EP1121199B1 - Dispositif d'analyse chimique et/ou biochimique avec un support d'analyse - Google Patents

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EP1121199B1
EP1121199B1 EP99947579A EP99947579A EP1121199B1 EP 1121199 B1 EP1121199 B1 EP 1121199B1 EP 99947579 A EP99947579 A EP 99947579A EP 99947579 A EP99947579 A EP 99947579A EP 1121199 B1 EP1121199 B1 EP 1121199B1
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EP
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support
analysis
thermal
substrate
bowl
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EP99947579A
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Yves Fouillet
Jean-Frédéric Clerc
Jean Therme
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a device chemical and / or biological analysis, equipped with a analysis support which may be of the single-use type.
  • the invention finds applications in fields of chemistry and biology.
  • the device can be used in chemical amplification or reaction processes Polymerase Chain Reaction (PCR) polymerase for analysis of genetic material (DNA).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the equipment also has a cost of high manufacturing.
  • the object of the invention is to propose a biological and / or chemical analysis device not having the limitations mentioned above.
  • Another goal is to reduce the times of heating, cooling and allow a accurate and selective temperature control of components to be analyzed during the different phases of reaction.
  • Another object of the invention is to propose a such a device can be quickly adapted to different types of products to analyze and do requiring no complex connection operations.
  • the invention also aims to propose a device with an analysis support, very low cost, possibly for single use, which can be and replaced after each use, or after a limited number of uses. For example, we are considering to perform a thousand sequential analyzes with a device before throwing it away.
  • the invention has more precisely for purpose a chemical analysis device and / or biological comprising an analysis support with at least one inlet bowl to collect a sample, at least one outlet bowl for delivering said sample, at least one internal channel through the bracket to connect the inlet bowl to the outlet bowl, and at least one tank to reagent, connected to each channel respectively between a inlet bowl and an outlet bowl, wherein the inlet bowl, the outlet bowl and the tank open on a first side of the support analysis.
  • the device may in particular include a plurality of inlet bowls and a plurality corresponding outlet cuvettes, each cuvette inlet respectively being connected to a bowl of associated output, by means of a channel.
  • micropipette micropipette
  • the implementation place liquids to be analyzed in the cuvettes inlet and / or reagents in the tanks can be done by means of watertight supply of fluids such as a plug deposited on the tank or bowl and connected to a syringe or a tank under pressure.
  • the supply of liquids to analyze and / or reagents can be automated at means of a dispensing robot (dispense) at high resolution.
  • the sequential analyzes assuming the replacement in time of at least one reactive by another can be automated by sequential introduction into the tank corresponding of several different reagents. Enter two different reagents a neutral buffer liquid can, or not, be introduced into the tank.
  • the or internal channels can be planned for extend near at least one second face of the analysis support so as to be separate from said second face only by a thin wall.
  • the thin wall can present a thickness of less than 100 ⁇ m.
  • the wall is chosen Thin enough to allow heat exchange with thermal sources external to the support analysis.
  • the wall separating the channels of the second side can be chosen thinner than a wall separating the channels between them or basins.
  • the face opposite channels to the thin wall may present a thermal barrier, this can be achieved by a layer of low thermal conductive material and / or a structuring of the substrate to locate on the channels a cavity filled with air or a little gas coolant.
  • This thermal barrier makes it possible to standardize the temperature in the channels.
  • the device may further comprise a thermal support independent of the analysis support, thermal support having a heat exchange face with at least a thermal source, and said thermal medium can be removably attached to the support of analysis in order to put in contact the exchange face with the second face of the analysis support.
  • this support can be of the single or multiple use type uses, that is, to be thrown away after one or several uses. We mean by use the sequential realization of a number of neighboring analyzes for example 1000.
  • the heat exchange face may include a or several thermostatically controlled zones, each equipped with minus a heat source.
  • Thermostatic zones coincide with at least one area of the analysis support located downstream of a connection between a reagent and a channel.
  • downstream used here refers to to a flow direction of the liquid to be analyzed from the entrance bowls to the bowls of exit.
  • Thermal sources may include one or several electric heating resistors thermostatically controlled.
  • thermal sources may also include one or several channels crossed by a heat transfer fluid. This fluid can be used to heat or cool locally the analysis support.
  • the support analysis may comprise a first substrate having through openings which form respectively the bowls and reservoirs, and a second substrate, glued to the first substrate, the second substrate having grooves, covered by the first substrate to form channels, and coinciding respectively with the openings therethrough.
  • This particularly simple structure allows reduce media manufacturing costs analysis.
  • the first substrate can have two layers thermally weakly conductive, eg thick a few microns.
  • the first substrate can present at minus a non-through opening so as to create at minus a thermal insulation cavity.
  • the invention also relates to a method of implementation of an analysis device as described above, according to which the support is brought into contact with analysis with thermal support during a phase fixed-term analysis, at least one sample to be analyzed and at least one reagent being introduced into analysis support prior to the analysis phase or during the analysis phase, and then after the analysis, we remove the support analysis support thermal.
  • the analysis support can be reused.
  • Figure 1 is a section of a support 100 according to the invention.
  • a bowl is represented 102 mainly formed by an opening crossing made in a substrate 100a of the support, near one of its ends.
  • an outlet bowl 104 is made at the neighborhood of a second end.
  • the bowls 102, 104 open into a first face 106 of the support 100.
  • An internal channel 108 connects the inlet and outlet bowls exit.
  • Channel 108 is in the form of a groove etched in a second substrate 100b glued to first substrate so that the latter covers the groove.
  • the depth of the groove is practically equal to the thickness of the second substrate 100b, so that only a thin wall 110 separates the channel 108 of a second face 112 of the analysis support 100.
