EA047726B1 - MULTISPECIFIC PD-1 BINDING MOLECULES AND METHODS OF THEIR APPLICATION - Google Patents
MULTISPECIFIC PD-1 BINDING MOLECULES AND METHODS OF THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA047726B1 EA047726B1 EA202090579 EA047726B1 EA 047726 B1 EA047726 B1 EA 047726B1 EA 202090579 EA202090579 EA 202090579 EA 047726 B1 EA047726 B1 EA 047726B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- domain
- mat
- cdr
- amino acid
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 455
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 352
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 303
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 295
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 222
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 190
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 claims description 182
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 102
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 55
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 43
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 43
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 claims description 40
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 34
- -1 CD86 Proteins 0.000 claims description 32
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims description 29
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 claims description 27
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 27
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 27
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 25
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 claims description 24
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 claims description 24
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 23
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 22
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 22
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 22
- 101710083479 Hepatitis A virus cellular receptor 2 homolog Proteins 0.000 claims description 21
- 229940126547 T-cell immunoglobulin mucin-3 Drugs 0.000 claims description 21
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 21
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 21
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 claims description 20
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 claims description 20
- 102100038929 V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Human genes 0.000 claims description 20
- 102100038078 CD276 antigen Human genes 0.000 claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 19
- 102100029822 B- and T-lymphocyte attenuator Human genes 0.000 claims description 18
- 101710185679 CD276 antigen Proteins 0.000 claims description 18
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 18
- 101000864344 Homo sapiens B- and T-lymphocyte attenuator Proteins 0.000 claims description 18
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 claims description 18
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 claims description 18
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 18
- 108010079206 V-Set Domain-Containing T-Cell Activation Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 15
- 102100024213 Programmed cell death 1 ligand 2 Human genes 0.000 claims description 14
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 13
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108700030875 Programmed Cell Death 1 Ligand 2 Proteins 0.000 claims description 12
- 101100407308 Mus musculus Pdcd1lg2 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 9
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 8
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 8
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 8
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 101000666896 Homo sapiens V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Proteins 0.000 claims description 7
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 7
- 102100029740 Poliovirus receptor Human genes 0.000 claims description 7
- 102100038282 V-type immunoglobulin domain-containing suppressor of T-cell activation Human genes 0.000 claims description 7
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 102100035943 HERV-H LTR-associating protein 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 101001021491 Homo sapiens HERV-H LTR-associating protein 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 claims description 6
- 101000971513 Homo sapiens Natural killer cells antigen CD94 Proteins 0.000 claims description 6
- 101000586618 Homo sapiens Poliovirus receptor Proteins 0.000 claims description 6
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 claims description 6
- 102100021462 Natural killer cells antigen CD94 Human genes 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 6
- IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N fluquinconazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1N1C(=O)C2=CC(F)=CC=C2N=C1N1C=NC=N1 IJJVMEJXYNJXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102100038077 CD226 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 claims description 5
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031351 Galectin-9 Human genes 0.000 claims description 5
- 101710121810 Galectin-9 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000884298 Homo sapiens CD226 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 5
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 101000597780 Mus musculus Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 claims description 5
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000016778 CD4+/CD56+ hematodermic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037540 Alveolar soft tissue sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010004593 Bile duct cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009047 Chordoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010073140 Clear cell sarcoma of soft tissue Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008743 Desmoplastic Small Round Cell Tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 206010064581 Desmoplastic small round cell tumour Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014967 Ependymoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003364 Extraskeletal myxoid chondrosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008961 Fibrous Dysplasia of Bone Diseases 0.000 claims description 2
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021309 Germ cell tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009164 Islet Cell Adenoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010024612 Lipoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001853 McCune-Albright syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 claims description 2
- 206010052399 Neuroendocrine tumour Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033701 Papillary thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033963 Parathyroid tumour Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007913 Pituitary Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008938 Rhabdoid tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 206010073334 Rhabdoid tumour Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008736 Systemic mastocytosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009365 Thymic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024447 adrenal gland neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001119 benign fibrous histiocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000012080 benign lipomatous neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011654 childhood malignant neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000292 clear cell sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010103 fibrous dysplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003884 gestational trophoblastic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002529 islet cell tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005252 lipomatous cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030883 malignant astrocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010051747 multiple endocrine neoplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000023833 nerve sheath neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016065 neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022102 pancreatic neuroendocrine neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010916 pituitary tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002267 posterior uveal melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011096 spinal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014618 spinal cord cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030045 thyroid gland papillary carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000025443 tumor of adipose tissue Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017997 tumor of parathyroid gland Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 claims 5
- 102000002698 KIR Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010043610 KIR Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 206010050513 Metastatic renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 102100026115 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 Human genes 0.000 description 484
- 208000017972 multifocal atrial tachycardia Diseases 0.000 description 469
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 244
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 101
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 87
- 238000000375 direct analysis in real time Methods 0.000 description 83
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 67
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 66
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 66
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 59
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 59
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 50
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 46
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 46
- 230000006870 function Effects 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 101710186160 S-adenosylmethionine synthase 3 Proteins 0.000 description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 30
- 101710186159 S-adenosylmethionine synthase 4 Proteins 0.000 description 29
- 101710186156 S-adenosylmethionine synthase 5 Proteins 0.000 description 29
- 102100035947 S-adenosylmethionine synthase isoform type-2 Human genes 0.000 description 28
- 101710167557 S-adenosylmethionine synthase isoform type-2 Proteins 0.000 description 28
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 27
- 101710186153 S-adenosylmethionine synthase 2 Proteins 0.000 description 27
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 27
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 27
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 25
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 24
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 23
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 23
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 21
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 21
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 17
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 16
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 15
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 14
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 101710094000 Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 12
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 12
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 12
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 12
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 11
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 11
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 10
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 10
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 10
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 10
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 10
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 9
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 9
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 9
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 8
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 8
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 8
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 8
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 7
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 7
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 7
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 5
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 5
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 4
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 4
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 125000000613 asparagine group Chemical class N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000194 Growth hormone-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 102400001066 Growth hormone-binding protein Human genes 0.000 description 3
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 3
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 3
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 3
- 101001117312 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 2 Proteins 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 3
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 2
- 229940125565 BMS-986016 Drugs 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 2
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 2
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101100022187 Caenorhabditis elegans mab-10 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100031940 Epithelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 2
- 101100334515 Homo sapiens FCGR3A gene Proteins 0.000 description 2
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 101000955999 Homo sapiens V-set domain-containing T-cell activation inhibitor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241000989747 Maba Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102220482767 Mitochondrial coenzyme A diphosphatase NUDT8_D79A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029527 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102100024586 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 14 Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 2
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 2
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 230000010319 checkpoint response Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012926 crystallographic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 2
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000001521 potassium lactate Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101100540120 Caenorhabditis elegans vab-3 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000867232 Escherichia coli Heat-stable enterotoxin II Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010007707 Hepatitis A Virus Cellular Receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000884279 Homo sapiens CD276 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100460850 Homo sapiens NCR3LG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012450 HuMAb Mouse Methods 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 102220478985 Interleukin-4 receptor subunit alpha_L64A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 239000001358 L(+)-tartaric acid Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- YALRCXHVQYBSJC-UHFFFAOYSA-N Mammea A/AB Chemical compound C12=C(O)C(C(=O)C(C)CC)=C(O)C(CC=C(C)C)=C2OC(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 YALRCXHVQYBSJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101710201161 Natural cytotoxicity triggering receptor 3 ligand 1 Proteins 0.000 description 1
- 241001181114 Neta Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102220473319 PCNA-associated factor_I65A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000566598 Podomys floridanus Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102220593424 Protein PMS2CL_N34A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 1
- 108010029180 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000001555 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000021712 Soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101001057121 Staphylococcus aureus Enterotoxin type B Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 102000000551 Syk Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010016672 Syk Kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000013534 Troponin C Human genes 0.000 description 1
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 description 1
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010065158 Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member 14 Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048232 Yawning Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009460 calcium influx Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 230000009827 complement-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009786 epithelial differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 150000002308 glutamine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150107276 hpd-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000048119 human PDCD1LG2 Human genes 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940126546 immune checkpoint molecule Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003259 immunoinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002794 lymphocyte assay Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007193 modulation by symbiont of host erythrocyte aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005375 negative regulation of lymphocyte activation Effects 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108010048507 poliovirus receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010425 regulation of immunoglobulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000006716 regulation of lymphocyte proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027425 release of sequestered calcium ion into cytosol Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102220012488 rs397516129 Human genes 0.000 description 1
- 102220078865 rs776745618 Human genes 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 235000021309 simple sugar Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявкиCross-reference to related applications
Заявка на настоящий патент испрашивает приоритет согласно заявкам на патенты США № 62/198867 (поданной 30 июля 2015 г.; заявка в стадии рассмотрения), 62/239559 (поданной 9 октября 2015 г.; заявка в стадии рассмотрения), 62/255140 (поданной 13 ноября 2015 г.; заявка в стадии рассмотрения) и 62/322974 (поданной 15 апреля 2016 г.; заявка в стадии рассмотрения), содержание которых полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки.This patent application claims priority to U.S. Patent Application Nos. 62/198,867 (filed July 30, 2015; pending), 62/239,559 (filed October 9, 2015; pending), 62/255,140 (filed November 13, 2015; pending), and 62/322,974 (filed April 15, 2016; pending), the entire contents of which are incorporated herein by reference.
Ссылка на перечень последовательностейLink to sequence listing
Настоящее изобретение включает один или более перечней последовательностей в соответствии с параграфом 1.821 раздела 37 Свода федеральных правил США и далее, которые раскрыты на машиночитаемых носителях (файл озаглавлен: 1301_0122PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, создан 1 июля 2016 г. и имеет размер 282789 байт), указанный файл полностью включен в настоящий патент посредством ссылки.The present invention includes one or more sequence listings in accordance with 37 CFR 1.821 et seq., which are disclosed on a machine-readable medium (file entitled: 1301_0122PCT_Sequence_Listing_ST25.txt, created July 1, 2016 and has a size of 282,789 bytes), which file is incorporated herein by reference in its entirety.
Область техникиField of technology
Настоящее изобретение относится к PD-1-связывающим молекулам, которые содержат PD-1связывающий домен из отобранных антител к PD-1, способных связываться с PD-1 яванских макак и PD1 человека: моноклонального антитела 1 (МАТ 1) к PD-1 , MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. В частности, согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые представляют собой гуманизированные или химерные варианты указанных антител или содержат PD-1-связывающие фрагменты указанных антител к PD-1 (в частности, иммуноконъюгаты, диатела, BiTE, биспецифические антитела и т.д.). В частности, согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые дополнительно способны связываться с эпитопом молекулы, участвующей в регуляции контрольной точки иммунного ответа, которая присутствует на поверхности иммунной клетки. Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения указанных PD-1-связывающих молекул для детектирования PD-1 или для стимуляции иммунного ответа. Согласно настоящему изобретению также предложены способы комбинированной терапии, в которых PD-1-связывающую молекулу, которая содержит один или более PD-1-связывающих доменов указанных отобранных антител к PD-1, вводят в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые эффективно стимулируют иммунный ответ, и/или в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые специфично связываются с раковым антигеном.The present invention relates to PD-1-binding molecules that comprise a PD-1-binding domain of selected anti-PD-1 antibodies capable of binding to cynomolgus macaque PD-1 and human PD1: anti-PD-1 monoclonal antibody 1 (MAB 1), anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15. In particular, the present invention provides PD-1-binding molecules that are humanized or chimeric versions of said antibodies or comprise PD-1-binding fragments of said PD-1 antibodies (in particular, immunoconjugates, diabodies, BiTEs, bispecific antibodies, etc.). In particular, the present invention provides PD-1-binding molecules that are additionally capable of binding to an epitope of a molecule involved in the regulation of an immune checkpoint that is present on the surface of an immune cell. The present invention also provides methods of using said PD-1-binding molecules to detect PD-1 or to stimulate an immune response. The present invention also provides methods of combination therapy in which a PD-1-binding molecule that comprises one or more PD-1-binding domains of said selected PD-1 antibodies is administered in combination with one or more additional molecules that effectively stimulate an immune response and/or in combination with one or more additional molecules that specifically bind to a cancer antigen.
Уровень техникиState of the art
I. Иммунные ответы, опосредуемые клетками.I. Cell-mediated immune responses.
Иммунная система человека и других млекопитающих обеспечивает защиту от инфекций и заболеваний. Такая защита обеспечивается как гуморальным иммунным ответом, так и иммунным ответом, опосредуемым клетками. Гуморальный ответ приводит к выработке антител и других биологических молекул, которые способны распознать и нейтрализовать чужеродные мишени (антигены). Напротив, опосредуемый клетками иммунный ответ включает активацию Т-клетками макрофагов, природных клеток-киллеров (NK) и антигенспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов, а также высвобождение различных цитокинов в ответ на распознавание антигена (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48). Способность Т-клеток оптимально опосредовать иммунный ответ на антиген требует двух различных сигнальных взаимодействий (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation, Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339). Во-первых, антиген, который был расположен на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК), должен быть презентирован антигенспецифичным наивным CD4+ Т-клеткам. Процесс презентации включает передачу сигнала посредством Тклеточного рецептора (TCR), управляющего Т-клеткой для инициирования иммунного ответа, который будет специфичным в отношении презентированного антигена. Во-вторых, ряд костимулирующих и ингибирующих сигналов, опосредуемых взаимодействиями между АПК и различными поверхностными молекулами Т-клеток, запускает сначала активацию и пролиферацию Т-клеток и, в конечном итоге, их ингибирование. Следовательно, первый сигнал придает специфичность иммунному ответу, тогда как второй сигнал служит для определения характера, величины и продолжительности ответа.The immune system of humans and other mammals provides protection against infections and diseases. This protection is mediated by both humoral and cell-mediated immune responses. The humoral response results in the production of antibodies and other biological molecules that are able to recognize and neutralize foreign targets (antigens). In contrast, the cell-mediated immune response involves the activation of macrophages, natural killer (NK) cells, and antigen-specific cytotoxic T lymphocytes by T cells, as well as the release of various cytokines in response to antigen recognition (Dong, C. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39–48). The ability of T cells to optimally mediate an immune response to antigen requires two distinct signaling interactions (Viglietta, V. et al. (2007) Modulating Co-Stimulation, Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339). First, antigen that has been displayed on the surface of antigen-presenting cells (APCs) must be presented to antigen-specific naive CD4+ T cells. The presentation process involves signaling via the T cell receptor (TCR), directing the T cell to initiate an immune response that is specific for the presented antigen. Second, a series of costimulatory and inhibitory signals mediated by interactions between APCs and various T cell surface molecules trigger first T cell activation and proliferation and, ultimately, their inhibition. The first signal therefore confers specificity to the immune response, whereas the second signal serves to determine the nature, magnitude, and duration of the response.
Иммунная система тщательно контролируется костимулирующими и коингибирующими лигандами и рецепторами. Упомянутые молекулы обеспечивают второй сигнал для активации Т-клеток и обеспечивают сбалансированный комплекс положительных и отрицательных сигналов, чтобы максимально увеличить иммунные ответы на инфекцию, при этом сводя к минимуму аутоиммунные ответы (Wang, L. et al. (March 7, 2011) VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses, J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections, Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Особое значение имеет связывание лигандов В7.1 (CD80) и В7.2 (CD86) антигенпрезентирующей клетки, а также CD28 и рецепторов CTLA-4 CD4+ Т-лимфоцита (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, С et al. (2003) Immune Regulation by Novel CostimulatoryThe immune system is tightly controlled by costimulatory and coinhibitory ligands and receptors. These molecules provide a second signal for T cell activation and ensure a balanced set of positive and negative signals to maximize immune responses to infection while minimizing autoimmune responses (Wang, L. et al. (March 7, 2011) VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T-Cell Responses, J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections, Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288). Of particular importance is the binding of the ligands B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) of the antigen-presenting cell, as well as CD28 and CTLA-4 receptors of the CD4+ T lymphocyte (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory
- 1 047726- 1 047726
Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321). Связывание В7.1 или B7.2 с CD28 стимулирует активацию Т-клеток; связывание В7.1 или В7.2 с CTLA-4 ингибирует такую активацию (Dong, С. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548). CD28 конститутивно экспрессируется на поверхности Т-клеток (Gross, J., et al. (1992) Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse, J. Immunol. 149:380-388), тогда как экспрессия CTLA-4 быстро усиливается после активации Т-клеток (Linsley, P. et al. (1996) Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement, Immunity 4:535-543). Поскольку CTLA-4 является более высокоаффинным рецептором (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126), связывание сначала инициирует пролиферацию Т-клеток (посредством CD28) и затем ингибирует его (посредством развивающейся экспрессии CTLA-4), ослабляя тем самым эффект, если пролиферация больше не требуется.Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39–48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:307–321). Binding of B7.1 or B7.2 to CD28 stimulates T cell activation; binding of B7.1 or B7.2 to CTLA-4 inhibits such activation (Dong, S. et al. (2003) Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules, Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation, Immunol. Rev. 229:3 07-321; Greenwald, R. J. et al. (2005) The B7 Family Rev. 23:515-548). CD28 is constitutively expressed on the surface of T cells (Gross, J., et al. (1992) Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse, J. Immunol. 149:380-388), whereas CTLA-4 expression is rapidly upregulated following T cell activation (Linsley, P. et al. (1996) Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement, Immunity 4:535-543). Because CTLA-4 is a higher affinity receptor (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126), binding first initiates T cell proliferation (via CD28) and then inhibits it (via nascent CTLA-4 expression), thereby attenuating the effect if proliferation is no longer required.
Дальнейшие исследования лигандов рецептора CD28 привели к идентификации и описанию набора родственных молекул В7 (суперсемейство В7) (Coyle, A.J. et al. (2001) The Expanding В7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function, Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells. Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) CD28/B7 System of T-Cell Costimulation, Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). В настоящее время существует несколько известных членов семейства: В7.1 (CD80), В7.2 (CD86), индуцируемый костимулирующий лиганд (ICOS-L), лиганд программируемой смерти-1 (PD-L1; В7-Н1), лиганд программируемой смерти-2 (PD-L2, B7-DC), В7-Н3, В7-Н4 и В7-Н6 (Collins, M. et al. (2005) The В7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) Evolution Of The В7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).Further studies of CD28 receptor ligands led to the identification and characterization of a set of related B7 molecules (the B7 superfamily) (Coyle, A. J. et al. (2001) The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T-Cell Function, Nature Immunol. 2(3):203–209; Sharpe, A. H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116–126; Greenwald, R. J. et al. (2005) The B7 Family Revisited, Ann. Rev. Immunol. 23:515–548; Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1–223.7; Loke, P. et al. (2004) Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T-Cells. Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy, Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance, Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) CD28/B7 System of T-Cell Costimulation, Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses, Microbes Infect. 6:759-766). Currently, there are several known members of the family: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), inducible costimulatory ligand (ICOS-L), programmed death ligand-1 (PD-L1; B7-H1), programmed death ligand-2 (PD-L2, B7-DC), B7-H3, B7-H4, and B7-H6 (Collins, M. et al. (2005) The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands, Genome Biol. 6:223.1–223.7; Flajnik, M. F. et al. (2012) Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC, Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2).
II. Белок программируемой смерти-1 (PD-1).II. Programmed death protein-1 (PD-1).
Белок программируемой смерти-1 (PD-1, также известный как CD279) представляет собой мембранный белок типа I массой 31 кДа, являющийся членом расширенного семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4, который в целом отрицательно регулирует иммунные ответы (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887-3895; публикация заявки на патент США № 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667, патенты США № № 6808710, 7101500, 7488802, 7635757, 7722868, PCT публикация WO 01/14557).Programmed death protein-1 (PD-1, also known as CD279) is a 31 kDa type I membrane protein that is a member of the expanded CD28/CTLA-4 family of T cell regulators that generally negatively regulates immune responses (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887–3895; U.S. Patent Application Publication Nos. 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667, U.S. Patent Nos. 6,808,710, 7,101,500, 7,488,802, 7,635,757, 7722868, PCT publication WO 01/14557).
PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах (Agata, Y. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes, Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC, J. Immunol. 169:5538-5545) и с низкими уровнями на природных киллерных Т-клетках (NKклетках) (Nishimura, H. et al. (2000) Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice, J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). Внеклеточная область PD-1 состоит из одного вариабельного домена (V) иммуноглобулина (Ig), который на 23% идентичен эквивалентному домену в CTLA-4 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). После внеклеточного вариабельного домена Ig расположена трансмембранная область и внутриклеточный хвост. Внутриклеточный хвост содержит два сайта фосфорилирования, расположенных в иммунорецепторном тирозиновом ингибирующем мотиве и иммунорецепторном тирозиновом переключающем мотиве, это свидетельствует о том, что PD-1 отрицательно регулирует сигналы TCR (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887-3895; Blank, С et al. (2006) Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer, Immunol. Immunother. 56(5):739-745). PD-1 ингибирует иммунную систему путем связывания с В7-Н1 и B7-DC (Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251-260; патенты США № 6803192, 7794710, публикации заявок на патент США № 2005/0059051, 2009/0055944, 2009/0274666, 2009/0313687, PCT публикация WO 01/39722, WO 02/086083).PD-1 is expressed on activated T cells, B cells, and monocytes (Agata, Y. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes, Int. Immunol. 8(5):765–772; Yamazaki, T. et al. (2002) Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And APC, J. Immunol. 169:5538–5545) and at low levels on natural killer T cells (NK cells) (Nishimura, H. et al. (2000) Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice, J. Exp. Med. 191:891–898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). The extracellular region of PD-1 consists of a single immunoglobulin (Ig) variable (V) domain that is 23% identical to the equivalent domain in CTLA-4 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). Following the extracellular Ig variable domain is a transmembrane region and an intracellular tail. The intracellular tail contains two phosphorylation sites located in the immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif and the immunoreceptor tyrosine-based switch motif, suggesting that PD-1 negatively regulates TCR signaling (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887–3895; Blank, C. et al. (2006) Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer, Immunol. Immunother. 56(5):739–745). PD-1 inhibits the immune system by binding to B7-H1 and B7-DC (Flies, D.B. et al. (2007) The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity, J. Immunother. 30(3):251–260; U.S. Patent Nos. 6,803,192, 7,794,710, U.S. Patent Application Publications Nos. 2005/0059051, 2009/0055944, 2009/0274666, 2009/0313687, PCT Publication Nos. WO 01/39722, WO 02/086083).
- 2 047726- 2 047726
В7-Н1 и B7-DC широко экспрессируются на поверхностях тканей человека и мыши, таких как сердце, плацента, мышцы, фетальная печень, селезенка, лимфатические узлы и тимус, а также печень, легкие, почки, клетки островков поджелудочной железы и тонкого кишечника мыши (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). У человека экспрессия белка В7-Н1 была обнаружена в клетках эндотелия человека (Chen, Y. et al. (2005) Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells, Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1 Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis, J. Immunol. 169:3581-3588), миокарде (Brown, J.A. et al. (2003) Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production, J. Immunol. 170:1257-1266), синцитиотрофобластах (Petroff, M.G. et al. (2002) 57 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface, Placenta 23:S95-S101). Молекулы также экспрессируются резидентными макрофагами некоторых тканей, макрофагами, которые были активированы интерфероном (ИФН)--- или фактором некроза опухоли (ФНО)-а (Latchman, Y. et al. (2001) PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation, Nat. Immunol 2:261-268), и в опухолях (Dong, H. (2003) B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity, J. Mol. Med. 81:281-287).B7-H1 and B7-DC are widely expressed on the surfaces of human and mouse tissues, such as the heart, placenta, muscle, fetal liver, spleen, lymph nodes, and thymus, as well as mouse liver, lung, kidney, pancreatic islet cells, and small intestine (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). In humans, B7-H1 protein expression has been detected in human endothelial cells (Chen, Y. et al. (2005) Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells, Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1 Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis, J. Immunol. 169:3581-3588), myocardium (Brown, J.A. et al. (2003) Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production, J. Immunol. 170:1257-1266), syncytiotrophoblasts (Petroff, M.G. et al. (2002) 57 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface, Placenta 23:S95-S101). The molecules are also expressed by resident macrophages of some tissues, by macrophages that have been activated by interferon (IFN)--- or tumor necrosis factor (TNF)-a (Latchman, Y. et al. (2001) PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation, Nat. Immunol 2:261-268), and in tumors (Dong, H. (2003) B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity, J. Mol. Med. 81:281-287).
Было обнаружено, что взаимодействие В7-Н1 и PD-1 посылает существенный отрицательный костимулирующий сигнал Т- и В-клеткам (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And AntiTumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) и выполняет функцию индуктора гибели клеток (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition, J. Molec. Med. 83:193-202). Более конкретно, было обнаружено, что взаимодействие рецептора PD-1 в низких концентрациях и лиганда В7-Н1 приводит к передаче ингибирующего сигнала, который сильно ингибирует пролиферацию антигенспецифичных CD8+ Т-клеток; при более высоких концентрациях взаимодействия с PD-1 не ингибируют пролиферацию Т-клеток, а значительно снижают выработку многих цитокинов (Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Было обнаружено, что пролиферация Т-клеток и выработка цитокинов под действием покоящихся и ранее активированных CD4 и CD8 Т-клеток, и даже наивных Т-клеток из пуповинной крови, ингибируется растворимыми гибридными белками B7-H1-Fc (Freeman, G.J. et al. (2000) Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel В7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation, J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation, Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2, Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126).The interaction of B7-H1 and PD-1 has been found to send a significant negative costimulatory signal to T and B cells (Martin-Orozco, N. et al. (2007) Inhibitory Costimulation And AntiTumor Immunity, Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) and functions as a cell death inducer (Ishida, Y. et al. (1992) Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death, EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, SK et al. (2005) The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition, J. Molec. Med. 83:193-202). More specifically, it was found that interaction of the PD-1 receptor at low concentrations with the B7-H1 ligand results in the transmission of an inhibitory signal that potently inhibits the proliferation of antigen-specific CD8 + T cells; at higher concentrations, interactions with PD-1 do not inhibit T cell proliferation but significantly reduce the production of many cytokines (Sharpe, AH et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126). T cell proliferation and cytokine production by resting and previously activated CD4 and CD8 T cells, and even naive cord blood T cells, have been found to be inhibited by soluble B7-H1-Fc fusion proteins (Freeman, GJ et al. (2000) Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation, J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation, Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2, Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) The B7-CD28 Superfamily, Nature Rev. Immunol. 2:116-126).
Роль В7-Н1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток позволяет предположить, что указанные биологические молекулы могут служить терапевтическими мишенями для лечения воспаления и рака. В этой связи было предложено применение антител к PD-1 для лечения инфекций и опухолей, а также активирующей модуляции адаптивного иммунного ответа (см. публикации заявок на патент США № 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401, патенты США № 7521051, 7563869, 7595048, PCT публикации WO 2004/056875, WO 2008/083174). Антитела, способные специфично связываться с PD-1, были описаны Agata, Т. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes, Int. Immunol. 8(5):765-772; и Berger, R. et al. (2008) Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies, Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (см. также патенты США № 8008449 и 8552154, публикации патентов США № 2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 и 2014/0044738; и PCT публикации патентов WO 2003/099196 WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2006/121168, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2009/014708, WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549 и WO 2013/014668).The role of B7-H1 and PD-1 in inhibiting T cell activation and proliferation suggests that these biological molecules may serve as therapeutic targets for the treatment of inflammation and cancer. In this regard, the use of anti-PD-1 antibodies for the treatment of infections and tumors, as well as activating modulation of the adaptive immune response has been proposed (see US Patent Application Publications Nos. 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401, US Patents Nos. 7521051, 7563869, 7595048, PCT Publications WO 2004/056875, WO 2008/083174). Antibodies capable of specifically binding to PD-1 have been described by Agata, T. et al. (1996) Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And In Lymphocytes, Int. Immunol. 8(5):765-772; and Berger, R. et al. (2008) Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies, Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (see also U.S. Patent Nos. 8,008,449 and 8,552,154, U.S. Patent Publication Nos. 2007/0166281; 2012/0114648; 2012/0114649; 2013/0017199; 2013/0230514 and 2014/0044738; and PCT Patent Publication Nos. WO 2003/099196, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2006/121168, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2009/014708, WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549 and WO 2013/014668).
Однако, несмотря на все предшествующие достижения, остается потребность в улучшенных композициях, способных более активно направлять иммунную систему организма на поражение раковых клеток или инфицированных патогенами клеток, особенно в более низких терапевтических концентрациях. Несмотря на то что адаптивная иммунная система может быть мощным защитным механизмом против рака и заболевания, зачастую ей препятствуют механизмы подавления иммунитета в микроокружении опухоли, такие как экспрессия PD-1. Кроме того, коингибирующие молекулы, экспрессируемые опухолевыми клетками, иммунными клетками и стромальными клетками в опухолевой среде, могут преимущественно ослаблять ответы Т-клеток на раковые клетки. Следовательно, остается потребность в эффективных PD-1-связывающих молекулах. В частности, существует потребность в эффективных PD-1связывающих молекулах, имеющих желательный профиль кинетики связывания и способных выступать антагонистами оси PD-1/PD-L1, блокируя взаимодействие PD-1/PD-L1, что может обеспечить улучшенное терапевтическое действие у пациентов, страдающих раком или другими заболеваниями и состояниями. Настоящее изобретение направлено на указанные и другие цели.However, despite all previous achievements, there remains a need for improved compositions that can more actively direct the body's immune system to attack cancer cells or pathogen-infected cells, especially at lower therapeutic concentrations. Although the adaptive immune system can be a potent defense mechanism against cancer and disease, it is often hampered by immune suppression mechanisms in the tumor microenvironment, such as PD-1 expression. In addition, coinhibitory molecules expressed by tumor cells, immune cells, and stromal cells in the tumor environment can preferentially attenuate T cell responses to cancer cells. Therefore, there remains a need for effective PD-1-binding molecules. In particular, there is a need for effective PD-1 binding molecules that have a desirable binding kinetic profile and are capable of acting as antagonists of the PD-1/PD-L1 axis by blocking the PD-1/PD-L1 interaction, which can provide an improved therapeutic effect in patients suffering from cancer or other diseases and conditions. The present invention is directed to these and other purposes.
- 3 047726- 3 047726
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение относится к PD-1-связывающим молекулам, содержащим PD-1связывающий домен из отобранных антител к PD-1, способных связываться с PD-1 яванских макак и PD1 человека: MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. Согласно настоящему изобретению в частности предложены PD-1-связывающие молекулы, которые являются гуманизированными или химерными вариантами указанных антител или которые содержат PD-1-связывающие фрагменты указанных антител к PD-1 (в частности, иммуноконъюгаты, диатела, BiTE, биспецифические антитела и т.д.). В частности согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые дополнительно способны связываться с эпитопом молекулы, участвующей в регуляции контрольной точки иммунного ответа, которая присутствует на поверхности иммунной клетки. Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения указанных PD-1-связывающих молекул для детектирования PD-1 или для стимуляции иммунного ответа. Согласно настоящему изобретению также предложены способы комбинированной терапии, в которых PD-1-связывающую молекулу, которая содержит один или более PD-1связывающих доменов указанных отобранных антител к PD-1, вводят в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые эффективно стимулируют иммунный ответ, и/или в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые специфично связываются с раковым антигеном. В частности, согласно настоящему изобретению предложена молекула, связывающая PD-1 человека, которая содержит три домена гипервариабельных участков (CDR) тяжелой цепи (Н) CDRH1, CDRH2 и CDRH3 и три домена CDR легкой цепи (L) CDRL1, CDRL2 и CDRL3, причем:The present invention relates to PD-1-binding molecules comprising a PD-1-binding domain from selected anti-PD-1 antibodies capable of binding to cynomolgus macaque PD-1 and human PD1: anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15. The present invention provides, in particular, PD-1-binding molecules that are humanized or chimeric versions of said antibodies or that comprise PD-1-binding fragments of said antibodies to PD-1 (in particular, immunoconjugates, diabodies, BiTEs, bispecific antibodies, etc.). In particular, the present invention provides PD-1-binding molecules that are additionally capable of binding to an epitope of a molecule involved in the regulation of an immune checkpoint that is present on the surface of an immune cell. The present invention also provides methods of using said PD-1-binding molecules to detect PD-1 or to stimulate an immune response. The present invention also provides methods of combination therapy, wherein a PD-1 binding molecule comprising one or more PD-1 binding domains of said selected anti-PD-1 antibodies is administered in combination with one or more additional molecules that effectively stimulate an immune response and/or in combination with one or more additional molecules that specifically bind to a cancer antigen. In particular, the present invention provides a human PD-1 binding molecule that comprises three heavy chain complementarity determining region (CDR) domains (H) CDRH1, CDRH2 and CDRH3 and three light chain (L) CDR domains (L) CDR L 1, CDR L 2 and CDR L 3, wherein:
(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT к PD-1 1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 73; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT к PD-1 1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 78; или (B) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 2 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 87; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 2 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 и SEQ ID NO: 92; или (C) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 3 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 101; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 3 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 106; или (D) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 4 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110 и SEQ ID NO: 111; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 4 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 116; или (E) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 5 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 5 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126; или (F) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 6 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 и SEQ ID NO: 131; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 6 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 и SEQ ID NO: 136; или (G) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 7 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 7 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 144, SEQ(A) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT α-PD-1 1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, and SEQ ID NO: 73; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT α-PD-1 1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, and SEQ ID NO: 78; or (B) (1) the CDR H 1 domain, the CDR H 2 domain, and the CDR H 3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT α-PD-1 2 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, and SEQ ID NO: 87; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain, and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT 2 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, and SEQ ID NO: 92; or (C) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT 3 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, and SEQ ID NO: 101; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain are the light chain CDR domains of MAT 3 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, and SEQ ID NO: 106; or (D) (1) the CDR H 1 domain, the CDR H 2 domain, and the CDR H 3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 4 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, and SEQ ID NO: 111; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT 4 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, and SEQ ID NO: 116; or (E) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 5 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, and SEQ ID NO: 121; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT 5 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 and SEQ ID NO: 126; or (F) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT 6 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 and SEQ ID NO: 131; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the light chain CDR domains of MAT 6 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135 and SEQ ID NO: 136; or (G) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT 7 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, and SEQ ID NO: 141; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain, and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT 7 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, and SEQ ID NO: 146;
- 4 047726- 4 047726
ID NO: 145 и SEQ ID NO: 146; или (Н) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 8 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 и SEQ ID NO: 163; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 8 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 и SEQ ID NO: 168; или (I) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 9 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 и SEQ ID NO: 173; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 9 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 и SEQ ID NO: 178; или (J) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 10 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 и SEQ ID NO: 194; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 10 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 и SEQ ID NO: 199; или (K) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 11 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 и SEQ ID NO: 204; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 11 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 и SEQ ID NO: 209; или (L) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 12 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 и SEQ ID NO: 214; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 12 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218 и SEQ ID NO: 219 или (М) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 13 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 и SEQ ID NO: 224; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 13 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228 и SEQ ID NO: 229; или (N) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 14 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 и SEQ ID NO: 234; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 14 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238 и SEQ ID NO: 239; или (О) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT 15 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 и SEQ ID NO: 244; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT 15 к PD-1 и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248 и SEQ ID NO: 249; или (Р) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT к PD-1 человека (hPD-1) 7(1.2) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT к hPD-1 7 (1.2) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 145 и SEQ ID NO: 146; или (Q) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цепи MAT к hPD-1 7 (1.3) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 141; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT к hPD-1 7 (1.3) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 и SEQ ID NO: 145; или (R) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 представляют собой домены CDR тяжелой цеID NO: 145 and SEQ ID NO: 146; or (H) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 8 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 and SEQ ID NO: 163; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT 8 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167 and SEQ ID NO: 168; or (I) (1) the CDR H 1 domain, the CDR H 2 domain and the CDR H 3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 9 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172 and SEQ ID NO: 173; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT 9 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 and SEQ ID NO: 178; or (J) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 10 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193 and SEQ ID NO: 194; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT 10 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 and SEQ ID NO: 199; or (K) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT 11 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203 and SEQ ID NO: 204; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the light chain CDR domains of MAT 11 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 and SEQ ID NO: 209; or (L) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 12 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213 and SEQ ID NO: 214; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain and the CDR L 3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT 12 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218 and SEQ ID NO: 219 or (M) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 13 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of: SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 and SEQ ID NO: 224; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the light chain CDR domains of MAT 13 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228 and SEQ ID NO: 229; or (N) (1) the CDR H 1 domain, the CDR H 2 domain and the CDR H 3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT 14 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233 and SEQ ID NO: 234; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT 14 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238 and SEQ ID NO: 239; or (O) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the CDR domains of the heavy chain of MAT 15 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, and SEQ ID NO: 244; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of MAT 15 to PD-1 and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, and SEQ ID NO: 249; or (P) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT to human PD-1 (hPD-1) 7(1.2) and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140 and SEQ ID NO: 141; and (2) the CDR L 1 domain, the CDR L 2 domain and the CDR L 3 domain are the light chain CDR domains of MAT to hPD-1 7(1.2) and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 145 and SEQ ID NO: 146; or (Q) (1) the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT to hPD-1 7 (1.3) and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, and SEQ ID NO: 141; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain are the light chain CDR domains of MAT to hPD-1 7 (1.3) and, respectively, comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, and SEQ ID NO: 145; or (R) (1) the CDR H 1 domain, the CDR H 2 domain, and the CDR H 3 domain are the heavy chain CDR domains of MAT to hPD-1 7 (1.3)
- 5 047726 пи MAT к hPD-1 9 (2.2) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 172 и SEQ ID NO: 173; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 представляют собой домены CDR легкой цепи MAT к hPD-1 9 (2.2) и, соответственно, содержат аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 и SEQ ID NO: 178. Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации всех указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула представляет собой антитело, и в частности указанная молекула представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.- 5,047,726 pi mAb to hPD-1 9 (2.2) and, respectively, comprise the amino acid sequences: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 172 and SEQ ID NO: 173; and (2) the CDRL1 domain, the CDRL2 domain and the CDRL3 domain are the CDR domains of the light chain of mAb to hPD-1 9 (2.2) and, respectively, comprise the amino acid sequences: SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189 and SEQ ID NO: 178. According to the present invention, embodiments of all of these molecules binding human PD-1 are also provided, wherein said molecule is an antibody, and in particular said molecule is a chimeric antibody or a humanized antibody.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181 или SEQ ID NO: 250.The present invention also provides embodiments of said human PD-1 binding molecules, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, or SEQ ID NO: 250.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186 или SEQ ID NO: 251.The present invention also provides embodiments of said human PD-1 binding molecules, wherein the light chain variable domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, or SEQ ID NO: 251.
Согласно настоящему изобретению также предложен вариант реализации, в котором молекула, связывающая PD-1 человека, представляет собой биспецифическую связывающую молекулу, способную одновременно связываться с PD-1 человека и со вторым эпитопом, и в частности предложен вариант реализации, в котором второй эпитоп является эпитопом молекулы, участвующей в регуляции контрольной точки иммунного ответа, присутствующей на поверхности иммунной клетки (в частности, если второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, ГКГС класса I или II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA, и наиболее конкретно, если второй эпитоп представляет собой эпитоп CD137, CTLA-4, LAG-3, OX40, TIGIT или TIM-3).The present invention also provides an embodiment wherein the human PD-1 binding molecule is a bispecific binding molecule capable of simultaneously binding to human PD-1 and to a second epitope, and in particular provides an embodiment wherein the second epitope is an epitope of a molecule involved in the regulation of an immune checkpoint present on the surface of an immune cell (in particular where the second epitope is an epitope of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3, or VISTA, and most particularly if the second epitope is an epitope of CD137, CTLA-4, LAG-3, OX40, TIGIT, or TIM-3).
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации, в которых молекула, связывающая PD-1 человека, представляет собой биспецифическую молекулу, содержащую сайт связывания эпитопа LAG-3, в частности, в которой сайт связывания эпитопа LAG-3 содержит:The present invention also provides embodiments in which the human PD-1 binding molecule is a bispecific molecule comprising a LAG-3 epitope binding site, in particular in which the LAG-3 epitope binding site comprises:
(A) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи MAT к LAG-3 1, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, соответственно; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 вариабельной области легкой цепи MAT к LAG-3 1, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48, соответственно; или (B) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи VH1 MAT к LAG-3 человека (hLAG-3) 1, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44, соответственно; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 вариабельной области легкой цепи VL4 MAT к hLAG-3 1, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 48, соответственно; или (C) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи MAT к LAG-3 6, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 59, соответственно; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 вариабельной области легкой цепи MAT к LAG-3 6, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63, соответственно; или (D) (1) домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 вариабельной области тяжелой цепи VH1 MAT к hLAG-3 6, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 59, соответственно; и (2) домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3 вариабельной области легкой цепи MAT к LAG-3 6, содержащие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63, соответственно.(A) (1) a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a CDRH3 domain of the heavy chain variable region of MAT anti-LAG-3 1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, and SEQ ID NO: 44, respectively; and (2) a CDRL1 domain, a CDRL2 domain, and a CDRL3 domain of the light chain variable region of MAT anti-LAG-3 1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, and SEQ ID NO: 48, respectively; or (B) (1) a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a CDRH3 domain of the human anti-LAG-3 (hLAG-3) MAT VH1 heavy chain variable region 1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, and SEQ ID NO: 44, respectively; and (2) a CDR L 1 domain, a CDR L 2 domain, and a CDR L 3 domain of the VL4 light chain variable region of MAT κ hLAG-3 1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 47, and SEQ ID NO: 48, respectively; or (C) (1) a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a CDRH3 domain of the heavy chain variable region of MAT κ LAG-3 6 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, and SEQ ID NO: 59, respectively; and (2) a CDRL1 domain, a CDRL2 domain, and a CDRL3 domain of the light chain variable region of MAT κ LAG-3 6 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, and SEQ ID NO: 63, respectively; or (D) (1) a CDRH1 domain, a CDRH2 domain, and a CDRH3 domain of the VH1 heavy chain variable region of MAT to hLAG-3 6 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, and SEQ ID NO: 59, respectively; and (2) a CDR L 1 domain, a CDR L 2 domain, and a CDR L 3 domain of the light chain variable region of MAT to LAG-3 6 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 62, and SEQ ID NO: 63, respectively.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула представляет собой диатело, и в частности указанное диатело представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит две или три, или четыре, или пять полипептидных цепей. Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула представляет собой трехвалентную связывающую молекулу и в частности указанная трехвалентная связывающая молекула представляет собой ковалентно связанный комплекс, который содержит три, четыре, пять или более пяти полипептидных цепей. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула содержитThe present invention also provides embodiments of said human PD-1 binding molecules, wherein said molecule is a diabody, and in particular said diabody is a covalently linked complex that comprises two or three or four or five polypeptide chains. The present invention also provides embodiments of said human PD-1 binding molecules, wherein said molecule is a trivalent binding molecule, and in particular said trivalent binding molecule is a covalently linked complex that comprises three, four, five or more than five polypeptide chains. The present invention further provides embodiments of said human PD-1 binding molecules, wherein said molecule comprises
- 6 047726 область Fc. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены варианты реализации указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула содержит домен, связывающий альбумин, и в частности деиммунизированный домен, связывающий альбумин.- 6 047726 Fc region. According to the present invention, embodiments of said molecules binding human PD-1 are further provided, wherein said molecule comprises an albumin binding domain, and in particular a deimmunized albumin binding domain.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации всех указанных молекул, связывающих PD-1 человека, причем указанная молекула содержит область Fc, и при этом область Fc представляет собой вариант области Fc, который содержит одну или более модификаций аминокислот, которые снижают аффинность варианта области Fc в отношении FcyR и/или увеличивают период полувыведения из сыворотки крови, и более конкретно, в которой указанные модификации содержат по меньшей мере одну замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из:The present invention also provides embodiments of all of the above human PD-1 binding molecules, wherein the above molecule comprises an Fc region, and wherein the Fc region is a variant Fc region that comprises one or more amino acid modifications that reduce the affinity of the variant Fc region for FcyR and/or increase the serum half-life, and more particularly wherein the above modifications comprise at least one amino acid substitution selected from the group consisting of:
(1) L234A; L235A;(1) L234A; L235A;
(2) L234A и L235A;(2) L234A and L235A;
(3) M252Y; M252Y и S254T;(3) M252Y; M252Y and S254T;
(4) M252Y и Т256Е;(4) M252Y and T256E;
(5) M252Y, S254T и Т256Е; или (6) K288D и Н435К;(5) M252Y, S254T and T256E; or (6) K288D and Н435К;
где нумерация представляет собой индекс по системе нумерации ЕС, описанной в Кабат. Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации, в которых любую из вышеописанных PD-1-связывающих молекул применяют для стимуляции иммунного ответа, опосредуемого Т-клетками. Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены варианты реализации, в которых любую из вышеописанных PD-1-связывающих молекул применяют для лечения заболевания или состояния, связанного с подавленной иммунной системой, в частности, рака или инфекции.wherein the numbering is an index according to the EU numbering system described in Kabat. The present invention also provides embodiments in which any of the above-described PD-1 binding molecules is used to stimulate a T-cell mediated immune response. The present invention further provides embodiments in which any of the above-described PD-1 binding molecules is used to treat a disease or condition associated with a suppressed immune system, in particular cancer or an infection.
Согласно настоящему изобретению в частности предложен вариант применения в лечении или диагностике, или прогнозировании рака, причем рак характеризуется присутствием раковой клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечников, ассоциированного со СПИДом рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухоли сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной саркомы клеток почек, светлоклеточной саркомы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринной опухоли, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной тиреокарциномы, опухоли паращитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочек периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериальной увеальной меланомы, редкого гематологического расстройства, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной саркомы, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.According to the present invention, in particular, a variant of use in the treatment or diagnosis, or prognosis of cancer is proposed, wherein the cancer is characterized by the presence of a cancer cell selected from the group consisting of a cell: an adrenal tumor, AIDS-associated cancer, alveolar soft tissue sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid artery tumor, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal cell sarcoma, clear cell sarcoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing's tumor, extraskeletal myxoid chondrosarcoma, imperfect bone fibrogenesis, fibrous dysplasia of bone, gallbladder or bile duct cancer, gastric cancer, gestational trophoblastic disease, germ cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, islet cell tumor, Kaposi's sarcoma, renal cell cancer, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, medulloblastoma, melanoma, meningioma, multiple endocrine neoplasia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumor, ovarian cancer, pancreatic cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematological disorder, metastatic cancer kidney cancer, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell sarcoma, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic carcinoma, thymoma, metastatic thyroid cancer, and uterine cancer.
Согласно настоящему изобретению предложен способ применения в лечении или диагностике, или прогнозировании рака, причем рак представляет собой колоректальный рак, гепатоцеллюлярную карциному, глиому, рак почек, рак молочной железы, множественную миелому, рак мочевого пузыря, нейробластому; саркому, неходжкинскую лимфому, немелкоклеточный рак легких, рак яичников, рак поджелудочной железы, ректальный рак, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелолейкоз (CML), острый В-линейный лимфобластный лейкоз (B-ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), лейкоз ворсистых клеток (HCL), бластную опухоль из плазмоцитоидных дендритных клеток (BPDCN), неходжкинские лимфомы (NHL), включая лейкоз мантийных клеток (MCL) и мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL), лимфому Ходжкина, системный мастоцитоз или лимфому Беркитта.According to the present invention, a method is provided for use in the treatment or diagnosis, or prognosis of cancer, wherein the cancer is colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, glioma, renal cancer, breast cancer, multiple myeloma, bladder cancer, neuroblastoma; sarcoma, non-Hodgkin's lymphoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, rectal cancer, acute myeloid leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), hairy cell leukemia (HCL), blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm (BPDCN), non-Hodgkin's lymphomas (NHL) including mantle cell leukemia (MCL) and small lymphocytic lymphoma (SLL), Hodgkin's lymphoma, systemic mastocytosis, or Burkitt's lymphoma.
Согласно настоящему изобретению также предложены варианты реализации, в которых любая из вышеописанных PD-1-связывающих молекул содержит детектируемую метку и применяется для детектирования PD-1.The present invention also provides embodiments in which any of the above-described PD-1 binding molecules comprises a detectable label and is used to detect PD-1.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
На фиг. 1 представлено схематическое изображение типичного ковалентно связанного диатела, содержащего два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждая из которых содержит домен, способствующий образованию гетеродимера, с Е-спиралью или K-спиралью. Остаток цистеина может присутствовать в линкере и/или в домене, стимулирующем образование гетеродимера, как показано на фиг. 3В. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки.Fig. 1 is a schematic representation of a typical covalently linked diabody containing two epitope-binding sites consisting of two polypeptide chains, each containing a heterodimer-promoting domain with an E-helix or a K-helix. A cysteine residue may be present in the linker and/or in the heterodimer-promoting domain, as shown in Fig. 3B. The VL and VH domains, which recognize the same epitope, are shown using the same shading or filling.
На фиг. 2 представлено схематическое изображение типичной ковалентно связанной молекулы диаFig. 2 shows a schematic representation of a typical covalently linked dia molecule.
- 7 047726 тела, содержащей два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждая из которых содержит домен СН2 и CH3, так, что соответствующие цепи образуют полную область Fc или ее часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки.- 7 047726 body containing two epitope-binding sites consisting of two polypeptide chains, each containing a CH2 and a CH3 domain, such that the corresponding chains form all or part of an Fc region. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or filling.
На фиг. 3А-3С представлены схемы, иллюстрирующие типичное четырехвалентное диатело, содержащее четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух пар полипептидных цепей (т.е. в целом из четырех полипептидных цепей). Один полипептид каждой пары содержит домен СН2 и CH3, так, что соответствующие цепи образуют полную область Fc или ее часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки. Две пары полипептидных цепей могут быть одинаковыми. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых домены VL и VH распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3А-3С), полученная молекула обладает четырьмя сайтами связывания эпитопов и является биспецифической и двухвалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых домены VL и VH распознают один и тот же эпитоп (например, в обеих цепях использованы аналогичные CDR домена VL и аналогичные CDR домена VH), полученная молекула обладает четырьмя сайтами связывания эпитопов и является моноспецифичной и четырехвалентной в отношении одного эпитопа. В другом варианте две пары полипептидов могут быть разными. В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых домены VL и VH каждой пары полипептидов распознают различные эпитопы (как показано на фиг. 3А-3С), полученная молекула содержит четыре эпитопсвязывающих сайта и является тетраспецифичной и моновалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. На фиг. 3А представлено диатело, содержащее область Fc, которое содержит пептид домена, стимулирующего образование гетеродимера, содержащего остаток цистеина. На фиг. 3В представлено диатело, содержащее область Fc, которое содержит домены, способствующие образованию гетеродимера, с Е-спиралью и Kспиралью, содержащие остаток цистеина и линкер (необязательно содержащий остаток цистеина). На фиг. 3С представлено диатело, содержащее область Fc, которое содержит домены СН1 и CL.Figs. 3A-3C are diagrams illustrating an exemplary tetravalent diabody comprising four epitope-binding sites consisting of two pairs of polypeptide chains (i.e., a total of four polypeptide chains). One polypeptide of each pair comprises a CH2 and a CH3 domain, such that the corresponding chains form all or part of an Fc region. The VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or filling. The two pairs of polypeptide chains may be the same. In embodiments of the present invention in which the VL and VH domains recognize different epitopes (as shown in Figs. 3A-3C), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is bispecific and bivalent with respect to each epitope bound. In embodiments of the invention in which the VL and VH domains recognize the same epitope (e.g., the same VL domain CDRs and the same VH domain CDRs are used in both chains), the resulting molecule has four epitope binding sites and is monospecific and tetravalent for one epitope. Alternatively, the two pairs of polypeptides may be different. In embodiments of the invention in which the VL and VH domains of each pair of polypeptides recognize different epitopes (as shown in Figs. 3A-3C), the resulting molecule has four epitope binding sites and is tetraspecific and monovalent for each epitope bound. Fig. 3A shows a diabody comprising an Fc region that comprises a cysteine residue-containing heterodimer promoting domain peptide. Fig. 3B shows a diabody containing an Fc region that contains heterodimer-promoting domains with an E-helix and a K-helix containing a cysteine residue and a linker (optionally containing a cysteine residue). Fig. 3C shows a diabody containing an Fc region that contains CH1 and CL domains.
На фиг. 4А и 4В представлены схемы типичной ковалентно связанной молекулы диатела, содержащей два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из трех полипептидных цепей. Две полипептидные цепи содержат домены СН2 и CH3, так, что соответствующие цепи образуют полную область Fc или ее часть. Полипептидные цепи, содержащие домен VL и VH, дополнительно содержат домен, способствующий образованию гетеродимера. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки.Figures 4A and 4B are schematic diagrams of a typical covalently linked diabody molecule containing two epitope-binding sites composed of three polypeptide chains. The two polypeptide chains contain CH2 and CH3 domains, such that the corresponding chains form all or part of an Fc region. The polypeptide chains containing the VL and VH domain additionally contain a domain that facilitates heterodimer formation. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or filling.
На фиг. 5 представлена схема типичной ковалентно связанной молекулы диатела, содержащей четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из пяти полипептидных цепей. Две полипептидные цепи содержат домен СН2 и CH3, так, что соответствующие цепи образуют область Fc, которая включает полную область Fc или ее часть. Полипептидные цепи, содержащие соединенные домены VL и VH, дополнительно содержат домен, способствующий образованию гетеродимера. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки.Figure 5 shows a schematic of a typical covalently linked diabody molecule containing four epitope-binding sites composed of five polypeptide chains. Two of the polypeptide chains contain a CH2 and CH3 domain, such that the corresponding chains form an Fc region that includes all or part of the Fc region. The polypeptide chains containing the linked VL and VH domains additionally contain a domain that facilitates heterodimer formation. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or filling.
На фиг. 6A-6F представлены схемы типичных трехвалентных связывающих молекул, содержащих область Fc, содержащих три эпитопсвязывающих сайта. На фиг. 6А и 6В, соответственно, схематично представлены домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два домена связывания, характерных для диатела, и связывающий домен типа Fab, имеющих различные ориентации доменов, в которых связывающие домены, характерные для диатела, являются N-концевыми или С-концевыми по отношению к области Fc. Молекулы на фиг. 6А и 6В содержат четыре цепи. На фиг. 6С и 6D, соответственно, схематически представлены домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, N-концевых по отношению к области Fc, и связывающий домен типа Fab, в которых легкая цепь и тяжелая цепь соединены посредством полипептидного спейсера или связывающего домена типа scFv. Трехвалентные связывающие молекулы на фиг. 6Е и 6F, соответственно, схематически иллюстрируют домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, С-концевых по отношению к области Fc, и связывающий домен типа Fab, или связывающий домен типа scFv, в котором находятся связывающие домены, характерные для диатела. Трехвалентные связывающие молекулы на фиг. 6C-6F содержат три цепи. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одинакового затенения или заливки.Figs. 6A-6F are schematic representations of exemplary trivalent binding molecules comprising an Fc region containing three epitope-binding sites. Figs. 6A and 6B, respectively, are schematic representations of the domains of trivalent binding molecules comprising two diabody-specific binding domains and a Fab-type binding domain having different domain orientations in which the diabody-specific binding domains are N-terminal or C-terminal to the Fc region. The molecules of Figs. 6A and 6B contain four chains. Figs. 6C and 6D, respectively, are schematic representations of the domains of trivalent binding molecules comprising two diabody-specific binding domains N-terminal to the Fc region and a Fab-type binding domain in which the light chain and the heavy chain are linked by a polypeptide spacer or an scFv-type binding domain. The trivalent binding molecules in Figs. 6E and 6F, respectively, schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two diabody-specific binding domains C-terminal to the Fc region and a Fab-type binding domain or an scFv-type binding domain in which the diabody-specific binding domains reside. The trivalent binding molecules in Figs. 6C-6F contain three chains. The VL and VH domains, which recognize the same epitope, are shown using the same shading or filling.
На фиг. 7A-7D показано, что MAT к PD-1 1-15 связываются с PD-1 человека. Кривые связывания для связывания с shPD-1-His представлены на фиг. 7А (МАТ к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 4 к PD-1 и MAT 9 к PD-1), фиг. 7В (МАТ 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1 и MAT 7 к PD-1) и фиг. 7С (МАТ 3 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD1). Кривые связывания для связывания с shPD-1-Fc человека представлены на фиг. 7D (МАТ 3 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD-1).Figures 7A-7D show that anti-PD-1 MAbs 1-15 bind to human PD-1. Binding curves for binding to shPD-1-His are shown in Figure 7A (anti-PD-1 MAb 1, anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 4, and anti-PD-1 MAb 9), Figure 7B (anti-PD-1 MAb 5, anti-PD-1 MAb 6, and anti-PD-1 MAb 7), and Figure 7C (anti-PD-1 MAb 3, anti-PD-1 MAb 8, anti-PD-1 MAb 10, anti-PD-1 MAb 11, anti-PD-1 MAb 12, anti-PD-1 MAb 13, anti-PD-1 MAb 14, and anti-PD-1 MAb 15). Binding curves for binding to human shPD-1-Fc are shown in Fig. 7D (MAT 3 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1, and MAT 15 to PD-1).
На фиг. 8А-8С показано, что MAT к PD-1 1-15 связываются с PD-1 яванских макак. Кривые связывания для связывания с scynoPD-1-hFc представлены на фиг. 8А (МАТ к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 4 кFigures 8A–8C show that anti-PD-1 MAbs 1–15 bind to cynomolgus macaque PD-1. Binding curves for binding to scynoPD-1-hFc are shown in Figure 8A (anti-PD-1 MAb 1, anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 4, anti-PD-1 MAb 5, anti-PD-1 MAb 6, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 8, anti-PD-1 MAb 9, anti-PD-1 MAb 10, anti-PD-1 MAb 11, anti-PD-1 MAb 12, anti-PD-1 MAb 13, anti-PD-1 MAb 14, anti-PD-1 MAb 15, anti-PD-1 MAb 16, anti-PD-1 MAb 17, anti-PD-1 MAb 18, anti-PD-1 MAb 19, anti-PD
- 8 047726- 8 047726
PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1), фиг. 8В (МАТ 9 к PD-1) и фиг. 8С (МАТ 3 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 10 к PD-1, МАТ 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1,MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD-1). На фиг. 9A-9D представлены результаты оценки способности MAT к PD-1 1-15 блокировать связывание PD-L1 человека с PD-1 человека. Кривые ингибирования представлены на фиг. 9А (МАТ к PD-1 I, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 15 к PD-1 и MAT к PD-1 А), фиг. 9В (МАТ 4 к PD-1), фиг. 9С (МАТ 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1 и MAT к PD-1 А) и фиг. 9D (МАТ 3 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 10 к PD-1,MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1,MAT 15 к PD-1 и MAT к PD-1 A).PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1), Fig. 8B (MAT 9 to PD-1) and Fig. 8C (MAT 3 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 and MAT 15 to PD-1). Figs. 9A-9D show the results of assessing the ability of MATs to PD-1 1-15 to block the binding of human PD-L1 to human PD-1. The inhibition curves are shown in Fig. 9A (MAT to PD-1 I, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 15 to PD-1 and MAT to PD-1 A), Fig. 9B (MAT 4 to PD-1), Fig. 9C (MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1 and MAT to PD-1 A) and Fig. 9D (MAT 3 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1, MAT 15 to PD-1 and MAT to PD-1 A).
На фиг. 10А-10В представлены результаты оценки тканевой специфичности MAT к hPD-1 7. На фиг. 10А представлены результаты гистологического окрашивания ткани нормальной толстой кишки (панели i и vii), печени (панели ii и viii), легких (панели iii и ix), поджелудочной железы (панели iv и х), почек (панели v и xi) и сердца (панели vi и xii). На фиг. 10А, панели i-vi, представлены результаты исследования ткани, которую инкубировали с меченым MAT 7 к PD-1 (0,313 мкг/мл). На фиг. 10А, панели viixii, представлены результаты исследования ткани, которую инкубировали с меченым MAT для контроля изотипа (0,314 мкг/мл). На фиг. 10В представлены результаты гистологического окрашивания кожи (панели i и iv), миндалин (панели ii и v) и клеток линии NSO, экспрессирующих PD-1 (панели iii и vi). На фиг. 10В, панели i-iii, представлены результаты исследования ткани, которую инкубировали с меченым MAT 7 к PD-1 (0,313 мкг/мл).Figures 10A-10B show the results of the tissue specificity analysis of hPD-1 mAb 7. Figure 10A shows the histological staining of normal colon (panels i and vii), liver (panels ii and viii), lung (panels iii and ix), pancreas (panels iv and x), kidney (panels v and xi), and heart (panels vi and xii) tissue. Figure 10A, panels i-vi, show the results of tissue incubated with labeled hPD-1 mAb 7 (0.313 μg/mL). Figure 10A, panels viixii, show the results of tissue incubated with labeled isotype control mAb (0.314 μg/mL). 10B shows the results of histological staining of skin (panels i and iv), tonsils (panels ii and v), and PD-1-expressing NSO cells (panels iii and vi). Fig. 10B, panels i-iii, show the results of tissue incubated with labeled MAb 7 to PD-1 (0.313 μg/mL).
На фиг. 11 представлены профили связывания гуманизированных антител к PD-1 человека, MAT к hPD-1 2, MAT к hPD-1 7 (1.1), MAT к hPD-1 7 (1.2), MAT к hPD-1 9 (1.1), и контрольных антител к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, содержащих IgG1 (АА) или IgG4 (P), для связывания с PD-1 на поверхности клеток.Figure 11 shows the binding profiles of humanized anti-PD-1 antibodies, anti-hPD-1 MAb 2, anti-hPD-1 MAb 7 (1.1), anti-hPD-1 MAb 7 (1.2), anti-hPD-1 MAb 9 (1.1), and anti-PD-1 control antibodies, anti-PD-1 MAb A and anti-PD-1 MAb B, containing IgG1 (AA) or IgG4 (P), for binding to PD-1 on the cell surface.
На фиг. 12А-12В представлены результаты оценки способности гуманизированных антител к PD, MAT к hPD-1 2, MAT к hPD-1 7 (1.1), MAT к hPD-1 7(1.2), MAT к hPD-1 9 (1.1), эталонных антител к PD1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, содержащих IgG1 (АА) или IgG4 (P), блокировать связывание растворимого PD-L1 человека (фиг. 12А) и растворимого PD-L2 человека (фиг. 12В) с PD-1 человека на поверхности клеток.Figures 12A-12B show the results of evaluating the ability of humanized anti-PD antibodies, anti-hPD-1 MAb 2, anti-hPD-1 MAb 7 (1.1), anti-hPD-1 MAb 7 (1.2), anti-hPD-1 MAb 9 (1.1), reference anti-PD1 antibodies, anti-PD-1 MAb A, and anti-PD-1 MAb B containing IgG1 (AA) or IgG4 (P), to block the binding of soluble human PD-L1 (Figure 12A) and soluble human PD-L2 (Figure 12B) to human PD-1 on the cell surface.
На фиг. 13 представлены результаты оценки способности гуманизированных антител к PD, MAT к hPD-1 2, MAT к hPD-1 7(1.1), MAT к hPD-1 7(1.2), MAT к hPD-1 9(1.1), и эталонных антител к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, содержащих IgG1 (АА) или IgG4 (P), выступать антагонистами оси PD1/PD-L1, блокируя взаимодействие PD-1/PD-L1 и предотвращая подавление ответов Т-клеток в количественном исследовании с использованием репортера люциферазы Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1.Figure 13 shows the results of evaluating the ability of humanized anti-PD antibodies, anti-hPD-1 MAb 2, anti-hPD-1 MAb 7(1.1), anti-hPD-1 MAb 7(1.2), anti-hPD-1 MAb 9(1.1), and reference anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAb A and anti-PD-1 MAb B, containing IgG1 (AA) or IgG4 (P), to act as antagonists of the PD1/PD-L1 axis by blocking the PD-1/PD-L1 interaction and preventing the suppression of T cell responses in a quantitative assay using the Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1 luciferase reporter.
На фиг. 14 представлены результаты, свидетельствующие о том, что MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, сопоставимых или выше тех, которые характерны для эталонных антител к PD-1 (МАТ к PD-1 А и MAT к PD-1 В), и что обработка с использованием МАТ 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 в комбинации с MAT к LAG-3 1 обеспечила наибольшее увеличение высвобождения цитокинов. Представлены профили секреции ИФН-γ из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), стимулированных энтеротоксином В стафилококка (SEB), обработанных антителами к PD-1 и антителами к LAG-3 по отдельности и в комбинации.Figure 14 presents results showing that anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 9, and anti-PD-1 MAb 15 were able to stimulate cytokine production to levels comparable to or higher than those of the reference anti-PD-1 antibodies (anti-PD-1 MAb A and anti-PD-1 MAb B), and that treatment with anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 9, and anti-PD-1 MAb 15 in combination with anti-LAG-3 MAb 1 provided the greatest increase in cytokine release. We present IFN-γ secretion profiles from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with staphylococcal enterotoxin B (SEB), treated with anti-PD-1 antibodies and anti-LAG-3 antibodies individually and in combination.
На фиг. 15А-15В представлены результаты оценки способности гуманизированных антител к PD, MAT к hPD-1 2, MAT к hPD-1 7(1.2), MAT к hPD-1 9(1.1), и эталонных антител к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, содержащих IgG1 (АА) или IgG4 (P), стимулировать выработку цитокинов. Представлены профили секреции ИФН-γ (фиг. 15А) и ФНО-α (фиг. 15В) из SEB-стимулированных МКПК, обработанных антителами к PD-1.Figures 15A-15B show the results of the assessment of the ability of humanized anti-PD antibodies, anti-hPD-1 mAb 2, anti-hPD-1 mAb 7(1.2), anti-hPD-1 mAb 9(1.1), and the reference anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 mAb A and anti-PD-1 mAb B, containing IgG1 (AA) or IgG4 (P), to stimulate cytokine production. The secretion profiles of IFN-γ (Figure 15A) and TNF-α (Figure 15B) from SEB-stimulated PBMCs treated with anti-PD-1 antibodies are shown.
На фиг. 16А-16В представлены результаты, свидетельствующие о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART A, DART D, DART E, DART F, DART G и DART H, способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, сопоставимых или превышающих уровни, наблюдаемые при введении комбинации MAT к PD-1+MAT к LAG-3 (МАТ к PD-1 А+MAT к LAG-3 А), а также о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART A, DART D, DART E, DART F и DART G, обеспечили наибольшее усиление высвобождения цитокинов. Профили секреции ИФН-γ из МКПК, стимулированных низкой концентрацией SEB (0,2 нг/мл), обработанных биспецифическими диателами PD-1xLAG-3 или антителами к PD-1 и LAG-3 по отдельности и в комбинации, представлены в графической форме. Результаты, полученные с использованием МКПК от двух типичных доноров, представлены на фиг. 16А и фиг. 16В.Figures 16A-16B show results demonstrating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabody constructs, DART A, DART D, DART E, DART F, DART G, and DART H, were able to stimulate cytokine production to levels comparable to or greater than those observed with the combination of anti-PD-1 mAb+anti-LAG-3 mAb (anti-PD-1 mAb A+anti-LAG-3 mAb A), and that the PD-1xLAG-3 bispecific diabody constructs, DART A, DART D, DART E, DART F, and DART G, provided the greatest enhancement of cytokine release. IFN-γ secretion profiles from PBMCs stimulated with a low concentration of SEB (0.2 ng/ml) treated with PD-1xLAG-3 bispecific diabodies or with antibodies to PD-1 and LAG-3 alone and in combination are shown in graphical form. The results obtained using PBMCs from two representative donors are shown in Fig. 16A and Fig. 16B.
На фиг. 17А-17В представлены результаты, свидетельствующие о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART A, DART В и DART С, способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, превышающих уровни, наблюдаемые при введении комбинации MAT к PD-1+MAT к LAG-3 (МАТ к PD-1 А+MAT к LAG-3 А). Профили секреции ИФН-γ из МКПК от двух типичных доноров, стимулированных высокой концентрацией SEB (85 нг/мл), которые обрабатывали биспецифическими диателами PD-1xLAG-3 или антителами к PD-1 и антителами к LAG-3 по отдельности и в комбинаFigures 17A–17B show results demonstrating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies constructs, DART A, DART B, and DART C, are able to stimulate cytokine production to levels exceeding those observed with the combination of anti-PD-1 mAb+anti-LAG-3 mAb (anti-PD-1 mAb A+anti-LAG-3 mAb A). IFN-γ secretion profiles from PBMCs from two representative donors stimulated with high concentrations of SEB (85 ng/mL) treated with PD-1xLAG-3 bispecific diabodies or anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies alone and in combination
- 9 047726 ции, представлены в графической форме. Результаты, полученные с использованием МКПК от двух типичных доноров, представлены на фиг. 17А и фиг. 17В.- 9 047726 tions are presented in graphical form. The results obtained using PBMCs from two typical donors are shown in Fig. 17A and Fig. 17B.
На фиг. 18А-18В представлены результаты, свидетельствующие о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART A, DART В и DART С, способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, превышающих уровни, наблюдаемые при введении комбинации MAT к PD-1+MAT к LAG-3 (MAT к PD-1 A+MAT к LAG-3 А). Профили секреции ИФН-γ из МКПК от двух типичных доноров, стимулированных средней концентрацией SEB (0,5 нг/мл), которые обрабатывали биспецифическими диателами PD-1xLAG-3 или антителами к PD-1 и антителами к LAG-3 по отдельности или в комбинации, представлены в графической форме. Результаты, полученные с использованием МКПК от двух типичных доноров, представлены на фиг. 18А и фиг. 18В.Figures 18A-18B show results demonstrating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies constructs, DART A, DART B, and DART C, are able to stimulate cytokine production to levels exceeding those observed with the combination of anti-PD-1 mAb+anti-LAG-3 mAb (anti-PD-1 mAb A+anti-LAG-3 mAb A). IFN-γ secretion profiles from PBMCs from two representative donors stimulated with a medium concentration of SEB (0.5 ng/mL) that were treated with the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies or with anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies, either alone or in combination, are shown in graphical form. The results obtained using PBMCs from two representative donors are shown in Figure 18A and Figure 18B.
На фиг. 19 представлены результаты, свидетельствующие о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART D и DART H, способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, сопоставимых или превышающих уровни, которые наблюдают при введении комбинации MAT к PD1+MAT к LAG-3 (МАТ к PD-1 А+MAT к LAG-3 А), а также о том, что DART D обеспечило наибольшее увеличение высвобождения цитокинов. Профили секреции ИЛ-2 из МНПК от типичного донора, стимулированных высокой концентрацией SEB (85 нг/мл), которые обрабатывали биспецифическими диателами PD-1xLAG-3 или антителами к PD-1 и антителами к LAG-3, по отдельности и в комбинации, представлены в графической форме. На фиг. 20 представлены результаты, свидетельствующие о том, что конструкции биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART В и DART I, способны стимулировать выработку цитокинов до уровней, превышающих те, которые наблюдали при введении комбинации MAT к PD-1+MAT к LAG-3 (МАТ к PD-1 А+MAT к LAG-3 А, MAT к hPD-1 7(1.2)+MAT к hLAG-3 1(1.4), MAT к hPD-1 7(1.2)+MAT к hLAG-3 6(1.1)). Профили секреции ИФН-γ из МКПК от типичного донора, стимулированных средней концентрацией SEB (0,5 нг/мл), которые обрабатывали биспецифическими диателами PD-1xLAG-3 или антителами к PD-1 и антителами к LAG-3, по отдельности и в комбинации, представлены в графической форме.Figure 19 shows the results demonstrating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies constructs, DART D and DART H, were able to stimulate cytokine production to levels comparable to or greater than those observed with the combination of anti-PD1 mAb+anti-LAG-3 mAb (anti-PD-1 mAb A+anti-LAG-3 mAb A), and that DART D provided the greatest increase in cytokine release. The IL-2 secretion profiles from typical donor PBMCs stimulated with a high concentration of SEB (85 ng/mL) that were treated with the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies or with anti-PD-1 antibodies and anti-LAG-3 antibodies, alone and in combination, are shown in graphical form. 20 presents results indicating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies constructs, DART B and DART I, are capable of stimulating cytokine production to levels exceeding those observed with the administration of a combination of anti-PD-1 MAb + anti-LAG-3 MAb (anti-PD-1 MAb A + anti-LAG-3 MAb A, anti-hPD-1 MAb 7(1.2) + anti-hLAG-3 MAb 1(1.4), anti-hPD-1 MAb 7(1.2) + anti-hLAG-3 MAb 6(1.1)). IFN-γ secretion profiles from typical donor PBMCs stimulated with a moderate concentration of SEB (0.5 ng/mL) that were treated with PD-1xLAG-3 bispecific diabodies or anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies, individually and in combination, are shown in graphical form.
На фиг. 21A-21D представлены результаты, свидетельствующие о том, что биспецифическое диатело PD-1xLAG-3, DART I, способно стимулировать выработку цитокинов до уровней, превышающих те, которые наблюдали при введении комбинации MAT к PD-1+MAT к LAG-3 (МАТ к PD-1 А+MAT к LAG3 А). Профили секреции ИФН-γ (фиг. 21А и 21С) и ИЛ-2 (фиг. 21В и 21D) из CD4 Т-клеток памяти от двух типичных доноров, стимулированных столбнячным анатоксином (5 мкг/мл), которые обрабатывали биспецифическим диателом PD-1xLAG-3, DART-I, антителами к PD-1 и антителами к LAG-3 в комбинации или антителом для контроля изотипа, представлены в графической форме. Результаты, полученные на 7 день с использованием CD4 Т-клеток памяти от двух типичных доноров, представлены на фиг. 21АВ и фиг. 21C-D. На фиг. 22 представлены результаты, свидетельствующие о том, что параметры фармакокинетики биспецифической молекулы PD-1xLAG-3, DART I, сопоставимы с таковыми для антитела к PD-1, MAT к PD-1 A IgG4 (P), у яванских макак. Линии указывают среднюю концентрацию в сыворотке крови DART I (сплошная линия) и MAT к PD-1 А (пунктирная линия). Отдельные значения для самцов (заполненные символы) и самок (открытые символы) обезьян представлены в графической форме для DART I (треугольники) и MAT к PD-1 А (круги).Figures 21A-21D show results demonstrating that the PD-1xLAG-3 bispecific diabody, DART I, is able to stimulate cytokine production to levels exceeding those observed with the combination of anti-PD-1 mAb+anti-LAG-3 mAb (anti-PD-1 mAbA+anti-LAG3 mAbA). The secretion profiles of IFN-γ (Figures 21A and 21C) and IL-2 (Figures 21B and 21D) from tetanus toxoid-stimulated (5 μg/ml) memory CD4 T cells from two representative donors treated with the PD-1xLAG-3 bispecific diabody, DART-I, anti-PD-1 antibody, and anti-LAG-3 antibody in combination, or an isotype control antibody are shown in graphical form. Results obtained at day 7 using memory CD4 T cells from two typical donors are shown in Fig. 21AB and Figs. 21C–D. Figure 22 shows results demonstrating that the pharmacokinetic parameters of the PD-1xLAG-3 bispecific molecule, DART I, are comparable to those of the anti-PD-1 antibody, anti-PD-1 A IgG4 mAb (P), in cynomolgus monkeys. Lines indicate mean serum concentrations of DART I (solid line) and anti-PD-1 A mAb (dashed line). Individual values for male (filled symbols) and female (open symbols) monkeys are plotted for DART I (triangles) and anti-PD-1 A mAb (circles).
