EA050387B1 - Способ и устройство для инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения и их использование с целью создания вакцин - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, растениеводства, фармакогнозии, биохимии, а именно к способу и устройству доставки целевых компонентов в межклеточное пространство растительных тканей и в клетки для транзиентной экспрессии целевых генов и получения фармацевтически ценных белковых продуктов. Осуществляют заполнение контейнера водной средой, погружение вегетирующего растения в эту водную среду, герметизацию контейнера, первичное ультразвуковое воздействие на вегетирующее растение, вакуумирование контейнера, сброс вакуума в контейнере с помощью регулятора давления, первую опрессовку контейнера. Изобретение обеспечивает усиление инфильтрации любой части тканей вегетирующего растения, погруженного в водную среду внутри контейнер.

Description

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, растениеводства, фармакогнозии, биохимии и, в частности, к способу доставки (преимущественно, с помощью инфильтрации) целевых компонентов (например, вирусных частиц, и/или макромолекул нуклеиновых кислот, и/или нуклеопротеиновых комплексов) в межклеточное пространство растительных тканей и в клетки, для транзиентной экспрессии целевых генов и получения фармацевтически ценных белковых продуктов.

Инфильтрация заключается во введении в листья и/или другие части живого растения, различных веществ (целевых компонентов). С помощью этой технологии возможно получить трансгенные растения путем их трансформации in planta, с возможностью последующего перепрограммирования растительных клеток и/или редактирования их генома. В частности, инфильтрация может быть использована для замены клеток млекопитающих и птиц клетками и тканями растений при производстве вакцин и терапевтических белков для медицинских и ветеринарных целей, как это описано, например, в [1].

Согласно первой из своих сторон, изобретение относится к способу для инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения, содержащего подготовительную фазу, включающую в себя следующие этапы:

этап заполнения контейнера водной средой, содержащей эти целевые компоненты, этап погружения предопределенной части тканей вегетирующего растения в водную среду внутри контейнера, этап герметизации контейнера.

Данный способ инфильтрации известен и характеризуется низкой эффективностью внедрения целевых компонентов внутрь межклеточных пространств живых растительных клеток и, в целом, длительным циклом трансформации тканей вегетирующего растения, что неоптимально.

Опирающееся на это оригинальное наблюдение настоящее изобретение главным образом имеет целью предложить способ инфильтрации, позволяющий, по меньшей мере, сгладить, как минимум, один из указанных выше недостатков. Для достижения этой цели способ инфильтрации, соответствующий приведенному во вступлении выше общему описанию, характеризуется по существу тем, что он дополнительно содержит фазу обработки тканей вегетирующего растения, которая следует за подготовительной фазой и включает в себя следующие этапы:

этап первичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть тканей вегетирующего растения с помощью излучателя, расположенного внутри контейнера и погруженного в водную среду, при этом первая частота работы излучателя, первая длительность работы излучателя и первая плотность мощности работающего излучателя в водной среде выбраны таким образом, чтобы обеспечить превышение порога кавитации этой водной среды, этап вакуумирования контейнера с помощью источника разрежения, соединенного с контейнером, при этом разрежение, создаваемое внутри контейнера источником разрежения, и вторая длительность поддержания разрежения, созданного внутри контейнера, выбраны таким образом, чтобы обеспечить удаление остатков пузырьков воздуха из межклеточных пространств тканей вегетирующего растения, этап регулируемого сброса вакуума в контейнере с помощью первого регулятора давления, взаимодействующего с контейнером, при этом скорость открывания первого регулятора давления такова, чтобы исключить вскипание водной среды, этап первой опрессовки контейнера с помощью компрессора, соединенного с контейнером, при этом первое избыточное давление, создаваемое внутри контейнера компрессором, и третья длительность поддержания, созданного внутри контейнера первого избыточного давления выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения.

Тот факт, что фаза обработки содержит четыре указанных этапа (ультразвуковое воздействие, вакуумирование, регулируемый сброс вакуума, опрессовка) позволяет создать синергетическое воздействие на ткани вегетирующего растения, что позволяет целевым компонентам быстрее и легче проникать в межклеточное пространство растительных тканей. В результате, при прочих равных условиях, количество целевых компонентов, введенных в межклеточное пространство растительных тканей в единицу времени, растет. Таким образом, описанное выше синергетическое воздействие усиливает инфильтрацию и повышает ее эффективность.

Кроме того, это синергетическое воздействие позволяет одинаково эффективно проводить инфильтрацию для любого типа предопределенной части тканей вегетирующего растения, погруженной в водную среду внутри контейнера и, в частности, в такие плотные части, как корень и стебель.

Преимущественно, фаза обработки тканей вегетирующего растения дополнительно содержит этап вторичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть тканей вегетирующего растения с помощью излучателя, расположенного внутри контейнера и погруженного в водную среду. В этих условиях этап вторичного ультразвукового воздействия происходит одновременно с этапом опрессовки контейнера. Вторая частота работы излучателя, четвертая длительность работы излучателя и вторая плотность мощности работающего излучателя в водной среде выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения.

- 1 050387

Благодаря этим выгодным признакам, расширяется разнообразие возможностей, обеспечивающее оптимальный выбор путей инфильтрации целевых компонентов в растительную ткань.

Преимущественно, после этапа первой опрессовки, фаза обработки тканей вегетирующего растения дополнительно содержит этап полного сброса первого избыточного давления с помощью второго регулятора давления, взаимодействующего с контейнером.

Эти выгодные признаки увеличивают функциональные возможности способа инфильтрации, согласно изобретению, и, в частности, вносит вклад в увеличение его надежности: например, в случае поломки (то есть выхода из строя) первого регулятора давления.

