EP0666981A1 - Sensor for detecting biologically decomposable substances - Google Patents

Sensor for detecting biologically decomposable substances

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Publication number
EP0666981A1
EP0666981A1 EP93923968A EP93923968A EP0666981A1 EP 0666981 A1 EP0666981 A1 EP 0666981A1 EP 93923968 A EP93923968 A EP 93923968A EP 93923968 A EP93923968 A EP 93923968A EP 0666981 A1 EP0666981 A1 EP 0666981A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
membrane
electrode
sensor according
enzyme
membranes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP93923968A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Gerald Dr. Urban
Gerhard Jobst
Artur Jachimowicz
Peter Svasek
Manfred Rakohl
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Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP0666981A1 publication Critical patent/EP0666981A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes

Definitions

  • the invention relates to a sensor for detecting biologically, in particular enzymatically, convertible substances of a biological substrate with an electrode and at least one membrane covering the electrode.
  • glucose sensors A particularly suitable way of determining glucose is the enzymatic reaction of glucose with glucose oxidase, in which gluconolactone and hydrogen peroxide are formed while consuming oxygen.
  • the water formed in this way • ⁇ • peroxide can be at an anode under dissipation of electrons back to form oxygen, the anode current can be measured and can be regarded as a measure for the oxidase by the Glucose ⁇ converted glucose.
  • other biological or enzymatic reactions are conceivable, in which the enzymatic reaction product can be used to obtain a corresponding signal on an electrode.
  • the invention now aims to further develop a sensor of the type mentioned in the introduction so that with high measurement signals and good linearity over a large concentration ""
  • the senor according to the invention is essentially characterized in that at least three membranes are provided, of which at least two each have at least one enzyme for the conversion of the biological substance to be determined and / or one reactant for a reaction product of the enzymatic Contain reaction and that at least one further membrane is arranged for setting a distance between the aforementioned membranes and / or as a permselective membrane.
  • oxidase or peroxidase in particular glucose oxidase or lactate oxidase
  • a catalase-containing membrane is arranged at a greater distance from the electrode than an oxidase-containing membrane the adjustability of this distance between the two membranes makes it possible to optimize the available signal and to ensure that the greater part of the hydrogen peroxide formed is actually converted back to oxygen at the anode and not directly about the return path via the membrane containing catalase decomposes the hydrogen peroxide to water and oxygen.
  • the reaction at the anode leads to the decomposition of one molecule of hydrogen peroxide to one molecule of oxygen, whereas the catalase reaction with two molecules of hydrogen peroxide only allows one molecule of oxygen to recede into the surrounding substrate.
  • glucose oxidase as well as, for example, a lactate oxidase each form a molecule of hydrogen peroxide while consuming a molecule of oxygen, the fact that a larger part of the converted hydrogen peroxide is converted back directly under the action of the catalase would lead to a depletion of oxygen in the Lead environment and at the same time, of course, to a substantial reduction in the useful signal at the anode, or a reduction in the linear measuring range.
  • a particularly stable and high sensitivity can be achieved according to the invention in that the further membrane determining the distance between the membranes containing enzymes determines about 5 to 250%, preferably 50 to 150%, the strength of the membrane carrying an enzyme, which membrane is closer to the electrode be ⁇ contributes.
  • the design is advantageously made such that the electrode is covered by a semi-permeable membrane with an exclusion limit between 50 and 150 Daltons.
  • the design is advantageously made such that the membrane determining the distance between the enzyme-bearing membranes consists of hydrogels, furthermore preferably the enzyme-bearing membranes consist of radically crosslinked polymers, in particular of photocrosslinked polymers.
  • the use of free-radically crosslinked polymers as a matrix for the membranes carrying the enzymes has the advantage that the enzymes are incorporated into the membranes be particularly protected and maintain their high activity unhindered.
  • An improvement in the stability of the signal and a greater independence of the signal from the oxygen concentration in the measuring medium can be achieved by executing the membrane which creates the distance between the two enzyme membranes from a membrane for gases such as e.g. Oxygen, permeable, for the substance to be reacted, in particular glucose but impermeable material, preferably polysiloxanes, reach, such a membrane for the passage of glucose must have openings which are preferably larger than the thickness of the underlying membrane. In such openings one can be used for both oxygen and e.g. Glucose permeable membrane can be used.
  • gases such as e.g. Oxygen, permeable
  • glucose but impermeable material preferably polysiloxanes
  • An improvement in the stability of the enzymes in the manufacture of the membranes can be achieved in that the enzymes are mixed with polymeric substances, e.g. Polyethylene glycol, dissolved or dispersed in a membrane precursor and used in this form in the manufacture of the membrane.
  • polymeric substances e.g. Polyethylene glycol
  • the design for these purposes is advantageously such that at least one membrane containing a reactant for an enzymatic reaction product is arranged between a membrane containing an enzyme and the electrode, the reaction between said reactants and the enzymatic reaction product being electrical must be reversible.
  • the design is advantageously made such that the electrode for anodic Settlement of H2O2 is formed in 02 with derivation of electrons, noble metal, in particular platinum, being advantageous as suitable materials for such an electrode.
  • the working electrodes can be polarized relative to a reference electrode, a silver-silver chloride electrode being used as the reference electrode, for example.
  • the design is preferably such that the outer membrane, which contains enzymes, in particular catalase, for the higher molecular weight reaction products of an inner, enzyme-carrying membrane, in particular gluco - nolactone or pyruvate, is permeable.
  • FIG. 1 shows a section through a first one
  • FIG. 2 shows a schematic representation of the individual layers of the sensor shown in FIG. 1, the most important implementation reactions being indicated;
  • Fig. 3 in a to Fig. Similar representation shows a section through a modified embodiment of a sensor according to the invention;
  • Fig. 4 shows a section through a design of a sensor according to the invention, which is particularly suitable as an immunosensor, and
  • FIG. 5 shows a section through a modified design of a sensor.
  • a work piece made of platinum for example, is located on a substrate 1.
  • electrode 2 arranged.
  • a semipermeable membrane 3 is directly adjacent to the working electrode 2, to which a membrane 4 containing an enzyme, for example glucose oxidase or lactate oxidase, is connected.
  • This membrane 4 is followed by a further membrane 5, which is intended to increase the distance between the first membrane 4 containing an enzyme and a second membrane 6 containing another enzyme, for example catalase.
  • insulation for example made of a polyimide 7, is also indicated.
  • the glucose oxidase-containing membrane 4 converts the glucose with oxygen to gluconolactone + hydrogen peroxide, while when lactate is used, lactate oxidase is used in the membrane 4 to convert it to pyruvate and hydrogen peroxide .
  • the hydrogen peroxide passes through the semipermeable membrane 3 to the anode formed, for example, by platinum, the hydrogen peroxide being converted on this electrode 2 and the current caused by the released electrons being processed into a measurement signal.
  • the external for example catalytic, provided membrane 6, in which a conversion of hydrogen peroxide into water and oxygen takes place.
  • an additional membrane 5 is provided, which delays the diffusion of the hydrogen peroxide formed in the membrane 4 into the membrane 6 containing catalase, so that relatively more hydrogen peroxide molecules are seen towards the working electrode Long as such molecules in turn are broken down in the membrane 6.
  • the membrane 5 has a thickness, which is between approximately 5 and 250% of the thickness of the membrane 4 closer to the electrode, so that it immediately results that the relative dimensions shown in the drawing are not to scale.
  • the semipermeable membrane 3 immediately adjacent to the electrode 2 essentially serves to prevent molecules other than hydrogen peroxide from reaching the surface of the electrode and thus poisoning it.
  • This mode of operation of the membrane 3 is indicated in FIG. 2 by the arrow 8, the arrow 8 representing, for example, acetaminophen, uric acid or the like.
  • the membrane 5 the strength of which is selected as a function of the substances to be determined and the further boundary conditions with a view to optimizing the signal, can also have hydrophobic properties, for example, so that the diffusion of oxygen is less impeded than the diffusion ⁇ sion of glucose, so that overall a balanced balance between glucose and oxygen is always ensured in the area of the membrane 4 in order to ensure complete conversion of the glucose.
  • peroxidase or a porous conductive membrane can also be provided in the outermost membrane 6, it being necessary in each case in this membrane 6 to ensure that peroxide is broken down. Before they are in a porous conductive membrane, the hydrogen peroxide can thus be broken down electrically by catalytic cleavage.
  • the membrane 5 causes a flattening of the gradient for the diffusion of hydrogen peroxide through or to the catalase membrane, so that on the one hand more hydrogen peroxide reaches the electrode 2. Furthermore, as can be seen directly from the most important reaction equations above, a conversion of 100% of the oxygen takes place at the electrode, while only 50% of the originally present oxygen can be used again by the conversion in the catalase membrane.
  • the membrane 4 can contain a reactant for an enzymatic reaction product, so that the membrane 4 can be used as a storage medium for a quantity to be measured, the reaction product being formed in the outer membrane 6 .
  • a membrane which is permeable for the reaction product of the enzymatic reaction on the substrate side but impermeable for the reaction product of the second reactant to be accumulated is advantageously inserted between the two layers mentioned above.
