EP1183531A1 - Annular chromatograph - Google Patents

Annular chromatograph

Info

Publication number
EP1183531A1
EP1183531A1 EP98958716A EP98958716A EP1183531A1 EP 1183531 A1 EP1183531 A1 EP 1183531A1 EP 98958716 A EP98958716 A EP 98958716A EP 98958716 A EP98958716 A EP 98958716A EP 1183531 A1 EP1183531 A1 EP 1183531A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gels
zone
annular
annular chromatograph
chromatograph according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98958716A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Adalbert Prior
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Prior Separation Technology GmbH
Original Assignee
Prior Separation Technology GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Prior Separation Technology GmbH filed Critical Prior Separation Technology GmbH
Publication of EP1183531A1 publication Critical patent/EP1183531A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1892—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns the sorbent material moving as a whole, e.g. continuous annular chromatography, true moving beds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/58—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid the sorbent moving as a whole
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2215/00—Separating processes involving the treatment of liquids with adsorbents
    • B01D2215/02—Separating processes involving the treatment of liquids with adsorbents with moving adsorbents
    • B01D2215/022—Physically moving the adsorbent as a whole, e.g. belts, discs or sheets
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/58—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid the sorbent moving as a whole
    • G01N2030/587—Continuous annular chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
    • G01N30/463—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns for multidimensional chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters

Definitions

  • the present invention relates to a circular chromatograph with a feed in the form of a particle bed.
  • Annular chromatography has been a variant of preparative chromatographic separations that has been recognized for a number of years and is increasingly being used. Annular chromatography is preferably used when large amounts of substance mixtures have to be separated, since this type of chromatography can be operated continuously, and with a relatively high degree of resolution.
  • P-CAC preparative continuous annular chromatography
  • Such procedures are known and widely used in the prior art (see e.g. EP-A-371 .648).
  • annular chromatography In addition to the advantage of the high throughput of annular chromatography, this is also characterized by high resolution and specificity. Nevertheless, for various specific separation problems it is necessary to follow up further annular chromatography steps - for example using different separation gels than in the first step - in order to achieve the desired degree of separation. On the one hand, this is relatively easy to achieve in comparison to conventional column chromatography, since in the case of annular chromatographic separations it is known at which point on the circumference the desired product or products emerge; on the other hand, further annular chromatographs are required for this, which of course greatly increases the outlay in terms of equipment and therefore money.
  • the aim of the present invention is therefore to provide a device for annular chromatography, by means of which the resolution and specificity of this chromatographic separation process can be increased efficiently without excessively increasing the outlay on equipment and thus the process costs.
  • the invention achieves this aim by means of an annular chromatograph with a feed in the form of a particle bed, which is characterized in that the particle bed has at least two zones arranged one above the other, which contain different bed material and are preferably separated from one another by at least one separating layer.
  • At least one of the zones can be adapted as an electrophoresis zone by providing electrical connections, preferably in the form of sliding contacts, as a result of which electrophoretic separations can also be carried out in the advantageous manner described above.
  • This electrophoresis zone can preferably be delimited by at least one electrically non-conductive separating layer to the other zone (s) in order to increase the efficiency of the electrophoresis.
  • the bed material for the at least two zones can generally consist of anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, gel permeation gels, affinity gels, hydrophobchromatography (HIC) gels, displacement (displacement) resins, reversed phase (reversed phase) gels, Electrophoresis gels and other separation media used in practice, which offers a variety of possibilities for combined separations, as described in more detail below. If one of the zones in the chromatograph according to the invention is an electrophoresis zone, an electrophoresis gel is of course chosen as the particle bed for this zone.
  • the separating layer or separating layers are preferably selected from membranes, non-porous, inert particle material, in particular glass beads, and - especially for any electrophoresis zones - from electrically non-conductive material.
  • the uppermost zone of the particle bed is covered with a cover layer and / or underlaid with a base layer, the cover and base layers preferably being made of the same material as the separating layer (s).
  • a chromatograph according to the invention particularly preferably comprises at least one electrophoresis zone or at least one exclusion gel zone and at least one adsorber resin zone, in particular at least one adsorber resin zone containing an ion exchange resin, which, for example, proteins (one after the other according to their size and their charge), as well as numerous biotechnological process products such as eg enzymes, h-EGF ("human epidermal growth factor”) and immunoglobulins, separated and cleaned extremely selectively and with high resolution.
  • a tempering (ie heating or cooling) jacket can also be provided on the inner and / or outer circumference of the annular separating column (11) in order to be able to set the optimum temperature for each separation.
  • FIGS. 1 a) and 1 b) are schematic representations of an annular chromatograph with 2 or 3 separation zones that can be used according to the present invention
  • FIG. 2a) is a schematic
  • FIG. 2b) is a schematic enlargement of a detail of the dashed area from FIG. 2a).
  • FIG. 2b) is a partial view of a section through a further annular chromatograph according to the invention with an electrophoresis zone.
  • 1 a) and 1 b) two variants of the annular chromatograph of the present invention are shown schematically.
  • 1 a) shows an embodiment with two, in FIG. 1 b) one with three separation zones of the particle bed.
  • zones 1 and 2, or 1, 2 and 3 preferably consist of release resins selected from e.g. Anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, affinity gels, hydrophobchromatography (HIC) gels, displacement (displacement) resins, electrophoresis gels, and optionally from other stationary phases customary in the field, such as e.g. Silica gel, aluminum oxide, etc.
  • release resins selected from e.g. Anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, affinity gels, hydrophobchromatography (HIC) gels, displacement (displacement) resins, electrophoresis gels, and optionally from other stationary phases customary in the field, such as e.g. Silica gel, aluminum oxide,
  • the invention comprises the following combinations of two stationary phases:
  • Ion exchange chromatography e.g. Mono S (Pharmacia) or Toyopearl DEAE 650S (TosoHaas);
  • Reversed phase chromatography e.g. Amberchrom CG-161 cd (Rohm & Haas) or Sephasil C8 (Pharmacia);
  • Size exclusion and gel permeation chromatography e.g. Sephadex G1 5 (Pharmacia) or Toyopearl HW 40F (TosoHaas);
  • Affinity chromatography e.g. Toyopearl AF Tresyl-650M (TosoHaas) or EAH Sepharose-4B (Pharmacia);
  • Adsorption chromatography e.g. Amberlite XAD (Rohm & Haas) or Purolite MN200 (Purolite).
  • two cation exchange gels or two exclusion gels can also be arranged one above the other (eg Sephadex G 15 via Toyopearl HW 40F or the like).
  • annular chromatographs with a particle bed comprising at least one exclusion gel zone and at least one adsorber resin zone, in particular at least one adsorber resin zone containing an ion exchange resin, and annular chromatographs with at least one electrophoresis gel in one of the zones.
  • the two or three gels are introduced one after the other into the annular gap of an annular column 11 made of material which is inert to the components of the separation solutions, preferably glass, each of the gel zones being covered with a separation layer 5 before the next is applied thereon to prevent mixing of the different zone materials.
  • the top of the particle bed forms a cover layer 8.
  • a base layer 9 is additionally shown, which serves (in addition to a porous base plate, not shown), for example frit, membrane disc, etc. to prevent particulate matter from escaping at the bottom of the column.
  • the material for the separating, covering and base layers 5, 8, 9 is selected from membranes and non-porous particle material which is inert to all components of the respective separating solutions and can be the same or different for all three layers, but it is special must not be electrically conductive for electrophoretic separations. Glass beads are preferred according to the invention, since they are inert and easy to apply in practically all common applications.
  • the loading takes place in the order 9-2-5-1 -8, in FIG. 1 b) in the order 3-5-2-5-1-8.
  • the other components of the annular chromatograph can be designed in a conventional manner. So the column 1 1 (driven by a motor, not shown) rotatably mounted on an axis 12 and is fed via connecting lines 1 3 for feed and eluents and a distributor head 14 fixedly mounted on the axis, the feed channels 15 of the distributor head 14 preferably immersing in the cover layer 8 in order to ensure an even task.
  • the channels can have the usual designs, ie single, multiple or slot nozzles or the like, but curved slot nozzles of different widths which are adapted to the column circumference are preferred for the invention, in order to be able to match the feed and eluent flows as closely as possible.
  • outlet channels 16 are provided for collecting the eluates. These outlets 16 can either be connected to the column 11 (i.e. they rotate with it about axis 12) or they can be fixed to the axis 12 and e.g. are in contact with the column rotating relative to it via a slip ring, the latter embodiment being preferred.
  • FIG. 2a shows a partial view of an embodiment of an annular chromatograph according to the invention with an electrophoresis separation step, namely the electrophoresis separation zone 4, which leads to another zone above and below (not shown) by means of a separation layer 5 made of electrically non-conductive material is limited.