Преимущественно, после этапа полного сброса первого избыточного давления, фаза обработки тканей вегетирующего растения дополнительно содержит этап второй опрессовки контейнера с помощью компрессора, при этом второе избыточное давление содержится в пределах от 1,5-105 до 2,0-105 Па.

Вторая опрессовка контейнера дополнительно повышает эффективность инфильтрации для любого типа предопределенной части тканей вегетирующего растения, погруженной в водную среду внутри контейнера и, в частности, в такие плотные части, как корень и стебель. Указанное выше значение второго избыточного давления позволяет эффективно проводить инфильтрацию целевых компонентов в ткани вегетирующего растения в течение длительного времени, например, от нескольких десятков минут до нескольких суток.

Согласно первому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа первичного ультразвукового воздействия:

первая частота работы излучателя содержится в интервале от 20 до 48 кГц, первая длительность работы излучателя содержится в интервале от 10 до 300 с, первая плотность мощности работающего излучателя в водной среде содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт-см^-3.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика трех указанных признаков способа (частоты, длительности, плотности мощности), при которых ультразвуковое воздействие обеспечивает превышение порога кавитации в водной среде. Наличие в водной среде схлопывающихся кавитационных пузырьков воздуха способствует кавитационной эрозии поверхности вегетирующего растения. Кроме того, первая длительность работы излучателя, содержащаяся в (широком) интервале от 10 до 300 с способствует расширению функциональных возможностей способа инфильтрации, согласно изобретению, в части эффективной ультразвуковой дегазации межклеточных пространств для любого типа предопределенной части тканей вегетирующего растения, погруженной в водную среду внутри контейнера и, особенно, для эффективной ультразвуковой дегазации межклеточных пространств такой плотной предопределенной части вегетирующего растения, как его корень и/или стебель.

Согласно второму варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа первичного ультразвукового воздействия первая частота работы излучателя содержится в интервале от 20 до 48 кГц, первая длительность работы излучателя содержится в интервале от 90 до 120 с, первая плотность мощности работающего излучателя в водной среде содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт-см^-3.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика трех указанных признаков способа (частоты, длительности, плотности мощности), при которых ультразвуковое воздействие обеспечивает превышение порога кавитации в водной среде. Наличие в водной среде схлопывающихся кавитационных пузырьков воздуха способствует кавитационной эрозии поверхности вегетирующего растения. Кроме того, в отличие от первого варианта реализации способа инфильтрации, описанного выше, данный второй вариант реализации являет первую длительность работы излучателя, которая содержится в укороченном интервале от 10 до 120 с. Это ограничивает (с 300 до 120 с, при прочих равных условиях) максимальное время первичного ультразвукового воздействия, что способствует более щадящей (для структурной целостности тканей вегетирующего растения, особенно для его семян) ультразвуковой дегазации межклеточных пространств.

Согласно третьему варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа первичного ультразвукового воздействия первая частота работы излучателя составляет 32 кГц, первая длительность работы излучателя содержится в интервале от 30 до 60 с, и первая плотность мощности работающего излучателя в водной среде содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт-см^-3.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика трех указанных признаков способа (частоты, длительности, плотности мощности), при которых ультразвуковое воздействие обеспечивает превышение порога кавитации в водной среде. Наличие в водной среде схлопывающихся кавитационных пузырьков воздуха способствует кавитационной эрозии поверхности вегетирующего растения. Кроме того, в отличие от первого и второго вариантов реализации способа инфильтрации, описанных выше, данный третий вариант реализации являет первую длительность работы излучателя, которая со- 2 050387 держится в узком интервале от 30 до 60 с. Это позволяет, с одной стороны, разумно уменьшить до 60 с максимальное время первичного ультразвукового воздействия, что способствует более щадящей (для структурной целостности тканей вегетирующего растения, особенно для его листьев и/или клубней) ультразвуковой дегазации межклеточных пространств. С другой стороны, выбор данного узкого интервала позволяет увеличить с 10 до 30 с минимальное время первичного ультразвукового воздействия, что гарантирует (при прочих равных условиях) достаточную для целей инфильтрации ультразвуковую дегазацию межклеточных пространств в тканях вегетирующего растения. В этих условиях, согласно наблюдениям заявителя, именно выбор первой частоты работы излучателя равной 32 кГц позволяет обеспечить максимально возможную синергетику трех указанных признаков способа (частоты, длительности, плотности мощности) для широкого списка вегетирующих растений (в частности, для табака), при которой ультразвуковая дегазацию межклеточных пространств тканей особенно заметна.

Согласно четвертому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа вакуумирования контейнера разрежение, создаваемое внутри контейнера источником разрежения, содержится в интервале от 0,1-10⁵ до 0,7-10⁵ Па, вторая длительность поддержания разрежения, созданного внутри контейнера, содержится в интервале от 60 до 300 с.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика двух указанных признаков способа (собственно разрежения и длительности его поддержания внутри контейнера). Благодаря такой синергетике, происходит эффективное удаление остатков пузырьков воздуха из межклеточных пространств тканей вегетирующего растения. Кроме того, вторая длительность поддержания созданного внутри контейнера разрежения, содержащаяся в (широком) интервале от 60 до 300 с способствует расширению функциональных возможностей способа инфильтрации, согласно изобретению, в части эффективного удаления остатков пузырьков воздуха в межклеточных пространствах тканей вегетирующего растения, погруженного в водную среду внутри контейнера и, особенно, для эффективного удаления остатков пузырьков воздуха в межклеточных пространствах такой плотной предопределенной части вегетирующего растения, как его корень и/или стебель.