  • a significant improvement in the stability of the enzymes in the production of the membranes can be achieved in that the solution which is the membrane precursor and which contains the enzyme contains, apart from water and the enzyme, predominantly polymeric components * .
  • the membrane formers are preferably dissolved in a mixture of water and polyethylene glycol and the enzyme is likewise dissolved or dispersed therein.
  • the membrane 5 which represents a specific embodiment, has a non-uniform membrane 5.
  • the membrane 5 consists of a hydrophobic sieve-like membrane 9, which is only permeable to gases.
  • stoppers 10 are used in the openings of the sieve-like membrane 9, which in particular consist of polyhydroxyethyl methaacrylate and which stoppers are permeable both for gases and for glucose.
  • the other reference numerals in FIG. 5 were chosen as in FIG.
  • Precursor 2 96% precursor 1 and 4% glucose oxidase
  • PS851 poly (dimethyl-2 -3% methyl methacryloxypropyl siloxane); Petrarch), 1% w.w '-dimethoxy w-phenylacetophenone and 50% toluene
  • Example 1 Integrated glucose / lactate sensor for in vivo
  • a flexible electrode structure is used as the electrochemical transducer, which is described in Urban G., Jobst G., Keplinger F., Aschauer E., Jachimowicz A., Kohl F. (1992); Biosensors & Bioelectronic 7: 733-739 and two platinum working electrodes with a surface area of 0.4 mm 2 which are provided with an electropolymerized permselective layer, a platinum counter electrode and a silver / silver chloride quasi reference electrode, which contains a flexible Polymer film are present and are insulated with a photostructurable polyimide insulation lacquer.
  • the wafer which contains a large number of electrode structures described above, is coated with precursor 2 by means of a centrifugal process.
  • Those working electrodes which are to be designed as glucose electrodes are irradiated with ultraviolet light for one minute through a photomask using a mask adjusting device.
  • This process forms an insoluble polymer network, which physically includes the enzymes it contains.
  • the unexposed and therefore not networked parts of the Precursors are dissolved in a mixture of polyethylene glycol / water 1: 1 with ultrasound support.
  • the catalase membrane is produced by the same process using Precursor 4 and covers the entire
  • the layer thicknesses of the membranes can be controlled in a simple manner, which in the example described is 4 ⁇ m for the glucose oxidase membrane, 6 ⁇ m for the lactate oxidase membrane, 6 ⁇ m for the intermediate membrane and 6 ⁇ m for the catalase membrane.
  • a platinum working electrode with a surface of 0.96 mm 2 which is provided with a permselective layer, is used as the electrochemical transducer, which is produced on silicon wafers together with a platinum counter electrode and a silver / silver chloride quasi reference electrode by means of thin-film technology processes.
  • the working electrodes of the wafer which contains a large number of electrode structures described above, are placed on the computer using a computer-controlled nanoliter metering device and a computer-controlled XY table which controls the metering device. Positioned over the individual working electrodes, 80 nl precursor 5 applied and then the entire wafer exposed to ultraviolet light. After the uncrosslinked precursor material has been removed with a mixture of polyethylene glycol / water 1: 1, an enzyme membrane with a layer thickness of 8 ⁇ m remains. This process is repeated with 40 ml precursor 1 and 40 ml precursor 6, which leads to the formation of the desired intermediate layer with a thickness of 4 ⁇ m and for the formation of the desired membrane destroying glutamate and water peroxide with a thickness of 4 ⁇ m.
  • the sensors according to this exemplary embodiment show the desired selectivity against glutamine even in the presence of glutamate, as a result of which no simultaneous determination of glutamate is necessary in order to obtain the correct glutamine concentration.
  • An electrode arrangement produced by means of conventional screen printing technology is used as the electrochemical transducer, which has working electrodes made of a mixture of graphite paste with horseradish peroxidase and binder and silver chloride counterelectrodes.
  • the thixotropic precursor 9 is applied to the working electrodes by means of a screen printing process and dried at room temperature.
  • the intermediate membrane is made of precursor 8 and the catalase membrane is made of precursor 10.
  • the electrical signal is not obtained by oxidation of hydrogen peroxide but by reduction of the enzyme mercury peroxidase adhering to the graphite electrode, which in turn is pxidized by hydrogen peroxide.
  • Example 4 Affinity sensor with intermediate product accumulation
  • Example 2 The electrode structure described in Example 2 is used as the electrochemical transducer.
  • a 3 ⁇ m thick horseradish peroxidase membrane is formed above the working electrode, which in this case has no permselective membrane, in accordance with the method described in Example 1 using precursor 11.
  • This membrane is impregnated with a 1% aqueous solution of 2,5-dihydroxy benzoic acid and in turn covered with a 2 ⁇ m thick gas-permeable membrane which is produced from precursor 7.
  • precursor 12 a third approximately 0.5 ⁇ m thick membrane is formed over the gas-permeable membrane using the same method, to the primary amino groups of which the desired antibody or antigen is bound by means of glutardialdehyde coupling.
  • the enzymatic activity of this membrane only develops in the course of the affinity test, which is carried out as a classic "sandwich" test with glucose oxidase as the marker enzyme.
  • the electrical signal is obtained by reducing the p-benzoquinonecarboxylic acid, which in turn is oxidized by hydrogen peroxide under the catalytic effect of horseradish peroxidase.
  • An advantage of the arrangement described is the possibility of accumulating the resulting oxidized intermediate product by keeping the working electrode used currentless. After a certain period of time has elapsed, by means of which the sensitivity of the sensor can be controlled in the simplest way, a corresponding cathodic polarization voltage is applied to the working electrode and thus the quinone reduced, the measurement signal being obtained at the same time and the sensor returning to its initial state.

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Abstract

A sensor which detects biologically, in particular enzymatically, decomposable substances in a biological substrate by means of an electrode (2) and at least one membrane which covers the electrode (2), has at least three membranes (3, 4, 5, 6), of which at least two contain each at least one enzyme for reacting with the biological substance to be determined and/or a reactant for a reaction product of the enzymatic reaction. At least one additional membrane (3, 5) sets the distance between said membranes (4, 6) and/or is arranged as a permselective membrane.

Description

Sensor zur Erfassung von biologisch umsetzbaren SubstanzenSensor for the detection of biologically feasible substances
Die Erfindung bezieht sich auf einen Sensor zur Erfassung von biologisch, insbesondere enzymatisch, umsetzbaren Substanzen eines biologischen Substrates mit einer Elektrode und wenigstens einer die Elektrode abdeckenden Membran.The invention relates to a sensor for detecting biologically, in particular enzymatically, convertible substances of a biological substrate with an electrode and at least one membrane covering the electrode.
Sensoren der eingangs genannten Art sind beispielsweise als Glucosesensoren bereits vorgeschlagen worden. Eine besonders geeignete Art der Bestimmung von Glucose ist hiebei die enzy- matische Umsetzung der Glucose mit Glucoseoxidase, bei welcher unter Verbrauch von Sauerstoff Gluconolacton und Wasserstoff¬ peroxid gebildet wird. Das auf diese Weise gebildete Wasser•■• stoffperoxid läßt sich an einer Anode unter Ableitung von Elektronen zu Sauerstoff rückbilden, wobei der Anodenstrom gemessen werden kann und als Maß für die durch die Glucose¬ oxidase umgesetzte Glucose angesehen werden kann. Analog sind andere biologische bzw. enzymatische Umsetzungen denkbar, bei welchen das enzymatische Umsetzungsprodukt zur Gewinnung eines entsprechenden Signals an einer Elektrode herangezogen werden kann.Sensors of the type mentioned in the introduction have already been proposed, for example, as glucose sensors. A particularly suitable way of determining glucose is the enzymatic reaction of glucose with glucose oxidase, in which gluconolactone and hydrogen peroxide are formed while consuming oxygen. The water formed in this way, • ■ • peroxide can be at an anode under dissipation of electrons back to form oxygen, the anode current can be measured and can be regarded as a measure for the oxidase by the Glucose¬ converted glucose. Analogously, other biological or enzymatic reactions are conceivable, in which the enzymatic reaction product can be used to obtain a corresponding signal on an electrode.
Wenn ein derartiger Sensor, welcher prinzipiell in vivo oder in vitro verwendbar sein soll, in vivo Verwendung findet, muß naturgemäß dafür Sorge getragen werden, daß kritische Um¬ setzungsprodukte, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid, nicht in das Substrat bzw. Meßmedium gelangen, sondern tatsachlich an der Elektrode unter Elektronenabgabe zersetzt werden können. Um in solchen Fallen sicherzustellen, daß eine Rück- diffusion von H2O2 in das biologische Substrat ausgeschlossen werden kann, wurde bereits eine zusatzliche, Katalase enthaltende Membran vorgeschlagen. Gleichfalls bekannt sind Multienzymmembranen für komplexe Umsetzungen.If such a sensor, which should in principle be used in vivo or in vitro, is used in vivo, care must naturally be taken to ensure that critical reaction products, such as hydrogen peroxide, do not get into the substrate or measuring medium, but actually the electrode can be decomposed with electron donation. In order to ensure in such cases that back diffusion of H2O2 into the biological substrate can be ruled out, an additional membrane containing catalase has already been proposed. Multi-enzyme membranes for complex implementations are also known.
