EP1185706A1 - Methode de production de melanges complexes d'adnc et applications de ces melanges pour l'analyse de l'expression des genes - Google Patents

Methode de production de melanges complexes d'adnc et applications de ces melanges pour l'analyse de l'expression des genes

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Publication number
EP1185706A1
EP1185706A1 EP00949524A EP00949524A EP1185706A1 EP 1185706 A1 EP1185706 A1 EP 1185706A1 EP 00949524 A EP00949524 A EP 00949524A EP 00949524 A EP00949524 A EP 00949524A EP 1185706 A1 EP1185706 A1 EP 1185706A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cdna
mixtures
mrna
complex
hybridization
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00949524A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Arnould
Charles Auffray
Charles Decraene
Geneviève PIETU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1185706A1 publication Critical patent/EP1185706A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the subject of the invention is a method for the production of complex mixtures of cDNA and the applications of such mixtures in particular, as probes for studying the expression profiles of genes in a tissue or cells of animal origin, vegetable and microbial.
  • the methods developed to collect the expression profiles of a large number of genes are based on the hybridization of complex cDNA probes derived from messenger AKN (mRNA) on different supports carrying either cDNA clones or oligonucleotides specific to thousands of genes.
  • mRNA messenger AKN
  • RNAs by reverse transcription (abbreviated as RT, for Reverse Transcription) of mRNAs conventionally comprises the use as primers either of oligo (dT) or of oligonucleotides randomly synthesized, or of oligonucleotides specific for the genes studied .
  • the oligo primer (dT) binds to the poly (A) tail of mRNAs (characteristics of the 3'OH end of messenger RNAs eukaryotes) and reverse transcriptase lengthens the oligo primer (dT) towards the 5'P end of the mRNAs.
  • the binding of the primer consisting of randomly synthesized oligonucleotides, is done randomly over the entire length of the mRNA and the elongation of the cDNA is done under the same conditions as those described above.
  • the fixation is done specifically on the genes studied and the elongation is done as described above.
  • each reverse transcriptase molecule initiates the synthesis of a complementary chain of an mRNA, then stops spontaneously after the extension of a few hundred nucleotides, and detaches from the chain in progress. synthesis. It then attaches to another chain in the course of synthesis, the elongation of which it pursues. This has the effect of promoting the most abundant mRNAs in the initial sample.
  • the object of the invention is therefore to provide a method for producing cDNA mixtures of high reliability and reproducibility.
  • the method according to the invention for the production of a complex mixture of cDNA by reverse transcription of mRNA of tissues or cells, is characterized by the addition to the reaction mixture of elongation terminators, the recovery of the mixture of cDNA formed, advantageously followed by its purification.
  • the addition of the elongation terminators has the effect of preventing the re-priming mentioned above, the reverse transcriptase molecules then initiating the synthesis of the complementary chains of the weakly represented mRNA molecules (the least abundant). It follows that the complex mixtures of cDNA produced in the presence of the elongation terminators represent all of the starting mRNAs, including the mRNAs present in small quantities.
  • the mRNA used in the method of the invention comes from cells in culture or from samples or from tissue, and can be of any origin, animal, plant or microbial.
  • a widely used elongation terminator is the dideoxynucleotides.
  • the reverse transcription reaction is in particular carried out according to the usual techniques.
  • Oligonucleotides suitable for carrying out the method of the invention include hexamers or oligonucleotides synthesized at random. Marking means are advantageously added to the reaction medium, for example radioactive elements, fluorescent, luminescent or colorimetric agents, which makes it possible to have labeled cDNAs for subsequent applications.
  • the method according to the invention is applicable to all productions of cDNA by RT from mRNA of a tissue or of a cell, whatever the origin.
  • the yield of the transcription reaction can be up to 90% and even exceed this value, whereas it generally only reaches around 30% by operating under the usual conditions.
  • this method has the advantage of allowing the study of a very large number of genes and their expression levels, whatever the species or the tissue studied, thanks to the demonstration weakly expressed genes.
  • kits for the implementation of the above method for the purposes of synthesis of such mixtures of cDNA are characterized in that they contain, in addition to reagents for carrying out reverse transcription, elongation terminators, in particular dideoxynucleotides, and a user manual.
