savoir en présence de ladite substance toxique ou en l'absence dudit nutriment. Ainsi, à l'issue de l'étape b) du procédé ci-dessus, les bactéries dans lesquelles le plasmide est présent peuvent être sélectionnées sur la base de l'expression d'un marqueur de sélection provenant du plasmide. De même, à l'issue de l'étape c) , les bactéries dans lesquelles l'ADN du plasmide a été intégré au chromosome peuvent être sélectionnées sur la base de l'expression d'un marqueur de sélection provenant du plasmide construit à 1 ' étape a) . Une autre possibilité de sélection à l'issue de l'étape c) consiste à utiliser une propriété de la souche qui découle de l'intégration du plasmide et/ou de l'excision des séquences du vecteur. Par exemple, on peut utiliser un plasmide conditionnel comprenant un marqueur de sélection M (par exemple un marqueur de résistance) , et une séquence d'ADN capable de s'intégrer par recombinaison homologue dans un gène bactérien X, ledit gène X étant indispensable dans certaines conditions pour la bactérie (par exemple un gène essentiel pour sa croissance sur un milieu donné), l'intégration du plasmide inactivant le gène X, et l'excision des séquences du vecteur restaurant son activité. Dans ce cas, les bactéries dans lesquelles l'ADN plasmidique a été intégré peuvent être sélectionnées sur la base de l'expression du marqueur de sélection M, en conditions dans lesquelles le gène X n'est pas indispensable, et les bactéries dans lesquelles les séquences du vecteur intégré ont été excisées peuvent être sélectionnées, en conditions dans lesquelles le gène X est indispensable, sur la base de la restauration de son activité. Ce mode de sélection permet également en outre de sélectionner en une seule étape des bactéries dans lesquelles l'intégration de l'ADN plasmidique et l'excision des séquences du vecteur ont eu lieu ; dans ce cas les bactéries sont directement cultivées en conditions dans lesquelles le gène X est indispensable, et qui sont également sélectives pour le marqueur M. Les bactéries sélectionnées seront celles dans lesquelles l'intégration du plasmide et l'excision des séquences du vecteur (y compris le marqueur M) ont restauré l'activité du gène X.
Des séquences d'ADN capables de s'intégrer dans le chromosome d'une bactérie de l'espèce
Lb . delbrueckii comprennent notamment : des séquences choisies sur la base de leur homologie avec une portion du chromosome où l'on souhaite introduire une modification, c'est à dire présentant une homologie suffisante avec cette portion du chromosome pour pouvoir recombiner avec elle ; des séquences transposables, notamment des transposons ou des séquences d'insertion (IS) ; de telles séquences peuvent s'insérer au hasard ou avec une certaine spécificité dans le chromosome bactérien.
Les modifications que l'on souhaite intégrer dans le chromosome bactérien peuvent être apportées par la simple intégration de ces séquences, celle-ci pouvant par exemple entraîner 1 ' inactivation d'un gène à l'intérieur duquel elle s'effectue. Il est également possible d'utiliser ces séquences pour intégrer un fragment d'ADN, notamment un gène d'intérêt d'origine hétérologue, ou un fragment d'ADN de Lb . delbrueckii préalablement modifié, dans le chromosome bactérien.
Dans le cas de l'intégration par recombinaison homologue, par exemple, on peut apporter à l'intérieur d'une séquence identique à celle de la région du chromosome que l'on souhaite modifier, des modifications par insertion, délétion, ou substitution, pouvant aller d'un seul nucléotide à plusieurs milliers de nucléotides. La séquence ainsi modifiée est insérée à l'étape a) du procédé selon l'invention, dans un vecteur conditionnel chez Lb . delbrueckii , comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système apparenté, tel que défini ci-dessus. L'intégration s'effectue par recombinaison (simple crossmg-over) entre le fragment d'ADN chromosomique clone et la région homologue du chromosome bactérien. Cet événement de recombinaison créant des duplications de la région d' homologie, de part et d'autre des séquences du vecteur, la structure intégrée dans le chromosome est constituée des séquences du vecteur encadrées de part et d'autre par une copie de la région d' homologie, comme le montre la Figure 1.
L'utilisation de séquences pouvant s'intégrer par recombinaison homologue permet notamment : d' inactiver un (ou des) gène (s) bactérien (s) , - - de modifier l'expression des gènes et/ou l'activité des produits codés par ces gènes ; - d'introduire, de façon stable, de nouvelles fonctions dans le chromosome , - d'étudier et d'utiliser l'expression des gènes in si tu ; - de muter le chromosome par intégration via des fragments chromosomiques aléatoires ;
- d'insérer, de façon stable, des séquences destinées à marquer les souches. Ces séquences serviront par la suite de traceurs ; - d'introduire plusieurs modifications séquentielles dans une même souche.