Die Erfindung zielt nun darauf ab, einen Sensor der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß bei hohen Me߬ signalen und guter Linearität über einen großen Konzentrati- " "The invention now aims to further develop a sensor of the type mentioned in the introduction so that with high measurement signals and good linearity over a large concentration ""
onsbereich auch über die zu erwartende Lebensdauer der Enzym¬ membranen weitestgehend konstante und reproduzierbare Meßer¬ gebnisse erzielt werden können.on the expected lifetime of the enzyme membranes, largely constant and reproducible measurement results can be achieved.
Zur Lösung dieser Aufgabe ist der erfindungsgemäße Sensor im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens drei Mem¬ branen vorgesehen sind, von welchen wenigstens zwei jeweils wenigstens ein Enzym für die Umsetzung der zu bestimmenden biologischen Substanz und/oder einen Reaktanten für ein Um¬ setzungsprodukt der enzymatischen Umsetzung enthalten und daß wenigstens eine weitere Membran für die Einstellung eines Abstandes zwischen den vorgenannten Membranen und/oder als permselektive Membran angeordnet ist. Dadurch, daß zwei von¬ einander getrennte Membranen vorgesehen sind, welche jeweils wenigstens ein Enzym für die Umsetzung der zu bestimmenden biologischen Sustanz bzw. einen Reaktanten für ein Umsetzungs¬ produkt der enzymatischen Umsetzung enthalt, wird es möglich, die Umsetzung bei Verwendung bekannter permselektiver Mem¬ branen so zu steuern, daß eine Rückdiffusion in das Substrat verhindert werden kann und daß gleichzeitig eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird. Insbesondere dann, wenn beispielsweise in der zweiten Membran ein Reaktant für das Umsetzungsprodukt der enzymatischen Umsetzung vorgesehen ist, wird es möglich, das Reaktionsprodukt eines derartigen Reak- tanten mit dem Umsetzungsprodukt der enzymatischen Reaktion zu speichern und auf diese Weise ein akkumuliertes Signal nach bestimmten Zeitintervallen zu gewinnen. Bei Verwendung von je¬ weils voneinander verschiedenen Enzymen in voneinander ge¬ trennten Membranen wird es möglich, in einer Membran die ge- wünschte enzymatische Umsetzung zur Bildung des die Messung an der Elektrode ermöglichenden Umsetzungsproduktes und in der zweiten Membran eine Reaktion durchzuführen, welche eine Rück¬ diffusion des Umsetzungsproduktes ohne Zersetzung desselben in das umgebende Substrat gleichfalls verhindert. Dadurch, daß nun wenigstens eine weitere Membran für die Einstellung eines Abstandes zwischen den vorgenannten Membranen oder als permselektive oder semipermeable Membran angeordnet ist, wird die Möglichkeit geschaffen, die Empfindlichkeit wesentlich zu steigern und gleichzeitig die Meßwerte zu linearisieren und über die Zeit ohne Nachkalibrierung vergleichbare Meßergeb¬ nisse zu erhalten. Insbesondere dann, wenn als Enzym eine Oxidase oder Peroxidase, insbesondere Glucoseoxidase oder Lactatoxidase, eingesetzt wird, und weiters, wie es einer bevorzugten Weiterbildung entspricht, eine Katalase enthal¬ tende Membran in größerem Abstand von der Elektrode angeordnet ist als eine Oxidase enthaltende Membran, ergibt sich durch die Einstellbarkeit dieses Abstandes zwischen den beiden Mem¬ branen die Möglichkeit, das erhältliche Signal zu optimieren und sicherzustellen, daß der größere Teil des gebildeten Wasserstoffperoxides tatsächlich an der Anode zu Sauerstoff rückgebildet wird und- nicht etwa unmittelbar den Rückweg über die Katalase enthaltende Membran unter Zersetzung des Wasserstoffperoxides zu Wasser und Sauerstoff nimmt. Die Umsetzung an der Anode führt bei Zersetzung eines Moleküles von Wasserstoffperoxid zu einem Molekül Sauerstoff, wohingegen die Katalasereaktion bei zwei Molekülen Wasserstoffperoxid lediglich ein Molekül Sauerstoff in das umgebende Substrat rücktreten laßt. Wenn somit die Glucoseoxidase ebenso wie beispielsweise eine Lactatoxidase jeweils unter Verbrauch ei¬ nes Moleküles Sauerstoff ein Molekül Wasserstoffperoxid bil¬ det, würde der Umstand, daß ein größerer Teil des umgesetzten Wasserstoffperoxides unter Einwirkung der Katalase direkt rückgewandelt wird, zu einer Abreicherung von Sauerstoff in der Umgebung führen und gleichzeitig naturgemäß zu einer wesentlichen Verringerung des Nutzsignales an der Anode, oder einer Verringerung des linearen Meßbereiches. Durch die Ein- Stellung des Abstandes zwischen den beiden Membranen laßt sich somit ein größeres Signal messen und es wird gleichzeitig eine verbesserte und vergleichmäßigte Umsetzung in der die Oxidase enthaltenden Membran sichergestellt. Diese verbesserte Um¬ setzung bleibt auch dann voll erhalten, wenn bereits Teilbe¬ reiche der Oxidase enthaltenden Membran als verbraucht zu be¬ zeichnen sind, da immer noch hinreichend Zeit für den Durch¬ tritt des Wasserstoffperoxides zur Elektrode verbleibt und die jeweils für die Rückdiffusion und die für die Umsetzung mit der Katalase zur Verfügung stehende Zeit im wesentlichen un¬ verändert bleibt. Wenn zusätzlich, wie erfindungsgemäß vorge¬ schlagen, eine permselektive Membran Verwendung findet, läßt sich sicherstellen, daß zum einen lediglich die gewünschten Umsetzungsprodukte, wie beispielsweise H2O2, bis zur Elektrode gelangen, so daß eine Vergiftung der Elektrode vermieden wer¬ den kann. Weiters laßt sich durch Verwendung derartiger perm¬ selektiver Membrane naturgemäß auch der Durchtritt von höher¬ molekularen Inhibitoren für die enzymatische Reaktion verhin¬ dern.To achieve this object, the sensor according to the invention is essentially characterized in that at least three membranes are provided, of which at least two each have at least one enzyme for the conversion of the biological substance to be determined and / or one reactant for a reaction product of the enzymatic Contain reaction and that at least one further membrane is arranged for setting a distance between the aforementioned membranes and / or as a permselective membrane. The fact that two mutually separate membranes are provided, each containing at least one enzyme for the implementation of the biological substance to be determined or one reactant for a reaction product of the enzymatic conversion, makes it possible to carry out the reaction using known permselective membranes ¬ to control branches so that back diffusion into the substrate can be prevented and at the same time a high sensitivity is achieved. In particular, if, for example, a reactant is provided in the second membrane for the reaction product of the enzymatic reaction, it becomes possible to store the reaction product of such a reactant with the reaction product of the enzymatic reaction and in this way to add an accumulated signal after certain time intervals win. When using different enzymes in separate membranes, it becomes possible to carry out the desired enzymatic conversion in one membrane to form the reaction product that enables measurement at the electrode and to carry out a reaction in the second membrane, which results in a backward reaction ¬ diffusion of the reaction product without decomposing it into the surrounding substrate is also prevented. Characterized in that at least one further membrane is now arranged for setting a distance between the aforementioned membranes or as a permselective or semipermeable membrane created the possibility of significantly increasing the sensitivity and at the same time linearizing the measured values and obtaining comparable measurement results over time without recalibration. Particularly when an oxidase or peroxidase, in particular glucose oxidase or lactate oxidase, is used as an enzyme, and furthermore, as a preferred development, a catalase-containing membrane is arranged at a greater distance from the electrode than an oxidase-containing membrane the adjustability of this distance between the two membranes makes it possible to optimize the available signal and to ensure that the greater part of the hydrogen peroxide formed is actually converted back to oxygen at the anode and not directly about the return path via the membrane containing catalase decomposes the hydrogen peroxide to water and oxygen. The reaction at the anode leads to the decomposition of one molecule of hydrogen peroxide to one molecule of oxygen, whereas the catalase reaction with two molecules of hydrogen peroxide only allows one molecule of oxygen to recede into the surrounding substrate. If the glucose oxidase as well as, for example, a lactate oxidase each form a molecule of hydrogen peroxide while consuming a molecule of oxygen, the fact that a larger part of the converted hydrogen peroxide is converted back directly under the action of the catalase would lead to a depletion of oxygen in the Lead environment and at the same time, of course, to a substantial reduction in the useful signal at the anode, or a reduction in the linear measuring range. By setting the distance between the two membranes, a larger signal can thus be measured and at the same time an improved and more uniform conversion is ensured in the membrane containing the oxidase. This improved implementation is fully retained even if partial areas of the membrane containing oxidase can already be described as used, since there is still sufficient time for the hydrogen peroxide to pass to the electrode and the for the back diffusion and the time available for the reaction with the catalase remains essentially unchanged. If, in addition, as proposed according to the invention, a permselective membrane is used, it can be ensured that, on the one hand, only the desired reaction products, such as H2O2, reach the electrode, so that poisoning of the electrode can be avoided. Furthermore, by using such permselective membranes it is naturally also possible to prevent the passage of higher molecular inhibitors for the enzymatic reaction.
