EP0951560A1 - Conjugues d'un vecteur particulaire et d'oligonucleotides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Conjugues d'un vecteur particulaire et d'oligonucleotides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant

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Publication number
EP0951560A1
EP0951560A1 EP97952090A EP97952090A EP0951560A1 EP 0951560 A1 EP0951560 A1 EP 0951560A1 EP 97952090 A EP97952090 A EP 97952090A EP 97952090 A EP97952090 A EP 97952090A EP 0951560 A1 EP0951560 A1 EP 0951560A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleus
oligonucleotides
cationic
conjugate
particulate vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97952090A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Betbeder
Roger Kravtzoff
Ignacio De Miguel
Sophie Sixou
Pamela Pavco
Thale Jarvis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biovector Therapeutics SA
Original Assignee
Biovector Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biovector Therapeutics SA filed Critical Biovector Therapeutics SA
Publication of EP0951560A1 publication Critical patent/EP0951560A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle

Definitions

  • the invention relates to conjugates for addressing oligonucleotides, antisense and ribozymes, in cells, their preparation process and the pharmaceutical compositions containing them.
  • Oligonucleotides are a particularly interesting class of molecules because of their ability to form specific complexes by hybridization with complementary nucleic acid sequences. These complexes can be in the form of duplexes resulting from the hybridization of oligonucleotides with single-stranded DNA sequences or with RNA sequences, such as mRNA, or alternatively in the form of triplexes, by hybridization with double stranded DNA molecules (1-6).
  • RNA sequences such as mRNA
  • the invention relates more particularly to antisense oligonucleotides and ribozymes, the ability of which to specifically inhibit the expression of genes in in vitro models (16, 18) and the proliferation of cells in vivo ( 19, 20), as well as the RNAse H activity of the ribozymes.
  • the binding of oligonucleotides and ribozymes to mRNAs leads to inhibition of the translation of said mRNA according to two general processes, on the one hand, the degradation of this mRNA or of the RNA / DNA duplexes by cellular ribonuclease H (RNase H) or by the catalytic activity of ribozymes, on the other hand the steric blocking of the cellular machinery (1-9).
  • a major constraint in the use of these modified oligonucleotides lies in the fact that the hybridization complexes between the RNA and the oligonucleotide must be sufficiently stable so as not to be dissociated by the cellular machinery.
  • the antisense oligonucleotides or the ribozymes are directed towards the coding region, they are separated from their target by the translation ribosomes (11-15). This dissociation can be avoided by combining with the oligonucleotides reagents capable of reacting spontaneously, or after irradiation, with the target RNA (3-6, 10, 11).
  • 2,568,254 describes the application of oligonucleotide compounds linked to an intercalating agent for the selective blocking of a nucleic acid sequence, and more particularly the application of these compounds to selective blocking in vivo the expression of a gene or sequence involved in the initiation, propagation or termination of the replication of a nucleic acid, the transcription of one or more genes and / or their translation.
  • Cationic lipids such as DOTMA or DOTAP, already known for DNA transfection, could also constitute carriers of oligonucleotides (40, 41) and ribozymes. Their efficiency has been demonstrated, and more particularly the oligonucleotide and DOTAP complexes allow an increase in transport and a decrease in the intra- and extra-cellular degradation of the oligonucleotides (41). However, the cellular toxicity of these complexes limits their use in in vitro experiments (27, 42) or for local administration (43). More recently, the adsorption of oligonucleotides on polyalkylcyanoacrylate nanoparticles has made it possible to strengthen protection against degradation by nucleases (44).
  • BVSM Supramolecular Biovectors
  • Biovectors capable of fixing, and advantageously vectorizing, different substances or active principles, and therefore useful for the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • non-liquid hydrophilic central core consisting of a matrix of naturally or chemically cross-linked polysaccharides or oligosaccharides, which can be modified by various ionic groups;
  • lipid layers consisting in particular of phospholipids.
  • apolipoprotein B molecules grafted onto the layer of phospholipids or protein or peptide ligands capable of specifically recognizing cellular LDL receptors.
  • the Supramolecular Biovectors envisaged were of the type described in the international patent application PCT WO 92 21 329 that is to say made up of a core of polysaccharides crosslinked by epichlorohydrin, functionalized with glycidyltrimethylammonium chloride in order to show positive charges, and covered with a first layer of fatty acids and a second lipid layer . It was proposed to associate the acylated nuclei with the oligonucleotides by simple mixing in an aqueous medium, then to produce the external lipid layer by mixing the acetylated nuclei associated with the oligonucleotides with a lipid solution.
  • the work which led to the present invention was carried out thanks to the knowledge of the Applicant on the methods of manufacturing Supramolecular biovectors, which allowed him to study the possibilities of modulation of the degree of crosslinking of the polysaccharide matrix and adjustments of the level of cationic charges in the nucleus.
  • the invention therefore aims to provide new means of transport, protection and targeting of oligonucleotides in cells, in particular for therapeutic purposes.
  • This object is achieved thanks to a new ionic conjugate, stable in a biological medium, of a particulate vector comprising at least one non-liquid cationic hydrophilic nucleus and of polyanionic oligonucleotides, making it possible to transport in cells and to protect said oligonucleotides capable of hybridize with cellular mRNA.
  • the invention relates more particularly to a conjugate of a particulate vector and of oligonucleotides, characterized in that the particulate vector comprises at least one non-liquid hydrophilic nucleus consisting of a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides and modified with cationic ligands, the rate of positive charges of which is between approximately 0.6 and 1.8 milliEquivalent of positive charges per gram of nucleus and the rate of crosslinking is substantially that obtained by crosslinking with between 5 and 20% of mole of epichlorohydrin per mole of bone in the polysaccharides or oligosaccharides, and in that said particulate vector is conjugated by stable ionic bonds in a biological medium to polyanionic oligonucleotides protected by said particulate vector, said oligonucleotides being capable of hybridizing to a cellular mRNA.
  • the quantities of oligonucleotides conjugated to the particulate vector is at least equal and often very much greater than that possible with the simple transport systems of the prior art; in fact, on the order of 1000 copies of an oligonucleotide can be conjugated to the particulate vector; the half-life of oligonucleotides in the conjugate of the invention is increased by approximately 8 times compared to that of free oligonucleotides;
  • the particulate vector of the conjugate of the invention comprises at least one non-liquid hydrophilic nucleus, the size of which is generally between 10 nm and 5 ⁇ m and which preferably consists of a matrix of polysaccharides or of oligosaccharides naturally or chemically crosslinked carrying an overall cationic charge.
  • the polysaccharides of the matrix are chosen from the group comprising dextran, starch, cellulose, their derivatives and substituted, their hydrolysis products and their salts and esters.
  • This crosslinking rate is defined by reference to the crosslinking capacity of a defined quantity of epichlorohydrin, which is a well known crosslinking agent and described in the patent applications of the Applicant cited above.
  • the rate of crosslinking of the matrix allowing the production of the conjugates of the invention is obtained by reaction with between 5 and 20% of mole of epichlorohydrin per mole of bone in the polysaccharides or oligosaccharides constituting the matrix of the nucleus.
  • This level of crosslinking is decisive for ensuring the stability of the conjugate of the invention in biological fluids of the blood plasma type. However, without this stability, the in vivo and in vitro efficiency of the conjugates of the invention for transporting and addressing the oligonucleotides in the target cells would be considerably reduced.
  • hydrophilic matrix of the nucleus Another essential characteristic of the hydrophilic matrix of the nucleus is to be positively ionized. This cationic ionization is obtained by grafting, onto the hydrophilic matrix, ligands carrying positively charged functions.
  • the rate of positive charges in the nucleus constitutes, like the rate of crosslinking of the hydrophilic matrix, an essential characteristic of the conjugate on which its effectiveness depends.
  • the cationic nature of the nucleus is indeed essential for the formation of the ionic conjugate of the invention with polyanionic oligonucleotides. But this cationic character must be rigorously defined so as to ensure the functionality of the conjugate in a therapeutic strategy.
  • the research carried out by the Applicant has established that the nucleus must have between 0.6 to 1.8 milliEquivalent and preferably 0.8 to 1.6 milliEquivalent of positive charges per gram of nucleus to ensure a level of efficient conjugation with oligonucleotides.
  • the rates of crosslinking and of positive charges of the nucleus defined above are decisive for obtaining the maximum conjugation between the vector and the oligonucleotides, and ensuring the stability and the low toxicity of the conjugates of the invention.
  • the non-liquid hydrophilic core is covered in whole or in part with at least one layer of amphiphilic compounds.
  • these amphiphilic compounds are chosen from natural or synthetic lipids and phospholipids, ceramides, fatty acids, glycolipids, lipoproteins and surfactants.
  • the invention more particularly contemplates particulate vectors whose non-liquid hydrophilic core is covered in whole or in part with an external layer consisting of:
  • Another embodiment of a conjugate of the invention consists in using Biovectors of the type described in European patent No. 344 040, that is to say comprising a central core previously defined, covered in whole or in part with two layers of amphiphilic compounds.
  • the amphiphilic compounds are those described above.
  • the case is more particularly preferred of a central core covered in whole or in part with a first layer of fatty acids, itself covered in whole or in part with a lipid layer.
  • particulate vectors comprising at least one amphiphilic layer advantageously makes it possible to associate with the conjugate of the invention an additional active principle useful for transporting, addressing or presenting the conjugate at the level of the cell membrane, in the cytoplasm or during hybridization with a target mRNA.
  • an additional active principle can also be carried out at the nucleus of the particle vector of the conjugate.
  • the oligonucleotides conjugated to the particulate vector of the invention are natural or modified oligodeoxyribonucleotides or oligoribonucleotides, optionally labeled, comprising on the order of 5 bases up to a hundred bases. Such labeling (s) and / or modification (s) are acceptable within the framework of the invention, if they do not substantially change the polyanionionic character of the oligonucleotide.
  • the oligonucleotides conjugated to the particulate vector of the invention also cover antisense and ribozymes.
  • the particulate vector according to the invention can be conjugated to several tens up to about 1000 copies of the same oligonucleotide, or be conjugated to several oligonucleotides of different sequences, and in this case, each oligonucleotide of different sequence must be present at around 100 copies.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more conjugates according to the invention or their pharmaceutically acceptable salts, dispersed in pharmaceutically acceptable excipients. These pharmaceutical compositions can, for example, be administered systemically or else be applied locally, the excipients or vehicles used are chosen to be compatible with the chosen mode of administration or application.
  • the invention also relates to the conjugate defined above intended to be used for addressing an oligonucleotide in a cell and in particular in the cytoplasm.
  • the invention further relates to the particulate vectors used in the conjugates described above.
  • These particulate vectors are of the type comprising at least one non-liquid cationic hydrophilic nucleus constituted by a matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides carrying a global cationic charge and having at least one of the following characteristics: the crosslinking rate is substantially that obtained by crosslinking with between 5 and 20% of mole of epichlorohydrin per mole of bone in the polysaccharides or oligosaccharides; said matrix of naturally or chemically crosslinked polysaccharides or oligosaccharides is modified by cationic ligands, the rate of positive charges of which is between 0.6 and 1.8 milliEquivalents and advantageously between 0.8 and 1.6 milliEquivalent of positive charges per gram of kernel.
  • the non-liquid hydrophilic core is covered in whole or in part with at least one layer of amphiphilic compounds.
  • these amphiphilic compounds are chosen from natural or synthetic lipids and phospholipids, ceramides, fatty acids, glycolipids, lipoproteins and surfactants.
  • the invention more particularly contemplates particulate vectors whose non-liquid hydrophilic core is covered in whole or in part with an external layer consisting of:
  • the oligonucleotides addressed in the cytoplasm of a cell are oligoribonucleotides or oligodeoxyribonucleotides, antisense or ribozymes, possibly labeled, natural or modified as long as the labeling or modification does not substantially change the polyanionic character of the oligonucleotides.
  • the invention also relates to the methods for preparing the ionic conjugates defined above. Indeed, the methods described in the prior art do not make it possible to obtain conjugates having all the properties required for an antisense or ribozyme strategy.
  • the research carried out by the Applicant on the preparation of conjugates has enabled it to define methods making it possible to obtain functional conjugates in a reproducible manner.
