EA047656B1 - RNAi CONSTRUCTS DESIGNED TO SUPPRESS PNPLA3 EXPRESSION - Google Patents
RNAi CONSTRUCTS DESIGNED TO SUPPRESS PNPLA3 EXPRESSION Download PDFInfo
- Publication number
- EA047656B1 EA047656B1 EA202191629 EA047656B1 EA 047656 B1 EA047656 B1 EA 047656B1 EA 202191629 EA202191629 EA 202191629 EA 047656 B1 EA047656 B1 EA 047656B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rnai construct
- pnpla3
- rnai
- nucleotides
- expression
- Prior art date
Links
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 title claims description 323
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 179
- 102100031251 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase PNPLA3 Human genes 0.000 title claims description 20
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 title claims 59
- 101001129184 Homo sapiens 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase PNPLA3 Proteins 0.000 title description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 271
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 217
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 172
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 140
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 104
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 89
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 69
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 40
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 39
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 38
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 32
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 32
- -1 bicyclic nucleic acid Chemical class 0.000 claims description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 26
- 206010053219 non-alcoholic steatohepatitis Diseases 0.000 claims description 22
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 22
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 108050003337 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase PNPLA3 Proteins 0.000 claims description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 102200129022 rs738409 Human genes 0.000 description 307
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 293
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 291
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 290
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 288
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 264
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 131
- 241000232219 Platanista Species 0.000 description 110
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 107
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 description 84
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 77
- 101100244213 Homo sapiens PNPLA3 gene Proteins 0.000 description 70
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 70
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 61
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 60
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 53
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 51
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 47
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 43
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 40
- 102000032222 human adiponutrin Human genes 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 32
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 31
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 30
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 29
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 27
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 26
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 26
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 25
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 19
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 17
- 230000007863 steatosis Effects 0.000 description 17
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 17
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 17
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 16
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 16
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 101100013786 Mus musculus Gapdh gene Proteins 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101150114988 invA gene Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 12
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 12
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 12
- PPDBOQMNKNNODG-NTEUORMPSA-N (5E)-5-(4-chlorobenzylidene)-2,2-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)cyclopentanol Chemical compound C1=NC=NN1CC1(O)C(C)(C)CC\C1=C/C1=CC=C(Cl)C=C1 PPDBOQMNKNNODG-NTEUORMPSA-N 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 11
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 11
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 11
- 101150021607 rppH gene Proteins 0.000 description 11
- 101150082821 sacA gene Proteins 0.000 description 11
- 101150070603 yadA gene Proteins 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 10
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 101000669513 Homo sapiens Metalloproteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 9
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 9
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 9
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 9
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 8
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 8
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000000021 endosomolytic effect Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 101100231743 Homo sapiens HPRT1 gene Proteins 0.000 description 7
- 101100339600 Mus musculus Hprt1 gene Proteins 0.000 description 7
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 7
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 7
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 7
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 7
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 7
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical group N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 6
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 6
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 6
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 6
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 6
- 102220192598 rs738408 Human genes 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 5
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 102000045334 human TBP Human genes 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 5
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000785944 Homo sapiens Asialoglycoprotein receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100324528 Mus musculus Asgr1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 108010087178 adiponutrin Proteins 0.000 description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 4
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical group C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 4
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 3
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000608672 Homo sapiens Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats Proteins 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000002057 Patatin-like phospholipase domains Human genes 0.000 description 3
- 108050009491 Patatin-like phospholipase domains Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 101150000107 SCAP gene Proteins 0.000 description 3
- 101710145783 TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039543 Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 3
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 3
- 102000051237 human ASGR1 Human genes 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000008410 smoothened signaling pathway Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- DXDIHODZARUBLA-UHFFFAOYSA-N 2,3-dibenzoyloxybutanedioic acid;hydrate Chemical compound O.C=1C=CC=CC=1C(=O)OC(C(O)=O)C(C(=O)O)OC(=O)C1=CC=CC=C1 DXDIHODZARUBLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKAAWCHIBBNLOJ-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutanoic acid;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NCCC(N)C(O)=O CKAAWCHIBBNLOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DZIKSWKAPREDIH-WDTGYIAMSA-N 3-[(3s,5s,8r,9s,10s,13r,17r)-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3-[(4r,5s,6r)-4,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-14-hydroxy-10,13-dimethyl-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-tetradecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-fur Chemical compound C1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)OC1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2C[C@H]3[C@]([C@@H]4[C@H](C5(CC[C@@H]([C@@]5(C)CC4)C=4COC(=O)C=4)O)CC3)(C)CC2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DZIKSWKAPREDIH-WDTGYIAMSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 101150066399 COL4A1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 2
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100274957 Mus musculus Col1a1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100384405 Mus musculus Col3a1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100244214 Mus musculus Pnpla3 gene Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N N-acetyl-s-geranylgeranyl-l-cysteine Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 101150077804 TIMP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 2
- 102000005353 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- XJHCXCQVJFPJIK-UHFFFAOYSA-M caesium fluoride Chemical compound [F-].[Cs+] XJHCXCQVJFPJIK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- ADYPXRFPBQGGAH-UMYZUSPBSA-N dihydroergotamine mesylate Chemical compound CS(O)(=O)=O.C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C)C1=CC=CC=C1 ADYPXRFPBQGGAH-UMYZUSPBSA-N 0.000 description 2
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 2
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 description 2
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 2
- 231100000832 liver cell necrosis Toxicity 0.000 description 2
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000011201 multiple comparisons test Methods 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 125000004219 purine nucleobase group Chemical group 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical group CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N (+)-borneol Chemical group C1C[C@@]2(C)[C@@H](O)C[C@@H]1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical group C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N (-)-isopinocampheol Chemical group C1C(O)C(C)C2C(C)(C)C1C2 REPVLJRCJUVQFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- GTXSRFUZSLTDFX-HRCADAONSA-N (2s)-n-[(2s)-3,3-dimethyl-1-(methylamino)-1-oxobutan-2-yl]-4-methyl-2-[[(2s)-2-sulfanyl-4-(3,4,4-trimethyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)butanoyl]amino]pentanamide Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](S)CCN1C(=O)N(C)C(C)(C)C1=O GTXSRFUZSLTDFX-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- YRASDMUWFUDPGT-UOGQDSSISA-N (2s,3s,4r)-4-butan-2-yl-3-(carboxymethyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CCC(C)[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)[C@H]1CC(O)=O YRASDMUWFUDPGT-UOGQDSSISA-N 0.000 description 1
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- ZIZMDHZLHJBNSQ-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydrophenazine Chemical compound C1=CC=C2N=C(C=CCC3)C3=NC2=C1 ZIZMDHZLHJBNSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydropyrimidin-4-amine Chemical compound N=C1NCNC=C1 WKKCYLSCLQVWFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Chemical group OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSZBNXRNKJWUKH-UHFFFAOYSA-N 1-nitro-5-phenyltetrazole Chemical compound [O-][N+](=O)N1N=NN=C1C1=CC=CC=C1 FSZBNXRNKJWUKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZMNEDXVUJLQAF-UHFFFAOYSA-N 1-o-tert-butyl 2-o-methyl 4-hydroxypyrrolidine-1,2-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC(O)CN1C(=O)OC(C)(C)C MZMNEDXVUJLQAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- PNXSUXRNBHUCSF-HSYVXBRLSA-N 107658-43-5 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)OC(=O)CC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)OC(=O)[C@H](CCC(=O)OC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)N)C1C=NC=N1 PNXSUXRNBHUCSF-HSYVXBRLSA-N 0.000 description 1
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical compound NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RLOQBKJCOAXOLR-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrole-2-carboxamide Chemical class NC(=O)C1=CC=CN1 RLOQBKJCOAXOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(azaniumyl)propanoate;chloride Chemical compound Cl.NCC(N)C(O)=O SKWCZPYWFRTSDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 2,6-diaminopimelic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azaniumylethoxy)ethoxy]acetate Chemical compound NCCOCCOCC(O)=O RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical compound N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 description 1
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 2-nitro-1h-pyrrole Chemical class [O-][N+](=O)C1=CC=CN1 FTBBGQKRYUTLMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIAJCGFYHIANNA-QIZZZRFXSA-N 3b-Hydroxy-5-cholenoic acid Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]1(C)CC2 HIAJCGFYHIANNA-QIZZZRFXSA-N 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LAVZKLJDKGRZJG-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1C=CN2 LAVZKLJDKGRZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound C=1C=CC=CC=1CSC=1N=NNN=1 GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1H-pyrimidin-4-one Chemical group N1CNC=C(C1=O)C KBDWGFZSICOZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1,5-dihydroimidazo[4,5-c]pyridin-4-one Chemical compound O=C1NC(N)=CC2=C1N=CN2 KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSWCIARYGITEOY-UHFFFAOYSA-N 6-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2C=CNC2=C1 PSWCIARYGITEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- KBCBKZHEGSUDBQ-OFBQIVOGSA-N 9-[(2R,3S,4R,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolan-2-yl]-1H-purin-6-one Chemical compound CO[C@@]1([C@@H](O[C@@H]([C@H]1O)CO)N1C=NC=2C(O)=NC=NC1=2)O KBCBKZHEGSUDBQ-OFBQIVOGSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032091 ALK and LTK ligand 2 Human genes 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical class NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 102100026292 Asialoglycoprotein receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000006374 C2-C10 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 101150008656 COL1A1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008975 Col3a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Chemical group CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical class S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical group O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010087294 GALA peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108010026027 Hemopexin Proteins 0.000 description 1
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 1
- 101000776351 Homo sapiens ALK and LTK ligand 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101000611202 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 208000009481 Laryngeal Edema Diseases 0.000 description 1
- 206010023845 Laryngeal oedema Diseases 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N Lithocholsaeure Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101100328555 Mus musculus Col4a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153331 Mus musculus Timp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910003849 O-Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229910003872 O—Si Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 102100040283 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B Human genes 0.000 description 1
- 241001387976 Pera Species 0.000 description 1
- 101710132772 Peroxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 101150087356 Pnpla3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001510071 Pyrrhocoridae Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010037884 Rash pruritic Diseases 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCDNRPPFBQDQHR-SSYATKPKSA-N Syrosingopine Chemical compound C1=C(OC)C(OC(=O)OCC)=C(OC)C=C1C(=O)O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C(=O)OC)[C@H]2C[C@@H]3C(NC=4C5=CC=C(OC)C=4)=C5CCN3C[C@H]2C1 ZCDNRPPFBQDQHR-SSYATKPKSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- IVTVGDXNLFLDRM-HNNXBMFYSA-N Tomudex Chemical compound C=1C=C2NC(C)=NC(=O)C2=CC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)S1 IVTVGDXNLFLDRM-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical class O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;adamantane Chemical compound CC(O)=O.C1C(C2)CC3CC1CC2C3 XVIYCJDWYLJQBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000005215 alkyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000002344 aminooxy group Chemical group [H]N([H])O[*] 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N borneol Chemical group C1CC2(C)C(C)CC1C2(C)C CKDOCTFBFTVPSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116229 borneol Drugs 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000701 chemical imaging Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003983 crown ethers Chemical class 0.000 description 1
- WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N cyclandelate Chemical compound C1C(C)(C)CC(C)CC1OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 WZHCOOQXZCIUNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N cytidine monophosphate Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000021045 dietary change Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N diltiazem hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1[C@@H](OC(C)=O)C(=O)N(CC[NH+](C)C)C2=CC=CC=C2S1 HDRXZJPWHTXQRI-BHDTVMLSSA-N 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N dl-isoborneol Chemical group C1CC2(C)C(O)CC1C2(C)C DTGKSKDOIYIVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005745 ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N fructosamine Chemical compound NC[C@@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 1
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000005597 hydrazone group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002952 image-based readout Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910001506 inorganic fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 229940028435 intralipid Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N lactose group Chemical group OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N lithocholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N 0.000 description 1
- 231100000849 liver cell damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N methylidenehydrazine Chemical compound NN=C IDBOAVAEGRJRIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- QTNLALDFXILRQO-UHFFFAOYSA-N nonadecane-1,2,3-triol Chemical group CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)CO QTNLALDFXILRQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064696 nutrilipid Drugs 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M phosphinate Chemical compound [O-][PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Chemical group 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 125000003808 silyl group Chemical group [H][Si]([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000005309 thioalkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 235000010692 trans-unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Description
Область техники, к которой относится изобретениеField of technology to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к композициям и способам модуляции экспрессии пататинподобного фосфолипазного домена 3 (PNPLA3) в печени. В частности, настоящее изобретение относится к терапевтическим средствам на основе нуклеиновой кислоты, предназначенным для снижения экспрессии PNPLA3 посредством РНК-интерференции, и к способам применения таких терапевтических средств на основе нуклеиновой кислоты с целью лечения или предотвращения болезни печени, такой как неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD).The present invention relates to compositions and methods for modulating the expression of patatin-like phospholipase domain 3 (PNPLA3) in the liver. In particular, the present invention relates to nucleic acid therapeutics for reducing the expression of PNPLA3 via RNA interference and to methods of using such nucleic acid therapeutics to treat or prevent a liver disease such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of an invention
Являясь частью спектра патологий печени, неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) представляет собой самое распространенное хроническое заболевание печени в мире, заболеваемость которым удвоилась за последние 20 лет, и в настоящее время, по оценкам, она затрагивает приблизительно 20% населения в мире (Sattar et al. (2014), BMJ, 349:g4596; Loomba and Sanyal (2013), Nature Reviews Gastroenterology & hepatology 10(11):686-690; Kim and Kim (2017), Clin. Gastroenterol. Hepatol. 15(4):474485; Petta et al. (2016), Dig. Liver. Dis. 48(3):333-342). NAFLD начинается с накопления триглицеридов в печени и определяется наличием цитоплазматических липидных капель более чем в 5% гепатоцитов у индивидуума 1) без избыточного потребления алкоголя в анамнезе и 2) у которого были исключены другие типы болезней печени (Zhu et al. (2016), World J. Gastroenterol. 22(36):8226-33; Rinella (2015), JAMA, 313(22):2263-73; Yki-Jarvinen (2016), Diabetologia, 59(6):1104-11). У некоторых индивидуумов накопление эктопического жира в печени, называемое стеатозом, вызывает воспаление и повреждение клеток печени, что приводит к более поздней стадии заболевания, называемой неалкогольным стеатогепатитом (NASH) (Rinella, выше). По состоянию на 2015 год у 75-100 миллионов американцев прогнозируется развитие NAFLD; при этом NASH составляет примерно 10-30% диагнозов NAFLD (Rinella, выше; Younossi et al. (2016), Hepatology, 64(5):1577-1586).As part of a spectrum of liver pathologies, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common chronic liver disease worldwide, the incidence of which has doubled over the past 20 years and is currently estimated to affect approximately 20% of the world's population (Sattar et al. (2014), BMJ, 349:g4596; Loomba and Sanyal (2013), Nature Reviews Gastroenterology & hepatology 10(11):686–690; Kim and Kim (2017), Clin. Gastroenterol. Hepatol. 15(4):474–485; Petta et al. (2016), Dig. Liver. Dis. 48(3):333–342). NAFLD begins with the accumulation of triglycerides in the liver and is defined by the presence of cytoplasmic lipid droplets in more than 5% of hepatocytes in an individual 1) with no history of excess alcohol consumption and 2) in whom other types of liver disease have been excluded (Zhu et al. (2016) World J. Gastroenterol. 22(36):8226–33; Rinella (2015) JAMA, 313(22):2263–73; Yki-Jarvinen (2016) Diabetologia, 59(6):1104–11). In some individuals, the accumulation of ectopic fat in the liver, called steatosis, causes inflammation and liver cell damage, leading to a later stage of the disease called nonalcoholic steatohepatitis (NASH) (Rinella, supra). As of 2015, 75–100 million Americans are projected to develop NAFLD, with NASH accounting for approximately 10–30% of NAFLD diagnoses (Rinella, supra; Younossi et al. (2016) Hepatology, 64(5):1577–1586).
Пататин-подобный фосфолипазный домен 3 (PNPLA3), ранее известный как адипонутрин (ADPN) и кальций-независимая фосфолипаза А2-эпсилон (iPLA(2^), представляет собой трансмембранный белок II типа (Wilson et al. (2006), J. Lipid Res 47(9):1940-9; Jenkins et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(47):48968-75). Первоначально идентифицированный в липоцитах как мембрано-ассоциированный белок, которым богата жировая ткань, который индуцируется во время адипогенеза у мышей, в настоящее время хорошо изучен как экспрессируемый и в других тканях, включая и печень (Wilson et al, выше; Baulande et al. (2001), J. Biol. Chem. 276(36):33336-44; Moldes et al. (2006). Eur. J. Endocrinol. 155(3):461-8; Faraj et al. (2006), J. Endocrinol. 191(2):427-35; Liu et al. (2004), J. Clin. Endocrinol. Metab. 89(6):2684-9; Lake et al. (2005), J. Lipid. Res. 46(11):2477-87). В бесклеточных биохимических системах рекомбинантный белок PNPLA3 может проявлять либо активность триацилглицерол-липазы, либо трансацилирующую активность (Jenkins et al., выше; Kumari et al. (2012), Cell Metab. 15(5):691-702; He et al. (2010), J. Biol. Chem. 285(9):6706-15). В гепатоцитах PNPLA3 экспрессируется в эндоплазматическом ретикулуме и на липидных мембранах и преимущественно проявляет активность триацилглицеролгидролазы (He et al., выше; Huang et al. (2010), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(17):7892-7; Ruhanen et al. (2014), J. Lipid. Res. 55(4):739-46; Pingitore et al. (2014), Biochim. Biophys. Acta, 1841(4):574-80). Несмотря на отсутствие секреторного сигнала, данные указывают на то, что PNPLA3 секретируется и может быть выявлен в плазме крови человека в виде мультимеров, связанных дисульфидными связями (Winberg et al. (2014), Biochem. Biophys. Res. Commun, 446(4):1114-9). Соответственно, новое терапевтическое средство, целенаправленно воздействующее на функцию PNPLA3, представляет новый подход к снижению уровней PNPLA3 и лечению болезней печени, таких как неалкогольная жировая болезнь печени.Patatin-like phospholipase domain 3 (PNPLA3), previously known as adiponutrin (ADPN) and calcium-independent phospholipase A2-epsilon (iPLA(2^), is a type II transmembrane protein (Wilson et al. (2006) J. Lipid Res 47(9):1940–9; Jenkins et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(47):48968–75). Initially identified in lipocytes as a membrane-associated protein enriched in adipose tissue that is induced during adipogenesis in mice, it is now well characterized as being expressed in other tissues, including the liver (Wilson et al, supra; Baulande et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(36):33336–44; Moldes et al. (2006). Eur. J. Endocrinol. 155(3):461–8; Faraj et al. (2006), J. Endocrinol. 191(2):427–35; Liu et al. (2004), J. Clin. Endocrinol. Metab. 89(6):2684–9; Lake et al. (2005), J. Lipid. Res. 46(11):2477–87). In cell-free biochemical systems, recombinant PNPLA3 protein can exhibit either triacylglycerol lipase activity or transacylating activity (Jenkins et al., above; Kumari et al. (2012), Cell Metab. 15(5):691–702; He et al. (2010), J. Biol. Chem. 285(9):6706–15). In hepatocytes, PNPLA3 is expressed in the endoplasmic reticulum and on lipid membranes and predominantly exhibits triacylglycerol hydrolase activity (He et al., above; Huang et al. (2010), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(17):7892–7; Ruhanen et al. (2014), J. Lipid. Res. 55(4):739–46; Pingitore et al. (2014), Biochim. Biophys. Acta, 1841(4):574–80). Despite the lack of a secretory signal, data indicate that PNPLA3 is secreted and can be detected in human plasma as disulfide-linked multimers (Winberg et al. (2014) Biochem. Biophys. Res. Commun, 446(4):1114-9). Accordingly, a new therapeutic agent that specifically targets PNPLA3 function represents a new approach to reduce PNPLA3 levels and treat liver diseases such as non-alcoholic fatty liver disease.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Настоящее изобретение частично основано на конструировании и получении конструкций для RNAi, которые целенаправленно воздействуют на ген PNPLA3 и снижают экспрессию PNPLA3 в клетках печени. Ингибирование экспрессии PNPLA3 по специфической последовательности является применимым для лечения или предотвращения состояний, ассоциированных с экспрессией PNPLA3, таких как заболевания печени, такие как, например, жировой гепатоз (стеатоз), неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени (необратимое прогрессирующее рубцевание печени) или ожирение, связанное с PNPLA3. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения представлена конструкция для RNAi, содержащая смысловую нить и антисмысловую нить, где антисмысловая нить содержит участок, имеющий последовательность, которая является комплементарной последовательности мРНК PNPLA3. В определенных вариантах осуществления антисмысловая нить содержит участок, имеющий по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из антисмысловой последовательности, представленной в табл. 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления RNAi по настоящему изобретению избирательно подавляет минорные аллели PNPLA3-rs738409, PNPLA3-rs738408 и/или PNPLA3-rs738409rs738408 по сравнению с эталонным аллелем, который не содержит данных изменений.The present invention is based, in part, on the design and production of RNAi constructs that target the PNPLA3 gene and reduce PNPLA3 expression in liver cells. Inhibition of PNPLA3 expression at a specific sequence is useful for treating or preventing conditions associated with PNPLA3 expression, such as liver diseases such as, for example, fatty liver disease (steatosis), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), cirrhosis (irreversible progressive scarring of the liver), or PNPLA3-associated obesity. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides an RNAi construct comprising a sense strand and an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region having a sequence that is complementary to a PNPLA3 mRNA sequence. In certain embodiments, the antisense strand comprises a region having at least 15 contiguous nucleotides of the antisense sequence set forth in Table 1 or 2. In some embodiments, the RNAi of the present invention selectively suppresses the minor alleles of PNPLA3-rs738409, PNPLA3-rs738408 and/or PNPLA3-rs738409rs738408 compared to a reference allele that does not contain these changes.
В некоторых вариантах осуществления смысловая нить конструкций для RNAi, описанных в данном документе, содержит последовательность, которая комплементарна последовательности антисмысловой нити в достаточной степени, чтобы образовать дуплексный участок длиной от приблизительно 15 до приблизительно 30 пар оснований. В этих и других вариантах осуществления каждая смысловая иIn some embodiments, the sense strand of the RNAi constructs described herein comprises a sequence that is sufficiently complementary to the sequence of the antisense strand to form a duplex region of about 15 to about 30 base pairs in length. In these and other embodiments, each sense and
- 1 047656 антисмысловая нити имеют длину, составляющую от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат по меньшей мере один тупой конец. В других вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат по меньшей мере один нуклеотидный липкий конец. Такие нуклеотидные липкие концы могут содержать по меньшей мере от 1 до 6 неспаренных нуклеотидов и могут быть расположены на 3'-конце смысловой нити, 3'-конце антисмысловой нити или 3'-конце как смысловой, так и антисмысловой нитей. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат липкий конец из двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце смысловой нити и на 3'-конце антисмысловой нити. В других вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат липкий конец из двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце антисмысловой нити и тупой конец на 3'-конце смысловой нити/5'-конце антисмысловой нити.- 1 047 656 antisense strands have a length of from about 15 to about 30 nucleotides. In some embodiments, the RNAi constructs comprise at least one blunt end. In other embodiments, the RNAi constructs comprise at least one nucleotide overhang. Such nucleotide overhangs may comprise at least 1 to 6 unpaired nucleotides and may be located at the 3' end of the sense strand, the 3' end of the antisense strand, or the 3' end of both the sense and antisense strands. In certain embodiments, the RNAi constructs comprise an overhang of two unpaired nucleotides at the 3' end of the sense strand and at the 3' end of the antisense strand. In other embodiments, RNAi constructs comprise a sticky end of two unpaired nucleotides on the 3' end of the antisense strand and a blunt end on the 3' end of the sense strand/5' end of the antisense strand.
Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, в том числе нуклеотиды, имеющие модификации рибозного кольца, нуклеинового основания или фосфодиэфирного остова. В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат один или несколько 2'-модифицированных нуклеотидов. Такие 2'-модифицированные нуклеотиды могут включать 2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, 2'-O-метил-модифицuрованные нуклеотиды, 2'-O-метоксиэтил-модифицированные нуклеотиды, 2'-O-аллил-модифицированные нуклеотиды, бициклические нуклеиновые кислоты (BNA), гликолевые нуклеиновые кислоты (GNA), инвертированные основания (например, инвертированный аденозин) или их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления конструкции для RNAi содержат один или несколько 2'-фтормодифицированных нуклеотидов, 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления все нуклеотиды в смысловой и антисмысловой нитях конструкции для RNAi представляют собой модифицированные нуклеотиды.The RNAi constructs of the present invention may comprise one or more modified nucleotides, including nucleotides having modifications to the ribose ring, nucleobase, or phosphodiester backbone. In some embodiments, the RNAi constructs comprise one or more 2'-modified nucleotides. Such 2'-modified nucleotides may include 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, 2'-O-methoxyethyl-modified nucleotides, 2'-O-allyl-modified nucleotides, bicyclic nucleic acids (BNA), glycol nucleic acids (GNA), inverted bases (e.g., inverted adenosine), or combinations thereof. In one specific embodiment, the RNAi constructs comprise one or more 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, or combinations thereof. In some embodiments, all nucleotides in the sense and antisense strands of the RNAi construct are modified nucleotides.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат по меньшей мере одну модификацию остова, такую как модифицированную межнуклеотидную или межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi, описанные в данном документе, содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь. В конкретных вариантах осуществления фосфоротиоатные межнуклеотидные связи могут быть расположены на 3'- или 5'-концах смысловой и/или антисмысловой нитей.In some embodiments, the RNAi constructs comprise at least one backbone modification, such as a modified internucleotide or internucleoside linkage. In certain embodiments, the RNAi constructs described herein comprise at least one phosphorothioate internucleotide linkage. In particular embodiments, the phosphorothioate internucleotide linkages can be located at the 3' or 5' ends of the sense and/or antisense strands.
В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нить и/или смысловая нить конструкций для RNAi по настоящему изобретению могут содержать последовательность из антисмысловой и смысловой последовательностей, представленных в табл. 1 или 2, или состоять из нее. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi могут представлять собой любые из дуплексных соединений, перечисленных в любой из табл. 1 или 2.In some embodiments, the antisense strand and/or sense strand of the RNAi constructs of the present invention may comprise or consist of a sequence from the antisense and sense sequences set forth in Table 1 or 2. In certain embodiments, the RNAi constructs may be any of the duplex compounds listed in either Table 1 or 2.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На фиг. 1A-1D показан скрининг пяти молекул siRNA как для дозозависимого нокдауна мРНК, так и для функциональной стабильности in vivo.Figures 1A–1D show the screening of five siRNA molecules for both dose-dependent mRNA knockdown and functional stability in vivo.
На фиг. 2A-2G показан эффект молекул siRNA относительно PNPLA3 у мышей in vivo, вес печени, подтверждение экспрессии PNPLA3 у человека, содержание триглицеридов в печени, уровни TIMP1 в сыворотке крови и гистологические признаки стеатоза или воспаления.Figures 2A-2G show the effect of siRNA molecules on PNPLA3 in mice in vivo, liver weight, confirmation of human PNPLA3 expression, liver triglyceride content, serum TIMP1 levels, and histological evidence of steatosis or inflammation.
На фиг. 3A-3G показан эффект молекул siRNA относительно PNPLA3 in vivo, вес печени, подтверждение экспрессии PNPLA3 у человека, содержание триглицеридов в печени, уровни TIMP1 в сыворотке крови и гистологические признаки стеатоза или воспаления.Figures 3A-3G show the effect of siRNA molecules on PNPLA3 in vivo, liver weight, confirmation of human PNPLA3 expression, liver triglyceride content, serum TIMP1 levels, and histological evidence of steatosis or inflammation.
На фиг. 4A-4D показаны способность молекулы siRNA, специфичной к PNPLA3rs738409-rs738408, восстанавливать ассоциированные с болезнью фенотипы за счет сверхэкспрессии PNPLA3rs738409-rs738408, содержание триглицеридов в печени, уровни TIMP1 в сыворотке крови и гистологические признаки стеатоза или воспаления.Figures 4A-4D show the ability of the PNPLA3 rs738409-rs738408 specific siRNA molecule to rescue disease-associated phenotypes by overexpressing PNPLA3 rs738409-rs738408 , liver triglyceride content, serum TIMP1 levels, and histological evidence of steatosis or inflammation.
На фиг. 5A-5L показана способность молекул siRNA, специфичных к PNPLA3rs738409-rs738408, предотвращать развитие раннего фиброза.Figures 5A-5L show the ability of siRNA molecules specific for PNPLA3 rs738409-rs738408 to prevent the development of early fibrosis.
На фиг. 6A и 6B показана полная последовательность плазмиды на основе AAV, содержащей целевые последовательности минорного аллеля PNPLA3. Часть, содержащая мышиный промотор CMV, репортерный ген люциферазы светляка и целевые последовательности, подчеркнута.Figures 6A and 6B show the complete sequence of an AAV-based plasmid containing the target sequences of the minor allele of PNPLA3. The portion containing the mouse CMV promoter, firefly luciferase reporter gene, and target sequences is underlined.
На фиг. 7A и 7B показана полная последовательность плазмиды на основе AAV, содержащей целевые последовательности эталонного аллеля PNPLA3. Часть, содержащая мышиный промотор CMV, репортерный ген люциферазы светляка и целевые последовательности, подчеркнута.Figures 7A and 7B show the complete sequence of an AAV-based plasmid containing the target sequences of the PNPLA3 reference allele. The portion containing the mouse CMV promoter, firefly luciferase reporter gene, and target sequences is underlined.
На фиг. 8 показаны иллюстративные изображения мыши, которой ввели AAV, экспрессирующий целевые последовательности минорного аллеля PNPLA3 человека (верхний ряд), по сравнению с мышью, которой ввели AAV, экспрессирующий целевые последовательности эталонного аллеля PNPLA3 человека (нижний ряд). После получения исходных изображений (первый столбец) одну и ту же молекулу siRNA вводили обеим мышам (D-2878 при 3 мг/кг). Столбцы 2-5 представляют собой изображения, полученные на 1, 2, 3 и 4 неделе соответственно. Цвета на изображениях были преобразованы в оттенки серого с применением программного обеспечения Living Image®. Более светлые участки представляют собой области с низкой общей интенсивностью потока [ф/с], по сравнению с более темными участками сFigure 8 shows illustrative images of a mouse injected with AAV expressing target sequences of the human PNPLA3 minor allele (top row) compared to a mouse injected with AAV expressing target sequences of the human PNPLA3 reference allele (bottom row). After baseline images were obtained (first column), the same siRNA molecule was injected into both mice (D-2878 at 3 mg/kg). Columns 2–5 represent images acquired at weeks 1, 2, 3, and 4, respectively. Colors in the images were converted to grayscale using Living Image® software. Lighter areas represent areas of low overall flux intensity [f/s], compared to darker areas with
- 2 047656 высокой интенсивностью потока [ф/с]. Относительный процент нокдауна у мышей, обработанных с помощью siRNA в каждый момент времени еженедельно, нормализованный относительно мышей, обработанных средой-носителем, изображен во вставке (ряды 2 и 4).- 2 047656 high flux [f/s]. Relative percentage of knockdown in mice treated with siRNA at each time point weekly, normalized to vehicle-treated mice, is shown in the inset (rows 2 and 4).
На фиг. 9 показан пример молекулы siRNA, D-2419, демонстрирующий как дозозависимый, так и аллель-селективный нокдаун мРНК и функциональной эффективности in vivo.Figure 9 shows an example of an siRNA molecule, D-2419, demonstrating both dose-dependent and allele-selective mRNA knockdown and functional efficacy in vivo.
(A) Молекулу siRNA, D-2419, вводили при 3,0 и 10,0 миллиграммах на килограмм веса тела подкожно в область живота мыши.(A) The siRNA molecule, D-2419, was administered at 3.0 and 10.0 milligrams per kilogram of body weight subcutaneously into the abdomen of mice.
(B) Данные представляют собой средний относительный процент нокдауна мРНК и стандартную ошибку среднего для аллеля PNPLA3rs738409-rs738408 человека по сравнению с PNPLA3WT, установленным в контрольной группе, обработанной средой-носителем.(B) Data represent the mean relative percentage of mRNA knockdown and standard error of the mean for the human PNPLA3 rs738409-rs738408 allele compared to PNPLA3 WT , determined in the vehicle-treated control group.
(C) Ткани печени, выделенные из группы, получавшей лечение в течение двух недель, подвергали обработке для определения содержания триглицеридов с целью оценки функциональной эффективности.(C) Liver tissues isolated from the two-week treatment group were processed for triglyceride content to assess functional efficacy.
(D) Для контроля эффективной GalNAc-опосредованной доставки siRNA D-2787, siRNA, перекрестно реагирующую с HPRT и Hprt человека и мыши соответственно, доставляли при 10 мг/кг и ткани печени собирали через две недели. Данные представляют собой копии мРНК HPRT и мРНК Hprt у мышей, обработанных с помощью D-2787 (N=4), по сравнению с мышами, обработанными средойносителем (N=5).(D) To control for efficient GalNAc-mediated delivery of D-2787 siRNA, siRNA cross-reacting with human and mouse HPRT and Hprt, respectively, was delivered at 10 mg/kg and liver tissues were harvested two weeks later. Data represent HPRT mRNA and Hprt mRNA copies in D-2787-treated mice (N=4) compared to vehicle-treated mice (N=5).
(E) Данные представляют собой средний относительный процент нокдауна мРНК и стандартную ошибку среднего для мРНК HPRT человека и Hprt мыши соответственно, установленные для контрольной группы, обработанной средой-носителем; все данные нормализованы относительно TBP человека.(E) Data represent the mean relative percentage of mRNA knockdown and standard error of the mean for human HPRT and mouse Hprt mRNA, respectively, determined from the vehicle-treated control group; all data are normalized to human TBP.
(F) Для подтверждения экспрессии рецептора GalNAc на гепатоцитах мышей PXB® уровни мРНК Asgr1 мыши и мРНК ASGR1 человека оценивали в отсутствие и в присутствии D-2419.(F) To confirm GalNAc receptor expression on PXB® mouse hepatocytes, mouse Asgr1 mRNA and human ASGR1 mRNA levels were assessed in the absence and presence of D-2419.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
Настоящее изобретение направлено на композиции и способы регуляции экспрессии гена, кодирующего белок 3, содержащий пататин-подобный фосфолипазный домен (PNPLA3). В некоторых вариантах осуществления ген может находиться внутри клетки или субъекта, такого как млекопитающее (например, человека). В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат конструкции для RNAi, которые целенаправленно воздействуют на мРНК PNPLA3 и снижают экспрессию PNPLA3 в клетке или млекопитающем. Такие конструкции для RNAi являются применимыми для лечения или предотвращения разных форм заболеваний печени, таких как, например, жировой гепатоз (стеатоз), неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени (необратимое прогрессирующее рубцевание печени) или ожирение, связанное с PNPLA3.The present invention is directed to compositions and methods for regulating the expression of a gene encoding patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3). In some embodiments, the gene may be within a cell or subject, such as a mammal (e.g., a human). In some embodiments, the compositions of the present invention comprise RNAi constructs that target PNPLA3 mRNA and reduce PNPLA3 expression in a cell or mammal. Such RNAi constructs are useful for treating or preventing various forms of liver disease, such as, for example, fatty liver disease (steatosis), nonalcoholic steatohepatitis (NASH), liver cirrhosis (irreversible progressive scarring of the liver), or PNPLA3-associated obesity.
В 2008 году полногеномные исследования ассоциаций (GWAS), направленные на поиск несинонимичных вариаций последовательности или однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с NAFLD, идентифицировали вариант PNPLA3, (rs738409[G], кодирующий I148M; который обозначают как PNPLA3-rs738409, PNPLA3-ma или минорный аллель PNPLA3), который достоверно ассоциирован с содержанием жира в печени. После этого первичного отчета последующие GWAS подтвердили PNPLA3-rs738409 в качестве основной генетической детерминанты NAFLD, достоверно ассоциированной с 1) повышенными уровнями сывороточного биомаркера повреждения печени, аланинаминотрансферазы (ALT), 2) заболеваемостью, прогрессированием и тяжестью NAFLD, 3) выявляемой как у страдающих ожирением, так и у худых индивидуумов, и 4) с единственным известным SNP, который, как было установлено, достоверно ассоциирован со всеми стадиями NAFLD: стеатозом, NASH, циррозом и гепатоклеточной карциномой. Консенсус среди многочисленных GWAS указывает на то, что ассоциация PNPLA3 rs738409 с NAFLD является независимой от возраста, пола, этнической принадлежности, метаболического синдрома, индекса веса тела, инсулинорезистентности и липидов сыворотки крови. Кроме того, согласно статистическим анализам нескольких источников, примерно 50% пациентов с NAFLD являются носителями мутации PNPLA3 rs738409. Пациенты могут быть носителями гомозиготной или гетерозиготной мутации PNPLA3 rs738409. Кроме того, было обнаружено, что пациенты, имеющие мутацию PNPLA3 rs738409, также часто являются носителями мутации, отстоящей на три пары оснований от rs738408 (Tian et al. (2010), Nature Genetics, 42:21-23). Таким образом, пациент может иметь минорный аллель PNPLA3-rs738409, минорный аллель PNPLA3-rs738408 или мутацию в двух минорных аллелях (PNPLA3-dma) PNPLA3-rs738409-rs738408.In 2008, genome-wide association studies (GWAS) looking for nonsynonymous sequence variations, or single nucleotide polymorphisms (SNPs), associated with NAFLD identified a PNPLA3 variant (rs738409[G], encoding I148M; referred to as PNPLA3-rs738409, PNPLA3-ma, or the minor allele of PNPLA3) that was significantly associated with liver fat content. Following this initial report, subsequent GWAS confirmed PNPLA3-rs738409 as a major genetic determinant of NAFLD, significantly associated with 1) elevated levels of the serum liver injury biomarker alanine aminotransferase (ALT), 2) the incidence, progression, and severity of NAFLD, 3) detectable in both obese and lean individuals, and 4) with the only known SNP found to be significantly associated with all stages of NAFLD: steatosis, NASH, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Consensus among multiple GWAS indicates that the association of PNPLA3 rs738409 with NAFLD is independent of age, sex, ethnicity, metabolic syndrome, body mass index, insulin resistance, and serum lipids. In addition, according to statistical analyses from several sources, approximately 50% of patients with NAFLD are carriers of the PNPLA3 rs738409 mutation. Patients can be carriers of either homozygous or heterozygous PNPLA3 rs738409 mutation. Furthermore, it has been found that patients carrying the PNPLA3 rs738409 mutation also frequently carry a mutation three base pairs away from rs738408 (Tian et al. (2010) Nature Genetics, 42:21-23). Thus, a patient can have a minor allele of PNPLA3-rs738409, a minor allele of PNPLA3-rs738408, or a mutation in two minor alleles (PNPLA3-dma) of PNPLA3-rs738409-rs738408.
Исследователи разработали мышиные модели для изучения функции PNPLA3 in vivo. На сегодняшний день не было выявлено детектируемого метаболического фенотипа, связанного с дефицитом Pnpla3 или сверхэкспрессией Pnpla3. И напротив, экспрессия Pnpla3I148M как у трансгенных мышей, так и у мышей с соответствующим нокином вызывала повышение уровня печеночных триглицеридов, подобное наблюдаемому при NAFLD. Таким образом, в совокупности данные, полученные на мышиной модели in vivo, указывают на экспрессию мутантной формы белка Pnpla3I148M, а не на сверхэкспрессию белка дикого типа в качестве фактора, способствующего развитию фенотипа заболевания. Эти наблюдения, помимо высокой частоты минорных аллелей у индивидуумов, страдающих NAFLD, и преобладающей связи с заболеванием, подчеркивают значение PNPLA3-rs738409 в качестве основной терапевтической мишени при NAFLD.The researchers developed mouse models to study PNPLA3 function in vivo. To date, no detectable metabolic phenotype has been identified associated with Pnpla3 deficiency or Pnpla3 overexpression. In contrast, Pnpla3 I148M expression in both transgenic and knockin mice resulted in elevated hepatic triglyceride levels similar to that observed in NAFLD. Thus, taken together, the in vivo mouse model data implicate expression of the mutant form of the Pnpla3 I148M protein, rather than overexpression of the wild-type protein, as a contributing factor to the disease phenotype. These observations, in addition to the high frequency of minor alleles in individuals with NAFLD and the predominant association with the disease, highlight the importance of PNPLA3-rs738409 as a major therapeutic target in NAFLD.
- 3 047656- 3 047656
РНК-интерференция (RNAi) представляет собой процесс введения экзогенной РНК в клетку, который приводит к специфической деградации мРНК, кодирующей целевой белок, с последующим снижением экспрессии белка. Достижения как в области технологии RNAi, так и в области доставки в печень, а также растущие положительные результаты применения средств терапии на основе RNAi, предполагают, что RNAi представляет собой убедительное средство терапевтического воздействия на NAFLD путем прямого целенаправленного воздействия на PNPLA3I148M. Многочисленные GWAS указывают на наличие дозозависимого эффекта PNPLA3 rs738409 в отношении заболеваемости, прогрессирования и тяжести течения NAFLD (GWAS); наблюдалась тенденция к удвоению, если не большему увеличению, отношения шансов для носителей гомозиготного генотипа по сравнению с носителями гетерозиготного генотипа, но при этом отношение шансов было по меньшей мере в два раза больше для индивидуумов с гетерозиготным генотипом по сравнению с индивидуумами с аллелем дикого типа. Таким образом, сайленсинг PNPLA3, использующий специфичность распознавания аллелей, может быть как потенциальным средством для снижения уровней печеночных триглицеридов у носителей PNPLA3I148M, так и представлять вариант, при котором гетерозиготные носители могут получить пользу без сайленсинга аллеля дикого типа. В соответствии с этим авторы настоящего изобретения определили короткие интерферирующие РНК (siRNA), специфичные к SNP PNPLA3I148M, и продемонстрировали доказательство концепции in vitro. Используя обе линии клеток гепатомы, Hep3B (гомозиготную по эталонному аллелю, PNPLA3I148I) и HEPG2 (гомозиготную по минорному аллелю, PNPLA3I148M), авторы настоящего изобретения идентифицировали последовательности siRNA, способные специфично подавлять экспрессию гена PNPLA3I148M. Ингибиторный эффект данных последовательностей был подтвержден скринингом на клетках яичника китайского хомячка (CHO) со сверхэкспрессией PNPLA3I148I либо PNPLA3I148M. Используя адено-ассоциированный вирус (AAV) для достижения сверхэкспрессии in vivo PNPLA3I148M человека, авторы настоящего изобретения затем показали, что обработка минорными аллельспецифическими SNP не только вызывала специфическое снижение экспрессии PNPLA3I148M человека у мышей, но также в значительной степени обращала вспять накопление печеночных триглицеридов, вызванное сверхэкспрессией PNPLA3I148M человека.RNA interference (RNAi) is the process of introducing exogenous RNA into a cell, which results in specific degradation of the mRNA encoding the target protein, followed by downregulation of the protein expression. Advances in both RNAi technology and liver delivery, as well as the increasing positive results with RNAi-based therapeutics, suggest that RNAi represents a compelling therapeutic option for targeting NAFLD by directly targeting PNPLA3I148M. Multiple GWAS indicate a dose-response effect of PNPLA3 rs738409 on NAFLD incidence, progression, and severity (GWAS); a trend toward a doubling, if not greater, increase in the odds ratio was observed for carriers of the homozygous genotype compared to carriers of the heterozygous genotype, but the odds ratio was at least twice as great for individuals with the heterozygous genotype compared to individuals with the wild-type allele. Thus, silencing of PNPLA3 using allele recognition specificity may both be a potential means of reducing hepatic triglyceride levels in PNPLA3I148M carriers and represent an option in which heterozygous carriers can benefit without silencing the wild-type allele. Accordingly, the present inventors identified short interfering RNAs (siRNAs) specific for the PNPLA3I148M SNP and demonstrated proof of concept in vitro. Using both hepatoma cell lines, Hep3B (homozygous for the reference allele, PNPLA3I148I) and HEPG2 (homozygous for the minor allele, PNPLA3I148M), we identified siRNA sequences capable of specifically suppressing the expression of the PNPLA3I148M gene. The inhibitory effect of these sequences was confirmed by screening in Chinese hamster ovary (CHO) cells overexpressing either PNPLA3I148I or PNPLA3I148M. Using adeno-associated virus (AAV) to achieve in vivo overexpression of human PNPLA3I148M, the present inventors then showed that treatment with minor allele-specific SNPs not only caused a specific reduction in human PNPLA3I148M expression in mice, but also significantly reversed the accumulation of hepatic triglycerides induced by human PNPLA3I148M overexpression.
Используемый в данном документе термин конструкция для RNAi относится к средству, содержащему молекулу РНК, которая при введении в клетку способна снижать экспрессию целевого гена (например, PNPLA3) посредством механизма РНК-интерференции. РНК-интерференция представляет собой процесс, посредством которого молекула нуклеиновой кислоты вызывает расщепление и деградацию молекулы целевой РНК (например, матричной РНК или мРНК) специфичным для последовательности образом, например через путь РНК-индуцированного комплекса сайленсинга (RISC). В некоторых вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит молекулу двухнитевой РНК, содержащую две антипараллельные нити из смежных нуклеотидов, которые достаточно комплементарны друг другу, чтобы гибридизоваться с образованием дуплексного участка. Термины гибридизовать или гибридизация относятся к спариванию комплементарных полинуклеотидов, обычно с помощью водородных связей (например, связей Уотсона-Крика, Хугстина или обратной водородной связи Хугстина) между комплементарными основаниями в двух полинуклеотидах. Нить, содержащую участок, имеющий последовательность, которая по сути комплементарна целевой последовательности (например, целевой мРНК), называют антисмысловой нитью.As used herein, the term "RNAi construct" refers to an agent comprising an RNA molecule that, when introduced into a cell, is capable of reducing the expression of a target gene (e.g., PNPLA3) via an RNA interference mechanism. RNA interference is a process by which a nucleic acid molecule causes the cleavage and degradation of a target RNA molecule (e.g., messenger RNA or mRNA) in a sequence-specific manner, such as via the RNA-induced silencing complex (RISC) pathway. In some embodiments, an RNAi construct comprises a double-stranded RNA molecule comprising two antiparallel strands of adjacent nucleotides that are sufficiently complementary to each other to hybridize to form a duplex region. The terms hybridize or hybridization refer to the pairing of complementary polynucleotides, usually via hydrogen bonds (e.g., Watson-Crick, Hoogsteen, or reverse Hoogsteen hydrogen bonds) between complementary bases in the two polynucleotides. The strand containing the region having a sequence that is essentially complementary to the target sequence (e.g., the target mRNA) is called the antisense strand.
Термин смысловая нить относится к нити, которая включает участок, который по сути комплементарен участку антисмысловой нити. В некоторых вариантах осуществления смысловая нить может содержать участок, имеющий последовательность, которая по сути идентична целевой последовательности.The term sense strand refers to a strand that includes a region that is substantially complementary to a region of the antisense strand. In some embodiments, the sense strand may include a region that has a sequence that is substantially identical to a target sequence.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлено средство для RNAi, направленное на PNPLA3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено средство для RNAi, которое связывается с сайтом rs738409 PNPLA3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено средство для RNAi, которое связывается с сайтом rs738408 PNPLA3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретение представлено средство для RNAi, которое связывается как с сайтом rs738409, так и с сайтом rs738408 PNPLA3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено средство для RNAi, которое предпочтительно связывается с rs738409 PNPLA3, а не с нативной последовательностью PNPLA3 (PNPLA3-ref). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено средство для RNAi, которое предпочтительно связывается с rs738408 PNPLA3, а не с последовательностью PNPLA3-ref. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлено средство для RNAi, которое предпочтительно связывается с PNPLA3-dma, а не с PNPLA3-ma. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представлена молекула для RNAi, которая содержит любую из последовательностей, перечисленных в табл. 1 или 2.In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that targets PNPLA3. In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that binds to the rs738409 site of PNPLA3. In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that binds to the rs738408 site of PNPLA3. In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that binds to both the rs738409 site and the rs738408 site of PNPLA3. In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that preferentially binds to rs738409 of PNPLA3 over the native sequence of PNPLA3 (PNPLA3-ref). In some embodiments, the invention provides an RNAi agent that preferentially binds to rs738408 of PNPLA3 over the PNPLA3-ref sequence. In some embodiments, the present invention provides an RNAi agent that preferentially binds to PNPLA3-dma over PNPLA3-ma. In some embodiments, the present invention provides an RNAi molecule that comprises any of the sequences listed in Table 1 or 2.
