EP1066388A2 - Prozessive glycosyltransferase - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Protein. Es weist identische oder unterschiedliche katalytisch aktive Domänen von Glycosyltransferasen auf und ist prozessiv aktiv. Insbesondere ist dasselbe Protein in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Prozessschritten sukzessiv aktiv.

Description

Bezeichnung: PROZESSIVE GLYCOSYLTRANSFERASE

Die Erfindung betrifft die Verwendung von prozessiven UDP-Zucker:l,2-Diacylglycerol-3-ß-,

UDP-Zucker: S-ß-l^'-phospho-OT-glyceryl-l'^'-diacyl-^-glycerol)- und UDP-Zucker: 3-[O- ß-D-glucopyranosyl] -s«-glycerol- 1 ,3 '-phospho- 1 ',2'-diacyl-5«-glycerol-D-Zuckertransferasen

und ähnlicher Proteine sowie die zugehörigen kodierenden Nukleinsäuren zur Veränderung

des Gehalts und/oder der Struktur von Glycosyldiacylglycerolen und/oder deren synthetische

Folgeprodukte sowie anderen durch diese Enzyme glycosylierte Substrate in transgenen Zellen

und /oder Organismen.

Es wurden Glycosyl-Diacylglycerole enzymatisch mit Hilfe einer Zuckertransferase

hergestellt. Hierzu wurde das für eine UDP-Zuckertransferase kodierende Gen aus

genomischer DNA von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus isoliert und in E. coli

kloniert und exprimiert. Die Aktivität der Enzyme konnte mit speziellen in vitro

Enzymnachweissystemen nachgewiesen werden. Die Produkte wurden ebenfalls in

Lipidextrakten von transgenen E. coli Zellen nachgewiesen und identifiziert. Es handelt sich

dabei um verschiedene neuartige Glycolipide mit unterschiedlicher Anzahl von Glucoseresten

(maximal vier), die ß(l-»6)glycosidisch miteinander verknüpft sind und Diacylglycerol

(DAG) oder Phosphatidylglycerol (PG) als primären Akzeptor verwenden:

Zusätzlich handelt es sich dabei um zwei verschieden strukturierte neuartige Phosphoglycolipide (PL1 und PL2) mit unterschiedlicher Anzahl von Glucoseresten

(maximal zwei), die in einem Fall (PL2) ebenfalls ß(l— >6)-glycosidisch miteinander

verknüpft sind und Phosphatidylglycerol (und zwar beide Diastereomere, i.e. hinsichtlich der Konfiguration des nichtacylierten Glycerolrestes) als Akzeptor verwenden. Die Glycosylreste können darüber hinaus zusätzlich in Position 6'" der terminalen Glucose acyliert sein:

1) MGlcD:- 3-[O-ß-D-glucopyranosyl]-l,2-diacylglycerol (Staphylococcus aureusypfP)

2) DGlcD: 3-[O-ß-D-glucopyranosyl-(l-»6)-O-ß-D-glucopyranosyl]-l,2-diacylglycerol

3) TGlcD: 3-[O-ß-D-glucopyranosyl-(l→6)-O-ß-D-glucopyranosyl-(l→6)-O-ß-D-

glucopyranosyl] - 1 ,2-diacylglycerol

4) TeGlcD: 3-[O-ß-D-glucopyranosyl-(l-»6)-O-ß-D-glucopyranosyl-(l→6)-O-ß-D-

glucopyranosyl-( 1 →6)-O-ß-D-glucopyranosyl]- 1 ,2-diacylglycerol.

5) Phospholipidl : S-fO-ß-D-glucopyranosylJ-OT-glycerol-l^'-phospho-l'^'-diacyl-Λ'«-

glycerol)

6)Phospholipid2:{3-[O-(6^,"-O-acyl)-ß-D-glucopyranosyl-(l^m→6'^,)-O-ß-D-glucopyranosyl]- 2-

acyl-w-glycerol-l^'-phospho-l'^'-diacyl-^-glycerol} .

Anmerkung: Die Numerierung der Glycerylreste I (Gro¹) und II (Gro¹¹) entspricht hier der Numerierung 1-3 bzw. l'-3' D.h. Gro¹ ist "links" und Gro" ist „rechts" entsprechend der

Abbildung 15.

Überraschenderweise wirken die Enzyme prozessiv, d.h. alle gefundenen neuartigen Glycolipide werden durch die sukzessive Addition von UDP-Glucose auf das jeweils

vorhergehende Produkt der Enzyme gebildet. Außerdem werden Alkyl-ß-D-Glucoside,

Ceramide (beide Enzyme), Sterole und Sterolglucoside (nur S. aureus Enzym) als Akzeptoren

für eine weitere Glucosilierungsreaktion verwendet.

Stand der Technik

Glyceroglycolipide stellen eine Gruppe von Membrankomponenten dar, die strukturell sehr

heterogen ist. Man findet sie in Bakterien ( Kates, 1990), Pflanzen und in sehr geringen

Mengen auch in Tieren. Viele Strukturen gerade bakterieller Glycolipide sind schon seit

langer Zeit beschrieben (Kates, 1990), die sie synthetisierenden Gene sind allerdings in

keinem Fall kloniert worden, so daß diese Substanzen nur in analytischen Mengen aus den

entsprechenden Organismen gewonnen werden können. Erst anfang 1997 erschien eine erste

Publikation, in der die Klonierung und Expression einer pflanzlichen Galactose: 1,2-

Diacylglycerol-Galactosyltransferase beschrieben wird (Shimojina et al., 1997). Bei diesem

Enzym handelt es sich allerdings nicht um eine "prozessive" Glycosyltransferase.

Datenbankrecherchen in der "U.S. Patent Database" ergaben, daß zwei weitere Patente zu

Glycosyltransferasen existieren: Patent-Nr. 5545554: Glycosyltransferases for biosynthesis of

oligosaccharides, and genes encoding them, und Patent-Nr 5641668: Proteins having

glycosyltransferase activity. Bei dem erstgenannten Patent handelt es sich offenbar nur um

Oligosaccharid synthetisierende Glycosyltransferasen, so daß das von uns beschriebene Enzym, eine Lipid Glycosyltransferase, nicht betroffen ist. Das zweitgenannte Patent betrifft

allgemein Glycosyltransferasen, dem gegenüber das in diesem Patent beschriebene prozessive

Enzym neu ist.

Wirtschaftliche Anwendbarkeit

Glycosyldiacylglycerole sind natürlich vorkommende Verbindungen, die in Pflanzen, Tieren

und Bakterien gefunden werden können. Eine preiswerte Herstellung dieser Verbindungen im

großtechnischen Maßstab war bisher allerdings nicht möglich, da entsprechende Gene noch

nicht kloniert waren. Glycosyldiacylglycerole können je nach Zahl der Zuckerreste und

Struktur der Fettsäuren in ganz unterschiedlichen Bereichen Verwendung finden. Bei Veresterung mit den üblichen C18-ungesättigten Fettsäuren haben

Diglucosyldiacylglycerole Emulgatoreneigenschaften, die eine Verwendung in der

Nahrungsmittelindustrie nahelegen (Mayonnaise, Margarine, Eis, Konfekt etc.).

Bei Anwesenheit hochungesättigter Fettsäuren können Glycolipide in Polymere integriert

werden, die dann neue Eigenschaften und Oberflächen erhalten. Schließlich können

Glucosyldiacylglycerole Detergenzcharakter erhalten, wenn die Kettenlänge der Fettsäuren

stark verkürzt wird. Dies wäre bereits jetzt in transgenem Raps mit dominierender Laurinsäure

möglich. Derartige Detergenzien wären in großen Mengen preiswert herstellbar und

biologisch abbaubar.

Die von dem S. aureus Enzym glucosylierten Phospholipide erhalten durch die Ladung des

Phosphatrestes zwischen den beiden Glycerinresten einerseits und durch die Acylierung

der/des Zuckerrestes andererseits neue physikochemische Eigenschaften. Mit den

beschriebenen prozessiven Zuckertransferasen lassen sich damit nicht nur neutrale Lipide, sondern auch geladene Glycolipide gezielt herstellen bzw. variieren. Damit wird eine weitere

Klasse von geladenen Glyco-Phospholipiden durch die Zuckertransferasen erschlossen.

