EP1037973A2 - Method for isolating short and long-chain nucleic acids - Google Patents

Method for isolating short and long-chain nucleic acids

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Publication number
EP1037973A2
EP1037973A2 EP98966787A EP98966787A EP1037973A2 EP 1037973 A2 EP1037973 A2 EP 1037973A2 EP 98966787 A EP98966787 A EP 98966787A EP 98966787 A EP98966787 A EP 98966787A EP 1037973 A2 EP1037973 A2 EP 1037973A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acids
carrier
membranes
materials
carrier material
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98966787A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Peter Bendzko
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Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Original Assignee
Invitek GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1037973A2 publication Critical patent/EP1037973A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the invention relates to a simple and extremely fast method for isolating and purifying large amounts of short- and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials. It is of great importance for a large number of laboratories working biologically, molecular biologically, forensically, medically, analytically and biochemically.
  • the fields of application of the invention are forensic medicine, medical diagnostics, molecular biology, biochemistry, genetic engineering and all other related fields.
  • kits are based on the well-known principle of binding nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and use suspensions of finely ground glass powder (e.g. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Sigma) as carrier materials. or also silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
  • a method for isolating nucleic acids that is practical for a large number of different applications is shown in US Pat. No. 5,234,809 (Boom).
  • a method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase is described there.
  • the chaotropic buffers implement both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase.
  • the method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and is particularly useful in the area of isolating viral nucleic acids.
  • the object of the invention was to develop a method for isolating nucleic acids, in particular plasmid DNA, preferably from a wide variety of starting quantities, which leads to isolated nucleic acids which meet the high quality parameters of subsequent applications, extremely simple to carry out, quickly and is inexpensive.
  • the object was achieved according to the claims, according to the invention by a combined batch column process, in which the nucleic acid binding to mineral support materials is carried out as a batch process and the bound nucleic acids are then processed chromatographically.
  • the method according to the invention for the isolation and purification of short- and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials is characterized by
  • the method according to the invention is also suitable for the isolation and purification of short- and long-chain nucleic acids from other starting materials, e.g. from bacterial lysates, vegetable components, DNA fragments from PCR batches or from agarose gels.
  • Preferred carrier materials are silicon compounds, e.g. Silicon dioxide, silicas or silica gels.
  • the silicon compounds used according to the invention have an average particle size of 7 nm to 5000 ⁇ m, preferably 7-40 nm or 500-5000 nm.
  • Chaotropic salts are e.g. Guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, lithium chloride, sodium perchlorate, sodium iodide and / or urea, preferably in concentrations of 1 to 10 M.
  • Detergents such as e.g. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS and / or CTAB, optionally protein-degrading enzymes, such as e.g. Proteinases used.
  • membranes which have a pore size which is larger than that of the carrier materials used, preferably in centrifugation cartridges, the pore size of the membranes being specified as a function of the average particle size of the carrier material used.
  • nylon or polysulfone membranes are preferably used.
  • the carriers with the fixed nucleic acids are washed before or after their application to the membrane. The subsequent elution of the nucleic acid from the carrier is carried out professionally with buffers of low ionic strength.
  • centrifugation membranes which can effectively be used for nucleic acid purifications must have a pore size which is smaller than that of the carrier matrices used, since mineral particles which have particle diameters smaller than the pores of the centrifugation membranes always centrifuge through the pores during a centrifugation step become.
  • the invention is based on the surprising finding that a combined batch column method for isolating nucleic acids using mineral carrier particles, which can even be very much smaller than the pore diameter of commercially available centrifugation columns, is possible.
  • the process according to the invention of combining a batch process with a column process is not limited by the use of any mineral carrier materials, even very small mineral carrier particles and their extremely large specific surfaces, with regard to the volumes of the starting materials.
  • the method provides very high yields of high-purity DNA and is also very easy to carry out and can be compared to widely used anion exchange systems e.g. in the isolation of plasmid DNA can be realized in a much shorter time.