  • the support 100 is general parallelepiped shape and the first and second faces are the opposite major faces and parallel.
  • the figure also shows in section 120a, 120b, 120c reagent reservoirs arranged between inlet and outlet bowls 102 and 102.
  • tanks also open on the first side 106 of the analysis support 100. Fittings or passages 122a are provided to connect each of the tanks to channel 108.
  • passages 122a are shown in the plane of the figure, so that the tanks do stand out no entry and exit cuvettes in Figure 1.
  • the liquid to be analyzed can be introduced into the entry bowls using a pipette.
  • Reagent reservoirs can be filled in the same way.
  • Figure 1B shows an analysis support according to FIG. 1A whose reservoirs 120a, 120b and 120c are respectively associated with means fluid supply 150a, 150b and 150c.
  • These means comprise plugs, or supply caps 152a, 152b, 152c applied from tightly above the tanks and connected to Syringe pusher 154a, 154b and 154c which contain reagents.
  • the caps can be glued to the surface of the analysis stand or tight against the surface, using a seal.
  • the references 156a, 156b and 156c denote pressure sensors respectively provided on pipes connecting the syringe pumps to caps 152a, 152b and 152c, so as to control the pressure and / or flow of reagents.
  • the inlet bowls and tanks are subject to the atmospheric pressure, or at a pressure set by the feeding system, while a vacuum line 124 is applied to the outlet cuvettes.
  • a first spontaneous filling of the support analysis can be performed with a polar solvent (such as alcohol) followed by a nominal solvent to avoid the formation of bubbles. This filling puts benefit from a capillary effect in the channels.
  • a polar solvent such as alcohol
  • the analytical product arriving at the cuvettes of output can be taken there also by means of pipettes.
  • Figure 2 shows more precisely and separately the two substrates 100a and 100b which form the analytical support.
  • the analysis support comprises a plurality of inlet cuvettes 102 and a plurality outlet cuvettes 104.
  • the bowls are shaped like openings through openings in the first substrate 100a. These openings have a flared shape in V, forming a funnel.
  • each inlet bowl 102 is individually connected to an outlet basin 104 through a channel 108.
  • the analysis support includes three reservoirs reagent 120a, 120b, 120c.
  • each tank is common to several channels 108 to which it is connected by means of connectors 122a, 122b.
  • Reference 122a designates more precisely bores of the first substrate 110a connecting a tank to branches 122b corresponding, practiced in the second substrate 110b and respectively connected to the channels. (Good heard, tanks can also be individualized for the different channels).
  • Quantities of liquids (liquid to be analyzed, and reagents) that mix at the crossroads of branches 122b and channels 108 depend on the respective size of these branches and canals 108.
  • FIG. 3 shows an analysis support 100, conforms to that of FIG. 2, the substrates of which 100a and 100b are permanently glued.
  • the analysis support is represented above a corresponding thermal support 200.
  • the thermal support 200 has a face heat exchange 212 facing the second side 112 of the analysis support 100, in the vicinity of which are the channels.
  • the heat exchange face 212 of the thermal support 200 and the second face 112 of the analysis support are intended to be put into contact.
  • the heat exchange face 212 has three thermostatic zones 220a, 220b, 220c each equipped one or more heat sources (no shown).
  • the three thermostated zones 220a, 220b, 220c are arranged to coincide with portions analysis support channels located in the vicinity respectively reservoirs 120a, 120b, 120c, or more precisely branches supplying the reagents.
  • the fluid in the channel 122b can pass through a only once each thermal zone or several times thanks to suitable channel patterns as shown Figure 5 described later.
  • Figure 4 is a schematic section of analysis support reported on the thermal support to represent in more detail the thermostated zones.
  • analysis support and thermal support are represented with a slight spacing. These supports are however in contact.
  • the zones thermostats may include several sources thermal. This is the case of the thermostated zone 220a.
  • the electrical resistors of the first source 230 can be brought to a temperature of 94 ° C, the heat transfer fluid of the second heat source 232 at a temperature of 55 ° C and the heat transfer fluid of the third heat source 234 at a temperature of 72 ° C.
  • Thermal sources can be miniaturized so that thermal support has a submillimetric thermal resolution (less than one millimeter).
  • FIG. 5 is a top view of a portion of a first substrate 100a of an analysis support and shows an alternative embodiment of a channel 108.
  • Channel 108 is folded in a pattern repeated geometric.
  • a thermal support can be associated with the analysis support.
  • a liquid analyze can, by traversing different sections of the pattern, be brought into thermal contact so sequential with different heat sources of the thermostatically controlled area.
  • Figures 6 and 7 show two variants of realization of the device making it possible to improve uniformity of temperature in the channels in insulating their upper face, i.e. the face opposite to said second face 112 of the support analysis.
  • a first solution shown in Figure 6 is to perform in the upper part 100a of the hybridization support a cavity 160 (opening or not). This cavity coincides with at minus part of channel 108.
  • a second solution, shown in Figure 7, is to set up between the upper and lower parts 100a, 100b of the analysis support a layer 100c of material poor conductor of heat. It is possible also to use an upper substrate equipped with a layer 100c of a thermal insulating material.
  • FIGS 8 to 11, described below, give an example of a method of producing a support analysis as described above.
  • a first substrate plate 100a for example made of silicon
  • openings are made, as shown in FIG. 8.
  • These openings constitute the bowls or tanks 102, 104, 120a, 120b, 120c.
  • the chemically etched openings are made with inclined sides by anisotropic chemical etching for example (KOH) so as to give them a flared shape.
  • the location of the openings is defined by an etching mask (not shown) coincident with the pattern of the grooves.