Согласно пятому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа вакуумирования контейнера разрежение, создаваемое внутри контейнера источником разрежения, содержится в интервале от 0,1-10⁵ до 0,7-10⁵ Па, вторая длительность поддержания разрежения, созданного внутри контейнера, содержится в интервале от 90 до 300 с.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика двух указанных признаков способа (собственно разрежения и длительности его поддержания внутри контейнера). Благодаря такой синергетике, происходит эффективное удаление остатков пузырьков воздуха из межклеточных пространств тканей вегетирующего растения. Кроме того, выбор данного узкого интервала от 90 до 300 с для второй длительности поддержания созданного внутри контейнера разрежения позволяет увеличить с 60 до 90 с минимальное время воздействия разрежением на ткани вегетирующего растения с целью эффективного удаления остатков пузырьков воздуха из их межклеточных пространств. Согласно наблюдениям заявителя, именно выбор данного узкого интервала от 90 до 300 с для второй длительности поддержания созданного внутри контейнера разрежения наряду с разрежением от 0,1-10⁵ до 0,7-10⁵ Па позволяет обеспечить максимально возможную синергетику этих двух указанных признаков способа для широкого списка вегетирующих растений (в частности, для табака), при которой остаточная дегазация межклеточных пространств их тканей особенно заметна.

Согласно шестому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа первой опрессовки контейнера первое избыточное давление, создаваемое компрессором внутри контейнера, содержится в интервале от 1,5-105 до 10-10⁵ Па, третья длительность поддержания первого избыточного давления, созданного внутри контейнера, содержится в интервале от 60 до 300с.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика двух указанных признаков способа (собственно избыточное давление и длительности его поддержания внутри контейнера). Благодаря такой синергетике, происходит эффективное снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения. Кроме того, третья длительность поддержания первого избыточного давления, созданного внутри контейнера, содержащаяся в (широком) интервале от 60 до 300 с, способствует расширению функциональных возможностей способа инфильтрации, согласно изобретению, в части снижения диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения, погруженного в водную среду внутри контейнера и, особенно, для такой плотной предопределенной части вегетирующего растения, как его корень и/или стебель.

- 3 050387

Согласно седьмому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа первой опрессовки контейнера первое избыточное давление, создаваемое компрессором внутри контейнера, содержится в интервале от 1,5-105 до 10-105 Па, и третья длительность поддержания первого избыточного давления, созданного внутри контейнера, содержится в интервале от 90 до 300с.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика двух указанных признаков способа (собственно избыточного давления и длительности его поддержания внутри контейнера). Благодаря такой синергетике, происходит эффективное снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения. Кроме того, выбор данного узкого интервала от 90 до 300 с для третьей длительности поддержания первого избыточного давления, созданного внутри контейнера, позволяет увеличить с 60 до 90 с минимальное время воздействия избыточным давлением на ткани вегетирующего растения с целью эффективного снижения диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения. Согласно наблюдениям заявителя, именно выбор данного узкого интервала от 90 до 300 с для третьей длительности поддержания созданного внутри контейнера первого избыточного давления наряду с первым избыточным давлением от 1,5-105 до 10-105 Па позволяет обеспечить максимально возможную синергетику этих двух указанных признаков способа для широкого списка вегетирующих растений (в частности, для табака), при которой снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства особенно заметно.

Согласно восьмому варианту реализации способа инфильтрации, согласно изобретению, во время этапа вторичного ультразвукового воздействия вторая частота работы излучателя содержится в интервале от 20 до 48 кГц, четвертая длительность работы излучателя содержится в интервале от 10 до 300 с, вторая плотность мощности работающего излучателя в водной среде содержится в интервале от 0,5 до 1,5 Вт-см^-3.

Благодаря этим выгодным признакам, обеспечивается синергетика трех указанных признаков способа (собственно частота работы излучателя, длительности его работы и плотность его мощности). Благодаря такой синергетике, происходит эффективное снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения. Кроме того, выбор данного узкого интервала от 10 до 300 с для четвертой длительности работы излучателя позволяет оптимизировать время воздействия излучения на ткани вегетирующего растения с целью эффективного снижения диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения. Согласно наблюдениям заявителя, именно выбор данного узкого интервала от 10 до 300 с для четвертой длительности работы излучателя наряду со второй плотностью мощности работающего излучателя в водной среде от 0,5 до 1,5 Вт-см^-3 позволяет обеспечить максимально возможную синергетику этих трех указанных признаков способа для широкого списка вегетирующих растений (в частности, для табака, например, Nicotiana tabacum, Nicotiana macrofilla, Nicotiana benthamiana и другие), при которой снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов в межклеточные пространства особенно заметно.

Преимущественно, предопределенной частью вегетирующего растения, которая погружается в водную среду внутри контейнера, является все целое вегетирующее растение, включающее в себя листья, стебли, корни, клубни, семена.

Это позволяет подвергать воздействию данного способа все растение целиком, что повышает выход конечного продукта. Кроме того, возможность подвергать воздействию данного способа именно корневую систему вегетирующего растения открывает новые возможности для получения специфических продуктов, который невозможно или неоптимально получать, воздействуя на листья и/или на стебли.

Преимущественно, водная среда внутри контейнера содержит водную суспензию по меньшей мере одного из следующих целевых компонентов: (а) бактерий; (б) вирусов; (в) генетического материала, содержащего целевые гены; (г) генетического материала, содержащего гены белка оболочки вирусов; (д) вирусных частиц; (е) макромолекул нуклеиновых кислот; (ж) белков; (з) нуклеопротеиновых комплексов; (и) органических соединений; (к) неорганических соединений; (л) вирусоподобных частиц.