  • Slip contacts are provided both at the upper and at the lower end of the electrophoresis zone 4, preferably directly adjacent to the respective separation layer (s), each consisting of a conductor ring 6 mounted on the outside of the axis 12, each of which has a network connection 10 is supplied with current, as well as from an annular current collector 7 provided on the inside of the column 1 1, which lies closely against the conductor ring 6 and is in electrical contact therewith.
  • Example 1 Cation exchanger - exclusion gel: ion exchange-size exclusion chromatography
  • the platinum group metals rhodium, palladium, platinum and iridium can be continuously separated from one another by means of preparative annular chromatography. Common metals present at the same time, such as iron, copper, nickel or cobalt, can also be continuously separated from the precious metals.
  • the precious metal solution is usually in concentrated hydrochloric acid. Due to the high chloride concentration, the noble metals are all present as anionic chloro complexes.
  • Base metals have the property of binding to a cation exchanger under certain conditions, while the noble metals as anionic complexes pass through the cation exchanger without retention. This property can be used to make the base in the first step Separate accompanying metals from the precious metals and separate the precious metals from one another in a second process step. With the P-CAC system of the present invention, this is possible in the simplest apparatus design.
  • exclusion gel 2 e.g. Sephadex, Toyopearl or Biogel
  • d 1 50-240 ⁇ m
  • a cation exchanger 1 e.g. Dowex, Purolite, Amberlite
  • another glass bead layer 8 are layered over this glass bead layer 5.
  • the feed solution is pumped into the annular column at the radial position 0 °.
  • the feed channel 15 is immersed in the upper glass bead layer 8.
  • the main eluent (top eluent) is 0.5-1 m Hcl.
  • the noble metals run through the cation exchange layer 1 without interaction and are then separated from one another in the exclusion gel layer 2.
  • the individual fractions of rhodium (Rh), palladium (Pd), platinum (Pt) and iridium (Ir) can be collected separately.
  • the base metals adsorb to the cation exchanger and are stripped at the radial position where the last precious metal elutes (Ir) with a step eluent (2 m or higher HCI).
  • the 2 m HCI desorbs the base metals from the cation exchanger and drives them to the exclusion gel layer. There the base metals have no interaction with the stationary phase. The base metals can now be obtained as a common fraction.
  • a 26 cm high layer of Sephadex G-15 was covered with 5 cm glass beads.
  • a 5 cm thick layer of Dowex 50-W X8 was applied to this layer, which in turn was overlaid with a layer of glass beads.
  • the solution was eluted with 0.5 m HCl.
  • the noble metals passed through the cation exchange layer 1 without interaction and separated on the Sephadex layer 2.
  • Four differently colored bands formed - Rh band (red), Pd band (brown), Pt band (yellow) and Ir band (brown).
  • the step eluent (2 m HCI) was stripped for the base metals.
  • the step eluent desorbed the base metals from the cation exchanger, and a greenish-yellow band formed that runs through the column without interaction.
  • the base metals could be obtained as a common fraction after the iridium fraction.
  • Ru and Os are also contained in the separation mixture, Ru elutes between Rh and Pd and Os according to Ir (see Example 2).
  • Example 2 Adsorption resin - exclusion gel adsorption Z size exclusion chromatography
  • the exclusion gel is filled into the P-CAC (at least up to half the height), a separation layer (glass beads or membrane) is placed over the exclusion gel, the adsorption resin (Amberlite XAD7 or Purolite MN 200) is filled over this layer.
  • a separation layer glass beads or membrane
  • the adsorption resin Amberlite XAD7 or Purolite MN 200
  • a precious metal solution containing all the platinum group metals (but at least two of them) and gold is used as the feed for the P-CAC.
  • Gold is from the adsorber resin selectively adsorbed, while the other platinum group metals run unretarded through the adsorbent layer and are separated on the exclusion gel. After elution of the last component, the gold is stripped from the adsorber resin using a step eluent.
  • the anion exchanger is filled at least halfway up the P-CAC.
  • a separation layer is filled over the anion exchanger (membrane or glass beads of the appropriate size), and over the separation layer the cation exchanger up to the maximum filling level.
  • a metal solution containing rhodium and iridium as well as non-precious metals such as iron, nickel, cobalt or copper is pumped into the annular column as a feed.
  • the base metals adsorb on the cation exchanger, while rhodium and iridium pass through to the anion exchanger.
  • Ir (IV) adsorbs on the anion exchanger and rhodium runs through.
  • step eluent 1 After all rhodium is eluted, turn on this angular position with the step eluent 1 elutes the base metals. After this elution, the reduction from Ir (IV) to Ir (III) takes place with the step eluent 2.
  • Example 4 Anion exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
  • the P-CAC is filled with an exclusion gel at least up to half the fill level, then overlaid with a separating layer, which is in turn overlaid with an anion exchanger.
  • a precious metal solution which in addition to gold as a cyanide complex also contains the platinum group metals, is applied to the ring gap as a feed solution.
  • the gold cyanide binds as an anionic complex to the anion exchanger, the remaining platinum group metals pass through the anion exchanger without interaction and are separated on the exclusion gel.
  • a strip solution for the desorption of the gold is introduced into the annular gap.
  • anion exchangers and exclusion gels in biotechnology is also conceivable; eg for the production and purification of monoclonal antibodies.
  • the anion exchanger can be used to remove pyrogens, nucleic acids and proteases; the salts of the buffer solution can then be removed in the exclusion gel.
  • a P-CAC column is filled with an exclusion gel to at least 50% of the fill level, overlaid with a separating layer and loaded with superlig gels up to the final fill level (superlig gels are gels with crown ether as a functional group; trademark of IBC Advanced Technology) .
  • superlig gels are gels with crown ether as a functional group; trademark of IBC Advanced Technology) .
  • a precious metal solution containing a high proportion of base metals is applied as a feed to the ring gap of the P-CAC.
  • the base metals have no affinity for the Superlig gel and therefore elute through the entire pillar and can be collected as a common fraction.
  • the precious metals are stripped from the Superlig gel and separate on the exclusion gel in the order Rh - Pd - Pt - Ir.
  • the anion exchanger as the upper layer serves to pre-clean the cellulase; is eluted with a Tris.HCI buffer.
  • the fraction obtained, in which the cellulase is located, is then further fractionated in a cation exchanger as under layer (Pharmacia Mono S) with an acetate buffer as the eluent.
  • a very high resolution can be achieved with the cation exchanger, so that the cellulase can be obtained in a pure state.
  • Example 7 Cation exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
  • a preliminary cleaning and concentration of the antibody is achieved with the cation exchanger as the upper phase (Pharmacia S Sepharose High Performance).
  • MES with NaCI is used as a buffer.
  • the pool (fraction which also contains the antibody) is then freed of dimeric oligomers and of transferrin via an exclusion gel (Superdex 200) as the lower phase with a sterile sodium chloride buffer.
  • Example 8 Anion exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
  • the anion exchanger (Pharmacia Q - Sepharose) as the upper phase serves for the pre-cleaning (cleaning based on the charge) of the growth factor
  • the exclusion gel serves for the final cleaning of the growth factor.
  • Example 9 Hydrophobchromatography (HIC) gel exclusion gel
  • the upper stationary phase (HIC gel, Pharmacia Phenyl Sepharose CL) is used for the initial cleaning and concentration of the prolactin (concentration by a factor of 7).
  • the prolactin is finally purified on an exclusion gel (e.g. Pharmacia Sephadex G 100).
  • Protein pool can be obtained that contains proteins of the same charge, including the macroglobulin.
  • the macroglobulin is in the second layer, the HIC gel
  • the anion exchanger e.g. Pharmacia DEAE Sepharose
  • the fermentation broth is separated after loading.
  • the pool in which the transcriptase is located passes through the second layer, the HIC gel (e.g. Pharmacia Phenyl Sepharose High Performance). Due to the different hydrophobicity after this layer, the transcriptase is obtained in pure form.
  • Example 12 Cation exchanger - anion exchanger, with one of the stationary phases in the displacement (displacement) mode ion exchange-Z-displacement chromatography protein separation
  • An anion exchanger eg Pharmacia Mono Q
  • An inert layer for example glass beads or a membrane, is layered on this anion exchanger and a cation exchanger is filled in (for example Pharmacia Mono S).
  • a mixture of different proteins is separated on the cation exchanger due to different charge, the separated fractions are concentrated on the anion exchanger using a displacement reagent or displacer (eg Nalcolyte). Separation and simultaneous concentration can thus be combined.
  • a displacement reagent or displacer eg Nalcolyte
  • Example 1 3 Exclusion gel - electrophoresis gel
  • the electrophoresis gel forms the lower layer in the P-CAC, which is covered with an exclusion gel. If proteins of different charge and different pI values are now applied to the exclusion gel, they separate due to their size. The electrophoretic layer then takes over the additional separation of the proteins based on their charge.
  • Example 14 Exclusion gel - cation exchanger, with the cation exchanger in displacement mode, size exclusion zone exchange chromatography
  • an exclusion gel eg Pharmacia Sephadex G25
  • proteins eg albumins
  • a feed solution which contains the amino acids L-glutamic acid, L-valine and L-leucine. Separation in the exclusion gel gives a fraction containing the proteins and a fraction containing the amino acids.
  • the amino acids are separated on a cation exchanger (eg Dowex 50 W-X8) with a displacer (eg 0.1 N NaOH) and concentrated at the same time.
  • the amino acids are listed in the order glutamine Acid - valine - leucine obtained.
  • the displacer must be followed by a regeneration solution (eg dilute H 2 S0 4 ) in order to bring the gel bed into its original state.
  • displacement elution is also not limited to use in cation exchange.
  • the present invention provides a new annular chromatograph with a particle bed consisting of several different zones, with which several types of chromatographic separations can be carried out continuously, in one step and thus more quickly and cost-effectively than in the prior art was previously possible.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

