EP1171572A2 - Modular cell carrier systems for the three-dimensional cell growth - Google Patents

Modular cell carrier systems for the three-dimensional cell growth

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Publication number
EP1171572A2
EP1171572A2 EP00912550A EP00912550A EP1171572A2 EP 1171572 A2 EP1171572 A2 EP 1171572A2 EP 00912550 A EP00912550 A EP 00912550A EP 00912550 A EP00912550 A EP 00912550A EP 1171572 A2 EP1171572 A2 EP 1171572A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell
segments
cells
cell support
support system
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00912550A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Markus Oles
Dierk Landwehr
Beate Kossmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Creavis Gesellschaft fuer Technologie und Innovation mbH
Original Assignee
Creavis Gesellschaft fuer Technologie und Innovation mbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Creavis Gesellschaft fuer Technologie und Innovation mbH filed Critical Creavis Gesellschaft fuer Technologie und Innovation mbH
Publication of EP1171572A2 publication Critical patent/EP1171572A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/10—Hollow fibers or tubes

Definitions

  • the present invention relates to artificial cell carrier systems for three-dimensional cell growth and their use
  • Growth is not only desirable for building up thicker layers, but also in order to maintain a functional cell structure such as an organ.
  • Cellular structures show interactions between the cells or other tissues in addition to a high cell density Interactions are necessary epigenetic factors for cell proliferation and differentiation
  • pore formation in these foams is important, since the cells settle in the pores or the nutrients are supplied via small pores in the material Dimensioning the pore n, however, can only be controlled inadequately. If the pores are too small, no cells can grow in there; if the pores are too large, undesired, two-dimensional cell growth takes place there.
  • the nutrient supply that is crucial for the growth of the cells or the removal of metabolic products also depends on a defined one Pore size distribution from The difficult to control pore size distribution leads to insufficiently controllable cell growth So far, no functional tissue or organ clusters have been cultivated with these concepts.For uses that require a higher degree of differentiation and thicker cell layers, such as connective tissue or artificial organs, these techniques have failed.A reason for this is the unavoidable supply of thick cell layers with nutrient media and Oxygen, as is ensured in vivo by vascularization of the tissue.
  • the cells can only be supplied with oxygen and nutrients via intercellular routes via a few cells or cell layers
  • the individual cell layers are not in contact with one another, so there are two-dimensional layers stacked on top of one another and no three-dimensional structure
  • JC Hager et al in J Natl Cancer Inst, 69, 6 (1982) describe a system of ordered bundles of hollow fibers for the growth of tumor cells. These fibers serve as a surface for cell adhesion and, via pores in the fibers, as a supply route for the provision of Nutrients and oxygen With them, three-dimensional cell growth can be achieved Orderly cell growth is not possible due to the difficult to control fiber spacing. Furthermore, the length, diameter and arrangement of the fibers determine the expansion and structure of the tissue to be grown
  • WO 90/02796 and US 5 510 254 describe a further possibility of building approximately three-dimensional cell structures.
  • mesh-like cell support structures optionally coated with growth-promoting substances, are used.
  • the tissues can be arranged to superstructures, with a cellular connection between the individual layers depending on their distance and thus can only be influenced inadequately.
  • Systems of this type are suitable for cell structures with a few layers; a complex, multi-layered three-dimensional cell structure cannot be grown with the aid of these tissues
  • the object of the present invention was therefore to provide a cell carrier with which three-dimensional cell tissue can be grown in vitro and in vivo
  • the present invention therefore relates to a cell carrier system made of porous material, the cell carrier system consisting of modularly shaped segments which are wholly or partly constructed from half-shells
  • the porosity of the modularly shaped segments can be specifically adapted to the cell type used.
  • the modularly shaped segments can have pores with an average diameter of 0.5 to 5 ⁇ m.
  • the distribution of the pores is advantageously chosen such that between one and three pores are available per grown cell for the supply of the cells, ie the segments advantageously have pores with an average spacing of 1 to 10 ⁇ m.
  • the segments of the cell carriers have a porous structure in whole or in part, with targeted cell growth preferably occurring only at the porous locations of the segments
  • the non-porous areas of the segments can be used for fastening purposes or the like due to the reduced cell growth here
  • the cell tissue grown on the cell carrier systems according to the invention is capable of proliferation in vitro and in vivo due to the excellent vascularization.
  • the modular shape of the segments enables cell carrier systems of almost any shape and complexity to be built up.
  • the optional connection between two or more segments enables the cultivation of practically any large, related cell and tissue cultures
  • Cell carrier systems according to the present invention enable the construction of three-dimensional cell tissues in which all cells can be supplied with nutrient solution and oxygen via a porous and thus micro-structured surface
  • the cells on the cell support systems according to the invention are supplied via a capillary system, which can be formed by combining the half-shells in each case with two modularly shaped systems.
  • the segments can be combined in such a way that a closed hollow body, that is to say a capillary system, is formed from the two half-shells.
  • the combination of two segments can be simplified by appropriate holding pins.
  • the capillaries preferably have a diameter of 20-70 ⁇ m Such a system offers the possibility of distributing released growth factors throughout the cell culture and thereby enabling differentiation of the tissue. With the present invention it is possible to ensure a continuous outflow and inflow of nutrients, metabolites, oxygen and growth factors to the cell tissues
  • the cell growth as well as the cell differentiation are significantly influenced by the surface topography of the cell carrier.
  • the exchange of nutrients and the distribution of the cells on the surface is determined by the type and topography of the microstructure, ie in the present case by the porosity of the surface Diffusion of the metabolic activity of the tissue is limited
  • the vascularization of the tissue also increases and thus reduces the necessary diffusion pathways
  • the cell support systems consist of shaped segments which enable a modular structure of a composite system
  • Suitable materials for the cell support systems according to the invention are, for example, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyurethane, polyamide, PVC, polyethylene, polypropylene, polystyrene or polysulfonate, and mixtures or copolymers thereof
  • the fixing of two segments to form a capillary system can be done by gluing, microwave or radio frequency techniques. Of course, this must be done in a way that the pores of the material are not or only slightly affected
  • the cell support systems can be they individual segments or preformed capillary systems, can be connected to each other. This can be achieved by using spacers, which are advantageously already fixed to them during the manufacture of the segments.
  • the spacers also ensure a constant distance between them individual segment layers, so that cells can grow here too
  • Modularly shaped segments preferably have spacers with a height of 20 to 200 ⁇ m. If the spacers are hollow and suitable for liquid transport, the nutrient solution can thus be guided through the entire system
  • the modular design of the segments causes a mini-cry of the natural environment of the cells, so that proliferation, differentiation or the execution of the physiological functions of the cells takes place as long as the cells can be supplied with nutrient solution by the porous material.
  • This supply usually takes place over 2 to 20 cell layers, the number of supplied cell layers strongly dependent on the metabolism of the cells Liver and kidney cells must be grown on cell support systems with small distances (20-40 ⁇ m), since they also require a high blood supply in the body
  • the distance between the cell support systems fibroblasts and cartilage cells can be very large, up to 200 ⁇ m
  • the individual segments can be produced using micro system technology.
  • a suitable process is, for example, the LIGA process, a structuring process that is based on basic processes of X-ray lithography, electroplating and molding.
  • the mold inserts produced by LIGA technology can then be used in injection molding, reactive resin molding or Any number of copies can be made from various plastics with high level of detail and at relatively low cost using the stamping process.
  • the pores can be introduced into the material using suitable spinous processes on the mold inserts
  • Fig. 2 shows an example of the structure of a cell carrier according to the invention from two segments.
  • a segment consists of a central supply pipe, from which branches branch off vertically, at periodically repeating intervals.These branches form a capillary system.
  • the surface of the segments is provided with small pores which depend on the the cell type used have a diameter of 0.5-5 ⁇ m.
  • the pores have an average spacing of 1 to 10 ⁇ m, the distance between the branches (L1) can be between 20 and 200 ⁇ m, adapted to the cell type
  • the nutrient medium is actively or passively pumped through a corresponding gradient through the central supply pipe.
  • the distribution of the nutrient medium and the respiratory gases to Tissue is ensured by diffusion.
  • the nutrient cycle is designed so that the medium can run off again via a drain and can be returned to the cycle or collected for further processing / disposal
  • the individual segments have a modular structure so that they can be fitted together to form larger, three-dimensional objects.This creates an artificial capillary network that enables the cells to be vascularized almost naturally.
  • the segments suitably have appropriate spacers as plug-in devices for a simple and precisely fitting connection between two Allow segments
  • spacers In order to set the desired distances between the segments according to the invention, these are provided with spacers.
  • the spacers expediently serve as a plug-in device for fixing two segments (AH in FIG. 3).