Dans le cas de l'intégration par l'intermédiaire d'une séquence transposable, la séquence transposable sera insérée dans le plasmide ; l'intégration dans le chromosome permet de réaliser la modification, d'obtenir ainsi des mutants présentant des caractères intéressants et de caractériser plus aisément le ou les gène (s) muté (s). La structure transposée dans le chromosome, peut être constituée des séquences du vecteur encadrées de part et d'autre par une copie de la séquence transposable.
Ces séquences transposables peuvent provenir de bactéries appartenant à l'espèce Lb . delbrueckii , ou provenir d'autres espèces bactériennes, notamment d'autres bactéries lactiques. Il peut s'agir de transposons ou de séquences d'insertion.
Des séquences transposables fonctionnelles chez Lb . delbrueckii peuvent être identifiées en insérant une séquence transposable à tester (transposon ou séquence d'insertion), dans un vecteur à réplication conditionnelle chez Lb . delbrueckii comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système apparenté, tel que défini ci -dessus, en mettant en œuvre les étapes b) et c) du procédé conforme à l'invention, et en recherchant la présence de transposants à l'issue de ces étapes . Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence 2 séquences d'insertion fonctionnelles chez Lb . delbrueckii . La présente Invention a également pour objet l'utilisation de l'une ou l'autre de ces séquences pour modifier le chromosome de Lb . delbrueckii .
Il s'agit de la séquence d'insertion dénommée
IS1223 précédemment mise en évidence par WALKER et al.
(J. Bacteriol., 176, 5330-5340, 1994) chez Lb . johnsonii , et de la séquence d'insertion dénommée IS1201 , précédemment mise en évidence par TAILLIEZ et al. (Gène,
145, 75-79, 1994) chez Lb . helveticus .
La présente invention a également pour objet tout plasmide intégratif résultant de l'insertion de l'une de ces 2 séquences dans un vecteur à réplication conditionnelle chez Lb . delbrueckii , et notamment dans un vecteur comprenant le système de réplication de pVE6002, tels que ceux décrits dans la Demande PCT WO 93/18164 ou dans un vecteur comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système apparenté, tel que défini ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit vecteur est un vecteur non- conjugatif .
Des plasmides integratifs conformes à 1 ' invention sont notamment illustrés par le plasmide pVI49 et le plasmide pVI52. Le plasmide pVI49 hébergé par la souche VI209 de E. coli , et le plasmide pVI52, hébergé par la souche VI217 de E. coli , ont été déposés selon le
Traité de Budapest le 17 septembre 1999, sous les numéros respectifs 1-2317 et 1-2318, auprès de la CNCM
(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) , 25 rue du Docteur Roux, à Paris.
Dans les deux cas de figure : intégration par recombinaison homologue ou par transposition d'un élément mobile, l'excision des séquences provenant du vecteur peut s'effectuer, au cours de l'étape e) du procédé conforme à l'invention, par recombinaison entre les séquences homologues flanquant les séquences du vecteur.
Par exemple, dans le cas de l'intégration par recombinaison homologue, un second événement de recombinaison (double crossing-over) peut avoir lieu entre les régions homologues dupliquées de part et d'autre des séquences du vecteur. Cet événement conduit à l'excision des séquences du vecteur, et permet, pour une fraction des clones, de substituer la forme sauvage chromosomique par la forme modifiée plasmidique comme le montre la Figure 1.
Légende de la Figure 1 :
A, B : ADN chromosomique clone dans le vecteur ;
A : modification ; RC : réplicon conditionnel ;
M : marqueur de sélection , -
P : conditions permissives
NP : conditions non-permissives.
Par exemple, dans le cas de l'intégration par certaines séquences transposables, celles-ci constituent également de part et d'autre des séquences du vecteur, des régions homologues favorables à des événements de recombinaison qui conduisent à l'excision des séquences du vecteur, et de l'une des copies de l'IS, l'autre demeurant dans le chromosome bactérien au site de transposition.
La Figure 2 représente l'excision des séquences d'un vecteur par recombinaison homologue entre des IS. Légende de la Figure 2 :
I : séquence d' insertion ;
M : marqueur de sélection ;
NP : conditions non-permissives.
Les bactéries sélectionnées à température non permissive pendant l'étape c) (>42°C), sont cultivées sans pression de sélection pour permettre la recombinaison entre les régions homologues flanquant les séquences du vecteur.
Après élimination des séquences excisées, conformément à l'étape f) du procédé conforme à l'invention, on obtient ainsi : dans le cas d'un plasmide comprenant une séquence capable de s'intégrer par recombinaison homologue, une bactérie différant de la bactérie-hôte d'origine par la présence, dans son chromosome, de la modification apportée par cette séquence ; dans le cas d'un plasmide comprenant une séquence transposable, une bactérie différant de la bactérie-hôte d'origine par la présence, dans son chromosome, d'une copie de ladite séquence transposable.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention de plasmides integratifs et de leur utilisation chez Lb . delbrueckii .