Молекула двухнитевой РНК может включать химические модификации рибонуклеотидов, в том числе модификации компонентов рибонуклеотидов, представляющих собой рибозный сахар, основание или остов, таких как те, которые описаны в данном документе или известны из уровня техники. Любые такие модификации, которые используются в двухнитевой молекуле РНК (например, siRNA, shRNA илиThe double-stranded RNA molecule may include chemical modifications of the ribonucleotides, including modifications of the ribose sugar, base, or backbone components of the ribonucleotides, such as those described herein or known in the art. Any such modifications that are used in a double-stranded RNA molecule (e.g., siRNA, shRNA, or
- 4 047656 им подобные), охватываются термином двухнитевая РНК в целях настоящего изобретения.- 4 047656 and the like), are encompassed by the term double-stranded RNA for the purposes of the present invention.
Согласно терминологии, используемой в данном документе, первая последовательность комплементарна второй последовательности, если полинуклеотид, содержащий первую последовательность, может гибридизоваться с полинуклеотидом, содержащим вторую последовательность, с образованием дуплексного участка при определенных условиях, таких как физиологические условия. Другие такие условия могут включать умеренные или жесткие условия гибридизации, которые известны специалистам в данной области. Первая последовательность считается полностью комплементарной (комплементарной на 100%) второй последовательности, если полинуклеотид, содержащий первую последовательность оснований, соединяется с полинуклеотидом, содержащим вторую последовательность, по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей без каких-либо ошибочно спаренных оснований. Последовательность является по сути комплементарной целевой последовательности, если эта последовательность по меньшей мере приблизительно на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% комплементарна целевой последовательности. Процент комплементарности может быть рассчитан путем деления числа оснований в первой последовательности, которые являются комплементарными основаниям в соответствующих положениях во второй или целевой последовательности, на общую длину первой последовательности. Можно также сказать, что последовательность является по сути комплементарной другой последовательности, когда при гибридизации этих двух последовательностей встречается не более 5, 4, 3, 2 или 1 ошибочно спаренных по дуплексному участку из 30 пар оснований. Как правило, если присутствуют какие-либо нуклеотидные липкие концы, как это указано в данном документе, последовательность таких липких концов не учитывается при определении степени комплементарности между двумя последовательностями. Например, смысловая нить длиной 21 нуклеотид и антисмысловая нить длиной 21 нуклеотид, которые гибридизуются с образованием дуплексного участка из 19 пар оснований с 2 нуклеотидными липкими концами на 3'-конце каждой нити, будут считаться полностью комплементарными в соответствии с термином, используемым в данном документе.According to the terminology used herein, a first sequence is complementary to a second sequence if a polynucleotide comprising the first sequence can hybridize to a polynucleotide comprising the second sequence to form a duplex region under certain conditions, such as physiological conditions. Other such conditions may include moderate or stringent hybridization conditions, which are known to those skilled in the art. A first sequence is considered to be fully complementary (100% complementary) to a second sequence if a polynucleotide comprising the first base sequence binds to a polynucleotide comprising the second sequence along the entire length of one or both nucleotide sequences without any mismatched bases. A sequence is substantially complementary to a target sequence if the sequence is at least about 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% complementary to the target sequence. The percentage of complementarity may be calculated by dividing the number of bases in the first sequence that are complementary to bases at corresponding positions in the second or target sequence by the total length of the first sequence. A sequence may also be said to be substantially complementary to another sequence when the two sequences hybridize to form no more than 5, 4, 3, 2, or 1 mismatch within a 30 base pair duplex region. Generally, if any nucleotide overhangs are present as defined herein, the sequence of such overhangs is not taken into account in determining the degree of complementarity between two sequences. For example, a 21 nucleotide long sense strand and a 21 nucleotide long antisense strand that hybridize to form a 19 base pair duplex region with 2 nucleotide overhangs at the 3' end of each strand would be considered to be fully complementary within the meaning of the term as used herein.
В некоторых вариантах осуществления участок антисмысловой нити содержит последовательность, которая полностью комплементарна участку целевой последовательности РНК (например, мРНК PNPLA3). В таких вариантах осуществления смысловая нить может содержать последовательность, которая полностью комплементарна последовательности антисмысловой нити. В других таких вариантах осуществления смысловая нить может содержать последовательность, которая по сути комплементарна последовательности антисмысловой нити, например имея 1, 2, 3, 4 или 5 ошибочно спаренных оснований в дуплексном участке, образованном смысловой и антисмысловой нитями. В определенных вариантах осуществления предпочтительно, чтобы любые ошибочно спаренные основания находились в концевых участках (например, в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидов от 5'- и/или 3'-концов нитей). В одном варианте осуществления любые ошибочно спаренные основания в дуплексном участке, образованном из смысловой и антисмысловой нитей, находятся в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидов от 5'-конца антисмысловой нити.In some embodiments, a region of the antisense strand comprises a sequence that is completely complementary to a region of a target RNA sequence (e.g., PNPLA3 mRNA). In such embodiments, the sense strand may comprise a sequence that is completely complementary to a sequence of the antisense strand. In other such embodiments, the sense strand may comprise a sequence that is substantially complementary to a sequence of the antisense strand, such as having 1, 2, 3, 4, or 5 mismatches in a duplex region formed by the sense and antisense strands. In certain embodiments, it is preferred that any mismatches be in terminal regions (e.g., within 6, 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotides of the 5' and/or 3' ends of the strands). In one embodiment, any mismatched bases in a duplex region formed from the sense and antisense strands are within 6, 5, 4, 3, 2, or 1 nucleotides of the 5' end of the antisense strand.
В определенных вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить двухнитевой РНК могут представлять собой две отдельные молекулы, которые гибридизуются с образованием дуплексного участка, но в остальном не связаны. Такие двухнитевые молекулы РНК, образованные двумя отдельными нитями, называют малыми интерферирующими РНК или короткими интерферирующими РНК (siRNA). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению содержат siRNA.In certain embodiments, the sense strand and the antisense strand of a double-stranded RNA may be two separate molecules that hybridize to form a duplex region but are otherwise unrelated. Such double-stranded RNA molecules formed by two separate strands are called small interfering RNAs or short interfering RNAs (siRNAs). Thus, in some embodiments, the RNAi constructs of the present invention comprise siRNA.
Если две по сути комплементарные нити dsRNA образованы отдельными молекулами РНК, эти молекулы не должны, но могут быть ковалентно связаны. Там, где две нити ковалентно соединены иным способом, чем образование непрерывной цепи нуклеотидов между 3'-концом одной нити и 5'-концом соответствующей другой нити, образующей дуплексную структуру, соединяющую структуру называют линкер. Нити РНК могут иметь одинаковое или разное количество нуклеотидов. Максимальное количество пар оснований в дуплексе равно числу нуклеотидов в самой короткой нити dsRNA за вычетом любых липких концов, которые присутствуют в дуплексе. В дополнение к дуплексной структуре RNAi могут содержать один или несколько нуклеотидных липких концов.If two essentially complementary strands of dsRNA are formed by separate RNA molecules, the molecules need not be, but may be, covalently linked. Where two strands are covalently joined by other means than by forming a continuous chain of nucleotides between the 3' end of one strand and the 5' end of the corresponding other strand, forming a duplex structure, the connecting structure is called a linker. The RNA strands may have the same or different numbers of nucleotides. The maximum number of base pairs in a duplex is equal to the number of nucleotides in the shortest strand of dsRNA minus any overhangs that are present in the duplex. In addition to the duplex structure, RNAi may contain one or more nucleotide overhangs.
В других вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить, которые гибридизуются с образованием дуплексного участка, могут быть частью одной молекулы РНК, т.е. смысловые и антисмысловые нити могут быть частью самокомплементарного участка одиночной молекулы РНК. В таких случаях одиночная молекула РНК содержит дуплексный участок (также называемый как участок стебля) и участок петли. 3'-конец смысловой нити соединяется с 5'-концом антисмысловой нити непрерывной последовательностью неспаренных нуклеотидов, которые будут образовывать участок петли. Участок петли обычно имеет длину, достаточную для того, чтобы молекула РНК могла свернуться обратно так, чтобы антисмысловая нить могла образовывать пару со смысловой нитью, образуя дуплекс или участок стебля. Участок петли может содержать от приблизительно 3 до приблизительно 25, от приблизительно 5 до приблизительно 15 или от приблизительно 8 до приблизительно 12 неспаренных нуклеотидов. Такие молекулы РНК по меньшей мере частично с самокомплементарными участками обозначают как короткие шпильковые РНК (shRNA). В некоторых вариантах осуществления участок петли может содержатьIn other embodiments, the sense strand and the antisense strand that hybridize to form a duplex region may be part of a single RNA molecule, i.e., the sense and antisense strands may be part of a self-complementary region of a single RNA molecule. In such cases, the single RNA molecule comprises a duplex region (also referred to as a stem region) and a loop region. The 3' end of the sense strand is connected to the 5' end of the antisense strand by a continuous sequence of unpaired nucleotides that will form a loop region. The loop region is typically long enough to allow the RNA molecule to fold back so that the antisense strand can pair with the sense strand to form a duplex or stem region. The loop region may comprise from about 3 to about 25, from about 5 to about 15, or from about 8 to about 12 unpaired nucleotides. Such RNA molecules with at least partially self-complementary regions are referred to as short hairpin RNAs (shRNAs). In some embodiments, the loop region may comprise
- 5 047656 по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 или 25 неспаренных нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления участок петли может содержать 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или меньше неспаренных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению содержат shRNA. Длина одной по меньшей мере частично самокомплементарной молекулы РНК может составлять от приблизительно 35 до приблизительно 100 нуклеотидов, от приблизительно 45 до приблизительно 85 нуклеотидов или от приблизительно 50 до приблизительно 60 нуклеотидов и содержать дуплексный участок и участок петли, каждый из которых имеет длину, указанную в данном документе.- 5,047,656 at least 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, or 25 unpaired nucleotides. In some embodiments, the loop region may comprise 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or less unpaired nucleotides. In certain embodiments, the RNAi constructs of the present invention comprise shRNA. The length of one at least partially self-complementary RNA molecule may be from about 35 to about 100 nucleotides, from about 45 to about 85 nucleotides, or from about 50 to about 60 nucleotides and comprise a duplex region and a loop region, each of which has a length as specified herein.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению содержат смысловую нить и антисмысловую нить, где антисмысловая нить содержит участок, имеющий последовательность, которая по сути или полностью комплементарна последовательности матричной РНК (мРНК) PNPLA3. Используемый в данном документе термин последовательность мРНК PNPLA3 относится к любой последовательности матричной РНК, включая сплайс-варианты, кодирующие белок PNPLA3, включая варианты белка PNPLA3 или изоформы любых видов (например, мыши, крысы, нечеловекообразного примата, человека). Белок PNPLA 3 также известен как адипонутрин (ADPN) и кальций-независимая фосфолипаза А2-эпсилон (iPLA(2^)).In some embodiments, the RNAi constructs of the present invention comprise a sense strand and an antisense strand, wherein the antisense strand comprises a region having a sequence that is substantially or completely complementary to a PNPLA3 messenger RNA (mRNA) sequence. As used herein, the term PNPLA3 mRNA sequence refers to any messenger RNA sequence, including splice variants, encoding a PNPLA3 protein, including PNPLA3 protein variants or isoforms from any species (e.g., mouse, rat, non-human primate, human). PNPLA 3 protein is also known as adiponutrin (ADPN) and calcium-independent phospholipase A2-epsilon (iPLA(2^)).
Последовательность мРНК PNPLA3 также включает последовательность транскрипта, экспрессируемого в виде последовательности комплементарной ДНК (кДНК). Термин последовательность кДНК относится к последовательности транскрипта мРНК, экспрессируемой в виде оснований ДНК (например, гуанина, аденина, тимина и цитозина), но не оснований РНК (например, гуанина, аденина, урацила и цитозина). Таким образом, антисмысловая нить конструкции для RNAi по настоящему изобретению может содержать участок, имеющий последовательность, которая по сути или полностью комплементарна последовательности мРНК PNPLA3 или последовательности кДНК PNPLA3. мРНК PNPLA3 или последовательность кДНК может включать без ограничения любую мРНК PNPLA3 или последовательность кДНК, такую как те, которые могут быть получены из эталонной последовательности NCBI NM_025225.2.The PNPLA3 mRNA sequence also includes the sequence of the transcript expressed as a complementary DNA (cDNA) sequence. The term cDNA sequence refers to the sequence of the mRNA transcript expressed as DNA bases (e.g., guanine, adenine, thymine, and cytosine), but not RNA bases (e.g., guanine, adenine, uracil, and cytosine). Thus, the antisense strand of the RNAi construct of the present invention may comprise a region having a sequence that is substantially or completely complementary to the PNPLA3 mRNA sequence or the PNPLA3 cDNA sequence. The PNPLA3 mRNA or cDNA sequence may include, but is not limited to, any PNPLA3 mRNA or cDNA sequence, such as those that can be obtained from the NCBI reference sequence NM_025225.2.
Участок антисмысловой нити может быть по сути комплементарен или полностью комплементарен по меньшей мере 15 последовательным нуклеотидам из последовательности мРНК PNPLA3. В некоторых вариантах осуществления целевой участок последовательности мРНК PNPLA3, антисмысловая нить которого содержит комплементарный участок, может составлять от приблизительно 15 до приблизительно 30 последовательных нуклеотидов, от приблизительно 16 до приблизительно 28 последовательных нуклеотидов, от приблизительно 18 до приблизительно 26 последовательных нуклеотидов, от приблизительно 17 до приблизительно 24 последовательных нуклеотидов, от приблизительно 19 до приблизительно 25 последовательных нуклеотидов, от приблизительно 19 до приблизительно 23 последовательных нуклеотидов или от приблизительно 19 до приблизительно 21 последовательных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления участок антисмысловой нити, содержащий последовательность, которая по сути или полностью комплементарна последовательности мРНК PNPLA3, в некоторых вариантах осуществления может содержать по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из антисмысловой последовательности, представленной в табл. 1 или 2. В других вариантах осуществления антисмысловая последовательность содержит по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из антисмысловой последовательности, представленной в табл. 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления смысловая и/или антисмысловая последовательность содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов из последовательности, представленной в табл. 1 или 2, не более чем с 1, 2 или 3 ошибочно спаренными нуклеотидами.The region of the antisense strand may be substantially complementary or fully complementary to at least 15 consecutive nucleotides of the PNPLA3 mRNA sequence. In some embodiments, the target region of the PNPLA3 mRNA sequence whose antisense strand comprises the complementary region may be from about 15 to about 30 consecutive nucleotides, from about 16 to about 28 consecutive nucleotides, from about 18 to about 26 consecutive nucleotides, from about 17 to about 24 consecutive nucleotides, from about 19 to about 25 consecutive nucleotides, from about 19 to about 23 consecutive nucleotides, or from about 19 to about 21 consecutive nucleotides. In certain embodiments, the portion of the antisense strand comprising a sequence that is substantially or completely complementary to a sequence of the PNPLA3 mRNA may, in some embodiments, comprise at least 15 contiguous nucleotides of the antisense sequence shown in Table 1 or 2. In other embodiments, the antisense sequence comprises at least 16, at least 17, at least 18, or at least 19 contiguous nucleotides of the antisense sequence shown in Table 1 or 2. In some embodiments, the sense and/or antisense sequence comprises at least 15 nucleotides of the sequence shown in Table 1 or 2, with no more than 1, 2, or 3 mismatched nucleotides.
Смысловая нить конструкции для RNAi обычно содержит последовательность, которая настолько комплементарна последовательности антисмысловой нити, что две нити гибридизуются в физиологических условиях с образованием дуплексного участка.The sense strand of an RNAi construct typically contains a sequence that is so complementary to the sequence of the antisense strand that the two strands hybridize under physiological conditions to form a duplex region.
Термин дуплексный участок относится к участку в двух комплементарных или по сути комплементарных полинуклеотидах, которые образуют пары оснований друг с другом либо путем спаривания оснований по Уотсону-Крику, либо посредством другого взаимодействия водородных связей, создавая дуплекс между двумя полинуклеотидами. Дуплексный участок конструкции для RNAi должен быть достаточной длины, чтобы позволить конструкции для RNAi встраиваться в механизм РНК-интерференции, например, путем взаимодействия с ферментом Dicer и/или комплексом RISC. Например, в некоторых вариантах осуществления дуплексный участок имеет длину от приблизительно 15 до приблизительно 30 пар оснований. Другие значения длины дуплексного участка в данном диапазоне также являются подходящими, такие как от приблизительно 15 до приблизительно 28 пар оснований, от приблизительно 15 до приблизительно 26 пар оснований, от приблизительно 15 до приблизительно 24 пар оснований, от приблизительно 15 до приблизительно 22 пар оснований, от приблизительно 17 до приблизительно 28 пар оснований, от приблизительно 17 до приблизительно 26 пар оснований, от приблизительно 17 до приблизительно 24 пар оснований, от приблизительно 17 до приблизительно 23 пар оснований, от приблизительно 17 до приблизительно 21 пары оснований, от приблизительно 19 до приблизительно 25 пар оснований, от приблизительно 19 до приблизительно 23 пар оснований илиThe term "duplex region" refers to a region in two complementary or substantially complementary polynucleotides that base pair with each other either by Watson-Crick base pairing or other hydrogen bonding interactions, creating a duplex between the two polynucleotides. The duplex region of an RNAi construct should be of sufficient length to allow the RNAi construct to integrate into the RNA interference machinery, such as by interacting with the Dicer enzyme and/or the RISC complex. For example, in some embodiments, the duplex region is from about 15 to about 30 base pairs in length. Other values of the length of the duplex region within this range are also suitable, such as from about 15 to about 28 base pairs, from about 15 to about 26 base pairs, from about 15 to about 24 base pairs, from about 15 to about 22 base pairs, from about 17 to about 28 base pairs, from about 17 to about 26 base pairs, from about 17 to about 24 base pairs, from about 17 to about 23 base pairs, from about 17 to about 21 base pairs, from about 19 to about 25 base pairs, from about 19 to about 23 base pairs or
- 6 047656 от приблизительно 19 до приблизительно 21 пары оснований. В одном варианте осуществления дуплексный участок имеет длину от приблизительно 17 до приблизительно 24 пар оснований. В другом варианте осуществления дуплексный участок имеет длину от приблизительно 19 до приблизительно 21 пары оснований.- 6,047,656 from about 19 to about 21 base pairs. In one embodiment, the duplex region is from about 17 to about 24 base pairs in length. In another embodiment, the duplex region is from about 19 to about 21 base pairs in length.
В некоторых вариантах осуществления средство для RNAi по настоящему изобретению содержит дуплексный участок от приблизительно 24 до приблизительно 30 нуклеотидов, который взаимодействует с целевой последовательностью РНК, например целевой последовательностью мРНК PNPLA3, чтобы направлять расщепление целевой РНК. Не ограничиваясь теорией, авторы настоящего изобретения напоминают, что длинная двухнитевая РНК, вводимая в клетки, может быть разрезана до siRNA посредством эндонуклеазы III типа, известной как Dicer (Sharp et al. (2001), Genes Dev. 15:485). Dicer, фермент, подобный рибонуклеазе III, 15 осуществляет процессинг dsRNA с образованием коротких интерферирующих РНК длиной 19-23 пар оснований с характерными 3'-липкими концами длиной в два основания (Bernstein, et al., (2001), Nature, 409:363). Затем siRNA встраиваются в состав комплекса сайленсинга, индуцированного РНК (RISC), в котором одна или несколько хеликаз расплетают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити направлять распознавание мишени (Nykanen, et al., (2001), Cell, 107:309). При связывании с соответствующей целевой 20 мРНК одна или несколько эндонуклеаз в составе комплекса RISC расщепляют мишень с индуцированием сайленсинга (Elbashir, et al., (2001), Genes Dev. 15:188).In some embodiments, the RNAi agent of the present invention comprises a duplex region of about 24 to about 30 nucleotides that interacts with a target RNA sequence, such as a target sequence of PNPLA3 mRNA, to direct cleavage of the target RNA. Without being limited by theory, the present inventors recall that long double-stranded RNA introduced into cells can be cleaved into siRNA by a type III endonuclease known as Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, a ribonuclease III-like enzyme, 15 processes dsRNA to form short interfering RNAs of 19-23 bp in length with characteristic two-base 3' overhangs (Bernstein, et al., (2001) Nature, 409:363). The siRNAs are then incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC), in which one or more helicases unwind the siRNA duplex, allowing the complementary antisense strand to direct target recognition (Nykanen, et al., (2001), Cell, 107:309). Upon binding to the appropriate target mRNA, one or more endonucleases in the RISC complex cleave the target, inducing silencing (Elbashir, et al., (2001), Genes Dev. 15:188).
Для тех вариантов осуществления, в которых смысловая нить и антисмысловая нить являются двумя отдельными молекулами (например, в том случае, когда конструкция для RNAi содержит siRNA), смысловая нить и антисмысловая нить не должны быть такой же длины, как длина дуплексного участка. Например, одна или обе нити могут быть длиннее дуплексного участка и содержать один или несколько неспаренных нуклеотидов или ошибочно спаренных нуклеотидов, фланкирующих дуплексный участок. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит по меньшей мере один нуклеотидный липкий конец. Используемый в данном документе термин нуклеотидный липкий конец относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выступают за пределы дуплексного участка на терминальных концах нитей. Нуклеотидные липкие концы обычно образуются в том случае, когда 3'-конец одной нити выступает за пределы 5'-конца другой нити или когда 5'-конец одной нити выступает за пределы 3'-конца другой нити. Длина нуклеотидного липкого конца обычно составляет от 1 до 6 нуклеотидов, от 1 до 5 нуклеотидов, от 1 до 4 нуклеотидов, от 1 до 3 нуклеотидов, от 2 до 6 нуклеотидов, от 2 до 5 нуклеотидов или от 2 до 4 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидный липкий конец содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов. В одном конкретном варианте осуществления нуклеотидный липкий конец содержит от 1 до 4 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления нуклеотидный липкий конец содержит 2 нуклеотида. Нуклеотиды в составе липкого конца могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные нуклеотиды, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления липкий конец содержит динуклеотид, представляющий собой 5'-уридин-уридин-3' (5'-UU-3'). В таких вариантах осуществления динуклеотид UU может содержать рибонуклеотиды или модифицированные нуклеотиды, например, 2'-модифицированные нуклеотиды. В других вариантах осуществления липкий конец содержит динуклеотид, представляющий собой 5'-дезокситимидин-дезокситимидин-3' (5'-dTdT-3').For embodiments in which the sense strand and the antisense strand are two separate molecules (e.g., when the RNAi construct comprises siRNA), the sense strand and the antisense strand need not be the same length as the duplex region. For example, one or both strands may be longer than the duplex region and contain one or more unpaired nucleotides or mismatched nucleotides flanking the duplex region. Thus, in some embodiments, the RNAi construct comprises at least one nucleotide overhang. As used herein, the term nucleotide overhang refers to an unpaired nucleotide or nucleotides that extend beyond the duplex region at the terminal ends of the strands. Nucleotide overhangs are typically formed when the 3' end of one strand extends beyond the 5' end of the other strand, or when the 5' end of one strand extends beyond the 3' end of the other strand. The length of a nucleotide overhang is typically from 1 to 6 nucleotides, from 1 to 5 nucleotides, from 1 to 4 nucleotides, from 1 to 3 nucleotides, from 2 to 6 nucleotides, from 2 to 5 nucleotides, or from 2 to 4 nucleotides. In some embodiments, the nucleotide overhang comprises 1, 2, 3, 4, 5, or 6 nucleotides. In one particular embodiment, the nucleotide overhang comprises 1 to 4 nucleotides. In certain embodiments, the nucleotide overhang comprises 2 nucleotides. The nucleotides in the overhang may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides, or modified nucleotides as described herein. In some embodiments, the overhang comprises a dinucleotide that is 5'-uridine-uridine-3' (5'-UU-3'). In such embodiments, the UU dinucleotide may comprise ribonucleotides or modified nucleotides, such as 2'-modified nucleotides. In other embodiments, the overhang comprises a dinucleotide that is 5'-deoxythymidine-deoxythymidine-3' (5'-dTdT-3').