  • Such a process is characterized in that it comprises the following stages: a) the preparation of the cationic nucleus: - by mixing a hydrophilic polymer, of polysaccharide or oligosaccharide nature, chemically or naturally crosslinked with a crosslinking agent in a ratio between 0.06 and 0.2 mole, and preferably between 0.1 and 0.15 mole, of crosslinking agent per unit of bone in the polysaccharide or the oligosaccharide,
  • a cationic ligand so as to obtain a charge rate of the nucleus of between 0.6 and 1.8 and preferably between 0.8 and 1.6 millEquivalents per gram of nucleus; b) loading of the polyanionic oligonucleotides: by adding, with stirring, to the nucleus prepared in step (a), between approximately 0.02 and 0.4 gram, and preferably between 0.05 and 0.2 gram, d oligonucleotide per gram of nucleus, at a rate of between approximately 0.25 ⁇ g of oligonucleotide per mg of nucleus per hour and 6 mg per mg of nucleus per hour, and preferably between 4 ⁇ g / mg / hour and 1 mg / mg / hour, at a temperature between about 20 ° C and 60 ° C and preferably between 40 ° C and 50 ° C.
  • step (a) can include adjustments in step (a).
  • step (a) further comprises, the grafting onto the core or the underlying layer of a layer consisting of amphiphilic compounds.
  • a layer of fatty acids linked to the nucleus by covalent bonds, and / or - an external sheet capable of modifying the cellular behavior of the conjugate of the invention, consisting, for example of zwitterionic phospholipids associated or not to anionic and / or cationic lipids, linked to the underlying layer or to the nucleus by hydrophobic and / or ionic and / or hydrogen bonds.
  • step (b) of the process of the invention consists in adding to particulate vectors prepared in accordance with step (a), the concentration of which is expressed in cationic nucleus is between 1 and 20 mg / ml, a solution of oligonucleotides at a concentration of between 1 and 20 mg / ml, so as to obtain an oligonucleotide / particle vector ratio of between 2 and 40%, and preferably between 5 and 20%, according to kinetics adding the oligonucleotide solution between 5 ⁇ l / ml / h and 300 ⁇ l / ml / h, and at an incubation temperature between 20 ° C and 60 ° C, and preferably between 40 ° C and 50 ° C,
  • Figure 1 shows the effect of charge density on the cytotoxicity of cationic NPS.
  • Cationic NPS with different charge densities are incubated with HL60 cells. After 72 hours of incubation, cell viability is determined by an MTT test.
  • FIG. 2 shows the effect of the crosslinking rate (epichlorohydrin / dare units ratio) on the cytotoxicity of cationic NPS.
  • Cationic NPS (1.4 mEq / g) having different crosslinking rates are incubated with HL60 cells. After 72 hours of incubation, cell viability is determined by an MTT test.
  • FIG. 3 represents the effect of crosslinking on the characteristics of the Antisens Biovector conjugates.
  • Cationic NPS (1.4 mEq / g) having different crosslinking rates are conjugated to Antisense.
  • the association yields (M) and the stability in PBS (phosphate buffered saline) (-m.) are determined as a function of the crosslinking rate of NPS.
  • FIG. 4 shows the degradation kinetics of oligonucleotides in different media. Free oligonucleotides (empty symbols) or conjugated to biovectors (solid symbols) are incubated in culture medium supplemented with serum
  • FIG. 5 shows the kinetics of penetration of oligonucleotides into cells.
  • MCF7 cells are incubated with oligonucleotides free ( ⁇ > LJ) or conjugated to biovectors (- * -> ⁇ ).
  • Two different concentrations of oligonucleotide were used, 0.8 mg / ml (d; A) e t 6.2 mcg / ml (; L_). After different incubation times, cell penetration of the oligonucleotides was determined by flow cytometry.
  • FIG. 6 represents the cellular activity of the biovector Antisense conjugates.
  • Antisense oligonucleotides targeting the c-myc oncogene (15 seas phosphorothioate) are conjugated to biovectors. These free oligonucleotides or conjugates to the biovectors as well as the free biovectors are incubated with 5 ⁇ 10 4 HL60 cells. At different incubation times, cell proliferation is determined by an MTT test. The results are expressed in Optical Density at 570 nm.
  • FIG. 7 represents the cellular activity of the Ribozymes / Biovectors conjugates.
  • Ribozyme oligonucleotides targeting 1 Oncogen c-myb (35 seas) are conjugated to biovectors or Lipofectamine.
  • These free or conjugated Ribozymes (FIG. 7a), as well as various controls, conjugate inactive Ribozyme Biovectors, Scrambled Ribozyme Biovector conjugates, inactive Lipofectamine Ribozyme conjugate and free biovector (FIG. 7b), are incubated with 2 ⁇ 10 ⁇ cells. The results are expressed as a percentage of cell proliferation relative to the control (untreated cells)
  • FIG. 8 represents the specific inhibition of protein synthesis by a phosphorothioate (ODM-PO) or phosphodiester (ODM-PD) antisense conjugated to the biovectors.
  • ODM-PO phosphorothioate
  • ODM-PD phosphodiester
  • SMBV Empty biovector
  • SMBV-AS Antisense Biovector conjugate
  • SMBV-SC Biovector conjugate "scramble”
  • DOTAP DOTAP alone
  • DOTAP-AS Biovector antisense conjugate
  • DOTAP-SC DOTAP conjugate "scramble”
  • Control Cells only
  • Control-AS Free Antisense
  • Control-SC free "Scramble”.
  • Figure 9 shows the inhibition of the proliferation of an SK-Br3 line by anti-erb2 anti-sense biovector conjugates.
  • the proliferation of SK-Br3 cells is determined after incubation of the cells with an anti erb2 antisense conjugated to the biovectors. The results are expressed in number of cells as a function of time. The control corresponds to cells treated in the absence of oligonucleotide and biovector.
  • the preparation is allowed to stir for 8 hours at 20 ° C.
  • the ionic gel obtained is then dispersed in 2 liters of osmosis water, neutralized with acetic acid and homogenized by a Rannie homogenizer (type Minilab 8:30) at a pressure of 1000 bars.
  • the Polysaccharide Cores (NPS) thus obtained are ultrafiltered through a 30 Kd membrane (Incelltech, France) and filtered through a 0.45 ⁇ m cartridge (Millipore, France).
  • the loading rate of the NPS obtained is determined by elementary analysis of the nitrogen level present in the gel.
  • Table 2 reports the different cationic NPSs prepared according to Example 1 with epichlorohydrin / variable glucose unit molar ratios and a constant GTMA / glucose unit ratio (50%) allowing a charge of 1.4 mEq / g of gel.
  • the usable ratios are between 0 and 20% corresponding to the modification of one glucose unit out of five.
  • the ratio is between 6 and 20%, and preferably between 10 and 15%.
  • biovectors take place in two main stages: (1) the synthesis of cationic polysaccharide nuclei (NPS), (2) the association of lipids with NPS, called synthesis of biovectors (light type).
  • NPS cationic polysaccharide nuclei
  • ROQUETTE Glucidex maltodextrins
  • the gel is diluted with 8 liters of demineralized water and neutralized with glacial acetic acid.
  • the hydrogel obtained is ground using a high pressure homogenizer (RANNIE Lab).
  • the pressure exerted is 400 bars.
  • the dispersed matrices have an average diameter of 60 nm.
  • the purification takes place in successive stages of:
  • NPS are concentrated, collected in sterile bottles and stored at -20 ° C.
  • the thawed cationic polysaccharide nuclei are diluted with osmosis water in a glass receptacle in the proportion of 1 mg of NPS / 1 ml of water.
  • the dispersion is first placed under magnetic stirring (5-10 minutes) and then homogenized (RANNIE Minilab) at 400 bars for 3 minutes.
  • the NPS dispersion is placed in a water bath at 80 ° C.
  • the lipids (example: mixture of egg yolk lecithin / cholesterol), in powder form, are weighed so that the total mass represents, for example 20% (/ w) of the mass of the NPS.
  • the constituent lipids of the membrane are mixed and solubilized with 2 ml of 95% ethanol (v / v).
  • the loaded lipids represent, for example, 5% (w / w) of the total lipids.
  • the homogenizer is brought to a temperature of 60 ° C minimum by circulating water in a closed circuit.
  • the NPS dispersed at 80 ° C. are subjected to magnetic stirring and the ethanolic lipid solution is injected into the NPS dispersion.
  • the homogenizer circuit heating water is removed and replaced by the "NPS / lipids" dispersion at 80 ° C.
  • This new dispersion is homogenized at 450 bars for 25 minutes in a closed circuit at 60 ° C minimum.
  • the preparation is introduced into a glass flask and then subjected to low pressure at 60 ° C to remove the ethanol remaining in solution. If necessary, the biovectors obtained can be concentrated by ultrafiltration, lyophilization or evaporation.
  • the cationic biovectors thus obtained are then stored under sterile conditions after filtration through 0.2 ⁇ m.
  • the Supramolecular Biovectors known as "NPS" of Example 3 are prepared, which are subjected to an acylation step to obtain Acylated NPS. After phospholipidation, the complete SMBVs are obtained.
  • Different suspensions of cationic NPS are diluted in a cell culture medium (RPMI 1640, Gilco, France).
  • the suspensions obtained are then mixed with an equivalent volume of cell suspension (lOO ⁇ L of HL60 cell at 5 10 4 cells / ml).
  • the cell suspensions thus prepared are incubated for 72 hours at 37 ° C. in an incubator with 5% of CO 2 .
  • Example 1 The NPS of Example 1 (initial Epichlorohydrin / glucose unit ratio of 10%) were used to show the loading effect on the cytotoxicity of cationic NPS.
  • Figure 1 shows the response curves obtained on the HL60 line and for charge densities between 0.8 and 1.4 mEq / g. It appears that the cellular toxicity of NPS is observed for concentrations of between 10 and 150 ⁇ g / ml (IC20 after 3 days of incubation). However, this can be modulated by the density of cationic charges of the NPS.
  • FIG. 2 gives the cytotoxicity curves obtained with the HL60 cells and the cationic NPS of example 2. For this charge density (1.4 mEq / g) and for crosslinking rates varying from 0 to 16.7 %, cell toxicity is observed for concentrations ranging from 10a 150 ⁇ g / ml (IC20). As with the loading effect, crosslinking appears to be an important parameter of the cellular toxicity of cationic NPS.
  • Table 3 summarizes the cytotoxicity results observed on the HL60 line after 72 hours of incubation for different cationic NPS which differ in their charge density and their crosslinking rate. The results are expressed as IC20, the concentration of NPS which inhibits 20% of cell proliferation 72 hours after incubation.
  • Example 6 Loading of Oligonucleotide into cationic NPS.
  • oligonucleotide solution (sea antisense) at 2.5 mg / ml in water is slowly added (5 ⁇ l / ml every hour) to a solution of cationic NPS at 1 mg / ml maintained at 45 ° C. with magnetic stirring. .
  • the oligonucleotide / NPS ratio is 5% (w / w).
  • the concentration of free oligonucleotides is determined by spectrophotometry after ultrafiltration of the preparations.
  • the preparation is incubated in PBS (10 mM NaH 2 P0 4 / Na 2 HP ⁇ 4 , NaCl 130 mM, KC1 2 mM, pH 7.4). After this incubation (30 min. At 37 ° C.), the free oligonucleotides associated with the NPS are separated by ultrafiltration and the concentration is determined by spectrophotometry.
  • PBS 10 mM NaH 2 P0 4 / Na 2 HP ⁇ 4 , NaCl 130 mM, KC1 2 mM, pH 7.4
  • Table 4 summarizes the association results obtained for different charges of cationic NPS (0.6; 0.9 and 1.6 mEq / g) and shows the influence of charge of cationic NPS on the yields of association and stability in PBS of oligonucleotide-NPS complexes.
  • FIG. 3 gives the results obtained when the NPS of Example 2 are used in the association protocol.
  • the synthesis of the optimal NPS for the formation of the conjugates must correspond to a compromise between the charge density of the NPS and the crosslinking of the polysaccharide in order to maximize the qualities of the oligonucleotide-biovector conjugate and to minimize the cellular toxicity thereof.