Благодаря этим выгодным признакам, способ инфильтрации, согласно изобретению, адаптирован к широкой гамме целевых компонентов и множеству применений.

Согласно второй из своих сторон изобретение относится к устройству для инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения.

Это устройство содержит контейнер, адаптированный для герметизации, излучатель, расположенный внутри контейнера и адаптированный для излучения ультразвуковых волн, при этом этот излучатель также соединен с ультразвуковым генератором, источник разрежения, соединенный с контейнером,

- 4 050387 первый регулятор давления, соединенный с контейнером, компрессор, соединенный с контейнером, второй регулятор давления, соединенный с контейнером, блок управления, селективно взаимодействующий с источником разрежения, первым регулятором давления, компрессором, вторым регулятором давления, ультразвуковым генератором, при этом устройство адаптировано для осуществления способа инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения, согласно изобретению.

Благодаря такому устройству, возможно поставить на поток инфильтрацию целевых компонентов в ткани вегетирующих растений для массовых биотехнологических производств.

Преимущественно, устройство для инфильтрации дополнительно содержит держатель для селективной фиксации вегетирующего растения внутри контейнера.

Благодаря этому выгодному признаку, возможно оптимизировать укладку растений внутри контейнера, и тем самым повысить производительность устройства, то есть массу вегетирующих растений, подвергающихся инфильтрации в единицу времени.

Преимущественно, источник разрежения и компрессор объединены друг с другом.

Благодаря этому выгодному признаку, возможно ускорить производство установки для реализации способа, снизить ее вес и объем.

Преимущественно, первый регулятор давления и второй регулятор давления объединены друг с другом.

Благодаря этому выгодному признаку, возможно ускорить производство установки для реализации способа, снизить ее вес и объем.

Преимущественно, устройство для инфильтрации адаптировано для получения вирусоподобных частиц.

Вирусоподобные частицы (по-английки virus-like particles), -это молекулярные комплексы, похожие на вирусы, но не способные к инфицированию живых организмов, поскольку не содержат вирусного генома. Тот факт, что устройство для инфильтрации адаптировано для получения вирусоподобных частиц позволяет ускорить производство вакцин.

Согласно третьей из своих сторон, изобретение относится к использованию устройства для инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения, согласно изобретению, с целью создания вакцин.

Такое использование устройства позволяет ускорить производство вакцин.

Другие отличительные признаки и преимущества изобретения явно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным, со ссылками на прилагаемые рисунки, на которых:

фиг. 1 схематично изображает пример способа инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения, согласно изобретению, фиг. 2 схематично изображает - на упрощенном виде сбоку в разрезе - пример устройства для инфильтрации целевых компонентов в ткани вегетирующего растения, согласно изобретению, фиг. 3 представляет фотографию некоторых частей устройства для инфильтрации, согласно изобретению, схематично показанного на фиг. 2, а именно: открытый (до герметизации) контейнер, внутри которого находится держатель сетчатого типа для селективной фиксации в нем вегетирующего растения, фиг. 4 представляет фотографию некоторых частей устройства для инфильтрации, согласно изобретению, схематично показанного на фиг. 2, а именно: держатель каркасного типа для селективной фиксации вегетирующего растения (внутри контейнера, последний не показан).

Как упомянуто ранее и представлено на фиг. 1, 2, изобретение относится, согласно первой из своих сторон, к способу Ω инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1.

Как показано на фиг. 1, 2, этот способ Ω инфильтрации содержит подготовительную фазу Φ1, включающую в себя следующие этапы:

этап Е1 заполнения контейнера 20 водной средой М, содержащей эти целевые компоненты Z, этап Е2 погружения предопределенной части 10 тканей вегетирующего растения 1 в водную среду М внутри контейнера 20, этап Е3 герметизации контейнера 20.

Под предопределенной частью 10 тканей вегетирующего растения 1 надо понимать, например, только листья 11 на стебле 12 (то есть, иными словами, стеблевая зона с листьями), или только корни 13 (клубни 14), или только макушка растения 1 с семенами 15. Заявитель отмечает, что возможность подвергать инфильтрации именно корневую систему 13, 14 вегетирующего растения 1 открывает новые возможности для получения специфических продуктов, который невозможно или неоптимально получать, воздействуя на листья 11 и/или на стебли 12. Например, для целей создания так называемых съедобных вакцин (то есть вакцин, которые адаптированы для перорального приема) эффективно подвергать инфильтрации именно миниклубни и столоны вегетирующего картофеля известного, как Solarium tuberosum. Другим примером может служить процесс получения таких продуктов, как, например, бутирилхолинэстераза, пероксидаза хрена. Для их получения эффективно подвергать инфильтрации именно открытую (ибо растущую в аэропонных условиях) корневую систему растения хрена известного, как Armoracia rusticana.

- 5 050387

В самом общем случае (не показан), предопределенной частью 10 вегетирующего растения 1, которая погружается в водную среду М внутри контейнера 20, может быть все вегетирующее растение 1 целиком, включающее в себя листья 11, стебли 12, корни 13, клубни 14, семена 15.

