EP0628819A2 - Coated carrier, method for manufacturing it and its use in immobilising biomolecules on the surfaces of solids - Google Patents

Coated carrier, method for manufacturing it and its use in immobilising biomolecules on the surfaces of solids Download PDF

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EP0628819A2
EP0628819A2 EP94108127A EP94108127A EP0628819A2 EP 0628819 A2 EP0628819 A2 EP 0628819A2 EP 94108127 A EP94108127 A EP 94108127A EP 94108127 A EP94108127 A EP 94108127A EP 0628819 A2 EP0628819 A2 EP 0628819A2
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EP
European Patent Office
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polymer
mol
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hydrophilic spacer
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Ludger Dr. Heiliger
Hans-Ulrich Dr. Siegmund
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Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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    • G01N33/545—Synthetic resin

Definitions

  • the present invention describes coated supports and a process for their preparation which are suitable for immobilizing proteins and other biomolecules, in particular receptor proteins. This enables improved production of biosensors and bioassays.
  • the adsorptive processes have the disadvantage of the lack of stability of the protein immobilization
  • the covalent attachment with coupling or activation reagents often requires a relatively high number of process steps, the use of highly pure and unstable reagents or the use of reaction conditions that are not compatible with all proteins.
  • the efficiency of protein immobilization is also often inadequate, either due to protein denaturation or due to insufficient coverage of the surface with proteins.
  • some activation reagents are capable of cross-linking, resulting in poorly defined surfaces. The reproducibility of the immobilization is also very bad.
  • the invention further relates to a method for producing coated carriers, characterized in that an inert carrier according to the Langmuir-Blodgett (LB) - or according to the self-assembly (SA -) - technique with a monomolecular layer made of a polymer suitable for these techniques is coated, this containing 0.8-20 mol%, based on the number of moles of all comonomers, of a comonomer which has an active group which is suitable for binding molecules of biological origin and is located at the end of a hydrophilic spacer group, and between the inert carrier and the monomolecular layer 0-200 monomolecular layers of a polymer suitable for the LB or SA technology without the comonomers containing active groups.
  • LB Langmuir-Blodgett
  • SA - self-assembly
  • the invention relates to the use of the coated carrier for the attachment (immobilization) of molecules of biological origin.
  • the inert solid body can also be primed with one or more layers of film-forming substances in order to ensure better adhesion of the top, protein-binding layer.
  • the solid should have a planar structure and a surface polarity that is as uniform as possible.
  • SA technology There are superficially loaded materials, which can also be introduced later, such as with surface-oxidized plastics.
  • Biosensors can be constructed using numerous methods. Depending on the detection method (electrochemical, optical or other), metal electrodes, semiconductor surfaces, membrane-coated electrodes, light-conducting or translucent materials (glasses, plastics), quartz crystals or surface resonators are to be modified as surfaces to be used according to the invention.
  • Known groups from the classic protein immobilization are possible as reactive groups, for example N-hydroxysuccinimide groups, isocyanate, isothiocyanate or nitrophenyl ester for NH2 immobilization, iodoacetamide or maleimide groups for SH immobilization or hydrazide groups for binding glycoproteins cleaved by periodate treatment.
  • Preferred hydrophilic spacer groups are oligoethylene oxide groups or oligopropylene oxide groups with 5-9 units.
  • the inert solid and the monomolecular layer made of the polymer (II) can be incorporated, the polymer of which is of the formula (II) by omitting the proportion of monomer can be derived with the index s.
  • Polymers that carry more than one electrical charge, which accordingly represent polyions, are suitable for carrying out the SA technology.
  • suitable polycations are compounds with amino functions and sulfonium groups, such as polylysine, polyallylamine, polyethyleneimine, polyvinylpyridine, (meth) acrylates modified with amino functions (for example poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) and dextrans (for example DEAE-dextran) and Chitosan.
  • the amino compounds can be converted into the ionized state either by simple protonation or by quaternization
  • polyanions examples include polycarboxylic acids, polyphosphonic acids and polysulfonic acids.
  • suitable polyanions include polyglutamate, poly (meth) acrylic acid, polystyrene sulfonic acid or dextran sulfate.
  • 0-200 layers of the above polyions suitable for the SA technique can be applied to an inert support.
  • the polymers to be attached are alternately charged in opposite directions; the carrier to be coated is generally pretreated so that it also carries opposite charges to the first polymer layer to be applied.
  • a polyionic polymer which contains 0.8-20 mol%, preferably 2.5-10 mol%, based on the total number of all comonomers, of monomer units which are used for the final layer is then also applied when using the SA technique
  • Binding of molecules of biological origin contains suitable active groups of the type described above located at the end of a hydrophilic spacer group (formula (I)).
  • the cationic groups are hydrazine groups (-NH-NH2 or -NH-NH2 ⁇ HCl)
  • these hydrazine groups can both effect the ionic bond to the underlying polyanionic layer and also with their over this binding amount bind the molecules of biological origin.
  • the active group can account for up to 100 mol% in addition to the proportion according to the invention of 0.8-20 mol%.
  • Counterions are the polyanions H+, (earth) alkali metal cations, NH4 ⁇ or fully or partially substituted by C1-C8 alkyl, phenyl or benzyl ammonium.
  • Counterions are OH ⁇ , halide, sulfate, C1-C8 alkyl sulfonate or phenyl sulfonate in the polycations.
  • Cations can also be caused by exposure to water or Acids only arise when used in SA technology, for example from - NH2 and water -NH3 ⁇ OH ⁇ .
  • polyanions are vinyl polymerizable acids, such as poly (meth) acrylic acid or polystyrene sulfonic acid.
  • the reactive groups are incorporated, as in the case of the polymers for LB technology, using reactive monomers.
  • the same reactive monomers (formula I) are preferably used to build up polymers suitable for SA technology.
  • Preferred polycations are those with the pyridinium, ammonium or -CO-Q-alkylene-ammonium cations mentioned as R9 in the context of the formula (III).
  • the molar proportion of the reactive groups is between 20 and 0.8%, preferably between 10 and 2.5%.
  • the index s in (III) has the value zero for the 0 to 200 layers below the top layer; in the lower layers, the polyanion or polycation therefore has no active group.
  • the exceptional position of the hydrazine group has already been described above.
  • solvents which dissolve the polymers but are not miscible with a medium on the surface of which the polymers are spread are suitable in a known manner.
  • the medium is water
  • solvents are e.g. Methylene chloride and other halogenated aliphatic hydrocarbons; Aromatic series hydrocarbons; water-immiscible esters and other known to those skilled in the art.
  • water-miscible solvents e.g. water-soluble alcohols and ethers, dimethyl sulfoxide, peralkyl acid amides and others known to the person skilled in the art.
  • Molecules of biological origin are, for example, proteins, steroids, metabolic products, vitamins, nucleic acids, preferably biological receptor molecules, such as immunoglobulins, lectins or enzymes, for example glucose oxidase, urease, antibodies.
  • biological receptor molecules such as immunoglobulins, lectins or enzymes, for example glucose oxidase, urease, antibodies.
  • the protein to be immobilized can be used either without pretreatment, in the case of immunoglobulins after cleavage to form Fab fragments or after periodic cleavage of glycoside residues, and via auxiliary proteins, as in the case of immunoglobulins with protein A or protein G.
  • auxiliary proteins as in the case of immunoglobulins with protein A or protein G.
  • the 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers, which due to the content of m-TMI are also in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm, and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and for the alkyl part the absorptions between 0.7 and 2.2 ppm.
  • the 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers in the alkyl range between 0.7 and 2.2 ppm as well as the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm.
  • the 32S elemental analysis showed 0.45% S, corresponding to 4.1 mol% reactive group.
  • the crude solution was added dropwise to 500 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with water and dried.
  • the 1 H-NMR showed the broad resonances typical for polymers in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and 2 for the alkyl part, 2 ppm.
  • Example 3a The experiment from Example 3a) was repeated, using dimethyl sulfoxide as the solvent instead of dioxane.
  • the 14N elemental analysis showed 0.4% N for polymer 5, or 0.7% N for polymer 6, corresponding to 2.8 mol%, or 5 mol% of the NHS-activated reactive group from Example 3a).
  • the 1 H-NMR showed the broad resonances typical for polymers in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and 2 for the alkyl part, 2 ppm.
  • the 14N elemental analysis showed 0.9% N, corresponding to 6 mol% of reactive group 3 from Example 3.
  • the crude solution was added dropwise to 400 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with water and dried.
  • the 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers in the aromatic range between 6.5 and 8.3 ppm as well as the protons adjacent to the ester groups between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and for the alkyl part 2.2 ppm.
  • the absorbance values at 480 nm standardized to the pure dye gave 15% by weight of dye in the polymer.
  • the 14N elemental analysis showed 1.5% N, corresponding to 4 mol% of the NHS-activated reactive group 3 from Example 3.
  • a glass or plastic carrier was coated with an LB (method according to DE-OS 39 38 598) or SA layer (method according to DE-OS 42 08 645) and covered with a second carrier of the same type, the edges of which were covered with a 0.1 mm thick layer Teflon tape was coated so that there was a 0.1 mm gap between the two supports.
  • This space was filled with 1 ml of a solution of ⁇ -galactosidase (1 mg / ml, 10 mmol carbonate buffer pH 8) and then incubated for 1 h at room temperature.
  • EPPS buffer 0.1 mol / l N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [3-propanesulfonic acid] (EPPS), 1 mmol / l MgCl2, 0.05% NaN3, 0.1 g / l bovine serum albumin, pH 8) washed.
  • the plate was incubated with 2 ml of a 0.5 mmol / l solution of dimethylacridinone galactoside (DMAG) in EPPS buffer for 1 h at 37 ° C. The solution was then transferred to a cuvette and added to Measure 634 nm in the photometer against untreated DMAG solution.
  • DMAG dimethylacridinone galactoside
  • 0.25 ml of a solution of protein A (0.1 mg / ml in 0.01 mol / l carbonate buffer pH 8.0) was passed through and then incubated overnight at room temperature. The cover slip was then removed and the film was rinsed in citrate buffer (25 mmol / l citrate, 15 mmol / l potassium phosphate, 0.5 mol / l KCl, 1 mmol / l MgCl2).
  • the linkage of the digitoxigenin derivative to immobilized immunoglobulin and its washing stability compared to citrate buffer pH 6.4 could be detected via the ratio of the fluorescence 577 to 515 nm (Förster energy transfer, as described in DE-OS 39 38 598) (see table).
  • This space was mixed with 1 ml of a solution of anti-digoxin IgG, which had previously been subjected to periodate oxidation (4 mg IgG in 0.5 ml 0.01 M NaIO4, 0.1 M acetate buffer pH 5.5, incubated for 45 min at room temperature, then desalted using Biogel P6G ).
  • the piece of film was rinsed with citrate buffer pH 6.4 (see Example 10), left to dry and cut into smaller pieces.
  • the fluorescence was measured at 495 and 577 nm on these sample foils before and after immersion in a solution containing TRITC-labeled digitoxigenin (1 ⁇ g / ml in citrate buffer pH 6.4 with the addition of 0.001% by volume Tween 20) (suggestion: 405 nm).
  • the binding of the digitoxigenin derivative to immobilized immunoglobulin and its washing stability compared to citrate buffer pH 6.4 / Tween 20 could be detected via the ratio of the fluorescence 577 to 495 nm (see table).