  • Example 7 Obtaining a non-aggregative protocol during the preparation of the oligonucleotide-biovector conjugates.
  • Biovectors prepared as in Example 4 are conjugated to oligonucleotides (18-mer antisense) using the protocol described in Example 6 with an Oligonucleotide / NPS ratio of 10%.
  • the energy supply is carried out using two methods:
  • Method 1 The oligonucleotides are added at room temperature in an ultrasonic bath.
  • Method 2 The addition of the oligonucleotides is carried out with magnetic stirring at 45 ° C.
  • Method 1 results in aggregation of the Biovectors, indicating that ultrasound is not sufficient to dissociate the Biovector / oligonucleotide aggregates.
  • method 2 results in a non-aggregative conjugation protocol making it possible to obtain homogeneous suspensions.
  • Table 5 gives the characteristics of the Oligonucleotide-Biovector conjugates obtained using an antisense oligonucleotide [OligoDeoxyNucleotide (ODN) of 15 mothers] or a Ribozyme (OligoRiboNucleotide (ORN) of 35 mothers], and the biovectors described in l Example 3, the NPS of which have defined characteristics (for example a load of 0.8 mEq / g and a crosslinking rate of 12.5%).
  • the association protocol used corresponds to the protocol of Example 6. However, the oligonucleotide solution is added at the rate of 10 ⁇ l / ml, every hour for 4 hours of incubation. Thus, the oligonucleotide / NPS ratio is maintained at 10%.
  • oligonucleotides for example antisense oligonucleotides or ribozymes
  • a cationic oligonucleotide / NPS ratio of between 2 and 40%, and preferably between 5 and 20%, kinetics of adding the oligonucleotide solution of between 5 ⁇ l / ml / h and 300 ⁇ l / ml / h, a incubation temperature between 20 ° C and 60 ° C, and preferably between 40 ° C and 50 ° C, the conjugates of the invention are obtained, the functional characteristics of which are remarkable.
  • Oligonucleotides (phosphodiester, 15 mothers, Genset, France) are labeled with phosphorus 32 by the following method: labeling of the 5 ′ end with ATP- [g P] by T4 polynucleotide kinase (Boehringher Mannheim, France) , followed by purification on an exclusion column.
  • the samples are taken, heated to 65 ° C to destroy the nuclease activities, and stored at 4 ° C until analysis.
  • the samples are analyzed by electrophoresis on acrylamide gel (20%).
  • the gels are autoradiographed and quantified on the Kodak DSC 200 system.
  • FIG. 4 shows that the conjugation of the oligonucleotides to the Biovectors makes it possible to obtain effective protection against nucleases. Indeed, free oligonucleotides are rapidly degraded in media containing active serum. Thus, in these media, the degradation of the free oligonucleotide is complete after 45 minutes of incubation. Conversely, after conjugation to the biovectors, complete degradation of the oligonucleotides is obtained after 6 to 8 hours of incubation. The same type of profile can be obtained after incubation in human plasma, the half-life time passing from 120 min. at 225 min. , respectively for the free oligonucleotide and conjugated to the Biovectors.
  • Example 10 Cell penetration of the oligonucleotide / Biovector conjugates. Protocol. Biovector / oligonucleotide conjugates are prepared with a fluorescein-labeled oligonucleotide (phosphodiester, 18 mothers, Genset, France). The oligonucleotides, either free or conjugated to the biovectors, are incubated with 2 ⁇ 10 MCF7 cells (human mammary carcinoma) at the concentration of 0.78 and 6.25 ⁇ g / ml.
  • MCF7 cells human mammary carcinoma
  • FIG. 5 gives the results obtained and shows the capacity of the Biovectors to increase the cellular penetration of the oligonucleotides.
  • the cell penetration of the oligonucleotides is extremely low.
  • effective cell penetration of the oligonucleotide can be obtained after conjugation to the Biovector. This penetration is linked to the concentration of oligonucleotide-biovector conjugate and to the incubation time of the conjugate and of the cells. The combination of these properties of the conjugate
  • Oligonucleotide-biovector stabilization of 1 oligonucleotide facing the action of nucleases and cell penetration, is certainly the important point for improving the biological activity of oligonucleotides in the antisense and ribozymes strategy.
  • Biovectors are prepared according to the protocol described in Example 3, the NPS of which have defined characteristics (for example a load of 0.8 mEq / g and a crosslinking rate of 12.5%).
  • An antisense targeting the mRNA of the oncogenic c-myc (15 mothers phosphorothioate, Lynx Therapeutics, California) is conjugated to these biovectors according to the protocol described in Example 6, with an oligonucleotide / NPS ratio of 5%.
  • the unconjugated Biovectors are incubated at 37 ° C. with 5 ⁇ 10 cells (line HL60) at the concentration of ⁇ M in the culture medium (RPMI1640 + 10% fetal calf serum). At different times, the cells are removed, washed in PBS and cell proliferation is determined by an MTT test.
  • results reported in FIG. 6 show a marked improvement in the antisense activity which is expressed by an inhibition of cell proliferation over time. It is important to note that for the concentration used (1 ⁇ M), the free oligonucleotide is not capable of expressing this activity. Conversely, the oligonucleotide-biovector conjugates under the conditions make it possible to inhibit cell proliferation during the five days of the experiment.
  • the oligonucleotide used in these experiments being a phosphorathioate oligonucleotide, inherently resistant to nucleases present in the culture medium, this improvement in antisense activity seems to be due to the increase in the cellular concentration of oligonucleotides.
  • Example 12 Cellular activity of Ribozyme Biovector conjugates. Biovectors are prepared according to the protocol described in Example 3, the NPS of which have defined characteristics (for example a load of 0.8 mEq / g and a crosslinking rate of 12.5%).
  • Ribozymes targeting the mRNA of the oncogenic c-myb are conjugated to these biovectors according to the protocol described in Example 6 with an oligonucleotide / NPS ratio of 5%.
  • three negative controls are prepared under the same conditions, an inactive Ribozyme conjugate, Ribozyme unable to effect catalytic cleavage of mRNA, a "scrambled" Ribozyme conjugate, Ribozyme unable to recognize the sequence of c-myb, and empty biovectors.
  • active and inactive ribozymes are conjugated to lipofectamine.
  • RSMC cells rat smooth muscle cell
  • serum-free culture medium Optimem
  • 100 ⁇ l of Optimem containing varying concentrations of Ribozymes are added to the cells.
  • cell proliferation is stimulated by placing the cells in a culture medium supplemented with 10% fetal calf serum.
  • Cell proliferation is determined by a Bromo deoxy Uridine (BrdU) test.
  • Figures 7a and 7b show the response curve obtained for the Ribozyme-Biovectors conjugates, Ribozymes-lipofectamine, as well as for various controls, Empty biovector or conjugate with inactive ribozymes.
  • active or inactive Ribozymes which are not conjugated to biovectors do not exhibit any inhibition of cell proliferation.
  • lipofectamine exhibits significant toxicity, which on the one hand does not make it possible to increase the concentration of ribozymes, and on the other hand makes it difficult to compare the activity of active and inactive ribozymes.
  • the biovectors make it possible to considerably increase the biological activity of the ribozymes, advantageously compared to the prior art.
  • Example 13 Specific inhibition of protein synthesis by an antisense conjugated to biovectors.
  • Biovectors are prepared according to the protocol described in Example 4, the NPS of which have defined characteristics (for example a charge of 1.6 mEq / g and a crosslinking rate of 10%).
  • Two conjugates of oligonucleotide-biovectors are prepared from a phosphorothioate antisense targeting the mRNA of the Erb2 pro-oncogene (15 mothers, Genset, France) and the same phosphodiester antisense sequence (15 mothers, Genset, France).
  • the control conjugates, "scrambled" sequence conjugated to Biovectors, and empty Biovector were prepared.
  • These various conjugates are prepared according to the protocol described in Example 6 with an oligonucleotide / NPS ratio of 10%. By comparison, the same antisense is conjugated to DOTAP. ,. 4
  • the cells are tested for the presence of the P185-Erb2 protein.
  • the cells are collected, washed in PBS and incubated in the presence of an anti-Erb-2 antibody (OP39, Oncogéne Science, France).
  • Analysis of the cells is carried out using a flow cytometer after revelation by a second antibody labeled with fluorescein.
  • the results obtained and presented in FIG. 8 show the contribution of conjugation to biovectors in the expression of the biological activity of an antisense. It is particularly noteworthy that there is no significant difference between the activity of the phosphodiester and phophorothioate antisense.
  • Example 14 In-vitro biological activity of an antisense conjugated to biovectors (Model Erb-2). Oligonucleotide-biovector conjugates are prepared under the conditions described in the example 13 and using the phosphorothioate derivative of this example.
  • SK-Br3 cells in 60 ⁇ l of RPMI 1640 are incubated in the presence of the various preparations, conjugate of oligonucleotide phosphorothioate and biovector, of oligonucleotide phosphorothioate free or biovector .
  • the incubations are carried out at a concentration of 180 ⁇ g / ml of biovector corresponding to a concentration of 3 ⁇ M in oligonucleotide.
  • 200 ⁇ l of RPMI 1640 supplemented with 5% fetal calf serum are added to the cell suspensions and the cells are again incubated at 37 ° C.
  • FIG. 9 shows the proliferation curve of the cells after treatment with the different preparations. Under these conditions, the free oligonucleotide is incapable of inhibiting cell proliferation. It is notable that the oligonucleotide targeting an oncogen allows, after conjugation to the biovectors, to completely inhibit the cell proliferation of this tumor line.

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Abstract

L'invention concerne un conjugué ionique, stable dans un milieu biologique, d'un vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique et d'oligonucléotides polyanioniques. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques contenant ces conjugués et l'utilisation de vecteur particulaire pour délivrer des oligonucléotides dans les cellules.

Description

CONJUGUES D'UN VECTEUR PARTICULAIRE ET D 'OLIGONUCLEOTIDES, LEUR PROCÉDÉ DE PRÉPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT.
L'invention se rapporte à des conjugués permettant l'adressage d' oligonucleotides, antisens et de ribozymes, dans les cellules, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques les contenant . Les oligonucleotides constituent une classe de molécules particulièrement intéressante du fait de leur aptitude à former par hybridation des complexes spécifiques avec des séquences d'acides nucléiques complémentaires . Ces complexes peuvent se présenter sous la forme de duplexes résultant de l'hybridation d 'oligonucleotides avec des séquences d'ADN simples brins ou avec des séquences d'ARN, comme de l'ARNm, ou encore sous forme de triplexes, par hybridation avec des molécules d'ADN doubles brins (1-6) . Les propriétés rappelées ci-dessous confèrent aux oligonucleotides des possibilités d'applications remarquables pour l'étude des gènes et dans le domaine thérapeutique (17). Ainsi, l'invention se rapporte plus particulièrement aux oligonucleotides antisens et aux ribozymes, dont on a déjà étudié la capacité à inhiber spécifiquement l'expression de gènes sur des modèles in vi tro (16, 18) et la prolifération des cellules in vivo (19, 20), ainsi que l'activité RNAse H des ribozymes . La fixation d 'oligonucleotides et des ribozymes sur les ARNm conduit à 1 ' inhibition de la traduction dudit ARNm selon deux processus généraux, d'une part la dégradation de cet ARNm ou des duplexes ARN/ADN par la ribonuclease H cellulaire (RNase H) ou par l'activité catalytique des ribozymes, d'autre part le blocage stérique de la machinerie cellulaire (1-9). L'utilisation d' oligonucleotides chimiquement modifiés permet d'améliorer leur incorporation par la cellule et leur résistance aux nucléases (10), notamment les 3 ' -exonucléases . Parmi, les modifications chimiques d' oligonucleotides proposées dans l'art antérieur, la plus prometteuse semble être l'utilisation d'analogues structuraux des oligonucleotides phosphodiesters comme les oligonucleotides phosphorothioates . Ceux-ci résistent au clivage par les nucléases et n'inhibent pas la dégradation par la RNase H (28) . Ces avantages ont conduit à plusieurs études celullaires et de pharmacocinétique (18, 29, 30) ainsi qu'à des essais cliniques de ces composés comme agents antitumoraux et antiviraux (31). Mais, la mise en évidence d'effets non- spécifiques a limité considérablement l'enthousiasme de l'utilisation thérapeutique des olignucléotides antisens (17, 32, 33) .