EXEMPLE 1 : SELECTION DE PLASMIDES THERMOSENSIBLES CHEZ LJ . delbrueckii
Obtention des plasmides Un plasmide navette L . bulgaricus - E . coli constitué de pGB3631 (un dérivé séquence de pIP501,
[BRANTL et al., Gène, 142, 155-156, (1994)]) et de l'origine pSKII de E. coli a été construit. Ce plasmide, dénommé pVI1055, est représenté sur la figure 3. Il porte un gène ery de résistance à 1 ' érythromycine (Ery) .
Un autre dérivé de pIP501, le plasmide pGB305Δ [LE CHATELIER et al., Plasmid, 29, 50-61, (1995)] a également été testé. Mise en évidence de la thermosensibilité chez Lb. delbrueckii
Transformation des bactéries
Des bactéries de la souche ATCC 11842 de Lb . delbrueckii subsp. bulgari cus ou de la souche VU04 déposée selon le Traité de Budapest le 17 septembre 1999, sous le numéro 1-2316, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) , 25 rue du Docteur Roux, à Paris, sont cultivées en milieu MRS, 0,1% glycine (DIFCO) jusqu'en début de phase stationnaire . Elles sont ensuite centrifugées et lavées dans du tampon d' électroporation (0,4 M sucrose, 1 mM MgCl2, 5 mM KH2P04, pH 6,0) et mises en suspension dans ce même tampon à une concentration correspondant à une DOêoo d'environ 50. La suspension est incubée 20 min à 45°C puis refroidie sur de la glace. Une aliquote de 80 μl de la suspension est mélangée avec l'ADN plasmidique (-1,5 μg) et le mélange est transféré dans une cuve d' électroporation de 0,2 cm. L' électroporation est effectuée à 1 kV, 800 Ω, et 25 μF . Immédiatement après 1 ' électroporation, le mélange est dilué dans 2 ml de milieu d'expression (0,2 M sucrose, 5% lait écrémé en poudre, 0,1% extrait de levure, 1% casaminoacides, 25 mM MgCl2) . Après incubation pendant 3 h à 37°C dans ce milieu, les cellules sont étalées sur des boites de milieu sélectif (MRS Agar avec 10 μg/ml d' érythromycine) ; les boites sont incubées en jarre d' anaérobiose à 37°C pendant 48 h, et les colonies résistantes à 1 ' érythromycine sont sélectionnées.
Thermosensibilité de dérivés de pIP501 (réplication thêta)
La thermosensibilité de pGB305Δ et de pVI1055 a d'abord été évaluée par des essais de transformation de Lb . delbrueckii , (ATCC 11842 ou VI104) selon le protocole décrit ci -dessus, avec des étalements sur milieu sélectif à 37°C et 42°C. Pour les 2 plasmides, on obtient des transformants à 37°C mais pas à 42 °C.
La thermosensibilité de pVI1055 a ensuite été confirmée par comparaison de sa stabilité à 37°C et à 44°C. Une culture en MRS/Ery (10 μg/ml) à 37°C a été diluée en MRS sans Ery puis incubée en parallèle à 37°C et à 44 °C. Des prélèvements sont effectués à différents temps, et les cellules sont étalées après dilution sur MRS et MRS/Ery, afin de déterminer la proportion de cellules ayant perdu le plasmide.
A 37°C, environ 30% des cellules ont perdu le plasmide pVI1055 après 48 heures. A 44°C, la stabilité de pVI1055 est nettement affectée puisque -100% des cellules ont perdu le plasmide après 48 heures. EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE DE TRANSPOSITION DE SEQUENCES D'INSERTION (IS) CHEZ Lb. delbrueckii .
Des séquences d'insertion isolées de bactéries lactiques ont été clonées dans pVI1055. A température permissive pour la réplication du plasmide, la multiplication d'un transformant génère une population bactérienne contenant le plasmide. L'IS présente sur le plasmide dans la population bactérienne peut transposer dans le chromosome. En cas de transposition de l'IS, la structure transposée présente dans le chromosome, peut correspondre au vecteur plasmidique, encadré de part et d'autre par une copie de l'IS, comme le montre la Figure 4. A température non permissive (44°C) , les plasmides contenant les IS conduisent à l'obtention de clones EryR avec une fréquence supérieure à celle observée pour pVI1055, le plasmide sans IS. Dans le cas d'obtention de clones EryR, l'analyse structurale de l'ADN chromosomique par Southern Blot avec une sonde correspondant à l'IS testée, permet de vérifier que l'intégration résulte bien d'un événement de transposition. Mise en évidence de la transposition ;
Les IS 1223 (WALKER and KLAENHAMMER, 1994, référence précitée), et 1201 (TAILLEZ et al . , 1994, référence précitée) ont été clonées dans le plasmide pVI1055, générant respectivement les plasmides pVI48, pVI49 (correspondant aux 2 orientations de 1 ' IS1223) , et pVI52.