Eine besonders stabile und hohe Empfindlichkeit läßt sich er¬ findungsgemäß dadurch erreichen, daß die den Abstand zwischen den Enzyme enthaltenden Membranen bestimmende weitere Membran etwa 5 bis 250 %, vorzugsweise 50 bis 150 %, der Stärke der näher der Elektrode gelegenen, ein Enzym tragenden Membran be¬ trägt.A particularly stable and high sensitivity can be achieved according to the invention in that the further membrane determining the distance between the membranes containing enzymes determines about 5 to 250%, preferably 50 to 150%, the strength of the membrane carrying an enzyme, which membrane is closer to the electrode be¬ contributes.
um sicherzustellen, daß an die Elektrode selbst lediglich die gewünschten Umsetzungsprodukte gelangen, ist die Ausbildung mit Vorteil so getroffen, daß die Elektrode von einer semiper- meablen Membrane mit einer Ausschlußgrenze zwischen 50 und 150 Dalton abgedeckt ist.In order to ensure that only the desired reaction products reach the electrode itself, the design is advantageously made such that the electrode is covered by a semi-permeable membrane with an exclusion limit between 50 and 150 Daltons.
Für einen ungestörten und sicheren Betrieb des Sensors über lange Zeiträume können besonders bevorzugte Materialien für die einzelnen Membranen eingesetzt werden. Mit Vorteil ist beispielsweise die Ausbildung so getroffen, daß die den Abstand zwischen den Enzyme tragenden Membranen bestimmende Membran aus Hydrogelen besteht, wobei weiters vorzugsweise die Enzyme tragenden Membranen aus radikalisch vernetzten Poly¬ meren, insbesondere aus photovernetzten Polymeren bestehen. Insbesondere die Verwendung von radikalisch vernetzten Poly- meren als Matrix für die Enzyme tragende Membranen hat hiebei den Vorzug, daß die Enzyme bei ihrem Einbau in die Membranen besonders geschont werden und ihre hohe Aktivität ungehindert beibehalten.For undisturbed and safe operation of the sensor over long periods of time, particularly preferred materials can be used for the individual membranes. For example, the design is advantageously made such that the membrane determining the distance between the enzyme-bearing membranes consists of hydrogels, furthermore preferably the enzyme-bearing membranes consist of radically crosslinked polymers, in particular of photocrosslinked polymers. In particular, the use of free-radically crosslinked polymers as a matrix for the membranes carrying the enzymes has the advantage that the enzymes are incorporated into the membranes be particularly protected and maintain their high activity unhindered.
Eine Verbesserung der Stabilität des Signals sowie eine grö¬ ßere Unabhängigkeit des Signals von der Sauerstoffkonzen¬ tration im Meßmedium läßt sich durch die Ausführung der den Abstand zwischen den beiden Enzymmembranen herstellenden Mem¬ bran aus einem zwar für Gase, wie z.B. Sauerstoff, permeablen, für die umzusetzende Substanz, insbesondere Glucose aber impermeablen Material, vorzugsweise Polysiloxanen, erreichen, wobei eine derartige Membran für den Durchtritt von Glucose Öffnungen aufweisen muß, die vorzugsweise größer als die Dicke der darunterliegenden Membran sind. In derartige Öffnungen kann eine sowohl für Sauerstoff als auch z.B. Glucose perme- able Membran eingesetzt sein.An improvement in the stability of the signal and a greater independence of the signal from the oxygen concentration in the measuring medium can be achieved by executing the membrane which creates the distance between the two enzyme membranes from a membrane for gases such as e.g. Oxygen, permeable, for the substance to be reacted, in particular glucose but impermeable material, preferably polysiloxanes, reach, such a membrane for the passage of glucose must have openings which are preferably larger than the thickness of the underlying membrane. In such openings one can be used for both oxygen and e.g. Glucose permeable membrane can be used.
Eine Verbesserung der Stabilität der Enzyme in der Herstellung der Membranen laßt sich dadurch erreichen, daß die Enzyme mit Polymeren Substanzen, wie z.B. Polyethylenglykol, in einer Membranvorstufe gelöst bzw. dispergiert werden und in dieser Form bei der Herstellung der Membran eingesetzt werden.An improvement in the stability of the enzymes in the manufacture of the membranes can be achieved in that the enzymes are mixed with polymeric substances, e.g. Polyethylene glycol, dissolved or dispersed in a membrane precursor and used in this form in the manufacture of the membrane.
Um, wie bereits eingangs erwähnt, auch bei überaus geringen Signalen reproduzierbare Meßwerte zu erlangen, kann es vor- teilhaft sein, das Umsetzungsprodukt der enzymatischen Reak¬ tion, beispielsweise über eine nachgeschaltete Reaktion mit einem Reaktanten zwischenzuspeichern und nur nach gewissen Zeitabständen eine Messung vorzunehmen. Mit Vorteil ist die Ausbildung für diese Zwecke so getroffen, daß zwischen einer ein Enzym enthaltenden Membran und der Elektrode wenigstens eine einen Reaktanten für ein enzymatisches Umsetzungsprodukte enthaltende Membran angeordnet ist, wobei die Reaktion zwi¬ schen den genannten Reakanten und dem enzymatischen Umset¬ zungsprodukt elektrisch reversierbar sein muß.In order, as already mentioned at the beginning, to obtain reproducible measured values even with extremely low signals, it can be advantageous to temporarily store the reaction product of the enzymatic reaction, for example via a subsequent reaction with a reactant, and to carry out a measurement only after certain time intervals. The design for these purposes is advantageously such that at least one membrane containing a reactant for an enzymatic reaction product is arranged between a membrane containing an enzyme and the electrode, the reaction between said reactants and the enzymatic reaction product being electrical must be reversible.
Insbesondere zur Messung von Glucose ist mit Vorteil die Ausbildung so getroffen, daß die Elektrode zur anodischen Um- Setzung von H2O2 in 02 unter Ableitung von Elektronen ausge¬ bildet ist, wobei als geeignete Materialien für eine derartige Elektrode Edelmetall, insbesondere Platin vorteilhaft sind. Die Arbeitselektroden können hiebei gegenüber einer Referenz- elektrode polarisiert sein, wobei als Referenzelektrode bei¬ spielsweise eine Silber-Silberchlorid-Elektrode zum Einsatz gelangen kann.In particular for measuring glucose, the design is advantageously made such that the electrode for anodic Settlement of H2O2 is formed in 02 with derivation of electrons, noble metal, in particular platinum, being advantageous as suitable materials for such an electrode. The working electrodes can be polarized relative to a reference electrode, a silver-silver chloride electrode being used as the reference electrode, for example.
Um sicherzustellen, daß beispielsweise bei Verwendung von zwei Enzymen enthaltenden Membranen, bei welchen die äußere Membran Katalase enthält, tatsächlich die gewünschten Reaktanten in die innenliegende Membrane eintreten können, um auf diese Wei¬ se beispielsweise die Umsetzung einer Glucose mit Glucoseoxi¬ dase zu gewährleisten und andererseits sicherzustellen, daß in der außenliegenden Membran zumindest gegebenenfalls rück¬ diffundierendes Wasserstoffperoxid enzymatisch zersetzt werden kann, ist die Ausbildung bevorzugt so getroffen, daß die außenliegende , Enzyme, insbesondere Katalase , enthaltende Membran für die höhermolekularen Umsetzungsprodukte einer innenliegenden, Enzyme tragenden Membran, insbesondere Gluco- nolacton oder Pyruvat , permeabel ist .To ensure that, for example, when using membranes containing two enzymes, in which the outer membrane contains catalase, the desired reactants can actually enter the inner membrane, in order to ensure, for example, the reaction of a glucose with glucose oxide and on the other hand, to ensure that at least optionally back-diffusing hydrogen peroxide can be enzymatically decomposed in the outer membrane, the design is preferably such that the outer membrane, which contains enzymes, in particular catalase, for the higher molecular weight reaction products of an inner, enzyme-carrying membrane, in particular gluco - nolactone or pyruvate, is permeable.