En outre, une contrainte majeure de l'utilisation de ces oligonucleotides modifiés réside dans le fait que les complexes d'hybridation entre 1 'ARN et 1 ' oligonucleotide doivent être suffisamment stables pour ne pas être dissociés par la machinerie cellulaire. Ainsi, lorsque les oligonucleotides antisens ou les ribozymes sont dirigés vers la région codante, ils sont séparés de leur cible par les ribosomes de la traduction (11-15) . Cette dissociation peut être évitée en associant aux oligonucleotides des réactifs capables de réagir spontanément, ou après irradiation, avec l'ARN cible (3-6, 10, 11) .
On connaît par exemple la Demande de Brevet Internationale publiée sous le n° WO 90/12020 qui propose de coupler la furocoumarine à un oligonucleotide par l'intermédiaire d'un sucre ribose ou déoxyribose. Les Demandes de Brevet Européen n° 316 016, Internationale n° WO 89/06702 et Allemand n° 3928900 décrivent l'utilisation de conjugués de psoralène et d' oligonucleotides pour bloquer l'expression génétique. La demande de Brevet Français n° 2 568 254, décrit l'application de composés oligonucleotides liés à un agent intercalant pour le blocage sélectif d'une séquence d'acide nucléique, et plus particulièrement l'application de ces composés au blocage sélectif in vivo de l'expression d'un gène ou d'une séquence impliquée dans l'initiation, la propagation ou la terminaison de la replication d'un acide nucléique, de la transcription d'un ou plusieurs gènes et/ou de leur traduction.
Toutefois, ces méthodes chimiques présentent des inconvénients, car, l'induction de pontages par des agents chimiques s'accompagne souvent de réctions non spécifiques, et l'activation photochimique est difficile à mettre en oeuvre in vivo.
L'efficacité des oligonucleotides antisens et de ribozymes est également limitée, d'une part du fait de leur nature polyanionique qui conduit à des interactions non-spécifiques avec des molécules extracellulaires cationiques (21, 22), et d'autre part, en raison de leur faible diffusion au travers de la membrane plasmatique (23-25) . Afin de palier ces inconvénients, il est proposé dans l'art antérieur d'utiliser, comme indiqué précédemment, des oligonucleotides chimiquement modifiés ou des systèmes de transport et de délivrance (27).
Les stratégies d' encapsulation des oligonucleotides et de ribozymes semblent constituer une meilleure approche que les modifications chimiques pour favoriser à la fois le transport et la stabilité d' oligonucleotides non-modifiés, tout en conservant leur spécificité d'hybridation. Ainsi, il a été réalisé, dans l'art antérieur, 1 ' encapsulation d' oligonucleotides dans des liposomes, dans des immunoliposomes (34, 35) ou des liposomes sensibles au pH (36) . Il a été montré que 1 ' encapsulation permet une protection relative des oligonucleotides contre les nucléases et augmente leur délivrance dans des cellules. Malgré ces avantages, 1 ' encapsulation d' oligonuléotides dans des liposomes n'est pas entièrement satisfaisante notamment en raison de problèmes dans le rendement d' encapsulation. Il a également été envisagé, dans l'art antérieur, que l'interaction entre des oligonucleotides conjugués au cholestérol avec des LDL naturels, permet de prolonger la demi-vie plasmatique des oligonucleotides (38) , de 1 à 10 minutes, et d'augmenter l'efficacité in vi tro d' oligonucleotides antisens (39). Toutefois, la préparation de LDL à partir de plasma humain et la faible stabilité des oligonucleotides ainsi associés demeurent des handicaps majeurs à leur utilisation thérapeutique .
Des lipides cationiques, comme le DOTMA ou le DOTAP, déjà connus pour la transfection d'ADN, pourraient également constituer des transporteurs d' oligonucleotides (40, 41) et de ribozymes. Leur efficacité a été démontrée, et plus particulièrement les complexes oligonucleotides et DOTAP permettent une augmentation du transport et une diminution de la dégradation intra et extra celullaire des oligonucleotides (41) . Mais la toxicité cellulaire de ces complexes limite leur utilisation dans des expériences in vitro (27, 42) ou pour une administration locale (43) . Plus récemment, l'adsorption d'oligonucleotides sur des nanoparticules de polyalkylcyanoacrylate à permis de renforcer la protection contre la dégradation par les nucléases (44) . L'inhibition de la croissance néoplastique chez des souris nudes a été observée avec une concentration d'oligonucleotides adsorbés sur ces nanoparticules, 100 fois plus faible qu'avec des oligonucleotides libres (45). Mais les possibilités d'utilisation systémique de ces véhicules n'ont pas été démontrées à ce jour.
Il n'existe donc à ce jour aucun système de transport, d'adressage et de protection efficace des oligonucleotides, antisens et ribozymes, permettant leur utilisation thérapeutique.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés sous le terme général de Biovecteurs Supramoléculaires (BVSM) ou Biovecteurs, capables de fixer, et avantageusement de vectoriser, différentes substances ou principes actifs, et donc utiles pour la fabrication de compositions pharmaceutiques .
Un premier type de Biovecteurs Supramoléculaires, et son procédé de préparation, a été décrit dans le brevet européen No. 344 040. II s'agit de particules comprenant de
1 ' intérieur vers 1 ' extérieur :
- un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers ;
- un couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau; une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides .
Les développements de cette première génération de Biovecteurs Supramoléculaires ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer de nouveaux Biovecteurs Supramoléculaires, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés. Les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les No. WO 92/21329, WO 92/21330, WO 94/23701, WO 94/20078 et WO 96 06 638 décrivent ces Biovecteurs Supramoléculaires, leur fabrication, leur association à divers principes actifs et leur utilisation pour la préparation de compositions pharmaceutiques.
L'enseignement des demandes de brevets ci- dessus est incorporé dans la présente description par référence.
L'association d'un Biovecteur Supramoléculaire avec des oligonucleotides a été envisagée dans la demande de brevet internationale PCT No. WO 92/21330, dans le cadre d'un Biovecteur Supramoléculaire possédant un tropisme sélectif pour un type de cellule, et présentant donc la structure particulière suivante :
- un noyau hydrophile non liquide,
- une première couche de nature lipidique liée au noyau par des liaisons covalentes,
- une seconde couche de phospholipides liée à la première couche par des interactions hydrophobes,
- des molécules d' apolipoprotéine B greffées sur la couche de phospholipides ou de ligands protéiques ou peptidiques capables de reconnaître spécifiquement les récepteurs cellulaires des LDL.
La possibilité de l'association d'un Biovecteur Supramoléculaire avec des oligonucleotides a également été présentée par les Inventeurs lors du "21st International Symposium on Controlled release of Bioactive Materials", qui s'est tenu du 27 au 30 Juin 1994 à Nice (France) . Lors de cette présentation, il a été proposé d'utiliser des Biovecteurs Supramoléculaires pour augmenter l'efficacité thérapeutique d' oligonucleotides non modifiés. Les Biovecteurs Supramoléculaires envisagés étaient du type décrit dans la demande de brevet internationale PCT WO 92 21 329 c'est à dire constitués d'un noyau de polysaccharides réticulés par 1 ' épichlorhydrine, fonctionnalisé par du chlorure de glycidyltriméthylammonium afin de faire apparaître des charges positives, et recouvert d'une première couche d'acides gras et d'une seconde couche lipidique. Il était proposé d'associer les noyaux acylés aux oligonucleotides par simple mélange en milieu aqueux, puis de réaliser la couche externe lipidique par mélange des noyaux acétylés associés aux oligonucleotides avec une solution de lipide.
Les travaux de recherche menés par la Demanderesse depuis ce symposium, lui ont permis de mettre en évidence, comme indiqué dans les exemples rapportés ci-après, que l'efficacité d'une association d'un Biovecteur Supramoléculaire et d' oligonucleotides ne relevait pas d'une simple incorporation des oligonucleotides dans le Biovecteur Supramoléculaire, mais nécessite la formation d'un conjugué ionique qui doit être stable dans un milieu biologique présentant les caractéristiques ioniques du plasma sanguin, et permettre le transport, la protection et l'adressage d' oligonucleotides, antisens ou ou ribozymes, dans les cellules et avantageusement dans leur cytoplasme. En outre, il s'agit de préparer des conjugués dont le taux d'association d' oligonucleotides est maximal afin d'assurer l'efficacité optimale de l'effet désiré.
Or, un tel conjugué ionique stable établi entre, d'une part les charges positives du noyau et, d'autre part, des oligonucleotides polyanioniques, ne peut être obtenu que si le taux de réticulation de la matrice et le niveau de charges positives du noyau sont rigoureusement définis.
Les travaux ayant conduit à la présente invention ont été réalisés grâce aux connaissances de la Demanderesse sur les procédés de fabrication des Biovecteurs Supramoléculaires, qui lui ont permis d'étudier les possibilités de modulation du degré de réticulation de la matrice polysaccharidique et d'ajustements du niveau de charges cationiques du noyau. L ' invention a donc pour but de fournir de nouveaux moyens de transport, de protection et d'adressage d' oligonucleotides dans les cellules, notamment à des fins thérapeutiques. Ce but est atteint grâce à un nouveau conjugué ionique, stable dans un milieu biologique, d'un vecteur particulaire comportant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique et d' oligonucleotides polyanioniques, permettant de transporter dans les cellules et de protéger lesdits oligonucleotides capables de s'hybrider avec un ARNm cellulaire.
L'invention se rapporte plus particulièrement à un conjugué d'un vecteur particulaire et d'oligonucleotides, caractérisé en ce que le vecteur particulaire comprend au moins un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés et modifiés par des ligands cationiques, dont le taux de charges positives est compris entre environ 0,6 et 1,8 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau et le taux de réticulation est sensiblement celui obtenu par réticulation avec entre 5 et 20% de mole d ' épichlorhydrine par mole d'osé dans les polysaccharides ou oligosaccharides, et en ce que ledit vecteur particulaire est conjugué par des liaisons ioniques stables en milieu biologique à des oligonucleotides polyanioniques protégés par ledit vecteur particulaire, lesdits oligonucleotides étant capables de s'hybrider à un ARNm cellulaire. Les résultats rapportés dans les exemples ci-après montrent les propriétés remarquables des conjugués selon l'invention. Plus particulièrement, il a été observé que : - la quantité d 'oligonucleotides conjuguée au vecteur particulaire est au moins égale et souvent très supérieure à celle possible avec les systèmes de simple transport de l'art antérieur; en effet, de l'ordre de 1000 copies d'un oligonucleotide peuvent être conjuguées au vecteur particulaire; la demi-vie d' oligonucleotides dans le conjugué de l'invention est augmentée d'environ 8 fois par rapport à celle d' oligonucleotides libres;
1 ' internalisation des conjugués de l'invention dans les cellules permet d'augmenter d'environ 30 fois la quantité d' oligonucleotides passant la membrane cellulaire en 5 heures, et d'environ 10 fois la quantité d'oligonucleotides dans le cytosol desdites cellules . Les travaux réalisés par la Demanderesse sur les vecteurs particulaires et la préparation du conjugué de l'invention, ont permis d'obtenir, de manière surprenante par rapport aux spéculations de 1 ' art antérieur, des taux et des rendements d'association optimaux, puisque la Demanderesse est parvenue, dans des conditions optimales, à conjuguer 100% des oligonucleotides mélangés aux vecteurs particulaires. Ces conditions optimales sont de l'ordre de 0 à 0,3 g d' oligonucleotides par gramme de vecteurs.
Le vecteur particulaire du conjugué de l'invention comporte au moins un noyau hydrophile non liquide, dont la taille est généralement comprise entre 10 nm et 5 μm et qui est constitué, de préférence, d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulé portant une charge globale cationique.
Les polysaccharides de la matrice sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.