Les propriétés de ces 2 IS et la nature des plasmides obtenus sont indiquées dans le tableau 1 ci- après .
a: taille correspondant à l'IS encadrée des répétitions directes (DR) b: La mention de deux plasmides indique que l'IS a été clonée dans les deux orientations
Pour rechercher l'activité de transposition, les souches contenant les plasmides porteurs des IS à tester ont été cultivées à 37°C en MRS/Ery (10 μg/ml) . Puis les cellules sont diluées en MRS et incubées à 44°C. A différents temps, des échantillons sont prélevés et étalés sur boîtes MRS (pour déterminer le compte de cellules viables) et sur MRS/Ery (compte de cellules EryR) .
Résultats ;
IS1223 (pVI48/pVI49) : Les plasmides pVI48 ou pVI49 ont été introduits chez VI104. En présence de 1' IS1223 , la fréquence des cellules EryR est plus élevée qu'avec pVI1055 seul. Après digestion, les ADN chromosomiques des clones EryR, obtenus sont hybrides avec 1 ' IS1223 . Dans tous les cas, les clones EryR résultent d'événements de transposition.
1S1201 (pVl52) : le plasmide pVI52 a été introduit dans VI104. La fréquence d'intégration de pVI52 est plus élevée que celle de pVI1055 seul. Tous les clones EryR analysés par Southern résultent de transposition. Ces résultats démontrent l'activité de transposition des IS 1223 et 1201 chez Lb . delbrueckii .

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un plasmide comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système de réplication apparenté en tant que vecteur conditionnel, thermosensible, d'intégration permettant d'introduire une modification de l'information génétique d'une bactérie de l'espèce Lb . delbrueckii .
2) Procédé pour modifier l'information génétique portée par le chromosome d'une bactérie de l'espèce Lb . delbrueckii , caractérisé en ce qu'il comprend : a) la construction d'un plasmide integratif, par insertion d'au moins une séquence d'ADN capable de s'intégrer dans le chromosome bactérien, dans un vecteur conditionnel comprenant le système de réplication thêta de pIP501 ou un système de réplication apparenté , ledit plasmide integratif portant en outre au moins un marqueur de sélection , - b) l'introduction du plasmide dans ladite bactérie et la multiplication de celle-ci, en conditions permissives pour la réplication et le maintien sous forme stable dudit plasmide ; c) la multiplication des bactéries exprimant au moins un marqueur de sélection du plasmide à l'issue de l'étape b) en conditions non-permissives pour la réplication et/ou le maintien sous forme stable dudit plasmide ; et optionnellement , d) la récupération des bactéries exprimant au moins un marqueur de sélection provenant du plasmide, à l'issue de 1 ' étape c) .
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre : e) l'excision des séquences provenant du vecteur, par multiplication des bactéries exprimant à l'issue de l'étape c) , au moins un marqueur de sélection provenant du plasmide, et avantageusement, f) l'élimination de l'ADN excisé, par multiplication des bactéries obtenues à l'étape e) en conditions non- permissives pour la réplication et le maintien dudit vecteur sous forme plasmidique stable. 4) Procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3 , caractérisé en ce que la séquence d'ADN capable de s'insérer dans le chromosome bactérien est une séquence homologue d'une portion du chromosome où l'on souhaite introduire une modification. 5) Procédé selon une quelconque des revendications 2 ou 3 , caractérisé en ce que la séquence d'ADN capable de s'insérer dans le chromosome bactérien est une séquence transposable.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite séquence transposable est une séquence d'insertion.
7) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite séquence d'insertion est choisie parmi l'IS2223 de Lb . johnsonii et 1 ' IS1201 de Lb . hel veti cus .
8) Utilisation d'une séquence d'insertion choisie parmi 1 ' 151223 de Lb . johnsonii et l' IS1201 de Lb . helveticus pour modifier le chromosome de Lb . delbrueckii . 9) Plasmide integratif pour la mise en œuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il résulte de l'insertion de l'une des séquences IS1223 ou IS1201 dans un plasmide choisi parmi : - les plasmides comprenant le système de réplication de pVE6002 ; les plasmides comprenant le système de réplication thêta du réplicon pIPSOl, ou un système de réplication apparenté. 10) Plasmide integratif selon la revendication
8, choisi dans le groupe constitué par le plasmide pVI49 et le plasmide pVI52, déposés auprès de la CNCM le 17 septembre 1999, sous les numéros respectifs 1-2317 et I- 2318.
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