На фиг. 23А-23С представлены концентрации антител в сыворотке крови и процент связанного PD1 на поверхности CD4+ или CD8+ Т-клеток в зависимости от времени у животных после лечения с использованием различных антител к PD-1. Процент связанного PD-1 на поверхности CD4+ или CD8+ Тклеток после лечения с использованием MAT к PD-1 представлен в графической форме на правых осях OY; символы представляют собой процент (%) связанного PD-1 на Т-клетках для каждого отдельного животного, и пунктирные линии представляют собой средние значения. Концентрации MAT в сыворотке крови представлены в графической форме на левых осях OY; символы представляют собой уровни в сыворотке крови для каждого отдельного животного, и сплошные линии представляют собой кривые нелинейной аппроксимации данных. На каждой панели представлены данные для животных (n=1/пол/группа), которым вводили 10 мг/кг MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) (фиг. 23А), MAT к PD-1 A IgG4 (P) (фиг. 23В) или MAT к PD-1 В IgG4 (P) (фиг. 23В) путем внутривенной (в/в) инфузии на 1 день.Figures 23A-23C show serum antibody concentrations and the percentage of bound PD1 on CD4+ or CD8+ T cells as a function of time in animals after treatment with different anti-PD-1 antibodies. The percentage of bound PD-1 on CD4+ or CD8+ T cells after treatment with anti-PD-1 mAbs is plotted on the right OY axes; symbols represent the percentage (%) of bound PD-1 on T cells for each individual animal, and dashed lines represent mean values. Serum mAb concentrations are plotted on the left OY axes; symbols represent serum levels for each individual animal, and solid lines represent nonlinear fits of the data. Each panel shows data for animals (n=1/sex/group) that received 10 mg/kg anti-hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P) (Fig. 23A), anti-PD-1 mAb A IgG4 (P) (Fig. 23B), or anti-PD-1 mAb B IgG4 (P) (Fig. 23B) by intravenous (i.v.) infusion on day 1.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые содержат PD-1-связывающий домен отобранных антител к PD-1, способных связываться с PD-1 яванских макак и PD-1 человека: MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. В частности, согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые являются гуманизированными или химерными вариантами указанных антител, или которые содержат PD-1-связывающие фрагменты указанных антител к PD-1 (в частности, иммуноконъюгаты, диатела (включая, но не ограничиваясь ими, DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I и DART-J), BiTE, биспецифические антитела и т.д.). Согласно настоящему изобретению предложены PD-1-связывающие молекулы, которые дополниAccording to the present invention, PD-1-binding molecules are provided that comprise a PD-1-binding domain of selected anti-PD-1 antibodies capable of binding to cynomolgus macaque PD-1 and human PD-1: anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15. In particular, the present invention provides PD-1-binding molecules that are humanized or chimeric versions of said antibodies, or that comprise PD-1-binding fragments of said PD-1 antibodies (in particular, immunoconjugates, diabodies (including, but not limited to, DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I and DART-J), BiTEs, bispecific antibodies, etc.). The present invention provides PD-1-binding molecules that complement
- 10 047726 тельно способны связываться с эпитопом молекулы, участвующей в регуляции контрольной точки иммунного ответа, которая присутствует на поверхности иммунной клетки. Согласно настоящему изобретению также предложены способы применения указанных PD-1-связывающих молекул для детектирования PD-1 или для стимуляции иммунного ответа. Согласно настоящему изобретению также предложены способы комбинированной терапии, в которых PD-1-связывающую молекулу, которая содержит один или более PD-1-связывающих доменов указанных отобранных антител к PD-1, вводят в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые эффективно стимулируют иммунный ответ, и/или в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые специфично связываются с раковым антигеном.- 10 047726 are particularly capable of binding to an epitope of a molecule involved in the regulation of an immune response checkpoint, which is present on the surface of an immune cell. According to the present invention, there are also provided methods of using said PD-1-binding molecules for detecting PD-1 or for stimulating an immune response. According to the present invention, there are also provided methods of combination therapy, in which a PD-1-binding molecule, which comprises one or more PD-1-binding domains of said selected antibodies to PD-1, is administered in combination with one or more additional molecules that effectively stimulate an immune response, and/or in combination with one or more additional molecules that specifically bind to a cancer antigen.
I. Антитела и их связывающие домены.I. Antibodies and their binding domains.
Антитела согласно настоящему изобретению представляют собой молекулы иммуноглобулинов, способные специфично связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина. В настоящем изобретении термины антитело и антитела относятся к моноклональным антителам, мультиспецифичным антителам, антителам человека, гуманизированным антителам, синтетическим антителам, химерным антителам, поликлональным антителам, антителам верблюдовых, одноцепочечным Fvs (scFv), одноцепочечным антителам, фрагментам Fab, фрагментам F(ab'), соединенным дисульфидными связями биспецифическим Fvs (sdFv), внутриклеточным антителам и эпитопсвязывающим фрагментам любого из вышеуказанных. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA1) или подкласса. Было показано, что, помимо известных способов применения антител в диагностике, антитела можно применять в качестве терапевтических агентов. Антитела способны иммунологически специфично связываться с полипептидом или белком или небелковой молекулой вследствие присутствия на такой молекуле определенного домена или фрагмента или конформации (эпитопа). Содержащая эпитоп молекула может обладать иммуногенной активностью так, что она вызывает выработку антител у животного, такие молекулы называются антигенами. В последние несколько десятилетий наблюдается возрождение интереса к терапевтическому потенциалу антител, и антитела стали одним из ведущих классов биотехнологических препаратов (Chan, C.E. et al. (2009) The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases, Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 лекарственных препаратов на основе антител были одобрены для применения или находятся на стадии разработки.The antibodies of the present invention are immunoglobulin molecules capable of specifically binding to a target such as a carbohydrate, a polynucleotide, a lipid, a polypeptide, etc., via at least one antigen recognition site located in the variable domain of the immunoglobulin molecule. In the present invention, the terms antibody and antibodies refer to monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, synthetic antibodies, chimeric antibodies, polyclonal antibodies, camelid antibodies, single-chain Fvs (scFv), single-chain antibodies, Fab fragments, F(ab') fragments, disulfide-linked bispecific Fvs (sdFv), intracellular antibodies, and epitope-binding fragments of any of the foregoing. In particular, antibodies include immunoglobulin molecules and immunologically active fragments of immunoglobulin molecules, i.e. molecules that contain an antigen-binding site. Immunoglobulin molecules may be of any type (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA1), or subclass. In addition to the known diagnostic uses of antibodies, antibodies have been shown to be useful as therapeutic agents. Antibodies are capable of immunologically specifically binding to a polypeptide or protein or nonprotein molecule due to the presence of a particular domain or fragment or conformation (epitope) on such molecule. The epitope-containing molecule may have immunogenic activity such that it elicits the production of antibodies in an animal, such molecules being called antigens. Over the past few decades, there has been a resurgence of interest in the therapeutic potential of antibodies, and antibodies have become one of the leading classes of biotechnological drugs (Chan, C.E. et al. (2009) The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases, Singapore Med. J. 50(7):663-666). More than 200 antibody-based drugs have been approved for use or are in development.
Термин моноклональное антитело относится к гомогенной популяции антител, причем моноклональное антитело состоит из аминокислот (природных и неприродных), которые участвуют в селективном связывании антигена. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены к одному эпитопу (или антигенному сайту). Термин моноклональное антитело включает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, а также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')2 Fv), одноцепочечные фрагменты (scFv), их мутированные варианты, гибридные белки, содержащие часть антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена, обладающий требуемой специфичностью и способностью связываться с антигеном. Термин не являются ограничивающим в отношении источника антитела или способа его получения (например, с помощью гибридомы, отбора фага, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает полноразмерные иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением антитело. Способы получения моноклональных антител известны в данной области техники. Одним из способов, которые могут быть использованы, является способ, описанный Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256:495-497, или его модификация. Как правило, моноклональные антитела вырабатываются у мышей, крыс или кроликов. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат желательный эпитоп. Иммуноген может представлять собой, но не ограничивается ими, первичные клетки, культивируемые линии клеток, раковые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань. Клетки, используемые для иммунизации, можно культивировать в течение определенного периода времени (например, по меньшей мере 24 часов) до их использования в качестве иммуногена. Клетки могут быть использованы в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production, ILAR J. 37(3):119-125). В целом клетки должны поддерживаться в интактном состоянии и предпочтительно жизнеспособном состоянии при использовании в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечить более эффективное детектирование антигенов, чем поврежденные клетки, иммунизированным животным. Использование денатурации или жестких адъювантов, например, адъюванта Фрейда, может привести к повреждению клеток и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить несколько раз с периодическими интервалами, такими как один раз в две недели или еженеThe term monoclonal antibody refers to a homogeneous population of antibodies, wherein a monoclonal antibody is composed of amino acids (natural and non-natural) that participate in the selective binding of an antigen. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed to a single epitope (or antigenic site). The term monoclonal antibody includes not only intact monoclonal antibodies and full-length monoclonal antibodies, but also fragments thereof (such as Fab, Fab', F(ab') 2 Fv), single-chain fragments (scFv), mutated variants thereof, fusion proteins containing part of an antibody, humanized monoclonal antibodies, chimeric monoclonal antibodies, and any other modified configuration of the immunoglobulin molecule that contains an antigen recognition site having the desired specificity and ability to bind to an antigen. The term is not limiting as to the source of the antibody or the method of its production (e.g., by hybridoma, phage selection, recombinant expression, transgenic animals, etc.). The term includes full-length immunoglobulins as well as fragments, etc., described above under the definition of antibody. Methods for producing monoclonal antibodies are known in the art. One method that can be used is the method described by Kohler, G. et al. (1975) Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity, Nature 256:495-497, or a modification thereof. Typically, monoclonal antibodies are produced in mice, rats, or rabbits. The antibodies are produced by immunizing the animal with an immunogenic amount of cells, cell extracts, or protein preparations that contain the desired epitope. The immunogen may be, but is not limited to, primary cells, cultured cell lines, cancer cells, proteins, peptides, nucleic acids, or tissue. Cells used for immunization may be cultured for a period of time (e.g., at least 24 hours) prior to use as an immunogen. Cells may be used as immunogens alone or in combination with a non-denaturing adjuvant such as Ribi (see, e.g., Jennings, VM (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production, ILAR J. 37(3):119-125). In general, cells should be maintained in an intact state and preferably viable when used as immunogens. Intact cells may provide more efficient antigen detection than damaged cells in immunized animals. The use of denaturing or harsh adjuvants, such as Freud's adjuvant, may cause cell damage and is therefore not recommended. The immunogen can be administered multiple times at periodic intervals, such as once every two weeks or every
- 11 047726 дельно, или можно вводить так, чтобы поддерживать жизнеспособность животного (например, в тканевом рекомбинанте). В другом варианте, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифичными для желательного патогенного эпитопа, могут быть секвенированы и получены с использованием любых рекомбинантных способов, известных в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подходящее антитело секвенируют, и полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая представляющее интерес антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для последующего использования. Полинуклеотидную последовательность подходящих антител можно использовать для генетической манипуляции, чтобы получить моноспецифичные или полиспецифичные (например, биспецифические, триспецифичные и тетраспецифичные) молекулы согласно настоящему изобретению, а также антитело с оптимизированной аффинностью, химерное антитело, гуманизированное антитело и/или антитело, содержащее фрагменты антител собачьих, чтобы улучшить аффинность или другие характеристики антитела. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности антигенсвязывающей части антитела и замену оставшейся части антитела из вида, отличного от человека, последовательностями антител человека.- 11 047 726 directly, or can be administered in a manner that maintains the viability of the animal (e.g., in a tissue recombinant). Alternatively, existing monoclonal antibodies and any other equivalent antibodies that are immunospecific for a desired pathogenic epitope can be sequenced and produced using any recombinant techniques known in the art. In one embodiment of the present invention, a suitable antibody is sequenced and the polynucleotide sequence is then cloned into a vector for expression or propagation. The sequence encoding the antibody of interest can be maintained in the vector in a host cell, and the host cell can then be propagated and frozen for later use. The polynucleotide sequence of suitable antibodies can be used for genetic manipulation to obtain monospecific or polyspecific (e.g. bispecific, trispecific and tetraspecific) molecules according to the present invention, as well as an affinity-optimized antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody and/or an antibody containing fragments of canine antibodies in order to improve the affinity or other characteristics of the antibody. The general principle of humanization of an antibody includes maintaining the basic sequence of the antigen-binding portion of the antibody and replacing the remaining portion of the antibody from a non-human species with human antibody sequences.
Природные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух легких цепей, связанных с двумя тяжелыми цепями. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL) и константный домен (CL). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен (VH), три константных домена (CH1, CH2 и CH3) и шарнирный домен, расположенный между доменами СН1 и СН2. Основная структурная единица природных иммуноглобулинов (например, IgG), таким образом, представляет собой тетрамер, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессируемые в виде гликопротеина массой приблизительно 150000 Да. Амино-концевая (N-концевая) часть каждой цепи содержит вариабельный домен, содержащий от 100 до 110 или более аминокислот, в основном ответственных за распознавание антигена. Карбокси-концевая (С-концевая) часть каждой цепи определяет константную область, при этом легкие цепи содержат один константный домен, и тяжелые цепи обычно содержат три константных домена и шарнирный домен. Следовательно, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой nVL-CL-c, и структура тяжелых цепей IgG представляет собой n-VH-CH1-H-CH2-CH3-C (где Н представляет собой шарнирный домен, и n и с представляют, соответственно, N-конец и С-конец полипептида). Вариабельные домены молекулы IgG состоят из гипервариабельных участков (CDR), которые содержат остатки, вступающие в контакт с эпитопом, и сегменты, отличные от CDR, называемые каркасными сегментами (FR), которые в целом поддерживают структуру и определяют расположение петель CDR, чтобы обеспечить такой контакт (хотя некоторые остатки каркасных участков также могут связываться с антигеном). Соответственно, домены VL и VH имеют структуру n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3FR4-C. Полипептиды, которые представляют собой (или могут выполнять их функции) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела, обозначены, соответственно, как домен CDRL1, домен CDRL2 и домен CDRL3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут выполнять их функции) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, обозначены, соответственно, как домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3. Соответственно, термины домен CDRL1, домен CDRL2, домен CDRL3, домен CDRH1, домен CDRH2 и домен CDRH3 относятся к полипептидам, которые, когда они входят в состав белка, придают указанному белку способность связываться с определенным эпитопом независимо от того, является ли указанный белок антителом, содержащим легкие и тяжелые цепи, или диателом или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т.д.), или представляет собой другой тип белка. Соответственно, в настоящей заявке термин эпитопсвязывающий фрагмент означает фрагмент антитела, способный иммуноспецифично связываться с эпитопом, и термин эпитопсвязывающий сайт относится к той части молекулы, которая содержит эпитопсвязывающий фрагмент, который отвечает за связывание эпитопа. Эпитопсвязывающий сайт может содержать 1, 2, 3, 4, 5 или все 6 доменов CDR указанного антитела и, несмотря на то, что он способен иммуноспецифично связываться с указанным эпитопом, может проявлять иммуноспецифичность, аффинность или селективность в отношении эпитопа, который отличается от эпитопа указанного антитела. Предпочтительно, однако, эпитопсвязывающий фрагмент содержит все 6 доменов CDR указанного антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одну полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет амино-конец и карбокси-конец (например, диатело, фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2 и т.д.).Natural antibodies (such as IgG antibodies) consist of two light chains linked to two heavy chains. Each light chain contains a variable domain (VL) and a constant domain (CL). Each heavy chain contains a variable domain (VH), three constant domains (CH1, CH2, and CH3), and a hinge domain located between the CH1 and CH2 domains. The basic structural unit of natural immunoglobulins (e.g., IgG) is thus a tetramer containing two light chains and two heavy chains, usually expressed as a glycoprotein of approximately 150,000 Da. The amino-terminal (N-terminal) portion of each chain contains a variable domain of 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition. The carboxyl-terminal (C-terminal) portion of each chain defines the constant region, with light chains containing one constant domain and heavy chains typically containing three constant domains and a hinge domain. Therefore, the structure of the light chains of the IgG molecule is nVL-CL-c, and the structure of the heavy chains of IgG is n-VH-CH1-H-CH2-CH3-C (where H represents the hinge domain and n and c represent the N-terminus and C-terminus of the polypeptide, respectively). The variable domains of the IgG molecule are composed of hypervariable regions (CDRs), which contain the residues that make contact with the epitope, and segments other than the CDRs, called framework segments (FRs), which generally maintain the structure and determine the arrangement of the CDR loops to enable such contact (although some residues of the framework regions may also bind the antigen). Accordingly, the VL and VH domains have the structure n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3FR4-C. The polypeptides that are (or can perform the function of) the first, second, and third CDRs of the light chain of an antibody are designated, respectively, as the CDRL1 domain, the CDRL2 domain, and the CDRL3 domain. Similarly, the polypeptides that are (or can perform the function of) the first, second, and third CDRs of the heavy chain of an antibody are designated, respectively, as the CDRH1 domain, the CDRH2 domain, and the CDRH3 domain. Accordingly, the terms CDRL1 domain, CDRL2 domain, CDRL3 domain, CDRH1 domain, CDRH2 domain and CDRH3 domain refer to polypeptides that, when incorporated into a protein, confer on said protein the ability to bind to a particular epitope, regardless of whether said protein is an antibody comprising light and heavy chains, or a diabody or a single-chain binding molecule (e.g., scFv, BiTe, etc.), or is another type of protein. Accordingly, in the present application, the term epitope-binding fragment means a fragment of an antibody capable of immunospecifically binding to an epitope, and the term epitope-binding site refers to that portion of the molecule that contains the epitope-binding fragment that is responsible for binding the epitope. The epitope-binding site may comprise 1, 2, 3, 4, 5 or all 6 CDR domains of said antibody and, although capable of immunospecifically binding to said epitope, may exhibit immunospecificity, affinity or selectivity for an epitope that is different from the epitope of said antibody. Preferably, however, the epitope-binding fragment comprises all 6 CDR domains of said antibody. The epitope-binding fragment of an antibody may be a single polypeptide chain (e.g., scFv) or may comprise two or more polypeptide chains, each having an amino terminus and a carboxy terminus (e.g., diabody, Fab fragment, F(ab') 2 fragment, etc.).
Согласно настоящему изобретению в частности предложены одноцепочечные фрагменты вариабельных доменов (scFv) антител к PD-1 согласно настоящему изобретению и мультиспецифичные связывающие молекулы, содержащие их. Одноцепочечные фрагменты вариабельных доменов получают путем соединения вариабельных доменов легкой цепи и/или тяжелой цепи с использованием короткого соединяющего пептида. В работе Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) описан пример соединяющих пептидов, которые образуют связь длиной приблизительно 3,5 нм между карбокси-концом одного вариабельного домена и амино-концом другого вариабельного домена. Были разработаны и использованы линкеры, имеющие другие последовательности (Bird et al.The present invention provides, in particular, single-chain variable domain fragments (scFv) of the anti-PD-1 antibodies of the present invention and multispecific binding molecules comprising the same. The single-chain variable domain fragments are prepared by joining the variable domains of a light chain and/or a heavy chain using a short linking peptide. Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) describe an example of linking peptides that form a bond of approximately 3.5 nm in length between the carboxy terminus of one variable domain and the amino terminus of another variable domain. Linkers having other sequences have been designed and used (Bird et al.
- 12 047726 (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для придания им дополнительных функций, таких как прикрепление лекарственных препаратов или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты могут быть получены рекомбинантными или синтетическими способами. Для получения scFv с помощью синтетических способов может быть использован автоматизированный синтезатор. Для получения scFv с помощью рекомбинантных способов подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, который кодирует scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, например, эукариотическую клетку, такую как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, или прокариотическую клетку, такую как Е. coli. Полинуклеотиды, которые кодируют представляющие интерес scFv, могут быть получены с помощью стандартных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv может быть выделен с использованием стандартных способов очистки белка, известных в данной области техники.- 12 047726 (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). In turn, the linkers can be modified to impart additional functions, such as drug attachment or attachment to solid supports. Single-chain variants can be produced by recombinant or synthetic methods. To produce scFv by synthetic methods, an automated synthesizer can be used. To produce scFv by recombinant methods, a suitable plasmid containing a polynucleotide that encodes an scFv can be introduced into a suitable host cell, for example, a eukaryotic cell such as yeast, plant, insect or mammalian cells, or a prokaryotic cell such as E. coli. Polynucleotides that encode the scFv of interest can be obtained by standard manipulations such as polynucleotide ligation. The resulting scFv can be isolated using standard protein purification methods known in the art.
В область настоящего изобретения в частности также включены гуманизированные варианты антител к PD-1 согласно настоящему изобретению и полиспецифичные связывающие молекулы, содержащие их. Термин гуманизированное антитело относится к химерной молекуле, обычно полученной с использованием рекомбинантных методик, содержащей антигенсвязывающий сайт иммуноглобулина из видов, отличных от человека, и остальную иммуноглобулиновую структуру молекулы, которая основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Антитела к PD-1 человека согласно настоящему изобретению включают гуманизированные, химерные варианты и варианты, содержащие фрагменты антител собачьих, антител MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. Полинуклеотидная последовательность вариабельных доменов указанных антител может быть использована для генетической манипуляции, чтобы получить указанные производные и улучшить аффинность или другие характеристики указанных антител. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности антигенсвязывающей части антитела с заменой оставшейся части антитела из вида, отличного от человека, последовательностями антител человека. Существуют четыре общих этапа гуманизации моноклонального антитела. Указанные этапы включают: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности исходных вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антитела, (2) дизайн гуманизированного антитела или антитела, содержащего фрагменты антител собачьих, т.е. принимается решение о том, какой каркасный участок антитела будет использован во время процесса гуманизации или включения фрагментов антител собачьих, (3) фактические методологии/методики гуманизации или включения фрагментов антител собачьих, и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела. См., например, патенты США № 4816567; 5807715; 5866692 и 6331415.The present invention also specifically includes humanized variants of the PD-1 antibodies of the present invention and multispecific binding molecules comprising them. The term humanized antibody refers to a chimeric molecule, typically produced using recombinant techniques, comprising an antigen-binding site of an immunoglobulin from a non-human species and the remainder of the immunoglobulin structure of the molecule, which is based on the structure and/or sequence of a human immunoglobulin. The human PD-1 antibodies of the present invention include humanized, chimeric variants and variants comprising fragments of canine antibodies, antibodies MAT to PD-1 1, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1. The polynucleotide sequence of the variable domains of said antibodies can be used for genetic manipulation to obtain said derivatives and improve the affinity or other characteristics of said antibodies. The general principle of humanization of an antibody involves maintaining the core sequence of the antigen-binding portion of the antibody while replacing the remainder of the antibody from a non-human species with human antibody sequences. There are four general steps in humanizing a monoclonal antibody. These steps include: (1) determining the nucleotide and predicted amino acid sequence of the original light and heavy chain variable domains of the antibody, (2) designing the humanized or canine-derived antibody, i.e., deciding which framework region of the antibody will be used during the humanization or canine-derived antibody incorporation process, (3) the actual humanization or canine-derived antibody incorporation methodologies/techniques, and (4) transfection and expression of the humanized antibody. See, e.g., U.S. Pat. Nos. 4,816,567; 5,807,715; and 6,331,415.
Антигенсвязывающий сайт может содержать полный вариабельный домен, гибридизованный с константным доменом, или только гипервариабельные участки (CDR) указанного вариабельного домена, привитые на соответствующие каркасные участки. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или могут быть модифицированы одной или более заменами аминокислот. Это исключает константную область в качестве иммуногена у человека, однако сохраняется возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный домен (LoBuglio, A.F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Другой подход сосредоточен не только на обеспечении константных областей человеческого происхождения, но и на модификации вариабельных доменов, чтобы как можно более точно изменить их на человеческую форму. Известно, что вариабельные домены тяжелых и легких цепей содержат три гипервариабельных участка (CDR), которые изменяются в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют способность к связыванию, фланкированных четырьмя каркасными участками (FR), которые являются относительно консервативными у данного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении антител из вида, отличного от человека, по отношению к определенному антигену, вариабельные домены могут быть преобразованы или гуманизированы путем прививки CDR, полученных из антител из видов, отличных от человека, на FR, присутствующие в антителе человека, подлежащем модификации. Применение упомянутого подхода к различным антителам было описано вThe antigen-binding site may comprise the entire variable domain fused to the constant domain, or only the complementarity determining regions (CDRs) of the variable domain grafted onto the appropriate framework regions. The antigen-binding sites may be wild-type or may be modified by one or more amino acid substitutions. This eliminates the constant region as an immunogen in humans, but retains the possibility of an immune response to the foreign variable domain (LoBuglio, A. F. et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Another approach focuses not only on providing constant regions of human origin, but also on modifying the variable domains to change them as closely as possible to the human form. The variable domains of the heavy and light chains are known to contain three complementarity determining regions (CDRs), which vary depending on the antigens in question and determine the binding ability, flanked by four framework regions (FRs), which are relatively conserved in a given species and which are thought to provide a framework for the CDRs. When producing antibodies from a non-human species against a given antigen, the variable domains can be reshaped or humanized by grafting CDRs derived from antibodies from non-human species onto FRs present in the human antibody to be modified. The application of this approach to various antibodies has been described in
- 13 047726- 13 047726
Sato, К. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies for Therapy», Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity», Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) «Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDRGrafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation», Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) «Construction Of Reshaped Human Antibodies With HTV-Neutralizing Activity», Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) «Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:41814185; Tempest, P.R. et al. (1991) «Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo», Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) «HumanizedAntibodies For Antiviral Therapy», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:28692873; Carter, P. et al. (1992) «Humanization Of An Anti-pl 8 5her 2 Antibody For Human Cancer Therapy», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) «Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen», J. Immunol. 148:11491154.Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851–856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323–327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534–1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDRGrafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation", Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HTV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124–134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:41814185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in Vivo,” Bio/Technology 9:266–271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:28692873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-pl 8 5her 2 Antibody For Human Cancer Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co., M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen", J. Immunol. 148:11491154.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела содержат один или более CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), последовательности которых отличаются в сравнении с исходным антителом. Был описан ряд молекул гуманизированных антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, полученный из иммуноглобулина из вида, отличного от человека, включая химерные антитела, содержащие вариабельный домен грызуна или модифицированный вариабельный домен грызуна, и связанные с ними гипервариабельные участки (CDR), гибридизованные с константными доменами человека (см., например, Winter et al. (1991) Man-made Antibodies, Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol. 138:4534-4538, и Brown et al. (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res. 47:3577-3583). В других ссылках описаны CDR грызунов, привитые в поддерживающий каркасный участок человека (FR), перед гибридизацией с соответствующими константными доменами человека (см., например, Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; и Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321:522-525). В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые каркасными участками грызунов после рекомбинации поверхностных остатков. См., например, публикацию европейского патента № 519596. Указанные гуманизированные молекулы предназначены для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов к белкам человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтического применения указанных фрагментов у реципиентовлюдей. Другие способы гуманизации антител, которые также могут быть использованы, раскрыты в Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, и в патентах США № 6180377; 6054297; 5997867 и 5866692.In some embodiments of the present invention, humanized antibodies retain all CDR sequences (e.g., a humanized murine antibody that contains all six CDRs from murine antibodies). In other embodiments of the present invention, humanized antibodies contain one or more CDRs (one, two, three, four, five, or six) whose sequences differ from those of the parent antibody. A number of humanized antibody molecules containing an antigen-binding site derived from an immunoglobulin from a non-human species have been described, including chimeric antibodies containing a rodent or modified rodent variable domain and their associated complementarity determining regions (CDRs) fused to human constant domains (see, e.g., Winter et al. (1991) Man-made Antibodies, Nature 349:293–299; Lobuglio et al. (1989) Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220–4224 (1989), Shaw et al. (1987) Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen, J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody, Cancer Res. 47:3577-3583). Other references describe rodent CDRs grafted into a human scaffold framework (FR) region prior to hybridization with the corresponding human constant domains (see, e.g., Riechmann, L. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies for Therapy, Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity, Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse, Nature 321:522-525). Another reference describes rodent CDRs supported by rodent framework regions after recombination of surface residues. See, for example, European Patent Publication No. 519,596. These humanized molecules are intended to minimize the undesirable immunological response to rodent anti-human antibody molecules, which limits the duration and effectiveness of therapeutic use of these fragments in human recipients. Other methods of humanizing antibodies that may also be used are disclosed in Daugherty et al. (1991) Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins, Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, and in U.S. Patents 6,180,377; 6,054,297; and 5,866,692.
II. Рецепторы Fcy (FcyR).II. Fcy receptors (FcyR).
Домены СН2 и CH3 двух тяжелых цепей взаимодействуют с образованием области Fc, которая представляет собой домен, распознаваемый клеточными рецепторами Fc, включая, но не ограничиваясь ими, рецепторы Fc-гамма (FcyR). В настоящем изобретении термин область Fc используется для определения С-концевой области тяжелой цепи IgG. Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ примерного IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 1):The CH2 and CH3 domains of the two heavy chains interact to form an Fc region, which is a domain recognized by cellular Fc receptors, including, but not limited to, Fc-gamma receptors (FcyRs). In the present invention, the term Fc region is used to define the C-terminal region of the IgG heavy chain. The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG1 is the sequence shown below (SEQ ID NO: 1):
- 14 047726- 14 047726
231 240 250 260 270 280231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEWESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNHYTQKS LSLSPGX numbered using the EU index as described in Kabat, where X is lysine (K) or absent.
Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ примерного IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 2):The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG2 is as follows (SEQ ID NO: 2):
231 240 250 260 270 280231 240 250 260 270 280
440 447440 447
ALHNHYTQKS LSLSPGX пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNHYTQKS LSLSPGX numbered using the EU index as described in Kabat, where X is lysine (K) or absent.
Аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ примерного IgG3 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 3):The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG3 is as follows (SEQ ID NO: 3):
231 240 250 260 270 280231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFKWYVDAPELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTF RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHEWESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFCSVMHE
440 447440 447
ALHNRFTQKS LSLSPGX пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNRFTQKS LSLSPGX numbered using the EU index as described in Kabat, where X is lysine (K) or absent.
Аминокислотная последовательность домена CH2-CH3 примерного IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 4):The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG4 is as follows (SEQ ID NO: 4):
- 15 047726- 15 047726
231 240 250 260 270 280231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDTAPEFLGGPSV FLFPPKPKDT
LMISRTPEVT CVWDVSQEDLMISRTPEVT CVWDVSQED
PEVQFNWYVDPEVQFNWYVD
290 300 310 320 330290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTYGVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RWSVLTVLH QDWLNGKEYKRWSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKGLPSCKVSNKGLPS
340 350 360 370 380340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYTSIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVKLPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEGFYPSDIAVE
390 400 410 420 430390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDSWESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEGDGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHENVFSCSVMHE
440 447440 447
ALHNHYTQKS LSLSLGX пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNHYTQKS LSLSLGX numbered using the EU index as described in Kabat, where X is lysine (K) or absent.
В настоящем описании нумерация остатков в константной области тяжелой цепи IgG соответствует индексу ЕС, как изложено в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (Кабат), полностью включенной в настоящее изобретение посредством ссылки. Термин индекс ЕС, как изложено в работе Кабат относится к нумерации в соответствии с системой ЕС антитела IgG1 человека. Аминокислоты из вариабельных доменов зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначены в соответствии с положением аминокислоты в цепи. В работе Kabat et al. описаны многочисленные аминокислотные последовательности для антител, идентифицирована аминокислотная консенсусная последовательность для каждой подгруппы и каждой аминокислоте присвоен номер остатка, и CDR идентифицированы, как определено в работе Kabat et al. (следует понимать, что CDRH1, определенный в работе Chothia, С. & Lesk, A. M. ((1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917), начинается на пять остатков ранее). Схема нумерации Кабат может быть расширена на антитела, не включенные в его сборник, путем сопоставления рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в Кабат по отношению к консервативным аминокислотам. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области техники и позволяет легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях в разных антителах, включая химерные или гуманизированные варианты. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи антитела человека занимает положение, эквивалентное таковому для аминокислоты в положении 50 легкой цепи мышиного антитела.As used herein, the numbering of residues in the constant region of the IgG heavy chain corresponds to the EU index as set forth in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (Kabat), incorporated herein by reference in its entirety. The term EU index as set forth in Kabat refers to the numbering according to the EU system of the human IgG1 antibody. Amino acids from the variable domains of mature heavy and light chains of immunoglobulins are designated according to the position of the amino acid in the chain. Kabat et al. describe numerous amino acid sequences for antibodies, identify an amino acid consensus sequence for each subgroup, and assign a residue number to each amino acid and identify the CDRs as defined in Kabat et al. (It should be understood that CDRH1 defined in Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins, J. Mol. Biol. 196:901-917) begins five residues earlier.) The Kabat numbering scheme can be extended to antibodies not included in its compendium by matching the antibody in question to one of the consensus sequences in Kabat with respect to conserved amino acids. This method of assigning residue numbers has become standard in the art and allows for the ready identification of amino acids at equivalent positions in different antibodies, including chimeric or humanized variants. For example, the amino acid at position 50 of the light chain of a human antibody occupies a position equivalent to that of the amino acid at position 50 of the light chain of a mouse antibody.
Полиморфизмы наблюдали в ряде различных положений в константных областях антитела (например, в положениях СН1, включая, но не ограничиваясь ими, положения 192, 193 и 214, в положениях Fc, включая, но не ограничиваясь ими, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358, в соответствии с системой нумерации ЕС, изложенной в Кабат), и, соответственно, могут существовать небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из предшествующего уровня техники. Хорошо известны полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В настоящее время известно 18 GM-аллотипов: G1m (1, 2, 3, 17) или G1m (a, x, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. Pergamon, Oxford, p. 4378 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Согласно настоящему изобретению конкретно предусмотрено, что антитела согласно настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, обеспеченных в настоящем документе. Помимо этого в некоторых системах экспрессии С-концевой остаток аминокислоты (выделенный жирным шрифтом) домена CH3 может быть удален после трансляции. Соответственно, С-концевой остаток домена CH3 представляет собой необязательный остаток аминокислоты в PD-1-связывающих молекулах согласно настоящему изобретению. В область настоящего изобретения конкретно включены PD-1-связывающие молекулы, лишенные С-концевого остатка домена CH3. В область настоящего изобретения также конкретно включены конструкции, содержащие С-концевой остаток лизина домена CH3.Polymorphisms have been observed at a number of different positions in the constant regions of the antibody (e.g., at CH1 positions including but not limited to positions 192, 193 and 214, at Fc positions including but not limited to positions 270, 272, 312, 315, 356 and 358, according to the EU numbering system set out in Kabat), and accordingly, there may be minor differences between the presented sequence and sequences known in the prior art. Polymorphic forms of human immunoglobulins are well known. Currently, 18 GM allotypes are known: G1m (1, 2, 3, 17) or G1m (a, x, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) or G3m (b1, c3, , b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation. Pergamon, Oxford, p. 4378 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). The present invention specifically contemplates that the antibodies of the present invention may comprise any allotype, isoallotype, or haplotype of any immunoglobulin gene, and are not limited to the allotype, isoallotype, or haplotype of the sequences provided herein. In addition, in some expression systems, the C-terminal amino acid residue (shown in bold) of the CH3 domain may be removed after translation. Accordingly, the C-terminal residue of the CH3 domain is an optional amino acid residue in the PD-1 binding molecules of the present invention. Specifically included within the scope of the present invention are PD-1 binding molecules lacking the C-terminal residue of the CH3 domain. Specifically included within the scope of the present invention are constructs comprising the C-terminal lysine residue of the CH3 domain.
Активирующие и ингибирующие сигналы передаются посредством лигирования области Fc с клеточным рецептором Fc-гамма (FcyR). Способность указанного лигирования осуществлять диаметрально противоположные функции обусловлена структурными различиями между различными FcyR. Два различных домена в цитоплазматических сигнальных доменах рецептора, называемых иммунорецепторными тирозиновыми активирующими мотивами (ITAM) и иммунорецепторными тирозиновыми ингибирующими мотивами (ITIM), являются причиной различных ответов. Привлечение различных цитоплазматических ферментов к этим структурам обуславливает результат опосредуемых FcyR клеточных отвеActivating and inhibitory signals are transmitted through ligation of the Fc region to the cellular Fc-gamma receptor (FcyR). The ability of this ligation to perform diametrically opposed functions is due to structural differences between the different FcyRs. Two distinct domains within the cytoplasmic signaling domains of the receptor, called immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs), are responsible for the distinct responses. Recruitment of different cytoplasmic enzymes to these structures determines the outcome of FcyR-mediated cellular responses.
- 16 047726 тов. ITAM-содержащие комплексы FcyR включают FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, тогда как ITIMсодержащие комплексы включают только FcyRIIB. Нейтрофилы человека экспрессируют ген FcyRIIA. Кластеризация FcyRIIA посредством иммунных комплексов или специфичной сшивки антител служит для агрегации ITAM вместе с рецептор-ассоциированными киназами, которые способствуют фосфорилированию ITAM. Фосфорилирование ITAM служит местом стыковки для Syk-киназы, активация которой приводит к активации последующих субстратов (например, PI3K). Клеточная активация приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов. Ген FcyRIIB экспрессируется в В-лимфоцитах; внеклеточный домен FcyRIIB на 96% идентичен FcyRIIA и связывается с комплексами IgG аналогичным образом. Присутствие ITIM в цитоплазматическом домене FcyRIIB определяет данный ингибирующий подкласс FcyR. Недавно была установлена молекулярная основа такого ингибирования. При совместном лигировании с активирующим FcyR ITIM в FcyRIIB становится фосфорилированным и притягивает домен SH2 инозитолполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), который гидролизует фосфоинозитные мессинджеры, которые высвобождаются в результате активации тирозинкиназы, опосредуемой ITAM-содержащим FcyR, что впоследствии ведет к предотвращению притока внутриклеточного Са2+. Соответственно, сшивка FcyRIIB ослабляет активирующий ответ на лигирование FcyR и ингибирует клеточную восприимчивость. Как следствие, предотвращается активация В-клеток, пролиферация В-клеток и секреция антител.- 16 047726 items. ITAM-containing FcyR complexes include FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, whereas ITIM-containing complexes include only FcyRIIB. Human neutrophils express the FcyRIIA gene. Clustering of FcyRIIA by immune complexes or specific cross-linking of antibodies serves to aggregate ITAMs together with receptor-associated kinases, which promote ITAM phosphorylation. ITAM phosphorylation serves as a docking site for Syk kinase, whose activation leads to activation of subsequent substrates (e.g., PI3K). Cellular activation leads to the release of proinflammatory mediators. The FcyRIIB gene is expressed in B lymphocytes; the extracellular domain of FcyRIIB is 96% identical to FcyRIIA and binds to IgG complexes in a similar manner. The presence of ITIM in the cytoplasmic domain of FcyRIIB defines this inhibitory subclass of FcyR. The molecular basis for this inhibition has recently been elucidated. When co-ligated with the activating FcyR, the ITIM of FcyRIIB becomes phosphorylated and recruits the SH2 domain of inositol polyphosphate 5'-phosphatase (SHIP), which hydrolyzes phosphoinositol messengers that are released upon tyrosine kinase activation mediated by ITAM-containing FcyR, subsequently leading to the prevention of intracellular Ca 2+ influx. Accordingly, cross-linking of FcyRIIB attenuates the activating response to FcyR ligation and inhibits cellular susceptibility. As a consequence, B-cell activation, B-cell proliferation, and antibody secretion are prevented.
III. Биспецифические антитела, полиспецифичные диатела и диатела DART™.III. Bispecific antibodies, polyspecific diabodies and DART™ diabodies.
Способность антитела связываться с эпитопом антигена зависит от присутствия и аминокислотной последовательности доменов VL и VH антитела. Взаимодействие легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, и, в частности, взаимодействие их доменов VL и VH образует один из двух сайтов связывания эпитопов природного антитела. Природные антитела способны связываться только с одним видом эпитопов (т.е. они моноспецифичны), несмотря на то, что они могут связываться с несколькими копиями указанного вида эпитопа (т.е. проявляют бивалентность или поливалентность). Связывающие домены согласно настоящему изобретению связываются с эпитопами иммуноспецифичным образом. В настоящем изобретении антитело, диатело или другая связывающая эпитоп молекула, как полагают, иммуноспецифично связывается с областью другой молекулы (т.е. эпитопом), если она реагирует или связывается чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с данным эпитопом по сравнению с другими эпитопами. Например, антитело, которое иммуноспецифично связывается с вирусным эпитопом, представляет собой антитело, которое связывается с данным вирусным эпитопом с большей аффинностью, авидностью, более легко и/или с большей продолжительностью, по сравнению с его иммуноспецифичным связыванием с другими вирусными эпитопами или невирусными эпитопами. Также следует понимать, прочитав это определение, что, например, антитело (или фрагмент или эпитоп), которое иммуноспецифично связывается с первой мишенью, может, но необязательно, специфично или предпочтительно связываться со второй мишенью. Соответственно, иммунноспецифичное связывание необязательно требует (хотя и может включать его) исключительного связывания. Как правило, но необязательно, ссылка на связывание означает специфичное связывание. Считается, что две молекулы способны связываться друг с другом физиоспецифичным образом, если такое связывание проявляет специфичность, с которой рецепторы связываются со своими соответствующими лигандами.The ability of an antibody to bind to an epitope of an antigen depends on the presence and amino acid sequence of the VL and VH domains of the antibody. The interaction of the antibody light chain and the antibody heavy chain, and in particular the interaction of their VL and VH domains, forms one of the two epitope binding sites of a natural antibody. Natural antibodies are capable of binding to only one type of epitope (i.e., they are monospecific), although they can bind to multiple copies of a given type of epitope (i.e., they exhibit bivalentity or polyvalency). The binding domains of the present invention bind to epitopes in an immunospecific manner. In the present invention, an antibody, diabody or other epitope-binding molecule is said to immunospecifically bind to a region of another molecule (i.e., an epitope) if it reacts or binds more frequently, more rapidly, with a longer duration and/or with a higher affinity to a given epitope compared to other epitopes. For example, an antibody that immunospecifically binds to a viral epitope is an antibody that binds to that viral epitope with greater affinity, avidity, more readily, and/or for a longer duration than it immunospecifically binds to other viral epitopes or non-viral epitopes. It should also be understood from reading this definition that, for example, an antibody (or fragment or epitope) that immunospecifically binds to a first target may, but need not, bind specifically or preferentially to a second target. Accordingly, immunospecific binding does not necessarily require (although it may include) exclusive binding. Typically, but not necessarily, reference to binding means specific binding. Two molecules are said to be capable of binding to each other in a physiospecific manner if such binding exhibits the specificity with which receptors bind to their respective ligands.
Функциональность антител может быть повышена путем получения полиспецифичных молекул на основе антител, которые могут одновременно связываться с двумя отдельными и разными антигенами (или различными эпитопами одного и того же антигена) и/или путем получения молекулы на основе антитела, имеющего более высокую валентность (т.е. более двух сайтов связывания) в отношении одного и того же эпитопа и/или антигена.The functionality of antibodies can be enhanced by producing polyspecific antibody-based molecules that can simultaneously bind to two separate and different antigens (or different epitopes of the same antigen) and/or by producing an antibody-based molecule that has a higher valency (i.e., more than two binding sites) for the same epitope and/or antigen.
Для того чтобы обеспечить молекулы, обладающие большими функциональными возможностями, чем природные антитела, был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифических антител (см., например, PCT публикации WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), в большинстве из которых используют линкерные пептиды, чтобы гибридизовать дополнительный эпитопсвязывающий фрагмент (например, scFv, VL, VH и т.д.) с или в пределах центральной части антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) или гибридизовать несколько фрагментов, связывающих эпитоп (например, два фрагмента Fab или scFv). В альтернативных форматах используют линкерные пептиды для гибридизации фрагмента, связывающего эпитоп (например, scFv, VL, VH и т.д.), с доменом димеризации, таким как домен СН2-СНЗ, или альтернативными полипептидами (WO 2005/070966, WO 2006/107786А WO 2006/107617А, WO 2007/046893). Как правило, упомянутые подходы включают компромиссные варианты и приемлемые варианты. Например, в PCT публикациях WO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172 раскрыто, что использование линкеров может вызвать проблемы в терапевтических условиях, и описано триспецифичное антитело, в котором домены CL и СН1 передвинуты с их соответствующих природных положений, а также домены VL и VH были диверсифицированы (WO 2008/027236, WO 2010/108127), чтобы придать им способность связываться более чем с одним антигеном. Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, специфичность связывания изменена в пользу способности связываться с дополнительными видами антигенов. В PCT публикациях WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрыты модификаIn order to provide molecules with greater functionality than natural antibodies, a wide range of recombinant bispecific antibody formats have been developed (see, e.g., PCT Publications WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), most of which use linker peptides to fusion an additional epitope-binding moiety (e.g., scFv, VL, VH, etc.) to or within the core portion of the antibody (IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM) or to fusion multiple epitope-binding moieties (e.g., two Fab or scFv moieties). Alternative formats use linker peptides to hybridize an epitope binding moiety (e.g. scFv, VL, VH, etc.) to a dimerization domain such as a CH2-CH3 domain or alternative polypeptides (WO 2005/070966, WO 2006/107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Typically, these approaches include compromise options and acceptable options. For example, PCT publications WO 2013/174873, WO 2011/133886 and WO 2010/136172 disclose that the use of linkers may cause problems in a therapeutic setting and describe a trispecific antibody in which the CL and CH1 domains have been moved from their respective natural positions and the VL and VH domains have been diversified (WO 2008/027236, WO 2010/108127) to confer the ability to bind to more than one antigen. Accordingly, in the molecules disclosed in these documents, the binding specificity is altered in favor of the ability to bind to additional types of antigens. PCT publications WO 2013/163427 and WO 2013/119903 disclose a modification
- 17 047726 ции домена СН2 для включения аддукта гибридного белка, содержащего связывающий домен. В документе отмечено, что домен СН2, вероятно, играет лишь минимальную роль в качестве посредника эффекторной функции. В PCT публикациях WO 2010/028797, WO2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, области Fc которых были заменены дополнительными доменами VL и VH так, чтобы получить трехвалентные связывающие молекулы. В PCT публикациях WO 2003/025018 и WO2003012069 раскрыты рекомбинантные диатела, отдельные цепи которых содержат домены scFv. В PCT публикации WO 2013/006544 раскрыты поливалентные молекулы Fab, которые синтезируют как одну полипептидную цепь и затем подвергают протеолизу с образованием гетеродимерных структур. Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, все или некоторые функциональные возможности выступать посредниками эффекторной функции изменены в пользу способности связываться с дополнительными видами антигенов. В PCT публикациях WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрыты способы добавления дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление диатела к легкой цепи антитела или добавление дополнительных доменов VL и VH к легким и тяжелым цепям антитела, или добавление гетерологичного гибридного белка, или связывание нескольких доменов Fab друг с другом). Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, нативная структура антител изменена в пользу способности связываться с дополнительными видами антигенов.- 17 047726 of the CH2 domain to comprise a hybrid protein adduct containing the binding domain. The document notes that the CH2 domain likely plays only a minimal role as a mediator of effector function. PCT publications WO 2010/028797, WO2010028796 and WO 2010/028795 disclose recombinant antibodies whose Fc regions have been replaced with additional VL and VH domains so as to yield trivalent binding molecules. PCT publications WO 2003/025018 and WO2003012069 disclose recombinant diabodies whose individual chains contain scFv domains. PCT Publication WO 2013/006544 discloses polyvalent Fab molecules that are synthesized as a single polypeptide chain and then subjected to proteolysis to form heterodimeric structures. Accordingly, in the molecules disclosed in these documents, all or some of the functional capabilities to act as mediators of effector function are altered in favor of the ability to bind to additional types of antigens. PCT publications WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 and WO 1991/003493 disclose methods for adding additional binding domains or functional groups to an antibody or antibody portion (e.g., adding a diabody to the light chain of an antibody, or adding additional VL and VH domains to the light and heavy chains of an antibody, or adding a heterologous fusion protein, or linking multiple Fab domains to each other). Accordingly, in the molecules disclosed in the said documents, the native structure of the antibodies is modified in favor of the ability to bind to additional types of antigens.
В данной области техники также упомянута возможность получения диател, которые отличаются от указанных природных антител своей способностью связываться с двумя или более различными видами эпитопов (т.е. проявляют биспецифичность или полиспецифичность в дополнение к бивалентной или поливалентной форме) (см., например,The art also mentions the possibility of producing diabodies that differ from said natural antibodies in their ability to bind to two or more different types of epitopes (i.e. exhibit bispecificity or polyspecificity in addition to the bivalent or polyvalent form) (see, for example,
Holliger et al. (1993) «’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific AntibodyHolliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody
Fragments», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et allyFragments", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.
US 2004/0220388/WO 02/02781 (Mertens et alfi Alt et aL (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) «Л Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity», J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et a/.y Olafsen, T. et al. (2004) «Covalent Di sulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications», Protein Eng. Des. Sei.US 2004/0220388/WO 02/02781 (Mertens et al. Alt et aL (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "L Fully Human Recombinant IgG- Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al. Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Di sulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation and Radiolabeling for Tumor Targeting Applications", Protein Sei.
17(l):21-27; Wu, A. et al. (2001) «Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain FvFv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange», Protein Engineering17(l):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain FvFv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange", Protein Engineering
14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) «Л Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain», Abstract 3P-683, J. Biochem.14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "L Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain", Abstract 3P-683, J. Biochem.
76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) «Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System», Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) «Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy», Cancer Res. 69(12):4941-4944).76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941–4944).
Дизайн диател основан на получении производного антитела, известного как одноцепочечный фрагмент вариабельных доменов (scFv). Подходящие молекулы получают путем связывания вариабельных доменов легкой цепи и/или тяжелой цепи с использованием короткого соединяющего пептида. В работе Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) описан пример соединяющих пептидов, которые образуют мостик длиной приблизительно 3,5 нм между карбокси-концом одного вариабельного домена и амино-концом другого вариабельного домена. Были разработаны и использованы линкеры, имеющие другие последовательности (Bird et al. (1988) Single-Chain AntigenBinding Proteins, Science 242:423-426). В свою очередь, линкеры могут быть модифицированы для придания им дополнительных функций, таких как прикрепление лекарственных препаратов или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты могут быть получены рекомбинантными или синтетическими способами. Для получения scFv синтетическим способом может быть использован автоматизированный синтезатор. Для получения scFv рекомбинантными способами подходящая плазмида, содержащая полинуклеотид, который кодирует scFv, может быть введена в подходящую клетку-хозяина, например, эукариотическую клетку, например, клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, или прокариотическую клетку, такую как клетка Е. coli. Полинуклеотиды, которые кодируют представляющие интерес scFv, могут быть получены с помощью стандартных манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv может быть выделен с использованием стандартных способов очистки белка, известных в данной области техники. Обеспечение немоноспецифичных диател представляет значительное преимущество по сравнению с антителами, включая, но не ограничиваясь ими,The design of diabodies is based on the production of an antibody derivative known as a single-chain variable fragment (scFv). Suitable molecules are prepared by linking the variable domains of the light chain and/or heavy chain using a short linking peptide. Bird et al. (1988) (Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426) describe an example of linking peptides that form a bridge of approximately 3.5 nm in length between the carboxy terminus of one variable domain and the amino terminus of the other variable domain. Linkers having other sequences have been designed and used (Bird et al. (1988) Single-Chain Antigen-Binding Proteins, Science 242:423-426). In turn, the linkers can be modified to impart additional functions, such as drug attachment or attachment to solid supports. Single-chain variants can be produced by recombinant or synthetic methods. An automated synthesizer can be used to produce scFv by synthetic methods. To produce scFv by recombinant methods, a suitable plasmid containing a polynucleotide that encodes an scFv can be introduced into a suitable host cell, for example, a eukaryotic cell, such as yeast, plant, insect or mammalian cells, or a prokaryotic cell, such as an E. coli cell. Polynucleotides that encode the scFv of interest can be obtained by standard manipulations, such as ligation of polynucleotides. The resulting scFv can be isolated using standard protein purification methods known in the art. The provision of non-monospecific diabodies represents a significant advantage over antibodies, including, but not limited to,
- 18 047726 способность колигировать и колокализовать клетки, которые экспрессируют различные эпитопы. Соответственно, биспецифические диатела имеют широкое применение, включая терапию и иммунодиагностику. Биспецифичность обеспечивает большую гибкость в разработке и модификации диател для различных вариантов применения, обеспечивая повышенную авидность в отношении мультимерных антигенов, сшивание различных антигенов и направленное нацеливание на конкретные типы клеток, которое основано на присутствии обоих антигенов-мишеней. Вследствие своей повышенной валентности, низких скоростей диссоциации и быстрого клиренса из системы кровообращения (для диател небольшого размера около или менее ~50 кДа), молекулы диател, известные в данной области техники, также нашли особое применение в области визуализации опухолей (Fitzgerald et al. (1997) Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, Protein Eng. 10:1221). Биспецифичность диател легла в основу их применения для колигирования различных клеток, например, сшивки цитотоксических Т-клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, Nature 314:628-631, и Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). В другом варианте, или дополнительно, биспецифические диатела могут быть использованы для колигирования рецепторов на поверхности различных клеток или на одной клетке. Колигирование различных клеток и/или рецепторов можно применять для модуляции эффекторных функций и/или передачи сигналов с участием иммунных клеток. Полиспецифичные молекулы (например, биспецифические диатела), содержащие сайты связывания эпитопов, могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной клетки, такую как В7-Н3 (CD276), В7-Н4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (В7-1), CD86 (В7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1ВВ), CD137L (41BBL), CD226, CTLA-4 (CD152), галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), рецептор активации клеток-киллеров (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258), ГКГС класса I или II, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PDL2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2), и/или VISTA (PD-1H), которые экспрессируются на Т-лимфоцитах, природных клетках-клетках (NK), антигенпрезентирующих клетках или других мононуклеарных клетках. В частности, сайты связывания эпитопов, направленные на рецептор клеточной поверхности (или его лиганд), который участвует в регулировании контрольной точки иммунного ответа, можно применять для получения биспецифических или полиспецифичных связывающих молекул, которые выступают антагонистами или блокируют ингибирующую передачу сигналов молекулами контрольной точки иммунного ответа и тем самым стимулируют, активируют или усиливают иммунные ответы у субъекта. Молекулы, участвующие в регулировании иммунных контрольных точек, включают, но не ограничиваются ими, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектин-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, ГКГС класса I или II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 и/или VISTA.- 18 047726 the ability to ligate and colocalize cells that express different epitopes. Accordingly, bispecific diabodies have a wide range of applications, including therapy and immunodiagnostics. Bispecificity provides greater flexibility in designing and modifying diabodies for a variety of applications by providing increased avidity for multimeric antigens, cross-linking of different antigens, and targeted targeting to specific cell types based on the presence of both target antigens. Due to their increased valency, low off-rates, and rapid clearance from the circulation (for small diabodies of about or less than ~50 kDa), diabody molecules known in the art have also found particular application in the field of tumor imaging (Fitzgerald et al. (1997) Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris, Protein Eng. 10:1221). The bispecificity of diabodies has led to their use for the coligation of various cells, for example, the cross-linking of cytotoxic T cells to tumor cells (Staerz et al. (1985) Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). Alternatively, or additionally, bispecific diabodies can be used to coligate receptors on the surface of different cells or on the same cell. Co-ligation of different cells and/or receptors can be used to modulate effector functions and/or signaling involving immune cells. Polyspecific molecules (e.g. bispecific diabodies) containing epitope binding sites can be directed to the surface determinant of any immune cell, such as B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), BTLA (CD272), CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70 (CD27L), CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), CD94 (KLRD1), CD137 (4-1BB), CD137L (41BBL), CD226, CTLA-4 (CD152), galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS (CD278), ICOSL (CD275), killer cell activation receptor (KIR), LAG-3 (CD223), LIGHT (TNFSF14, CD258), MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40 (CD134), OX40L (CD134L), PD1H, PD-1 (CD279), PD-L1 (B7-H1, CD274), PDL2 (B7-CD, CD273), PVR (NECL5, CD155), SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 (HAVCR2), and/or VISTA (PD-1H), which are expressed on T lymphocytes, natural killer (NK) cells, antigen-presenting cells, or other mononuclear cells. In particular, epitope binding sites directed to a cell surface receptor (or its ligand) that is involved in regulating an immune checkpoint response can be used to generate bispecific or polyspecific binding molecules that antagonize or block inhibitory signaling by immune checkpoint molecules and thereby stimulate, activate, or enhance immune responses in a subject. Molecules involved in regulating immune checkpoints include, but are not limited to, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD40L, CD47, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3, and/or VISTA.
Однако вышеупомянутые преимущества сопряжены со значительными затратами. Для образования указанных немоноспецифичных диател необходима успешная сборка двух или более отдельных и различных полипептидов (т.е. указанный процесс образования требует, чтобы диатела были образованы путем гетеродимеризации различных типов полипептидных цепей). Этот факт отличается от ситуации с моноспецифичными диателами, которые образуются путем гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку по меньшей мере два различных полипептида (т.е. две полипептидные молекулы) должны быть обеспечены для образования немоноспецифичного диатела и поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к получению неактивных молекул (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583588), получение указанных полипептидов должно быть выполнено так, чтобы предотвратить ковалентное связывание между полипептидами одного и того же типа (т.е. чтобы предотвратить гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588). В этой связи в данной области техники было предложено нековалентное соединение таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).However, the above advantages are associated with significant costs. The formation of these non-monospecific diabodies requires the successful assembly of two or more separate and distinct polypeptides (i.e., this formation process requires that the diabodies be formed by heterodimerization of different types of polypeptide chains). This is in contrast to the situation with monospecific diabodies, which are formed by homodimerization of identical polypeptide chains. Since at least two different polypeptides (i.e., two polypeptide molecules) must be provided to form a non-monospecific diabody and since homodimerization of such polypeptides results in inactive molecules (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588), the production of said polypeptides must be carried out in a way that prevents covalent association between polypeptides of the same type (i.e., to prevent homodimerization) (Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588). In this regard, non-covalent linking of such polypeptides has been proposed in the art (see, for example, Olafsen et al. (2004) Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications, Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain, Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
Однако в данной области техники установлено, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируют на нефункциональные мономеры (см., например, Lu, D. et al. (2005) А Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For EnHowever, it has been established in the art that bispecific diabodies consisting of non-covalently linked polypeptides are unstable and easily dissociate into non-functional monomers (see, for example, Lu, D. et al. (2005) A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For En
- 19 047726 hanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).- 19 047726 hanced Antitumor Activity, J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
В свете этой проблемы в данной области техники удалось разработать стабильные, ковалентно связанные гетеродимерные немоноспецифичные диатела, названные диатела DART™ (Dual Affinity ReTargeting Reagents (перенаправляющие реагенты с двойной аффинностью)); см., например, публикации патентов США № 2013-0295121; 2010-0174053 и 2009-0060910; публикации европейских патентов ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221; и PCT публикации WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; и Sloan, D.D. et al. (2015) Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by DualAffinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat. 1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART™) Platform, Blood pii: blood-2014-05575704; Chichili, G.R. et al. (2015) A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold, Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion, J. Mol. Biol. 399(3):436-449). Указанные диатела содержат два или более ковалентно связанных полипептидов и включают модификацию одного или более остатков цистеина в каждой из используемых полипептидных молекул, что позволяет формировать дисульфидные связи и тем самым ковалентно связывать две полипептидные цепи. Например, было показано, что добавление остатка цистеина к С-концу указанных конструкций обеспечивает образование дисульфидной связи между полипептидными цепями, стабилизируя полученный гетеродимер без отрицательного влияния на характеристики связывания двухвалентной молекулы.In light of this problem, the art has developed stable, covalently linked heterodimeric non-monospecific diabodies termed DART™ diabodies (Dual Affinity ReTargeting Reagents); see, e.g., U.S. Patent Publication Nos. 2013-0295121; 2010-0174053; and 2009-0060910; European Patent Publications EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; and PCT Publications WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; and Sloan, D.D. et al. (2015) Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by DualAffinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells, PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat. 1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART™) Platform, Blood pii: blood-2014-05575704; Chichili, G.R. et al. (2015) A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates, Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimally Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma, Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) Therapeutic Control Of In Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold, Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion, J. Mol. Biol. 399(3):436–449). These diabodies comprise two or more covalently linked polypeptides and involve modification of one or more cysteine residues in each of the polypeptide molecules used, which allows for the formation of disulfide bonds and thereby covalently linking the two polypeptide chains. For example, it has been shown that addition of a cysteine residue to the C-terminus of these constructs provides for the formation of a disulfide bond between the polypeptide chains, stabilizing the resulting heterodimer without adversely affecting the binding properties of the divalent molecule.
Каждый из двух полипептидов простейшего биспецифического диатела DART состоит из трех доменов. Первый полипептид содержит (в направлении от N-конца к С-концу): (i) первый домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), и (iii) третий домен, который содержит остаток цистеина (или содержащий цистеин домен), и домен, способствующий образованию гетеродимера, который служит для стимулирования гетеродимеризации со вторым полипептидом диатела и для ковалентной связи первого и второго полипептидов диатела друг с другом. Второй полипептид содержит (в направлении от N-конца к Сконцу): (i) первый домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит остаток цистеина (или содержащий цистеин домен), и комплементарный домен, способствующий образованию гетеродимера, который объединяется с доменом, стимулирующим образование гетеродимера, первой полипептидной цепи, чтобы стимулировать гетеродимеризацию с первой полипептидной цепью. Остаток цистеина (или содержащий цистеин домен) третьего домена второй полипептидной цепи стимулирует образование ковалентной связи между второй полипептидной цепью и первой полипептидной цепью диатела. Указанные молекулы являются стабильными, эффективными и обладают способностью одновременно связываться с двумя или более антигенами. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения третьи домены первого и второго полипептидов содержат остаток цистеина, который служит для связывания полипептидов посредством дисульфидной связи. На фиг. 1 представлена схема указанного диатела, в котором для образования ковалентной связи используются домены, способствующие образованию гетеродимера, содержащие Е-спираль/К-спираль, и содержащий цистеин линкер. Как показано на фиг. 2 и фиг. 3А-3С, один или оба полипептида могут дополнительно содержать последовательность домена CH2-CH3 так, что соединение двух полипептидов диатела образует область Fc, которая способна связываться с рецептором Fc клеток (таких как В-лимфоциты, дендритные клетки, природные клетки-киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки). Как более подробно описано ниже, домены СН2 и/или CH3 указанных полипептидных цепей не обязательно должны иметь идентичные последовательности, и предпочтительно модифицированы, чтобы содействовать соединению двух полипептидных цепей.Each of the two polypeptides of the simplest bispecific DART diabody consists of three domains. The first polypeptide comprises (in the direction from the N-terminus to the C-terminus): (i) a first domain that contains a binding region from the variable domain of the light chain of a first immunoglobulin (VL1), (ii) a second domain that contains a binding region from the variable domain of the heavy chain of a second immunoglobulin (VH2), and (iii) a third domain that contains a cysteine residue (or a cysteine-containing domain) and a heterodimer-promoting domain that serves to promote heterodimerization with the second diabody polypeptide and to covalently link the first and second diabody polypeptides to each other. The second polypeptide comprises (in the direction from the N-terminus to the C-terminus): (i) a first domain that comprises a binding region from the variable domain of the light chain of a second immunoglobulin (VL2), (ii) a second domain that comprises a binding region from the variable domain of the heavy chain of a first immunoglobulin (VH1), and (iii) a third domain that comprises a cysteine residue (or a cysteine-containing domain) and a complementary heterodimer-promoting domain that combines with the heterodimer-promoting domain of the first polypeptide chain to promote heterodimerization with the first polypeptide chain. The cysteine residue (or cysteine-containing domain) of the third domain of the second polypeptide chain promotes the formation of a covalent bond between the second polypeptide chain and the first polypeptide chain of the diabody. The said molecules are stable, effective and have the ability to simultaneously bind to two or more antigens. According to one embodiment of the present invention, the third domains of the first and second polypeptides comprise a cysteine residue that serves to link the polypeptides via a disulfide bond. Fig. 1 is a diagram of said diabody that utilizes E-helix/K-helix heterodimer-promoting domains and a cysteine-containing linker to form a covalent bond. As shown in Fig. 2 and Fig. 3A-3C, one or both polypeptides may further comprise a CH2-CH3 domain sequence such that the junction of the two polypeptides of the diabody forms an Fc region that is capable of binding to an Fc receptor of cells (such as B lymphocytes, dendritic cells, natural killer cells, macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, and mast cells). As described in more detail below, the CH2 and/or CH3 domains of said polypeptide chains need not have identical sequences, and are preferably modified to facilitate joining of the two polypeptide chains.
Было описано множество вариантов указанных молекул (см, например, публикации патентов США № 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053 и 2009/0060910; публикации европейских патентов EP 2714079 ЕР 2601216, EP 2376109, EP 2158221; и PCT публикации WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). Указанные диатела DART™, содержащие область Fc, могут содержать две пары полипептидных цепей. Первая полипептидная цепь содержит (в направлении от N-конца к С-концу): (i) первый домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), (iii) третий доNumerous variations of these molecules have been described (see, for example, U.S. Patent Publication Nos. 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318, 2013/0295121, 2010/0174053, and 2009/0060910; European Patent Publications EP 2714079, EP 2601216, EP 2376109, EP 2158221; and PCT Publications WO 2012/162068, WO 2012/018687, WO 2010/080538). These DART™ diabodies containing an Fc region may comprise two pairs of polypeptide chains. The first polypeptide chain comprises (in the direction from the N-terminus to the C-terminus): (i) a first domain that comprises a binding region from the variable domain of the light chain of a first immunoglobulin (VL1), (ii) a second domain that comprises a binding region from the variable domain of the heavy chain of a second immunoglobulin (VH2), (iii) a third to
- 20 047726 мен, который содержит остаток цистеина (или содержащий цистеин домен) и стимулирует гетеродимеризацию со вторым полипептидом диатела и образование ковалентной связи между первым и вторым полипептидами диатела, и (iv) домен СН2-СН3. Второй полипептид содержит (в направлении от N-конца к С-концу): (i) первый домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) второй домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) третий домен, который содержит остаток цистеина (или содержащий цистеин домен), и домен, способствующий образованию гетеродимера, который стимулирует гетеродимеризацию с первой полипептидной цепью. В данном случае два первых полипептида соединяются друг с другом с образованием области Fc. На фиг. 3А-3С представлены схемы трех вариантов указанных диател, в которых используются разные домены, способствующие образованию гетеродимера. Другие диатела DART™, содержащие область Fc, могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид указанных диател DART™ содержит три домена: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2CH3. Второй полипептид указанных диател DART™ содержит: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (iii) домен, который стимулирует гетеродимеризацию и образование ковалентной связи с первой полипептидной цепью диатела. Третий полипептид указанных диател DART™ содержит последовательность СН2-СНЗ. Соответственно, первая и вторая полипептидные цепи указанных диател DART™ связываются с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связываться с эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Такие более сложные молекулы DART также содержат цистеинсодержащие домены, которые участвуют в образовании ковалентно связанного комплекса. Соответственно, первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи между остатками цистеина в их соответствующих третьих доменах. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи соединяются друг с другом с образованием области Fc, которая стабилизируется посредством дисульфидной связи. На фиг. 4А-4В представлены схемы указанных диател, содержащих три полипептидные цепи.- 20 047 726 me, which contains a cysteine residue (or a cysteine-containing domain) and promotes heterodimerization with a second diabody polypeptide and the formation of a covalent bond between the first and second diabody polypeptides, and (iv) a CH2-CH3 domain. The second polypeptide comprises (in the direction from the N-terminus to the C-terminus): (i) a first domain that contains a binding region from the variable domain of the light chain of a second immunoglobulin (VL2), (ii) a second domain that contains a binding region from the variable domain of the heavy chain of a first immunoglobulin (VH1), and (iii) a third domain that contains a cysteine residue (or a cysteine-containing domain) and a heterodimer formation promoting domain that promotes heterodimerization with the first polypeptide chain. In this case, the first two polypeptides are associated with each other to form an Fc region. In Fig. 3A-3C are schematic diagrams of three embodiments of said diabodies that utilize different domains that promote heterodimer formation. Other DART™ diabodies that contain an Fc region may contain three polypeptide chains. The first polypeptide of said DART™ diabodies contains three domains: (i) a VL1 containing domain, (ii) a VH2 containing domain, and (iii) a domain that contains the sequence CH2CH3. The second polypeptide of said DART™ diabodies contains: (i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and the formation of a covalent bond with the first polypeptide chain of the diabody. The third polypeptide of said DART™ diabodies contains the sequence CH2-CH3. Accordingly, the first and second polypeptide chains of the said DART™ diabodies associate to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding to an epitope, as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope. Such more complex DART molecules also contain cysteine-containing domains that participate in the formation of a covalently linked complex. Accordingly, the first and second polypeptides are linked to each other via a disulfide bond between cysteine residues in their respective third domains. Notably, the first and third polypeptide chains are linked to each other to form an Fc region that is stabilized by a disulfide bond. Figs. 4A-4B show schematics of the said diabodies containing three polypeptide chains.
Другие диатела DART™, содержащие область Fc, могут содержать пять полипептидных цепей, которые могут содержать связывающие области из вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи вплоть от трех различных иммуноглобулинов (называемых VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3). Например, первая полипептидная цепь указанных диател может содержать: (i) домен, содержащий VH1, (ii) домен, содержащий СН1, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3. Вторая и пятая полипептидные цепи указанных диател могут содержать: (i) домен, содержащий VL1, и (ii) домен, содержащий CL. Третья полипептидная цепь указанных диател может содержать: (i) домен, содержащий VH1, (ii) домен, содержащий СН1, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) домен, содержащий VL2, (v) домен, содержащий VH3, и (vi) домен, способствующий образованию гетеродимера, причем домены, способствующие образованию гетеродимера, стимулируют димеризацию третьей цепи с четвертой цепью. Четвертый полипептид указанных диател может содержать: (i) домен, содержащий VL3, (ii) домен, содержащий VH2, и (iii) домен, который стимулирует гетеродимеризацию и образование ковалентной связи с третьей полипептидной цепью диатела. В данном случае первый и третий полипептиды соединяются друг с другом с образованием области Fc. Такие более сложные молекулы DART™ также содержат цистеинсодержащие домены, которые участвуют в образовании ковалентно связанного комплекса так, что каждая полипептидная цепь связана с по меньшей мере одной дополнительной полипептидной цепью посредством дисульфидной связи с участием остатков цистеина. Предпочтительно указанные домены упорядочены в направлении от N-конца к С-концу. На фиг. 5 представлены схемы указанных диател, содержащих пять полипептидных цепей.Other DART™ diabodies containing an Fc region may contain five polypeptide chains, which may contain binding regions from the light chain and heavy chain variable domains of up to three different immunoglobulins (referred to as VL1/VH1, VL2/VH2, and VL3/VH3). For example, the first polypeptide chain of such diabodies may contain: (i) a VH1 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, and (iii) a CH2-CH3 containing domain. The second and fifth polypeptide chains of such diabodies may contain: (i) a VL1 containing domain, and (ii) a CL containing domain. The third polypeptide chain of said diabodies may comprise: (i) a domain containing VH1, (ii) a domain containing CH1, (iii) a domain containing the sequence CH2-CH3, (iv) a domain containing VL2, (v) a domain containing VH3, and (vi) a domain promoting the formation of a heterodimer, wherein the domains promoting the formation of a heterodimer stimulate the dimerization of the third chain with the fourth chain. The fourth polypeptide of said diabodies may comprise: (i) a domain containing VL3, (ii) a domain containing VH2, and (iii) a domain that stimulates heterodimerization and the formation of a covalent bond with the third polypeptide chain of the diabody. In this case, the first and third polypeptides are connected to each other to form an Fc region. Such more complex DART™ molecules also contain cysteine-containing domains that participate in the formation of a covalently linked complex such that each polypeptide chain is linked to at least one additional polypeptide chain via a disulfide bond involving cysteine residues. Preferably, said domains are ordered in an N-terminal to C-terminal direction. Figure 5 shows schematics of said diabodies containing five polypeptide chains.
Альтернативные конструкции известны в данной области техники для вариантов применения, в которых предпочтительной является четырехвалентная молекула, но область Fc не требуется, включая, но не ограничиваясь ими, четырехвалентные тандемные антитела, также называемые TandAbs (см., например, публикации патентов США № 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 20130189263; публикации европейских патентов EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 и EP 1293514; PCT публикации WO 1999/057150, WO 2003/025018 и WO 2013/013700), которые образованы путем гомодимеризации двух идентичных цепей, каждая из которых содержит домен VH1, VL2, VH2 и VL2.Alternative constructs are known in the art for applications in which a tetravalent molecule is preferred but an Fc region is not required, including, but not limited to, tetravalent tandem antibodies, also referred to as TandAbs (see, e.g., U.S. Patent Publication Nos. 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667, 20130189263; European Patent Publication Nos. EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936, and EP 1293514; PCT Publication Nos. WO 1999/057150, WO 2003/025018, and WO 2013/013700), which are formed by homodimerization of two identical chains, each containing a VH1, VL2, VH2 and VL2 domain.
Недавно были описаны трехвалентные структуры, включающие два связывающих домена, характерных для диател, и один домен типа, не характерного для диател, и область Fc (см., например, PCT публикацию: PCT/US15/33076, озаглавленную Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения, поданную 29 мая 2015 г., и PCT/US15/33081, озаглавленную Триспецифичные связывающие молекулы, которые специфично связываются с несколькими антигенами рака и способы их применения, поданную 29 мая 2015 г.). Указанные трехвалентные молекулы могут быть использованы для получения моноспецифичных, биспецифических или триспецифичных молекул. На фиг. 6A-6F представлены схемы указанных трехвалентных молекул, содержащих 3 или 4 полипептидные цепи.Recently, trivalent structures comprising two diabody-type binding domains and one non-diabody-type domain and an Fc region have been described (see, e.g., PCT Publication Nos. PCT/US15/33076, entitled Trispecific Binding Molecules and Methods of Using Them, filed May 29, 2015, and PCT/US15/33081, entitled Trispecific Binding Molecules That Specifically Bind to Multiple Cancer Antigens and Methods of Using Them, filed May 29, 2015). These trivalent molecules can be used to prepare monospecific, bispecific, or trispecific molecules. Figures 6A-6F are schematic diagrams of these trivalent molecules comprising 3 or 4 polypeptide chains.
IV. Молекулы, связывающие PD-1 человека, согласно настоящему изобретению.IV. Human PD-1 binding molecules according to the present invention.
Предпочтительные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению включают анPreferred PD-1 binding molecules of the present invention include an
- 21 047726 титела, диатела, BiTE и т.д. и способны связываться с непрерывной или прерывистой (например, конформационной) частью (эпитопом) PD-1 человека (CD279). Молекулы, связывающие PD-1 человека, согласно настоящему изобретению предпочтительно также способны связываться с молекулами PD-1 одного или более видов, отличных от человека, в частности с PD-1 приматов (и частности таких видов приматов как яванские макаки). Типичный полипептид PD-1 (последовательность в NCBI NP_005009.2; включая сигнальную последовательность из 20 остатков аминокислот (показаны подчеркиванием) и 268 остатков аминокислот зрелого белка) содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 68):- 21 047 726 titos, diabodies, BiTEs, etc. and are capable of binding to a continuous or discontinuous (e.g., conformational) portion (epitope) of human PD-1 (CD279). The human PD-1 binding molecules of the present invention are preferably also capable of binding to PD-1 molecules of one or more non-human species, in particular to primate PD-1 (and in particular to primate species such as cynomolgus macaques). An exemplary PD-1 polypeptide (sequence in NCBI NP_005009.2; including a signal sequence of 20 amino acid residues (shown underlined) and 268 amino acid residues of the mature protein) comprises the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 68):
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLWTEGDNAMQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLWTEGDNA
TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQLTFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL
PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGWGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYATPNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGWGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы, связывающие PD-1 человека, согласно настоящему изобретению характеризуются любым (одним или более) из следующих критериев:According to some embodiments of the present invention, human PD-1 binding molecules of the present invention are characterized by any one or more of the following criteria:
(1) специфично связывается с PD-1 человека, эндогенно экспрессируемым на поверхности стимулированной Т-клетки человека;(1) specifically binds to human PD-1 endogenously expressed on the surface of stimulated human T cells;
(2) специфично связывается с PD-1 человека с равновесной константой связывания (KD) 40 нМ или менее;(2) specifically binds to human PD-1 with an equilibrium binding constant (K D ) of 40 nM or less;
(3) специфично связывается с PD-1 человека с равновесной константой связывания (KD) 5 нМ или менее;(3) specifically binds to human PD-1 with an equilibrium binding constant (K D ) of 5 nM or less;
(4) специфично связывается с PD-1 человека со скоростью прямой реакции (ka) 1,5x104 М-1мин-1 или более;(4) binds specifically to human PD-1 with a forward reaction velocity (ka) of 1.5x104 M -1 min -1 or more;
(5) специфично связывается с PD-1 человека со скоростью прямой реакции (ka) 90,0x104 М-1мин-1 или более;(5) specifically binds to human PD-1 with a forward reaction velocity (ka) of 90.0x104 M -1 min -1 or more;
(6) специфично связывается с PD-1 человека со скоростью обратной реакции (kd) 7x10-4 мин-1 или менее;(6) binds specifically to human PD-1 with a kd of 7x10 -4 min -1 or less;
(7) специфично связывается с PD-1 человека со скоростью обратной реакции (kd) 2x10-4 мин-1 или менее;(7) binds specifically to human PD-1 with a kd of 2x10 -4 min -1 or less;
(8) специфично связывается с PD-1 примата, отличного от человека (например, PD-1 яванской макаки);(8) binds specifically to non-human primate PD-1 (e.g., cynomolgus macaque PD-1);
(9) ингибирует (т.е. блокирует или препятствует) связывание/ингибирующую активность лиганда PD-1 (PD-L1/PD-L2) с PD-1;(9) inhibits (i.e. blocks or interferes with) the binding/inhibitory activity of PD-1 ligand (PD-L1/PD-L2) to PD-1;
(10) стимулирует иммунный ответ; и/или (11) оказывает синергическое действие с антителом к LAG-3 человека, чтобы стимулировать антигенспецифичный ответ Т-клеток.(10) stimulates an immune response; and/or (11) synergizes with an antibody to human LAG-3 to stimulate an antigen-specific T cell response.