  • Chromosomal DNA and proteins are subsequently sedimented by a 5 minute centrifugation step at 14,000 rpm and the clear centrifuged supernatant is subsequently incubated with 20 ⁇ l of a suspension made of a mineral carrier material consisting of silica nanoparticles (average particle size 40 nm).
  • the solution is then transferred to a mini centrifugation column (e.g. Micro Spin Nylon or Micro Spin PSE; LIDA).
  • the carrier particles with the bound plasmid DNA are brought to the surface of the filter membrane by centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm and washed there by adding a washing solution (60% ethanol; NaCl) and a further centrifugation step. The washing step is repeated one more time.
  • the remaining ethanol is finally removed from the carrier material by centrifugation at 12,000 rpm for 2 min.
  • the bound plasmid DNA is detached by adding 100 ⁇ l of a low salt buffer (e.g. 10 mm Tris-HCl) at 70 ° C and subsequent centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm.
  • the centrifugate contains the isolated plasmid DNA.
  • Chromosomal DNA and proteins are subsequently sedimented by a 10 minute centrifuge step at 5000 rpm and the clear centrifuged supernatant is subsequently treated with 150 ⁇ l of a suspension made of a mineral carrier material consisting of silica nanoparticles (average particle size 40 nm) incubated.
  • the solution is then transferred to a centrifugation column (eg Macro Spin Nylon; LIDA).
  • the carrier particles with the bound plasmid DNA are brought to the surface of the filter membrane by centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm and there by adding a washing solution (60%) ethanol; NaCl) and another centrifugation step. The washing step is repeated one more time.
  • the remaining ethanol is finally removed from the carrier material by centrifugation at 5000 rpm for 10 min or by incubation of the centrifugation column at 37 ° C. for 10 min.
  • the bound plasmid DNA is detached by adding 200 ⁇ l - 300 ⁇ l of a low salt buffer (eg 10 mm Tris-HCl) at 70 ° C. and subsequent centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm.
  • the centrifugate contains the isolated plasmid DNA.

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Abstract

The inventive method concerns the isolation and purification of short and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials and is characterized by the following steps: lysis of materials containing nucleic acids; incubation with a mineral supporting material; application on membranes having a pore size which is larger than the particle size of the supporting material; removal of the nucleic acids from the supporting material by elution, whereby the supporting material particles surprisingly remain on the membrane.

Description

Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen NukleinsäurenProcess for the isolation of short and long chain nucleic acids
Die Erfindung betrifft ein einfaches und extrem schnelles Verfahren zur Isolierung und Reinigung großer Mengen von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, forensisch-, medizinisch- analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die forensische Medizin, medizinische Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete.The invention relates to a simple and extremely fast method for isolating and purifying large amounts of short- and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials. It is of great importance for a large number of laboratories working biologically, molecular biologically, forensically, medically, analytically and biochemically. The fields of application of the invention are forensic medicine, medical diagnostics, molecular biology, biochemistry, genetic engineering and all other related fields.
Alle kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z.B. Glasmilk , BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 AI).All commercially available kits are based on the well-known principle of binding nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts and use suspensions of finely ground glass powder (e.g. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Sigma) as carrier materials. or also silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 AI).
Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials wie auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet , um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu Isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.A method for isolating nucleic acids that is practical for a large number of different applications is shown in US Pat. No. 5,234,809 (Boom). A method for isolating nucleic acids from nucleic acid-containing starting materials by incubating the starting material with a chaotropic buffer and a DNA-binding solid phase is described there. The chaotropic buffers implement both the lysis of the starting material and the binding of the nucleic acids to the solid phase. The method is well suited for isolating nucleic acids from small sample quantities and is particularly useful in the area of isolating viral nucleic acids.