Согласно изобретению, как показано на фиг. 1, 2, этот способ Ω инфильтрации дополнительно содержит фазу обработки Ф₂ тканей вегетирующего растения 1, которая следует за подготовительной фазой Φ1 и включает в себя следующие этапы:

этап Е4 первичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть 10 тканей вегетирующего растения 1 с помощью излучателя 21, расположенного внутри контейнера 20 и погруженного в водную среду М, при этом первая частота ν1 работы излучателя 21, первая длительность τ1 работы излучателя 21 и первая плотность R_1W мощности W работающего излучателя 21 в водной среде М выбраны таким образом, чтобы обеспечить превышение порога кавитации этой водной среды М, этап Е5 вакуумирования контейнера 20 с помощью источника 22 разрежения Ψ, соединенного с контейнером 20, при этом разрежение Ψ, создаваемое внутри контейнера 20 источником 22 разрежения Ψ, и вторая длительность τ2 поддержания разрежения Ψ, созданного внутри контейнера 20, выбраны таким образом, чтобы обеспечить удаление остатков пузырьков воздуха из межклеточных пространств тканей вегетирующего растения 1, этап Е6 регулируемого сброса вакуума в контейнере 20 с помощью первого регулятора 23 давления Р, взаимодействующего с контейнером 20, при этом скорость открывания Λ первого регулятора 23 давления Р такова, чтобы исключить вскипание водной среды М, этап Е7 первой опрессовки контейнера 20 с помощью компрессора 24, соединенного с контейнером 20, при этом первое избыточное давление P1, создаваемое внутри контейнера 20 компрессором 24, и третья длительность τ₃ поддержания созданного внутри контейнера 20 первого избыточного давления P1 выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов Z в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения 1.

Преимущественно, фаза обработки Ф₂ тканей вегетирующего растения 1 дополнительно содержит этап Е8 вторичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть 10 тканей вегетирующего растения 1 с помощью излучателя 21, расположенного внутри контейнера 20 и погруженного в водную среду М. В этих условиях, этап Е8 вторичного ультразвукового воздействия происходит одновременно с этапом Е7 опрессовки контейнера 20. При этом, вторая частота ν₂ работы излучателя 21, четвертая длительность τ₄ работы излучателя 21 и вторая плотность R_2W мощности W работающего излучателя 21 в водной среде М выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов Z в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения 1.

Как видно из фиг. 1, после этапа Е7 первой опрессовки, фаза обработки Ф₂ тканей вегетирующего растения 1 может дополнительно содержать этап Е9 полного сброса первого избыточного давления P1 с помощью второго регулятора 25 давления Р, взаимодействующего с контейнером 20.

Также, как видно из фиг. 1, после этапа Е9 полного сброса первого избыточного давления P1, фаза обработки Φ2 тканей вегетирующего растения 1 может дополнительно содержать этап Е10 второй опрессовки контейнера 20 с помощью компрессора 24, при этом второе избыточное давление Р₂ поддерживается в пределах от 1,5-105Па до 2-105Па: 1,5-105Па<Р₂<2-105Па.

Преимущественно, во время этапа Е4 первичного ультразвукового воздействия:

первая частота ν1 работы излучателя 21 лежит в диапазоне от 20 кГц до 48 кГц:

кГц <ν1< 48 кГц, первая длительность τ1 работы излучателя 21 лежит в пределах от 10 с до 300 с:

с <τ1< 300 с, и первая плотность R_1W мощности W работающего излучателя 21 в водной среде М лежит в пределах от 1,5 Вт-см’³ до 10 Вт-см’³:

1, 5Вт-см’³<R_1W<10Вт-см’³.

В одном из вариантов реализации способа Ω инфильтрации, во время этапа Е4 первичного ультразвукового воздействия:

первая частота ν1 работы излучателя 21 лежит в диапазоне от 20 кГц до 48 кГц: 20 кГц <ν1<48 кГц, первая длительность τ1 работы излучателя 21 лежит в пределах от 90с до 120с: 90 с <τ1<120 с, и первая плотность R_1W мощности W работающего излучателя 21 в водной среде М лежит в пределах от 1,5 Вт-см’³ до 10 Вт-см’³:

1,5Вт-см’³ <R_1W<10Вт-см’³.

В другом варианте реализации способа Ω инфильтрации, во время этапа Е4 первичного ультразвукового воздействия:

первая частота ν1 работы излучателя 21 составляет 32 кГц, первая длительность τ1 работы излучателя 21 лежит в пределах от 30 с до 60 с: 30 с<т1< 60 с, и первая плотность R_1W мощности W работающего излучателя 21 в водной среде М лежит в пределах от 1,5 Вт-см’³ до 10 Вт-см’³:

- 6 050387

1,5 Вт-см^-3 <R_1w<10Bt-cm^-3.

Преимущественно, во время этапа Е5 вакуумирования контейнера 20:

разрежение Ψ, создаваемое внутри контейнера 20 источником 22 разрежения Ψ, лежит в пределах от 0,1-10⁵Па до 0,7-105Па:

0,1-10⁵Па<Ψ<0,7-10⁵Па, и вторая длительность т₂ поддержания разрежения Ψ, созданного внутри контейнера 20, лежит в пределах от 60 с до 300 с:

с <т₂<300 с.

В одном из вариантов реализации способа Ω инфильтрации, во время этапа Е5 вакуумирования контейнера 20:

разрежение Ψ, создаваемое внутри контейнера 20 источником 22 разрежения Ψ, содержится в интервале от 0,1<105Па до 0,7-105Па:

0,1-10⁵Па<Ψ< 0,7-105Па, и вторая длительность хг поддержания разрежения Ψ, созданного внутри контейнера 20, лежит в пределах от 90 с до 300 с:

с <т₂<300 с.

