EP1173557A1 - Method for encapsulating macromolecules and/or particles and use thereof - Google Patents

Method for encapsulating macromolecules and/or particles and use thereof

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EP1173557A1
EP1173557A1 EP00927032A EP00927032A EP1173557A1 EP 1173557 A1 EP1173557 A1 EP 1173557A1 EP 00927032 A EP00927032 A EP 00927032A EP 00927032 A EP00927032 A EP 00927032A EP 1173557 A1 EP1173557 A1 EP 1173557A1
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EP
European Patent Office
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substance
particles
macromolecules
released
temperature
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00927032A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Robert-Matthias Leiser
Vitali Pavlovich Zubov
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nexttec GmbH
Original Assignee
nexttec GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1173557A1 publication Critical patent/EP1173557A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/04—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction

Definitions

  • the present invention relates to a method for the inclusion of macromolecules.
  • the method according to the invention presented offers a solution which overcomes the described technological disadvantages of the prior art.
  • An additional advantage of the method according to the invention is that the enclosed macromolecules and / or particles are thermally stabilized.
  • the present invention relates to a method for the inclusion of macromolecules and / or particles, in which at least two substances A and B are used, of which substance A is liquid at a temperature greater than or equal to Tl in a gel state and less than or equal to Tl and Fabric B forms the outer cover.
  • the included macromolecules and / or particles can be released by sequentially opening the outer shell and changing the temperature to less than or equal to Tl.
  • substance B is solid at a temperature less than or equal to T2 and liquid at a temperature greater than or equal to T2.
  • the enclosed macromolecules and / or particles can be released by sequential changes in temperature.
  • the temperature T1 is preferably lower than T2.
  • substance B forms a shell which is opened by physical, chemical or enzymatic action.
  • the enclosed macromolecules and / or particles are released by sequential physical, chemical or enzymatic action and temperature change.
  • the macromolecules are preferably proteins, lectins, enzymes and / or nucleic acids.
  • the particles are preferably virus particles or parts thereof, cells or parts thereof, carrier materials or the like.
  • substance A forms a solution or suspension with the macromolecules and / or particles to be enclosed at a temperature of less than or equal to T2.
  • substance A or the mixture of substance A and the macromolecules and / or particles to be enclosed is at least partially dehydrated within the outer shell formed by substance B.
  • substance B is involved about paraffin.
  • substance B is gelatin or other polysaccharide gels, polymerized liposomes, complexes of polyionic acids and bases or polyacrylates.
  • substance A is polyvinyl caprolactam.
  • substance A is water-soluble copolymers with polyvinylcaprolactam.
  • the polyvinylcaprolactam is preferably used with an average molecular weight of 150,000 to 1,200,000 and in concentrations of preferably 1 to 20%.
  • the method according to the invention is used in particular for sequential enzymatic reactions. Necessary components for a later enzymatic reaction are encapsulated and released into the reaction mixture of the earlier enzymatic reaction at the desired time.
  • the method is used in particular in the contamination control of DNA amplification reactions.
  • the invention makes it possible that, after a PCR reaction, the resulting amplificate is trimmed (cut) before opening the reaction vessel in such a way that it can no longer serve as a matrix for renewed amplifications, but remains accessible for detection.
  • deoxyuridine residues are incorporated into the PCR primers instead of thymidine residues.
  • an enzyme mixture of a thermostable form of the enzyme uracil-DNA glycosylase (UDG) and Pfu DNA polymerase mixed with polyvinyl caprolactam (PVC) and enclosed in an outer paraffin shell is formed from the mixture of enzymes and PVC during the first heating to temperatures above 45 ° C within the outer paraffin capsule. When the reaction mixture is heated further to 95 ° C.
  • the outer paraffin capsule is melted; in the course of the reaction, the paraffin forms a thin film on the surface of the reaction mixture and is thus separated from the PVC capsule formed.
  • the PVK capsule is retained throughout the amplification and separates the enzyme mixture of UDG and Pfu-DNA polymerase from the other components of the reaction mixture.
  • the reaction mixture is cooled to 20 ° C.