  • the invention relates, as new products, to mixtures of complex cDNAs as obtained by the method defined above and, where appropriate, using said kits.
  • mixtures are characterized in that they reliably reflect the transcriptional state of a tissue or cells, namely the number and level of expression of the genes.
  • Such mixtures therefore constitute copies of high quality transcriptomes and thus make it possible to improve, in hybridization experiments, the performance of the complex cDNA probes produced from such mixtures.
  • the invention therefore also relates to the use of complex mixtures of cDNA as hybridization probes.
  • these probes make it possible to demonstrate the expression of a large number of genes by considerably improving the capacity for detecting the activity of weakly expressed genes.
  • the quality of the complex mixture cDNAs as probes was tested by synthesizing complex probes from messenger RNA from various tissues.
  • the inventors have thus demonstrated that the complex mixtures according to the invention made it possible to detect on the filters a number of clones 50 to 150% higher than that observed with the cDNA mixtures used up to now, the majority of the clones thus identified being clones corresponding to weakly expressed genes.
  • the invention therefore also relates to a method for studying the expression profile of genes in a tissue or cells.
  • This method includes bringing the labeled cDNA mixtures defined above into contact with the DNA to be studied (cDNA, or DNA specific oligonucleotides), under conditions allowing hybridization of the complementary sequences when they are present.
  • cDNA DNA to be studied
  • These supports can be Nylon® filters, but also other supports, including glass slides.
  • Appropriate conditions correspond to the use of a temperature of 68 ° C for 2 hours with the same solution with 20 x 10 cpm of probe.
  • the filters are washed, then the hybrids formed are revealed.
  • the invention thus provides means for studying the expression of genes and the modulations of this expression as a function of certain factors.
  • oncology mainly in colon cancers, to identify the genes modified in cancer cells compared to healthy cells and to determine potential targets for therapeutic developments; in neuromuscular diseases for identifications of the above type indicated at the muscle level, for example in Duchesne's myopathy (DMD); to carry out studies on weightless muscles, or in neurodegenerative diseases (Parkinson's disease or Lateral sclerosing amyotrophy (ALS).
  • DMD Duchesne's myopathy
  • ALS Lateral sclerosing amyotrophy
  • FIGS. 1 and 2 respectively represent, according to the 4 priming conditions of RT
  • FIG. 2A the hybridization of high density filters with complex cDNA probes derived from poly (A) + mRNA of mouse skeletal muscle
  • Example 1 Production of a complex mixture of cDNAs from mice of skeletal muscle of mice.
  • a complex mixture of cDNAs is synthesized by reverse transcription of 500 ng of poly (A) mRNA + mouse skeletal muscle.
  • the reaction is carried out using the pre-amplification system
  • the complex mixture obtained is purified on a column of Sephadex G-50 (Quick Spin, Boehringer Mannheim, France S.A., Meylan, France).
  • the amount of radioactivity is determined before and after purification using a scintillation counter (Beckman instruments France SA, Gagny, France) to calculate the specific activity of the complex mixture of cDNA (cpm / ⁇ g of cDNA) and the performance of the cDNA synthesis (%).
  • a theoretical maximum of cDNA synthesis equal to 20 ng is used, a value which results from the limiting concentration of dATP in the reaction (0.3 ⁇ M).
  • Example 2 Use of the complex mixture of cDNA of Example 1 as probe. Using the complex mixture of purified cDNA for hybridization on nylon filters ® high density (Hybond-N +, Amersham France SA, France), comprising the ion AMPLIFIERS PCR products inserts 1339 clones DNA from a human skeletal muscle bank.
  • the filters are prehybridized at 68 ° C for 30 minutes in ® ExpressHyb hybridization solution (Clontech Inc., Palo Alto, CA, USA). Hybridization is carried out at 68 ° C for 2 hours in the same solution with 20 x 10 cpm of probe.
  • the filters are washed at room temperature twice for 30 minutes in 1X SSC / 0.1% SDS, and twice for 30 minutes in 0.1X SSC / 0.1% SDS.
  • the 1339 hybridization signals are identified and quantified using software specially designed for this application.