В настоящем изобретении термин антигенспецифичный ответ Т-клеток относится к ответам Тклетки, которые являются результатом стимуляции Т-клетки антигеном, в отношении которого специфична Т-клетка. Неограничивающие примеры ответов Т-клеток при антигенспецифичной стимуляции включают пролиферацию и выработку цитокинов (например, выработку ФНО-α, ИФН-γ). Способность молекулы стимулировать антигенспецифичный ответ Т-клеток может быть определена, например, с использованием количественного исследования МКПК, стимулированных энтеротоксином типа В Staphylococcus aureus (SEB), описанного в настоящем документе.In the present invention, the term antigen-specific T cell response refers to T cell responses that result from stimulation of a T cell with an antigen for which the T cell is specific. Non-limiting examples of T cell responses upon antigen-specific stimulation include proliferation and cytokine production (e.g., TNF-α, IFN-γ production). The ability of a molecule to stimulate an antigen-specific T cell response can be determined, for example, using the Staphylococcus aureus enterotoxin type B (SEB)-stimulated PBMC assay described herein.
Предпочтительные молекулы, связывающие PD-1 человека, согласно настоящему изобретению содержат домены VH и/или VL мышиных моноклональных антител к PD-1 человека МАТ к PD-1 1, МАТ 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD1, MAT 14 к PD-1 или МАТ 15 к PD-1, и более предпочтительно содержат 1, 2 или все 3 CDRH домена VH и/или 1, 2 или все 3 CDRL домена VL указанных моноклональных антител к PD-1 человека. Указанные предпочтительные молекулы, связывающие PD-1 человека, включают биспецифические (или полиспецифичные) антитела, химерные или гуманизированные антитела, BiTe, диатела и т.д., и указанные связывающие молекулы, содержащие варианты областей Fc.Preferred human PD-1 binding molecules according to the present invention comprise the VH and/or VL domains of the mouse anti-human PD-1 monoclonal antibodies MAb anti-PD-1 1, MAb anti-PD-1 2, MAb anti-PD-1 3, MAb anti-PD-1 4, MAb anti-PD-1 5, MAb anti-PD-1 6, MAb anti-PD-1 7, MAb anti-PD-1 8, MAb anti-PD-1 9, MAb anti-PD-1 10, MAb anti-PD-1 11, MAb anti-PD-1 12, MAb anti-PD-1 13, MAb anti-PD-1 14 or MAb anti-PD-1 15, and more preferably comprise 1, 2 or all 3 CDR H of the VH domain and/or 1, 2 or all 3 CDR L of the VL domain of said anti-PD-1 monoclonal antibodies human. Said preferred molecules binding to human PD-1 include bispecific (or polyspecific) antibodies, chimeric or humanized antibodies, BiTe, diabodies, etc., and said binding molecules containing variant Fc regions.
Согласно настоящему изобретению в частности предложены PD-1-связывающие молекулы, содержащие PD-1-связывающий домен, которые содержат:According to the present invention, in particular, PD-1-binding molecules comprising a PD-1-binding domain are provided, which comprise:
(A) (1) три CDRH домена VH MAT к PD-1 1;(A) (1) three CDRH domains of VH MAT to PD-1 1;
(2) три CDRl домена VL MAT к PD-1 1;(2) three CDRl domains of VL MAT to PD-1 1;
(3) три CDRH домена VH MAT к PD-1 1 и три CDRL домена VL MAT к PD-1 1;(3) three CDRH domains of VH MAT to PD-1 1 and three CDRL domains of VL MAT to PD-1 1;
(4) домен VH из VH1 MAT к hPD-1 1;(4) VH domain from VH1 MAT to hPD-1 1;
(5) домен VL из VL1 MAT к hPD-1 1;(5) VL domain of VL1 MAT to hPD-1 1;
- 22 047726 (6) домены VH и VL MAT к hPD-1 1;- 22 047726 (6) VH and VL domains of MAT to hPD-1 1;
(B) (1) три CDRH домена VH MAT 2 к PD-1;(B) (1) three CDRH domains of VH MAT 2 to PD-1;
(2) три CdRl домена VL MAT 2 к PD-1;(2) three CdR l domains of VL MAT 2 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 2 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 2 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 2 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 2 to PD-1;
(4) домен VH из VH1 MAT к hPD-1 2;(4) VH domain from VH1 MAT to hPD-1 2;
(5) домен VL из VL1 MAT к hPD-1 2;(5) VL domain of VL1 MAT to hPD-1 2;
(6) домены VH и VL MAT к hPD-1 2;(6) VH and VL domains of MAT to hPD-1 2;
(C) (1) три CDRH домена VH MAT 3 к PD-1;(C) (1) three CDRH domains of VH MAT 3 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 3 к PD-1;(2) three CDRL domains of VL MAT 3 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 3 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 3 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 3 to PD-1 and three CDRL domains of VL MAT 3 to PD-1;
(D) (1) три CDRH домена VH MAT 4 к PD-1;(D) (1) three CDRH domains of VH MAT 4 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 4 к PD-1;(2) three CDRL domains of MAT 4 VL to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 4 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 4 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 4 to PD-1 and three CDRL domains of VL MAT 4 to PD-1;
(E) (1) три CDRH домена VH MAT 5 к PD-1;(E) (1) three CDRH domains of VH MAT 5 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 5 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 5 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 5 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 5 к PD-1;(3) three CDRH domains of MAT 5 VH to PD-1 and three CDRL domains of MAT 5 VL to PD-1;
(F) (1) три CDRH домена VH MAT 6 к PD-1;(F) (1) three CDRH domains of VH MAT 6 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 6 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 6 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 6 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 6 к PD-1;(3) three CDRH domains of MAT 6 VH to PD-1 and three CDRL domains of MAT 6 VL to PD-1;
(G) (1) три CDRH домена VH MAT 7 к PD-1;(G) (1) three CDRH domains of MAT 7 VH to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 7 к PD-1 или VL2 MAT к hPD-1 7 или VL3 MAT к hPD-1 7;(2) three CDRL domains of VL MAT 7 to PD-1 or VL2 MAT to hPD-1 7 or VL3 MAT to hPD-1 7;
(3) три CDRH домена VH MAT 7 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 7 к PD-1 или VL2 MAT к hPD1 7, VL3 MAT к hPD-1 7;(3) three CDRH domains of VH MAT 7 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 7 to PD-1 or VL2 MAT to hPD1 7, VL3 MAT to hPD-1 7;
(4) домен VH из VH1 MAT к hPD-1 7 или VH2 MAT к hPD-1 7;(4) the VH domain of VH1 MAT to hPD-1 7 or VH2 MAT to hPD-1 7;
(5) домен VL из VL1 MAT к hPD-1 7 или VL2 MAT к hPD-1 7, или VL3 MAT к hPD-1 7;(5) the VL domain of VL1 MAT to hPD-1 7 or VL2 MAT to hPD-1 7, or VL3 MAT to hPD-1 7;
(6) домены VH и VL MAT к hPD-1 7(1.1) или MAT к hPD-1 7(1.2), или MAT к hPD-1 7(1.3), или MAT к hPD-1 7(2.1), или MAT к hPD-1 7(2.2), или MAT к hPD-1 7(2.3);(6) VH and VL domains of MAT to hPD-1 7(1.1) or MAT to hPD-1 7(1.2), or MAT to hPD-1 7(1.3), or MAT to hPD-1 7(2.1), or MAT to hPD-1 7(2.2), or MAT to hPD-1 7(2.3);
(H) (1) три CDRH домена VH MAT 8 к PD-1;(H) (1) three CDRH domains of VH MAT 8 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 8 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 8 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 8 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 8 к PD-1;(3) three CDRH domains of MAT 8 VH to PD-1 and three CDR L domains of MAT 8 VL to PD-1;
(I) (1) три CDRH домена VH MAT 9 к PD-1 или VH2 MAT к hPD-1 9;(I) (1) three CDRH domains of VH MAT 9 to PD-1 or VH2 MAT to hPD-1 9;
(2) три CDRL домена VL MAT 9 к PD-1 или VL2 MAT к hPD-1 9;(2) three CDRL domains of VL MAT 9 to PD-1 or VL2 MAT to hPD-1 9;
(3) три CDRH домена VH MAT 9 к PD-1 или VH2 MAT к hPD-1 9 и три CDRL домена VL MAT 9 к PD-1 или VL2 MAT к hPD-1 9;(3) three CDRH domains of VH MAT 9 to PD-1 or VH2 MAT to hPD-1 9 and three CDR L domains of VL MAT 9 to PD-1 or VL2 MAT to hPD-1 9;
(4) домен VH из VH1 MAT к hPD-1 9 или VH2 MAT к hPD-1 9;(4) the VH domain of VH1 MAT to hPD-1 9 or VH2 MAT to hPD-1 9;
(5) домен VL из VL1 MAT к hPD-1 9 или VL2 MAT к hPD-1 9;(5) the VL domain of VL1 MAT to hPD-1 9 or VL2 MAT to hPD-1 9;
(6) домены VH и VL MAT к hPD-1 9(1.1) или MAT к hPD-1 9(1.2), или MAT к hPD-1 9(2.1), или MAT к hPD-1 9(2.2);(6) VH and VL domains of MAT to hPD-1 9(1.1) or MAT to hPD-1 9(1.2), or MAT to hPD-1 9(2.1), or MAT to hPD-1 9(2.2);
(J) (1) три CDRH домена VH MAT 10 к PD-1;(J) (1) three CDRH domains of VH MAT 10 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 10 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 10 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 10 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 10 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 10 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 10 to PD-1;
(K) (1) три CDRH домена VH MAT 11 к PD-1;(K) (1) three CDRH domains of VH MAT 11 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 11 к PD-1;(2) three CDRL domains of VL MAT 11 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 11 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 11 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 11 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 11 to PD-1;
(L) (1) три CDRH домена VH MAT 12 к PD-1;(L) (1) three CDRH domains of VH MAT 12 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 12 к PD-1;(2) three CDRL domains of VL MAT 12 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 12 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 12 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 12 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 12 to PD-1;
(M) (1) три CDRH домена VH MAT 13 к PD-1;(M) (1) three CDRH domains of VH MAT 13 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 13 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 13 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 13 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 13 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 13 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 13 to PD-1;
(N) (1) три CDRH домена VH MAT 14 к PD-1;(N) (1) three CDRH domains of VH MAT 14 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 14 к PD-1;(2) three CDRs of the L domain of VL MAT 14 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 14 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 14 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 14 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 14 to PD-1;
(O) (1) три CDRH домена VH MAT 15 к PD-1;(O) (1) three CDRH domains of VH MAT 15 to PD-1;
(2) три CDRL домена VL MAT 15 к PD-1;(2) three CDRL domains of VL MAT 15 to PD-1;
(3) три CDRH домена VH MAT 15 к PD-1 и три CDRL домена VL MAT 15 к PD-1;(3) three CDRH domains of VH MAT 15 to PD-1 and three CDR L domains of VL MAT 15 to PD-1;
(4) домен VH из VH1 MAT к hPD-1 15;(4) VH domain from VH1 MAT to hPD-1 15;
(5) домен VL из VL1 MAT к hPD-1 15;(5) VL domain of VL1 MAT to hPD-1 15;
(6) домены VH и VL MAT к hPD-1 15; или который связывается или конкурирует за связывание с одним и тем же эпитопом, что и МАТ к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1(6) the VH and VL domains of anti-hPD-1 MAT 15; or which binds to or competes for binding to the same epitope as anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14
- 23 047726 или MAT 15 к PD-1.- 23 047726 or MAT 15 to PD-1.
А. Моноклональное антитело к PD-1 человека 1.A. Monoclonal antibody to human PD-1 1.
1. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 1.1. Mouse monoclonal antibody to human PD-1 1.
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена VH MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 69) (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 69) is shown below (CDR H residues are underlined).
DVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWNWIRQ FPGNKLEWMGDVQLQESGPG RVKPSQSLSL TCTVTGFSIT NDYAWNWIRQ FPGNKLEWMG
HITYSGSTSY NPSLKSRISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCARDYHITYSGSTSY NPSLKSRISI TRDTSKNHFF LQLSSVTPED TATYYCARDY
GSGYPYTLDY WGQGTSVTVS SGSGYPYTLDY WGQGTSVTVS S
CDRhI МАТ к PD-1 1 (SEQ ГО NO: 71): ND YAWNCDRhI MAT to PD-1 1 (SEQ GO NO: 71): ND YAWN
CDRH2 MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 72): HITYSGSTSYNPSLKSCDR H 2 MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 72): HITYSGSTSYNPSLKS
CDRH3 MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 73): DYGSGYPYTLDYCDR H 3 MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 73): DYGSGYPYTLDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT к PD-1 1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 70 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT to PD-1 1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 70 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
cagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaactg gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag cactagctac aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc a a g agattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt caccgtctcc tcccagatccagt gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc cgggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc aatgattatg cctggaactg gatccgacag tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc cacataacct acagtggcag cactagctac a acccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgggaca catccaagaa ccacttcttc ctgcagttga gttctgtgac tcctgaggac acagccacat attactgtgc a a g agattac ggtagtggct acccctatac tttggactac tggggtcaag gtacctcagt caccgtctcc tcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 74) представлена ниже (остатки CDRl выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 74) is shown below (CDR l residues are underlined):
QIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTCSATSIVS YVYWYQQKPG SSPQPWIYLTQIVLTQSPAL MSASPGEKVT MTCSATSIVS YVYWYQQKPG SSPQPWIYLT
SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG TKLEIKSNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG TKLEIK
CDRlI MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 76): SATSIVSYVYCDRlI MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 76): SATSIVSYVY
CDRl2 MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 77): LTSNLASCDR l 2 MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 77): LTSNLAS
CDRl3 MAT к PD-1 1 (SEQ ID NO: 78): QQWSDNPYTCDR l 3 MAT to PD-1 1 (SEQ ID NO: 78): QQWSDNPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT к PD-1 1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 75 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT to PD-1 1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 75 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
caaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacgtttact ggtaccagca gaagcctgga tcctcccccc aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtgataacc cgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaacaaattgttc tcacccagtc tccagcactc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc atgacctgca gtgccacctc aattgtaagt tacgtttact ggtaccagca gaagcctgga tcctcccccc aaccctggat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc ttcagtggca g tgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtgataacc cgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaa
2. Гуманизация моноклонального антитела к PD-1, MAT к PD-1 1, чтобы получить МАТ к hPD-1 1.2. Humanization of the monoclonal antibody to PD-1, mAb to PD-1 1, to obtain mAb to hPD-1 1.
Вышеописанное мышиное антитело к PD-1 человека, MAT к PD-1 1, было гуманизировано и дополнительно деиммунизировано после идентификации антигенных эпитопов, чтобы продемонстрировать возможность гуманизации антитела к PD-1 человека с целью уменьшения его антигенности при введении человеку-реципиенту. В результате гуманизации получили один гуманизированный домен VH, обозначенный в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 1, и один гуманизированный домен VL, обозначенный в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 1. Соответственно, антитело, содержащее гуманизированные домены VL, спаренные с гуманизированным доменом VH, называется МАТ к hPD-1 1.The above-described murine anti-human PD-1 antibody, anti-PD-1 mAb 1, was humanized and further deimmunized after identification of antigenic epitopes to demonstrate the feasibility of humanizing an anti-human PD-1 antibody to reduce its antigenicity when administered to a human recipient. The humanization resulted in one humanized VH domain, designated herein as VH1 anti-hPD-1 mAb 1, and one humanized VL domain, designated herein as VL1 anti-hPD-1 mAb 1. Accordingly, an antibody comprising humanized VL domains paired with a humanized VH domain is referred to as anti-hPD-1 mAb 1.
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hPD-1 1 (SEQ ID NO: 79) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of VH1 MAT to hPD-1 1 (SEQ ID NO: 79) is shown below (CDRH residues are underlined):
DVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWNWIRQ PPGKGLEWIG HITYSGSTSY NPSLKSRLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCARDY GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS SDVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGFSIS NDYAWNWIRQ PPGKGLEWIG HITYSGSTSY NPSLKSRLTI TRDTSKNQFV LTMTNMDPVD TATYYCARDY GSGYPYTLDY WGQGTTVTVS S
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH1 MAT к hPD-1 1, содержит последовательность,An exemplary polynucleotide that encodes VH1 MAT to hPD-1 1 contains the sequence,
- 24 047726 приведенную в SEQ ID NO: 80 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaattg gattaggcag cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat aatcccagtc tgaagagсcg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcgagattat ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc tcc- 24 047726 given in SEQ ID NO: 80 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gacgtacagc tccaggaaag tggcccaggt ctggtgaagc catcccagac actgagcctg acttgcaccg tgagtggctt ctccatctca aatgactacg cctggaattg gattaggcag cctcccggta aagggctgga gtggatcggc cacatcacat acagcggctc cacatcatat aatcccagtc tgaagagсcg tcttaccatt actcgcgaca ctagtaagaa ccagtttgtt ctgaccatga ccaacatgga ccctgtggat actgcaacat actattgtgc tcgagattat ggttctggtt acccttatac actcgactac tggggacagg gaaccactgt gaccgtgagc tcc
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 MAT к hPD-1 1 (SEQ ID NO: 81) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием): EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITCSATSIVS YVYWYQQKPG QAPQPLIYLT SNLASGIPAR FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG TKVEIKThe amino acid sequence of the VL domain from the VL1 MAT to hPD-1 1 (SEQ ID NO: 81) is shown below (CDRH residues are underlined): EIVLTQSPAT LSVSPGEKVT ITCSATSIVS YVYWYQQKPG QAPQPLIYLT SNLASGIPAR FSGSGSGTDF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SDNPYTFGGG TKVEIK
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL1 MAT к hPD-1 1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 82 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga aaaggtcacc attacttgct ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtact ggtatcagca gaagcccggt caggctcccc agccattgat atatctgacc agcaacctgg cttctggtat cccagctcgt ttttccggta gcgggtccgg gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa gacgccgcca cctattattg tcaacagtgg tcagacaatc catacacttt tggcggtggc accaaagtcg aaataaagAn exemplary polynucleotide that encodes the VL1 mAb to hPD-1 1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 82 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaaatcgttc tgacccagag cccagcaacc ctgtctgtct cccccggaga aaaggtcacc attacttgct ctgctacttc tatcgtgtcc tacgtgtact ggtatcagca gaagcccggt caggctcccc agccattgat atatctgacc agcaacctgg cttctggtat cccagctcgt ttttccggta gcgggtccgg gactgatttc actttgacta tcagctctct ggaggcagaa gacgccgcca cctattattg tcaacagtgg tcagacaatc catacacttt tggcggtggc accaaagtcg aaataaag
В. Моноклональное антитело к PD-1 человека 2.B. Monoclonal antibody to human PD-1 2.
1. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 2.1. Mouse monoclonal antibody to human PD-1 2.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 2 к PD-1 (SEQ ID NO: 83) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 83) is shown below (CDRH residues are underlined).
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLS DYFDYWGQGT TLTVSSDVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLS DYFDYWGQGT TLTVSS
CDRhI МАТ 2 к PD-1 (SEQ ГО NO: 85): SFGMHCDRhI MAT 2 to PD-1 (SEQ GO NO: 85): SFGMH
CDRH2 МАТ 2 к PD-1 (SEQ ГО NO: 86): YISSGSMSISYADTVKGCDR H 2 MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 86): YISSGSMSISYADTVKG
CDRH3 МАТ 2 к PD-1 (SEQ ГО NO: 87): LSDYFDYCDR H 3 MAT 2 to PD-1 (SEQ GO NO: 87): LSDYFDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 2 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 84 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgagt gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 2 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 84 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gatgtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac atcagtagtg gcagtatgag catttcctat gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgagt gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 2 к PD-1 (SEQ ID NO: 88) представлена ниже (остатки CDRl выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 88) is shown below (CDR l residues are underlined):
DWMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IKDWMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPK LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV FFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IK
CDRlI MAT 2 к PD-1 (SEQ ID NO: 90): RSSQSLVHSTGNTYLHCDRlI MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 90): RSSQSLVHSTGNTYLH
CDRl2 MAT 2 к PD-1 (SEQ ID NO: 91): RVSNRFSCDR l 2 MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 91): RVSNRFS
CDRl3 MAT 2 к PD-1 (SEQ ID NO: 92): SQTTHVPWTCDR l 3 MAT 2 to PD-1 (SEQ ID NO: 92): SQTTHVPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 2 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 89 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRl, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 2 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 89 (nucleotides encoding CDR l residues are underlined):
- 25 047726 gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gagccttgtt cacagtactg- 25 047726 gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gagccttgtt cacagtactg
Igaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agtagagtgg aggetgagga tctgggagtt tttttctgct ctcaaactac acatgttccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaIgaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agtagagtgg aggetgagga tctgggagtt tttttctgct ctcaaactac acatgt tccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa
2. Гуманизация моноклонального антитела к PD-1 человека, MAT 2 к PD-1, чтобы получить МАТ к hPD-1 2.2. Humanization of the anti-human PD-1 monoclonal antibody, anti-PD-1 mAb 2, to produce anti-hPD-1 mAb 2.
Вышеописанное мышиное моноклональное антитело PD-1 человека, MAT 2 к PD-1, было гуманизировано и дополнительно деиммунизировано после идентификации антигенных эпитопов, чтобы продемонстрировать возможность гуманизации антитела к PD-1 человека с целью уменьшения его антигенности при введении человеку-реципиенту. В результате гуманизации получили один гуманизированный домен VH, обозначенный в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 2, и один гуманизированный домен VL, обозначенный в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 1. Соответственно, любое антитело, содержащее гуманизированные домены VL, спаренные с гуманизированным доменом VH, называется МАТ к hPD-1 2.The above-described murine monoclonal antibody to human PD-1, anti-PD-1 Mab 2, was humanized and further deimmunized after identification of antigenic epitopes to demonstrate the feasibility of humanizing an anti-human PD-1 antibody to reduce its antigenicity when administered to a human recipient. The humanization resulted in one humanized VH domain, designated herein as VH1 anti-hPD-1 Mab 2, and one humanized VL domain, designated herein as VL1 anti-hPD-1 Mab 1. Accordingly, any antibody comprising humanized VL domains paired with a humanized VH domain is referred to as an anti-hPD-1 Mab 2.
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hPD-1 2 (SEQ ID NO: 93) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of VH1 MAT to hPD-1 2 (SEQ ID NO: 93) is shown below (CDRH residues are underlined):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS DYFDYWGQGT TVTVSSEVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRTED TALYYCASLS DYFDYWGQGT TVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH1 MAT к hPD-1 2, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 94 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaagtgeaat tggttgagag tggtggtggc etggtgeage caggtggaag tctgcggttg tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga tgcattgggt gcgccaggct cccggcaagg gtctcgagtg ggtagcatac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat gccgacacag tgaaaggcag gtttactatc tcccgtgaca atgeaaaaaa cacactgtac etgeaaatga atageetgeg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttccctgtct gattaetteg actactgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttccAn exemplary polynucleotide that encodes a VH1 mAb to hPD-1 2 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 94 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaagtgeaat tggttgagag tggtggtggc etggtgeage caggtggaag tctgcggttg tcctgtgcag caagcggatt tgtgttcagc tcttttggga tgcattgggt gcgccaggct cccggcaagg gtctcgagtg ggtagcatac atctccagcg ggtccatgtc tattagttat gccgacacag tgaaaggcag gtttactatc tcccgtgaca atgeaaaaa cacactgtac etgeaaatga atageetgeg caccgaggac accgccttgt actactgcgc ttccctgtct gattaetteg actactgggg tcagggcaca actgtgacag tttcttcc
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 MAT к hPD-1 2 (SEQ ID NO: 95) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of VL1 MAT to hPD-1 2 (SEQ ID NO: 95) is shown below (CDRH residues are underlined):
DWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQDWMTQSPLS LPVTLGQPAS ISCRSSQSLV HSTGNTYLHW YLQKPGQSPQ
LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP WTFGQGTKLE IKLLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQTTHVP WTFGQGTKLE IK
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL1 MAT к hPD-1 2, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 96 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt atttcttgtc ggagttcaca gagtctggta cattccacagAn exemplary polynucleotide that encodes the VL1 MAT to hPD-1 2 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 96 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gacgttgtga tgacacagtc accactgagt ctgccagtta ccctgggcca gccagccagt atttcttgtc ggagttcaca gagtctggta cattccacag
Igaaatacata tctccattgg tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag etgetgattt atagagtgte taategattt tctggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac aetgaaaate tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgta gtcagaccac ccatgtaccc tggacttttg gccaaggtac taagctggaa atcaagIgaaatacata tctccattgg tacctgcaaa aaccagggca gagcccccag etgetgattt atagagtgte taategattt tctggcgtgc cagatcggtt cagcggcagc gggtctggca ctgatttcac aetgaaaate tctagggtgg aggcagagga cgtaggcgtt tactactgta gtcagaccac ccatgtacc c tggacttttg gccaaggtac taagctggaa atcaag
С. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 3.C. Murine monoclonal antibody to human PD-1 3.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 3 к PD-1 (SEQ ID NO: 97) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 3 to PD-1 (SEQ ID NO: 97) is shown below (CDRH residues are underlined).
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMHWVKQT PVHGLEWIGTQVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFT DYVMHWVKQT PVHGLEWIGT
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTREKIDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSNTAY MELRSLTSED SAVYYFTREK
ITTIVEGTYW YFDVWGTGTT VTVSSITTIVEGTYW YFDVWGTGTT VTVSS
CDRhI MAT 3 к PD-1 (SEQ ID NO: 99): DYVMHCDRhI MAT 3 to PD-1 (SEQ ID NO: 99): DYVMH
CDRH2 MAT 3 к PD-1 (SEQ ID NO: 100): TIDPETGGTAYNQKFKGCDR H 2 MAT 3 to PD-1 (SEQ ID NO: 100): TIDPETGGTAYNQKFKG
CDRH3 MAT 3 к PD-1 (SEQ ID NO: 101): EKITTIVEGTYWYFDVCDR H 3 MAT 3 to PD-1 (SEQ ID NO: 101): EKITTIVEGTYWYFDV
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 3 к PD-1, содержит последовательAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 3 to PD-1 contains the sequence
- 26 047726 ность, приведенную в SEQ ID NO: 98 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):- 26 047726 the sequence shown in SEQ ID NO: 98 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
caggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa tgcactgggt gaagcagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattggaact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aagagagaag attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tctggggс a c agggaccacg gtcaccgtct cctcacaggttcaac tgcaacagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgtaa tgcactgggt gaagcagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattggaact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaag t tcaagggcaa ggccatactg actgcagaca agtcctccaa cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactttac aagagagaag attactacga tagtagaggg gacatactgg tacttcgatg tctggggс a c agggaccacg gtcaccgtct cctca
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 3 к PD-1 (SEQ ID NO: 102) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 3 to PD-1 (SEQ ID NO: 102) is shown below (CDR L residues are underlined):
DVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGDTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHLP YTFGGGTKLE IKDVLLTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGDTYLEW YLQKPGQSPK LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHLP YTFGGGTKLE IK
CDRlI MAT 3 к PD-1 (SEQ Ш NO: 104): RSSQNIVHSNGDTYLECDRlI MAT 3 to PD-1 (SEQ Ш NO: 104): RSSQNIVHSNGDTYLE
CDRl2 MAT 3 к PD-1 (SEQ Ш NO: 105): KVSNRFSCDR l 2 MAT 3 to PD-1 (SEQ Ш NO: 105): KVSNRFS
CDRl3 MAT 3 к PD-1 (SEQ Ш NO: 106): FQGSHLPYTCDR l 3 MAT 3 to PD-1 (SEQ Ш NO: 106): FQGSHLPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 3 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 103 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием): gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gaacattgta catagtaatg gagacaccta tttggaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tattaetget ttcaaggttc acatcttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaaAn exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 3 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 103 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined): gatgttttgc tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gaacattgta catagtaatg gagacaccta tttggaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagattttac actcaaaatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tattaetget ttcaaggttc acatcttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
D. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 4.D. Murine monoclonal antibody to human PD-1 4.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 107) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 107) is shown below (CDRH residues are underlined).
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLT DYFDYWGQGT TLTVSSDVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFVFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY ISSGSMSISY ADTVKGRFTV TRDNAKNTLF LQMTSLRSED TAIYYCASLT DYFDYWGQGT TLTVSS
CDRhI МАТ 4 к PD-1 (SEQ ГО NO: 109): SFGMHCDRhI MAT 4 to PD-1 (SEQ GO NO: 109): SFGMH
CDRH2 МАТ 4 к PD-1 (SEQ ГО NO: 110): YISSGSMSISYADTVKGCDR H 2 MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 110): YISSGSMSISYADTVKG
CDRH3 МАТ 4 к PD-1 (SEQ ГО NO: 111): LTDYFDYCDR H 3 MAT 4 to PD-1 (SEQ GO NO: 111): LTDYFDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 4 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 108 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gatgtgeage tegtggagte tgggggaggc ttagtgeage ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tegteagget ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat attagtagtg gcagtatgag tatttcctat gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc etgeaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgact gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcaAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 4 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 108 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gatgtgeage tegtggagte tgggggaggc ttagtgeage ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cgttttcagt agctttggaa tgcactgggt tegteagget ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatat attagtagtg gcagtatgag tatttcctat gcagacacag tgaagggccg attcaccgtc accagagaca atgccaagaa caccctgttc etgeaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccattt attactgtgc atccctgact gactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 112) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 112) is shown below (CDR L residues are underlined):
- 27 047726- 27 047726
DWMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYFHW YLQKPGQSPK LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IKDWMSQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSTGNTYFHW YLQKPGQSPK LLIYRVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQTTHVP WTFGGGTKLE IK
CDRlI MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 114): RSSQSLVHSTGNTYFHCDRlI MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 114): RSSQSLVHSTGNTYFH
CDRl2 MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 115): RVSNRFSCDR l 2 MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 115): RVSNRFS
CDRl3 MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 116): SQTTHVPWTCDR l 3 MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 116): SQTTHVPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 4 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 113 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием): gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcctgca gatetagtea gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttccattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tatttetget ctcaaactac acatgttccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaAn exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 4 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 113 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined): gatgttgtga tgtcccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcctgca gatetagtea gagccttgtt cacagtactg gaaacaccta tttccattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc taaccgattt tctggggtcc ccgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tatttetget ctcaaactac acatgttccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa
Е. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 5.E. Murine monoclonal antibody to human PD-1 5.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 117) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 117) is shown below (CDR H residues are underlined).
QVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMNWMKQR PGQGLEWIGV IHPSDSETWL NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH YGSSPFAYWG QGTLVTVSAQVQLQQPGVE LVRPGASVKL SCKASGYSFT AYWMNWMKQR PGQGLEWIGV IHPSDSETWL NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH YGSSPFAYWG QGTLVTVSA
CDRhI МАТ 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 119): AYWMNCDRhI MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 119): AYWMN
CDRH2 MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 120): VIHPSDSETWLNQKFKDCDR H 2 MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 120): VIHPSDSETWLNQKFKD
CDRH3 MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 121): EHYGSSPFAYCDR H 3 MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 121): EHYGSSPFAY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 5 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 118 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa etggtgagge etggagette agtgaagctg teetgeaagg ettetggeta ctccttcacc gcctactgga tgaactggat gaaacagagg cctggacaag geettgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta aatcagaagt tcaaggac a a ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tetgeggtet attactgtgc aagagagcac taeggtagta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcaAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 5 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 118 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): caggtccaac tgcagcagcc tggggttgaa etggtgagge etggagette agtgaagctg teetgeaagg ettetggeta ctccttcacc gcctactgga tgaactggat gaaacagagg cctggacaag geettgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta aatcagaagt tcaaggac a a ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tetgeggtet attactgtgc aagagagcac taeggtagta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 122) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIYAASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FCQQSKEVPY TFGGGTKLEI КThe amino acid sequence of the VL domain of MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 122) is shown below (CDR L residues are underlined): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIYAASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDTAMY FCQQSKEVPY TFGGGTKLEI K
CDRlI MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 124): RANESVDNYGMSFMNCDRlI MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 124): RANESVDNYGMSFMN
CDRl2 MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 125): AASNQGSCDR l 2 MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 125): AASNQGS
CDRl3 MAT 5 к PD-1 (SEQ ID NO: 126): QQSKEVPYTCDR l 3 MAT 5 to PD-1 (SEQ ID NO: 126): QQSKEVPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 5 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 123 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 5 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 123 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
- 28 047726 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa- 28 047726 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc gg ggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag atttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa
F. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 6.F. Mouse monoclonal antibody to human PD-1 6.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 6 к PD-1 (SEQ ID NO: 127) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 6 to PD-1 (SEQ ID NO: 127) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PEKRLEWVAT ISGGGSDTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCARQK ATTWFAYWGQ GTLVTVSTEVKLVESGGG LVNPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PEKRLEWVAT ISGGGSDTYY PDSVKGRFTI SRDNAKNNLY LQMSSLRSED TALYYCARQK ATTWFAYWGQ GTLVTVST
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 6 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 128 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 6 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 128 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaagaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggt gcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 6 к PD-1 (SEQ ID NO: 132) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 6 to PD-1 (SEQ ID NO: 132) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMNWF QQKPGQPPKLDIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD NYGISFMNWF QQKPGQPPKL
LIYPASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPW TFGGGTKLEI КLIYPASNQGS GVPARFSGSG SGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPW TFGGGTKLEI K
CDRlI MAT 6 к PD-1 (SEQ ID NO: 134): RASESVDNYGISFMNCDRlI MAT 6 to PD-1 (SEQ ID NO: 134): RASESVDNYGISFMN
CDRl2 MAT 6 к PD-1 (SEQ ID NO: 135): PASNQGSCDR l 2 MAT 6 to PD-1 (SEQ ID NO: 135): PASNQGS
CDRl3 MAT 6 к PD-1 (SEQ Ш NO: 136): QQSKEVPWTCDR l 3 MAT 6 to PD-1 (SEQ Ш NO: 136): QQSKEVPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 6 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 133 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 6 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 133 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaagacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa
G. Моноклональное антитело к PD-1 человека 7.G. Monoclonal antibody to human PD-1 7.
1. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 7.1. Murine monoclonal antibody to human PD-1 7.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 137) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 137) is shown below (CDRH residues are underlined).
- 29 047726- 29 047726
QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDKATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSQVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYSFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDKATL TVDKSSTTAY MQLISPTSED SAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
CDRhI MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 139): SYWMNCDRhI MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 139): SYWMN
CDRH2 MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 140): VIHPSDSETWLDQKFKDCDR H 2 MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 140): VIHPSDSETWLDQKFKD
CDRH3 MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 141): EHYGTSPFAYCDR H 3 MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 141): EHYGTSPFAY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 7 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 138 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta gatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggagcac tacggtacta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt gtcttccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 7 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 138 (nucleotides encoding CDR H residues are underlined): gaggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaggc ctggagcttc agtgaagctg tcctgcaagg cttctggcta ctccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg cctggacaag gccttgagtg gattggcgtg attcatcctt ccgatagtga aacttggtta gatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccac cacagcctac atgcaactca tcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagggagcac tacggtacta gcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt gtcttcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 142) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPY TFGGGTKLEI КThe amino acid sequence of the VL domain of MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 142) is shown below (CDR L residues are underlined): DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPARFSGSG FGTDFSLNIH PMEEDDAAMY FCQQSKEVPY TFGGGTKLEI K
CDRlI MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 144): RANESVDNYGMSFMNCDRlI MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 144): RANESVDNYGMSFMN
CDRl2 MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 145): AASNQGSCDR l 2 MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 145): AASNQGS
CDRl3 MAT 7 к PD-1 (SEQ ID NO: 146): QQSKEVPYTCDR l 3 MAT 7 to PD-1 (SEQ ID NO: 146): QQSKEVPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 7 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 143 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 7 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 143 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaagacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc atctcctgca gagccaacga aagtgttgat aattatggca tgagttttat gaactggttc caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatccatg ctgcatccaa ccaaggatcc ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tttgggacag acttcagcct caacatccat cctatggagg aggatgatgc tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa
2. Гуманизация моноклонального антитела к PD-1 человека 7, чтобы получить МАТ к hPD-1 7.2. Humanization of monoclonal antibody to human PD-1 7 to obtain mAb to hPD-1 7.
Вышеописанное мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека, МАТ 7 к PD-1, было гуманизировано и дополнительно деиммунизировано после идентификации антигенных эпитопов, чтобы продемонстрировать возможность гуманизации антитела к PD-1 человека с целью уменьшения его антигенности при введении человеку-реципиенту. В результате гуманизации получили два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 7 и VH2 MAT к hPD-1 7, и три гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 7, VL2 MAT к hPD-1 7 и VL3 MAT к hPD-1 7. Любой из гуманизированных доменов VL может быть спарен с любым из гуманизированных доменов VH. Соответственно, любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, спаренных с гуманизированным доменом VH, в общем называется МАТ к hPD-1 7, и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются со ссылкой на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 MAT к hPD-1 7 и VL2 MAT к hPD-1 1, в частности называется МАТ к hPD-1 7(1.2).The above-described murine monoclonal antibody to human PD-1, anti-PD-1 MAb 7, was humanized and further deimmunized after identification of antigenic epitopes to demonstrate the feasibility of humanizing an anti-human PD-1 antibody to reduce its antigenicity when administered to a human recipient. The humanization resulted in two humanized VH domains, designated herein as anti-hPD-1 MAb 7 VH1 and anti-hPD-1 MAb 7 VH2, and three humanized VL domains, designated herein as anti-hPD-1 MAb 7 VL1, anti-hPD-1 MAb 7 VL2, and anti-hPD-1 MAb 7 VL3. Any of the humanized VL domains may be paired with any of the humanized VH domains. Accordingly, any antibody comprising one of the humanized VL domains paired with a humanized VH domain is generally referred to as an anti-hPD-17 mAb, and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by reference to specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody comprising a VH1 anti-hPD-17 mAb and a VL2 anti-hPD-11 mAb is specifically referred to as an anti-hPD-17 mAb(1.2).
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of the VH1 MAT to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147) is shown below (CDRH residues are underlined):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGVQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREHIHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSYGTSPFAYWG QGTLVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH1 MAT к hPD-1 7, содержит последовательность,An exemplary polynucleotide that encodes VH1 MAT to hPD-1 7 contains the sequence,
- 30 047726 приведенную в SEQ ID NO: 148 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg gattggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc- 30 047726 given in SEQ ID NO: 148 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca ccaggcagg gtctggaatg gattggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc
Аминокислотная последовательность домена VH из VH2 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 149) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of the VH2 MAT to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 149) is shown below (CDRH residues are underlined):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWAGVQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWAGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSIHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH2 MAT к hPD-1 7, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 150 (нуклеотиды, кодирующие CDRH остатки, выделены подчеркиванием): caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg ggctggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctccAn exemplary polynucleotide that encodes a VH2 mAb to hPD-17 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 150 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): caagttcaat tggtacagag cggggcagag gtgaagaaac ccggcgccag tgttaaggtg tcctgcaaag ccagcggtta cagctttaca agctattgga tgaattgggt gcgtcaagca ccagggcagg gtctggaatg ggctggggtg atacatcctt ctgacagcga aacatggttg gaccagaaat ttaaagatcg tgtgacaatt acagtcgata agtccacaag cactgcttac atggaactct ccagcttgcg gtccgaggac accgctgtgt attattgcgc cagagagcac tacggcacat caccttttgc atactggggc cagggaactc tcgtaaccgt atcctcc
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 151) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of the hPD-1 MAT VL1 7 (SEQ ID NO: 151) is shown below (CDRH residues are underlined):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LLSLSPGERAT LSCRANESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI КLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI K
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL1 MAT к hPD-1 7, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 152 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaaatga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaaAn exemplary polynucleotide that encodes the hPD-1 7 MAT VL1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 152 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaaatga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
Аминокислотная последовательность домена VL из VL2 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 153) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of the VL2 MAT to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 153) is shown below (CDRH residues are underlined):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI КLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI K
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL2 MAT к hPD-1 7, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 154 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaaAn exemplary polynucleotide that encodes the VL2 mAb to hPD-17 has the sequence set forth in SEQ ID NO: 154 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccagggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
Аминокислотная последовательность домена VL из VL3 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 155) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL3 MAT to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 155) is shown below (CDR H residues are underlined):
- 31 047726- 31 047726
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNRGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI КEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNRGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI K
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL3 MAT к hPD-1 7, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 156 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaaAn exemplary polynucleotide that encodes the VL3 mAb to hPD-17 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 156 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaaatcgtac tcacccagtc acctgcaacc ctttctctga gccccggtga acgtgccact ctcagctgca gagcaagtga gagtgtggac aattacggca tgtccttcat gaactggttt cagcagaagc ctgggcagcc acctaagctg ctcatccacg ccgcctctaa ccgcggatct ggggtgcctt cacgtttttc tggatcagga agtggcactg acttcaccct tacaatcagc tctctggagc cagaggactt tgccgtctat ttctgccagc aatctaaaga ggtgccctat acttttggtg gcgggaccaa ggttgagatc aaa
CDRl1 домена VL из VL2 MAT к hPD-1 7 и VL3 МАТ к hPD-1 7 содержит замену аспарагина аминокислотой серином и содержит аминокислотную последовательность: ((SEQ ID NO:CDR l 1 of the VL domain from VL2 of MAT to hPD-1 7 and VL3 of MAT to hPD-1 7 contains a substitution of asparagine for the amino acid serine and contains the amino acid sequence: ((SEQ ID NO:
157), замененный серин выделен подчеркиванием). Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRL1 MAT 7 к PD-1, описанных выше. Помимо этого CDRL2 домена VL VL3 МАТ к hPD-1 7 содержит замену глутамина аминокислотой аргинином и содержит аминокислотную последовательность: ЛЛХХ5ХХ ((SEQ ID NO: 158), замененный аргинин выделен подчеркиванием). Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRL2 MAT 7 к PD-1, описанных выше.157), the substituted serine is underlined). According to the present invention, it is envisaged that a similar substitution can be included in any of the CDR L 1 domains of MAT 7 to PD-1 described above. In addition, CDR L 2 of the VL VL3 domain of MAT 7 to hPD-1 comprises a substitution of glutamine with the amino acid arginine and comprises the amino acid sequence: LLXX 5 XX ((SEQ ID NO: 158), the substituted arginine is underlined). According to the present invention, it is envisaged that a similar substitution can be included in any of the CDR L 2 domains of MAT 7 to PD-1 described above.
Н. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 8.H. Murine monoclonal antibody to human PD-1 8.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 159) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 159) is shown below (CDRH residues are underlined).
EGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVKQN HGKSLEWIGDEGQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFT DYYMNWVKQN HGKSLEWIGD
INPKNGDTHY NQKFKGEATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCASDF DYWGQGTTLT VSSINPKNGDTHY NQKFKGEATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCASDF DYWGQGTTLT VSS
CDRhI МАТ 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 161): DYYMNCDRhI MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 161): DYYMN
CDRH2 MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 162): DINPKNGDTHYNQKFKGCDR H 2 MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 162): DINPKNGDTHYNQKFKG
CDRh3 MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 163): DFDYCDRh3 MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 163): DFDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 8 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 160 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagaac catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta aaaatggtga cactcactac aaccagaagt tcaagggcga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagcgatttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 8 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 160 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gagggccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata tcctgtaagg cttctggata cacgttcact gactactaca tgaactgggt gaagcagaac catggaaaga gccttgagtg gattggagat attaatccta aaaatggtga cactcactac aaccagaagt tcaagggcga ggccacattg actgtagaca agtcctccac cacagcctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc gagcgatttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 164) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 164) is shown below (CDRL residues are underlined):
DWMTQTPLS LPVGLGDQAS ISCRSSQTLV YSNGNTYLNW FLQKPGQSPKDWMTQTPLS LPVGLGDQAS ISCRSSQTLV YSNGNTYLNW FLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP FTFGSGTKLE IKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP FTFGSGTKLE IK
CDRlI MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 166):CDRlI MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 166):
CDRl2 MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 167):CDR l 2 MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 167):
CDRl3 MAT 8 к PD-1 (SEQ ID NO: 168):CDR l 3 MAT 8 to PD-1 (SEQ ID NO: 168):
RSSQTLVYSNGNTYLNRSSQTLVYSNGNTYLN
KVSNRFSKVSNRFS
SQSTHVPFTSQSTHVPFT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 8 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 165 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 8 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 165 (nucleotides encoding CDRL residues are underlined):
- 32 047726 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gacccttgta tatagtaatg gaaacaccta tttaaattgg ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tatttetget ctcaaagtac acatgttcca ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa- 32 047726 gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtcg gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gacccttgta tatagtaatg gaaacaccta tttaaattgg ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tatttetget ctcaaagtac acatgttcca ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa
I. Моноклональное антитело к PD-1 человека 9.I. Monoclonal antibody to human PD-1 9.
1. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 9.1. Murine monoclonal antibody to human PD-1 9.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 169) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 169) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQT PEKRLEWVATEVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQT PEKRLEWVAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCARYGISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQISSLRSED TALYYCARYG
FDGAWFAYWG QGTLVTVSSFDGAWFAYWGQGTLVTVSS
CDRhI МАТ 9 к PD-1 (SEQ ГО NO: 171): SYLVSCDRhI MAT 9 to PD-1 (SEQ GO NO: 171): SYLVS
CDRH2 МАТ 9 kPD-1 (SEQ ГО NO: 172): TISGGGGNTYYSDSVKGCDR H 2 MAT 9 kPD-1 (SEQ ID NO: 172): TISGGGGNTYYSDSVKG
CDRh3 MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 173): YGFDGAWFAYCDRh3 MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 173): YGFDGAWFAY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 9 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 170 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 9 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 170 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat tcagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac etgeaaatea gcagtctgag gtctgaggac aeggeettgt attactgtgc aaggtatggt ttcgacggcg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctcttccgaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatcttg tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtggtaa cacctactat tcagaca gtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac etgeaaatea gcagtctgag gtctgaggac aeggeettgt attactgtgc aaggtatggt ttcgacggcg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctcttcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 174) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 174) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITCRASENIY SYLAWYQQKQ EKSPQLLVYNDIQMTQSPAS LSASVGDIVT ITCRASENIY SYLAWYQQKQ EKSPQLLVYN
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYCQH HYAVPWTFGG GTRLEITAKTLAAGVPS RFSGSGSGTQ FSLTINSLQP EDFGNYYCQH HYAVPWTFGG GTRLEIT
CDRlI MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 176): RASENIYSYLACDRlI MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 176): RASENIYSYLA
CDRl2 MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 177): NAKTLAACDR l 2 MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 177): NAKTLAA
CDRl3 MAT 9 к PD-1 (SEQ ID NO: 178): QHHYAVPWTCDR l 3 MAT 9 to PD-1 (SEQ ID NO: 178): QHHYAVPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 9 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 175 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 9 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 175 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc etatetgeat ctgtgggaga tattgtcacc atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag gaaaaatctc ctcagctcct ggtetataat gcaaaaacct tggcagcagg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggaattatta ctgtcagcat cattatgctg ttccgtggac gtteggtgga ggcaccagac tggaaatcac agacatccaga tgactcagtc tccagcctcc etatetgeat ctgtgggaga tattgtcacc atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag gaaaaatctc ctcagctcct ggtetataat gcaaaaacct tggcagcagg tgtgccatca aggttcagtg tggatc aggcacacag ttttctctga ccatcaacag cctgcagcct gaagattttg ggaattatta ctgtcagcat cattatgctg ttccgtggac gtteggtgga ggcaccagac tggaaatcac a
2. Гуманизация моноклонального антитела к PD-1 человека 9, чтобы получить МАТ к hPD-1 9.2. Humanization of monoclonal antibody to human PD-1 9 to obtain mAb to hPD-1 9.
Вышеописанное мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 9 гуманизировали и дополнительно деиммунизировали после идентификации антигенных эпитопов, чтобы продемонстрировать возможность гуманизации антитела к PD-1 человека с целью уменьшения его антигенности при введении человеку-реципиенту. В результате гуманизации получили два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящей заявке как VH1 MAT к hPD-1 9 и VH2 MAT к hPD-1 9, и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящей заявке как VL1 MAT к hPD-1 9 и VL2 MAT к hPD-1 9. Любой из гуманизированных доменов VL может быть спарен с гуманизированными доменами VH. Соответственно, любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, спаренных с гуманизироThe above-described murine monoclonal antibody to human PD-1 9 was humanized and further deimmunized after identification of antigenic epitopes to demonstrate the feasibility of humanizing an antibody to human PD-1 to reduce its antigenicity when administered to a human recipient. The humanization resulted in two humanized VH domains, designated herein as VH1 MAT to hPD-1 9 and VH2 MAT to hPD-1 9, and two humanized VL domains, designated herein as VL1 MAT to hPD-1 9 and VL2 MAT to hPD-1 9. Any of the humanized VL domains can be paired with humanized VH domains. Accordingly, any antibody comprising one of the humanized VL domains paired with a humanized
- 33 047726 ванным доменом VH, в общем случае называется МАТ к hPD-1 9, и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются со ссылкой на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 MAT к hPD-1 9 и VL2 MAT к hPD-1 9, в частности называется МАТ к hPD-1 9(1.2).- 33 047726 humanized VH domain is generally referred to as an anti-hPD-19 MAb, and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by reference to specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody comprising VH1 of an anti-hPD-19 MAb and VL2 of an anti-hPD-19 MAb is specifically referred to as an anti-hPD-19 MAb(1.2).
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hPD-1 9 (SEQ ID NO: 179) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of the VH1 MAT to hPD-1 9 (SEQ ID NO: 179) is shown below (CDR H residues are underlined):
EVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQA PGKGLEWVATEVQLVESGGG LVRPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVSWVRQA PGKGLEWVAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARYG FDGAWFAYWG QGTLVTVSSISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARYG FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH1 MAT к hPD-1 9, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 180 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgtcttgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH1 mAb to hPD-1 9 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 180 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggtgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgtcttgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg ggtggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccctgcg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
Аминокислотная последовательность домена VH из VH2 MAT к hPD-1 9 (SEQ ID NO: 181) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of the VH2 MAT to hPD-1 9 (SEQ ID NO: 181) is shown below (CDRH residues are underlined):
EVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVGWVRQA PGKGLEWTATEVQLVESGGG LARPGGSLKL SCAASGFTFS SYLVGWVRQA PGKGLEWTAT
ISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCARYG FDGAWFAYWG QGTLVTVSSISGGGGNTYY SDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSARAED TATYYCARYG FDGAWFAYWG QGTLVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH2 MAT к hPD-1 9, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 182 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgggctgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg gacggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctccAn exemplary polynucleotide that encodes a VH2 mAb to hPD-19 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 182 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaggtgcagc tggtggaaag tgggggcggc ctggcgcgac ccgggggaag tctgaaactg tcctgtgcag catcaggatt tactttttca tcttatctcg tgggctgggt aagacaagca cccggaaaag gcttggaatg gacggccact atctccggtg gaggtggcaa cacctactat agcgacagtg tcaagggaag atttaccatc agtcgcgaca acgctaagaa tagcctgtac ctccagatga actccgcacg cgccgaggac accgccacct attactgtgc acgctatgga tttgacggcg catggtttgc ctactgggga cagggcacat tggtaaccgt tagctcc
CDRH1 домена VH из VH2 MAT к hPD-1 9 содержит замену серина аминокислотой глицином и содержит аминокислотную последовательность: sylv-((SEQ ID NO: 183), замененный глицин выделен подчеркиванием). Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRH1 MAT 9 к PD-1, описанных выше.CDRH1 of the VH domain of VH2 of MAT to hPD-1 9 comprises a substitution of serine with the amino acid glycine and comprises the amino acid sequence: sylv - ((SEQ ID NO: 183), the substituted glycine is underlined). According to the present invention, it is envisaged that a similar substitution may be included in any of the CDRH1 domains of MAT 9 to PD-1 described above.
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 МАТ к hPD-1 9 (SEQ ID NO: 184) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of the hPD-1 mAb VL1 9 (SEQ ID NO: 184) is shown below (CDRH residues are underlined):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SYLAWYQQKP GKAPKLLIYNDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY SYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ GTKLEIKAKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ GTKLEIK
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL1 MAT к hPD-1 9, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 185 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacaac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa aAn exemplary polynucleotide that encodes the VL1 mAb to hPD-19 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 185 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat tcatacctcg cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacaac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa a
Аминокислотная последовательность домена VL из VL2 MAT к hPD-1 9 (SEQ ID NO: 186) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of the VL2 MAT to hPD-1 9 (SEQ ID NO: 186) is shown below (CDRH residues are underlined):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYDDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASENIY NYLAWYQQKP GKAPKLLIYD
AKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ GTKLEIKAKTLAAGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYAVPWTFGQ GTKLEIK
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL2 MAT к hPD-1 9, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 187 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL2 MAT to hPD-1 9 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 187 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
- 34 047726 gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacgac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgccaagt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa a- 34 047726 gacattcaga tgactcagtc tcccagcagt ctgtccgcat ccgtggggga tcgggtcacc atcacctgcc gtgcctcaga aaacatctat aactacctcg cctggtatca acagaaacct ggtaaagccc caaaattgct catttacgac gccaagaccc tcgcagctgg cgtgcca agt aggttctcag gcagcggctc agggacagat ttcaccctca ccatatcctc actgcagccc gaggattttg ccacttacta ctgccagcat cattacgcag tgccctggac cttcggacaa ggcactaagc tcgagatcaa a
CDRL1 домена VL из VL2 MAT к hPD-1 9 содержит замену серина аминокислотой аспарагином и содержит аминокислотную последовательность: kaseniynyla (SEQ id NO: 188), замененный аспарагин выделен подчеркиванием).CDRL1 of the VL domain of the VL2 MAT to hPD-1 9 contains a substitution of serine by the amino acid asparagine and contains the amino acid sequence: kaseniynyla (SEQ ID NO: 188), the substituted asparagine is underlined).
Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRL1 MAT 9 к PD-1, описанных выше. CDRL2 домена VL из VL2 MAT к hPD-1 9 содержит замену аспарагина аминокислотой аспартатом и содержит аминокислотную последовательность: daktlaa((SEQ ID\() 189), замененный аспартат выделен подчеркиванием). Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRL2 MAT 7 к PD-1, описанных выше.According to the present invention, it is envisaged that the same substitution may be included in any of the CDRL1 domains of MAT 9 to PD-1 described above. CDRL2 of the VL domain of VL2 MAT 9 to hPD-1 comprises a substitution of asparagine with the amino acid aspartate and comprises the amino acid sequence: daktlaa ((SEQ ID\() 189), the substituted aspartate is underlined). According to the present invention, it is envisaged that the same substitution may be included in any of the CDRL2 domains of MAT 7 to PD-1 described above.
J. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 10.J. Murine monoclonal antibody to human PD-1 10.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 10 к PD-1 (SEQ ID NO: 190) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 10 to PD-1 (SEQ ID NO: 190) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMSWVRQT PEKRLEWVAS ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCARQE LAFDYWGQGT TLTVSSEVILVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS NYLMSWVRQT PEKRLEWVAS ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRSED TALYYCARQE LAFDYWGQGT TLTVSS
CDRhI МАТ 10 к PD-1 (SEQ Ш NO: 192): NYLMSCDRhI MAT 10 to PD-1 (SEQ Ш NO: 192): NYLMS
CDRH2 МАТ 10 kPD-1 (SEQ Ш NO: 193): SISGGGSNIYYPDSVKGCDR H 2 MAT 10 kPD-1 (SEQ Ш NO: 193): SISGGGSNIYYPDSVKG
CDRH3 MAT 10 к PD-1 (SEQ Ш NO: 194): QELAFDYCDR H 3 MAT 10 to PD-1 (SEQ Ш NO: 194): QELAFDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 10 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 191 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaagt attagtggtg gtggtagtaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagaa ctggcttttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 10 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 191 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaagtgatac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatctca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaagt attagtggtg gtggtagtaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg attcaccata tccagggaca atgccaagaa caccctgtac ctgcaaatga acagtctgag gtctgaggac acggccttgt attactgtgc aagacaagaa ctggcttttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 10 к PD-1 (SEQ ID NO: 195) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 10 to PD-1 (SEQ ID NO: 195) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRTSQDIS NFLNWYQQKP DGTIKLLIYYDIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRTSQDIS NFLNWYQQKP DGTIKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GSTLPWTFGG GTKLEIITSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GSTLPWTFGG GTKLEII
CDRl1 MAT 10 к PD-1 (SEQ ID NO: 197): RTSQDISNFLNCDR l 1 MAT 10 to PD-1 (SEQ ID NO: 197): RTSQDISNFLN
CDRl2 MAT 10 к PD-1 (SEQ Ш NO: 198): YTSRLHSCDR l 2 MAT 10 to PD-1 (SEQ Ш NO: 198): YTSRLHS
CDRl3 MAT 10 к PD-1 (SEQ Ш NO: 199): QQGSTLPWTCDR l 3 MAT 10 to PD-1 (SEQ Ш NO: 199): QQGSTLPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 10 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 196 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 10 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 196 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca ggacaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcat agatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca ggacaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca gatggaacta ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc t ggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtagtacgc ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcat a
- 35 047726- 35 047726
K. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 11.K. Murine monoclonal antibody to human PD-1 11.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 11 к PD-1 (SEQ ID NO: 200) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 11 to PD-1 (SEQ ID NO: 200) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMHWVKQR PGQGLKWMGA IYPGNSDTHY NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTTGT YSYFDVWGTG TTVTVSSEVQLQQSGTV LARPGASVKM SCKTSGYTFT GYWMHWVKQR PGQGLKWMGA IYPGNSDTHY NQKFKGKAKL TAVTSASTAY MELSSLTNED SAIYYCTTGT YSYFDVWGTG TTVTVSS
CDRhI МАТ 11 к PD-1 (SEQ Ш NO: 202): GYWMHCDRhI MAT 11 to PD-1 (SEQ Ш NO: 202): GYWMH
CDRH2 МАТ 11 к PD-1 (SEQ Ш NO: 203): AI YPGNSDTHYNQKFKGCDR H 2 MAT 11 to PD-1 (SEQ Ш NO: 203): AI YPGNSDTHYNQKFKG
CDRH3 МАТ 11 к PD-1 (SEQ Ш NO: 204): GTYS YFDVCDR H 3 MAT 11 to PD-1 (SEQ Ш NO: 204): GTYS YFDV
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 11 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 201 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga tgcactgggt aaaacagagg cctggacagg gtctgaaatg gatgggggct atttatcctg gaaatagtga tactcactac aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tactgggacc tactcgtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc aAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 11 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 201 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaaga cttctggcta cacatttacc ggctactgga tgcactgggt aaaacagagg cctggacagg gtctgaaatg gatgggggct atttatcctg gaaatagtga tactcactac aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcgatct attactgtac tactgggacc tactcgtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc a
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 11 к PD-1 (SEQ ID NO: 205) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 11 to PD-1 (SEQ ID NO: 205) is shown below (CDR L residues are underlined):
DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TSIHWYQHRT NGSPRLLIKYDILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TSIHWYQHRT NGSPRLLIKY
ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SNSWLTFGAG TKLELKASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ SNSWLTFGAG TKLELK
CDRlI MAT И к PD-1 (SEQ Ш NO: 207): RASQSIGTSIHCDRlI MAT AND to PD-1 (SEQ Ш NO: 207): RASQSIGTSIH
CDRl2 MAT И к PD-1 (SEQ Ш NO: 208): YASES ISCDR l 2 MAT AND to PD-1 (SEQ Ш NO: 208): YASES IS
CDRl3 MAT 11 к PD-1 (SEQ Ш NO: 209): QQSNSWLTCDR l 3 MAT 11 to PD-1 (SEQ Ш NO: 209): QQSNSWLT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 11 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 206 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием): gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcacagaaca aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc aggtttagtg gcagtggatc agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaaAn exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 11 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 206 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined): gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaga aagagtcagt ttctcctgca gggccagtca gagcattggc acaagcatac actggtatca gcacagaaca aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gatcccttcc aggtttagtg gcagtggatc agggactgat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa agtaatagct ggctcacgtt cggtgctggg accaagctgg agctgaaa
L. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 12.L. Murine monoclonal antibody to human PD-1 12.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 12 к PD-1 (SEQ ID NO: 210) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 12 to PD-1 (SEQ ID NO: 210) is shown below (CDRH residues are underlined).
QGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMHWVKQT PVHGLEWIGTQGHLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGFTFT DYEMHWVKQT PVHGLEWIGT
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSRER ITTWEGAYW YFDVWGTGTT VTVSSIDPETGGTAY NQKFKGKAIL TVDKSSTTTY MELRSLTSED SAVFYCSRER ITTWEGAYW YFDVWGTGTT VTVSS
CDRhI MAT 12 к PD-1 (SEQ ID NO: 212): DYEMHCDRhI MAT 12 to PD-1 (SEQ ID NO: 212): DYEMH
CDRH2 MAT 12 к PD-1 (SEQ Ш NO: 213): TIDPETGGTAYNQKFKGCDR H 2 MAT 12 to PD-1 (SEQ Ш NO: 213): TIDPETGGTAYNQKFKG
CDRh3 MAT 12 к PD-1 (SEQ Ш NO: 214): ERITTVVEGAYWYFDVCDRh3 MAT 12 to PD-1 (SEQ Ш NO: 214): ERITTVVEGAYWYFDV
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 12 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 211 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 12 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 211 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
- 36 047726 cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga tgcactgggt gaaacagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattgggact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aagagagagg attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tctggggс a c agggaccacg gtcaccgtct cctca- 36 047726 cagggtcacc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg tcctgcaagg cttcgggctt cacatttact gactatgaga tgcactgggt gaaacagaca cctgtgcatg gcctggaatg gattgggact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac aatcagaagt tcaagggcaa ggccatactg acagtagaca aatcttccac tacaacctac atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct tttattgttc aagagagagg attactacgg ttgttgaggg ggcatactgg tacttcgatg tctggggс a c agggaccacg gtcaccgtct cctca
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 4 к PD-1 (SEQ ID NO: 215) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 4 to PD-1 (SEQ ID NO: 215) is shown below (CDR L residues are underlined):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLICKVSTRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP IYTFGGGTKLE IKDVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQNIV HSNGNTYLEW YLQKPGQSPK LLICKVSTRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP IYTFGGGTKLE IK
CDRlI MAT 12 к PD-1 (SEQ Ш NO: 217): RSSQNIVHSNGNTYLECDRlI MAT 12 to PD-1 (SEQ Ш NO: 217): RSSQNIVHSNGNTYLE
CDRl2 MAT 12 к PD-1 (SEQ ID NO: 218): KVSTRFSCDR l 2 MAT 12 to PD-1 (SEQ ID NO: 218): KVSTRFS
CDRl3 MAT 12 к PD-1 (SEQ TO NO: 219): FQGSHVPYTCDR l 3 MAT 12 to PD-1 (SEQ TO NO: 219): FQGSHVPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 12 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 216 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 12 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 216 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct gcaaagtttc cacccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tattattget ttcaaggttc acatgttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaagatgttttga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatetagtea gaacattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct gcaaagtttc cacccgattt tctggggtcc cagacaggtt ca gtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggetgagga tctgggagtt tattattget ttcaaggttc acatgttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa
М. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 13.M. Murine monoclonal antibody to human PD-1 13.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 13 к PD-1 (SEQ ID NO: 220) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 13 to PD-1 (SEQ ID NO: 220) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMSWVRQT PEKRLEWVAT ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCARQA YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS SEVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SHTMSWVRQT PEKRLEWVAT ISGGGSNIYY PDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCARQA YYGNYWYFDV WGTGTTVTVS S
CDRhI МАТ 13 к PD-1 (SEQ ID NO: 222): SHTMSCDRhI MAT 13 to PD-1 (SEQ ID NO: 222): SHTMS
CDRH2 MAT 13 к PD-1 (SEQ Ш NO: 223): TISGGGSNIYYPDSVKGCDR H 2 MAT 13 to PD-1 (SEQ Ш NO: 223): TISGGGSNIYYPDSVKG
CDRh3 MAT 13 к PD-1 (SEQ Ш NO: 224): QAYYGNYWYFDVCDRh3 MAT 13 to PD-1 (SEQ Ш NO: 224): QAYYGNYWYFDV
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 13 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 221 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggttctaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac etgeaaatga gcagtctgag gtctgaggac aeggeettgt attactgtgc aagacaagct tactacggta attactggta ettegatgte tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc tccAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 13 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 221 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agccatacca tgtcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggttctaa tatctactat ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac etgeaaatga gcagtctgag gtctgaggac aeggeettgt attactgtgc aagacaagct tactacggta attactggta ettegatgte tggggcacag ggaccacggt caccgtctcc tcc
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 13 к PD-1 (SEQ ID NO: 225) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 13 to PD-1 (SEQ ID NO: 225) is shown below (CDR L residues are underlined):
- 37 047726- 37 047726
DIQMTQSPAT QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYADIQMTQSPAT QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYCQQ LDSIPWTFGG GTKLEIKATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVSYYCQQ LDSIPWTFGG GTKLEIK
CDRlI MAT 13 к PD-1 (SEQ Ш NO: 227): LASQTIGTWLACDRlI MAT 13 to PD-1 (SEQ Ш NO: 227): LASQTIGTWLA
CDRl2 MAT 13 к PD-1 (SEQ ID NO: 228): AATSLADCDR l 2 MAT 13 to PD-1 (SEQ ID NO: 228): AATSLAD
CDRl3 MAT 13 к PD-1 (SEQ Ш NO: 229): QQLDSIPWTCDR l 3 MAT 13 to PD-1 (SEQ Ш NO: 229): QQLDSIPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 13 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 226 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием): gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc atcacgtgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa cttgacagta ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa aAn exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 13 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 226 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined): gacattcaga tgacccagtc tcctgccacc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc atcacgtgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taagttatta ctgtcaacaa cttgacagta ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa a
N. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 14.N. Murine monoclonal antibody to human PD-1 14.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 14 к PD-1 (SEQ ID NO: 230) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 14 to PD-1 (SEQ ID NO: 230) is shown below (CDR H residues are underlined).
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWITWVKQR PGQGLQWIGN IYPGTDGTTY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCATGL HWYFDVWGTG TTVTVSSQVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYNFI SYWITWVKQR PGQGLQWIGN IYPGTDGTTY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MHLSRLTSED SAVYYCATGL HWYFDVWGTG TTVTVSS
CDRhI МАТ 14 kPD-1 (SEQ ID NO: 232): SYWITCDRhI MAT 14 kPD-1 (SEQ ID NO: 232): SYWIT
CDRH2 MAT 14 к PD-1 (SEQ Ш NO: 233): NIYPGTDGTTYNEKFKSCDR H 2 MAT 14 to PD-1 (SEQ Ш NO: 233): NIYPGTDGTTYNEKFKS
CDRH3 MAT 14 к PD-1 (SEQ Ш NO: 234): GLHWYFDVCDR H 3 MAT 14 to PD-1 (SEQ Ш NO: 234): GLHWYFDV
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 14 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 231 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga taacctgggt gaaacagagg cctggacaag gccttcagtg gattggaaat atttatcctg gtactgatgg tactacctac aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac atgcacctca gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aactgggcta cactggtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc cAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 14 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 231 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgaagatg tcctgcaagg cttctggcta caacttcatc agctactgga taacctgggt gaaacagagg cctggacaag gccttcagtg gattggaaat atttatcctg gtactgatgg tactacctac aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca catcctccag cacagcctac atgcacctca gtcgcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aactgggcta cactggtact tcgatgtctg gggcacaggg accacggtca ccgtctcctc c
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 14 к PD-1 (SEQ ID NO: 235) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 14 to PD-1 (SEQ ID NO: 235) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQSVG TNVAWYQQKP GQSPKALIYSDIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQSVG TNVAWYQQKP GQSPKALIYS
ASSRFSGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNSYPYTFGG GTKLEIKASSRFSGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNSYPYTFGG GTKLEIK
CDRlI MAT 14 к PD-1 (SEQ Ш NO: 237): KASQSVGTNVACDRlI MAT 14 to PD-1 (SEQ Ш NO: 237): KASQSVGTNVA
CDRl2 MAT 14 к PD-1 (SEQ Ш NO: 238): SASSRFSCDR l 2 MAT 14 to PD-1 (SEQ Ш NO: 238): SASSRFS
CDRl3 MAT 14 к PD-1 (SEQ Ш NO: 239): QQYNSYPYTCDR l 3 MAT 14 to PD-1 (SEQ Ш NO: 239): QQYNSYPYT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 14 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 236 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием): gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt gtcacctgca aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaagccc ggtcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctccc gattcagtgg cgtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa aAn exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 14 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 236 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined): gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt gtcacctgca aggccagtca gagtgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaagccc ggtcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctccc gattcagtgg cgtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagtaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggaaataaa a
- 38 047726- 38 047726
O. Моноклональное антитело к PD-1 человека 15.O. Monoclonal antibody to human PD-1 15.
1. Мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека 15.1. Murine monoclonal antibody to human PD-1 15.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT 15 к PD-1 (SEQ ID NO: 240) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT 15 to PD-1 (SEQ ID NO: 240) is shown below (CDR H residues are underlined).
EVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLISWVRQT PEKRLEWVAA ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTRRG TYAMDYWGQG TSVTVSSEVMLVESGGG LVKPGGSLKL SCAASGFIFS SYLISWVRQT PEKRLEWVAA ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSED TALYYCTRRG TYAMDYWGQG TSVTVSS
CDRhI МАТ 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 242): SYLISCDRhI MAT 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 242): SYLIS
CDRH2 MAT 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 243): AISGGGADTYYADSVKGCDR H 2 MAT 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 243): AISGGGADTYYADSVKG
CDRH3 MAT 15 к PD-1 (SEQ Ш NO: 244): RGTYAMDYCDR H 3 MAT 15 to PD-1 (SEQ Ш NO: 244): RGTYAMDY
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VH MAT 15 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 241 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgctgcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat gccgacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aagacgaggg acctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc cAn exemplary polynucleotide that encodes the VH domain of MAT 15 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 241 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatctca tctcttgggt tcgccagact ccggagaaga ggctggagtg ggtcgctgcc attagtggtg gtggtgctga cacctactat gccgacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtat ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccttat attactgtac aagacgaggg acctatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc c
Аминокислотная последовательность домена VL MAT 15 к PD-1 (SEQ ID NO: 245) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT 15 to PD-1 (SEQ ID NO: 245) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYADIQMTQSPAS QSASLGESVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKSPQLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYCQQ LYSIPWTFGG GTKLEIKATSLADGVPS RFSGSGSGTK FSFKISSLQA EDFVNYYCQQ LYSIPWTFGG GTKLEIK
CDRlI MAT 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 247): LASQTIGTWLACDRlI MAT 15 kPD-1 (SEQ Ш NO: 247): LASQTIGTWLA
CDRl2 MAT 15 к PD-1 (SEQ ID NO: 248): AATSLADCDR l 2 MAT 15 to PD-1 (SEQ ID NO: 248): AATSLAD
CDRl3 MAT 15 kPD-1 (SEQ ГО NO: 249): QQLYSIPWTCDR l 3 MAT 15 kPD-1 (SEQ GO NO: 249): QQLYSIPWT
Примерный полинуклеотид, который кодирует домен VL MAT 15 к PD-1, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 246 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRL, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes the VL domain of MAT 15 to PD-1 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 246 (nucleotides encoding CDR L residues are underlined):
gacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctgggaga aagtgtcacc atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tggcacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taaattatta ctgtcaacaa ctttacagta ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa agacattcaga tgacccagtc tcccgcctcc cagtctgcat ctctggggaga aagtgtcacc atcacatgcc tggcaagtca gaccattggt acatggttag catggtatca gcagaaacca gggaaatctc ctcagctcct gatttatgct gcaaccagct tggcagatgg ggtcccatca aggttcagtg gtagtggatc tgg cacaaaa ttttctttca agatcagcag cctacaggct gaagattttg taaattatta ctgtcaacaa ctttacagta ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa a
2. Гуманизация моноклонального антитела к PD-1 человека 15, чтобы получить МАТ к hPD-1 15.2. Humanization of monoclonal antibody to human PD-1 15 to obtain mAb to hPD-1 15.
Вышеописанное мышиное моноклональное антитело к PD-1 человека было гуманизировано и дополнительно деиммунизировано после идентификации антигенных эпитопов, чтобы продемонстрировать возможность гуманизации антитела к PD-1 человека с целью уменьшения его антигенности при введении человеку-реципиенту. В результате гуманизации получили один гуманизированный домен VH, обозначенный в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 2, и один гуманизированный домен VL, обозначенный в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 1. Антитело, содержащее гуманизированный домен VL, спаренный с гуманизированным доменом VH, называется МАТ к hPD-1 15.The above-described murine monoclonal antibody to human PD-1 was humanized and further deimmunized after identification of antigenic epitopes to demonstrate the feasibility of humanizing an antibody to human PD-1 to reduce its antigenicity when administered to a human recipient. The humanization resulted in one humanized VH domain, designated herein as VH1 mAb to hPD-1 2, and one humanized VL domain, designated herein as VL1 mAb to hPD-1 1. An antibody comprising a humanized VL domain paired with a humanized VH domain is referred to as mAb to hPD-1 15.
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hPD-1 15 (SEQ ID NO: 250) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of the VH1 MAT to hPD-1 15 (SEQ ID NO: 250) is shown below (CDRH residues are underlined):
EVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAAEVQLVESGGG LVRPGGSLRL SCAASGFTFS SYLISWVRQA PGKGLEWVAA
ISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRGISGGGADTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TATYYCARRG
TYAMDYWGQG TLVTVSSTYAMDYWGQG TLVTVSS
Примерный полинуклеотид, который кодирует VH1 MAT к hPD-1 15, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 251 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием):An exemplary polynucleotide that encodes VH1 MAT to hPD-1 15 comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 251 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined):
- 39 047726 gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctcttgggt gcgccaagcc ccaggtaagg gccttgaatg ggtcgccgcc attagtgggg gtggtgccga tacatattat gccgacagcg tcaagggacg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccggcgcggg acttacgcta tggactattg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c- 39 047726 gaagtgcaac tggttgaaag tggcggcggg ctggtgcggc caggtggttc actcagactg tcttgtgcag cttcaggctt tacattctcc tcttatctta tctcttgggt gcgccaagcc ccaggtaagg gccttgaatg ggtcgccgcc attagtgggg gtggtgcc ga tacatattat gccgacagcg tcaagggacg tttcaccatc agcagggaca acgccaagaa tagcctttac ctgcagatga actcacttag agctgaagac accgctactt attactgtgc ccggcgcggg acttacgcta tggactattg gggccagggc accttggtca ctgtctcatc c
Аминокислотная последовательность домена VH из VL1 MAT к hPD-1 15 (SEQ ID NO: 252) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain from VL1 MAT to hPD-1 15 (SEQ ID NO: 252) is shown below (CDR H residues are underlined):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKAPKLLIYADIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCLASQTIG TWLAWYQQKP GKAPKLLIYA
ATSLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYCQQ LYSIPWTFGQ GTKLEIKATSLADGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDFATYYCQQ LYSIPWTFGQ GTKLEIK
Примерный полинуклеотид, который кодирует VL1 MAT к hPD-1 15, содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 253 (нуклеотиды, кодирующие остатки CDRH, выделены подчеркиванием): gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc atcacctgtc tggccagtca gaccattgga acctggctcg cctggtatca gcagaaacct ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagatgg agtgccctcc cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc gaggatttcg ctacatacta ctgtcaacag ctctactcca ttccatggac ctttggtcag ggtactaaac tggagatcaa aAn exemplary polynucleotide that encodes the VL1 mAb to hPD-1 15 has the sequence set forth in SEQ ID NO: 253 (nucleotides encoding CDRH residues are underlined): gatatccaga tgacccagtc tcccagctct ctcagtgcaa gcgtaggcga ccgtgtgacc atcacctgtc tggccagtca gaccattgga acctggctcg cctggtatca gcagaaacct ggcaaggccc ctaagctgct gatttacgcc gccacctccc tcgcagatgg agtgccctcc cgatttagcg ggtccgggtc cggcaccgac ttcacattca caatcagcag cctccagccc gaggatttcg ctacatacta ctgtcaacag ctctactcca ttccatggac ctttggtcag ggtactaaac tggagatcaa a
V. Моноклональные антитела к PD-1 человеку 1-15 и их производные, содержащие модифицированную область Fc.V. Monoclonal antibodies to human PD-1 1-15 and their derivatives containing a modified Fc region.