Нуклеотидный липкий конец может находиться на 5'-конце или 3'-конце одной или обеих нитей. Например, в одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 5'-конце и на 3'-конце антисмысловой нити. В другом варианте осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 5'-конце и на 3'-конце смысловой нити. В некоторых вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 5'-конце смысловой нити и на 5'-конце антисмысловой нити. В других вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 3'-конце смысловой нити и на 3'-конце антисмысловой нити.The nucleotide overhang may be at the 5' end or the 3' end of one or both strands. For example, in one embodiment, the RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 5' end and at the 3' end of the antisense strand. In another embodiment, the RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 5' end and at the 3' end of the sense strand. In some embodiments, the RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 5' end of the sense strand and at the 5' end of the antisense strand. In other embodiments, the RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 3' end of the sense strand and at the 3' end of the antisense strand.
Конструкции для RNAi могут содержать один нуклеотидный липкий конец на одном конце молекулы двухнитевой РНК и тупой конец на другом. Термин тупой конец означает, что смысловая нить и антисмысловая нить полностью спарены по основаниям на конце молекулы и что отсутствуют какиелибо неспаренные нуклеотиды, которые выступают за пределы дуплексного участка. В некоторых вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 3'-конце смысловой нити и тупой конец на 5'-конце смысловой нити и на 3'-конце антисмысловой нити. В других вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец на 3'-конце антисмысловой нити и тупой конец на 5'-конце антисмысловой нити и на 3'-конце смысловой нити. В определенных вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит тупой конец на обоих концах молекулы двухнитевой РНК. В таких вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить имеют одинаковую длину, а дуплексный участок имеет такую же длину, как смысловая и антисмысловая нити (т.е. молекула является двухнитевой по всей ее длине).RNAi constructs may comprise a single nucleotide overhang at one end of a double-stranded RNA molecule and a blunt end at the other. The term blunt end means that the sense strand and the antisense strand are completely base-paired at the end of the molecule and that there are no unpaired nucleotides that protrude beyond the duplex region. In some embodiments, an RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 3' end of the sense strand and a blunt end at the 5' end of the sense strand and at the 3' end of the antisense strand. In other embodiments, an RNAi construct comprises a nucleotide overhang at the 3' end of the antisense strand and a blunt end at the 5' end of the antisense strand and at the 3' end of the sense strand. In certain embodiments, an RNAi construct comprises a blunt end at both ends of the double-stranded RNA molecule. In such embodiments, the sense strand and the antisense strand are the same length, and the duplex region is the same length as the sense and antisense strands (i.e., the molecule is double-stranded along its entire length).
Длина каждой смысловой нити и антисмысловой нити может независимо составлять т приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов, от приблизительно 18 до приблизительноThe length of each sense strand and antisense strand can independently be from about 15 to about 30 nucleotides, from about 18 to about
- 7 047656 нуклеотидов, от приблизительно 19 до приблизительно 27 нуклеотидов, от приблизительно 19 до приблизительно 25 нуклеотидов, от приблизительно 19 до приблизительно 23 нуклеотидов, от приблизительно 21 до приблизительно 25 нуклеотидов или от приблизительно 21 до приблизительно 23 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления длина каждой смысловой нити и антисмысловой нити составляет приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24 или приблизительно 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить имеют одинаковую длину, но образуют дуплексный участок, который короче данных нитей, поэтому конструкция для RNAi содержит два нуклеотидных липки конца. К примеру, в одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит (i) смысловую нить и антисмысловую нить, каждая из которых имеет длину 21 нуклеотид; (ii) дуплексный участок, который имеет длину 19 пар оснований; и (iii) нуклеотидные липкие концы из двух неспаренных нуклеотидов как на 3'-конце смысловой нити, так и на 3'-конце антисмысловой нити. В другом варианте осуществления конструкция для RNAi содержит (i) смысловую нить и антисмысловую нить, каждая из которых имеет длину 23 нуклеотида; (ii) дуплексный участок, имеющий длину 21 пара оснований; и (iii) нуклеотидные липкие концы из двух неспаренных нуклеотидов как на 3'-конце смысловой нити, так и на 3'-конце антисмысловой нити. В других вариантах осуществления смысловая нить и антисмысловая нить имеют одинаковую длину и образуют дуплексный участок по всей их длине, поэтому на обоих липких концах двухнитевой молекулы отсутствуют нуклеотидные липкие концы. В одном таком варианте осуществления конструкция для RNAi имеет тупые концы и содержит (i) смысловую нить и антисмысловую нити, каждая из которых имеет длину 21 нуклеотид; и (ii) дуплексный участок, имеющий длину 21 пара оснований. В другом таком варианте осуществления конструкция для RNAi имеет тупые концы и содержит (i) смысловую нить и антисмысловую нить, каждая из которых имеет длину 23 нуклеотида; и (ii) дуплексный участок, имеющий длину 23 пары оснований.- 7,047,656 nucleotides, from about 19 to about 27 nucleotides, from about 19 to about 25 nucleotides, from about 19 to about 23 nucleotides, from about 21 to about 25 nucleotides, or from about 21 to about 23 nucleotides. In certain embodiments, the length of each sense strand and antisense strand is about 18, about 19, about 20, about 21, about 22, about 23, about 24, or about 25 nucleotides. In some embodiments, the sense strand and antisense strand are the same length but form a duplex region that is shorter than these strands, such that the RNAi construct comprises two nucleotide ends. For example, in one embodiment, the RNAi construct comprises (i) a sense strand and an antisense strand each being 21 nucleotides in length; (ii) a duplex region that is 19 base pairs in length; and (iii) nucleotide overhangs of two unpaired nucleotides at both the 3' end of the sense strand and the 3' end of the antisense strand. In another embodiment, the RNAi construct comprises (i) a sense strand and an antisense strand that are each 23 nucleotides in length; (ii) a duplex region that is 21 base pairs in length; and (iii) nucleotide overhangs of two unpaired nucleotides at both the 3' end of the sense strand and the 3' end of the antisense strand. In other embodiments, the sense strand and antisense strand are the same length and form a duplex region along their entire length, such that there are no nucleotide overhangs at either end of the double-stranded molecule. In one such embodiment, the RNAi construct is blunt-ended and comprises (i) a sense strand and an antisense strand, each of which is 21 nucleotides in length; and (ii) a duplex region having a length of 21 base pairs. In another such embodiment, the RNAi construct is blunt-ended and comprises (i) a sense strand and an antisense strand, each of which is 23 nucleotides in length; and (ii) a duplex region having a length of 23 base pairs.
В других вариантах осуществления смысловая нить или антисмысловая нить длиннее другой нити, и при этом две нити образуют дуплексный участок, длина которого равна длине более короткой нити, поэтому конструкция для RNAi содержит по меньшей мере один нуклеотидный липкий конец. Например, в одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит (i) смысловую нить длиной 19 нуклеотидов; (ii) антисмысловую нить длиной 21 нуклеотид; (iii) дуплексный участок, имеющий длину 19 пар оснований; и (iv) один нуклеотидный липкий конец из двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце антисмысловой нити. В другом варианте осуществления конструкция для RNAi содержит (i) смысловую нить длиной 21 нуклеотид; (ii) антисмысловую нить длиной 23 нуклеотида; (iii) дуплексный участок, имеющий длину 21 пара оснований; и (iv) один нуклеотидный липкий конец из двух неспаренных нуклеотидов на 3'-конце антисмысловой нити.In other embodiments, the sense strand or the antisense strand is longer than the other strand, and the two strands form a duplex region that is equal in length to the shorter strand, such that the RNAi construct comprises at least one nucleotide overhang. For example, in one embodiment, the RNAi construct comprises (i) a sense strand that is 19 nucleotides long; (ii) an antisense strand that is 21 nucleotides long; (iii) a duplex region that is 19 base pairs long; and (iv) a single nucleotide overhang of two unpaired nucleotides at the 3' end of the antisense strand. In another embodiment, the RNAi construct comprises (i) a sense strand that is 21 nucleotides long; (ii) an antisense strand that is 23 nucleotides long; (iii) a duplex region that is 21 base pairs long; and (iv) one nucleotide sticky end of two unpaired nucleotides at the 3' end of the antisense strand.
Антисмысловая нить конструкции для RNAi по настоящему изобретению может содержать последовательность из любой из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1 или 2, или последовательность нуклеотидов 1-19 любой из данных антисмысловых последовательностей. Каждая из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1 и 6, содержит последовательность из 19 последовательных нуклеотидов (первые 19 нуклеотидов, считая с 5'-конца), которая комплементарна последовательности мРНК PNPLA3, плюс последовательность нуклеотидного липкого конца, состоящего из двух нуклеотидов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антисмысловая нить содержит последовательность нуклеотидов 1-19 из любой из SEQ ID NO: 1-166 или 167-332.The antisense strand of the RNAi construct of the present invention may comprise a sequence from any of the antisense sequences presented in Table 1 or 2, or a sequence of nucleotides 1-19 of any of these antisense sequences. Each of the antisense sequences presented in Tables 1 and 6 comprises a sequence of 19 consecutive nucleotides (the first 19 nucleotides counted from the 5' end) that is complementary to the sequence of the PNPLA3 mRNA, plus a nucleotide overhang sequence consisting of two nucleotides. Thus, in some embodiments, the antisense strand comprises a sequence of nucleotides 1-19 of any of SEQ ID NOs: 1-166 or 167-332.
Модифицированные нуклеотиды.Modified nucleotides.
Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов. Термин модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, который имеет одну или больше химических модификаций нуклеозида, нуклеинового основания, пентозного кольца или фосфатной группы. Используемые в данном документе модифицированные нуклеотиды не охватывают рибонуклеотиды, содержащие аденозинмонофосфат, гуанозинмонофосфат, уридинмонофосфат и цитидинмонофосфат, и дезоксирибонуклеотиды, содержащие дезоксиаденозинмонофосфат, дезоксигуанозинмонофосфат, дезокситимидинмонофосфат и дезоксицитидинмонофосфат. Однако конструкции для RNAi могут содержать комбинации модифицированных нуклеотидов, рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Встраивание модифицированных нуклеотидов в одну или обе нити двухнитевых молекул РНК может улучшать стабильность молекул РНК in vivo, например, за счет снижения восприимчивости молекул к нуклеазам и другим процессам деградации. Эффективность конструкций для RNAi в отношении снижения экспрессии целевого гена также можно повысить путем встраивания модифицированных нуклеотидов.The RNAi constructs of the present invention may comprise one or more modified nucleotides. The term modified nucleotide refers to a nucleotide that has one or more chemical modifications to a nucleoside, a nucleobase, a pentose ring, or a phosphate group. As used herein, modified nucleotides do not include ribonucleotides containing adenosine monophosphate, guanosine monophosphate, uridine monophosphate, and cytidine monophosphate, and deoxyribonucleotides containing deoxyadenosine monophosphate, deoxyguanosine monophosphate, deoxythymidine monophosphate, and deoxycytidine monophosphate. However, the RNAi constructs may comprise combinations of modified nucleotides, ribonucleotides, and deoxyribonucleotides. The incorporation of modified nucleotides into one or both strands of double-stranded RNA molecules can improve the stability of RNA molecules in vivo, for example by reducing the susceptibility of the molecules to nucleases and other degradation processes. The efficiency of RNAi constructs in reducing target gene expression can also be increased by incorporating modified nucleotides.
В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды имеют модификацию рибозного сахара. Данные модификации сахара могут включать модификации в 2'- и/или 5'-положении пентозного кольца, а также модификации бициклического сахара. Термин '^'-модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему пентозное кольцо с заместителем в положении 2', отличным от H или OH. Такие 2'-модификации включают без ограничения 2'-О-алкил (например, O-C1-C10 или O-Ci-Cio замещенный алкил), 2'-О-аллил (O-CH2CH=Ch2), 2'-С-аллил, 2'-фторо, 2'-0-метил (OCH), 2'-О-метоксиэтил (O-(CH2)2OCH), 2'-OCF3, 2'-O(CH2)2SCH, 2'-O-аминоαлкил, 2'-амино (например, NH2),In certain embodiments, the modified nucleotides have a modification of the ribose sugar. These sugar modifications can include modifications at the 2' and/or 5' position of the pentose ring, as well as modifications of the bicyclic sugar. The term "N'-modified nucleotide" refers to a nucleotide having a pentose ring with a substituent at the 2' position other than H or OH. Such 2'-modifications include, but are not limited to, 2'-O-alkyl (e.g., O-C1-C10 or O-Ci-Cio substituted alkyl), 2'-O-allyl (O- CH2CH = Ch2 ), 2'-C-allyl, 2'-fluoro, 2'-0-methyl (OCH), 2'-O-methoxyethyl (O-( CH2 ) 2OCH ), 3 , 2'-O(CH 2 ) 2 SCH, 2'-O-aminoαalkyl, 2'-amino (for example, NH 2 ),
- 8 047656- 8 047656
2'-О-этиламин и 2'-азидо. Модификации в 5'-положении пентозного кольца включают без ограничения 5'-метил (R или S); 5'-винил и 5'-метокси.2'-O-ethylamine and 2'-azido. Modifications at the 5' position of the pentose ring include, but are not limited to, 5'-methyl (R or S); 5'-vinyl and 5'-methoxy.
Термин бициклическая модификация сахара относится к модификации пентозного кольца, при которой мостик соединяет два атома кольца с образованием второго кольца, что приводит к образованию бициклической структуры сахара. В некоторых вариантах осуществления бициклическая модификация сахара предусматривает мостик между атомами углерода пентозного кольца в 4'- и 2'-положениях. Нуклеотиды, содержащие сахарный фрагмент с бициклической модификацией сахара, используются в данном документе как термин бициклические нуклеиновые кислоты или BNA. Иллюстративные бициклические модификации сахара включают без ограничения a-L-метиленокси (4'-CH2-O-2') бициклическую нуклеиновую кислоту (BNA); e-D-метиленокси (4'-CH2-O-2') BNA (также называемую закрытой нуклеиновой кислотой или LNA); этиленокси (4'-(CH2)2-O-2') BNA; аминоокси (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA; оксиамино (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA; метил (метиленокси) (4'-CH(CH)-O-2') BNA (также называемую конформационно затрудненную этилом или cEt); метилен-тио (4'-CH2-S-2') BNA; метилен-амино (4'-CH2-N(R)-2') BNA; метилкарбоциклическую (4'-CH2-CH(CH)-2') BNA; пропиленкарбоциклическую (4'-(CH2)3-2') BNA и метокси (этиленокси) (4'-CH(CH2OMe)-O-2') BNA (также называемую конформационно затрудненной MOE или cMOE). Эти и другие нуклеотиды с модифицированным сахаром, которые могут быть встроены в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, описаны в патенте США № 9181551, в публикации патента США № 2016/0122761 и у Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19, 937-954, 2012, при этом все они включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.The term bicyclic sugar modification refers to a modification of a pentose ring in which a bridge connects two atoms of the ring to form a second ring, resulting in a bicyclic sugar structure. In some embodiments, the bicyclic sugar modification comprises a bridge between the carbon atoms of the pentose ring at the 4' and 2' positions. Nucleotides comprising a sugar moiety with a bicyclic sugar modification are used herein as the term bicyclic nucleic acids or BNAs. Exemplary bicyclic sugar modifications include, but are not limited to, aL-methyleneoxy (4'-CH 2 -O-2') bicyclic nucleic acid (BNA); eD-methyleneoxy (4'-CH 2 -O-2') BNA (also referred to as a locked nucleic acid or LNA); ethyleneoxy (4'-(CH 2 ) 2 -O-2') BNA; aminooxy (4'-CH 2 -ON(R)-2') BNA; oxyamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA; methyl (methyleneoxy) (4'-CH(CH)-O-2') BNA (also called ethyl constrained or cEt); methylene-thio (4'-CH 2 -S-2') BNA; methylene-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA; methylcarbocyclic (4'-CH2-CH(CH)-2') BNA; propylenecarbocyclic (4'-(CH 2 ) 3 -2') BNA and methoxy (ethyleneoxy) (4'-CH(CH 2 OMe)-O-2') BNA (also called conformationally constrained MOE or cMOE). These and other sugar-modified nucleotides that can be incorporated into the RNAi constructs of the present invention are described in U.S. Patent No. 9,181,551, U.S. Patent Publication No. 2016/0122761, and Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19, 937-954, 2012, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат один или несколько 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов, 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов, 2'-O-метоксиэтил-модифицированный нуклеотидов, 2'-O-аллил-модифицированных нуклеотидов, бициклических нуклеиновых кислот (BNA) или их комбинации. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат один или несколько 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов, 2'-O-метилмодифицированных нуклеотидов, 2'-O-метоксиэтил-модифицированных нуклеотидов или их комбинации. В одном конкретном варианте осуществления конструкции для RNAi содержат один или несколько 2'-фтор-модифицированных нуклеотидов, 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов или их комбинации.In some embodiments, the RNAi constructs comprise one or more 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, 2'-O-methoxyethyl-modified nucleotides, 2'-O-allyl-modified nucleotides, bicyclic nucleic acids (BNAs), or combinations thereof. In certain embodiments, the RNAi constructs comprise one or more 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, 2'-O-methoxyethyl-modified nucleotides, or combinations thereof. In one specific embodiment, the RNAi constructs comprise one or more 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, or combinations thereof.
Как смысловые, так и антисмысловые нити конструкций для RNAi могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов. Например, в некоторых вариантах осуществления смысловая нить содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше модифицированных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления все нуклеотиды в смысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая нить содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше модифицированных нуклеотидов. В других вариантах осуществления все нуклеотиды в антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды. В некоторых других вариантах осуществления все нуклеотиды в смысловой нити и все нуклеотиды в антисмысловой нити представляют собой модифицированные нуклеотиды. В этих и других вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды могут представлять собой 2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, 2'-O-метилмодифицированные нуклеотиды или их комбинации.Both the sense and antisense strands of the RNAi constructs may comprise one or more modified nucleotides. For example, in some embodiments, the sense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more modified nucleotides. In certain embodiments, all nucleotides in the sense strand are modified nucleotides. In some embodiments, the antisense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, or more modified nucleotides. In other embodiments, all nucleotides in the antisense strand are modified nucleotides. In some other embodiments, all nucleotides in the sense strand and all nucleotides in the antisense strand are modified nucleotides. In these and other embodiments, the modified nucleotides may be 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, or combinations thereof.
В некоторых вариантах осуществления все пиримидиновые нуклеотиды, предшествующие аденозиновому нуклеотиду в смысловой нити, антисмысловой нити или в обеих нитях, представляют собой модифицированные нуклеотиды. Например, там, где в любой нити появляется последовательность 5'-CA-3' или 5'-UA-3', нуклеотиды цитидин и уридин представляют собой модифицированные нуклеотиды, предпочтительно 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды. В определенных вариантах осуществления все пиримидиновые нуклеотиды в смысловой нити являются модифицированными нуклеотидами (например, 2'-O-метил-модифицированными нуклеотидами), а 5'-нуклеотиды во всех случаях последовательности 5'-CA-3' или 5'-UA-3' в антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами (например, 2'-O-метил-модифицированными нуклеотидами). В других вариантах осуществления все нуклеотиды в дуплексном участке представляют собой модифицированные нуклеотиды. В таких вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды предпочтительно представляют собой 2'-O-метилмодифицированные нуклеотиды, 2'-фтор-модифицированные нуклеотиды или их комбинации.In some embodiments, all of the pyrimidine nucleotides preceding the adenosine nucleotide in the sense strand, the antisense strand, or both strands are modified nucleotides. For example, where the sequence 5'-CA-3' or 5'-UA-3' appears in either strand, the cytidine and uridine nucleotides are modified nucleotides, preferably 2'-O-methyl-modified nucleotides. In certain embodiments, all of the pyrimidine nucleotides in the sense strand are modified nucleotides (e.g., 2'-O-methyl-modified nucleotides), and the 5' nucleotides in all instances of the sequence 5'-CA-3' or 5'-UA-3' in the antisense strand are modified nucleotides (e.g., 2'-O-methyl-modified nucleotides). In other embodiments, all of the nucleotides in the duplex region are modified nucleotides. In such embodiments, the modified nucleotides are preferably 2'-O-methyl-modified nucleotides, 2'-fluoro-modified nucleotides, or combinations thereof.
В ряде вариантов осуществления, в которых конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец, нуклеотиды в липком конце могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные нуклеотиды. В одном варианте осуществления нуклеотиды в липком конце представляют собой дезоксирибонуклеотиды, например, дезокситимидин. В другом варианте осуществления нуклеотиды в липком конце представляют собой модифицированные нуклеотиды. Например, в некоторых вариантах осуществления нуклеотиды в липком конце представляют собой 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды, 2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, 2'-метоксиэтилмодифицированные нуклеотиды или их комбинации.In some embodiments in which the RNAi construct comprises a nucleotide overhang, the nucleotides in the overhang may be ribonucleotides, deoxyribonucleotides, or modified nucleotides. In one embodiment, the nucleotides in the overhang are deoxyribonucleotides, such as deoxythymidine. In another embodiment, the nucleotides in the overhang are modified nucleotides. For example, in some embodiments, the nucleotides in the overhang are 2'-O-methyl-modified nucleotides, 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-methoxyethyl-modified nucleotides, or combinations thereof.
Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут также содержать одну или несколькоThe RNAi constructs of the present invention may also comprise one or more
- 9 047656 модифицированных межнуклеотидных связей. Используемый в данном документе термин модифицированная межнуклеотидная связь относится к межнуклеотидной связи, отличной от природной 3'-5'-фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах осуществления модифицированная межнуклеотидная связь представляет собой фосфорсодержащую межнуклеотидную связь, такую как сложную фосфотриэфирную, сложную аминоалкилфосфотриэфирную, алкилфосфонатную (например, метилфосфонатную, 3'-алкиленфосфонатную), фосфинатную, фосфорамидатную (например, 3'-аминофосфорамидатную и аминоалкилфосфорамидатную), фосфоротиоатную (P=S), хиралфосфоротиоатную, фосфородитиоатную, тионофосфорамидатную, тионоалкилфосфонатную, сложную тионоалкилфосфотриэфирную и боранофосфатную. В одном варианте осуществления модифицированная межнуклеотидная связь представляет собой сложную 2'-5'-фосфодиэфирную связь. В других вариантах осуществления модифицированная межнуклеотидная связь представляет собой нефосфорную межнуклеотидную связь и, таким образом, может упоминаться как модифицированная межнуклеозидная связь. Такие нефосфорсодержащие связи включают без ограничения морфолиновые связи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые связи (-O-Si(H)2-O-); сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые связи; формацетильные и тиоформацетильные связи; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленметилиминовые (-CH2-N(CH)-O-CH2-) и метиленгидразиновые связи; сульфонатные и сульфонамидные связи; амидные связи и другие, имеющие смешанные составные части, содержащие N, O, S и CH2. В одном варианте осуществления модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой пептидную связь (например, аминоэтилглицин) для создания пептидной нуклеиновой кислоты или PNA, такой как описанной в патентах США № 5539082; 5714331 и 5719262. Другие подходящие модифицированные межнуклеотидные и межнуклеозидные связи, которые могут быть использованы в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, описаны в патентах США № 6693187, 9181551, в публикации патента США № 2016/0122761 и у Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19, 937-954, 2012, при этом все они включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.- 9,047,656 modified internucleotide linkages. As used herein, the term modified internucleotide linkage refers to an internucleotide linkage other than a natural 3'-5' phosphodiester linkage. In some embodiments, the modified internucleotide linkage is a phosphorus-containing internucleotide linkage such as a phosphotriester, an aminoalkylphosphotriester, an alkylphosphonate (e.g., methylphosphonate, 3'-alkylenephosphonate), a phosphinate, a phosphoramidate (e.g., 3'-aminophosphoramidate and aminoalkylphosphoramidate), a phosphorothioate (P=S), a chiralphosphorothioate, a phosphorodithioate, a thionophosphoramidate, a thionoalkylphosphonate, a thionoalkylphosphotriester, and a boranophosphate. In one embodiment, the modified internucleotide linkage is a 2'-5' phosphodiester linkage. In other embodiments, the modified internucleotide linkage is a non-phosphorus internucleotide linkage and thus may be referred to as a modified internucleoside linkage. Such non-phosphorus-containing linkages include, but are not limited to, morpholine linkages (formed in part from the sugar moiety of a nucleoside); siloxane linkages (-O-Si(H) 2 -O-); sulfide, sulfoxide, and sulfone linkages; formacetyl and thioformacetyl linkages; alkene-containing backbones; sulfamate backbones; methylenemethylimine ( -CH2 -N(CH)-O- CH2- ) and methylenehydrazine linkages; sulfonate and sulfonamide linkages; amide linkages and others having mixed moieties containing N, O, S, and CH2. In one embodiment, the modified internucleoside linkage is a peptide linkage (e.g., aminoethylglycine) to create a peptide nucleic acid or PNA, such as those described in U.S. Patent Nos. 5,539,082; 5,714,331 and 5,719,262. Other suitable modified internucleotide and internucleoside linkages that can be used in the RNAi construct of the present invention are described in U.S. Patent Nos. 6,693,187, 9,181,551, U.S. Patent Publication No. 2016/0122761 and Deleavey and Damha, Chemistry and Biology, Vol. 19, 937-954, 2012, all of which are herein incorporated by reference in their entireties.