Die Erfindung wird nachfolgend an Hand von in der Zeichnung schematisch dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläu- tert . In dieser zeigen Fig. l einen Schnitt durch eine ersteThe invention is explained in more detail below on the basis of exemplary embodiments schematically illustrated in the drawing. 1 shows a section through a first one
Aus führungs form eines erfindungsgemäßen Sensors ; Fig .2 eine schematische Darstellung der einzelnen Schichten des in Fig. l dargestellten Sensors , wobei die wesentlichsten Umset ¬ zungsreaktionen angedeutet sind; Fig .3 in einer zu Fig . l ahn- liehen Darstellung einen Schnitt durch eine abgewandelte Aus¬ führungsform eines erfindungsgemäßen Sensors ; Fig . 4 einen Schnitt durch eine insbesondere als Immunosensor geeignete Ausbildung eines erfindungsgemäßen Sensors und Fig .5 einen Schnitt durch eine abgewandelte Ausbildung eines Sensors .From embodiment of a sensor according to the invention; 2 shows a schematic representation of the individual layers of the sensor shown in FIG. 1, the most important implementation reactions being indicated; Fig. 3 in a to Fig. Similar representation shows a section through a modified embodiment of a sensor according to the invention; Fig. 4 shows a section through a design of a sensor according to the invention, which is particularly suitable as an immunosensor, and FIG. 5 shows a section through a modified design of a sensor.
Bei dem in den Fig.l und 2 dargestellten Sensor ist auf einem Substrat 1 eine beispielsweise aus Platin bestehende Arbeits- elektrode 2 angeordnet. Der Arbeitselektrode 2 unmittelbar benachbart ist eine semipermeable Membran 3, an welche eine ein Enzym, beispielsweise Glucoseoxidase oder Lactatoxidase enthaltende Membran 4 anschließt. An diese Membran 4 schließt eine weitere Membran 5 an, welche den Abstand zwischen der er¬ sten, ein Enzym enthaltenden Membran 4 und einer zweiten ein weiteres Enzym, beispielsweise Katalase, enthaltenden Membran 6 zu vergrößern bestimmt ist. In Fig.l sind weiters Iso¬ lierungen, beispielsweise aus einem Polyimid 7 angedeutet.In the sensor shown in FIGS. 1 and 2, a work piece made of platinum, for example, is located on a substrate 1. electrode 2 arranged. A semipermeable membrane 3 is directly adjacent to the working electrode 2, to which a membrane 4 containing an enzyme, for example glucose oxidase or lactate oxidase, is connected. This membrane 4 is followed by a further membrane 5, which is intended to increase the distance between the first membrane 4 containing an enzyme and a second membrane 6 containing another enzyme, for example catalase. In FIG. 1, insulation, for example made of a polyimide 7, is also indicated.
Die wesentlichen in dem Sensor gemäß Fig.l und 2 ablaufenden Reaktionen sind folgende:The main reactions taking place in the sensor according to FIGS. 1 and 2 are as follows:
Glucose + 02 G0D > Gluconolacton + H2O2 Lactat + 02 L0D > Pyruvat + H2O2Glucose + 02 G0D > gluconolactone + H2O2 lactate + 02 L0D > pyruvate + H2O2
H2θ2 Anode^ 2H+ + 2e_ + 02 H2θ2 anode ^ 2H + + 2e _ + 02
2H202 Katalase .. 2H2θ + 022H202 catalase .. 2 H2θ + 02
GOD ... Glucoseoxidase LOD ... LactatoxidaseGOD ... glucose oxidase LOD ... lactate oxidase
Bei der Bestimmung von Glucose im Blut erfolgt in der Glucose¬ oxidase enthaltenden Membran 4 eine Umsetzung der Glucose mit Sauerstoff in Gluconolacton + Wasserstoffperoxid, während bei der Bestimmung von Lactat bei Einsatz von Lactatoxidase in der Membran 4 eine Umsetzung in Pyruvat und Wasserstoffperoxid er¬ folgt. Das Wasserstoffperoxid gelangt durch die semipermeable Membran 3 an die beispielsweise von Platin gebildete Anode, wobei an dieser Elektrode 2 eine Umsetzung des Wasserstoffper¬ oxid erfolgt und der durch die freigesetzten Elektronen be¬ wirkte Strom zu einem Meßsignal verarbeitet werden kann.When glucose in the blood is determined, the glucose oxidase-containing membrane 4 converts the glucose with oxygen to gluconolactone + hydrogen peroxide, while when lactate is used, lactate oxidase is used in the membrane 4 to convert it to pyruvate and hydrogen peroxide . The hydrogen peroxide passes through the semipermeable membrane 3 to the anode formed, for example, by platinum, the hydrogen peroxide being converted on this electrode 2 and the current caused by the released electrons being processed into a measurement signal.
Um bei der Anwendung des Sensors in vivo zu verhindern, daß das das Meßsignal liefernde Wasserstoffperoxid wiederum in die Blutbahn gelangt ist die außenliegende, beispielsweise Kata- läse enthaltende Membran 6 vorgesehen, in welcher eine Umset¬ zung von Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff erfolgt.In order to prevent the hydrogen peroxide supplying the measurement signal from entering the bloodstream when the sensor is used in vivo, the external, for example catalytic, provided membrane 6, in which a conversion of hydrogen peroxide into water and oxygen takes place.
Um das Meßsignal und dessen Stabilität zu verbessern ist wei¬ ters eine zusätzliche Membran 5 vorgesehen, welche die Diffu¬ sion des in.der Membran 4 gebildeten Wasserstoffperoxid in die Katalase enthaltende Membran 6 verzögert, so daß relativ gese¬ hen mehr Wasserstoffperoxidmoleküle zur Arbeitselektrode ge¬ langen als derartige Moleküle in der Membran 6 wiederum ab¬ gebaut werden. Die Membran 5 weist hiebei eine Dicke, auf, welche zwischen etwa 5 und 250 % der Stärke der näher der Elektrode gelegenen Membran 4 beträgt, so daß sich unmittelbar ergibt, daß die in der Zeichnung dargestellten relativen Ab¬ messungen nicht maßstäblich sind.In order to improve the measurement signal and its stability, an additional membrane 5 is provided, which delays the diffusion of the hydrogen peroxide formed in the membrane 4 into the membrane 6 containing catalase, so that relatively more hydrogen peroxide molecules are seen towards the working electrode Long as such molecules in turn are broken down in the membrane 6. The membrane 5 has a thickness, which is between approximately 5 and 250% of the thickness of the membrane 4 closer to the electrode, so that it immediately results that the relative dimensions shown in the drawing are not to scale.
Die der Elektrode 2 unmittelbar benachbarte semipermeable Mem¬ bran 3 dient hiebei im wesentlichen dazu, zu verhindern, daß andere Moleküle als Wasserstoffperoxid an die Oberfläche der Elektrode gelangen und diese somit vergiften. Diese Wirkungsweise der Membran 3 ist hiebei in Fig.2 durch den Pfeil 8 angedeutet, wobei der Pfeil 8 beispielsweise Aceta- minophen, Harnsäure od.dgl., darstellt. Diese Stoffe gelangen unverändert durch die Membranen 4, 5 und 6 und werden von der Membran 3 vor der Elektrode 2 zurückgehalten, um eine Vergif- tung derselben zu verhindern.The semipermeable membrane 3 immediately adjacent to the electrode 2 essentially serves to prevent molecules other than hydrogen peroxide from reaching the surface of the electrode and thus poisoning it. This mode of operation of the membrane 3 is indicated in FIG. 2 by the arrow 8, the arrow 8 representing, for example, acetaminophen, uric acid or the like. These substances pass unchanged through the membranes 4, 5 and 6 and are retained by the membrane 3 in front of the electrode 2 in order to prevent poisoning thereof.