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Abstract

Coated carriers consist of an inert solid body and of a monomolecular layer of a polymer which contains active groups which are located at the end of a hydrophilic spacer group. These active groups are suitable for binding molecules of biological origin. Between the inert solid body and the monomolecular polymer layer it is possible to insert 0-200 monomolecular layers without active groups. All the layers are applied by the LB or SA technique. Molecules of biological origin can be bound (immobilised) on these coated carriers.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt beschichtete Träger und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, die zur Immobilisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen, insbesondere von Rezeptorproteinen geeignet sind. Dies ermöglicht eine verbesserte Herstellung von Biosensoren und Biotests.The present invention describes coated supports and a process for their preparation which are suitable for immobilizing proteins and other biomolecules, in particular receptor proteins. This enables improved production of biosensors and bioassays.

Die Immobilisierung von Proteinen und anderen Biomolekülen ist für viele analytische und biotechnologische Verfahren von Wichtigkeit. Als analytische Verfahren seien hier insbesondere Festphasen-Immunoassays sowie Bio- und Immunosensoren genannt, bei denen sich durch die Immobilisierung eine Verbesserung der Handhabbarkeit von Immunglobulinen (Antikörpern) ergibt. Nach dem derzeitigen Stand der Technik werden Proteine meist adsorptiv über ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen an Oberflächen gebunden oder sie werden über kovalente Bindungen über die Verwendung von Hilfsreagenzien angekoppelt. Als ein mittlerweile klassisch zu nennendes Beispiel für letztere Vorgehensweise sei die Aktivierung von Glas durch APTS (3-Aminopropyl-triethoxysilan) und Glutardialdehyd mit anschließender Bindung von Protein und einer ggf. daran anschließenden Reduktion der entstehenden Schiff-Base durch Natriumborhydrid zu nennen. Einen Überblick über bei Immunoassays benutzte Verfahren findet man beispielsweise in P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", S. 297-328 (Elsevier, Amsterdam 1987). Für biotechnologische Verfahren sind daneben Einkapselungsverfahren für Enzyme in permeablen Polymeren oder Membranen gebräuchlich.The immobilization of proteins and other biomolecules is important for many analytical and biotechnological processes. Solid-phase immunoassays and bio- and immunosensors, in which immobilization improves the handling of immunoglobulins (antibodies), may be mentioned here in particular as analytical methods. According to the current state of the art, proteins are mostly bound to surfaces by adsorption through ionic or hydrophobic interactions, or they are coupled via covalent bonds through the use of auxiliary reagents. Activation of glass by APTS (3-aminopropyl-triethoxysilane) and glutardialdehyde with subsequent binding of protein and a subsequent subsequent reduction of the resulting Schiff base by sodium borohydride should be mentioned as a classic example of the latter procedure. An overview of methods used in immunoassays can be found, for example, in P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", pp. 297-328 (Elsevier, Amsterdam 1987). Encapsulation processes for enzymes in permeable polymers or membranes are also common for biotechnological processes.

Während die adsorptiv arbeitenden Verfahren den Nachteil der mangelnden Stabilität der Proteinimmobilisierung besitzen, erfordert die kovalente Anbindung mit Kupplungs- oder Aktivierungsreagenzien oft eine relativ hohe Anzahl von Prozeßschritten, die Verwendung von hochreinen und instabilen Reagenzien oder die Anwendung von nicht mit allen Proteinen kompatiblen Umsetzungsbedingungen. Auch ist der Wirkungsgrad der Proteinimmobilisierung oft mangelhaft, entweder durch Proteindenaturierung oder durch eine zu geringe Belegung der Oberfläche mit Proteinen. Weiterhin sind einige Aktivierungsreagenzien zur Quervernetzung fähig, wobei sich schlecht definierte Oberflächen ergeben. Die Reproduzierbarkeit der Immobilisierung wird damit ebenfalls sehr schlecht.While the adsorptive processes have the disadvantage of the lack of stability of the protein immobilization, the covalent attachment with coupling or activation reagents often requires a relatively high number of process steps, the use of highly pure and unstable reagents or the use of reaction conditions that are not compatible with all proteins. The efficiency of protein immobilization is also often inadequate, either due to protein denaturation or due to insufficient coverage of the surface with proteins. Furthermore, some activation reagents are capable of cross-linking, resulting in poorly defined surfaces. The reproducibility of the immobilization is also very bad.

In der vorliegenden Erfindung werden diese Probleme dadurch gelöst, daß neue beschichtete Träger, die mit einem dünnen, filmbildenden Polymer überzogen sind, bereitgestellt werden, bei denen das Polymer

  • a) auf der Oberfläche eines inerten Festkörpers fest anhaftet und
  • b) Reaktivgruppen zur kovalenten Bindung des zu immobilisierenden Proteins besitzt.
In the present invention, these problems are solved by providing new coated supports coated with a thin film-forming polymer in which the polymer
  • a) adheres firmly to the surface of an inert solid and
  • b) has reactive groups for covalently binding the protein to be immobilized.

Der Vorteil besteht in einer Reduzierung des Immobilisierungsaufwandes auf im wesentlichen zwei Schritte:

  • a) Beschichtung des Festkörpers
  • b) kovalente Anbindung des Proteins an den beschichteten Festkörper
Der Prozeß der Filmbildung (Schichtbildung) kann auf verschiedene Weisen vor sich gehen. Es bieten sich die Langmuir-Blodgett- (LB-) Technik, die Self-Assembly-(SA-) Technik oder eine Kombination aus beiden an. Beide Verfahren sind in A. Ullman, "An Introduction to Ultrathin Organic Films", Part Two, S. 101-132 bzw. Part Three, S. 237-304 (Academic Press, San Diego, 1991) beschrieben. Insbesondere das in DE-OS 40 26 978 und DE-OS 42 08 645 beschriebene SA-Verfahren, bei dem Schichten aus funktionalisierbaren Polyionen verwendet werden, ist aufgrund seiner einfachen Handhabung und der Möglichkeit, beliebig geformte Festkörper sowie Hohlräume zu beschichten, für diesen Zweck gut geeignet.The advantage is a reduction in the immobilization effort to essentially two steps:
  • a) coating the solid
  • b) covalent attachment of the protein to the coated solid
The process of film formation (layer formation) can take place in different ways. Langmuir-Blodgett (LB) technology, self-assembly (SA) technology or a combination of both are available. Both methods are described in A. Ullman, "An Introduction to Ultrathin Organic Films", Part Two, pp. 101-132 and Part Three, pp. 237-304 (Academic Press, San Diego, 1991). In particular, the SA process described in DE-OS 40 26 978 and DE-OS 42 08 645, in which layers of functionalizable polyions are used, is for this purpose due to its simple handling and the possibility of coating solid bodies and cavities of any shape well suited.

Die Erfindung betrifft somit beschichtete Träger, bestehend aus

  • a) einem inerten Festkörper und
  • b) einer monomolekularen Schicht eines für die Langmuir-Blodgett-(LB-) oder für die Self-Assembly-(SA-) Technik geeigneten Polymers, wobei
  • c) das Polymer 0,8-20 Mol-%, bevorzugt 2,5-10 Mol-%,bezogen auf die Molzahl aller Comonomere, an einem Comonomer enthält, das eine zur Bindung von Molekülen biologischen Ursprungs geeignete, am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppe besitzt und wobei
  • d) zwischen dem inerten Träger a) und der monomolekularen Schicht b) 0-200 monomolekulare Schichten eines für die LB- oder SA-Technik geeigneten Polymers ohne Aktivgruppen gemäß c) angeordnet sind.
The invention thus relates to coated carriers consisting of
  • a) an inert solid and
  • b) a monomolecular layer of a polymer suitable for the Langmuir-Blodgett (LB) or for the self-assembly (SA) technique, where
  • c) the polymer contains 0.8-20 mol%, preferably 2.5-10 mol%, based on the number of moles of all comonomers, of a comonomer which is suitable for binding molecules of biological origin at the end of a hydrophilic spacer group has a sedentary active group and where
  • d) 0-200 monomolecular layers of a polymer suitable for the LB or SA technology without active groups according to c) are arranged between the inert carrier a) and the monomolecular layer b).

Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung beschichteter Träger, dadurch gekennzeichnet, daß ein inerter Träger nach der Langmuir-Blodgett (LB)- oder nach der Self-Assembly (SA-)-Technik mit einer monomolekularen Schicht aus einem für diese Techniken geeigneten Polymer beschichtet wird, wobei dieses 0,8-20 Mol-%, bezogen auf die Molzahl aller Comonomere, an einem Comonomer enthält, das eine zur Bindung von Molekülen biologischen Ursprungs geeignete, am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppe besitzt und wobei zwischen dem inerten Träger und der monomolekularen Schicht 0-200 monomolekulare Schichten eines für die LB- oder SA-Technik geeigneten Polymers ohne die Aktivgruppen enthaltenden Comonomeren angeordnet werden.The invention further relates to a method for producing coated carriers, characterized in that an inert carrier according to the Langmuir-Blodgett (LB) - or according to the self-assembly (SA -) - technique with a monomolecular layer made of a polymer suitable for these techniques is coated, this containing 0.8-20 mol%, based on the number of moles of all comonomers, of a comonomer which has an active group which is suitable for binding molecules of biological origin and is located at the end of a hydrophilic spacer group, and between the inert carrier and the monomolecular layer 0-200 monomolecular layers of a polymer suitable for the LB or SA technology without the comonomers containing active groups.

Die Erfindung betrifft schließlich die Verwendung des beschichteten Trägers zur Anbindung (Immobilisierung) von Molekülen biologischen Ursprungs.Finally, the invention relates to the use of the coated carrier for the attachment (immobilization) of molecules of biological origin.