В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi содержат одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Фосфоротиоатные межнуклеотидные связи могут присутствовать в смысловой нити, антисмысловой нити или в обеих нитях конструкции для RNAi. К примеру, в некоторых вариантах осуществления смысловая нить содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В других вариантах осуществления антисмысловая нить содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В дополнительных вариантах осуществления обе нити содержат 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Конструкции для RNAi могут содержать одну или больше фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 3'-конце, 5'-конце, или как на 3'-, так и на 5'-концах смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей. Например, в определенных вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит от приблизительно 1 до приблизительно 6 или больше (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше) последовательных фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 3'-конце смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей. В других вариантах осуществления конструкция для RNAi содержит от приблизительно 1 до приблизительно 6 или больше (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше) последовательных фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 5'-конце смысловой нити, антисмысловой нити или обеих нитей. В одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце смысловой нити и одну фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце антисмысловой нити. В другом варианте осуществления конструкция для RNAi содержит две последовательные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 3'-конце антисмысловой нити (т.е. фосфоротиоатную межнуклеотидную связь в случае первой и второй межнуклеотидных связей на 3'-конце антисмысловой нити). В другом варианте осуществления конструкция для RNAi содержит две последовательные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи как на 3'-, так и на 5'-концах антисмысловой нити. В еще одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит две последовательные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи как на 3'-, так и на 5'-концах антисмысловой нити и две последовательные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи на 5'-конце смысловой нити. В еще одном варианте осуществления конструкция для RNAi содержит две последовательные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи как на 3'-, так и на 5'-концах антисмысловой нити и две последовательных фосфоротиоатные межнуклеотидные связи как на 3'-, так и на 5'-концах смысловой нити (т.е. фосфоротиоатную межнуклеотидную связь в первой и второй межнуклеотидной связях как на 5'-, так и на 3'-концах антисмысловой нити и фосфоротиоатную межнуклеотидную связь в первой и второй межнуклеотидной связях как на 5'-, так и на 3'-концах смысловой нити). В любом из вариантов осуществления, в котором одна или обе нити содержат одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, остальные межнуклеотидные связи внутри цепей могут представлять собой природные сложные 3'-5'-фосфодиэфирные связи. Например, в некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеотидная связь смысловой и антисмысловой нитей выбрана из сложного фосфодиэфира и фосфоротиоата, где по меньшей мере одна межнуклеотидная связь представляет собой фосфоротиоат.In certain embodiments, RNAi constructs comprise one or more phosphorothioate internucleotide linkages. The phosphorothioate internucleotide linkages may be present in the sense strand, the antisense strand, or both strands of the RNAi construct. For example, in some embodiments, the sense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more phosphorothioate internucleotide linkages. In other embodiments, the antisense strand comprises 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more phosphorothioate internucleotide linkages. In further embodiments, both strands comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or more phosphorothioate internucleotide linkages. RNAi constructs can comprise one or more phosphorothioate internucleotide linkages at the 3' end, the 5' end, or both the 3' and 5' ends of the sense strand, the antisense strand, or both strands. For example, in certain embodiments, an RNAi construct comprises from about 1 to about 6 or more (e.g., about 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more) consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at the 3' end of the sense strand, the antisense strand, or both strands. In other embodiments, an RNAi construct comprises from about 1 to about 6 or more (e.g., about 1, 2, 3, 4, 5, 6, or more) consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at the 5' end of the sense strand, the antisense strand, or both strands. In one embodiment, the RNAi construct comprises one phosphorothioate internucleotide linkage at the 3' end of the sense strand and one phosphorothioate internucleotide linkage at the 3' end of the antisense strand. In another embodiment, the RNAi construct comprises two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at the 3' end of the antisense strand (i.e., a phosphorothioate internucleotide linkage for the first and second internucleotide linkages at the 3' end of the antisense strand). In another embodiment, the RNAi construct comprises two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at both the 3' and 5' ends of the antisense strand. In yet another embodiment, the RNAi construct comprises two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at both the 3' and 5' ends of the antisense strand and two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at the 5' end of the sense strand. In another embodiment, the RNAi construct comprises two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at both the 3' and 5' ends of the antisense strand and two consecutive phosphorothioate internucleotide linkages at both the 3' and 5' ends of the sense strand (i.e., a phosphorothioate internucleotide linkage in the first and second internucleotide linkages at both the 5' and 3' ends of the antisense strand and a phosphorothioate internucleotide linkage in the first and second internucleotide linkages at both the 5' and 3' ends of the sense strand). In any of the embodiments in which one or both strands comprise one or more phosphorothioate internucleotide linkages, the remaining internucleotide linkages within the strands may be naturally occurring 3'-5' phosphodiester linkages. For example, in some embodiments, each internucleotide linkage of the sense and antisense strands is selected from a phosphodiester and a phosphorothioate, wherein at least one internucleotide linkage is a phosphorothioate.
В ряде вариантов осуществления, в которых конструкция для RNAi содержит нуклеотидный липкий конец, два или более неспаренных нуклеотида в составе липкого конца могут быть соединены поIn some embodiments in which the RNAi construct comprises a nucleotide overhang, two or more unpaired nucleotides within the overhang may be joined at
- 10 047656 средством фосфоротиоатной межнуклеотидной связи. В определенных вариантах осуществления все неспаренные нуклеотиды в нуклеотидном липком конце на 3'-конце антисмысловой нити и/или смысловой нити соединены фосфоротиоатными межнуклеотидными связями. В других вариантах осуществления все неспаренные нуклеотиды в нуклеотидном липком конце на 5'-конце антисмысловой нити и/или смысловой нити соединены фосфоротиоатными межнуклеотидными связями. В еще одних дополнительных вариантах осуществления все неспаренные нуклеотиды в любом нуклеотидном липком конце соединены фосфоротиоатными межнуклеотидными связями.- 10 047656 by means of a phosphorothioate internucleotide linkage. In certain embodiments, all unpaired nucleotides in the nucleotide overhang at the 3' end of the antisense strand and/or the sense strand are linked by phosphorothioate internucleotide linkages. In other embodiments, all unpaired nucleotides in the nucleotide overhang at the 5' end of the antisense strand and/or the sense strand are linked by phosphorothioate internucleotide linkages. In yet further embodiments, all unpaired nucleotides in either nucleotide overhang are linked by phosphorothioate internucleotide linkages.
В определенных вариантах осуществления модифицированные нуклеотиды, встроенные в одну или обе нити конструкции для RNAi по настоящему изобретению, имеют модификацию нуклеинового основания (также называемого в данном документе как основание). Термин модифицированное нуклеиновое основание или модифицированное основание относится к основанию, отличному от встречающихся в природе пуриновых оснований аденина (A) и гуанина (G) и пиримидиновых оснований тимина (T), цитозина (C) и урацила (U). Модифицированные нуклеиновые основания могут быть синтетическими или встречающимися в природе модификациями и включают без ограничения универсальные основания, 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин (X), гипоксантин (I), 2-аминоаденин, 6-метиладенин, 6-метилгуанин и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галогено, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-дезазагуанин и 7-дезазааденин, 3-дезазагуанин и 3-дезазааденин.In certain embodiments, modified nucleotides incorporated into one or both strands of an RNAi construct of the present invention have a modification of the nucleobase (also referred to herein as a base). The term modified nucleobase or modified base refers to a base other than the naturally occurring purine bases adenine (A) and guanine (G) and the pyrimidine bases thymine (T), cytosine (C), and uracil (U). The modified nucleobases may be synthetic or naturally occurring modifications and include, but are not limited to, universal bases, 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosine, xanthine (X), hypoxanthine (I), 2-aminoadenine, 6-methyladenine, 6-methylguanine and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and -cytosine, 5-propynyluracil and -cytosine, 6-azouracil, -cytosine and -thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl and other 8-substituted adenines and guanines, 5-halo, in particular 5-bromo, 5-trifluoromethyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and 7-methyladenine, 8-azaguanine and 8-azaadenine, 7-deazaguanine and 7-deazaadenine, 3-deazaguanine and 3-deazaadenine.
В некоторых вариантах осуществления модифицированное основание представляет собой универсальное основание. Термин универсальное основание относится к аналогу основания, который неизбирательно образует пары оснований со всеми природными основаниями в РНК и ДНК без изменения двойной спиральной структуры образовавшегося дуплексного участка. Универсальные основы известны специалистам в данной области и включают без ограничения инозин, C-фенил, C-нафтил и другие ароматические производные, азольные карбоксамиды и производные нитроазола, такие как 3-нитропиррол, 4-нитроиндол, 5-нитроиндол и 6-нитроиндол.In some embodiments, the modified base is a universal base. The term universal base refers to a base analog that non-selectively base pairs with all natural bases in RNA and DNA without altering the double helical structure of the resulting duplex region. Universal bases are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, inosine, C-phenyl, C-naphthyl and other aromatic derivatives, azole carboxamides, and nitroazole derivatives such as 3-nitropyrrole, 4-nitroindole, 5-nitroindole, and 6-nitroindole.
Другие подходящие модифицированные основания, которые могут быть встроены в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, включают те, которые описаны в публикациях Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., Vol. 10, 297-310, 2000 и Peacock et al., J. Org. Chern., Vol. 76, 7295-7300, 2011, при этом все они включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин, тимин и урацил могут быть заменены другими нуклеиновыми основаниями, такими как модифицированные нуклеиновые основания, описанные выше, без существенного изменения свойств спаривания оснований у полинуклеотида, содержащего нуклеотид с таким замещенным нуклеиновым основанием.Other suitable modified bases that can be incorporated into the RNAi constructs of the present invention include those described in Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., Vol. 10, 297-310, 2000 and Peacock et al., J. Org. Chern., Vol. 76, 7295-7300, 2011, all of which are incorporated herein by reference in their entireties. It is well known to one of skill in the art that guanine, cytosine, adenine, thymine, and uracil can be replaced with other nucleobases, such as the modified nucleobases described above, without substantially altering the base pairing properties of a polynucleotide comprising a nucleotide with such a substituted nucleobase.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению 5'конец смысловой нити, антисмысловой нити или как антисмысловой, так и смысловой нити содержит фосфатный фрагмент. Используемый в данном документе термин фосфатный фрагмент относится к концевой фосфатной группе, которая включает немодифицированные фосфаты (-O-P=O)(OH)OH), а также модифицированные фосфаты. Модифицированные фосфаты включают фосфаты, в которых одна или несколько групп О и ОН заменены на Н, О, S, N (R) или алкил, где R представляет собой Н, защитную аминогруппу или незамещенный или замещенный алкил. Иллюстративные фосфатные фрагменты включают без ограничения 5'-монофосфат; 5'-дифосфат; 5'-трифосфат; 5'-гуанозиновый кэп (7-метилированный или неметилированный); 5'-аденозиновый кэп или любую другую модифицированную или немодифицированную структуру нуклеотидного кэпа; 5'-монотиофосфат (фосфоротиоат); 5'-монодитиофосфат (фосфородитиоат); 5'-альфа-тиотрифосфат; 5'-гамма-тиотрифосфат, 5'-фосфороамидаты; 5'-винилфосфаты; 5'-алкилфосфонаты (например, алкил = метил, этил, изопропил, пропил и т.д.) и 5'-алкилэфирфосфонаты (например, алкилэфир = метоксиметил, этоксиметил и т.д.).In some embodiments of an RNAi construct of the present invention, the 5' end of the sense strand, the antisense strand, or both the antisense and sense strands comprises a phosphate moiety. As used herein, the term phosphate moiety refers to a terminal phosphate group that includes unmodified phosphates (-O-P=O)(OH)OH) as well as modified phosphates. Modified phosphates include phosphates in which one or more of the O and OH groups are replaced with H, O, S, N (R), or alkyl, where R is H, a protecting amino group, or unsubstituted or substituted alkyl. Exemplary phosphate moieties include, but are not limited to, 5'-monophosphate; 5'-diphosphate; 5'-triphosphate; 5'-guanosine cap (7-methylated or unmethylated); 5'-adenosine cap or any other modified or unmodified nucleotide cap structure; 5'-monothiophosphate (phosphorothioate); 5'-monodithiophosphate (phosphorodithioate); 5'-alpha-thiotriphosphate; 5'-gamma-thiotriphosphate, 5'-phosphoramidates; 5'-vinyl phosphates; 5'-alkyl phosphonates (e.g. alkyl = methyl, ethyl, isopropyl, propyl, etc.) and 5'-alkyl ether phosphonates (e.g. alkyl ether = methoxymethyl, ethoxymethyl, etc.).
Модифицированные нуклеотиды, которые могут быть встроены в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, могут иметь более одной химической модификации из описанных в данном документе. Например, модифицированный нуклеотид может иметь модификацию рибозного сахара, а также модификацию нуклеинового основания. В качестве примера модифицированный нуклеотид может содержать 2'-модификацию сахара (например, 2'-фтор и 2'-метил) и содержать модифицированное основание (например, 5-метилцитозин или псевдоурацил). В других вариантах осуществления модифицированный нуклеотид может содержать модификацию сахара в сочетании с модификацией 5'-фосфата, при этом когда модифицированный нуклеотид будет включен в полинуклеотид, образуется модифицированная межнуклеотидная или межнуклеозидная связь. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеотид может содержать модификацию сахара, такую как 2'-фтор-модификация, 2'-O-метил-модификация или бициклическая модификация сахара, а также 5'-фосфоротиоатную группу. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления одна или обе нити конструкции для RNAi поModified nucleotides that can be incorporated into the RNAi constructs of the present invention can have more than one chemical modification described herein. For example, a modified nucleotide can have a modification of the ribose sugar as well as a modification of the nucleobase. As an example, a modified nucleotide can comprise a 2' sugar modification (e.g., 2'-fluoro and 2'-methyl) and comprise a modified base (e.g., 5-methylcytosine or pseudouracil). In other embodiments, a modified nucleotide can comprise a sugar modification in combination with a 5'-phosphate modification, wherein when the modified nucleotide is incorporated into a polynucleotide, a modified internucleotide or internucleoside linkage is formed. For example, in some embodiments, a modified nucleotide can comprise a sugar modification, such as a 2'-fluoro modification, a 2'-O-methyl modification, or a bicyclic sugar modification, and a 5'-phosphorothioate group. Accordingly, in some embodiments, one or both strands of the RNAi construct are
- 11 047656 настоящему изобретению содержат комбинацию 2'-модифицированных нуклеотидов или BNA и фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. В определенных вариантах осуществления как смысловые, так и антисмысловые нити конструкции для RNAi по настоящему изобретению содержат комбинацию 2'-фтормодифицированных нуклеотидов, 2'-O-метил-модифицированных нуклеотидов и фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Иллюстративные конструкции для RNAi, содержащие модифицированные нуклеотиды и межнуклеотидные связи, показаны в таблице 2.- 11 047 656 of the present invention comprise a combination of 2'-modified nucleotides or BNAs and phosphorothioate internucleotide linkages. In certain embodiments, both the sense and antisense strands of an RNAi construct of the present invention comprise a combination of 2'-fluoro-modified nucleotides, 2'-O-methyl-modified nucleotides, and phosphorothioate internucleotide linkages. Exemplary RNAi constructs comprising modified nucleotides and internucleotide linkages are shown in Table 2.
Функция конструкции для RNAi.Function of the construct for RNAi.
Предпочтительно конструкции для RNAi по настоящему изобретению снижают или подавляют экспрессию PNPLA3 в клетках, в частности в клетках печени. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ снижения экспрессии PNPLA3 i в клетке путем приведения клетки в контакт с любой конструкцией для RNAi, описанной в данном документе. Клетка может находиться в условиях in vitro или in vivo. Экспрессию PNPLA3 можно оценивать путем измерения количества или уровня мРНК PNPLA3, белка PNPLA3 или другого биомаркера, связанного с экспрессией PNPLA3. Снижение экспрессии PNPLA3 в клетках или у животных, обработанных конструкцией для RNAi по настоящему изобретению, можно определить по сравнению с экспрессией PNPLA3 в клетках или у животных, не обработанных конструкцией для RNAi, либо обработанных контрольной конструкцией для RNAi. Например, в некоторых вариантах осуществления снижение экспрессии PNPLA3 оценивают путем (a) измерения количества или уровня мРНК PNPLA3 в клетках печени, обработанных конструкцией для RNAi по настоящему изобретению; (b) измерения количества или уровня мРНК PNPLA3 в клетках печени, обработанных контрольной конструкцией для RNAi (например, средством для RNAi, направленным на молекулу РНК, не экспрессируемую в клетках печени, или конструкцией для RNAi, имеющей нонсенс- или скремблированную последовательность) или обработанных без конструкции; и (c) сравнения измеренных уровней мРНК PNPLA3 в обработанных клетках из (a) с измеренными уровнями мРНК PNPLA3 в контрольных клетках из (b). Уровни мРНК PNPLA3 в обработанных клетках и в контрольных клетках перед сравнением могут быть нормализованы относительно уровней РНК контрольного гена (например, 18S рибосомальной РНК). Уровни мРНК PNPLA3 можно измерять с помощью различных методик, включая нозерн-блоттинг, анализ с защитой от действия нуклеаз, гибридизацию in situ (FISH), ПЦР с обратной транскрипцией ((RT)-PCR), ПЦР в режиме реального времени (RT-PCR), количественную ПЦР и им подобные.Preferably, the RNAi constructs of the present invention reduce or suppress the expression of PNPLA3 in cells, particularly liver cells. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a method of reducing the expression of PNPLA3 i in a cell by contacting the cell with any of the RNAi constructs described herein. The cell may be in vitro or in vivo. The expression of PNPLA3 can be assessed by measuring the amount or level of PNPLA3 mRNA, PNPLA3 protein, or another biomarker associated with the expression of PNPLA3. A reduction in the expression of PNPLA3 in cells or animals treated with an RNAi construct of the present invention can be determined in comparison to the expression of PNPLA3 in cells or animals not treated with the RNAi construct or treated with a control RNAi construct. For example, in some embodiments, a decrease in PNPLA3 expression is assessed by (a) measuring the amount or level of PNPLA3 mRNA in liver cells treated with an RNAi construct of the invention; (b) measuring the amount or level of PNPLA3 mRNA in liver cells treated with a control RNAi construct (e.g., an RNAi agent targeted to an RNA molecule not expressed in liver cells, or an RNAi construct having a nonsense or scrambled sequence) or treated without the construct; and (c) comparing the measured PNPLA3 mRNA levels in the treated cells of (a) with the measured PNPLA3 mRNA levels in the control cells of (b). The PNPLA3 mRNA levels in the treated cells and in the control cells can be normalized relative to the RNA levels of a control gene (e.g., 18S ribosomal RNA) prior to comparison. PNPLA3 mRNA levels can be measured using a variety of techniques including Northern blot, nuclease protection assay, in situ hybridization (FISH), reverse transcription-PCR ((RT)-PCR), real-time PCR (RT-PCR), quantitative PCR, and the like.
В других вариантах осуществления снижение экспрессии PNPLA3 оценивают путем (a) измерения количества или уровня белка PNPLA3 в клетках печени, обработанных конструкцией для RNAi по настоящему изобретению; (b) измерения количества или уровня белка PNPLA3 в клетках печени, обработанных контрольной конструкцией для RNAi (например, средством для RNAi, направленным на молекулу РНК, не экспрессируемую в клетках печени, или конструкцией для RNAi, имеющей нонсенс- или скремблированную последовательность) или обработанных без конструкции; и (c) сравнения измеренных уровней белка PNPLA3 в обработанных клетках из (a) с измеренными уровнями белка PNPLA3 в контрольных клетках из (b). Методики измерения уровней белка PNPLA3 известны специалистам в данной области и включают вестерн-блоттинг, иммуноанализы (например, ELISA) и проточную цитометрию. Иллюстративная методика оценки экспрессии белка PNPLA3 на основе иммуноанализа описана в примере 2. В примере 3 описана иллюстративная методика измерения мРНК PNPLA3 с помощью RNA FISH. Для оценки эффективности конструкции для RNAi по настоящему изобретению может быть использована любая методика, способная измерять мРНК или белок PNPLA3.In other embodiments, the reduction in PNPLA3 expression is assessed by (a) measuring the amount or level of PNPLA3 protein in liver cells treated with an RNAi construct of the invention; (b) measuring the amount or level of PNPLA3 protein in liver cells treated with a control RNAi construct (e.g., an RNAi agent directed to an RNA molecule not expressed in liver cells, or an RNAi construct having a nonsense or scrambled sequence) or treated without the construct; and (c) comparing the measured PNPLA3 protein levels in the treated cells of (a) with the measured PNPLA3 protein levels in the control cells of (b). Techniques for measuring PNPLA3 protein levels are known to those of skill in the art and include Western blotting, immunoassays (e.g., ELISA), and flow cytometry. An exemplary immunoassay-based assay for assessing PNPLA3 protein expression is described in Example 2. An exemplary assay for measuring PNPLA3 mRNA using RNA FISH is described in Example 3. Any assay capable of measuring PNPLA3 mRNA or protein can be used to assess the efficacy of the RNAi construct of the present invention.
В некоторых вариантах осуществления методики оценки уровней экспрессии PNPLA3 выполняют in vitro в клетках, которые нативно экспрессируют PNPLA3 (например, в клетках печени) или в клетках, которые были сконструированы для экспрессии PNPLA3. В определенных вариантах осуществления методики проводят in vitro в клетках печени. Подходящие клетки печени включают без ограничения первичные гепатоциты (например, гепатоциты человека, нечеловекообразных приматов или грызунов), клетки HepAD38, клетки HuH-6, клетки HuH-7, клетки HuH-5-2, клетки BNLCL2, клетки Hep3B или клетки HepG2. В одном варианте осуществления клетки печени представляют собой клетки Hep3B. В другом варианте осуществления клетки печени представляют собой клетки HepG2.In some embodiments, the methods for assessing PNPLA3 expression levels are performed in vitro in cells that natively express PNPLA3 (e.g., liver cells) or in cells that have been engineered to express PNPLA3. In certain embodiments, the methods are performed in vitro in liver cells. Suitable liver cells include, but are not limited to, primary hepatocytes (e.g., human, non-human primate, or rodent hepatocytes), HepAD38 cells, HuH-6 cells, HuH-7 cells, HuH-5-2 cells, BNLCL2 cells, Hep3B cells, or HepG2 cells. In one embodiment, the liver cells are Hep3B cells. In another embodiment, the liver cells are HepG2 cells.
В других вариантах осуществления методики оценки уровней экспрессии PNPLA3 проводят in vivo. Можно вводить конструкции для RNAi и любые контрольные конструкции для RNAi животному (например, грызуну или нечеловекообразному примату) и оценивать уровни мРНК или белка PNPLA3 в образце ткани печени, отобранном у животного после обработки. В качестве альтернативы или дополнительно биомаркер или функциональный фенотип, ассоциированный с экспрессией PNPLA3, можно оценивать у животных, которых обрабатывали указанным средством.In other embodiments, the methods for assessing PNPLA3 expression levels are performed in vivo. The RNAi constructs and any control RNAi constructs can be administered to an animal (e.g., a rodent or non-human primate) and the levels of PNPLA3 mRNA or protein can be assessed in a liver tissue sample collected from the animal after treatment. Alternatively or additionally, a biomarker or functional phenotype associated with PNPLA3 expression can be assessed in animals treated with the agent.