Bei der Herstellung von Pflanzenölen aus Olsaaten fällt eine Lecithinfraktion an, in der Phospho- und Glycolipide angereichert werden. Durch die Überexpression der in diesem Patent beschriebenen Gene in diesen Pflanzen, könnten verschiedenste Glycolipide (Glucosyldiacylglycerole, Sterylglucosid, Glucocerebrosid und andere hier beschriebene Lipide) angereichert werden, was sich positiv auf das Backverhalten von Teigwaren, denen diese Lecithinfraktion zugefügt wird, auswirkt. Die von dem S. aureus Enzym glucosylierten Phospholipide erhalten durch die Ladung des

Phosphatrestes zusätzlich noch andere physikochemischen Eigenschaften.

1. Isolierung und Klonierung vonypfP

Aus B. subtilis wurde das ypfP-Gen isoliert, das in der SubtiList Datenbank als offener

Leserahmen unbekannter Funktion (accession number P54166) beschrieben ist. Als weiteres

Gen wurde eine Sequenz aus Staphylococcus aureus (accession number Y 14370) als offener

Leserahmen unbekannter Funktion beschrieben, isoliert und kloniert.

Für die DNA Isolation, Restriktionsanalyse und Ligation wurden Standardmethoden

verwendet (Sambrook et al., 1989). Die genomische DNA aus Bacillus subtilis 019 wurde

nach Cutting et al., 1990 isoliert. Die genomische DNA von S. aureus wurde uns von Prof.

Dr. Witte, (Robert Koch-Institut, Postfach 650280, 13302 Berlin) zur Verfügung gestellt.

Restriktionsendonukleasen und DNA modifizierende Enzyme wurden von den Firmen New

England Biolabs und Boehringer Mannheim bezogen und nach Angaben des Herstellers

verwendet.

E. coli XL1 Blue (MRF') (Stratagene), E. coli BL21 (DE3) (Novagen) und Bacillus

subtilis 019 wurden bei 37°C in Luria Broth (LB) (Sambrook et al., 1989) angezogen. Für mit Plasmiden transformierte E. colis wurden die Antibiotika Ampicillin (100 μg ml^"1) und

Kanamycin (30 μg ml^"1) dem Medium zugesetzt. Die Vektoren pUC18 (Yanish-Perron et al.,

1985) und pET24c(+) und pET24d(+) (Novagen) wurden als Klonierungsvektoren verwendet.

Die ypfP Gene wurden aus genomischer DNA von B. subtilis und S. aureus mittels PCR

isoliert. Hierzu wurden die spezifischen Primer PJ1 (5' CCGAGCTCC

CATATGAATACCAATAAAAGAG V) und PJ2 (5' TCCGGATCCTJACGATAGC

ACTTTGGC 3') für B. subtilis ypfP und die Primer PJ10

5' TTTCCATGGTTACTCAAAATAAAAAGATATTG 3'und

PJ11 5 TTGGATCCTTATTTAACGAAGAATCTTGCATATAA T für das S. aureus Gen,

deren unterstrichener Teil am 5' und 3' Ende der ypfP Gene hybridisierte, verwendet. Es wurde folgendes Programm für die Amplifizierung benutzt: 10 min bei 94 °C; 30 Zyklen von

0.5 min bei 55°C bzw. 60°C für S. aureus ypfP, 2 min bei 72 °C, 1 min bei 94 °C; ein Zyklus

von 10 min bei 72 °C. Für die Amplifizierung des 1170 bp Produktes aus der genomischen

DNA von B. subtilis wurde die Vo-Polymerase von Boehringer verwendet, für die

Amplifizierung des 1190 bp Produktes aus S. aureus genomischer DNA die Ptw-Polymerase

von Stratagene verwendet. Die amplifizierten Gene wurden im mit Smal linearisierten pUC18

Vector kloniert, die anschließend pypfP3 und psayl genannt wurden. Für die Konstruktion der

Expressionsvektoren pEypfP24 und pEsαv24 wurden die v/? P-Fragmente mittels BamUl und

Ndel bzw. Ncol aus pypfP3 bzw. psayl herausgeschnitten und in den BamRl, Ndel bzw. Ncol

linearisierten pET24c(+) bzw. pET24d(+) ligiert. E. coli XL1 Blue (MRF') wurde mit pypfP3

und psayl und E. coli BL21 (DE3) mit pEypfP24 und pEsay24 transformiert. Die korrekte

Klonierung im Leserahmen wurde durch Sequenzierung überprüft. Die DNA von pypfP3 und psayl wurde einsträngig mit der Didesoxy Methode sequenziert (Automatic Sequencer 373A

und 377, Applied Biosystems). Die Computer Analyse der Sequenzen erfolgte mit Clone

manager for Windows 4.1 (Scientific & Educational Software). Die Datenbank Suchen wurden

mit BLAST (Altschul et al., 1990) durchgeführt. Sequenzhomologien wurden mit ClustalX analysiert (Higgins and Sharp, 1988).

2. Expression der ypfP-Gene

Für die Expression der Gene wurde ypfP im pET24c(+) bzw. pET24d(+) kloniert und

E. coli BL21 (DE3) mit dem entstandenen Konstrukt pEypfP24 und pEsay24 transformiert.

Vorkulturen von E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) pEypfP24 und

E. coli BL21 (DE3) pEsay24 wurden über Nacht bei 37°C angezogen und die Hauptkulturen

mit einer optischen Dichte (O.D.)₅₈₀ von 0,05 gestartet. Die Induktion erfolgte bei einer

O.D.₅₈₀ von 0,8 mit 0,4 mM IPTG. Anschließend wurde weitere 2 h bei 37°C inkubiert. Alle

folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Das Ernten der Zellen erfolgte durch

Zentrifugation (15 min, 5000.x g). Das Zellsediment wurde in Puffer 1 (50 mM Tris-HCl,

pH 8,0; 20 % (v/v) Glycerol) (4 % des Volumens der Expressionskultur) aufgenommen. Die

Zellen wurden eingefroren und nach dem Auftauen beschallt ( 3x 40 s; Braun, Labsonic

2000). Inclusion bodies wurden durch Zentrifugation (15 min, 4000x g) gewonnen und der

Überstand anschließend durch Ultrazentrifugation (1 h, 147000* g) in Membranfraktion und

löslichen Überstand getrennt (für B. subtilis ypfP).

Einschlußkörper ("Inclusion bodies"), Membranfraktion und löslicher Überstand wurden im

SDS-PAGE aufgetrennt. Die SDS-PAGE wurde nach Laemmli, 1970 durchgeführt und die Gele mit Coomassie brilliant blue R250 (Serva) gefärbt. Im SDS-PAGE konnte in der Membranfraktion und der Inclusion body Fraktion eine

Überexpressionsbande der apparenten molekularen Masse von 44 kDa identifiziert werden.

Das Molekulargewicht stimmt mit der für YpfP ermittelten Masse von 43,6 kDa bzw.

44,7 kDa überein. Eine derartige Proteinbande war in der löslichen Fraktion und dem

untransformierten E. coli nicht vorhanden (Fig. 1/13).

3. Lipidextraktion und Analyse

Expressionskulturen von E. coli BL21 (DE3) pEypfP24 bzw. pE.? v24 und Kulturen der

spätlogarithmischen Wuchsphase von Bacillus subtilis 019 wurden durch Zentrifugation

(15 min, 5000 g) geerntet und die sedimentierten Zellen 10 min in Wasser gekocht. Die

Lipidextraktion erfolgte nach Linscheid et al., 1997. Für die Trennung der einzelnen Lipide

mittels präparativer Chromatographie, wurden die Lipide dünnschichtchromatographisch

aufgetrennt. Hierzu wurden folgende Lösungsmittelgemische verwendet: (1)

Chloroform/Methanol/H₂O (70:30:4, v/v/v) für die Trennung von MGlcD, DGlcD , TGlcD

und TeGlcD von Phospholipiden; (2) Diethyl Ether/Petroleum Ether (2:1, v/v) für die

Trennung von acetyliertem DGlcD von nicht-acetyliertem DGlcD; (3) Diethyl

Ether/Petroleum Ether (4:1, v/v) für die Trennung von acetyliertem TGlcD von nicht-

acetyliertem TGlcD; (4) Chloroform/ Aceton (9:1, v/v) für die Trennung von acetyliertem

TeGlcD von nicht-acetyliertem TeGlcD.

Die Trennung der beiden acetylierten Phosphoglucolipide PL1 und PL2 erfolgte im

Laufmittel Chloroform /Methanol (80:20, v/v). Anschießend wurden die beiden acetylierten

Lipide aus dem Kieselgel extrahiert und in Chloroform aufgenommen. Durch Zugabe von Diazomethan wurden die Lipide methyliert und anschließend im Laufmittel Toluol/Methanol (9:1, v/v) aufgetrennt.