  • FIG. 2A illustrates the qualitative aspects of the hybridization of high density filters with the complex cDNA probes obtained in each condition tested.
  • the number of clones with strong or medium hybridization intensity values shows limited variations when the four RT conditions are used.
  • the number of clones with low intensity values is more than doubled when using didoexoxynucleotides with oligo primers (dT), and multiplied almost 18 times when used with hexamers.
  • the fraction of clones associated with the hybridization signals which cannot be distinguished from the background noise with high reliability is limited to 16%, which illustrates the improved capacity of the corresponding complex cDNA probe to reflect the transcripts. the least abundant.
  • the hybridization intensity values obtained with a complex cDNA probe produced with hexamers and dideoxynucleotides in 4 hybridizations of the same filter at high density differs from -10%.

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Abstract

Conformément à l'invention, on produit un mélange complexe d'ADNc par transcription inverse d'ARNm de tissus ou de cellules, en ajoutant dans le mélange réactionnel d'ARNm, des terminateurs d'élongation, en récupérant le mélange d'ADNc formé, puis avantageusement en le purifiant. Application du mélange complexe d'ADNc, notamment, comme sondes d'hybridation, en particulier pour déterminer le niveau d'expression de gènes dans un échantillon.

Description

METHODE DE PRODUCTION DE MELANGES COMPLEXES D'ADNc ET APPLICATIONS DE CES MELANGES POUR L'ANALYSE DE L'EXPRESSION
DES GENES
L'invention a pour objet une méthode pour la production de mélanges complexes d'ADNc et les applications de tels mélanges en particulier, comme sondes pour l'étude des profils d'expression de gènes dans un tissu ou des cellules d'origine animale, végétale et microbienne.
Les méthodes développées pour collecter les profils d'expression d'un grand nombre de gènes sont basées sur l'hybridation de sondes complexes d'ADNc dérivés d'AKN messagers (ARNm) sur différents supports portant soit des clones d'ADNc, soit des oligonucléotides spécifiques de milliers de gènes.
L ' obtention des ADNc par transcription inverse (en abrégé RT, pour Reverse Transcription) des ARNm comprend classiquement l'utilisation comme amorces soit d'oligo (dT) , soit d' oligonucléotides synthétisés de façon aléatoire, soit des oligonucléotides spécifiques des gènes étudiés. Dans le premier cas, l'amorce oligo(dT) se fixe sur la queue poly(A) des ARNm (caractéristiques de l'extrémité 3'OH des ARN messagers eucaryotes) et la transcriptase inverse allonge l'amorce oligo(dT) en direction de l'extrémité 5'P des ARNm. Dans le second cas, la fixation de l'amorce, constituée d' oligonucléotides synthétisés au hasard, se fait de façon aléatoire sur toute la longueur de l'ARNm et l' elongation de 1 'ADNc se fait dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus. Dans le 3ème cas, la fixation se fait spécifiquement sur les gènes étudiés et l' elongation se fait comme décrit précédemment. En utilisant ces ADNc comme sondes, il s'agit d'obtenir simultanément plusieurs milliers de signaux d'hybridation qui reflètent des situations biologiques et leurs variations dynamiques pour des études de physiologie, pathologie, ou pharmacologie, mais aussi pour des études comparatives de différents organismes modèles .
On mesurera que la fiabilité de telles études dépend de la nature du mélange d'ADNc produit qui doit refléter la complexité de la population d'ARNm quel que soit le niveau d'abondance des espèces moléculaires qui la constitue.
Or la technique évoquée ci-dessus, qui est la plus couramment utilisée dans les laboratoires, et les kits commercialisés pour synthétiser les ADNc selon les deux types de réaction indiqués plus haut, ne permettent pas une transcription satisfaisante de l'ensemble d'une population d'ARNm, en particulier des ARNm faiblement représentés . Dans la technique classique de transcription inverse, chaque molécule de transcriptase inverse amorce la synthèse d'une chaîne complémentaire d'un ARNm, puis s'arrête spontanément après l' elongation de quelques centaines de nucleotides, et se détache de la chaîne en cours de synthèse. Elle s'attache alors à une autre chaîne en cours de synthèse dont elle poursuit 1 ' elongation. Ceci a pour effet de favoriser les ARNm les plus abondants dans l'échantillon de départ.