The present invention relates to an annular chromatograph comprising a coating in the shape of a particulate bed, wherein said chromatograph is characterised in that the particulate bed comprises at least two superimposed areas which contain different materials and which are separated from each other by at least one separation layer.

Description

AnnularchromatographAnnular chromatograph
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Annularchromatographen mit einer Beschik- kung in Form eines Teilchenbetts.The present invention relates to a circular chromatograph with a feed in the form of a particle bed.
Annularchromatographie stellt eine seit einigen Jahren anerkannte und in immer stärker zunehmendem Maße praktizierte Variante präparativer chromatographischer Trennungen dar. Vorzugsweise wird Annularchromatographie eingesetzt, wenn große Mengen an Substanzgemischen aufzutrennen sind, da diese Art der Chromatographie kontinuierlich betrieben werden kann, und das bei relativ hohem Auflösungsgrad.Annular chromatography has been a variant of preparative chromatographic separations that has been recognized for a number of years and is increasingly being used. Annular chromatography is preferably used when large amounts of substance mixtures have to be separated, since this type of chromatography can be operated continuously, and with a relatively high degree of resolution.
Eine typische P-CAC-Apparatur ("P-CAC", preparative continuous annular chromato- graphy = präparative kontinuierliche Annularchromatographie) besteht aus einem kreisringförmigem Teilchenbett, das in den Zwischenraum (Ringspalt) zwischen zwei konzentrischen Zylindern gepackt ist. Unter Rotation des Teilchenbetts um seine Achse werden am oberen Ende kontinuierlich Feedlösung sowie ein oder mehrere Eluenten aufgegeben. Derartige Verfahrensweisen sind nach dem Stand der Technik bekannt und weitverbreitet (siehe z.B. EP-A-371 .648).A typical P-CAC apparatus ("P-CAC", preparative continuous annular chromatography = preparative continuous annular chromatography) consists of an annular particle bed which is packed in the space (annular gap) between two concentric cylinders. While rotating the particle bed around its axis, feed solution and one or more eluents are continuously added at the upper end. Such procedures are known and widely used in the prior art (see e.g. EP-A-371 .648).
Neben dem Vorteil der großen Durchsatzmengen der Annularchromatographie zeichnet sich diese auch durch hohe Auflösung und Spezifität aus. Dennoch ist es für verschiedene spezifische Trennprobleme erforderlich, weitere Annularchromatographieschritte - beispielsweise unter Verwendung anderer Trenngele als im ersten Schritt - nachzuschalten, um den gewünschten Trennungsgrad zu erzielen. Dies ist einerseits im Vergleich zur herkömmlichen Säulenchromatographie relativ einfach zu bewerkstelligen, da bei annularchromatographischen Trennungen bekannt ist, an welcher Stelle am Kreisumfang das oder die gewünschten Produkte austreten; andererseits sind dafür weitere Annularchromatographen vonnöten, was natürlich den apparativen und damit finanziellen Aufwand stark erhöht. Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Annularchromatographie, mittels derer die Auflösung und Spezifität dieses chromatographischen Trennverfahrens effizient gesteigert werden können, ohne den apparativen Aufwand und damit die Verfahrenskosten übermäßig zu erhöhen.In addition to the advantage of the high throughput of annular chromatography, this is also characterized by high resolution and specificity. Nevertheless, for various specific separation problems it is necessary to follow up further annular chromatography steps - for example using different separation gels than in the first step - in order to achieve the desired degree of separation. On the one hand, this is relatively easy to achieve in comparison to conventional column chromatography, since in the case of annular chromatographic separations it is known at which point on the circumference the desired product or products emerge; on the other hand, further annular chromatographs are required for this, which of course greatly increases the outlay in terms of equipment and therefore money. The aim of the present invention is therefore to provide a device for annular chromatography, by means of which the resolution and specificity of this chromatographic separation process can be increased efficiently without excessively increasing the outlay on equipment and thus the process costs.
Die Erfindung erreicht dieses Ziel durch einen Annularchromatographen mit einer Beschickung in Form eines Teilchenbetts, der dadurch gekennzeichnet ist, daß das Teilchenbett zumindest zwei übereinander angeordnete Zonen aufweist, die unterschiedliches Bettmaterial enthalten und vorzugsweise durch jeweils zumindest eine Trennschicht voneinander getrennt sind.The invention achieves this aim by means of an annular chromatograph with a feed in the form of a particle bed, which is characterized in that the particle bed has at least two zones arranged one above the other, which contain different bed material and are preferably separated from one another by at least one separating layer.
Auf diese Weise lassen sich Vor- und Haupttrennschritte oder aber mehrere Trennungen auf unterschiedlicher Grundlage, wie z.B. Ausschluß- oder Affinitäts- und lonen- austausch-Chromatographie etc., nacheinander innerhalb derselben Trennvorrichtung, kontinuierlich und mit hoher Auflösung und Spezifität durchführen, wobei zusätzlich der Zeit-, Kosten- und apparative Aufwand von Säulenwechsel, einschließlich von z.B. Einengung und Konditionierung des Gemischs für den nächsten Trennschritt, Regenerierung bzw. erneute Äquilibrierung der Säulen, etc., sowie (z.B. bei oxidations- oder feuchtigkeitsempfindlichen Substanzen) die Gefahr von Beeinträchtigungen der Proben bei deren Handhabung minimiert bzw. gänzlich ausgeschaltet werden.In this way, preliminary and main separation steps or several separations on a different basis, such as Carry out exclusion or affinity and ion exchange chromatography etc., successively within the same separating device, continuously and with high resolution and specificity, with the additional time, cost and equipment required for column changes, including e.g. Concentration and conditioning of the mixture for the next separation step, regeneration or re-equilibration of the columns, etc., as well as (e.g. in the case of substances sensitive to oxidation or moisture) the risk of impairment of the samples when handling them is minimized or completely eliminated.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann zumindest eine der Zonen durch Vorsehen von elektrischen Anschlüssen, vorzugsweise in Form von Schleifkontakten, als Elektrophoresezone adaptiert werden, wodurch auch elektrophoretische Trennungen in der oben beschriebenen vorteilhaften Weise durchgeführt werden können. Diese Elektrophoresezone kann vorzugsweise durch jeweils zumindest eine elektrisch nichtleitende Trennschicht zu der bzw. den übrigen Zone(n) hin begrenzt sein, um die Effizienz der Elektrophorese zu erhöhen. Das Bettmaterial für die zumindest zwei Zonen kann dabei allgemein aus Anionenaus- tauschharzen, Kationenaustauschharzen, Ausschlußgelen, Gelpermeationsgelen, Affinitätsgelen, Hydrophobchromatographie-(HIC-)Gelen, Verdrängungs-(Displacement-)Har- zen, Umkehrphasen-(Reversed Phase-)Gelen, Elektrophorese-Gelen und anderen in der Praxis eingesetzten Trennmedien ausgewählt werden, was eine Vielzahl von Möglichkeiten für kombinierte Trennungen bietet, wie nachstehend detaillierter beschrieben. Falls eine der Zonen im erfindungsgemäßen Chromatographen eine Elektrophoresezone ist, wird als Teilchenbett für diese Zone natürlich ein Elektrophorese-Gel gewählt.In a particularly preferred embodiment, at least one of the zones can be adapted as an electrophoresis zone by providing electrical connections, preferably in the form of sliding contacts, as a result of which electrophoretic separations can also be carried out in the advantageous manner described above. This electrophoresis zone can preferably be delimited by at least one electrically non-conductive separating layer to the other zone (s) in order to increase the efficiency of the electrophoresis. The bed material for the at least two zones can generally consist of anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, gel permeation gels, affinity gels, hydrophobchromatography (HIC) gels, displacement (displacement) resins, reversed phase (reversed phase) gels, Electrophoresis gels and other separation media used in practice, which offers a variety of possibilities for combined separations, as described in more detail below. If one of the zones in the chromatograph according to the invention is an electrophoresis zone, an electrophoresis gel is of course chosen as the particle bed for this zone.
Die Trennschicht bzw. Trennschichten werden erfindungsgemäß bevorzugt aus Membranen, nicht-porösem, inertem Teilchenmaterial, insbesondere Glasperlen, und - speziell für etwaige Elektrophoresezonen - aus elektrisch nicht-leitendem Material ausgewählt.According to the invention, the separating layer or separating layers are preferably selected from membranes, non-porous, inert particle material, in particular glass beads, and - especially for any electrophoresis zones - from electrically non-conductive material.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die oberste Zone des Teilchenbetts mit einer Deckschicht bedeckt und/oder mit einer Grundschicht unterlegt, wobei die Deck- und die Grundschicht vorzugsweise aus demselben Material wie die Trenn- schicht(en) bestehen.In preferred embodiments of the invention, the uppermost zone of the particle bed is covered with a cover layer and / or underlaid with a base layer, the cover and base layers preferably being made of the same material as the separating layer (s).