Der inerte Festkörper kann dabei auch zunächst mit einer oder mehreren Lagen von filmbildenden Substanzen grundiert sein, um eine bessere Anhaftung der obersten, proteinbindenden Schicht zu gewährleisten. Bei Verwendung der LB-Technik sollte der Festkörper eine planare Struktur und eine möglichst einheitliche Oberflächenpolarität besitzen. Für die Beschichtung mit Polyionen nach der SA-Technik bieten sich oberflächlich geladene Materialien an, was sich auch nachträglich einführen läßt, wie z.B. bei oberflächenoxidierten Kunststoffen.The inert solid body can also be primed with one or more layers of film-forming substances in order to ensure better adhesion of the top, protein-binding layer. When using the LB technique, the solid should have a planar structure and a surface polarity that is as uniform as possible. For coating with polyions using SA technology There are superficially loaded materials, which can also be introduced later, such as with surface-oxidized plastics.

Besonders interessant als inerte Festkörper sind alle Materialien, auf denen Biotests ausgeführt werden oder aus denen die Oberflächen von Biosensoren hergestellt werden. Biotests finden beispielsweise auf Tüpfelplatten, Teststreifen oder in Durchflußsystemen statt; typische Materialien sind Kunststoffe, modifizierte Biopolymere und Gläser. Biosensoren lassen sich nach zahlreichen Verfahren aufbauen. Je nach Nachweismethode (elektrochemisch, optisch oder andere) sind Metallelektroden, Halbleiteroberflächen, membranüberzogene Elektroden, lichtleitende oder lichtdurchlässige Materialien (Gläser, Kunststoffe), Schwingquarze oder Oberflächenresonatoren als erfindungsgemäß einzusetzende Oberflächen zu modifizieren.Of particular interest as inert solids are all materials on which bioassays are carried out or from which the surfaces of biosensors are made. Biotests take place, for example, on spotted plates, test strips or in flow systems; typical materials are plastics, modified biopolymers and glasses. Biosensors can be constructed using numerous methods. Depending on the detection method (electrochemical, optical or other), metal electrodes, semiconductor surfaces, membrane-coated electrodes, light-conducting or translucent materials (glasses, plastics), quartz crystals or surface resonators are to be modified as surfaces to be used according to the invention.

Als Reaktivgruppen kommen aus der klassischen Proteinimmobilisierung bekannte Gruppen in Frage, beispielsweise N-Hydroxysuccinimidgruppen, Isocyanat, Isothiocyanat oder Nitrophenylester zur NH₂-Immobilisierung, Iodacetamid- oder Maleimidgruppen zur SH-Immobilisierung oder Hydrazidgruppen zur Bindung von durch Periodatbehandlung gespaltenen Glykoproteinen.Known groups from the classic protein immobilization are possible as reactive groups, for example N-hydroxysuccinimide groups, isocyanate, isothiocyanate or nitrophenyl ester for NH₂ immobilization, iodoacetamide or maleimide groups for SH immobilization or hydrazide groups for binding glycoproteins cleaved by periodate treatment.

Eine direkte Ankopplung ans Polymerrückgrat, beispielsweise der Einbau von N-Hydroxysuccinimidyl-methacrylat, führte jedoch zu keiner zufriedenstellenden Proteinimmobilisierung. Es wurde gefunden, daß es vorteilhaft ist, diese Gruppen über eine hydrophile Spacergruppe ausreichender Länge an das Polymerrückgrat anzubinden, wodurch sich offenbar eine bessere Annäherung der Reaktivgruppe an das zu bindende Protein in wäßrigem Medium ergibt. Bei den Spacergruppen haben sich heteroatomhaltige Kohlenwasserstoffketten von mehr als 4 Atomen, vorzugsweise von 5-30, besonders bevorzugt 7-30, ganz besonders bevorzugt von 13 bis 30 Atomen Länge bewährt, insbesondere Oligoethylenoxidketten. Beispiele für derartige Gruppen sind die folgenden Monomere (I):



        CH₂=C(R¹)―R²   (I),



in denen

R¹
für H oder CH₃ steht und
R²
die Gruppe
Figure imgb0001
 oder -CO-O-R⁴ bedeutet, wobei
R³
für -(CH₂-)m-SO₂-(CH₂-)n-N=C=X mit X=S oder O oder für -C(CH₃)₂-NH-CO-Y steht,
R⁴
für -(CH₂-)m-NH-CO-Y, -[CH(R¹)-CH₂-O-)o-SO₂-R⁵ oder -[CH(R¹)-CH₂-O-]o-CO-R⁶ steht,
Y
für
Figure imgb0002
 -NH-NH₂ oder -NH-NH₃⊕Cl⊖,
Figure imgb0003
 oder -NH-(CH₂-)p-O-SO₂-R⁵ steht,
R⁵
CH₃, CpF2p+1, Phenyl oder Tolyl bedeutet,
R⁶
-(CH₂-)m-CO-Y oder Y bedeutet,
m und n
unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 4 sind und
o und p
unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 9 sind.
A direct coupling to the polymer backbone, for example the incorporation of N-hydroxysuccinimidyl methacrylate, did not lead to a satisfactory protein immobilization. It has been found that it is advantageous to bind these groups to the polymer backbone via a hydrophilic spacer group of sufficient length, which apparently results in a better approximation of the reactive group to the protein to be bound in an aqueous medium. For the spacer groups, heteroatom-containing hydrocarbon chains of more than 4 atoms, preferably of 5-30, particularly preferably 7-30, very particularly preferably of 13 to 30 atoms in length, in particular oligoethylene oxide chains, have proven successful. Examples of such groups are the following monomers (I):



CH₂ = C (R¹) ―R² (I),



in which
R¹
represents H or CH₃ and
R²
the group
Figure imgb0001
 or -CO-O-R⁴ means, wherein
R³
stands for - (CH₂-) m -SO₂- (CH₂-) n -N = C = X with X = S or O or for -C (CH₃) ₂-NH-CO-Y,
R⁴
represents - (CH₂-) m -NH-CO-Y, - [CH (R¹) -CH₂-O-) o -SO₂-R⁵ or - [CH (R¹) -CH₂-O-] o -CO-R⁶ ,
Y
For
Figure imgb0002
 -NH-NH₂ or -NH-NH₃ ⊕ Cl ⊖ ,
Figure imgb0003
 or -NH- (CH₂-) p -O-SO₂-R⁵,
R⁵
Represents CH₃, C p F 2p + 1 , phenyl or tolyl,
R⁶
- (CH₂-) m -CO-Y or Y means
m and n
are independently integers from 1 to 4 and
o and p
are independently integers from 1 to 9.

Bevorzugt als hydrophile Spacergruppen sind Oligoethylenoxidgruppen oder Oligopropylenoxidgruppen mit 5-9 Einheiten.Preferred hydrophilic spacer groups are oligoethylene oxide groups or oligopropylene oxide groups with 5-9 units.

Diese lassen sich in folgende, beispielhaft genannte, für die LB-Technik geeignete Polymere (II) einbauen:

Figure imgb0004

   in der

R¹ und R²
die oben genannte Bedeutung haben,
R⁷ und R⁸
unabhängig voneinander H oder CH₃ bedeuten,
q
eine ganze Zahl von 12-22, bevorzugt 16-18 darstellt,
r
einen Wert von 0,6-1,25, bevorzugt 0,8-1,1, besonders bevorzugt 0,9-1,05 bedeutet und
s
einen Wert von 0,02-0,4, bevorzugt 0,05-0,2 bedeutet.
These can be incorporated into the following polymers (II), which are mentioned as examples and are suitable for LB technology:
Figure imgb0004
in the
R1 and R2
have the meaning given above,
R⁷ and R⁸
independently of one another denote H or CH₃,
q
represents an integer from 12-22, preferably 16-18,
r
is a value of 0.6-1.25, preferably 0.8-1.1, particularly preferably 0.9-1.05 and
s
means a value of 0.02-0.4, preferably 0.05-0.2.

Zwischen dem inerten Festkörper und der monomolekularen Schicht aus dem Polymer (II) können 0-200, bevorzugt 0-50, besonders bevorzugt 0-20, hochgeordnete Polymerschichten eingelagert werden, deren Polymer aus dem der Formel (II) durch Fortlassen des Anteils an Monomer mit dem Index s ableitbar ist.Between the inert solid and the monomolecular layer made of the polymer (II), 0-200, preferably 0-50, particularly preferably 0-20, highly ordered polymer layers can be incorporated, the polymer of which is of the formula (II) by omitting the proportion of monomer can be derived with the index s.

Für die Durchführung der SA-Technik kommen Polymere in Frage, die mehr als eine elektrische Ladung tragen, die demnach Polyionen darstellen.Polymers that carry more than one electrical charge, which accordingly represent polyions, are suitable for carrying out the SA technology.

Als Polykationen kommen beispielsweise Verbindungen mit Aminofunktionen und Sulfoniumgruppen in Betracht, wie Polylysin, Polyallylamin, Polyethylenimin, Polyvinylpyridin, mit Aminofunktionen modifizierte (Meth-)Acrylate (z.B. Poly-N,N-dimethylaminoethyl-methacrylat) und Dextrane (z.B. DEAE-Dextran) sowie Chitosan. Die Aminoverbindungen können entweder durch einfache Protonierung oder durch Quaternisierung in den ionisierten Zustand übergeführt werdenExamples of suitable polycations are compounds with amino functions and sulfonium groups, such as polylysine, polyallylamine, polyethyleneimine, polyvinylpyridine, (meth) acrylates modified with amino functions (for example poly-N, N-dimethylaminoethyl methacrylate) and dextrans (for example DEAE-dextran) and Chitosan. The amino compounds can be converted into the ionized state either by simple protonation or by quaternization

Als Polyanionen kommen beispielsweise Polycarbonsäuren, Polyphosphonsäuren und Polysulfonsäuren in Betracht. Beispiele hierfür sind Polyglutamat, Poly-(meth-)acrylsäure, Polystyrolsulfonsäure oder Dextransulfat.Examples of suitable polyanions are polycarboxylic acids, polyphosphonic acids and polysulfonic acids. Examples include polyglutamate, poly (meth) acrylic acid, polystyrene sulfonic acid or dextran sulfate.

In einer ähnlichen Weise, wie sie oben für die LB-Technik beschrieben wurde, können auf einem inerten Träger 0-200 Schichten der zur SA-Technik geeigneten obigen Polyionen angebracht werden. In bekannter Weise sind die anzubringenden Polymere jeweils alternativ gegensinnig geladen; der zu beschichtende Träger ist im allgemeinen vorbehandelt, so daß er zur ersten anzubringenden Polymerschicht ebenfalls gegensinnige Ladungen trägt.In a similar manner as described above for the LB technique, 0-200 layers of the above polyions suitable for the SA technique can be applied to an inert support. In a known manner, the polymers to be attached are alternately charged in opposite directions; the carrier to be coated is generally pretreated so that it also carries opposite charges to the first polymer layer to be applied.