  • the drilling of the layer 100c of thermal insulating material for example SiO 2 in the case of the variant proposed in FIG. 7, can be carried out, for example, by etching CHF 3 by dry process, the dimension of the perforation being defined by a mask or using the walls of the chemically created hole as a mask.
  • Figure 9 shows the etching of grooves, forming the channels 108, in a second substrate 100b for example silicon.
  • the engraving is done at through an etching mask (not shown) having a pattern corresponding to the desired channels. This is, for example, a chemical etching (KOH).
  • KOH chemical etching
  • the depth of the grooves is for example of the order of 100 ⁇ m for a substrate 100b with a thickness of 250 to 450 ⁇ m.
  • a third step shown in Figure 10 includes sealing of the first and second substrates 100a and 100b, so as to communicating the cuvettes or reservoirs 102, 104, 120a, 120b, 120c, with channels (grooves) 108 correspondents. Sealing takes place, for example, by direct bonding (molecular) of the two substrates.
  • the grooves 108 of the second substrate 100b are covered by the first substrate 100a to form the channels.
  • a final step, shown in Figure 11, comprises thinning the second substrate 100b of way to preserve between the channel 108 and the surface 112 exterior that a thin wall 110.
  • This wall 110 has a thickness of around 10 ⁇ m so as to encourage exchanges thermal.
  • Thinning is achieved by etching and / or by mechanochemical polishing.
  • a plurality of analysis supports conforming to the invention can be manufactured simultaneously and collectively according to the above method in two silicon wafers (corresponding to the first and second substrates).
  • the process is completed by a cutting slices with the saw to individualize the analysis supports.
  • Figure 12 shows an embodiment particular of the thermal support 200 of a device analysis according to the invention.
  • the thermal support 200 comprises for essentially a base 202 on which are arranged one or several thermostatic bars.
  • the thermal support includes three bars thermostatically controlled 320a, 320b, 320c which form respectively three thermostatically controlled zones.
  • All or some of the bars can be drowned in a thermal insulating material.
  • two bars 320b and 320c are surrounded by a solid thermal insulating material, while the first bar 320a is left in free contact with ambient air on its side faces.
  • Each bar is equipped with heating and / or cooling.
  • the first bar 320a is equipped with a channel 322a which traverses it and which makes it possible to thermostate it by circulation of a heat transfer fluid.
  • the other bars 320b and 320c are also equipped with such channels 322b and 322c.
  • the channels are respectively connected to thermostatic baths with pumping systems (not shown) for circulate the coolant.
  • connection between the baths and the bars can take place by means of hydraulic connections not represented.
  • the channels can be of circular type, as the figures show, but can also be equipped with fin systems to optimize the heat exchange.
  • the third bar 320c is equipped an electrical resistance 330.
  • the resistance electric is used here as “hot spring” while the coolant is used as “cold source”.
  • the second bar 320b has an element 340 for measuring the temperature, such as a resistance, used to control, for example, the temperature of the associated thermostated bath.
  • Reference 100 generally designates a removable analysis support arranged on the support thermal so as to be in contact with the bars Circulators. The detailed description of such support is not repeated here. We can refer to this subject explanations given with reference to figures preceding.
  • the analysis support 100 can be simply placed on the thermal support 200. It can also be pressed against thermal support at means of a flange or a suction system not represented.
  • the means for the control of temperature that is to say in particular the baths thermostats and the thermostated bars, are integral with the thermal support or in connection fluidic with the thermal support, and as the analysis support is removable, it is possible to realize the latter in a simple and inexpensive way.

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Description

Domaine technique
La présente invention concerne un dispositif d'analyse chimique et/ou biologique, équipé d'un support d'analyse pouvant être du type à usage unique.
L'invention trouve des applications dans les domaines de la chimie et de la biologie. En particulier, le dispositif peut être mis à profit dans des procédés d'amplification chimique ou de réaction de polymérase de type PCR (Polymerase Chain Reaction) pour l'analyse de matériau génétique (ADN).
Etat de la technique antérieure
On connaít actuellement des systèmes macroscopiques d'analyse chimique ou biologique utilisant des plaques de titrage. Ces plaques comportent des cuvettes dans lesquelles on mélange des échantillons et des réactifs par pipetage (à la pipette). Pour permettre les réactions chimiques ou biologiques, les plaques sont successivement chauffées à des températures de consigne par des étuvages successifs, puis sont refroidies.
Avec de tels systèmes, l'apport des réactifs est une opération longue et complexe, notamment en raison d'un apport successif de chaque réactif. De plus, l'inertie thermique de chauffage et de refroidissement des plaques de titrage s'avère trop importante et allonge le temps d'analyse.
On connaít par ailleurs, des équipements d'analyse chimique et/ou biochimique qui se présentent sous forme de structures complètes incorporant les moyens de chauffage nécessaires à l'analyse. Des systèmes de connexion par tuyauterie permettent d'amener les échantillons et les réactifs dans la structure.
L'utilisation de ces équipements implique cependant des opérations complexes et fastidieuses de connexion pour l'amenée des fluides, analytes et réactifs, ainsi que des opérations de connexion électrique pour l'alimentation en énergie des moyens de chauffage. En raison de la spécificité des analyses, il est nécessaire de renouveler les opérations de connexion lors de chaque nouvelle utilisation de l'équipement.
Les équipements présentent en outre un coût de fabrication élevé.
Une illustration plus complète des techniques et équipements dans le domaine de l'analyse biochimique est donnée par les documents (1) et (2) dont les références sont précisées à la fin de la présente description.
Exposé de l'invention
L'invention a pour but de proposer un dispositif d'analyse biologique et/ou chimique ne présentant pas les limitations évoquées ci-dessus.