Besonders bevorzugt umfaßt ein erfindungsgemäßer Chromatograph zumindest eine Elektrophoresezone bzw. zumindest eine Ausschlußgelzone und zumindest eine Adsorberharzzone, wobei insbesondere zumindest eine Adsorberharzzone ein lonentauscher- harz enthält, womit sich z.B. Proteine (nacheinander entsprechend ihrer Größe und ihrer Ladung), sowie zahlreiche biotechnologische Verfahrensprodukte, wie z.B. Enzyme, h-EGF ("human epidermal growth factor", Human-Epidermalwachstumsfaktor) und Immunglobuline, äußerst selektiv und hochauflösend auftrennen und reinigen lassen. In einer Ausführungsform der Erfindung kann auch am inneren und/oder äußeren Umfang der annularen Trennsäule (1 1 ) ein Temperier-(d.h. Heiz- bzw. Kühl-)Mantel vorgesehen sein, um die jeweils zur Trennung optimale Temperatur einstellen zu können.A chromatograph according to the invention particularly preferably comprises at least one electrophoresis zone or at least one exclusion gel zone and at least one adsorber resin zone, in particular at least one adsorber resin zone containing an ion exchange resin, which, for example, proteins (one after the other according to their size and their charge), as well as numerous biotechnological process products such as eg enzymes, h-EGF ("human epidermal growth factor") and immunoglobulins, separated and cleaned extremely selectively and with high resolution. In one embodiment of the invention, a tempering (ie heating or cooling) jacket can also be provided on the inner and / or outer circumference of the annular separating column (11) in order to be able to set the optimum temperature for each separation.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, worin die Fig. 1 a) und 1 b) schematische Darstellungen eines gemäß vorliegender Erfindung einsetzbaren Annularchromatographen mit 2 bzw. 3 Trennzonen sind, Fig. 2a) eine schematische Teilansicht eines Schnitts durch einen weiteren erfindungsgemäßen Annularchromatographen mit Elektrophoresezone ist und Fig. 2b) eine schematische Ausschnittsvergrößerung des strichlierten Bereichs aus Fig. 2a) ist.In the following, the invention will be described by way of examples and with reference to the accompanying drawings, in which FIGS. 1 a) and 1 b) are schematic representations of an annular chromatograph with 2 or 3 separation zones that can be used according to the present invention, FIG. 2a) is a schematic FIG. 2b) is a schematic enlargement of a detail of the dashed area from FIG. 2a). FIG. 2b) is a partial view of a section through a further annular chromatograph according to the invention with an electrophoresis zone.
In den Fig. 1 a) und 1 b) sind zwei Varianten des Annularchromatographen der vorliegenden Erfindung schematisch dargestellt. In Fig. 1 a) ist eine Ausführungsform mit zwei, in Fig. 1 b) eine mit drei Trennzonen des Teilchenbetts dargestellt. Diese Zonen 1 und 2, bzw. 1 , 2 und 3, bestehen vorzugsweise aus Trennharzen, ausgewählt aus z.B. Anionen- austauschharzen, Kationenaustauschharzen, Ausschlußgelen, Affinitätsgelen, Hydro- phobchromatographie-(HIC-)Gelen, Verdrängungs-(Displacement-)Harzen, Elektrophoresegelen, sowie gegebenenfalls aus anderen auf dem Gebiet üblichen stationären Phasen, wie z.B. Kieselgel, Aluminiumoxid, etc. Diese breite Palette an Auswahlmöglichkeiten ergibt eine große Vielfalt an Kombinationen von zweien oder mehreren dieser Trennmittel.1 a) and 1 b) two variants of the annular chromatograph of the present invention are shown schematically. 1 a) shows an embodiment with two, in FIG. 1 b) one with three separation zones of the particle bed. These zones 1 and 2, or 1, 2 and 3, preferably consist of release resins selected from e.g. Anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, affinity gels, hydrophobchromatography (HIC) gels, displacement (displacement) resins, electrophoresis gels, and optionally from other stationary phases customary in the field, such as e.g. Silica gel, aluminum oxide, etc. This wide range of options results in a large variety of combinations of two or more of these release agents.
So umfaßt die Erfindung beispielsweise folgende Kombinationen zweier stationärer Phasen:For example, the invention comprises the following combinations of two stationary phases:
• Kationenaustauscher - Anionenaustauscher• Cation exchanger - anion exchanger
• Kationenaustauscher - Ausschlußgel• Cation exchanger - exclusion gel
• Anionenaustauscher - Ausschlußgel• Anion exchanger - exclusion gel
• Kationenaustauscher - Affinitätsgel • Anionenaustauscher - Affinitätsgel• Cation exchanger - affinity gel • Anion exchanger - affinity gel
• Kationenaustauscher - Hydrophobchromatographie-Gel• Cation exchanger - hydrophobic chromatography gel
• Anionenaustauscher - Hydrophobchromatographie-Gel• Anion exchanger - hydrophobic chromatography gel
• Ausschlußgel - Affinitätsgel• Exclusion gel - affinity gel
• Ausschlußgel - Hydrophobchromatographie-Gel• Exclusion gel - hydrophobic chromatography gel
• Hydrophobchromatographie-Gel - Affinitätsgel• Hydrophobchromatography gel - affinity gel
sowie derartige Kombinationen mit einem Elektrophoresegel anstelle eines der beiden obigen Gele oder zusätzlich dazu (Drei-Zonen-Chromatographie). Die obige Aufstellung der binären Kombinationsmöglichkeiten beschreibt nicht, wie die Gele in der Säule relativ zueinander angeordnet sind, d.h., welches das obere und welches das untere Gel darstellt. Dies hängt einzig und allein vom Trennproblem ab.and such combinations with an electrophoresis gel instead of or in addition to one of the two gels above (three-zone chromatography). The above list of binary combinations does not describe how the gels are arranged in the column relative to each other, i.e. which is the top and which is the bottom gel. This depends solely on the separation problem.
Beispiele für die in der Erfindung einsetzbaren Trenntechniken sind u.a.:Examples of separation techniques that can be used in the invention include:
• lonenaustauschchromatographie: z.B. Mono S (Pharmacia) oder Toyopearl DEAE 650S (TosoHaas);Ion exchange chromatography: e.g. Mono S (Pharmacia) or Toyopearl DEAE 650S (TosoHaas);
• Umkehrphasen-(Reversed Phase-)Chromatographie: z.B. Amberchrom CG- 161 cd (Rohm & Haas) oder Sephasil C8 (Pharmacia);Reversed phase chromatography: e.g. Amberchrom CG-161 cd (Rohm & Haas) or Sephasil C8 (Pharmacia);
• Hydrophobchromatographie: Phenyl Sepharose (Pharmacia) oder TSK Gel Phenyl 5PW (TosoHaas);• Hydrophobchromatography: Phenyl Sepharose (Pharmacia) or TSK Gel Phenyl 5PW (TosoHaas);
• Ausschluß-(Size Exclusion-) und Gelpermeationschromatographie: z.B. Sephadex G1 5 (Pharmacia) oder Toyopearl HW 40F (TosoHaas);Size exclusion and gel permeation chromatography: e.g. Sephadex G1 5 (Pharmacia) or Toyopearl HW 40F (TosoHaas);
• Affinitätschromatographie: z.B. Toyopearl AF Tresyl-650M (TosoHaas) oder EAH Sepharose-4B (Pharmacia);Affinity chromatography: e.g. Toyopearl AF Tresyl-650M (TosoHaas) or EAH Sepharose-4B (Pharmacia);
• Adsorptionschromatographie: z.B. Amberlite XAD (Rohm & Haas) oder Purolite MN200 (Purolite).Adsorption chromatography: e.g. Amberlite XAD (Rohm & Haas) or Purolite MN200 (Purolite).
Im Schutzumfang der Erfindung sind auch Kombinationen zweier oder mehrerer Gele desselben Typs, aber z.B. von unterschiedlichen Herstellern stammend, enthalten. Bei- spielsweise können auch zwei Kationenaustauschgele oder zwei Ausschlußgele übereinander angeordnet werden (z.B. Sephadex G 1 5 über Toyopearl HW 40F o.a.).Combinations of two or more gels of the same type, but for example from different manufacturers, are also included in the scope of the invention. - for example, two cation exchange gels or two exclusion gels can also be arranged one above the other (eg Sephadex G 15 via Toyopearl HW 40F or the like).
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden Annularchromatographen mit einem Teilchenbett aus zumindest einer Ausschlußgelzone und zumindest einer Adsorberharzzone, wobei insbesondere zumindest eine Adsorberharzzone ein lonenaustauschharz enthält, sowie Annularchromatographen mit zumindest einem Elektrophoresegel in einer der Zonen.According to the invention, particular preference is given to annular chromatographs with a particle bed comprising at least one exclusion gel zone and at least one adsorber resin zone, in particular at least one adsorber resin zone containing an ion exchange resin, and annular chromatographs with at least one electrophoresis gel in one of the zones.
Die zwei bzw. drei Gele werden nacheinander in den Ringspalt einer Annular-Säule 1 1 aus gegenüber den Komponenten der Trennlösungen inertem Material, vorzugsweise Glas, eingebracht, wobei jede der Gelzonen mit einer Trennschicht 5 bedeckt wird, bevor die nächste darauf aufgebracht wird, um eine Durchmischung der verschiedenen Zonenmaterialien zu verhindern. Den Abschluß des Teilchenbetts nach oben hin bildet in beiden Fällen eine Deckschicht 8. In Fig. 1 a) ist zusätzlich eine Grundschicht 9 dargestellt, die (zusätzlich zu einer - nicht dargestellten - porösen Bodenplatte, z.B. Fritte, Membranscheibe, etc.) dazu dient, ein Austreten von Teilchenmaterial am Boden der Säule zu verhindern. Das Material für die Trenn-, die Deck- und die Grundschichten 5, 8, 9 wird ausgewählt aus Membranen sowie nicht-porösem, gegenüber sämtlichen Komponenten der jeweiligen Trennlösungen inertem Teilchenmaterial und kann für alle drei Schichten gleich oder unterschiedlich sein, wobei es aber speziell für elektrophore- tische Trennungen nicht elektrisch leitend sein darf. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Glasperlen, da diese bei praktisch allen gängigen Anwendungen inert und leicht aufzubringen sind.The two or three gels are introduced one after the other into the annular gap of an annular column 11 made of material which is inert to the components of the separation solutions, preferably glass, each of the gel zones being covered with a separation layer 5 before the next is applied thereon to prevent mixing of the different zone materials. In both cases, the top of the particle bed forms a cover layer 8. In FIG. 1 a), a base layer 9 is additionally shown, which serves (in addition to a porous base plate, not shown), for example frit, membrane disc, etc. to prevent particulate matter from escaping at the bottom of the column. The material for the separating, covering and base layers 5, 8, 9 is selected from membranes and non-porous particle material which is inert to all components of the respective separating solutions and can be the same or different for all three layers, but it is special must not be electrically conductive for electrophoretic separations. Glass beads are preferred according to the invention, since they are inert and easy to apply in practically all common applications.
Für den Annularchromatographen aus Fig. 1 a) erfolgt somit das Beschicken in der Reihenfolge 9-2-5-1 -8, in Fig. 1 b) in der Reihenfolge 3-5-2-5-1-8.For the annular chromatograph from FIG. 1 a), the loading takes place in the order 9-2-5-1 -8, in FIG. 1 b) in the order 3-5-2-5-1-8.
Die übrigen Bauteile des Annularchromatographen können in herkömmlicher Weise ausgeführt sein. So ist die Säule 1 1 (von einem nicht dargestellten Motor angetrieben) rotierbar auf einer Achse 12 gelagert und wird über Anschlußleitungen 1 3 für Feed und Eluenten und einen fix an der Achse montierten Verteilerkopf 14 gespeist, wobei die Zufuhrkanälen 1 5 des Verteilerkopfes 14 vorzugsweise in die Deckschicht 8 eintauchen, um gleichmäßige Aufgabe zu gewährleisten. Die Kanäle können die üblichen Ausgestaltungsformen, d.h. Einzel-, Mehrfach- oder Schlitzdüsen oder dergleichen, aufweisen, für die Erfindung bevorzugt werden jedoch an den Säulenumfang angepaßt gekrümmte Schlitzdüsen unterschiedlicher Breite, um die Feed- und Eluentenströme möglichst genau aufeinander abstimmen zu können.The other components of the annular chromatograph can be designed in a conventional manner. So the column 1 1 (driven by a motor, not shown) rotatably mounted on an axis 12 and is fed via connecting lines 1 3 for feed and eluents and a distributor head 14 fixedly mounted on the axis, the feed channels 15 of the distributor head 14 preferably immersing in the cover layer 8 in order to ensure an even task. The channels can have the usual designs, ie single, multiple or slot nozzles or the like, but curved slot nozzles of different widths which are adapted to the column circumference are preferred for the invention, in order to be able to match the feed and eluent flows as closely as possible.