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren zu entwickeln, insbesondere von Plasmid-DNS, vorzugsweise aus unterschiedlichsten Ausgangsmengen, welches zu isolierten Nukleinsäuren führt, die den hohen Qualitätsparametern nachfolgender Applikationen gerecht werden, extrem einfach in der Durchführung, schnell und kostengünstig ist.The object of the invention was to develop a method for isolating nucleic acids, in particular plasmid DNA, preferably from a wide variety of starting quantities, which leads to isolated nucleic acids which meet the high quality parameters of subsequent applications, extremely simple to carry out, quickly and is inexpensive.
Die Aufgabe wurde gemäß den Ansprüchen realisiert, erfindungsgemäß durch ein kombiniertes Batch-Säulenverfahren, indem die Nukleinsäurebindung an mineralische Trägermaterialien als Batch- Verfahren erfolgt und man die gebundenenen Nukleinsäuren danach chromatographisch aufbereitet. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien ist gekennzeichnet durchThe object was achieved according to the claims, according to the invention by a combined batch column process, in which the nucleic acid binding to mineral support materials is carried out as a batch process and the bound nucleic acids are then processed chromatographically. The method according to the invention for the isolation and purification of short- and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials is characterized by
- Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,Lysis of materials containing nucleic acids,
- Inkubation mit einem mineralischen Trägeπnaterial,Incubation with a mineral carrier material,
- Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,Application to membranes which have a pore size which is larger than the particle size of the carrier materials,
- Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel überraschend auf der Membran zurückbleiben.- Separation of the nucleic acids from the carrier material by elution, the carrier particles surprisingly remaining on the membrane.
Als bevorzugte Ausgangsmaterialien, die Nukleinsäuren enthalten, kommen komplexe biologische Systeme, wie z.B. Blut, Gewebe, Urin oder Stuhlproben, die gegebenenfalls an festen Materialien gebunden sind, in Frage. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch für die Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus anderen Ausgangsmaterialien geeignet, wie z.B. aus bakteriellen Lysaten, pflanzlichen Komponenten, von DNS-Fragmenten aus PCR-Ansätzen oder aus Agarosegelen.Complex biological systems, such as e.g. Blood, tissue, urine, or stool samples that may be bound to solid materials. However, the method according to the invention is also suitable for the isolation and purification of short- and long-chain nucleic acids from other starting materials, e.g. from bacterial lysates, vegetable components, DNA fragments from PCR batches or from agarose gels.
Bevorzugte Trägermaterialien sind Siliziumverbindungen, wie z.B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren oder Silicagele. Die erfindungsgemäß eingesetzten Siliciumverbindungen weisen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 um, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, auf.Preferred carrier materials are silicon compounds, e.g. Silicon dioxide, silicas or silica gels. The silicon compounds used according to the invention have an average particle size of 7 nm to 5000 μm, preferably 7-40 nm or 500-5000 nm.
Die Lyse der Ausgangsstoffe und die anschließende Inkubation mit den Trägermaterialien erfolgt in einem Puffersystem, das chaotrope Salze aufweist. Chaotrope Salze sind z.B. Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff, vorzugsweise in Konzentrationen 1 bis 10 M.The lysis of the starting materials and the subsequent incubation with the carrier materials takes place in a buffer system which has chaotropic salts. Chaotropic salts are e.g. Guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, lithium chloride, sodium perchlorate, sodium iodide and / or urea, preferably in concentrations of 1 to 10 M.
Als die Lyse fördernde Komponenten werden Detergentien wie z.B. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS und/oder CTAB, ggf. Protein-abbauende Enzyme, wie z.B. Proteinasen eingesetzt.Detergents such as e.g. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS and / or CTAB, optionally protein-degrading enzymes, such as e.g. Proteinases used.