Une caractéristique essentielle du noyau, adaptée à la formation de conjugués avec des oligonucleotides, réside dans le taux de réticulation de la matrice. Ce taux de réticulation est défini par référence à la capacité de réticulation d'une quantité définie d' épichlorhydrine, qui est un agent de réticulation bien connu et décrit dans les demandes de brevet de la Demanderesse citées précédemment. Le taux de réticulation de la matrice permettant la réalisation des conjugués de l'invention est obtenu par réaction avec entre 5 et 20% de mole d ' épichlorhydrine par mole d'osé dans les polysaccharides ou oligosaccharides constituant la matrice du noyau. Ce niveau de réticulation est déterminant pour assurer la stabilité du conjugué de l'invention dans les liquides biologiques du type du plasma sanguin. Or, sans cette stabilité, l'efficacité in vivo et in vi tro des conjugués de l'invention pour transporter et adresser les oligonucleotides dans les cellules cibles serait considérablement diminuée.
Une autre caractéristique essentielle de la matrice hydrophile du noyau est d'être ionisée positivement. Cette ionisation cationique est obtenue par greffage, sur la matrice hydrophile, de ligands portant des fonctions chargées positivement.
Le taux de charges positives du noyau constitue, comme le taux de réticulation de la matrice hydrophile, une caractéristique essentielle du conjugué dont dépend son efficacité. Le caractère cationique du noyau est en effet indispensable à la formation du conjugué ionique de l'invention avec des oligonucleotides polyanioniques. Mais ce caractère cationique doit être rigoureusement défini de façon à assurer la fonctionalité du conjugué dans une stratégie thérapeutique. Ainsi, les travaux de recherche menés par la Demanderesse ont établi que le noyau doit posséder entre 0,6 à 1,8 milliEquivalent et de préférence de 0,8 à 1,6 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau pour assurer un niveau de conjugaison efficace avec les oligonucleotides.
Les taux de réticulation et de charges positives du noyau définis ci-dessus sont déterminants pour obtenir la conjugaison maximale entre le vecteur et les oligonucleotides, et assurer la stabilité et la faible toxicité des conjugués de l'invention.
Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles . Avantageusement ces composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs . L'invention envisage plus particulièrement, des vecteurs particulaires dont le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche externe constituée :
- essentiellement de phospholipides naturels ou synthétiques et/ou de céramides, éventuellement associés à d'autres composés amphiphiles, ou - d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes .
Une autre forme de réalisation d'un conjugué de l'invention consiste à utiliser des Biovecteurs du type décrit dans le brevet européen No. 344 040, c'est à dire comportant un noyau central précédemment défini, recouvert en totalité ou en partie de deux couches de composés amphiphiles. Les composés amphiphiles sont ceux décrits précédemment. Dans cette forme de réalisation, on préfère plus particulièrement le cas d'un noyau central recouvert en totalité ou en partie d'une première couche d'acides gras, elle-même recouverte en totalité ou en partie d'un couche lipidique.
La mise en oeuvre de vecteurs particulaires comportant au moins une couche amphiphile permet avantageusement d'associer au conjugué de l'invention un principe actif supplémentaire utile pour le transport, l'adressage ou la présentation du conjugué au niveau de la membrane de la cellule, dans le cytoplasme ou lors de l'hybridation avec un ARNm cible. Mais l'association d'un principe actif supplémentaire peut être également réalisée au niveau du noyau du vecteur particulaire du conjugué .
Les oligonucleotides conjugués au vecteur particulaire de 1 ' invention sont des oligodésoxyribonucléotides ou oligoribonucléotides naturels ou modifiés, éventuellement marqués, comportant de l'ordre de 5 bases jusqu'à une centaine de bases. De tels marquage (s) et/ou modification (s) sont acceptable dans le cadre de l'invention, s'ils ne changent pas substantiellement le caratère polyanionionique de 1 'oligonucleotide. Les oligonucleotides conjugués au vecteur particulaire de 1 ' invention couvrent également les antisens et les ribozymes . Le vecteur particulaire selon l'invention peut être conjugué à plusieurs dizaines jusqu'à de l'ordre de 1000 copies d'un même oligonucleotide, ou être conjugué à plusieurs oligonucleotides de séquences différentes, et dans ce cas, chaque oligonucleotide de séquence différente doit être présent à environ de l'ordre de 100 copies. L'invention se rapporte aussi à des compositions pharmaceutiques comprenant un ou plusieur conjugués selon l'invention ou leurs sels pharmaceutiquement acceptables, dispersés dans des excipients pharmaceutiquement acceptables . Ces compositions pharmaceutiques peuvent être par exemple administrées par voie systémique ou encore être appliquées localement, les excipients ou véhicules utilisés sont choisis pour être compatibles avec le mode d'administration ou d'application retenu.
L'invention concerne également le conjugué défini précédemment destiné à être utilisé pour adresser un oligonucleotide dans une cellules et notamment dans le cytoplasme.
L'invention a en outre pour objet les vecteurs particulaires mis en oeuvre dans les conjugués décrits précédemment. Ces vecteurs particulaires sont du type comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés portant une charge globale cationique et présentant au moins une des caractéristiques suivantes : - le taux de réticulation est sensiblement celui obtenu par réticulation avec entre 5 et 20% de mole d' épichlorhydrine par mole d'osé dans les polysaccharides ou oligosaccharides; ladite matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés est modifiée par des ligands cationiques, dont le taux de charges positives est compris entre 0,6 et 1,8 milliEquivalents et avantageusement entre 0,8 et 1,6 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau . Selon une forme de réalisation particulière du vecteur particulaire de l'invention, le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles. Avantageusement ces composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs . L'invention envisage plus particulièrement, des vecteurs particulaires dont le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche externe constituée :
- essentiellement de phospholipides naturels ou synthétiques et/ou de céramides, éventuellement associés à d'autres composés amphiphiles, ou
- d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes.
Les résultats rapportés dans les exemples ci-après, montre qu'un vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique, est avantageusement utilisable pour adresser des oligonucleotides au cytoplasme d'une cellule.
Comme indiqué précédemment, les oligonucleotides adressées dans le cytoplasme d'une cellule sont des oligoribonucléotides ou oligodésoxyribonucléotides, antisens ou ribozymes, éventuellement marqués, naturels ou modifiés dès lors que le marquage ou la modification ne change pas substantiellement le caratère polyanionique des oligonucleotides .
L ' invention concerne également les procédés de préparation des conjugués ioniques définis précédemment. En effet, les procédés décrits dans l'art antérieur ne permettent pas d'obtenir des conjugués présentant toutes les propriétés requises pour une stratégie antisens ou ribozyme. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur la préparation de conjugués lui ont permis de définir des procédés permettant d'obtenir de façon reproductible des conjugués fonctionnels.
Un tel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la préparation du noyau cationique : - en mélangeant un polymère hydrophile, de nature polysaccharidique ou oligosaccharidique, chimiquement ou naturellement réticulé avec un agent de réticulation dans un rapport compris entre 0,06 et 0,2 mole, et de préférence entre 0,1 et 0,15 mole, d'agent de réticulation par unité d'osé dans le polysaccharide ou 1 ' oligosaccharide,
- en ajoutant au mélange ci-dessus un ligand cationique de façon à obtenir un taux de charge du noyau compris entre 0,6 et 1,8 et de préférence entre 0,8 et 1,6 millEquivalent par gramme de noyau; b) le chargement des oligonucleotides polyanioniques : en ajoutant, sous agitation, au noyau préparé à l'étape (a), entre environ 0,02 et 0,4 gramme, et de préférence entre 0,05 et 0,2 gramme, d' oligonucleotide par gramme de noyau, selon un débit compris entre environ 0,25 μg d' oligonucleotide par mg de noyau et par heure et 6mg par mg de noyau et par heure, et de préférence entre 4 μg/mg/heure et 1 mg/mg/heure, à une température comprise entre environ 20°C et 60°C et de préférence entre 40°C et 50°C.
Selon le type de vecteur particulaire entrant dans la composition du conjugué de l'invention, le procédé ci-dessus peut comprendre des aménagements à 1 ' étape (a) . Pour la préparation de vecteur particulaire dont le noyau est recouvert en totalité ou en partie d'une ou deux couches de composés amphiphiles, l'étape (a) comprend en outre, le greffage sur le noyau ou la couche sous-jacente d'une couche constituée de composés amphiphiles .
Il peut s'agir du greffage :
- d'une couche d'acides gras, liée au noyau par des liaisons covalentes, et/ou - d'un feuillet externe capable de modifier le comportement cellulaire du conjugué de l'invention, constitué, par exemple de phospholipides zwitterioniques associés ou non à des lipides anioniques et/ou cationiques, lié à la couche sous-jacente ou au noyau par des liaisons hydrophobes et/ou ioniques et/ou hydrogènes .
Une forme de mise en oeuvre préférée de l'étape (b) du procédé de l'invention consiste à ajouter à des vecteurs particulaires préparés conformément à l'étape (a), dont la concentration exprimée en noyau cationique est comprise entre 1 et 20 mg/ml, une solution d' oligonucleotides à une concentration comprise entre 1 et 20 mg/ml, de façon à obtenir un rapport oligonucleotides/vecteurs particulaires compris entre 2 et 40%, et de préférence entre 5 et 20%, selon une cinétique d'ajout de la solution d' oligonucleotides comprise entre 5 μl/ml/h et 300 μl/ml/h, et à une température d'incubation comprise entre 20°C et 60°C, et préférentiellement entre 40°C et 50°C,
D'autres avantages et caractéristiques de 1 ' invention apparaîtont des exemples qui suivent qui concernent la préparation et l'utilisation des vecteurs particulaires et des conjugués de l'invention et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente l'effet de la densité de charge sur la cytotoxicité des NPS cationiques. Des NPS cationiques possédant différentes densités de charges sont incubés avec des cellules HL60. Après 72 heures d'incubation la viabilité cellulaire est déterminée par un test au MTT.
- La figure 2 représente l'effet du taux de réticulation (rapport épichlorhydrine/unités ose) sur la cytotoxicité des NPS cationiques. Des NPS cationiques (1,4 mEq/g) possédant différents taux de réticulation sont incubés avec des cellules HL60. Après 72 heures d'incubation la viabilité cellulaire est déterminée par un test au MTT.
La figure 3 représente l'effet de la réticulation sur les caractéristiques des conjugués Antisens Biovecteur. Des NPS cationiques (1,4 mEq/g) possédant différents taux de réticulation sont conjugués à des Antisens. Après conjugaison les rendements d'association ( M ) et la stabilité en PBS (phosphate Buffered Saline) ( -m. ) sont déterminés en fonction du taux de réticulation de NPS.
- La figure 4 représente les cinétiques de dégradation des oligonucleotides dans différents milieux. Des oligonucleotides libres (symboles vide) ou conjugués au biovecteurs (symboles pleins) sont incubés dans du milieu de culture complémenté en sérum
( \m .\—I ) / milieux de culture complémenté en sérum inactivé ( Aî Δ) et en plasma humain ( Φ >0 ) . Après incubation, les échantillons sont analysés par électrophorèse (20% PAGE) et autoradiographie. La quantité d' oligonucleotides non dégradés est exprimée en pourcentage du témoin (TO).
- La figure 5 représente la cinétique de pénétration des oligonucleotides dans les cellules. Des cellules MCF7 sont incubées avec des oligonucleotides libres ( β>LJ )ou conjugués aux biovecteurs ( -*- > Δ ) . Deux concentrations différentes d' oligonucleotide sont utilisées, 0,8 μg/ml ( d;A) et 6,2 μg/ml ( ;L_ ). Après différents temps d'incubation, la pénétration cellulaire des oligonucleotides étaient déterminée par cytometrie en flux.
La figure 6 représente l'activité cellulaire des conjugués Antisens biovecteurs. Des oligonucleotides Antisens ciblant 1 ' oncogéne c-myc (15 mers phosphorothioate) sont conjugués à des biovecteurs. Ces oligonucleotides libres ou conjugués aux biovecteurs ainsi que les biovecteurs libres sont incubés avec 5 x 10^ cellules HL60. A différents temps d'incubation, la prolifération cellulaire est déterminée par un test MTT. Les résultats sont exprimés en Densité Optique à 570 nm.