Als abschließende Schicht wird sodann auch bei Anwendung der SA-Technik ein polyionisches Polymer angebracht, das 0,8-20 Mol-%, bevorzugt 2,5-10 Mol-%, bezogen auf die Gesamtzähl aller Comonomere, an Monomereinheiten enthält, die zur Bindung von Molekülen biologischen Ursprungs geeignete, am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppen der oben beschriebenen Art enthält (Formel (I)).A polyionic polymer which contains 0.8-20 mol%, preferably 2.5-10 mol%, based on the total number of all comonomers, of monomer units which are used for the final layer is then also applied when using the SA technique Binding of molecules of biological origin contains suitable active groups of the type described above located at the end of a hydrophilic spacer group (formula (I)).

Für den Fall, daß als abschließende Schicht ein Polykation angebracht wird und die kationischen Gruppen Hydrazingruppen sind (-NH-NH₂ oder -NH-NH₂·HCl), können diese Hydrazingruppen sowohl die ionische Bindung zur darunter liegenden polyanionischen Schicht bewirken als auch mit ihrer über diese Bindung hinausgehende Menge die Moleküle biologischen Ursprungs binden. In einem solchen Fall kann also die Aktivgruppe über den erfindungsgemäßen Anteil von 0,8-20 Mol-% hinaus bis zu 100 Mol-% ausmachen.In the event that a polycation is applied as the final layer and the cationic groups are hydrazine groups (-NH-NH₂ or -NH-NH₂ · HCl), these hydrazine groups can both effect the ionic bond to the underlying polyanionic layer and also with their over this binding amount bind the molecules of biological origin. In such a case, the active group can account for up to 100 mol% in addition to the proportion according to the invention of 0.8-20 mol%.

Somit ergeben sich in Analogie zur obigen Formel (II) für die SA-Technik einsetzbare Polymere für die oberste Schicht der Formel

Figure imgb0005

in der R¹, R², R⁷ und s die obige Bedeutung haben,

t
einen Wert von 1,6 bis 2,25, bevorzugt 1,8 bis 2,1, besonders bevorzugt 1,9 bis 2,05, annimmt und
R⁹
ein Anion aus der Gruppe von -SO₃⊖, -C₆H₄-SO₃⊖, -COO⊖ und -O-PO₃⊖⊖ oder
ein Kation aus der Gruppe von
Figure imgb0006
 -N(R¹⁰, R¹¹, R¹²), -S(R¹⁰, R¹¹) ,
Figure imgb0007
 -NH-NH₃⊕ oder
Figure imgb0008
 bedeutet,
worin R¹⁰, R¹¹ und R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₂₂-Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeuten und
Q für O oder NH steht und die Indices o und m unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 9 darstellen.
In analogy to the above formula (II), this results in polymers which can be used for the SA technique for the top layer of the formula
Figure imgb0005
in which R¹, R², R⁷ and s have the above meaning,
t
assumes a value of 1.6 to 2.25, preferably 1.8 to 2.1, particularly preferably 1.9 to 2.05 and
R⁹
an anion from the group of -SO₃ ⊖ , -C₆H₄-SO₃ ⊖ , -COO ⊖ and -O-PO₃ ⊖⊖ or
a cation from the group of
Figure imgb0006
 -N (R¹⁰, R¹¹, R¹²), -S (R¹⁰, R¹¹),
Figure imgb0007
 -NH-NH₃ ⊕ or
Figure imgb0008
 means
wherein R¹⁰, R¹¹ and R¹² independently represent hydrogen, C₁-C₂₂-alkyl, phenyl or benzyl and
Q stands for O or NH and the indices o and m independently represent integers from 1 to 9.

Gegenionen sind bei den Polyanionen H⁺, (Erd)Alkalimetallkationen, NH₄⊕ oder ganz oder teilweise durch C₁-C₈-Alkyl, Phenyl oder Benzyl substituiertes Ammonium.Counterions are the polyanions H⁺, (earth) alkali metal cations, NH₄ ⊕ or fully or partially substituted by C₁-C₈ alkyl, phenyl or benzyl ammonium.

Gegenionen sind bei den Polykationen OH⊖, Halogenid, Sulfat, C₁-C₈-Alkylsulfonat oder Phenylsulfonat. Kationen können auch durch Einwirkung von Wasser oder Säuren erst bei der Anwendung in der SA-Technik entstehen, so beispielsweise aus - NH₂ und Wasser -NH₃⊕OH⊖.Counterions are OH ⊖ , halide, sulfate, C₁-C₈ alkyl sulfonate or phenyl sulfonate in the polycations. Cations can also be caused by exposure to water or Acids only arise when used in SA technology, for example from - NH₂ and water -NH₃ ⊕ OH ⊖ .

Bevorzugt bei den Polyanionen sind vinylpolymerisierbare Säuren, wie Poly-(meth)acrylsäure oder Polystyrolsulfonsäure. Bei diesen erfolgt der Einbau der Reaktivgruppen ebenso wie bei den Polymeren für die LB-Technik über Reaktivmonomere. Es werden bevorzugt die gleichen Reaktivmonomere (Formel I) zum Aufbau von für die SA-Technik geeigneten Polymeren verwendet.Preferred for the polyanions are vinyl polymerizable acids, such as poly (meth) acrylic acid or polystyrene sulfonic acid. In these, the reactive groups are incorporated, as in the case of the polymers for LB technology, using reactive monomers. The same reactive monomers (formula I) are preferably used to build up polymers suitable for SA technology.

Bevorzugt bei den Polykationen sind solche mit den im Rahmen der Formel (III) als R⁹ genannten Pyridinium-, Ammonium- oder -CO-Q-Alkylen-ammonium-Kationen.Preferred polycations are those with the pyridinium, ammonium or -CO-Q-alkylene-ammonium cations mentioned as R⁹ in the context of the formula (III).

Der molare Anteil der Reaktivgruppen beträgt zwischen 20 und 0,8 %, bevorzugt zwischen 10 und 2,5 %.The molar proportion of the reactive groups is between 20 and 0.8%, preferably between 10 and 2.5%.

In Analogie zur oben beschriebenen LB-Technik hat bei den 0 bis 200 Schichten unter der obersten Schicht der Index s in (III) den Wert Null; bei den unteren Schichten trägt das Polyanion bzw. Polykation also keine Aktivgruppe. Die Ausnahmestellung der Hydrazingruppe wurde oben bereits beschrieben.In analogy to the LB technique described above, the index s in (III) has the value zero for the 0 to 200 layers below the top layer; in the lower layers, the polyanion or polycation therefore has no active group. The exceptional position of the hydrazine group has already been described above.

Für die LB-Technik kommen in bekannter Weise Lösungsmittel in Frage, die die Polymeren lösen, aber nicht mischbar sind mit einem Medium, auf dessen Oberfläche die Polymere gespreitet werden. Im wichtigen Fall, bei dem das Medium Wasser ist, sind solche Lösungsmittel z.B. Methylenchlorid und andere halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe; (Halogen)Kohlenwasserstoffe der aromatischen Reihe; mit Wasser nicht mischbare Ester und andere, dem Fachmann bekannte.For LB technology, solvents which dissolve the polymers but are not miscible with a medium on the surface of which the polymers are spread are suitable in a known manner. In the important case where the medium is water, such solvents are e.g. Methylene chloride and other halogenated aliphatic hydrocarbons; Aromatic series hydrocarbons; water-immiscible esters and other known to those skilled in the art.

Für die SA-Technik kommen für den Fall von Wasser als Medium hochpolare, gegebenenfalls mit Wasser mischbare Lösungsmittel in Frage, z.B. wasserlösliche Alkohole und Ether, Dimethylsulfoxid, Peralkyl-säureamide und andere, dem Fachmann bekannte.For the SA technology, in the case of water as a medium, highly polar, optionally water-miscible solvents are suitable, e.g. water-soluble alcohols and ethers, dimethyl sulfoxide, peralkyl acid amides and others known to the person skilled in the art.

Moleküle biologischen Ursprungs sind beispielsweise Proteine, Steroide, Stoffwechselprodukte, Vitamine, Nukleinsäuren, bevorzugt biologische Rezeptormoleküle, wie Immunoglobuline, Lectine oder Enzyme, beispielsweise Glukoseoxidase, Urease, Antikörper.Molecules of biological origin are, for example, proteins, steroids, metabolic products, vitamins, nucleic acids, preferably biological receptor molecules, such as immunoglobulins, lectins or enzymes, for example glucose oxidase, urease, antibodies.

Das zu immobilisierende Protein kann entweder ohne Vorbehandlung, im Falle von Immunglobulinen nach Spaltung zu Fab-Fragmenten oder nach Periodatspaltung von Glykosidresten, sowie über Hilfsproteine, wie im Falle von Immunglobulinen mit Protein A oder Protein G, eingesetzt werden. Mit den so immobilisierten Proteinen können in gleicher Art, wie in EP 429 907-A für Concanavalin A und Mannose beschrieben, Bindungen von Antigen über einen Förster-Energietransfer nachgewiesen werden.The protein to be immobilized can be used either without pretreatment, in the case of immunoglobulins after cleavage to form Fab fragments or after periodic cleavage of glycoside residues, and via auxiliary proteins, as in the case of immunoglobulins with protein A or protein G. With the proteins immobilized in this way, in the same way as described in EP 429 907-A for concanavalin A and mannose, binding of antigen can be detected via a Förster energy transfer.

Beispiele:Examples: Beispiel 1:Example 1: Synthese des Reaktivpolymers 1 mit Reaktivgruppe 1Synthesis of reactive polymer 1 with reactive group 1

In 55 ml Dioxan wurden 4 g Stearylmethacrylat, 2,36 g 4-Methacryloyl-2,2-dimethyl-dioxolan, 0,24 g m-Isopropenyl-α-α-dimethyl-benzyl-isocyanat (m-TMI®, Fa. American Cyanamid Co.) und 10 mg Azobisisobutyronitril eingetragen. Die Apparatur wurde evakuiert, mit Reinststickstoff beschickt, dieser Zyklus zweimal wiederholt und 6 h bei 70oC gerührt. Zu der Rohlösung wurden 0,2 g p-Nitrophenol und 10 mg Diazabicyclo[2,2,2]octan gegeben. Danach wurde die Lösung 16 h bei 55oC gerührt. Nach Erkalten wurde die Rohlösung in 200 ml Methanol eingetropft, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel, der abgesaugt wurde.4 g of stearyl methacrylate, 2.36 g of 4-methacryloyl-2,2-dimethyl-dioxolane, 0.24 g of m-isopropenyl-α-α-dimethyl-benzyl-isocyanate (m-TMI®, Fa. American Cyanamid Co.) and 10 mg azobisisobutyronitrile. The apparatus was evacuated, charged with ultrapure nitrogen, this cycle was repeated twice and the mixture was stirred at 70 ° C. for 6 h. 0.2 g of p-nitrophenol and 10 mg of diazabicyclo [2.2.2] octane were added to the crude solution. The solution was then stirred at 55 ° C. for 16 h. After cooling, the crude solution was added dropwise to 200 ml of methanol, a white precipitate precipitating out, which was filtered off with suction.