Преимущественно, во время этапа Е7 первой опрессовки контейнера 20:

первое избыточное давление P1, создаваемое компрессором 24 внутри контейнера 20, лежит в пределах от 1,5-105Па до 10-10⁵Па:

1,5<10⁵Па<P₁<10-10⁵Па, и третья длительность тЗ поддержания первого избыточного давления P1, созданного внутри контейнера 20, лежит в пределах от 60 с до З00с:

с <т₃<300 с.

В одном из вариантов реализации способа Ω. инфильтрации, во время этапа Е7 первой опрессовки контейнера 20:

первое избыточное давление P1, создаваемое компрессором 24 внутри контейнера 20, лежит в пределах от 1,5-105Па до 10-10⁵Па:

1,5-10⁵Па<P₁<10-10⁵Па, и третья длительность т₃ поддержания первого избыточного давления P1, созданного внутри контейнера 20, лежит в пределах от 90 с до З00с:

с <т₃< 300 с.

Преимущественно, во время этапа Е8 вторичного ультразвукового воздействия:

вторая частота ν₂ работы излучателя 21 лежит в интервале от 20кГц до 48кГц:

20кГц <ν₂< 48кГц, четвертая длительность т₄ работы излучателя 21 лежит в пределах от 10 с до 300 с:

с <т₄< 300 с, и вторая плотность R₂w мощности W работающего излучателя в водной среде М лежит в пределах от 0,5 Вт-см-³ до 1,5 Вт-см^-3:

0,5Вт<см^-3< R_2w<1,5Bt-cm^-3.

Преимущественно, водная среда М внутри контейнера 20 содержит водную суспензию по меньшей мере одного из следующих целевых компонентов Z: (а) бактерий (в том числе, агробактерий); (б) вирусов; (в) генетического материала, содержащего целевые гены; (г) генетического материала, содержащего гены белка оболочки вирусов; (д) вирусных частиц; (е) макромолекул нуклеиновых кислот; (ж) белков; (з) нуклеопротеиновых комплексов; (и) органических соединений; (к) неорганических соединений; (л) вирусоподобных частиц.

Как показано на фиг. 2-4, согласно второй из своих сторон, изобретение касается устройства 1 для инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1. Это устройство 1 содержит:

контейнер 20, адаптированный для герметизации, излучатель 21, расположенный внутри контейнера 20 и адаптированный для излучения ультразвуковых волн, при этом этот излучатель 21 также соединен с ультразвуковым генератором 26, источник 22 разрежения Ψ, соединенный с контейнером 20, первый регулятор 23 давления Р, соединенный с контейнером 20, компрессор 24, соединенный с контейнером 20, второй регулятор 25 давления Р, соединенный с контейнером 20, блок управления 27, селективно взаимодействующий с источником 22 разрежения Ψ, первым регулятором 23 давления Р, компрессором 24, вторым регулятором 25 давления Р, ультразвуковым генератором 26.

При этом, устройство 1 адаптировано для осуществления способа Ω инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1, согласно изобретению.

Блок управления 27 преимущественно оборудован (не показано) центральным процессором, называемым ЦПУ (по-английски, Central Processing Unit), снабжен- 7 050387 ным хронометром и адаптированным для мильтипрограмной одновременной обработки данных, средствами памяти способными регистрировать данные (например, частоты, давления и т.п.) и/или сведения (например, правила), по меньшей мере одним устройством сопряжения человек-машина, включающим по меньшей мере одно средство отображения (преимущественно тактильный экран) и/или одно средство тревоги (звуковой, визуальной, тактильной, пахучей).

Как видно на фиг. 2-4, устройство 1 для инфильтрации может дополнительно содержать держатель 28 для селективной фиксации вегетирующего растения 1 внутри контейнера 20.

Как показано на фиг. 3, держатель 28 может быть сетчатого типа для селективной фиксации в нем вегетирующего растения. Сетчатый тип держатель 28 наиболее адаптирован для вегетирующих растений 1, стебель которых являет малую жесткость, то есть может сломаться в процессе инфильтрации из-за увеличения веса листьев 11 и/или семян 15.

На фиг. 4 представлен альтернативный держатель 28 каркасного типа. Он адаптирован для вегетирующих растений 1, стебель которых имеет достаточную жесткость, чтобы удержать такие вегетирующие растения 1 внутри контейнера 20 во время инфильтрации в вертикальном (то есть параллельном направлению вектора силы тяжести G) положении без механических повреждений. В примере на фиг. 4 держатель 28 каркасного типа содержит вырезы (ячейки), которые адаптированы для одновременного удержания восьми вегетирующих растений 1 (не показаны), что способствует повышению производительности устройство 1 для инфильтрации.

Преимущественно, источник разрежения 22 и компрессор 24 объединены друг с другом (не показано).

Преимущественно, первый регулятор 23 давления Р и второй регулятор 25 давления Р объединены друг с другом (не показано).

Преимущественно, устройство 1 для инфильтрации может дополнительно содержать рециркулятор (поанглийски, recirculator), адаптированный для обеспечения циркуляции водной среды М в контейнере 20.

Наличие рециркулятора (не показан) способствует лучшему омыванию водной средой М предопределенной части 10 тканей вегетирующего растения 1, что повышает эффективность инфильтрации.

В частности, если в момент погружения Е2 предопределенной части 10 тканей вегетирующего растения 1 в водную среду М произошел случайный захват, например, листьями 11 или семенами 15, воздушных пузырьков (не показаны), которые могут снижать эффект ультразвукового воздействия, то течение, созданное внутри контейнера 20 позволяет механически оторвать эти воздушные пузырьки от растения 1 и эвакуировать их в свободный объем контейнера 20. Этот свободный объем расположен между свободной поверхностью водной среды М и внутренней поверхностью крышки 200 контейнера 20, когда последний загерметизирован.