Am unteren Ende der Säulen sind Auslaßkanäle bzw. -röhrchen 16 zur Sammlung der Eluate vorgesehen. Diese Auslässe 16 können entweder mit der Säule 1 1 verbunden sein (d.h. sie rotieren mit dieser um Achse 12) oder aber an der Achse 12 fixiert sein und z.B. über einen Schleifring mit der sich relativ dazu drehenden Säule in Kontakt stehen, wobei letztere Ausführungsform bevorzugt wird.At the lower end of the columns, outlet channels 16 are provided for collecting the eluates. These outlets 16 can either be connected to the column 11 (i.e. they rotate with it about axis 12) or they can be fixed to the axis 12 and e.g. are in contact with the column rotating relative to it via a slip ring, the latter embodiment being preferred.
Fig. 2a) zeigt eine Teilansicht einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Annularchromatographen mit einem Elektrophorese-Trennschritt, nämlich die Elektrophorese- Trennzone 4, die zu jeweils einer anderen darüber- und darunterliegenden (nicht dargestellten) Zone hin mittels je einer Trennschicht 5 aus elektrisch nicht leitendem Material begrenzt ist. Sowohl am oberen als auch am unteren Ende der Elektrophoresezone 4, vorzugsweise direkt angrenzend an die jeweilige(n) Trennschicht(en), sind Schleifkontakte vorgesehen, bestehend aus je einem an der Außenseite der Achse 12 montierten Leiterring 6, der über jeweils einen Netzanschluß 10 mit Strom versorgt wird, sowie aus einem an der Innenseite der Säule 1 1 vorgesehenen ringförmigen Stromabnehmer 7, der eng am Leiterring 6 anliegt und in elektrischem Kontakt damit steht. Letzterer ist im Bereich des Schleifkontakts - entweder punktuell oder flächig - durch den Säulenmantel hindurch geführt, um im Inneren der Säule die für die elektrophoretische Trennung erforderliche elektrische Spannung aufzubauen. Fig. 2b) stellt eine vergrößerte Ansicht des strichlierten Bereichs aus Fig. 2a) dar und zeigt den Schleifkontakt in etwas detaillierterer Form.2a) shows a partial view of an embodiment of an annular chromatograph according to the invention with an electrophoresis separation step, namely the electrophoresis separation zone 4, which leads to another zone above and below (not shown) by means of a separation layer 5 made of electrically non-conductive material is limited. Slip contacts are provided both at the upper and at the lower end of the electrophoresis zone 4, preferably directly adjacent to the respective separation layer (s), each consisting of a conductor ring 6 mounted on the outside of the axis 12, each of which has a network connection 10 is supplied with current, as well as from an annular current collector 7 provided on the inside of the column 1 1, which lies closely against the conductor ring 6 and is in electrical contact therewith. The latter is guided through the column jacket in the area of the sliding contact - either selectively or flatly - in order to build up the electrical voltage required for the electrophoretic separation in the interior of the column. 2b) shows an enlarged view of the dashed area from FIG. 2a) and shows the sliding contact in somewhat more detailed form.
Es folgen spezifische Anwendungsbeispiele für die vorliegende Erfindung. Die Erfindung ist allerdings keineswegs auf diese Einsatzmöglichkeiten beschränkt. Bevorzugte Einsatzgebiete für erfindungsgemäße Annularchromatographen sind z.B. Trennungen von unedlen Metallen und Edelmetallen sowie zahlreiche Trennungen und Reinigungsschritte in der Biotechnologie.Specific application examples for the present invention follow. However, the invention is by no means restricted to these possible uses. Preferred fields of application for annular chromatographs according to the invention are e.g. Separations of base metals and precious metals as well as numerous separations and cleaning steps in biotechnology.
Beispiel 1 : Kationenaustauscher - Ausschlußgel: lonenaustausch-ZGrößenauschluß-ChromatographieExample 1: Cation exchanger - exclusion gel: ion exchange-size exclusion chromatography
Flüssigchromatographische Trennung der Platingruppenmetalle unter gleichzeitigerLiquid chromatographic separation of the platinum group metals with simultaneous
Entfernung der unedlen MetalleRemoval of base metal
Die Platingruppenmetalle Rhodium, Palladium, Platin und Iridium können mittels prä- parativer Annularchromatographie kontinuierlich voneinander getrennt werden. Gleichzeitig anwesende unedle Metalle wie beispielsweise Eisen, Kupfer, Nickel oder Kobalt können ebenfalls kontinuierlich von den Edelmetallen getrennt werden.The platinum group metals rhodium, palladium, platinum and iridium can be continuously separated from one another by means of preparative annular chromatography. Common metals present at the same time, such as iron, copper, nickel or cobalt, can also be continuously separated from the precious metals.
Die chromatographische Trennung der Platingruppenmetalle unter Verwendung von Austauschergelen (z.B. Sephadex, Toyopearl oder Biogel) wurde bereits in US-A- 4.885.143 beschrieben. Konzentrierte Edelmetall-Lösungen aus den Leach-Prozessen der Scheidereien enthalten in der Regel zusätzlich unedle Metalle wie Eisen, Kupfer oder Nickel in unterschiedlichen Konzentrationen.The chromatographic separation of the platinum group metals using exchange gels (e.g. Sephadex, Toyopearl or Biogel) has already been described in US-A-4,885,143. Concentrated precious metal solutions from the leaching processes of the tailor shops usually also contain base metals such as iron, copper or nickel in different concentrations.
Nach dem Leach-Prozeß liegt die Edelmetall-Lösung meist in konzentrierter Salzsäure vor. Aufgrund der hohen Chloridkonzentration liegen die Edelmetalle alle als anionische Chlorokomplexe vor. Unedle Metalle haben die Eigenschaft, sich unter bestimmten Bedingungen an einen Kationenaustauscher zu binden, während die Edelmetalle als anionische Komplexe ohne Retention durch den Kationenaustauscher laufen. Diese Eigenschaft kann man sich zunutze machen, um im ersten Verfahrensschritt die unedlen Begleitmetalle von den Edelmetalle zu trennen und in einem zweiten Verfahrensschritt die Edelmetalle untereinander aufzutrennen. Mit dem P-CAC-System der vorliegenden Erfindung wird das in einfachster apparativer Bauweise möglich.After the leaching process, the precious metal solution is usually in concentrated hydrochloric acid. Due to the high chloride concentration, the noble metals are all present as anionic chloro complexes. Base metals have the property of binding to a cation exchanger under certain conditions, while the noble metals as anionic complexes pass through the cation exchanger without retention. This property can be used to make the base in the first step Separate accompanying metals from the precious metals and separate the precious metals from one another in a second process step. With the P-CAC system of the present invention, this is possible in the simplest apparatus design.
Eine Säule, wie in Fig. 1 a) dargestellt, wird bis zu einer gewissen Höhe (genaue Versuchsbedingungen nachstehend in den Tabellen 1 und 2) mit einem Ausschlußgel 2 (z.B. Sephadex, Toyopearl oder Biogel) gefüllt und darüber Glasperlen 5 geschichtet (d = 1 50-240 μm); über diese Glasperlenschicht 5 wird ein Kationenaustauscher 1 (z.B. Dowex, Purolite, Amberlite) und darauf schließlich erneut eine Glasperlenschicht 8 geschichtet.A column, as shown in Fig. 1 a), is filled to a certain height (exact test conditions in Tables 1 and 2 below) with an exclusion gel 2 (e.g. Sephadex, Toyopearl or Biogel) and glass beads 5 layered over it (d = 1 50-240 µm); A cation exchanger 1 (e.g. Dowex, Purolite, Amberlite) and finally another glass bead layer 8 are layered over this glass bead layer 5.
Die Feedlösung wird an der radialen Position 0° in die Annularsäule eingepumpt. Dabei taucht der Feedkanal 1 5 in die obere Glasperlenschicht 8 ein. Als Haupteluens (Top-Eluens) dient 0,5-1 m Hcl. Die Edelmetalle laufen ohne Wechselwirkung durch die Kationenaustauscherschicht 1 und werden dann in der Ausschlußgelschicht 2 voneinander getrennt. Am Ende der Säule können die einzelnen Fraktionen von Rhodium (Rh), Palladium (Pd), Platin (Pt) und Iridium (Ir) getrennt aufgefangen werden.The feed solution is pumped into the annular column at the radial position 0 °. The feed channel 15 is immersed in the upper glass bead layer 8. The main eluent (top eluent) is 0.5-1 m Hcl. The noble metals run through the cation exchange layer 1 without interaction and are then separated from one another in the exclusion gel layer 2. At the end of the column, the individual fractions of rhodium (Rh), palladium (Pd), platinum (Pt) and iridium (Ir) can be collected separately.
Die unedlen Metalle adsorbieren an den Kationenaustauscher und werden an der radialen Position, an der das letzte Edelmetall eluiert (Ir) mit einem Step-Eluenten (2 m oder höher HCI) gestrippt. Die 2 m HCI desorbiert die unedlen Metalle vom Kationenaustauscher und treibt sie zur Ausschlußgelschicht. Dort haben die unedlen Metalle keinerlei Wechselwirkung mit der stationären Phase. Die unedlen Metalle können nun als gemeinsame Fraktion gewonnen werden.The base metals adsorb to the cation exchanger and are stripped at the radial position where the last precious metal elutes (Ir) with a step eluent (2 m or higher HCI). The 2 m HCI desorbs the base metals from the cation exchanger and drives them to the exclusion gel layer. There the base metals have no interaction with the stationary phase. The base metals can now be obtained as a common fraction.
Im speziellen wird eine Lösung (6 m HCI) folgender Konzentration kontinuierlich in die einzelnen Edelmetalle und in eine Fraktion, welche die unedlen Metalle enthält, getrennt. Tabelle 1 Konzentration der Metalle in der FeedlösungIn particular, a solution (6 m HCl) of the following concentration is continuously separated into the individual noble metals and into a fraction which contains the base metals. Table 1 Concentration of the metals in the feed solution
Eine 26 cm hohe Schicht Sephadex G-1 5 wurde mit 5 cm Glasperlen überschichtet. Auf diese Schicht wurde eine 5 cm dicke Schicht Dowex 50-W X8 aufgegeben, welche wiederum mit einer Glasperlenschicht überlagert wurde. Eluiert wurde die Lösung mit 0,5 m HCI. Die Edelmetalle durchliefen die Kationenaustauscherschicht 1 ohne Wechselwirkung und trennten sich auf der Sephadex-Schicht 2 auf. Dabei bildeten sich 4 verschieden gefärte Banden aus - Rh-Bande (rot), Pd-Bande (braun), Pt-Bande (gelb) und Ir-Bande (braun).A 26 cm high layer of Sephadex G-15 was covered with 5 cm glass beads. A 5 cm thick layer of Dowex 50-W X8 was applied to this layer, which in turn was overlaid with a layer of glass beads. The solution was eluted with 0.5 m HCl. The noble metals passed through the cation exchange layer 1 without interaction and separated on the Sephadex layer 2. Four differently colored bands formed - Rh band (red), Pd band (brown), Pt band (yellow) and Ir band (brown).