Ausbeute 5,2 g, entsprechend 76,5 % der theoretischen Ausbeute.Yield 5.2 g, corresponding to 76.5% of the theoretical yield.

Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen, die aufgrund des Gehaltes an m-TMI auch im aromatischen Bereich zwischen 7 und 7,5 ppm liegen, sowie auch die der Esterfunktion benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm und für den Alkylteil die Absorptionen zwischen 0,7 und 2,2 ppm.The 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers, which due to the content of m-TMI are also in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm, and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and for the alkyl part the absorptions between 0.7 and 2.2 ppm.

Die ¹⁴N - Elementaranalyse ergab 0,4 % N, entsprechend 4 mol-% Reaktivgruppe.The ¹⁴N - elemental analysis showed 0.4% N, corresponding to 4 mol% reactive group.

Beispiel 2:Example 2: a) Herstellung der Reaktivgruppe 2a) Preparation of reactive group 2

Unter Stickstoff wurden 5 g 6-Aminohexanol in 95 ml Methylenchlorid gelöst und 6,6 g Isocyanatoethylmethacrylat, in 15 ml Methylenchlorid gelöst, bei Raumtemperatur langsam zugetropft und 2 h nachgerührt. Das Methylenchlorid wurde im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Diethylether kristallisiert. Ausbeute 9,8 g, entsprechend 84,5 % der theoretischen Ausbeute.5 g of 6-aminohexanol were dissolved in 95 ml of methylene chloride under nitrogen and 6.6 g of isocyanatoethyl methacrylate, dissolved in 15 ml of methylene chloride, were slowly added dropwise at room temperature and the mixture was subsequently stirred for 2 hours. The methylene chloride was removed in vacuo and the residue was crystallized in diethyl ether. Yield 9.8 g, corresponding to 84.5% of the theoretical yield.

Das ¹H-NMR zeigte die Harnstoffprotonen bei 5,45 und 5,55 ppm, die vinylischen Protonen bei 5,6 und 6,1 ppm sowie die Alkylresonanzen zwischen 1,2 und 1,7 ppm.1 H-NMR showed the urea protons at 5.45 and 5.55 ppm, the vinyl protons at 5.6 and 6.1 ppm and the alkyl resonances between 1.2 and 1.7 ppm.

b) Synthese des Reaktivpolymers 2b) Synthesis of reactive polymer 2

In 55 ml Dioxan wurden 4 g Stearylmethacrylat, 2,36 g Methacryloyldimethyldioxolan, 0,32 g Substanz aus Beispiel 2a) und 10 mg Azobisisobutyronitril eingetragen. Die Apparatur wurde evakuiert, mit Reinststickstoff beschickt, dieser Zyklus zweimal wiederholt und 6 h bei 70 oC gerührt. Die abgekühlte Lösung wurde mit 0,15 g Methylsulfonsäurechlorid und 0,15 g Pyridin versetzt und 2 h bei 40 oC gerührt. Nach Erkalten wurde die Rohlösung in 200 ml Methanol eingetropft, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel, der mit Wasser gewaschen und dann abgesaugt wurde. Ausbeute 5,2 g, entsprechend 76 % der theoretischen Ausbeute.4 g of stearyl methacrylate, 2.36 g of methacryloyldimethyldioxolane, 0.32 g of substance from Example 2a) and 10 mg of azobisisobutyronitrile were introduced into 55 ml of dioxane. The apparatus was evacuated, charged with ultrapure nitrogen, this cycle was repeated twice and the mixture was stirred at 70 ° C. for 6 h. The cooled solution was mixed with 0.15 g of methylsulfonyl chloride and 0.15 g of pyridine and stirred at 40 ° C. for 2 hours. After cooling, the crude solution was dropped into 200 ml of methanol, a white precipitate precipitating out, which was washed with water and then suction filtered. Yield 5.2 g, corresponding to 76% of the theoretical yield.

Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen im Alkyl-Bereich zwischen 0,7 und 2,2 ppm sowie auch die der Esterfunktion benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm.The 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers in the alkyl range between 0.7 and 2.2 ppm as well as the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm.

Die ³²S Elementaranalyse ergab 0,45 % S, entsprechend 4,1 mol-% Reaktivgruppe.The ³²S elemental analysis showed 0.45% S, corresponding to 4.1 mol% reactive group.

Beispiel 3:Example 3: a) Synthese der Reaktivpolymeren 3 und 4 und der Reaktivgruppe 3a) Synthesis of reactive polymers 3 and 4 and reactive group 3

In 15 ml Dioxan wurden je 2,45 g Stearylmethacrylat und Methacryloyldimethyldioxolan sowie 150 mg Azobisisobutyronitril gelöst. Dazu wurden 0,25 g (für Polymer 3) bzw. 0,5 g (für Polymer 4) an Reaktivgruppe 3 (siehe unten; Herstellung beschrieben in Beispiel 1 in DE-OS 42 02 050) zugegeben und 18 h bei 70oC gerührt. Nach dem Erkalten wurden 0,5 g (für Polymer 3), bzw. 1g (für Polymer 4) N,N'-Disuccinimidylcarbonat zugegeben und 5 h bei 50oC gerührt. Die Rohlösung wurde in 500 ml Methanol eingetropft, der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen im aromatischen Bereich zwischen 7 und 7,5 ppm sowie auch die der Esterfunktion benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm und für den Alkylteil die Absorptionen zwischen 0,7 und 2,2 ppm. Die ¹⁴N - Elementaranalyse ergab 0,3 % N für Polymer 3, bzw. 0,5 % N für Polymer 4, entsprechend 2,1 mol-%, bzw. 3,6 mol-% N-Hydroxysuccinimid (=NHS)-aktivierten Reäktivgruppe.

Figure imgb0009
2.45 g of stearyl methacrylate and methacryloyldimethyldioxolane and 150 mg of azobisisobutyronitrile were dissolved in 15 ml of dioxane. For this, 0.25 g (for polymer 3) or 0.5 g (for polymer 4) of reactive group 3 (see below; preparation described in example 1 in DE-OS 42 02 050) were added and 18 h at 70 ° C. touched. After cooling, 0.5 g (for Polymer 3) were respectively added 1g (for polymer 4) N, N'-disuccinimidyl carbonate and stirred for 5 h at 50 ° C. The crude solution was added dropwise to 500 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with water and dried. The 1 H-NMR showed the broad resonances typical for polymers in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and 2 for the alkyl part, 2 ppm. The ¹⁴N - elemental analysis showed 0.3% N for polymer 3, or 0.5% N for polymer 4, corresponding to 2.1 mol%, or 3.6 mol% N-hydroxysuccinimide (= NHS) -activated Reactive group.
Figure imgb0009

b) Synthese der Reaktivpolymeren 5 und 6b) Synthesis of reactive polymers 5 and 6

Der Versuch aus Beispiel 3a) wurde wiederholt, wobei statt Dioxan Dimethylsulfoxid als Lösungsmittel verwendet wurde. Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 0,4 % N für Polymer 5, bzw. 0,7 % N für Polymer 6, entsprechend 2,8 mol-%, bzw. 5 mol-% der NHS-aktivierten Reaktivgruppe aus Beispiel 3a).The experiment from Example 3a) was repeated, using dimethyl sulfoxide as the solvent instead of dioxane. The ¹⁴N elemental analysis showed 0.4% N for polymer 5, or 0.7% N for polymer 6, corresponding to 2.8 mol%, or 5 mol% of the NHS-activated reactive group from Example 3a).

Beispiel 4:Example 4: Synthese des Reaktivpolymers 7Synthesis of reactive polymer 7

In 25 ml Dioxan wurden 3,38 g Stearylmethacrylat und 2 g Methacryloyldimethyldioxolan sowie 100 mg Azobisisobutyronitril gelöst. Dazu wurden 0,54 g Reaktivgruppe 3 aus Beispiel 3 gegeben und 20 h bei 70oC gerührt. Nach dem Erkalten wurden 0,2 g NHS und 0,4 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Rohlösung wurde in 400 ml Methanol eingetropft, der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen im aromatischen Bereich zwischen 7 und 7,5 ppm sowie auch die der Esterfunktion benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm und für den Alkylteil die Absorptionen zwischen 0,7 und 2,2 ppm. Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 0,9 % N, entsprechend 6 mol-% der Reaktivgruppe 3 aus Beispiel 3.3.38 g of stearyl methacrylate and 2 g of methacryloyldimethyldioxolane and 100 mg of azobisisobutyronitrile were dissolved in 25 ml of dioxane. 0.54 g of reactive group 3 from Example 3 were added and the mixture was stirred at 70 ° C. for 20 h. After cooling, 0.2 g of NHS and 0.4 g of dicyclohexylcarbodiimide were added and the mixture was stirred at room temperature for 16 h. The crude solution was added dropwise to 400 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with water and dried. The 1 H-NMR showed the broad resonances typical for polymers in the aromatic range between 7 and 7.5 ppm and also the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and 2 for the alkyl part, 2 ppm. The ¹⁴N elemental analysis showed 0.9% N, corresponding to 6 mol% of reactive group 3 from Example 3.