При нормальном функционировании иммунной системы взаимодействие комплексов антителоантиген с клетками иммунной системы приводит к широкому спектру ответов, начиная от эффекторных функций, таких как зависимая от антител цитотоксичность, дегрануляция тучных клеток и фагоцитоз, до иммуномодулирующих сигналов, таких как регулирование пролиферации лимфоцитов и секреции антител. Все указанные взаимодействия инициируются путем связывания области Fc антител или иммунных комплексов со специализированными поверхностными рецепторами клеток на кроветворных клетках. Разнообразие клеточных ответов, вызванных антителами и иммунными комплексами, обусловлено структурной гетерогенностью трех рецепторов Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) и FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) и FcyRIII (CD16) являются активирующими (т.е. усиливающими иммунную систему) рецепторами; FcyRIIB (CD32B) является ингибирующим (т.е. ослабляющим иммунную систему) рецептором. Помимо этого взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) выступает посредником рециркуляции молекул IgG из эндосомы к поверхности клетки и высвобождения в кровь. Аминокислотная последовательность примерного IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), IgG3 (SEQ ID NO: 3) и IgG4 (SEQ ID NO: 4) представлена ниже.During normal immune system function, interactions of antibody–antigen complexes with immune cells result in a wide range of responses, ranging from effector functions such as antibody-dependent cytotoxicity, mast cell degranulation, and phagocytosis to immunomodulatory signals such as regulation of lymphocyte proliferation and antibody secretion. All of these interactions are initiated by binding of the Fc region of antibodies or immune complexes to specialized cell surface receptors on hematopoietic cells. The diversity of cellular responses elicited by antibodies and immune complexes is due to the structural heterogeneity of the three Fc receptors: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), and FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), and FcyRIII (CD16) are activating (i.e., immune-enhancing) receptors; FcγRIIB (CD32B) is an inhibitory (i.e., weakening the immune system) receptor. In addition, interaction with the neonatal Fc receptor (FcRn) mediates the recycling of IgG molecules from the endosome to the cell surface and release into the blood. The amino acid sequence of exemplary wild-type IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), IgG3 (SEQ ID NO: 3), and IgG4 (SEQ ID NO: 4) is shown below.
Модификация области Fc обычно приводит к измененному фенотипу, например, измененному периоду полувыведения из сыворотки крови, измененной стабильности, измененной восприимчивости к клеточным ферментам или измененной эффекторной функции. Желательной может быть модификация антитела или другой связывающей молекулы согласно настоящему изобретению в отношении эффекторной функции, например, для того чтобы повысить эффективность указанной молекулы в лечении рака. Снижение или устранение эффекторной функции является желательным в некоторых случаях, например, в случае антител, механизм действия которых включает блокирование или антагонистическое действие, но не лизис клеток, несущих антиген-мишень. Повышенная эффекторная функция обычно является желательной, когда она направлена на нежелательные клетки, такие как опухолевые и чужеродные клетки, в которых FcyR экспрессируются с низкими уровнями, например, опухолеспецифичные В-клетки с низким уровнем FcyRIIB (например, неходжкинская лимфома, CLL и лимфома Беркитта). В указанных вариантах реализации молекулы согласно настоящему изобретению, которым придали или которые имеют измененную эффекторную функциональную активность, можно применять для лечения и/или предотвращения заболевания, расстройства или инфекции, при которых желательной является повышенная эффективность эффекторной функциональной активности.Modification of the Fc region typically results in an altered phenotype, such as altered serum half-life, altered stability, altered susceptibility to cellular enzymes, or altered effector function. It may be desirable to modify an antibody or other binding molecule of the present invention with respect to effector function, for example, in order to increase the efficacy of said molecule in the treatment of cancer. Reduction or elimination of effector function is desirable in some cases, for example, in the case of antibodies whose mechanism of action includes blocking or antagonizing, but not lysing, cells bearing the target antigen. Increased effector function is typically desirable when it is directed to unwanted cells, such as tumor and foreign cells in which FcyRs are expressed at low levels, for example, tumor-specific B cells with low levels of FcyRIIB (e.g., non-Hodgkin's lymphoma, CLL, and Burkitt's lymphoma). In these embodiments, molecules of the present invention that have been rendered or have altered effector functional activity may be used to treat and/or prevent a disease, disorder or infection in which increased efficacy of effector functional activity is desired.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат область Fc, которая содержит одну или более модификаций (например, замен, делеций или вставок) в аминокислотной последовательности области Fc дикого типа (например, SEQ ID NO: 1), которые снижают аффинность и авидность области Fc, и, соответственно, молекулы согласно настоящему изобретению, в отношении одного или более рецепторов FcyR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения молекулы согласно настоящему изобретениюIn some embodiments, the PD-1 binding molecules of the invention comprise an Fc region that comprises one or more modifications (e.g., substitutions, deletions, or insertions) in the amino acid sequence of the wild-type Fc region (e.g., SEQ ID NO: 1) that reduce the affinity and avidity of the Fc region, and thus the molecule of the invention, for one or more FcyR receptors. In other embodiments, the molecules of the invention
- 40 047726 содержат область Fc, которая содержит одну или более модификаций аминокислот области Fc дикого типа, которые увеличивают аффинность и авидность области Fc и, соответственно, молекулы согласно настоящему изобретению, в отношении одного или более рецепторов FcyR. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения молекулы содержат вариант области Fc, причем указанный вариант придает или опосредует повышенную активность, связанную с антитело-зависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), и/или повышенное связывание с FcyRIIA по сравнению с молекулой, не содержащей область Fc или содержащей область Fc дикого типа. В других вариантах реализации настоящего изобретения молекулы содержат вариант области Fc, причем указанный вариант придает или опосредует сниженную активность АЗКЦ (или другой эффекторной функции) и/или повышенное связывание с FcyRIIB по сравнению с молекулой, не содержащей область Fc или содержащей область Fc дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации в область настоящего изобретения включены PD-1-связывающие молекулы, содержащие вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc не проявляет детектируемого связывания с любым FcyR по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей область Fc дикого типа. Согласно другим вариантам реализации в область настоящего изобретения включены PD-1связывающие молекулы, содержащие вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc связывается только с одним FcyR, предпочтительно с одним из FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIIIA. Любое подходящее повышение аффинности и/или авидности предпочтительно оценивают путем измерения в условиях in vitro степени детектируемого связывания с FcyR или FcYR-связанной активности в клетках, которые экспрессируют низкие уровни FcyR, когда активность связывания исходной молекулы (без модифицированной области Fc) не поддается детектированию в клетках, или в клетках, которые экспрессируют целевые антигены, отличные от рецепторов Fcy в плотности от 30000 до 20000 молекул/клетку, в плотности от 20000 до 10000 молекул/клетку, в плотности от 10000 до 5000 молекул/клетку, в плотности от 5000 до 1000 молекул/клетку, в плотности от 1000 до 200 молекул/клетку или в плотности 200 молекул/клетку или менее (но не менее 10, 50, 100 или 150 молекул/клетку). PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать вариант области Fc, имеющий измененную аффинность в отношении активирующего и/или ингибирующего рецептора Fcy. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула содержит вариант области Fc, который имеет повышенную аффинность в отношении FcyRIIB и сниженную аффинность в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей область Fc дикого типа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула согласно настоящему изобретению, содержит вариант области Fc, который имеет уменьшенную аффинность в отношении FcyRIIB и повышенную аффинность в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей область Fc дикого типа. В другом варианте реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, который имеет уменьшенную аффинность в отношении FcyRIIB и уменьшенную аффинность в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей область Fc дикого типа. В другом варианте реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, который имеет неизменную аффинность в отношении FcyRIIB и уменьшенную (или повышенную) аффинность в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA относительно сопоставимой молекулы, содержащей область Fcy дикого типа.- 40 047 726 comprise an Fc region that comprises one or more amino acid modifications of a wild-type Fc region that increase the affinity and avidity of the Fc region, and thus the molecule of the present invention, for one or more FcyR receptors. According to other embodiments of the present invention, the molecules comprise a variant Fc region, wherein the variant confers or mediates increased antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity and/or increased binding to FcyRIIA compared to a molecule that lacks an Fc region or that comprises a wild-type Fc region. In other embodiments of the present invention, the molecules comprise a variant Fc region, wherein the variant confers or mediates decreased ADCC activity (or other effector function) and/or increased binding to FcyRIIB compared to a molecule that lacks an Fc region or that comprises a wild-type Fc region. In some embodiments, the present invention includes within its scope PD-1 binding molecules comprising a variant Fc region, wherein said variant Fc region exhibits no detectable binding to any FcyR, compared to a comparable molecule comprising a wild-type Fc region. In other embodiments, the present invention includes within its scope PD-1 binding molecules comprising a variant Fc region, wherein said variant Fc region binds to only one FcyR, preferably one of FcyRIIA, FcyRIIB, or FcyRIIIA. Any suitable increase in affinity and/or avidity is preferably assessed by measuring in vitro the extent of detectable binding to FcyR or FcYR-related activity in cells that express low levels of FcyR, where binding activity of the parent molecule (without the modified Fc region) is not detectable in the cells, or in cells that express target antigens other than Fcy receptors at a density of 30,000 to 20,000 molecules/cell, at a density of 20,000 to 10,000 molecules/cell, at a density of 10,000 to 5,000 molecules/cell, at a density of 5,000 to 1,000 molecules/cell, at a density of 1,000 to 200 molecules/cell, or at a density of 200 molecules/cell or less (but not less than 10, 50, 100, or 150 molecules/cell). The PD-1 binding molecules of the present invention may comprise a variant Fc region having an altered affinity for the activating and/or inhibitory receptor Fcy. In one embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule comprises a variant Fc region that has an increased affinity for FcyRIIB and a decreased affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA compared to a comparable molecule comprising a wild-type Fc region. In another embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention comprises a variant Fc region that has a decreased affinity for FcyRIIB and an increased affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA compared to a comparable molecule comprising a wild-type Fc region. In another embodiment of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that has a reduced affinity for FcyRIIB and a reduced affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to a comparable molecule comprising a wild-type Fc region. In another embodiment of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region that has an unchanged affinity for FcyRIIB and a reduced (or increased) affinity for FcyRIIIA and/or FcyRIIA relative to a comparable molecule comprising a wild-type Fcy region.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, имеющий измененную аффинность в отношении FcyRIIIA и/или FcyRIIA, так, что иммуноглобулин обладает повышенной эффекторной функцией. Неограничивающие примеры эффекторных функций клеток включают антитело-зависимую клеточную цитотоксичность, антитело-зависимый фагоцитоз, фагоцитоз, опсонизацию, опсонофагоцитоз, связывание клеток, образование розеток, связывание с компонентом комплемента G1q и комплементзависимую клеточную цитотоксичность. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения аффинность или эффекторная функция изменяется по меньшей мере в 2 раза, предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей область Fc дикого типа. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вариант области Fcy иммуноспецифично связывается с одним или более FcR с величиной аффинности, которая по меньшей мере на 65%, предпочтительно по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 1о0%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% или 250% превышает аффинность молекулы, содержащей область Fc дикого типа. Такие измерения могут представлять собой количественные исследования в условиях in vivo или in vitro, и в предпочтительном варианте представляют собой количественные исследования в условиях in vitro, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) или поверхностный плазмонный резонанс.In some embodiments of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region having an altered affinity for FcγRIIIA and/or FcγRIIA, such that the immunoglobulin has an enhanced effector function. Non-limiting examples of cellular effector functions include antibody-dependent cellular cytotoxicity, antibody-dependent phagocytosis, phagocytosis, opsonization, opsonophagocytosis, cell binding, rosetting, binding to complement component G1q, and complement-dependent cellular cytotoxicity. In a preferred embodiment of the present invention, the affinity or effector function is altered by at least 2-fold, preferably at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, at least 10-fold, at least 50-fold, or at least 100-fold compared to a comparable molecule comprising a wild-type Fc region. According to other embodiments of the present invention, the variant Fc region immunospecifically binds to one or more FcRs with an affinity that is at least 65%, preferably at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% or 250% greater than the affinity of a molecule comprising a wild-type Fc region. Such measurements may be quantitative in vivo or in vitro assays, and are preferably quantitative in vitro assays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or surface plasmon resonance.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, причем указанный вариант являетсяAccording to various embodiments of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant is
- 41 047726 агонистом по меньшей мере одного вида активности рецептора FcyR или является антагонистом по меньшей мере одного вида активности рецептора FcyR. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения молекулы содержат вариант, который является антагонистом одного или более видов активности FcyRIIB, например, опосредуемой В-клетками передачи сигналов, активации Вклеток, пролиферации В-клеток, выработки антител, внутриклеточного притока кальция в В-клетки, прогрессирования клеточного цикла, FcYRIIB-опосредуемого ингибирования передачи сигналов с участием FcεRI, фосфорилирования FcyRIIB, привлечения SHIP, фосфорилирования SHIP и связывания с Shc, или активности одной или более молекул последующих каскадов реакций (например, МАР-киназы, JNK, р38 или Akt) в пути передачи сигнала с участием FcyRIIB. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант, который является агонистом одного или более видов активности FcεRI, например, активации тучных клеток, мобилизации кальция, дегрануляции, выработки цитокинов или высвобождения серотонина.- 41 047726 an agonist of at least one FcyR receptor activity or an antagonist of at least one FcyR receptor activity. According to a preferred embodiment of the present invention, the molecules comprise a variant that is an antagonist of one or more FcyRIIB activities, such as B cell-mediated signaling, B cell activation, B cell proliferation, antibody production, intracellular calcium influx into B cells, cell cycle progression, FcεRIIB-mediated inhibition of FcεRI signaling, FcyRIIB phosphorylation, SHIP recruitment, SHIP phosphorylation and binding to Shc, or the activity of one or more downstream molecules (e.g., MAP kinase, JNK, p38, or Akt) in the FcyRIIB signaling pathway. According to another embodiment of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant that is an agonist of one or more activities of FcεRI, such as mast cell activation, calcium mobilization, degranulation, cytokine production, or serotonin release.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы содержат область Fc, содержащую области из двух или более изотипов IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). В настоящем изобретении область Fc, как полагают, имеет конкретный изотип IgG, если ее аминокислотная последовательность наиболее гомологична указанному изотипу относительно других изотипов IgG. Различные изотипы IgG проявляют различные физические и функциональные свойства, включая период полувыведения из сыворотки крови, связывание комплемента, аффинность связывания в отношении FcyR и активность эффекторных функций (например, АЗКЦ, КЗЦ и т.д.), вследствие различий в аминокислотных последовательностях шарнирной области и/или области Fc, например, как описано в Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; или Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. Указанный тип варианта области Fcy можно применять по отдельности, или в комбинации с модификацией аминокислот, для воздействия на Fc-опосредуемую эффекторную функцию и/или активность связывания. В случае использования в комбинации, модификация аминокислоты и шарнирная область/область Fc IgG могут проявлять сходную функциональность (например, повышенную аффинность в отношении FcyRIIA) и могут действовать аддитивно или, более предпочтительно, синергически, чтобы модифицировать эффекторную функциональность в молекуле согласно настоящему изобретению, по сравнению с молекулой согласно настоящему изобретению, которая содержит область Fc дикого типа. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения модификация аминокислот и область Fc IgG могут проявлять противоположную функциональность (например, повышение и уменьшение аффинности в отношении FcyRIIA, соответственно) и могут селективно регулировать или снижать специфичную функциональность в молекуле согласно настоящему изобретению, по сравнению с молекулой согласно настоящему изобретению, не содержащей область Fc или содержащей область Fc дикого типа такого же изотипа.In some embodiments, the molecules comprise an Fc region comprising regions from two or more IgG isotypes (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4). In the present invention, an Fc region is considered to be of a particular IgG isotype if its amino acid sequence is most homologous to that isotype relative to other IgG isotypes. Different IgG isotypes exhibit different physical and functional properties, including serum half-life, complement binding, binding affinity for FcyR, and effector function activity (e.g., ADCC, CDC, etc.), due to differences in the amino acid sequences of the hinge region and/or the Fc region, e.g., as described in Flesch and Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; or Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. The type of Fcy region variant may be used alone or in combination with an amino acid modification to affect Fc-mediated effector function and/or binding activity. When used in combination, the amino acid modification and the hinge/IgG Fc region may exhibit similar functionality (e.g., increased affinity for FcyRIIA) and may act additively or, more preferably, synergistically to modify effector functionality in a molecule of the present invention, as compared to a molecule of the present invention that comprises a wild-type Fc region. In other embodiments of the present invention, the amino acid modification and the Fc region of an IgG may exhibit opposite functionality (e.g., increasing and decreasing affinity for FcγRIIA, respectively) and may selectively regulate or decrease specific functionality in a molecule of the present invention, compared to a molecule of the present invention that does not contain an Fc region or contains a wild-type Fc region of the same isotype.
В предпочтительном конкретном варианте реализации PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, по сравнению с областью Fc дикого типа, так, что указанная молекула имеет измененную аффинность в отношении FcR, при условии, что указанный вариант области Fc не содержит замену в положениях, которые непосредственно вступают в контакт с FcyR, на основании данных кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc-FcR, таких как те, которые описаны Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Примеры положений в области Fc, которые непосредственно вступают в контакт с FcyR, представляют собой остатки аминокислот 234-239, остатки аминокислот 265-269 (петля В/С), остатки аминокислот 297-299 (петля С'/Е) и остатки аминокислот 327332 (петля F/G). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы согласно настоящему изобретению содержат варианты области Fc, содержащие модификацию по меньшей мере одного остатка, который не вступает в непосредственный контакт с FcyR, на основании данных структурного и кристаллографического анализа, например, находится вне сайта связывания Fc-FcyR.In a preferred specific embodiment, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant Fc region comprises at least one amino acid modification, relative to a wild-type Fc region, such that said molecule has an altered affinity for FcR, with the proviso that said variant Fc region does not comprise a substitution at positions that directly contact FcγR, based on crystallographic and structural analysis of Fc-FcR interactions, such as those described by Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Exemplary positions in the Fc region that directly contact FcγR are amino acid residues 234-239, amino acid residues 265-269 (B/C loop), amino acid residues 297-299 (C'/E loop), and amino acid residues 327-332 (F/G loop). In some embodiments of the present invention, the molecules of the present invention comprise variants of the Fc region comprising a modification of at least one residue that does not directly contact FcyR, based on structural and crystallographic analysis, such as being outside the Fc-FcyR binding site.
Варианты области Fc хорошо известны в данной области техники, и любой известный вариант области Fc может быть использован согласно настоящему изобретению для придания или модификации эффекторной функции, проявляемой молекулой согласно настоящему изобретению, содержащей область Fc (или ее часть), в соответствии с данными функциональных исследований, например, в NK-зависимом или зависимом от макрофагов количественном исследований. Например, варианты области Fc, идентифицированные как варианты, изменяющие эффекторную функцию, раскрыты в PCT публикациях WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; и WO 2008/140603, и любой подходящий вариант, раскрытый в указанных публикациях, можно применять в молекулах согласно настоящему изобретению.Fc region variants are well known in the art, and any known Fc region variant can be used according to the present invention to confer or modify the effector function exhibited by a molecule of the present invention comprising an Fc region (or a portion thereof), as determined by functional assays, such as NK-dependent or macrophage-dependent assays. For example, Fc region variants identified as effector function altering variants are disclosed in PCT publications WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; and WO 2008/140603, and any suitable variant disclosed in these publications can be used in the molecules of the present invention.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, содержащий одну или более модификаций аминокислот в одной или более областях, модификация (модификации) которых изменяет (относительно области Fc дикого типа) соотношение величин аффинности варианта области Fc в пользу актиAccording to some embodiments of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region comprising one or more amino acid modifications in one or more regions, the modification(s) of which alters (relative to a wild-type Fc region) the affinity ratio of the variant Fc region in favor of the active
- 42 047726 вирующего FcyR (например, FcyRIIA или FcyRIIIA) относительно ингибирующего FcyR (такого как FcYRIIB):- 42 047726 of a activating FcyR (such as FcyRIIA or FcyRIIIA) relative to an inhibitory FcyR (such as FcYRIIB):
Соотношение величин аффинности=Изменение аффинности варианта Fc, относительно дикого типа, в пользу активирующего FcYR/Изменение аффинности варианта Fc, относительно дикого типа, в пользу ингибирующего FcyRAffinity ratio = Change in affinity of Fc variant, relative to wild type, in favor of activating FcYR / Change in affinity of Fc variant, relative to wild type, in favor of inhibitory FcyR
Особенно предпочтительными являются PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, которые содержат вариант области Fc (по сравнению с областью Fc дикого типа), в которых вариант области Fc имеет соотношение величин аффинности больше 1. Указанные молекулы особенно полезны в обеспечении терапевтического или профилактического лечения заболевания, расстройства или инфекции или улучшения ее симптома, когда желательной является повышенная эффективность эффекторной функции клеток (например, АЗКЦ), опосредуемой FcyR, например, при раке или инфекционном заболевании. Напротив, вариант области Fc, имеющий соотношение величин аффинности меньше 1, вызывает уменьшение эффективности эффекторной функции клеток. В табл. 1 приведены примерные одинарные, двойные, тройные, четырехкратные и пятикратные мутации, независимо от того, характерно для них соотношение величин аффинности больше или меньше 1.Particularly preferred are PD-1 binding molecules of the present invention that comprise a variant Fc region (compared to a wild-type Fc region) in which the variant Fc region has an affinity ratio of greater than 1. These molecules are particularly useful in providing therapeutic or prophylactic treatment for, or amelioration of, a disease, disorder or infection where increased efficiency of FcyR-mediated cellular effector function (e.g., ADCC) is desired, such as in cancer or an infectious disease. In contrast, a variant Fc region having an affinity ratio of less than 1 causes a decrease in the efficiency of cellular effector function. Table 1 lists exemplary single, double, triple, quadruple and quintuple mutations, regardless of whether they have an affinity ratio of greater than or less than 1.
Таблица 1Table 1
Типичные одинарные и множественные мутации, перечисленные в соответствии с соотношением величин аффинностиTypical single and multiple mutations listed according to the ratio of affinity values
- 43 047726- 43 047726
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc содержат любые модификации аминокислот (например, замены) в любом из положений 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 или 330 и предпочтительно один или более из следующих остатков: А240, I240, L241, L243, Н244, N298, I328 или V330. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc содержат любые модификации аминокислот (например, замены) в любом из положений 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439 и предпочтительно один или более из следующих остатков: Н280, Q280, Y280, G290, S290, Т290, Y290, N294, K295, Р296, D298, N298, Р298, V298, I300 или L300. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc, которые связываются с FcyR с измененной аффинностью, содержат любые модификации аминокислот (например, замены) в любом из положений 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Предпочтительно вариант области Fc содержит любой из следующих остатков: А256, N268, Q272, D286, Q286, S286, А290, S290, А298, М301, A312, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, N326, S326, K330, Т339, А333, А334, Е334, Н334, L334, М334, Q334, V334, К335, Q335, А359, А360 или А430.According to a specific embodiment of the present invention, the Fc region variants comprise any amino acid modifications (e.g., substitutions) at any of positions 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328, or 330, and preferably one or more of the following residues: A240, I240, L241, L243, H244, N298, I328, or V330. According to another embodiment of the present invention, the Fc region variants comprise any amino acid modifications (e.g., substitutions) at any of positions 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, or 439 and preferably one or more of the following residues: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 or L300. According to a preferred embodiment of the present invention, Fc region variants that bind FcyR with altered affinity comprise any amino acid modifications (e.g., substitutions) at any of positions 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439. Preferably, the Fc region variant comprises any of the following residues: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 or A430.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc, которые связываются с FcyR (посредством своей области Fc) со сниженной аффинностью, содержат любые модификации аминокислот (например, замены) в любом из положений 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 или 439.According to another embodiment of the present invention, Fc region variants that bind FcyR (via their Fc region) with reduced affinity comprise any amino acid modifications (e.g., substitutions) at any of positions 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438, or 439.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc, которые свяAccording to another embodiment of the present invention, Fc region variants that are associated
- 44 047726 зываются с FcyR (посредством своей области Fc) с повышенной аффинностью, содержат любые модификации аминокислот (например, замены) в любом из положений 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 или 430. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения варианты области Fc, которые связываются с FcyRIIA с повышенной аффинностью, содержат любой из следующих остатков: А255, А256, А258, А267, А268, N268, А272, Q272, А276, А280, А283, А285, А286, D286, Q286, S286, А290, S290, М301, Е320, М320, Q320, R320, Е322, А326, D326, Е326, S326, K330, А331, Q335, A337 или А430.- 44 047726 bind FcγR (via its Fc region) with increased affinity, comprise any amino acid modifications (e.g., substitutions) at any of positions 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398, or 430. According to another embodiment of the present invention, Fc region variants that bind FcγRIIA with increased affinity comprise any of the following residues: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 or A43 0.
Предпочтительные варианты содержат одну или более модификаций в любом из положений: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 или 332.Preferred embodiments comprise one or more modifications at any of positions 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 or 332.
Особенно предпочтительные варианты содержат одну или более модификаций, выбранных из групп A-AI: ______________________________________________________________________Particularly preferred embodiments comprise one or more modifications selected from groups A-AI: ______________________________________________________________________
- 45 047726- 45 047726
Еще более предпочтительные варианты содержат одну или более модификаций, выбранных из групп 1-105: __________________________________________________________________________Even more preferred embodiments contain one or more modifications selected from groups 1-105: __________________________________________________________________________
- 46 047726- 46 047726
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула согласно настоящему изобретению будет содержать вариант области Fc, содержащий по меньшей мере одну модификацию в области Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретенияIn one embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention will comprise a variant Fc region comprising at least one modification in the Fc region. In some embodiments of the present invention
- 47 047726 вариант области Fc содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.- 47 047726 the Fc region variant comprises at least one substitution selected from the group consisting of L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc содержит:According to a specific embodiment of the present invention, the Fc region variant comprises:
(A) по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L;(A) at least one substitution selected from the group consisting of F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L;
(B) по меньшей мере две замены, выбранные из группы, состоящей из:(B) at least two replacements selected from the group consisting of:
(1) F243L и P396L;(1) F243L and P396L;
(2) F243L и R292P; и (3) R292P и V305I;(2) F243L and R292P; and (3) R292P and V305I;
(C) по меньшей мере три замены, выбранные из группы, состоящей из:(C) at least three replacements selected from the group consisting of:
(1) F243L, R292P и Y300L;(1) F243L, R292P and Y300L;
(2) F243L, R292P и V305I;(2) F243L, R292P and V305I;
(3) F243L, R292P и P396L; и (4) R292P, V305I и P396L;(3) F243L, R292P and P396L; and (4) R292P, V305I and P396L;
(D) по меньшей мере четыре замены, выбранные из группы, состоящей из:(D) at least four replacements selected from the group consisting of:
(1) F243L, R292P, Y300L и P396L; и (2) F243L, R292P, V305I и P396L; или (Е) по меньшей мере пять замен, выбранных из группы, состоящей из:(1) F243L, R292P, Y300L and P396L; and (2) F243L, R292P, V305I and P396L; or (E) at least five substitutions selected from the group consisting of:
(1) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L; и (2) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L.(1) F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L; and (2) L235V, F243L, R292P, Y300L and P396L.
В другом конкретном варианте реализации настоящего изобретения вариант области Fc содержит замены:In another specific embodiment of the present invention, the Fc region variant comprises the substitutions:
(A) F243L, R292P и Y300L;(A) F243L, R292P and Y300L;
(b) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L; или (C) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.(b) L235V, F243L, R292P, Y300L and P396L; or (C) F243L, R292P, Y300L, V305I and P396L.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула согласно настоящему изобретению содержит вариант области Fc, который проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (по сравнению со связыванием, проявляемым областью Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1связывающая молекула согласно настоящему изобретению будет содержать вариант области Fc, которая проявляет сниженное (или по существу отсутствующее) связывание с FcyR (например, FcyRIIIA) и сниженную (или по существу отсутствующую) эффекторную функцию АЗКЦ. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант области Fc содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc содержит замену L234A; L235A; L234A и L235A; D265A; N297Q или N297G.In one embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention comprises a variant Fc region that exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a), or FcγRIIIB (CD16b) (compared to the binding exhibited by the Fc region of wild-type IgG1 (SEQ ID NO: 1)). In one embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention will comprise a variant Fc region that exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγR (e.g., FcγRIIIA) and reduced (or substantially absent) ADCC effector function. According to some embodiments of the present invention, the variant Fc region comprises at least one substitution selected from the group consisting of L234A, L235A, D265A, N297Q, and N297G. According to a specific embodiment of the present invention, the variant Fc region comprises the substitution L234A; L235A; L234A and L235A; D265A; N297Q, or N297G.
Предпочтительные последовательности IgG1 для доменов СН2 и CH3 PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению будут содержать замены L234A/L235A (SEQ ID NO: 5):Preferred IgG1 sequences for the CH2 and CH3 domains of PD-1 binding molecules according to the present invention will contain the substitutions L234A/L235A (SEQ ID NO: 5):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула согласно настоящему изобретению содержит область Fc, которая по своей природе проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcyRIIIA (CD16а) и/или сниженную эффекторную функцию (по сравнению со связыванием, проявляемым Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула согласно настоящему изобретению не содержит область Fc IgG2 (SEQ ID NO: 2) или область Fc IgG4, (SEQ ID NO: 4). В случае использования области Fc IgG4, в область настоящего изобретения также включено введение стабилизирующей мутации, такой как замена S228P шарнирной области IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 13: eskygppcppcp, (lu et al. (2008) The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrijugation, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969), чтобы уменьшить частоту обмена нитей. Другие стабилизирующие мутации, известные в данной области техники, могут быть введены в область Fc IgG4 (Peters, P et al. (2012) Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability, J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT публикация патента WO 2008/145142).According to another embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention comprises an Fc region that inherently exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγRIIIA (CD16a) and/or reduced effector function (compared to the binding exhibited by wild-type IgG1 Fc (SEQ ID NO: 1)). According to a specific embodiment of the present invention, a PD-1 binding molecule of the present invention does not comprise an IgG2 Fc region (SEQ ID NO: 2) or an IgG4 Fc region, (SEQ ID NO: 4). In the case of using the Fc region of IgG4, it is also within the scope of the present invention to introduce a stabilizing mutation, such as a S228P substitution of the IgG4 hinge region (see, for example, SEQ ID NO: 13: eskygppcppcp, (l u et al. (2008) The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation, J. Pharmaceutical Sciences 97:960-969), to reduce the frequency of strand exchange. Other stabilizing mutations known in the art can be introduced into the Fc region of IgG4 (Peters, P et al. (2012) Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability, J. Biol. Chem., 287:24525-24533; PCT Patent Publication WO 2008/145142).
Согласно другим вариантам реализации в область настоящего изобретения включено применениеAccording to other embodiments, the present invention includes within its scope the use of
- 48 047726 любого варианта области Fc, известного в данной области техники, такого как те, которые раскрыты в Jefferis, B.J. et al. (2002) «Interaction Sites On Human- 48 047726 any Fc region variant known in the art, such as those disclosed in Jefferis, B.J. et al. (2002) “Interaction Sites On Human
IgG-Fc For FcgammaR: Current Models», Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) «Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function», Biochem. Soc. Trans. 30:48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) «Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement», J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) «High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R», J. Biol.IgG-Fc For FcgammaR: Current Models,” Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function", Biochem. Soc. Trans. 30:48790; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement", J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R", J. Biol.
Chern. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) «Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc», J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) «Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4», J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) «in vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies», Cell.Chern. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc", J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4", J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) “In vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell.
Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) «Recombinant human IgG Molecules LackingImmunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking
Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities», Eur. J. Immunol. 29:261324; Jefferis, R. et al. (1996) «Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions», Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) «Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains», J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) «Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1Н», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) «Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation», Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) «Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors», FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al.Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,” Eur. J. Immunol. 29:261324; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions", Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains", J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation", Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors", FASEB J. 9:115-19; Alegre, M. L. et al.
(1994) «А Non-Activating «Humanized» Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties in vivo», Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) «Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma Rll», Mol.(1994) “A Non-Activating “Humanized” Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties in Vivo”, Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma Rll", Mol.
Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) «Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG», J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) «Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG», Nature 332:563-564;Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG", J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG", Nature 332:563-564;
патентах США № 5624821; 5885573; 6194551; 7276586 и 7317091; и PCT публикациях WO 00/42072 и PCT WO 99/58572.U.S. Patents 5,624,821; 5,885,573; 6,194,551; 7,276,586; and 7,317,091; and PCT Publications WO 00/42072 and PCT WO 99/58572.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы согласно настоящему изобретению дополнительно содержат один или более сайтов гликозилирования так, что один или более углеводных фрагментов ковалентно присоединены к молекуле. Предпочтительно молекулы согласно настоящему изобретению, содержащие один или более сайтов гликозилирования и/или одну или более модификаций в области Fc, обеспечивают или обладают повышенной эффекторной функцией, опосредуемой антителом, например, повышенной активностью АЗКЦ, по сравнению с немодифицированным антителом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены молекулы, содержащие одну или более модификаций аминокислот, которые, как известно, непосредственно или косвенно взаимодействуют с углеводным фрагментом области Fc, включая, но не ограничиваясь ими, аминокислоты в положениях 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 и 301. Аминокислоты, которые прямо или косвенно взаимодействуют с углеводным фрагментом области Fc, известны в данной области техники, см., например, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7, которая полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки.According to some embodiments of the present invention, the molecules of the present invention further comprise one or more glycosylation sites such that one or more carbohydrate moieties are covalently attached to the molecule. Preferably, the molecules of the present invention comprising one or more glycosylation sites and/or one or more modifications in the Fc region provide or have an enhanced effector function mediated by the antibody, such as enhanced ADCC activity, compared to an unmodified antibody. According to some embodiments of the present invention are provided molecules comprising one or more amino acid modifications that are known to interact directly or indirectly with the carbohydrate moiety of the Fc region, including, but not limited to, amino acids at positions 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299, and 301. Amino acids that interact directly or indirectly with the carbohydrate moiety of the Fc region are known in the art, see, for example, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены молекулы, которые были модифицированы путем введения одного или более сайтов гликозилирования в один или более сайтов молекул, предпочтительно без изменения функциональности молекул, например, активности связывания с антигеном-мишенью или FcyR. Сайты гликозилирования могут быть введены в вариабельную и/или константную область молекул согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении термин сайты гликозилирования включает любую конкретную аминокислотную последовательность в антителе, к которой будет специфично или ковалентно прикреплен олигосахарид (т.е. углеводы, содерAccording to another embodiment of the present invention, there are provided molecules that have been modified by introducing one or more glycosylation sites into one or more sites of the molecules, preferably without altering the functionality of the molecules, such as the binding activity to a target antigen or FcyR. The glycosylation sites may be introduced into the variable and/or constant region of the molecules of the present invention. As used herein, the term glycosylation sites includes any particular amino acid sequence in an antibody to which an oligosaccharide (i.e., carbohydrates containing
- 49 047726 жащие два или более простых сахара, соединенных вместе). Олигосахаридные боковые цепи, как правило, присоединены к остову антитела посредством N- или О-связей. N-связанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. О-связанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину, треонину. Молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования, включая N-связанные и О-связанные сайты гликозилирования. Любой сайт гликозилирования для N-связанного или О-связанного гликозилирования, известный в данной области техники, может быть использован в соответствии с настоящим изобретением. Примерный Nсвязанный сайт гликозилирования, который можно применять в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, представляет собой аминокислотную последовательность: Asn-X-Thr/Ser, в которой X может представлять собой любую аминокислоту, и Thr/Ser означает треонин или серин. Подходящий сайт или сайты могут быть введены в молекулу согласно настоящему изобретению с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение (см., например, in vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, p. 106-116, которая полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки. Примерный способ введения сайта гликозилирования в молекулу согласно настоящему изобретению может включать: модификацию или мутирование аминокислотной последовательности молекулы так, чтобы получить желательную последовательность Asn-X-Thr/Ser.- 49 047726 containing two or more simple sugars linked together). Oligosaccharide side chains are typically attached to the antibody backbone via N- or O-linkages. N-linked glycosylation refers to the attachment of an oligosaccharide moiety to the side chain of an asparagine residue. O-linked glycosylation refers to the attachment of an oligosaccharide moiety to a hydroxyamino acid, such as serine, threonine. The molecules of the present invention may comprise one or more glycosylation sites, including N-linked and O-linked glycosylation sites. Any glycosylation site for N-linked or O-linked glycosylation known in the art may be used in accordance with the present invention. An exemplary N-linked glycosylation site that can be used in accordance with the methods of the present invention is the amino acid sequence: Asn-X-Thr/Ser, wherein X can be any amino acid and Thr/Ser is threonine or serine. A suitable site or sites can be introduced into a molecule of the present invention using methods well known in the art to which the present invention pertains (see, for example, in vitro Mutagenesis, Recombinant DNA: A Short Course, J. D. Watson, et al. W. H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116, which is incorporated herein by reference in its entirety. An exemplary method for introducing a glycosylation site into a molecule of the present invention can comprise: modifying or mutating the amino acid sequence of the molecule so as to obtain the desired sequence Asn-X-Thr/Ser.
Согласно некоторым вариантам реализации согласно настоящему изобретению предложены способы модификации содержания углеводов в молекуле согласно настоящему изобретению путем добавления или удаления сайта гликозилирования. Способы модификации содержания углеводов в антителах (и молекулах, содержащих домены антител, например, область Fc) хорошо известны в данной области техники и включены в область настоящего изобретения, см., например, патент США № 6218149; EP 0359096 В1; публикацию патента США US 2002/0028486; WO 03/035835; публикацию патента США 2003/0115614; патент США № 6218149; патент США № 6472511; все из которых полностью включены в настоящий патент посредством ссылки. Согласно другим вариантам реализации согласно настоящему изобретению предложены способы модификации содержания углеводов в молекуле согласно настоящему изобретению путем удаления одного или более эндогенных углеводных фрагментов молекулы. Согласно конкретному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложено смещение сайта гликозилирования области Fc антитела путем модификации положений, смежных с 297. Согласно конкретному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложена модификация положения 296 так, что положение 296, но не положение 297, является гликозилированным.In some embodiments, the present invention provides methods of modifying the carbohydrate content of a molecule of the present invention by adding or removing a glycosylation site. Methods of modifying the carbohydrate content of antibodies (and molecules comprising antibody domains, e.g., an Fc region) are well known in the art and are included within the scope of the present invention, see, e.g., U.S. Patent No. 6,218,149; EP 0 359 096 B1; U.S. Patent Publication No. US 2002/0028486; WO 03/035835; U.S. Patent Publication No. 2003/0115614; U.S. Patent No. 6,218,149; U.S. Patent No. 6,472,511; all of which are incorporated herein by reference in their entireties. In other embodiments, the present invention provides methods of modifying the carbohydrate content of a molecule of the present invention by removing one or more endogenous carbohydrate moieties from the molecule. In a specific embodiment, the present invention provides for shifting the glycosylation site of the Fc region of an antibody by modifying positions adjacent to 297. In a specific embodiment, the present invention provides for modifying position 296 such that position 296, but not position 297, is glycosylated.
Эффекторная функция также может быть модифицирована с помощью методик, таких как введение одного или более остатков цистеина в область Fc, обеспечивая тем самым возможность образования межцепочечной дисульфидной связи в указанной области с получением гомодимерного антитела, которое может иметь улучшенную способность к интернализации и/или повышенную комплементзависимую цитотоксичность и АЗКЦ (Caron, Р.С. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также могут быть получены с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, описанных в Wolff, E.A. et al. (1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice, Cancer Research 53:2560-2565. В другом варианте, антитело может быть модифицировано для включения двух областей Fc и, соответственно, может иметь повышенную активность комплемент-опосредованной цитотоксичности и АЗКЦ (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)Effector function can also be modified by techniques such as the introduction of one or more cysteine residues into the Fc region, thereby allowing for the formation of an interchain disulfide bond in said region to produce a homodimeric antibody that may have improved internalization capacity and/or enhanced complement-dependent cytotoxicity and ADCC (Caron, P.C. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. Homodimeric antibodies with enhanced antitumor activity can also be produced using heterobifunctional crosslinkers as described in Wolff, E.A. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. Homodimeric antibodies with enhanced antitumor activity can also be produced using the heterobifunctional crosslinkers described in Wolff, E.A. et al. (1992) Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies, J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity, J. Immunol. 148(9):2918-2922. al. (1993) Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice, Cancer Research 53:2560-2565. In another embodiment, the antibody can be modified to include two Fc regions and, accordingly, can have enhanced complement-mediated cytotoxicity and ADCC activity (Stevenson, G.T. et al. (1989) A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)
Период полувыведения из сыворотки крови молекул согласно настоящему изобретению, содержащих области Fc, может быть увеличен за счет увеличения аффинности связывания области Fc в отношении FcRn. В настоящем изобретении термин период полувыведения означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое является мерой среднего времени существования молекул после их введения. Период полувыведения может быть выражен как время, необходимое для выведения пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из организма субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или конкретного компартмента его организма, например, при измерении в сыворотке крови, т.е. период полувыведения из кровотока, или в других тканях. В целом, увеличение периода полувыведения приводит к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для введенной молекулы.The serum half-life of the molecules of the present invention comprising Fc regions can be increased by increasing the binding affinity of the Fc region for FcRn. As used herein, the term half-life refers to a pharmacokinetic property of a molecule that is a measure of the average time the molecules exist after administration. The half-life can be expressed as the time required to eliminate fifty percent (50%) of a known amount of the molecule from the body of a subject (e.g., a human patient or other mammal) or a specific compartment of the body, such as when measured in blood serum, i.e., the half-life in the bloodstream, or in other tissues. In general, an increase in the half-life results in an increase in the mean residence time (MRT) in the bloodstream for the administered molecule.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, по сравнению с областью Fc дикого типа, так, что указанная молекула имеет увеличенный период полувыведения (по сравнению с областью Fc дикого типа). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, причем указанный вариантIn some embodiments of the present invention, PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant Fc region comprises at least one amino acid modification, relative to a wild-type Fc region, such that said molecule has an increased half-life (relative to a wild-type Fc region). In some embodiments of the present invention, PD-1 binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein said variant
- 50 047726 области Fc содержит замену аминокислоты, которая увеличивает период полувыведения, в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436. Многочисленные специфичные мутации, способные увеличивать период полувыведения молекулы, содержащей область Fc, известны в данной области техники и включают, например, M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации. Например, см. мутации, описанные в патентах США № 6277375, 7083784; 7217797, 8088376; публикации заявок на патент США 2002/0147311; 2007/0148164; и международные публикации WO 98/23289; WO 2009/058492; и WO 2010/033279, которые полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Молекулы, содержащие область Fc, с увеличенным периодом полувыведения также включают те, которые содержат замены в двух или более остатках области Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 и 436. В частности, указанные молекулы содержат две или более замен, выбранных из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K и Y436I. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc содержит замены:- 50 047726 Fc region comprises an amino acid substitution that increases half-life at one or more positions selected from the group consisting of 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 and 436. Numerous specific mutations capable of increasing the half-life of a molecule comprising an Fc region are known in the art and include, for example, M252Y, S254T, T256E, and combinations thereof. For example, see the mutations described in U.S. Patent Nos. 6,277,375, 7,083,784; 7,217,797, 8,088,376; U.S. Patent Application Publications 2002/0147311; 2007/0148164; and International Publications WO 98/23289; WO 2009/058492; and WO 2010/033279, which are incorporated herein by reference in their entireties. Fc region-containing molecules with an increased half-life also include those that comprise substitutions in two or more Fc region residues 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 and 436. In particular, said molecules comprise two or more substitutions selected from: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K and Y436I. According to a specific embodiment of the present invention, the Fc region variant comprises substitutions:
(A) M252Y, S254T и Т256Е;(A) M252Y, S254T and T256E;
(B) M252Y и S254T;(B) M252Y and S254T;
(C) M252Y и Т256Е;(C) M252Y and T256E;
(D) T250Q и M428L;(D) T250Q and M428L;
(E) T307Q и N434A;(E) T307Q and N434A;
(F) A378V и N434A;(F) A378V and N434A;
(G) N434A и Y436I;(G) N434A and Y436I;
(Н) V308P и N34A; или (I) K288D и Н435К.(H) V308P and N34A; or (I) K288D and H435K.
В область настоящего изобретения дополнительно включены варианты областей Fc, которые содержат:The present invention further includes within its scope variants of Fc regions that comprise:
(A) одну или более мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcyR; и (B) одну или более мутаций, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки крови.(A) one or more mutations that alter effector function and/or FcyR; and (B) one or more mutations that increase serum half-life.
VI. Биспецифические молекулы, связывающие PD-1 человека.VI. Bispecific molecules binding to human PD-1.
Согласно одному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифические связывающие молекулы, которые способны связываться с первым эпитопом и вторым эпитопом, причем указанный первый эпитоп представляет собой эпитоп PD-1 человека, и указанный второй эпитоп аналогичен или отличается от эпитопа PD-1, или представляет собой эпитоп другой молекулы, который присутствует на поверхности иммунной клетки (такой как Т-лимфоцит) и участвует в регулировании контрольной точки иммунного ответа. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения второй эпитоп представляет собой эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, галектина-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, ГКГС класса I или II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 или VISTA. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения второй эпитоп не является эпитопом PD-1. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения второй эпитоп представляет собой CD137, CTLA-4, LAG-3, OX40, TIGIT или TIM-3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифическая молекула содержит более двух сайтов связывания эпитопов. Указанные биспецифические молекулы могут связывать два или более различных эпитопов LAG-3 и по меньшей мере один эпитоп молекулы, которая отлична от LAG-3.According to one embodiment, the present invention provides bispecific binding molecules that are capable of binding to a first epitope and a second epitope, wherein said first epitope is an epitope of human PD-1, and said second epitope is similar to or different from an epitope of PD-1, or is an epitope of another molecule that is present on the surface of an immune cell (such as a T lymphocyte) and is involved in regulating an immune checkpoint response. According to one embodiment of the present invention, the second epitope is an epitope of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD3, CD8, CD16, CD27, CD32, CD40, CD40L, CD47, CD64, CD70, CD80, CD86, CD94, CD137, CD137L, CD226, CTLA-4, galectin-9, GITR, GITRL, HHLA2, ICOS, ICOSL, KIR, LAG-3, LIGHT, MHC class I or II, NKG2a, NKG2d, OX40, OX40L, PD1H, PD-1, PD-L1, PD-L2, PVR, SIRPa, TCR, TIGIT, TIM-3 or VISTA. According to one embodiment of the present invention, the second epitope is not an epitope of PD-1. According to a specific embodiment of the present invention, the second epitope is CD137, CTLA-4, LAG-3, OX40, TIGIT or TIM-3. According to some embodiments of the present invention, the bispecific molecule comprises more than two epitope binding sites. These bispecific molecules can bind two or more different epitopes of LAG-3 and at least one epitope of a molecule that is different from LAG-3.
В область настоящего изобретения включены биспецифические антитела, способные одновременно связываться с PD-1 и вторым эпитопом (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения биспецифическое антитело, способное одновременно связываться с PD-1 и вторым эпитопом, получают с использованием любого из способов, описанных в PCT публикациях WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 и WO 2014/022540, каждая из которых полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки.The present invention includes bispecific antibodies capable of simultaneously binding to PD-1 and a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). According to some embodiments of the present invention, a bispecific antibody capable of simultaneously binding to PD-1 and a second epitope is produced using any of the methods described in PCT publications WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873 and WO 2014/022540, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.
А. Биспецифические диатела, не содержащие области Fc.A. Bispecific diabodies lacking the Fc region.
Согласно одному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифические диатела, которые содержат, и наиболее предпочтительно состоят из них, первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, последовательности которых обеспечивают ковалентное связывание указанных полипептидных цепей друг с другом с образованием ковалентно связанного диатела, которое способно одновременно связываться с первым эпитопом и вторым эпитопом, причем указанныеAccording to one embodiment, the present invention provides bispecific diabodies that comprise, and most preferably consist of, a first polypeptide chain and a second polypeptide chain, the sequences of which provide for the covalent binding of said polypeptide chains to each other to form a covalently linked diabody that is capable of simultaneously binding to a first epitope and a second epitope, wherein said
- 51 047726 эпитопы не идентичны друг другу. Соответственно, указанные биспецифические диатела содержат домены VL1/VH1, которые способны связываться с первым эпитопом, и домены VL2VVH2, которые способны связываться со вторым эпитопом. Обозначение VL1 и VH1 означает, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связываются с первым эпитопом, указанного биспецифического диатела. Аналогичным образом, обозначение VL2 и VH2 означает, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связываются со вторым эпитопом, указанного биспецифического диатела. Вне зависимости от того, обозначен ли конкретный эпитоп как первый и второй эпитоп; такое обозначение имеет отношение только к присутствию и ориентации доменов полипептидных цепей связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения один из указанных эпитопов представляет собой эпитоп PD-1, и другой из указанных эпитопов не является эпитопом PD-1 (например, эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).- 51 047726 epitopes are not identical to each other. Accordingly, said bispecific diabodies comprise VL1/VH1 domains which are capable of binding to a first epitope and VL2VVH2 domains which are capable of binding to a second epitope. The designation VL1 and VH1 means, respectively, a variable domain of a light chain and a variable domain of a heavy chain which bind to the first epitope of said bispecific diabody. Likewise, the designation VL2 and VH2 means, respectively, a variable domain of a light chain and a variable domain of a heavy chain which bind to the second epitope of said bispecific diabody. Regardless of whether a particular epitope is designated as the first and second epitope; such designation is relevant only to the presence and orientation of the domains of the polypeptide chains of the binding molecules according to the present invention. According to one embodiment of the present invention, one of said epitopes is a PD-1 epitope and the other of said epitopes is not a PD-1 epitope (e.g., an epitope of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).
Домен VL первой полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH второй полипептидной цепи с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который специфичен в отношении первого антигена (т.е. PD-1 или антигена, который содержит второй эпитоп). Аналогичным образом, домен VL второй полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который специфичен в отношении второго антигена (т.е. антигена, который содержит второй эпитоп, или PD-1). Следовательно, выбор доменов VL и VH первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, что две полипептидные цепи диатела в совокупности содержат домены VL и VH, способные связываться как с эпитопом PD-1, так и со вторым эпитопом (т.е. они содержат VLPD-1/VHPD-1 и VL2/VH2, где PD-1 представляет собой первый эпитоп, или VL1/VH1 и VLPD-1/VHPD-1, где PD-1 представляет собой второй эпитоп).The VL domain of the first polypeptide chain interacts with the VH domain of the second polypeptide chain to form a first functional antigen-binding site that is specific for a first antigen (i.e., PD-1 or an antigen that contains a second epitope). Similarly, the VL domain of the second polypeptide chain interacts with the VH domain of the first polypeptide chain to form a second functional antigen-binding site that is specific for a second antigen (i.e., an antigen that contains a second epitope, or PD-1). Consequently, the selection of the VL and VH domains of the first and second polypeptide chains is coordinated such that the two polypeptide chains of the diabody collectively comprise VL and VH domains capable of binding to both the PD-1 epitope and a second epitope (i.e., they comprise VL PD-1 /VH PD-1 and VL2/VH2, where PD-1 is the first epitope, or VL1/VH1 and VL PD-1 /VH PD-1 , where PD-1 is the second epitope).
Первая полипептидная цепь варианта реализации указанных биспецифических диател содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL1 моноклонального антитела, способный связываться с первым или вторым эпитопом (т.е. VLPD-1 или VL эпитоп 2), первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH2 моноклонального антитела, способный связываться со вторым эпитопом (если указанная первая полипептидная цепь содержит VLPD-1) или первым эпитопом (если указанная первая полипептидная цепь содержит VL эпитоп 2), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий остаток цистеина, домен, способствующий образованию гетеродимера, и Сконец (фиг. 1).The first polypeptide chain of an embodiment of said bispecific diabodies comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus, the N-terminus, the VL1 domain of the monoclonal antibody capable of binding to a first or second epitope (i.e. VL PD-1 or VL epitope 2), a first intermediate spacer peptide (linker 1), the VH2 domain of the monoclonal antibody capable of binding to a second epitope (if said first polypeptide chain comprises VL PD-1 ) or the first epitope (if said first polypeptide chain comprises VL epitope 2), a second intermediate spacer peptide (linker 2), optionally comprising a cysteine residue, a domain facilitating the formation of a heterodimer, and a C-terminus (Fig. 1).
Вторая полипептидная цепь указанного варианта реализации биспецифических диател содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL2 моноклонального антитела, способный связываться с PD-1 или вторым эпитопом (т.е. VLPD-1 или VL эпитоп 2, и при этом указанный домен VL не является подходящим для включения в первую полипептидную цепь диатела), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH1 моноклонального антитела, способный связываться со вторым эпитопом (если указанная вторая полипептидная цепь содержит VLPD-1) или PD-1 (если указанная вторая полипептидная цепь содержит VL эпитоп 2), второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), необязательно содержащий остаток цистеина, домен, способствующий образованию гетеродимера, и С-конец (фиг. 1).The second polypeptide chain of said embodiment of the bispecific diabodies comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus, the N-terminus, a VL2 domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 or a second epitope (i.e. VL PD-1 or VL epitope 2 , and wherein said VL domain is not suitable for inclusion in the first polypeptide chain of the diabody), an intermediate linker peptide (linker 1), a VH1 domain of a monoclonal antibody capable of binding to a second epitope (if said second polypeptide chain comprises VL PD-1 ) or PD-1 (if said second polypeptide chain comprises VL epitope 2 ), a second intermediate spacer peptide (linker 2), optionally comprising a cysteine residue, a domain that promotes heterodimer formation, and a C-terminus (Fig. 1).
Наиболее предпочтительно длина промежуточного линкерного пептида (например, линкера 1), который разделяет указанные домены VL и VH, выбрана так, чтобы по существу или полностью препятствовать связыванию доменов VL и VH полипептидной цепи друг с другом. Соответственно, домены VL и VH первой полипептидной цепи по существу или полностью неспособны связываться друг с другом. Аналогичным образом, домены VL и VH второй полипептидной цепи по существу или полностью неспособны связываться друг с другом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) содержит последовательность, представленную в (SEQ ш N0:14): gggsgggg.Most preferably, the length of the intermediate linker peptide (e.g., linker 1), which separates said VL and VH domains, is selected so as to substantially or completely prevent the VL and VH domains of the polypeptide chain from binding to each other. Accordingly, the VL and VH domains of the first polypeptide chain are substantially or completely unable to bind to each other. Likewise, the VL and VH domains of the second polypeptide chain are substantially or completely unable to bind to each other. A preferred intermediate spacer peptide (linker 1) comprises the sequence presented in ( SE Q w N0:14 ) : gggsgggg.
Длина и состав второго промежуточного линкерного пептида (линкера 2) выбраны на основании выбора доменов, стимулирующих образование гетеродимера. Как правило, второй промежуточный линкерный пептид (линкер 2) будет содержать 3-20 остатков аминокислот. В частности, если домены, способствующие образованию гетеродимера, не содержат остаток цистеина, используют второй промежуточный линкерный пептид, содержащий цистеин (линкер 2). Второй промежуточный линкерный пептид, содержащий цистеин (линкер 2), будет содержать 1, 2, 3 или более остатков цистеина. Предпочтительный цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) содержит последовательность, приведенную в SEQ ГО NO: 15: GGCGGG.The length and composition of the second intermediate linker peptide (linker 2) are selected based on the selection of heterodimer-promoting domains. Typically, the second intermediate linker peptide (linker 2) will contain 3-20 amino acid residues. In particular, if the heterodimer-promoting domains do not contain a cysteine residue, a second intermediate linker peptide containing cysteine (linker 2) is used. The second intermediate linker peptide containing cysteine (linker 2) will contain 1, 2, 3 or more cysteine residues. A preferred cysteine-containing spacer peptide (linker 2) comprises the sequence given in SEQ ID NO: 15: GGCGGG.
В другом варианте, линкер 2 не содержит цистеин (например,In another embodiment, linker 2 does not contain cysteine (e.g.,
GGG, GGGS (SEQ ГО NO: 29),GGG, GGGS (SEQ ID NO: 29),
LGGGSG (SEQ ГО NO: 261), GGGSGGGSGGG (SEQ ГО NO: 262), ASTKG (SEQ ГО NO: 30),LGGGSG (SEQ GO NO: 261), GGGSGGGSGGG (SEQ GO NO: 262), ASTKG (SEQ GO NO: 30),
LEPKSS (SEQ ГО NO: 33), APSSS (SEQ ГО NO: 34), и т.д.), и используется цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера, описанный ниже. Необязательно, может быть использован цистеинсодержащий линкер 2 и цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера. Домены, способствующие образованиюLEPKSS (SEQ ID NO: 33), APSSS (SEQ ID NO: 34), etc.), and the cysteine-containing heterodimer-promoting domain described below is used. Optionally, a cysteine-containing linker 2 and a cysteine-containing heterodimer-promoting domain may be used. The heterodimer-promoting domains
- 52 047726 гетеродимера, могут представлять собой (SEQ ID NO: 16) или vepksc (SEQ ID NO: 17), или AEPKSC (SEQ ID NO: 18) на одной полипептидной цепи, и GFNRGEC (SEQ ID NO: 19) или FNRGEC (SEQ ID NO: 20) на другой полипептидной цепи (US2007/0004909).- 52 047726 heterodimers may be (SEQ ID NO: 16) or vepksc (SEQ ID NO: 17) or AEPKSC (SEQ ID NO: 18) on one polypeptide chain, and GFNRGEC (SEQ ID NO: 19) or FNRGEC (SEQ ID NO: 20) on the other polypeptide chain (US2007/0004909).
Более предпочтительно, однако, домены, способствующие образованию гетеродимера, указанных диател образованы одним, двумя, тремя или четырьмя тандемно повторяющимися спиральными доменами противоположного заряда, которые содержат последовательность из по меньшей мере шести, по меньшей мере семи или по меньшей мере восьми остатков аминокислот, так, что домен, способствующий образованию гетеродимера, обладает общим зарядом (Apostolovic, В. et al. (2008) «pH-Sensitivity of theMore preferably, however, the heterodimer-promoting domains of said diabodies are formed by one, two, three or four tandemly repeating helical domains of opposite charge that comprise a sequence of at least six, at least seven or at least eight amino acid residues such that the heterodimer-promoting domain has an overall charge (Apostolovic, B. et al. (2008) “pH-Sensitivity of the
E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil», Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) «Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain», J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) «Comparison of in vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils», Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) «Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions», Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) «Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy», J. Mol. Recognit. 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) «Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding», Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) «Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag», Protein Science 21:511519; Ghosh, T.S. et al. (2009) «End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures», Neta. Crystallographica D65:10321041; Grigoryan, G. et al. (2008) «Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions», Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) «Designing Heterodimeric TwoStranded a-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And a-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity», J. Biol. Chern. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) «The d'—d—d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'—a—a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif», J. Amer. Chern. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) «Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface», J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) «Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance», J.E3/K3 Heterodimeric Coil,” Biomacromolecules 9:3173–3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of in vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coils,” Structure 10:1235–1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions”, Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy", J. Mol. Recognize 17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded De Novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754–1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag,” Protein Science 21:511519; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures", Neta. Crystallographica D65:10321041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity in Coiled-Coil Interactions”, Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric TwoStranded a-Helical Coiled-Coils: The Effects of Hydrophobicity And a-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity", J. Biol. Chern. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d'—d—d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'—a—a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,” J. Amer. Chern. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface", J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance", J.
Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) «The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies», Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) «А Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism», J. Gene Med. 10:355-367).Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies", Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand-Pseudoreceptor System Based On De Novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism", J. Gene Med. 10:355-367).
Указанные повторяющиеся спиральные домены могут быть точными повторами или могут содержать замены. Например, спиральный домен из домена, стимулирующего образование гетеродимера, первой полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми остатков аминокислот, выбранную для придания отрицательного заряда указанному домену, стимулирующему образование гетеродимера, и спиральный домен из домена, стимулирующего образование гетеродимера, второй полипептидной цепи может содержать последовательность из восьми остатков аминокислот, отобранных для придания положительного заряда указанному домену, стимулирующему образование гетеродимера. Вне зависимости от того, какая спираль предусмотрена для первой или второй полипептидных цепей, предусмотрено, что для другой полипептидной цепи используется спираль противоположного заряда. Положительно заряженная аминокислота может представлять собой лизин, аргинин, гистидин и т.д. и/или отрицательно заряженная аминокислота может представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и т.д. Положительно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой лизин и/или отрицательно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой глутаминовую кислоту. Возможно использование только одного домена, стимулирующего образование гетеродимера, (поскольку указанный домен будет ингибировать гомодимеризацию и тем самым способствовать гетеродимеризации), однако предпочтительно, чтобы первая и вторая полипептидные цепи диател согласно наSaid repeating helical domains may be exact repeats or may comprise substitutions. For example, a helical domain from a heterodimer-promoting domain of a first polypeptide chain may comprise a sequence of eight amino acid residues selected to impart a negative charge to said heterodimer-promoting domain, and a helical domain from a heterodimer-promoting domain of a second polypeptide chain may comprise a sequence of eight amino acid residues selected to impart a positive charge to said heterodimer-promoting domain. Regardless of which helix is provided for the first or second polypeptide chains, it is envisaged that a helix of the opposite charge is used for the other polypeptide chain. The positively charged amino acid may be lysine, arginine, histidine, etc. and/or the negatively charged amino acid may be glutamic acid, aspartic acid, etc. The positively charged amino acid is preferably lysine and/or the negatively charged amino acid is preferably glutamic acid. It is possible to use only one heterodimer formation promoting domain (since said domain will inhibit homodimerization and thus promote heterodimerization), however, it is preferable that the first and second polypeptide chains of the diabodies according to
- 53 047726 стоящему изобретению содержали домены, способствующие образованию гетеродимера.- 53 047726 of the present invention contained domains that promote the formation of a heterodimer.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения один из доменов, стимулирующих образование гетеродимера, будет содержать четыре тандемных спиральных домена Еспираль (SEQ ID N0: 21: evaalek-evaalek-evaalek-evaalek), в которых остатки глутамата будут придавать отрицательный заряд при pH 7, в то время как другие домены, стимулирующие образование гетеродимера, будут содержать четыре тандемных домена K-спираль (SEQ ID NO: 22: kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke), в которых остатки лизина будут придавать положительный заряд при pH 7. Присутствие указанных заряженных доменов способствует ассоциации первого и второго полипептидов и, соответственно, способствует образованию гетеродимера. Особенно предпочтительным является домен, способствующий образованию гетеродимера, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов Е-спираль, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, был модифицирован для включения остатка цистеина: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23).According to a preferred embodiment of the present invention, one of the heterodimer formation promoting domains will comprise four tandem helical E-helix domains ( SEQ ID NO: 21: evaalek-evaalek-evaalek-evaalek) in which the glutamate residues will impart a negative charge at pH 7, while the other heterodimer formation promoting domains will comprise four tandem K-helix domains (SEQ ID NO: 22: kvaalke-kvaalke-kvaalke-kvaalke) in which the lysine residues will impart a positive charge at pH 7. The presence of these charged domains promotes the association of the first and second polypeptides and, accordingly, promotes the formation of the heterodimer. Particularly preferred is a heterodimer formation promoting domain in which one of the four tandem helical E-helix domains comprising the sequence given in SEQ ID NO: 21 has been modified to include a cysteine residue: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23).
Аналогичным образом, особенно предпочтительным является домен, способствующий образованию гетеродимера, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов K-спираль, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 22, был модифицирован для включения остатка цистеина: kvaacke-kvaalke-kvaalke-kvaalke (SEQ ID NO: 24).Similarly, particularly preferred is a heterodimer formation promoting domain in which one of the four tandem helical K-helix domains comprising the sequence set forth in SEQ ID NO: 22 has been modified to include a cysteine residue: kvaacke-kvaalke-kvaalke-kvaalke (SEQ ID NO: 24).
Как раскрыто в WO 2012/018687, для того чтобы улучшить фармакокинетические свойства диател в условиях in vivo, диатело может быть модифицировано, чтобы содержать полипептидную часть сывороточного связывающего белка на одном или более концах диатела. Наиболее предпочтительно указанная полипептидная часть сывороточного связывающего белка будет встроена на С-конце диатела. Альбумин является самым распространенным белком в плазме крови и имеет период полувыведения 19 дней у человека. Альбумин содержит несколько сайтов связывания небольших молекул, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и тем самым продлевать их периоды полувыведения из сыворотки крови. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 состоит из 46 остатков аминокислот, образующих стабильный трехвинтовой жгут, и обладает широкой альбуминсвязывающей специфичностью (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules, J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). Соответственно, особенно предпочтительная полипептидная часть сывороточного связывающего белка для улучшения фармакокинетических свойств диатела в условиях in vivo представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из стрептококкового белка G и более предпочтительно альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus dysgalactiae G148 (SEQ ID NO: 25): laeakvlanr eldkygvsdy yknlidnaksAs disclosed in WO 2012/018687, in order to improve the pharmacokinetic properties of the diabodies in vivo, the diabody can be modified to contain a polypeptide portion of a serum binding protein at one or more ends of the diabody. Most preferably, said polypeptide portion of a serum binding protein will be inserted at the C-terminus of the diabody. Albumin is the most abundant protein in blood plasma and has a half-life of 19 days in humans. Albumin contains several small molecule binding sites that allow it to non-covalently bind to other proteins and thereby prolong their half-lives in serum. The albumin-binding domain 3 (ABD3) of the G protein of Streptococcus strain G148 consists of 46 amino acid residues that form a stable three-helical cord and has broad albumin-binding specificity (Johansson, M.U. et al. (2002) Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules, J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). Accordingly, a particularly preferred polypeptide portion of a serum binding protein for improving the pharmacokinetic properties of the diabody in vivo is the albumin binding domain (ABD) of streptococcal protein G, and more preferably the albumin binding domain 3 (ABD3) of protein G of Streptococcus dysgalactiae strain G148 (SEQ ID NO: 25): laeakvlanr eldkygvsdy yknlidnaks
AEGVKALIDE ILAALP.AEGVKALIDE ILAALP.
Как раскрыто в WO 2012/162068 (который включен в настоящее изобретение посредством ссылки), деиммунизированные варианты, содержащие последовательность SEQ ID NO: 25, способны ослаблять или устранять связывание с ГКГС класса II. Исходя из результатов комбинированных мутаций, следующие комбинации замен рассматривают как предпочтительные замены для получения указанного деиммунизированного ABD: 66D/70S+71A; 66S/70S+71A; 66S/70S+79A; 64А/65А/71А; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64А/65А/71А+66Е; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64А/65А/79А+66Е. Варианты ABD содержат модификации L64A, I65A и D79A или модификации N66S, T70S и D79A. Варианты деиммунизированного ABD, содержащего аминокислотную последовательность:As disclosed in WO 2012/162068 (which is incorporated herein by reference), deimmunized variants comprising the sequence of SEQ ID NO: 25 are capable of reducing or eliminating binding to MHC class II. Based on the results of the combined mutations, the following substitution combinations are considered as preferred substitutions for obtaining said deimmunized ABD: 66D/70S+71A; 66S/70S+71A; 66S/70S+79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. ABD variants contain modifications L64A, I65A and D79A or modifications N66S, T70S and D79A. Deimmunized ABD variants containing the amino acid sequence:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP (seq id ^. 26), или аминокислотную последовательность:LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID 66 NAKS 70 A 71 EGVKALIDE ILAALP (seq id ^. 26), or the amino acid sequence:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ilaalp (seq id no: 27), или аминокислотную последовательность:LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 6 6NAKS 70 VEGVKALIA79E ilaalp (seq id no: 27), or amino acid sequence:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP (seq id ^, 28), являются особенно предпочтительными, поскольку указанные деиммунизированные ABD проявляют по существу связывание дикого типа, обеспечивая при этом ослабленное связывание с ГКГС класса II. Соответственно, первая полипептидная цепь указанного диатела, содержащего ABD, содержит пептидный линкер, предпочтительно расположенный на С-конце относительно содержащего Е-спираль (или K-спираль) домена указанной полипептидной цепи, так, чтобы указанный линкер находился между содержащим Е-спираль (или K-спираль) доменом и ABD (который предпочтительно представляет собой деиммунизированный ABD). Предпочтительная последовательность для указанного линкерного пептида представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 29: gggs.LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66 NAKS 70 VEGVKALIA 79 E ILAALP (seq id ^, 28), are particularly preferred because said deimmunized ABDs exhibit substantially wild-type binding while providing attenuated binding to MHC class II. Accordingly, the first polypeptide chain of said ABD-containing diabody comprises a peptide linker, preferably positioned C-terminally relative to the E-helix (or K-helix)-containing domain of said polypeptide chain, such that said linker is located between the E-helix (or K-helix)-containing domain and the ABD (which is preferably a deimmunized ABD). A preferred sequence for said linker peptide is the sequence set forth in SEQ ID NO: 29: gggs.
В. Биспецифические диатела, содержащие области Fc.B. Bispecific diabodies containing Fc regions.
Согласно одному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифические диатела, содержащие область Fc, способную одновременно связываться с PD-1 и вторым эпитопом (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Добавление домена СН2-СН3 IgG к одной или обеим полипептидным цепям антитела так, что соединение цепей диатела приводит к образованию области Fc, увеличивает биологический период полувыведения и/или изменяет валентность диатела. Вклю- 54 047726 чение доменов СН2-СН3 IgG в оба полипептида диатела обеспечит образование двухцепочечного биспецифического диатела, содержащего область Fc (фиг. 2).In one embodiment, the present invention provides bispecific diabodies comprising an Fc region capable of simultaneously binding to PD-1 and a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The addition of a CH2-CH3 domain of IgG to one or both polypeptide chains of the antibody such that the joining of the diabody chains results in the formation of an Fc region, increases the biological half-life and/or alters the valency of the diabody. Inclusion of the CH2-CH3 domains of IgG into both polypeptides of the diabody will ensure the formation of a two-chain bispecific diabody containing the Fc region (Fig. 2).
В другом варианте, включение доменов СН2-СНЗ IgG только в один из полипептидов диатела обеспечит образование более сложного четырехцепочечного биспецифического диатела, содержащего область Fc (фиг. 3А-3С). На фиг. 3С представлено типичное четырехцепочечное диатело, содержащее константный домен легкой цепи (CL) и константный домен тяжелой цепи СН1, однако в качестве альтернативы могут быть использованы фрагменты указанных доменов, а также другие полипептиды (см., например, фиг. ЗА и 3В, публикации патентов США 2013-0295121; 2010-0174053 и 2009-0060910; публикацию европейского патента EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 и PCT публикации WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Следовательно, например, вместо домена СН1 можно применять пептид, содержащий аминокислотную последовательность gvepksc (SEQ ID NO: 16), vepksc (SEQ ID NO: 17) или aepksc (SEQ ID NO: 18), полученную из шарнирного домена IgG человека, и вместо домена CL можно применять 6 С-концевых аминокислот легкой каппа-цепи человека GFNRGEC (SEQ Ш NO: 19) или FNRGEC (SEQ Ш NO: 20).In another embodiment, inclusion of the CH2-CH3 domains of IgG in only one of the diabody polypeptides would result in the formation of a more complex four-chain bispecific diabody containing the Fc region (Fig. 3A-3C). 3C shows an exemplary four-chain diabody comprising a light chain constant domain (CL) and a heavy chain constant domain CH1, however, fragments of these domains, as well as other polypeptides, can be used as an alternative (see, for example, Figs. 3A and 3B, U.S. Patent Publications 2013-0295121; 2010-0174053; and 2009-0060910; European Patent Publication EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; and PCT Publications WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Therefore, for example, instead of the CH1 domain, a peptide comprising the amino acid sequence gvepksc (SEQ ID NO: 16), vepksc (SEQ ID NO: 17) or aepksc (SEQ ID NO: 18) derived from the hinge domain of human IgG can be used, and instead of the CL domain, the 6 C-terminal amino acids of the human kappa light chain GFNRGEC (SEQ ID NO: 19) or FNRGEC (SEQ ID NO: 20) can be used.
Типичное четырехцепочечное диатело, содержащее пептид, представлено на фиг. 3А. В другом варианте или, в дополнение, можно применять пептид, содержащий тандемные спиральные домены противоположного заряда, такие как спиральные домены Е-спираль (SEQ ГО NO: 21: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK или SEQ ГО NO:A typical four-chain diabody comprising the peptide is shown in Fig. 3A. Alternatively or in addition, a peptide comprising tandem helical domains of opposite charge, such as E-helix helical domains (SEQ ID NO: 21: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK or SEQ ID NO:
23: EVAAGEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK);23: EVAAGEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK);
и домены K-спираль (SEQ ID NO: 22:and K-helix domains (SEQ ID NO: 22:
KVikALKE-KVikALKE-KVikALKE-KVikALKE или SEQ ГО NO: 24: KVAACKE-KVAALKEKVAALKE - KVAALKE).KVikALKE-KVikALKE-KVikALKE-KVikALKE or SEQ GO NO: 24: KVAACKE-KVAALKEKVAALKE - KVAALKE).
Типичный спиральный домен, входящий в состав четырехцепочечного диатела, представлен на фиг. 3В.A typical helical domain that is part of a four-stranded diabody is shown in Fig. 3B.
Молекулы диател, содержащих области Fc, согласно настоящему изобретению обычно содержат дополнительные промежуточные линкерные пептиды (линкеры). Как правило, дополнительные линкеры будут содержать 3-20 остатков аминокислот. Дополнительные или альтернативные линкеры, которые могут быть использованы в молекулах антител, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению, включают:The Fc region-containing diabody molecules of the present invention typically contain additional intervening linker peptides (linkers). Typically, the additional linkers will contain 3-20 amino acid residues. Additional or alternative linkers that may be used in the Fc region-containing antibody molecules of the present invention include:
GGGS (SEQ ГО NO: 29), LGGGSG (SEQ ГО NO: 261),GGGS (SEQ GO NO: 29), LGGGSG (SEQ GO NO: 261),
GGGSGGGSGGG (SEQ ГО NO: 262), ASTKG (SEQ ГО NO: 30), DKTHTCPPCP (SEQ ГО NO: 31), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ГО NO: 32), LEPKSS (SEQ ГО NO: 33), APSSS (SEQ ГО NO: 34), и APSSSPME (SEQ ГО NO: 35), LEPKSADKTHTCPPC SEQ ГО NO: 36), GGC и GGG. SEQ ГО NO: 33 можно использовать вместо GGG или GGC, чтобы облегчить клонирование. Помимо этого непосредственно после аминокислот GGG или последовательности, представленной в SEQ ID NO: 33, может быть расположена последовательность, представленная в SEQ ID NO: 31, с образованием альтернативных линкеров: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 263); и LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 37).GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 262), ASTKG (SEQ ID NO: 30), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 31), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 32), LEPKSS (SEQ ID NO: 33), APSSS (SEQ ID NO: 34), and APSSSPME (SEQ ID NO: 35), LEPKSADKTHTCPPC SEQ ID NO: 36), GGC and GGG. SEQ ID NO: 33 can be used instead of GGG or GGC to facilitate cloning. In addition, the amino acids GGG or the sequence presented in SEQ ID NO: 33 can be immediately followed by the sequence presented in SEQ ID NO: 31 to form alternative linkers: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 263); and LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 37).
Молекула диатела, содержащая область Fc, согласно настоящему изобретению может содержать шарнирную область IgG в дополнение или вместо линкера. Примерная шарнирная область содержит:The Fc region-containing diabody molecule of the present invention may comprise an IgG hinge region in addition to or in place of a linker. An exemplary hinge region comprises:
EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 32) из IgGl,EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 32) from IgGl,
ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 11) из IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 12) из IgG4 иERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 11) from IgG2, ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 12) from IgG4 and
ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 13) и вариант шарнирной области IgG4, содержащий стабилизирующую замену для уменьшения обмена нитей.ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 13) and a variant IgG4 hinge region containing a stabilizing substitution to reduce strand exchange.