Die Acetylierung der Glucolipide erfolgte nach Tulloch et al., 1973. Die Synthese der

Fettsäuremethylester aus DGlcD mit Na-Methylat wurde nach Roughan und Beevers, 1981

durchgeführt. Abspaltung der Fettsäure in sn 1 -Position des DGlcD wurde durch Inkubation

mit Rhizopus Lipase (Boehringer) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die

Inkubation mit Cerebrosidase (von Prof. Dr. Sandhoff, Uni Bonn zur Verfügung gestellt) erfolgte nach Vaccaro et al., 1993.

E. coli BL21 (OE3) pEypfP24 und pE.s y24 Lipidextrakte zeigten verschiedene neuartige

Glycolipide, die im Wildtyp nicht detektiert werden konnten (Fig.2./12). Diese Glycolipide reagierten mit einem Zucker-spezifischen Sprühreagenz, waren allerdings Nihydrin- und

Phosphat-negativ (die nativen PLl und PL2 waren Phosphat-positiv). Eins der neuen

Glycolipide cochromatographierte mit einem Diglucosyl Diacylglycerol (DGlcD) Standard

aus B. cereus . Die verschiedenen Glycolipide wurden gereinigt und acetyliert. Die

Glycolipidbande mit der Polarität des DGlcD cochromatographierte auch nach Acetylierung

mit dem acetylierten DGlcD Standard aus B. cereus.

4. Analyse der neuartigen Glycolipide mittels MS und NMR

Die massenspektrometrische (MS) und kernresonanzspektroskopische (NMR)-Analyse der

neuartigen Glycolipide wurde ausschließlich an deren per-O-azetylierten Derivaten (1, 2, 3, 4)

bzw. an deren Phosphomethylester (PLl, PL2) vorgenommen.

4.1. Massenspektrometrische Analyse (CI-MS undMALDI-MS)

4.1.1. EI-MS und CI-MS (DIP-Mode) Die massenspektrometrische Analyse der neutralen Glycolipide wurde an einem Hewlett Packard Massenspektrometer (Model 5989) mittels direktem Probeneinlaß [direct insert probe

(DIP)] durchgeführt. Die Probe wurde von 80°C bis 325°C mit einer Geschwindigkeit von 30°C/min verdampft.

Während alle per-O-azetylierten Di-(2), Tri- (3), und Tetrahexosyl-(4) diacylglycerolipide durch MS Analyse im DIP-Mode direkt analysiert werden konnten, konnten die beiden Phospholipide PLl und PL2 mit dieser Methodik nicht erfaßt werden. Infolge der hohen Polarität und der Komplexität des Moleküls wurden die Phospholipide daher vor der MS- Analyse mit Fluorwasserstoff (48% HF, 4°C, 20h) de-phosphoryliert, das de-phosphorylierte Fragment per-O-acetyliert und erst danach massenspektrometrisch (DIP-Mode) analysiert. Elektronenstoß (electron impact, EI-MS) Spektren wurden bei 70 eV aufgenommen und die chemische Ionisation (CI-MS) erfolgte mit Ammoniak (0.5 Torr).

In der DIP-MS Analyse zeigten alle per-O-azetylierten Di-(2), Tri- (3), und Tetrahexosyl-(4) diacylglycerolipide im EI-Mode charakteristische Fragmente für terminale Mono-hexosyl (m/z = 331) und Di-hexosyl (m/z = 619) Reste und unterschieden sich durch die Lage des Verdampfungsmaximums (9.5 min, 2 10.6 min, 3; und 12.0 min, 4). Das Disaccharid 2 zeigte im CI-MS ein pseudomolekulares Ion {[M+NH₄]⁺ m/z - 1202}, in dem Hexadecanoyl (16:0) und Hexadecenoyl (16:1) als Fettsäurereste identifiziert werden konnten. Daneben fand sich ein weiteres Ion {[M+NH₄]⁺ m/z = 1230} das als Disaccharid mit 16:0 und 18:1 (oder 18:0 und 16:1) als Fettsäuren identifiziert werden konnte. Die Mengen der beiden unterschiedlich azylierten Diglykosylipide verhielten sich wie 2:3.

Das Trisaccharid 3 zeigte das erwartete pseudomolekulare Ion {[M+NFLt]^"1" m/z = 1490 und 1516} mit ebenderselben Heterogenität im Azylierungsmuster, jedoch in leicht modifizierter Proportion (2:1).

Das Tetrasaccharid 4 zeigte eine Verdampfungskurve mit einem erhöhten Maximum in der

Verdampfungszeit (12.0 min) gegenüber 2 und 3. Pseudomolekulare Ionen im CI-MS konnten

bei dieser Verbindung jedoch nicht erzeugt werden. Das Vorhandensein des Tetrasacchaarids

4 konnte daher unter diesen Bedingungen nur durch charakteristische Fragmente des nicht-

reduzierenden Glycosylteils indirekt abgeleitet (m/z = 331 bzw. 619) werden.

Im DIP-MS (CI-Modus) zeigten sowohl PLl als auch PL2 eine charakteristisch biphasische

Verdampfungskurve, in welcher das erste Maximum (~6 min) aus den de-phosphorylierten

und re-acetylierten Partialstrukturen und das zweite (~ 11.0 min) aus den diagnostischen

Pyrolysefragmenten des intakten, mittels HF-Hydrolyse nicht gespaltenen Phospholipids

zugeordnet werden konnten. Hieraus mußte festgestellt werden, daß die angewandte

Reaktionszeit (6-20h) zur Entfernung des Phosphatrestes mittels wässriger (48%) HF nicht

ausreichend war, da beide Phospholipide nur teilweise in ihre dephosphorylierten

Teilfragmente zerlegt worden waren. Trotz dieser Einschränkung konnte das

Fettsäureverteilungsmuster auf die beiden Glycerinreste Gro¹ und Gro" eindeutig bestimmt

werden.

Für PLl ergab der erste Peak zwei Pseudomolekular-Ionen [M+NFL;]⁺ (m/z= 626 und 654),

die den Molekülionen und folglich dem monoacetylietem Glycerolrest Gro" mit 16:0 und 16:1

(M = 608) bzw 16:0 und 18:1 (oder 18:0 und 16:1)( M = 636 ) zugeordnet werden konnten.

Dieser Peak enthielt somit das aus der HF-Behandlung und Re-acetylierung erwartete

Produkt. Dagegen wurde ein analoges Reaktionsprodukt, abgeleitet von Gro¹ (mit Glc als

Substituent), nicht beobachtet.

Der zweite Peak (~11.0 min) zeigte drei Fragmente, die, im Gegensatz zum ersten Peak, nur Pyrolyseprodukte des PLl, die während der MS-Analyse gebildet wurden, aber keine

intakten Derivate darstellten. Das erste Ion (m/z = 447) wurde einem Fragment zugeordnet,

das von Gro¹ abgeleitet, mit einer peracetylierten Glc und mit einem Acetylrest substituiert ist.

Die anderen beiden Fragmente (m/z= 549 und 577) stammten von Gro". Sie trugen ein

Diacyglycerol, in dem je eine Palmitinsäure (16:0) und eine Palmitoleinsäure (16:1) verestert

waren (m/z= 549), und ein zweites Fragment (m/z = 577) mit je einer Palmitinsäure (16:0) und

einer Oleinsäure (18:l)(bzw. alternativ 16:1 und 18:0). Aus diesem Fragmentierungsmuster

konnte bereits geschlossen werden, daß es sich bei PLl um ein „asymmetrisch acyliertes"

Phospholipid handelt, da Gro" alle beiden Fettsäuren trägt und Gro¹ im nativen Phospholipid

mit einer freien Hydroxylgruppe und einer Glucose relativ hydrophil erscheint.