Die Membran 5, deren Stärke in Abhängigkeit von den zu bestim¬ menden Stoffen und den weiteren Randbedingungen im Hinblick auf eine Optimierung des Signals gewählt wird, kann beispiels- weise auch hydrophobe Eigenschaften aufweisen, so daß die Diffusion von Sauerstoff weniger behindert wird als die Diffu¬ sion von Glucose, so daß insgesamt im Bereich der Membran 4 immer für ein ausgewogenes Gleichgewicht zwischen Glucose und Sauerstoff gesorgt wird, um eine vollständige Umsetzung der Glucose sicherzustellen. Anstelle von Katalase kann in der äußersten Membran 6 auch Peroxidase oder eine poröse leitfähige Membran vorgesehen sein, wobei in dieser Membran 6 jeweils sichergestellt sein muß, daß ein Abbau von Peroxid erfolgt. Bevor sie in einer po¬ rösen leitfähigen Membran kann somit das Wasserstoffperoxid elektrisch durch katalytische Spaltung abgebaut werden. Insgesamt bewirkt die Membran 5 eine Verflachung des Gradienten für die Diffusion von Wasserstoffperoxid durch bzw. an die Katalasemembran, so daß einerseits mehr Wasserstoff¬ peroxid an die Elektrode 2 gelangt. Darüberhinaus erfolgt, wie aus den obigen wichtigsten Reaktionsgleichungen unmittelbar ersichtlich, an der Elektrode eine Umsetzung von 100 % des Sauerstoffes, während durch die Umsetzung in der Katalase¬ membran nur 50 % des ursprünglich vorhandenen Sauerstoffes wiederum nutzbar werden.The membrane 5, the strength of which is selected as a function of the substances to be determined and the further boundary conditions with a view to optimizing the signal, can also have hydrophobic properties, for example, so that the diffusion of oxygen is less impeded than the diffusion ¬ sion of glucose, so that overall a balanced balance between glucose and oxygen is always ensured in the area of the membrane 4 in order to ensure complete conversion of the glucose. Instead of catalase, peroxidase or a porous conductive membrane can also be provided in the outermost membrane 6, it being necessary in each case in this membrane 6 to ensure that peroxide is broken down. Before they are in a porous conductive membrane, the hydrogen peroxide can thus be broken down electrically by catalytic cleavage. Overall, the membrane 5 causes a flattening of the gradient for the diffusion of hydrogen peroxide through or to the catalase membrane, so that on the one hand more hydrogen peroxide reaches the electrode 2. Furthermore, as can be seen directly from the most important reaction equations above, a conversion of 100% of the oxygen takes place at the electrode, while only 50% of the originally present oxygen can be used again by the conversion in the catalase membrane.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig.3 sind die Bezugszeichen der vorangehenden Figuren beibehalten worden, wobei unmittelbar ersichtlich ist, daß bei dieser Ausführungsform eine der Membran 5 gemäß dem Beispiel der Fig.l und 2 entsprechende Membran nicht vorgesehen ist. Auch bei diesem Sensor sind zwei voneinander verschiedene Enzyme enthaltende Membranen 4 und 6 vorgesehen, wobei beispielsweise ebenfalls die zu Fig.l und 2 erläuterten Reaktionen ablaufen können. Anstelle von Enzymen kann jedoch bei der Ausführungsform gemäß Fig.3 die Membran 4 einen Reaktanten für ein enzymatisches Umsetzungsprodukt enthalten, so daß die Membran 4 als Speichermedium für eine zu messende Größe eingesetzt werden kann, wobei das Umset¬ zungsprodukt in der außenliegenden Membran 6 entsteht. In vorteilhafter Weise wird bei dieser Ausführungsform zwischen den beiden oben erwähnten Schichten eine Membran, welche zwar für das Umsetzungsprodukt der enzymatischen Reaktion auf der Substratseite permeabel, für das zu akkumulierende Reaktions¬ produkt des zweiten Reaktanten jedoch impermeabel ist, einge- Eine wesentliche Verbesserung der Stabilität der Enzyme bei der Herstellung der Membranen läßt sich dadurch erreichen, daß die Lösung, welche die Membranenvorstufe darstellt, und das Enzym enthält, abgesehen von Wasser und dem Enzym überwiegend polymere Komponenten* enthalt. Vorzugsweise sind die Membranen¬ bildner in einer Mischung aus Wasser und Polyethylenglycol ge¬ löst und das Enzym darinnen ebenfalls gelöst bzw. dispergiert.In the embodiment according to FIG. 3, the reference symbols of the preceding figures have been retained, it being immediately apparent that in this embodiment a membrane 5 corresponding to the example in FIGS. 1 and 2 is not provided. In this sensor, too, two membranes 4 and 6 containing different enzymes are provided, for example, the reactions explained for FIGS. 1 and 2 can also take place. Instead of enzymes, however, in the embodiment according to FIG. 3, the membrane 4 can contain a reactant for an enzymatic reaction product, so that the membrane 4 can be used as a storage medium for a quantity to be measured, the reaction product being formed in the outer membrane 6 . In this embodiment, a membrane which is permeable for the reaction product of the enzymatic reaction on the substrate side but impermeable for the reaction product of the second reactant to be accumulated is advantageously inserted between the two layers mentioned above. A significant improvement in the stability of the enzymes in the production of the membranes can be achieved in that the solution which is the membrane precursor and which contains the enzyme contains, apart from water and the enzyme, predominantly polymeric components * . The membrane formers are preferably dissolved in a mixture of water and polyethylene glycol and the enzyme is likewise dissolved or dispersed therein.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig.4 sind die Bezugszeichen der vorangegangenen Figuren beibehalten worden, wobei ersichtlich ist, daß bei dieser spezifischen Ausführungsform eine der semipermeablen Membran 3 entsprechende Membran zur Abdeckung der Elektrode 2 nicht vorgesehen ist. Die in dieser spezifischen Ausführungsform vorgesehene Membran 5 ist für Gase wie 02 und H2O2 permeabel nicht jedoch für die Reaktanten und stellt somit in bezug auf die Reaktanten eine Sperrschicht zwischen den Membranen 4 und 6 dar. Bei dieser spezifischen Ausführungsform wird in der Membran 4 eine Akkumulation der Umsetzungsprodukte erreicht und in der Membran 6 sind Reak- tanten für die Umsetzungsprodukte enthalten. Eine derartige Ausbildung ist besonders vorteilhaft für die Bestimmung von Antigen/Antikörperreaktionen, wobei die Enzymaktivitat in der Enzyme enthaltenden Membran durch geeignete Immobilisierung unter Verwendung von Antigen/Antikörperreaktionen den Anti- genen oder Antikörpern proportional geführt wird.In the embodiment according to FIG. 4, the reference numerals of the preceding figures have been retained, it being apparent that in this specific embodiment, a membrane corresponding to the semipermeable membrane 3 is not provided for covering the electrode 2. The membrane 5 provided in this specific embodiment is permeable to gases such as 02 and H2O2 but not to the reactants and thus represents a barrier layer between the membranes 4 and 6 with respect to the reactants. In this specific embodiment, the membrane 4 accumulates of the reaction products is reached and the reactants for the reaction products are contained in the membrane 6. Such an embodiment is particularly advantageous for the determination of antigen / antibody reactions, the enzyme activity in the membrane containing enzymes being carried out proportionally to the antigen or antibody by suitable immobilization using antigen / antibody reactions.
Fig.5, welche eine spezifische Ausführungsform darstellt, weist eine nicht einheitliche Membran 5 auf. Die Membran 5 besteht hiebei aus einer hydrophoben siebartig ausgebildeten Membran 9, welche lediglich für Gase durchlässig ist. In die Öffnungen der siebartigen Membran 9 sind bei dieser Aus¬ bildungsform Pfropfen 10 eingesetzt, welche insbesondere aus Polyhydroxyethylmethaacrylat bestehen und welche Pfropfen so¬ wohl für Gase als auch für Glucose durchlässig sind. Die wei- teren Bezugszeichen der Fig.5 wurden wie in der Fig.l gewählt. Durch den kanalisierten Durchtritt der zu bestimmenden Sub- stanzen in die Enzyme enthaltenden Membran wird die Umsetzung über lange Zeit vergleichmäßigt.5, which represents a specific embodiment, has a non-uniform membrane 5. The membrane 5 consists of a hydrophobic sieve-like membrane 9, which is only permeable to gases. In this embodiment, stoppers 10 are used in the openings of the sieve-like membrane 9, which in particular consist of polyhydroxyethyl methaacrylate and which stoppers are permeable both for gases and for glucose. The other reference numerals in FIG. 5 were chosen as in FIG. Through the channelized passage of the sub- punching into the membrane containing enzymes, the reaction is evened out over a long period of time.
Für die nachfolgenden Ausführungsbeispiele werden folgendeThe following are for the following exemplary embodiments
Substanzen verwendet:Substances used:
Precursor 1:Precursor 1:
19% Hydroxyethylmethacrylat19% hydroxyethyl methacrylate
19% Poly-Hydroxyethylmethacrylat19% poly-hydroxyethyl methacrylate
1% Tetraethylenglycolmethacrylat1% tetraethylene glycol methacrylate
1% w.w'-Dimethoxy w-Phenylacetophenon1% w.w'-dimethoxy w-phenylacetophenone
30% Polyethylenglycol30% polyethylene glycol
30% Wasser30% water
Precursor 2: 96% Precursor 1 und 4% GlukoseoxidasePrecursor 2: 96% precursor 1 and 4% glucose oxidase
Precursor 3:Precursor 3:
98% Precursor 1 und 2% Lakatatoxidase98% Precursor 1 and 2% Lakatatoxidase
Precursor 4:Precursor 4:
98% Precursor 1 und 2% Katalase98% precursor 1 and 2% catalase
Precursor 5:Precursor 5:
96% Precursor 1 und 2% Glutamatoxidase und 2% Glutaminase96% precursor 1 and 2% glutamate oxidase and 2% glutaminase
Precursor 6:Precursor 6:
96% Precursor 1 und 2% Glutamatoxidase und 2% Catalase96% precursor 1 and 2% glutamate oxidase and 2% catalase
Precursor 7:Precursor 7:
49% PS851 ( Poly (Dimethyl- 2 -3 % Methyl Methacryloxypropyl Siloxan) ; Petrarch) , 1% w.w ' -Dimethoxy w-Phenylacetophenon und 50% Toluol49% PS851 (poly (dimethyl-2 -3% methyl methacryloxypropyl siloxane); Petrarch), 1% w.w '-dimethoxy w-phenylacetophenone and 50% toluene
Precursor 8 :Precursor 8:
5% Gelatin5% gelatin
15% Silikondispersion SLM (Wacker)15% silicone dispersion SLM (Wacker)
80% Wasser Precursor 9:80% water Precursor 9:
98% Precursor 8 und 2% Glukoseoxidase98% precursor 8 and 2% glucose oxidase
Precursor 10:Precursor 10:
99% Precursor 8 und 1% Katalase99% precursor 8 and 1% catalase
Precursor 11:Precursor 11:
98% Precursor 1 und 2% Meerretichperoxidase98% precursor 1 and 2% horseradish peroxidase
Precursor 12:Precursor 12:
99.8% Precursor 1 und 0,2% Methacrylsäure g-Aminopropylester99.8% precursor 1 and 0.2% methacrylic acid g-aminopropyl ester
Beisniel 1: Integrierter Glncose/Laktat Sensor für den in-vivoExample 1: Integrated glucose / lactate sensor for in vivo
Einsatzcommitment
Als elektrochemischer Transducer wird eine flexible Elektro¬ denstruktur verwendet welche in Urban G., Jobst G. , Keplinger F., Aschauer E. , Jachimowicz A., Kohl F. (1992); Biosensors & Bioelectronic 7:733-739 beschrieben ist und zwei Platin-Ar¬ beitselektroden mit einer Fläche von 0,4 mm2 welche mit einer elektropolymerisierten permselektiven Schicht versehen sind, einer Platin-Gegenelektrode und einer Silber/Silberchlorid Quasireferenzelektrode enthält, welche auf einer flexiblen Polymerfolie vorliegen und mit einem photostrukturierbaren Polyimidisolationslack isoliert sind.A flexible electrode structure is used as the electrochemical transducer, which is described in Urban G., Jobst G., Keplinger F., Aschauer E., Jachimowicz A., Kohl F. (1992); Biosensors & Bioelectronic 7: 733-739 and two platinum working electrodes with a surface area of 0.4 mm 2 which are provided with an electropolymerized permselective layer, a platinum counter electrode and a silver / silver chloride quasi reference electrode, which contains a flexible Polymer film are present and are insulated with a photostructurable polyimide insulation lacquer.