Beispiel 5:Example 5: a) Herstellung der Reaktivgruppe 4a) Preparation of reactive group 4

In 40 ml Dioxan wurden 5 g Ethylenoxid-Oligomer-methacrylat mit einem mittleren Mol.-Gew. von 350 (Blemmer PE-350®, Firma Nippon Oil & Fats), 1,13 g Succinanhydrid sowie 10 mg 2,5-Bis-tert.-butylphenol gelöst, 5 Tropfen konzentrierte Schwefelsäure zugegeben und 12 h unter Rückfluß gekocht. Die Schwefelsäure wurde mit Natriummethanolat neutralisiert und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde mit Methylenchlorid aufgenommen und die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde im Hochvakuum eingeengt und der Rückstand getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die vinylischen Protonen bei 5,55 und 6,1 ppm, die Ethylenoxid-Einheiten bei 3,65 ppm, die der Esterfunktion benachbarten Protonen bei 4,25 ppm und die α-Carbonylprotonen bei 2,65 ppm.5 g of ethylene oxide oligomer methacrylate with an average mol. of 350 (Blemmer PE-350®, Nippon Oil & Fats), 1.13 g of succinic anhydride and 10 mg of 2,5-bis-tert-butylphenol dissolved, 5 drops of concentrated sulfuric acid added and the mixture refluxed for 12 hours. The sulfuric acid was neutralized with sodium methoxide and the solution was concentrated. The residue was taken up in methylene chloride and the solution was filtered. The filtrate was concentrated in a high vacuum and the residue was dried. 1 H-NMR showed the vinyl protons at 5.55 and 6.1 ppm, the ethylene oxide units at 3.65 ppm, the protons adjacent to the ester function at 4.25 ppm and the α-carbonyl protons at 2.65 ppm.

b) Synthese des Reaktivpolymers 8b) Synthesis of the reactive polymer 8

In 10 ml Dimethylsulfoxid wurden 1,3 g Natrium-p-styrylsulfonat, 0,2 g Reaktivgruppe 4 aus Beispiel 5a) sowie 0,5 g Cumarinfarbstoff 1 (Formel siehe unten; siehe auch Beispiel 2 in DE 4114482 A1) gelöst und nach Zugabe von 20 mg Azobisisobutyronitril 15 h bei 65 oC gerührt. Die viskose Rohlösung wurde in 100 ml Ethanol eingetropft und der entstandene Niederschlag abgesaugt und in 12 ml Dimethylsulfoxid wieder gelöst. Der Lösung wurden 0,1 g NHS und 0,2 g Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde in 100 ml Ethanol eingetropft, der Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Banden mit Ethylenoxid-Einheiten bei 3,65 ppm, aromatischen Absorptionen zwischen 6,5 und 8,5 ppm sowie die aliphatischen Protonen zwischen 0,7 und 2 ppm. Die auf den reinen Farbstoff normierten Extinktionswerte bei 385 nm ergaben 20 Gew.-% Farbstoffanteil im Polymer.1.3 g of sodium p-styryl sulfonate, 0.2 g of reactive group 4 from example 5a) and 0.5 g of coumarin dye 1 (formula see below; see also example 2 in DE 4114482 A1) were dissolved in 10 ml of dimethyl sulfoxide and after addition stirred by 20 mg of azobisisobutyronitrile at 65 o C for 15 h. The viscous crude solution was added dropwise to 100 ml of ethanol and the precipitate formed was suction filtered and redissolved in 12 ml of dimethyl sulfoxide. 0.1 g of NHS and 0.2 g of dicyclohexylcarbodiimide were added to the solution and the mixture was stirred at room temperature for 16 h. The solution was added dropwise in 100 ml of ethanol, the precipitate was filtered off with suction and dried in a high vacuum. The 1 H-NMR showed the broad bands typical for polymers with ethylene oxide units at 3.65 ppm, aromatic absorptions between 6.5 and 8.5 ppm and the aliphatic protons between 0.7 and 2 ppm. The absorbance values at 385 nm normalized to the pure dye gave 20% by weight of dye in the polymer.

Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 1,45 % N, entsprechend 4 mol-% NHS-aktivierte Reaktivgruppe 4 aus Beispiel 5a).

Figure imgb0010
The ¹⁴N elemental analysis showed 1.45% N, corresponding to 4 mol% NHS-activated reactive group 4 from Example 5a).
Figure imgb0010

Beispiel 6:Example 6: Synthese des Reaktivpolymers 9Synthesis of reactive polymer 9

In 10 ml Dimethylacetamid wurden 2,14 g Stearylmethacrylat, 1,06g Methacryloyldimethyldioxolan, 0,75 g Cumarinfarbstoff 2 (Formel siehe unten; siehe auch Beispiel 3 in DE-OS 42 13 323) sowie 41 mg Azobisisobutyronitril gelöst. Dazu wurden 0,142 g Reaktivgruppe 3 aus Beispiel 3a) gegeben und 20 h bei 70 oC gerührt. Nach dem Erkalten wurden 49 mg NHS und 88 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Rohlösung wurde in 400 ml Methanol eingetropft, der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen im aromatischen Bereich zwischen 6,5 und 8,3 ppm sowie auch die den Estergruppen benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm und für den Alkylteil die Absorptionen zwischen 0,7 und 2,2 ppm. Die auf den reinen Farbstoff normierten Extinktionswerte bei 480 nm ergaben 15 Gew.-% Farbstoffanteil im Polymer. Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 1,5 % N, entsprechend 4 mol-% der NHS-aktivierten Reaktivgruppe 3 aus Beispiel 3.

Figure imgb0011
2.14 g of stearyl methacrylate, 1.06 g of methacryloyldimethyldioxolane, 0.75 g of coumarin dye 2 (formula see below; see also Example 3 in DE-OS 42 13 323) and 41 mg of azobisisobutyronitrile were dissolved in 10 ml of dimethylacetamide. 0.142 g of reactive group 3 from example 3a) were added and the mixture was stirred at 70 ° C. for 20 h. After cooling, 49 mg of NHS and 88 mg of dicyclohexylcarbodiimide were added and the mixture was stirred at room temperature for 16 h. The crude solution was added dropwise to 400 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with water and dried. The 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers in the aromatic range between 6.5 and 8.3 ppm as well as the protons adjacent to the ester groups between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and for the alkyl part 2.2 ppm. The absorbance values at 480 nm standardized to the pure dye gave 15% by weight of dye in the polymer. The ¹⁴N elemental analysis showed 1.5% N, corresponding to 4 mol% of the NHS-activated reactive group 3 from Example 3.
Figure imgb0011

Beispiel 7:Example 7: a) Herstellung der Reaktivgruppe 5a) Preparation of reactive group 5

In 5 ml Acetonitril wurden bei 0 oC 1 g Natriumcarbonat und 2 g Reaktivgruppe 4 aus Beispiel 5a) vorgelegt und 0,51 g Isobutylchloroformat in 5 ml Acetonitril zugetropft. Es wurde 1 h bei dieser Temperatur gerührt, weitere 10 ml Acetonitril zugesetzt und die Mischung unter Stickstoffatmosphäre filtriert. Das Filtrat wurde bei 0 oC einer Lösung aus 0,18 g Hydrazinhydrat in 5 ml Acetonitril zugetropft und 2 h bei dieser Temperatur gerührt. Die Lösung wurde filtriert, mit 1 n Salzsäure auf pH 4 gestellt und im Hochvakuum eingeengt, wobei ein gelbes, viskoses Öl zurückblieb.1 g of sodium carbonate and 2 g of reactive group 4 from example 5a) were initially introduced into 5 ml of acetonitrile at 0 ° C., and 0.51 g of isobutyl chloroformate in 5 ml of acetonitrile were added dropwise. The mixture was stirred at this temperature for 1 h, a further 10 ml of acetonitrile was added and the mixture was filtered under a nitrogen atmosphere. The filtrate was added dropwise at 0 ° C. to a solution of 0.18 g of hydrazine hydrate in 5 ml of acetonitrile and the mixture was stirred at this temperature for 2 h. The solution was filtered, adjusted to pH 4 with 1N hydrochloric acid and concentrated in a high vacuum, leaving a yellow, viscous oil.

Das ¹H-NMR zeigte die vinylischen Protonen bei 5,55 und 6,1 ppm, die Ethylenoxid-Einheiten bei 3,65 ppm, die der Esterfunktion benachbarten Protonen bei 4,3 ppm und die α-Carbonylprotonen bei 2,65 ppm. Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 4,8 Gew.-%, entsprechend 4,88 Mol-% an Reaktivgruppe.1 H-NMR showed the vinyl protons at 5.55 and 6.1 ppm, the ethylene oxide units at 3.65 ppm, the protons adjacent to the ester function at 4.3 ppm and the α-carbonyl protons at 2.65 ppm. The ¹⁴N elemental analysis showed 4.8 wt .-%, corresponding to 4.88 mol% of reactive group.

b) Synthese des Reaktivpolymers 10b) Synthesis of reactive polymer 10

In 4 ml Dimethylsulfoxid wurden 0,65 g Natrium-p-styrylsulfonat, 0,1 g Reaktivgruppe 5 aus Beispiel 7a) sowie 0,25 g Cumarinfarbstoff 1 aus Beispiel 5b) gelöst und nach Zugabe von 10 mg Azobisisobutyronitril 15 h bei 65 oC gerührt. Die viskose Rohlösung wurde in 60 ml Ethanol eingetropft und der entstandene Niederschlag abgesaugt und im Hochvakuum getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Banden mit Ethylenoxid-Einheiten bei 3,65 ppm, aromatischen Absorptionen zwischen 6,5 und 8,5 ppm sowie die aliphatischen Protonen zwischen 0,7 und 2 ppm. Die auf den reinen Farbstoff normierten Extinktionswerte bei 385 nm ergaben 20 Gew.-% Farbstoffanteil im Polymer.0.65 g of sodium p-styryl sulfonate, 0.1 g of reactive group 5 from Example 7a) and 0.25 g of coumarin dye 1 from Example 5b) were dissolved in 4 ml of dimethyl sulfoxide and, after addition of 10 mg of azobisisobutyronitrile, at 65 ° C. for 15 hours touched. The viscous crude solution was dripped into 60 ml of ethanol and the precipitate formed was suction filtered and dried under high vacuum. 1 H-NMR showed the broad bands typical of polymers with ethylene oxide units at 3.65 ppm, aromatic Absorbances between 6.5 and 8.5 ppm and the aliphatic protons between 0.7 and 2 ppm. The absorbance values at 385 nm normalized to the pure dye gave 20% by weight of dye in the polymer.

Die ¹⁴N-Elementaranalyse ergab 1,64 % N, entsprechend 4 mol-% Reaktivgruppe 5 aus Beispiel 7a).The ¹⁴N elemental analysis showed 1.64% N, corresponding to 4 mol% of reactive group 5 from Example 7a).

Beispiel 8:Example 8: Synthese des Vergleichspolymers 11:Synthesis of Comparative Polymer 11:

In 20 ml Dioxan wurden 3,38 g Stearylmethacrylat sowie 2 g Methacryloyldimethyldioxolan mit 100 mg Azobisisobutyronitril gelöst und 20 h bei 70 oC gerührt. Nach dem Erkalten wurde die Rohlösung in 200 ml Methanol eingetropft, der entstandene Niederschlag abfiltriert, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Das ¹H-NMR zeigte die für Polymere typischen breiten Resonanzen der der Esterfunktion benachbarten Protonen zwischen 3,5 und 4,5 ppm und für den Alkylteil die Absorptionen zwischen 0,7 und 2,2 ppm.3.38 g of stearyl methacrylate and 2 g of methacryloyldimethyldioxolane were dissolved in 100 ml of azobisisobutyronitrile in 20 ml of dioxane and the mixture was stirred at 70 ° C. for 20 hours. After cooling, the crude solution was dripped into 200 ml of methanol, the precipitate formed was filtered off, washed with methanol and dried. The 1 H-NMR showed the broad resonances typical of polymers of the protons adjacent to the ester function between 3.5 and 4.5 ppm and the absorptions between 0.7 and 2.2 ppm for the alkyl part.