In einer radialen Position von 270° relativ zum Feedaufgabepunkt wurde der Step- Eluens (2 m HCI) zum Strippen für die unedlen Metalle aufgegeben. Das Step-Eluens desorbierte die unedlen Metalle vom Kationenaustauscher, und es bildete sich eine grünlich-gelbe Bande, die ohne Wechselwirkung durch die Säule läuft. Die unedlen Metalle konnten als gemeinsame Fraktion nach der Iridiumfraktion gewonnen werden.In a radial position of 270 ° relative to the feed point, the step eluent (2 m HCI) was stripped for the base metals. The step eluent desorbed the base metals from the cation exchanger, and a greenish-yellow band formed that runs through the column without interaction. The base metals could be obtained as a common fraction after the iridium fraction.
Tabelle 2 VersuchsbedingungenTable 2 Test conditions
Höhe der Säule: 41 cm, davonHeight of the column: 41 cm, thereof
26 cm Sephadex G-15 5 cm Glasperlen (d = 150-240 μm) 5 cm Dowex 50 W-X8 in der H+-Form 5 cm Glasperlen (d = 150-240 μm). Top - Eluent26 cm Sephadex G-15 5 cm glass beads (d = 150-240 μm) 5 cm Dowex 50 W-X8 in the H + shape 5 cm glass beads (d = 150-240 μm). Top eluent
Sind außerdem noch Ru und Os im Trenngemisch enthalten, so eluiert Ru zwischen Rh und Pd und Os nach Ir (siehe Beispiel 2).If Ru and Os are also contained in the separation mixture, Ru elutes between Rh and Pd and Os according to Ir (see Example 2).
Beispiel 2: Adsorptionsharz - Ausschlußgel Adsorptions-ZGrößenauschluß-ChromatographieExample 2: Adsorption resin - exclusion gel adsorption Z size exclusion chromatography
Selektive Abtrennung von Gold aus einer Edelmetall-Lösung und gleichzeitige Trennung der PlatingruppenmetalleSelective separation of gold from a precious metal solution and simultaneous separation of the platinum group metals
Das Ausschlußgel wird in den P-CAC gefüllt (zumindest bis zur halben Höhe), über das Ausschlußgel kommt eine Trennschicht (Glasperlen oder Membran), über diese Schicht wird das Adsorptionsharz (Amberlite XAD7 oder auch Purolite MN 200) gefüllt.The exclusion gel is filled into the P-CAC (at least up to half the height), a separation layer (glass beads or membrane) is placed over the exclusion gel, the adsorption resin (Amberlite XAD7 or Purolite MN 200) is filled over this layer.
Eine Edelmetall-Lösung, die alle Platingruppenmetalle (aber zumindest zwei davon) und Gold enthält, wird als Feed für den P-CAC verwendet. Gold wird vom Adsorberharz selektiv adsorbiert, während die anderen Platingruppenmetalle unretardiert durch die Adsorberschicht laufen und auf dem Ausschlußgel aufgetrennt werden. Nach der Elution der letzten Komponente wird mit einem Step-Eluenten das Gold vom Adsorberharz gestrippt.A precious metal solution containing all the platinum group metals (but at least two of them) and gold is used as the feed for the P-CAC. Gold is from the adsorber resin selectively adsorbed, while the other platinum group metals run unretarded through the adsorbent layer and are separated on the exclusion gel. After elution of the last component, the gold is stripped from the adsorber resin using a step eluent.
AdsorberharzAdsorber resin
AusschlußgelExclusion gel
Beispiel 3: Kationenaustauscher - Anionenaustauscher lonenaustausch-ChromatographieExample 3: Cation Exchanger - Anion Exchanger Ion Exchange Chromatography
Abtrennung der unedlen Metalle von einer Rh/Ir-Lösung und anschließende Trennung von Rhodium und IridiumSeparation of the base metal from a Rh / Ir solution and subsequent separation of rhodium and iridium
Der Anionenaustauscher wird zumindest bis zur halben Höhe in den P-CAC gefüllt. Über den Anionenaustauscher wird eine Trennschicht gefüllt (Membran oder Glasperlen entsprechender Größe), und über die Trennschicht der Kationenaustauscher bis zur maximalen Füllhöhe. Eine Metall-Lösung, die Rhodium und Iridium sowie Nicht-Edelmetalle wie Eisen, Nickel, Kobalt oder Kupfer enthält, wird als Feed in die Annularsäule gepumpt. Die unedlen Metalle adsorbieren am Kationenaustauscher, während Rhodium und Iridium bis zum Anionenaustauscher durchlaufen. Am Anionenaustauscher adsorbiert Ir(IV), und Rhodium läuft durch. Nachdem alles Rhodium eluiert ist, werden an dieser Winkelposition mit dem Step-Eluenten 1 die unedlen Metalle eluiert. Nach dieser Elution erfolgt die Reduktion von Ir(IV) zu Ir(lll) mit dem Step-Eluenten 2.The anion exchanger is filled at least halfway up the P-CAC. A separation layer is filled over the anion exchanger (membrane or glass beads of the appropriate size), and over the separation layer the cation exchanger up to the maximum filling level. A metal solution containing rhodium and iridium as well as non-precious metals such as iron, nickel, cobalt or copper is pumped into the annular column as a feed. The base metals adsorb on the cation exchanger, while rhodium and iridium pass through to the anion exchanger. Ir (IV) adsorbs on the anion exchanger and rhodium runs through. After all rhodium is eluted, turn on this angular position with the step eluent 1 elutes the base metals. After this elution, the reduction from Ir (IV) to Ir (III) takes place with the step eluent 2.
Feed Eluent Stepl Step2Feed Eluent Stepl Step2
KationeπtauscherCation exchangers
AnionentauscherAnion exchanger
Beispiel 4: Anionenaustauscher - Ausschlußgel lonenaustausch-ZGrößenauschluß-ChromatographieExample 4: Anion exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
Abtrennung von Goldcyanid aus einer Edelmetall-Lösung unter gleichzeitigerSeparation of gold cyanide from a precious metal solution with simultaneous
Auftrennung der EdelmetalleSeparation of the precious metals
Der P-CAC wird zumindest bis zur halben Füllhöhe mit einem Ausschlußgel befüllt, dann mit einer Trennschicht überlagert, und diese wiederum mit einem Anionenaustauscher überschichtet. Eine Edelmetall-Lösung, die neben Gold als Cyanid-Komplex auch noch die Platingruppenmetalle enthält, wird als Feed-Lösung auf den Ringspalt aufgebracht. Das Goldcyanid bindet sich als anionischer Komplex an den Anionenaustauscher, die restlichen Platingruppenmetalle durchlaufen den Anionenaustauscher ohne Wechselwirkung und werden auf dem Ausschlußgel aufgetrennt. Nach dem Winkel, an dem das letzte Platingruppenmetall (Iridium) die Säule verläßt, wird eine Strip- Lösung zur Desorption des Goldes in den Ringspalt eingebracht. Es ist auch eine Kombination von Anionenaustauschern und Ausschlußgelen in der Biotechnologie denkbar; z.B. zur Gewinnung und Reinigung von monoklonalen Antikörper. Dabei können durch den Anionenaustauscher Pyrogene, Nukleinsäuren und Proteasen entfernt werden; im Ausschlußgel können anschließend die Salze der Pufferlösung entfernt werden.The P-CAC is filled with an exclusion gel at least up to half the fill level, then overlaid with a separating layer, which is in turn overlaid with an anion exchanger. A precious metal solution, which in addition to gold as a cyanide complex also contains the platinum group metals, is applied to the ring gap as a feed solution. The gold cyanide binds as an anionic complex to the anion exchanger, the remaining platinum group metals pass through the anion exchanger without interaction and are separated on the exclusion gel. At the angle at which the last platinum group metal (iridium) leaves the column, a strip solution for the desorption of the gold is introduced into the annular gap. A combination of anion exchangers and exclusion gels in biotechnology is also conceivable; eg for the production and purification of monoclonal antibodies. The anion exchanger can be used to remove pyrogens, nucleic acids and proteases; the salts of the buffer solution can then be removed in the exclusion gel.
AnionentauscherAnion exchanger
AusschlußgelExclusion gel
Beispiel 5: Affinitätsgel - AusschlußgelExample 5: Affinity Gel - Exclusion Gel
Affinitäts-ZGrößenauschluß-ChromatographieAffinity Z size exclusion chromatography
Abtrennung von unedlen Metallen aus einer Edelmetall-Lösung unter nachfolgenderSeparation of base metals from a precious metal solution under the following
Trennung der EdelmetalleSeparation of the precious metals
Eine P-CAC-Säule wird zu mindestens 50 % der Füllhöhe mit einem Ausschlußgel befüllt, mit einer Trennschicht überlagert und mit Superlig-Gelen bis zur endgültigen Füllhöhe beschickt (Superlig-Gele sind Gele mit Kronenether als funktionelle Gruppe; Trademark von IBC Advanced Technology). Eine Edelmetall-Lösung, die einen hohen Anteil an unedlen Metallen enthält, wird als Feed auf den Ringspalt des P-CAC aufgebracht. Die unedlen Metalle haben keine Affinität zum Superlig-Gel und eluieren daher durch die gesamte Säule und können als gemeinsame Fraktion aufgefangen werden. Die Edelmetalle werden vom Superlig-Gel gestrippt und trennen sich auf dem Ausschlußgel entsprechend der Reihenfolge Rh - Pd - Pt - Ir auf.A P-CAC column is filled with an exclusion gel to at least 50% of the fill level, overlaid with a separating layer and loaded with superlig gels up to the final fill level (superlig gels are gels with crown ether as a functional group; trademark of IBC Advanced Technology) . A precious metal solution containing a high proportion of base metals is applied as a feed to the ring gap of the P-CAC. The base metals have no affinity for the Superlig gel and therefore elute through the entire pillar and can be collected as a common fraction. The precious metals are stripped from the Superlig gel and separate on the exclusion gel in the order Rh - Pd - Pt - Ir.
Feed Eluent StripFeed eluent strip
Ähnliche Applikationen sind mit stationären Phasen denkbar, die Komplexbildner (wie Dithizone, Dehydrodithizone, Hydroxychinolinate, Pyridylazo-naphtholate etc.) als reaktive Gruppen gekoppelt haben. Mit diesen stationären Phasen ist es aber nur unter schwierigen Bedingungen möglich, die Edelmetalle qualitativ voneinander zu trennen (pro Metall muß ein Strip-Eluens verwendet werden). Es ist daher nicht sinnvoll, diese stationären Phasen noch mit einer anderen Phase zu überlagern, da dies die Elutions- bedingungen zusätzlich erschweren und den Prozeß unwirtschaftlich machen würde. Beispiel 6: Kationenaustauscher - Anionenaustauscher lonenaustausch-Chromatographie Zweistufen-Reinigung einer CellulaseSimilar applications are conceivable with stationary phases that have complexing agents (such as dithizones, dehydrodithizones, hydroxyquinolinates, pyridylazo-naphtholates, etc.) coupled as reactive groups. With these stationary phases, however, it is only possible under difficult conditions to qualitatively separate the noble metals from one another (a strip eluent must be used for each metal). It is therefore not sensible to overlay these stationary phases with another phase, as this would make the elution conditions even more difficult and would make the process uneconomical. Example 6: Cation Exchanger - Anion Exchanger Ion Exchange Chromatography Two-step purification of a cellulase