Преимущественно, устройство 1 для инфильтрации адаптировано для получения вирусоподобных частиц.

Согласно третьей из своих сторон, изобретение касается использования устройства 1 для инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1, согласно изобретению, с целью создания вакцин.

Пример ниже иллюстрирует (см. также фиг. 1-4) один из вариантов осуществления способа Ω. инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1, согласно изобретению.

Вегетирующие растения 1 (например, Nicotiana benthamiana), выращенные аэропонным способом, в условиях фитотрона, устанавливаются с помощью держателя 28 внутрь контейнера 20, который заполняется Е1 водной суспензией агробактерий (например, Agrobacter tumifaciens и/или Agrobacter rhizogenes), несущих целевые компоненты (например, гены). При этом, вегетирующие растения 1 целиком погружаются Е2 в эту водную суспензию агробактерий с целевыми генами. Далее происходит герметизация Е3 контейнера 20. Затем, вегетирующие растения 1 подвергаются Е4 первичному ультразвуковому воздействию с первой частотой ν1=22 кГц работы излучателя 21. При этом, первая длительность τ₁ работы излучателя 21 составляет 120 с, а первая плотность R1W мощности (W) работающего в суспензии излучателя 21 составляет 0,7 Вт-см’³ в режиме дегазации. Затем, свободный объем контейнера 20, который расположен между свободной поверхностью суспензии и внутренней поверхностью крышки 200 контейнера 20, вакуумируется Е5 до значений 0,5*105Па, благодаря источнику 22 разрежения Ψ. При этом, вторая длительность τ₂ поддержания разрежения Ψ, созданного внутри контейнера 20 составляет 120 с. Далее происходит Е6 регулируемый сброс вакуума с помощью первого регулятора 23 давления Р, после чего происходит Е7 первая опрессовка контейнера 20 с помощью компрессора 24. При этом, первое избыточное давление P1 вдвое превышает атмосферное давление. В этих условиях вегетирующие растения 1 выдерживаются в течение третьей длительности τ₃, которая составляет 120 с.

В результате общая длительность процесса составляет всего 360 с, что подтверждает возможность использования способа Ω инфильтрации целевых компонентов Z в ткани вегетирующего растения 1 при массовом производстве вакцин.

-

Claims (15)

1. Библиография.

   1. Leuzinger К, Dent М., Hurtado J., Stahnke J., Lai H., Zhou X., Chen

   Q. Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of

   Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. 77, e50521, 2013.

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ (Ω) инфильтрации целевых компонентов (Z) в ткани вегетирующего растения (1), содержащий подготовительную фазу (Φ1), включающую в себя следующие этапы:

   этап (Е1) заполнения контейнера (20) водной средой (М), содержащей эти целевые компоненты (Z), этап (Е2) погружения предопределенной части (10) тканей вегетирующего растения (1) в водную среду (М) внутри контейнера (20), этап (Е3) герметизации контейнера (20), отличающийся тем, что этот способ (Ω) инфильтрации дополнительно содержит фазу обработки (Φ₂) тканей вегетирующего растения (1), которая следует за подготовительной фазой (Φ₁) и включает в себя следующие этапы:

   этап (Е4) первичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть (10) тканей вегетирующего растения (1) с помощью излучателя (21), расположенного внутри контейнера (20) и погруженного в водную среду (М), при этом первая частота (ν₁) работы излучателя (21), первая длительность (τ₁) работы излучателя (21) и первая плотность (R1W) мощности (W) работающего излучателя (21) в водной среде (М) выбраны таким образом, чтобы обеспечить превышение порога кавитации этой водной среды (М), этап (Е5) вакуумирования контейнера (20) с помощью источника (22) разрежения (Ψ), соединенного с контейнером (20), при этом разрежение (Ψ), создаваемое внутри контейнера (20) источником (22) разрежения (Ψ), и вторая длительность (τ₂) поддержания разрежения (Ψ), созданного внутри контейнера (20), выбраны таким образом, чтобы обеспечить удаление остатков пузырьков воздуха из межклеточных пространств тканей вегетирующего растения (1), этап (Е6) регулируемого сброса вакуума в контейнере (20) с помощью первого регулятора (23) давления (Р), взаимодействующего с контейнером (20), при этом скорость открывания (Λ) первого регулятора (23) давления (Р) такова, чтобы исключить вскипание водной среды (М), этап (Е7) первой опрессовки контейнера (20) с помощью компрессора (24), соединенного с контейнером (20), при этом первое избыточное давление (P1), создаваемое внутри контейнера (20) компрессором (24), и третья длительность (τ₃) поддержания созданного внутри контейнера (20) первого избыточного давления (P1) выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов (Z) в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения (1).
2. 2. Способ (Ω) инфильтрации по п.1, отличающийся тем, что фаза обработки (Φ₂) тканей вегетирующего растения (1) дополнительно содержит этап (Е8) вторичного ультразвукового воздействия на эту предопределенную часть (10) тканей вегетирующего растения (1) с помощью излучателя (21), расположенного внутри контейнера (20) и погруженного в водную среду (М), тем, что этап (Е8) вторичного ультразвукового воздействия происходит одновременно с этапом (Е7) опрессовки контейнера (20), и тем, что вторая частота (ν₂) работы излучателя (21), четвертая длительность (τ₄) работы излучателя (21) и вторая плотность (R_2W) мощности (W) работающего излучателя (21) в водной среде (М) выбраны таким образом, чтобы обеспечить снижение диффузионных ограничений при введении целевых компонентов (Z) в межклеточные пространства тканей вегетирующего растения (1).
3. 3. Способ (Ω) инфильтрации по п.2, отличающийся тем, что после этапа (Е7) первой опрессовки фаза обработки (Φ₂) тканей вегетирующего растения (1) дополнительно содержит этап (Е9) полного сброса первого избыточного давления (P1) с помощью второго регулятора (25) давления (Р), взаимодействующего с контейнером (20).
4. 4. Способ (Ω) инфильтрации по п.3, отличающийся тем, что после этапа (Е9) полного сброса первого избыточного давления (P1) фаза обработки (Φ₂) тканей вегетирующего растения (1) дополнительно содержит этап (E10) второй опрессовки контейнера (20) с помощью компрессора (24), при этом второе избыточное давление (P₂) содержится в пределах от 1,5-105Па до 2,0-105Па.
5. 5. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-4, отличающийся тем, что во время этапа (Е4) первичного ультразвукового воздействия первая частота (ν1) работы излучателя (21) содержится в интервале от 20 до 48 кГц, первая длительность (τ1) работы излучателя (21) содержится в интервале от 10 до 300 с, первая плотность (R_1W) мощности (W) работающего излучателя (21) в водной среде (М) содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт-см^-3.
6. 6. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-4, отличающийся тем, что во время этапа