Erfindungsgemäß werden zur Separierung der verwendeten mineralischen Trägermaterialien Membranen verwendet, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die der eingesetzten Trägermaterialien, vorzugsweise in Zentrifugationskartuschen, wobei man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert. Bevorzugt werden gemäß der Erfindung Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt. Die Träger mit den fixierten Nukleinsäuren werden vor oder nach ihrem Aufbringen auf die Membran gewaschen. Die anschließende Elution der Nukleinsäure vom Träger wird fachgemäß mit Puffern geringer Ionenstärke durchgeführt.According to the invention, to separate the mineral carrier materials used, membranes are used which have a pore size which is larger than that of the carrier materials used, preferably in centrifugation cartridges, the pore size of the membranes being specified as a function of the average particle size of the carrier material used. According to the invention, nylon or polysulfone membranes are preferably used. The carriers with the fixed nucleic acids are washed before or after their application to the membrane. The subsequent elution of the nucleic acid from the carrier is carried out professionally with buffers of low ionic strength.
Es ist allgemein naheliegend, daß die für Nukleinsäurereinigungen effektiv nutzbaren Zentrifugationsmembranen eine Porengröße aufweisen müssen, die kleiner ist, als die der eingesetzten Trägermatrices, da mineralische Partikel, welche kleinere Partikeldurchmesser als die Poren von den Zentrifugationsmembranen haben, während eines Zentrifugationsschrittes immer durch die Poren zentrifugiert werden.It is generally obvious that the centrifugation membranes which can effectively be used for nucleic acid purifications must have a pore size which is smaller than that of the carrier matrices used, since mineral particles which have particle diameters smaller than the pores of the centrifugation membranes always centrifuge through the pores during a centrifugation step become.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein kombiniertes Batch- Säulen-Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren unter Einbeziehung von mineralischen Trägerpartikeln, die sogar sehr viel kleiner als die Porendurchmesser kommerziell verfügbarer Zentrifugationssäulen sein können, möglich ist.The invention is based on the surprising finding that a combined batch column method for isolating nucleic acids using mineral carrier particles, which can even be very much smaller than the pore diameter of commercially available centrifugation columns, is possible.
Überraschenderweise kann ein solches Kombinationsverfahren sogar mit mineralischen Trägermaterialien kleiner 50nm realisiert werden, wodurch der Vorteil der extrem hohen Bindungsoberflächen solcher Partikeln ausgenutzt werden kann.Surprisingly, such a combination process can even be implemented with mineral carrier materials smaller than 50 nm, whereby the advantage of the extremely high binding surfaces of such particles can be exploited.
Das erfindungsgemäße Verfahren der Kombination eines Batch- mit einem Säulenverfahren ist durch die Verwendung beliebiger mineralischer Trägermaterialien, auch sehr kleiner mineralischer Trägerpartikel und deren extrem großen spezifischen Oberflächen, hinsichtlich der Volumina der Ausgangsmaterialien nicht limitiert.The process according to the invention of combining a batch process with a column process is not limited by the use of any mineral carrier materials, even very small mineral carrier particles and their extremely large specific surfaces, with regard to the volumes of the starting materials.
Das bedeutet, notwendige Ausgangslösungen, welche in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials (z.B. bakterielle Lysate) ansonsten erhöht werden müssen, sind nicht mehr limitiert, da die Schritte der Bindung der Plasmid-DNA an die verwendeten Trägerpartikel nicht innerhalb einer Säule erfolgen müssen.This means that necessary starting solutions, which otherwise have to be increased depending on the amount of the starting material (e.g. bacterial lysates), are no longer limited, since the steps of binding the plasmid DNA to the carrier particles used do not have to take place within a column.