Как показано на фиг. 3А-3С, диатела согласно настоящему изобретению могут содержать четыре разные цепи. Первая и третья полипептидные цепи указанного диатела содержат три домена: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера, и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3. Вторая и четвертая полипептидные цепи содержат: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера, причем домены, способствующие образованию гетеродимера, способствуют димеризации первой/третьей полипептидных цепей со второй/четвертой полипептидными цепями. Домены VL и/или VH третьей и четвертой полипептидных цепей, а также домены VL и/или VH первой и второй полипептидных цепей могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить четырехвалентное связывание, которое является моноспецифичным, биспецифическим или тетраспецифичным. Обозначение VL3 и VH3 означает, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связываются с третьим эпитопом, указанного диатела. Аналогичным образом,As shown in Fig. 3A-3C, the diabodies of the present invention may comprise four different chains. The first and third polypeptide chains of said diabody comprise three domains: (i) a VL1 containing domain, (ii) a VH2 containing domain, (iii) a heterodimer forming domain, and (iv) a CH2-CH3 containing domain. The second and fourth polypeptide chains comprise: (i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a heterodimer forming domain, wherein the heterodimer forming domains facilitate dimerization of the first/third polypeptide chains with the second/fourth polypeptide chains. The VL and/or VH domains of the third and fourth polypeptide chains and the VL and/or VH domains of the first and second polypeptide chains may be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific or tetraspecific. The designation VL3 and VH3 denotes, respectively, the variable domain of the light chain and the variable domain of the heavy chain that bind to the third epitope of the said diabody. Similarly,
- 55 047726 обозначение VL4 и VH4 означает, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связываются с четвертым эпитопом, указанного диатела. Общая структура полипептидных цепей типичных четырехцепочечных диател, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению представлена в табл. 2:- 55 047726 the designation VL4 and VH4 means, respectively, the variable domain of the light chain and the variable domain of the heavy chain, which bind to the fourth epitope of the said diabody. The general structure of the polypeptide chains of typical four-chain diabodies containing the Fc region, according to the present invention is presented in Table 2:
Таблица 2Table 2
HPD=домен, способствующий образованию гетеродимера.HPD=heterodimer promoting domain.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения диатела согласно настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. содержат четыре эпитопсвязывающих сайта), Fc-содержащими диателами (фиг. 3А-3С), которые состоят из четырех полных полипептидных цепей. Биспецифические четырехвалентные диатела, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммунологически специфичных в отношении PD1 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом PD-1 или с различными эпитопами PD-1), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных в отношении второго эпитопа (например, В7Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д).According to a specific embodiment of the present invention, the diabodies of the present invention are bispecific, tetravalent (i.e., contain four epitope-binding sites), Fc-containing diabodies (Figs. 3A-3C) that are comprised of four complete polypeptide chains. The bispecific tetravalent Fc region-containing diabodies of the present invention comprise two epitope-binding sites immunologically specific for PD1 (which may be capable of binding to the same PD-1 epitope or to different PD-1 epitopes) and two epitope-binding sites specific for a second epitope (e.g., B7H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения биспецифические диатела, содержащие области Fc, могут содержать три полипептидные цепи. Первый полипептид указанного диатела содержит три домена: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Второй полипептид указанных диател содержит: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (iii) домен, который стимулирует гетеродимеризацию и образование ковалентной связи с первой полипептидной цепью диатела. Третий полипептид указанных диател содержит последовательность СН2-СНЗ. Соответственно, первая и вторая полипептидные цепи указанных диател связываются друг с другом с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связываться с первым эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Первый и второй полипептиды связаны друг с другом посредством дисульфидной связи, включающей остатки цистеина в их соответствующих третьих доменах. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи соединяются друг с другом с образованием области Fc, которая стабилизируется посредством дисульфидной связи. Указанные диатела обладают повышенной эффективностью. На фиг. 4А и 4В представлены структуры указанных диател. Указанные биспецифические диатела, содержащие область Fc, могут иметь одну из двух ориентации (табл. 3).According to another embodiment of the present invention, bispecific diabodies comprising Fc regions may comprise three polypeptide chains. The first polypeptide of said diabody comprises three domains: (i) a domain comprising VL1, (ii) a domain comprising VH2, and (iii) a domain comprising the sequence CH2-CH3. The second polypeptide of said diabodies comprises: (i) a domain comprising VL2, (ii) a domain comprising VH1, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and the formation of a covalent bond with the first polypeptide chain of the diabody. The third polypeptide of said diabodies comprises the sequence CH2-CH3. Accordingly, the first and second polypeptide chains of said diabodies bind to each other to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding to the first epitope, as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to the second epitope. The first and second polypeptides are linked to each other by a disulfide bond involving cysteine residues in their respective third domains. Notably, the first and third polypeptide chains are linked to each other to form an Fc region that is stabilized by a disulfide bond. These diabodies have increased potency. Figures 4A and 4B show the structures of these diabodies. These bispecific diabodies containing the Fc region can have one of two orientations (Table 3).
Таблица 3Table 3
HPD=домен, способствующий образованию гетеродимера.HPD=heterodimer promoting domain.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения диатела согласно настоящему изобретению являются биспецифическими, двухвалентными (т.е. содержат два эпитопсвязывающих сайта), Fc-содержащими диателами (фиг. 4А-4В), которые состоят из трех полных полипептидных цепей. Биспецифические, двухвалентные Fc-содержащие диатела согласно настоящему изобретению содержат один сайт связывания эпитопа, иммунологически специфичный в отношении PD-1, и один сайт связывания эпитопа, специфичный в отношении второго эпитопа (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).In a specific embodiment of the present invention, the diabodies of the present invention are bispecific, bivalent (i.e., contain two epitope-binding sites), Fc-containing diabodies (Figs. 4A-4B) that are comprised of three complete polypeptide chains. The bispecific, bivalent Fc-containing diabodies of the present invention comprise one epitope-binding site immunologically specific for PD-1 and one epitope-binding site specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения биспецифические диатела, содерAccording to another embodiment of the present invention, bispecific diabodies containing
- 56 047726 жащие области Fc, могут содержать в общей сложности пять полипептидных цепей. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения две из указанных пяти полипептидных цепей содержат одинаковую аминокислотную последовательность. Первая полипептидная цепь указанных диател содержит: (i) домен, содержащий VH1, (ii) домен, содержащий СН1, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Первая полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH1 и константную область тяжелой цепи. Вторая и пятая полипептидные цепи указанных диател содержат: (i) домен, содержащий VL1, и (ii) домен, содержащий CL. Вторая и/или пятая полипептидные цепи указанных диател могут представлять собой легкие цепи антитела, которое содержит VL1, комплементарный VH1 первой/третьей полипептидной цепи. Первая, вторая и/или пятая полипептидные цепи могут быть выделены из природных антител. В другом варианте, они могут быть сконструированы рекомбинантно. Третья полипептидная цепь указанных диател содержит: (i) домен, содержащий VH1, (ii) домен, содержащий СН1, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ, (iv) домен, содержащий VL2, (v) домен, содержащий VH3, и (vi) домен, способствующий образованию гетеродимера, причем домены, способствующие образованию гетеродимера, способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью. Четвертый полипептид указанных диател содержит: (i) домен, содержащий VL3, (ii) домен, содержащий VH2, и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и образованию ковалентной связи с третьей полипептидной цепью диатела.- 56 047726 containing Fc regions may comprise a total of five polypeptide chains. According to a specific embodiment of the present invention, two of said five polypeptide chains comprise the same amino acid sequence. The first polypeptide chain of said diabodies comprises: (i) a domain comprising VH1, (ii) a domain comprising CH1, and (iii) a domain comprising the sequence CH2-CH3. The first polypeptide chain may be a heavy chain of an antibody that comprises VH1 and a heavy chain constant region. The second and fifth polypeptide chains of said diabodies comprise: (i) a domain comprising VL1, and (ii) a domain comprising CL. The second and/or fifth polypeptide chains of said diabodies may be light chains of an antibody that comprises VL1 complementary to VH1 of the first/third polypeptide chain. The first, second and/or fifth polypeptide chains may be isolated from natural antibodies. In another embodiment, they can be constructed recombinantly. The third polypeptide chain of said diabodies comprises: (i) a domain containing VH1, (ii) a domain containing CH1, (iii) a domain containing the sequence CH2-CH3, (iv) a domain containing VL2, (v) a domain containing VH3, and (vi) a domain facilitating the formation of a heterodimer, wherein the domains facilitating the formation of a heterodimer facilitate the dimerization of the third chain with the fourth chain. The fourth polypeptide of said diabodies comprises: (i) a domain containing VL3, (ii) a domain containing VH2, and (iii) a domain that facilitates heterodimerization and the formation of a covalent bond with the third polypeptide chain of the diabody.
Соответственно, первая и вторая, а также третья и пятая, полипептидные цепи указанных диател связываются с образованием двух сайтов связывания VL1/VH1, способных связываться с первым эпитопом. Третья и четвертая полипептидные цепи указанных диател связываются с образованием сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом, а также сайтом связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Первый и третий полипептиды связываются друг с другом посредством дисульфидной связи, включающей остатки цистеина в их соответствующих константных областях. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи соединяются друг с другом с образованием области Fc. Указанные диатела обладают повышенной эффективностью. На фиг. 5 представлена структура указанных диател. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различными так, чтобы обеспечить связывание, которое является моноспецифичным, биспецифическим или триспецифичным. Однако, как указано в настоящем документе, указанные домены предпочтительно выбраны так, чтобы связываться с PD-1 и вторым эпитопом (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).Accordingly, the first and second, as well as the third and fifth, polypeptide chains of said diabodies bind to form two VL1/VH1 binding sites capable of binding to the first epitope. The third and fourth polypeptide chains of said diabodies bind to form a VL2/VH2 binding site, which is capable of binding to the second epitope, as well as a VL3/VH3 binding site, which is capable of binding to the third epitope. The first and third polypeptides bind to each other via a disulfide bond involving cysteine residues in their respective constant regions. It is noteworthy that the first and third polypeptide chains bind to each other to form an Fc region. Said diabodies have increased efficiency. Fig. 5 shows the structure of said diabodies. It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2 and VL3/VH3 domains may be the same or different so as to provide binding that is monospecific, bispecific or trispecific. However, as indicated herein, said domains are preferably selected so as to bind to PD-1 and a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).
Домены VL и VH полипептидных цепей выбраны так, чтобы образовывать сайты связывания VL/VH, специфичные в отношении желательного эпитопа. Сайты связывания VL/VH, образованные при связывании полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить тетравалентное связывание, которое является моноспецифичным, биспецифическим, триспецифичным или тетраспецифичным. В частности, домены VL и VH могут быть выбраны так, что биспецифическое антитело может содержать два сайта связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа или три сайта связывания для первого эпитопа и один сайт связывания для второго эпитопа, или два сайта связывания для первого эпитопа, один сайт связывания для второго эпитопа и один сайт связывания для третьего эпитопа (как показано на фиг. 5). Общая структура полипептидных цепей типичных пятицепочечных диател, содержащих область Fc, представлена в табл. 4.The VL and VH domains of the polypeptide chains are selected to form VL/VH binding sites specific for a desired epitope. The VL/VH binding sites formed upon binding of the polypeptide chains may be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific, trispecific, or tetraspecific. In particular, the VL and VH domains may be selected such that the bispecific antibody may comprise two binding sites for a first epitope and two binding sites for a second epitope, or three binding sites for the first epitope and one binding site for the second epitope, or two binding sites for the first epitope, one binding site for the second epitope, and one binding site for a third epitope (as shown in Fig. 5). The general structure of the polypeptide chains of typical five-chain diabodies containing an Fc region is presented in Table 4.
Таблица 4Table 4
HPD=домен, способствующий образованию гетеродимера.HPD=heterodimer promoting domain.
- 57 047726- 57 047726
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения диатела согласно настоящему изобретению являются биспецифическими четырехвалентными (т.е. содержат четыре эпитопсвязывающих сайта) диателами, содержащими область Fc, которые состоят из пяти полных полипептидных цепей, содержащих два сайта связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения биспецифические четырехвалентные диатела, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммунологически специфичных в отношении PD-1 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом PD-1 или с различными эпитопами PD-1), и два эпитопсвязывающих сайта, специфичных в отношении второго эпитопа (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения биспецифические четырехвалентные диатела, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению содержат три эпитопсвязывающих сайта, иммунологически специфичных в отношении PD-1, которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом PD-1 или с различными эпитопами PD-1), и один эпитопсвязывающий сайт, специфичный в отношении второго эпитопа (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения биспецифические четырехвалентные диатела, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению содержат один эпитопсвязывающий сайт, иммунологически специфичный в отношении PD-1, и три эпитопсвязывающих сайта, специфичных в отношении второго эпитопа (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 ГКГС класса I или II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.).According to a specific embodiment of the present invention, the diabodies of the present invention are bispecific tetravalent (i.e., contain four epitope-binding sites) diabodies containing an Fc region that consist of five complete polypeptide chains containing two binding sites for a first epitope and two binding sites for a second epitope. According to one embodiment of the present invention, the bispecific tetravalent diabodies comprising an Fc region according to the present invention comprise two epitope-binding sites immunologically specific for PD-1 (which may be capable of binding to the same epitope of PD-1 or to different epitopes of PD-1) and two epitope-binding sites specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). According to another embodiment of the present invention, the bispecific tetravalent diabodies comprising an Fc region according to the present invention comprise three epitope-binding sites immunologically specific for PD-1, which may be capable of binding to the same epitope of PD-1 or to different epitopes of PD-1), and one epitope-binding site specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). According to another embodiment of the present invention, the bispecific tetravalent diabodies comprising an Fc region according to the present invention comprise one epitope-binding site immunologically specific for PD-1 and three epitope-binding sites specific for a second epitope (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.).
С. Биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, содержащие области Fc.C. Bispecific trivalent binding molecules containing Fc regions.
Согласно другому варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, содержащие область Fc, способные одновременно связываться с первым эпитопом, вторым эпитопом и третьим эпитопом, причем по меньшей мере один из указанных эпитопов не идентичен другому. Соответственно, указанные биспецифические диатела содержат домены VL1/VH1, которые способны связываться с первым эпитопом, домены VL2/VH2, которые способны связываться со вторым эпитопом, и домены VL3/VH3, которые способны связываться с третьим эпитопом. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения один или два из указанных эпитопов представляют собой эпитоп PD-1, и другой (или другие) из указанных эпитопов не является эпитопом PD-1 (например, эпитоп В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Указанные биспецифические трехвалентные связывающие молекулы содержат три эпитопсвязывающих сайта, два из которых являются связывающими доменами, характерными для диател, которые обеспечивают сайт связывания А и сайт связывания В, и один из которых является связывающим доменом, не характерным для диател, который обеспечивает сайт связывания С (см., например, фиг. 6A-6F и PCT заявку: PCT/US15/33081; и PCT/US15/33076).According to another embodiment, according to the present invention, bispecific trivalent binding molecules are provided, comprising an Fc region, capable of simultaneously binding to a first epitope, a second epitope and a third epitope, wherein at least one of said epitopes is not identical to the other. Accordingly, said bispecific diabodies comprise VL1/VH1 domains, which are capable of binding to the first epitope, VL2/VH2 domains, which are capable of binding to the second epitope, and VL3/VH3 domains, which are capable of binding to the third epitope. According to one embodiment of the present invention, one or two of said epitopes are a PD-1 epitope and the other (or others) of said epitopes are not a PD-1 epitope (e.g., an epitope of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-1, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The bispecific trivalent binding molecules comprise three epitope-binding sites, two of which are diabody-specific binding domains that provide binding site A and binding site B, and one of which is a non-diabody-specific binding domain that provides binding site C (see, for example, Figs. 6A-6F and PCT application PCT/US15/33081; and PCT/US15/33076).
Как правило, трехвалентные связывающие молекулы согласно настоящему изобретению будут содержать четыре различные полипептидные цепи (см. фиг.6А-6В), однако молекулы могут содержать меньшее или большее количество полипептидных цепей, например, путем гибридизации указанных полипептидных цепей друг с другом (например, посредством пептидной связи) или путем деления указанных полипептидных цепей с образованием дополнительных полипептидных цепей или путем связывания меньшего количества или дополнительных полипептидных цепей посредством дисульфидных связей. На фиг. 6B-6F проиллюстрирован данный аспект настоящего изобретения путем схематического представления указанных молекул, содержащих три полипептидные цепи. Как показано на фиг. 6A-6F, трехвалентные связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут иметь альтернативные ориентации, в которых связывающие домены, характерные для диател, являются N-концевыми (фиг. 6А, 6С и 6D) или С-концевыми (фиг. 6В, 6Е и 6F) относительно области Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения первая полипептидная цепь указанных трехвалентных связывающих молекул согласно настоящему изобретению содержит: (i) домен, содержащий VL1, (ii) домен, содержащий VH2, (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера, и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Домены VL1 и VL2 будут расположены в направлении N-конца или С-конца относительно домена, содержащего СН2-СНЗ, как представлено в табл. 5 (фиг. 6А и 6В). Вторая полипептидная цепь указанных вариантов реализации содержит: (i) домен, содержащий VL2, (ii) домен, содержащий VH1, и (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера. Третья полипептидная цепь указанных вариантов реализации содержит: (i) домен, содержащий VH3, (ii) домен, содержащий СН1, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СНЗ. Третья полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которая содержит VH3 и константную область тяжелой цепи. Четвертый полипептид указанных вариантов реализации содержит: (i) домен, содержащий VL3, и (ii) домен, содержащий CL. Четвертая полипептидная цепь может представлять собой легкую цепь антитела, которая содержит VL3, комплементарный VH3 третьей полипептидной цепи. Третья или четвертая полипептидные цепи могут быть выделены из природных антител. В другом варианте, они могут быть сконструированы с помощьюTypically, the trivalent binding molecules of the present invention will comprise four different polypeptide chains (see Figs. 6A-6B), however, the molecules may comprise fewer or more polypeptide chains, such as by hybridizing said polypeptide chains to each other (e.g., via a peptide bond) or by dividing said polypeptide chains to form additional polypeptide chains or by linking fewer or additional polypeptide chains via disulfide bonds. Figs. 6B-6F illustrate this aspect of the present invention by schematically representing said molecules comprising three polypeptide chains. As shown in Figs. 6A-6F, the trivalent binding molecules of the present invention may have alternative orientations in which the binding domains characteristic of diabodies are N-terminal (Figs. 6A, 6C and 6D) or C-terminal (Figs. 6B, 6E and 6F) relative to the Fc region. According to some embodiments of the present invention, the first polypeptide chain of the trivalent binding molecules of the present invention comprises: (i) a VL1 containing domain, (ii) a VH2 containing domain, (iii) a heterodimer formation promoting domain, and (iv) a CH2-CH3 containing domain. The VL1 and VL2 domains will be located in an N-terminal or C-terminal direction relative to the CH2-CH3 containing domain, as shown in Table 5 (Figs. 6A and 6B). The second polypeptide chain of the embodiments comprises: (i) a VL2 containing domain, (ii) a VH1 containing domain, and (iii) a heterodimer formation promoting domain. The third polypeptide chain of the embodiments comprises: (i) a VH3 containing domain, (ii) a CH1 containing domain, and (iii) a CH2-CH3 containing domain. The third polypeptide chain may be a heavy chain of an antibody that comprises VH3 and a heavy chain constant region. The fourth polypeptide of these embodiments comprises: (i) a VL3-containing domain, and (ii) a CL-containing domain. The fourth polypeptide chain may be a light chain of an antibody that comprises a VL3 complementary to the VH3 of the third polypeptide chain. The third or fourth polypeptide chains may be isolated from natural antibodies. Alternatively, they may be engineered using
- 58 047726 рекомбинантных, синтетических или других способов.- 58 047726 recombinant, synthetic or other methods.
Вариабельные домены легкой цепи первой и второй полипептидных цепей отделены от вариабельных доменов тяжелой цепи указанных полипептидных цепей промежуточным спейсерным линкером, длина которого недостаточна для соединения их доменов VL1/VH2 (или VL2/VH1) с образованием эпитопсвязывающего сайта, способного связываться с любым из первого или второго эпитопов. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) для этой цели содержит последовательность, представленную в (SEQ ID NO: 14): GGGSGGGG. Другие домены трехвалентных связывающих молекул могут быть разделены одним или более промежуточными спейсерными пептидами, необязательно содержащими остаток цистеина. Примерные линкеры, пригодные для получения трехвалентных связывающих молекул, предложены в настоящем документе и также предложены в PCT заявке: PCT/US15/33081; и PCT/US15/33076. Соответственно, первая и вторая полипептидные цепи указанных трехвалентных связывающих молекул соединяются с образованием сайта связывания VL1/VH1, способного связываться с первым эпитопом, а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом. Третья и четвертая полипептидные цепи указанных трехвалентных связывающих молекул соединяются с образованием сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различными так, чтобы обеспечить связывание, которое является моноспецифичным, биспецифическим или триспецифичным.The light chain variable domains of the first and second polypeptide chains are separated from the heavy chain variable domains of said polypeptide chains by an intervening spacer linker that is insufficient in length to connect their VL1/VH2 (or VL2/VH1) domains to form an epitope-binding site capable of binding to either of the first or second epitopes. A preferred intervening spacer peptide (linker 1) for this purpose comprises the sequence presented in (SEQ ID NO: 14): GGGSGGGG. Other domains of the trivalent binding molecules may be separated by one or more intervening spacer peptides, optionally comprising a cysteine residue. Exemplary linkers useful for preparing trivalent binding molecules are provided herein and are also provided in PCT application: PCT/US15/33081; and PCT/US15/33076. Accordingly, the first and second polypeptide chains of said trivalent binding molecules are joined to form a VL1/VH1 binding site capable of binding to a first epitope, as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope. The third and fourth polypeptide chains of said trivalent binding molecules are joined to form a VL3/VH3 binding site that is capable of binding to a third epitope. It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2 and VL3/VH3 domains can be the same or different so as to provide binding that is monospecific, bispecific or trispecific.
Как описано выше, трехвалентные связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать три полипептида. Трехвалентные связывающие молекулы, содержащие три полипептидные цепи, могут быть получены путем присоединения доменов четвертого полипептида к N-концу VH3содержащего домена третьего полипептида. В другом варианте, используется третья полипептидная цепь трехвалентной связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, содержащая следующие три домена: (i) домен, содержащий VL3, (ii) домен, содержащий VH3, и (iii) домен, содержащий СН2-СНЗ, причем VL3 и VH3 отделены друг от друга промежуточным спейсерным пептидом, который является достаточно длинным (содержит по меньшей мере 9 или более аминокислотных остатков), чтобы обеспечить возможность соединения указанных доменов с образованием эпитопсвязывающего сайта. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различными так, чтобы обеспечить связывание, которое является моноспецифичным, биспецифическим или триспецифичным. Однако в настоящем документе указанные домены предпочтительно выбраны так, чтобы связываться с PD-1 и вторым эпитопом (или вторым и третьим эпитопом) (предпочтительно указанные эпитопы представляют собой эпитопы В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). В частности, домены VL и VH могут быть выбраны так, что трехвалентная связывающая молекула содержит два сайта связывания для первого эпитопа и один сайт связывания для второго эпитопа или один сайт связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа, или один сайт связывания для первого эпитопа, один сайт связывания для второго эпитопа и один сайт связывания для третьего эпитопа. Общая структура полипептидных цепей типичных трехвалентных связывающих молекул согласно настоящему изобретению представлена на фиг. 6A-6F и в табл. 5.As described above, the trivalent binding molecules of the present invention may comprise three polypeptides. Trivalent binding molecules comprising three polypeptide chains may be prepared by joining domains of a fourth polypeptide to the N-terminus of a VH3-containing domain of a third polypeptide. In another embodiment, a third polypeptide chain of the trivalent binding molecule of the present invention is used, comprising the following three domains: (i) a VL3-containing domain, (ii) a VH3-containing domain, and (iii) a CH2-CH3-containing domain, wherein VL3 and VH3 are separated from each other by an intervening spacer peptide, which is sufficiently long (containing at least 9 or more amino acid residues) to allow the said domains to be joined to form an epitope-binding site. It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2 and VL3/VH3 domains may be the same or different so as to provide binding that is monospecific, bispecific or trispecific. However, herein, said domains are preferably selected so as to bind to PD-1 and a second epitope (or a second and third epitope) (preferably, said epitopes are epitopes of B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3 MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). In particular, the VL and VH domains can be selected such that the trivalent binding molecule comprises two binding sites for a first epitope and one binding site for a second epitope, or one binding site for a first epitope and two binding sites for a second epitope, or one binding site for a first epitope, one binding site for a second epitope and one binding site for a third epitope. The general structure of the polypeptide chains of typical trivalent binding molecules according to the present invention is shown in Fig. 6A-6F and in Table 5.
Таблица 5Table 5
HPD=домен, способствующий образованию гетеродимера.HPD=heterodimer promoting domain.
Согласно одному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифи- 59 047726 ческие трехвалентные связывающие молекулы, которые содержат два эпитопсвязывающих сайта для PD1 и один эпитопсвязывающий сайт для второго эпитопа, присутствующего на молекуле, отличной от PD1 (например, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта для PD-1 могут связываться с одним и тем же эпитопом или различными эпитопами. Согласно другому варианту реализации согласно настоящему изобретению предложены биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, которые содержат один эпитопсвязывающий сайт для PD-1 и два эпитопсвязывающих сайта, которые связываются со вторым антигеном, присутствующим на молекуле, отличной от PD-1 (например, В7-Н3, В7Н4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, ГКГС класса I или II, ОХ40, PD-L1, TCR, TIM-3 и т.д.). Два эпитопсвязывающих сайта для второго антигена могут связываться с одним и тем же эпитопом или различными эпитопами антигена (например, с одинаковыми или различными эпитопами LAG-3). Как указано выше, указанные биспецифические трехвалентные связывающие молекулы могут содержать три или четыре полипептидные цепи.In one embodiment, the present invention provides bispecific trivalent binding molecules that comprise two epitope-binding sites for PD1 and one epitope-binding site for a second epitope present on a molecule other than PD1 (e.g., B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The two epitope-binding sites for PD-1 may bind to the same epitope or different epitopes. According to another embodiment, the present invention provides bispecific trivalent binding molecules that comprise one epitope-binding site for PD-1 and two epitope-binding sites that bind to a second antigen present on a molecule other than PD-1 (e.g., B7-H3, B7H4, BTLA, CD40, CD80, CD86, CD137, CTLA-4, ICOS, KIR, LAG-3, MHC class I or II, OX40, PD-L1, TCR, TIM-3, etc.). The two epitope-binding sites for the second antigen may bind to the same epitope or different epitopes of the antigen (e.g., the same or different epitopes of LAG-3). As noted above, the bispecific trivalent binding molecules may comprise three or four polypeptide chains.
VII. Константные домены и области Fc.VII. Constant domains and Fc regions.
Согласно настоящему изобретению предложены константные домены антитела, которые можно применять в получении PD-1-связывающих молекул (например, антител, диател, трехвалентных связывающих молекул и т.д.) согласно настоящему изобретению.The present invention provides antibody constant domains that can be used in the production of PD-1 binding molecules (e.g., antibodies, diabodies, trivalent binding molecules, etc.) according to the present invention.
Предпочтительный домен CL представляет собой домен CL легкой каппа-цепи IgG человека. Аминокислотная последовательность примерного домена CL легкой каппа-цепи человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 8):A preferred CL domain is the CL domain of the human IgG kappa light chain. The amino acid sequence of an exemplary CL domain of the human kappa light chain is the sequence shown below (SEQ ID NO: 8):
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSGRTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECNSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
В другом варианте примерный домен CL представляет собой домен CL лямбда-цепи IgG человека. Аминокислотная последовательность примерного домена CL лямбда-цепи человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 9):In another embodiment, an exemplary CL domain is a CL domain of a human IgG lambda chain. The amino acid sequence of an exemplary CL domain of a human lambda chain is the sequence shown below (SEQ ID NO: 9):
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKAQPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAPGVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECSTECS
Согласно настоящему изобретению PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать область Fc. Область Fc указанных молекул согласно настоящему изобретению может быть любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать домен СН1 и/или шарнирную область. Если домен СН1 и/или шарнирная область присутствуют в указанных молекулах, то они могут быть любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4) и предпочтительно имеют тот же изотип, что и желательная область Fc.According to the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention may comprise an Fc region. The Fc region of said molecules of the present invention may be of any isotype (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4). The PD-1 binding molecules of the present invention may further comprise a CH1 domain and/or a hinge region. If a CH1 domain and/or a hinge region are present in said molecules, they may be of any isotype (e.g., IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4), and preferably have the same isotype as the desired Fc region.
Примерный домен СН1 представляет собой домен CH1 IgG1 человека.An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG1.
Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 10):The amino acid sequence of an exemplary CH1 domain of human IgG1 is as follows (SEQ ID NO: 10):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
Примерный домен СН1 представляет собой домен CH1 IgG2 человека.An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG2.
Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 257):The amino acid sequence of an exemplary CH1 domain of human IgG2 is as follows (SEQ ID NO: 257):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
Примерный домен СН1 представляет собой домен CH1 IgG4 человека.An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG4.
Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 254):The amino acid sequence of an exemplary CH1 domain of human IgG4 is as follows (SEQ ID NO: 254):
I ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVI ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
Одна примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область IgG1 человека. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 32): epkscdkthtcppcp.One exemplary hinge region is a human IgG1 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG1 hinge region is as follows (SEQ ID NO:32): epkscdkthtcppcp.
Другая примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область IgG2 человека. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 11): erkccvecppcp.Another exemplary hinge region is a human IgG2 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG2 hinge region is as follows (SEQ ID NO: 11): erkccvecppcp.
Другая примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область IgG4 человека. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 12): eskygppcpscp.Another exemplary hinge region is a human IgG4 hinge region. The amino acid sequence of an exemplary human IgG4 hinge region is the sequence shown below (SEQ ID NO: 12): eskygppcpscp.
Как описано в настоящем документе, шарнирная область IgG4 может содержать стабилизирующуюAs described herein, the hinge region of IgG4 may contain a stabilizing
- 60 047726 мутацию, такую как замена S228P. Аминокислотная последовательность типичной стабилизированной шарнирной области IgG4 представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 13): ESKYGPPCPPCP.- 60 047726 mutation such as S228P substitution. The amino acid sequence of a typical stabilized hinge region of IgG4 is the sequence shown below (SEQ ID NO: 13): ESKYGPPCPPCP.
Область Fc молекул, содержащих область Fc (например, антител, диател и трехвалентных молекул), согласно настоящему изобретению может представлять собой полную область Fc (например, полную область Fc IgG) или только фрагмент области Fc. Необязательно, область Fc молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению не имеет С-концевого аминокислотного остатка лизина. В частности, область Fc молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению может представлять собой модифицированный вариант области Fc. Несмотря на то что область Fc биспецифических молекул, содержащих области Fc, согласно настоящему изобретению может быть способна связываться с одним или более рецепторами Fc (например, FcyR), более предпочтительно указанный вариант области Fc имеет измененные характеристики связывания с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа) или будет иметь существенно сниженную или отсутствующую способность связываться с ингибирующим рецептором. Соответственно, область Fc молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению может содержать некоторые или все домены СН2 и/или некоторые или все домены CH3 полной области Fc или может содержать вариант последовательности СН2 и/или вариант последовательности CH3 (который может содержать, например, одну или более вставок и/или одну или более делеций по отношению к доменам СН2 или CH3 полной области Fc). Указанные области Fc могут содержать участки полипептида, отличные от области Fc, или могут содержать части областей Fc, которые в природных условиях не являются полными, или могут содержать неприродные ориентации доменов СН2 и/или CH3 (такие как, например, два домена СН2 или два домена CH3, или, в направлении от N-конца к Сконцу, домен CH3, соединенный с доменом СН2, и т.д.).The Fc region of the Fc region-containing molecules (e.g., antibodies, diabodies, and trivalent molecules) of the present invention may be a complete Fc region (e.g., a complete Fc region of an IgG) or only a fragment of an Fc region. Optionally, the Fc region of the Fc region-containing molecules of the present invention does not have a C-terminal lysine amino acid residue. In particular, the Fc region of the Fc region-containing molecules of the present invention may be a modified version of the Fc region. Although the Fc region of the bispecific molecules comprising the Fc regions of the present invention may be capable of binding to one or more Fc receptors (e.g., FcyR), more preferably, said variant Fc region has altered binding characteristics to FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) or FcyRIIIB (CD16b) (relative to the binding exhibited by the wild-type Fc region) or will have a substantially reduced or absent ability to bind to an inhibitory receptor. Accordingly, the Fc region of the Fc region-containing molecules of the present invention may comprise some or all of the CH2 domains and/or some or all of the CH3 domains of a full Fc region, or may comprise a CH2 sequence variant and/or a CH3 sequence variant (which may comprise, for example, one or more insertions and/or one or more deletions with respect to the CH2 or CH3 domains of a full Fc region). Said Fc regions may contain regions of a polypeptide other than the Fc region, or may contain portions of Fc regions that are not complete in nature, or may contain non-natural orientations of the CH2 and/or CH3 domains (such as, for example, two CH2 domains or two CH3 domains, or, in the N-terminal to C-terminal direction, a CH3 domain connected to a CH2 domain, etc.).
Модификации области Fc, идентифицированные как изменяющие эффекторную функцию, известны в данной области техники, включая модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcyRIIA (CD16A) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcyRIIB (CD32B) (см., например, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells in vitro And Controls Tumor Expansion in vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, Cancer Res. 57(18):8882-8890). Примерные варианты областей Fc IgG1 человека со сниженным связыванием с CD32B и/или повышенным связыванием с CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Указанные замены аминокислот могут присутствовать в области Fc IgG1 человека в любой комбинации или дополнительной комбинации. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc IgG1 человека содержит замену F243L, R292P и Y300L. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc IgG1 человека содержит замену F243L, R292P, Y300L, V305I и P296L.Modifications of the Fc region identified as altering effector function are known in the art, including modifications that increase binding to activating receptors (e.g., FcγRIIA (CD16A)) and decrease binding to inhibitory receptors (e.g., FcγRIIB (CD32B)) (see, e.g., Stavenhagen, J.B. et al. (2007) Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells in Vitro And Controls Tumor Expansion in Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors, Cancer Res. 57(18):8882-8890). Exemplary embodiments of human IgG1 Fc regions with reduced binding to CD32B and/or increased binding to CD16A comprise the substitutions F243L, R292P, Y300L, V305I, or P296L. These amino acid substitutions may be present in the human IgG1 Fc region in any combination or additional combination. According to one embodiment of the present invention, the human IgG1 Fc region variant comprises the substitution F243L, R292P and Y300L. According to another embodiment of the present invention, the human IgG1 Fc region variant comprises the substitution F243L, R292P, Y300L, V305I and P296L.
В частности, предпочтительно области Fc полипептидных цепей молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению проявляют уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1). Варианты областей Fc и мутированные формы, способные опосредовать такое измененное связывание, описаны выше. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения молекулы, содержащие области Fc, согласно настоящему изобретению содержат область Fc IgG, которая проявляет сниженную эффекторную функцию АЗКЦ. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей указанных молекул, содержащих область Fc, содержит любую 1, 2 или 3 замены: L234A, L235A, N297Q и N297G. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариант области Fc IgG человека содержит замену N297Q, замену N297G, замены L234A и L235A или замену D265A, поскольку эти мутации устраняют связывание с FcR. В другом варианте используют домен СН2-СН3 области Fc, который по своей природе проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcyRIIIA (CD16а) и/или сниженную эффекторную функцию (относительно связывания, проявляемого областью Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения молекулы, содержащие области Fc, согласно настоящему изобретению содержат область Fc IgG2 (SEQ ID NO: 2) или область Fc IgG4 (SEQ ID NO: 4). При использовании области Fc IgG4 в область настоящего изобретения включено введение стабилизирующей мутации, такой как замена S228P в шарнирной области, описанной выше (см., например, SEQ ID NO: 13). Поскольку замены N297G, N297Q, L234A, L235A и D265A устраняют эффекторную функцию, в тех случаях, когда желательной является эффекторная функция, указанные замены предпочтительно не будут использованы.In particular, it is preferred that the Fc regions of the polypeptide chains of the Fc region-containing molecules of the present invention exhibit reduced (or substantially absent) binding to FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) or FcγRIIIB (CD16b) (relative to the binding exhibited by the wild-type IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 1). Variants of the Fc regions and mutated forms capable of mediating such altered binding are described above. According to a specific embodiment of the present invention, the Fc region-containing molecules of the present invention comprise an IgG Fc region that exhibits reduced ADCC effector function. According to a preferred embodiment of the present invention, the CH2-CH3 domain of the first and/or third polypeptide chains of said Fc region-containing molecules comprises any 1, 2 or 3 of the substitutions: L234A, L235A, N297Q and N297G. In another embodiment of the present invention, a variant human IgG Fc region comprises a N297Q substitution, an N297G substitution, L234A and L235A substitutions, or a D265A substitution, since these mutations abolish binding to FcRs. In another embodiment, a CH2-CH3 domain of an Fc region is used that inherently exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγRIIIA (CD16a) and/or reduced effector function (relative to the binding exhibited by the wild-type IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 1)). In a specific embodiment of the present invention, molecules comprising Fc regions of the present invention comprise an IgG2 Fc region (SEQ ID NO: 2) or an IgG4 Fc region (SEQ ID NO: 4). When using the Fc region of IgG4, it is within the scope of the present invention to introduce a stabilizing mutation, such as the S228P substitution in the hinge region described above (see, for example, SEQ ID NO: 13). Since the N297G, N297Q, L234A, L235A and D265A substitutions eliminate effector function, in cases where effector function is desired, these substitutions will preferably not be used.
В частности, предпочтительно области Fc полипептидных цепей молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению проявляют увеличенный период полувыведения из сыворотки крови (относительно периода полувыведения, проявляемого соответствующей Fc дикого типа). Варианты области Fc и мутированные формы, имеющие увеличенный период полувыведения из сыворотки крови,In particular, it is preferred that the Fc regions of the polypeptide chains of the Fc region-containing molecules of the present invention exhibit an increased serum half-life (relative to the half-life exhibited by the corresponding wild-type Fc). Fc region variants and mutated forms having an increased serum half-life,
- 61 047726 описаны выше. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения домен СН2CH3 первой и/или третьей полипептидных цепей указанных молекул, содержащих область Fc, содержит любую 1, 2 или 3 из замен: M252Y, S254T и Т256Е. В область настоящего изобретения также включены молекулы, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению, содержащие варианты области Fc, содержащие:- 61 047726 are described above. According to a preferred embodiment of the present invention, the CH2CH3 domain of the first and/or third polypeptide chains of said Fc region-containing molecules comprises any 1, 2 or 3 of the substitutions: M252Y, S254T and T256E. Also included within the scope of the present invention are Fc region-containing molecules according to the present invention comprising Fc region variants comprising:
(A) одну или более мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcyR; и (B) одну или более мутаций, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки крови.(A) one or more mutations that alter effector function and/or FcyR; and (B) one or more mutations that increase serum half-life.
Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и CH3 молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению будет содержать замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 258):A preferred IgG1 sequence for the CH2 and CH3 domains of the Fc region-containing molecules of the present invention will comprise the substitutions L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 258):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.
Предпочтительная последовательность IgG4 для доменов СН2 и CH3 молекул, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению будет содержать замены M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 259):A preferred IgG4 sequence for the CH2 and CH3 domains of the Fc region-containing molecules of the present invention will comprise the substitutions M252Y/S254T/T256E (SEQ ID NO: 259):
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVDAPEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPSGVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVESIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX where X is lysine (K) or absent.
Для диател и трехвалентных связывающих молекул, первая и третья полипептидные цепи которых не идентичны, желательным является снижение или предотвращение гомодимеризации между доменами СН2-СНЗ двух первых полипептидных цепей или между доменами СН2-СНЗ двух третьих полипептидных цепей. Домены СН2 и/или CH3 указанных полипептидных цепей не обязательно должны иметь одинаковые последовательности, и преимущественно модифицированы, чтобы стимулировать комплексообразование между двумя полипептидными цепями. Например, замена аминокислоты (предпочтительно замена аминокислотой, содержащей объемную боковую группу, образующую выступ, например, триптофаном), может быть введена в домен СН2 или CH3 так, что стерическое влияние предотвратит взаимодействие с доменом, мутированным аналогичным образом, и приведет к спариванию мутированного домена с доменом, в который была введена комплементарная или содействующая мутация, т.е. впадина (например, замена глицином). Такие группы мутаций могут быть введены в любую пару полипептидов, содержащих домены СН2-СНЗ, которые образуют область Fc. Способы модификации белков для стимулирования гетеродимеризации по отношению к гомодимеризации хорошо известны в данной области техники, в частности, в отношении модификации молекул, подобных иммуноглобулинам, и включены в область настоящего изобретения (см., например, работы Ridgway et al. (1996) 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CHS Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых полностью включена в настоящее изобретение посредством ссылки). Предпочтительно выступ вводят в домены СН2-СНЗ первой полипептидной цепи, и впадину вводят в домены СН2-СНЗ третьей полипептидной цепи диател, содержащих три полипептидные цепи. Соответственно, выступ предотвратит гомодимеризацию первой полипептидной цепи посредством ее доменов СН2 и/или CH3. Поскольку третья полипептидная цепь предпочтительно содержит замену, обеспечивающую впадину, она будет гетеродимеризоваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризоваться сама с собой. Указанная стратегия может быть использована для антител и трехвалентных связывающих молекул, содержащих три, четыре или пять цепей, описанных выше, в которых выступ введен в домены СН2-СНЗ первой полипептидной цепи, и впадина введена в домены СН2-СНЗ третьей полипептидной цепи.For diabodies and trivalent binding molecules whose first and third polypeptide chains are not identical, it is desirable to reduce or prevent homodimerization between the CH2-CH3 domains of the first two polypeptide chains or between the CH2-CH3 domains of the third two polypeptide chains. The CH2 and/or CH3 domains of said polypeptide chains need not have identical sequences and are advantageously modified to promote complex formation between the two polypeptide chains. For example, an amino acid substitution (preferably a substitution with an amino acid containing a bulky side group forming a knob, such as tryptophan) can be introduced into a CH2 or CH3 domain such that steric influence will prevent interaction with a domain mutated in a similar manner and will result in pairing of the mutated domain with a domain into which a complementary or promoting mutation, i.e. a hole, has been introduced (e.g., a glycine substitution). Such groups of mutations can be introduced into any pair of polypeptides containing the CH2-CH3 domains that form the Fc region. Methods for modifying proteins to promote heterodimerization over homodimerization are well known in the art, particularly with respect to the modification of immunoglobulin-like molecules, and are included within the scope of the present invention (see, for example, Ridgway et al. (1996) 'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CHS Domains For Heavy Chain Heterodimerization, Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis, J. Immunol. Methods 296:95-101; each of which is incorporated herein by reference in its entirety). Preferably, the knob is introduced into the CH2-CH3 domains of the first polypeptide chain and the hole is introduced into the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain of diabodies comprising three polypeptide chains. Accordingly, the knob will prevent homodimerization of the first polypeptide chain via its CH2 and/or CH3 domains. Since the third polypeptide chain preferably contains a substitution providing a hole, it will heterodimerize with the first polypeptide chain and also homodimerize with itself. This strategy can be used for antibodies and trivalent binding molecules comprising three, four or five chains described above, in which the knob is introduced into the CH2-CH3 domains of the first polypeptide chain and the hole is introduced into the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain.
Предпочтительный выступ создают путем модификации области Fc IgG для включения модификации T366W. Предпочтительную впадину создают путем модификации области Fc IgG для включения модификации T366S, L368A и Y407V. Чтобы облегчить очистку гомодимера третьей полипептидной цепи, несущей впадину, из готовой биспецифической гетеродимерной молекулы, содержащей область Fc, сайт связывания белка А доменов СН2 и CH3, несущих впадину, третьей полипептидной цепи предпочтительно мутируют путем замены аминокислоты в положении 435 (H435R). Соответственно, гомодимер третьей полипептидной цепи, несущей впадину, не будет связываться с белком А, тогда как бисA preferred knob is created by modifying the Fc region of IgG to include the modification T366W. A preferred hole is created by modifying the Fc region of IgG to include the modification T366S, L368A, and Y407V. To facilitate purification of the hole-bearing third polypeptide chain homodimer from the final bispecific heterodimeric molecule comprising the Fc region, the protein A binding site of the hole-bearing CH2 and CH3 domains of the third polypeptide chain is preferably mutated by substituting an amino acid at position 435 (H435R). Accordingly, the hole-bearing third polypeptide chain homodimer will not bind to protein A, whereas the bis
- 62 047726 пецифический гетеродимер сохранит свою способность связываться с белком А посредством сайта связывания белка А в первой полипептидной цепи. В другом варианте реализации третья полипептидная цепь, несущая впадину, может содержать замены аминокислот в положениях 434 и 435 (N434A/N435K).- 62 047726 the specific heterodimer will retain its ability to bind to protein A via the protein A binding site in the first polypeptide chain. In another embodiment, the third polypeptide chain bearing the hole may contain amino acid substitutions at positions 434 and 435 (N434A/N435K).
Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и CH3 первой полипептидной цепи молекулы, содержащей область Fc, согласно настоящему изобретению будет содержать последовательность несущую выступ, представленную ниже (SEQ ID NO: 6):A preferred IgG1 amino acid sequence for the CH2 and CH3 domains of the first polypeptide chain of the Fc region-containing molecule of the present invention will comprise the knob-bearing sequence shown below (SEQ ID NO: 6):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.
Предпочтительная аминокислотная последовательность IgG1 для доменов СН2 и CH3 второй полипептидной цепи молекулы, содержащей область Fc, согласно настоящему изобретению, содержащей две полипептидные цепи (или третьей полипептидной цепи молекулы, содержащей область Fc, содержащей три, четыре или пять полипептидных цепей), будет содержать несущую впадину последовательность, представленную ниже (SEQ ID NO: 7):A preferred IgG1 amino acid sequence for the CH2 and CH3 domains of the second polypeptide chain of the Fc region-containing molecule of the present invention comprising two polypeptide chains (or the third polypeptide chain of the Fc region-containing molecule comprising three, four or five polypeptide chains) will comprise the cavity-bearing sequence presented below (SEQ ID NO: 7):
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEWESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGX где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.ALHNRYTQKS LSLSPGX where X is lysine (K) or absent.
Как следует отметить, домены СН2-СНЗ из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, содержат замену в положении 234 остатком аланина и в положении 235 остатком аланина и, соответственно, образуют область Fc, которая проявляет уменьшенное (или по существу отсутствую щее) связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) или FcyRIIIB (CD16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа (SEQ ID NO: 1). В область настоящего изобретения также включены указанные домены СН2-СНЗ, которые содержат альтернативные и/или дополнительные замены, которые модифицируют эффекторную функцию и/или активность связывания области Fc с FyR. В область настоящего изобретения также включены указанные домены СН2-СНЗ, которые дополнительно содержат одну или более замен аминокислот, увеличивающих период полувыведения. В частности, в область настоящего изобретения включены указанные несущие впадину и несущие выступ домены СН2-СНЗ, которые дополнительно содержат M252Y/S254T/T256E.As should be noted, the CH2-CH3 domains of the sequences set forth in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 comprise a substitution at position 234 with an alanine residue and at position 235 with an alanine residue and, accordingly, form an Fc region that exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a), or FcγRIIIB (CD16b) (relative to the binding exhibited by the wild-type Fc region (SEQ ID NO: 1). Also included within the scope of the present invention are said CH2-CH3 domains that comprise alternative and/or additional substitutions that modify the effector function and/or binding activity of the Fc region with FyR. Also included within the scope of the present invention are said CH2-CH3 domains that further comprise one or more amino acid substitutions, increasing the half-life. In particular, the scope of the present invention includes said CH2-CH3 cavity-bearing and knob-bearing domains, which further comprise M252Y/S254T/T256E.
Предпочтительно первая полипептидная цепь будет содержать несущую выступ последовательность СН2-СНЗ, например, представленную в SEQ ID NO: 6. Однако, как будет отмечено, несущий впадину домен СН2-СНЗ (например, SEQ ID NO: 7) может быть использован в первой полипептидной цепи, и в этом случае несущий выступ домен СН2-СНЗ (например, SEQ ID NO: 6) может быть использован во второй полипептидной цепи молекулы, содержащей область Fc, согласно настоящему изобретению, содержащей две полипептидные цепи (или в третьей полипептидной цепи молекулы, содержащей область Fc, содержащей три, четыре или пять полипептидных цепей).Preferably, the first polypeptide chain will comprise a CH2-CH3 knob-bearing sequence, such as that shown in SEQ ID NO: 6. However, as will be noted, a CH2-CH3 hole-bearing domain (e.g., SEQ ID NO: 7) may be used in the first polypeptide chain, in which case a CH2-CH3 knob-bearing domain (e.g., SEQ ID NO: 6) may be used in a second polypeptide chain of an Fc region-containing molecule of the present invention comprising two polypeptide chains (or in a third polypeptide chain of an Fc region-containing molecule comprising three, four or five polypeptide chains).
Как подробно описано выше, в область настоящего изобретения включены молекулы, содержащие область Fc (например, антитела и диатела, содержащие область Fc), содержащие домены СН2 и CH3 дикого типа или содержащие домены СН2 и CH3 с комбинациями замен, описанными выше. Примерная аминокислотная последовательность домена СН2-СНЗ IgG1, включающая такие варианты, представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 260):As described in detail above, included within the scope of the present invention are molecules comprising an Fc region (e.g., antibodies and diabodies comprising an Fc region) comprising wild-type CH2 and CH3 domains or comprising CH2 and CH3 domains with the combinations of substitutions described above. An exemplary amino acid sequence of an IgG1 CH2-CH3 domain comprising such variants is the sequence set forth below (SEQ ID NO: 260):
APEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVDAPEX1X2GGPSV FLFPPKPKDT LX3IX4RX5PEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPAGVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLX6CX7VK GFYPSDIAVEPIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLX 6 CX 7 VK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLXgSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHEWESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLXgSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHX9X10YTQKS LSLSPGX11 в которой:ALHX9X10YTQKS LSLSPGX11 in which:
(a) X1 и Х2 оба представляют собой L (дикий тип) или оба представляют собой А (уменьшенное связывание с FcyR);(a) X1 and X2 are both L (wild type) or both are A (reduced binding to FcyR);
(b) Х3, Х4 и Х5, соответственно, представляют собой М, S и Т (дикий тип) или Y, Т и Е (увеличенный период полувыведения), (c) Х6, Х7 и Х8, соответственно, представляют собой Т, L и Y (дикий тип) или W, L и Y (выступ), или S, А и V (впадина);(b) X 3 , X 4 and X 5 , respectively, represent M, S and T (wild type) or Y, T and E (extended half-life), (c) X 6 , X 7 and X 8 , respectively, represent T, L and Y (wild type) or W, L and Y (protrusion), or S, A and V (valley);
- 63 047726 (d) X9 и Х10, соответственно, представляют собой N и Н (дикий тип) или представляют собой N и R (отсутствует связывание с белком А), или А и K (отсутствует связывание с белком А); и (e) X11 представляет собой K или отсутствует.- 63 047726 (d) X 9 and X 10 , respectively, are N and H (wild type), or are N and R (no binding to protein A), or A and K (no binding to protein A); and (e) X11 is K or is absent.
Согласно другим вариантам реализации в область настоящего изобретения включены PD-1связывающие молекулы, содержащие домены СН2 и/или CH3, которые были модифицированы, чтобы способствовать гетеродимеризации по сравнению с гомодимеризацией, с использованием мутаций, известных в данной области техники, таких как те, которые раскрыты в PCT публикациях WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867, все из которых полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.In other embodiments, the present invention includes within its scope PD-1 binding molecules comprising CH2 and/or CH3 domains that have been modified to promote heterodimerization over homodimerization using mutations known in the art, such as those disclosed in PCT publications WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
VIII. Биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3.VIII. Bispecific binding molecules PD-1xLAG-3.
Согласно настоящему изобретению в частности предложены биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3 (например, биспецифические антитела, биспецифические диатела и т.д.), содержащие эпитопсвязывающий фрагмент антитела к PD-1 и предпочтительно одно из новых антител к PD-1 человека, предложенных в настоящем документе, и эпитопсвязывающий фрагмент антитела к LAG-3 человека, предпочтительно одно из новых антител к LAG-3 человека, предложенных в настоящем документе. Предпочтительные биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3 согласно настоящему изобретению содержат эпитопсвязывающие фрагменты антител, которые позволяют им скоординировано связываться с двумя различными эпитопами: эпитопом PD-1 и эпитопом LAG-3 так, чтобы ослабить ингибиторную активность указанных молекул. В настоящем изобретении такое ослабление относится к уменьшению по меньшей мере на 20%, уменьшению по меньшей мере на 50%, уменьшению по меньшей мере на 80% или уменьшению по меньшей мере на 90% детектируемой ингибиторной активности PD-1 и/или LAG-3, или к полному устранению детектируемой ингибиторной активности PD-1 и/или LAG-3. Выбор эпитопсвязывающих фрагментов (например, доменов VL и VH) антитела к PD-1 человека и антитела к LAG-3 координируется так, что полипептидные цепи, которые образуют указанные биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3, соединяются с образованием по меньшей мере одного функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфичным в отношении первого антигена (т.е. PD-1 или LAG-3), и по меньшей мере одного функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфичным в отношении второго антигена (т.е. PD-1 или LAG-3, в зависимости от идентичности первого антигена).The present invention provides in particular PD-1xLAG-3 bispecific binding molecules (e.g. bispecific antibodies, bispecific diabodies, etc.) comprising an epitope-binding fragment of an antibody to PD-1, and preferably one of the novel human PD-1 antibodies provided herein, and an epitope-binding fragment of an antibody to human LAG-3, preferably one of the novel human LAG-3 antibodies provided herein. Preferred PD-1xLAG-3 bispecific binding molecules according to the present invention comprise epitope-binding fragments of antibodies that allow them to coordinately bind to two different epitopes: a PD-1 epitope and a LAG-3 epitope, so as to attenuate the inhibitory activity of said molecules. In the present invention, such attenuation refers to a decrease by at least 20%, a decrease by at least 50%, a decrease by at least 80%, or a decrease by at least 90% of the detectable inhibitory activity of PD-1 and/or LAG-3, or to a complete elimination of the detectable inhibitory activity of PD-1 and/or LAG-3. The selection of epitope-binding fragments (e.g., VL and VH domains) of the anti-human PD-1 antibody and the anti-LAG-3 antibody is coordinated such that the polypeptide chains that form said PD-1xLAG-3 bispecific binding molecules are joined to form at least one functional antigen-binding site that is specific for a first antigen (i.e., PD-1 or LAG-3) and at least one functional antigen-binding site that is specific for a second antigen (i.e., PD-1 or LAG-3, depending on the identity of the first antigen).
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения биспецифическая связывающая молекула PD-1xLAG-3 согласно настоящему изобретению представляет собой биспецифическое антитело, которое предпочтительно содержит две, три, четыре или пять полипептидных цепей, описанных в настоящем документе. В другом конкретном варианте реализации биспецифическая связывающая молекула PD-1xLAG-3 согласно настоящему изобретению представляет собой биспецифическое антитело, которое предпочтительно содержит две, три или четыре полипептидные цепи, описанные в настоящем документе (см., например, WO 2007/024715; WO2007/110205; WO 2009/080251; WO 2009/080254; WO 2009/089004; WO 2011/069104; WO 2011/117329; WO 2011/131746; WO 2011/133886; WO 2011/143545; WO 2012/023053; WO 2013/060867, все из которых полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки).According to a specific embodiment of the present invention, the PD-1xLAG-3 bispecific binding molecule of the present invention is a bispecific antibody that preferably comprises two, three, four or five polypeptide chains as described herein. In another specific embodiment, a PD-1xLAG-3 bispecific binding molecule of the present invention is a bispecific antibody that preferably comprises two, three or four polypeptide chains as described herein (see, e.g., WO 2007/024715; WO2007/110205; WO 2009/080251; WO 2009/080254; WO 2009/089004; WO 2011/069104; WO 2011/117329; WO 2011/131746; WO 2011/133886; WO 2011/143545; WO 2012/023053; WO 2013/060867, all of which are fully are incorporated into the present invention by reference).
А. Антитела к LAG-3 человека.A. Antibodies to human LAG-3.
Примерные антитела, которые являются иммуноспецифичными для LAG-3 человека, приведены ниже. Дополнительные желательные антитела могут быть получены путем выделения гибридом, секретирующих антитела, выявленных с использованием LAG-3 или его пептидного фрагмента, или путем скрининга библиотек рекомбинантных антител для определения связывания с LAG-3 или его пептидным фрагментом. LAG-3 человека (включая сигнальную последовательность, состоящую из 28 остатков аминокислот (выделена подчеркиванием), и зрелый белок, состоящий из 497 остатков аминокислот) содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 38):Exemplary antibodies that are immunospecific for human LAG-3 are provided below. Additional desirable antibodies can be obtained by isolating hybridomas that secrete antibodies detected using LAG-3 or a peptide fragment thereof, or by screening recombinant antibody libraries for binding to LAG-3 or a peptide fragment thereof. Human LAG-3 (including the 28 amino acid residue signal sequence (underlined) and the 497 amino acid residue mature protein) has the amino acid sequence provided below (SEQ ID NO: 38):
MWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP WWAQEGAPA QLPCSPTIPLMWEAQFLGLL FLQPLWVAPV KPLQPGAEVP WWAQEGAPA QLPCSPTIPL
QDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTYRDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQLQDLSLLRRAG VTWQHQPDSG PPAAAPGHPL APGPHPAAPS SWGPRPRRYT VLSVGPGGLR SGRLPLQPRV QLDERGRQRG DFSLWLRPAR RADAGEYRAA VHLRDRALSC RLRLRLGQAS MTASPPGSLR ASDWVILNCS FSRPDRPASV HWFRNRGQGR VPVRESPHHH LAESFLFLPQ VSPMDSGPWG CILTY RDGFN VSIMYNLTVL GLEPPTPLTV YAGAGSRVGL PCRLPAGVGT RSFLTAKWTP PGGGPDLLVT GDNGDFTLRL EDVSQAQAGT YTCHIHLQEQ QLNATVTLAI ITVTPKSFGS PGSLGKLLCE VTPVSGQERF VWSSLDTPSQ RSFSGPWLEA QEAQLLSQPW QCQLYQGERL LGAAVYFTEL SSPGAQRSGR APGALPAGHL LLFLILGVLS LLLLVTGAFG FHLWRRQWRP RRFSALEQGI HPPQAQSKIE ELEQEPEPEP EPEPEPEPEP EPEQL
- 64 047726- 64 047726
1. Моноклональное антитело к LAG-3 A.1. Monoclonal antibody to LAG-3 A.
Антитело к LAG-3 человека, BMS-986016 (25F7; Medarex/BMS), обозначенное в настоящем документе МАТ к LAG-3 А, и его варианты были описаны (см., например, WO 2014/008218). Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи MAT к LAG-3 А содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 39) (CDR выделены подчеркиванием): QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSSThe anti-human LAG-3 antibody, BMS-986016 (25F7; Medarex/BMS), herein designated anti-LAG-3 mAb, and variants thereof have been described (see, e.g., WO 2014/008218). The amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-LAG-3 mAb comprises the amino acid sequence set forth below (SEQ ID NO: 39) (CDRs are underlined): QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS DYYWNWIRQP PGKGLEWIGE INHNGNTNSN PSLKSRVTLS LDTSKNQFSL KLRSVTAADT AVYYCAFGYS DYEYNWFDPW GQGTLVTVSS
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи МАТ к LAG-3 А содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 40) (CDR выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-LAG-3A MAT contains the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 40) (CDRs are underlined):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYDEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ
GTNLEIKGTNLEIK
Недавно были идентифицированы дополнительные мышиные антитела к LAG-3 человека, обладающие уникальными характеристиками связывания (см. заявку на патент США № 62/172277). Предпочтительные биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3 согласно настоящему изобретению содержат эпитопсвязывающие фрагменты антитела к LAG-3, MAT к LAG-3 1 или MAT к LAG-3 6, которые связываются с новым эпитопом и не конкурируют с BMS-986016 за связывание с LAG-3. Особенно предпочтительными являются биспецифические связывающие молекулы PD-1xLAG-3 согласно настоящему изобретению, которые содержат гуманизированные домены VH и/или VL MAT к LAG-3 1 или MAT к LAG-3 6.Recently, additional murine anti-human LAG-3 antibodies have been identified that have unique binding characteristics (see U.S. Patent Application Ser. No. 62/172,277). Preferred PD-1xLAG-3 bispecific binding molecules of the present invention comprise epitope-binding fragments of an anti-LAG-3 antibody, anti-LAG-3 Mab 1, or anti-LAG-3 Mab 6 that bind to a novel epitope and do not compete with BMS-986016 for binding to LAG-3. Particularly preferred are PD-1xLAG-3 bispecific binding molecules of the present invention that comprise humanized VH and/or VL domains of anti-LAG-3 Mab 1 or anti-LAG-3 Mab 6.
2. МАТ к LAG-3 1.2. MAT to LAG-3 1.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT к LAG-3 1 (SEQ ID NO: 41) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием).The amino acid sequence of the VH domain of MAT to LAG-3 1 (SEQ ID NO: 41) is shown below (CDR H residues are underlined).
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGWQIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFR NYGMNWVKQA PGKVLKWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARESINTYTGESTY ADDFEGRFAF SLGTSASTAY LQINILKNED TATYFCARES
LYDYYSMDYW GQGTSVTVSSLYDYYSMDYW GQGTSVTVSS
CDRhI МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 42): RNYGMNCDRhI MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 42): RNYGMN
CDRH2 МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO43): WINTYTGESTYADDFEGCDR H 2 MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO43): WINTYTGESTYADDFEG
CDRH3 МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 44): ESLYDYYSMDYCDR H 3 MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 44): ESLYDYYSMDY
Аминокислотная последовательность домена VL MAT к LAG-3 1 (SEQ ID NO: 45) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT to LAG-3 1 (SEQ ID NO: 45) is shown below (CDRL residues are underlined):
DVWTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPEDVWTQTPLT LSVTIGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFPRLIYLVSELD SGVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKLE IKYTFGGGTKLE IK
CDRlI МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 46): KSSQSLLHSDGKTYLNCDRlI MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 46): KSSQSLLHSDGKTYLN
CDRl2 МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 47): LVSELDSCDR l 2 MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 47): LVSELDS
CDRl3 МАТ к LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 48): WQGTHFPYTCDR l 3 MAT to LAG-3 1 (SEQ Ш NO: 48): WQGTHFPYT
Два примерных гуманизированных домена VH MAT к LAG-3 1, обозначенных в настоящем документе VH1 MAT к hLAG-3 1 и МАТ к hLAG-3 1 VH2, и четыре примерных гуманизированных домена VL MAT к LAG-3 1 VL1 MAT к hLAG-3 1 , VL2 MAT к hLAG-3 1 , VL3 MAT к hLAG-3 1 и VL4 MAT к hLAG-3 1, приведены ниже. Любой из гуманизированных доменов VL может быть спарен с любым из гуманизированных доменов VH, чтобы получить LAG-3-связывающий домен. Соответственно, любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, спаренный с гуманизированным доменом VH, в общем называется МАТ к hLAG-3 1, и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются посредством ссылки на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 MAT к hLAG-3 1 и VL2 MAT к hLAG-3 1, в частности называется МАТ к hLAG-3 1 (1.2).Two exemplary humanized VH domains of the anti-LAG-3 MAT 1, designated herein as VH1 of the anti-hLAG-3 MAT 1 and VH2 of the anti-hLAG-3 MAT, and four exemplary humanized VL domains of the anti-LAG-3 MAT 1, VL1 of the anti-hLAG-3 MAT 1, VL2 of the anti-hLAG-3 MAT 1, VL3 of the anti-hLAG-3 MAT 1, and VL4 of the anti-hLAG-3 MAT 1, are provided below. Any of the humanized VL domains can be paired with any of the humanized VH domains to produce a LAG-3 binding domain. Accordingly, any antibody comprising one of the humanized VL domains paired with a humanized VH domain is generally referred to as an anti-hLAG-3 mAb 1, and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by reference to specific VH/VL domains, e.g., a humanized antibody comprising a VH1 anti-hLAG-3 mAb 1 and a VL2 anti-hLAG-3 mAb 1 is specifically referred to as an anti-hLAG-3 mAb 1 (1.2).
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 49) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain from VH1 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 49) is shown below (CDRH residues are underlined):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGWQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSSINTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
Аминокислотная последовательность домена VH из VH2 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 50) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain from VH2 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 50) is shown below (CDRH residues are underlined):
- 65 047726- 65 047726
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSSQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYFCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 51) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL1 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 51) is shown below (CDR L residues are underlined):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFPRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IKYTFGGGTKVE IK
Аминокислотная последовательность домена VL из VL2 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 52) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL2 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 52) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQRPGQSPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IK
Аминокислотная последовательность домена VL из VL3 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 53) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL3 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 53) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDGKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFPRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP
YTFGGGTKVE IKYTFGGGTKVE IK
Аминокислотная последовательность домена VL из VL4 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 54) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL4 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 54) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IK
CDRL1 домена VL из VL4 MAT к hLAG-3 1 содержит замену глицина остатком аланина и содержит аминокислотную последовательность: kssqsllhsdaktyln (SEQ ш NO: 55), замененный аланин выделен подчеркиванием.CDRL1 of the VL domain from VL4 MAT to hLAG-3 1 contains a substitution of glycine by an alanine residue and contains the amino acid sequence: kssqsllhsdaktyln (SEQ ID NO: 55), the substituted alanine is underlined.
Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из описанных выше доменов CDRL1 MAT к LAG-3 1.According to the present invention, it is envisaged that a similar substitution may be included in any of the above-described domains of the CDRL1 MAT to LAG-3 1.
3. МАТ к LAG-3 6.3. MAT to LAG-3 6.
Аминокислотная последовательность домена VH MAT к LAG-3 6 (SEQ ID NO: 56) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain of MAT to LAG-3 6 (SEQ ID NO: 56) is shown below (CDR H residues are underlined):
EVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSEVLLQQSGPE LVKPGASVKI PCKASGYTFT DYNMDWVKQS HGESLEWIGD INPDNGVTIY NQKFEGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
CDRhI МАТ к LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 57): DYNMDCDRhI MAT to LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 57): DYNMD
CDRH2 МАТ к LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 58): DINPDNGVTIYNQKFEGCDR H 2 MAT to LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 58): DINPDNGVTIYNQKFEG
CDRH3 МАТ к LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 59): EADYFYFDYCDR H 3 MAT to LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 59): EADYFYFDY
Аминокислотная последовательность домена VL MAT к LAG-3 6 (SEQ ID NO: 60) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain of MAT to LAG-3 6 (SEQ ID NO: 60) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SWAWYQQKP GQSPKLLIFS ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKDIVMTQSHRF MSTSVGDRVS ITCKASQDVS SWAWYQQKP GQSPKLLIFS ASYRYTGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQA ADLAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK
CDRlI МАТ к LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 61): KASQDVSSWACDRlI MAT to LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 61): KASQDVSSWA
CDRl2 МАТ к LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 62): SASYRYTCDR l 2 MAT to LAG-3 6 (SEQ Ш NO: 62): SASYRYT
CDRl3 МАТ к LAG-3 6 (SEQ ID NO: 63): HYSTPWTCDR l 3 MAT to LAG-3 6 (SEQ ID NO: 63): HYSTPWT
Два примерных гуманизированных домена VH MAT к LAG-3 6, обозначенных в настоящем документе как VH1 MAT к hLAG-3 6 и VH2 MAT к hLAG-3 6, и два примерных гуманизированных домена VL MAT к LAG-3 6, обозначенных VL1 MAT к hLAG-3 1 и VL2 MAT к hLAG-3 1, приведены ниже. Любой из гуманизированных доменов VL может быть спарен с любым из гуманизированных доменов VH, чтобы получить LAG-3-связывающий домен. Соответственно, любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, спаренный с гуманизированным доменом VH, в общем называется МАТ к hLAG-3 6, и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются посредством ссылки на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 MAT к hLAG-3 6 и VL2 MAT к hLAG-3 6, в частности называется МАТ к hLAG-3 6 (1.2).Two exemplary humanized VH domains of the anti-LAG-3 MAT 6, designated herein as VH1 MAT 6 to hLAG-3 and VH2 MAT 6, and two exemplary humanized VL domains of the anti-LAG-3 MAT 6, designated VL1 MAT 6 to hLAG-3 1 and VL2 MAT 6 to hLAG-3, are shown below. Any of the humanized VL domains can be paired with any of the humanized VH domains to produce a LAG-3 binding domain. Accordingly, any antibody comprising one of the humanized VL domains paired with a humanized VH domain is generally referred to as an anti-hLAG-3 mAb 6, and specific combinations of humanized VH/VL domains are referred to by reference to specific VH/VL domains, e.g., a humanized antibody comprising VH1 of an anti-hLAG-3 mAb 6 and VL2 of an anti-hLAG-3 mAb 6 is specifically referred to as an anti-hLAG-3 mAb 6 (1.2).
- 66 047726- 66 047726
Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 MAT к hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 294) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain from VH1 MAT to hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 294) is shown below (CDR H residues are underlined):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGDQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMDWVRQA PGQGLEWMGD
INPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSINPDNGVTIY NQKFEGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
Аминокислотная последовательность домена VH из VH2 MAT к hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 295) представлена ниже (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VH domain from VH2 MAT to hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 295) is shown below (CDRH residues are underlined):
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSDEVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS DYNMDWVRQA PGKGLEWVSD
INPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSSINPDNGVTIY NQKFEGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA DYFYFDYWGQ GTTLTVSS
Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 MAT к hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 296) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL1 MAT to hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 296) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYSDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK
Аминокислотная последовательность домена VL из VL2 MAT к hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 297) представлена ниже (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the VL domain from VL2 MAT to hLAG-3 6 (SEQ ID NO: 297) is shown below (CDRL residues are underlined):
DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYSDIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKASYRYTGVPD RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIAVYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIK
CDRL1 домена VL из VL1 и VL2 MAT к hLAG-3 6 содержит замену лизина остатком аминокислоты аргинина, и содержит аминокислотную последовательность: kasqdvsswa (SEQ ID NO: 298), замененный аргинин выделен подчеркиванием.CDRL1 of the VL domain from VL1 and VL2 of MAT to hLAG-3 6 contains a substitution of lysine with the amino acid residue arginine, and contains the amino acid sequence: kasqdvsswa (SEQ ID NO: 298), the substituted arginine is underlined.
Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аналогичная замена может быть включена в любой из доменов CDRL1 MAT к LAG-3 6, описанных выше.According to the present invention, it is envisaged that a similar substitution may be included in any of the CDRL1 MAT domains to LAG-3 6 described above.
В. Примерные четырехцепочечные диатела, содержащие область Fc, имеющие Е^-спираль.B. Exemplary four-stranded diabodies containing the Fc region and having an E^-helix.
Были получены четыре примерных биспецифических четырехцепочечных диатела, содержащих область Fc, PD-1xLAG-3, имеющих домены, способствующие образованию гетеродимера, с Е^-спиралями (обозначенные DART A, DART В, DART С и DART I). Структура указанных диател, содержащих область Fc, подробно описана ниже. Указанные типичные диатела PD-1xLAG-3 являются иллюстративными и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.Four exemplary bispecific four-chain Fc region-containing diabodies of PD-1xLAG-3 having heterodimer-promoting domains with Eβ-helices were obtained (designated DART A, DART B, DART C, and DART I). The structure of these Fc region-containing diabodies is described in detail below. These exemplary PD-1xLAG-3 diabodies are illustrative and in no way limit the scope of the present invention.
1. DART A.1. DART A.
DART А представляет собой биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, вариант области Fc IgG4, модифицированный так, чтобы увеличить период полувыведения, и цистеинсодержащие домены, способствующие образованию гетеродимера, с Е/Kспиралью. Первая и третья полипептидные цепи DART А содержат, в направлении от N-конца к Сконцу: N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ш NO: 15)); цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23)); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена СН2-СНЗ IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец.DART A is a bispecific four-chain diabody comprising an Fc region containing two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, a variant of the IgG4 Fc region modified to increase its half-life, and cysteine-containing domains that facilitate heterodimer formation with an E/K helix. The first and third polypeptide chains of DART A comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL4 MAb to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a cysteine-containing heterodimer formation promoting domain (E-helix) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23)); a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant CH2-CH3 domain of IgG4 containing the M252Y/S254T/T256E substitutions and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART А представляет собой вариант последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 267:The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART A is a variant of the sequence shown in SEQ ID NO: 267:
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDXiKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDXiKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLX2IX3R X4PEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G в которой X1, X2, Х3 и Х4 выбраны независимо, и в которой X1 представляет собой А или G; X2RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH G QGTLVTVSSG GCGGGEVAAC EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLX2IX3R X4PEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G in which X1, X2 , X3 , and X4 are independently chosen, and in which X1 is A or G; X2
- 67 047726 представляет собой Y или М; Х3 представляет собой Т или S; и Х4 представляет собой Е или Т.- 67 047726 represents Y or M; X3 represents T or S; and X4 represents E or T.
Аминокислотные последовательности первой и третьей полипептидных цепей DART А представляют собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 267, в которой X1 представляет собой А; Х2 представляет собой Y; Х3 представляет собой Т; и Х4 представляет собой Е.The amino acid sequences of the first and third polypeptide chains of DART A are the sequence shown in SEQ ID NO: 267, wherein X1 is A; X2 is Y; X3 is T; and X4 is E.
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART А содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ IDNO: 24); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART A comprise, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus, VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a cysteine-containing domain that facilitates heterodimer formation (K-helix) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ IDNO: 24); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART А представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 268):The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART A is as follows (SEQ ID NO: 268):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKELIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG TVTVSSG GCGGGKVAAC KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
2. DART В.2. DART B.
DART В идентично DART А, за исключением того, что первая и третья полипептидные цепи DART В содержат домен VL из VL3 MAT к hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 53), который содержит замену аминокислоты в CDRL1. Соответственно, первая и третья полипептидные цепи DART В содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL3 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 53); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Еспираль) (evaacek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 23)); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена СН2-СНЗ IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец. Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART В представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 267, в которой X1 представляет собой G; Х2 представляет собой Y; Х3 представляет собой Т; и Х4 представляет собой Е.DART B is identical to DART A except that the first and third polypeptide chains of DART B comprise the VL domain of VL3 MAT to hLAG-3 1 (SEQ ID NO: 53), which contains an amino acid substitution in CDRL1. Accordingly, the first and third polypeptide chains of DART B comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL3 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 53); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); an intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a cysteine-containing heterodimer formation promoting domain (Ehelix) (evaacek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 23)); a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant CH2-CH3 domain of IgG4 containing the substitutions M252Y/S254T/T256E and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and a C-terminus. The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART B is the sequence set forth in SEQ ID NO: 267, wherein X1 is G; X2 is Y; X3 is T; and X4 is E.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART В представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 268.The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART B is the sequence shown in SEQ ID NO: 268.
3. DART С.3. DART C.
DART С идентично DART В, за исключением того, что первая и третья полипептидные цепи DART В содержат домен СН2-СНЗ IgG4 дикого типа, лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 4). Соответственно, первая и третья полипептидные цепи DART С содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL3 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 53); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (evaacek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 23)); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); домен СН2-СНЗ IgG4, лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 4); и С-конец.DART C is identical to DART B except that the first and third polypeptide chains of DART B comprise a wild-type IgG4 CH2-CH3 domain lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 4). Accordingly, the first and third polypeptide chains of DART C comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus, a VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL3 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 53); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); a VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); an intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a cysteine-containing heterodimer-promoting domain (E-helix) (evaacek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 23)); a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); the CH2-CH3 domain of IgG4 lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 4); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART С представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 267, в которой X1 представляет собой G; Х2 представляет собой М; X3 представляет собой S; и Х4 представляет собой Т.The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART C is the sequence set forth in SEQ ID NO: 267, wherein X1 is G; X2 is M; X3 is S; and X4 is T.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART С представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 268.The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART C is the sequence shown in SEQ ID NO: 268.
4. DART I.4. DART I.
DART I представляет собой биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, вариант области Fc IgG4, модифицированный так, чтобы увеличить период полувыведения, и цистеинсодержащие домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью. Первая и третья полипептидные цепи DART I содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL1 MAT к hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 296); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VHDART I is a bispecific four-chain diabody comprising an Fc region containing two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, a variant of the IgG4 Fc region modified to increase half-life, and cysteine-containing domains that facilitate heterodimer formation with an E/K helix. The first and third polypeptide chains of DART I comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL1 MAb to hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 296); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); a VH domain
- 68 047726 моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15))· цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23))· стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена CH2-CH3 IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец.- 68 047726 monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)) a cysteine-containing heterodimer-promoting domain (E-helix) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 23)) a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant of the CH2-CH3 domain of IgG4 containing the M252Y/S254T/T256E substitutions and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART I представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 290):The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART I is as follows (SEQ ID NO: 290):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYSDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS
ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGGASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMNGTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN
WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSSWVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTTITVDKS TSTAYMELSS
LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVALRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA
ALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDTALEKEVAALE KEVAALEKES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYLYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY
RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYTRWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSLPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGDGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART I содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 294); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: GGCGGG (SEQ ID NO: 15)); цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ IDNO: 24); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART I comprise, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 14)); the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 294); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: GGCGGG (SEQ ID NO: 15)); a cysteine-containing domain that facilitates heterodimer formation (K-helix) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ IDNO: 24); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART I представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 291):The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART I is as follows (SEQ ID NO: 291):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSGGC GGGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK ELIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG T TLTVSSGGC GGGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E
С. Примерные четырехцепочечные диатела, содержащие область Fc, имеющие домены CL/CH1.C. Exemplary four-chain diabodies containing the Fc region and CL/CH1 domains.