Das de-phosphorylierte und per-O-acetylierte PL2 zeigte in der DIP-MS Analyse ebenfalls

eine biphasische Verdampfungskurve. Der erste Peak hatte ein identisches

Verdampfungsmaximum (~ 6 min) und Fragmentierungsmuster zu PLl, woraus geschlossen

werden konnte, daß PL2 bezüglich des Fettsäuresubstitutionsmusters in Gro¹ mit PLl identisch ist. Der zweite Peak (11.0 min) zeigte dagegen vier Fragmentionen. Das erste Paar

(m/z = 550 und 577) wurde als Pyrolyse-Fragment abgeleitet von Gro" mit 16:0 und 18:1

(bzw. 16:1 und 18:0) identifiziert und war damit PLl analog. Das zweite Paar (m/z= 1202.9

und 1231.1) konnte als [M+NH₄]⁺-Ion eines intakten Derivates identifiziert werden, das nach

De-phosphorylierung und Re-acetylierung aus PL2 entstanden war. Dieses PL2-Derivat ist

ein Glycerol-Glc-Disaccharid, welches zusätzlich mit zwei Fettsäuren 16:0 und 16:1 (M =

1185) bzw. 16:0 und 18:1 (M=1203) und einem Acetylrest (an der ursprünglichen

Phosphatposition) verestert ist. Obwohl durch diese Analysen das Fettsäuresubstitutionmuster den beiden Glycerolresten Gro¹ und Gro" zugeordnet werden konnte, gelang es erst durch die

NMR-Analyse das exakte Substitutionsmuster der Fettsäuren zu bestimmen (s. unten). Die

DIP-MS Analysen der beiden intakten Phospholipidderivate PLl und PL2 konnten, infolge

der thermischen Instabilität der Moleküle, mit dieser Methode nicht vollständig analysiert

werden und wurden deshalb zusätzlich mittels MALDI-TOF-MS Analyse untersucht.

4.1.2. MALDI-TOF-MS

Die MALDI-TOF-MS Analysen wurden an einem Bruker-Reflex II Spektrometer im

Reflektormodus bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV mit Hilfe der „delayed ion

extraction" im positiven Modus durchgeführt. Die per-O-acetylierten und

phosphomethylierten Proben von PLl und PL2 wurden in Chloroform aufgenommen

(lOμg/mL), und eine 2μL Lösung davon wurde mit 2μL einer Matrixlösung (0.5 M 2,4,6-

Trihydroxyacetophenon; Aldrich, Steinheim) gemischt. Ein Aliquot dieser Mischung (0.5 μL)

wurde auf einen Metallträger aufgebracht, mit warmer Luft getrocknet und unmittelbar danach

in das Spektrometer eingebracht. Die Eichung der Spektren erfolgte mittels internem Standard

(Angiotensin). Alle Massenangaben erfolgen ausschließlich für die monoisotopischen Massen

der Moleküle.

Es wurden jeweils zwei Derivate der beiden Phospholipide mittels MALDI-TOF-MS

analysiert: die freien Phosphorsäurederivate und die Phosphomethylester (PLl und PL2).

Das freie Phosphorsäurederivat von PLl zeigte vor der Veresterung des Phosphatrestes

(Diazomethan) im positiven Reflektor-Modus ein Pseudomolekularion [M-H+Na]⁺ von m/z = 1116,48, was mit der errechneten Summenformel C₅₄H ₅O₂₀P (M=l 094,56) übereinstimmt.

Das nicht veresterte Phosphorsäurederivat von PL2 zeigte unter den gleichen Bedingungen

ein Pseudomolekularion [M-H+Na]⁺ von m/z = 1796,43 das der Summenformel C₉ Hι₆ O₂₈P

(M=l 775,06) entspricht, und folglich im Vergleich zu PLl zusätzlich eine Hexose und eine Fettsäure (16:0 und/oder 18:1) trägt.

Anmerkung: Die hier angegebenen Massen der MALDI-TOF- MS Analysen beziehen sich

immer nur auf das kleinste monoisotopische Pseudomolekülion oder Massenfragment. Es

wurde somit bei allen Massenangaben nur jeweils die kleinste Fettsäure (16:0) berücksichtigt

(s. Abbildung 15). Alle hier angegebenen Pseudomolekularen Ionen zeigten pro Fettsäure

immer eine Heterogenität, die durch den Austausch von 16:0, 16:1, 18:0 und 18:1 entstanden,

sich in allen Massenspektren (DIP und MALDI) niederschlägt, aber in den hier vorliegenden

Massenangaben hier nicht mitberücksichtigt ist].

PLl zeigte nach Behandlung mit Diazomethan ein Pseudomolekularion [M-H+Na]⁺ von m/z

= 1130,69, das der Summenformel C₅₅H ₇O₂oP (M=l 108,57) entspricht und folglich nur eine

zusätzliche Methylgruppe (Drn/z=14) gegenüber der freien Säure enthält. PL2 zeigte unter

den gleichen Bedingungen ein Pseudomolekularion [M-H+Na]⁺ von m/z = 1811,42, das der

Summenformel C ₅Hι₆ O₂₈P (M=l 789,07) entspricht und ebenfalls nur eine zusätzliche

Methylgruppe (Dm/z=14) gegenüber der freien Säure enthält. Dadurch konnten nicht nur die

vorangegangenen MS-Analysen (DIP-MS) bestätigt werden, es konnte darüber hinaus auch

zweifelsfrei gezeigt werden, daß sowohl PLl als auch PL2 Phosphodiester darstellen, die

vermutlich mit zwei Glycerinresten substituiert sind. In beiden Fällen konnte durch

Diazomethan-Behandlung und Überführung in den betreffenden Methylester nur eine Methylgruppe eingeführt werden.

4.2. Protonenresonanz spektroskopische (* H-NMR) Analyse

Die per-O-azetylierten und gereinigten Proben (2_- 4, 30-200 μg) wurden in 100 μL CDC1₃

(99.96 %, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA) gelöst und in spezielle

Mikro-NMR-Kapillarröhrchen (2.5 mm O.D. , Wilmad, Buena, NJ, USA) überfuhrt. Die

Protonenspektren (' H-NMR) wurden an einem 600 MHz Spektrometer (Bruker Avance DRX

600) aufgenommen, das mit einem speziellen Mikroprobenkopf (PH TXI 600SB) ausgerüstet war. Die Proben wurden bei 300K gemessen und die chemische Verschiebung auf internes

Trimethylsilan (TMS, 6_H = 0.000 ppm) bezogen. Ein- und zweidimensionale homonuklear

korrelierte Spektren (Η,Η COSY, ROESY, and relayed COSY) wurden mit der Standard

Bruker Software aufgenommen (XWINNMR, Version 1.3).

Die eindimensionalen (1D) ' H-NMR Spektren (600 MHz, Mikroprobenkopf) des Di- (2, «

200 μg), Tri- (3, « 200 μg) and Tetrahexosyldiacylglycerolipids (4, « 50 μg) der

Verbindungen 2, 3 und 4 sind in der Abbildung 3a-c dargestellt und die Ergebnisse sind in

der Tabelle I (Anhang) dargestellt.

Die Zuordnung der Signale erfolgte mittels 1D- und zweidimensionaler (2D-)

Protonenresonanzspektroskopie (Η-'H COSY, relayed Η,Η COSY, ROESY) im Vergleich

zum strukturverwandten ß-Gentiobioseoctaacetat (1), das zur eindeutigen Zuordnung als

Referenzsubstanz diente und daher ebenfalls in der Tabelle I abgebildet ist. Die ß-anomere Konfiguration aller Hexosen in dieser Substanz ergibt sich aus der Kopplungskonstanten J_lι2, die bei allen Glucosen zwischen 7.6 und 8 Hz liegt. Die weiteren Kopplungskonstanten der

pyranosidischen Ringprotonen H-2, H-3, H-4, und H-5 (J_2;3, J_3;4, and J _;5) waren alle größer

als 9.5 Hz, wodurch eine Glucopyranose bestimmt werden konnte. Die chemische

Verschiebung der Methylenprotonen (H-6a and H-6b) wie auch die Kopplungskonstanten

( _a,_6b) des terminalen Glc Restes (A) sind für alle Oligosaccharide gleich (4.062 + 0.005 ppm

für H-6a und 4.205±0.005 ppm für H-6b) verglichen mit H-6a,6b von A in

ß-Gentiobioseoctaacetat, wodurch die Zuordnung der Spinsysteme aller terminalen Glc Reste

A in den Oligosacchariden 2, 3, und 4 einerseits, aber auch bei PLl und PL2 andererseits

möglich war.