  • the inflow and outflow are also designed so that the individual segments are in a liquid-carrying manner with one another Can be connected Hollow spacers can be used to connect the inflows and outflows of segments
  • the segments can also be stacked offset from one another
  • the desired cell types can be applied to the individual segments after the cell carrier has been built up.
  • the system is placed in a roller bottle with a cell suspension of high density.In this bottle, the system remains at an average number of revolutions of the roller bottle until enough cells are on the Having fixed the surface This is typically completed after 3 to 8 hours. Then the system is transferred, preferably under sterile conditions, into a Petri dish and fresh medium is pumped through the cell supports through the supply connections of the segments. After a few days, the segment surfaces and thus a multilayer cell tissue between the channel walls
  • the cell tissue can also be built up step by step.
  • a level of the cell carrier according to the invention is incubated with cells. After a cell layer has grown on this, the lowest level, the system is gradually moved around a cell carrier layer extended to allow a cell layer to grow here as well
  • the successive procedure has the advantage that different differentiation of a cell type can also be enforced by different spacing of the segments or the support layers. The different differentiation of a cell type is important e.g. in skin cells in practice have kept segment spacings of 3-6 cell layers
  • the cell carriers according to the invention enable the cells to be well supplied with nutrients. This can be achieved by branching the segments.
  • FIG. 4 a to e shows an exemplary embodiment of such a system based on a honeycomb structure. Food medium is pumped into this system through an inlet the medium run off and returned to the circuit or collected for further processing / disposal The surface of the segments is provided with small pores with a large size and distribution as already described. Combining the segments also creates an artificial capillary network in this embodiment variant
  • the diameter of the individual honeycombs (“key width”) depends on the cell type used and can be between 70 and 180 ⁇ m.
  • the next honeycomb-shaped cell carrier can be stacked over 90 degrees (FIG. 4 c) and stacked over the previous cell carrier become
  • a three-dimensional cell culture can also be built up with honeycomb-shaped segments.
  • appropriately designed plug connections between the honeycombs enable cell growth across layers (FIG. 4 e)
  • the honeycomb-shaped cell carriers are constructed from two half shells or a half shell and a membrane which are firmly connected to one another
  • FIG. 5 shows schematically the structure of such a cell carrier in a pyramidal design in the top (FIG. 5 a) and side view (FIGS. 5 b and c)
  • Segments are periodically arranged in parallel rows (Fig. 5 c and d) between The rows remain at a distance, preferably from half the base area of a pyramid.
  • the individual rows of segments can in turn be connected to one another by spacers which may be suitable for liquid transport.
  • Nutrient medium is pumped through the elements via an inlet. The medium can run off via a drain, be returned to the circuit or be collected for further processing / disposal
  • the surfaces of the pyramids are provided with small pores with size and distribution as described.
  • the pyramids themselves are hollow, open at the base surface and thus also form a half-shell.
  • the side view in FIG. 5 c shows the connection of two segments a closed cell support system
  • a cell culture with pyramid-shaped cell support segments according to the invention can be constructed as follows: In a suitable cell culture system, some pyramid-shaped segments are applied to the base as a basic element. Above these structures, further segments can now be positioned. The combination of segments creates the cell supports (see side view Fig. 5 c ) The segments can be nested so that there is a distance between the surfaces of the pyramids in which the cells can grow
  • the advantage of this structure is that the geometrical dimensions of the elements are independent of the selected cell type. Only the layer spacing and the pore diameter of the elements must be adapted to the cell type used in order to achieve the highest possible cell density or a small dead volume within the pyramids, ie the supply elements. a small height of the individual pyramid elements is recommended in comparison to their base area.
  • the cell supports shown in FIG. 5 d have the following dimensions
  • Width of the segments a3 150 - 300 ⁇ m Length of the segments a5 integer multiples of a3 Distance of the cell carriers a4 50 - 300 ⁇ m
  • these can also be formed by combining a half-shell of a modularly shaped segment with a semi-permeable membrane while building a capillary system.A permeable membrane is stretched on the back of a segment.
  • the protruding membrane parts can be removed using suitable etching processes Technology has the advantage that two segments do not have to be assembled precisely.
  • Semipermeable membranes such as Gorotex, Simpatex or ceramic membranes are suitable for this purpose. Plasma etching has proven to be a preferred etching process.
  • the protruding membrane portions are removed in a plasma reactor with plasma gases such as F 2 , Cl 2 , CF 3 7F, CC1 3 + / C1 and O 2 etches
  • plasma gases such as F 2 , Cl 2 , CF 3 7F, CC1 3 + / C1 and O 2 etches
  • This embodiment of the present invention also ultimately creates closed cavities or capillaries.
  • the pore size and distribution of the membranes correspond to those of the segments with an average distance of 1 to 10 ⁇ m and an average diameter of 0.5 to 5 ⁇ m
  • Another object of the present invention is the use of the three-dimensional cell support systems for bioreactors and for the cultivation of eukaryotic or organic stem cells
  • Important stem cells are heptocytes, kidney cells, endothelial cells, epithelial cells or myocytes
  • human proteins By using cell carriers according to the invention which are optimized for human cell types, human proteins can thus also be synthesized. This means that the structure and in particular the folding of the synthetic proteins corresponds to the natural proteins of the human body
  • the proteins or other substances produced by the cells can be continuously removed via the nutrient supply cycle. In the case of non-adherent systems, this is only possible by filtration or by centrifuging the suspensions. For example, the development of cell cultures as an implant up to artificial hybrid organs
  • cell carrier systems according to the invention has the advantage that the hepatocytes are not present in a suspension but can grow organotypically. This ensures that the heptatocytes achieve a degree of differentiation which is also present in vitro
  • the hepatocytes can be adequately supplied.
  • the individual segments are switched in such a way that there is only one inlet and one outlet Protection from infection is closed by an external encapsulation.
  • the blood circulation of a patient can then be closed via the inflow and outflow in the outside.
  • the cells then take over the function of the liver.
  • other artificial organs such as a Kidney to be built up
  • the replication of artificial tissue and tissue replacement on cell supports according to the invention offers decisive advantages in the toxicity test. Encapsulation is not necessary for the replication of the skin.In imitation of the anatomical model, the blood supply to the dermis must decrease more and more when artificial skin is being grown Increasing distances between the segments in the cell culture can be achieved. Because the artificial vascularization due to this construction lies in precisely defined cell layers, this can also be used for penetration tests. For such tests, the elements in the cell culture must be supplied in layers, so that only nutrient medium can be removed for analysis in the desired cell layer.
  • the use of cell carriers according to the invention has advantages in particular in the creation of disease models.
  • the cells that carry the characteristic features of the disease at the cellular level are brought into a cell culture and are kept in a 3D culture by segments. This technique keeps the cells longer in the "pathological" physiological state and does not redifferentiate again so quickly.
  • the use of such models is primarily in the pharmaceutical industry, which can test new drugs on such models. Furthermore, such models can make a decisive contribution to understanding some diseases

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Abstract

The invention relates to cell carrier systems consisting of half-shells of a porous material. Said half-shells can form a capillary system by means of combination with each other or with a semipermeable membrane. The cell carrier systems can be used for the cultivation of eucaryontic or organic stem cells or for bioreactors.