La figure 7 représente l'activité cellulaire des conjugués Ribozymes/Biovecteurs . Des oligonucleotides Ribozymes ciblant 1 Oncogéne c-myb (35 mers) sont conjugués à des biovecteurs ou à de la Lipofectamine. Ces Ribozymes libres ou conjugués (figure 7a) , ainsi que différents contrôles, conjugués Biovecteurs Ribozyme inactif, conjugués Biovecteurs Scrambled Ribozyme, conjugué Ribozyme inactif lipofectamine et biovecteur libre (figure 7b) , sont incubés avec 2 x 10^ cellules. Les résultats sont exprimés en pourcentage de prolifération cellulaire par rapport au contrôle (cellules non traitées)
La figure 8 représente l'inhibition spécifique de la synthèse d'une protéine par un antisens phosphorothioate (ODM-PO) ou phosphodiester (ODM-PD) conjugué aux biovecteurs. L'inhibition de la production de Pl85-erb2 est mesurée après incubation de cellules SK-Br3 avec différentes préparations d' oligonucleotides . Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport au contrôle (cellules non traitées) . Dans cette figure les abréviations des différentes préparations d' oligonucleotides ont les significations suivantes : SMBV = Biovecteur vide ; SMBV-AS = Conjugué Biovecteur antisens ; SMBV-SC = Conjugué Biovecteur "scramble" ; DOTAP = DOTAP seul ; DOTAP-AS = Conjugué antisens Biovecteur ; DOTAP-SC = Conjugué DOTAP "scramble" ; Control = Cellules seules ; Control-AS = Antisens libres ; Control-SC = "Scramble" libre. - La figure 9 représente l'inhibition de la prolifération d'une lignée SK-Br3 par des conjugués biovecteurs Antisens anti erb2. La prolifération de cellules SK-Br3 est déterminée après incubation des cellules avec un antisens anti erb2 conjugué des biovecteurs. Les résultats sont exprimés en nombre de cellules en fonction du temps . Le contrôle correspond à des cellules traitées en absence d' oligonucleotide et de biovecteur.
Exemple 1 : Préparation de Noyaux
Polvsaccharidiαues Cationiques possédant différents taux de charge .
Dans un réacteur de 3 litres, on solubilise 100g de Glucidex 2 (Roquette, France) dans 0.2 litres de NaOH 2N. Lorsque la solution est homogène, on introduit l'agent de réticulation, épichlorhydrine (Fluka, Suisse) , avec un rapport molaire (mole d'epichlorhydrine/mole d'unité glucose) de 10%. Après la fin de l'addition, la préparation est maintenue sous agitation pendant 12 heures à 20°C. On ajoute ensuite le Glycidyl Triméthylammonium Chloride (GTMA, Fluka, Suisse) . De façon à obtenir différents taux de charge, plusieurs rapports molaires GTMA/ unité glucose sont utilisés (Table 1) . Lorsque tout le GTMA est ajouté, on laisse la préparation sous agitation pendant 8 heures à 20°C. Le gel ionique obtenu est ensuite dispersé dans 2 litres d'eau osmosée, neutralisé avec de l'acide acétique et homogénéisé par un homogénéisateur Rannie (type Minilab 8:30) à une pression de 1000 bars.
Les Noyaux Polysaccharidiques (NPS) ainsi obtenus sont ultrafiltrés sur une membrane de 30 Kd (Incelltech, France) et filtrés sur une cartouche 0.45 um (Millipore, France).
Dans le tableau 1 ci-dessous, le taux de charge des NPS obtenus est déterminé par analyse élémentaire du taux d'azote présent dans le gel.
Tableau 1
Ainsi en modulant le rapport initial GTMA/unité glucose il est possible de moduler la densité de charge des NPS cationiques .
Ces travaux et ceux réalisés sur d'autres polysaccharides, ont permis de démontrer qu'il est possible de modifier la densité de charge des NPS dans une gamme de 0 à 2 mEq/g correspondant à un rapport GTMA/unité glucose de 0 à 70%. Pour la synthèse des conjugués de l'invention, il est nécessaire que la charge soit comprise entre 0.6 et 1,8 mEq/g et de façon préférentielle entre 0,8 et 1,6 mEq/g.
Exemple 2 Préparation de Noyaux
Polysaccharidiques Cationiques possédant différent taux de réticulation.
Le tableau 2 ci-dessous rapporte les différents NPS cationiques préparés selon l'exemple 1 avec des rapports molaires epichlorhydrine/unité glucose variable et un rapport GTMA/unité glucose constant (50%) permettant d'obtenir une charge de 1,4 mEq/g de gel. Tableau 2
Ces travaux et ceux réalisés sur d'autres polysaccharides, ont permis de démontrer que les rapports utilisables sont compris entre 0 et 20% correspondant à la modification d'une unité glucose sur cinq. Pour la préparation des conjugués de l'invention le rapport est compris entre 6 et 20%, et préférentiellement entre 10 et 15%.
Exemple 3 Préparation de Biovecteur
Supramoléculaire dit "SMBV-liqht" .
La préparation des biovecteurs se déroule en deux étapes principales : (1) la synthèse des Noyaux polysaccharidiques (NPS) cationiques, (2) l'association de lipides aux NPS, dite synthèse des biovecteurs (type light) .
(1) Synthèse des NPS cationiques .
500 g de maltodextrines Glucidex (ROQUETTE) sont solubilisés avec 0.880 litres d'eau dans un réacteur thermostaté à 20°C sous agitation. Puis, l'on introduit environ 7 g de NaBH et on laisse 1 heure sous agitation.
220 ml de NaOH 10M sont rajoutés puis 30,25 ml d ' épichlorydrine (Fluka). Après 12 heures de réaction, 382,3 g de glycidyltriméthylammonium chloride (Fluka) sont introduits et le mélange est maintenu sous agitation durant 10 heures.
Le gel est dilué avec 8 litres d'eau déminéralisée et neutralisé à l'acide acétique glacial. L'hydrogel obtenu est broyé par l'intermédiaire d'un homogénéisateur à haute pression (RANNIE Lab) . La pression exercée est de 400 bars. A l'issue de cette étape, les matrices dispersées ont un diamètre moyen de 60 nm. La purification s'opère par des étapes successives de :
- microfiltration 0,45 μm pour éliminer les particules de taille trop importante, et diafiltration à volume constant pour éliminer les petites molécules (sels, fragments polysaccharidiques) .
Enfin, les NPS sont concentrés, récupérés dans des flacons stériles et conservés à -20°C.
(2 ) Synthèse des biovecteurs .
Les noyaux polysaccharidiques cationiques décongelés sont dilués avec de 1 ' eau osmosée dans un réceptacle en verre dans la proportion de lmg de NPS /lml d'eau. La dispersion est placée dans un premier temps sous agitation magnétique (5-10 minutes) puis homogénéisée (RANNIE Minilab) à 400 bars durant 3 minutes. La dispersion de NPS est placée dans un bain- marie à 80°C.
Les lipides (exemple : mélange de lécithine de jaune d' oeuf/cholestérol) , sous forme de poudre, sont pesés de telle sorte que la masse totale représente, par exemple 20% ( /w) de la masse des NPS. Les lipides constitutifs de la membrane sont mélangés et solubilisés avec 2 ml d'éthanol 95% (v/v) . Les lipides chargés représentent, par exemple, 5 % (w/w) des lipides totaux.
L'homogénéisateur, est amené à une température de 60°C minimum par circulation d'eau en circuit fermé.
Concomitamment, les NPS dispersés à 80°C sont soumis à une agitation magnétique et la solution éthanolique de lipide est injectée dans la dispersion de NPS. L'eau de chauffage de circuit du l'homogénéisateur est évacuée et remplacée par la dispersion "NPS/lipides" à 80°C. Cette nouvelle dispersion est homogénéisée à 450 bars pendant 25 minutes en circuit fermé à 60°C minimum. A l'issue de cette étape, la préparation est introduite dans un ballon en verre puis soumise à basse pression à 60°C pour éliminer 1 ' éthanol resté en solution. SI nécessaire, les biovecteurs obtenus peuvent être concentrés par ultrafiltration, lyophilisation ou évaporation.
Les biovecteurs cationiques ainsi obtenus sont alors entreposés dans des conditions stériles après filtration sur 0,2 μm.
Exemple 4 : Préparation de Biovecteur
Supramoléculaire dit "SMBV-complet" .
La préparation d'un SMBV-complet est celle décrite dans la demande de brevet européen No. 344 040, avec lécithine de jaune d'oeuf /cholestérol (80/20 p/p)- rapport Lipide/NPS 100%.
Dans ce mode de réalisation, on prépare les Biovecteurs Supramoléculaires dit "NPS" de l'exemple 3, que l'on soumet à une étape d'acylation pour obtenir des NPS acylés . Après phospholipidation, on obtient les SMBV-complets .
Exemple 5 : Cytotoxicité des Noyaux Polysaccharidiques cationiques .
Protocole.
Différentes suspensions de NPS cationiques sont diluées dans un milieu de culture cellulaire (RPMI 1640, Gilco, France). Les suspensions obtenues sont alors mixées avec un volume équivalent de suspension cellulaire (lOOμL de Cellule HL60 à 5 104 Cellules/ml) . Les suspensions cellulaires ainsi préparées sont incubées 72 heures à 37°C dans un incubateur avec 5% de C02.
Après incubation, les cellules sont lavées en PBS (lOmM Na2HP04/NaH2P04, 130 mM NaCl, 2 mM KC1, pH
7,4) et la viabilité cellulaire est déterminée par un test au MTT.
Chaque résultat est la moyenne de 2 expériences indépendantes effectuées sur six points d' expérimentation .
a) Effet de la charge des Novaux
Polysaccharidiques .
Les NPS de l'exemple 1 (rapport initial Epichlorhydrine/unité glucose de 10%) ont été utilisés pour montrer l'effet de charge sur la Cytotoxicité des NPS cationiques .
La figure 1 montre les courbes de réponse obtenues sur la lignée HL60 et pour des densités de charge comprise entre 0,8 et 1,4 mEq/g. Il apparaît que la toxicité cellulaire des NPS est observée pour des concentrations comprises entre 10 et 150 μg/ml (IC20 après 3 jours d'incubation,). Cependant, celle ci peut être modulée par la densité de charges cationiques des NPS.
b) Effet du taux de réticulation.
La figure 2 donne les courbes de cytotoxicité obtenues avec les cellules HL60 et les NPS cationiques de l'exem le 2. Pour cette densité de charge (1,4 mEq/g) et pour des taux de réticulation variant de 0 à 16,7%, la toxicité cellulaire est observée pour des concentrations allant de 10a 150 μg/ml (IC20) . De même que pour l'effet de charge, la réticulation apparaît comme un paramètre important de la toxicité cellulaire des NPS cationiques .
c) Effet synergique de la Charge et du Taux de réticulation.
Le tableau 3 ci-dessous résume les résultats de Cytotoxicité observés sur lignée HL60 après 72 heures d'incubation pour différents NPS cationiques qui différent par leur densité de charge et leur taux de réticulation. Les résultats sont exprimés en IC20, concentration de NPS qui inhibe 20% de la prolifération cellulaire 72 heures après incubation.
Tableau 3
(*rapport initial épichlorhydrine/unité glucose) et différentes charges des NPS cationiques.
Ces résultats indiquent qu'il existe un effet synergique entre Cytotoxicité induite par la densité de charge et par le taux de réticulation des NPS cationiques. Ainsi, il est possible de moduler la toxicité cellulaire des NPS cationiques en modulant les conditions de synthèse de ces NPS.
Pour la préparation des conjugés oligonucleotides/biovecteurs, la recherche d'une toxicité minimale et d'un rendement maximal d'association doit conduire à l'obtention d'un compromis. Celui-ci, peut-être réalisé pour des charge comprises être 0.8 et 1.6 mEq/g et des taux de réticualtion de 10 à 15%.
Exemple 6 : Chargement d' Oligonucleotide dans des NPS cationiques .
Méthodes .