Un autre but est de réduire les temps de chauffage, de refroidissement et de permettre un contrôle en température précis et sélectif des composants à analyser au cours des différentes phases de réaction.
Un but de l'invention est encore de proposer un tel dispositif pouvant être adapté rapidement à différents types de produits à analyser et ne nécessitant pas d'opérations de connexion complexes.
L'invention a aussi pour but de proposer un dispositif avec un support d'analyse, de très faible coût, pouvant être à usage unique, qui peut être jeté et remplacé après chaque utilisation, ou après un nombre limité d'utilisations. On envisage par exemple d'effectuer un millier d'analyses séquentielles avec un dispositif avant de le jeter.
Pour atteindre ces buts, l'invention a plus précisément pour objet un dispositif d'analyse chimique et/ou biologique comprenant un support d'analyse avec au moins une cuvette d'entrée pour recueillir un échantillon, au moins une cuvette de sortie pour délivrer ledit échantillon, au moins un canal interne traversant le support pour relier la cuvette d'entrée à la cuvette de sortie, et au moins un réservoir à réactif, relié à chaque canal respectivement entre une cuvette d'entrée et une cuvette de sortie, dans lequel la cuvette d'entrée, la cuvette de sortie et le réservoir débouchent sur une première face du support d'analyse.
Le dispositif peut en particulier comporter une pluralité de cuvettes d'entrée et une pluralité correspondante de cuvettes de sortie, chaque cuvette d'entrée étant respectivement reliée à une cuvette de sortie associée, au moyen d'un canal.
La mise en place des liquides à analyser dans les cuvettes d'entrée et/ou des réactifs dans les réservoirs correspondants peut avoir lieu par micropipetage (à la micropipette).
Selon un autre mode d'utilisation, la mise en place des liquides à analyser dans les cuvettes d'entrée et/ou des réactifs dans les réservoirs correspondants peut avoir lieu par des moyens étanches d'amenée de fluides tels qu'un bouchon déposé sur le réservoir ou la cuvette et relié à une seringue ou à une citerne sous pression.
La mise en place des liquides et/ou des réactifs peut être obtenue par une combinaison des deux modes décrits précédemment.
Pour des supports avec un grand nombre de cuvettes et/ou de réservoirs, l'apport des liquides à analyser et/ou des réactifs peut être automatisé au moyen d'un robot de distribution (dispense) à haute résolution. Par ailleurs, les analyses séquentielles supposant le remplacement dans le temps d'au moins un réactif par un autre peuvent être automatisées par l'introduction séquentielle dans le réservoir correspondant de plusieurs réactifs distincts. Entre deux réactifs distincts un liquide tampon neutre peut, ou non, être introduit dans le réservoir.
Selon un aspect particulier de l'invention, le ou les canaux internes peu(ven)t être prévu(s) pour s'étendre à proximité d'au moins une deuxième face du support d'analyse de façon à n'être séparé de ladite deuxième face que par une paroi mince. Dans une réalisation particulière la paroi mince peut présenter une épaisseur inférieure à 100 µm.
De façon plus précise, la paroi est choisie suffisamment mince pour permettre un échange thermique avec des sources thermiques externes au support d'analyse.
En particulier, la paroi séparant les canaux de la deuxième face peut être choisie plus mince qu'une paroi séparant les canaux entre eux ou des cuvettes.
Selon un autre aspect de l'invention, la face des canaux opposée à la paroi mince peut présenter une barrière thermique, celle-ci pouvant être réalisée par une couche de matériau peu conducteur thermique et/ou une structuration du substrat permettant de localiser sur les canaux une cavité remplie d'air ou d'un gaz peu caloporteur.
Cette barrière thermique permet d'uniformiser la température dans les canaux.
Selon un autre aspect de l'invention, le dispositif peut comporter en outre un support thermique indépendant du support d'analyse, le support thermique présentant une face d'échange thermique avec au moins une source thermique, et ledit support thermique pouvant être rapporté de façon amovible sur le support d'analyse afin de mettre en contact la face d'échange thermique avec la deuxième face du support d'analyse.
Le caractère séparé du support d'analyse et du support thermique permet de concevoir des supports d'analyse sans propres moyens de chauffage ou de refroidissement. Cette caractéristique permet de réduire par conséquent dans des proportions importantes le coût du support d'analyse. Ainsi, ce support peut être du type à utilisation unique ou à plusieurs utilisations, c'est-à-dire être jeté après une ou plusieurs utilisations. On entend par utilisation la réalisation séquentielle d'un nombre d'analyses voisin par exemple de 1000.
La face d'échange thermique peut comporter une ou plusieurs zones thermostatées équipées chacune d'au moins une source thermique. Les zones thermostatées coïncident avec au moins une zone du support d'analyse située en aval d'un raccord entre un réservoir à réactif et un canal.
En associant une zone thermostatée du support thermique avec une zone correspondante du support d'analyse située respectivement au voisinage, par exemple en aval, de chaque réservoir à réactif, il est possible de contrôler et d'adapter sélectivement la température du liquide à analyser en fonction de chaque réactif utilisé.
Le terme aval utilisé ici s'entend par rapport à une direction d'écoulement des liquides à analyser depuis les cuvettes d'entrée jusqu'aux cuvettes de sortie.
Les sources thermiques peuvent comporter une ou plusieurs résistances électriques chauffantes thermostatées.
A titre alternatif ou complémentaire les sources thermiques peuvent comporter également un ou plusieurs canaux traversés par un fluide caloporteur. Ce fluide peut être utilisé pour chauffer ou refroidir localement le support d'analyse.