Description

Modulare Zellträeersvsteme für dreidimensionales ZellwachstumModular cell carrier systems for three-dimensional cell growth
Die vorliegende Erfindung betrifft kunstliche Zelltragersysteme für ein dreidimensionales Zellwachstum und deren VerwendungThe present invention relates to artificial cell carrier systems for three-dimensional cell growth and their use
Die Kultivierung von tierischen, humanen und im zunehmenden Maße auch pflanzlichen Zellen wird heute für eine Vielzahl von Aufgaben eingesetzt Hierzu zahlen neben wissenschaftlichen Zwecken und pharmakologischen Untersuchungen auch zunehmend biotechnische Anwendungen wie die Produktion von Antikörpern und Pharmazeutika All diesen Anwendungen liegt ein zweidimensionales Wachstumsverhalten der Zellen zugrunde, da mit den meisten Zellkultur-Techniken nur eine Zellschicht (Monolayer) gezüchtet werden kannThe cultivation of animal, human and increasingly also plant cells is used today for a multitude of tasks. In addition to scientific purposes and pharmacological investigations, biotechnical applications such as the production of antibodies and pharmaceuticals are also increasingly important. All of these applications are based on a two-dimensional growth behavior of the cells , because with most cell culture techniques only one cell layer (monolayer) can be grown
Wahrend der seriellen Subkultivierung von Zellen oder Primarkulturen wird häufig eine Veränderung in der Genexpression festgestellt Dies gilt auch für viele immortalisierte Zellinien, die häufig nur noch einen Bruchteil ihrer ursprunglichen Differenzierung zeigen Neben der genetischen Instabilität gibt es weitere Ursachen für diese Differenzierung in vitro Im naturlichen Gewebeverband (in vivo) wachsen die Zellen in einer raumlich hoch strukturierten Umgebung Hierdurch ergeben sich andere Zeil-Interaktionen, die eine völlig andere Zellaktivitat und Proliferation zur Folge haben Ein weiteres, sehr wichtiges Merkmal des naturlichen Gewebeverbandes ist die Vaskularisierung Es handelt sich hierbei um ein dichtes Netz von Blutgefäßen (Kapillaren und Venolen) mit denen die Versorgung der Zellen mit Wachstumsfaktoren und Sauerstoff sichergestellt wirdDuring the serial subcultivation of cells or primary cultures, a change in gene expression is often found.This also applies to many immortalized cell lines, which often only show a fraction of their original differentiation.In addition to genetic instability, there are other causes for this differentiation in vitro in natural tissue (In vivo) the cells grow in a spatially highly structured environment. This results in other cell interactions, which result in a completely different cell activity and proliferation. Another, very important feature of the natural tissue structure is the vascularization. This is a dense Network of blood vessels (capillaries and venules) with which the supply of cells with growth factors and oxygen is ensured
Diese Erkenntnis hat zu verfeinerten Zellkulturtechniken geführt, die naher an der naturlichen Umgebung (in vivo) orientiert sind und die extrazellulare Matrix (ECM) mit in das in vitro System einbeziehenThis finding has led to refined cell culture techniques that are closer to the natural environment (in vivo) and incorporate the extracellular matrix (ECM) into the in vitro system
In-vitro-Zellkulturen wachsen häufig nur zweidimensional (Monolayer) Ein mehrlagigesIn vitro cell cultures often only grow two-dimensionally (monolayer)
Wachstum ist nicht nur zum Aufbau von dickeren Schichten erwünscht, sondern auch, um einen funktionsfähigen Zellverband wie z B ein Organ zu erhalten Zeilverbande weisen neben einer hohen Zelldichte Interaktionen zwischen den Zellen oder anderen Geweben auf Diese Interaktionen sind für die Zell-Proliferation und -Differenzierung notwendige epigenetische FaktorenGrowth is not only desirable for building up thicker layers, but also in order to maintain a functional cell structure such as an organ. Cellular structures show interactions between the cells or other tissues in addition to a high cell density Interactions are necessary epigenetic factors for cell proliferation and differentiation
In jüngster Zeit wurden deshalb verstärkt Bemühungen unternommen, auch mehrlagige Zellkulturen (Multilayer) zu produzieren Erste Ansätze verwenden hierfür ein dreidimensionales Wachstumsgerust, auf dem die Zellen proliferieren können Die Gestalt solcher Gerüste variiert sehr stark Eine mittlerweile sehr häufig genutzte Technik ist die Herstellung einer extrazellularen Matrix aus Laminin, Matrigel, Fibronetin und Collagen (z B E A Blomme et al "Influence of extracellular matrix macromolecules on normal human keratinocyte phenotype and parathyroid hormone-related protein secretion and expression in vitro" in Experimental Cell Research, (1998), 238, 1, 204-15) Bei dieser Technik werden die Kulturgefaße mit einer mehr oder weniger dünnen Schicht dieser Komponenten beschichtet Die so entstandene Struktur dient dann als Wachstumsgerust für verschiedene ZelltypenFor this reason, efforts have recently been made to produce multilayer cell cultures (multilayer). First approaches use a three-dimensional growth framework on which the cells can proliferate. The shape of such scaffolds varies very widely. A technique that is now very widely used is the production of an extracellular matrix from laminin, matrigel, fibronetin and collagen (e.g. BEA Blomme et al "Influence of extracellular matrix macromolecules on normal human keratinocyte phenotype and parathyroid hormone-related protein secretion and expression in vitro" in Experimental Cell Research, (1998), 238, 1, 204-15) With this technique, the culture vessels are coated with a more or less thin layer of these components. The resulting structure then serves as a growth framework for various cell types
Andere Ansätze nutzen Zellulose Schaume oder Hydrogele als Wachstumsgeruste für Zellkulturen, so beschrieben in EP 0 451 707- A Der Vorteil dieser Schaume liegt in dem sehr guten Oberflachen/Volumenverhaltnis, d h bezogen auf ein kleines Volumen wird eine sehr große Oberfläche als Adhasionsflache für das Zellwachstum zur Verfügung gestellt Häufig werden diese Wachstumsmatrixen ebenfalls mit einer extrazellularen Matrix beschichtet, um eine bessere Proliferation und Differenzierung zu gewahrleisten (siehe z B Y Watanabe et al "TNF-alpha bifünctionally induces proliferation in primary hepatocytes role of cell anchorage and spreading" in Journal of Immunology, (1997), S 4840-7) Als Materialien zur Herstellung von derartigen schaumartigen Zelltragern werden z B Cellulosederivate eingesetzt Wichtig ist die Porenbildung in diesen Schäumen, da die Zellen in den Poren angesiedelt werden oder aber die Nahrstoffversorgung über kleine Poren im Material erfolgt Die Dimensionierung der Poren kann jedoch nur unzureichend gesteuert werden Sind die Poren zu klein, so können dort keine Zellen einwachsen, bei zu großen Poren findet dort ein unerwünschtes, zweidimensionales Zellwachstum statt Die für das Wachstum der Zellen entscheidende Nahrstoffversorgung bzw der Abtransport von Stoffwechselprodukten hangt ebenfalls von einer definierten Porengroßenverteilung ab Die schwer zu kontrollierende Porengroßenverteilung führt somit zu einem ungenügend kontrollierbaren Zellwachstum Bisher konnten mit diesen Konzepten keine f nktionellen Gewebe- oder Organverbande gezüchtet werden Bei Verwendungszwecken, die einen höheren Differenzierungsgrad und dickere Zellschichten erforderten, wie beispielsweise Bindegewebe oder kunstliche Organe, versagten diese Techniken Ein Grund dafür ist die nicht zu gewahrleistende Versorgung dicker Zellschichten mit Nahrmedien und Sauerstoff, wie es in vivo durch eine Vaskularisierung des Gewebes sichergestellt wird Eine Versorgung der Zellen über interzellulare Wege mit Sauerstoff und Nährstoffen ist nur über wenige Zellen bzw Zellschichten möglichOther approaches use cellulose foams or hydrogels as growth scaffolds for cell cultures, as described in EP 0 451 707-A. The advantage of these foams is the very good surface / volume ratio, ie based on a small volume, a very large surface area is used as an adhesion surface for cell growth Often these growth matrices are also coated with an extracellular matrix in order to ensure better proliferation and differentiation (see, for example, BY Watanabe et al "TNF-alpha bifunctionally induces proliferation in primary hepatocytes role of cell anchorage and spreading" in the Journal of Immunology , (1997), p 4840-7) Cellulose derivatives are used as materials for the production of such foam-like cell carriers. For example, pore formation in these foams is important, since the cells settle in the pores or the nutrients are supplied via small pores in the material Dimensioning the pore n, however, can only be controlled inadequately.If the pores are too small, no cells can grow in there; if the pores are too large, undesired, two-dimensional cell growth takes place there.The nutrient supply that is crucial for the growth of the cells or the removal of metabolic products also depends on a defined one Pore size distribution from The difficult to control pore size distribution leads to insufficiently controllable cell growth So far, no functional tissue or organ clusters have been cultivated with these concepts.For uses that require a higher degree of differentiation and thicker cell layers, such as connective tissue or artificial organs, these techniques have failed.A reason for this is the unavoidable supply of thick cell layers with nutrient media and Oxygen, as is ensured in vivo by vascularization of the tissue. The cells can only be supplied with oxygen and nutrients via intercellular routes via a few cells or cell layers