Une solution d' oligonucleotide (antisens de 15 mer) à 2,5 mg/ml en eau est lentement ajoutée (5μl/ml toutes les heures) à une solution de NPS cationiques à 1 mg/ml maintenue à 45°C sous agitation magnétique. Ainsi, le rapport Oligonucléotide/NPS est de 5% (p/p) . Après le dernier ajout d' oligonucleotide la préparation est incubée 1 heure sous agitation magnétique à 45°C.
La concentration en oligonucleotides libres est déterminée par spectrophotométrie après ultrafiltration des préparations. De même, afin de déterminer la stabilité du complexe vis à vis de la force ionique, la préparation est incubée en PBS (10 mM NaH2P04/Na2HPθ4, NaCl 130 mM, KC1 2 mM, pH 7.4). Après cette incubation ( 30 min. à 37°C) , les oligonucleotides libres et associés au NPS sont séparés par ultrafiltration et la concentration est déterminée par spectrophotométrie. a) Effet de la charge des NPS cationiques.
La table 4 ci-dessous résume les résultats d'association obtenus pour différentes charges des NPS cationiques (0,6; 0,9 et 1,6 mEq/g) et montre l'influence de charge des NPS cationiques sur les rendements d'association et la stabilité en PBS des complexes oligonucléotide-NPS.
Tableau 4
Les résultats obtenus indiquent qu'il existe une relation étroite entre la charge des NPS et la qualité des conjugués NPS-oligonucléotide mesurée par les rendements d'association et leurs stabilités après incubation en PBS.
b) Effet du taux de réticulation.
La figure 3 donne les résultats obtenus lorsque les NPS de l'exemple 2 sont utilisés dans le protocole d'association.
Ces résultats indiquent que pour la charge utilisée, 1,4 mEq/g, le taux de réticulation a peu d'influence sur les rendements d'association. A l'inverse l'augmentation du rapport épichlorhydrine/ unité de glucose permet d'améliorer progressivement la stabilité du complexe après incubation en PBS.
Ainsi, la synthèse du NPS optimal pour la formation des conjugués doit correspondre à un compromis entre la densité de charge du NPS et la réticulation du polysaccharide afin de maximaliser les qualités du conjugué oligonucleotide-biovecteur et à minimaliser la toxicité cellulaire de ceux-ci.
Exemple 7 : Obtention d'un protocole non- agrégatif lors de la préparation des conjugués oligonucleotide-biovecteurs .
Des biovecteurs préparés comme dans l'exemple 4 sont conjugués à des oligonucleotides (antisens de 18 -mères) en utilisant le protocole décrit dans l'exemple 6 avec un rapport Oligonucléotide/NPS de 10%. Cependant l'apport d'énergie est effectué suivant deux méthodes :
Méthode 1 : Les oligonucleotides sont ajoutés à température ambiante dans un bain à ultrasons.
Méthode 2 : L'ajout des oligonucleotides est effectué sous agitation magnétique à 45°C.
La méthode 1 aboutit à une agrégation des Biovecteurs, indiquant que les ultrasons ne sont pas suffisants pour dissocier les agrégats Biovecteurs/ oligonucleotide. A l'inverse, la méthode 2 aboutit à un protocole de conjugaison non-agrégatif permettant d'obtenir des suspensions homogènes.
Exemple 8 : Préparation d'un conjugué d'oliqonucléotide et de Biovecteur
La tableau 5 ci-dessous donne les caractéristiques des conjugués Oligonucléotide- Biovecteur obtenus en utilisant un oligonucleotide antisens [OligoDeoxyNucléotide (ODN) de 15 -mères] ou un Ribozyme (OligoRiboNucléotide (ORN) de 35 -mères) , et les biovecteurs décrits à l'exemple 3 dont les NPS possèdent des caractéristiques définies (par exemple une charge de 0,8 mEq/g et un taux de réticulation de 12,5 %) . Le protocole d'association utilisé correspond au protocole de l'exemple 6. Cependant, la solution d' oligonucleotide est ajoutée à raison de lOμl/ml, toutes les heures pour 4 heures d'incubation. Ainsi, le rapport oligonucléotide/NPS est maintenu à 10%.
Tableau 5
Les résultats montrent que la nature des oligonucleotides, en particulier leur taille (nombre de mères) et leur structure (antisens versus Ribozyme) , a peu d'influence sur les caractéristiques des conjugués oligonucléotides-biovecteurs . De plus, ces résultats confirment que le protocole d'association utilisé, qui est un protocole non-agrégatif, permet d'obtenir des conjugués stérilisables par filtration sur membrane 0, 2 μm.
Ainsi dans un protocole de conjugaison utilisant : des biovecteurs à une concentration exprimée en NPS cationique comprise entre 1 et 20 mg/ml, des oligonucleotides (par exemple des oligonucleotides antisens ou des ribozymes) à une concentration comprise entre 1 et 20 mg/ml,
- un rapport oligonucléotide/NPS cationique compris entre 2 et 40%, et préférentiellement entre 5 et 20%, une cinétique d'ajout de la solution d' oligonucleotide comprise entre 5 μl/ml/h et 300 μl/ml/h, une température d'incubation comprise entre 20°C et 60°C, et préférentiellement entre 40°C et 50°C, on obtient des conjugués de l'invention dont les caractéristiques fonctionnelles sont remarquables.
Exemple 9 : Protection des oligonucleotides après conjugaison avec les biovecteurs
Des oligonucleotides (phosphodiester, 15 mères, Genset, France) sont marqués au phosphore 32 par la méthode suivante : marquage de l'extrémité 5' avec de l'ATP-[g P] par la T4 polynucléotide kinase (Boehringher Mannheim, France) , suivi d'une purification sur colonne d'exclusion.
Ces oligonucleotides libres ou conjugués avec des Biovecteurs (rapport Oligonucleotide/ NPS 10%) sont incubés à une concentration de 6,25 μg/ml dans différents milieux :
- RPMI 1640 + 10% de Sérum de veau foetal
- RPMI 1640 + 10% de sérum de veau foetal inactivé (Contrôle négatif)
- Plasma humain A différents temps, les échantillons sont prélevés, chauffés à 65°C pour détruire les activités nucléasiques, et conservés à 4°C jusqu'à l'analyse. Les échantillons sont analysés par electrophorèse sur gel acrylamide (20%) . Les gels sont autoradiographiés et quantifiés sur Kodak DSC 200 système.
La figure 4 montre que la conjugaison des oligonucleotides aux Biovecteurs permet d'obtenir une protection efficace contre les nucléases. En effet, les oligonucleotides libres sont rapidement dégradés dans les milieux contenant du sérum actif. Ainsi, dans ces milieux la dégradation de 1 'oligonucleotide libre est totale après 45 minutes d'incubation. A l'inverse après conjugaison aux biovecteurs, la dégradation complète des oligonucleotides est obtenue après 6 à 8 heures d'incubation. Le même type de profil peut être obtenu après incubation dans du plasma humain, le temps de demie-vie passant de 120 min. à 225 min. , respectivement pour l' oligonucleotide libre et conjugué aux Biovecteurs.
Exemple 10 : Pénétration cellulaire des conjugués oligonucléotides/Biovecteurs . Protocole . Des conjugués Biovecteurs/oligonucleotides sont préparés avec un Oligonucleotide marqué à la fluorescéine (phosphodiester, 18 mères, Genset, France). Les oligonucleotides, soit libres, soit conjugués aux biovecteurs sont incubés avec 2 10 cellules MCF7 (carcinome mammaire humain) à la concentration de 0.78 et 6.25 μg/ml.
Après incubation des cellules à 37°C, celles-ci sont collectées par trypsinisation et lavées en PBS. Les cellules sont alors incubées pour 40 min. en monensine (20μm) et analysées par cytometrie en flux possédant un laser d'excitation à 488 nm et un filtre d'émission à 530 nm (Becton Dickinson, France). Les résultats sont exprimés en unité arbitraire de
4 fluorescence obtenue pour 10 cellules vivantes. La figure 5 donne les résultats obtenus et montre la capacité des Biovecteurs à augmenter la pénétration cellulaire des oligonucleotides. En particulier, de façon attendue, la pénétration cellulaire des oligonucleotides est extrêmement faible. A l'inverse, une pénétration cellulaire efficace de 1 'oligonucleotide peut être obtenue après conjugaison au Biovecteur. Cette pénétration est liée à la concentration en conjugué oligonucléotide-Biovecteur et au temps d'incubation du conjugué et des cellules. L'association de ces propriétés du conjugué
Oligonucleotide-biovecteur, stabilisation de 1 'oligonucleotide face à l'action des nucléases et pénétration cellulaire, est certainement le point important pour l'amélioration de l'activité biologique des oligonucleotides dans les stratégie antisens et ribozymes .
Exemple 11 : Activité des conjugués
Antisens-Biovecteur sur lignée HL60
Des biovecteurs sont préparés selon le protocole décrit à l'exem le 3 dont les NPS possèdent des caractéristiques définies (par exemple une charge de 0,8 mEq/g et un taux de réticulation de 12,5 %) ..
Un antisens ciblant l'ARNm de 1 ' oncogéne c- myc (15 mères phosphorothioate, Lynx Therapeutics , Californie) est conjugué à ces biovecteurs selon le protocole décrit à l'exemple 6, avec un rapport oligonucléotide/NPS de 5%.
Les Biovecteurs non conjugués, 1' oligonucleotide libre ou conjugué aux biovecteurs, sont incubés à 37°C avec 5 10 cellules (lignée HL60) à la concentration de luM dans le milieu de culture (RPMI1640 + 10% de sérum de veau foetal) . A différent temps, les cellules sont prélevées, lavées en PBS et la prolifération cellulaire est déterminée par un test au MTT.
Les résultats rapportés à la figure 6 montrent une nette amélioration de l'activité antisens qui s'exprime par une inhibition de la prolifération cellulaire au cours du temps. Il important de noter que pour la concentration utilisée (1 uM) , 1 ' oligonucleotide libre n'est pas capable d'exprimer cette activité. A l'inverse, les conjugués oligonucleotide-biovecteurs dans les conditions permettent d'inhiber la prolifération cellulaire pendant les cinq jours de 1 ' expérience . L' oligonucleotide utilisé dans ces expériences étant un oligonucleotide phosphorathioate, par nature résistant aux nucléases présentes dans le milieu de culture, cette amélioration de l'activité antisens semble bien être due, à l'augmentation de la concentration cellulaire en oligonucleotides.
Exemple 12 : Activité cellulaire des conjugués Ribozyme Biovecteur. Des biovecteurs sont préparés selon le protocole décrit a l'exemple 3 dont les NPS possèdent des caractéristiques définies (par exemple une charge de 0,8 mEq/g et un taux de réticulation de 12,5 %) .
Des ribozymes ciblant le mRNA de l' oncogéne c-myb (Ribozyme Pharmaceutical Inc., Boulder, Colorado) sont conjugués à ces biovecteurs selon le protocole décrit à l'exemple 6 avec un rapport oligonucléotide/NPS de 5%. De plus, trois contrôles négatifs sont préparés dans les même conditions, un conjugué de Ribozyme inactif, Ribozyme incapable de effectuer la coupure catalytique du mRNA, un conjugué de "scrambled" Ribozyme, Ribozyme incapable de reconnaître la séquence du c-myb, et des biovecteurs vides. Par comparaison à l'art antérieur, les ribozymes actifs et inactifs sont conjugués à de la lipofectamine.
Dans ces expériences, 2.10^ cellules RSMC (rat smooth muscle cell) sont incubées en milieu de culture sans sérum (Optimem) . Après 48 heures d'incubation, 100 μl d'Optimem contenant des concentrations variables de Ribozymes sont ajoutés aux cellules. Après une nouvelle incubation de 24 heures (3 heures pour la lipofectamine) , la prolifération cellulaire est stimulée en plaçant les cellules dans un milieu de culture complémenté avec 10% de sérum de veau foetal. La prolifération cellulaire est déterminée par un test au 5 Bromo deoxy Uridine (BrdU) . Les figures 7a et 7b montrent la courbe de réponse obtenue pour les conjugués Ribozyme-Biovecteurs, des Ribozymes-lipofectamine, ainsi que pour différents contrôles, Biovecteur vide ou conjugué avec des ribozymes inactifs. Dans les même conditions les Ribozymes actifs ou inactifs non conjugués aux biovecteurs ne présentent aucune inhibition de la prolifération cellulaire. Dans les mêmes conditions, la lipofectamine présente une toxicité importante, qui d'une part ne permet pas d'accroître la concentration en ribozymes, et d'autre part rend difficile la comparaison d'activité des ribozymes actifs et inactifs.