Beispiel 9Example 9 Immobilisierung von β-GalactosidaseImmobilization of β-galactosidase

Ein Glas- oder Kunststoffträger wurde mit einer LB- (Verfahren nach DE-OS 39 38 598) oder SA-Schicht (Verfahren nach DE-OS 42 08 645) überzogen und mit einem zweiten gleichartigen Träger abgedeckt, dessen Ränder mit einem 0.1 mm starken Teflonband überzogen waren, so daß sich zwischen beiden Trägern 0.1 mm Abstand ergab. Dieser Zwischenraum wurde mit 1 ml einer Lösung von β-Galactosidase (1 mg/ml, 10 mmol Carbonatpuffer pH 8) gefüllt und anschließend 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Abdeckung wurde anschließend vom Probenträger entfernt und der Träger dreimal mit EPPS-Puffer (0.1 mol/l N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[3-propansulfonsäure] (EPPS), 1 mmol/l MgCl₂, 0.05 % NaN₃, 0.1 g/l Rinderserumalbumin, pH 8) gewaschen. Das Plättchen wurde mit 2 ml einer 0.5 mmol/l Lösung von Dimethylacridinon-galactosid (DMAG) in EPPS-Puffer 1 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Lösung in eine Küvette umgefüllt und bei 634 nm im Photometer gegen unbehandelte DMAG-Lösung vermessen. Die Resultate sind in folgender Tabelle dargestellt: Substanz Extinktion (634 nm) Reaktivpolymer 1 1.46 Reaktivpolymer 2 0.64 Reaktivpolymer 2 0.44 Reaktivpolymer 3 0.317 Reaktivpolymer 4 0.436 Reaktivpolymer 5 0.471 Reaktivpolymer 6 1.503 Reaktivpolymer 7 0.861 Reaktivpolymer 8 1.912 Reaktivpolymer 9 2.16 Vergleichspolymer 11 0.06 (ohne Reaktivgruppe) APTS/GA (s. unten) 0.363 (Vergleichsprobe, konventioneller Aktivierung) A glass or plastic carrier was coated with an LB (method according to DE-OS 39 38 598) or SA layer (method according to DE-OS 42 08 645) and covered with a second carrier of the same type, the edges of which were covered with a 0.1 mm thick layer Teflon tape was coated so that there was a 0.1 mm gap between the two supports. This space was filled with 1 ml of a solution of β-galactosidase (1 mg / ml, 10 mmol carbonate buffer pH 8) and then incubated for 1 h at room temperature. The cover was then removed from the sample holder and the holder three times with EPPS buffer (0.1 mol / l N- [2-hydroxyethyl] piperazine-N '- [3-propanesulfonic acid] (EPPS), 1 mmol / l MgCl₂, 0.05% NaN₃, 0.1 g / l bovine serum albumin, pH 8) washed. The plate was incubated with 2 ml of a 0.5 mmol / l solution of dimethylacridinone galactoside (DMAG) in EPPS buffer for 1 h at 37 ° C. The solution was then transferred to a cuvette and added to Measure 634 nm in the photometer against untreated DMAG solution. The results are shown in the following table: substance Absorbance (634 nm) Reactive polymer 1 1.46 Reactive polymer 2 0.64 Reactive polymer 2 0.44 Reactive polymer 3 0.317 Reactive polymer 4 0.436 Reactive polymer 5 0.471 Reactive polymer 6 1,503 Reactive polymer 7 0.861 Reactive polymer 8 1,912 Reactive polymer 9 2.16 Comparative polymer 11 0.06 (without reactive group) APTS / GA (see below) 0.363 (comparative sample, conventional activation)

Man erkennt gegenüber einer Probe ohne Reaktivgruppen (adsorptive Bindung) und gegenüber einer auf konventionelle Weise mit Aminopropylsilan und Glutardialdehyd (APTS/GA) behandelten Probe eine angehobene Enzymaktivität.An increased enzyme activity can be seen compared to a sample without reactive groups (adsorptive binding) and compared to a sample treated in a conventional manner with aminopropylsilane and glutardialdehyde (APTS / GA).

Beispiel 10Example 10 Immobilisierung von Immunglobulin über Protein AImmobilization of immunoglobulin via protein A

Eine mit einer LB-Schicht (Substanz: Reaktivpolymer 9) überzogener Streifen aus Polycarbonat-Folie ("Macrofol") wurde mit einem Deckglas abgedeckt, dessen Ränder mit einem 0.1 mm starken Teflonband überzogen warem, so daß sich zwischen beiden Trägern 0.1 mm Abstand ergab. Dazwischen wurden 0.25 ml einer Lösung von Protein A (0.1 mg/ml in 0.01 mol/l Carbonatpuffer pH 8.0) hindurchgegeben und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Deckglas entfernt und die Folie in Citratpuffer (25 mmol/l Citrat, 15 mmol/l Kaliumphosphat, 0.5 mol/l KCl, 1 mmol/l MgCl₂) gespült. Danach wurde mit 0.5 ml einer Lösung von Anti-Digoxin-IgG (0.2 mg/ml in Citratpuffer pH 6.4) benetzt und erneut abgedeckt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurde das Deckglas wiederum entfernt und erneut mit 2ml Citratpuffer pH 6.4 gewaschen, die Folie trocknen gelassen und in kleinere Probenstücke zerschnitten. Diese Proben wurden in eine Lösung von Tetramethylrhodamin-markiertem Digitoxigenin (1 µg/ml in Citratpuffer pH 6.4) eingetaucht und bei 515 und 577 nm die Fluoreszenz gemessen (Anregung: 405 nm). Über das Verhältnis der Fluoreszenzen 577 zu 515 nm (Förster-Energietransfer, wie in DE-OS 39 38 598 beschrieben) ließ sich die Anbindung des Digitoxigeninderivates an immobilisiertes Immunglobulin und dessen Waschstabilität gegenüber Citratpuffer pH 6.4 detektieren (s. Tabelle). Typisches Bindungsverhalten von TRITC-Digitoxigenin Fluoreszenzverhältnis 577/515 vor TRITC-Digitoxigenin 0.51 nach TRITC-Digitoxigenin 1.80 1x gewaschen 1.82 2x gewaschen 1.50 3x gewaschen 1.79 nochmals mit Wasser gewaschen 2.26 A strip of polycarbonate film ("Macrofol") covered with an LB layer (substance: reactive polymer 9) was covered with a cover glass, the edges of which were covered with a 0.1 mm thick Teflon tape, so that there was a 0.1 mm distance between the two supports . In between, 0.25 ml of a solution of protein A (0.1 mg / ml in 0.01 mol / l carbonate buffer pH 8.0) was passed through and then incubated overnight at room temperature. The cover slip was then removed and the film was rinsed in citrate buffer (25 mmol / l citrate, 15 mmol / l potassium phosphate, 0.5 mol / l KCl, 1 mmol / l MgCl₂). Then 0.5 ml of a solution of anti-digoxin IgG (0.2 mg / ml in citrate buffer pH 6.4) was wetted and covered again. After 1 h at room temperature, the cover slip was again removed and washed again with 2 ml of citrate buffer pH 6.4, the film was allowed to dry and cut into smaller specimens. These samples were immersed in a solution of tetramethylrhodamine-labeled digitoxigenin (1 µg / ml in citrate buffer pH 6.4) and the fluorescence was measured at 515 and 577 nm (excitation: 405 nm). The linkage of the digitoxigenin derivative to immobilized immunoglobulin and its washing stability compared to citrate buffer pH 6.4 could be detected via the ratio of the fluorescence 577 to 515 nm (Förster energy transfer, as described in DE-OS 39 38 598) (see table). Typical binding behavior of TRITC digitoxigenin Fluorescence ratio 577/515 before TRITC digitoxigenin 0.51 after TRITC-Digitoxigenin 1.80 Washed once 1.82 Washed twice 1.50 Washed 3 times 1.79 washed again with water 2.26

Beispiel 11Example 11 Immobilisierung von Dig-AK über HydrazidchemieImmobilization of Dig-AK via hydrazide chemistry

Ein mit einer SA-Schicht (Reaktivpolymer 10, auf Polylysin-Grundierung) überzogener Streifen aus oberflächenaktivierter PET-Folie (AGFA "gold", 175 µm) wurde mit einem Deckglas abgedeckt, dessen Ränder mit einem 0.1 mm starken Teflonband überzogen waren, so daß sich zwischen beiden Trägern 0.1 mm Abstand ergab. Dieser Zwischenraum wurde mit 1 ml einer Lösung von Anti-Digoxin-IgG versetzt, der zuvor einer Periodatoxidation unterzogen wurde (4 mg IgG in 0.5 ml 0.01 M NaIO₄, 0.1 M Acetatpuffer pH 5.5, 45 min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend über Biogel P6G entsalzt). Nach Inkubieren über Nacht bei 8°C wurde das Folienstück mit Citratpuffer pH 6.4 (siehe Beispiel 10) gespült, trocknen gelassen und in kleinere Stücke zerschnitten. An diesen Probenfolien wurde vor und nach Eintauchen in eine Lösung, die TRITC-markiertes Digitoxigenin (1 µg/ml in Citratpuffer pH 6.4, mit Zusatz von 0.001 Vol-% Tween 20) enthielt, bei 495 und 577 nm die Fluoreszenz gemessen (Anregung: 405 nm). Über das Verhältnis der Fluoreszenzen 577 zu 495 nm ließ sich die Anbindung des Digitoxigeninderivates an immobilisiertes Immunglobulin und dessen Waschstabilität gegenüber Citratpuffer pH 6.4 / Tween 20 detektieren (s. Tabelle). Typisches Bindungsverhalten von TRITC-Digitoxigenin Fluoreszenzverhältnis 577/495 vor TRITC-Digitoxigenin 0.12 nach TRITC-Digitoxigenin 0.62 1x gewaschen 0.51 2x gewaschen 0.49 3x gewaschen 0.52 4x gewaschen 0.46 A strip of surface-activated PET film (AGFA "gold", 175 μm) covered with an SA layer (reactive polymer 10, on polylysine primer) was covered with a cover glass, the edges of which were covered with 0.1 mm thick Teflon tape so that there was a 0.1 mm gap between the two supports. This space was mixed with 1 ml of a solution of anti-digoxin IgG, which had previously been subjected to periodate oxidation (4 mg IgG in 0.5 ml 0.01 M NaIO₄, 0.1 M acetate buffer pH 5.5, incubated for 45 min at room temperature, then desalted using Biogel P6G ). After incubating overnight at 8 ° C., the piece of film was rinsed with citrate buffer pH 6.4 (see Example 10), left to dry and cut into smaller pieces. The fluorescence was measured at 495 and 577 nm on these sample foils before and after immersion in a solution containing TRITC-labeled digitoxigenin (1 µg / ml in citrate buffer pH 6.4 with the addition of 0.001% by volume Tween 20) (suggestion: 405 nm). The binding of the digitoxigenin derivative to immobilized immunoglobulin and its washing stability compared to citrate buffer pH 6.4 / Tween 20 could be detected via the ratio of the fluorescence 577 to 495 nm (see table). Typical binding behavior of TRITC digitoxigenin Fluorescence ratio 577/495 before TRITC digitoxigenin 0.12 after TRITC-Digitoxigenin 0.62 Washed once 0.51 Washed twice 0.49 Washed 3 times 0.52 4x washed 0.46