Das Verfahren liefert sehr hohe Ausbeuten an hochreiner DNA und ist außerdem sehr einfach in der Durchführung und kann im Vergleich zu weitverbreiteten Anionenaustauschersystemen z.B. bei der Isolierung von Plasmid-DNA in einer sehr viel kürzeren Zeit realisiert werden.The method provides very high yields of high-purity DNA and is also very easy to carry out and can be compared to widely used anion exchange systems e.g. in the isolation of plasmid DNA can be realized in a much shorter time.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt werden. 1. Miniprep-Isolierung von Plasmid-DNAThe invention is to be illustrated below using exemplary embodiments. 1. Miniprep isolation of plasmid DNA
2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 1 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 100 μl Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 300 μl Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes. Durch Zugabe von 300 μl Soution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 5 minutigen Zentrifugationsschritt bei 14.000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 20 μl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica- Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Minizentrifugationssäule (z.B. Micro Spin Nylon oder Micro Spin PSE; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 1 Minute bei bei 12.000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 12.000 rpm für 2 min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundnenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von lOOμl eines Niedrigsalzpuffers (z.B. lOmM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 1 Minute bei 12.000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.2 ml of a bacterial overnight culture are transferred to a 2 ml Eppendorf reaction vessel and centrifuged for 1 min at 12,000 rpm. The cell pellet is then resuspended with 100 μl of Solution I (Tris-HCl, EDTA; glucose). The cell lysis is carried out by adding 300 μl of Solution II (NaOH; SDS) by swirling the reaction vessel carefully and briefly. The necessary neutralization reaction is carried out by adding 300 μl of Soution III (sodium acetate; guanidinium hydrochloride). Chromosomal DNA and proteins are subsequently sedimented by a 5 minute centrifugation step at 14,000 rpm and the clear centrifuged supernatant is subsequently incubated with 20 μl of a suspension made of a mineral carrier material consisting of silica nanoparticles (average particle size 40 nm). The solution is then transferred to a mini centrifugation column (e.g. Micro Spin Nylon or Micro Spin PSE; LIDA). The carrier particles with the bound plasmid DNA are brought to the surface of the filter membrane by centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm and washed there by adding a washing solution (60% ethanol; NaCl) and a further centrifugation step. The washing step is repeated one more time. The remaining ethanol is finally removed from the carrier material by centrifugation at 12,000 rpm for 2 min. The bound plasmid DNA is detached by adding 100 μl of a low salt buffer (e.g. 10 mm Tris-HCl) at 70 ° C and subsequent centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm. The centrifugate contains the isolated plasmid DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Miniprep) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abbildung 1 dargestellt.The gel electrophoretic representation of isolated plasmid DNA (miniprep) from individual single cell colonies is shown in Figure 1.
2. Midiprep-Isolierung von Plasmid DNA2. Midiprep isolation of plasmid DNA
25 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 50 ml Flacon-Reaktionsgefaß überführt und für 10 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 1 ml Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 1,8 ml Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes und Inkubation für 5 min.. Durch Zugabe von 1,8 ml Solution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) und nachfolgender Inkubation für 10 min auf Eis erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 10 minutigen Zentrifuagtionsschritt bei 5000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 150 μl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica-Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Zentrifugationssäule (z.B. Macro Spin Nylon; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm an die Oberfläche der Filtentiembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60%) Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min oder durch die Inkubation der Zentrifugationssäule bei 37°C für 10min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 200 μl - 300 μl eines Niedrigsalzpuffers (z.B. lOmM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid -DNA.25 ml of a bacterial overnight culture are transferred to a 50 ml flacon reaction vessel and centrifuged for 10 min at 5,000 rpm. The cell pellet is then resuspended with 1 ml of Solution I (Tris-HCl, EDTA; glucose). The cell lysis is carried out by adding 1.8 ml of Solution II (NaOH; SDS) by briefly gently swirling the reaction vessel and incubating for 5 min. By adding 1.8 ml of Solution III (sodium acetate; guanidinium hydrochloride) and subsequent incubation for 10 min the necessary neutralization reaction takes place on ice. Chromosomal DNA and proteins are subsequently sedimented by a 10 minute centrifuge step at 5000 rpm and the clear centrifuged supernatant is subsequently treated with 150 μl of a suspension made of a mineral carrier material consisting of silica nanoparticles (average particle size 40 nm) incubated. The solution is then transferred to a centrifugation column (eg Macro Spin Nylon; LIDA). The carrier particles with the bound plasmid DNA are brought to the surface of the filter membrane by centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm and there by adding a washing solution (60%) ethanol; NaCl) and another centrifugation step. The washing step is repeated one more time. The remaining ethanol is finally removed from the carrier material by centrifugation at 5000 rpm for 10 min or by incubation of the centrifugation column at 37 ° C. for 10 min. The bound plasmid DNA is detached by adding 200 μl - 300 μl of a low salt buffer (eg 10 mm Tris-HCl) at 70 ° C. and subsequent centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm. The centrifugate contains the isolated plasmid DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Midipreparation) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abbildung 2 dargestellt. The gel electrophoretic representation of isolated plasmid DNA (midipreparation) from individual single cell colonies is shown in Figure 2.