Der Anionenaustauscher als obere Schicht (Pharmacia Mono Q) dient zur Vorreinigung der Cellulase; eluiert wird mit einem Tris.HCI-Puffer. Die gewonnene Fraktion, in der sich die Cellulase befindet, wird anschließend in einem Kationenaustauscher als unter Schicht (Pharmacia Mono S) mit einem Acetat-Puffer als Eluens weiter fraktioniert. Mit dem Kationenaustauscher kann eine sehr hohe Auflösung erreicht werden, sodaß die Cellulase in reinem Zustand gewonnen werden kann.The anion exchanger as the upper layer (Pharmacia Mono Q) serves to pre-clean the cellulase; is eluted with a Tris.HCI buffer. The fraction obtained, in which the cellulase is located, is then further fractionated in a cation exchanger as under layer (Pharmacia Mono S) with an acetate buffer as the eluent. A very high resolution can be achieved with the cation exchanger, so that the cellulase can be obtained in a pure state.
Beispiel 7: Kationenaustauscher - Ausschlußgel lonenaustausch-ZGrößenauschluß-ChromatographieExample 7: Cation exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
Gewinnung von monoklonalem lgG2B aus einer FermentationsbrüheObtaining monoclonal IgG 2B from a fermentation broth
Eine vorläufige Reinigung und Konzentrierung des Antikörpers wird mit dem Kationenaustauscher als obere Phase (Pharmacia S Sepharose High Performance) erreicht. Dabei wird MES mit NaCI als Puffer verwendet. Der Pool (Fraktion, die auch den Antikörper enthält) wird anschließend über ein Ausschlußgel (Superdex 200) als untere Phase mit einem sterilen Natriumchlorid-Puffer von DimerenZOligomeren sowie von Transferrin befreit.A preliminary cleaning and concentration of the antibody is achieved with the cation exchanger as the upper phase (Pharmacia S Sepharose High Performance). MES with NaCI is used as a buffer. The pool (fraction which also contains the antibody) is then freed of dimeric oligomers and of transferrin via an exclusion gel (Superdex 200) as the lower phase with a sterile sodium chloride buffer.
Beispiel 8: Anionenaustauscher - Ausschlußgel lonenaustausch-ZGrößenauschluß-ChromatographieExample 8: Anion exchanger - exclusion gel ion exchange-size exclusion chromatography
Reinigung von Human-Epidermalwachstumsfaktor (h-EGF, Human Epidermal GrowthPurification of Human Epidermal Growth Factor (h-EGF, Human Epidermal Growth
Factor), exprimiert als extracelluläres Produkt durch Saccharomyces cerevisiaeFactor), expressed as an extracellular product by Saccharomyces cerevisiae
Der Anionenaustauscher (Pharmacia Q - Sepharose) als obere Phase dient zur Vorreinigung (Reinigung aufgrund der Ladung) des Wachstumsfaktors, die untere Phase, das Ausschlußgel (Pharmacia Superdex 75) dient der Endreinigung des Wachstumsfaktors. Beispiel 9: Hydrophobchromatographie-(HIC-)Gel - AusschlußgelThe anion exchanger (Pharmacia Q - Sepharose) as the upper phase serves for the pre-cleaning (cleaning based on the charge) of the growth factor, the lower phase, the exclusion gel (Pharmacia Superdex 75) serves for the final cleaning of the growth factor. Example 9: Hydrophobchromatography (HIC) gel exclusion gel
Affin itäts-ZGrößenauschluß-ChromatographieAffinity Z Size Exclusion Chromatography
Gewinnung von Human-Hypophysen-Prolactin (Human pituitary prolactin)Obtaining human pituitary prolactin
Die obere stationäre Phase (HIC-Gel, Pharmacia Phenyl Sepharose CL) dient zur Erstreinigung und Aufkonzentrierung des Prolactins (Aufkonzentrierung um den Faktor 7). Im zweiten Schritt wird das Prolactin auf einem Ausschlußgel (z.B. Pharmacia Sephadex G 100) endgereinigt.The upper stationary phase (HIC gel, Pharmacia Phenyl Sepharose CL) is used for the initial cleaning and concentration of the prolactin (concentration by a factor of 7). In the second step, the prolactin is finally purified on an exclusion gel (e.g. Pharmacia Sephadex G 100).
Beispiel 10: Kationenaustauscher - Hydrophobchromatographie-Gel lonenaustausch-ZAffinitäts-ChromatographieExample 10: Cation Exchanger - Hydrophob Chromatography Gel Ion Exchange ZAffinity Chromatography
Gewinnung von α-2-MakroglobulinObtaining α-2 macroglobulin
Mit dem Kationenaustauscher (obere stationäre Phase, z.B. Pharmacia Mono S) kann einWith the cation exchanger (upper stationary phase, e.g. Pharmacia Mono S) one can
Proteinpool gewonnen werden, der Proteine gleicher Ladung enthält, unter anderem auch das Makroglobulin. Das Makroglobulin wird in der zweiten Schicht, dem HIC-GelProtein pool can be obtained that contains proteins of the same charge, including the macroglobulin. The macroglobulin is in the second layer, the HIC gel
(z.B. Pharmacia Phenyl Sepharose) bis zur Homogenität gereinigt.(e.g. Pharmacia Phenyl Sepharose) cleaned to homogeneity.
Beispiel 1 1 : Anionenaustauscher - Hydrophobchromatographie-Gel lonenaustausch-ZAffinitäts-ChromatographieExample 11: Anion Exchanger - Hydrophob Chromatography Gel Ion Exchange ZAffinity Chromatography
Reinigung einer rekombinanten reversen Transkriptase von HIVPurification of a recombinant reverse transcriptase from HIV
In der oberen Phase, dem Anionenaustauscher (z.B. Pharmacia DEAE Sepharose) wird die Fermentationsbrühe nach Ladung getrennt. Der Pool, in dem sich die Transkriptase befindet, durchläuft die zweite Schicht, das HIC-Gel (z.B. Pharmacia Phenyl Sepharose High Performance). Man gewinnt durch die unterschiedliche Hydrophobizität nach dieser Schicht die Transkriptase in reiner Form.In the upper phase, the anion exchanger (e.g. Pharmacia DEAE Sepharose), the fermentation broth is separated after loading. The pool in which the transcriptase is located passes through the second layer, the HIC gel (e.g. Pharmacia Phenyl Sepharose High Performance). Due to the different hydrophobicity after this layer, the transcriptase is obtained in pure form.
Beispiel 12: Kationenaustauscher - Anionenaustauscher, mit einer der stationären Phasen im Verdrängungs-(Displacement-)Modus lonenaustausch-ZVerdrängungs-Chromatographie Proteintrennung In einen Annularchromatographen wird ein Anionenaustauscher (z.B. Pharmacia Mono Q) eingefüllt. Auf diesen Anionenaustauscher wird eine inerte Schicht, z.B. Glasperlen oder eine Membran, geschichtet, und darüber ein Kationenaustauscher eingefüllt (z.B. Pharmacia Mono S). Eine Mischung unterschiedlicher Proteine wird auf dem Kationenaustauscher aufgrund unterschiedlicher Ladung getrennt, die getrennten Fraktionen werden am Anionenaustauscher unter Verwendung eines Verdrängungsreagens oder Displacers (z.B. Nalcolyte) aufkonzentriert. Somit läßt sich eine Trennung und eine simultane Aufkonzentrierung kombinieren.Example 12: Cation exchanger - anion exchanger, with one of the stationary phases in the displacement (displacement) mode ion exchange-Z-displacement chromatography protein separation An anion exchanger (eg Pharmacia Mono Q) is filled into an annular chromatograph. An inert layer, for example glass beads or a membrane, is layered on this anion exchanger and a cation exchanger is filled in (for example Pharmacia Mono S). A mixture of different proteins is separated on the cation exchanger due to different charge, the separated fractions are concentrated on the anion exchanger using a displacement reagent or displacer (eg Nalcolyte). Separation and simultaneous concentration can thus be combined.
Beispiel 1 3: Ausschlußgel - Elektrophorese-GelExample 1 3: Exclusion gel - electrophoresis gel
Größenauschluß-ChromatographieZElektrophoreseSize exclusion chromatography electrophoresis
ProteintrennungProtein separation
Das Elektrophorese-Gel bildet die untere Schicht im P-CAC, die mit einem Ausschlußgel überschichtet ist. Werden nun Proteine unterschiedlicher Ladung und unterschiedlicher pl-Werte auf das Ausschlußgel aufgebracht, trennen sich diese aufgrund der Größe. Die elektrophoretische Schicht übernimmt dann die zusätzliche Auftrennung der Proteine aufgrund ihrer Ladung.The electrophoresis gel forms the lower layer in the P-CAC, which is covered with an exclusion gel. If proteins of different charge and different pI values are now applied to the exclusion gel, they separate due to their size. The electrophoretic layer then takes over the additional separation of the proteins based on their charge.
Beispiel 14: Ausschlußgel - Kationenaustauscher, mit dem Kationenaustauscher im Verdrängungs-(Displacement-)Modus Größenauschluß-Zlonenaustausch-ChromatographieExample 14: Exclusion gel - cation exchanger, with the cation exchanger in displacement mode, size exclusion zone exchange chromatography
Aufarbeitung einer Aminosäuremischung unter gleichzeitiger Abtrennung von ProteinenProcessing of an amino acid mixture with simultaneous separation of proteins
Die obere stationäre Phase, ein Ausschlußgel (z.B. Pharmacia Sephadex G25) dient zur Abtrennung von Proteinen (z.B. Albumine) aus einer Feed-Lösung, welche die Aminosäuren L-Glutaminsäure, L-Valin und L-Leucin enthält. Die Trennung im Ausschlußgel ergibt eine Fraktion, welche die Proteine enthält, und eine Fraktion, welche die Aminosäuren enthält. In der zweiten Schicht werden die Aminosäuren auf einem Kationenaustauscher (z.B. Dowex 50 W-X8) mit einem Displacer (z.B. 0,1 n NaOH) getrennt und gleichzeitig aufkonzentriert. Die Aminosäuren werden in der Reihenfolge Glutamin- säure - Valin - Leucin gewonnen. Dem Displacer muß eine Regenerierlösung (z.B. verdünnte H2S04) folgen, um das Gelbett in den Ausgangszustand zu bringen.The upper stationary phase, an exclusion gel (eg Pharmacia Sephadex G25) is used to separate proteins (eg albumins) from a feed solution which contains the amino acids L-glutamic acid, L-valine and L-leucine. Separation in the exclusion gel gives a fraction containing the proteins and a fraction containing the amino acids. In the second layer, the amino acids are separated on a cation exchanger (eg Dowex 50 W-X8) with a displacer (eg 0.1 N NaOH) and concentrated at the same time. The amino acids are listed in the order glutamine Acid - valine - leucine obtained. The displacer must be followed by a regeneration solution (eg dilute H 2 S0 4 ) in order to bring the gel bed into its original state.
Das Beispiel der Displacement-Elution ist ebenfalls nicht auf die Anwendung im Kationenaustausch beschränkt.The example of displacement elution is also not limited to use in cation exchange.
Wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, bietet der vorliegenden Erfindung einen neuen Annularchromatographen mit einem aus mehreren unterschiedlichen Zonen bestehenden Teilchenbett, mit dem mehrere Arten chromatographischer Trennungen kontinuierlich, in einem Schritt und somit rascher und kostengünstiger durchgeführt werden können, als dies nach dem Stand der Technik bislang möglich war. As can be seen from the above description, the present invention provides a new annular chromatograph with a particle bed consisting of several different zones, with which several types of chromatographic separations can be carried out continuously, in one step and thus more quickly and cost-effectively than in the prior art was previously possible.