Dans une réalisation particulière du support d'analyse, celui-ci peut comporter un premier substrat présentant des ouvertures traversantes qui forment respectivement les cuvettes et réservoirs, et un deuxième substrat, collé au premier substrat, le deuxième substrat présentant des rainures, recouvertes par le premier substrat pour former des canaux, et coïncidant respectivement avec les ouvertures traversantes.
Cette structure particulièrement simple permet de réduire les coûts de fabrication des supports d'analyse.
La fabrication du support peut avoir lieu, conformément à l'invention, selon un procédé comprenant les étapes successives suivantes :
  • formation, dans un premier substrat, d'ouvertures traversantes, lesdites ouvertures correspondant respectivement à des cuvettes d'entrée ou de sortie, ou à des réservoirs de réactif,
  • formation dans un deuxième substrat de rainures selon un motif permettant de relier entre elles au moins deux ouvertures du premier substrat,
  • collage du premier substrat sur le deuxième substrat de façon à recouvrir les rainures,
  • amincissement du deuxième substrat, après le collage, en préservant une épaisseur de substrat supérieure à une profondeur maximale des rainures.
Selon un mode de réalisation particulier, le premier substrat peut présenter deux couches thermiquement peu conductrices, épaisses par exemple de quelques microns.
Selon un second mode particulier de réalisation, le premier substrat peut présenter au moins une ouverture non traversante de façon à créer au moins une cavité d'isolation thermique.
L'invention concerne également un procédé de mise en oeuvre d'un dispositif d'analyse tel que décrit ci-dessus, selon lequel on met en contact le support d'analyse avec le support thermique pendant une phase d'analyse de durée déterminée, au moins un échantillon à analyser et au moins un réactif étant introduits dans le support d'analyse préalablement à la phase d'analyse ou pendant la phase d'analyse, puis, après la phase d'analyse, on retire le support d'analyse du support thermique.
Au terme de l'analyse, le support d'analyse peut être réutilisé.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, en référence aux figures des dessins annexés. Cette description est donnée à titre purement illustratif et non limitatif.
Brève description des figures
  • La figure 1A est une coupe schématique simplifiée d'un support d'analyse conforme à l'invention.
  • La figure 1B montre le support d'analyse de la figure 1A équipé de moyens de remplissage de réservoirs à réactifs.
  • La figure 2 est un éclaté en perspective montrant de façon plus précise la structure du support d'analyse.
  • La figure 3 est une vue en perspective simplifiée d'un support d'analyse conforme à la figure 2 et d'un support thermique.
  • La figure 4 est une coupe longitudinale schématique du support d'analyse mis en place sur le support thermique.
  • La figure 5 est une vue en plan d'une partie d'un support d'analyse conforme à l'invention, constituant une variante par rapport aux figures 1 à 4.
  • La figure 6 est une coupe transversale simplifiée d'un support d'analyse incluant une partie conforme à la figure 5.
  • La figure 7 est une coupe transversale simplifiée d'un support d'analyse incluant une partie conforme à la figure 5 et constituant une variante par rapport à la figure 6.
  • Les figures 8, 9, 10 et 11 sont des coupes longitudinales schématiques de substrats lors d'étapes successives de fabrication d'un support d'analyse conforme à l'invention.
  • La figure 12 est une coupe transversale d'un support d'analyse et d'un support thermique conforme à l'invention et illustrant une réalisation particulière du support thermique.
Description détaillée de modes de mise en oeuvre de l'invention
Dans la description qui suit, des parties identiques, similaires ou équivalentes des figures sont repérées avec les mêmes références numériques afin d'en faciliter la lecture.
La figure 1 est une coupe d'un support d'analyse 100 conforme à l'invention.
Sur cette figure, est représentée une cuvette d'entrée 102 formée pour l'essentiel par une ouverture traversante pratiquée dans un substrat 100a du support, au voisinage de l'une de ses extrémités. De la même façon, une cuvette de sortie 104 est pratiquée au voisinage d'une deuxième extrémité. Les cuvettes 102, 104 débouchent en une première face 106 du support 100. Un canal interne 108 relie les cuvettes d'entrée et de sortie.
Le canal 108 se présente sous la forme d'une rainure gravée dans un second substrat 100b collé au premier substrat de sorte que ce dernier recouvre la rainure.
On observe que la profondeur de la rainure est pratiquement égale à l'épaisseur du deuxième substrat 100b, de sorte que seul une mince paroi 110 sépare le canal 108 d'une deuxième face 112 du support d'analyse 100.
Dans l'exemple illustré, le support 100 est de forme générale parallélépipédique et les première et deuxième faces sont les faces principales opposées et parallèles.
La figure représente également en coupe des réservoirs de réactif 120a, 120b, 120c agencés entre les cuvettes d'entrée 102 et de sortie 104. Les réservoirs débouchent également sur la première face 106 du support d'analyse 100. Des raccords ou passages 122a sont prévus pour relier chacun des réservoirs au canal 108.
Pour des raisons de simplification, les passages 122a sont représentés dans le plan de la figure, de sorte que les réservoirs ne se distinguent pas des cuvettes d'entrée et de sortie sur la figure 1.
Le liquide à analyser peut être introduit dans les cuvettes d'entrée au moyen d'une pipette.
Les réservoirs des réactifs peuvent être remplis de la même façon.
Dans le cas de l'analyse séquentielle mettant en oeuvre de façon successive des réactifs différents, dans le cas également où les réactifs doivent être conservés à une température bien contrôlée avant usage, il est préférable d'utiliser des réservoirs de petits volumes alimentés par un système de type pousse-seringue tel que représenté à la figure 1B.