Были получены четыре примерных биспецифических четырехцепочечных диатела, содержащих область Fc, PD-1xLAG-3, содержащих домены CL/CH1, и обозначены DART D, DART E, DART J и DART 1. Структура указанных диател, содержащих область Fc, подробно описана ниже. Указанные примерные диатела PD-1xLAG-3 являются иллюстративными и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.Four exemplary bispecific four-chain Fc region-containing PD-1xLAG-3 diabodies containing CL/CH1 domains were obtained and designated DART D, DART E, DART J, and DART 1. The structure of these Fc region-containing diabodies is described in detail below. These exemplary PD-1xLAG-3 diabodies are illustrative and in no way limit the scope of the present invention.
1. DART D.1. DART D.
DART D представляет собой биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, домены CL/CH1 и вариант области Fc IgG4, модифицированный так, чтобы увеличить период полувыведения. Первая и третья полипептидные цепи DART D содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD1 (VLpd-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен СН1 IgG4 (SEQ ID NO: 254); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена GH2-CH3 IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец.DART D is a bispecific four-chain diabody comprising an Fc region containing two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, CL/CH1 domains, and a variant IgG4 Fc region modified to increase half-life. The first and third polypeptide chains of DART D comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD1 (VL pd-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); an intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); the CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 254); a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant of the GH2-CH3 domain of IgG4 containing the substitutions M252Y/S254T/T256E and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART D представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 269):The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART D is as follows (SEQ ID NO: 269):
- 69 047726- 69 047726
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPYLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTNTFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN
YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYLYGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL
QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGASTKGQISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGASTKG
PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPAPSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA
VLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPPVLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP
CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVWD VSQEDPEVQFCPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVWD VSQEDPEVQF
NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSNNWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN
KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPSKGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS
DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSCDIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GSVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART D содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHpd-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен CL каппацепи (SEQ ID NO: 8); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART D comprise, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag- 3 VL4 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH pd-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); CL domain of kappa chain (SEQ ID NO: 8); and C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART D представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 270):The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART D is as follows (SEQ ID NO: 270):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 2. DART E.DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV SETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 2. DART E.
DART E представляет собой другое биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, домены CL/CH1 и вариант Fc IgG4, модифицированный так, чтобы увеличить период полувыведения. Сайты связывания PD-1 и LAG-3 DART E расположены в обратном порядке в сравнении с DART D.DART E is a different bispecific four-chain diabody comprising an Fc region containing two PD-1-specific binding sites, two LAG-3-specific binding sites, CL/CH1 domains, and an IgG4 Fc variant modified to increase half-life. The PD-1 and LAG-3 binding sites of DART E are in the reverse order compared to DART D.
Первая и третья полипептидные цепи DART E содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHpd-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен СН1 IgG4 (SEQ ID NO: 254); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена СН2CH3 IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец.The first and third polypeptide chains of DART E comprise, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus, VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL4 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH pd-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); an intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 254); stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant of the IgG4 CH2CH3 domain containing the M252Y/S254T/T256E substitutions and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART Е представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 271):The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART E is as follows (SEQ ID NO: 271):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL GDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV SETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSL GGGSGASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTKTYTCNV DHKPSNTKVD KRVESKYGPP CPPCPAPEFL GGPSVFLFPP KPKDTLYITR EPEVTCVWD VSQEDPEVQF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ FNSTYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KGLPSSIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSQ EEMTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP LDSDGSFF LYSRLTVDKS RWQEGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSL G
- 70 047726- 70 047726
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART E содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART E comprise, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); CL domain of kappa chain (SEQ ID NO: 8); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART E представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 272): EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 3. DART J.The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART E is as follows (SEQ ID NO: 272): EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSL GGGSGRTVAA PSVFIFPPSD EQLKSGTASV VCLLNNFYPR EAKVQWKVDN ALQSGNSQES VTEQDSKDST YSLSSTLTLS KADYEKHKVY ACEVTHQGLS SPVTKSFNRG EC 3. DART J.
DART J представляет собой биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, домены CL/CH1 и вариант Fc IgG4, модифицированный так, чтобы увеличить период полувыведения. Первая и третья полипептидные цепи DART J содержат в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL1 MAT к hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 296); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен CH1 IgG4 (SEQ ID NO: 254); стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 13); вариант домена CH2-CH3 IgG4, содержащий замены M252Y/S254T/T256E и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 259); и С-конец.DART J is a bispecific four-chain diabody comprising an Fc region containing two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, CL/CH1 domains, and an IgG4 Fc variant modified to increase half-life. The first and third polypeptide chains of DART J comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL1 MAT to hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 296); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); an intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); the CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 254); a stabilized hinge region of IgG4 (SEQ ID NO: 13); a variant of the CH2-CH3 domain of IgG4 containing the substitutions M252Y/S254T/T256E and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 259); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART J представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 292):The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART J is as follows (SEQ ID NO: 292):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKFK DRVTITVDKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSLGGGSG ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGDIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVS SWAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYSTPWTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYSFTSYWMN WVRQAPGQGL EWIGVIHPSD SETWLDQKF K DRVTITVDKS TSTAYMELSSS LRSEDTAVYY CAREHYGTSP FAYWGQGTLV TVSSLGGGSG ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LYITREPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS SRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART J содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 294); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен CL каппацепи (SEQ ID NO: 8); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART J comprise, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAb to hLAG-3 6) (SEQ ID NO: 294); intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); CL domain of kappa chain (SEQ ID NO: 8); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART J представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 293):The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART J is as follows (SEQ ID NO: 293):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPYLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTDTFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD
YNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYMYNMDWVRQAP GQGLEWMGDI NPDNGVTIYN QKFEGRVTMT TDTSTSTAYM
ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSLGG GSGRTVAAPSELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFYFDYWGQG TTLTVSSLGG GSGRTVAAPS
VFIFPPSDEQ LKSGTASWC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVTVFIFPPSDEQ LKSGTASWC LLNNFYPREA KVQWKVDNAL QSGNSQESVT
EQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGECEQDSKDSTYS LSSTLTLSKA DYEKHKVYAC EVTHQGLSSP VTKSFNRGEC
- 71 047726- 71 047726
4. DART 1.4. DART 1.
DART 1 представляет собой биспецифическое четырехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, домены CL/CH1, и вариант области Fc IgG1, модифицированный для снижения связывания с FcyR. Первая и третья полипептидные цепи DART 1 содержат в направлении от N-конца к Сконцу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL MAT к PD-1 A) (SEQ ID NO: 65); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14))· домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к LAG-3 A) (SEQ ID NO: 39); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261))· домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10); шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 32); вариант домена CH2-CH3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A и лишенный С-концевого остатка (SeQ ID NO: 5); и С-конец.DART 1 is a bispecific four-chain diabody comprising an Fc region having two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, CL/CH1 domains, and a variant IgG1 Fc region modified to reduce binding to FcyR. The first and third polypeptide chains of DART 1 comprise, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL MAT to PD-1 A) (SEQ ID NO: 65); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)) the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to LAG-3 A) (SEQ ID NO: 39); intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)) IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 10); IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 32); a variant IgG1 CH2-CH3 domain containing L234A/L235A substitutions and lacking the C-terminal residue (SeQ ID NO: 5); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART 1 представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 284):The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART 1 is as follows (SEQ ID NO: 284):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGWQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK GRFTISRDNS KNTLFLQMNS LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSLG GGSGASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLYI TREPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSIS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGQ GTNLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGWQPG RSLRLDCKAS GITFSNSGMH WVRQAPGKGL EWVAVIWYDG SKRYYADSVK ISRDNS KNTLFLQMNS LRAEDTAVYY CATNDDYWGQ GTLVTVSSLG GGSGASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK RVEPKSCDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLYI TREPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCS VMHEALH NHYTQKSLSL SPG
Вторая и четвертая полипептидные цепи DART 1 содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL MAT к LAG3 A) (SEQ ID NO: 40); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH MAT к PD-1 A) (SEQ ID NO: 64); промежуточный линкерный пептид (линкер 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8); и С-конец.The second and fourth polypeptide chains of DART 1 comprise, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL MAT to LAG3 A) (SEQ ID NO: 40); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH MAT to PD-1 A) (SEQ ID NO: 64); intermediate linker peptide (linker 2: lgggsg (SEQ ID NO: 261)); CL domain of kappa chain (SEQ ID NO: 8); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART 1 представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 285):The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART 1 is as follows (SEQ ID NO: 285):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS RVTLSLDTSK NQFSLKLRSV TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSLGGGS GRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC D. Примерные пятицепочечные диатела, содержащие область Fc.EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ QWGAGLLKPS ETLSLTCAVY GGSFSDYYWN WIRQPPGKGL EWIGEINHNG NTNSNPSLKS R VTLSLDTSK NQFSLKLRSV TAADTAVYYC AFGYSDYEYN WFDPWGQGTL VTVSSLGGGS GRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC D. Approximate five-chain diabodies containing the Fc region.
Были получены два примерных биспецифических пятицепочечных диатела, содержащих область Fc, PD-1xLAG-3, содержащих домены CL/CH1 и домены, способствующие образованию гетеродимеров, с E/K-спиралью, и обозначены DART F и DART G. Структура указанных диател, содержащих область Fc, подробно описана ниже. Указанные примерные диатела PD-1xLAG-3 являются иллюстративными и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.Two exemplary bispecific five-chain diabodies containing the Fc region, PD-1xLAG-3, were obtained, containing CL/CH1 domains and domains promoting heterodimer formation with an E/K helix, and are designated DART F and DART G. The structure of these diabodies containing the Fc region is described in detail below. These exemplary diabodies PD-1xLAG-3 are illustrative and in no way limit the scope of the present invention.
1. DART F.1. DART F.
DART F представляет собой биспецифическое пятицепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее три сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, один сайт связывания, специфичный в отношении LAG-3, домены CL/CH1, вариант области Fc IgG1, несущий выступ/впадину, модифицированный для снижения связывания с FcyR и увеличения периода полувыведения, и домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью. Первая полипептидная цепь DART F содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10); шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 32); несущий впадину домен СН2-СИ3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 260, в которой X1 представляет собой А, X2 представляет собой А; Х3 представляет собой Y, X4 представляетDART F is a bispecific five-chain diabody comprising an Fc region having three binding sites specific for PD-1, one binding site specific for LAG-3, CL/CH1 domains, a knob/hole variant of the IgG1 Fc region modified to reduce binding to FcyR and increase half-life, and E/K helix heterodimer formation promoting domains. The first polypeptide chain of DART F comprises, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); the CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10); the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32); IgG1 CH2-CH3 cavity domain containing the L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K substitutions and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 260, in which X1 is A, X2 is A; X3 is Y, X4 is
- 72 047726 собой Т, X5 представляет собой Е, X6 представляет собой S, X7 представляет собой A, X8 представляет собой V, Х9 представляет собой А, Х10 представляет собой K и Х11 отсутствует); и С-конец.- 72 047726 is T, X5 is E, X6 is S, X7 is A, X8 is V, X9 is A, X10 is K and X11 is absent); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART F представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 273):The amino acid sequence of the first polypeptide chain of DART F is as follows (SEQ ID NO: 273):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGVQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREHIHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH
YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHAKYTQ KSLSLSPGYGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY V DGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHAKYTQ KSLSLSPG
Вторая и пятая полипептидные цепи DART F содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153), домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8) и С-конец.The second and fifth polypeptide chains of DART F contain, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153), CL domain of the kappa chain (SEQ ID NO: 8) and C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и пятой полипептидной цепи DART F представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 274):The amino acid sequence of the second and fifth polypeptide chains of DART F is the sequence shown below (SEQ ID NO: 274):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGECLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
Третья полипептидная цепь DART F содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10); шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 32); несущий выступ домен CH2-CH3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E и лишенный Сконцевого остатка (SEQ ID NO: 260, в которой X1 представляет собой А, X2 представляет собой А, X3 представляет собой Y, X4 представляет собой Т, X5 представляет собой Е, X6 представляет собой W, X7 представляет собой L, X8 представляет собой Y, X9 представляет собой Н, Х10 представляет собой Н и X11 отсутствует); промежуточный линкерный пептид (gggsgggsggg (SEQ ID NO: 262)); домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ Ш NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ id NO: 21)); и С-конец.The third polypeptide chain of DART F comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); the CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10); the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32); a CH2-CH3 knob-bearing domain of IgG1 containing the substitutions L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 260, in which X1 is A, X2 is A, X3 is Y, X4 is T, X5 is E, X6 is W, X7 is L, X8 is Y, X9 is H, X10 is H and X11 is absent); an intermediate linker peptide (gggsgggsggg (SEQ ID NO: 262)); the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL4 MAb to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); a VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a domain facilitating heterodimer formation (E-helix) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 21)); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART F представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 275):The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART F is as follows (SEQ ID NO: 275):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGVQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV
IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IVMTQTPLSL SVTPGQPASI SCKSSQSLLH SDAKTYLNWL LQKPGQPPER LIYLVSELDS GVPDRFSGSG SGTDFTLKIS RVEAEDVGVY YCWQGTHFPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKIHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP EAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IVMTQTPLSL SVTPGQPASI SCKSSQSLLH SDAKTYLNWL LQKPGQPPER LIYLVSELDS GVPDRFSSGG SGTDFTLKIS RVEAEDVGVY YCWQGTHFPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
Четвертая полипептидная цепь DART F содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQThe fourth polypeptide chain of DART F contains, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VLPD-1 VL2 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 1)
- 73 047726- 73 047726
ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1:GGGSGGGG (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22))); и С-конец.ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: GGGSGGGG (SEQ ID NO: 14)); the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a domain facilitating the formation of a heterodimer (K-helix) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22))); and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность четвертых полипептидных цепей DART F представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 276):The amino acid sequence of the fourth polypeptide chains of DART F is as follows (SEQ ID NO: 276):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSEMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSEMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKELIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG TVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
2. DART G.2. DART G.
DART G представляет собой биспецифическое пятицепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее два сайта связывания, специфичных в отношении PD-1, два сайта связывания, специфичных в отношении LAG-3, домены CL/CH1, вариант области Fc IgG1, несущий выступ/впадину, модифицированный так, чтобы снижать связывание с FcyR и увеличивать период полувыведения, и домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью. Первая полипептидная цепь DART G содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10); шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 32); несущий впадину домен CH2-CH3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K и лишенный С-концевого остатка (SEQ ID NO: 260, в которой X1 представляет собой А, X2 представляет собой А; X3 представляет собой Y, X4 представляет собой Т, X5 представляет собой Е, X6 представляет собой S, X7 представляет собой A, X8 представляет собой V, X9 представляет собой А, Х10 представляет собой K и X11 отсутствует); и С-конец.DART G is a bispecific five-chain diabody comprising an Fc region having two binding sites specific for PD-1, two binding sites specific for LAG-3, CL/CH1 domains, a knob/hole variant of the IgG1 Fc region modified to decrease binding to FcyR and increase half-life, and E/K helix heterodimer formation promoting domains. The first polypeptide chain of DART G comprises, from N-terminus to C-terminus: N-terminus; the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAb to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); the CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10); the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32); a CH2-CH3 hole-bearing domain of IgG1 containing the substitutions L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/N434A/H435K and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 260, in which X1 is A, X2 is A; X3 is Y, X4 is T, X5 is E, X6 is S, X7 is A, X8 is V, X9 is A, X10 is K and X11 is absent); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART G представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 277):The amino acid sequence of the first polypeptide chain of DART G is as follows (SEQ ID NO: 277):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGWQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW
INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHAKYT QKSLSLSPGINTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTV DKSRW QQGNVFSCSV MHEALHAKYT QKSLSLSPG
Вторая и пятая полипептидные цепи DART G содержат в направлении от N-конца к С-концу: Nконец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54), домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8) и С-конец.The second and fifth polypeptide chains of DART G contain, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL4 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54), the CL domain of the kappa chain (SEQ ID NO: 8) and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй и пятой полипептидной цепи DART G представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 278):The amino acid sequence of the second and fifth polypeptide chains of DART G is the sequence shown below (SEQ ID NO: 278):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE
RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGECRLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC
Третья полипептидная цепь DART G содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); домен IgG1 CH1 (SEQ ID NO: 10); шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 32); несущий выступ домен CH2-CH3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E и лишенный Сконцевого остатка (SEQ ID NO: 260, в которой X1 представляет собой А, X2 представляет собой А, X3 представляет собой Y, X4 представляет собой Т, X5 представляет собой Е, X6 представляет собой W, X7 представляет собой L, X8 представляет собой Y, X9 представляет собой Н, Х10 представляет собой Н и X11 отсутствует); промежуточный линкерный пептид (gggsgggsggg (SEQ ID NO: 262)); домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антиThe third polypeptide chain of DART G comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); the IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 10); the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32); a CH2-CH3 knob-bearing domain of IgG1 containing the L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E substitutions and lacking the C-terminal residue (SEQ ID NO: 260, in which X1 is A, X2 is A, X3 is Y, X4 is T, X5 is E, X6 is W, X7 is L, X8 is Y, X9 is H, X10 is H and X11 is absent); an intermediate linker peptide (gggsgggsggg (SEQ ID NO: 262)); the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); an intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain monoclonal anti
- 74 047726 тела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 21)); и С-конец.- 74 047726 a body capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); a cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); a domain facilitating the formation of a heterodimer (E-helix) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 21)); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART G представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 279):The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART G is as follows (SEQ ID NO: 279):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGG GGSGGGSGGG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLYITREP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE SLEPE DFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGEVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK
Четвертая полипептидная цепь DART G содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPD-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22)); и С-конец.The fourth polypeptide chain of DART G comprises, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH PD-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); domain facilitating heterodimer formation (K-helix) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22)); and C-end.
Аминокислотная последовательность четвертых полипептидных цепей DART G представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 280):The amino acid sequence of the fourth polypeptide chains of DART G is as follows (SEQ ID NO: 280):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDRVTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KEEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYSFTS YWMNWVRQAP GQGLEWIGVI HPSDSETWLD QKFKDR VTIT VDKSTSTAYM ELSSLRSEDT AVYYCAREHY GTSPFAYWGQ GTLVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
Е. Примерное трехцепочечное диатело, содержащее область Fc, имеющее E/K-спираль.E. Exemplary three-chain diabody containing an Fc region with an E/K helix.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены биспецифические трехцепочечные диатела, содержащие область Fc, PD-1xLAG-3, содержащие домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью. Было получено примерное биспецифическое трехцепочечное диатело, содержащее область Fc, PD-1xLAG-3, содержащее домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью, обозначенное как DART H. Ниже подробно описана структура указанного диатела, содержащего область Fc. Указанное примерное диатело PD-1xLAG-3 является иллюстративным и никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения. DART H представляет собой биспецифическое трехцепочечное диатело, содержащее область Fc, содержащее один сайт связывания, специфичный в отношении PD-1, один сайт связывания, специфичный в отношении LAG-3, вариант несущей выступ/впадину области Fc IgG1, модифицированный для снижения связывания с FcyR, и домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью.The present invention further provides bispecific three-chain diabodies comprising an Fc region, PD-1xLAG-3, containing domains that facilitate heterodimer formation with an E/K helix. An exemplary bispecific three-chain diabody comprising an Fc region, PD-1xLAG-3, containing domains that facilitate heterodimer formation with an E/K helix, designated as DART H, was obtained. The structure of said diabody comprising an Fc region is described in detail below. Said exemplary diabody PD-1xLAG-3 is illustrative and in no way limits the scope of the present invention. DART H is a bispecific three-chain diabody comprising an Fc region containing one binding site specific for PD-1, one binding site specific for LAG-3, a variant of the IgG1 Fc knob/hole region modified to reduce binding to FcyR, and heterodimer-promoting domains with an E/K helix.
Первая полипептидная цепь DART H содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера, (Е-спираль) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 21)); промежуточный линкер (спейсер-линкер 3: gggdkthtcppcp (SEQ ID NO: 263)); несущий выступ домен СН2-СНЗ IgG1, содержащий замены L234A/L235A и содержащий С-концевой остаток лизина (SEQ ID NO: 6); и С-конец.The first polypeptide chain of DART H comprises, in direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); domain facilitating heterodimer formation (E-helix) (evaalek-evaalek-evaalek-evaalek (SEQ ID NO: 21)); an intermediate linker (spacer-linker 3: gggdkthtcppcp (SEQ ID NO: 263)); a CH2-CH3 knob-bearing domain of IgG1 containing the L234A/L235A substitutions and containing a C-terminal lysine residue (SEQ ID NO: 6); and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART H представляет собой поThe amino acid sequence of the first polypeptide chain of DART H is
- 75 047726 следовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 281):- 75 047726 the sequence given below (SEQ ID NO: 281):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY ITFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA DDFEGRFVFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGKEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY ITFGGGTKVEI KGGGSGGGGQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTN YGMNWVRQAP GQGLEWMGWI NTYTGESTYA VFS MDTSASTAYL QISSLKAEDT AVYYCARESL YDYYSMDYWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
Вторая полипептидная цепь DART H содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLLaG-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); промежуточный линкерный пептид (линкер 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VHPd-1 VH1 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); цистеинсодержащий промежуточный линкерный пептид (линкер 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-kvaalke-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22)); и С-конец.The second polypeptide chain of DART H comprises, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus; VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL L a G- 3 VL4 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); intermediate linker peptide (linker 1: gggsgggg (SEQ ID NO: 14)); VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH Pd-1 VH1 MAT to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); cysteine-containing intermediate linker peptide (linker 2: ggcggg (SEQ ID NO: 15)); domain facilitating heterodimer formation (K-helix) (KVAALKE-kvaalke-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 22)); and C-end.
Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи DART H представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 282):The amino acid sequence of the second polypeptide chain of DART H is the sequence shown below (SEQ ID NO: 282):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKEDIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKGGGSGGGG QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV SETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
Третья полипептидная цепь DART H содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; шарнирную область (dkthtcppcp (SEQ ID NO: 31), несущий выступ домен СН2-СНЗ IgGl, содержащий замены L234A/L235A и содержащий С-концевой остаток лизина (SEQ ID NO: 7) и С-конец.The third polypeptide chain of DART H comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the hinge region (dkthtcppcp (SEQ ID NO: 31), the CH2-CH3 knob-bearing domain of IgG1 containing the L234A/L235A substitutions and containing the C-terminal lysine residue (SEQ ID NO: 7) and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART H представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 283):The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART H is as follows (SEQ ID NO: 283):
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDDKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYKPEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGKCKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK
F. Примерное биспецифическое антитело.F. Exemplary bispecific antibody.
Было получено примерное четырехцепочечное биспецифическое антитело PD-1xLAG-3, обозначенное как BSAB А. Структура указанного биспецифического антитела подробно описана ниже. Указанное примерное биспецифическое антитело PD-1xLAG-3 является иллюстративным и никоим образом не ограничивает объем настоящего изобретения.An exemplary four-chain bispecific antibody PD-1xLAG-3, designated as BSAB A, was obtained. The structure of said bispecific antibody is described in detail below. Said exemplary bispecific antibody PD-1xLAG-3 is illustrative and does not limit the scope of the present invention in any way.
BSAB А представляет собой биспецифическое антитело, содержащее один сайт связывания, специфичный в отношении PD-1, один сайт связывания, специфичный в отношении LAG-3, вариант Fc IgGl, модифицированный для снижения связывания с FcyR и для содействия комплексообразованию между двумя различными полипептидами тяжелой цепи (см. например, WO 2011/143545).BSAB A is a bispecific antibody comprising one binding site specific for PD-1, one binding site specific for LAG-3, an IgG1 Fc variant modified to reduce binding to FcyR and to promote complex formation between two different heavy chain polypeptides (see, for example, WO 2011/143545).
Первая полипептидная цепь BSAB А содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с PD-l (VHPd-1 VHl MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); домен CHl IgGl (SEQ ID NO: 10); вариант шарнирной области IgGl, содержащий замены D221E/P228E (пронумерованные в соответствии с системой ЕС, описанной в Kabat et al., и выделенные подчеркиванием в SEQ ID NO: 286 ниже); вариант домена СН2-СНЗ IgGl, содержащий замены L234A/L235A/L368E (замены выделены подчеркиванием в SEQ ID NO: 286 ниже) и лишенный Сконцевого остатка; и С-конец.The first polypeptide chain of BSAB A comprises, in direction from N-terminus to C-terminus: an N-terminus; a VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VH Pd-1 VH1 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 147); a CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10); a variant hinge region of IgG1 containing the substitutions D221E/P228E (numbered according to the EU system described in Kabat et al. and highlighted by underlining in SEQ ID NO: 286 below); a variant CH2-CH3 domain of IgG1 containing the substitutions L234A/L235A/L368E (substitutions highlighted by underlining in SEQ ID NO: 286 below) and lacking the C-terminal residue; and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи BSAB A представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 286):The amino acid sequence of the first polypeptide chain of BSAB A is the sequence shown below (SEQ ID NO: 286):
- 76 047726- 76 047726
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCEKTHTCPE CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCE VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LY SLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCEKTHTCPE CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCE VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
Вторая полипептидная цепь BSAB содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с PD-1 (VLPD-1 VL2 MAT к hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8) и С-конец.The second polypeptide chain of BSAB comprises, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to PD-1 (VL PD-1 VL2 MAb to hPD-1 7) (SEQ ID NO: 153); the CL domain of the kappa chain (SEQ ID NO: 8) and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи BSAB представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 287):The amino acid sequence of the second polypeptide chain of BSAB is the sequence shown below (SEQ ID NO: 287):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGECEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLT LSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC
Третья полипептидная цепь BSAB А содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VH моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VHLAG-3 VH1 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10); вариант шарнирной области IgG1, содержащий замены D221R/P228R (замены выделены подчеркиванием в SEQ ID NO: 288 ниже); вариант домена СН2CH3 IgG1, содержащий замены L234A/L235A/L409R (замены выделены подчеркиванием в SEQ ID NO: 288 ниже) и лишенный С-концевого остатка; и С-конец.The third polypeptide chain of BSAB A comprises, in direction from N-terminus to C-terminus: an N-terminus; a VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VH LAG-3 VH1 MAb to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 49); an IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 10); a variant IgG1 hinge region containing the substitutions D221R/P228R (substitutions are underlined in SEQ ID NO: 288 below); a variant IgG1 CH2CH3 domain containing the substitutions L234A/L235A/L409R (substitutions are underlined in SEQ ID NO: 288 below) and lacking the C-terminal residue; and a C-terminus.
Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи BSAB A представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 288):The amino acid sequence of the third polypeptide chain of BSAB A is the sequence shown below (SEQ ID NO: 288):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCRKTHTCP RCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTYTGESTY ADDFEGRFVF SMDTSASTAY LQISSLKAED TAVYYCARES LYDYYSMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCRKTHTCP RCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
Четвертая полипептидная цепь BSAB А содержит в направлении от N-конца к С-концу: N-конец; домен VL моноклонального антитела, способного связываться с LAG-3 (VLlag-3 VL4 MAT к hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); домен CL каппа-цепи (SEQ ID NO: 8) и С-конец.The fourth polypeptide chain of BSAB A contains, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: the N-terminus; the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to LAG-3 (VL lag-3 VL4 MAT to hLAG-3 1) (SEQ ID NO: 54); the CL domain of the kappa chain (SEQ ID NO: 8) and the C-terminus.
Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи BSAB А представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 289):The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of BSAB A is the sequence shown below (SEQ ID NO: 289):
DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC IX. Эталонные антитела.DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL HSDAKTYLNW LLQKPGQPPE RLIYLVSELD SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCWQGTHFP YTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC IX. Reference antibodies.
А. Эталонные антитела к PD-1 человека.A. Reference antibodies to human PD-1.
Для того чтобы оценить и описать новые молекулы, связывающие PD-1 человека, согласно настоящему изобретению, использовали следующие эталонные антитела: ниволюмаб (также известное как 5С4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106 и выпущенное на рынок под наименованием OPDIVO™ компанией Bristol-Myers Squibb), антитело IgG4 человека, обозначенное в настоящем документе как МАТ к PD-1 А, и пембролизумаб (ранее известное как ламбролизумаб, также известное как MK-3475, SCH-900475, и выпущенное на рынок под наименованием KEYTRUDA™ компанией Merck) гуманизированное антитело IgG4, обозначенное в настоящем документе как МАТ к PD-Ш.In order to evaluate and characterize the novel human PD-1 binding molecules of the present invention, the following reference antibodies were used: nivolumab (also known as 5C4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106 and marketed as OPDIVO™ by Bristol-Myers Squibb), a human IgG4 antibody, referred to herein as anti-PD-1A mAb, and pembrolizumab (formerly known as lambrolizumab, also known as MK-3475, SCH-900475, and marketed as KEYTRUDA™ by Merck), a humanized IgG4 antibody, referred to herein as anti-PD-III mAb.
1. Ниволюмаб (МАТ к PD-1 А).1. Nivolumab (mAb to PD-1A).
- 77 047726- 77 047726
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи МАТ к PD-1 А содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 64) (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-PD-1A mAb contains the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 64) (CDRH residues are underlined):
QVQLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAVQVQLVESGGG WQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV
IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATNDIWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND
DYWGQGTLVT VSSDYWGQGTLVT VSS
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи МАТ к PD-1 А содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 65) (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-PD-1A mAb contains the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 65) (CDRL residues are underlined):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYDEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ
GTKVEIKGTKVEIK
2. Пембролизумаб (МАТ к PD-1 В).2. Pembrolizumab (mAb to PD-1B).
Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи МАТ к PD-1 В содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 66) (остатки CDRH выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the heavy chain variable domain of the anti-PD-1B mAb contains the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 66) (CDRH residues are underlined):
QVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGGQVQLVQSGVE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYYMYWVRQA PGQGLEWMGG
INPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRDINPSNGGTNF NEKFKNRVTL TTDSSTTTAY MELKSLQFDD TAVYYCARRD
YRFDMGFDYW GQGTTVTVSSYRFDMGFDYW GQGTTVTVSS
Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи МАТ к PD-1 В содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 67) (остатки CDRL выделены подчеркиванием):The amino acid sequence of the light chain variable domain of the anti-PD-1B mAb contains the amino acid sequence shown below (SEQ ID NO: 67) (CDRL residues are underlined):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASKGVS TSGYSYLHWY QQKPGQAPRL
LIYIASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEIKLIYIASYLES GVPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHSRDLPL TFGGGTKVEIK
X. Способы получения.X. Methods of obtaining.
Полинуклеотид к PD-1 человека и другие агонисты, антагонисты и модуляторы PD-1 могут быть созданы из полинуклеотидов и/или последовательностей антител к PD-1 1-15 с помощью способов, известных в данной области техники, например, синтетических или рекомбинантных способов. Один из способов получения указанных пептидных агонистов, антагонистов и модуляторов включает химический синтез полипептида с последующей обработкой в условиях окисления, подходящих для получения нативной конформации, т.е. правильных дисульфидных связей. Указанный способ можно осуществлять с использованием методологий, хорошо известных специалистам в данной области техники (см., например, Kelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M. et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; см. также патенты США № 4105603; 3972859; 3842067; и 3862925). Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть легко получены с использованием твердофазного пептидного синтеза (Merrifield, В. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).Polynucleotide to human PD-1 and other agonists, antagonists and modulators of PD-1 can be created from polynucleotides and/or sequences of antibodies to PD-1 1-15 by methods known in the art, for example, synthetic or recombinant methods. One method for producing said peptide agonists, antagonists and modulators includes chemical synthesis of the polypeptide followed by treatment under oxidative conditions suitable for obtaining the native conformation, i.e., correct disulfide bonds. The method can be carried out using methodologies well known to those skilled in the art (see, for example, Kelley, R. F. et al. (1990) In: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M. et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; see also U.S. Patents 4,105,603; 3,972,859; 3,842,067; and 3,862,925). The polypeptides of the present invention can be readily prepared using solid phase peptide synthesis (Merrifield, B. (1986) Solid Phase Synthesis, Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century, Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
Согласно другому варианту реализации полностью человеческие антитела, содержащие один или более CDR из MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1,MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1,MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1, или тех, которые конкурируют с MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1 за связывание с PD-1 человека или его растворимой формой, можно получить с помощью коммерчески доступных линий мышей, которые были модифицированы для экспрессии специфичных белков иммуноглобулинов человека. Трансгенные животные, которые предназначены для получения более желательного (например, полностью человеческих антител) или более устойчивого иммунного ответа, также могут быть использованы для получения гуманизированных антител или антител человека. Примеры подходящей технологии включают XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Фримонт, Калифорния, США), HuMAb-Mouse™ и ТС MOUSE™ (обе технологии от Medarex, Inc., Принстон, Нью-Джерси, США).According to another embodiment, fully human antibodies comprising one or more CDRs from anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15, or those that compete with anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1 for binding to human PD-1 or a soluble form thereof can be produced using commercially available mouse strains that have been modified to express specific human immunoglobulin proteins. Transgenic animals that are designed to produce a more desirable (e.g., fully human antibodies) or a more robust immune response can also be used to produce humanized or human antibodies. Examples of suitable technology include XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA, USA), HuMAb-Mouse™ and TC MOUSE™ (both technologies from Medarex, Inc., Princeton, NJ, USA).
В другом варианте антитела могут быть получены рекомбинантными способами и экспрессированы с использованием любого способа, известного в данной области техники. Антитела могут быть получены рекомбинантным способом, путем сначала выделения антител, полученных от животных-хозяев, получения последовательности гена и затем использования последовательности гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках линии СНО). Другой способ, который можноIn another embodiment, the antibodies can be produced recombinantly and expressed using any method known in the art. The antibodies can be produced recombinantly by first isolating the antibodies from the host animals, obtaining the gene sequence, and then using the gene sequence to recombinantly express the antibody in host cells (e.g., CHO cells). Another method that can be
- 78 047726 применять, представляет собой экспрессию последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93; и Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157). Подходящие способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т. д, известны в данной области техники. В другом варианте антитела могут быть получены рекомбинантными способами с помощью технологии фагового дисплея (см., например, патенты США № 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winter, G. et al. (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).- 78 047726 apply, is the expression of the antibody sequence in plants (e.g., tobacco) or transgenic milk. Suitable methods for recombinant expression of antibodies in plants or milk have been disclosed (see, e.g., Peeters et al. (2001) Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants, Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) Human Antibodies From Transgenic Mice, Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et al. (1999) Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies, J. Immunol Methods 231:147-157). Suitable methods for producing antibody derivatives, e.g., humanized, single-chain, etc., are known in the art. In another embodiment, antibodies can be produced recombinantly using phage display technology (see, e.g., U.S. Patents 5,565,332, 5,580,717, 5,733,743, 6,265,150 and Winter, G. et al. (1994) Making Antibodies By Phage Display Technology, Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).
Антитела или белок, представляющий интерес, могут быть подвергнуты секвенированию с помощью расщепления по Эдману, которое хорошо известно специалистам в данной области техники. Информация о пептиде, полученная на основании данных масс-спектрометрии или расщепления по Эдману, может быть использована для разработки зондов или праймеров, которые используют для клонирования белка, представляющего интерес.The antibodies or protein of interest can be sequenced using Edman digestion, which is well known to those skilled in the art. The peptide information obtained from mass spectrometry or Edman digestion can be used to design probes or primers that are used to clone the protein of interest.
Альтернативный способ клонирования белка, представляющего интерес, представляет собой панорамирование с использованием очищенного PD-1 или его частей для клеток, экспрессирующих представляющее интерес антитело или белок, который содержит один или более CDR из MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1, или антитела, которое конкурирует с MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1 за связывание с PD1 человека. Процедура панорамирования может быть проведена путем получения библиотеки кДНК из тканей или клеток, которые экспрессируют PD-1, гиперэкспрессии кДНК во втором типе клеток и скрининга трансфецированных клеток второго типа для оценки специфичного связывания с PD-1 в присутствии или в отсутствие MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. Подробные описания способов, используемых в клонировании генов млекопитающих, кодирующих белки клеточной поверхности, путем панорамирования, можно найти в данной области техники (см., например, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 и Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol. 140:5841-5854).An alternative method for cloning a protein of interest is to pan using purified PD-1 or portions thereof to cells expressing an antibody of interest or a protein that contains one or more CDRs from anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15, or an antibody that competes with anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1, or MAT 15 to PD-1 for binding to human PD1. The panning procedure can be performed by preparing a cDNA library from tissues or cells that express PD-1, overexpressing the cDNA in a second cell type, and screening the transfected second cell type to assess specific binding to PD-1 in the presence or absence of anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15. Detailed descriptions of the methods used in cloning mammalian genes encoding cell surface proteins by panning can be found in the art (see, for example, Aruffo, A. et al. (1987) Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al. (1999) Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation, Endocrinol. 140:5841-5854).
Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клеткухозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфицирование (например, если вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус коровьей оспы). Выбор векторов или полинуклеотидов для введения часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина. Любая клетка-хозяин, способная к гиперэкспрессии гетерологичных ДНК, может быть использована для выделения генов, кодирующих антитело, полипептид или белок, представляющий интерес. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки линии COS, HeLa и СНО. Предпочтительно клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне примерно в 5 раз выше, более предпочтительно в 10 раз выше, еще более предпочтительно в 20 раз выше, чем уровень соответствующего эндогенного антитела или белка, представляющего интерес, если он присутствует, в клетке-хозяине. Скрининг клетокхозяев для определения специфичного связывания с PD-1 осуществляют с помощью иммунологического количественного исследования или флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Клетка, гиперэкспрессирующая антитело или белок, представляющий интерес, может быть идентифицирована.Vectors containing the polynucleotides of interest may be introduced into the host cell by any of a number of suitable methods, including electroporation; transfection using calcium chloride, rubidium chloride, calcium phosphate, DEAE-dextran, or other substances; microparticle bombardment; lipofection; and infection (e.g., if the vector is an infectious agent such as vaccinia virus). The choice of vectors or polynucleotides for introduction will often depend on the characteristics of the host cell. Any host cell capable of overexpressing heterologous DNAs may be used to isolate genes encoding the antibody, polypeptide, or protein of interest. Non-limiting examples of suitable mammalian host cells include, but are not limited to, COS, HeLa, and CHO cells. Preferably, the host cells express the cDNA at a level of about 5 times higher, more preferably 10 times higher, even more preferably 20 times higher than the level of the corresponding endogenous antibody or protein of interest, if present, in the host cell. Screening of the host cells for specific binding to PD-1 is performed by immunoassay or fluorescence-activated cell sorting (FACS). A cell overexpressing the antibody or protein of interest can be identified.
В область настоящего изобретения включены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность антител согласно настоящему изобретению. Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области техники. Полипептиды могут быть получены путем протеолитического или другого типа расщепления антител, рекомбинантными способами (т.е. одиночные или гибридные полипептиды), как описано выше, или с помощью химического синтеза. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды, содержащие не более приблизительно 50 аминокислот, обычно получают путем химического синтеза. Способы химического синтеза известны в данной области техники и являются коммерчески доступными. Например, полипептид к PD-1 человека может быть получен с помощью автоматического синтезатора полипептидов, используя твердофазный способ.The present invention includes polypeptides comprising the amino acid sequence of the antibodies of the present invention. The polypeptides of the present invention can be prepared by methods known in the art. The polypeptides can be prepared by proteolytic or other type of cleavage of antibodies, by recombinant methods (i.e., single or hybrid polypeptides), as described above, or by chemical synthesis. Antibody polypeptides, especially shorter polypeptides containing no more than about 50 amino acids, are typically prepared by chemical synthesis. Chemical synthesis methods are known in the art and are commercially available. For example, a polypeptide to human PD-1 can be prepared by an automated polypeptide synthesizer using a solid phase method.
В область настоящего изобретения включены варианты антител MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1 иIncluded within the scope of the present invention are antibody variants MAT to PD-1 1, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1 and
- 79 047726 их полипептидных фрагментов, которые связываются с PD-1, включая функционально эквивалентные антитела и гибридные полипептиды, которые не оказывают существенного влияния на свойства указанных молекул, а также варианты, которые имеют повышенную или пониженную активность. Модификация полипептидов является стандартным способом в данной области техники и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами остатков аминокислот, одной или более делециями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного вредного влияния на функциональную активность, или использование химических аналогов. Остатки аминокислот, которые могут быть консервативно замещены друг другом, включают, но не ограничиваются ими: глицин/аланин; серин/треонин; валин/изолейцин/лейцин; аспарагин/глутамин; аспарагиновую кислоту/глутаминовую кислоту; лизин/аргинин; и фенилаланин/тирозин. Подходящие полипептиды также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно замены аминокислот будут консервативными, т.е. замененная аминокислота будет обладать химическими свойствами, сходными с таковыми исходной аминокислоты. Подходящие консервативные замены известны в данной области техники, и примеры были приведены выше. Модификации аминокислот могут варьироваться от изменения или модификации одной или более аминокислот до полной реорганизации области, такой как вариабельный домен. Изменения в вариабельном домене могут изменять аффинность связывания и/или специфичность. Другие способы модификации включают использование методик соединения, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные способы, окислительную замену и хелатирование. Модификации могут быть использованы, например, для прикрепления меток для иммунологического количественного исследования, таких как прикрепление радиоактивных фрагментов для радиоиммунологического количественного исследования. Модифицированные полипептиды получают с использованием процедур, традиционных в данной области техники, и могут быть подвергнуты скринингу с использованием стандартных количественных исследований, известных в данной области техники.- 79 047 726 polypeptide fragments thereof that bind to PD-1, including functionally equivalent antibodies and hybrid polypeptides that do not significantly affect the properties of these molecules, as well as variants that have increased or decreased activity. Modification of polypeptides is a standard method in the art and does not need to be described in detail herein. Examples of modified polypeptides include polypeptides with conservative substitutions of amino acid residues, one or more deletions or additions of amino acids that do not significantly adversely affect functional activity, or the use of chemical analogs. Amino acid residues that can be conservatively substituted for each other include, but are not limited to: glycine/alanine; serine/threonine; valine/isoleucine/leucine; asparagine/glutamine; aspartic acid/glutamic acid; lysine/arginine; and phenylalanine/tyrosine. Suitable polypeptides also include glycosylated and non-glycosylated polypeptides, as well as polypeptides with other post-translational modifications such as, for example, glycosylation with different sugars, acetylation and phosphorylation. Preferably, the amino acid substitutions will be conservative, i.e., the substituted amino acid will have chemical properties similar to those of the original amino acid. Suitable conservative substitutions are known in the art and examples have been provided above. Amino acid modifications can range from changing or modifying one or more amino acids to completely reorganizing a region such as a variable domain. Changes in the variable domain can alter binding affinity and/or specificity. Other methods of modification include the use of coupling techniques known in the art, including, but not limited to, enzymatic methods, oxidative substitution and chelation. Modifications can be used, for example, to attach labels for immunoassay, such as attaching radioactive fragments for radioimmunoassay. The modified polypeptides are prepared using procedures conventional in the art and can be screened using standard quantitative assays known in the art.
В область настоящего изобретения включены гибридные белки, содержащие один или более полипептидов или антител MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1 согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации согласно настоящему изобретению предложен гибридный полипептид, который содержит легкую цепь, тяжелую цепь или обе легкую и тяжелую цепи. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный полипептид содержит гетерологичную константную область иммуноглобулина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный полипептид содержит вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи антитела, вырабатываемого гибридомами, депонированными в общедоступных базах. Для целей настоящего изобретения гибридный белок антитела содержит один или более полипептидных доменов, которые специфично связываются с PD-1, и другую аминокислотную последовательность, к которой он не присоединен в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другой области.The present invention includes within its scope fusion proteins comprising one or more polypeptides or antibodies of MAT to PD-1 1, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1 according to the present invention. According to one embodiment, the present invention provides a fusion polypeptide that comprises a light chain, a heavy chain, or both light and heavy chains. According to another embodiment, the present invention provides a fusion polypeptide that comprises a heterologous immunoglobulin constant region. According to another embodiment of the present invention, the hybrid polypeptide comprises a light chain variable domain and a heavy chain variable domain of an antibody produced by hybridomas deposited in publicly available databases. For the purposes of the present invention, the hybrid antibody protein comprises one or more polypeptide domains that specifically bind to PD-1 and another amino acid sequence to which it is not attached in the native molecule, such as a heterologous sequence or a homologous sequence from another region.
XI. Применение PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению.XI. Use of PD-1-binding molecules according to the present invention.
В область настоящего изобретения включены композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению (например, антитела к PD1, биспецифические диатела к PD-1 и т.д.), полипептиды, полученные из указанных молекул, полинуклеотиды, содержащие последовательности, кодирующие указанные молекулы или полипептиды, и другие агенты, описанные в настоящем документе.Included within the scope of the present invention are compositions, including pharmaceutical compositions, comprising PD-1-binding molecules of the present invention (e.g., anti-PD1 antibodies, anti-PD-1 bispecific diabodies, etc.), polypeptides derived from said molecules, polynucleotides comprising sequences encoding said molecules or polypeptides, and other agents described herein.
А. Варианты терапевтического применения.A. Therapeutic options.
Как обсуждалось выше, PD-1 играет важную роль в отрицательной регуляции пролиферации, функции и гомеостаза Т-клеток. Некоторые из PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению обладают способностью ингибировать функцию PD-1 и тем самым обращать ингибирование иммунной системы, опосредованное PD-1. В этой связи MAT к PD-1 1, MAT 3 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, их гуманизированные производные и молекулы, содержащие их PD-1-связывающие фрагменты (например, биспецифические антитела, биспецифические диатела (включая, но не ограничиваясь ими, DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I и DART-J) и т.д.), или те, которые конкурируют за связывание с указанными антителами, могут быть использованы для блокирования ингибирования иммунной системы, опосредованного PD-1, и тем самым способствуют активации иммунной системы.As discussed above, PD-1 plays an important role in the negative regulation of T cell proliferation, function and homeostasis. Some of the PD-1-binding molecules of the present invention have the ability to inhibit PD-1 function and thereby reverse PD-1-mediated inhibition of the immune system. In this regard, MAT to PD-1 1, MAT 3 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 and MAT 15 to PD-1, their humanized derivatives and molecules comprising PD-1-binding fragments thereof (e.g., bispecific antibodies, bispecific diabodies (including, but not limited to, DART-A, DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-H, DART-I and DART-J) and etc.), or those that compete for binding to these antibodies, may be used to block PD-1-mediated inhibition of the immune system and thereby promote activation of the immune system.
Указанные биспецифические PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, которые связываются с PD-1, и другой молекулой, участвующей в регуляции контрольной точки иммунного ответа, которая присутствует на поверхности клетки (например, LAG-3), усиливают иммунную систему, блокируя ингибирование иммунной системы, опосредованное PD-1 и указанными молекулами конSaid bispecific PD-1 binding molecules according to the present invention, which bind to PD-1 and another molecule involved in the regulation of an immune checkpoint present on the cell surface (e.g., LAG-3), enhance the immune system by blocking the inhibition of the immune system mediated by PD-1 and said checkpoint molecules.
- 80 047726 трольной точки иммунного ответа. Соответственно, указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно применять для усиления иммунного ответа (например, опосредуемого Т-клетками иммунного ответа) субъекта. В частности, указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения любых заболеваний или состояний, связанных с нежелательно подавленной иммунной системой, включая рак и заболевания, которые связаны с присутствием патогена (например, бактериальную, грибковую, вирусную инфекцию или инфекцию простейшими).- 80 047726 immune response control point. Accordingly, said PD-1-binding molecules of the present invention can be used to enhance the immune response (e.g., T-cell-mediated immune response) of a subject. In particular, said PD-1-binding molecules of the present invention can be used to treat any diseases or conditions associated with an undesirably suppressed immune system, including cancer and diseases that are associated with the presence of a pathogen (e.g., a bacterial, fungal, viral or protozoan infection).
Виды рака, которые можно лечить с использованием указанных PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению, включают виды рака, характеризующиеся присутствием раковой клетки, выбранной из группы, состоящей из клетки: опухоли надпочечников, ассоциированного со СПИДом рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухолей сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной карциномы клеток почек, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, рака яичников, рака поджелудочной железы, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочек периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериальной увеальной меланомы, редкого гематологического расстройства, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.Cancers that can be treated using said PD-1 binding molecules according to the present invention include cancers characterized by the presence of a cancer cell selected from the group consisting of: adrenal tumor, AIDS-associated cancer, alveolar soft tissue sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid artery tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal cell carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing's tumor, extraskeletal myxoid chondrosarcoma, fibrogenesis imperfecta of bone, fibrous dysplasia of bone, gallbladder cancer or bile duct, gastric cancer, gestational trophoblastic disease, germ cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, islet cell tumor, Kaposi sarcoma, renal cell cancer, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, medulloblastoma, melanoma, meningioma, multiple endocrine neoplasia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors, ovarian cancer, pancreatic cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematological disorder, metastatic renal cell carcinoma, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic carcinoma, thymoma, metastatic thyroid cancer, and uterine cancer.
В частности, указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для лечения колоректального рака, гепатоцеллюлярной карциномы, глиомы, рака почек, рака молочной железы, множественной миеломы, рака мочевого пузыря, нейробластомы, саркомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы и рака прямой кишки.In particular, the PD-1 binding molecules of the present invention can be used to treat colorectal cancer, hepatocellular carcinoma, glioma, renal cancer, breast cancer, multiple myeloma, bladder cancer, neuroblastoma, sarcoma, non-Hodgkin's lymphoma, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer and rectal cancer.
Связанные с патогенами заболевания, которые можно лечить с использованием указанных PD-1связывающих молекул согласно настоящему изобретению, включают хронические вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции. Хронические инфекции, которые можно лечить с использованием PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению, включают вирус ЭпштейнаБарр, вирус гепатита A (HAV); вирус гепатита В (HBV); вирус гепатита С (HCV); вирусы герпеса (например, HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус везикулярного стоматита (VSV), инфекции, вызванныеPathogen-related diseases that can be treated using said PD-1 binding molecules according to the present invention include chronic viral, bacterial, fungal and parasitic infections. Chronic infections that can be treated using the PD-1 binding molecules according to the present invention include Epstein-Barr virus, hepatitis A virus (HAV); hepatitis B virus (HBV); hepatitis C virus (HCV); herpes viruses (e.g. HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), human immunodeficiency virus (HIV), vesicular stomatitis virus (VSV), infections caused by
Bacilli, Citrobacter, Cholera, Diphtheria, Enterobacter, Gonococci, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococci, Mycobacterium, Pseudomonas, Pneumonococci, бактериями риккетсиями,Bacilli, Citrobacter, Cholera, Diphtheria, Enterobacter, Gonococci, Helicobacter pylori, Klebsiella, Legionella, Meningococci, Mycobacterium, Pseudomonas, Pneumonococci, Rickettsia bacteria,
Salmonella, Serratia, Staphylococci, Streptococci, Tetanus,Salmonella, Serratia, Staphylococci, Streptococci, Tetanus,
Aspergillus (fumigatus, niger и т. д.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и т. д.), Cryptococcus neoformans, видами рода Mucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirosis, Borrelia burgdorferi, гельминтными паразитами (анкилостомами, ленточными червями, трематодами, плоскими червями (например,Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Mucorales species (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Leptospirosis, Borrelia burgdorferi, helminth parasites (hookworms, tapeworms, trematodes, flatworms (e.g.
Giardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi иGiardia lambia, trichinella, Dientamoeba Fragilis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi and
Leishmania donovani).Leishmania donovani).
Указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с другими противораковыми агентами, в частности, молекулами, которые специфично связываются с раковым антигеном (например, антителами, диателами). Противораковые препараты, которые можно комбинировать с PD-1-связывающими молекулами согласно настоящему изобретению, включают молекулы, которые специфично связываются с еще одним раковым антигеном, включая: 19.9, обнаруженный при раке толстой кишки, в муцинах при раке желудка; 4.2; А33 (антиген колоректальной карциномы, Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); ADAM-9 (публикация патента США 2006/0172350, PCT публикация WO 06/084075); АН6, обнаруженный при раке желудка; ALCAM (PCT публикация WOThe PD-1 binding molecules of the present invention can be combined with other anti-cancer agents, in particular molecules that specifically bind to a cancer antigen (e.g., antibodies, diabodies). Anti-cancer drugs that can be combined with the PD-1 binding molecules of the present invention include molecules that specifically bind to another cancer antigen, including: 19.9, found in colon cancer, in gastric cancer mucins; 4.2; A33 (colorectal carcinoma antigen, Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); ADAM-9 (US Patent Publication 2006/0172350, PCT Publication WO 06/084075); AH6, found in gastric cancer; ALCAM (PCT Publication WO
- 81 047726- 81 047726
03/093443); АРО-1 (злокачественный антиген лимфоцитов человека) (Trauth et al. (1989) «Monoclonal03/093443); APO-1 (human lymphocyte malignant antigen) (Trauth et al. (1989) "Monoclonal
Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis», Science 245:301-304); Bl (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9); B7-H3 (Collins, M. et al. (2005) «The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands», Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A. et al. (2001) «В7-НЗ: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production», Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) «Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes», J. Immunol. 168:6294-6297); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):57784); бета-катенин (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9);Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction of Apoptosis,” Science 245:301-304); Bl (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9); B7-H3 (Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands”, Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A. et al. (2001) “B7-NZ: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes", J. Immunol. 168:6294-6297); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):57784); beta-catenin (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9);
антигены группы крови ALeb/Ley, обнаруженные при аденокарциноме толстой кишки; антиген лимфомы Беркитта-38.13, С14, обнаруженный при аденокарциноме толстой кишки; СА125 (антиген карциномы яичников) (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81 ; Yu et al. (1991) «Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants», Cancer Res. 51(2):468-475); карбоксипаптидазу M (публикация патента США 2006/0166291); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Ghetie et al. (1994) «Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human В-Cell Tumor Lines in vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest», Blood 83:1329-1336; Troussard, X. etal. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Reff et al. (1994) «Depletion Of В Cells in vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20», Blood 83:435-445; Thomas, D.A. etal. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD33 (Sgouros et al. (1993) «Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia», J. Nucl. Med. 34:422-430); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. etal. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD46 (патент США №7148038; PCT публикация WO 03/032814); CD52 (Eketorp, S.S. et al. (2014) «Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients», Ann Hematol. 93(10): 1725-1733; Suresh, T. et al. (2014) «New Antibody Approaches To Lymphoma Therapy», J. Hematol. Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) «Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies In Acute Lymphoblastic Leukemia», Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD317 (Kawai, S. et al. (2008) «Interferon-А Enhances CDS 17 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell Carcinoma Xenograft Models», Cancer Science 99(12):2461-2466; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody», Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. etal. (2009) «Chimeric And Humanized Anti-HM 1.2 4 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer», 63(1):23-31; Sayeed, A. et al. (2013) «Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells», PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10); CDK4 (Lee, Y.M. etal. 2006 Cell Cycle 5(18):2110СЕ СЕА (карциноэмбриональный антиген;blood group antigens ALe b /Le y found in colon adenocarcinoma; Burkitt lymphoma antigen-38.13, C14 found in colon adenocarcinoma; CA125 (ovarian carcinoma antigen) (Bast, RC Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81 ; Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants", Cancer Res. 51(2):468-475); carboxylpeptide M (US Patent Publication 2006/0166291); CD5 (Calin, GA et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Ghetie et al. (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest", Blood 83:1329-1336; Troussard, X et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); (Kreitman, RJ 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia", J. Nucl. Med. 34:422-430); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. etal. 2005 Ann NY Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, JG 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD46 (US Patent No. 7148038; PCT Publication WO 03/032814); CD52 (Eketorp, S.S. et al. (2014) "Alemtuzumab (Anti-CD52 Monoclonal Antibody) As Single-Agent Therapy In Patients With Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL)-A Single Region Experience On Consecutive Patients", Ann Hematol. 93(10): 1725-1733; Suresh, T. et al. (2014) Antibody Approaches To Lymphoma Therapy," J. Hematol. Oncol. 7:58; Hoelzer, D. (2013) "Targeted Therapy With Monoclonal Antibodies in Acute Lymphoblastic Leukemia," Curr. Opin. 25(6):701-706); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, PG et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD317 (Kawai, S. et al. (2008) "Interferon-A Enhances CDS 17 Expression And The Antitumor Activity Of Anti-CD317 Monoclonal Antibody In Renal Cell Carcinoma Xenograft Models", Cancer Science 99(12):2461-2466; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against L ung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody,” Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. et al. (2009) “Chimeric And Humanized Anti-HM 1.2 4 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells,” 63(1): 23-31; (2013) "Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasion In High Grade Breast Cancer Cells", PLoS ONE 8(6)e67191, pp. 1-10); CDK4 (Lee, YM etal. 2006 Cell Cycle 5(18):2110CE CEA (carcinoembryonic antigen;
- 82 047726- 82 047726
Foon et al. (1995) «Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine», J. Clin. Invest. 96(l):334-42); Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; TellezAvila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CEACAM9/CEACAM6 (Zheng, C. et al. (2011) «Α Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Celis-Mediated Tumor Immunity», PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11); CO 17-1A (Ragnhammar et al. (1993) «Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced», Int. J. Cancer 53:751-758);Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine", J. Clin. Invest. 96(l):334-42); Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; TellezAvila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CEACAM9/CEACAM6 (Zheng, C. et al. (2011) "Α Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Celis-Mediated Tumor Immunity", PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11); CO 17-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced", Int. J. Cancer 53:751 -758);
СО-43 (антиген группы крови Leb); СО-514 (антиген группы крови Lea), обнаруженный при аденокарциноме; СТА-1; CTLA-4 (Peggs, K.S. et al., 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-1з); цитокератин 8 (PCT публикация WO 03/024191); D1.1; D156-22; DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) «TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics», Expert Opin. Ther. Targets 14(10): 1091-1108; Andera, L. (2009) «Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family», Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3): 173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) «Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy», Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) «Following the TRAIL to Apoptosis», Immunologic Res. 35(3):249-262);CO-43 (blood group antigen Le b ); CO-514 (blood group antigen Le a ), found in adenocarcinoma; CTA-1; CTLA-4 (Peggs, KS et al., 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); cytokeratin 8 (PCT publication WO 03/024191); D1.1; D156-22; DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics", Expert Opin. Ther. Targets 14(10): 1091-1108; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family", Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3): 173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy”, Clin, Cancer 13(8): 2313-2317; Chaudhari, B. R. et al. (2006) “Following the TRAIL to Apoptosis”, Immunologic Res.
ряд E1 (группа крови В), обнаруженный при раке поджелудочной железы; EGFR (рецептор эпидермального фактора роста, Adenis, A. et al., 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); эфрин (и, в частности, EphA2 (патент США 7569672, PCT публикация WO 06/084226), Erb (ErbBl, ЕгЬВЗ, ErbB4, Zhou, H. etal. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-1338); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1): 123-128); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-1025); ганглиозид GD2 (Gru; Saleh et al. (1993) «Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen», J.Immunol., 151, 3390-3398); ганглиозд GD3 (Gd3; Shitara et al. (1993) «А Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities», Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380); ганглиозид GM2 (Gw; Livingston et al. (1994) «Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside», J. Clin. Oncol. 12:1036-1044); ганглиозид GM3 (Gw; Hoon et al. (1993) «Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers», Cancer Res. 53:5244-5250); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) «Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma», J. Clin. Immunol. 2:135-140); gplOO (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27);the E1 series (blood group B), found in pancreatic cancer; EGFR (epidermal growth factor receptor, Adenis, A. et al., 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); ephrin (and in particular EphA2 (US Patent 7,569,672, PCT Publication WO 06/084226), Erb (ErbB1, ErbB3, ErbB4, Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5): 1325-1338); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1): 123-128); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P. O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-1025); ganglioside GD2 (Gru; Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen", J. Immunol., 151, 3390-3398); ganglioside GD3 (Gd3; Shitara et al. (1993) “A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities,” Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380); GM2 ganglioside (Gw; Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside", J. Clin. Oncol. 12:1036-1044); ganglioside GM3 (Gw; Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers", Cancer Res. 53:5244-5250); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of Aulating Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma", J. Clin. Immunol. 2:135-140); gplOO (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27);
Gp37 (T-клеточный антиген лейкоза человека,Gp37 (human T-cell leukemia antigen,
Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) «Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Abi, Ab2, and Ab3)», J. Immunol. 141:1398-1403); gp75 (антиген меланомы; Vijayasardahl et al. (1990) «The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse В (Brown) Locus Gene Product», J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380); gpA33 (Heath, J.K. et al. (1997) «The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) «Characterization Of PosttranslationalModifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium», Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) «EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia», J. Clin. Pathol. 59(3):260-263);Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) “Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Abi, Ab2, and Ab3),” J. Immunol. 141:1398-1403); gp75 (melanoma antigen; Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse In (Brown) Locus Gene Product", J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380); gpA33 (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) “Characterization of Posttranslational Modifications of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein of Human Gastrointestinal Epithelium,” Biochem. Res. Commun. 236(3):682–686; et al. (2006) "EpCAM and gpA33 are Markers of Barrett's Metaplasia", J. Clin. Pathol. 59(3):260-263);
антиген HER2 (HER2/neu, p185HER2; Kumar, Pal S et al., 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); HMFG (антиген глобулы молочного жира человека, WO1995015171); папилломавирус-Б6 человека/папилломавирус-Е7 человека (DiMaio, D. et al., 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; HMW-MAA (высокомолекулярный антиген меланомы,HER2 antigen (HER2/neu, p185 HER2 ; Kumar, Pal S et al., 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); HMFG (human milk fat globule antigen, WO1995015171); human papillomavirus-B6/human papillomavirus-E7 (DiMaio, D. et al., 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; HMW-MAA (high molecular weight melanoma antigen,
- 83 047726- 83 047726
Natali et al. (1987) «Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance», Cancer 59:55-63;Natali et al. (1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance”, Cancer 59:55-63;
Mittelman et al. (1990) «Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-HighMolecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies», J. Clin. Invest.Mittelman et al. (1990) “Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-HighMolecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,” J. Clin. Invest.
86:2136-2144); антиген I (дифференцировочный антиген, Feizi (1985) «Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens», Nature 314:53-57); IL13Ra2 (PCT публикация WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) «.Glioma IL13Ra2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis», PLoS One. 18;8(10):e77769;86:2136-2144); antigen I (differentiation antigen, Feizi (1985) “Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens”, Nature 314:53-57); IL13Ra2 (PCT publication WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) ".Glioma IL13Ra2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis", PLoS One. 18;8(10):e77769;
Barderas, R. et al. (2012) «High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis», Cancer Res. 72(11):27802790; Kasaian, M.T. et al. (2011) «IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Ra2», J. Immunol. 187(l):561-569; Bozinov, O. et al.Barderas, R. et al. (2012) "High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis", Cancer Res. 72(11):27802790; Kasaian, M.T. et al. (2011) "IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Ra2", J. Immunol. 187(l):561-569; Bozinov, O. et al.
(2010) «Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas», Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al.(2010) "Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas", Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al.
(2009) «А novel role of inter leukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis», Cancer Res. 69(22):8678-8685);(2009) “A novel role of inter leukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis,” Cancer Res. 69(22):8678-8685);
интегрин β6 (PCT публикация WO 03/087340); JAM-3 (PCT публикация WO 06/084078); KID3 (PCT публикация WO 05/028498); KID31 (PCT публикация WO 06/076584); общий антиген карциномы KS 1/4 Hellstrom et al. (1986) Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Res. 46:3917-3923); LEA; LUCA-2 (публикации патентов США 2006/0172349; PCT публикация WO 06/083852); M1:22:25:8; M18; М39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, В. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al., 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; мезотелин (Chang K, and Pastan I. 1996 Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers, Proc Natl Acad Sci USA 93:136-40), MUC-1 (Mathelin, С 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, С et al., 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Myl; Nацетилглюкозаминилтрансферазу (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); неогликопротеин; NS-10, обнаруженный при аденокарциномах; OFA-1; OFA-2; онкостатин М (рецептор онкостатина бета, патент США № 7572896, PCT публикация WO 06/084092); р15 (Gil, J. et al., 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); p97 (ассоциированный с меланомой антиген; Estin et al. (1989) Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454); РЕМ (полиморфный эпителиальный муцин, Hilkens et al. (1992) Cell MembraneAssociated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property, Trends in Biochem. Sci. 17:359-363); РЕМА (антиген полиморфного эпителиального муцина); PIPA (патент США № 7405061, PCT публикация WO 04/043239); PSA (антиген предстательной железы, Henttu et al. (1989) cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen, Cancer Res. 53:227-230; Cracco, C.M. et al., 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (специфичный для простаты мембранный антиген, Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180); простатическая кислая фосфатаза (Tailor et al. (1990) Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); R24, обнаруженный при меланоме; ROR1 (патент США № 5843749); сфинголипиды; SSEA1; SSEA-3; SSEA-4; sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); Т-клеточный рецептор, полученный из кожной Т-клеточной лимфомы (см. Edelson (1998) Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy, Cancer J Sci Am. 4:62-71); T5A7, обнаруженный в миелоидных клетках; TAG-72 (Yokota et al. (1992) Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms, Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (группа крови А); рецептор TNF (рецептор TNFα, рецептор TNF-β; рецептор TNF-γ (van Horssen, R. et al., 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al., 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (группа крови Н), рецептор трансферрина (патент США № 7572895, PCT публикация WO 05/121179), 5Т4 (TPBG, гликопротеин трофобласта; Boghaert, E.R. et al. (2008) The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin, Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin, Curr. Oncol. Rep. 16:370, p. 1-6); TSTA (опухолеспецифичный трансплантационный антиген), например, вирусно-индуцированные опухолевые антигены, включая Т-антиген ДНК-содержащих опухолевых вирусов и антигены оболочки РНК-содержащих опуintegrin β6 (PCT Publication No. WO 03/087340); JAM-3 (PCT Publication No. WO 06/084078); KID3 (PCT Publication No. WO 05/028498); KID31 (PCT Publication No. WO 06/076584); carcinoma common antigen KS 1/4 Hellstrom et al. (1986) Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Res. 46:3917-3923); LEA; LUCA-2 (U.S. Patent Publication Nos. 2006/0172349; PCT Publication No. WO 06/083852); M1:22:25:8; M18; M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, V. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al., 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; mesothelin (Chang K, and Pastan I. 1996 Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelin elium, mesotheliomas, and ovarian cancers, Proc Natl Acad Sci USA 93:136-40), MUC-1 (Mathelin, C 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); Myl; N-acetylglucosaminyltransferase (Dennis, JW 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); neoglycoprotein; NS-10, found in adenocarcinomas; OFA-1; OFA-2; oncostatin M (oncostatin beta receptor, U.S. Patent No. 7,572,896, PCT Publication WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al., 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); p97 (melanoma-associated antigen; Estin et al. (1989) Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454); PEM (polymorphic epithelial mucin, Hilkens et al. (1992) Cell MembraneAssociated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property, Trends in Biochem. Sci. 17:359-363); PEMA (polymorphic epithelial mucin antigen); PIPA (US Patent No. 7,405,061, PCT Publication WO 04/043239); PSA (prostate specific antigen, Henttu et al. (1989) cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen, Cancer Res. 53:227-230; Cracco, CM et al., 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (prostate specific membrane antigen, Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180); prostatic acid phosphatase (Tailor et al. (1990) Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); R 24 , found in melanoma; ROR1 (U.S. Patent No. 5,843,749); sphingolipids; SSEA1; SSEA-3; SSEA-4; sTn (Holmberg, LA 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); T-cell receptor, derived from cutaneous T-cell lymphoma (see Edelson (1998) Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy, Cancer J Sci Am. 4:62-71); T5A7, found in myeloid cells; TAG-72 (Yokota et al. (1992) Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms, Cancer Res. 52:3402–3408); TL5 (blood group A); TNF receptor (TNFα receptor, TNF-β receptor; TNF-γ receptor (van Horssen, R. et al., 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al., 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (blood group H), transferrin receptor (US Patent No. 7,572,895, PCT Publication WO 05/121179), 5T4 (TPBG, trophoblast glycoprotein; Boghaert, ER et al. (2008) The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin, Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin, Curr. Oncol. Rep. 16:370, p. 1-6); TSTA (tumor-specific transplantation antigen), such as virally induced tumor antigens, including T antigen of DNA tumor viruses and envelope antigens of RNA tumor
- 84 047726 холевых вирусов, онкофетальный антиген-альфа-фетопротеин, такой как СЕА толстой кишки, онкофетальный антиген опухоли мочевого пузыря (Hellstrom et al. (1985) «Monoclonal Antibodies To Cell Surface- 84 047726 holoviruses, oncofetal antigen-alpha-fetoprotein, such as colon CEA, oncofetal antigen of bladder tumor (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface
Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas», Cancer. Res. 45:22102188); VEGF (Pietrantonio, F. et al. (2015) «Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians», Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272-281; Grabowski, J.P. (2015) «.Current Management Of Ovarian Cancer», Minerva Med. 106(3):151-156; Field, K.M. (2015) «Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies», Cancer 121(7):997-1007; Suh, D.H. et al. (2015) «Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014», J. Gynecol. Oncol. 26(2): 156-167; Liu, K.J. et al.Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas", Cancer. Res. 45:22102188); VEGF (Pietrantonio, F. et al. (2015) "Bevacizumab-Based Neoadjuvant Chemotherapy For Colorectal Cancer Liver Metastases: Pitfalls And Helpful Tricks In A Review For Clinicians", Crit. Rev. Oncol. Hematol. 95(3):272- 281; Grabowski, J.P. (2015) ".Current Management of Ovarian Cancer", Minerva Med. 106(3):151-156; Field, K.M. (2015) "Bevacizumab And Glioblastoma: Scientific Review, Newly Reported Updates, And Ongoing Controversies ", Cancer 121(7):997-1007; Suh, D.H. et al. (2015) "Major Clinical Research Advances In Gynecologic Cancer In 2014", J. Gynecol. Oncol. 26(2): 156-167; Liu, K.J. et al.
(2015) «Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer», Tumour Biol. 36(3): 1323-1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) «Bevacizumab treatment in the elderly patient with metastatic colorectal cancer», Clin. Interv. Aging 10:127-133);(2015) "Bevacizumab In Combination With Anticancer Drugs For Previously Treated Advanced Non-Small Cell Lung Cancer", Tumour Biol. 36(3): 1323-1327; Di Bartolomeo, M. et al. (2015) “Bevacizumab treatment in the elderly patient with metastatic colorectal cancer,” Clin. Interv. Aging 10:127-133);
рецептор VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-998); VEP8; VEP9; VIM-D5; и гаптен Y, Ley, обнаруженный в клетках эмбриональной карциномы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению используют в комбинации с одной или более молекулами, которые специфично связываются с 5Т4, В7Н3, CD19, CD20, CD51, CD123, DR5, EGFR, EpCam, GD2, gpA33, HER2, ROR-1, TAG-72, антителом к VEGF-A и/или VEGFR2.VEGF receptor (O'Dwyer. PJ 2006 Oncologist. 11(9):992-998); VEP8; VEP9; VIM-D5; and hapten Y, Le y , found in embryonal carcinoma cells. In some embodiments, the PD-1 binding molecules of the invention are used in combination with one or more molecules that specifically bind to 5T4, B7H3, CD19, CD20, CD51, CD123, DR5, EGFR, EpCam, GD2, gpA33, HER2, ROR-1, TAG-72, an antibody to VEGF-A, and/or VEGFR2.
Указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с иммуногенным агентом, таким как опухолевая вакцина. Подходящие вакцины могут содержать очищенные опухолевые антигены (включая рекомбинантные белки, пептиды и молекулы углеводов), аутологичные или аллогенные опухолевые клетки. Было описано несколько стратегий, касающихся опухолевых вакцин (см., например, Palena, С., et al., (2006) «Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies», Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I., et al. (2011) «Cancer immunotherapy comes of age», Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) «The anti-tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derived peptides», Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) «Generation of T-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines», J. Clin. Oncol. 20, 26242632; Vermeij, R. et al. (2012) «Potentiation of a p53-SLP vaccine by cyclophosphamide in ovarian cancer: a single-arm phase II study.» Int. J. Cancer 131, E670-E680).The PD-1 binding molecules of the present invention may be combined with an immunogenic agent, such as a tumor vaccine. Suitable vaccines may contain purified tumor antigens (including recombinant proteins, peptides and carbohydrate molecules), autologous or allogeneic tumor cells. Several tumor vaccine strategies have been described (see, for example, Palena, S., et al., (2006) “Cancer vaccines: preclinical studies and novel strategies,” Adv. Cancer Res. 95, 115-145; Mellman, I., et al. (2011) “Cancer immunotherapy comes of age,” Nature 480, 480-489; Zhang, X. M. et al. (2008) “The anti -tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derived peptides,” Oncol. Rep. 20, 245-252; Disis, M. L. et al. (2002) “Generation of T-cell immunity to the HER-2/neu protein after active immunization with HER-2/neu peptide-based vaccines,” J. Clin. 26242632; Vermeij, R. et al. (2012) “Potentiation of a p53-SLP vaccine by cyclophosphamide in ovarian cancer: a single-arm phase II study.” Int. J. Cancer 131, E670-E680).
Указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с химиотерапевтическими схемами. В этих случаях существует возможность снижения дозы вводимого химиотерапевтического реагента (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).The PD-1 binding molecules of the present invention can be combined with chemotherapeutic regimens. In these cases, it is possible to reduce the dose of the administered chemotherapeutic reagent (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304).
Указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с другими иммуностимулирующими молекулами, такими как антитела, которые активируют восприимчивость иммунной системы хозяина, чтобы обеспечить повышенные уровни активации Т-клеток. В частности, было показано, что антитела к PD-1, антитела к PD-L1 и/или антитела к CTLA-4 активируют иммунную систему (см., например, del Rio, M-L. et al. (2005) «Antibody-Mediated Signaling ThroughThe PD-1 binding molecules of the present invention can be combined with other immunostimulatory molecules, such as antibodies, that activate the host immune system's responsiveness to provide increased levels of T cell activation. In particular, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, and/or anti-CTLA-4 antibodies have been shown to activate the immune system (see, e.g., del Rio, M-L. et al. (2005) "Antibody-Mediated Signaling Through
PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation», Eur. J. Immunol 35:3545-3560; Barber, D. L. et al. (2006) «Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection», Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) «Involvement OfPD-Ll On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade», Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al., (1996) «Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade», Science 271, 1734-1736).PD-1 Costimulates T Cells And Enhances CD28-Dependent Proliferation,” Eur. J Immunol 35:3545–3560; Barber, D. L. et al. (2006) “Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection,” Nature 439, 682-687; Iwai, Y. et al. (2002) "Involvement OfPD-Ll On Tumor Cells In The Escape From Host Immune System And Tumor Immunotherapy By PD-L1 Blockade", Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 12293-12297; Leach, D. R., et al., (1996) "Enhancement Of Antitumor Immunity By CTLA-4 Blockade", Science 271, 1734-1736).
Дополнительные иммуностимулирующие молекулы, которые можно комбинировать с PD-1связывающими молекулами согласно настоящему изобретению, включают антитела к молекулам на поверхности дендритных клеток, которые активируют функцию дендритных клеток (ДК) и представление антигена, антитела к CD40, способные заменить активность хелперных Т-клеток, и активирующие антитела к костимулирующим молекулам Т-клеток, таким как PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB и ICOS (см., например,Additional immunostimulatory molecules that can be combined with the PD-1 binding molecules of the present invention include antibodies to molecules on the surface of dendritic cells that activate dendritic cell (DC) function and antigen presentation, antibodies to CD40 that can replace helper T cell activity, and activating antibodies to T cell costimulatory molecules such as PD-L1, CTLA-4, OX-40 4-1BB, and ICOS (see, e.g.,
- 85 047726- 85 047726
Ito et al. (2000) «Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By SubcutaneousIto et al. (2000) "Effective Priming Of Cytotoxic T Lymphocyte Precursors By Subcutaneous
Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4Administration Of Peptide Antigens In Liposomes Accompanied By Anti-CD40 And Anti-CTLA-4
Antibodies»,Immunobiology 201:527-40; патент США №5811097; Weinberg et al. (2000) «Engagement of the OX-40 Receptor in vivo Enhances Antitumor Immunity», Immunol 164:2160-2169; Melero et al. (1997) «Monoclonal Antibodies Against The 4-IBB T-Cell Activation Molecule Eradicate Establish ed Tumors», Nature Medicine 3: 682-685; Hutloff et al.Antibodies”, Immunobiology 201:527-40; US Patent No. 5811097; Weinberg et al. (2000) “Engagement of the OX-40 Receptor in vivo Enhances Antitumor Immunity,” Immunol 164:2160–2169; Melero et al. (1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-IBB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors,” Nature Medicine 3: 682–685; Hutloff et al.