Der Einsatz von semipermeablen Membranen schaffte hier zum Teil Abhilfe Ein System, das den Einsatz von Polymervliesen als Tragersystem in Verbindung mit einer Perfüsionskammer nutzt, wird beispielsweise von M Sittinger et al in "The International Journal of Artificial Organs" 1997, Vol 20 No 1, S 57-62 beschrieben Auf großen Vlies-Flachen werden hier Knorpel im ersten Schritt zu einem möglichst konfluenten Monolayer gezüchtet Danach werden die Zellen in ein Perfüsionskultursystem eingebracht In diesen Kammern können Knorpelzellen gut wachsen, da hier ein für diesen Gewebetyp ausreichender Austausch von Nährstoffen und Abfallprodukten gewahrleistet ist Die Grenzen dieser Technik sind aber auch nach wenigen Zellschichten erreicht, so daß Gewebearten, die eine intensive Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff benotigen, hiermit nicht gezüchtet werden könnenThe use of semipermeable membranes partially remedied this. A system that uses the use of polymer nonwovens as a carrier system in connection with a perfusion chamber is described, for example, by M Sittinger et al in "The International Journal of Artificial Organs" 1997, Vol 20 No 1, S 57-62 described Cartilage is grown here in a first step to a confluent monolayer on large fleece surfaces. Afterwards, the cells are introduced into a perfusion culture system. Cartilage cells can grow well in these chambers, as there is an adequate exchange of nutrients and waste products for this tissue type The limits of this technique are reached even after a few cell layers, so that tissue types that require an intensive supply of nutrients and oxygen cannot be grown with it
Durch geeignetes ubereinanderschichten einzelner Membranen kann ebenfalls eine annähernd dreidimensionale Struktur geschaffen werden Der Nachteil dieser Struktur ist aber, das sie nicht selbst tragend ist, schlecht bzw nur bis zu einer kleinen Hohe stapelbar und die Nahrstoffversorgung durch die aufeinander liegenden Membranbahnen schwierig zu kontrollieren istAppropriate layering of individual membranes can also create an approximately three-dimensional structure. However, the disadvantage of this structure is that it is not self-supporting
Weiterhin stehen die einzelnen Zellschichten nicht miteinander in Kontakt, es liegen somit aufeinander gestapelte zweidimensionale Schichten und keine dreidimensionale Struktur vorFurthermore, the individual cell layers are not in contact with one another, so there are two-dimensional layers stacked on top of one another and no three-dimensional structure
J C Hager et al beschreiben in J Natl Cancer Inst , 69, 6 (1982) ein System von geordneten Bundein aus Hohlfasern zur Züchtung von Tumorzellen Diese Fasern dienen als Oberflache für die Zelladhasion und, über Poren in den Fasern, als Versorgungsweg für die Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff Mit ihnen kann ein dreidimensionales Zellwachstum erreicht werden Ein geordnetes Zellwachstum ist durch die schwer zu kontrollierenden Faserabstande nicht möglich Weiterhin bestimmen Lange, Durchmesser und Anordnung der Fasern die Ausdehnung und Struktur des zu zuchtenden GewebesJC Hager et al in J Natl Cancer Inst, 69, 6 (1982) describe a system of ordered bundles of hollow fibers for the growth of tumor cells. These fibers serve as a surface for cell adhesion and, via pores in the fibers, as a supply route for the provision of Nutrients and oxygen With them, three-dimensional cell growth can be achieved Orderly cell growth is not possible due to the difficult to control fiber spacing. Furthermore, the length, diameter and arrangement of the fibers determine the expansion and structure of the tissue to be grown
WO 90/02796 und US 5 510 254 beschreiben eine weitere Möglichkeit, annähernd dreidimensionale Zellstrukturen aufzubauen Hier werden netzartige Zelltragerstrukturen, gegebenenfalls mit wachstumsfordernden Stoffen beschichtet, eingesetzt Die Gewebe können zu Uberstrukturen angeordnet werden, wobei eine zellulare Verbindung zwischen den einzelnen Schichten von deren Abstand abhangt und somit ebenfalls nur unzureichend beeinflußt werden kann Systeme dieser Art sind für Zellstrukturen mit wenigen Schichten geeignet, eine komplexe, viellagige dreidimensionale Zellstruktur kann mit Hilfe von diesen Geweben nicht gezüchtet werdenWO 90/02796 and US 5 510 254 describe a further possibility of building approximately three-dimensional cell structures. Here, mesh-like cell support structures, optionally coated with growth-promoting substances, are used. The tissues can be arranged to superstructures, with a cellular connection between the individual layers depending on their distance and thus can only be influenced inadequately. Systems of this type are suitable for cell structures with a few layers; a complex, multi-layered three-dimensional cell structure cannot be grown with the aid of these tissues
Weiterentwickelte Zelltragersysteme sind in E Wintermantel, S -W Ha, "Biokompatible Werkstoffe und Bauweisen" Springer Verlag 1996, S 98-109 beschrieben Hier werden insbesondere die Oberflachentopographie und Oberflachenfünktionalitat von porösen Tragern diskutiert Diese Tragersysteme weisen jedoch ebenfalls keine definierten Porengroßen bzw eine auf den eingesetzten Zelltyp und/oder den angestrebten Verwendungszweck angepaßte Oberflachenbeschaffenheit auf Ein gezielter dreidimensionaler Aufbau von Zellgeweben ist mit diesen Techniken nicht möglichFurther developed cell carrier systems are described in E Wintermantel, S -W Ha, "Biocompatible materials and construction methods" Springer Verlag 1996, S 98-109 Here, in particular, the surface topography and surface functionality of porous carriers are discussed. However, these carrier systems also have no defined pore sizes or one on the The cell type used and / or the surface condition adapted to the intended use are targeted. A targeted three-dimensional structure of cell tissues is not possible with these techniques
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es somit, einen Zelltrager zur Verfügung zu stellen, mit dem dreidimensionale Zellgewebe in vitro und in vivo gezüchtet werden könnenThe object of the present invention was therefore to provide a cell carrier with which three-dimensional cell tissue can be grown in vitro and in vivo
Es wurde gefunden, daß mit einem Zelltragersystem, bestehend aus modular geformten Segmenten eines porösen Materials auch komplexe dreidimensionale Zellgewebe hergestellt werden könnenIt has been found that complex three-dimensional cell tissues can also be produced with a cell carrier system consisting of modularly shaped segments of a porous material
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Zelltragersystem aus porösem Material, wobei das Zelltragersystem aus modular geformten Segmenten besteht, die ganz oder teilweise aus Halbschalen aufgebaut sind Die Porosität der modular geformten Segmente kann gezielt an den verwendeten Zelltyp angepaßt werden Die modular geformten Segmente können je nach Zelltyp Poren mit einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis 5 μm aufweisen Die Verteilung der Poren wird vorteilhaft so gewählt, daß zwischen einer und drei Poren pro angewachsener Zelle für die Versorgung der Zellen bereitstehen, d h die Segmente besitzen vorteilhaft Poren mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm Die Segmente der Zelltrager besitzen ganz oder teilweise eine poröse Struktur, wobei ein gezieltes Zellwachstum vorzugsweise nur an den porösen Stellen der Segmente erfolgtThe present invention therefore relates to a cell carrier system made of porous material, the cell carrier system consisting of modularly shaped segments which are wholly or partly constructed from half-shells The porosity of the modularly shaped segments can be specifically adapted to the cell type used. Depending on the cell type, the modularly shaped segments can have pores with an average diameter of 0.5 to 5 μm. The distribution of the pores is advantageously chosen such that between one and three pores are available per grown cell for the supply of the cells, ie the segments advantageously have pores with an average spacing of 1 to 10 μm. The segments of the cell carriers have a porous structure in whole or in part, with targeted cell growth preferably occurring only at the porous locations of the segments
Die nicht-porosen Stellen der Segmente können durch das hier verminderte Zellwachstum für Befestigungszwecke o a eingesetzt werdenThe non-porous areas of the segments can be used for fastening purposes or the like due to the reduced cell growth here
Das auf den erfindungsgemaßen Zelltragersystemen gezüchtete Zellgewebe ist aufgrund der hervorragenden Vaskularisierung in vitro und in vivo proliferationsfahig Durch die modulare Form der Segmente können Zelltragersysteme mit nahezu beliebiger Form und Komplexität aufgebaut werden Die optionale Verbindung zwischen zwei oder mehreren Segmenten ermöglicht die Züchtung von praktisch beliebig großen, zusammenhangenden Zeil- und GewebekulturenThe cell tissue grown on the cell carrier systems according to the invention is capable of proliferation in vitro and in vivo due to the excellent vascularization. The modular shape of the segments enables cell carrier systems of almost any shape and complexity to be built up. The optional connection between two or more segments enables the cultivation of practically any large, related cell and tissue cultures