La figure 1B montre un support d'analyse conforme à la figure 1A dont les réservoirs 120a, 120b et 120c sont respectivement associés à des moyens d'amenée de fluide 150a, 150b et 150c.
Ces moyens comportent des bouchons, ou capuchons d'alimentation 152a, 152b, 152c appliqués de façon étanche au-dessus des réservoirs et reliés à des pousse-seringues 154a, 154b et 154c qui contiennent des réactifs. Les capuchons peuvent être collés à la surface du support d'analyse ou serrés contre la surface, en utilisant un joint d'étanchéité.
Les références 156a, 156b et 156c désignent respectivement des capteurs de pressions ménagés sur des conduites reliant les pousse-seringues aux capuchons 152a, 152b et 152c, de façon à contrôler la pression et/ou le débit des réactifs.
Bien que non représenté, un système d'alimentation semblable peut également équiper les cuvettes d'entrée.
Comme le montrent les figures 1A et 1B, les cuvettes d'entrée et les réservoirs sont soumis à la pression atmosphérique, ou à une pression fixée par le système d'alimentation, tandis qu'une ligne à vide 124 est appliquée aux cuvettes de sortie.
Un premier remplissage spontané du support d'analyse peut être effectué avec un solvant polaire (tel que de l'alcool) suivi d'un solvant nominal afin d'éviter la formation de bulles. Ce remplissage met à profit un effet de capillarité dans les canaux.
Après ce premier remplissage, les analytes et réactifs sont ajoutés.
Le produit d'analyse arrivant aux cuvettes de sortie peut y être prélevé également au moyen de pipettes.
La figure 2 montre de façon plus précise et de façon séparée les deux substrats 100a et 100b qui forment le support d'analyse.
On observe que le support d'analyse comporte une pluralité de cuvettes d'entrée 102 et une pluralité de cuvettes de sortie 104.
Les cuvettes ont la forme d'ouvertures traversantes pratiquées dans le premier substrat 100a. Ces ouvertures présentent une forme évasée en V, formant un entonnoir.
Par ailleurs, dans l'exemple de la figure 2, chaque cuvette d'entrée 102 est individuellement reliée à une cuvette de sortie 104 par un canal 108.
Le support d'analyse comprend trois réservoirs à réactif 120a, 120b, 120c.
Dans cet exemple, chaque réservoir est commun à plusieurs canaux 108 auxquels il est relié au moyen de raccords 122a, 122b. La référence 122a désigne plus précisément des perçages du premier substrat 110a reliant un réservoir à des embranchements 122b correspondants, pratiqués dans le deuxième substrat 110b et connectés respectivement aux canaux. (Bien entendu, des réservoirs peuvent également être individualisés pour les différents canaux).
Les quantités de liquides (liquides à analyser, et réactifs) qui se mélangent au croisement des embranchements 122b et des canaux 108 dépendent de la taille respective de ces embranchements et des canaux 108.
La figure 3 montre un support d'analyse 100, conforme à celui de la figure 2, dont les substrats 100a et 100b sont définitivement collés.
Le support d'analyse est représenté au-dessus d'un support thermique 200 correspondant.
Le support thermique 200 présente une face d'échange thermique 212 tournée vers la deuxième face 112 du support d'analyse 100, au voisinage de laquelle se trouvent les canaux. La face d'échange thermique 212 du support thermique 200 et la deuxième face 112 du support d'analyse sont destinées à être mises en contact.
La face d'échange thermique 212 présente trois zones thermostatées 220a, 220b, 220c équipées chacune d'une ou de plusieurs sources thermiques (non représentées).
Les trois zones thermostatées 220a, 220b, 220c sont disposées de façon à coïncider avec des portions de canaux du support d'analyse situés au voisinage respectivement des réservoirs 120a, 120b, 120c, ou plus précisément des embranchements apportant les réactifs.
Le fluide dans le canal 122b peut traverser une seule fois chaque zone thermique ou plusieurs fois grâce à des motifs de canal adaptés comme représenté figure 5 décrite ultérieurement.
La figure 4 est une coupe schématique du support d'analyse reporté sur le support thermique permettant de représenter de façon plus détaillée les zones thermostatées.
Pour des raisons de clarté de la figure, le support d'analyse et le support thermique sont représentés avec un léger espacement. Ces supports sont cependant en contact.
Comme indiqué ci-dessus, les zones thermostatées peuvent comporter plusieurs sources thermiques. Ceci est le cas de la zone thermostatée 220a. Celle-ci comporte une première source thermique 230 formée de résistances électriques, telles que par exemple des microrésistances en platine. Elle comporte également deux sources 232 et 234 sous la forme de canaux traversés par des fluides caloporteurs.
Dans le cas d'une analyse de type PCR, les résistances électriques de la première source 230 peuvent être portées à une température de 94°C, le fluide caloporteur de la deuxième source thermique 232 à une température de 55°C et le fluide caloporteur de la troisième source thermique 234 à une température de 72°C.
Ces températures correspondent respectivement à des étapes de dénaturation, d'hybridation et d'élongation d'ADN (cf. document (1))
Les sources thermiques peuvent être miniaturisées de sorte que le support thermique présente une résolution thermique submillimétrique (inférieure au millimètre).
La figure 5 est une vue de dessus d'une partie d'un premier substrat 100a d'un support d'analyse et montre une variante de réalisation d'un canal 108.
Le canal 108 est replié selon un motif géométrique répété.
Sur la figure, on a représenté également en trait discontinu la position de sources thermiques d'une zone thermostatée 220, d'un support thermique pouvant être associé au support d'analyse. on observe que, grâce au motif géométrique du canal, un liquide à analyser peut, en parcourant différents tronçons du motif, être mis en contact thermique de façon séquentielle avec différentes sources thermiques de la zone thermostatée.