Die glykosidische ß(l— >6) Bindung konnte mit Hilfe der Verschiebung nach höherem Feld der

(überlappenden) Signale von H-6a und H-6b in den Resten B, C, und D (3.855 + 0.05 ppm)

festgestellt werden, da diese sich deutlich von den unsubstituierten Methylensignalen des

terminalen H-6a,6b (A) unterschieden. Diese Tatsache zeigt klar, daß alle Glc-Reste der

Verbindungen 2, 3, und 4 identisch, also ß(l→6)-glykosidisch verknüpft sind. Dieser Befund

konnte mit Hilfe eines zweidimensional korrelierten Spektrums (Η^H-COSY, Abbildung 14

unten) und einem Kern-Overhauser- Spektrum (rotating-frame NOE spectroscopy, ROESY,

Abbildung 4, oben) des Trisaccharides 3 bestätigt werden. Man erkennt im ROESY-Spektrum

die (eingezeichneten) Kreuzsignale der anomeren H-l Protonen H-1^Λ, H-1^B, und H-l , die

zwischen H-l^A/H-6a,6b^B, H-l^B/H-6a,6b^c, und H-l^c/H-3a,3b^Gro, beobachtet werden (Fig. 14)

und eine eindeutige Zuordnung der drei Spinsysteme zu den einzelnen Glucosylresten A,B

und C gestatten. Neben den Protonen der Glycosylreste konnten in allen ' H-NMR Spektren jene der Glycerineinheit (H-la,lb^Gro, H-2^Gro, und H-3a,3b^Gro) identifiziert werden (Fig. 3, Tabelle I). Die Fettsäuren zeigten die erwarteten Methylen- (-CH₂-, 1.185 ppm) und Methylprotonen -

CH₃ (0.812 ppm). Schließlich fanden sich in allen Glycolipiden 2-4, PLl und PL2 Signale

von olefinischen Protonen (-CH=CH-, «5.27 ppm), welche aus den MS Spektren den

ungesättigte Fettsäuren 16:1 und/oder 18:1 zugeordnet werden konnten.

Die NMR Analysen von PLl und PL2 wurden in Analogie zu den nicht-phosphorylierten

Verbindungen 1 - 4 ausschließlich mit den per-O-acetylierten Monomethylester-Derivaten

durchgeführt. Proben (0,1 - 0,2 mg) wurden in 500 μL CDC1₃ (99.96 %, Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, USA) gelöst und in 5 mm NMR Röhrchen (Ultra Precision NMR sample tubes, Isocom, Landshut) bei 300K vermessen. Protonen- und Phosphor-31 Spektren (Η- und ³¹P-NMR) wurden mit einem 600 MHz Spektrometer (Bruker Avance DRX 600) mit einem Inversprobenkopf (5mm TXI 13C) und die Kohlenstoff- 13 (¹³C-NMR) Spektren mit einem 360 MHz Bruker AM Spektrometer (5mm Dualprobenkopf) bei 90,6 MHz

aufgenommen. Die chemische Verschiebung wurde auf internes Tetramethylsilan (TMS, 6_H =

0.000 ppm) bzw. Chloroform (CHC1₃, δ_c = 77,00 ppm) bezogen. Die ³¹P-NMR Spektren

wurden bei 242,9 MHz aufgenommen und auf einen externen Standard (85% H₃PO₄ = 0,0 ppm) kalibriert. Ein- (1D) und zweidimensionale (2D) homonuklear korrelierte Spektren (Η,Η COSY, NOESY, und relayed COSY) und heteronuklear korrelierte Spektren [Η,¹³C- und 1H,³¹P-HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence sowie Η,¹³C-HMBC (hetero multiple bond correlation)] wurden mit der Standard Bruker Software aufgenommen

(XWINNMR, Version 1.3).

Im Η-NMR (Abbildung 14) zeigte PLl in Analogie zu MGlcD: {3-[O-ß-D-glucopyranosyl]- 1,2-diacylglycerol (aus Staphylococcus aureus ypfP)) charakteristische Signale, die einem ß- glycosidisch gebundenen Glc-Rest entsprechen. Überraschenderweise war das anomere Proton H-l in ein Signalpaar (H-l und H-l ') mit vergleichbarer Intensität aufgespalten (H-l, 4,461 ppm, J_i;2 7,9 Hz; H-l ', 4,457 ppm, J,₂ 7,9 Hz). Während die anderen Protonen (H-2, H- 3, H-4, H-5, H-6a,b) identische chemische Verschiebung und Kopplungskonstanten im Vergleich zu MGlcD zeigten, waren jene von H-3a^Gr0 ' und H-3b^Gro ' (3,62 und 3,88 ppm) einerseits und H-la^Gro " und H-lb^Gro " (4,11 und 4,31 ppm) andererseits aufgespalten. Die

Feinauflösung der beiden anderen Methylenprotonensignale der Glycerinreste I und II (H-la,b^Gro ' und H-3a,b^Gro " ; ~ 4,08 - 4,14 ppm) konnte dagegen nicht beobachtet werden. Darüber hinaus fanden wir zwei singuläre Methinprotonen für H-2^{Gro 1} (ddd, 5,082 ppm, 5,3 Hz) und H-2 ^Gro " (ddd, 5,168 ppm, 5,3 Hz), wie es für ein Diglycerid erwartet werden kann. Weitere charakteristische Signale waren die Methylgruppe des Phosphatesters, die ebenfalls ein aufgespaltenes charakteristisches Dublett (POCH₃, 3,828 und 3,810 ppm) mit einer charakteristischen J_H,p Kopplung von 11,2 Hz zeigten. Über das Integral der

Phosphomethylgruppe (3H) konnte ein Phosphatmonomethylester, PLl als Phosphodiester identifiziert und damit die Ergebnisse der MS-Analysen bestätigt werden. Schließlich fanden wir 5 OAc Signale (2,026, 2,018, 1,989, 1,954, 1,934 ppm; alle s), wodurch geschlossen werden konnte, daß neben den vier OAc Gruppen des terminalen Glc Restes noch eine fünfte, wahrscheinlich an einem der beiden Glycerinreste gebunden war. Das genaue

Fettsäureverteilungsmuster konnte durch ein HMBC-Experiment teilweise bestimmt werden.

Über die Konnektivitäten der α-Methylenprotonen der Fettsäuren (-O-COCH₂-) konnte eine Fettsäure der Position sn-l im Glycerinrest II zugeordnet werden. Die Substitution der zweiten Fettsäure dagegen konnte im HMBC-Experiment wegen der geringen Substanzmenge nicht bestimmt weden und war nur anhand der MS-Analysen zu ermitteln.

Im ³¹P-NMR zeigte PLl eine Aufspaltung des Phosphatsignales (0,514 und 0,444 ppm), die

im entkoppelten Spektrum als Singulett erscheinen. Das Η,³¹P-HMQC Experiment hatte

einerseits die erwartete Konnektivität mit der Phosphomethylestergruppe (3,828 und 3,810

ppm) und andererseits mit den beiden Methylenprotonen der Glycerinreste I (H-la,b^{Gro l} und

H-3a,b^Gro ")(~ 4,08 - 4,14 ppm) gezeigt, an die es gebunden ist und wodurch die Phosphatsubstitution bestimmt werden konnte. Mit diesem Experiment konnte folglich die

Verbindung der Glycerinreste I und II über einen Phosphatdiester bewiesen werden, die sich

durch das Vorhandensein eines Phosphomonomethylester sowohl bei der NMR als auch

durch charakteristische Fragmente bei der MS-Analyse bereits andeutete.

Besonders erwähnenswert erscheint uns die Aufspaltung der Signale für H-1^G1°, H-3a,b^{Gro 1}

und H-la,b^{Gro 11} Diese Anomalie im ' H-NMR Spektrum kann mit der Existenz eines

Diastereomerenpaares von PLl erklärt werden. Durch die Einführung einer Methylgruppe

wird das prochirale Phosphat (R-O-PO(OH)-OR') in der Mitte des Moleküls chiral

(R-O-PO(OMe)-OR'), und es entstehen zwei Diastereomere Phospholipide PLl und PLl'

(Abbildung 15). Eine derartige Chiralität des Phosphoratoms wurde bereits bei anderen

Phospholipiden in Η-, ¹³C- und ³¹P-NMR Spektren beobachtet und beschrieben (Bruzik et

al.,1983).