3 Vergleich der benotigten Arbeitsschritte und des notwendigen Zeitaufwandes der erfinderischen Methode mit einem kommerziell eingesetzten Systems zur Isolierung von Plasmid-DNA (Midiprep) auf der Basis eines Anionenaustauschers3 Comparison of the required steps and the time required for the inventive method with a commercially used system for isolating plasmid DNA (Midiprep) based on an anion exchanger

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien durch1. Process for the isolation and purification of short and long chain nucleic acids from different biological and other starting materials
- Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,Lysis of materials containing nucleic acids,
- Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,- incubation with a mineral carrier material,
- Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,Application to membranes which have a pore size which is larger than the particle size of the carrier materials,
- Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel auf der Membran zurückbleiben.- Separation of the nucleic acids from the carrier material by elution, the carrier particles remaining on the membrane.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß2. The method according to claim 1, characterized in that
Ausgangsmaterialien komplexe biologische Systeme, wie z.B. Blut, Gewebe, Urin, Stuhl, die ggf. an festen Materialien gebunden sind, bakterielle Lysate, pflanzliche Komponenten, DNS-Fragmente aus PCR-Ansätzen oder Agarosegele sind.Starting materials complex biological systems, e.g. Blood, tissue, urine, stool, which may be bound to solid materials, bacterial lysates, vegetable components, DNA fragments from PCR mixtures or agarose gels.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterialien Siliziumverbindungen, wie, z.B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren, Silicagele eingesetzt werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that as carrier materials silicon compounds, such as, e.g. Silicon dioxide, silicas, silica gels are used.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Siliciumverbindungen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, aufweisen.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the silicon compounds used have an average particle size of 7 nm to 5000 nm, preferably 7-40 nm or 500-5000 nm.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse der Nukleinsäuren und ihre Bindung an das mineralische Trägermaterial mit chaotropen Salzlösungen in Kombination mit lysierenden Komponenten erfolgt.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the lysis of the nucleic acids and their binding to the mineral carrier material is carried out with chaotropic salt solutions in combination with lysing components.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotrope Salze Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff eingesetzt werden.6. The method according to claim 5, characterized in that guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, lithium chloride, sodium perchlorate, sodium iodide and / or urea are used as chaotropic salts.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als lysierende Komponenten Detergentien und/oder protein-abbauende Enzyme eingesetzt werden.7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that detergents and / or protein-degrading enzymes are used as lysing components.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Membranen Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt werden.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that nylon or polysulfone membranes are used as membranes.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the pore size of the membranes is specified as a function of the average particle size of the carrier material used.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Träger fixierten Nukleinsäuren vor oder nach ihrem Aufbringen auf die Membran wäscht.10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the carrier fixed nucleic acids are washed before or after their application to the membrane.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution der Nukleinsäure vom Träger mit Puffern geringer Ionenstärke durchführt. 11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that one carries out the elution of the nucleic acid from the support with buffers of low ionic strength.
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