Zelltragersysteme gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen den Aufbau von dreidimensionalen Zellgeweben, in dem alle Zellen über eine poröse und damit mikro strukturierte Oberflache mit Nährlösung und Sauerstoff versorgt werden könnenCell carrier systems according to the present invention enable the construction of three-dimensional cell tissues in which all cells can be supplied with nutrient solution and oxygen via a porous and thus micro-structured surface
Die Versorgung der Zellen auf den erfindungsgemaßen Zelltragersystemen erfolgt über ein Kapillarsystem, das durch Kombination der Halbschalen je zwei modular geformter Systeme gebildet werden kann Die Segmente können in einer Weise kombiniert werden, daß aus den beiden Halbschalen ein geschlossener Hohlkörper, d h ein Kapillarsystem entsteht Die Kombination von zwei Segmenten kann durch entsprechende Haltestifte vereinfacht werden Die Kapillaren weisen bevorzugt einen Duchmesser von 20-70 μm auf Ein solches System bietet die Möglichkeit, freigesetzte Wachstumsfaktoren in der gesamten Zellkultur zu verteilen und dadurch eine Differenzierung des Gewebes zu ermöglichen Es ist mit der vorliegenden Erfindung möglich, einen kontinuierlichen Ab- und Zufluß von Nährstoffen, Stoffwechselprodukten, Sauerstoff und Wachstumsfaktoren zu den Zellgeweben zu gewahrleistenThe cells on the cell support systems according to the invention are supplied via a capillary system, which can be formed by combining the half-shells in each case with two modularly shaped systems.The segments can be combined in such a way that a closed hollow body, that is to say a capillary system, is formed from the two half-shells. The combination of two segments can be simplified by appropriate holding pins. The capillaries preferably have a diameter of 20-70 μm Such a system offers the possibility of distributing released growth factors throughout the cell culture and thereby enabling differentiation of the tissue. With the present invention it is possible to ensure a continuous outflow and inflow of nutrients, metabolites, oxygen and growth factors to the cell tissues
Das Zellwachstum wie auch die Zelldifferenzierung werden wesentlich über die Oberflachentopographie des Zelltragers beeinflußt Der Austausch von Nährstoffen und die Verteilung der Zellen auf der Oberflache wird durch die Art und Topographie der MikroStruktur d h im vorliegenden Fall von der Porosität der Oberflache bestimmt Die meisten Anwendungen sind hierbei durch Diffusion der metabolischen Aktivität des Gewebes limitiert Bei der vorliegenden Erfindung nimmt durch die gute Nahrstoffversorgung mit zunehmender metabolischer Aktivität auch die Vaskularisierung des Gewebes zu und reduziert somit die notigen DiffusionswegeThe cell growth as well as the cell differentiation are significantly influenced by the surface topography of the cell carrier. The exchange of nutrients and the distribution of the cells on the surface is determined by the type and topography of the microstructure, ie in the present case by the porosity of the surface Diffusion of the metabolic activity of the tissue is limited In the present invention, due to the good supply of nutrients with increasing metabolic activity, the vascularization of the tissue also increases and thus reduces the necessary diffusion pathways
Es ist ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß die Zelltragersysteme aus geformten Segmenten bestehen, die einen modularen Aufbau eines Verbundsystems ermöglichenIt is an essential feature of the present invention that the cell support systems consist of shaped segments which enable a modular structure of a composite system
Geeignete Materialien für die erfindungsgemaßen Zelltragersysteme sind beispielsweise Polycarbonat, Polymethylmethacrylat, Polyurethan, Polyamid, PVC, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol oder Polysulfonat, sowie deren Gemische oder CopolymereSuitable materials for the cell support systems according to the invention are, for example, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polyurethane, polyamide, PVC, polyethylene, polypropylene, polystyrene or polysulfonate, and mixtures or copolymers thereof
Die Fixierung von zwei Segmenten zur Bildung eines Kapillarsystems kann durch Kleben, Mikrowellen- oder Hochfrequenztechniken erfolgen Dies muß selbstverständlich in einer Weise erfolgen, das die Poren des Material nicht oder nur wenig beeinträchtigt werdenThe fixing of two segments to form a capillary system can be done by gluing, microwave or radio frequency techniques. Of course, this must be done in a way that the pores of the material are not or only slightly affected
Weiterhin können die Zelltragersysteme, seien es einzelne Segmente oder bereits vorgeformte Kapillarsysteme, miteinander verbunden werden Dies kann durch den Einsatz von Abstandhaltern, die vorteilhaft bereits mit der Herstellung der Segmente an diesen fixiert werden, erreicht werden Durch die Abstandhalter wird darüber hinaus ein konstanter Abstand zwischen einzelnen Segmentschichten eingestellt, so daß auch hier Zellen wachsen können Die modular geformten Segmente weisen bevorzugt Abstandhalter mit einer Hohe von 20 bis 200 μm auf Sofern die Abstandhalter hohl und für einen Flussigkeitstransport geeignet sind, kann so die Nährlösung durch das gesamte System geführt werdenFurthermore, the cell support systems, be they individual segments or preformed capillary systems, can be connected to each other.This can be achieved by using spacers, which are advantageously already fixed to them during the manufacture of the segments. The spacers also ensure a constant distance between them individual segment layers, so that cells can grow here too Modularly shaped segments preferably have spacers with a height of 20 to 200 μm. If the spacers are hollow and suitable for liquid transport, the nutrient solution can thus be guided through the entire system
Die modulare Ausführung der Segmente bewirkt ein Minikry der naturlichen Umgebung der Zellen, so daß eine Proliferation, Differenzierung oder die Ausführung der physiologischen Funktionen der Zellen so lange erfolgt, wie die Zellen mit Nährlösung durch das poröse Material versorgt werden können Diese Versorgung erfolgt in der Regel über 2 bis 20 Zellschichten, wobei die Anzahl der versorgten Zellschichten stark vom Stoffwechsel der Zellen abhangt Leber- und Nierenzellen müssen auf Zelltragersystemen mit kleinen Abstanden (20-40 μm) gezüchtet werden, da sie auch im Korper eine hohe Blutversorgung benotigen Der Abstand der Zelltragersysteme bei Fibroblasten und Knorpelzellen kann dagegen sehr groß, bis zu 200 μm, seinThe modular design of the segments causes a mini-cry of the natural environment of the cells, so that proliferation, differentiation or the execution of the physiological functions of the cells takes place as long as the cells can be supplied with nutrient solution by the porous material. This supply usually takes place over 2 to 20 cell layers, the number of supplied cell layers strongly dependent on the metabolism of the cells Liver and kidney cells must be grown on cell support systems with small distances (20-40 μm), since they also require a high blood supply in the body The distance between the cell support systems fibroblasts and cartilage cells, on the other hand, can be very large, up to 200 μm
Die einzelnen Segmente können mittels der Mikro Systemtechnik hergestellt werden Ein geeignetes Verfahren ist beispielsweise das LIGA- Verfahren, einem Strukturierungsverfahren, das auf Grundprozessen der Rontgen-LIthographie, Galvanik und Abformung beruht Mit den durch LIGA-Technik hergestellten Formeinsatzen können dann im Spritzguß, Reaktionsharzguß oder durch Prageverfahren beliebig viele Kopien aus diversen Kunststoffen mit hoher Detailtreue und mit relativ geringen Kosten hergestellt werden Die Poren können durch geeignete Dornfortsatze an den Formeinsatzen in das Material eingebracht werdenThe individual segments can be produced using micro system technology. A suitable process is, for example, the LIGA process, a structuring process that is based on basic processes of X-ray lithography, electroplating and molding. The mold inserts produced by LIGA technology can then be used in injection molding, reactive resin molding or Any number of copies can be made from various plastics with high level of detail and at relatively low cost using the stamping process. The pores can be introduced into the material using suitable spinous processes on the mold inserts
Fig 2 zeigt beispielhaft den Aufbau eines erfindungsgemaßen Zelltragers aus zwei Segmenten Ein Segment besteht aus einem zentralen Versorgungsrohr, von dem senkrecht, in periodisch sich wiederholenden Abstanden, Abzweigungen abgehen Diese Abzweigungen bilden ein Kapillarsystem Die Oberflache der Segmente sind mit kleinen Poren versehen, die abhangig vom verwendeten Zelltyp einen Durchmesser von 0,5-5 μm besitzen Die Poren besitzen einen mittleren Abstand von 1 bis 10 μm, der Abstand der Abzweigungen zueinander (Ll) kann dem Zelltyp angepaßt zwischen 20 und 200 μm betragenFig. 2 shows an example of the structure of a cell carrier according to the invention from two segments.A segment consists of a central supply pipe, from which branches branch off vertically, at periodically repeating intervals.These branches form a capillary system.The surface of the segments is provided with small pores which depend on the the cell type used have a diameter of 0.5-5 μm. The pores have an average spacing of 1 to 10 μm, the distance between the branches (L1) can be between 20 and 200 μm, adapted to the cell type