Ainsi, les biovecteurs permettent d'augmenter considérablement l'activité biologique des ribozymes, de manière avantageuse par rapport à l'art antérieur.
Exemple 13 : Inhibition spécifique de la synthèse d'une protéine par un antisens conjugué aux biovecteurs .
Des biovecteurs sont préparés selon le protocole décrit à l'exemple 4 dont les NPS possèdent des caractéristiques définies (par exemple une charge de 1,6 mEq/g et un taux de réticulation de 10 %) .. Deux conjugués d' oligonucléotide-biovecteurs sont préparés à partir d'un antisens phosphorothioate ciblant le mRNA du pro-oncogène Erb2 (15 mères, Genset, France) et de la même séquence antisens phosphodiester (15 mères, Genset, France) . Parallèlement, les conjugués témoins, "scrambled" séquence conjuguée aux Biovecteurs, et Biovecteur vides, ont été préparés. Ces différents conjugués sont préparés selon le protocole décrit à l'exemple 6 avec un rapport oligonucléotide/NPS de 10%. Par comparaison, les mêmes antisens sont conjugués à du DOTAP . , . 4
Dans ces expériences, 7.10 cellules SK-Br3
(lignée d'un adénocarcinome humain qui sur-exprime la protéine P185-Erb2) dans 300μl de RPMI 1640 (Gilco,
France) sont incubées en présence des différentes préparations : conjugué oligonucleotide Biovecteur, oligonucleotide libre ou Biovecteur libre. Les incubations sont effectuées à la concentration de
180μg/ml de Biovecteur correspondant à une concentration de 3μM en oligonucleotide. Après 5 heures d'incubation, 1 ml de RPMI 1640 complémenté avec 5% de sérum de veau foetal est ajouté aux suspensions cellulaires et les cellules sont de nouveau incubées à 37°C.
Après 72 heures d'incubation, les cellules sont testées pour la présence de la protéine P185-Erb2. Pour ce test, les cellules sont collectées, lavées en PBS et incubées en présence d'un anticorps anti Erb-2 ( OP39, Oncogéne Science, France). L'analyse des cellules est réalisée au cytometre en flux après révélation par un deuxième anticorps marqué à la fluorescéine. Les résultats obtenus et présentés à la figure 8 montrent l'apport de la conjugaison aux biovecteurs dans l'expression de l'activité biologique d'un antisens. Il est particulièrement notable qu'il n'existe pas de différence significative entre l'activité des antisens phosphodiester et phophorothioate . Cette absence de différence est certainement l'expression de la protection de 1' oligonucleotide après conjugaison aux Biovecteurs. D'autre part, les antisens sont deux fois plus actifs après conjugaison aux Biovecteurs qu'après conjugaison aux lipides cationiques classiquement utilisés (DOTAP) .
Exemple 14 : Activité biologique in-vitro d'un antisens conjugué aux biovecteurs (Modèle Erb-2). Des conjugués oligonucléotides-biovecteurs sont préparés dans les conditions décrites à 1 ' exemple 13 et en utilisant le dérivé phosphorothioate de cet exemple .
Pour ces expériences de prolifération, 5 x 103 cellules SK-Br3 dans 60 μl de RPMI 1640 (Gilco, France) sont incubées en présence des différentes préparations, conjugué d' oligonucleotide phosphorothioate et de biovecteur, d' oligonucleotide phosphorothioate libre ou biovecteur libre. Les incubations sont effectuées à la concentration de 180μg/ml de biovecteur correspondant à une concentration de 3μM en oligonucleotide. Après 5 heures d'incubation, 200μl de RPMI 1640 complémenté avec 5% de sérum de veau foetal sont ajoutés aux suspensions cellulaires et les cellules sont de nouveau incubées à 37°C. A différents temps, 24, 48, 72, 96 et 120 heures, les cellules sont collectées par trypsinisation et comptées sur un compteurs de cellules (Coultronics, France) . Les résultats sont la moyenne de six points expérimentaux. La figure 9 montre la courbe de prolifération des cellules après traitement avec les différentes préparations. Dans ces conditions, 1 ' oligonucleotide libre est incapable d'inhiber la prolifération cellulaire. Il est notable que 1 'oligonucleotide ciblant un oncogéne permette, après conjugaison aux biovecteurs, d'inhiber complètement la prolifération cellulaire de cette lignée tumorale.
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Claims

REVENDICATIONS
1) Conjugué ionique, stable dans un milieu biologique, d'un vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique et d ' oligonucleotides polyanioniques .
2) Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le vecteur particulaire comprend au moins un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés dont le taux de réticulation est sensiblement celui obtenu par réticulation avec entre 5 et 20% de mole d' épichlorhydrine par mole d'osé dans les polysaccharides ou oligosaccharides.
3) Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce que le vecteur particulaire comprend au moins un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés et modifiés par des ligands cationiques, dont le taux de charges positives est compris entre 0,6 à 1,8 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau .
4) Conjugué d'un vecteur particulaire et d' oligonucleotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 , caractérisé en ce que le vecteur particulaire comprend au moins un noyau hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés et modifiés par des ligands cationiques, dont le taux de charges positives est compris entre 0,6 à 1,8 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau et le taux de réticulation est sensiblement celui obtenu par réticulation avec entre 5 et 20% de mole d ' épichlorhydrine par mole d ' ose dans les polysaccharides ou oligosaccharides, et en ce que ledit vecteur particulaire est conjugué par des liaisons ioniques stables en milieu biologique à des oligonucleotides polyanionique protégés par ledit vecteur particulaire, lesdits oligonucleotides polyanioniques étant capables de s'hybrider à un ARNm cellulaire.
5) Conjugué selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que le taux de charges positives est compris entre 0,8 et 1,6 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau
6) Conjugué selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les polysaccharides de la matrice sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.
7) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles.
8) Conjugué selon la revendication 7, caractérisé en ce que les composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs . 9) Conjugué selon les revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche externe constituée essentiellement de phospholipides naturels ou synthétiques et/ou de céramides, éventuellement associés à d'autres composés amphiphiles.
10) Conjugué selon les revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche externe constituée d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes .
11) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie de deux couches de composés amphiphiles.
12) Conjugué selon la revendication 11, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est couvert en totalité ou en partie d'une première couche d'acides gras, elle-même recouverte en totalité ou en partie d'un couche lipidique.
13) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, associé au noyau et/ou à une couche externe, un principe actif utile pour le transport, l'adressage ou la présentation du conjugué au niveau de la membrane de la cellule et/ou dans le cytoplasme de celle-ci.
14) Conjugué selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les oligonucleotides sont des oligodésoxyribonucléotides ou des oligoribonucléotides, antisens ou ribozymes, éventuellement marqués, naturels ou modifiés dès lors que le marquage ou la modification ne change pas substantiellement leur caractère polyanionique.
15) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs conjugués selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou un sel pharmaceutiquement acceptable dudit conjugué, dispersé dans des excipients pharmaceutiquement acceptables.
16) Conjugué selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou composition selon la revendication 15, destiné à être utilisé pour adresser un oligonucleotide dans une cellule.
17) Vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique constitué d'une matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés portant une charge globale cationique, présentant au moins une des caractéristiques suivantes :
- le taux de réticulation est sensiblement celui obtenu par réticulation avec entre 5 et 20% de mole d ' épichlorhydrine par mole d'osé dans les polysaccharides ou oligosaccharides; - ladite matrice de polysaccharides ou d' oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés est modifiée par des ligands cationiques, dont le taux de charges positives est compris entre 0,6 à 1,8 milliEquivalents et avantageusement entre 0,8 et 1,6 milliEquivalent de charges positives par gramme de noyau .
18) Vecteur particulaire selon la revendication 17 , caractérisé en ce que les polysaccharides de la matrice sont choisis dans le groupe comprenant le dextrane, l'amidon, la cellulose, leurs dérivés et substitués, leurs produits d'hydrolyse et leurs sels et esters.
19) Vecteur particulaire selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'au moins une couche de composés amphiphiles.
20) Vecteur particulaire selon la revendication 19, caractérisé en ce que les composés amphiphiles sont choisis parmi les lipides et phospholipides naturels ou synthétiques, les céramides, les acides gras, les glycolipides, les lipoprotéines et les tensioactifs .
21) Vecteur particulaire selon les revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche externe constituée essentiellement de phospholipides naturels ou synthétiques et/ou de céramides, éventuellement associés à d'autres composés amphiphiles .
22) Vecteur particulaire selon les revendications 20 ou 21, caractérisé en ce que le noyau hydrophile non liquide est recouvert en totalité ou en partie d'une couche constituée d'acides gras naturels fixés au noyau par des liaisons covalentes .
23) Vecteur particulaire selon la revendication 22, caractérisé en ce que la couche d'acides gras est elle-même recouverte en totalité ou partie d'une couche lipidique.
24) Utilisation d'un vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique, pour adresser un oligonucleotide dans une cellule .
25) Utilisation selon la revendication 24, dans laquelle le vecteur particulaire est un vecteur selon l'une quelconque des revendications 17 à 23.
26) Utilisation selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce que les oligonucleotides sont des oligodésoxyribonucléotides ou des oligoribonucléotidesribozymes, antisens ou ribozymes, éventuellement marqués, naturels ou modifiés dès lors que le marquage ou la modification ne change pas substantiellement leur caractère polyanionique.
27) Procédé de préparation d'un conjugué ionique, stable dans un milieu biologique, d'un vecteur particulaire comprenant au moins un noyau hydrophile non liquide cationique et de séquences courtes d'acide nucléique polyanioniques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la préparation du noyau cationique :
- en mélangeant un polymère hydrophile, de nature polysaccharidique ou oligosaccharidique, chimiquement ou naturellement réticulé avec un agent de réticulation dans un rapport compris entre 0,06 et 0,2 mole, et de préférence entre 0,1 et 0,15 mole, d'agent de réticulation par unité d'osé dans le polysaccharide ou 1 ' oligosaccharide , - en ajoutant au mélange ci-dessus un ligand cationique de façon à obtenir un taux de charge du noyau compris entre 0,6 et 1,8 et de préférence entre 0,8 et 1,6 millEquivalent par gramme de noyau; b) le chargement des oligonucleotides polyanioniques : en ajoutant, sous agitation, au noyau préparé à l'étape (a), entre environ 0,02 et 0,4 gramme, et de préférence entre 0,05 et 0,2 gramme, d' oligonucleotide par gramme de noyau, selon un débit compris entre environ 0,25 μg d' oligonucleotide par mg de noyau et par heure et 6mg par mg de noyau et par heure, et de préférence entre 4μg/mg/heure et 1 mg/mg/heure, à une température comprise entre environ 20°C et 60°C et de préférence entre 40°C et 50°C.
28) Procédé selon la revendication 27, caractérisé en ce que avant l'étape (b) , on greffe sur la totalité ou sur une partie du noyau préparé à l'étape (a) une couche constituée de composés amphiphiles.
29) Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce que l'on greffe sur la totalité ou une partie de la première couche recouvrant le noyau une seconde couche constituée de composés amphiphiles.
30) Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, caractérisé en ce que l'étape
(b) consiste à ajouter à des vecteurs particulaires préparés conformément à l'étape (a) avec ou sans couche (s) externes de composés amphiphiles, dont la concentration exprimée en noyau cationique est comprise entre 1 et 20 mg/ml, une solution d' oligonucleotides à une concentration comprise entre 1 et 20 mg/ml, de façon à obtenir un rapport oligonucléotides/vecteurs particulaires compris entre 2 et 40%, et de préférence entre 5 et 20%, selon une cinétique d'ajout de la solution d' oligonucleotide comprise entre 5 μl/ml/h et 300 μl/ml/h, et à une température d'incubation comprise entre 20°C et 60°C, et préférentiellement entre 40°C et 50°C,
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