Claims

Patentansprüche: Claims:
1 . Annularchromatograph mit einer Beschickung in Form eines Teilchenbetts, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenbett zumindest zwei übereinander angeordnete Zonen (1 , 2, 3, 4) aufweist, die unterschiedliches Bettmaterial enthalten und vorzugsweise durch jeweils zumindest eine Trennschicht (5) voneinander getrennt sind.1 . Annular chromatograph with a charge in the form of a particle bed, characterized in that the particle bed has at least two zones (1, 2, 3, 4) arranged one above the other, which contain different bed material and are preferably separated from one another by at least one separating layer (5).
2. Annularchromatograph nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der Zonen (4) durch Vorsehen von elektrischen Anschlüssen, vorzugsweise in Form von Schleifkontakten, (6, 7) als Elektrophoresezone zur Durchführung von elektrophore- tischen Trennungen ausgebildet ist.2. Annular chromatograph according to claim 1, characterized in that at least one of the zones (4) is formed by providing electrical connections, preferably in the form of sliding contacts, (6, 7) as an electrophoresis zone for carrying out electrophoretic separations.
3. Annularchromatograph nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophoresezone (4) durch jeweils zumindest eine elektrisch nicht-leitende Trennschicht (5) zu der bzw. den übrigen Zone(n) (1 , 2, 3) hin begrenzt ist.3. Annular chromatograph according to claim 2, characterized in that the electrophoresis zone (4) by at least one electrically non-conductive separation layer (5) to the or the other zone (s) (1, 2, 3) is limited.
4. Annularchromatograph nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Bettmaterial für die zumindest zwei Zonen (1 , 2, 3, 4) aus Anionenaustausch- harzen, Kationenaustauschharzen, Ausschlußgelen, Gelpermeationsgelen, Affinitätsgelen, Hydrophobchromatographie-(HIC-)Gelen, Verdrängungs-(Displacement-)Harzen, Umkehrphasen-(Reversed Phase-)Gelen und Elektrophorese-Gelen ausgewählt ist.4. Annular chromatograph according to one of claims 1 to 3, characterized in that the bed material for the at least two zones (1, 2, 3, 4) from anion exchange resins, cation exchange resins, exclusion gels, gel permeation gels, affinity gels, hydrophobic chromatography (HIC) Gels, displacement (displacement) resins, reversed phase (reversed phase) gels and electrophoresis gels is selected.
5. Annularchromatograph nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Bettmaterial für die Elektrophoresezone (4) aus Elektrophoresegelen ausgewählt ist.5. Annular chromatograph according to claim 4, characterized in that the bed material for the electrophoresis zone (4) is selected from electrophoresis gels.
6. Annularchromatograph nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Trennschicht (5) aus Membranen, nicht-porösem, inertem Teilchenmaterial, vorzugsweise Glasperlen, und elektrisch nicht-leitendem Material ausgewählt ist. 6. Annular chromatograph according to one of the preceding claims, characterized in that the at least one separating layer (5) is selected from membranes, non-porous, inert particle material, preferably glass beads, and electrically non-conductive material.
7. Annularchromatograph nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenbett mit einer Deckschicht (8) bedeckt undZoder mit einer Grundschicht (9) unterlegt ist, wobei die Deck- und die Grundschicht (8, 9) vorzugsweise aus demselben Material wie die Trennschicht(en) (5) bestehen.7. Annular chromatograph according to one of the preceding claims, characterized in that the particle bed is covered with a cover layer (8) and Z or is underlaid with a base layer (9), the cover and base layers (8, 9) preferably made of the same material as that Separating layer (s) (5) exist.
8. Annularchromatograph nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenbett zumindest eine Elektrophoresezone enthält.8. Annular chromatograph according to one of the preceding claims, characterized in that the particle bed contains at least one electrophoresis zone.
9. Annularchromatograph nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchenbett zumindest eine Ausschlußgelzone und zumindest eine Adsorberharzzone enthält.9. Annular chromatograph according to one of the preceding claims, characterized in that the particle bed contains at least one exclusion gel zone and at least one adsorber resin zone.
10. Annularchromatograph nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Adsorberharzzone ein lonenaustauschharz enthält.10. Annular chromatograph according to claim 9, characterized in that at least one adsorber resin zone contains an ion exchange resin.
1 1 . Annularchromatograph nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß am inneren undZoder äußeren Umfang der annularen Trennsäule (1 1 ) ein Temperier-(d.h. Heiz- bzw. Kühl-)Mantel vorgesehen ist. 1 1. Annular chromatograph according to one of the preceding claims, characterized in that a tempering (i.e. heating or cooling) jacket is provided on the inner and outer circumference of the annular separating column (1 1).
EP98958716A 1997-12-01 1998-11-30 Annular chromatograph Withdrawn EP1183531A1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT203097 1997-12-01
AT203097A AT405025B (en) 1997-12-01 1997-12-01 Annular chromatograph
PCT/AT1998/000290 WO1999028740A1 (en) 1997-12-01 1998-11-30 Annular chromatograph

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1183531A1 true EP1183531A1 (en) 2002-03-06

Family

ID=3526306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP98958716A Withdrawn EP1183531A1 (en) 1997-12-01 1998-11-30 Annular chromatograph

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1183531A1 (en)
AT (1) AT405025B (en)
AU (1) AU754824B2 (en)
CA (1) CA2301570A1 (en)
EA (1) EA001640B1 (en)
WO (1) WO1999028740A1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19823814A1 (en) * 1998-05-27 1999-12-02 Octapharma Ag Ziegelbruecke Process for the separation and / or isolation of plasma proteins with annular chromatography
DE60126283T2 (en) 2001-10-03 2007-07-05 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method of reconstituting a biologically active recombinant protein
CN110441428B (en) * 2019-08-19 2021-08-24 江南大学 Method for rapidly analyzing protein and strong-polarity long amino acid sequence glycopeptide

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE950281C (en) * 1949-12-23 1956-10-18 Lkb Produkter Fabriks Aktiebol Method and device for the chromatographic separation of mixtures of different substances in solutions by means of sorption
DE2440848A1 (en) * 1974-08-26 1976-03-18 W Killer Ag Dr Continuous separation of component mixtures - using rotating annular vessel with cells filled with adsorbent material
US4642169A (en) * 1984-08-01 1987-02-10 University Of Iowa Research Foundation Continuous rotating electrophoresis column and process of using
US4740306A (en) * 1986-03-17 1988-04-26 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Chromatographic column
US4683042A (en) * 1986-04-29 1987-07-28 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method and apparatus for continuous annular electrochromatography
US5217608A (en) * 1988-07-21 1993-06-08 The Research Foundation Of State University Of New York Multi-column planet centrifuge chromatograph
US5149436A (en) * 1988-11-28 1992-09-22 Union Oil Company Of California Continuous displacement chromatographic method
DE4231327A1 (en) * 1992-09-18 1994-03-24 Reuter Karl Dr Continuous chromatography

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO9928740A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
ATA203097A (en) 1998-09-15
CA2301570A1 (en) 1999-06-10
EA199901022A1 (en) 2000-04-24
AT405025B (en) 1999-04-26
WO1999028740A1 (en) 1999-06-10
EA001640B1 (en) 2001-06-25
AU754824B2 (en) 2002-11-28
AU1474399A (en) 1999-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1140316B1 (en) Continuous method for separating substances according to molecular size
JP2001122869A (en) Tocotrienols purified by using liquid chromatography and method for producing tocotrienols
DE69604138T2 (en) Process for the fractional separation of the platinum group metals
DE68904732T2 (en) ION EXCHANGE AND SEPARATION METHOD.
DE60104833T2 (en) METHOD FOR SEPARATING A BASIC AMINO ACID FROM FERMENTATION BROTHS
AT405025B (en) Annular chromatograph
DE19611094C2 (en) Process for the purification of cyclosporin A and / or related cyclosporins from a cyclosporin-containing crude extract using chromatographic processes using silica gel as the adsorbent
US4885143A (en) Method for the interseparation of platinum group metals
DE19617775A1 (en) Selective filtration unit
JP2001098335A (en) Separation of platinum group metal
JP4550272B2 (en) Separation of platinum group metals
Kang et al. High-performance chromatofocusing using linear and concave pH gradients formed with simple buffer mixtures: II. Separation of proteins
US4758349A (en) Separation process for biological media
DE2448371C2 (en) Process for the isolation of transferrins from biological material
EP0968038B1 (en) Method and installation for adsorptive substance separation
EP0963227A1 (en) Annular chromatograph
EP3167283B1 (en) Device, use of said device, and method for separating substances with an improved utilization of the capacity of chromatographic media
EP1080112B1 (en) Method for separating and/or isolating plasma proteins by annularchromatography
EP4121186B1 (en) Chromatographic method for separating transition metals
DE19858777B4 (en) Process for the partial or complete separation of glycosylated and non-glycosylated proteins
DE102019004920B4 (en) Chromatographic process for the continuous separation and fractionation of multi-component mixtures, and a suitable device
EP0473011A2 (en) Process and installation for obtaining enzymes from enzyme containing suspension
EP1231992A1 (en) Method for separating cells and biomolecules using counter-current chromatography
Adachi et al. Ion-exchange high-performance liquid chromatographic separation of protein variants and isoforms on MCI GEL ProtEx stationary phases
WO1998057722A1 (en) Gradient elusion method

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 19991206

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BE CH DE ES FR GB IT LI NL SE

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20040602