Das Phospholipid 2 (PL2) zeigte im ' H-NMR dieselben charakteristische Aufspaltung der

beiden anomeren Protonen, in diesem Falle beider Glucosereste Glc^A und Glc^B (H-1^Λ und H-

l'^A ; 4,647 und 4,635 ppm, J ₂ 7.7 Hz) und H-1^B und H-1'^B (4,533 und 4,524 ppm, J,,₂ 7.9

Hz), die für die Diastereomerenpaare charakteristisch und analog PLl sind. Damit deutet sich

eine Strukturverwandtschaft beider Phospholipide und folglich ein Zusammenhang bei der Biosynthese dieser Phospholipide an. Das ' H-NMR Spektrum von PL2 zeigte große Ähnlichkeit mit jenem von DGlcD (2), wodurch die Interpretation der NMR-Spektren und damit die Strukturanalyse erleichtert wurde. Durch den Vergleich beider ' H-NMR Spektren konnte so die Substitution des vierten Acylrestes (16:0 oder 18:1) in Position an C-6^A der terminalen Glucose bestimmt werden. (Der dritte Acylrest steht an der C2-Gruppe des Gro¹.) Weitere charakteristische Signale waren der Phosphomethylester, welcher ebenfalls als aufgespaltenenes Dublett die Chiralität des Phosphatrestes und damit die Diastereomerie des Moleküls dokumentierte (3,835 und 3,818 ppm, J_P;H 11,2 Hz). Im ³¹P-NMR erhielt man bei

PL2 ebenfalls eine Aufspaltung des Phosphatsignales (0,414 und 0.275 ppm), was analog von PLl verlief und für das Diastereomerrenpaar PL2 und PL2' charakteristisch ist (Bruzik et al., 1983).

Zusammenfassend ergaben unsere Massen- (DIP und MALDI) und Η-, ¹³C- und ³¹P-NMR Analysen zweifelsfrei die Identifizierung von drei neutralen und zwei ionogenen

Glycolipiden, welche als Di-, Tri-, und Tetrasaccharid-diacylglycerol 2, 3, und 4 mit der folgenden Struktur im Glycosylteil identifizierte werden konnten:

ß-D-Glςp-( 1 →6)-ß-D-Glςp-( 1 →6)-Gro (2),

ß-D-Glςp-(l→6)-ß-D-Glςp-(l→6)-ß-D-Glςp-(l→6)-Gro (3), and

ß-D-Glcp-(l→6)-ß-D-Glc/7-(l→6)-ß-D-Glcp-(l→6)-ß-D-Glςp-(l→6)-Gro (4), sowie das Phospholipid 1 : S-fO-ß-D-glucopyranosylj-^-glycerol-l^'-phospho- ^'-diacyl-OT-glycerol)

(PLl) und das Phospholipid 2 : {3-[O-(6"*-O-acyl)-ß-D-glucopyranosyl-(l^M,->6")-O-ß-D-

glucopyranosyl]-2-acyl-5«-glycerol-l,3'-phospho-r,2'-diacyl-5«-glycerol} (PL2). 5. Enzymassay

Standard Enzymassays zur Messung der YpfP-Aktivität wurden in einem Endvolumen von

100 μl mit Puffer 1, 20 μl E. coli BL21 (DE3) pEypfP24 und pEsay24 Membranfraktion (20-

40 μg Protein) und 250 000 dpm UDP-[¹⁴C]Glucose (Spezifische Aktivität 10,8 GBq/mmol;

3,85 μM Endkonzentration) durchgeführt. Die Reaktion erfolgte 1 h bei 30°C und wurde

durch die Zugabe von Chloroform/Methanol (2:1; 2 ml) gestoppt. Die organische Mischung wurde durch Zugabe von 0,7 ml NaCl-Lösung (0,45 %(w/v)) gewaschen und die entstandene

Unterphase überführt. Ein Teil der Unterphase wurde zur Scintillationszählung eingesetzt und

der verbleibende Teil nach Evaporation der Lösungsmittel mit Argon für die

dünnschichtchromatographische Trennung verwendet.

Detergenzien wie Octyl-ß-D-Glucopyranosid (Sigma), Decyl-ß-D-Glucopyranosid (Sigma),

SDS, Chaps (Sigma), Tween 20, Dodecyl-ß-D-Maltosid (Sigma) und Natriumcholat (Sigma)

wurden in Konzentrationen, die zweimal der kritischen Micellen Konzentration entsprechen,

hinzugefügt (-> gilt nur für B. subtilis ypfP)

Ceramid wurde als Fluoreszierendes D-erythro-C6-NBD-Ceramid (Matreya, INC.),

Cholesterol als [4-¹⁴C]Cholesterol und Sterylglucosid als ¹⁴C-markiertes Sterylglycosid

zugesetzt (Abb.10/11). Die radioaktiven Produkte wurden durch Radiodetektion (BAS- 1000

Bio Imaging Analyzer, Fuji) auf den Dünnschichtchromatographieplatten nachgewiesen.

Die höchste Inkorporation von Radioaktivität wurde in Assays mit UDP-[¹⁴C]Glucose und

Membranfraktionen im Vergleich zu löslichen und Inclusion body Fraktionen von

E. coli BL21 (DE3) pEypfP24 und pEsay24 erzielt. Deshalb wurden alle folgenden in vitro Standard-Assays mit Membranfraktionen und UDP-[¹⁴C]Glucose durchgeführt. Die [^I4C] markierten lipophilen Produkte zeigten 70-80 % der Aktivität, die in den Assay eingesetzt wurde. Zur Identifizierung wurden die radioaktiven lipophilen Produkte mittels DC getrennt, wobei Monogalactosyl Diacylglycerol (MGD), DGlcD und TGlcD als nicht-radioaktive Standards eingesetzt wurden. Der größte Teil der Radioaktivität wurde im DGlcD gefunden,

wogegen MGlcD und TGlcD (→TGlcD nur bei B. subtilis) nur in geringen Mengen auftraten

(Fig.5.). Assays mit Membranfraktionen des untransformierten E. coli zeigten keinen Einbau von Radioaktivität in lipophile Produkte. Um die DAG Konzentration im Enzvmassay zu erhöhen, wurden die Effekte verschiedener Detergenzien auf die Aktivität des Enzyms

getested. Mit der Ausnahme von Lyso-PC (Sigma) und Alkyl-ß-D-Glucopyranosiden, führte

die Zugabe aller o.g. Detergenzien zur vollständigen Inhibierung der Enzymaktivität. [¹⁴C]MGlcD und [¹⁴C]DGlcD aus den Assays mit dem transformierten E. coli wurden isoliert und zur Identifikation ihrer Struktur verschiedenen chemischen und enzymatischen Behandlungen unterworfen.

Der DAG Anteil im [¹⁴C]DGlcD wurde durch die Behandlung mit Rhizopus Lipase nachgewiesen. Diese Lipase setzt spezifisch die Fettsäure in sn 1 -Position des DAG

beinhaltenden Lipids frei. Erwartungsgemäß cochromatographierte das entstandene radioaktive Produkt mit Lyso-DGlcD, welches durch die gleiche Behandlung aus nicht radioaktivem DGlcD hervorgegangen war. Die Inkubation von [¹⁴C]DGlcD mit Na-Methylat

führte zur Freisetzung freier Fettsäuremethylester und [¹⁴C]Glucosylglycerol, die gleichen Produkte wurden bei einem nicht radioaktiven DGlcD bekannter Struktur erzeugt. Die Charakterisierung der Bindung zwischen der ersten Glucose und dem DAG erfolgte durch Inkubation des markierten MGlcD mit Cerebrosidase. Dieses Enzym ist spezifisch für die ß-

glucosidische Bindung, aber unspezifisch für den hydrophoben Teil des Substrats (Vanderjagt

et al., 1994). Die Inkubation von [^l4C]Glucose markiertem MGlcD mit Cerebrosidase führte

zur Freisetzung markierter Glucose und unmarkiertem DAG. Der Erfolg der Hydrolyse wurde

durch Scintilationsmessung der wässrigen und organischen Phase, nach Phasentrennung,

kontrolliert. 90 % der Markierung wurden in der wässrigen Phase gefunden, verglichen mit 15 % in einem Kontrollexperiment, in dem 85 % der Radioaktivität als [¹⁴C]MGlcD in der

organischen Phase verblieben. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme einer ß-

glucosidischen Bindung zwischen der ersten Glucose und dem DAG im MGlcD.

6. Charakterisierung der Glycosyltransferase Aktivität

Die Bildung von drei verschiedenen radioaktiven Produkten in dem in vitro Enzvmassay wirft

die Frage auf, ob alle diese Produkte durch ein einzelnes Enzym produziert werden, das von

den yp/P-Gsnen kodiert wird. Um dieser Frage nachzugehen wurden drei der möglichen Zuckerakzeptoren in markierter Form einzeln mit unmarkierter UDP-Glucose in Anwesenheit

der Membranfraktion inkubiert. Die Zuckerakzeptoren wurden aus vorhergehenden Assays

isoliert. Assays mit radioaktivem [¹⁴C]DAG , [¹⁴C]MGlcD und [^I4C]DGlcD wurden vor

Hinzufügen der Membranfraktion, Puffer 1 und der UDP-Glucose (3,6 mM

Endkonzentration) durch Beschallen des radioaktiven Substrates in 0,5 mM Lyso- Phosphatidylcholin (bei [¹⁴C]DAG) oder Ethanol durchgeführt. Die maximale

Ethanolkonzentration im Assay betrug 5 %(v/v). Nach Umsetzung der Substrate wurden die

lipophilen Produkte mittels DC getrennt und durch Radiodetektion nachgewiesen (Fig.6. und

9). [¹⁴C]DAG wurde zu [¹⁴C]DGlcD und [¹⁴C]TGlcD, [¹⁴C]MGlcD zu [¹⁴C]DGlcD und [¹ C]TGlcD und [¹⁴C]DGlcD zu [¹⁴C]TGlcD umgesetzt. Die Umsetzung des radioaktiv

markierten DGlcD zu TGlcD erfolgte mit dem S. aureus Enzym nicht mehr.