Der Wafer, welcher eine Vielzahl oben beschriebener Elektro¬ denstrukturen enthält, wird mit Precursor 2 mittels eines Schleuderverfahren beschichtet. Durch eine Photomaske werden mittels eines Maskenjustiergerates jene Arbeitselektroden mit ultraviolettem Licht eine Minute lang bestrahlt welche als Glukoseelektroden ausgebildet werden sollen. Durch diesen Pro¬ zeß bildet sich ein unlösliches polymeres Netzwerk aus, wel¬ ches die enthaltenen Enzyme physikalisch einschließt. Die nicht belichteten und damit nicht vernetzten Teile des Precursors werden in einer Mischung aus Polyethylengly- col/Wasser 1:1 mit Ultraschallunterstützung wieder weggelöst.The wafer, which contains a large number of electrode structures described above, is coated with precursor 2 by means of a centrifugal process. Those working electrodes which are to be designed as glucose electrodes are irradiated with ultraviolet light for one minute through a photomask using a mask adjusting device. This process forms an insoluble polymer network, which physically includes the enzymes it contains. The unexposed and therefore not networked parts of the Precursors are dissolved in a mixture of polyethylene glycol / water 1: 1 with ultrasound support.
Der beschriebene Vorgang wird mit Precursor 3 unter Verwendung einer Photomaske welche die Ausformung der Laktatoxidase- membran auf der zweiten Arbeitselektrode erlaubt wiederholt.The process described is repeated with precursor 3 using a photomask which allows the lactate oxidase membrane to be shaped on the second working electrode.
Unter Verwendung von Precursor 1 und Wiederholung des be¬ schriebenen Vorgangs unter Verwendung einer Photomaske welche die Ausformung von Membranen auf den zwei bereits bestehenden Enzymmembranen erlaubt, wird die, einen Abstand einstellende, Membran erzeugt.Using precursor 1 and repeating the process described using a photomask which allows the formation of membranes on the two already existing enzyme membranes, the membrane which adjusts the distance is produced.
Die Katalasemembran wird nach selbigem Verfahren unter Ver- wendung von Precursor 4 hergestellt und bedeckt den gesamtenThe catalase membrane is produced by the same process using Precursor 4 and covers the entire
Multisensor.Multisensor.
Durch Variation der Umdrehungszahl beim Schleuderbeschichten lassen sich in einfacher Weise die Schichtdicken der Membranen steuern welche im beschriebenen Beispiel 4 μm für die Glu- koseoxidasemembran, 6 μm für die Laktatoxidasemembran, 6 μm für die Zwischenmembran und 6 μm für die Katalasemembran be¬ tragen.By varying the number of revolutions during spin coating, the layer thicknesses of the membranes can be controlled in a simple manner, which in the example described is 4 μm for the glucose oxidase membrane, 6 μm for the lactate oxidase membrane, 6 μm for the intermediate membrane and 6 μm for the catalase membrane.
Beispiel 2: Glutamati abhanσiger GlutaminsensorExample 2: Glutamati-dependent glutamine sensor
Als elektrochemischer Transducer findet eine mit einer permselektiven Schicht versehene Platinarbeitselektrode mit einer Flache von 0,96 mm2 Verwendung welche zusammen mit einer Platingegenelektrode und einer Silber/Silberchlorid Quasirefe¬ renzelektrode mittels dünnschichttechnologischer Verfahren auf Siliziumwafern hergestellt wird.A platinum working electrode with a surface of 0.96 mm 2, which is provided with a permselective layer, is used as the electrochemical transducer, which is produced on silicon wafers together with a platinum counter electrode and a silver / silver chloride quasi reference electrode by means of thin-film technology processes.
Auf die Arbeitselektroden des Wafers, welcher eine Vielzahl oben beschriebener Elektrodenstrukturen enthält, werden mit¬ tels einer computergesteuerten Nanoliterdosiereinrichtung und einem computergesteuerten X-Y Tisch welcher die Dosiereinrich- tung über die einzelnen Arbeitselektroden positioniert, 80 nl Precursor 5 aufgebracht und anschließend der ganze Wafer ul¬ traviolettem Licht ausgesetzt. Nach dem Herauslösen nicht vernetzten Precursormaterials mit einer Mischung von Polyethylenglycol/Wasser 1:1 verbleibt eine Enzymmembran mit einer Schichtdicke von 8 μm. Dieser Prozeß wird mit 40 nl Pre¬ cursor 1 und 40nl Precursor 6 wiederholt welches zur Ausbil¬ dung der gewünschten Zwischenschicht mit einer Dicke von 4 μm und zur Ausbildung der gewünschten Glutamat und Wasserperoxid zerstörenden Membran mit einer Dicke von 4 μm führt.The working electrodes of the wafer, which contains a large number of electrode structures described above, are placed on the computer using a computer-controlled nanoliter metering device and a computer-controlled XY table which controls the metering device. Positioned over the individual working electrodes, 80 nl precursor 5 applied and then the entire wafer exposed to ultraviolet light. After the uncrosslinked precursor material has been removed with a mixture of polyethylene glycol / water 1: 1, an enzyme membrane with a layer thickness of 8 μm remains. This process is repeated with 40 ml precursor 1 and 40 ml precursor 6, which leads to the formation of the desired intermediate layer with a thickness of 4 μm and for the formation of the desired membrane destroying glutamate and water peroxide with a thickness of 4 μm.
Die Sensoren gemäß diesem Ausführungsbeispiel zeigen die erwünschte Selektivität gegen Glutamin auch in Beisein von Glutamat, wodurch keine gleichzeitige Glutamatbestimmung not- wendig ist, um zur korrekten Glutaminkonzentration zu ge¬ langen.The sensors according to this exemplary embodiment show the desired selectivity against glutamine even in the presence of glutamate, as a result of which no simultaneous determination of glutamate is necessary in order to obtain the correct glutamine concentration.
Beispiel 3: Glukosesensor mit PeroxidaseableitungExample 3: Glucose sensor with peroxidase derivation
Als elektrochemischer Transducer findet eine mittels konven¬ tioneller Siebdrucktechnologie hergestellte Elektrodenanord¬ nung Verwendung, welche Arbeitselektroden aus einer Mischung von Graphitpaste mit Meerretichperoxidase und Bindemittel und Silberchloridgegenelektroden aufweist. Auf die Arbeitselek¬ troden wird mittels Siebdruckverfahren der thixotrope Pre¬ cursor 9 aufgebracht und bei Raumtemperatur getrocknet. In gleicher Weise werden die Zwischenmembran aus Precursor 8 und die Katalasemembran aus Precursor 10 hergestellt.An electrode arrangement produced by means of conventional screen printing technology is used as the electrochemical transducer, which has working electrodes made of a mixture of graphite paste with horseradish peroxidase and binder and silver chloride counterelectrodes. The thixotropic precursor 9 is applied to the working electrodes by means of a screen printing process and dried at room temperature. In the same way, the intermediate membrane is made of precursor 8 and the catalase membrane is made of precursor 10.