Durch das zentrale Versorgungsrohr wird das Nahrmedium aktiv oder passiv durch ein entsprechendes Gefalle gepumpt Die Verteilung des Nahrmediums und der Atemgase zum Gewebe wird durch Diffusion sichergestellt Der Nahrstoffkreislauf ist so gestaltet, daß das Medium über einen Abfluß wieder ablaufen und dem Kreislauf erneut zugeführt oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden kannThe nutrient medium is actively or passively pumped through a corresponding gradient through the central supply pipe. The distribution of the nutrient medium and the respiratory gases to Tissue is ensured by diffusion. The nutrient cycle is designed so that the medium can run off again via a drain and can be returned to the cycle or collected for further processing / disposal
Die einzelnen Segmente sind modular aufgebaut, so daß sie paßgenau zu größeren, dreidimensionalen Objekten zusammengesteckt werden können Hierdurch entsteht ein kunstliches Kapillarnetz, das eine nahezu naturliche Vaskularisierung der Zellen ermöglicht Geeigneterweise besitzen die Segmente entsprechende Abstandhalter als Steckvorrichtungen, um eine einfache und paßgenaue Verbindung zwischen zwei Segmenten zu ermöglichenThe individual segments have a modular structure so that they can be fitted together to form larger, three-dimensional objects.This creates an artificial capillary network that enables the cells to be vascularized almost naturally. The segments suitably have appropriate spacers as plug-in devices for a simple and precisely fitting connection between two Allow segments
Um die gewünschten Abstände zwischen den erfindungsgemaßen Segmenten einzustellen, sind diese mit Abstandhaltern versehen Zweckmäßig dienen die Abstandhalter als Steckvorrichtung zur Fixierung von zwei Segmenten (AH in Fig 3) Der Zu- und Abfluß ist ebenfalls so konstruiert, daß die einzelnen Segmente miteinander in einer flussigkeitsführenden Verbindung stehen können Für die Verbindung der Zu- und Abflüsse von Segmenten können hohl ausgeführte Abstandhalter eingesetzt werdenIn order to set the desired distances between the segments according to the invention, these are provided with spacers. The spacers expediently serve as a plug-in device for fixing two segments (AH in FIG. 3). The inflow and outflow are also designed so that the individual segments are in a liquid-carrying manner with one another Can be connected Hollow spacers can be used to connect the inflows and outflows of segments
Die Segmente können auch versetzt zu einander gestapelt werdenThe segments can also be stacked offset from one another
Die gewünschten Zelltypen können nach erfolgtem Aufbau des Zelltragers aus den einzelnen Segmenten auf diese aufgebracht werden Das System wird hierzu in eine Rollerflasche mit einer Zellsuspension von hoher Dichte gebracht In dieser Flasche bleibt das System bei mittlerer Umdrehungszahl der Rollerflasche solange, bis sich genügend Zellen auf der Oberflache festgesetzt haben Dies ist typischerweise nach 3 bis 8 Stunden abgeschlossen Anschließend wird das System, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen, in eine Petrieschale überführt und es wird durch die Versorgungsanschlusse der Segmente standig frisches Medium durch die Zelltrager gepumpt Nach wenigen Tagen bildet sich auf den Segmentoberflachen und damit zwischen den Kanalwanden ein mehrlagiges ZellgewebeThe desired cell types can be applied to the individual segments after the cell carrier has been built up.The system is placed in a roller bottle with a cell suspension of high density.In this bottle, the system remains at an average number of revolutions of the roller bottle until enough cells are on the Having fixed the surface This is typically completed after 3 to 8 hours. Then the system is transferred, preferably under sterile conditions, into a Petri dish and fresh medium is pumped through the cell supports through the supply connections of the segments. After a few days, the segment surfaces and thus a multilayer cell tissue between the channel walls
Alternativ kann der Aufbau des Zellgewebes auch schrittweise erfolgen Es wird zunächst eine Ebene der erfindungsgemaßen Zelltrager mit Zellen inkubiert Nachdem auf dieser, untersten Ebene eine Zellschicht gewachsen ist, wird das System um eine Zelltragerschicht schrittweise erweitert, um auch hier eine Zellschicht anwachsen zu lassen Das sukkzessive Vorgehen hat den Vorteil, das durch unterschiedliche Abstände der Segmente bzw der Tragerschichten auch eine unterschiedliche Differenzierung eines Zelltyps erzwungen werden kann Die unterschiedliche Differenzierung eines Zelltyps ist z B bei Hautzellen von Bedeutung In der Praxis haben sich Segmentabstande von 3-6 Zellagen bewahrtAlternatively, the cell tissue can also be built up step by step. First, a level of the cell carrier according to the invention is incubated with cells. After a cell layer has grown on this, the lowest level, the system is gradually moved around a cell carrier layer extended to allow a cell layer to grow here as well The successive procedure has the advantage that different differentiation of a cell type can also be enforced by different spacing of the segments or the support layers.The different differentiation of a cell type is important e.g. in skin cells in practice have kept segment spacings of 3-6 cell layers
Die erfindungsgemaßen Zelltrager ermöglichen eine gute Versorgung der Zellen mit Nährstoffen Dies kann durch eine Verästelung der Segmente erreicht werden Fig 4 a bis e zeigt eine beispielhafte Ausführung eines solchen Systems, basierend auf einer Wabenstruktur In dieses System wird durch einen Zulauf Nahrmedium gepumpt Über den Abfluß kann das Medium ablaufen und wieder dem Kreislauf zugeführt werden oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden Die Oberflache der Segmente ist mit kleinen Poren mit Große und Verteilung wie bereits beschrieben, versehen Durch Kombination der Segmente entsteht auch bei dieser Ausfuhrungsvariante ein kunstliches KapillarnetzThe cell carriers according to the invention enable the cells to be well supplied with nutrients. This can be achieved by branching the segments. FIG. 4 a to e shows an exemplary embodiment of such a system based on a honeycomb structure. Food medium is pumped into this system through an inlet the medium run off and returned to the circuit or collected for further processing / disposal The surface of the segments is provided with small pores with a large size and distribution as already described. Combining the segments also creates an artificial capillary network in this embodiment variant
Der Durchmesser der einzelnen Waben („Schlusselweite") ist abhangig vom verwendeten Zelltyp und kann zwischen 70 und 180 μm betragen Um eine optimale Versorgung der Zellen sicherzustellen, kann der nächste wabenformige Zelltrager um 90 Grad (Fig 4 c) gedreht über den vorhergehenden Zelltrager gestapelt werdenThe diameter of the individual honeycombs (“key width”) depends on the cell type used and can be between 70 and 180 μm. In order to ensure optimal supply to the cells, the next honeycomb-shaped cell carrier can be stacked over 90 degrees (FIG. 4 c) and stacked over the previous cell carrier become
Wie bei der leiterformigen Struktur beschrieben, kann auch mit wabenformigen Segmenten eine dreidimensionale Zellkultur aufgebaut werden Auch hier ermöglichen entsprechend ausgeführte Steckverbindungen zwischen den Waben ein schichtubergreifendes Zellwachstum (Fig 4 e)As described for the ladder-shaped structure, a three-dimensional cell culture can also be built up with honeycomb-shaped segments. Here, too, appropriately designed plug connections between the honeycombs enable cell growth across layers (FIG. 4 e)
Die wabenformigen Zelltrager sind, wie in Fig 1 skizziert, aus zwei fest miteinander verbundenen Halbschalen oder einer Halbschale und einer Membrane aufgebautAs sketched in FIG. 1, the honeycomb-shaped cell carriers are constructed from two half shells or a half shell and a membrane which are firmly connected to one another
Die erfindungsgemaßen Zelltrager können auch aus eher flachigen Segmenten aufgebaut werden Fig 5 zeigt schematisch den Aufbau eines solchen Zelltragers in einer pyramidenförmigen Ausführung in der Auf- (Fig 5 a) und Seitenansicht (Fig 5 b und c) DieThe cell carriers according to the invention can also be constructed from rather flat segments. FIG. 5 shows schematically the structure of such a cell carrier in a pyramidal design in the top (FIG. 5 a) and side view (FIGS. 5 b and c)
Segmente sind in parallel geführten Reihen periodisch angeordnet (Fig 5 c und d) Zwischen den Reihen bleibt ein Abstand, vorzugsweise von der halben Grundflache einer Pyramide Die einzelnen Segmentreihen können wiederum durch ggf für den Flussigkeitstransport geeignete Abstandhalter miteinander verbunden werden Über einen Zulauf wird Nahrmedium durch die Elemente gepumpt Über einen Abfluß kann das Medium ablaufen, dem Kreislauf wieder zugeführt oder zur Weiterverarbeitung/Entsorgung gesammelt werden Die Oberflachen der Pyramiden sind mit kleinen Poren mit Große und Verteilung wie beschrieben, versehen Die Pyramiden selbst sind hohl, an der Grundflache offen und bilden somit ebenfalls eine Halbschale Die Seitenansicht in Fig 5 c zeigt die Verbindung zweier Segmente zu einem geschlossenen ZelltragersystemSegments are periodically arranged in parallel rows (Fig. 5 c and d) between The rows remain at a distance, preferably from half the base area of a pyramid.The individual rows of segments can in turn be connected to one another by spacers which may be suitable for liquid transport. Nutrient medium is pumped through the elements via an inlet. The medium can run off via a drain, be returned to the circuit or be collected for further processing / disposal The surfaces of the pyramids are provided with small pores with size and distribution as described. The pyramids themselves are hollow, open at the base surface and thus also form a half-shell. The side view in FIG. 5 c shows the connection of two segments a closed cell support system