  • the PVC capsules are dissolved and the enzyme mixture is released. According to DE 199 13 834, the amplification products are trimmed.
  • DE 199 13 834 discloses a process for the degradation of in vitro synthesized nucleic acid molecules with the steps of incorporating at least one derivative of nucleotide residues into at least one starter oligonucleotide necessary for the amplification, performing the amplification and incorporation of the starter oligonucleotide (s) into the amplification products and, after completion of the amplification, degradation of the starter oligonucleotide sequences and their complementary sequences, the degradation of the starter oligonucleotide sequences and their complementary sequences comprising the following steps: cleavage of the base of the at least one derivative by means of a nucleic acid glycosylase which comprises the at least one Derivative recognizes creation of strand breaks at the point (s) at which the base (s) have been cleaved, separation of the oligonucleotide (s) resulting from the cleavage from the complementary strands of the amplification products and removal (hydrolysis) of the
  • aqueous solution of the enzyme mixture (see below) are added to 0.5 ml of a 6% strength aqueous solution of polyvinylcaprolactam (MW 900,000).
  • the mixture is kept for 30 to 60 min at room temperature with constant mixing (gentle shaking).
  • a thin paraffin film ( ⁇ ⁇ 1 mm) is applied to a glass plate by immersing the glass plate in liquid paraffin (heated to 60 ° C.) and cooling to room temperature (approx. 1 min).
  • the PVC-enzyme mixture (point 1) is added dropwise (5 to 10 ⁇ l) to the paraffin layer.
  • the capsules which contain the PVC-enzyme mixture, are cut out and placed in the PCR reaction vessels.
  • the PCR and the detection of the prevention of the risk of contamination are carried out as described in DE 199 13 834.6 in Example 1 with the proviso that the enzyme mixture according to item 1 of the present description from 5 units of UDG per 100 ⁇ l and 5 units of Pfu-DNA Polymerase consists of 100 ⁇ l in PCR reaction buffer.
  • the amplification products are trimmed after completion of the PCR by incubating the unopened PCR tubes for 20 min at 37 ° C. without further (external) addition of an enzyme mixture of UDG and Pfu DNA polymerase.
  • Example 1 of DE 199 13 832 is carried out as follows:
  • target DNA takes place in a thermocoder (GeneAmp PCR System 9700 from Perkin Elmer) with a preferably heated lid.
  • the DNA is first denatured for 5 min at 94 ° C and then amplified for 30 cycles under the following conditions:
  • UDG uracil DNA glycosylase dU 2'-deoxyuridine dUCP 5 -Dimethoxytrityl-dU-3 '- [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite
  • the oligonucleotides are synthesized in the synthesizer according to the regulations corresponding to the device.
  • the dUCP is installed at three thymine positions of the primers.

Abstract

The invention relates to a method for encapsulating macromolecules and/or particles. The method is characterised in that at least two substances A and B are used for the encapsulation of the macromolecules and/or particles. Substance A presents a gel-type state at temperatures greater than T1 and is liquid at temperatures below T1. Substance B encases the mixture of substance A and the macromolecules and/or particles to be encapsulated. The encapsulated macromolecules and/or particles are released through the sequential opening of the case formed from substance B and the adjustment of the temperature to below T1.

Description

Verfahren zur Einschließung von Makromolekülen und/oder Partikeln und seine Verwendung Process for the inclusion of macromolecules and / or particles and its use
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Einschließung von Makromolekülen.The present invention relates to a method for the inclusion of macromolecules.
In der Biochemie und Molekularbiologie werden häufig aufeinanderfolgende enzymatische Reaktionen durchgeführt, wozu in der Regel nach jeder Einzeletappe neue Reagenzien zugeführt werden müssen. Dies ist nicht nur wegen des Aufwandes von Nachteil, sondern bedeutet meist eine Gefahr der Verunreinigung des Reaktionsgemisches oder der Verschleppung von Reaktionsprodukten. Deshalb sind Methoden und Verfahren wünschenswert, die die räumliche Trennung von Reaktionspartnern und die Aufhebung dieser Trennung von außen, ohne erneutes Öffnen und Schließen des Reaktionsgefäßes ermöglichen.In biochemistry and molecular biology, successive enzymatic reactions are often carried out, for which purpose new reagents usually have to be added after each individual stage. This is not only disadvantageous because of the effort involved, but usually means that the reaction mixture is contaminated or reaction products are carried over. Therefore, methods and procedures are desirable which enable the spatial separation of reaction partners and the removal of this separation from the outside without opening and closing the reaction vessel again.