В определенных вариантах осуществления экспрессия PNPLA3 снижена в клетках печени по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45% или по меньшей мере на 50% за счет воздействия конструкции для RNAi по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления экспрессия PNPLA3 снижена в клетках печени по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере наIn certain embodiments, PNPLA3 expression is reduced in liver cells by at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, or at least 50% due to exposure to an RNAi construct of the invention. In some embodiments, PNPLA3 expression is reduced in liver cells by at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least
- 12 047656- 12 047656
80% или по меньшей мере на 85% за счет воздействия конструкции для RNAi по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления экспрессия PNPLA3 снижена в клетках печени приблизительно на 90% или больше, например на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или больше за счет воздействия конструкции для RNAi по настоящему изобретению. Процент снижения экспрессии PNPLA3 можно измерять при помощи любых способов, описанных в данном документе, а также других способов, известных в данной области. К примеру, в определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 45% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках Hep3B (содержащих PNPLA3 дикого типа) in vitro. В связанных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 75% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках Hep3B in vitro. В других вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках Hep3B in vitro. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 45% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках HepG2 (содержащих два минорных аллеля PNPLA3-rs738409-rs738408) in vitro. В связанных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 75% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках HepG2 in vitro. В других вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в клетках HepG2 in vitro. В определенных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 45% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в трансфицированных клетках CHO, экспрессирующих PNPLA3 I148I или I148M человека in vitro. В связанных вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 75% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в трансфицированных клетках CHO, экспрессирующих PNPLA3 I148I или I148M человека in vitro. В других вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% подавляют экспрессию PNPLA3 при концентрации 5 нМ в трансфицированных клетках CHO, экспрессирующих PNPLA3 I148I или I148M человека in vitro. Снижение PNPLA3 можно измерять с использованием различных методик, в том числе RNA FISH или капельной цифровой ПЦР, как это описано в примерах 2 и 3.80% or at least 85% due to exposure to an RNAi construct of the invention. In other embodiments, the expression of PNPLA3 is reduced in liver cells by about 90% or more, such as 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% or more due to exposure to an RNAi construct of the invention. The percentage reduction in PNPLA3 expression can be measured using any of the methods described herein, as well as other methods known in the art. For example, in certain embodiments, the RNAi constructs of the invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 45% at a concentration of 5 nM in Hep3B cells (containing wild-type PNPLA3) in vitro. In related embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, or at least 75% at a concentration of 5 nM in Hep3B cells in vitro. In other embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 96%, or at least 98% at a concentration of 5 nM in Hep3B cells in vitro. In certain embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 45% at a concentration of 5 nM in HepG2 cells (containing two minor alleles of PNPLA3-rs738409-rs738408) in vitro. In related embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, or at least 75% at a concentration of 5 nM in HepG2 cells in vitro. In other embodiments, the RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 96%, or at least 98% at a concentration of 5 nM in HepG2 cells in vitro. In certain embodiments, the RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 45% at a concentration of 5 nM in transfected CHO cells expressing human PNPLA3 I148I or I148M in vitro. In related embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, or at least 75% at a concentration of 5 nM in transfected CHO cells expressing human PNPLA3 I148I or I148M in vitro. In other embodiments, RNAi constructs of the present invention suppress the expression of PNPLA3 by at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 92%, at least 94%, at least 96%, or at least 98% at a concentration of 5 nM in transfected CHO cells expressing human PNPLA3 I148I or I148M in vitro. PNPLA3 reduction can be measured using a variety of techniques, including RNA FISH or droplet digital PCR, as described in Examples 2 and 3.
В некоторых вариантах осуществления значение IC50 рассчитывается для оценки способности конструкции для RNAi по настоящему изобретению подавлять экспрессию PNPLA3 в клетках печени. Термин значение IC50 означает дозу/концентрацию, необходимую для достижения 50% подавления биологической или биохимической функции. Значение IC50 для любого конкретного вещества или антагониста можно определить путем построения кривой зависимости доза-ответ и изучения влияния различных концентраций вещества или антагониста на уровни экспрессии или функциональную активность, определяемые в любом анализе. Значения IC50 можно рассчитать для данного антагониста или вещества путем определения концентрации, необходимой для подавления половины максимального биологического ответа или половины уровней нативной экспрессии. Таким образом, значение IC50 для любой конструкции для RNAi может быть рассчитано путем определения концентрации конструкции для RNAi, необходимой, чтобы подавить половину уровня нативной экспрессии PNPLA3 в клетках печени (например, уровня экспрессии PNPLA3 в контрольных клетках печени) в любом анализе, таком как иммуноанализ, или анализ RNA FISH, или анализ с помощью капельной цифровой ПЦР, которые описаны в примерах. Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут подавлять экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, в клетках Hep3B) со значением IC50, составляющим менее приблизительно 20 нМ. Например, конструкции для RNAi подавляют экспрессию PNPLA3 в клетках печени со значением IC50, составляющим от приблизительно 0,001 до приблизительно 20 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 5 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нМ или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 нМ. В определенных вариантах осуществления конструкция для RNAi подавляет экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, клетках Hep3B) со значением IC50, составляющим от приблизительно 1 до приблизительно 10 нМ. Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут подавлять экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, в клетках HepG2) со значением IC50, составляющим менее приблизительно 20 нМ. Например, конструкции для RNAi подавляют экспрессию PNPLA3 в клетках печени со значением IC50, составляюIn some embodiments, an IC50 value is calculated to assess the ability of an RNAi construct of the present invention to suppress PNPLA3 expression in liver cells. The term IC50 value means the dose/concentration required to achieve 50% suppression of a biological or biochemical function. The IC50 value for any particular substance or antagonist can be determined by constructing a dose-response curve and examining the effect of different concentrations of the substance or antagonist on the expression levels or functional activity measured in any assay. IC50 values can be calculated for a given antagonist or substance by determining the concentration required to suppress half the maximal biological response or half the native expression levels. Thus, the IC50 value for any RNAi construct can be calculated by determining the concentration of the RNAi construct required to suppress half the level of native expression of PNPLA3 in liver cells (e.g., the level of expression of PNPLA3 in control liver cells) in any assay, such as an immunoassay, or an RNA FISH assay, or a droplet digital PCR assay, which are described in the examples. The RNAi constructs of the present invention can suppress the expression of PNPLA3 in liver cells (e.g., Hep3B cells) with an IC50 value of less than about 20 nM. For example, the RNAi constructs downregulate PNPLA3 expression in liver cells with an IC50 of about 0.001 to about 20 nM, about 0.001 to about 10 nM, about 0.001 to about 5 nM, about 0.001 to about 1 nM, about 0.1 to about 10 nM, about 0.1 to about 5 nM, or about 0.1 to about 1 nM. In certain embodiments, the RNAi construct downregulates PNPLA3 expression in liver cells (e.g., Hep3B cells) with an IC50 of about 1 to about 10 nM. The RNAi constructs of the present invention can downregulate PNPLA3 expression in liver cells (e.g., HepG2 cells) with an IC50 of less than about 20 nM. For example, RNAi constructs suppress PNPLA3 expression in liver cells with an IC 50 value of
- 13 047656 щим от приблизительно 0,001 до приблизительно 20 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 5 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нМ или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 нМ. В определенных вариантах осуществления конструкция для RNAi подавляет экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, клетках HepG2) со значением IC50, составляющим от приблизительно 1 до приблизительно 10 нМ. Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут подавлять экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, в трансфицированных клетках CHO, экспрессирующих PNPLA3 I148I или I148M человека) со значением IC50, составляющим менее приблизительно 20 нМ. Например, конструкции для RNAi подавляют экспрессию PNPLA3 в клетках печени со значением IC50, составляющим от приблизительно 0,001 до приблизительно 20 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 5 нМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 1 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нМ или от приблизительно 0, до приблизительно 1 нМ. В определенных вариантах осуществления конструкция для RNAi подавляет экспрессию PNPLA3 в клетках печени (например, в трансфицированных клетках CHO, экспрессирующих PNPLA3 I148I или I148M человека) со значением IC50, составляющим от приблизительно 1 до приблизительно 10 нМ.- 13 047656 from about 0.001 to about 20 nM, from about 0.001 to about 10 nM, from about 0.001 to about 5 nM, from about 0.001 to about 1 nM, from about 0.1 to about 10 nM, from about 0.1 to about 5 nM, or from about 0.1 to about 1 nM. In certain embodiments, the RNAi construct suppresses PNPLA3 expression in liver cells (e.g., HepG2 cells) with an IC 50 of about 1 to about 10 nM. The RNAi constructs of the present invention can downregulate PNPLA3 expression in liver cells (e.g., transfected CHO cells expressing human PNPLA3 I148I or I148M) with an IC50 of less than about 20 nM. For example, the RNAi constructs downregulate PNPLA3 expression in liver cells with an IC50 of from about 0.001 to about 20 nM, from about 0.001 to about 10 nM, from about 0.001 to about 5 nM, from about 0.001 to about 1 nM, from about 0.1 to about 10 nM, from about 0.1 to about 5 nM, or from about 0 to about 1 nM. In certain embodiments, the RNAi construct suppresses PNPLA3 expression in liver cells (e.g., transfected CHO cells expressing human PNPLA3 I148I or I148M) with an IC 50 of about 1 to about 10 nM.
Конструкции для RNAi по настоящему изобретению можно легко получить с использованием методик, известных в данной области, например, с использованием обычного твердофазного синтеза нуклеиновых кислот. Полинуклеотиды конструкции для RNAi могут быть собраны на подходящем синтезаторе нуклеиновых кислот с использованием стандартных нуклеотидных или нуклеозидных предшественников (например, фосфорамидитов). Автоматизированные синтезаторы нуклеиновых кислот продаются коммерчески несколькими поставщиками, включая синтезаторы ДНК/РНК от Applied Biosystems (Фостер Сити, Калифорния), синтезаторы MerMade от BioAutomation (Ирвинг, Техас) и синтезаторы OligoPilot от GE Healthcare Life Sciences (Питтсбург, Пенсильвания).The RNAi constructs of the present invention can be readily prepared using techniques known in the art, such as using conventional solid-phase nucleic acid synthesis. The polynucleotides of the RNAi construct can be assembled on a suitable nucleic acid synthesizer using standard nucleotide or nucleoside precursors (e.g., phosphoramidites). Automated nucleic acid synthesizers are commercially available from several suppliers, including DNA/RNA synthesizers from Applied Biosystems (Foster City, Calif.), MerMade synthesizers from BioAutomation (Irving, Texas), and OligoPilot synthesizers from GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, Pa.).
Для синтеза олигонуклеотидов посредством химии фосфорамидитов может быть использована 2'-силильная защитная группа в сочетании с кислотолабильным диметокситритилом (DMT) в 5'-положении рибонуклеозидов. Известно, что конечные условия снятия защиты не приводят к значительной деградации РНК-продуктов. Все процессы синтеза можно проводить в любом автоматическом или ручном синтезаторе в большом, среднем или малом масштабе. Синтез также можно проводить в многолуночных планшетах, колонках или предметных стеклах.For the synthesis of oligonucleotides via phosphoramidite chemistry, a 2'-silyl protecting group can be used in combination with acid-labile dimethoxytrityl (DMT) at the 5' position of ribonucleosides. The final deprotection conditions are known to result in no significant degradation of the RNA products. All synthesis processes can be performed in any automated or manual synthesizer in large, medium or small scale. Synthesis can also be performed in multiwell plates, columns or glass slides.
2'-О-Силильную группу можно удалить посредством воздействия фторид-ионов, которые могут представлять собой любой источник фторид-иона, например, те соли, которые содержат фторид-ион в сочетании с неорганическими противоионами, например фторид цезия и фторид калия, или те соли, которые содержат фторид-ион в паре с органическим противоионом, например тетраалкиламмонийфторидом. В реакции снятия защиты можно использовать краун-эфирный катализатор в комбинации с неорганическим фторидом. Предпочтительным источником фторид-иона являются тетрабутиламмонийфторид или аминогидрофториды (например, объединение водного HF с триэтиламином в диполярном апротонном растворителе, например, диметилформамиде).The 2'-O-silyl group can be removed by the action of fluoride ions, which can be any source of fluoride ion, for example, those salts which contain fluoride ion in combination with inorganic counterions, for example, cesium fluoride and potassium fluoride, or those salts which contain fluoride ion paired with an organic counterion, for example, tetraalkylammonium fluoride. A crown ether catalyst in combination with an inorganic fluoride can be used in the deprotection reaction. Preferred sources of fluoride ion are tetrabutylammonium fluoride or aminohydrofluorides (for example, combining aqueous HF with triethylamine in a dipolar aprotic solvent, for example, dimethylformamide).
Выбор защитных групп для использования на сложных фосфитных триэфирах и сложных фосфотриэфирах может привести к изменению стабильности сложных триэфиров по отношению к фтору. Метильная защита сложного фосфотриэфира или сложного фосфитетриэфира может стабилизировать связь с ионами фтора и улучшить технологический выход процесса.The choice of protecting groups for use on phosphite triesters and phosphotriesters can alter the stability of the triesters toward fluorine. Methyl protection of a phosphotriester or phosphitetriester can stabilize the bond to fluorine ions and improve process yield.
Поскольку рибонуклеозиды имеют реакционноспособный 2'-гидроксильный заместитель, может быть желательной защита реакционноспособного 2'-положения в РНК защитной группой, которая будет ортогональна 5'-O-диметокситритильной защитной группе, например, устойчивой к обработке кислотой. Силильные защитные группы соответствуют этому критерию и могут быть легко удалены на конечной стадии снятия защиты с фтора, что может привести к минимальной деградации РНК.Since ribonucleosides have a reactive 2'-hydroxyl substituent, it may be desirable to protect the reactive 2' position in RNA with a protecting group that is orthogonal to the 5'-O-dimethoxytrityl protecting group, such as one that is stable to acid treatment. Silyl protecting groups meet this criterion and can be easily removed in the final fluorine deprotection step, which may result in minimal degradation of the RNA.
В стандартной реакции связывания фосфорамидита можно использовать тетразольные катализаторы. Предпочтительные катализаторы включают, например, тетразол, S-этилтетразол, бензилтиотетразол, нитрофенилтетразол.In the standard phosphoramidite coupling reaction, tetrazole catalysts can be used. Preferred catalysts include, for example, tetrazole, S-ethyltetrazole, benzylthiotetrazole, nitrophenyltetrazole.
Специалисту в данной области понятно, что дополнительные способы синтеза конструкций для RNAi, описанные в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области. Кроме того, различные стадии синтеза могут быть выполнены в альтернативной последовательности или для получения требуемых соединений. Другие превращения синтетической химии, защитные группы (например, для гидроксила, амино и т.д., присутствующие на основаниях) и методология защитных групп (защита и снятие защиты), применимые в синтезе конструкции для RNAi, описанные в данном документе, известны из уровня техники и включают, например, такие, как описанные в R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994) и L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) и их последующих изданиях. Синтеза средств для RNAi по индивидуальному заказу также доступен у нескольких коммерческих поставщиков, в том числе от Dharmacon,One skilled in the art will appreciate that additional methods for synthesizing the RNAi constructs described herein will be apparent to those skilled in the art. Furthermore, the various synthetic steps can be performed in an alternative sequence or to provide the desired compounds. Other synthetic chemistry transformations, protecting groups (e.g., for hydroxyl, amino, etc., present on bases), and protecting group methodology (protection and deprotection) useful in synthesizing the RNAi constructs described herein are known in the art and include, for example, those described in R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); TW Greene and PGM Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994) and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) and their subsequent editions. Custom RNAi synthesis reagents are also available from several commercial suppliers, including Dharmacon,
- 14 047656- 14 047656
Inc. (Лафайет, Колорадо), AxoLabs GmbH (Кульмбах, Германия) и Ambion, Inc. (Фостер Сити, Калифорния).Inc. (Lafayette, Colorado), AxoLabs GmbH (Kulmbach, Germany), and Ambion, Inc. (Foster City, California).
Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут содержать лиганд. Используемый в данном документе термин лиганд относится к любому соединению или любой молекуле, которые прямо или косвенно способны взаимодействовать с другим соединением или молекулой. Взаимодействие лиганда с другим соединением или молекулой может вызывать биологический ответ (например, инициировать каскад передачи сигнала, индуцировать рецептор-опосредованный эндоцитоз) или может просто представлять собой физическую связь. Лиганд может модифицировать одно или несколько свойств молекулы двухнитевой РНК, к которой он присоединен, таких как фармакодинамические, фармакокинетические, связывающие, абсорбционные свойства, распределение в клетках, поглощение клеткой, заряд и/или клиренс молекулы РНК.The RNAi constructs of the present invention may comprise a ligand. As used herein, the term ligand refers to any compound or molecule that is directly or indirectly capable of interacting with another compound or molecule. The interaction of the ligand with another compound or molecule may elicit a biological response (e.g., initiate a signal transduction cascade, induce receptor-mediated endocytosis) or may simply be a physical association. The ligand may modify one or more properties of the double-stranded RNA molecule to which it is attached, such as pharmacodynamics, pharmacokinetic, binding, absorption properties, cellular distribution, cellular uptake, charge, and/or clearance of the RNA molecule.
Лиганд может включать белок сыворотки крови (например, человеческий сывороточный альбумин, липопротеин низкой плотности, глобулин), фрагмент холестерина, витамин (биотин, витамин Е, витамин B12), фолатный фрагмент, стероид, желчную кислоту (например, холевую кислоту), жирную кислоту (например, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту), углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту), гликозид, фосфолипид или антитело или его связывающий фрагмент (например, антитело или связывающий фрагмент, который нацеливает конструкцию для RNAi на конкретный тип клеток, такой как клетки печени). Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие агенты (например, акридины), перекрестносшивающие средства (например, псорален, митомицин С), порфирины (TPPC4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например, адамантануксусную кислоту, 1-пиренбутировую кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-O(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецилглицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, 03-(олеоил)литохолевую кислоту, 03-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин), пептиды (например, пептид antennapedia), пептид Tat, пептиды RGD), алкилирующие средства, полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG) (например, PEG-40K), полиаминокислоты и полиамины (например, спермин, спермидин).The ligand may include a serum protein (e.g., human serum albumin, low-density lipoprotein, globulin), a cholesterol moiety, a vitamin (biotin, vitamin E, vitamin B12), a folate moiety, a steroid, a bile acid (e.g., cholic acid), a fatty acid (e.g., palmitic acid, myristic acid), a carbohydrate (e.g., dextran, pullulan, chitin, chitosan, inulin, cyclodextrin, or hyaluronic acid), a glycoside, a phospholipid, or an antibody or binding fragment thereof (e.g., an antibody or binding fragment that targets the RNAi construct to a specific cell type, such as liver cells). Other examples of ligands include dyes, intercalating agents (e.g., acridines), cross-linkers (e.g., psoralen, mitomycin C), porphyrins (TPPC4, texaphyrin, sapphirin), polycyclic aromatic hydrocarbons (e.g., phenazine, dihydrophenazine), artificial endonucleases (e.g., EDTA), lipophilic molecules such as adamantane acetic acid, 1-pyrenebutyric acid, dihydrotestosterone, 1,3-bis-O(hexadecyl)glycerol, geranyloxyhexyl group, hexadecylglycerol, borneol, menthol, 1,3-propanediol, heptadecyl group, 03-(oleoyl)lithocholic acid, 03-(oleoyl)cholenic acid, dimethoxytrityl or phenoxazine), peptides (e.g., peptide antennapedia), Tat peptide, RGD peptides), alkylating agents, polymers such as polyethylene glycol (PEG) (e.g. PEG-40K), polyamino acids and polyamines (e.g. spermine, spermidine).
В определенных вариантах осуществления лиганды обладают эндосомолитическими свойствами. Эндосомолитические лиганды способствуют лизису эндосомы и/или транспорту конструкции для RNAi по настоящему изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может представлять собой поликатионный пептид или пептидомиметик, который проявляет рН-зависимую активность мембраны и фузогенность. В одном варианте осуществления предполагается, что эндосомолитический лиганд имеет функционально активную конформацию при значении pH в эндосоме. Под активной конформацией подразумевается конформация, при которой эндосомолитический лиганд способствует лизису эндосомы и/или транспорту конструкции для RNAi по настоящему изобретению или ее компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Иллюстративные эндосомолитические лиганды включают пептид GALA (Subbarao et al., Biochemistry, Vol. 26, 2964-2972, 1987), пептид EALA (Vogel et al., J. Am. Chern. Soc., Vol. 118, 1581-1586, 1996) и их производные (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1559, 56-68, 2002). В одном варианте осуществления эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислоту), которая претерпевает изменение заряда или протонирование в ответ на изменение pH. Эндосомолитический компонент может быть линейным или разветвленным.In certain embodiments, the ligands have endosomolytic properties. Endosomolytic ligands promote lysis of the endosome and/or transport of the RNAi construct of the present invention or components thereof from the endosome to the cytoplasm of the cell. The endosomolytic ligand can be a polycationic peptide or a peptidomimetic that exhibits pH-dependent membrane activity and fusogenicity. In one embodiment, the endosomolytic ligand is believed to have a functionally active conformation at the pH of the endosome. By active conformation is meant a conformation in which the endosomolytic ligand promotes lysis of the endosome and/or transport of the RNAi construct of the present invention or components thereof from the endosome to the cytoplasm of the cell. Exemplary endosomolytic ligands include GALA peptide (Subbarao et al., Biochemistry, Vol. 26, 2964-2972, 1987), EALA peptide (Vogel et al., J. Am. Chern. Soc., Vol. 118, 1581-1586, 1996), and derivatives thereof (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, Vol. 1559, 56-68, 2002). In one embodiment, the endosomolytic component can comprise a chemical group (e.g., an amino acid) that undergoes a charge change or protonation in response to a change in pH. The endosomolytic component can be linear or branched.
В некоторых вариантах осуществления лиганд содержит липид или другую гидрофобную молекулу. В одном варианте осуществления лиганд содержит фрагмент холестерина или другой стероид. Сообщали, что конъюгированные с холестерином олигонуклеотиды более активны, чем их неконъюгированные аналоги (Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development, Vol. 12, 103-228, 2002). Лиганды, содержащие фрагменты холестерина и другие липиды для конъюгации с молекулами нуклеиновых кислот, также были описаны в патентах США № 7851615; 7745608 и 7833992, которые все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В другом варианте осуществления лиганд содержит фолатный фрагмент. Полинуклеотиды, конъюгированные с фолатными фрагментами, могут поглощаться клетками через рецепторно-опосредованный путь эндоцитоза. Такие конъюгаты фолатполинуклеотид описаны в патенте США № 8188247, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.In some embodiments, the ligand comprises a lipid or other hydrophobic molecule. In one embodiment, the ligand comprises a cholesterol moiety or another steroid. Cholesterol-conjugated oligonucleotides have been reported to be more active than their unconjugated counterparts (Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Development, Vol. 12, 103-228, 2002). Ligands comprising cholesterol moieties and other lipids for conjugation to nucleic acid molecules have also been described in U.S. Pat. Nos. 7,851,615; and 7,833,992, all of which are incorporated herein by reference in their entireties. In another embodiment, the ligand comprises a folate moiety. Polynucleotides conjugated to folate moieties can be taken up by cells via the receptor-mediated endocytosis pathway. Such folate polynucleotide conjugates are described in U.S. Patent No. 8,188,247, which is incorporated herein by reference in its entirety.
Принимая во внимание, что PNPLA3 экспрессируется в клетках печени (например, в гепатоцитах), в определенных вариантах осуществления желательно специфично доставлять конструкцию для RNAi именно в эти клетки печени. В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi могут быть специфично нацелены на печень путем использования лигандов, которые связываются или взаимодействуют с белками, экспрессируемыми на поверхности клеток печени. Например, в определенных вариантах осуществления лиганды могут содержать антигенсвязывающие белки (например, антитела или их связывающие фрагменты (например, Fab, scFv)), которые специфически связываются с рецептором, экспрессируемым на гепатоцитах.Given that PNPLA3 is expressed in liver cells (e.g., hepatocytes), in certain embodiments, it is desirable to specifically deliver the RNAi construct to these liver cells. In some embodiments, the RNAi constructs can be specifically targeted to the liver by using ligands that bind or interact with proteins expressed on the surface of liver cells. For example, in certain embodiments, the ligands can comprise antigen-binding proteins (e.g., antibodies or binding fragments thereof (e.g., Fab, scFv)) that specifically bind to a receptor expressed on hepatocytes.