(1999) «ICOS Is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related To CD28», Nature 397: 263-266; и Moran, A.E. et al. (2013) «The TNFRs 0X40, 4-1BB, and CD40 As Targets For Cancer Immunotherapy», Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004), и/или стимулирующие химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антигенсвязывающий домен, направленный к антигену заболевания, гибридизованный с одним или более внутриклеточными сигнальными доменами из различных костимулирующих белковых рецепторов (например, CD28, 4-1ВВ, ICOS, OX40 и т.д.), которые служат для стимуляции Т-клеток при связывании антигена (см., например,(1999) "ICOS Is An Inducible T-Cell Co-Stimulator Structurally And Functionally Related To CD28", Nature 397: 263-266; and Moran, A.E. et al. (2013) "The TNFRs 0X40, 4-1BB, and CD40 As Targets for Cancer Immunotherapy", Curr Opin Immunol. 2013 Apr; 25(2): 10.1016/j.coi.2013.01.004), and/or stimulatory chimeric antigen receptors (CARs) comprising an antigen-binding domain directed to a disease antigen fused to one or more intracellular signaling domains from different costimulatory protein receptors ( eg CD28, 4-1BB, ICOS, OX40, etc.), which serve to stimulate T cells upon antigen binding (see, eg,
Tettamanti, S. et al. (2013) «Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By CytokineInduced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor», Br.Tettamanti, S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By CytokineInduced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor", Br.
J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) «Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells», Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) «Т Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia», Blood 122:31383148; Pizzitola, I. et al. (2014) «Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo», Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells”, Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions and Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:31383148; Pizzitola, I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in Vivo", Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).
Указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно комбинировать с ингибирующим химерным антигенным рецептором (iCAR) для перенаправления нацеленных иммунотерапевтических ответов. iCAR содержит антигенсвязывающий домен, направленный к антигену заболевания, гибридизованный с одним или более внутриклеточными сигнальными доменами из различных ингибирующих белковых рецепторов (например, CTLA-4, PD-1 и т.д.), которые служат для ограничения ответов Т-клеток при связывании с антигеном (см., например, Fedorov V.D. (2013) PD-1-and CTLA-4Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses, Sci. Tranl. Med. 5:215ra172 doi:10.1126/ scitranslmed.3006597. В частности, указанные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению используют в комбинации с антителом к CD137, антителом к CTLA-4, антителом к ОХ40, антителом к LAG-3, антителом к PD-L1, антителом к TIGIT, антителом к TIM-3 и/или противораковой вакциной.The PD-1 binding molecules of the present invention can be combined with an inhibitory chimeric antigen receptor (iCAR) to redirect targeted immunotherapeutic responses. The iCAR comprises an antigen-binding domain directed to a disease antigen fused to one or more intracellular signaling domains from various inhibitory protein receptors (e.g., CTLA-4, PD-1, etc.) that serve to limit T cell responses upon binding to the antigen (see, e.g., Fedorov V.D. (2013) PD-1-and CTLA-4Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors (iCARs) Divert Off-Target Immunotherapy Responses, Sci. Tranl. Med. 5:215ra172 doi:10.1126/scitranslmed.3006597. In particular, the PD-1-binding molecules of the present invention are used in combination with an anti-CD137 antibody, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-OX40 antibody, an anti-LAG-3 antibody, an anti- PD-L1, anti-TIGIT antibody, anti-TIM-3 antibody and/or cancer vaccine.
В. Диагностическая и лечебно-диагностическая полезность.B. Diagnostic and therapeutic-diagnostic utility.
Некоторые из PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению не способны или проявляют слабую способность блокировать связывание PD-1 с лигандом PD-1L. В этой связи антитела MAT 2 к PD-1 и MAT 4 к PD-1, их гуманизированные производные, а также молекулы, содержащие их PD-1-связывающие фрагменты (например, биспецифические диатела, и т.д.), или те, которые конкурируют за связывание с указанными антителами, могут быть помечены детектируемой меткой (например, с использованием радиоактивных, ферментативных, флуоресцентных, хемилюминесцентных, парамагнитных, диамагнитных или других меченых фрагментов) и используются для детектирования PD-1 в образцах или визуализации PD-1 на клетках. Поскольку указанные молекулы не влияют на биологическую активность PD-1, они особенно полезны в способах определения степени, местоположения и изменения экспрессии PD-1 у субъектов (например, у субъектов, которых лечат от рака, связанного с экспрессией или нацеленным воздействием на PD-1).Some of the PD-1-binding molecules of the present invention are unable or exhibit weak ability to block the binding of PD-1 to the ligand PD-1L. In this regard, the antibodies MAB 2 to PD-1 and MAB 4 to PD-1, their humanized derivatives, as well as molecules containing their PD-1-binding fragments (e.g., bispecific diabodies, etc.), or those that compete for binding with said antibodies, can be labeled with a detectable label (e.g., using radioactive, enzymatic, fluorescent, chemiluminescent, paramagnetic, diamagnetic or other labeled moieties) and used to detect PD-1 in samples or visualize PD-1 on cells. Because these molecules do not affect the biological activity of PD-1, they are particularly useful in methods for determining the extent, location, and change in PD-1 expression in subjects (e.g., subjects being treated for cancer associated with PD-1 expression or targeting).
XII. Фармацевтические композиции.XII. Pharmaceutical compositions.
Композиции согласно настоящему изобретению включают нерасфасованные лекарственные композиции, пригодные для изготовления фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций) и фармацевтических композиций (т.е. композиций, которые подходят для введения субъекту или пациенту), которые могут быть использованы в приготовлении стандартных лекарственных форм. Подходящие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению или комбинацию подходящих агентов и фармацевтически приемлемого носителя. Предпочтительно композиции согласно настоящему изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество PD-1- 86 047726 связывающих молекул согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В область настоящего изобретения в частности включены подходящие фармацевтические композиции, в которых PD-1-связывающая молекула представляет собой: MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1; гуманизированное MAT к PD-1 1; MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1; PD-1-связывающий фрагмент любого указанного антитела; или в которых PD-1-связывающая молекула представляет собой биспецифическое диатело к PD-1- (например, биспецифическое диатело PD-1xLAG-3). В область настоящего изобретения включены в частности молекулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH из MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1; гуманизированного MAT к PD-1 1; MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1. В область настоящего изобретения также включены такие фармацевтические композиции, которые дополнительно содержат второе терапевтическое антитело (например, специфичное для опухолей моноклональное антитело), которое является специфичным в отношении конкретного ракового антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.The compositions of the present invention include bulk drug compositions suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions (e.g., crude or non-sterile compositions) and pharmaceutical compositions (i.e., compositions that are suitable for administration to a subject or patient) that can be used in the preparation of unit dosage forms. Suitable compositions comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of the PD-1 binding molecules of the present invention or a combination of suitable agents and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the compositions of the present invention comprise a prophylactically or therapeutically effective amount of the PD-1-86 047 726 binding molecules of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier. The present invention particularly includes suitable pharmaceutical compositions wherein the PD-1 binding molecule is: anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 8, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, or anti-PD-1 MAT 15; a humanized anti-PD-1 MAT 1; MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1; a PD-1-binding fragment of any of said antibodies; or wherein the PD-1-binding molecule is an anti-PD-1 bispecific diabody (e.g., a PD-1xLAG-3 bispecific diabody). Included within the scope of the present invention are in particular molecules that comprise 3 CDR L and 3 CDRH of MAT to PD-1 1, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1; humanized MAT to PD-1 1; MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1. The scope of the present invention also includes such pharmaceutical compositions that further comprise a second therapeutic antibody (e.g., a tumor-specific monoclonal antibody) that is specific for a particular cancer antigen and a pharmaceutically acceptable carrier.
Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для использования у животных и, более конкретно, у человека. Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, например адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательному веществу или носителю, с которым вводят лекарственное соединение. Подходящими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтепродуктов, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Физиологические солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если необходимо, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для поддержания pH. Подходящие композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и т. п.According to a specific embodiment of the present invention, the term pharmaceutically acceptable means approved by a regulatory agency of the federal or state government or listed in the United States Pharmacopeia or other generally recognized pharmacopeia for use in animals and, more particularly, in humans. The term carrier refers to a diluent, an adjuvant, such as Freund's adjuvant (complete and incomplete), an excipient, or a vehicle with which the drug compound is administered. Suitable pharmaceutical carriers can be sterile liquids such as water and oils, including petroleum oils, animal, vegetable, or synthetic oils such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, and the like. Water is a preferred carrier when the pharmaceutical composition is administered intravenously. Physiological saline solutions and aqueous dextrose and glycerol solutions can also be used as liquid carriers, particularly for injection solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, dry skim milk, glycerol, propylene, glycol, water, ethanol, etc. The composition, if necessary, can also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents or buffering agents to maintain pH. Suitable compositions can be in the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, pills, capsules, powders, sustained-release compositions, etc.
Обычно ингредиенты композиций согласно настоящему изобретению поставляют по отдельности или смешивают с получением стандартной дозированной формы, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или концентрата, не содержащего воды, в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. В том случае, если композиция должна быть введена путем инфузии, она может быть распределена с инфузионной бутылкой, содержащей стерильную фармацевтическую воду или физиологический раствор. В том случае, если композицию вводят путем инъекции, может быть обеспечена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора так, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.Typically, the ingredients of the compositions of the present invention are supplied separately or mixed to form a unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or a water-free concentrate, in a hermetically sealed container such as an ampoule or sachet indicating the amount of active agent. In the event that the composition is to be administered by infusion, it can be dispensed with an infusion bottle containing sterile pharmaceutical water or saline. In the event that the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline can be provided so that the ingredients can be mixed before administration.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли, образованные с анионами, такими как анионы, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и те, которые образованы катионами, такими как катионы, полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.The compositions of the present invention may be prepared in neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts formed with anions such as those derived from hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and those formed with cations such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, iron hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных PD-1-связывающей молекулой согласно настоящему изобретению (и более предпочтительно MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1; гуманизированным MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD1 или MAT 15 к PD-1, PD-1-связывающим фрагментом любого из указанных антител, или PD-1связывающей молекулой, которая представляет собой биспецифическое диатело к PD-1 (например, биспецифическое диатело PD-1xLAG-3)). В область настоящего изобретения, в частности, включены молеThe present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising one or more containers filled with a PD-1 binding molecule according to the present invention (and more preferably an anti-PD-1 MAT 1, an anti-PD-1 MAT 2, an anti-PD-1 MAT 3, an anti-PD-1 MAT 4, an anti-PD-1 MAT 5, an anti-PD-1 MAT 6, an anti-PD-1 MAT 7, an anti-PD-1 MAT 8, an anti-PD-1 MAT 9, an anti-PD-1 MAT 10, an anti-PD-1 MAT 11, an anti-PD-1 MAT 12, an anti-PD-1 MAT 13, an anti-PD-1 MAT 14 or an anti-PD-1 MAT 15; humanized anti-PD-1 MAT 1, an anti-PD-1 MAT 2, an anti-PD-1 MAT 3, an anti-PD-1 MAT 4, an anti-PD-1 MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD1 or MAT 15 to PD-1, a PD-1-binding fragment of any of these antibodies, or a PD-1-binding molecule that is a bispecific diabody to PD-1 (e.g., a PD-1xLAG-3 bispecific diabody). Included within the scope of the present invention are, in particular, molecules
- 87 047726 кулы, которые содержат 3 CDRL и 3 CDRH1 из MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 или MAT 15 к PD-1, по отдельности или с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Помимо этого один или более других профилактических или терапевтических агентов, пригодных для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтический пакет или набор. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, которое отражает одобрение указанным агентством производства, применения или продажи для введения человеку, может быть необязательно прикреплено к указанному контейнеру (контейнерам).- 87 047726 kits that contain 3 CDRL and 3 CDRH1 from MAT to PD-1 1, MAT 2 to PD-1, MAT 3 to PD-1, MAT 4 to PD-1, MAT 5 to PD-1, MAT 6 to PD-1, MAT 7 to PD-1, MAT 8 to PD-1, MAT 9 to PD-1, MAT 10 to PD-1, MAT 11 to PD-1, MAT 12 to PD-1, MAT 13 to PD-1, MAT 14 to PD-1 or MAT 15 to PD-1, alone or with a suitable pharmaceutically acceptable carrier. In addition, one or more other prophylactic or therapeutic agents suitable for treating a disease can also be included in the pharmaceutical package or kit. The present invention also provides a pharmaceutical package or kit comprising one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the present invention. A notice in the form prescribed by a governmental agency regulating the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products, which reflects approval by said agency of manufacture, use or sale for administration to humans, may optionally be affixed to said container(s).
Согласно настоящему изобретению также предложены наборы, которые можно применять в вышеуказанных способах. Набор может содержать любую из PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать один или более других профилактических и/или терапевтических агентов, пригодных для лечения рака, в одном или более контейнерах; и/или набор может дополнительно содержать одно или более цитотоксических антител, которые связываются с одним или более раковыми антигенами, ассоциированными с раком. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения другой профилактический или терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения профилактический или терапевтический агент представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.The present invention also provides kits that can be used in the above methods. The kit may comprise any of the PD-1 binding molecules of the present invention. The kit may further comprise one or more other prophylactic and/or therapeutic agents useful for treating cancer in one or more containers; and/or the kit may further comprise one or more cytotoxic antibodies that bind to one or more cancer antigens associated with cancer. In some embodiments of the present invention, the other prophylactic or therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. In other embodiments of the present invention, the prophylactic or therapeutic agent is a biological or hormonal therapeutic agent.
XIII. Способы введения.XIII. Methods of administration.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть обеспечены для лечения, профилактики и улучшения одного или более симптомов, связанных с заболеванием, расстройством или инфекцией, путем введения субъекту эффективного количества гибридного белка или конъюгированной молекулы согласно настоящему изобретению, или фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок или конъюгированную молекулу согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительному аспекту указанные композиции по существу очищены (т.е. по существу не содержат вещества, которые ограничивают их действие или вызывают нежелательные побочные эффекты). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, такое как млекопитающее, не относящееся к приматам (например, бычьих, лошадиных, кошачьих, собачьих, грызунов и т.д.), или примата (например, обезьяну, такую как яванская макака, человека и т.д.). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъект является человеком. Различные системы доставки известны и могут быть использованы для введения композиций согласно настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или гибридный белок, опосредованный рецепторами эндоццтоз (см., например, Wu et al. (1987) Receptor-Mediated in vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д.The compositions of the present invention can be provided for the treatment, prevention and amelioration of one or more symptoms associated with a disease, disorder or infection by administering to a subject an effective amount of a fusion protein or conjugated molecule of the present invention, or a pharmaceutical composition comprising a fusion protein or conjugated molecule of the present invention. According to a preferred aspect, said compositions are substantially purified (i.e., substantially free of substances that limit their action or cause undesirable side effects). According to a specific embodiment of the present invention, the subject is an animal, preferably a mammal, such as a non-primate mammal (e.g., bovine, equine, feline, canine, rodent, etc.) or a primate (e.g., a monkey such as a cynomolgus macaque, a human, etc.). According to a preferred embodiment of the present invention, the subject is a human. Various delivery systems are known and can be used to administer the compositions of the present invention, such as encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the antibody or fusion protein, receptor-mediated endocystosis (see, for example, Wu et al. (1987) Receptor-Mediated in vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construction of the nucleic acid as part of a retroviral or other vector, etc.
Способы введения молекулы согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и через слизистые оболочки (например, интраназальный и пероральный пути). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным способом, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Помимо этого также можно применять легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя и состава с аэрозольным агентом. См., например, патенты США № 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; и 4880078; и PCT публикации WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; и WO 99/66903, которые все полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.Methods of administration of the molecule of the present invention include, but are not limited to, parenteral administration (e.g., intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous and subcutaneous), epidural and mucosal (e.g., intranasal and oral routes). According to a specific embodiment of the present invention, the PD-1 binding molecules of the present invention are administered intramuscularly, intravenously or subcutaneously. The compositions can be administered by any convenient route, such as by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucosal membranes (e.g., oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.) and can be administered together with other biologically active agents. Administration can be systemic or local. In addition, pulmonary administration can also be used, for example, using an inhaler or nebulizer and an aerosol agent formulation. See, for example, U.S. Patent Nos. 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; and 4,880,078; and PCT Publications WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; and WO 99/66903, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
Согласно настоящему изобретению также предложены PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, упакованные в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества молекулы. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанные молекулы поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизованного порошка или концентрата, не содержащего воды, в герметично закрытом контейнере и могут быть восстановлены, например, с использованием воды или физиологического раствора до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению поставляют в виде сухого стерильного лиофилизованного порошка в герметично закрытом контейнере.The present invention also provides PD-1-binding molecules of the present invention packaged in a hermetically sealed container, such as an ampoule or a sachet, indicating the amount of the molecule. According to one embodiment of the present invention, said molecules are supplied as a dry, sterile, lyophilized powder or concentrate that does not contain water in a hermetically sealed container and can be reconstituted, for example, using water or saline to an appropriate concentration for administration to a subject. Preferably, the PD-1-binding molecules of the present invention are supplied as a dry, sterile, lyophilized powder in a hermetically sealed container.
- 88 047726- 88 047726
Лиофилизованные PD-1-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению следует хранить при температуре от 2 до 8°С в их первоначальном контейнере, и молекулы должны быть введены в течение 12 ч, предпочтительно в течение 6 ч, в течение 5 ч, в течение 3 ч или в течение 1 ч после восстановления. В другом варианте реализации указанные молекулы поставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации молекулы, гибридного белка или конъюгированной молекулы.The lyophilized PD-1 binding molecules of the present invention should be stored at a temperature of 2 to 8°C in their original container, and the molecules should be administered within 12 hours, preferably within 6 hours, within 5 hours, within 3 hours, or within 1 hour after reconstitution. In another embodiment, said molecules are supplied in liquid form in a hermetically sealed container indicating the amount and concentration of the molecule, fusion protein, or conjugated molecule.
Предпочтительно указанные PD-1-связывающие молекулы, если они обеспечены в жидкой форме, поставляют в герметично закрытом контейнере.Preferably, said PD-1 binding molecules, if provided in liquid form, are supplied in a hermetically sealed container.
Количество композиции согласно настоящему изобретению, которая будет эффективной при лечении, предотвращении или улучшении одного или более симптомов, связанных с расстройством, может быть определена с помощью стандартных клинических методик. Точная доза, которая будет применена в составе, также будет зависеть от способа введения и от тяжести состояния, и должна быть определена в соответствии с решением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых зависимости ответа от дозы, полученных из испытательных систем в условиях in vitro или животных моделей.The amount of the composition of the present invention that will be effective in treating, preventing or improving one or more symptoms associated with the disorder can be determined using standard clinical techniques. The exact dose to be used in the composition will also depend on the route of administration and the severity of the condition, and should be determined in accordance with the judgment of the practitioner and the circumstances of each patient. Effective doses can be extrapolated from dose response curves obtained from in vitro test systems or animal models.
В настоящем изобретении термин эффективное количество фармацевтической композиции в одном варианте реализации представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь ими, клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, ослабление симптома инфекции (например, вирусной нагрузки, лихорадки, боли, сепсиса и т.д.) или симптома рака (например, пролиферации раковых клеток, присутствия опухоли, метастаз опухоли и т.д.), повышая тем самым качество жизни индивидуумов, страдающих указанным заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление действия другого лекарственного средства, например, путем нацеленного воздействия и/или интернализации, замедление прогрессирования заболевания и/или продление периода выживания индивидуумов.In the present invention, the term "effective amount" of a pharmaceutical composition in one embodiment is an amount sufficient to obtain beneficial or desired results, including, but not limited to, clinical results such as a reduction in symptoms resulting from a disease, a reduction in a symptom of an infection (e.g., viral load, fever, pain, sepsis, etc.) or a symptom of cancer (e.g., cancer cell proliferation, tumor presence, tumor metastasis, etc.), thereby improving the quality of life of individuals suffering from said disease, a reduction in the dose of other drugs needed to treat the disease, an enhancement of the effect of another drug, such as by targeting and/or internalization, a slowing of the progression of the disease, and/or an extension of the survival period of individuals.
Эффективное количество можно вводить с помощью одного или более введений. Для целей настоящего изобретения эффективное количество лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для снижения пролиферации (или эффекта) присутствующего вируса и для уменьшения и/или замедления развития вирусного заболевания, прямо или косвенно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффективное количество лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции может быть, но необязательно, достигнуто в комбинации с другим лекарственным препаратом, соединением или фармацевтической композицией. Соответственно, эффективное количество может быть рассмотрено применительно к введению одного или более химиотерапевтических агентов, и один агент можно рассматривать как введенный в эффективном количестве, если, в комбинации с одним или более другими агентами, достигнут или может быть достигнут желательный результат.An effective amount can be administered by one or more administrations. For the purposes of the present invention, an effective amount of a drug, compound or pharmaceutical composition is an amount sufficient to reduce the proliferation (or effect) of the virus present and to reduce and/or slow the progression of the viral disease, directly or indirectly. According to some embodiments of the present invention, an effective amount of a drug, compound or pharmaceutical composition can optionally be achieved in combination with another drug, compound or pharmaceutical composition. Accordingly, an effective amount can be considered in relation to the administration of one or more chemotherapeutic agents, and one agent can be considered to be administered in an effective amount if, in combination with one or more other agents, the desired result is or can be achieved.
Несмотря на то что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента находится в пределах компетенции специалистов в данной области техники.Although individual needs vary, determination of optimal ranges of effective amounts of each component is within the skill of the art.
Для PD-1-связывающих молекул, включенных в область настоящего изобретения, дозировка, вводимая пациенту, предпочтительно определена на основании массы тела (кг) субъекта-реципиента. Для PD-1-связывающих молекул, включенных в область настоящего изобретения, вводимая пациенту дозировка, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,05 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 2 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 30 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 75 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 125 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 150 мг/кг или более массы тела субъекта.For PD-1 binding molecules included within the scope of the present invention, the dosage administered to a patient is preferably determined based on the body weight (kg) of the recipient subject. For PD-1 binding molecules included within the scope of the present invention, the dosage administered to a patient is typically at least about 0.01 μg/kg, at least about 0.05 μg/kg, at least about 0.1 μg/kg, at least about 0.2 μg/kg, at least about 0.5 μg/kg, at least about 1 μg/kg, at least about 2 μg/kg, at least about 5 μg/kg, at least about 10 μg/kg, at least about 20 μg/kg, at least about 50 μg/kg, at least about 0.1 mg/kg, at least about 1 mg/kg, at least about 3 mg/kg, at least about 5 mg/kg, at least about 10 mg/kg, at least about 30 mg/kg, at least about at least about 50 mg/kg, at least about 75 mg/kg, at least about 100 mg/kg, at least about 125 mg/kg, at least about 150 mg/kg or more of the subject's body weight.
Дозировка и частота введения PD-1-связывающей молекулы согласно настоящему изобретению может быть снижена или изменена путем усиления поглощения и проникновения молекулы в ткани посредством модификаций, таких как, например, липидирование.The dosage and frequency of administration of the PD-1 binding molecule of the present invention can be reduced or altered by enhancing the uptake and penetration of the molecule into tissues through modifications such as, for example, lipidation.
Дозировка PD-1-связывающей молекулы согласно настоящему изобретению, вводимая пациенту, может быть рассчитана для применения в качестве монотерапии. В другом варианте, молекула может быть использована в комбинации с другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка является более низкой, чем при введении указанных молекул в виде монотерапии.The dosage of the PD-1 binding molecule according to the present invention administered to a patient can be calculated for use as a monotherapy. In another embodiment, the molecule can be used in combination with other therapeutic compositions, and the dosage administered to the patient is lower than when these molecules are administered as a monotherapy.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить локально в область, нуждающуюся в лечении; такое введение может быть достигнуто, например, но не ограничиваясьThe pharmaceutical compositions of the present invention may be administered locally to the area in need of treatment; such administration may be achieved, for example, but not limited to,
- 89 047726 ими, путем местной инфузии, путем инъекции или с помощью имплантата, причем указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или желатинообразный материал, включая мембраны, такие как силастические мембраны, или волокна. Предпочтительно при введении молекулы согласно настоящему изобретению следует проявлять осторожность при использовании материалов, которые не поглощают молекулу.- 89 047726 by them, by local infusion, by injection or by means of an implant, wherein said implant is a porous, non-porous or gelatinous material, including membranes such as silastic membranes or fibres. Preferably, when administering the molecule according to the present invention, care should be taken to use materials that do not absorb the molecule.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть доставлены в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, p. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327).The compositions of the present invention may be delivered in a vesicle, in particular a liposome (see Langer (1990) New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327).
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть доставлены в системе с контролируемым высвобождением или в системе с замедленным высвобождением. Любая методика, известная специалисту в данной области техники, может быть использована для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одну или более PD-1-связывающих молекул согласно настоящему изобретению. См., например, патент США № 4526938; PCT публикацию WO 91/05548; PCT публикацию WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, которые все полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в системе с контролируемым высвобождением может быть использован насос (см. Langer, выше; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; и Saudek et al. (1989) A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N. Engl. J. Med. 321:574-579). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения полимерные материалы могут быть использованы для достижения контролируемого высвобождения молекул (см., например, Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192; During et al. (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: in vivo Characterization, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, J. Neurosurg. 7(1): 105-112); патент США № 5679377; патент США № 5916597; патент США № 5912015; патент США № 5989463; патент США № 5123232; PCT публикацию WO 99/15154; и PCT публикацию WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в препаратах с замедленным высвобождением, включают, но не ограничиваются ими, поли-2-гидроксиэтилметакрилат, полиметилметакрилат, полиакриловую кислоту, сополимер этилена и винилацетата, полиметакриловую кислоту, полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли-Ы-винилпирролидон, поливиниловый спирт, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и полиортоэфиры. Система с контролируемым высвобождением может быть размещена вблизи терапевтической мишени (например, легких), в результате этого необходима лишь доля системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, p. 115-138 (1984)). Полимерные композиции, которые можно применять в качестве имплантатов с контролируемым высвобождением, могут быть использованы в соответствии с Dunn et al. (см. патент США № 5945155). Данный конкретный способ основан на терапевтическом эффекте контролируемого высвобождения биоактивного материала из полимерной системы в условиях in situ. Имплантация обычно может происходить в любом месте организма пациента, нуждающегося в терапевтическом лечении. Можно использовать неполимерную систему замедленной доставки, в которой неполимерный имплантат в организме субъекта используется в качестве системы доставки лекарственного препарата. При имплантации в организме органический растворитель имплантата будет распределяться, диспергироваться или выщелачиваться из композиции в окружающую тканевую жидкость, и неполимерный материал будет постепенно коагулировать или осаждаться с образованием твердой микропористой матрицы (см. патент США № 5888533).The compositions of the present invention can be delivered in a controlled release system or a sustained release system. Any technique known to one of skill in the art can be used to prepare sustained release formulations containing one or more PD-1 binding molecules of the present invention. See, for example, U.S. Patent No. 4,526,938; PCT Publication No. WO 91/05548; PCT Publication No. WO 96/20698; Ning et al. (1996) Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel, Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, all of which are incorporated herein by reference in their entireties. According to one embodiment of the present invention, a pump may be used in the controlled release system (see Langer, supra; Sefton, (1987) Implantable Pumps, CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, Surgery 88:507-516; and Saudek et al. (1989) A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, N. Engl. J. Med. 321:574-579). According to another embodiment of the present invention, polymeric materials can be used to achieve controlled release of molecules (see, e.g., Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate, Science 228:190-192; During et al. (1989) Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: in vivo Characterization, Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits, J. Neurosurg. 7(1): 105-112); U.S. Patent No. 5,679,377; U.S. Patent No. 5,916,597; U.S. Patent No. 5,912,015; U.S. Patent No. 5,989,463; U.S. Patent No. 5,123,232; PCT Publication WO 99/15154; and PCT Publication WO 99/20253). Examples of polymers used in sustained release preparations include, but are not limited to, poly-2-hydroxyethyl methacrylate, polymethyl methacrylate, polyacrylic acid, ethylene-vinyl acetate copolymer, polymethacrylic acid, polyglycolides (PLG), polyanhydrides, poly-N-vinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polyethylene glycol, polylactides (PLA), poly(lactic-glycolic acid) copolymer (PLGA), and polyorthoesters. The controlled release system can be located near the therapeutic target (e.g., the lungs), resulting in only a fraction of the systemic dose being required (see, e.g., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Polymer compositions that can be used as controlled release implants can be used according to Dunn et al. (See U.S. Patent No. 5,945,155). This particular method is based on the therapeutic effect of controlled release of a bioactive material from a polymeric system under in situ conditions. Implantation can typically occur at any location in the body of a patient requiring therapeutic treatment. A non-polymeric sustained delivery system can be used, in which a non-polymeric implant in the body of a subject is used as a drug delivery system. When implanted in the body, the organic solvent of the implant will be distributed, dispersed or leached from the composition into the surrounding tissue fluid, and the non-polymeric material will gradually coagulate or precipitate to form a solid microporous matrix (See U.S. Patent No. 5,888,533).
Системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Любая методика, известная специалисту в данной области техники, может быть использована для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих один или более терапевтических агентов согласно настоящему изобретению. См., например, патент США № 4526938; международные публикацииControlled release systems are discussed in the review by Langer (1990, New Methods Of Drug Delivery, Science 249:1527-1533). Any technique known to one skilled in the art can be used to prepare sustained release formulations containing one or more therapeutic agents of the present invention. See, for example, U.S. Patent No. 4,526,938; International Publications
- 90 047726- 90 047726
WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al. (1996) «Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel», Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) «Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions», PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) «Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application», Pro. Int’l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) «Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery», Proc. Int’l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater.WO 91/05548 and WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application", Pro. Int'l. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rei. Bioact. Mater.
24:759-760, которые все полностью включены в настоящее изобретение посредством ссылки.24:759-760, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
Если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую PD-1-связывающую молекулу согласно настоящему изобретению, то нуклеиновую кислоту можно вводить в условиях in vivo, чтобы стимулировать экспрессию PD-1-связывающей молекулы, которую она кодирует, путем конструирования ее как части соответствующего вектора экспрессии нуклеиновой кислоты и путем введения так, чтобы указанный вектор стал внутриклеточным, например, с использованием ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286) или путем прямой инъекции, или с использованием бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или путем покрытия липидами, или поверхностными рецепторами клеток или трансфецирующими агентами, или путем введения указанного вектора, соединенного с гомеобоксоподобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868), и т.д. В другом варианте, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и встроена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации. Лечение субъекта с использованием терапевтически или профилактически эффективного количества PD-1-связывающей молекулы согласно настоящему изобретению может включать однократную обработку или предпочтительно может включать серию обработок. В предпочтительном примере субъекта лечат с использованием указанного диатела один раз в неделю в течение от 1 до 10 недель, предпочтительно от 2 до 8 недель, более предпочтительно от 3 до 7 недель и еще более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить один раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. В другом варианте фармацевтические композиции можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, раз в две недели, один раз в месяц, один раз каждые шесть недель, один раз в два месяца, два раза в год или один раз в год. Также будет понятно, что эффективная дозировка молекул, используемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в ходе конкретного лечения.If the composition of the present invention is a nucleic acid encoding a PD-1 binding molecule of the present invention, the nucleic acid can be administered in vivo to stimulate expression of the PD-1 binding molecule it encodes by constructing it as part of an appropriate nucleic acid expression vector and administering it so that the vector becomes intracellular, such as by using a retroviral vector (see U.S. Patent No. 4,980,286) or by direct injection or by using microparticle bombardment (e.g., gene gun; Biolistic, Dupont) or by coating with lipids or cell surface receptors or transfection agents, or by administering the vector linked to a homeobox-like peptide known to penetrate the nucleus (see, e.g., Joliot et al. (1991) Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868), etc. In another embodiment, the nucleic acid can be administered intracellularly and integrated into the host cell DNA for expression by homologous recombination. Treating a subject with a therapeutically or prophylactically effective amount of a PD-1 binding molecule according to the present invention can comprise a single treatment or, preferably, can comprise a series of treatments. In a preferred example, the subject is treated with said diabody once a week for 1 to 10 weeks, preferably 2 to 8 weeks, more preferably 3 to 7 weeks, and even more preferably for about 4, 5, or 6 weeks. The pharmaceutical compositions according to the present invention can be administered once a day, twice a day, or three times a day. In another embodiment, the pharmaceutical compositions may be administered once a week, twice a week, once every two weeks, once a month, once every six weeks, once every two months, twice a year, or once a year. It will also be understood that the effective dosage of the molecules used for treatment may increase or decrease over the course of a particular treatment.
ПримерыExamples
Следующие примеры иллюстрируют различные способы для композиций в диагностических или лечебных способах согласно настоящему изобретению. Примеры приведены в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.The following examples illustrate various methods for the compositions in diagnostic or therapeutic methods according to the present invention. The examples are provided for illustrative purposes and in no way limit the scope of the present invention.
Пример 1. Характеристика моноклональных антител к PD-1 человека.Example 1. Characterization of monoclonal antibodies to human PD-1.
Пятнадцать мышиных моноклональных антител, способных специфично связываться как с PD-1 человека, так и с PD-1 яванских макак, выделяли и обозначали МАТ к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, МАТ 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, МАТ 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и МАТ 15 к PD-1. Было обнаружено, что CDR указанных антител отличаются и представлены выше. Связывание с внеклеточным доменом PD-1 человека и яванских макак оценивали следующим образом: 96-луночные планшеты с плоским дном Maxi-Sorb™ покрывали растворимым PD-1 человека или PD-1 яванских макак (внеклеточный домен PD-1 человека, гибридизованный с полигистидиновой меткой (shPD-1 His) или областью Fc человека (shPD-1 hFc), или внеклеточный домен PD-1 яванских макак, гибридизованный с областью Fc человека (scyno-PD1 Fc)), каждый в концентрации 0,5 или 1 мкг/мл, планшеты промывали и инкубировали с одним из выделенных антител к PD-1, MAT к PD-1 1-15. Для проведения данных исследований антитела к PD-1 использовали в концентрации 3, 1,0, 0,3333, 0,1111, 0,0370, 0,0123 или 0,0041 мкг/мл (трехкратные последовательные разведения). Количество антитела, связывающегося с иммобилизованным PD-1 (человека или яванских макак), оценивали с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена (ПХ) вторичного антитела козы к IgG мыши. Все образцы исследовали на считывателе для планшетов (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers). Типичные кривые связывания для растворимого PD-1 человека и растворимого PD-1 яванских макак представлены на фиг. 7A-7D и фиг. 8А-8С, соответственно. Результаты проведенных исследований связывания (фиг. 7A-7D и фиг. 8А-8С) свидетельствуют о том, что все антитела к PD-1, MAT к PD-1 1-15, связываются как с растворимым PD-1 человека, так и с растворимым PD-1 яванских макак.Fifteen murine monoclonal antibodies capable of specifically binding to both human and cynomolgus macaque PD-1 were isolated and designated anti-PD-1 MAb 1, anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 3, anti-PD-1 MAb 4, anti-PD-1 MAb 5, anti-PD-1 MAb 6, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 8, anti-PD-1 MAb 9, anti-PD-1 MAb 10, anti-PD-1 MAb 11, anti-PD-1 MAb 12, anti-PD-1 MAb 13, anti-PD-1 MAb 14, and anti-PD-1 MAb 15. The CDRs of these antibodies were found to differ and are shown above. Binding to the extracellular domain of human and cynomolgus monkey PD-1 was assessed as follows: 96-well flat-bottomed Maxi-Sorb™ plates were coated with soluble human or cynomolgus monkey PD-1 (human PD-1 extracellular domain fused to a polyhistidine tag (shPD-1 His) or human Fc region (shPD-1 hFc), or cynomolgus monkey PD-1 extracellular domain fused to human Fc region (scyno-PD1 Fc)), each at a concentration of 0.5 or 1 μg/mL, the plates were washed and incubated with one of the isolated anti-PD-1 antibodies, PD-1 mAbs 1-15. For these studies, anti-PD-1 antibodies were used at concentrations of 3, 1.0, 0.3333, 0.1111, 0.0370, 0.0123, or 0.0041 μg/mL (three-fold serial dilutions). The amount of antibody binding to immobilized PD-1 (human or cynomolgus monkey) was estimated using horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody. All samples were run on a plate reader (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers). Representative binding curves for soluble human PD-1 and soluble cynomolgus monkey PD-1 are shown in Figs. 7A–7D and Figs. 8A–8C, respectively. The results of the binding studies (Figs. 7A-7D and Figs. 8A-8C) indicate that all anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAbs 1-15, bind to both human soluble PD-1 and cynomolgus macaque soluble PD-1.
Чтобы дополнительно охарактеризовать мышиные антитела к PD-1, их способность блокировать связывание растворимого PD-L1 человека с растворимым PD-1 человека оценивали в двух разных колиTo further characterize the murine anti-PD-1 antibodies, their ability to block the binding of soluble human PD-L1 to soluble human PD-1 was assessed in two different assays.
- 91 047726 чественных исследованиях. В одном количественном исследовании оценивали способность антител блокировать связывание PD-1 человека с PD-L1, иммобилизованным на поверхности. Для проведения данного количественного исследования каждое из антител к PD-1, MAT к PD-1 1-15, или контрольное антитело к PD-1 (MAT к PD-1 А) смешивали с гибридным белком shPD-1 His (в концентрации 2,5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с меченым биотином растворимым PD-L1 человека (внеклеточный домен PD-L1, гибридизованный с Fc человека (sPD-L1)), в концентрации 1 мкг/мл, иммобилизованным на планшете, покрытом стрептавидином. Для проведения данных исследований антитела к PD-1 использовали в концентрации 10, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 или 0,1563 мкг/мл (двукратные последовательные разведения). Количество shPD-1 His, связанного с иммобилизованным sPD-L1, оценивали с помощью His-метки с использованием вторичного антитела к His-метке, конъюгированного с ПХ. Все образцы исследовали на считывателе для планшетов (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers). Результаты данного эксперимента представлены на фиг. 9A-9D.- 91,047,726 quantitative studies. One quantitative study assessed the ability of antibodies to block binding of human PD-1 to surface-immobilized PD-L1. For this quantitative study, each of the anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 1-15 mAbs, or anti-PD-1 control antibody (anti-PD-1 A mAb) was mixed with shPD-1 His fusion protein (at a concentration of 2.5 μg/mL) and separately incubated with biotin-labeled soluble human PD-L1 (the extracellular domain of PD-L1 fused to human Fc (sPD-L1)), at a concentration of 1 μg/mL, immobilized on a streptavidin-coated plate. For these studies, anti-PD-1 antibodies were used at concentrations of 10, 5.0, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, or 0.1563 μg/mL (two-fold serial dilutions). The amount of shPD-1 His bound to immobilized sPD-L1 was estimated by His-tag using an HRP-conjugated anti-His-tag secondary antibody. All samples were run on a plate reader (Victor 2 Wallac, Perkin Elmers). The results of this experiment are shown in Figs. 9A–9D.
Результаты проведенных количественных исследований ингибирования (фиг. 9A-9D) свидетельствуют о том, что антитела к PD-1, MAT к PD-1 1, MAT 3 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 8 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1,MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, были способны блокировать связывание растворимого PD-L1 человека с растворимым PD-1 человека в разной степени, в то время как MAT 2 к PD-1 и MAT 4 к PD-1 проявили незначительную или отсутствующую блокирующую активность в данном формате количественных исследований.The results of the quantitative inhibition studies (Figs. 9A-9D) indicate that the anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAb 1, anti-PD-1 MAb 3, anti-PD-1 MAb 5, anti-PD-1 MAb 6, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 8, anti-PD-1 MAb 9, anti-PD-1 MAb 10, anti-PD-1 MAb 11, anti-PD-1 MAb 12, anti-PD-1 MAb 13, anti-PD-1 MAb 14, and anti-PD-1 MAb 15, were able to block the binding of soluble human PD-L1 to soluble human PD-1 to varying degrees, while anti-PD-1 MAb 2 and anti-PD-1 MAb 4 exhibited little or no blocking activity in this quantitative assay format.
Во втором количественном исследовании оценивали способность мышиных антител к PD-1, MAT к PD-1 1-15, блокировать связывание лиганда PD-1 (т.е. PD-L1 человека или PD-L2 человека) с PD-1, экспрессированным на поверхности клеток линии NSO. Для проведения данного количественного исследования каждое из антител к PD-1, MAT к PD-1 1-15, или контрольное антитело к PD-1 (МАТ к PD-1 А или MAT к PD-1 В) отдельно смешивали с биотинилированным растворимым PD-L1 человека (гибридный белок shPD-L1) или биотинилированным растворимым гибридным белком PD-L2-muIgFc человека (shPD-L2; Ancell, каталожный номер 573-030), каждый в концентрации 0,1 мкг/исследование, и инкубировали с клетками линии NSO, экспрессирующими PD-1 человека (~250000 клеток/лунку) в блокирующем буфере (FACS+10% сывороточного альбумина человека). Для проведения данных исследований антитела к PD-1 использовали в концентрации 4,0, 1,0, 2,5х10-1, 6,25х10-2, 1,56х10-2, 3,90х10-3, 9,76х10-4, 2,4x10-4, 0,6x10'4 мкг/исследование (четырехкратные последовательные разведения). Количество shPDL1 (или shPD-L2), связанного с поверхностью клеток линии NSO, определяли с использованием конъюгированного с фикоэритрином вторичного антитела, связанного со стрептавидином, с помощью FACS. Определяли значения ИК50 для ингибирования связывания PD-1/PD-L1, и среднее значение выборки (*) по меньшей мере двух экспериментов (за исключением тех случаев, когда это указано) представлено в табл. 6.In a second quantitative study, we assessed the ability of murine anti-PD-1 antibodies, PD-1 mAbs 1-15, to block the binding of PD-1 ligand (i.e., human PD-L1 or human PD-L2) to PD-1 expressed on the surface of NSO cells. To perform this quantitative assay, each anti-PD-1 antibody, anti-PD-1 mAb 1-15, or anti-PD-1 control antibody (anti-PD-1 mAb A or anti-PD-1 mAb B) was separately mixed with biotinylated soluble human PD-L1 (shPD-L1 fusion protein) or biotinylated soluble human PD-L2-muIgFc fusion protein (shPD-L2; Ancell, catalog #573-030), each at a concentration of 0.1 μg/assay, and incubated with human PD-1-expressing NSO cells (~250,000 cells/well) in blocking buffer (FACS+10% human serum albumin). For these studies, anti-PD-1 antibodies were used at concentrations of 4.0, 1.0, 2.5x10 -1 , 6.25x10 -2 , 1.56x10 -2 , 3.90x10 -3 , 9.76x10 -4 , 2.4x10-4, 0.6x10'4 μg/assay (fourfold serial dilutions). The amount of shPDL1 (or shPD-L2) bound to the surface of NSO cells was determined using a phycoerythrin-conjugated streptavidin-coupled secondary antibody by FACS. IC 50 values for inhibition of PD-1/PD-L1 binding were determined, and the mean value (*) of at least two experiments (except where indicated) is presented in Table 6.
Таблица 6Table 6
Ϊ Результаты одного эксперимента.Ϊ Results of one experiment.
Результаты количественных исследований ингибирования shPD-L1 (табл. 6) свидетельствуют о том, что антитела к PD-1, MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD-1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 11 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1, MAT 14 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, были способны блокировать связывание PD-L1 человека с PD-1 человека, экспрессируемым на поверхности клеток линии NSO. В частности, MAT к PD-1 1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 10 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 блокировали связывание shPD-L1 аналогично или более эффективно, чем эталонные антитела к PD-1 (МАТ к PD-1 А, MAT к PD-1 В), тогда как MAT 8 к PD-1 по существу не оказывало блокирующего действия в данном формате количественных исследований. Оба MAT 2 к PD-1 и MAT 4 к PD-1 были способны блокировать связывание PD-1/PD-L1 в данном формате количественных исследований.The results of quantitative shPD-L1 inhibition studies (Table 6) indicate that anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 3, anti-PD-1 MAT 4, anti-PD-1 MAT 5, anti-PD-1 MAT 6, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 9, anti-PD-1 MAT 10, anti-PD-1 MAT 11, anti-PD-1 MAT 12, anti-PD-1 MAT 13, anti-PD-1 MAT 14, and anti-PD-1 MAT 15, were able to block the binding of human PD-L1 to human PD-1 expressed on the surface of NSO cells. Specifically, anti-PD-1 mAb 1, anti-PD-1 mAb 5, anti-PD-1 mAb 6, anti-PD-1 mAb 7, anti-PD-1 mAb 10, and anti-PD-1 mAb 15 blocked shPD-L1 binding similarly to or more efficiently than the reference anti-PD-1 antibodies (anti-PD-1 mAb A, anti-PD-1 mAb B), whereas anti-PD-1 mAb 8 had essentially no blocking effect in this assay format. Both anti-PD-1 mAb 2 and anti-PD-1 mAb 4 were able to block PD-1/PD-L1 binding in this assay format.
- 92 047726- 92 047726
Аналогичным образом, антитела к PD-1, MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 3 к PD-1, MAT 4 к PD1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 10 к PD-1, MAT 12 к PD-1, MAT 13 к PD-1 и MAT 14 к PD-1, были способны блокировать связывание PD-L2 человека с PD-1 человека, экспрессируемым на поверхности клеток линии NSO, тогда как MAT 8 к PD-1 по существу не оказывало блокирующего действия в данном формате количественных исследований. В частности, MAT к PD-1 1, MAT 5 к PD-1, MAT 6 к PD-1, MAT 7 к PD-1 и MAT 10 к PD-1 блокировали связывание shPD-L2 аналогично или более эффективно, чем эталонные антитела к PD-1 (МАТ к PD-1 А, MAT к PD-1 В). Антитела к PD-1, MAT 11 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, не испытывали в данном количественном исследовании. Ниже приведены результаты для нескольких гуманизированных антител к PD-1, включая MAT к hPD-115.Similarly, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAb 1, anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 3, anti-PD1 MAb 4, anti-PD-1 MAb 5, anti-PD-1 MAb 6, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 9, anti-PD-1 MAb 10, anti-PD-1 MAb 12, anti-PD-1 MAb 13, and anti-PD-1 MAb 14, were able to block the binding of human PD-L2 to human PD-1 expressed on the surface of NSO cells, whereas anti-PD-1 MAb 8 had essentially no blocking effect in this quantitative assay format. Specifically, anti-PD-1 mAb 1, anti-PD-1 mAb 5, anti-PD-1 mAb 6, anti-PD-1 mAb 7, and anti-PD-1 mAb 10 blocked shPD-L2 binding similarly to or more efficiently than the reference anti-PD-1 antibodies (anti-PD-1 mAb A, anti-PD-1 mAb B). The anti-PD-1 antibodies anti-PD-1 mAb 11 and anti-PD-1 mAb 15 were not tested in this quantitative study. Results for several humanized anti-PD-1 antibodies, including anti-hPD-115, are provided below.
Пример 2. Гуманизация и дальнейшая характеристика.Example 2. Humanization and further characterization.
Вариабельные домены антител к PD-1, MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, гуманизировали, в тех случаях, когда были идентифицированы антигенные эпитопы, антитела дополнительно деиммунизировали для получения готовых гуманизированных вариабельных доменов. Гуманизация MAT к PD-1 1, MAT 2 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 позволила получить один гуманизированный домен VH и один гуманизированный домен VL для каждого антитела, обозначенные в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 1 и VL1 MAT к hPD-1 1; VH1 MAT к hPD-1 2 и VL1 MAT к hPD-1 2; и VH1 MAT к hPD-1 15 и VL1 MAT к hPD-1 15. Гуманизация MAT 7 к PD-1 позволила получить два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 7 и VH2 MAT к hPD-1 7, и три гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 1, VL2 MAT к hPD-1 7 и VL3 MAT к hPD-1 7. Гуманизация MAT 9 к PD-1 позволила получить два гуманизированных домена VH, обозначенных в настоящем документе как VH1 MAT к hPD-1 9 и VH2 MAT к hPD-1 9 и два гуманизированных домена VL, обозначенных в настоящем документе как VL1 MAT к hPD-1 9 и VL2 MAT к hPD-1 1. В тех случаях, когда было получено несколько гуманизированных вариабельных доменов, гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей конкретного антитела к PD-1 (например, MAT 7 к PD-1) можно применять в любой комбинации, и конкретные комбинации гуманизированных цепей упоминаются со ссылкой на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 MAT к hPD-1 7 и VL2 MAT к hPD-1 7, в частности называется МАТ к hPD-1 7 (1.2). Гуманизированные полноразмерные антитела получали с помощью константной области IgG1 человека, содержащей замены L234A/L235A (IgG1 (АА)), или константной области IgG4 человека, содержащей замену S228P (IgG4 (P)). Полноразмерные тяжелые цепи гуманизированного антитела IgG1 конструировали следующим образом: С-конец гуманизированного домена VH гибридизовали с N-концом константной области IgG1 человека, содержащей вариант домена СН2-СНЗ (содержащий замены L234A/L235A (АА)) и лишенной С-концевого остатка лизина (SEQ ID NO: 255):The variable domains of the anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 9, and anti-PD-1 MAT 15, were humanized and, where antigenic epitopes were identified, the antibodies were further deimmunized to generate final humanized variable domains. Humanization of anti-PD-1 MAT 1, anti-PD-1 MAT 2, and anti-PD-1 MAT 15 yielded one humanized VH domain and one humanized VL domain for each antibody, designated herein as VH1 anti-hPD-1 MAT 1 and VL1 anti-hPD-1 MAT 1; VH1 anti-hPD-1 MAT 2 and VL1 anti-hPD-1 MAT 2; and VH1 MAT to hPD-1 15 and VL1 MAT to hPD-1 15. Humanization of MAT 7 to PD-1 resulted in two humanized VH domains, designated herein as VH1 MAT to hPD-1 7 and VH2 MAT to hPD-1 7, and three humanized VL domains, designated herein as VL1 MAT to hPD-1 1, VL2 MAT to hPD-1 7, and VL3 MAT to hPD-1 7. Humanization of MAT 9 to PD-1 resulted in two humanized VH domains, designated herein as VH1 MAT to hPD-1 9 and VH2 MAT to hPD-1 9, and two humanized VL domains, designated herein as VL1 MAT to hPD-1 9 and VL2 MAT to hPD-1 1. In cases where there was several humanized variable domains are obtained, the humanized variable domains of the heavy and light chains of a particular anti-PD-1 antibody (e.g., anti-PD-1 Mab 7) can be used in any combination, and particular combinations of humanized chains are referred to with reference to specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody comprising VH1 of an anti-hPD-1 Mab 7 and VL2 of an anti-hPD-1 Mab 7 is specifically referred to as an anti-hPD-1 Mab 7 (1.2). Humanized full-length antibodies were obtained using the human IgG1 constant region containing the L234A/L235A substitutions (IgG1 (AA)), or the human IgG4 constant region containing the S228P substitution (IgG4 (P)). Full-length humanized IgG1 heavy chains were constructed as follows: The C-terminus of the humanized VH domain was fused to the N-terminus of a human IgG1 constant region containing a variant CH2-CH3 domain (containing L234A/L235A (AA) substitutions) and lacking the C-terminal lysine residue (SEQ ID NO: 255):
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGHTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKG QPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG
В SEQ ID NO: 255 остатки аминокислот 1-98 соответствуют домену СН1 IgG1 (SEQ ID NO: 10), остатки аминокислот 99-113 соответствуют шарнирной области IgG1 (SEQ ID NO: 32) и остатки аминокислот 114-329 соответствуют домену СН2-СНЗ IgG1, содержащему замены L234A/L235A (выделены подчеркиванием) (SEQ ID NO: 5), но лишенному С-концевого остатка лизина.In SEQ ID NO: 255, amino acid residues 1-98 correspond to the CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10), amino acid residues 99-113 correspond to the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32), and amino acid residues 114-329 correspond to the CH2-CH3 domain of IgG1 containing the L234A/L235A substitutions (underlined) (SEQ ID NO: 5) but lacking the C-terminal lysine residue.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи примерного гуманизированного антитела ((МАТ к hPD-1 7 (1.2)), содержащего константную область тяжелой цепи IgG1, содержащую мутацию L234A/L235A и лишенную С-концевого остатка лизина, представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 265):The amino acid sequence of the heavy chain of an exemplary humanized antibody ((anti-hPD-1 mAb 7 (1.2)) comprising an IgG1 heavy chain constant region containing the L234A/L235A mutation and lacking the C-terminal lysine residue is as follows (SEQ ID NO: 265):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LY SLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG
- 93 047726- 93 047726
В SEQ ID NO: 265 остатки аминокислот 1-119 соответствуют домену VH из VH1 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147), остатки аминокислот 120-217 соответствуют домену CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 10), остатки аминокислот 218-232 соответствуют шарнирной области IgG1 (SEQ ID NO: 32) и остатки аминокислот 233-448 соответствуют домену СН2-СНЗ IgG1, содержащему замены L234A/L235A (выделены подчеркиванием) (SEQ ID NO: 5) и лишенному С-концевого остатка лизина.In SEQ ID NO: 265, amino acid residues 1-119 correspond to the VH domain of the VH1 mAb to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147), amino acid residues 120-217 correspond to the CH1 domain of IgG1 (SEQ ID NO: 10), amino acid residues 218-232 correspond to the hinge region of IgG1 (SEQ ID NO: 32), and amino acid residues 233-448 correspond to the CH2-CH3 domain of IgG1 containing the L234A/L235A substitutions (underlined) (SEQ ID NO: 5) and lacking the C-terminal lysine residue.
Полноразмерные тяжелые цепи гуманизированного антитела IgG4 конструировали следующим образом: С-конец гуманизированного домена VH гибридизовали с N-концом константной области IgG4 человека, содержащей стабилизированную шарнирную область (содержащую замену S228P) и лишенную С-концевого остатка лизина (SEQ ID NO: 256):Full-length humanized IgG4 antibody heavy chains were constructed as follows: The C-terminus of the humanized VH domain was fused to the N-terminus of a human IgG4 constant region containing a stabilized hinge region (containing the S228P substitution) and lacking the C-terminal lysine residue (SEQ ID NO: 256):
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY LTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
В SEQ ID NO: 256 остатки аминокислот 1-98 соответствуют домену СН1 IgG4 (SEQ ID NO: 254), остатки аминокислот 99-110 соответствуют стабилизированной шарнирной области IgG4, содержащей замены S228P (выделены подчеркиванием) (SEQ ID NO: 13) и остатки аминокислот 111-326 соответствуют домену СН2-СНЗ IgG4 (SEQ ID NO: 4), лишенному С-концевого остатка лизина.In SEQ ID NO: 256, amino acid residues 1-98 correspond to the CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 254), amino acid residues 99-110 correspond to the stabilized hinge region of IgG4 containing S228P substitutions (underlined) (SEQ ID NO: 13), and amino acid residues 111-326 correspond to the CH2-CH3 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 4) lacking the C-terminal lysine residue.
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи примерного гуманизированного антитела ((МАТ к hPD-1 7 (1.2)), содержащего константную область тяжелой цепи IgG4, содержащую стабилизированную шарнирную область с мутацией S228P и лишенную С-концевого остатка лизина, представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 266):The amino acid sequence of the heavy chain of an exemplary humanized antibody ((anti-hPD-1 mAb 7 (1.2)) comprising an IgG4 heavy chain constant region comprising a stabilized hinge region with the S228P mutation and lacking the C-terminal lysine residue is as follows (SEQ ID NO: 266):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLGQVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT SYWMNWVRQA PGQGLEWIGV IHPSDSETWL DQKFKDRVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAREH YGTSPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LY SLSSWTV PSSSLGTKTY TCNVDHKPSN TKVDKRVESK YGPPCPPCPA PEFLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSQEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPSS IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSQEEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSRLT VDKSRWQEGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSLG
В SEQ ID NO: 266 остатки аминокислот 1-119 соответствуют домену VH из VH1 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147), остатки аминокислот 120-217 соответствуют домену CH1 IgG4 (SEQ ID NO: 254), остатки аминокислот 218-229 соответствуют стабилизированной шарнирной области IgG4, содержащей замену S228P (выделена подчеркиванием) (SEQ ID NO: 13), и остатки аминокислот 230-445 соответствуют домену СН2-СНЗ IgG4 (SEQ ID NO: 4), лишенному С-концевого остатка лизина.In SEQ ID NO: 266, amino acid residues 1-119 correspond to the VH domain of the VH1 mAb to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 147), amino acid residues 120-217 correspond to the CH1 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 254), amino acid residues 218-229 correspond to the stabilized hinge region of IgG4 containing the S228P substitution (underlined) (SEQ ID NO: 13), and amino acid residues 230-445 correspond to the CH2-CH3 domain of IgG4 (SEQ ID NO: 4) lacking the C-terminal lysine residue.
Полноразмерные гуманизированные легкие цепи конструировали следующим образом: С-конец гуманизированного домена VL гибридизовали с N-концом легкой каппа-цепи человека (SEQ ID NO: 8). Аналогичную легкую цепь спаривали с тяжелыми цепями IgG1 (АА) и IgG4 (P).Full-length humanized light chains were constructed as follows: The C-terminus of the humanized VL domain was fused to the N-terminus of the human kappa light chain (SEQ ID NO: 8). The same light chain was paired with the IgG1 (AA) and IgG4 (P) heavy chains.
Аминокислотная последовательность легкой цепи примерного гуманизированного антитела к PD-1 (МАТ к hPD-1 7 (1.2)), содержащего константную область каппа-цепи, представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 264):The amino acid sequence of the light chain of an exemplary humanized anti-PD-1 antibody (anti-hPD-1 mAb 7(1.2)) containing the kappa chain constant region is as follows (SEQ ID NO:264):
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKLEIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASESVD NYGMSFMNWF QQKPGQPPKL
LIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPYLIHAASNQGS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY FCQQSKEVPY
TFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKVTFGGGTKVEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASWCLL NNFYPREAKV
QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEVQWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV
THQGLSSPVT KSFNRGECTHQGLSSPVTSKSFNRGEC
В SEQ ID NO: 264 остатки аминокислот 1-111 соответствуют домену VL VL2 MAT к hPD-1 7 (SEQ ID NO: 151), и остатки аминокислот 112-218 соответствуют константной области легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 8).In SEQ ID NO: 264, amino acid residues 1-111 correspond to the VL domain of the VL2 MAT to hPD-1 7 (SEQ ID NO: 151), and amino acid residues 112-218 correspond to the constant region of the kappa light chain (SEQ ID NO: 8).
Антитела к PD-1, содержащие альтернативные константные области, например, модифицированные области Fc, могут быть легко получены путем включения различных константных областей и/или путем введения одной или более аминокислотных замен, добавлений или делеций. Например, если желательным является использование биспецифического антитела, то для облегчения гетеродимеризации используют несущие выступ и впадину домены СН2-СНЗ. Химерные антитела к PD-1, содержащие мышиныеAnti-PD-1 antibodies containing alternative constant regions, such as modified Fc regions, can be readily prepared by incorporating different constant regions and/or introducing one or more amino acid substitutions, additions or deletions. For example, if a bispecific antibody is desired, the CH2-CH3 knob and hole domains are used to facilitate heterodimerization. Chimeric anti-PD-1 antibodies containing murine
- 94 047726 вариабельные домены и константные области человека, получали, как описано выше. Гуманизированные антитела (IgG1 (AA) и/или IgG4 (P)) испытывали для оценки активности связывания и блокирования, как описано выше. Связывание с PD-1 человека (shPD-1 His и shPD-1 hFc) и PD-1 яванских макак (shPD-L1 hFc) гуманизированных антител было сопоставимо со связыванием соответствующего мышиного антитела. Помимо этого гуманизированные антитела сохраняли способность блокировать связывание PD-L1 человека с PD-1 человека в исследовании методом ИФА. Кинетику связывания мышиных антител MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1, MAT 15 к PD-1, гуманизированных антител MAT к hPD-1 2, MAT к hPD-1 7 (1.2), MAT к hPD-1 9 (1.1), MAT к hPD-1 15 и контрольных антител к PD-1, MAT к PD-1 A и MAT к PD-1 В, исследовали с использованием анализа Biacore. Антитела к PD-1 захватывали на иммобилизованном белке А и инкубировали с His-меченым растворимым PD-1 человека (shPD-1-His) или растворимым гибридным белком PD-1 Fc человека-яванских макак (scyno PD-1 hFc), расщепленным для удаления участка Fc, и кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore. В дополнительных исследованиях антитела к PD-1, MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), MAT к hPD-1 9 (1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 9 (1.1) IgG4 (Р), MAT к PD-1 A IgG1 (AA), MAT к PD-1 A IgG4 (P), MAT к PD-1 В IgG1 (AA) и MAT к PD-1 В IgG4 (P), захватывали на иммобилизованном козьем F(ab)2 к Fc человека, и кинетику связывания определяли с помощью анализа Biacore, как описано выше. Рассчитанные значения ka, kd и KD из данных исследований представлены в табл. 7.- 94 047 726 human variable domains and constant regions were prepared as described above. Humanized antibodies (IgG1 (AA) and/or IgG4 (P)) were tested for binding and blocking activity as described above. Binding to human PD-1 (shPD-1 His and shPD-1 hFc) and cynomolgus monkey PD-1 (shPD-L1 hFc) of the humanized antibodies was comparable to that of the corresponding mouse antibody. In addition, the humanized antibodies retained the ability to block human PD-L1 binding to human PD-1 in an ELISA assay. The binding kinetics of mouse anti-PD-1 antibodies mAb 2, anti-PD-1 mAb 7, anti-PD-1 mAb 9, anti-PD-1 mAb 15, humanized anti-hPD-1 mAb 2, anti-hPD-1 mAb 7 (1.2), anti-hPD-1 mAb 9 (1.1), anti-hPD-1 mAb 15, and anti-PD-1 control antibodies mAb PD-1 A and mAb PD-1 B were studied using Biacore analysis. Anti-PD-1 antibodies were captured on immobilized protein A and incubated with His-tagged soluble human PD-1 (shPD-1-His) or soluble human-cynomolgus monkey PD-1 Fc fusion protein (scyno PD-1 hFc) cleaved to remove the Fc region, and the binding kinetics were determined by Biacore analysis. In additional studies, anti-PD-1 antibodies, anti-hPD-1 mAb 7(1.2) IgG1 (AA), anti-hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (P), anti-hPD-1 mAb 9(1.1) IgG1 (AA), anti-hPD-1 mAb 9(1.1) IgG4 (P), anti-PD-1 mAb A IgG1 (AA), anti-PD-1 mAb A IgG4 (P), anti-PD-1 mAb B IgG1 (AA), and anti-PD-1 mAb B IgG4 (P), were captured onto immobilized goat anti-human F(ab)2 and binding kinetics were determined by Biacore analysis as described above. The calculated ka , kd , and K D values from these studies are presented in Table 7.
Т аблица 7Table 7
- 95 047726- 95 047726
а Меченый полигистидиновой меткой растворимый PD-1 человека (shPD-1 His). a Polyhistidine tagged soluble human PD-1 (shPD-1 His).
b Расщепленный растворимый PD-1 яванских макак (scyno PD-1 hFc). b Cleaved soluble cynomolgus monkey PD-1 (scyno PD-1 hFc).
Результаты свидетельствуют о том, что MAT 7 к PD-1 и гуманизированное МАТ к hPD-1 7 (1.2) демонстрируют лучшую кинетику связывания по сравнению с эталонными антителами к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В. Показатели кинетики связывания MAT 2 к PD-1 и MAT к hPD-1 2 приблизительно в два раза превышают аналогичные показатели для эталонных антител к PD-1, в то время как показатели кинетики связывания MAT 9 к PD-1, MAT к hPD-1 9 (1.1), MAT 15 к PD-1 и MAT к hPD-1 15 приблизительно в 2-6 раза превышают аналогичные показатели для эталонных антител к PD-1.The results indicate that anti-PD-1 mAb 7 and humanized anti-hPD-1 mAb 7 (1.2) exhibit superior binding kinetics compared to the anti-PD-1 reference antibodies, anti-PD-1 mAb A and anti-PD-1 mAb B. The binding kinetics of anti-PD-1 mAb 2 and anti-hPD-1 mAb 2 are approximately two-fold higher than those of the anti-PD-1 reference antibodies, while the binding kinetics of anti-PD-1 mAb 9, anti-hPD-1 mAb 9 (1.1), anti-PD-1 mAb 15 and anti-hPD-1 mAb 15 are approximately 2-6-fold higher than those of the anti-PD-1 reference antibodies.
Была изучена тканевая специфичность антитела к PD-1 человека, MAT к hPD-1 7. Нормальную ткань подвергали воздействию MAT 7 к PD-1 или антитела для контроля изотипа (0,313 мкг/мл), и визуализировали степень окрашивания. Bloxall™ использовали для блокирования эндогенных ферментов, чтобы уменьшить неспецифичное окрашивание муцина в ткани толстой кишки. Как показано на фиг. 10А, панели i-xii, MAT 7 к PD-1 и антитело для контроля изотипа не были способны помечать клетки нормальной толстой кишки, печени, легких, поджелудочной железы, почек и ткани сердца. Помимо этого MAT 7 к PD-1 и антитело для контроля изотипа не были способны окрашивать нормальную кожу (фиг. 10В, панели i-ii). Напротив, было обнаружено, что MAT 7 к PD-1 интенсивно окрашивает лимфоциты, присутствующие в нормальной ткани миндалин, и трансфецированные PDCD1 клетки линии NSO, экспрессирующие PD-1 (фиг. 10В, панели iii и v), в то время как антитело для контроля изотипа не было способно окрашивать клетки обоих указанных типов (фиг. 10В, панели iv и vi). Соответственно, результаты, представленные на фиг. 10А-10В, указывают на то, что MAT 7 к PD-1 способно специфично связываться с лимфоцитами и клетками, экспрессирующими PD-1.The tissue specificity of the anti-human PD-1 antibody, anti-hPD-1 mAb 7, was studied. Normal tissue was exposed to anti-PD-1 mAb 7 or isotype control antibody (0.313 μg/mL) and the extent of staining was visualized. Bloxall™ was used to block endogenous enzymes to reduce non-specific mucin staining in colon tissue. As shown in Fig. 10A, panels i-xii, anti-PD-1 mAb 7 and isotype control antibody were unable to label cells from normal colon, liver, lung, pancreas, kidney, and heart tissue. Additionally, anti-PD-1 mAb 7 and isotype control antibody were unable to stain normal skin (Fig. 10B, panels i-ii). In contrast, anti-PD-1 mAb 7 was found to intensely stain lymphocytes present in normal tonsil tissue and PDCD1-transfected PD-1-expressing NSO cells (Fig. 10B, panels iii and v), whereas the isotype control antibody was unable to stain either cell type (Fig. 10B, panels iv and vi). Accordingly, the results shown in Figs. 10A–10B indicate that anti-PD-1 mAb 7 is able to specifically bind to lymphocytes and PD-1-expressing cells.
Исследовали профили насыщения связывания MAT к hPD-1 2 IgG1 (AA), МАТ к hPD-1 7(1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1, (AA), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (Р), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG4 (P), MAT к hPD-1 15 IgG1 (AA) и эталонных антител к PD-1 MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В. В общих чертах, каждое из антител к PD-1, MAT к PD-1 1-15 или эталонных антител к PD-1 (MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В) смешивали с клетками линии NSO, экспрессирующими PD-1 человека (~250000 клеток/лунку) в блокирующем буфере (FACS+10% сывороточного альбумина человека). Для проведения данных исследований антитела к PD-1 использовали в концентрации 50, 12,5, 3,13, 2,0x10-4, 4,9х10-2, 1,2x10-2, 3,0х10-3, 1,9х10-4, 7,6x10-4, 4,75x10-5 или 1,19х10-5 мкг/исследование (четырехкратные последовательные разведения). Количество антитела, связанного с поверхностью клеток линии NSO, определяли с использованием конъюгированного с АРС вторичного козьего антитела к Ig человека методом FACS. Типичные кривые насыщения представлены на фиг. 11. Определяли значения ЭК50 и ЭК90, и среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) четырех отдельных экспериментов приведены в табл. 8.The saturation binding profiles of anti-hPD-1 2 IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 7(1.1) IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 7(1.2) IgG1, (AA), anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 mAb (P), anti-hPD-1 9(1.1) IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 9(1.1) IgG4 mAb (P), anti-hPD-1 15 IgG1 mAb (AA), and the anti-PD-1 reference antibodies anti-PD-1 MAB A and anti-PD-1 MAB B were studied. Briefly, each of the anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 1-15 mAbs, or anti-PD-1 reference antibodies (anti-PD-1 MAB A and anti-PD-1 MAB B) was mixed with NSO cells, expressing human PD-1 (~250,000 cells/well) in blocking buffer (FACS + 10% human serum albumin). For these studies, anti- PD -1 antibodies were used at a concentration of 50, 12.5, 3.13 , 2.0x10-4 , 4.9x10-2, 1.2x10-2, 3.0x10-3, 1.9x10-4, 7.6x10-4, 4.75x10-5, or 1.19x10-5 μg/assay (fourfold serial dilutions). The amount of antibody bound to the NSO cell surface was determined using APC-conjugated goat anti-human Ig secondary antibody by FACS. Representative saturation curves are shown in Fig. 11. The EC 50 and EC 90 values were determined, and the sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) of four individual experiments are given in Table 8.
- 96 047726- 96 047726
Таблица 8Table 8
Исследования насыщения связывания демонстрируют, что гуманизированные варианты MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 имеют благоприятный профиль для связывания с поверхностным PD-1. В частности, гуманизированные MAT 7 к PD-1 (MAT к hPD-1 7 (1.1) и MAT к hPD1 7 (1.2), содержащие область Fc IgG1 (AA) или IgG4 (P), имеют самые низкие значения ЭК90 из всех исследованных антител.Saturation binding studies demonstrate that humanized variants of anti-PD-1 mAb 2, anti-PD-1 mAb 7, anti-PD-1 mAb 9, and anti-PD-1 mAb 15 have a favorable binding profile to surface PD-1. In particular, humanized anti-PD-1 mAb 7 (anti-hPD-1 mAb 7(1.1) and anti-hPD1 mAb 7(1.2) containing the IgG1(AA) or IgG4(P) Fc region have the lowest EC90 values of all antibodies studied.
Чтобы дополнительно охарактеризовать гуманизированные антитела к PD-1, МАТ к hPD-1 2 IgG1 (AA), MAT к hPD-1 7(1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1, (АА), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (Р), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG4 (P) и MAT к hPD-1 15 IgG1 (AA), исследовали их способность блокировать связывание PD-L1 человека (shPD-L1) и PD-L2 человека (shPD-L2) с PD-1, экспрессируемым на поверхности клеток линии NSO. Указанные количественные исследования выполняли, как описано выше. Типичные кривые ингибирования связывания sPD-L1 и sPD-L2 с PD-1, экспрессированным в клетках линии NSO, представлены на фиг. 12А и 12В, соответственно. Определяли значения ИК50 и ИК90, и среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) трех отдельных экспериментов приведены в табл. 9.To further characterize the humanized anti-PD-1 antibodies, anti-hPD-1 2 IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 7(1.1) IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 7(1.2) IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 mAb (P), anti-hPD-1 9(1.1) IgG1 mAb (AA), anti-hPD-1 9(1.1) IgG4 mAb (P), and anti-hPD-1 15 IgG1 mAb (AA) were tested for their ability to block the binding of human PD-L1 (shPD-L1) and human PD-L2 (shPD-L2) to PD-1 expressed on the surface of NSO cells. These assays were performed as described above. Representative inhibition curves of sPD-L1 and sPD-L2 binding to PD-1 expressed in NSO cells are shown in Fig. 12A and 12B, respectively. IC 50 and IC 90 values were determined, and the sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) of three separate experiments are shown in Table 9.
Таблица 9Table 9
- 97 047726- 97 047726
Исследования ингибирования связывания лигандов демонстрируют, что гуманизированные варианты MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 способны ингибировать связывание sPD-L1 и sPD-L2 с PD-1 на поверхности клетки. В частности, гуманизированные MAT 7 к PD-1 (MAT к hPD-1 7 (1.1) и MAT к hPD-1 7 (1.2)) имеют самые низкие значения ИКзд из всех исследованных антител.Ligand binding inhibition studies demonstrate that humanized variants of anti-PD-1 mAb 2, anti-PD-1 mAb 7, anti-PD-1 mAb 9, and anti-PD-1 mAb 15 are able to inhibit the binding of sPD-L1 and sPD-L2 to PD-1 on the cell surface. In particular, humanized anti-PD-1 mAb 7 (anti-hPD-1 mAb 7 (1.1) and anti-hPD-1 mAb 7 (1.2)) have the lowest IC3 values of all antibodies studied.
Пример 3. Блокирование контрольной точки PD-1/PD-L1 гуманизированными антителами к PD-1 человека.Example 3. Blockade of the PD-1/PD-L1 checkpoint with humanized antibodies to human PD-1.
Способность MAT к hPD-1 2 IgG1 (AA), MAT к hPD-1 7(1.1) IgG1 (AA), МАТ к hPD-1 7(1.2) IgG1, (AA), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (P), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG1 (AA), MAT к hPD-1 9(1.1) IgG4 (P), MAT к hPD-1 15 IgG1 (AA) и эталонных антител к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, выступать антагонистами оси PD-1/PD-L1 (т.е. блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1 и предотвращать подавление ответов Т-клеток), исследовали в количественном исследовании с использованием репортера люциферазы Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1. В общих чертах, клетки линии СНО, экспрессирующие PD-L1 (CHO/PDL1), высевали в плотности 40000/лунку в 100 мкл культуральной среды (RPMI+10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС)+100 мкг/мл гигромицина В+100 мкг/мл G418) и инкубировали в течение ночи. На следующий день среды удаляли, и в каждую лунку вносили клетки Jurkat MNFAT-luc2/PD-1 (Promega) в плотности 50000 клеток/лунку в 40 мкл буфера для анализа (RPMI+2% ФБС) и антитела к PD-1, MAT к PD-1 1-15, или эталонные антитела к PD-1 (МАТ к PD-1 А и MAT к PD-1 В) (0-25 мкг/мл, восемь последовательных разведений в 2,5 раза в буфере для анализа), инкубировали в течение 6 ч при 37°С с дополнительной инкубацией в течение 5-10 мин при температуре окружающей среды. Затем в каждую лунку добавляли по 80 мкл субстрата BioGlo (Promega), и планшет инкубировали еще в течение 5-10 мин при температуре окружающей среды, интенсивность люминесценции измеряли в считывателе для планшетов Victor. Типичные кривые насыщения представлены на фиг. 13. Определяли значения ЭК50 и ЭК90, и среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) четырех отдельных экспериментов приведены в табл. 10.The ability of hPD-1 2 IgG1 MAb (AA), hPD-1 7(1.1) IgG1 MAb (AA), hPD-1 7(1.2) IgG1 MAb (AA), hPD-1 7(1.2) IgG4 MAb (P), hPD-1 9(1.1) IgG1 MAb (AA), hPD-1 9(1.1) IgG4 MAb (P), hPD-1 15 IgG1 MAb (AA) and the reference anti-PD-1 MAb, anti-PD-1 A and anti-PD-1 B MAb, to act as antagonists of the PD-1/PD-L1 axis (i.e., to block PD-1/PD-L1 interaction and prevent suppression of T cell responses) was investigated in a quantitative luciferase reporter assay Jurkat-luc-NFAT/CHO-PD-L1: Briefly, CHO cells expressing PD-L1 (CHO/PDL1) were seeded at a density of 40,000/well in 100 μl of culture medium (RPMI+10% fetal bovine serum (FBS)+100 μg/ml hygromycin B+100 μg/ml G418) and incubated overnight. The following day, the media were removed and Jurkat MNFAT-luc2/PD-1 cells (Promega) were added to each well at a density of 50,000 cells/well in 40 μl of assay buffer (RPMI+2% FBS) and anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 mAbs 1-15, or anti-PD-1 reference antibodies (anti-PD-1 mAbs A and anti-PD-1 mAbs B) (0-25 μg/ml, eight serial 2.5-fold dilutions in assay buffer) and incubated for 6 h at 37°C with an additional incubation for 5-10 min at ambient temperature. Then 80 μl of BioGlo substrate (Promega) were added to each well and the plate was incubated for an additional 5-10 min at ambient temperature, and the luminescence intensity was measured in a Victor plate reader. Typical saturation curves are shown in Fig. 13. The EC 50 and EC 90 values were determined, and the sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) of four individual experiments are given in Table 10.