Les figure 6 et 7 présentent deux variantes de réalisation du dispositif permettant d'améliorer l'uniformité de la température dans les canaux en isolant leur face supérieure, c'est-à-dire la face opposée à ladite deuxième face 112 du support d'analyse. Une première solution représentée à la figure 6 consiste à réaliser dans la partie supérieure 100a du support d'hybridation une cavité 160 (débouchante ou non). Cette cavité coïncide avec au moins une partie de canal 108. Une seconde solution, représentée à la figure 7, consiste à mettre en place entre les parties supérieure et inférieure 100a, 100b du support d'analyse une couche 100c de matériau faiblement conducteur de la chaleur. Il est possible également d'utiliser un substrat supérieur équipé d'une couche 100c d'un matériau isolant thermique.
Les figures 8 à 11, décrites ci-après, donnent un exemple de procédé de réalisation d'un support d'analyse tel que décrit précédemment.
Dans une première plaque de substrat 100a, par exemple en silicium, on pratique, comme le montre la figure 8, des ouvertures traversantes. Ces ouvertures constituent les cuvettes ou les réservoirs 102, 104, 120a, 120b, 120c. Les ouvertures gravées par voie chimique sont réalisées avec des flancs inclinés par gravure chimique anisotrope par exemple (KOH) de façon à leur conférer une forme évasée. L'emplacement des ouvertures est défini par un masque de gravure (non représenté) en coïncidence avec le motif des rainures. Le perçage de la couche 100c de matériau isolant thermique, par exemple SiO2 dans le cas de la variante proposée figure 7, peut être effectué, par exemple, par gravure CHF3 par voie sèche, la dimension de la perforation étant définie par un masque de gravure ou en utilisant les parois du trou créé par voie chimique comme masque.
La figure 9 montre la gravure de rainures, formant les canaux 108, dans un deuxième substrat 100b par exemple de silicium. La gravure est effectuée à travers un masque de gravure (non représenté) présentant un motif correspondant aux canaux souhaités. Il s'agit, par exemple, d'une gravure chimique (KOH). La profondeur des rainures est par exemple de l'ordre de 100µm pour un substrat 100b d'une épaisseur de 250 à 450µm.
Il peut s'agir aussi d'une gravure sèche SG6 permettant de réaliser des rainures plus profondes que larges par exemple 100µmx20µm.
Une troisième étape représentée à la figure 10 comprend le scellement des premier et deuxième substrats 100a et 100b, de manière à mettre en communication les cuvettes ou réservoirs 102, 104, 120a, 120b, 120c, avec les canaux (rainures) 108 correspondants. Le scellement a lieu, par exemple, par collage direct (moléculaire) des deux substrats.
Lors de cette opération, les rainures 108 du deuxième substrat 100b sont recouvertes par le premier substrat 100a pour former les canaux.
Une dernière étape, représentée à la figure 11, comprend l'amincissement du deuxième substrat 100b de façon à ne préserver entre le canal 108 et la surface extérieure 112 qu'une mince paroi 110.
Cette paroi 110 présente une épaisseur de l'ordre de 10µm de façon à favoriser les échanges thermiques.
L'amincissement est réalisé par gravure et/ou par polissage mécanochimique.
Une pluralité de supports d'analyse conformes à l'invention peuvent être fabriqués simultanément et collectivement selon le procédé ci-dessus dans deux tranches de silicium (correspondant aux premier et deuxième substrats).
Dans ce cas, le procédé est complété par un découpage des tranches à la scie pour individualiser les supports d'analyse.
La figure 12 montre une réalisation particulière du support thermique 200 d'un dispositif d'analyse conforme à l'invention.
Le support thermique 200 comprend pour l'essentiel un socle 202 sur lequel sont disposés un ou plusieurs barreaux thermostatés. Dans l'exemple de la figure, le support thermique comprend trois barreaux thermostatés 320a, 320b, 320c qui forment respectivement trois zones thermostatées.
Tout ou partie des barreaux peuvent être noyés dans un matériau isolant thermique. Dans l'exemple de la figure deux barreaux 320b et 320c sont entourés par un matériau isolant thermique solide, tandis que le premier barreau 320a est laissé en contact libre avec l'air ambiant sur ses faces latérales.
Chaque barreau est équipé de moyens de chauffage et/ou de refroidissement.
Le premier barreau 320a est équipé d'un canal 322a qui le parcourt et qui permet de le thermostater par circulation d'un fluide caloporteur.
Les autres barreaux 320b et 320c sont également équipés de tels canaux 322b et 322c. Les canaux sont respectivement reliés à des bains thermostatés avec des systèmes de pompage (non représentés) pour faire circuler le fluide caloporteur.
La liaison entre les bains et les barreaux peut avoir lieu au moyen de connexion hydrauliques non représentées.
Les canaux peuvent être du type circulaire, comme le montrent les figures, mais peuvent également être pourvus de systèmes d'ailettes pour optimiser les échanges thermiques.
Des éléments chauffants complémentaires peuvent être intégrés dans les barreaux. A titre d'illustration, le troisième barreau 320c est équipé d'une résistance électrique 330. La résistance électrique est utilisée ici comme "source chaude" tandis que le fluide caloporteur est utilisé comme "source froide".
Le deuxième barreau 320b comporte un élément 340 de mesure de la température, tel qu'une résistance, utilisé pour asservir, par exemple, la température du bain thermostaté associé.