- 15 047656- 15 047656
В определенных вариантах осуществления лиганд содержит углевод. Термин углевод относится к соединению, состоящему из одного или нескольких моносахаридных звеньев, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода. Углеводы включают без ограничения сахара (например, моносахариды, дисахариды, трисахариды, тетрасахариды и олигосахариды, содержащие от приблизительно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 моносахаридных единиц) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. В некоторых вариантах осуществления углевод, включенный в лиганд, представляет собой моносахарид, выбранный из пентозы, гексозы или гептозы, и ди- и трисахариды, включающие такие моносахаридные звенья. В других вариантах осуществления углевод, встроенный в лиганд, представляет собой аминосахар, такой как галактозамин, глюкозамин, N-ацетилгалактозамин и N-ацетилглюкозамин.In certain embodiments, the ligand comprises a carbohydrate. The term carbohydrate refers to a compound consisting of one or more monosaccharide units having at least 6 carbon atoms (which may be linear, branched, or cyclic) with an oxygen, nitrogen, or sulfur atom bonded to each carbon atom. Carbohydrates include, but are not limited to, sugars (e.g., monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, and oligosaccharides containing from about 4, 5, 6, 7, 8, or 9 monosaccharide units) and polysaccharides such as starches, glycogen, cellulose, and polysaccharide gums. In some embodiments, the carbohydrate included in the ligand is a monosaccharide selected from pentose, hexose, or heptose, and di- and trisaccharides including such monosaccharide units. In other embodiments, the carbohydrate incorporated into the ligand is an amino sugar such as galactosamine, glucosamine, N-acetylgalactosamine, and N-acetylglucosamine.
В некоторых вариантах осуществления лиганд содержит гексозу или гексозамин. Гексоза может быть выбрана из глюкозы, галактозы, маннозы, фукозы или фруктозы. Г ексозамин может быть выбран из фруктозамина, галактозамина, глюкозамина или маннозамина. В определенных вариантах осуществления лиганд содержит глюкозу, галактозу, галактозамин или глюкозамин. В одном варианте осуществления лиганд содержит глюкозу, глюкозамин или N-ацетилглюкозамин. В другом варианте осуществления лиганд содержит галактозу, галактозамин или N-ацетилгалактозамин. В конкретных вариантах осуществления лиганд содержит N-ацетилгалактозамин. Лиганды, содержащие глюкозу, галактозу и N-ацетилгалактозамин (GalNAc), особенно эффективны в нацеливании соединений на клетки печени. Смотрите, например, D'Souza and Devarajan, J. Control Release, Vol. 203, 126-139, 2015. Примеры GalNAcили галактозосодержащих лигандов, которые могут быть встроены в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, описаны в патентах США № 7491805; 8106022 и 8877917; в публикации патента США № 2003/0130186 и публикации WIPO № WO 2013/166155, которые все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.In some embodiments, the ligand comprises a hexose or a hexosamine. The hexose can be selected from glucose, galactose, mannose, fucose, or fructose. The hexosamine can be selected from fructosamine, galactosamine, glucosamine, or mannosamine. In certain embodiments, the ligand comprises glucose, galactose, galactosamine, or glucosamine. In one embodiment, the ligand comprises glucose, glucosamine, or N-acetylglucosamine. In another embodiment, the ligand comprises galactose, galactosamine, or N-acetylgalactosamine. In specific embodiments, the ligand comprises N-acetylgalactosamine. Ligands comprising glucose, galactose, and N-acetylgalactosamine (GalNAc) are particularly effective in targeting compounds to liver cells. See, for example, D'Souza and Devarajan, J. Control Release, Vol. 203, 126-139, 2015. Examples of GalNAc or galactose-containing ligands that can be incorporated into the RNAi constructs of the present invention are described in U.S. Patent Nos. 7,491,805; 8,106,022; and 8,877,917; U.S. Patent Publication No. 2003/0130186; and WIPO Publication No. WO 2013/166155, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
В определенных вариантах осуществления лиганд содержит мультивалентный углеводный фрагмент. Используемый в данном документе термин мультивалентный углеводный фрагмент относится к фрагменту, содержащему два или более углеводных звеньев, способных независимо связываться или взаимодействовать с другими молекулами. Например, мультивалентный углеводный фрагмент содержит два или более связывающих домена, состоящих из углеводов, которые могут связываться с двумя или более различными молекулами или двумя или более различными участками на одной и той же молекуле. Валентность углеводного фрагмента обозначает количество отдельных связывающих доменов в углеводном фрагменте. К примеру, термины одновалентный, двухвалентный, трехвалентный и четырехвалентный, относящиеся к углеводному фрагменту, относятся к углеводным фрагментам с одним, двумя, тремя и четырьмя связывающими доменами соответственно. Мультивалентный углеводный фрагмент может содержать мультивалентный лактозный фрагмент, мультивалентный галактозный фрагмент, мультивалентный глюкозный фрагмент, мультивалентный N-ацетилгалактозаминовый фрагмент, мультивалентный N-ацетилглюкозаминовый фрагмент, мультивалентный маннозный фрагмент или мультивалентный фукозный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления лиганд содержит мультивалентный галактозный фрагмент. В других вариантах осуществления лиганд содержит мультивалентный N-ацетилгалактозаминовый фрагмент. В этих и других вариантах осуществления мультивалентный углеводный фрагмент является двухвалентным, трехвалентным или четырехвалентным. В таких вариантах осуществления мультивалентный углеводный фрагмент может быть двухантенным или трехантенным. В одном конкретном варианте осуществления мультивалентный N-ацетилгалактозаминовый фрагмент является трехвалентным или четырехвалентным. В другом конкретном варианте осуществления мультивалентный галактозный фрагмент является трехвалентным или четырехвалентным. Иллюстративные трехвалентные и четырехвалентные GalNAc-содержащие лиганды для встраивания в конструкции для RNAi по настоящему изобретению подробно описаны ниже.In certain embodiments, the ligand comprises a multivalent carbohydrate moiety. As used herein, the term multivalent carbohydrate moiety refers to a moiety comprising two or more carbohydrate units that are capable of independently binding or interacting with other molecules. For example, a multivalent carbohydrate moiety comprises two or more binding domains consisting of carbohydrates that can bind to two or more different molecules or two or more different sites on the same molecule. The valency of a carbohydrate moiety refers to the number of individual binding domains in the carbohydrate moiety. For example, the terms monovalent, divalent, trivalent, and tetravalent, when referring to a carbohydrate moiety, refer to carbohydrate moieties with one, two, three, and four binding domains, respectively. The multivalent carbohydrate moiety may comprise a multivalent lactose moiety, a multivalent galactose moiety, a multivalent glucose moiety, a multivalent N-acetylgalactosamine moiety, a multivalent N-acetyl glucosamine moiety, a multivalent mannose moiety, or a multivalent fucose moiety. In some embodiments, the ligand comprises a multivalent galactose moiety. In other embodiments, the ligand comprises a multivalent N-acetylgalactosamine moiety. In these and other embodiments, the multivalent carbohydrate moiety is divalent, trivalent, or tetravalent. In such embodiments, the multivalent carbohydrate moiety may be biantennary or triantennary. In one particular embodiment, the multivalent N-acetylgalactosamine moiety is trivalent or tetravalent. In another particular embodiment, the multivalent galactose moiety is trivalent or tetravalent. Illustrative trivalent and tetravalent GalNAc-containing ligands for incorporation into RNAi constructs of the present invention are described in detail below.
Лиганд может быть присоединен или конъюгирован с молекулой РНК конструкции для RNAi непосредственно или опосредованно. К примеру, в некоторых вариантах осуществления лиганд ковалентно присоединен непосредственно к смысловой или антисмысловой нити конструкции для RNAi. В других вариантах осуществления лиганд ковалентно присоединен через линкер к смысловой или антисмысловой нити конструкции для RNAi. Лиганд может быть присоединен к нуклеиновым основаниям, сахарным фрагментам или межнуклеотидным связям полинуклеотидов (например, смысловой нити или антисмысловой нити) конструкции для RNAi по настоящему изобретению. Конъюгирование или присоединение к пуриновым нуклеиновым основаниям или их производным может происходить в любом положении, включая эндоциклические и экзоциклические атомы. В определенных вариантах осуществления 2-, 6-, 7или 8-положения пуринового нуклеинового основания присоединены к лиганду. Конъюгация с пиримидиновыми нуклеиновыми основаниями или их производными или присоединение к ним также может происходить в любом положении. В некоторых вариантах осуществления 2-, 5- и 6-положения пиримидинового нуклеинового основания могут быть присоединены к лиганду. Конъюгация с сахарными фрагментами нуклеотидов или присоединение к ним может происходить при любом атоме углерода. Иллюстративные атомы углерода сахарного фрагмента, которые могут быть присоединены к лиганду, включаютThe ligand may be attached or conjugated to the RNA molecule of the RNAi construct directly or indirectly. For example, in some embodiments, the ligand is covalently attached directly to the sense or antisense strand of the RNAi construct. In other embodiments, the ligand is covalently attached through a linker to the sense or antisense strand of the RNAi construct. The ligand may be attached to nucleobases, sugar moieties, or internucleotide linkages of polynucleotides (e.g., the sense strand or the antisense strand) of the RNAi construct of the present invention. Conjugation or attachment to purine nucleobases or derivatives thereof may occur at any position, including endocyclic and exocyclic atoms. In certain embodiments, the 2-, 6-, 7-, or 8-position of the purine nucleobase is attached to the ligand. Conjugation with or attachment to pyrimidine nucleobases or derivatives thereof may also occur at any position. In some embodiments, the 2-, 5-, and 6-positions of a pyrimidine nucleobase may be attached to the ligand. Conjugation with or attachment to sugar moieties of nucleotides may occur at any carbon atom. Exemplary carbon atoms of a sugar moiety that may be attached to a ligand include
- 16 047656 атомы углерода в положениях 2'-, 3'- и 5'. Атом в положении 1' также может быть присоединен к лиганду, такому как остаток основания. Межнуклеотидные связи также могут поддерживать прикрепление лиганда. В случае фосфорсодержащих связей (например, сложной фосфодиэфирной, фосфоротиоатной, фосфородитиоатной, фосфороамидатной и т.п.) лиганд может быть присоединен непосредственно к атому фосфора или к атому O, N или S, связанному с атомом фосфора. В случае аминосодержащих или амидсодержащих межнуклеозидных связей (например, PNA) лиганд может быть присоединен к атому азота амина или амида или к смежному атому углерода.- 16 047656 carbon atoms at positions 2'-, 3'- and 5'. The atom at position 1' may also be attached to a ligand, such as a base residue. Internucleotide linkages may also support ligand attachment. In the case of phosphorus-containing linkages (e.g., phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphoramidate, etc.), the ligand may be attached directly to the phosphorus atom or to an O, N, or S atom bonded to the phosphorus atom. In the case of amine-containing or amide-containing internucleoside linkages (e.g., PNA), the ligand may be attached to the nitrogen atom of the amine or amide or to an adjacent carbon atom.
В определенных вариантах осуществления лиганд может быть присоединен к 3'- или 5'-концу смысловой или антисмысловой нити. В определенных вариантах осуществления лиганд ковалентно присоединен к 5'-концу смысловой нити. В других вариантах осуществления лиганд ковалентно присоединен к 3'-концу смысловой нити. Например, в некоторых вариантах осуществления лиганд присоединен к 3'концевому нуклеотиду смысловой нити. В некоторых таких вариантах осуществления лиганд присоединен в 3'-положении 3'-концевого нуклеотида смысловой нити. В альтернативных вариантах осуществления лиганд присоединен вблизи 3'-конца смысловой нити, но перед одним или несколькими концевыми нуклеотидами (например, перед 1, 2, 3 или 4 концевыми нуклеотидами). В некоторых вариантах осуществления лиганд присоединен в 2'-положении сахара, входящего в состав 3'-концевого нуклеотида смысловой нити.In certain embodiments, the ligand can be attached to the 3' or 5' end of the sense or antisense strand. In certain embodiments, the ligand is covalently attached to the 5' end of the sense strand. In other embodiments, the ligand is covalently attached to the 3' end of the sense strand. For example, in some embodiments, the ligand is attached to the 3' terminal nucleotide of the sense strand. In some such embodiments, the ligand is attached at the 3' position of the 3' terminal nucleotide of the sense strand. In alternative embodiments, the ligand is attached near the 3' end of the sense strand, but before one or more terminal nucleotides (e.g., before 1, 2, 3, or 4 terminal nucleotides). In some embodiments, the ligand is attached at the 2' position of a sugar included in the 3' terminal nucleotide of the sense strand.
В определенных вариантах осуществления лиганд присоединен к смысловой или антисмысловой нити посредством линкера. Термин линкер означает атом или группу атомов, которые ковалентно соединяют лиганд с полинуклеотидным компонентом конструкции для RNAi. Длина линкера может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 30 атомов, от приблизительно 2 до приблизительно 28 атомов, от приблизительно 3 до приблизительно 26 атомов, от приблизительно 4 до приблизительно атомов, от приблизительно 6 до приблизительно 20 атомов, от приблизительно 7 до приблизительно атомов, от приблизительно 8 до приблизительно 20 атомов, от приблизительно 8 до приблизительно атомов, от приблизительно 10 до приблизительно 18 атомов и от приблизительно 12 до приблизительно 18 атомов. В некоторых вариантах осуществления линкер может содержать бифункциональный связывающий фрагмент, который обычно содержит алкильный фрагмент с двумя функциональными группами. Одну из функциональных групп выбирают для связывания с представляющим интерес соединением (например, смысловой или антисмысловой нитью конструкции для RNAi), а другую выбирают для связывания по сути с любой выбранной группой, такой как лиганд, как это описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления линкер содержит структуру цепи или олигомер, которые состоят из повторяющихся звеньев, таких как этиленгликоль или аминокислотные звенья. Примеры функциональных групп, которые обычно используются в бифункциональном связывающем фрагменте, включают без ограничения электрофилы для реакции с нуклеофильными группами и нуклеофилы для реакции с электрофильными группами. В некоторых вариантах осуществления бифункциональные связывающие фрагменты включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, ненасыщенные группы (например, двойные или тройные связи) и им подобные.In certain embodiments, the ligand is attached to the sense or antisense strand by a linker. The term "linker" means an atom or group of atoms that covalently connect the ligand to the polynucleotide component of the RNAi construct. The length of the linker can be from about 1 to about 30 atoms, from about 2 to about 28 atoms, from about 3 to about 26 atoms, from about 4 to about 6 atoms, from about 6 to about 20 atoms, from about 7 to about 8 atoms, from about 8 to about 20 atoms, from about 8 to about 10 atoms, from about 10 to about 18 atoms, and from about 12 to about 18 atoms. In some embodiments, the linker can comprise a bifunctional linking moiety, which typically comprises an alkyl moiety with two functional groups. One of the functional groups is selected to link to a compound of interest (e.g., a sense or antisense strand of an RNAi construct), and the other is selected to link to essentially any selected group, such as a ligand, as described herein. In certain embodiments, the linker comprises a chain structure or oligomer that is composed of repeating units, such as ethylene glycol or amino acid units. Examples of functional groups that are commonly used in a bifunctional linking moiety include, but are not limited to, electrophiles for reaction with nucleophilic groups and nucleophiles for reaction with electrophilic groups. In some embodiments, bifunctional linking moieties include amino, hydroxyl, carboxylic acid, thiol, unsaturated groups (e.g., double or triple bonds), and the like.
Линкеры, которые можно использовать для присоединения лиганда к смысловой или антисмысловой нити в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, включают без ограничения пирролидин, 8-амино-3,6-ди-оксаоктановую кислоту, сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан1-карбоксилат, 6-аминогексановую кислоту, замещенный C1-C10-алкил, замещенный или незамещенный С2-С10-алкенил или замещенный или незамещенный С-Сю-шивил. Предпочтительные группы заместителей для таких линкеров включают без ограничения гидроксил, амино, алкокси, карбокси, бензил, фенил, нитро, тиол, тиоалкокси, галоген, алкил, арил, алкенил и алкинил.Linkers that can be used to attach a ligand to the sense or antisense strand in an RNAi construct of the present invention include, but are not limited to, pyrrolidine, 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid, succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, 6-aminohexanoic acid, substituted C 1 -C 10 alkyl, substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkenyl, or substituted or unsubstituted C 2 -C 10 alkylyl. Preferred substituent groups for such linkers include, but are not limited to, hydroxyl, amino, alkoxy, carboxy, benzyl, phenyl, nitro, thiol, thioalkoxy, halogen, alkyl, aryl, alkenyl, and alkynyl.
В определенных вариантах осуществления линкеры являются расщепляемыми. Расщепляемый линкер представляет собой линкер, который достаточно стабилен вне клетки, но который при поступлении в целевую клетку расщепляется, высвобождая две части, которые линкер удерживает вместе. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый линкер расщепляется по меньшей мере в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или больше или по меньшей мере в 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом контрольном условии (которое может быть выбрано, например, для имитации или представления внутриклеточных состояний), чем в крови субъекта, или при втором контрольном условии (которое может быть выбрано, например, для имитации или представления условий, наблюдаемых в крови или сыворотке крови).In certain embodiments, the linkers are cleavable. A cleavable linker is a linker that is sufficiently stable outside the cell, but which, upon entering the target cell, cleaves, releasing the two portions that the linker holds together. In some embodiments, the cleavable linker cleaves at least 10-fold, 20-fold, 30-fold, 40-fold, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or more, or at least 100-fold faster in the target cell or under a first control condition (which may be selected, for example, to mimic or represent intracellular conditions) than in the subject's blood or under a second control condition (which may be selected, for example, to mimic or represent conditions observed in blood or blood serum).
Расщепляемые линкеры чувствительны к факторам расщепления, например к значению pH, окислительно-восстановительному потенциалу или присутствию деструктивных молекул. Как правило, расщепляющие средства более распространены или обнаруживаются при более высоких уровнях или активности внутри клеток, чем в сыворотке крови или в цельной крови. Примеры таких деструктивных средств включают: окислительно-восстановительные средства, которые выбраны для конкретных субстратов или которые не обладают субстратной специфичности, включая, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать окислительно-восстановительный расщепляемый линкер путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, такие, которыеCleavable linkers are sensitive to cleavage factors such as pH, redox potential, or the presence of degradative molecules. Typically, cleavable agents are more abundant or found at higher levels or activity inside cells than in serum or whole blood. Examples of such degradative agents include: redox agents that are substrate-selective or that lack substrate specificity, including, for example, oxidative or reductive enzymes or reducing agents such as mercaptans present in cells that can degrade a redox cleavable linker by reduction; esterases; endosomes; or agents that can create an acidic environment, such as those that
- 17 047656 приводят к pH пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемый кислотой линкер, действуя как обычная кислота, пептидазы (которые могут быть специфичными для субстрата) и фосфатазы.- 17 047656 result in a pH of five or lower; enzymes that can hydrolyze or degrade the acid-cleavable linker by acting as a general acid, peptidases (which may be substrate specific) and phosphatases.
Расщепляемый линкер может содержать фрагмент, который чувствителен к pH. Значение pH сыворотки крови составляет 7,4, в то время как среднее внутриклеточное pH немного ниже, находясь в пределах, составляющих приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы имеют более кислое значение pH в диапазоне 5,56,0, а лизосомы имеют еще более кислое значение pH, составляющее приблизительно 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую группу, которая расщепляется при предпочтительном pH, высвобождая таким образом молекулу РНК от лиганда внутри клетки или в требуемый компартмент клетки.The cleavable linker may contain a moiety that is sensitive to pH. The pH of blood serum is 7.4, while the average intracellular pH is slightly lower, ranging from approximately 7.1 to 7.3. Endosomes have a more acidic pH in the range of 5.5-6.0, and lysosomes have an even more acidic pH of approximately 5.0. Some linkers will have a cleavable group that cleaves at a preferred pH, thereby releasing the RNA molecule from the ligand within the cell or into a desired compartment of the cell.
Линкер может включать расщепляемую группу, которая расщепляется определенным ферментом. Тип расщепляемой группы, встроенной в линкер, может зависеть от целевой клетки. Например, нацеливающие на печень лиганды могут быть связаны с молекулами РНК посредством линкера, который включает сложноэфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, поэтому линкер будет более эффективно расщепляться в клетках печени, чем в других типах клеток, которые не богаты эстеразой. Другие типы клеток, богатых эстеразами, включают клетки легких, коркового вещества почек и яичка. Линкеры, содержащие пептидные связи, могут быть использованы при нацеливании на клетки, богатые пептидазами, такие как клетки печени и синовиоциты.The linker may include a cleavable group that is cleaved by a specific enzyme. The type of cleavable group incorporated into the linker may depend on the target cell. For example, liver-targeting ligands may be linked to RNA molecules via a linker that includes an ester group. Liver cells are rich in esterases, so the linker will be cleaved more efficiently in liver cells than in other cell types that are not esterase rich. Other esterase-rich cell types include lung, renal cortex, and testicular cells. Linkers containing peptide bonds may be used when targeting peptidase-rich cells such as liver cells and synoviocytes.
В целом пригодность расщепляемого кандидатного линкера может быть оценена путем тестирования способности деструктивного средства (или состояния) расщеплять кандидатный линкер. Также будет желательно проверить кандидатный расщепляемый линкер на способность противостоять расщеплению в крови или при контакте с другой нецелевой тканью. Таким образом, можно определить и выбрать относительную восприимчивость к расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбрано для указания расщепления в клетке-мишени, а второе выбрано для указания расщепления в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке крови. Такое оценивание можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органов или тканей или у целых животных. Может быть полезным провести первоначальное оценивание в условиях бесклеточных систем или условиях культивирования и подтвердить результаты дальнейшим оцениванием у целых животных. В некоторых вариантах осуществления полезные кандидатные линкеры расщепляются по меньшей мере в 2, 4, 10, 20, 50, 70 или 100 раз быстрее внутри клетки (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой крови (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внеклеточных условий).In general, the suitability of a cleavable candidate linker can be assessed by testing the ability of a degradative agent (or condition) to cleave the candidate linker. It will also be desirable to test the candidate cleavable linker for its ability to resist cleavage in blood or upon contact with other non-target tissue. In this way, the relative susceptibility to cleavage can be determined and selected between the first and second conditions, where the first is selected to indicate cleavage in the target cell and the second is selected to indicate cleavage in other tissues or biological fluids, such as blood or serum. Such evaluation can be performed in cell-free systems, in cells, in cell culture, in organ or tissue culture, or in whole animals. It may be useful to perform an initial evaluation in cell-free conditions or culture conditions and confirm the results by further evaluation in whole animals. In some embodiments, useful candidate linkers are cleaved at least 2, 4, 10, 20, 50, 70, or 100 times faster inside a cell (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) than in blood or blood serum (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions).
В других вариантах осуществления используют редокс-расщепляемые линкеры. Редоксрасщепляемые линкеры расщепляются при окислении или восстановлении. Примером восстановительнорасщепляемой группы является дисульфидная связывающая группа (-S-S-). Чтобы определить, является ли кандидатный расщепляемый линкер подходящим восстановительно-расщепляемым линкером или, например, подходит ли он для использования с определенной конструкцией для RNAi и с определенным лигандом, можно использовать одну или несколько методик, описанных в данном документе. Например, кандидатный линкер можно оценить путем инкубации с дитиотреитолом (DTT) или другим восстановителем, известным в данной области, который имитирует скорость расщепления, которая наблюдается в клетке, например в клетке-мишени. Кандидатные линкеры также можно оценивать в условиях, выбранных для имитации условий, протекающих в крови или в сыворотке крови. В конкретном варианте осуществления кандидатные линкеры расщепляются в крови не более чем на 10%. В других вариантах осуществления применимые кандидатные линкеры расщепляются в по меньшей мере 2, 4, 10, 20, 50, 70 или 100 раз быстрее внутри клетки (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в условиях in vitro, выбранных для имитации внеклеточных условий).In other embodiments, redox-cleavable linkers are used. Redox-cleavable linkers are cleavable upon oxidation or reduction. An example of a reductively cleavable group is a disulfide linking group (-S-S-). To determine whether a candidate cleavable linker is a suitable reductively cleavable linker or, for example, whether it is suitable for use with a particular RNAi construct and a particular ligand, one or more of the techniques described herein can be used. For example, a candidate linker can be evaluated by incubation with dithiothreitol (DTT) or another reducing agent known in the art that mimics the rate of cleavage that occurs in a cell, such as a target cell. Candidate linkers can also be evaluated under conditions selected to mimic conditions that occur in blood or serum. In a particular embodiment, candidate linkers are cleaved in blood by no more than 10%. In other embodiments, useful candidate linkers are cleaved at least 2, 4, 10, 20, 50, 70, or 100 times faster inside a cell (or under in vitro conditions selected to mimic intracellular conditions) than in blood (or under in vitro conditions selected to mimic extracellular conditions).