- 98 047726- 98 047726
Таблица 10Table 10
Исследования интенсивности сигналов репортера демонстрируют, что гуманизированные варианты MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 могут блокировать ось PD-1/PD-L1 и будут предотвращать подавление ответов Т-клеток. В частности, гуманизированное MAT 7 к PD-1 (МАТ к hPD-1 7 (1.1) и MAT к hPD-1 7 (1.2), содержащее область Fc IgG1 (AA) или IgG4 (P), имеет самые низкие значения ЭК50/ЭК90.Reporter signal intensity studies demonstrate that humanized variants of anti-PD-1 Mab 2, anti-PD-1 Mab 7, anti-PD-1 Mab 9 and anti-PD-1 Mab 15 can block the PD-1/PD-L1 axis and prevent the suppression of T cell responses. In particular, humanized anti-PD-1 Mab 7 (anti-hPD-1 Mab 7(1.1) and anti-hPD-1 Mab 7(1.2) containing the IgG1(AA) or IgG4(P) Fc region have the lowest EC50 / EC90 values.
Пример 4. Функциональная активность антител к PD-1 человека.Example 4. Functional activity of antibodies to human PD-1.
Энтеротоксин типа В Staphylococcus aureus (SEB) представляет собой микробный суперантиген, способный активировать значительную долю Т-клеток (5-30%) у SEB-чувствительных доноров. SEB связывается с ГКГС II вне борозды связывания пептидов и, следовательно, зависит от ГКГС II, но неограничен и опосредован TCR. SEB-стимуляция Т-клеток приводит к пролиферации олигоклональных Т-клеток и выработке цитокинов (хотя может наблюдаться изменчивость ответов доноров, и некоторые доноры не будут отвечать на SEB). В течение 48 ч SEB-стимуляции МКПК активируют PD-1 и LAG-3 с последующим усилением, которое наблюдается на 5-й день после высадки вторичной культуры в 96-луночный планшет с SEB-стимуляцией. Активация белков контрольной точки иммунного ответа PD-1 и LAG-3 после SEB-стимуляции МКПК ограничивает выделение цитокинов при повторной стимуляции. Была исследована способность антител к PD-1 по отдельности и в комбинации с антителами к LAG-3 усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. В общих чертах, МКПК очищали из цельной крови, полученной от здоровых доноров, подписавших форму информированного согласия (Biological Specialty Corporation), с использованием способа центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями изготовителя, и Т-клетки затем очищали, используя набор для выделения Т-клеток человека Dynabeads™ Untouched™ (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные МКПК культивировали в средах RPMI+10% инактивированной нагреванием ФБС+1% пенициллина/стрептомицина в объемных колбах Т25 в течение 2-3 дней по отдельности или с SEB (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,1 нг/мл (первичная стимуляция). В конце первого раунда SEB-стимуляции МКПК дважды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и сразу же высевали в 96-луночные планшеты для культивирования ткани в концентрации 1-5x105 клеток/лунку только в среды, среды с контрольным антителом или антителом к PD-1, среды с SEB в концентрации 0,1 нг/мл (вторичная стимуляция) и без антител или среды с SEB и контрольным IgG или антителом к PD-1, с добавлением или без антитела к LAG-3, и культивировали в течение еще 2-3 дней. В конце второй стимуляции супернатанты собирали для измерения секреции цитокинов с использованием наборов для ИФА DuoSet для измерения ИФН-γ, ФНО-α, ИЛ-10 и ИЛ-4 человека (R&D Systems) в соответствии с инструкциями производителя.Staphylococcus aureus enterotoxin type B (SEB) is a microbial superantigen capable of activating a significant proportion of T cells (5-30%) in SEB-responsive donors. SEB binds to MHC II outside the peptide binding groove and is therefore MHC II dependent but unrestricted and TCR-mediated. SEB stimulation of T cells results in oligoclonal T cell proliferation and cytokine production (although donor variability may occur and some donors will not respond to SEB). Within 48 h of SEB stimulation, PBMCs upregulate PD-1 and LAG-3, with a subsequent upregulation observed at day 5 after secondary culture in a 96-well SEB-stimulated plate. Activation of the immune checkpoint proteins PD-1 and LAG-3 following SEB stimulation of PBMCs limits cytokine release upon restimulation. The ability of anti-PD-1 antibodies alone and in combination with anti-LAG-3 antibodies to enhance cytokine release via checkpoint inhibition was investigated. Briefly, PBMCs were purified from whole blood obtained from healthy donors who signed an informed consent form (Biological Specialty Corporation) using the Ficoll-Paque Plus density gradient centrifugation method (GE Healthcare) according to the manufacturer's instructions, and T cells were then purified using the Dynabeads™ Untouched™ Human T Cell Isolation Kit (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. Purified PBMCs were cultured in RPMI+10% heat-inactivated FBS+1% penicillin/streptomycin in T25 flasks for 2-3 days alone or with SEB (Sigma-Aldrich) at 0.1 ng/ml (primary stimulation). At the end of the first round of SEB stimulation, PBMCs were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS) and immediately seeded in 96-well tissue culture plates at 1-5x105 cells/well in media only, media with control antibody or anti-PD-1 antibody, media with SEB at 0.1 ng/ml (secondary stimulation) and no antibody, or media with SEB and control IgG or anti-PD-1 antibody, with or without anti-LAG-3 antibody, and cultured for another 2-3 days. At the end of the second stimulation, supernatants were collected for measurement of cytokine secretion using DuoSet ELISA kits for human IFN-γ, TNF-α, IL-10, and IL-4 (R&D Systems) according to the manufacturer's instructions.
Исследовали способность MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и МАТ 15 к PD-1, по отдельности или в комбинации с уникальным MAT к LAG-3 1, усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки.The ability of anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 9, and anti-PD-1 MAT 15, alone or in combination with the unique anti-LAG-3 MAT 1, to enhance cytokine release via checkpoint inhibition was examined.
Данные исследования также включали использование одного или более из следующих эталонных антител к PD-1: MAT к PD-1 А; MAT к PD-1 В; и MAT к LAG-3 А, по отдельности или в комбинации. На фиг. 14 представлены профили секреции ИФН-γ из SEB-стимулированных (0,1 нг/мл) МКПК от типичного донора, имеющего надлежащий ответ (D: 38941), обработанных: контролем без антитела; антителомThese studies also included the use of one or more of the following anti-PD-1 reference antibodies: anti-PD-1A mAb; anti-PD-1B mAb; and anti-LAG-3A mAb, alone or in combination. Figure 14 shows the IFN-γ secretion profiles from SEB-stimulated (0.1 ng/mL) PBMCs from a typical responder donor (D: 38941) treated with: no antibody control; antibody
- 99 047726 для контроля изотипа; MAT 7 к PD-1 и/или MAT к LAG-3 7; MAT 9 к PD-1 и/или MAT к LAG-3 1; MAT 15 к PD-1 и/или MAT к LAG-3 1; MAT 2 к PD-1 и/или MAT к LAG-3 1; или эталонными антителами к PD-1, MAT к PD-1 В и/или MAT к LAG-3 А (антитела использовали в концентрации 10 мкг/мл).- 99 047726 for isotype control; MAT 7 to PD-1 and/or MAT to LAG-3 7; MAT 9 to PD-1 and/or MAT to LAG-3 1; MAT 15 to PD-1 and/or MAT to LAG-3 1; MAT 2 to PD-1 and/or MAT to LAG-3 1; or reference antibodies to PD-1, MAT to PD-1 B and/or MAT to LAG-3 A (antibodies were used at a concentration of 10 μg/ml).
В дополнительных исследованиях оценивали способность гуманизированных вариантов MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 (содержащих Fc IgG1 (AA) человека или IgG4 (P) человека), а также эталонных антител к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В, усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. Для проведения данных исследований антитела использовали в концентрации 0,625, 2,5 и 10 мкг/мл. На фиг. 15А-15В представлены профили секреции ИФН-γ (фиг. 15А) и ФНО-α; (фиг. 15В) из SEB-стимулированных (0,2 нг/мл) МКПК от типичного донора, имеющего ответ (D: 57709), которые обрабатывали контролем без антитела или одним из следующих антител: антителом для контроля изотипа; MAT к hPD-1 2 IgG1 (AA); MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1 (АА); MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (Р); MAT к hPD-1 9(1.1) IgG1 (AA); MAT к hPD-1 9(1.1) IgG4 (Р); MAT к hPD-1 15 IgG1 (AA); или эталонными антителами к PD-1, MAT к PD-1 A IgG1 (AA), MAT к PD-1 A IgG4 (P), MAT к PD-1 В IgG1 (AA), MAT к PD-1 В IgG4 (P). Общее количество ИФН-γ (пг/мг) в образцах, обработанных SEB+антитело, определяли для образцов, обработанных антителами к PD-1 в концентрации 0,625, 2,5 и 10 мкг/мл, и среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) для трех разных доноров, имеющих ответ (за исключением указанных случаев), приведены в табл. 11. Соотношение уровней ИФН-γ, секретируемого в образце, обработанном гуманизированными вариантами MAT 2 к PD1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1 (содержащими Fc IgG1 (AA) человека или IgG4 (P) человека), по сравнению с уровнями, индуцированными контрольными антителами к PD-1, MAT к PD-1 А и MAT к PD-1 В (т.е. гуманизированным MAT к PD-1/MAT к PD-1 А и гуманизированным MAT к PD1/MAT к PD-1 В), представлено в табл. 12 и табл. 13, соответственно.Additional studies assessed the ability of humanized anti-PD-1 Mab 2, anti-PD-1 Mab 7, anti-PD-1 Mab 9, and anti-PD-1 Mab 15 (containing human IgG1(AA) or human IgG4(P) Fc), as well as the anti-PD-1 reference antibodies, anti-PD-1 Mab A and anti-PD-1 Mab B, to enhance cytokine release through checkpoint inhibition. For these studies, antibodies were used at concentrations of 0.625, 2.5, and 10 μg/mL. Figures 15A–15B show the secretion profiles of IFN-γ (Figure 15A) and TNF-α; (Fig. 15B) from SEB-stimulated (0.2 ng/ml) PBMCs from a typical responder donor (D: 57709) that were treated with no antibody control or one of the following antibodies: isotype control antibody; anti-hPD-1 MAb 2 IgG1 (AA); anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG1 (AA); anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG4 (P); anti-hPD-1 MAb 9(1.1) IgG1 (AA); anti-hPD-1 MAb 9(1.1) IgG4 (P); anti-hPD-1 MAb 15 IgG1 (AA); or the reference antibodies to PD-1, MAb to PD-1 A IgG1 (AA), MAb to PD-1 A IgG4 (P), MAb to PD-1 B IgG1 (AA), MAb to PD-1 B IgG4 (P). The total amount of IFN-γ (pg/mg) in the samples treated with SEB+ antibody was determined for the samples treated with 0.625, 2.5, and 10 μg/mL of PD-1 antibodies, and the mean (SM) and standard deviation (SD, σ) for three different responding donors (except where indicated) are shown in Table 1. 11. The ratio of IFN-γ levels secreted in the sample treated with humanized versions of anti-PD1 MAB 2, anti-PD-1 MAB 7, anti-PD-1 MAB 9, and anti-PD-1 MAB 15 (containing human IgG1(AA) or human IgG4(P) Fc) compared to the levels induced by anti-PD-1 control antibodies, anti-PD-1 MAB A, and anti-PD-1 MAB B (i.e., humanized anti-PD-1 MAB/anti-PD-1A and humanized anti-PD1 MAB/anti-PD-1B) are presented in Table 12 and Table 13, respectively.
Таблица 11Table 11
ί Результаты, полученные у двух доноров, имевших ответ.ί Results obtained from two responding donors.
- 100 047726- 100 047726
Таблица 12Table 12
ί Результаты, полученные у двух доноров, имевших ответ. Таблица 13ί Results obtained from two donors who had a response. Table 13
ί Результаты, полученные у двух доноров, имевших ответ.ί Results obtained from two responding donors.
Результаты данных исследований демонстрируют, что антитела к PD-1, МАТ 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 и MAT 15 к PD-1, резко усиливали выработку ИФН-γ (фиг. 14 и 15А и табл. 11-13) и ФНО-α (фиг. 15В) из SEB-стимулированных МКПК при повторной стимуляции. Помимо этого комбинация антител к PD-1 с антителами к LAG-3 приводила к дополнительному усилению высвобождения цитокинов (фиг. 14) из SEB-стимулированных МКПК при повторной стимуляции. В частности, комбинация MAT 2 к PD-1, MAT 7 к PD-1, MAT 9 к PD-1 или MAT 15 к PD-1 с уникальным антителом к LAG-3, MAT к LAG-3 1, обеспечила наибольшее усиление.The results of these studies demonstrate that anti-PD-1 antibodies, anti-PD-1 MAb 2, anti-PD-1 MAb 7, anti-PD-1 MAb 9, and anti-PD-1 MAb 15, dramatically enhanced the production of IFN-γ (Figs. 14 and 15A and Tables 11–13) and TNF-α (Fig. 15B) from SEB-stimulated PBMCs upon restimulation. In addition, the combination of anti-PD-1 antibodies with anti-LAG-3 antibodies resulted in further enhancement of cytokine release (Fig. 14) from SEB-stimulated PBMCs upon restimulation. In particular, the combination of anti-PD-1 MAT 2, anti-PD-1 MAT 7, anti-PD-1 MAT 9, or anti-PD-1 MAT 15 with a unique anti-LAG-3 antibody, anti-LAG-3 MAT 1, provided the greatest enhancement.
- 101 047726- 101 047726
Пример 5. Исследования связывания биспецифических молекул PD-1xLAG-3.Example 5. Binding studies of bispecific PD-1xLAG-3 molecules.
Получали ряд биспецифических молекул PD-1xLAG-3, включая диатела, содержащие области Fc, содержащие три, четыре и пять цепей и биспецифическое антитело. Получали четыре диатела, содержащих четыре цепи и содержащих домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью, и обозначали DART A, DART В, DART С и DART I. Получали четыре диатела, содержащих четыре цепи и содержащих домены CH1/CL, и обозначали DART D, DART E, DART J и DART 1. Получали два диатела, содержащих пять цепей и содержащих домены, способствующие образованию гетеродимера, с E/K-спиралью, и домены CH1/CL, и обозначали DART F и DART G. Получали одно антитело, имеющее три цепи и содержащее E/K-спираль, и обозначали DART H. Получали одно биспецифическое антитело, содержащее четыре цепи, и обозначали BSAB А. Структура и аминокислотные последовательности указанных биспецифических молекул PD-1xLAG-3 приведены выше и обобщены в табл. 14 ниже.A number of PD-1xLAG-3 bispecific molecules were generated, including diabodies containing three-, four-, and five-chain Fc regions and a bispecific antibody. Four four-chain diabodies containing heterodimer-promoting domains with the E/K helix were generated and designated DART A, DART B, DART C, and DART I. Four four-chain diabodies containing CH1/CL domains were generated and designated DART D, DART E, DART J, and DART 1. Two five-chain diabodies containing heterodimer-promoting domains with the E/K helix and CH1/CL domains were generated and designated DART F and DART G. One three-chain antibody containing the E/K helix was generated and designated DART H. One four-chain bispecific antibody was generated and designated BSAB A. The structures and amino acid sequences of these PD-1xLAG-3 bispecific molecules are shown above and summarized in Table 14 below.
Таблица 14Table 14
- 102 047726- 102 047726
ί Молекулы, содержащие области Fc IgG4, также содержат стабилизированную шарнирную область IgG4.ί Molecules containing the IgG4 Fc regions also contain a stabilized IgG4 hinge region.
Дополнительные биспецифические молекулы PD-1xLAG-3, содержащие альтернативные сайты связывания эпитопов PD-1 и/или LAG-3, могут быть легко получены путем включения различных доменов VH и VL. Аналогичным образом, молекулы, связывающие антиген, отличный от LAG-3, могут быть получены путем включения VH и VL, имеющих желательную специфичность.Additional PD-1xLAG-3 bispecific molecules containing alternative binding sites for PD-1 and/or LAG-3 epitopes can be readily generated by incorporating different VH and VL domains. Similarly, molecules binding to an antigen other than LAG-3 can be generated by incorporating VH and VL having the desired specificity.
Профили насыщения связывания конструкций биспецифических диател PD-1xLAG-3: DART A, DART В, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I и DART 1; антител к PD-1: MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (P), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1 (AA), MAT к PD-1 A IgG1 (AA) и MAT к PD-1 A IgG4 (P); и антител к LAG-3: MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG4 (P), MAT к LAG-3 A IgG4 (P), MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG1 (AA) и MAT к LAG-3 A IgG1 (AA), исследовали по существу, как описано выше. Конструкции биспецифических антител PD-1xLAG-3 исследовали для оценки связывания с PD-1 и LAG-3, тогда как антитела к PD-1 и антитела к LAG-3 исследовали только для оценки связывания с их соответствующими антигенами. Для проведения данных исследований использовали клетки линии NSO, экспрессирующие PD1 или LAG-3. Использовали диатела и антитела (170,0-0,013 мкМ или 85,0-0,0021 мкМ (четырехкратные последовательные разведения). Значения ЭК50 и ЭК90 определяли и представляли в табл. 15-16. Представлено среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) для тех случаев, когда проводили два или более отдельных экспериментов.The saturation binding profiles of the PD-1xLAG-3 bispecific diabodies constructs: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, and DART 1; anti-PD-1 antibodies: anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG4 (P), anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG1 (AA), anti-PD-1 A MAb IgG1 (AA), and anti-PD-1 A MAb IgG4 (P); and anti-LAG-3 antibodies: anti-hLAG-3 MAb 1(1.4) IgG4 (P), anti-LAG-3 MAb IgG4 (P), anti-hLAG-3 MAb 1(1.4) IgG1 (AA), and anti-LAG-3 A MAb IgG1 (AA), were tested essentially as described above. The PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs were tested for binding to PD-1 and LAG-3, while anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies were tested only for binding to their respective antigens. NSO cells expressing PD1 or LAG-3 were used for these studies. Diabodies and antibodies were used (170.0–0.013 μM or 85.0–0.0021 μM (fourfold serial dilutions). EC50 and EC90 values were determined and presented in Tables 15–16. Sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) are presented when two or more separate experiments were performed.
- 103 047726- 103 047726
Таблица 15Table 15
§ Результаты, полученные в одном эксперименте.§ Results obtained in one experiment.
Таблица 16Table 16
§ Результаты, полученные в одном эксперименте.§ Results obtained in one experiment.
Исследования насыщения связывания демонстрируют, что конструкции биспецифических антител PD-1xLAG-3 сохраняют связывание с PD-1 и имеют профили связывания, которые сходны с профилями связывания антител к PD-1. Аналогичным образом, конструкции биспецифических антител PD-1xLAG-3 сохраняют связывание с LAG-3 и, за исключением DART 1, имеют профили связывания, которые сходны с профилями связывания исходных антител к LAG-3.Saturation binding studies demonstrate that PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs retain binding to PD-1 and have binding profiles that are similar to those of anti-PD-1 antibodies. Similarly, PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs retain binding to LAG-3 and, with the exception of DART 1, have binding profiles that are similar to those of the parental anti-LAG-3 antibodies.
Пример 6. Исследования ингибиторной способности биспецифических молекул PD-1xLAG-3.Example 6. Studies of the inhibitory capacity of bispecific PD-1xLAG-3 molecules.
Способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART A, DART В, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 и В SAB А; и антител к PD-1: MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (P), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1 (AA), MAT к PD-1 A IgG1 (AA) и MAT к PD-1 A IgG4 (P), блокировать связывание PD-L1 человека (shPD-L1) и PD-L2 человека (SHPD-L2) с PD-1, экспрессируемым на поверхности клеток линии NSO, исследовали по существу, как описано выше. Диатела и антитела использовали в концентраThe ability of the PD-1xLAG-3 bispecific molecules: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 and B SAB A; and the anti-PD-1 antibodies: anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG4 (P), anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG1 (AA), anti-PD-1 A MAb IgG1 (AA) and anti-PD-1 A MAb IgG4 (P) to block the binding of human PD-L1 (shPD-L1) and human PD-L2 (SHPD-L2) to PD-1 expressed on the surface of NSO cells was tested essentially as described above. Diabodies and antibodies were used in concen-
- 104 047726 ции 33,75-0,002 мкМ или 107,5-0,0001 мкМ (четырехкратные последовательные разведения).- 104 047726 33.75-0.002 μM or 107.5-0.0001 μM (fourfold serial dilutions).
Значения ИК50 и ИК90 определяли и представляли в табл. 17. Среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) представляли для тех случаев, когда проводили 2 или более отдельных экспериментов.The IC 50 and IC 90 values were determined and presented in Table 17. The sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) were presented for those cases where 2 or more separate experiments were performed.
Таблица 17Table 17
Исследования ингибирования связывания лиганда демонстрируют, что конструкции биспецифических антител PD-1xLAG-3 сохраняют способность ингибировать связывание sPD-L1 и sPD-L2 с PD-1 на поверхности клетки. Помимо этого исследовали способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART A, DART В, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 и В SAB А; и антител к LAG-3: MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG4 (P), MAT к LAG-3 A IgG4 (P), MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG1 (AA) и MAT к LAG-3 A IgG1 (AA), блокировать связывание LAG-3 человека с нативным ГКГС класса II на поверхности клеток Дауди. В общих чертах, каждую биспецифическую молекулу PD-1xLAG-3 и контрольное антитело к LAG-3 смешивали с биотинилированным растворимым гибридным белком LAG-3Fc человека (shLAG-3) (в концентрации 0,5 мкг/мл) и отдельно инкубировали с ГКГС IIположительными клетками Дауди (2,5x106 клеток). Количество LAG-3, связанного с поверхностью клеток Дауди, определяли с использованием ФЭ-конъюгированного вторичного антитела, связанного со стрептавидином, методом FACS. Диатела и антитела использовали в концентрации 27,5-0,026 мкМ (двукратные последовательные разведения) или 107,5-0,0001 мкМ (четырехкратные последовательные разведения) или 35-0,002 мкМ (четырехкратные последовательные разведения).Ligand binding inhibition studies demonstrate that the PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs retain the ability to inhibit sPD-L1 and sPD-L2 binding to PD-1 on the cell surface. In addition, the ability of the PD-1xLAG-3 bispecific molecules: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 and B SAB A; and anti-LAG-3 antibodies: anti-hLAG-3 MAb 1(1.4) IgG4 (P), anti-LAG-3 MAb A IgG4 (P), anti-hLAG-3 MAb 1(1.4) IgG1 (AA) and anti-LAG-3 MAb A IgG1 (AA) to block human LAG-3 binding to native MHC class II on the surface of Daudi cells was investigated. Briefly, each PD-1xLAG-3 bispecific molecule and anti-LAG-3 control antibody were mixed with biotinylated soluble human LAG-3Fc (shLAG-3) fusion protein (0.5 μg/mL) and separately incubated with MHC II positive Daudi cells (2.5 x 10 6 cells). The amount of LAG-3 bound to the Daudi cell surface was determined using a PE-conjugated streptavidin secondary antibody by FACS. Diabodies and antibodies were used at concentrations of 27.5-0.026 μM (two-fold serial dilutions) or 107.5-0.0001 μM (four-fold serial dilutions) or 35-0.002 μM (four-fold serial dilutions).
Значения ИК50 и ИК90 определяли и представляли в табл. 18. Среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) предоставляли в тех случаях, когда проводили 2 или более отдельных экспериментов.IC 50 and IC 90 values were determined and presented in Table 18. Sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) were provided in cases where 2 or more separate experiments were performed.
- 105 047726- 105 047726
Таблица 18Table 18
Исследования ингибирования связывания лигандов демонстрируют, что конструкции биспецифических антител PD-1xLAG-3 сохраняют способность ингибировать связывание гибридного белка shLAG-3Fc с ГКГС класса II на поверхности клетки. За исключением DART 1, биспецифические молекулы PD1xLAG-3 имеют аналогичные профили ингибирования, как и исходные антитела к LAG-3.Ligand binding inhibition studies demonstrate that PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs retain the ability to inhibit shLAG-3Fc fusion protein binding to cell surface MHC class II. With the exception of DART 1, PD1xLAG-3 bispecific molecules have similar inhibition profiles as the parental LAG-3 antibodies.
Пример 7. Блокирование молекул контрольной точки PD-1/PD-L1 под действием биспецифических молекул PD-1xLAG-3.Example 7. Blockade of PD-1/PD-L1 checkpoint molecules by bispecific PD-1xLAG-3 molecules.
Способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART A, DART В, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 и BSAB A; и антител к PD-1: MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4 (P), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG1 (AA), MAT к PD-1 A IgG1 (AA) и MAT к PD-1 A IgG4 (P), выступать антагонистами оси PD-1/PD-L1 (т.е. блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1 и предотвращать подавление ответов Тклеток), оценивали в количественном исследовании с использованием репортера люциферазы Jurkatluc2-NFAT/CHO-PD-L1 (с использованием клеток CHO/PD-L1 и клеток Jurkat MNFAT-luc2/PD-1), как описано выше. Диатела и антитела использовали в концентрации 100-0,0065 мкМ (четырехкратные последовательные разведения) или 100-0,0013 мкМ (пятикратные последовательные разведения).The ability of bispecific PD-1xLAG-3 molecules: DART A, DART B, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H, DART I, DART 1 and BSAB A; and anti-PD-1 antibodies: anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG4 (P), anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG1 (AA), anti-PD-1 A MAb IgG1 (AA), and anti-PD-1 A MAb IgG4 (P), to act as antagonists of the PD-1/PD-L1 axis (i.e., block PD-1/PD-L1 interaction and prevent suppression of T cell responses) were assessed in a quantitative Jurkatluc2-NFAT/CHO-PD-L1 luciferase reporter assay (using CHO/PD-L1 cells and Jurkat MNFAT-luc2/PD-1 cells) as described above. Diabodies and antibodies were used at a concentration of 100–0.0065 μM (four-fold serial dilutions) or 100–0.0013 μM (five-fold serial dilutions).
Значения ИК50 и ИК90 определяли и представляли в табл. 19. Среднее значение выборки (SM) и стандартное отклонение (SD, σ) представляли в тех случаях, когда проводили 2 или более отдельных экспериментов.The IC 50 and IC 90 values were determined and presented in Table 19. The sample mean (SM) and standard deviation (SD, σ) were presented in cases where 2 or more separate experiments were performed.
- 106 047726- 106 047726
Таблица 19Table 19
Исследования интенсивности сигнала репортера демонстрируют, что большинство конструкций биспецифических антител PD-1xLAG-3 сохраняют способность ингибировать связывание sPD-L1 с PD-1 на поверхности клетки. Конструкции четырехвалентных биспецифических диател PD-1xLAG-3, DART A, DART В, DART D, DART-E, DART F, DART G и DART I, были самыми сильными ингибиторами в данном количественном исследовании. Аналогичные результаты были получены для нескольких из указанных биспецифических конструкций, рассмотренных в количественном исследовании связывания PDL2 с использованием репортера.Reporter signal intensity studies demonstrate that most PD-1xLAG-3 bispecific antibody constructs retain the ability to inhibit sPD-L1 binding to cell surface PD-1. The tetravalent PD-1xLAG-3 bispecific diabodies, DART A, DART B, DART D, DART-E, DART F, DART G, and DART I, were the most potent inhibitors in this quantitative assay. Similar results were obtained for several of these bispecific constructs examined in the quantitative PDL2 binding reporter assay.
Пример 8. Функциональная активность биспецифических молекул PD-1xLAG-3.Example 8. Functional activity of bispecific PD-1xLAG-3 molecules.
Способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3 усиливать выделение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки исследовали в SEB-стимулированных МКПК при повторной стиму ляции, как описано выше, за исключением отмеченных случаев.The ability of PD-1xLAG-3 bispecific molecules to enhance cytokine release via checkpoint inhibition was examined in SEB-stimulated PBMCs upon restimulation as described above, except where noted.
В начальных исследованиях оценивали способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART A, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H; и антител к PD-1 и антител к LAG: MAT к PD1 A IgG4 (P) и MAT к LAG-3 A IgG4 (P), по отдельности или в комбинации, усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. В данных количественных исследованиях биспецифические молекулы и антитела PD-1xLAG-3 использовали в общей концентрации 3,125, 12,5 или 50 нМ, и МКПК стимулировали с использованием 0,2 нг/мл SEB (в предыдущих исследованиях использовали 0,1 нг/мл). Для проведения данных исследований, при использовании комбинации антител, концентрация каждого антитела составляла половину от общей концентрации (т.е. 1,563, 6,25, или 25 нМ). На фиг. 16А и 16В представлены профили секреции ИФН-γ из SEB-стимулированных МКПК двух типичных доноров, имевших ответ, D: 35644 и D: 59697, соответственно. Как уже отмечалось, не все доноры отвечали на SEB в концентрации 0,1 или 0,2 нг/мл. Для усиления SEB-стимуляции МКПК от большего количества доноров в дополнительных исследованиях SEB использовали в высокой концентрации 85 нг/мл или средней концентрации 0,5 нг/мл. При указанных концентрациях стимуляция SEB более устойчива у большего числа доноров, несмотря на то, что все еще может наблюдаться вариабельность ответов доноров.Initial studies assessed the ability of the PD-1xLAG-3 bispecific molecules: DART A, DART D, DART E, DART F, DART G, DART H; and anti-PD-1 antibodies and anti-LAG antibodies: anti-PD1 MAb A IgG4 (P) and anti-LAG-3 MAb A IgG4 (P), alone or in combination, to enhance cytokine release through checkpoint inhibition. In these quantitative studies, the PD-1xLAG-3 bispecific molecules and antibodies were used at a total concentration of 3.125, 12.5, or 50 nM, and PBMCs were stimulated with 0.2 ng/mL SEB (0.1 ng/mL was used in previous studies). For these studies, when using the antibody combination, the concentration of each antibody was half the total concentration (i.e., 1.563, 6.25, or 25 nM). In Fig. 16A and 16B show the IFN-γ secretion profiles from SEB-stimulated PBMCs from two typical responding donors, D:35644 and D:59697, respectively. As noted, not all donors responded to SEB at 0.1 or 0.2 ng/mL. To enhance SEB stimulation in PBMCs from a larger number of donors, additional studies used SEB at a high concentration of 85 ng/mL or a mid-range concentration of 0.5 ng/mL. At these concentrations, SEB stimulation is more robust across a larger number of donors, although donor response variability may still be observed.
В одном из указанных исследований оценивали способность биспецифических молекул PD-1xLAG3: DART A, DART В; антитела к PD-1: MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (Р); антитела к LAG-3: MAT к LAG-3 1 (1.4) IgG4 (P); и комбинации: MAT к PD-1 A IgG4 (P) и MAT к LAG-3 A IgG4 (P), усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. В указанных количественных исследованиях биспецифические молекулы и антитела PD-1xLAG-3 использовали в концентрации 0,019, 0,078, 0,3125, 1,25, 5 или 20 нМ, и МКПК стимулировали с использованием 85 нг/мл SEB. Для проведения данного количественного исследования, при использовании комбинации антител, каждое антитело обеспечивали в указанной концентрации, и, соответственно, общая концентрация антител в два раза выOne of the studies assessed the ability of PD-1xLAG3 bispecific molecules: DART A, DART B; anti-PD-1 antibodies: anti-hPD-1 MAb 7 (1.2) IgG4 (P); anti-LAG-3 antibodies: anti-LAG-3 MAb 1 (1.4) IgG4 (P); and combinations of anti-PD-1 MAb A IgG4 (P) and anti-LAG-3 MAb A IgG4 (P) to enhance cytokine release through checkpoint inhibition. In these quantitative studies, PD-1xLAG-3 bispecific molecules and antibodies were used at concentrations of 0.019, 0.078, 0.3125, 1.25, 5, or 20 nM, and PBMCs were stimulated with 85 ng/mL SEB. To perform this quantitative study, when using a combination of antibodies, each antibody was provided at the indicated concentration, and, accordingly, the total antibody concentration was doubled.
- 107 047726 ше концентрации, которую использовали для каждого антитела (т.е. 0,038, 0,156, 0,625, 2,5, 10 или 40 нМ). На фиг. 17А и 17В представлены профили секреции ИФН-γ из SEB-стимулированных МКПК от двух типичных доноров D: 55515 и D: 54024, соответственно. В другом исследовании оценивали способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART A, DART В, DART С; антитела к PD-1: MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P); антитела к LAG-3: MAT к LAG-3 1(1.4) IgG4(P); и комбинации: MAT к PD-1 A IgG4 (P) и МАТ к LAG-3 A IgG4 (P), усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. В данных количественных исследованиях биспецифические молекулы и антитела PD-1xLAG-3 использовали в общей концентрации 0,048, 0,195, 0,78, 3,125, 12,5 или 50 нМ, и МКПК стимулировали с использованием 0,5 нг/мл SEB. Для проведения данных исследований, в тех случаях, когда использовали комбинацию антител, концентрация каждого антитела составляла половину общей концентрации (т.е. 0,024, 0,098, 0,39, 1,563, 6,25 или 25 нМ). На фиг. 18А и 18В представлены профили секреции ИФН-γ из SEB-стимулированных МКПК от двух типичных доноров D: 20990 и D: 54947, соответственно.- 107 047 726 concentration used for each antibody (i.e., 0.038, 0.156, 0.625, 2.5, 10, or 40 nM). Figures 17A and 17B show the IFN-γ secretion profiles from SEB-stimulated PBMCs from two representative donors D: 55515 and D: 54024, respectively. In another study, the ability of PD-1xLAG-3 bispecific molecules: DART A, DART B, DART C; anti-PD-1 antibodies: anti-hPD-1 MAb 7(1.2) IgG4(P); anti-LAG-3 antibodies: anti-LAG-3 MAb 1(1.4) IgG4(P); and combinations of anti-PD-1 A IgG4 mAb (P) and anti-LAG-3 A IgG4 mAb (P), enhance cytokine release through checkpoint inhibition. In these quantitative studies, the bispecific molecules and PD-1xLAG-3 antibodies were used at a total concentration of 0.048, 0.195, 0.78, 3.125, 12.5, or 50 nM, and PBMCs were stimulated with 0.5 ng/mL SEB. For these studies, when a combination of antibodies was used, the concentration of each antibody was half the total concentration (i.e., 0.024, 0.098, 0.39, 1.563, 6.25, or 25 nM). In Fig. 18A and 18B show the IFN-γ secretion profiles from SEB-stimulated PBMCs from two typical donors D:20990 and D:54947, respectively.
В дополнительном исследовании оценивали высвобождение цитокина ИЛ-2.An additional study assessed the release of the cytokine IL-2.
В частности, исследовали способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART D, DART H; антител к PD-1: MAT к PD-1 A IgG4 (P), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P); антител к LAG-3: MAT к LAG-3 A IgG4 (Р) и MAT к LAG-3 1(1.4) IgG4(P); и комбинации: MAT к PD-1 A IgG4 (P) и MAT к LAG-3 A IgG4 (P), и MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P) и MAT к LAG-3 1(1.4) IgG4(P), усиливать высвобождение ИЛ-2 посредством ингибирования контрольной точки. В данных количественных исследованиях биспецифические молекулы PD-1xLAG-3 и антитела использовали в общей концентрации 3,125, 12,5 или 50 нМ, и МКПК стимулировали высокой концентрацией SEB 85 нг/мл. Для проведения данных исследований, в которых использовали комбинацию антител, концентрация каждого антитела составляла половину общей концентрации (т.е. 1,563, 6,25, или 25 нМ). На фиг. 19 представлен профиль секреции ИЛ-2 из SEBстимулированных МКПК от типичного донора (D: 54024).In particular, the ability of bispecific PD-1xLAG-3 molecules: DART D, DART H; antibodies to PD-1: MAT to PD-1 A IgG4 (P), MAT to hPD-1 7(1.2) IgG4(P); antibodies to LAG-3: MAT to LAG-3 A IgG4 (P) and MAT to LAG-3 1(1.4) IgG4(P); and combinations: MAT to PD-1 A IgG4 (P) and MAT to LAG-3 A IgG4 (P), and MAT to hPD-1 7(1.2) IgG4(P) and MAT to LAG-3 1(1.4) IgG4(P), to enhance IL-2 release through checkpoint inhibition was investigated. In these quantitative studies, the PD-1xLAG-3 bispecific molecules and antibodies were used at a total concentration of 3.125, 12.5, or 50 nM, and PBMCs were stimulated with a high concentration of SEB of 85 ng/mL. For these studies that used a combination of antibodies, the concentration of each antibody was half the total concentration (i.e., 1.563, 6.25, or 25 nM). Figure 19 shows the IL-2 secretion profile of SEB-stimulated PBMCs from a typical donor (D: 54024).
В дополнительных исследованиях оценивали способность биспецифических молекул PD-1xLAG-3: DART В и DART I; антител к PD-1: MAT к PD-1 A IgG4 (P), и MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P); антител к LAG-3: MAT к LAG-3 A IgG4 (P), MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG4(P) и MAT к hLAG-3 6(1.1) IgG4 (P); и комбинаций: MAT к PD-1 A IgG4 (P) и MAT к LAG-3 A IgG4 (Р), MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P) и MAT к hLAG-3 1(1.4) IgG4(P), а также MAT к hPD-1 7(1.2) IgG4(P) и MAT к hLAG-3 6(1.1) IgG4 (P), усиливать высвобождение цитокинов посредством ингибирования контрольной точки. В данных исследованиях биспецифические молекулы и антитела PD-1xLAG-3 использовали в концентрации 0,0061, 0,024, 0,09, 0,39, 1,56, 6,25 или 25 нМ, и МКПК стимулировали с использованием 0,5 нг/мл SEB. Для проведения данных исследований, в которых использовали комбинацию антител, каждое антитело обеспечивали в указанной концентрации, и, соответственно, общая концентрация антител в два раза выше концентрации, использованной для каждого антитела (т.е. 0,0122, 0,048, 0,18, 0,78, 3,12, 12,5 или 50 нМ). На фиг. 20 представлены профили секреции ИФН-γ из SEB-стимулированных МКПК, полученных от типичного донораD: 56041.Additional studies assessed the ability of PD-1xLAG-3 bispecific molecules: DART B and DART I; anti-PD-1 antibodies: anti-PD-1 MAT A IgG4 (P), and anti-hPD-1 MAT 7(1.2) IgG4(P); anti-LAG-3 antibodies: anti-LAG-3 MAT A IgG4 (P), anti-hLAG-3 MAT 1(1.4) IgG4(P), and anti-hLAG-3 MAT 6(1.1) IgG4 (P); and combinations of anti-PD-1 A IgG4(P) MAb and anti-LAG-3 A IgG4(P) MAb, anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) MAb and anti-hLAG-3 1(1.4) IgG4(P) MAb, and anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) MAb and anti-hLAG-3 6(1.1) IgG4(P) MAb, to enhance cytokine release through checkpoint inhibition. In these studies, the PD-1xLAG-3 bispecific molecules and antibodies were used at concentrations of 0.0061, 0.024, 0.09, 0.39, 1.56, 6.25, or 25 nM, and PBMCs were stimulated with 0.5 ng/ml SEB. For these studies, where a combination of antibodies was used, each antibody was provided at the indicated concentration, and accordingly, the total antibody concentration was twice the concentration used for each antibody (i.e., 0.0122, 0.048, 0.18, 0.78, 3.12, 12.5, or 50 nM). Figure 20 shows the IFN-γ secretion profiles from SEB-stimulated PBMCs obtained from a representative donor D: 56041.
Способность биспецифической молекулы PD-1xLAG-3 DART I; комбинации антитела к PD-1, MAT к PD-1 A IgG4 и антитела к LAG-3, MAT к LAG-3 A IgG4 (P); и антитела для отрицательного контроля, усиливать ответы антигенспецифичных Т-клеток исследовали с использованием количественного исследования вторичного иммунного ответа на столбнячный анатоксин. В частности, ответ антигенспецифичной усиленной секреции цитокинов измеряли с использованием столбнячного анатоксина в качестве антигена для индукции вторичного иммунного ответа в системе для количественного исследования на основе совместной культуры. В общих чертах, CD4 Т-клетки памяти (0,5-1,0x105 клеток/лунку) выделяли с использованием наборов для выделения на основе отрицательной селекции (Miltenyi Biotec, Сан-Диего, Калифорния, и Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) из периферической крови человека и культивировали в течение 5-7 дней с облученными моноцитами (0,01-0,05x105 клеток/лунку, 3500 рад) от того же донора в присутствии или в отсутствие 5 мкг/мл антигена столбнячного анатоксина для индукции вторичного иммунного ответа (TTd) и разведений (начиная с 25 нМ) DART I, MAT к PD-1 A IgG4+MAT к LAG-3 A IgG4(P), или антитела для контроля изотипа. В параллельных планшетах пролиферацию измеряли путем встраивания третированного тимидина и ИЛ-2 и ИФН-γ измеряли методом ИФА (R&D systems, Миннеаполис, Минесота) на 5-7 день. На фиг. 21A-D представлены профили секреции ИФН-γ (фиг. 21А, 21С) и ИЛ-2 (фиг. 21В, 21D) на 7 день для двух типичных доноров (D50702 и D54267).The ability of the PD-1xLAG-3 DART I bispecific molecule; a combination of anti-PD-1 antibody, anti-PD-1 A IgG4 mAb and anti-LAG-3 antibody, anti-LAG-3 A IgG4 mAb (P); and a negative control antibody, to enhance antigen-specific T cell responses was investigated using a quantitative tetanus toxoid secondary immune response assay. Specifically, the antigen-specific enhanced cytokine secretion response was measured using tetanus toxoid as the secondary immune response induction antigen in a co-culture-based quantitative assay system. Briefly, memory CD4 T cells (0.5-1.0 x 105 cells/well) were isolated using negative selection-based isolation kits (Miltenyi Biotec, San Diego, CA, and Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) from human peripheral blood and cultured for 5-7 days with irradiated monocytes (0.01-0.05 x 105 cells/well, 3500 rad) from the same donor in the presence or absence of 5 μg/ml tetanus toxoid antigen for secondary immune response (TTd) induction and dilutions (starting at 25 nM) of DART I, anti-PD-1 A IgG4 MAb+anti-LAG-3 A IgG4(P) MAb, or isotype control antibody. In parallel plates, proliferation was measured by tertiary thymidine incorporation and IL-2 and IFN-γ were measured by ELISA (R&D systems, Minneapolis, MN) on days 5–7. Figures 21A–D show the secretion profiles of IFN-γ (Figs. 21A, 21C) and IL-2 (Figs. 21B, 21D) on day 7 for two representative donors (D50702 and D54267).
Результаты проведенных исследований демонстрируют, что биспецифические молекулы PD1xLAG-3 значительно усиливали выработку ИФН-γ (фиг. 16А-16В, 17А-17В, 18А-18В, 20) и ИЛ-2 (фиг. 19) из SEB-стимулированных МКПК при повторной стимуляции. В дополнение биспецифические молекулы PD-1xLAG-3 значительно усиливали выработку ИФН-γ (фиг. 21А и 21С) из CD4 Т-клеток памяти, стимулированных столбнячным анатоксином. В частности, четырехвалентные биспецифические молекулы PD-1xLAG-3 обеспечили более значительное усиление, чем комбинация антител к PD-1 и антител к LAG-3.The results of these studies demonstrate that PD1xLAG-3 bispecific molecules significantly enhanced the production of IFN-γ (Figs. 16A-16B, 17A-17B, 18A-18B, 20) and IL-2 (Fig. 19) from SEB-stimulated PBMCs upon restimulation. In addition, PD-1xLAG-3 bispecific molecules significantly enhanced the production of IFN-γ (Figs. 21A and 21C) from tetanus toxoid-stimulated memory CD4 T cells. In particular, the tetravalent PD-1xLAG-3 bispecific molecules provided a more significant enhancement than the combination of anti-PD-1 and anti-LAG-3 antibodies.
- 108 047726- 108 047726
Пример 9. Фармакокинетика биспецифических молекул PD-1xLAG-3.Example 9. Pharmacokinetics of bispecific PD-1xLAG-3 molecules.
Фармакокинетику типичной биспецифической молекулы PD-1xLAG-3, DART I, и типичного антитела к PD-1, MAT к PD-1 А, исследовали у яванских макак. В общих чертах, двум яванским макакам (одному самцу и одной самке) вводили путем инфузии однократную дозу DART I (5 мг/кг) или MAT к PD-1 A (10 мг/кг), и концентрацию молекул в сыворотке крови контролировали с течением времени, используя ИФА в формате сэндвич. В общих чертах, 96-луночные планшеты для количественного исследования Maxi-Sorb™ покрывали растворимым PD-1 человека (shPD-1), блокировали бычьим сывороточным альбумином, промывали и инкубировали с калибровочными стандартами, стандартами для контроля качества и разбавленными образцами сыворотки. Количество захваченного DART I и MAT к PD-1 А оценивали путем последовательного добавления вторичного козьего биотинилированного антитела к IgG Fc человека и конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (СА-ПХ). Активность ПХ определяли с использованием субстрата ТМВ. Все образцы анализировали с помощью считывателя для микропланшетов (SpectraMax M2e, Molecular Device, Саннивейл, Калифорния, США), и сигналы OD, испускаемыми стандартами для калибровки, использовали в четырехпараметрической логистической модели с использованием программного обеспечения SoftMax Pro (версия 5.4, Molecular Devices). Концентрации MAT к PD-1 A или DART I определяли на основании интерполяции данных сигнала OD с помощью уравнения, описывающего стандартную кривую. По оценкам, нижний предел количественного определения (LLOQ) для данного исследования составил 9,775 нг/мл. На фиг. 22 представлена зависимость концентрации в сыворотке от времени, линии представляют среднее значение для самцов (заполненные символы) и самок (открытые символы) обезьян, которым путем инфузии вводили DART I (сплошная линия, треугольники) или MAT к PD-1 А (пунктирная линия, круги). Полученные данные свидетельствуют о том, что фармакокинетика биспецифической молекулы PD-1xLAG-3 сравнима с фармакокинетикой антитела к PD-1 у яванских макак.The pharmacokinetics of a candidate PD-1xLAG-3 bispecific molecule, DART I, and a candidate PD-1 antibody, anti-PD-1A mAb, were studied in cynomolgus monkeys. Briefly, two cynomolgus monkeys (one male and one female) were infused with a single dose of DART I (5 mg/kg) or anti-PD-1A mAb (10 mg/kg), and serum concentrations of the molecules were monitored over time using a sandwich ELISA. Briefly, 96-well Maxi-Sorb™ quantitative assay plates were coated with soluble human PD-1 (shPD-1), blocked with bovine serum albumin, washed, and incubated with calibration standards, quality control standards, and diluted serum samples. The amount of captured DART I and anti-PD-1A mAb was estimated by sequential addition of a secondary biotinylated goat anti-human IgG Fc antibody and streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SA-HRP). HRP activity was determined using TMB substrate. All samples were analyzed in a microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), and the OD signals emitted by the calibration standards were used in a four-parameter logistic model using SoftMax Pro software (version 5.4, Molecular Devices). Concentrations of anti-PD-1A or DART I mAb were determined based on interpolation of the OD signal data using the standard curve equation. The estimated lower limit of quantification (LLOQ) for this assay was 9.775 ng/mL. 22 shows the serum concentration-time curve, lines represent the mean for male (filled symbols) and female (open symbols) monkeys infused with DART I (solid line, triangles) or anti-PD-1A mAb (dashed line, circles). These data suggest that the pharmacokinetics of the bispecific PD-1xLAG-3 molecule are comparable to those of the anti-PD-1 antibody in cynomolgus monkeys.
Пример 10. Токсикологическое исследование антител к PD-1 и биспецифических молекул PD1xLAG-3.Example 10. Toxicology study of antibodies to PD-1 and bispecific PD1xLAG-3 molecules.
Профиль безопасности типичного антитела к PD1, MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (Р), и типичной биспецифической молекулы PD1xLAG-3, DART I, оценивали в исследовании по подбору дозы у яванских макак, проведенном не в рамках НЛП (Надлежащая лабораторная практика).The safety profile of a representative anti-PD1 antibody, anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb, and a representative PD1xLAG-3 bispecific molecule, DART I, was assessed in a non-GLP (Good Laboratory Practice) dose-finding study in cynomolgus monkeys.
В данном исследовании оценивали потенциальную токсичность и токсикокинетику антитела к PD-1 (МАТ к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P)), при введении с использованием нескольких внутривенных инфузий. Помимо этого оценивали потенциальную токсичность и фармакокинетику молекулы DART PD-1xLAG-3 (DART I) при введении путем однократной внутривенной инфузий. Дизайн исследования представлен в табл. 20.This study assessed the potential toxicity and toxicokinetics of an anti-PD-1 antibody (anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P)) administered via multiple intravenous infusions. In addition, the potential toxicity and pharmacokinetics of the DART molecule PD-1xLAG-3 (DART I) were assessed when administered via a single intravenous infusion. The study design is presented in Table 20.
Таблица 20Table 20
а В группах 1, 2А и 3А дозы вводили, начиная с 1 дня, и вскрытие проводили через 72 ч после введения последней (третьей) дозы на 18 день.a In groups 1, 2A and 3A, doses were administered starting on day 1 and necropsy was performed 72 h after the last (third) dose on day 18.
b В группах 2В и 3В дозы вводили, начиная с 1 дня, и вскрытие проводили через 7 дней после введения последней (третьей) дозы на 22 день. b In groups 2B and 3B, doses were administered starting on day 1 and necropsy was performed 7 days after the last (third) dose on day 22.
c В группе 4 дозу вводили на 1 день и затем наблюдали за животными в течение 28 дней после введения однократной дозы (до 29 дня); животных затем возвращали в колонию. c In Group 4, the dose was administered on day 1 and animals were then observed for 28 days after the single dose (until day 29); animals were then returned to the colony.
- 109 047726- 109 047726
В данном исследовании оценивали следующие параметры и конечные точки: клинические признаки, массу тела, потребление пищи, температуру тела, параметры клинической патологии (показатели гематологии, свертывания крови и клинической химии), биоаналитические и токсикокинетические параметры, уровни антител к лекарственному препарату, данные проточной цитометрии, уровни цитокинов, результаты макроскопического вскрытия, массу органов и результаты гистопатологических исследований.The following parameters and endpoints were assessed in this study: clinical signs, body weight, food intake, body temperature, clinical pathology parameters (hematology, coagulation, and clinical chemistry), bioanalytical and toxicokinetic parameters, drug antibody levels, flow cytometry data, cytokine levels, macroscopic autopsy results, organ weights, and histopathology results.
Все животные выжили до запланированной эвтаназии на 18 или 22 день или выбыли из исследования на 29 день. Для MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) отсутствовали связанные с исследуемым изделием изменения клинических признаков, потребления пищи, массы тела, температуры тела, показателей гематологии, свертывания крови или клинической химии или результатов макроскопического вскрытия. На 18 и 22 дни у животных, получавших MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в дозе 1 или 100 мг/кг, наблюдали увеличение массы селезенки и зависимую от дозы лимфогистиоцитарную инфильтрацию красной пульпы легкой и умеренной степени тяжести. По сравнению с окружающими лимфоцитами лимфогистиоцитарные клетки имели светлую цитоплазму и нерегулярные ядра. Редкие митотические фигуры были очевидны. На микроскопическом уровне инфильтрат коррелировал с увеличением массы селезенки.All animals survived to scheduled euthanasia on days 18 or 22 or were discontinued from the study on day 29. For the anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb, there were no study product-related changes in clinical signs, food intake, body weight, body temperature, hematology, coagulation, or clinical chemistry parameters, or gross necropsy findings. On days 18 and 22, animals receiving the anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb at 1 or 100 mg/kg developed enlarged spleen weights and a dose-dependent mild to moderate lymphohistiocytic infiltration of the red pulp. Compared with surrounding lymphocytes, the lymphohistiocytic cells had clear cytoplasm and irregular nuclei. Rare mitotic figures were evident. At the microscopic level, the infiltrate correlated with an increase in spleen mass.
Профили зависимости концентрации в сыворотке крови от времени для животных, получавших MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), проявляют профиль, ожидаемый для антитела у этого вида, за некоторыми исключениями. Наклон кривых после введения третьей дозы снижался более резко, чем после первой дозы для двух животных в группе дозы 1 мг/кг и у двух животных в группе дозы 100 мг/кг, что указывает на возможное появление антител к лекарственному препарату (ADA) на более поздних циклах. Анализ показал, что у 2/4 животных ADA развивались в группе 1 мг/кг, и у 1/4 животных ADA развивались в группе 100 мг/кг.Serum concentration-time profiles for animals treated with the hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb exhibited the profile expected for an antibody in this species, with some exceptions. The slope of the curves after the third dose declined more steeply than after the first dose for two animals in the 1 mg/kg dose group and two animals in the 100 mg/kg dose group, indicating the possible emergence of anti-drug antibodies (ADA) in later cycles. Analysis showed that 2/4 of the animals developed ADA in the 1 mg/kg group and 1/4 of the animals developed ADA in the 100 mg/kg group.
В заключение следует отметить, что введение MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) путем внутривенной инфузии один раз в неделю в течение 3 недель (1, 8 и 15 дни) хорошо переносилось у яванских макак при уровнях дозы 1 и 100 мг/кг. Дозозависимый лимфогистиоцитарный клеточный инфильтрат красной пульпы селезенки легкой и умеренной степени тяжести присутствовал при введении доз 1 и 100 мг/кг MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P).In conclusion, administration of anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P) by intravenous infusion once weekly for 3 weeks (days 1, 8, and 15) was well tolerated in cynomolgus monkeys at dose levels of 1 and 100 mg/kg. A dose-dependent mild to moderate lymphohistiocytic cell infiltrate of the splenic red pulp was present at doses of 1 and 100 mg/kg anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P).
Для DART I отсутствовали изменения клинических признаков, потребления пищи, массы тела, температуры тела, показателей гематологии или параметров свертывания крови. Изменения, связанные с DART I, параметров клинической химии, включали неблагоприятное, кратковременное повышение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на 2 день. Среднее изменение активности ACT было в 3,2 раза выше, чем активность у контрольных животных, получавших носитель, и в 7,8 раза выше уровней до начала исследования, при этом уровни были выше контрольного эталонного диапазона. Среднее изменение активности ЛДГ было в 2,5 раза выше, чем активность у контрольных животных, получавших носитель, и в 6,9 раза выше уровней до начала исследования. Оба параметра вернулись к исходным уровням на 8 день. В заключение следует отметить, что однократное введение DART-I путем внутривенной инфузии хорошо переносилось у яванских макак при уровне дозы 5 мг/кг.For DART I, there were no changes in clinical signs, food intake, body weight, body temperature, hematology, or coagulation parameters. DART I-related changes in clinical chemistry parameters included unfavorable, transient increases in aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase (LDH) on day 2. The mean change in AST activity was 3.2-fold greater than that in vehicle-treated controls and 7.8-fold greater than pre-study levels, with levels above the control reference range. The mean change in LDH activity was 2.5-fold greater than that in vehicle-treated controls and 6.9-fold greater than pre-study levels. Both parameters returned to baseline levels by day 8. In conclusion, a single administration of DART-I by intravenous infusion was well tolerated in cynomolgus monkeys at the 5 mg/kg dose level.
Пример 11. Исследование фармакокинетики антител к PD-1 при введении однократной дозы.Example 11. Study of the pharmacokinetics of antibodies to PD-1 after administration of a single dose.
Исследование фармакокинетики (ФК) при введении однократной дозы с выбранными токсикологическими конечными точками проводили у яванских макак. В данном исследовании MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) сравнивали с двумя другими антителами к PD1 IgG4 (Р): MAT к PD-1 A IgG4 (P) и MAT к PD-1 В IgG4 (P). Каждое антитело вводили двум обезьянам (1 самцу, 1 самке) в дозе 10 мг/кг путем внутривенной инфузии в течение 1 ч, и животные находились под наблюдением в течение 65 дней. Отсутствовали связанные с исследуемым изделием изменения клинических признаков, изменения массы тела, потребления пищи, высвобождения цитокинов или иммунофенотипирования, связанные с введением MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) или MAT к PD-1 A IgG4 (P). Полученные данные были сходны с данными для MAT к PD-1 В IgG4 (Р), за исключением того, что при введении MAT к PD-1 В IgG4 (P) наблюдали повышение уровней ИЛ-5.A single dose pharmacokinetic (PK) study with selected toxicology endpoints was conducted in cynomolgus macaques. In this study, anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb was compared with two other anti-PD1 IgG4 (P) antibodies: anti-PD-1 A IgG4 (P) mAb and anti-PD-1 B IgG4 (P) mAb. Each antibody was administered to two monkeys (1 male, 1 female) at 10 mg/kg by intravenous infusion over 1 hour and the animals were observed for 65 days. There were no study product-related changes in clinical signs, body weight, food intake, cytokine release, or immunophenotyping associated with administration of anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb or anti-PD-1 A IgG4 (P) mAb. The data obtained were similar to those for MAb to PD-1 B IgG4 (P), except that an increase in IL-5 levels was observed with the administration of MAb to PD-1 B IgG4 (P).
Связывание антитела к PD-1 с PD-1 на поверхности Т-клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием способа конкурентного связывания, в котором оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) флуоресцентномеченного MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), связывающегося с Т-клетками в отсутствие (контроль, ФСБ) или в присутствии избытка конкурента (немеченого MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P)), для образцов крови, собранных во всех временных точках у яванских макак, получавших MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), MAT к PD-1 A IgG4 (P) или MAT к PD-1 В IgG4 (Р). Как показано на фиг. 23А-23С, MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) и MAT к PD-1 В IgG4 (P) продемонстрировали длительное связывание с PD-1 на поверхности CD4+ и CD8+ Т-клеток (связывание с PD-1 поддерживалось на уровне >80% в течение 28 дней или более) (фиг. 23А и 23С, соответственно) по сравнению с MAT к PD-1 A IgG4 (P) (связывание с PD-1 поддерживалось на уровне >80% в течение 21 дня или менее) (фиг. 23В). Для каждого из антител к PD-1 данные по связыванию с PD-1 на Т-клетках коррелируют с их концентрацией в сыворотке крови.Anti-PD-1 antibody binding to PD-1 on T cells was determined by flow cytometry using a competitive binding assay that assessed the mean fluorescence intensity (MFI) of fluorescently labeled anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) mAb binding to T cells in the absence (control, PBS) or presence of excess competitor (unlabeled anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) mAb) for blood samples collected at all time points from cynomolgus monkeys treated with anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) mAb, anti-PD-1 A IgG4(P) mAb, or anti-PD-1 B IgG4(P) mAb. As shown in Fig. 23A-23C, anti-hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) MAb and anti-PD-1 B IgG4 (P) MAb demonstrated durable binding to PD-1 on CD4+ and CD8+ T cells (PD-1 binding was sustained at >80% for 28 days or more) (Figs. 23A and 23C, respectively) compared to anti-PD-1 A IgG4 (P) MAb (PD-1 binding was sustained at >80% for 21 days or less) (Fig. 23B). For each anti-PD-1 antibody, PD-1 binding data on T cells correlated with their serum concentration.
- 110 047726- 110 047726
Пример 12. Исследование токсичности при повторном введении.Example 12. Repeated-dose toxicity study.
Для оценки безопасности, токсикокинетического и фармакодинамического профиля терапевтических молекул согласно настоящему изобретению, примерную молекулу (МАТ к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P)) вводили яванским макакам и выполняли исследование по подбору дозы не в рамках НЛП. В данном исследовании четыре группы животных (по 10 на группу, 5 самцов и 5 самок) получали MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) или контрольный препарат один раз в неделю путем инфузии при 3 уровнях дозы. Животных оценивали для выявления любой потенциальной токсичности в течение 4-недельного периода дозирования лекарственного препарата и затем в течение дополнительного 10-недельного периода без введения лекарственного препарата. Экспериментальный дизайн данного исследования представлен в табл. 21. Животным вводили дозы один раз в неделю путем внутривенной инфузии в течение 1 ч с помощью откалиброванного инфузионного насоса на 1, 8, 15 и 22 день исследования. Одного самца и одну самку из каждой группы умерщвляли на 25 день, остальных животных умерщвляли на 95 день исследования. Оценивали влияние введения MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) на субпопуляции лейкоцитов в кровотоке, включая занятие рецепторов PD-1 на Т-лимфоцитах. Также определяли профили антител к лекарственному препарату (ADA).To evaluate the safety, toxicokinetic, and pharmacodynamic profile of the therapeutic molecules of the present invention, an exemplary molecule (anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) mAb) was administered to cynomolgus monkeys and a non-GLP dose-finding study was performed. In this study, four groups of animals (10 per group, 5 males and 5 females) received anti-hPD-1 7(1.2) IgG4(P) mAb or control drug once weekly by infusion at 3 dose levels. Animals were assessed for any potential toxicity during the 4-week drug dosing period and then for an additional 10-week drug-free period. The experimental design of this study is presented in Table 1. 21. Animals were dosed once weekly by intravenous infusion over 1 h using a calibrated infusion pump on study days 1, 8, 15, and 22. One male and one female from each group were sacrificed on day 25, and the remaining animals were sacrificed on study day 95. The effects of hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb administration on circulating leukocyte subsets, including PD-1 receptor occupancy on T lymphocytes, were assessed. Anti-drug antibody (ADA) profiles were also determined.
Таблица 21Table 21
а Контроль и MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) вводили еженедельно путем внутривенной инфузии. a Control and MAb to hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) were administered weekly by intravenous infusion.
Шесть обезьян (3 самца/3 самки) на группу вскрывали на 25 день, и оставшихся обезьян в группе восстановления (2 самца/2 самки) вскрывали на 95 день.Six monkeys (3 males/3 females) per group were necropsied on day 25, and the remaining monkeys in the recovery group (2 males/2 females) were necropsied on day 95.
Яванские макаки хорошо переносили еженедельные внутривенные (в/в) инфузии MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в дозах 0, 10, 40 и 150 мг/кг, и все животные выжили до запланированной эвтаназии на 25 или 95 день. Не было обнаружено связанных с MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) изменений клинических признаков, потребления пищи, массы тела, показателей физических, офтальмологических и неврологических обследований, электрокардиологических параметров, температуры тела, частоты дыхания, артериального давления и пульса, параметров свертывания крови, клинической химии и анализа мочи, массы органов или результатов макроскопического вскрытия. Изменения гематологических параметров, связанные с MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), включали кратковременное снижение титров лимфоцитов. Титры лимфоцитов умеренно уменьшались по сравнению с исходными уровнями (1 день до введения дозы) на 2 день (23 ч после инфузии) у самцов и самок при дозе >10 мг/кг, статистически достоверно для самцов при дозе 10 и 40 мг/кг и у самок при дозе 40 и 150 мг/кг по сравнению с контролями. Титры лимфоцитов возвращались практически к исходным уровням на 8 день до начала дозирования, но умеренно снижались у некоторых самцов и самок при всех уровнях дозы (в 0,47-0,68 раза относительно исходных уровней) на 9 день (23 ч после инфузии). Титры лимфоцитов увеличивались до введения дозы на 15 и 22 день, но уменьшались у некоторых самцов и самок (в 0,36-0,54 раза относительно исходных уровней) на 16 и 23 день (23 ч после инфузии).Cynomolgus macaques tolerated weekly intravenous (i.v.) infusions of anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb at doses of 0, 10, 40, and 150 mg/kg well, and all animals survived to scheduled euthanasia on days 25 or 95. No anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb-related changes in clinical signs, food intake, body weight, physical, ophthalmologic, and neurologic examination parameters, electrocardiologic parameters, body temperature, respiratory rate, blood pressure, and pulse rate, coagulation parameters, clinical chemistry, urinalysis, organ weights, or gross necropsy findings were detected. Anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb-related changes in hematologic parameters included a transient decrease in lymphocyte titers. Lymphocyte titers were modestly decreased from baseline (1 day predose) levels by day 2 (23 hours post-infusion) in males and females at doses >10 mg/kg, and statistically significant in males at 10 and 40 mg/kg and in females at 40 and 150 mg/kg compared with controls. Lymphocyte titers returned near baseline levels by day 8 predose but were modestly decreased in some males and females at all dose levels (0.47-0.68-fold relative to baseline) by day 9 (23 hours post-infusion). Lymphocyte titers increased predose on days 15 and 22 but were decreased in some males and females (0.36-0.54-fold relative to baseline) on days 16 and 23 (23 hours post-infusion).
Дозозависимое, кратковременное снижение популяций циркулирующих иммунных клеток, включая общую популяцию лейкоцитов, Т-клетки, В-клетки и NK-клетки, наблюдали через 23 ч после окончания инфузии у животных, получавших MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), по сравнению с контрольной группой. Наибольшую величину изменений наблюдали после введения первой дозы в 1 день; изменения меньшей величины кратковременно наблюдали после введения последующих доз на 8, 15 или 22 дни. Популяции иммунных клеток обычно восстанавливались до исходных значений, или близких к исходным, к 72 часу после окончания инфузии и на протяжении фазы восстановления. У животных, получавших MAT к hPD1 7 (1.2) IgG4 (P), не наблюдали изменений, касающихся циркулирующих моноцитов, по сравнению с контрольной группой.Dose-dependent, transient reductions in circulating immune cell populations, including total leukocytes, T cells, B cells, and NK cells, were observed 23 h after the end of infusion in animals receiving the anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb compared with controls. The greatest magnitude of change was observed after the first dose on day 1; smaller magnitude changes were briefly observed after subsequent doses on days 8, 15, and 22. Immune cell populations generally recovered to or near baseline values by 72 h after the end of infusion and throughout the recovery phase. No changes in circulating monocytes were observed in animals receiving the anti-hPD1 7(1.2)IgG4(P) mAb compared with controls.
Максимальное связывание MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) с PD-1+/CD4+ и PD-1+/CD8+ клетками наблюдали в течение фазы лечения MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) исследования при всех проверенных дозах (10, 40 или 150 мг/кг). Во время периода восстановления у животных, у которых не вырабатывалисьMaximal binding of mAb to hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) to PD-1+/CD4+ and PD-1+/CD8+ cells was observed during the treatment phase of the mAb to hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) study at all doses tested (10, 40 or 150 mg/kg). During the recovery period, animals that did not develop
- 111 047726 антитела к лекарственному препарату (ADA), концентрации MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в сыворотке крови оставались выше 29 мкг/мл, и максимальное связывание PD-1+/CD4+ и PD-1+/CD8+ T-клетками поддерживалось в течение всего 10-недельного периода восстановления. У указанных животных отсутствовали доказательства модуляции PD-1 на Т-клетках. Во время периода восстановления у животных, у которых развивались ADA-ответы, частота MGD012-связанных PD-1+ Т-клеток снижалась до исходного уровня. Снижение от максимального связывания MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (Р) с PD-1+/CD4+ и PD1+/CD8+ клетками ADA-положительных животных обычно имело место, когда кажущаяся концентрация MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в сыворотке крови уменьшалась ниже приблизительно 25 мкг/мл. Однако неизвестно, относилось ли данное кажущееся пороговое соотношение к ADA-отрицательным животным, поскольку присутствие ADA у ADA-положительных животных может способствовать блокированию связывания антител к PD-1 с PD-1.- 111 047726 anti-drug antibodies (ADA), serum hPD-1 mAb 7 (1.2) IgG4 (P) concentrations remained above 29 μg/mL, and peak PD-1+/CD4+ and PD-1+/CD8+ T cell binding was maintained throughout the 10-week recovery period. There was no evidence of PD-1 modulation on T cells in these animals. During the recovery period, MGD012-bound PD-1+ T cell frequencies decreased to baseline in animals that developed ADA responses. The decrease from maximal binding of anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb to PD-1+/CD4+ and PD1+/CD8+ cells in ADA-positive animals typically occurred when the apparent serum concentration of anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb decreased below approximately 25 μg/mL. However, it is unknown whether this apparent threshold ratio applied to ADA-negative animals, as the presence of ADA in ADA-positive animals may contribute to blocking binding of anti-PD-1 antibodies to PD-1.
Различия фармакокинетических ответов MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), связанные с полом животных, были минимальными и линейными в пределах исследованного диапазона доз (10-150 мг/кг). Для MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в дозе 10, 40 и 150 мг/кг комбинированное среднее значение Cmax для обоих полов составило 240 мкг/мл (0,240 мг/мл), 1078 мкг/мл (1,08 мг/мл) и 3938 мкг/мл (3,94 мг/мл), и значения AUC составили 47310 ч-мкг/мл (47,3 ч-мкг/мл), 205723 ч-мкг/мл (206 ч-мкг/мл) и 745681 ч-мкг/мл (746 ч-мкг/мл), соответственно. Средний клиренс согласно результатам некомпартментного анализа (NCA) первого цикла MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) до появления ADA составил 0,21 мл/ч/кг, что значительно ниже, чем скорость клубочковой фильтрации яванских макак, как и ожидалось для высокомолекулярного белка. Средний стационарный объем распределения согласно результатам NCA первого цикла MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) составил 68 мл/кг, что приблизительно в 1,5 раза больше объема сыворотки, но меньше, чем внеклеточное водное пространство. Это свидетельствует о том, что MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) вытекает из сосудов во внеклеточное пространство ткани, но не все внеклеточное пространство было доступно для указанной молекулы. Среднее значение среднего времени удержания (MRT) согласно результатам NCA первого цикла MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) составило 335 часов или приблизительно 14 дней. Появление ADA уменьшало концентрации MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в циклах 2-4. Доказательства снижения концентраций MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в сыворотке крови после введения повторных доз MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) наблюдали у 7/10, 4/10 и 3/10 животных в группах доз 10, 40 и 150 мг/кг, соответственно. Присутствие ADA к MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) было подтверждено у 4, 2 и 1 из указанных животных в группах доз 10, 40 и 150 мг/кг, соответственно; все животные, у которых ADA не были подтверждены, были в группе терминального вскрытия, в которой концентрации MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) в сыворотке крови, вероятно, препятствовали детектированию ADA. Соответственно, в последующих исследованиях токсикокинетики, если остаточная концентрация была ниже, чем предыдущая остаточная концентрация, данные, начиная с этого момента времени, подвергали пересмотру. На основании результатов двухкомпартментного моделирования данных по всем циклам для 3 групп дозирования, за исключением временных точек, которые подверглись влиянию ADA, средние значения для первичных параметров ТК для двухкомпартментной модели составили 0,22 мл/ч/кг для клиренса, 38,5 мл/кг для первоначального объема распределения (V1) и 33,8 мл/кг для V2, что дало средний равновесный объем распределения (Vss) 72,3 мл/кг и MRT 329 ч. Полученные значения согласуются с параметрами, полученными из NCA первой дозы. Результаты моделирования свидетельствуют о том, что, в отсутствие ADA, при еженедельном дозировании устойчивое состояние у яванских макак будет достигнуто после 5 дозы, и индекс накопления будет равен 2,4.Gender-related differences in the pharmacokinetic responses of mAb to hPD-1 7(1.2)IgG4(P) were minimal and linear across the dose range studied (10-150 mg/kg). For the hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb at 10, 40, and 150 mg/kg, the combined mean C max for both sexes was 240 μg/mL (0.240 mg/mL), 1078 μg/mL (1.08 mg/mL), and 3938 μg/mL (3.94 mg/mL), and the AUC values were 47,310 h-μg/mL (47.3 h-μg/mL), 205,723 h-μg/mL (206 h-μg/mL), and 745,681 h-μg/mL (746 h-μg/mL), respectively. The mean first-cycle noncompartmental clearance (NCA) of anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb before ADA was 0.21 mL/h/kg, which is significantly lower than the glomerular filtration rate in cynomolgus monkeys, as expected for a high-molecular-weight protein. The mean steady-state volume of distribution by first-cycle NCA of anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb was 68 mL/kg, which is approximately 1.5-fold greater than the serum volume but less than the extracellular aqueous space. This suggests that anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb leaks from the vasculature into the tissue extracellular space, but not all of the extracellular space is accessible to this molecule. The mean mean residence time (MRT) from the first cycle NCA of anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb was 335 hours or approximately 14 days. The introduction of ADA decreased anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb concentrations in cycles 2-4. Evidence of a decrease in serum anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb concentrations following repeated dosing of anti-hPD-1 7(1.2) IgG4 (P) mAb was observed in 7/10, 4/10, and 3/10 animals in the 10, 40, and 150 mg/kg dose groups, respectively. The presence of ADA to the anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P) was confirmed in 4, 2, and 1 of these animals in the 10, 40, and 150 mg/kg dose groups, respectively; all animals in which ADA was not confirmed were in the terminal necropsy group, in which serum anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P) concentrations likely prevented ADA detection. Accordingly, in subsequent toxicokinetic studies, if the trough concentration was lower than the previous trough concentration, the data from that time point onwards were re-evaluated. Based on the results of two-compartment modeling of data across all cycles for the 3 dosing groups excluding time points affected by ADA, the mean values for the primary TC parameters for the two-compartment model were 0.22 mL/h/kg for clearance, 38.5 mL/kg for initial volume of distribution (V1), and 33.8 mL/kg for V2 , resulting in a mean steady-state volume of distribution ( Vss ) of 72.3 mL/kg and an MRT of 329 h. These values are consistent with those derived from the first-dose NCA. The modeling results suggest that, in the absence of ADA, with weekly dosing in cynomolgus monkeys, steady-state would be reached after the 5th dose, with an accumulation index of 2.4.
На 25 день минимальные мультифокальные периваскулярные инфильтраты мононуклеарных клеток, связанные с MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), присутствовали в поверхностных слоях дермы в сайте в/в инъекции у самцов при дозе >40 мг/кг и у самок при дозе >10 мг/кг и были ожидаемой реакцией на повторную инъекцию чужеродного белка (моноклонального антитела). На 95 день не было отмечено какихлибо микроскопических изменений, связанных с MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P), это указывает на восстановление изменения, связанного с исследуемым изделием, наблюдаемого на 25 день.At day 25, minimal multifocal perivascular mononuclear cell infiltrates associated with anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P) were present in the superficial dermis at the IV injection site in males at doses >40 mg/kg and in females at doses >10 mg/kg and were the expected response to repeated injection of foreign protein (monoclonal antibody). At day 95, no microscopic changes associated with anti-hPD-1 mAb 7(1.2)IgG4(P) were noted, indicating recovery of the study device-related change observed at day 25.
В заключение следует отметить, что результаты данного исследования указывают на то, что введение MAT к hPD-1 7 (1.2) IgG4 (P) путем внутривенной инфузии один раз в неделю (1, 8, 15 и 22 дни) клинически хорошо переносилось у яванских макак при уровнях дозы 10, 40 или 150 мг/кг. Наблюдаемые эффекты были ограничены кратковременным снижением количества циркулирующих лимфоцитов и минимальными изменениями в месте инъекции, связанными с инъекцией чужеродного белка. На основании этих результатов уровень без наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL) считали равным 150 мг/кг (комбинированное среднее Cmax для обоих полов 3,94 мг/мл и AUC 746 ч-мг/мл).In conclusion, the results of this study indicate that administration of the anti-hPD-1 7(1.2)IgG4(P) mAb by intravenous infusion once weekly (days 1, 8, 15, and 22) was clinically well tolerated in cynomolgus monkeys at dose levels of 10, 40, or 150 mg/kg. The observed effects were limited to transient decreases in circulating lymphocytes and minimal injection site changes associated with the injection of foreign protein. Based on these results, a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) of 150 mg/kg was considered (combined mean C max for both sexes 3.94 mg/mL and AUC 746 h-mg/mL).
Все публикации и патенты, упомянутые в данном описании, включены в настоящее изобретение посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана для полного включения посредством ссылки. Несмотря на то что настоящее изобретение было описано применительно к конкретными вариантами реализации, следует понимать, что оно может быть дополнительно модифицировано, и предусмотрено, что настоящая заявка включает любые варианты, способы применения или адаптированные варианты согласно настояAll publications and patents mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference in its entirety. Although the present invention has been described with respect to specific embodiments, it is to be understood that it can be further modified, and it is intended that the present application include any variations, uses, or adaptations thereof.
- 112 -- 112 -
Claims (31)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/198,867 | 2015-07-30 | ||
US62/239,559 | 2015-10-09 | ||
US62/255,140 | 2015-11-13 | ||
US62/322,974 | 2016-04-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA047726B1 true EA047726B1 (en) | 2024-08-30 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020200054B2 (en) | PD-1-binding molecules and methods of use thereof | |
US11858991B2 (en) | LAG-3-binding molecules and methods of use thereof | |
EA047726B1 (en) | MULTISPECIFIC PD-1 BINDING MOLECULES AND METHODS OF THEIR APPLICATION | |
EA042076B1 (en) | PD-1 BINDING MOLECULES AND METHODS FOR THEIR APPLICATION | |
EA041483B1 (en) | LAG-3 BINDING MOLECULES AND METHODS FOR THEIR APPLICATION |