Das vorgelegte erfindungsgemäße Verfahren bietet hierzu eine Lösung an, die die beschriebenen technologischen Nachteile des bisherigen Standes der Technik überwindet.For this purpose, the method according to the invention presented offers a solution which overcomes the described technological disadvantages of the prior art.
Ein zusätzlicher Vorteil, des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass eine Thermostabilisierung der eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln erfolgt.An additional advantage of the method according to the invention is that the enclosed macromolecules and / or particles are thermally stabilized.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einschließung von Makromolekülen und/oder Partikeln, bei dem mindestens zwei Stoffe A und B zum Einsatz kommen, von denen Stoff A bei einer Temperatur größer oder gleich Tl in einem gelförmigen Zustand und kleiner oder gleich Tl flüssig ist und Stoff B die äußere Hülle bildet. Die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln können durch sequentielle Öffnung der äußeren Hülle und Temperaturänderung auf kleiner/gleich Tl freigesetzt werden.The present invention relates to a method for the inclusion of macromolecules and / or particles, in which at least two substances A and B are used, of which substance A is liquid at a temperature greater than or equal to Tl in a gel state and less than or equal to Tl and Fabric B forms the outer cover. The included macromolecules and / or particles can be released by sequentially opening the outer shell and changing the temperature to less than or equal to Tl.
In einer vorteilhaften Ausführungsform dieses Verfahrens ist Stoff B bei einer Temperatur kleiner oder gleich T2 fest und bei einer Temperatur größer oder gleich T2 flüssig. Die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln können durch sequentielle Temperaturänderungen freigesetzt werden.In an advantageous embodiment of this method, substance B is solid at a temperature less than or equal to T2 and liquid at a temperature greater than or equal to T2. The enclosed macromolecules and / or particles can be released by sequential changes in temperature.
Vorzugsweise ist die Temperatur Tl niedriger als T2.The temperature T1 is preferably lower than T2.
In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens zur Einschließung von Makromolekülen und/oder Partikeln bildet Stoff B eine Hülle, die durch physikalische, chemische oder enzymatische Einwirkung geöffnet wird. Die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln werden durch sequentielle physikalische, chemische oder enzymatische Einwirkung und Temperaturänderung freigesetzt.In another embodiment of the method for enclosing macromolecules and / or particles, substance B forms a shell which is opened by physical, chemical or enzymatic action. The enclosed macromolecules and / or particles are released by sequential physical, chemical or enzymatic action and temperature change.
Bei den Makromolekülen handelt es sich vorzugsweise um Proteine, Lektine, Enzyme und/oder Nukleinsäuren.The macromolecules are preferably proteins, lectins, enzymes and / or nucleic acids.
Bei den Partikeln handelt es sich vorzugsweise um Viruspartikeln oder Teile von diesen, Zellen oder Teile von diesen, Trägermaterialien oder ähnliches.The particles are preferably virus particles or parts thereof, cells or parts thereof, carrier materials or the like.
Der Stoff A bildet in einer vorzugsweisen Ausführungsform der Erfindung bei der Temperatur kleiner oder gleich T2 mit den einzuschließenden Makromolekülen und/oder Partikeln eine Lösung oder Suspension.In a preferred embodiment of the invention, substance A forms a solution or suspension with the macromolecules and / or particles to be enclosed at a temperature of less than or equal to T2.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Stoff A oder das Gemisch aus Stoff A und den einzuschließenden Makromolekülen und/oder Partikeln innerhalb der durch Stoff B gebildeten äußeren Hülle zumindest partiell dehydratiert.In another embodiment of the invention, substance A or the mixture of substance A and the macromolecules and / or particles to be enclosed is at least partially dehydrated within the outer shell formed by substance B.