Eine Zellkultur mit erfindungsgemaßen, pyramidenförmigen Zelltragersegmenten kann wie folgt aufgebaut werden In ein geeignetes Zellkultursystem werden als Basiselement einige pyramidenförmige Segmente auf dem Boden aufgebracht Oberhalb von diesen Strukturen können nun weitere Segmente positioniert werden Durch die Kombination von Segmenten entstehen die Zelltrager (siehe Seitenansicht Fig 5 c) Die Segmente können so ineinander verschachtelt werden, daß zwischen den Oberflachen der Pyramiden ein Abstand, in dem die Zellen wachsen können, bestehtA cell culture with pyramid-shaped cell support segments according to the invention can be constructed as follows: In a suitable cell culture system, some pyramid-shaped segments are applied to the base as a basic element. Above these structures, further segments can now be positioned. The combination of segments creates the cell supports (see side view Fig. 5 c ) The segments can be nested so that there is a distance between the surfaces of the pyramids in which the cells can grow
Der Vorteil dieser Struktur ist, daß die geometrischen Abmessungen der Elemente unabhängig vom gewählten Zelltyp sind Nur der Schichtabstand und der Porendurchmesser der Elemente muß an den verwendeten Zelltyp angepaßt werden Um eine möglichst hohe Zelldichte bzw ein kleines Totvolumen innerhalb der Pyramiden d h der Versorgungselemente zu erreichen, empfiehlt sich eine kleine Hohe der einzelnen Pyramidenelemente im Vergleich zu ihrer Grundflache Die in Fig 5 d gezeigten Zelltrager besitzen folgende AbmaßeThe advantage of this structure is that the geometrical dimensions of the elements are independent of the selected cell type. Only the layer spacing and the pore diameter of the elements must be adapted to the cell type used in order to achieve the highest possible cell density or a small dead volume within the pyramids, ie the supply elements. a small height of the individual pyramid elements is recommended in comparison to their base area. The cell supports shown in FIG. 5 d have the following dimensions
Pyramidenhohe al 20 - 40 μmPyramid height al 20 - 40 μm
Hohe Grundflache a2 20 - 40 μmHigh base area a2 20 - 40 μm
Breite der Segmente a3 150 - 300 μm Lange der Segmente a5 ganzzahlige Vielfache von a3 Abstand der Zelltrager a4 50 - 300 μm Alternativ zu den aus zwei Halbschalen aufgebauten Zelltragersystemen können diese auch durch Kombination einer Halbschale eines modular geformten Segments mit einer semipermeablen Membrane unter Aufbau eines Kapillarsystems gebildet werden Hierbei wird auf der Ruckseite eines Segments eine permeable Membrane gespannt Durch geeignete Atzverfahren können die überstehenden Membranteile entfernt werden Diese Technik hat den Vorteil, daß nicht zwei Segmente passgenau zusammengesetzt werden müssen Semipermeable Membran wie Gorotex, Simpatex oder keramische Membranen sind hierfür geeignet Als bevorzugtes Atzverfahren hat sich Plasmaatzen erwiesen Es handelt sich hierbei um eine Trockenatzvariante, die bei der Herstellung von Strukturen im μm-Bereich genutzt wird Nach dem Aufbringen durch Phaseninversionsprozeß der Membrane auf die Ruckseite eines Segmentes werden in einem Plasmareaktor mit Plasmagasen wie F2, Cl2, CF37F, CC13 +/C1 und O2 die überstehenden Membranteile weggeatzt Auch diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erzeugt letztendlich geschlossene Hohlräume bzw Kapillare Die Porengroße und Verteilung der Membranen entspricht denen der Segmente mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm und einem mittleren Durchmesser von 0,5 bis 5 μmWidth of the segments a3 150 - 300 μm Length of the segments a5 integer multiples of a3 Distance of the cell carriers a4 50 - 300 μm As an alternative to the cell carrier systems made up of two half-shells, these can also be formed by combining a half-shell of a modularly shaped segment with a semi-permeable membrane while building a capillary system.A permeable membrane is stretched on the back of a segment. The protruding membrane parts can be removed using suitable etching processes Technology has the advantage that two segments do not have to be assembled precisely. Semipermeable membranes such as Gorotex, Simpatex or ceramic membranes are suitable for this purpose. Plasma etching has proven to be a preferred etching process. This is a dry etching variant that is used to manufacture structures in the μm range After application by phase inversion process of the membrane on the back of a segment, the protruding membrane portions are removed in a plasma reactor with plasma gases such as F 2 , Cl 2 , CF 3 7F, CC1 3 + / C1 and O 2 etches This embodiment of the present invention also ultimately creates closed cavities or capillaries. The pore size and distribution of the membranes correspond to those of the segments with an average distance of 1 to 10 μm and an average diameter of 0.5 to 5 μm
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der dreidimensionalen Zelltragersysteme für Bioreaktoren und zur Kultivierung von eukaryontischen oder organischen StammzellenAnother object of the present invention is the use of the three-dimensional cell support systems for bioreactors and for the cultivation of eukaryotic or organic stem cells
Wichtige Stammzellen sind Heptozyten, Nierenzellen, Endothelzellen, Epithelzellen oder MyozytenImportant stem cells are heptocytes, kidney cells, endothelial cells, epithelial cells or myocytes
In der Biotechnologie werden zur Produktion von Hormonen, Cytokinen und anderen gentechnisch herstellbaren Arzneimitteln Zellkulturen verwendet, deren Erbgut so verändert wurde, daß sie zur Produktion der gewünschten Stoffe in der Lage sind Da diese Zellen bisher fast ausschließlich in zweidimensionalen Kulturen gezüchtet werden, differenzieren diese Zellen sehr schnell Dies hat zur Folge, daß die gewünschten Stoffe von der Zelle nicht sehr lange produziert werden und die Zellen ausgetauscht oder das Erbgut der Zellen erneut verändert werden muß Der Einsatz der erfindungsgemaßen, dreidimensionalen Zelltragern zur Kultivierung bietet den Vorteil, daß der Phanotyp der eingesetzten Zellen weitgehend erhalten bleibt und die Differenzierung spater oder gar nicht einsetzt Hierdurch können entscheidende Produktionsvorteile erzielt werdenIn biotechnology, cell cultures are used for the production of hormones, cytokines and other genetically producible medicinal products, the genetic makeup of which has been modified in such a way that they are able to produce the desired substances.These cells have so far been cultivated almost exclusively in two-dimensional cultures, so these cells differentiate very quickly this has the consequence that the desired substances are not produced by the cell for very long and the cells have to be exchanged or the genetic material of the cells has to be changed again. The use of the three-dimensional cell carriers according to the invention for cultivation has the advantage that the phanotype of the used ones Cells largely preserved remains and the differentiation sets in later or not at all. As a result, decisive production advantages can be achieved
Durch den Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragern, die für humane Zelltypen optimiert sind, können somit auch humane Proteine synthetisiert werden Dies bedeutet, daß der Aufbau und insbesondere die Faltung der synthetischen Proteine der naturlichen Proteine des menschlichen Korpers entsprichtBy using cell carriers according to the invention which are optimized for human cell types, human proteins can thus also be synthesized. This means that the structure and in particular the folding of the synthetic proteins corresponds to the natural proteins of the human body
Da die Zellen auf den erfindungsgemaßen Zelltragern adhariert und nicht in einer Suspension vorliegen, können die von den Zellen produzierten Proteine oder sonstigen Stoffe standig über den Kreislauf der Nahrstoffversorgung entnommen werden Bei nicht adharenten Systemen gelingt dies nur durch eine Filtration oder durch Zentrifügation der Suspensionen Dies ermöglicht z B den Aufbau von Zellkulturen als Implantat bis hin zu kunstlichen HybridorganenSince the cells adhere to the cell supports according to the invention and are not present in a suspension, the proteins or other substances produced by the cells can be continuously removed via the nutrient supply cycle. In the case of non-adherent systems, this is only possible by filtration or by centrifuging the suspensions For example, the development of cell cultures as an implant up to artificial hybrid organs
Die kunstliche Herstellung von Ersatzorganen bereitet noch immer sehr große Schwierigkeiten Klinische Losungsansatze gibt es bisher nur für eine kunstliche Leber (H G Koebe, F W Schildberg in "Die kunstliche Leber - ein Zwischenbericht ", Wiener klinische Wochenschrift, 110, 16, 551-563, 1998) Hier wird eine Suspension aus Hepatotzyten in einer Perfüsionskammer gehalten, die an den Blutkreislauf des Patienten angeschlossen und die Funktion der ausgefallenen Leber übernehmen kann Diese Technik kann bisher nur bei akuten Leberversagen genutzt werden, da die begrenzte Lebensdauer und der veränderte Phanotyp der Kulturen deren längere Verwendung zur Zeit ausschließtThe artificial production of replacement organs is still very difficult Clinical solutions are only available for an artificial liver (HG Koebe, FW Schildberg in "The artificial liver - an interim report", Wiener clinical weekly, 110, 16, 551-563, 1998 ) Here, a suspension of hepatotcytes is kept in a perfusion chamber, which is connected to the patient's bloodstream and can take over the function of the failed liver.This technique can only be used in the case of acute liver failure because the limited life span and the changed phanotype of the cultures make them longer Excludes use currently