Les inventeurs ont constaté que cette technique pouvait être perfectionnée en contrôlant la transcription. L ' invention a donc pour but de fournir une méthode de production de mélanges d'ADNc de grande fiabilité et reproductibilité .
Elle vise également ces mélanges en tant que tels et leurs applications notamment comme sondes d'hybridation.
La méthode selon l'invention, pour la production d'un mélange complexe d'ADNc par transcription inverse d'ARNm de tissus ou de cellules, est caractérisée par l'addition dans le mélange réactionnel de terminateurs d' elongation, la récupération du mélange d'ADNc formé, suivie avantageusement de sa purification. De manière surprenante, l'addition des terminateurs d' elongation a pour effet d'empêcher le réamorçage évoqué ci-dessus, les molécules de transcriptase inverse amorçant alors la synthèse des chaînes complémentaires des molécules d'ARNm faiblement représentées (les moins abondantes). Il s'ensuit que les mélanges complexes d'ADNc réalisés en présence des terminateurs d' elongation représentent l'ensemble des ARNm de départ, y compris les ARNm présents en faible quantité.
L'ARNm mis en oeuvre dans la méthode de 1 ' invention provient de cellules en culture ou de prélèvements ou encore de tissu, et peut être d'origine quelconque, animale, végétale ou microbienne.
Un terminateur d' elongation largement utilisé est constitué par les didéoxynucléotides .
La réaction de transcription inverse est en particulier réalisée selon les techniques habituelles.
Comme amorces d' elongation, on utilisera avec avantage des oligonucléotides de synthèse tels que mis en oeuvre classiquement dans les techniques de RT. Des oligonucléotides convenant pour la mise en oeuvre de la méthode de l'invention comprennent des hexamères ou des oligonucléotides synthétisés au hasard. Des moyens de marquage sont avantageusement ajoutés au milieu réactionnel, par exemple des éléments radioactifs, des agents fluorescents, luminescents ou colorimétriques, ce qui permet de disposer d'ADNc marqués pour les applications ultérieures.
De manière générale, la méthode selon l'invention est applicable à toutes les productions d'ADNc par RT à partir d'ARNm d'un tissu ou d'une cellule, quelle que soit l'origine.
Elle présente l'intérêt d'être hautement reproductible, fiable, efficace, et de ne pas engendrer de surcoût notable . Le rendement de la réaction de transcription peut s'élever jusqu'à 90 % et même dépasser cette valeur, alors qu'il n'atteint généralement qu'environ 30 % en opérant selon les conditions habituelles .
Comme illustré dans les exemples, cette méthode présente 1 ' avantage de permettre 1 ' étude d ' un très grand nombre de gènes et de leurs niveaux d'expression, quel que soit l'espèce ou le tissu étudié, grâce à la mise en évidence des gènes faiblement exprimés .
Il est alors possible de déterminer avec une grande fiabilité les niveaux d'expression des gènes par comptage des ADNc clones et séquences, par exemple selon la méthode SAGE ou le séquençage partiel de banques d'ADNc . L'invention vise également des kits pour la mise en oeuvre de la susdite méthode aux fins de synthèse de tels mélanges d'ADNc. Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils renferment en plus des réactifs pour la réalisation d'une transcription inverse, des terminateurs d' elongation, en particulier des didêoxynucléotides, et une notice d'utilisation.
L'invention vise, en tant que nouveaux produits, les mélanges d'ADNc complexes tels qu'obtenus par la méthode définie ci-dessus et le cas échéant en utilisant lesdits kits.
Ces mélanges sont caractérisés en ce qu'ils reflètent de manière fiable l'état transcriptionnel d'un tissu ou de cellules, à savoir le nombre et le niveau d'expression des gènes.
De tels mélanges constituent donc des copies de transcriptomes de grande qualité et permettent ainsi d'améliorer, dans les expériences d'hybridation, les performances des sondes d'ADNc complexes élaborées à partir de tels mélanges.