Bei Sensoren gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird das elektrische Signal nicht durch Oxidation von Wasserstoff¬ peroxid gewonnen sondern durch Reduktion des der Graphitelek¬ trode anhaftenden Enzyms Merretichperoxidase welche ihrerseits von Wasserstoffperoxid pxidiert wird. Beispiel 4; Affinitatssensor mit ZwischenproduktakkumulationIn sensors according to this exemplary embodiment, the electrical signal is not obtained by oxidation of hydrogen peroxide but by reduction of the enzyme mercury peroxidase adhering to the graphite electrode, which in turn is pxidized by hydrogen peroxide. Example 4; Affinity sensor with intermediate product accumulation
Als elektrochemischer Transducer findet die in Beispiel 2 be¬ schriebene Elektrodenstruktur Verwendung. Ober der Arbeits- elektrode, welche in diesem Fall keine permselektive Membran aufweist, wird gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Precursor 11 eine 3 μm dicke Meerretich- peroxidase-Membran ausgebildet. Diese Membran wird mit einer l%igen wäßrigen Lösung von 2,5-Dihydroxy Benzoesäure getränkt und ihrerseits mit einer 2 μm dicken gaspermeablen Membran welche aus Precursor 7 erzeugt wird bedeckt. Unter Verwendung von Precursor 12 wird nach selbigem Verfahren über der gas¬ permeablen Membran eine dritte ca. 0,5 μm dicke Membran ausgebildet an deren primäre Aminogruppen mittels Glutardial- dehydkopplung der gewünschte Antikörper oder Antigen gebunden wird. Die enzymatische Aktivität dieser Membrane bildet sich erst im Laufe des Affinitätstests aus, welcher als klassischer "Sandwich" Test mit Glukoseoxidase als Markerenzym ausgeführt ist.The electrode structure described in Example 2 is used as the electrochemical transducer. A 3 μm thick horseradish peroxidase membrane is formed above the working electrode, which in this case has no permselective membrane, in accordance with the method described in Example 1 using precursor 11. This membrane is impregnated with a 1% aqueous solution of 2,5-dihydroxy benzoic acid and in turn covered with a 2 μm thick gas-permeable membrane which is produced from precursor 7. Using precursor 12, a third approximately 0.5 μm thick membrane is formed over the gas-permeable membrane using the same method, to the primary amino groups of which the desired antibody or antigen is bound by means of glutardialdehyde coupling. The enzymatic activity of this membrane only develops in the course of the affinity test, which is carried out as a classic "sandwich" test with glucose oxidase as the marker enzyme.
] -Anti Hasen IgG <-> Hasen IgG <-> Anti-Hasen lgG--GOD] -Anti-Rabbit IgG <-> Rabbit IgG <-> Anti-Rabbit IgG - GOD
KonjugatConjugate
Bei Sensoren gemäß diesem Ausführungsbeispiel wird das elek- trische Signal durch Reduktion der p-Benzochinoncarbonsäure, welche ihrerseits durch Wasserstoffperoxid unter der kata- lytischen Wirkung von Merretichperoxidase oxidiert wird, er¬ halten.In sensors according to this exemplary embodiment, the electrical signal is obtained by reducing the p-benzoquinonecarboxylic acid, which in turn is oxidized by hydrogen peroxide under the catalytic effect of horseradish peroxidase.
Vorteilhaft an der beschriebenen Anordnung ist die Möglichkeit das entstehende oxidierte Zwischenprodukt zu akkumulieren in¬ dem die verwendete Arbeitselektrode stromlos gehalten wird. Nach Verstreichen einer gewissen Zeitdauer, mittels welcher auf einfachste Weise die Empfindlichkeit des Sensors gesteuert werden kann, wird eine entsprechend kathodische Polarisations¬ spannung an die Arbeitselektrode angelegt und damit das Chinon reduziert, wobei gleichzeitig das Meßsignal gewonnen wird und der Sensor in seinen Ausgangszustand zurückkehrt. An advantage of the arrangement described is the possibility of accumulating the resulting oxidized intermediate product by keeping the working electrode used currentless. After a certain period of time has elapsed, by means of which the sensitivity of the sensor can be controlled in the simplest way, a corresponding cathodic polarization voltage is applied to the working electrode and thus the quinone reduced, the measurement signal being obtained at the same time and the sensor returning to its initial state.

Claims

Patentansprüche: Claims:
1. Sensor zur Erfassung von biologisch, insbesondere enzyma¬ tisch, umsetzbaren Substanzen eines biologischen Substrates mit einer Elektrode und wenigstens einer die Elektrode ab¬ deckenden, mehrschichtigen Membran, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens drei Membranen (3,4,5,6) vorgesehen sind, von welchen wenigstens zwei jeweils wenigstens ein Enzym für die Umsetzung der zu bestimmenden biologischen Substanz und/oder einen Reaktanten für ein Umsetzungsprodukt der enzymatischen Umsetzung enthalten und daß wenigstens eine weitere Membran1. Sensor for the detection of biologically, in particular enzymatically, convertible substances of a biological substrate with an electrode and at least one multilayer membrane covering the electrode, characterized in that at least three membranes (3, 4, 5, 6) are provided are, of which at least two each contain at least one enzyme for the conversion of the biological substance to be determined and / or a reactant for a reaction product of the enzymatic conversion and that at least one further membrane
(3.5) für die Einstellung eines Abstandes zwischen den vorge¬ nannten Membranen (4,6) und/oder in an sich bekannter Weise als permselektive Membran angeordnet ist.(3.5) is arranged for setting a distance between the aforementioned membranes (4,6) and / or in a manner known per se as a permselective membrane.
2. Sensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als En¬ zyme eine Oxidase oder Peroxidase, insbesondere Glucoseoxidase oder Lactatoxidase, eingesetzt wird. .2. Sensor according to claim 1, characterized in that an oxidase or peroxidase, in particular glucose oxidase or lactate oxidase, is used as the enzyme. .
3. Sensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Katalase enthaltende Membran (6) in größerem Abstand von der Elektrode angeordnet ist als eine Oxidase enthaltende Membran (4).3. Sensor according to claim 2, characterized in that a catalase-containing membrane (6) is arranged at a greater distance from the electrode than an oxidase-containing membrane (4).
4. Sensor nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die den Abstand zwischen den Enzyme enthaltenden Membrane4. Sensor according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the membrane containing the distance between the enzymes
(4.6) bestimmende weitere Membran (5) etwa 5 bis 250 %, vor¬ zugsweise 50 bis 150 % der Stärke der näher der Elektrode (2) gelegenen ein Enzym tragenden Membran (4) beträgt.(4.6) determining further membrane (5) is about 5 to 250%, preferably 50 to 150% of the strength of the membrane (4) carrying an enzyme which is closer to the electrode (2).
5. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Elektrode (2) von einer semipermeablen Mem¬ brane (3) mit einer Ausschlußgrenze zwischen 50 und 150 Dalton abgedeckt ist.5. Sensor according to one of claims 1 to 4, characterized gekenn¬ characterized in that the electrode (2) is covered by a semipermeable membrane (3) with an exclusion limit between 50 and 150 daltons.
6. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die den Abstand zwischen den Enzyme tragenden — 8 —6. Sensor according to one of claims 1 to 5, characterized gekenn¬ characterized in that the distance between the enzymes bearing - 8th -
Membranen (4,6) bestimmende Membran (5) aus Hydrogelen be¬ steht.Membrane (4,6) determining membrane (5) consists of hydrogels.
7. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Enzyme tragenden Membranen (4,6) aus radika¬ lisch vernetzten Polymeren, insbesondere aus photovernetzten Polymeren bestehen.7. Sensor according to any one of claims 1 to 6, characterized gekenn¬ characterized in that the enzyme-carrying membranes (4,6) consist of radically cross-linked polymers, in particular of photocrosslinked polymers.
8. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß zwischen einer ein Enzym enthaltenden Membran (6) und der Elektrode (2) wenigstens eine einen Reaktanten für ein enzymatisches Umsetzungsprodukt enthaltende Membran (4) angeordnet ist, wobei die Reaktion zwischen den genannten Reakanten und dem enzymatischen Umsetzungsprodukt elektrisch reversierbar sein muß.8. Sensor according to one of claims 1 to 7, characterized gekenn¬ characterized in that between an enzyme-containing membrane (6) and the electrode (2) at least one reactant for an enzymatic reaction product containing membrane (4) is arranged, the Reaction between the mentioned reactants and the enzymatic reaction product must be electrically reversible.
9. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die Elektrode (2) zur anodischen Umsetzung von H2O2 in 02 unter Ableitung von Elektronen ausgebildet ist.9. Sensor according to one of claims 1 to 8, characterized gekenn¬ characterized in that the electrode (2) for the anodic conversion of H2O2 in 02 is formed with the derivation of electrons.
10. Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die außenliegende, Enzyme, insbesondere Kata¬ lase, enthaltende Membran (6) für die höhermolekularen Um¬ setzungsprodukte einer innenliegenden, Enzyme tragenden Mem- bran (4), insbesondere Gluconolacton oder Pyruvat, permeabel ist. 10. Sensor according to one of claims 1 to 9, characterized in that the outer membrane (6) containing enzymes, in particular catalase, for the higher molecular weight reaction products of an inner membrane-carrying membrane (4), in particular gluconolactone or pyruvate, is permeable.
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