Claims (10)

Beschichteter Träger, bestehend aus a) einem inerten Festkörper und b) einer monomolekularen Schicht eines für die Langmuir-Blodgett-(LB-) oder für die Self-Assembly-(SA-) Technik geeigneten Polymers, wobei c) das Polymer 0,8-20 Mol-%, bevorzugt 2,5-10 Mol-%, bezogen auf die Molzahl aller Comonomere, an einem Comonomer enthält, das eine zur Bindung von Molekülen biologischen Ursprungs geeignete, am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppe besitzt und wobei d) zwischen dem inerten Träger a) und der monomolekularen Schicht b) 0-200 monomolekulare Schichten eines für die LB- oder SA-Technik geeigneten Polymers ohne Aktivgruppen gemäß c) angeordnet sind. Coated carrier consisting of a) an inert solid and b) a monomolecular layer of a polymer suitable for the Langmuir-Blodgett (LB) or for the self-assembly (SA) technique, where c) the polymer contains 0.8-20 mol%, preferably 2.5-10 mol%, based on the mol number of all comonomers, of a comonomer which is suitable for binding molecules of biological origin at the end of a hydrophilic spacer group has a sedentary active group and where d) 0-200 monomolecular layers of a polymer suitable for the LB or SA technology without active groups according to c) are arranged between the inert carrier a) and the monomolecular layer b). Träger nach Anspruch 1, bei dem das Comonomer nach c) mit der am Ende einer hydrophilen Spacergruppen sitzenden Aktivgruppe eines der Formel



        CH₂=C(R¹)―R²



ist, in der R¹   für H oder CH₃ steht und R²   die Gruppe
Figure imgb0012
 oder -CO-O-R⁴ bedeutet, wobei R³   für -(CH₂-)m-SO₂-(CH₂-)n-N=C=X mit X=S oder O oder für -C(CH₃)₂-NH-CO-Y steht, R⁴   für -(CH₂-)m-NH-CO-Y, -[CH(R¹)-CH₂-O-)o-SO₂-R⁵ oder -[CH(R¹)-CH₂-O-]o-CO-R⁶ steht, Y   für
Figure imgb0013
 -NH-NH₂ oder -NH-NH₃⊕Cl⊖,
Figure imgb0014
 oder -NH-(CH₂-)p-O-SO₂-R⁵ steht, R⁵   CH₃, CpF2p+1 oder Phenyl bedeutet, R⁶   -(CH₂-)m-CO-Y oder Y bedeutet, m und n   unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 4 sind und o und p   unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 9 sind. Carrier according to Claim 1, in which the comonomer according to c) has one of the formula with the active group located at the end of a hydrophilic spacer group



CH₂ = C (R¹) ―R²



is in the R¹ is H or CH₃ and R² the group
Figure imgb0012
 or -CO-O-R⁴ means, wherein R³ stands for - (CH₂-) m -SO₂- (CH₂-) n -N = C = X with X = S or O or for -C (CH₃) ₂-NH-CO-Y, R⁴ for - (CH₂-) m -NH-CO-Y, - [CH (R¹) -CH₂-O-) o -SO₂-R⁵ or - [CH (R¹) -CH₂-O-] o -CO-R⁶ stands, Y for
Figure imgb0013
 -NH-NH₂ or -NH-NH₃ ⊕ Cl ⊖ ,
Figure imgb0014
 or -NH- (CH₂-) p -O-SO₂-R⁵, R⁵ represents CH₃, C p F 2p + 1 or phenyl, R⁶ means - (CH₂-) m -CO-Y or Y, m and n are independently integers from 1 to 4 and o and p are independently integers from 1 to 9. Träger nach Anspruch 1, bei dem das Polymer für die monomolekulare Schicht nach b) im Falle der Anwendung der LB-Technik eines mit statistisch wiederkehrenden Einheiten der Formel
Figure imgb0015
 ist, in der R¹ und R²   die in Anspruch 2 genannte Bedeutung haben, R⁷ und R⁸   unabhängig voneinander H oder CH₃ bedeuten, q   eine ganze Zahl von 12-20, bevorzugt 16-18 darstellt, r   einen Wert von 0,75-1,25, bevorzugt 0,8-1,1, besonders bevorzugt 0,9-1,05 bedeutet und s   einen Wert von 0,02-0,25, bevorzugt 0,05-0,2 bedeutet. Carrier according to Claim 1, in which the polymer for the monomolecular layer according to b) in the case of using the LB technique is one with statistically recurring units of the formula
Figure imgb0015
 is in the R¹ and R² have the meaning given in claim 2, R⁷ and R⁸ independently of one another are H or CH₃, q represents an integer from 12-20, preferably 16-18, r is a value of 0.75-1.25, preferably 0.8-1.1, particularly preferably 0.9-1.05 and s means a value of 0.02-0.25, preferably 0.05-0.2. Träger nach Anspruch 1, bei dem das Polymer für die monomolekulare Schicht nach b) im Falle der Anwendung der SA-Technik eines mit statistisch wiederkehrenden Einheiten der Formel
Figure imgb0016
 ist, in der R¹, R², R³ und s   die in Anspruch 3 gegebene Bedeutung haben, t   einen Wert von 1,6 bis 2,25, bevorzugt 1,8 bis 2,1, besonders bevorzugt 1,9 bis 2,05 annimmt und R⁹   ein Anion aus der Gruppe von -SO₃⊖, -C₆H₄-SO₃⊖, -COO⊖ und -O-PO₃⊖⊖ oder
ein Kation aus der Gruppe von
Figure imgb0017
 -N(R¹⁰, R¹¹, R¹²), -S(R¹⁰, R¹¹) ,
Figure imgb0018
 -NH-NH₃⊕ oder
Figure imgb0019
 bedeutet,
worin R¹⁰, R¹¹und R¹² unabhängig voneinander Wasserstoff, C₁-C₂₂-Alkyl, Phenyl oder Benzyl bedeuten und
Q für O oder NH steht und die Indices o und m unabhängig voneinander ganze Zahlen von 1 bis 9 darstellen.Carrier according to Claim 1, in which the polymer for the monomolecular layer according to b) in the case of using the SA technique is one with randomly repeating units of the formula
Figure imgb0016
 is in the R¹, R², R³ and s have the meaning given in claim 3, t assumes a value from 1.6 to 2.25, preferably 1.8 to 2.1, particularly preferably 1.9 to 2.05 and R⁹ is an anion from the group of -SO₃ ⊖ , -C₆H₄-SO₃ ⊖ , -COO ⊖ and -O-PO₃ ⊖⊖ or
a cation from the group of
Figure imgb0017
 -N (R¹⁰, R¹¹, R¹²), -S (R¹⁰, R¹¹),
Figure imgb0018
 -NH-NH₃ ⊕ or
Figure imgb0019
 means
wherein R¹⁰, R¹¹ and R¹² independently represent hydrogen, C₁-C₂₂-alkyl, phenyl or benzyl and
Q stands for O or NH and the indices o and m independently represent integers from 1 to 9. Träger nach Anspruch 1, bei dem die hydrophile Spacergruppe eine Kettenlänge von 5-30, bevorzugt 7-30, besonders bevorzugt 13-30 Atomen hat, wobei sowohl C-Atome als auch Heteroatome gezählt werden.Carrier according to Claim 1, in which the hydrophilic spacer group has a chain length of 5-30, preferably 7-30, particularly preferably 13-30 atoms, both C atoms and hetero atoms being counted. Träger nach Anspruch 1, bei dem die hydrophile Spacergruppe eine Oligoethylenoxidgruppe oder eine Oligopropylenoxidgruppe mit 5-9 Einheiten ist.The carrier of claim 1, wherein the hydrophilic spacer group is an oligoethylene oxide group or an oligopropylene oxide group having 5-9 units. Träger nach Anspruch 2, bei dem die am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppe Hydrazid, N-Hydroxysuccinimid, Nitrophenylester, Isothiocyanat, Iodcyanat, Iodacetamid, Maleimid oder Methylsulfonat, bevorzugt Hydrazid ist.A carrier according to claim 2, in which the active group located at the end of a hydrophilic spacer group is hydrazide, N-hydroxysuccinimide, nitrophenyl ester, isothiocyanate, iodine cyanate, iodoacetamide, maleimide or methyl sulfonate, preferably hydrazide. Verfahren zur Herstellung beschichteter Träger, dadurch gekennzeichnet, daß ein inerter Träger nach der Langmuir-Blodgett (LB)- oder nach der Self-Assembly (SA-)-Technik mit einer monomolekularen Schicht aus einem für diese Techniken geeigneten Polymer beschichtet wird, wobei dieses 0,8-20 Mol-%, bezogen auf die Molzahl aller Comonomere, an einem Comonomer enthält, das eine zur Bindung von Molekülen biologischen Ursprungs geeignete, am Ende einer hydrophilen Spacergruppe sitzende Aktivgruppe besitzt und wobei zwischen dem inerten Träger und der monomolekularen Schicht 0-200 monomolekulare Schichten eines für die LB- oder SA-Technik geeigneten Polymers ohne Aktivgruppen enthaltendes Comonomer angeordnet werden.Process for the production of coated carriers, characterized in that an inert carrier according to the Langmuir-Blodgett (LB) - or according to the self-assembly (SA -) technique is coated with a monomolecular layer made of a polymer suitable for these techniques, this 0.8-20 mol%, based on the number of moles of all comonomers, contains on a comonomer which is suitable for binding molecules of biological origin, on End of a hydrophilic spacer group has an active group and wherein 0-200 monomolecular layers of a polymer suitable for the LB or SA technique without a comonomer containing active groups are arranged between the inert support and the monomolecular layer. Verwendung des beschichteten Trägers nach Anspruch 1 zur Anbindung (Immobilisierung) von Molekülen biologischen Ursprungs.Use of the coated carrier according to claim 1 for binding (immobilization) of molecules of biological origin. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Protein A oder Protein G und dann das betreffende Immunglobulin an die Oberfläche des Festkörpers gebunden wird.Use according to claim 9, characterized in that first protein A or protein G and then the relevant immunoglobulin is bound to the surface of the solid.
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