L'invention vise donc également l'utilisation des mélanges complexes d'ADNc comme sondes d ' hybridation . De manière avantageuse, ces sondes permettent de mettre en évidence l'expression d'un grand nombre de gènes en améliorant considérablement la capacité de détection de l'activité des gènes faiblement exprimés.
La qualité des ADNc du mélange complexe en tant que sondes a été testée en synthétisant des sondes complexes à partir d'ARN messagers de divers tissus.
En utilisant des filtres à haute densité permettant l'étude de l'hybridation, simultanément, d'un grand nombre de clones, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les mélanges complexes selon 1 ' invention permettaient de détecter sur les filtres un nombre de clones supérieur de 50 à 150 % à celui observé avec les mélanges d'ADNc utilisés jusqu'alors, la majorité des clones ainsi identifiés étant des clones correspondant à des gènes faiblement exprimés.
L'invention vise donc également une méthode pour étudier le profil d'expression de gènes dans un tissu ou des cellules.
Cette méthode comprend la mise en contact des mélanges d'ADNc marqués définis ci-dessus avec l'ADN à étudier (ADNc, ou oligonucléotides spécifiques des ADN) , dans des conditions permettant l'hybridation des séquences complémentaires lorsqu'elles sont présentes. On opère dans des conditions stringentes ou non avec des supports sur lesquels sont déposés les ADN à étudier .
Ces supports peuvent être des filtres Nylon®, mais aussi d'autres supports, dont des lames de verre.
Des conditions appropriées correspondent à l'utilisation d'une température de 68 °C pendant 2 heures avec la même solution avec 20 x 10 cpm de sonde.
On procède à un lavage des filtres, puis on révèle les hybrides formés.
L'invention fournit ainsi des moyens pour étudier l'expression des gènes et les modulations de cette expression en fonction de certains facteurs.
Elle permet ainsi d'identifier des cibles au niveau thérapeutique pour développer des médicaments .
On citera à titre d'exemples, des applications en cancérologie, principalement dans les cancers du colon, pour identifier les gènes modifiés dans les cellules cancéreuses par rapport aux cellules saines et déterminer des cibles potentielles pour des développements thérapeutiques ; dans les maladies neuromusculaires pour des identifications du type sus- indiqué au niveau du muscle, par exemple dans la myopathie de Duchesne (DMD) ; pour effectuer des études sur les muscles en état d'apesanteur, ou encore dans des maladies neurodégenératives (Maladie de Parkinson ou Amyotrophie latérale sclérosante (ALS) .
D'autres applications chez les bovins et les caprins ont pour but d'étudier les gènes modifiés dans la glande mammaire durant la gestation et la lactation, afin de connaître les cibles permettant d'améliorer la qualité et la quantité de lait.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, dans lesquels il est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent respectivement, selon les 4 conditions d'amorçage de RT,
- la figure 1, le rapport entre la taille des inserts en kb et les intensités d'hybridation,
la figure 2A, l'hybridation de filtres à haute densité avec des sondes complexes d'ADNc dérivées d'ARNm poly (A) + de muscle squelettique de souris, et
- la figure 2B, la distribution des clones par classe d'hybridation. Exemple 1 : Production d'un mélange complexe d'ADNc à partir d'ARNm de muscle squelettique de souris.
On rapporte les résultats de 5 séries d'expériences.
On synthétise à chaque fois un mélange complexe d'ADNc par transcription inverse de 500 ng d'ARNm poly(A)+ de muscle squelettique de souris. On effectue la réaction à l'aide du système de pré-amplification
® .. .
SuperScript pour la synthèse du premier brin d'ADNc
(Life Technologies SARL, Cergy Pontoise, France) , en opérant selon les recommandations du fabricant . On utilise 500 ng d'hexamères ou 500 ng d'amorces oligo(dT), 50 μCi de [α-33P]dATP, 3000 Ci/mmole (A ersham France, S.A., Les Ulis, France) et 500 μM de d(T, C, G) TP
(Pharmacia Biotech, Orsay, France) dans un volume final de 50 μl .
On purifie le mélange complexe obtenu sur une colonne de Séphadex G- 50 (Quick Spin , Boehringer Mannheim, France S.A., Meylan, France) .