In einer vorzugsweisen Ausführung der Erfindung handelt es sich bei Stoff B um Paraffin.In a preferred embodiment of the invention, substance B is involved about paraffin.
In einer weiteren vorzugsweisen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei Stoff B um Gelatine oder andere Polysaccharidgele, polymerisierte Liposomen, Komplexe aus polyionischen Säuren und Laugen oder Polyacrylate.In a further preferred embodiment of the invention, substance B is gelatin or other polysaccharide gels, polymerized liposomes, complexes of polyionic acids and bases or polyacrylates.
In einer vorzugsweisen Ausführung der Erfindung handelt es sich bei Stoff A um Polyvinylcaprolactam.In a preferred embodiment of the invention, substance A is polyvinyl caprolactam.
In einer weiteren vorzugsweisen Ausführung der Erfindung handelt es sich bei Stoff A um wasserlösliche Copolymere mit Polyvinylcaprolactam.In a further preferred embodiment of the invention, substance A is water-soluble copolymers with polyvinylcaprolactam.
Das Polyvinylcaprolactam wird bevorzugt mit einer mittleren Molekülmasse von 150.000 bis 1.200.000 und in Konzentrationen von vorzugsweise 1 bis 20% eingesetzt.The polyvinylcaprolactam is preferably used with an average molecular weight of 150,000 to 1,200,000 and in concentrations of preferably 1 to 20%.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere für sequentielle enzymatische Reaktionen eingesetzt. Hierbei werden notwendige Komponenten für eine spätere enzymatische Reaktion eingekapselt und zum gewünschten Zeitpunkt in das Reaktionsgemisch der früheren enzymatischen Reaktion freigesetzt.The method according to the invention is used in particular for sequential enzymatic reactions. Necessary components for a later enzymatic reaction are encapsulated and released into the reaction mixture of the earlier enzymatic reaction at the desired time.
Insbesondere findet das Verfahren bei der Kontaminationskontrolle von DNA- Amplifikationsreaktionen Anwendung.The method is used in particular in the contamination control of DNA amplification reactions.
Die Erfindung ermöglicht es, dass nach einer PCR-Reaktion das entstandene Amplifikat vor Öffnen des Reaktionsgefäßes derart getrimmt (geschnitten) wird, daß es nicht weiter als Matrix für erneute Amplifikationen dienen kann, jedoch einer Detektion zugänglich bleibt.The invention makes it possible that, after a PCR reaction, the resulting amplificate is trimmed (cut) before opening the reaction vessel in such a way that it can no longer serve as a matrix for renewed amplifications, but remains accessible for detection.
Hierzu werden in die PCR-Primer statt Thymidinresten Desoxyuridinreste eingebaut. Für den erfindungsgemäßen Einschluß wird z.B. ein Enzymgemisch aus einer thermostabilen Form des Enzyms Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) und Pfu-DNA-Polymerase mit Polyvinylkaprolaktam (PVK) gemischt und in eine äußere Hülle aus Paraffin eingeschlossen. Nach Start der PCR bildet sich während der ersten Erwärmung auf Temperaturen oberhalb 45°C innerhalb der äußeren Paraffinkapsel aus dem Gemisch aus Enzymen und PVK eine innere Kapsel. Bei der weiteren erstmaligen Erwärmung des Reaktionsgemisches auf 95°C wird die äußere Paraffinkapsel geschmolzen; das Paraffin bildet im weiteren Reaktionsverlauf einen dünnen Film auf der Oberfläche des Reaktionsgemisches und ist damit von der entstandenen PVK- Kapsel abgetrennt. Die PVK-Kapsel bleibt während der gesamten Amplifikation erhalten und separiert das Enzymgemisch aus UDG und Pfu-DNA-Polymerase von den übrigen Bestandteilen des Reaktionsansatzes. Nach Abschluß der PCR wird das Reaktionsgemisch auf 20°C abgekühlt. Hierbei werden die PVK- Kapseln gelöst und das Enzymgemisch freigesetzt. Es folgt entsprechend der DE 199 13 834 das Trimmen der Amplifikate.For this purpose, deoxyuridine residues are