Kontrollexperimente, mit den gleichen Substraten und untransformierten E. coli

Membranfraktionen führten zu keinem der genannten Produkte. Die Ergebnisse sprechen für

eine Prozessivität des Enzyms, wobei die Startreaktion als UDP-Glucose: 1 ,2-Diacylglycerol-

3-ß-D-Glucosyltransferase Reaktion beschrieben werden kann. In den folgenden

Reaktionsschritten hingegen variieren die Glusoseakzeptoren und repräsentieren die Produkte

vorhergehender Additionen von ß-Glucosyl Resten.

Um einen Reaktionsmechanismus basierend auf dem Transfer von Glycosyl Resten von

Glycosiden auf verschiedene Akzeptoren, wie er bei Glycosidasen stattfindet, auszuschließen,

wurde der Enzymassay in Gegenwart von radioaktiv markiertem MGlcD, aber in Abwesenheit von UDP-Glucose durchgeführt. Es konnte kein Umsatz des radioaktiv markierten MGlcD

beobachtet werden. Die Inkubation von YpfP mit dem Glucosidase Inhibitor

Deoxynoijrimycin (Alexis Deutschland GmbH) und Substanz 3 (von Dr. Y. Ichikawa zur

Verfügung gestellt) wurde nach Ichikawa und Igarashi, 1995 durchgeführt. Diese

Verbindungen verhindern den Transfer von Glucose in Reaktionen, die von

Glucosylhydrolasen durchgeführt werden, aber nicht den Transfer bei Zuckernukleotid-

abhängigen Glucosyltransferasen. Keiner der Inhibitoren war in der Lage die Enzymraktion zu

hemmen. Beide Ansätze sprechen für einen Transfer der Glucose durch eine Zuckernukleotid-

abhängige Reaktion. Andererseits waren Ricinolsäure und Ölsäure, je nach Konzentration im

Ansatz, in der Lage das Enzym zu hemmen. Zugaben zwischen 25 und 50 μg in 100 μl

Assayvolumen führten zur Hemmung der Bildung von DGlcD und TGlcD, dem zweiten und dritten Schritt der Enzymreaktion. In diesen Experimenten akkumulierte MGlcD im

Reaktionansatz, das in normalen Assays in nur geringen Mengen auftrat. Konzentrationen

über 50 μg im Assayansatz führten zur vollständigen Inhibierung des Enzyms. Hydrolyse

Experimente mit Na-Methylat schließen die Möglichkeit einer Glucosilierung von Ricinolsäure (=12-D-hydroxy-Ölsäure) aus.

7. Substratspezißtät

Die Substratspezißtät wurde für den Zuckerdonor und Zuckerakzeptor charakterisiert. Neben

UDP-[¹⁴C]Glucose wurde auch UDP-[¹⁴C]Galactose getestet, allerdings wurde Galactose

nicht in lipophile Produkte eingebaut. Experimente bezüglich des Zuckerakzeptors zeigten,

daß neben DAG, MGlcD und DGlcD auch Alkyl-ß-D-Glucopyranoside als Akzeptor (gilt nur

für das B. subtilis Enzym) dienen können. Hierbei entstanden Produkte, die wahrscheinlich als

Alkyldiglucoside identifiziert werden konnten. Der einzige Hinweis bisher sind allerdings die

Rf-Werte der entstandenen Produkte und ihre Stabilität gegenüber alkalischer Hydrolyse.

Weder Alkyl-α-D-Glucopyranoside noch Alkyl-ß-D-Galactopyranoside konnten als

Akzeptoren dienen. Das S. aureus Enzym konnte sowohl Sterol, als auch Sterylglucosid

umsetzen. Diese Daten zeigen, daß die YpfP-Enzyme weniger spezifisch bezüglich des

Zuckerakzeptors sind aber eine höhere Spezifität für den Zuckerdonor UDP-Glucose

aufweisen.

Abkürzungen

AS Aminosäure

DAG Diacylglycerol DGlcD Diglucosyl Diacylglycerol

DHexD Dihexosyldiacylglycerol

DNA Desoxyribonukleinsäure

Glc Glucose

MGD Monogalactosyl Diacylglycerol

MGlcD Monoglucosyl Diacylglycerol

MHexD Monohexosyldiacylglycerol

PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese

PG Phosphatidylglycerol

SDS Natriumdodecylsulfat

TeGlcD Tetraglucosyl Diacylglycerol

TGlcD Triglucosyl Diacylglycerol

THexD Trihexosyldiacylglycerol

TeHexD Tetrahexosyldiacylglycerol

PLl Phospholipid 1

PL2 Phospholipid 2

Nukleotidsequenz

B. subtilis ypfP ttgaatacca ataaaagagt attaattttg actgcaaatt acggaaatgg acatgtgcag gtagccaaaa cactttatga

acaatgtgta cggctcggct ttcagcatgt aacagtttct aatttgtacc aagagtcaaa tccgattgtt tcagaggtaa

ctcaatacct ttatttaaaa agcttctcaa tcgggaaaca gttttatcgt ttgttttatt acggagttga caaaatctat aataaacgta

aattcaatat ttactttaaa atgggtaata aaagattggg cgaacttgtc gatgaacatc agcccgatat tattattaat acatttccga tgatcgtcgt gccggaatac agacgccgaa ctggaagagt cattcctacc ttcaacgtta tgactgattt ttgtcttcat aaaatttggg ttcacgaaaa cgtggataaa tattatgtgg cgacagatta cgtgaaggaa aaactgctgg agatcggcac

tcatccaagc aatgtaaaaa tcacaggaat tccaatcagg ccgcaatttg aagaatccat gcctgttggc ccgatatata aaaagtacaa tctttcacca aacaaaaaag tgcttctgat catggcaggt gctcacggtg tattaaagaa cgtaaaagag

ctgtgcgaaa accttgtcaa ggatgaccaa gtgcaagtag ttgtcgtgtg cgggaaaaat acggctttaa aagaatcttt

gagtgcgctt gaagcggaaa atggtgacaa attaaaagtt ctgggctatg tggagcgcat tgatgagcta tttcggatca

cagattgcat gattaccaag cccggcggca ttactttgac agaagccaca gccattggag tgcctgtcat tctgtacaaa

cccgtgcctg gccaggaaaa agaaaatgca aacttctttg aagaccgcgg agctgccatc gttgtgaacc gtcatgaaga

gattctcgag tcagtcactt cccttcttgc agatgaagat accttgcatc gcatgaagaa aaacattaag gaccttcatt

tagcaaactc ctctgaagtg attttagagg atatcctgaa ggaatcagaa atgatgaccg ccaaacaaaa agccaaagtg

ctatcgtaa

S. aureus ypfP

Atggttactca aaataaaaag atattgatta ttactggctc attcggtaac ggtcatatgcaagttacaca gagtatcgtt aatcaactta atgatatgaa tctagaccat ttaagcgtcattgagcacga tttatttatg gaagctcatc caattttgac ttctatttgt aaaaaatggt atatcaatag ctttaaatat tttagaaata tgtacaaagg gttttattac agccgcccagataaactaga caaatgtttt tacaaatact atggacttaa taagttaatt aatttattgataaaagaaaa gccagattta atattattaa cgtttcctac accagttatg tcggtactaa ctgagcaatt taacattaat attccagttg ctacagtgat gacagactat cgcttacata aaaactggat tacgccgtat tcaacaagat attatgtggc aacaaaagaa acgaaacaag acttcataga cgtaggtatt gatccttcaa cagttaaagt gacaggtatt cctattgata acaaatttga aacgcctatt aatcaaaagc agtggttaat agacaacaac ttagatccag ataagcaaac tattttaatg tcagctggtg catttggtgt atctaaaggt tttgacacga tgattactga tatattagcg aaaagtgcaa atgcacaagt agttatgatt tgtggtaaga gcaaagagct aaagcgttct ttaacagcta agtttaaatt aacgagaatg tatttgattc taggttatac caaacacatg aatgaatgga tggcatcaag tcaacttatg attacgaaac ctggtggtat cacaataact gaaggtttcg cccgttgtat tccaatgatt ttcctaaatc ctgcacctgg tcaagagctt gaaaatgcct tttactttga agaaaaaggt tttggtaaaa cgctgatac tccag