On détermine la quantité de radioactivité avant et après purification à l'aide d'un compteur de scintillation (Beckman instruments France S.A., Gagny, France) pour calculer l'activité spécifique du mélange complexe d'ADNc (cpm/μg d'ADNc) et le rendement de la synthèse en ADNc (%) . Pour calculer le rendement de la synthèse en ADNc, on utilise un maximum théorique de synthèse d'ADNc égal à 20 ng, valeur qui résulte de la concentration limitante de dATP dans la réaction (0,3 μM) .
Le tableau ci-après donne le rapport entre les conditions d'amorçage de la réaction RT, l'activité spécifique des mélanges d'ADNc complexes (AS, cp /μg d'ADNc) et le rendement de synthèse en ADNc (% du maximum théorique) .
Oligo(dT) Oligo (dt) Hexamères Hexamères + + ddTTP ddTTP
"* "correspond aux sondes utilisées pour les hybridations de filtres représentées sur la figure 2.
L'examen de ce tableau montre que l'activité spécifique des mélanges d'ADNc complexes se situe dans l'intervalle de 2 à 6 x 10 cpm/μg indépendamment des conditions de l'amorçage RT. En utilisant des amorces oligo (dT) ou des hexamères, le rendement de la réaction RT qui se situe, respectivement, de 15 à 89% et de 1 à 24%, apparaît très variable.
Au contraire, en présence de didéoxynucléotides, le rendement moyen de la réaction, égal à environ 35% en utilisant des oligo (dT) et à environ 95% en utilisant des hexamères apparaît beaucoup plus reproductible.
Les données de ce tableau montrent en outre que 1 ' incorporation de didéoxynucléotides dans le mélange réactionnel améliore l'efficacité de la synthèse d'ADNc amorcée avec les hexamères par un facteur de 5 en moyenne avec toutes les valeurs supérieures à 79%. Des résultats similaires sont obtenus en opérant avec 50 et 5 μM de ddTTP (à savoir 1/10 ou 1/100 de concentration en dNTP) et avec ddCTP à la place de ddTTP.
Exemple 2 : Utilisation du mélange complexe d'ADNc de l'exemple 1 comme sonde. On utilise le mélange complexe d'ADNc purifié aux fins d'hybridation sur des filtres de Nylon® à haute densité (Hybond-N+, Amersham France S.A., France), comportant les produits d'amplifica ion PCR des inserts de 1339 clones d'ADN à partir d'une banque de muscle squelettique humain.
Les filtres sont pré-hybridés à 68 °C pendant 30 minutes dans une solution d'hybridation ExpressHyb® (Clontech Inc., Palo Alto, CA, EUA) . On procède à l'hybridation à 68°C pendant 2 heures dans la même solution avec 20 x 10 cpm de sonde. On lave les filtres à température ambiante à deux reprises pendant 30 minutes dans SSC 1X/0,1% de SDS, et à deux reprises pendant 30 minutes dans SSC 0,1X/0,1% de SDS.
Ces conditions non stringentes permettent une hybridation optimale entre les sondes d'ADNc de souris et les cibles d'ADNc humains. Les filtres sont ensuite exposés à des écrans de phosphore pendant 16 heures
(Molecular Dynamics S.A., Paris, France).
Pour chaque filtre, on identifie et on quantifie les 1339 signaux d'hybridation à l'aide d'un logiciel spécialement conçu pour cette application
(XdotReader, Cose, France) . Pour chaque clone, la valeur de l'intensité de l'hybridation est calculée comme décrit dans Piétu et al, Génome Research, 1996, 6:492-503, et normalisée par division par la moyenne de toute les valeurs d'intensité sur chaque filtre.
L'utilisation d' hexamères et/ou de didéoxynucléotides dans la réaction RT n'introduit pas de déviation dans l'hybridation des inserts d'ADNc de différentes longueurs, comme le montre l'absence de corrélation globale entre l'intensité des signaux et la longueur des inserts d'ADNc (r <_0,05 avec les quatre conditions d'amorçage testées, rapportées dans la figure 1) .