incorporated into the PCR primers instead of thymidine residues. For the inclusion according to the invention, for example, an enzyme mixture of a thermostable form of the enzyme uracil-DNA glycosylase (UDG) and Pfu DNA polymerase mixed with polyvinyl caprolactam (PVC) and enclosed in an outer paraffin shell. After the start of the PCR, an inner capsule is formed from the mixture of enzymes and PVC during the first heating to temperatures above 45 ° C within the outer paraffin capsule. When the reaction mixture is heated further to 95 ° C. for the first time, the outer paraffin capsule is melted; in the course of the reaction, the paraffin forms a thin film on the surface of the reaction mixture and is thus separated from the PVC capsule formed. The PVK capsule is retained throughout the amplification and separates the enzyme mixture of UDG and Pfu-DNA polymerase from the other components of the reaction mixture. After completion of the PCR, the reaction mixture is cooled to 20 ° C. The PVC capsules are dissolved and the enzyme mixture is released. According to DE 199 13 834, the amplification products are trimmed.
Die DE 199 13 834 offenbart ein Verfahren zum Abbau von in-vitro synthetisierten Nucleinsäuremolekülen mit den Schritten Einbau von mindestens einem Derivat von Nucleotidresten in mindestens ein für die Amplifikation notwendiges Starter-Oligonucleotid, Durchführung der Amplifikation und Einbau der/des Starteroligonucleotide(s) in die Amplifikationsprodukte und nach Beendigung der Amplifikation, Abbau der Starter-Oligonucleotid-Sequenzen und deren Komplementärsequenzen, wobei der Abbau der Starter-Oligonucleotid-Sequenzen und deren Komplementärsequenzen folgende Schritte umfaßt: Abspaltung der Base des mindestens einen Derivates mittels einer Nucleinsäureglycosylase, die das mindestens eine Derivat erkennt, Schaffung von Strangbrüchen an der (den) Stelle(n), an der (denen) die Base(n) abgespalten worden ist (sind), Trennung der/des durch die Abspaltung entstandenen Oligonucleotide(s) von den Komplementärsträngen der Amplifikationsprodukte und Entfernung (Hydrolyse) des (der) entstandenen überhängenden 3 '-Endes (en) der Amplifikationsprodukte durch eine Nuclease, die 3 '-überhängende Enden eines Nucleinsäurestranges abspalten kann. Die Details dieser Experimente sind nachfolgend angeführt.DE 199 13 834 discloses a process for the degradation of in vitro synthesized nucleic acid molecules with the steps of incorporating at least one derivative of nucleotide residues into at least one starter oligonucleotide necessary for the amplification, performing the amplification and incorporation of the starter oligonucleotide (s) into the amplification products and, after completion of the amplification, degradation of the starter oligonucleotide sequences and their complementary sequences, the degradation of the starter oligonucleotide sequences and their complementary sequences comprising the following steps: cleavage of the base of the at least one derivative by means of a nucleic acid glycosylase which comprises the at least one Derivative recognizes creation of strand breaks at the point (s) at which the base (s) have been cleaved, separation of the oligonucleotide (s) resulting from the cleavage from the complementary strands of the amplification products and removal (hydrolysis) of the resulting overhanging 3 ' end (s) of the amplification products by a nuclease which can cleave 3 ' overhanging ends of a nucleic acid strand. The details of these experiments are given below.
Beispielexample
1. Zu 0,5 ml einer 6%igen wäßrigen Lösung von Polyvinylcaprolactam (MW 900.000) werden 0,5 ml der wäßrigen Lösung des Enzymgemisches (siehe unten) gegeben.1. 0.5 ml of the aqueous solution of the enzyme mixture (see below) are added to 0.5 ml of a 6% strength aqueous solution of polyvinylcaprolactam (MW 900,000).