La référence 100 désigne de façon générale un support d'analyse amovible disposé sur le support thermique de façon à être en contact avec les barreaux thermostatés. La description détaillée d'un tel support n'est pas répétée ici. On peut se reporter à ce sujet aux explications données en référence aux figures précédentes. Le support d'analyse 100 peut être simplement posé sur le support thermique 200. Il peut également être pressé contre le support thermique au moyen d'une bride ou d'un système d'aspiration non représentés.
Comme les moyens destinés au contrôle de température, c'est-à -dire en particulier les bains thermostatés et les barreaux thermostatés, sont solidaires du support thermique ou en connexion fluidique avec le support thermique, et comme le support d'analyse est amovible, il est possible de réaliser ce dernier de façon simple et peu coûteuse.
DOCUMENTS CITES
  • (1) Martin U. Kopp, et al., "Chemical Amplification : continuous-Flow PCR on a chip", Science, vol. 280, 15 May 1998, pages 1046-1048
  • (2) "Chip advance but cost contraints remain" dans Nature Biotechnology, vol. 16, juin 1998, page 509.

    • Claims (16)

    1. Dispositif d'analyse chimique et/ou biologique comprenant :
      un support d'analyse (100) avec au moins une cuvette d'entrée (102) pour recueillir un échantillon, au moins une cuvette de sortie (104) pour délivrer ledit échantillon, au moins un canal interne (108) traversant le support pour relier la cuvette d'entrée et la cuvette de sortie, et au moins un réservoir à réactif (120a, 120b, 120c) relié à chaque canal (108) entre la cuvette d'entrée et la cuvette de sortie, dans lequel la cuvette d'entrée, la cuvette de sortie et le réservoir débouchent sur une première face (106) du support d'analyse, dans lequel le canal interne (100) s'étend à proximité d'au moins une deuxième face (112) du support d'analyse de façon à être séparé de ladite deuxième face par une paroi mince (110), et
      un support thermique (200) indépendant du support d'analyse (100), le support thermique présentant une face d'échange thermique (212) avec au moins une zone thermostatée (220a, 220b, 220c) équipé d'au moins une source thermique ;
      le support d'analyse (100) pouvant être rapporté de façon amovible sur le support thermique (200) afin de mettre en contact la face d'échange thermique (212) du support thermique avec la deuxième face (112) du support d'analyse (100).
    2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une barrière thermique est disposée sur un côté des canaux opposé à une deuxième face du support.
    3. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la barrière thermique comporte une couche (100c) d'isolation thermique au-dessus des canaux.
    4. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel la barrière thermique comporte une cavité d'isolation thermique (160) au-dessus des canaux.
    5. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la paroi mince (110) présente une épaisseur inférieure à 100 µm.
    6. Dispositif d'analyse selon la revendication 1, dans lequel la zone thermostatée coïncide avec au moins une zone du support d'analyse (100) située au voisinage d'un raccord (122b), entre un réservoir à réactif et un canal, lorsque le support d'analyse est reporté sur le support thermique.
    7. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le support thermique comprend des moyens de refroidissement et/ou des moyens de chauffage.
    8. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel les moyens de chauffage comportent au moins une résistance électrique (230).
    9. Dispositif selon la revendication 7, dans lequel les moyens de refroidissement et/ou les moyens de chauffage comportent au moins un canal à fluide caloporteur.
    10. Dispositif selon la revendication 1, comprenant une pluralité de cuvettes d'entrée (102) et une pluralité correspondante de cuvettes de sortie (104), chaque cuvette d'entrée étant respectivement reliée à une cuvette de sortie associée au moyen d'un canal (108).
    11. Dispositif selon la revendication 10, comportant une pluralité de réservoirs à réactif (120a, 120b, 120c), chaque réservoir étant relié à chacun des canaux (108).
    12. Dispositif selon la revendication 11, avec des moyens externes (150a, 150b, 150c) de remplissage des réservoirs, comportant au moins un pousse-seringue (154a, 154b, 154c) avec ou sans mélangeur de réactifs, connecté de façon étanche à au moins un réservoir.
    13. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel les moyens de remplissage comportent des capuchons d'alimentation (152a, 152b, 152c) recouvrant de façon étanche les réservoirs, et équipés chacun d'au moins une conduite reliée respectivement à au moins un pousse-seringue.
    14. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le support d'analyse (100) comprend un premier substrat (100a) présentant des ouvertures traversantes qui forment respectivement les cuvettes et réservoirs, et un deuxième substrat (100b), collé au premier substrat, le deuxième substrat présentant des rainures (108), recouvertes par le premier substrat pour former des canaux, et coïncidant avec les ouvertures traversantes.
    15. Procédé de fabrication d'un support d'analyse selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes :
      formation dans un premier substrat (100a), des ouvertures traversantes, lesdites ouvertures correspondant respectivement à des cuvettes d'entrée ou de sortie, ou à des réservoirs de réactif,
      formation dans un deuxième substrat (100b) de rainures selon un motif permettant de relier entre elles au moins deux ouvertures du premier substrat,
      collage du premier substrat sur le deuxième substrat de façon à recouvrir les rainures,
      amincissement du deuxième substrat, après le collage, en préservant une épaisseur de substrat supérieure à une profondeur maximale des rainures.
    16. Procédé de mise en oeuvre d'un dispositif d'analyse selon la revendication 1, selon lequel on met en contact le support d'analyse avec le support thermique pendant une phase d'analyse de durée déterminée, au moins un échantillon à analyser et au moins un réactif étant introduits dans le support d'analyse préalablement à la phase d'analyse ou pendant la phase d'analyse, puis, après la phase d'analyse, on retire le support d'analyse du support thermique.
    EP99947579A 1998-10-16 1999-10-14 Dispositif d'analyse chimique et/ou biochimique avec un support d'analyse Expired - Lifetime EP1121199B1 (fr)

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