Der Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragersystemen bietet den Vorteil, daß die Hepatozyten nicht in einer Suspension vorliegen, sondern organotypisch wachsen können Hierdurch ist sichergestellt, daß die Heptatozyten einen Differenzierungsgrad erreichen, wie er auch in vito vorliegtThe use of cell carrier systems according to the invention has the advantage that the hepatocytes are not present in a suspension but can grow organotypically. This ensures that the heptatocytes achieve a degree of differentiation which is also present in vitro
Mit Hilfe der erfindungsgemaßen Zelltragersysteme und der so möglichen Vaskularisierung können die Hepatozyten ausreichend versorgt werden Die einzelnen Segmente werden so geschaltet, daß nur ein Zu- und ein Ablauf vorliegt Zur besseren Handhabbarkeit und zum Schutz vor Infektionen wird das System durch eine äußere Verkapselung geschlossen Der Blutkreislauf eines Patienten kann dann über den nach außen zugeführten Zu- und Ablauf abgeschlossen werden Im Reaktor übernehmen die Zellen dann die Funktion der Leber Mit dieser Technik können auch andere kunstliche Organe wie z B eine Niere aufgebaut werdenWith the aid of the cell carrier systems according to the invention and the vascularization that is possible in this way, the hepatocytes can be adequately supplied. The individual segments are switched in such a way that there is only one inlet and one outlet Protection from infection is closed by an external encapsulation. The blood circulation of a patient can then be closed via the inflow and outflow in the outside. In the reactor, the cells then take over the function of the liver. With this technique, other artificial organs such as a Kidney to be built up
Humane Nierenzellen können heute bereits gut in Kultur gehalten werden Bisher scheiterte der fünktionelle Einsatz dieser Zellen im Bereich der Dialyse aber an der Nachbildung von Nephronen in Verbindung mit fünktionell differenzierten Nierenzellen Durch die Kombination von Mikrosystemtechnik und Zellkulturtechnik ist es möglich, solche funktioneilen Einheiten der Niere nachzubilden Hierfür sind allerdings zwei getrennte Kreislaufsysteme, ein System für den Harn und ein System für den Blutkreislauf, notig Auch hier muß eine geeignete Verkapselung geschaffen werdenHuman kidney cells can already be kept in good culture today So far, the functional use of these cells in dialysis has failed due to the replication of nephrons in connection with functionally differentiated kidney cells.The combination of microsystem technology and cell culture technology makes it possible to simulate such functional units of the kidney For this, however, two separate circulatory systems, a system for the urine and a system for the blood circulation, are necessary. A suitable encapsulation must also be created here
Weitere Einsatzgebiete für die Verwendung der erfindungsgemaßen Zelltrager sind Langerhansche Inselzellen des Pankreas, deren Funktion bei Diabetikern eingeschränkt ist Bringt man gesunde Zellen dieses Types auf ein Gerüst von Zelltragern, kann kunstlich Insulin erzeugt werden Die Zelltrager werden mit den Blutkreislauf des Patienten verbunden Wie bei der Verwendung als Organersatz muß das System durch eine äußere Verkapselung geschlossen werdenFurther areas of application for the use of the cell carriers according to the invention are Langerhan's islet cells of the pancreas, the function of which is restricted in diabetics. If healthy cells of this type are placed on a scaffold of cell carriers, insulin can be artificially produced as an organ replacement, the system must be closed by an external encapsulation
Die Nachbildung von kunstlichen Gewebe und Gewebeersatz auf erfindungsgemaßen Zelltragern bietet bei der Toxizitatsprufüng entscheidende Vorteile Für die Nachbildung der Haut ist eine Verkapselung nicht notwendig In Nachahmung des anatomischen Vorbildes muß bei der Züchtung von kunstlicher Haut die Blutversorgung zur Lederhaut hin immer mehr abnehmen Technisch kann dies durch immer großer werdende Abstände der Segmente in der Zellkultur erreicht werden Da die kunstliche Vaskularisierung durch diese Bauweise in genau definierten Zellschichten liegen, kann dies auch für Penetrationsversuche genutzt werden Für solche Untersuchungen muß die Versorgung der Elemente in der Zellkultur aber schichtweise vorgenommen werden, so daß nur in der gewünschten Zellschicht Nahrmedium zur Analyse entnommen werden kann Der Einsatz von erfindungsgemaßen Zelltragern bringt insbesondere bei der Schaffung von Krankheitsmodellen Vorteile Hierzu werden die Zellen, die auf zellularer Ebene die charakteristischen Merkmale der Krankheit tragen, in eine Zellkultur gebracht und durch Segmente in einer 3D-Kultur gehalten werden Durch diese Technik bleiben die Zellen langer im "krankhaften" physiologischen Zustand und redifferenzieren nicht wieder so schnell Der Einsatz solcher Modelle liegt primär in der Pharmaindustrie, die an solchen Modellen neue Arzneimittel testen kann Außerdem können solche Modelle entscheidend zum Verständnis einiger Krankheiten beitragen The replication of artificial tissue and tissue replacement on cell supports according to the invention offers decisive advantages in the toxicity test. Encapsulation is not necessary for the replication of the skin.In imitation of the anatomical model, the blood supply to the dermis must decrease more and more when artificial skin is being grown Increasing distances between the segments in the cell culture can be achieved. Because the artificial vascularization due to this construction lies in precisely defined cell layers, this can also be used for penetration tests. For such tests, the elements in the cell culture must be supplied in layers, so that only nutrient medium can be removed for analysis in the desired cell layer The use of cell carriers according to the invention has advantages in particular in the creation of disease models. For this purpose, the cells that carry the characteristic features of the disease at the cellular level are brought into a cell culture and are kept in a 3D culture by segments. This technique keeps the cells longer in the "pathological" physiological state and does not redifferentiate again so quickly The use of such models is primarily in the pharmaceutical industry, which can test new drugs on such models. Furthermore, such models can make a decisive contribution to understanding some diseases

Claims

Patentansprüche:Claims:
1 Zelltragersystem aus porösen Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß das Zelltragersystem aus modular geformten Segmenten besteht, die ganz oder teilweise aus Halbschalen aufgebaut sind1 cell support system made of porous materials, characterized in that the cell support system consists of modularly shaped segments which are wholly or partly constructed from half-shells
2 Zelltragersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß je zwei modular geformte Segmente durch Kombination der Halbschalen ein2 cell support system according to claim 1, characterized in that two modular segments each by combining the half-shells
Kapillarsystem bildenForm the capillary system
3 Zelltragersystem nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß eine Halbschale eines modular geformten Segments durch Kombination mit einer semipermeablen Membrane ein Kapillarsystem bildet3 cell support system according to claim 1, characterized in that a half-shell of a modularly shaped segment forms a capillary system by combination with a semi-permeable membrane
Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Poren mit einem mittleren Durchmesser von 0,5 bisCell support system according to one of claims 1 to 3, characterized in that the modularly shaped segments have pores with an average diameter of 0.5 to
5 μm aufweisen5 μm
Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Poren mit einem mittleren Abstand von 1 bis 10 μm aufweisenCell support system according to one of claims 1 to 4, characterized in that the modularly shaped segments have pores with an average distance of 1 to 10 microns
Zelltragersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß die modular geformten Segmente Abstandhalter mit einer Hohe von 20 bis 200 μm aufweisen Zelltragersystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandhalter hohl sind und für einen Flussigkeitstransport geeignet sindCell support system according to one of claims 1 to 5, characterized in that the modularly shaped segments have spacers with a height of 20 to 200 microns Cell carrier system according to claim 6, characterized in that the spacers are hollow and are suitable for liquid transport
Verwendung der Zelltragersysteme gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Kultivierung von eukaryontischen oder organischen StammzellenUse of the cell carrier systems according to one of claims 1 to 7 for the cultivation of eukaryotic or organic stem cells
Verwendung der Zelltragersysteme gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für Bioreaktoren Use of the cell support systems according to one of claims 1 to 7 for bioreactors
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