   - 9 050387 (Е4) первичного ультразвукового воздействия первая частота (ν1) работы излучателя (21) содержится в интервале от 20 до 48 кГц, первая длительность (τ1) работы излучателя (21) содержится в интервале от 90 до 120 с, первая плотность (R_1W) мощности (W) работающего излучателя (21) в водной среде (М) содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт· см^-3.
7. 7. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-4, отличающийся тем, что во время этапа (Е4) первичного ультразвукового воздействия первая частота (ν1) работы излучателя (21) составляет 32 кГц, первая длительность (τ1) работы излучателя (21) содержится в интервале от 30 до 60 с, первая плотность (R_1W) мощности (W) работающего излучателя (21) в водной среде (М) содержится в интервале от 1,5 до 10 Вт· см³.
8. 8. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-7, отличающийся тем, что во время этапа (Е5) вакуумирования контейнера (20) разрежение (Ψ), создаваемое внутри контейнера (20) источником (22) разрежения (Ψ), содержится в интервале от 0,1· 105 до 0,7· 105 Па, вторая длительность (τ₂) поддержания разрежения (Ψ), созданного внутри контейнера (20), содержится в интервале от 60 до 300 с.
9. 9. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-7, отличающийся тем, что во время этапа (Е5) вакуумирования контейнера (20) разрежение (Ψ), создаваемое внутри контейнера (20) источником (22) разрежения (Ψ), содержится в интервале от 0,1· 105 до 0,7· 105 Па, вторая длительность (τ₂) поддержания разрежения (Ψ), созданного внутри контейнера (20), содержится в интервале от 90 до 300 с.
10. 10. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-9, отличающийся тем, что во время этапа (Е7) первой опрессовки контейнера (20) первое избыточное давление (P1), создаваемое компрессором (24) внутри контейнера (20), содержится в интервале от 1,5· 105 до 10· 105 Па, третья длительность (τ₃) поддержания первого избыточного давления (P₁), созданного внутри контейнера (20), содержится в интервале от 60 до 300 с.
11. 11. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-9, отличающийся тем, что во время этапа (Е7) первой опрессовки контейнера (20) первое избыточное давление (P1), создаваемое компрессором (24) внутри контейнера (20), содержится в интервале от 1,5· 105 до 10· 105 Па, третья длительность (τ3) поддержания первого избыточного давления (P1), созданного внутри контейнера (20), содержится в интервале от 90 до 300с.
12. 12. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.2-11, отличающийся тем, что во время этапа (Е8) вторичного ультразвукового воздействия вторая частота (ν2) работы излучателя (21) содержится в интервале от 20 до 48 кГц, четвертая длительность (τ₄) работы излучателя (21) содержится в интервале от 10 до 300 с, и вторая плотность (R_2W) мощности (W) работающего излучателя в водной среде (М) содержится в интервале от 0,5 до 1,5 Вт^см^-3.
13. 13. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-12, отличающийся тем, что предопределенной частью (10) вегетирующего растения (1), которая погружается в водную среду (М) внутри контейнера (20), является все целое вегетирующее растение (1), включающее в себя листья (11), стебли (12), корни (13), клубни (14), семена (15).
14. 14. Способ (Ω) инфильтрации по любому одному из пп.1-13, отличающийся тем, что водная среда (М) внутри контейнера (20) содержит водную суспензию по меньшей мере одного из следующих целевых компонентов (Z): (а) бактерий; (б) вирусов; (в) генетического материала, содержащего целевые гены; (г) генетического материала, содержащего гены белка оболочки вирусов; (д) вирусных частиц; (е) макромолекул нуклеиновых кислот; (ж) белков; (з) нуклеопротеиновых комплексов; (и) органических соединений; (к) неорганических соединений; (л) вирусоподобных частиц.
15. 15. Устройство (1) для инфильтрации целевых компонентов (Z) в ткани вегетирующего растения (1), содержащее контейнер (20), предназначенный для герметизации, излучатель (21), расположенный внутри контейнера (20) и предназначенный для излучения ультразвуковых волн, при этом этот излучатель (21) также соединен с ультразвуковым генератором (26), источник (22) разрежения (Ψ), соединенный с контейнером (20), первый регулятор (23) давления (Р), соединенный с контейнером (20), компрессор (24), соединенный с контейнером (20), второй регулятор (25) давления (Р), соединенный с контейнером (20),

    -