2. Die Mischung wird für 30 bis 60 min bei Raumtemperatur unter beständigem Mischen (vorsichtigem Schütteln) gehalten.2. The mixture is kept for 30 to 60 min at room temperature with constant mixing (gentle shaking).
3. Auf eine Glasplatte wird durch Eintauchen der Glasplatte in flüssiges Paraffin (erwärmt auf 60°C) und Abkühlen auf Raumtemperatur (ca. 1 min) ein dünner Paraffinfilm (δ< 1 mm) aufgebracht.3. A thin paraffin film (δ <1 mm) is applied to a glass plate by immersing the glass plate in liquid paraffin (heated to 60 ° C.) and cooling to room temperature (approx. 1 min).
4. Die PVK-Enzym-Mischung (Punkt 1) wird tropfenweise (5 bis 10 μl) auf die Paraffinschicht gegeben.4. The PVC-enzyme mixture (point 1) is added dropwise (5 to 10 μl) to the paraffin layer.
5. Die Tropfen werden unmittelbar danach mit einer zweiten Paraffinschicht in gleicher Weise wie unter Punkt 3 überzogen.5. Immediately afterwards, the drops are coated with a second paraffin layer in the same way as in point 3.
6. Nach Abkühlung werden die Kapseln, die die PVK-Enzym-Mischung enthalten, ausgeschnitten und in die PCR-Reaktionsgefäße gegeben.6. After cooling, the capsules, which contain the PVC-enzyme mixture, are cut out and placed in the PCR reaction vessels.
7. Die PCR und der Nachweis der Unterbindung der Kontaminationsgefährdung werden durchgeführt wie in DE 199 13 834.6 in Beispiel 1 beschrieben mit der Maßgabe, daß das Enzymgemisch nach Punkt 1 der vorliegenden Beschreibung aus 5 Einheiten UDG je 100 μl und 5 Einheiten Pfu-DNA- Polymerase je 100 μl in PCR-Reaktionspuffer besteht. Das Trimmen der Amplifikate nach Abschluß der PCR erfolgt durch Inkubation der ungeöffneten PCR-Gefäße für 20 min bei 37°C ohne weitere (externe) Zugabe eines Enzymgemisches aus UDG und Pfu-DNA-Polymerase. Das Beispiel 1 der DE 199 13 832 wird wie folgt durchgeführt:7. The PCR and the detection of the prevention of the risk of contamination are carried out as described in DE 199 13 834.6 in Example 1 with the proviso that the enzyme mixture according to item 1 of the present description from 5 units of UDG per 100 μl and 5 units of Pfu-DNA Polymerase consists of 100 μl in PCR reaction buffer. The amplification products are trimmed after completion of the PCR by incubating the unopened PCR tubes for 20 min at 37 ° C. without further (external) addition of an enzyme mixture of UDG and Pfu DNA polymerase. Example 1 of DE 199 13 832 is carried out as follows:
Zur Durchführung der PCR werden folgende Reaktionskomponenten miteinander vermischt:The following reaction components are mixed with one another to carry out the PCR:
lOx PCR-Puffer10 x PCR buffer
(0,1% Tween, 660mM Tris-HCI pH 8,8, 166mM (NH4)2SO4 5,0μl(0.1% Tween, 660mM Tris-HCl pH 8.8, 166mM (NH 4 ) 2 SO 4 5.0 µl
MgCI2 (25mM) 5,0μl dNTP's (je 2mM) 5,0μiMgCI 2 (25mM) 5.0μl dNTP's (2mM each) 5.0μi
DNA-Polymerase (5U/μl) 0,2μlDNA polymerase (5U / µl) 0.2µl
DNA-Template (0,2ng/μl) 5,0μlDNA template (0.2ng / μl) 5.0μl
Primer A (30pmol) l,0μlPrimer A (30pmol) 1.0μl
Primer B (30pmol) l,0μlPrimer B (30pmol) 1.0μl
H2O 27,8μlH 2 O 27.8 µl
Die Amplifikation der Ziel-DNA (Target-DNA) erfolgt in einem Thermocyder (GeneAmp PCR System 9700 von Perkin Eimer) mit vorzugsweise beheiztem Deckel. Hierbei wird die DNA zuerst für 5min bei 94°C denaturiert und anschließend für 30 Zyklen unter folgenden Bedingungen amplifiziert:The amplification of the target DNA (target DNA) takes place in a thermocoder (GeneAmp PCR System 9700 from Perkin Elmer) with a preferably heated lid. The DNA is first denatured for 5 min at 94 ° C and then amplified for 30 cycles under the following conditions:
30sec 94°C Zyklus-Denaturierung30sec 94 ° C cycle denaturation
15sec 56°C Primer-Hybridisierung („Annealing")15sec 56 ° C primer hybridization ("annealing")
20sec 72°C Elongation („Extension")20sec 72 ° C elongation ("Extension")
Zum Abschluß des PCR-Programmes erfolgt eine nochmalige Elongation bei 72°C für 1min.At the end of the PCR program, another elongation takes place at 72 ° C for 1min.