Aminosäuresequenz

B. subtilis YpfP

MNTNKRVLIL TANYGNGHVQ VAKTLYEQCV RLGFQHVTVS NLYQESNPIV

SEVTQYLYLK SFSIGKQFYR LFYYGVDKIY NKRKFNIYFK MGNKRLGELV

DEHQPDIIIN TFPMIVVPEY RRRTGRVIPT FNVMTDFCLH KIWVHENVDK

YYVATDYVK EKLLEIGTHPS NVKITGIPIR PQFEESMPVG PIYKKYNLSP

NKKVLLIMAG AHGVLKNVKE LCENLVKDDQ VQVVVVCGKN TALKESLSAL

EAENGDKLKV LGYVERIDEL FRITDCMITK PGGITLTEAT AIGVPVILYK

PVPGQEKENA NFFEDRGAAI VVNRHEEILE SVTSLLADED TLHRMKKNIK

DLHLANSSEV ILEDILKESE MMTAKQKAKV LS

S. aureus YpfP

MVTQNKKILI ITGSFGNGHM QVTQSIVNQL NDMNLDHLSV IEHDLFMEAH PILTSICKKW YINSFKYFRN MYKGFYYSRP DKLDKCFYKY YGLNKLINLL IKEKPDLILL TFPTPVMSVL TEQFNINIPV ATVMTDYRLH KNWITPYSTR YYVATKETKQ DFIDVGIDPS TVKVTGIPID NKFETPINQK QWLIDNNLDP DKQTILMSAG AFGVSKGFDT MITDILAKSA NAQVVMICGK SKELKRSLTA KFKLTRMYLI LGYTKHMNEW MASSQLMITK PGGITITEGF ARCIPMIFLN PAPGQELENA FYFEEKGFGK IADTPEEAIK IVASLTNGNE QLTNMISTME QDKIKYATQT ICRDLLDLIG HSSQPQEIYG KVPLYARFFV K

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Claims

Patentansprüche

1. Ein Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es identische oder unterschiedliche katalytisch aktive Domänen von Glycosyltransferasen aufweist und prozessiv aktiv ist, insbesondere dasselbe Protein in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Prozeßschritten sukzessiv aktiv ist.

2. Ein Protein entsprechend Anspruch 1, das als Glycosyltransferase die sukzessive Übertragung eines oder mehrerer Hexosereste auf ein Akzeptormolekül katalysiert, insbesondere mindestens eine der folgenden Reaktionen katalysiert: a) Addition von Hexose. ß auf ein Diacylglycerol

b) Addition von Hexose ß(l→6) auf ein MHexD

c) Addition von Hexose ß(l->6) auf ein DHexD

d) Addition von Hexose ß(l->6) auf ein THexD

e) Addition von Hexose ß(l-»6) auf ein TeHexD

f) Addition von Hexose ß auf ein Ceramid

g) Addition von Hexose ß (l- 6) auf ein Monohexosylceramid

h) Addition von Hexose ß auf ein Sterol

i) Addition von Hexose ß(l→6) auf ein Sterylglucosid

j) Addition von Hexose in ß-glycosidischer Bindung auf die primäre

Hydroxylgruppe von Phosphatidylglycerol

k) Addition von Hexose ß(l- 6) auf die erste Hexose von Phosphatidylglycerol-ß- D-glucosid.

3. Ein Protein entsprechend Anspruch 1 oder 2, das als Glycosyltransferase die sukzessive Übertragung eines oder mehrerer Hexosereste auf mindestens ein Akzeptormolekül zur Synthese von Glycolipiden, insbesondere Phosphoglycolipiden, katalysiert, insbesondere mindestens eine der folgenden Reaktionen katalysiert:

a) Addition von Gieß auf ein Diacylglycerol

b) Addition von Glc ß(l→6) auf ein MGlcD

c) Addition von Glc ß(l→6) auf ein DGlcD

d) Addition von Glc ß(l→6) auf ein TGlcD

e) Addition von Glc ß(l-»6) auf ein TeGlcD

f) Addition von Glc ß auf ein Ceramid

g) Addition von Glc ß(l-»6) auf ein Monoglucosylceramid

h) Addition von Glc ß auf ein Sterol

i) Addition von Glc ß(l- 6) auf ein Sterylglucosid

j) Addition von Glc in ß-(l- 6)-glycosidischer Bindung auf die primäre

Hydroxylgruppe von Phosphatidylglycerol

k) Addition von von Glc ß(l— 6) auf die erste Glc von Phosphatidylglycerol-ß-D-

glucosid.

4. Ein Protein entsprechend Anspruch 1, 2 oder 3 das ein Hybridprotein darstellt.

5. Ein Protein entsprechend Anspruch 4, das einen passenden Linker, der aus genetisch kodierten Aminosäuren besteht, enthält.

6. Ein DNA Molekül, das für ein Protein entsprechend einem der Ansprüche 1-5 kodiert.

7. Ein Hybridvektor, der ein DNA-Molekül entsprechend Anspruch 6 enthält.

8. Ein Expressionsvektor, der entsprechend Anspruch 7 ein DNA-Molekül zur in vivo oder in vitro Expression in Hefen, Bakterien (außer Bacillus subtilis), dikotyle oder monokotyle Pflanzen enthält.

9. Eine transgene Zelle oder Organismus, die/der einen Hybridvektor und/oder einen Expressionsvektor entsprechend Anspruch 7 oder 8 oder eine DNA- Sequenz entsprechend Anspruch 6 enthält. lO.Eine identische oder ähnliche Sequenz, kodierend für ein Protein, entsprechend

Anspruch 1, aus Bacillus subtilis und/oder Staphylococcus aureus und/oder einer verwandten Sequenz, die mindestens eine der folgenden Eigenschaften erfüllt: a) 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 % Identität zum deduzierten Protein aus ypfP (Clustal X) b) 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 % identische und ähnliche AS (Clustal X) zum deduzierten Protein aus ypfP c) bei folgender AS-Sequenz: EHQPDIII, mehr als 5 AS identisch sind

d) bei folgender AS-Sequenz: QVVVVCGKN, mehr als 6 AS identisch sind e) bei folgender AS-Sequenz: DCMITKPG, mehr als 6 AS identisch sind. f) die die AS-Sequenz MITKPGGITxTE enthalten (wobei x für eine beliebige AS

steht) g) die die AS-Sequenz VKxTGIPI enthalten (wobei x für eine beliebige AS steht) h) bei folgender AS-Sequenz : ZPDIIIxxxP mehr als 5 AS Identisch sind (wobei Z für die AS Q oder K und x für eine beliebige AS steht)

11. Die Nutzung eines Proteins entsprechend Anspruch 1 zur prozessiven Glycosylierung, insbesondere zur biosynthetischen Herstellung von Lipiden mit folgender Struktur: a) ß-D-Glcp-( 1 →6)-ß-D-Glcp-( 1 →6)-ß-D-Glcp-( 1 →6)-ß-D-Glcp-( 1 →6)-Gro,

b) 3-[O-ß-D-Glucopyranosyl]- phosphatidylglycerol (PLl), oder

c) {3-[O-(6"^,-O-Acyl)-ß-D-glucopyranosyl-(l'"->6^,,)-O-ß-D-glucopyranosyl]-2- acyl-phosphatidylglycerol} (PL2).

12. Folgeprodukte, die biosynthetisch in gentechnisch veränderten Mikroorganismen und/oder Pflanzen unter Verwendung des Proteins gemass Anspruch 1 durch weitere Umsetzung der durch die Wirkung der heterologen prozessiven Zuckertransferasen entstandenen Produkte entstehen, insbesondere durch die Addition einer Fettsäure auf die Position 6'" der terminalen Hexose in {3-[O-ß-D-

glucopyranosyl-(r"-»6")-O-ß-D-glucopyranosyl]-2-acyl-phosphatidylglycerol}.

13. Tetrasaccharid-diacylglycerid, insbesondere als Ergebnis der prozessiven Glycosylierung mit einem Protein nach einem der Ansprüche 1-6 oder 12.