La figure 2A illustre les aspects qualitatifs de l'hybridation de filtres à densité élevée avec les sondes d'ADNc complexes obtenues dans chaque condition testée .
L'analyse des signaux d'hybridation permet d'assigner des valeurs d'intensités aux 539 (40%), 451 (33%), 797 (60%) et 1122 (83%) clones, qui diffèrent du bruit de fond lorsque la sonde est amorcée avec, respectivement, des oligo (dT), des hexamères, des oligo (dT) + ddTTP et des hexamères + ddTTP.
Ces résultats montrent une augmentation globale des clones détectés en présence de didéoxynucléotides : + 47% et +148% en utilisant respectivement des amorces oligo (dT) ou des hexamères. La figure 2B illustre l'analyse quantitative des valeurs d'intensité d'hybridation distribuées dans 4 catégories représentatives : bruit de fond (B) , faible
(f) , moyen (M) : 2 fois la valeur faible, et forte (F) : 6 fois la valeur faible. Les significations des symboles utilisés sont les suivantes : amorces oligo (dT) : K , hexamères : ^ , amorces oligo (dT) + ddTTP : Q , et hexamères + ddTTP : \ . Le nombre de clones de chaque classe d'intensité d'hybridation est reporté en haut de chaque histogramme.
Le nombre de clones avec des valeurs d'intensités d'hybridation fortes ou moyennes montre des variations limitées lorsqu'on utilise les quatre conditions RT.
Au contraire, le nombre de clones avec des valeurs d'intensités faibles est plus que doublé lorsqu'on utilise les didoéoxynuclëotides avec des amorces oligo (dT), et multiplié presque de 18 fois lorsqu'on les utilise avec des hexamères. Dans ces conditions la fraction de clones associée aux signaux d'hybridation qui ne peut être distinguée du bruit de fond avec une fiabilité élevée est limitée à 16%, ce qui illustre la capacité améliorée de la sonde d'ADNc complexe correspondante à refléter les transcrits les moins abondants. De plus, les valeurs d'intensités d'hybridation obtenues avec une sonde d'ADNc complexe produite avec les hexamères et les didéoxynucléotides dans 4 hybridations du même filtre à densité élevée diffère de -10%.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Méthode pour la production d'un mélange complexe d'ADNc par transcription inverse d'ARNm de tissus ou de cellules, caractérisée par l'addition dans le mélange réactionnel d'ARNm, de terminateurs d' elongation, la récupération du mélange d'ADNc formé, suivi avantageusement de sa purification.
2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée par l'utilisation de didéoxynucléotides comme terminateurs d' elongation.
3/ Kits pour la synthèse de mélanges d'ADNc selon la méthode de la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils renferment en plus des réactifs pour la réalisation d'une transcription inverse, des terminateurs d' elongation, en particulier des didéoxynucléotides, et une notice d'utilisation.
4/ Mélanges d'ADNc tels qu'obtenus par mise en oeuvre de la méthode selon la revendication 1 ou 2, reflétant de manière fiable l'état transcriptionnel d'un tissu ou de cellules, à savoir le nombre et le niveau d'expression des gènes.
5/ Utilisation de mélanges complexes d'ADNc selon la revendication 4, comme sondes d'hybridation.
6/ Méthode pour l'étude de profils d'expression de gènes dans un tissu ou des cellules, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en contact des mélanges d'ADNc selon la -revendication 4, avec 1 'ADN à étudier (ADNc, ou oligonucléotides spécifiques des ADN) , dans des conditions permettant l'hybridation des séquences complémentaires lorsqu'elles sont présentes.
7/ Application de la méthode selon l'une des revendications 1 ou 2 aux productions d'ADNc par transcription inverse à partir des ARNm d'un tissu ou d'une cellule, en particulier en vue de déterminer le niveau d'expression des gènes par le comptage des ADNc clones et séquences, par exemple selon la méthode SAGE ou le séquençage partiel de banques d'ADNc.
EP00949524A 1999-06-10 2000-06-09 Methode de production de melanges complexes d'adnc et applications de ces melanges pour l'analyse de l'expression des genes Withdrawn EP1185706A1 (fr)

Applications Claiming Priority (3)

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