Abkürzungen:Abbreviations:
UDG Uracil-DNA-Glycosylase dU 2'-Desoxyuridin dUCP 5,-Dimethoxytrityl-dU-3'-[(2-cyanethyl)-(N,N-diisopropyl)]- phosphoramidit Die Oligonucleotide werden im Syntheseautomaten nach den dem Gerät entsprechenden Vorschriften synthetisiert. Der Einbau des dUCP erfolgt dabei an jeweils drei Thymin-Positionen der Primer.UDG uracil DNA glycosylase dU 2'-deoxyuridine dUCP 5 , -Dimethoxytrityl-dU-3 '- [(2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl)] - phosphoramidite The oligonucleotides are synthesized in the synthesizer according to the regulations corresponding to the device. The dUCP is installed at three thymine positions of the primers.
Nach einer sich anschließenden PCR (entsprechend dem vorstehenden Beispiel) wird ein Enzymgemisch aus 1 μl UDG (1 Unit/100) und 0,5 μl Pfu- DNA-Polymerase (5 Unit/μl) zugegeben und erhitzt für 10 min bei 37°C. After a subsequent PCR (corresponding to the example above), an enzyme mixture of 1 μl UDG (1 unit / 100) and 0.5 μl Pfu-DNA polymerase (5 unit / μl) is added and heated for 10 min at 37 ° C. ,

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Einschließung von Makromolekülen und/oder Partikeln, gekennzeichnet dadurch, dass bei der Einschließung der Makromoleküle und /oder Partikel mindestens zwei Stoffe A und B zum Einsatz kommen, von denen1. A method for the inclusion of macromolecules and / or particles, characterized in that at least two substances A and B are used in the inclusion of the macromolecules and / or particles, of which
• Stoff A bei einer Temperatur größer Tl in einem gelförmigen Zustand und kleiner Tl flüssig ist,Substance A is liquid at a temperature greater than Tl in a gel state and less than Tl,
• Stoff B das Gemisch aus Stoff A und den einzuschließenden Makromolekülen und/oder Partikeln umhüllt und• Substance B encases the mixture of substance A and the macromolecules and / or particles to be included and
• daß die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln durch sequentielle Öffnung der Hülle, die aus Stoff B gebildet wird, und Temperaturänderung auf kleiner Tl freigesetzt werden.• that the enclosed macromolecules and / or particles are released by sequential opening of the shell, which is formed from substance B, and temperature change to less than Tl.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß2. The method according to claim 1, characterized in that
• Stoff B bei einer Temperatur kleiner T2 fest und größer T2 flüssig ist und• Substance B is solid at a temperature lower than T2 and greater than T2 liquid and
• daß die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln durch sequentielle Temperaturänderungen freigesetzt werden.• that the enclosed macromolecules and / or particles are released by sequential changes in temperature.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß3. The method according to claim 1, characterized in that
• Stoff B eine äußere Hülle bildet, die durch physikalische, chemischer oder enzymatische Einwirkung geöffnet wird und• Substance B forms an outer shell which is opened by physical, chemical or enzymatic action and
• daß die eingeschlossenen Makromoleküle und/oder Partikeln durch sequentielle physikalische, chemische oder enzymatische Einwirkung und Temperaturanderung freigesetzt werden. • that the enclosed macromolecules and / or particles are released by sequential physical, chemical or enzymatic action and temperature change.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei den Makromolekülen um Proteine, Lektine, Enzyme und/oder Nukleinsäuren handelt.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the macromolecules are proteins, lectins, enzymes and / or nucleic acids.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei den Partikeln um Viruspartikeln oder Teilen von diesen, Zellen oder Teilen von diesen, Trägermaterialien oder ähnliches handelt.5. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the particles are virus particles or parts of these, cells or parts of these, carrier materials or the like.
6. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß Tl niedriger oder gleich T2 ist.6. The method according to claim 2, characterized in that Tl is lower than or equal to T2.
7. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß Tl höher oder gleich T2 ist.7. The method according to claim 2, characterized in that Tl is higher than or equal to T2.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß der Stoff A bei der Temperatur kleiner/gleich Tl mit den eingeschlossenen Makromolekülen und/oder Partikeln eine Lösung oder Suspension bildet.8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that the substance A forms a solution or suspension at the temperature less than or equal to Tl with the included macromolecules and / or particles.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß der Stoff A oder das Gemisch aus Stoff A und den einzuschließenden Makromolekülen und/oder Partikeln innerhalb der durch Stoff B gebildeten äußeren Hülle zumindest partiell dehydratiert ist.9. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the substance A or the mixture of substance A and the macromolecules and / or particles to be enclosed is at least partially dehydrated within the outer shell formed by substance B.
lO.Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei Stoff B um Paraffin handelt.10. The method according to claim 2, characterized in that substance B is paraffin.
11. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch , daß es sich bei Stoff B um Gelatine oder andere Polysaccharidgele, polymerisierte Liposomen, Komplexe aus polyionischen Säuren und Laugen oder Polyacrylate handelt.11. The method according to claim 3, characterized in that it is substance B gelatin or other polysaccharide gels, polymerized liposomes, complexes of polyionic acids and bases or polyacrylates.
12.Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei Stoff A um Polyvinylaprolactam handelt. 12.The method according to claim 1 to 11, characterized in that substance A is polyvinylaprolactam.
13.Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, gekennzeichnet dadurch daß es sich bei Stoff A um wasserlösliche Copolymere mit Polyvinylcaprolactam handelt.13. The method according to claim 1 to 11, characterized in that it is substance A is water-soluble copolymers with polyvinyl caprolactam.
14.Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch, daß Polyvinylcaprolactam mit einer mittleren Molekülmasse von vorzugsweise 150.000 bis 1.200.000 und in Konzentrationen von vorzugsweise 1 bis 20% zur Anwendung gelangt.14. The method according to claim 12 or 13, characterized in that polyvinyl caprolactam with an average molecular weight of preferably 150,000 to 1,200,000 and in concentrations of preferably 1 to 20% is used.
15.Verfahren für sequentielle enzymatische Reaktionen, gekennzeichnet dadurch, daß notwendige Komponenten für eine spätere enzymatische Reaktion eingeschlossen und zum gewünschten Zeitpunkt in das Reaktionsgemisch der früheren enzymatischen Reaktion freigesetzt werden nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 14.15. A process for sequential enzymatic reactions, characterized in that the necessary components for a later enzymatic reaction are included and released at the desired time in the reaction mixture of the earlier enzymatic reaction by a process according to claims 1 to 14.
16.Verfahren zur Kontaminationskontrolle von DNA-Amplifikationsreaktionen, gekennzeichnet dadurch, dass das(die) Enzym(e), das(die) für den Amplifikatabbau eingesetzt wird(werden), eingekapselt und zum gewünschten Zeitpunkt freigesetzt wird(werden) nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 14. 16. A method for the contamination control of DNA amplification reactions, characterized in that the enzyme (s) used for the amplification degradation is (are) encapsulated and released at the desired time according to a method according to Claims 1 to 14.
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