В еще одних дополнительных вариантах осуществления расщепляемые линкеры на основе фосфатов расщепляются средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое гидролизует фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как внутриклеточные фосфатазы.In still further embodiments, cleavable phosphate-based linkers are cleaved by agents that destroy or hydrolyze the phosphate group. An example of an agent that hydrolyzes phosphate groups in cells are enzymes such as intracellular phosphatases.
Примерами расщепляемых групп на основе фосфатов являются -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-.Examples of phosphate-based cleavable groups are -OP(O)(OR k )-O-, -OP(S)(OR k )-O-, -OP(S)(SRk)-O-, -SP(O) (OR k )-O-, -OP(O)(OR k )-S-, -SP(O)(OR k )-S-, -OP(S)(OR k )-S-, -SP( S)(OR k )-O-, -OP(O)(Rk)-O-, -OP(S)(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-O-, -SP(S )(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-S-, -OP(S)(Rk)-S-.
Конкретные варианты осуществления включают -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-.Specific embodiments include -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-.
Другим конкретным вариантом осуществления является -O-P(O)(OH)-O-. Данные кандидатные линкеры могут быть оценены с использованием методик, аналогичных описанным выше.Another specific embodiment is -O-P(O)(OH)-O-. These candidate linkers can be evaluated using methods similar to those described above.
В других вариантах осуществления линкеры могут содержать кислотно-расщепляемые группы, которые представляют собой группы, расщепляемые в кислых условиях. В некоторых вариантах осуществления кислотно-расщепляемые группы расщепляются в кислой среде со значением pH, составляющим приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,5, 5,0 или ниже), или средствами, такими как ферменты, которые могут действовать как обычная кислота. В клетке специфические органеллы сIn other embodiments, the linkers may contain acid-cleavable groups, which are groups that are cleavable under acidic conditions. In some embodiments, the acid-cleavable groups are cleavable in an acidic environment with a pH of about 6.5 or lower (e.g., about 6.0, 5.5, 5.0, or lower) or by means such as enzymes that can act as a normal acid. In a cell, specific organelles with
- 18 047656 низким pH, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить среду для расщепления кислотнорасщепляемых групп. Примеры кислотно-расщепляемых связывающих групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Кислотно-расщепляемые группы могут иметь общую формулу -C=NN-, C(O)O или -OC(O). Конкретным вариантом осуществления является случай, когда углерод, присоединенный к кислороду сложного эфира (алкоксигруппа), представляет собой арильную группу, замещенную алкильную группу или третичную алкильную группу, такую как диметил, пентил или трет-бутил. Данные кандидатные группы могут быть оценены с использованием методик, аналогичных описанным выше.- 18 047656 low pH, such as endosomes and lysosomes, can provide an environment for the cleavage of acid-cleavable groups. Examples of acid-cleavable linking groups include, but are not limited to, hydrazones, esters, and amino acid esters. Acid-cleavable groups can have the general formula -C=NN-, C(O)O, or -OC(O). A particular embodiment is the case where the carbon attached to the oxygen of the ester (an alkoxy group) is an aryl group, a substituted alkyl group, or a tertiary alkyl group such as dimethyl, pentyl, or tert-butyl. These candidate groups can be evaluated using techniques similar to those described above.
В других вариантах осуществления линкеры могут содержать расщепляемые группы на основе сложных эфиров, которые расщепляются ферментами, такими как внутриклеточные эстеразы и амидазы. Примеры расщепляемых сложноэфирных групп включают без ограничения сложные эфиры алкиленовых, алкениленовых и алкиниленовых групп. Расщепляемые сложным эфиром группы имеют общую формулу -C(O)O- или -OC(O)-. Данные кандидатные линкеры могут быть оценены с использованием методик, аналогичных описанным выше.In other embodiments, the linkers may comprise ester-based cleavable groups that are cleavable by enzymes such as intracellular esterases and amidases. Examples of cleavable ester groups include, but are not limited to, esters of alkylene, alkenylene, and alkynylene groups. Ester-cleavable groups have the general formula -C(O)O- or -OC(O)-. These candidate linkers may be evaluated using methods similar to those described above.
В дополнительных вариантах осуществления линкеры могут содержать расщепляемые группы на основе пептидов, которые расщепляются такими ферментами, как внутриклеточные пептидазы и протеазы. Расщепляемые группы на основе пептидов представляют собой пептидные связи, образовавшиеся между аминокислотами с образованием олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т.д.) и полипептидов. Расщепляемые группы на основе пептидов не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть образована между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи между аминокислотами, необходимой для образования пептидов и белков. Расщепляемая группа на основе пептидов обычно ограничена пептидной связью (то есть амидной связью) между аминокислотами, образующей пептиды и белки, и не включает всю амидную функциональную группу. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов имеют общую формулу -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, где RA и RB являются R-группами двух смежных аминокислот. Данные кандидатные группы могут быть оценены с использованием методик, аналогичных описанным выше.In additional embodiments, the linkers may comprise peptide-based cleavable groups that are cleavable by enzymes such as intracellular peptidases and proteases. Peptide-based cleavable groups are peptide bonds formed between amino acids to form oligopeptides (e.g., dipeptides, tripeptides, etc.) and polypeptides. Peptide-based cleavable groups do not include an amide group (-C(O)NH-). The amide group can be formed between any alkylene, alkenylene, or alkynylene. A peptide bond is a special type of amide bond between amino acids necessary for the formation of peptides and proteins. A peptide-based cleavable group is typically limited to a peptide bond (i.e., an amide bond) between amino acids forming peptides and proteins and does not include the entire amide functionality. Peptide-based cleavable linking groups have the general formula -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, where RA and RB are the R groups of two adjacent amino acids. These candidate groups can be evaluated using methods similar to those described above.
Другие типы линкеров, подходящие для присоединения лигандов к смысловой или антисмысловой нитям в конструкции для RNAi по настоящему изобретению, известны из уровня техники и могут включать линкеры, описанные в патентах США № 7723509; 8017762; 8828956; 8877917 и 9181551, которые все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.Other types of linkers suitable for attaching ligands to the sense or antisense strands in the RNAi construct of the present invention are known in the art and may include those described in U.S. Patent Nos. 7,723,509; 8,017,762; 8,828,956; 8,877,917; and 9,181,551, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
В определенных вариантах осуществления лиганд, ковалентно присоединенный к смысловой или антисмысловой нити конструкции для RNAi по настоящему изобретению, содержит фрагмент GalNAc, например мультивалентный фрагмент GalNAc. В некоторых вариантах осуществления мультивалентный фрагмент GalNAc представляет собой трехвалентный фрагмент GalNAc, и он присоединен к 3'-концу смысловой нити. В других вариантах осуществления мультивалентный фрагмент GalNAc представляет собой трехвалентный фрагмент GalNAc, и он присоединен к 5'-концу смысловой нити. В еще одних дополнительных вариантах осуществления мультивалентный фрагмент GalNAc представляет собой четырехвалентный фрагмент GalNAc, и он присоединен к 3'-концу смысловой нити. В еще одних дополнительных вариантах осуществления мультивалентный фрагмент GalNAc представляет собой четырехвалентный фрагмент GalNAc, и он присоединен к 5'-концу смысловой нити.In certain embodiments, a ligand covalently attached to the sense or antisense strand of an RNAi construct of the present invention comprises a GalNAc moiety, such as a multivalent GalNAc moiety. In some embodiments, the multivalent GalNAc moiety is a trivalent GalNAc moiety and is attached to the 3' end of the sense strand. In other embodiments, the multivalent GalNAc moiety is a trivalent GalNAc moiety and is attached to the 5' end of the sense strand. In yet further embodiments, the multivalent GalNAc moiety is a tetravalent GalNAc moiety and is attached to the 3' end of the sense strand. In yet further embodiments, the multivalent GalNAc moiety is a tetravalent GalNAc moiety and is attached to the 5' end of the sense strand.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут быть доставлены в клетку или ткань, представляющие интерес, путем введения вектора, который кодирует и контролирует внутриклеточную экспрессию конструкции для RNAi. Термин вектор (также упоминаемый в данном документе как вектор экспрессии) относится к композиции вещества, которая может быть использована для доставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты внутрь клетки. Из уровня техники известны многочисленные векторы, включая без ограничения линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, а также плазмиды и вирусы. Таким образом, термин вектор включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Примеры вирусных векторов включают без ограничения аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы и им подобные. Вектор может реплицироваться в живой клетке или может быть получен синтетическим путем.In some embodiments, the RNAi constructs of the present invention can be delivered to a cell or tissue of interest by introducing a vector that encodes and controls intracellular expression of the RNAi construct. The term vector (also referred to herein as an expression vector) refers to a composition of matter that can be used to deliver a nucleic acid of interest into a cell. Numerous vectors are known in the art, including, but not limited to, linear polynucleotides, polynucleotides linked to ionic or amphiphilic compounds, and plasmids and viruses. Thus, the term vector includes an autonomously replicating plasmid or virus. Examples of viral vectors include, but are not limited to, adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, retrovirus vectors, and the like. The vector can replicate in a living cell or can be produced synthetically.
В общих чертах вектор для экспрессии конструкции для RNAi по настоящему изобретению будет содержать один или несколько промоторов, функционально связанных с последовательностями, кодирующими конструкцию для RNAi. Используемые в данном документе выражения функционально связанный или под контролем транскрипции означают, что промотор находится в правильном положении и правильной ориентации относительно полинуклеотидной последовательности, чтобы контролировать инициацию транскрипции РНК-полимеразой и экспрессию полинуклеотидной последовательности. Термин промотор относится к последовательности, распознаваемой синтетическим аппаратом клетки, или к введенному синтетическому аппарату, необходимому для инициации специфической транскрипции последовательности гена. Подходящие промоторы включают без ограничения RNA pol I, pol II, HI или U6 RNA pol III, а также вирусные промоторы (например, промотор немедленно-раннего гена цитомегаIn general, a vector for expressing an RNAi construct of the present invention will comprise one or more promoters operably linked to sequences encoding the RNAi construct. As used herein, the terms operably linked or under transcriptional control mean that the promoter is in the correct position and orientation relative to the polynucleotide sequence to control the initiation of transcription by RNA polymerase and the expression of the polynucleotide sequence. The term promoter refers to a sequence recognized by the synthetic machinery of a cell, or to an introduced synthetic machinery, necessary for the initiation of specific transcription of a gene sequence. Suitable promoters include, but are not limited to, RNA pol I, pol II, HI, or U6 RNA pol III, as well as viral promoters (e.g., the cytomegalovirus immediate early gene promoter).
- 19 047656 ловируса человека (CMV), ранний промотор SV40 и длинный кольцевой повтор вируса саркомы Рауса). В некоторых вариантах осуществления предпочтительным является промотор HI или U6RNA pol III. Промотор может быть тканеспецифичным или индуцируемым промотором. Особый интерес представляют специфичные для печени промоторы, такие как промоторные последовательности гена альфа-1антитрипсина человека, гена альбумина, гена гемопексина и гена липазы печени. Индуцируемые промоторы включают промоторы, регулируемые экдизоном, эстрогеном, прогестероном, тетрациклином и изопропил-PD 1 -тиогалактопиранозидом (IPTG).- 19 047656 human lovirus (CMV), SV40 early promoter and Rous sarcoma virus long circular repeat). In some embodiments, the HI or U6RNA pol III promoter is preferred. The promoter may be tissue-specific or an inducible promoter. Of particular interest are liver-specific promoters such as the promoter sequences of the human alpha-1 antitrypsin gene, the albumin gene, the hemopexin gene and the liver lipase gene. Inducible promoters include those regulated by ecdysone, estrogen, progesterone, tetracycline and isopropyl-PD 1 -thiogalactopyranoside (IPTG).
В некоторых вариантах осуществления, в которых конструкция для RNAi содержит siRNA, две отдельные нити (смысловая и антисмысловая нити) могут экспрессироваться с одного вектора или из двух отдельных векторов. Например, в одном варианте осуществления последовательность, кодирующая смысловую нить, функционально связана с промотором на первом векторе, а последовательность, кодирующая антисмысловую нить, функционально связана с промотором на втором векторе. В таком варианте осуществления первый и второй векторы вводят совместно, например путем инфекции или трансфекции, в клетку-мишень, так что смысловая и антисмысловая нити после прохождения транскрипции будут гибридизоваться внутри клетки с образованием молекулы siRNA. В другом варианте осуществления смысловая и антисмысловая нити транскрибируются с двух разных промоторов, расположенных в одном векторе. В некоторых таких вариантах осуществления последовательность, кодирующая смысловую нить, функционально связана с первым промотором, а последовательность, кодирующая антисмысловую нить, функционально связана со вторым промотором, при этом первый и второй промоторы расположены в одном векторе. В одном варианте осуществления вектор содержит первый промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей молекулу siRNA, и второй промотор, функционально связанный с той же последовательностью в противоположном направлении, так что транскрипция последовательности из первого промотора приводит к синтезу смысловой нити молекулы siRNA, а транскрипция последовательности из второго промотора приводит к синтезу антисмысловой нити молекулы siRNA.In some embodiments in which the RNAi construct comprises siRNA, two separate strands (sense and antisense strands) may be expressed from a single vector or from two separate vectors. For example, in one embodiment, a sequence encoding the sense strand is operably linked to a promoter on a first vector and a sequence encoding the antisense strand is operably linked to a promoter on a second vector. In such an embodiment, the first and second vectors are introduced together, such as by infection or transfection, into a target cell such that the sense and antisense strands, after transcription, will hybridize within the cell to form an siRNA molecule. In another embodiment, the sense and antisense strands are transcribed from two different promoters located on a single vector. In some such embodiments, the sequence encoding the sense strand is operably linked to the first promoter and the sequence encoding the antisense strand is operably linked to the second promoter, wherein the first and second promoters are located on a single vector. In one embodiment, the vector comprises a first promoter operably linked to a sequence encoding an siRNA molecule and a second promoter operably linked to the same sequence in the opposite direction, such that transcription of the sequence from the first promoter results in synthesis of the sense strand of the siRNA molecule, and transcription of the sequence from the second promoter results in synthesis of the antisense strand of the siRNA molecule.
В других вариантах осуществления, в которых конструкция для RNAi содержит shRNA, последовательность, кодирующая одну по меньшей мере частично самокомплементарную молекулу РНК, функционально связана с промотором, что приводит к продуцированию одного транскрипта. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая shRNA, содержит инвертированный повтор, связанный линкерной полинуклеотидной последовательностью, что приводит к продуцированию структуры стебля и петли shRNA после транскрипции.In other embodiments, in which the RNAi construct comprises an shRNA, a sequence encoding one at least partially self-complementary RNA molecule is operably linked to a promoter, resulting in the production of one transcript. In some embodiments, the shRNA encoding sequence comprises an inverted repeat linked by a linker polynucleotide sequence, resulting in the production of an shRNA stem and loop structure after transcription.
В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий конструкцию для RNAi по настоящему изобретению, представляет собой вирусный вектор. Разные вирусные векторные системы, подходящие для экспрессии конструкций для RNAi, описанных в данном документе, включают без ограничения аденовирусные векторы, ретровирусные векторы (например, лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Малони), аденоассоциированные вирусные векторы; векторы на основе вируса простого герпеса; векторы на основе SV40; векторы на основе вируса полиомы; векторы на основе вируса папилломы; векторы на основе пикорнавируса и векторы на основе вируса оспы (например, вируса коровьей оспы). В определенных вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор (например, лентивирусный вектор).In some embodiments, a vector encoding an RNAi construct of the present invention is a viral vector. Various viral vector systems suitable for expressing the RNAi constructs described herein include, but are not limited to, adenoviral vectors, retroviral vectors (e.g., lentiviral vectors, Maloney murine leukemia virus), adeno-associated viral vectors; herpes simplex virus vectors; SV40 vectors; polyoma virus vectors; papilloma virus vectors; picornavirus vectors, and pox virus (e.g., vaccinia virus) vectors. In certain embodiments, the viral vector is a retroviral vector (e.g., a lentiviral vector).
Разные векторы, подходящие для использования в настоящем изобретении, способы вставки последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих молекулы siRNA или shRNA, в векторы, и способы доставки векторов к интересующим клеткам известны специалистам в данной области. См., например, Dornburg, Gene Therap., Vol. 2, 301-310, 1995; Eglitis, Biotechniques, Vol. 6, 608-614, 1988; Miller, HumGene Therap., Vol. 1, 5-14, 1990; Anderson, Nature, Vol. 392, 25-30, 1998; Rubinson D.A. et al., Nat. Genet., Vol. 33, 401-406, 2003; Brummelkamp et al., Science, Vol. 296, 550-553, 2002; Brummelkamp et al., Cancer Cell, Vol. 2, 243-247, 2002; Lee et al., Nat. Biotechnol., Vol. 20, 500-505, 2002; Miyagishi et al., Nat. Biotechnol., Vol. 20, 497-500, 2002; Paddison et al., GenesDev, Vol. 16, 948-958, 2002; Paul et al., Nat. Biotechnol, Vol. 20, 505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, 5515-5520, 2002 и Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, 6047-6052, 2002, которые все включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.Various vectors suitable for use in the present invention, methods of inserting nucleic acid sequences encoding siRNA or shRNA molecules into vectors, and methods of delivering the vectors to cells of interest are known to those skilled in the art. See, for example, Dornburg, Gene Therap., Vol. 2, 301-310, 1995; Eglitis, Biotechniques, Vol. 6, 608-614, 1988; Miller, HumGene Therap., Vol. 1, 5-14, 1990; Anderson, Nature, Vol. 392, 25-30, 1998; Rubinson D.A. et al., Nat. Genet., Vol. 33, 401-406, 2003; Brummelkamp et al., Science, Vol. 296, 550-553, 2002; Brummelkamp et al., Cancer Cell, Vol. 2, 243-247, 2002; Lee et al., Nat. Biotechnol., Vol. 20, 500-505, 2002; Miyagishi et al., Nat. Biotechnol., Vol. 20, 497-500, 2002; Paddison et al., GenesDev, Vol. 16, 948-958, 2002; Paul et al., Nat. Biotechnol, Vol. 20, 505-508, 2002; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, 5515-5520, 2002 and Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, 6047-6052, 2002, all of which are incorporated herein by reference in their entireties.
В настоящее изобретение также включены фармацевтические композиции и составы, содержащие описанные в данном документе конструкции для RNAi и фармацевтически приемлемые носители, наполнители или разбавители. Такие композиции и составы применимы в снижении экспрессии PNPLA3 у нуждающегося в этом субъекта. Когда предполагается применение в клинической практике, фармацевтические композиции и составы будут производиться в форме, подходящей для предполагаемого применения. В целом это предусматривает получение композиций, которые по сути не содержат пирогенов, а также других примесей, которые могут быть вредными для людей или животных.Also included in the present invention are pharmaceutical compositions and formulations comprising the RNAi constructs described herein and pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents. Such compositions and formulations are useful in reducing the expression of PNPLA3 in a subject in need thereof. When intended for clinical use, the pharmaceutical compositions and formulations will be manufactured in a form suitable for the intended use. In general, this includes compositions that are substantially free of pyrogens as well as other impurities that may be harmful to humans or animals.
Фразы фармацевтически приемлемый или фармакологически приемлемый относятся к молекулярным веществам и композициям, которые не вызывают нежелательных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении животному или человеку. Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель включает растворители,The phrases pharmaceutically acceptable or pharmacologically acceptable refer to molecular entities and compositions that do not produce undesirable, allergic or other adverse reactions when administered to an animal or human. As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent includes solvents,
- 20 047656 буферы, растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие абсорбцию, и им подобные, приемлемые для использования в составлении фармацевтических препаратов, как, например, фармацевтических препаратов, подходящих для введения людям. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда какие-либо традиционные среды или средство несовместимы с конструкциями для RNAi по настоящему изобретению, предполагается их применение в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции при условии, что они не инактивируют векторы или конструкции для RNAi в данных композициях.- 20 047656 buffers, solutions, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like, suitable for use in formulating pharmaceutical preparations, such as pharmaceutical preparations suitable for administration to humans. The use of such media and vehicles for pharmaceutically active substances is well known in the art. Except where any conventional media or vehicle is incompatible with the RNAi constructs of the present invention, their use in therapeutic compositions is contemplated. Additional active ingredients may also be included in the compositions, provided that they do not inactivate the vectors or RNAi constructs in the compositions.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, включая без ограничения способ введения, тип и степень заболевания или нарушения, подлежащего лечению, или дозу, подлежащую введению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции составлены на основе предполагаемого способа доставки. Например, в определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции составлены для парентеральной доставки. Парентеральные формы доставки включают внутривенную, внутриартериальную, подкожную, интратекальную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция составлена для внутривенной доставки. В таком варианте осуществления фармацевтическая композиция может включать средство для доставки на основе липидов. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция составлена для подкожной доставки. В таком варианте осуществления фармацевтическая композиция может включать нацеливающий лиганд (например, описанные в данном документе лиганды, содержащие GalNAc).Compositions and methods for formulating pharmaceutical compositions depend on a number of criteria, including, but not limited to, the route of administration, the type and extent of the disease or disorder being treated, or the dose being administered. In some embodiments, pharmaceutical compositions are formulated based on the intended route of delivery. For example, in certain embodiments, pharmaceutical compositions are formulated for parenteral delivery. Parenteral forms of delivery include intravenous, intraarterial, subcutaneous, intrathecal, intraperitoneal, or intramuscular injection or infusion. In one embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for intravenous delivery. In such an embodiment, the pharmaceutical composition may include a lipid-based delivery vehicle. In another embodiment, the pharmaceutical composition is formulated for subcutaneous delivery. In such an embodiment, the pharmaceutical composition may include a targeting ligand (e.g., the GalNAc-containing ligands described herein).
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат эффективное количество описанной в данном документе конструкции для RNAi. Термин эффективное количество означает количество, достаточное для получения полезного или желаемого клинического результата. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество означает количество, достаточное для снижения экспрессии PNPLA3 в гепатоцитах субъекта. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество может быть количеством, достаточным только для частичного снижения экспрессии PNPLA3, например, до уровня, сопоставимого с экспрессией аллеля PNPLA3 дикого типа в гетерозиготах человека. Сообщалось, что у людей, гетерозиготных по аллельным вариантам PNPLA3 с потерей функции, наблюдались более низкие уровни холестерина non-HDL в сыворотке крови и более низкий риск возникновения ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда по сравнению с индивидуумами без соответствующих аллельных вариантов (Nioi et al., New England Journal of Medicine, Vol. 374(22):2131-2141, 2016). Таким образом, не ограничиваясь теорией, считается, что частичное снижение экспрессии PNPLA3 может быть достаточным для достижения полезного снижения уровней сывороточного холестерина non-HDL в сыворотке крови и снижения риска возникновения ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда.In some embodiments, the pharmaceutical compositions comprise an effective amount of an RNAi construct described herein. The term "effective amount" means an amount sufficient to produce a beneficial or desired clinical result. In some embodiments, an effective amount means an amount sufficient to reduce the expression of PNPLA3 in hepatocytes of a subject. In some embodiments, an effective amount may be an amount sufficient to only partially reduce the expression of PNPLA3, such as to a level comparable to the expression of the wild-type PNPLA3 allele in human heterozygotes. Humans heterozygous for loss-of-function allelic variants of PNPLA3 have been reported to have lower serum non-HDL cholesterol levels and a lower risk of coronary heart disease and myocardial infarction compared to individuals without the corresponding allelic variants (Nioi et al., New England Journal of Medicine, Vol. 374(22):2131-2141, 2016). Thus, without being limited by theory, it is believed that partial reduction of PNPLA3 expression may be sufficient to achieve beneficial reductions in serum non-HDL cholesterol levels and a reduction in the risk of coronary heart disease and myocardial infarction.
Эффективное количество конструкции для RNAi по настоящему изобретению может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мг/кг веса тела, от приблизительно 0,05 до приблизительно 75 мг/кг веса тела, от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг веса тела, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг веса тела, от приблизительно 2,5 до приблизительно 20 мг/кг веса тела или от приблизительно 5 до приблизительно 15 мг/кг веса тела. В определенных вариантах осуществления однократная эффективная доза конструкции для RNAi по настоящему изобретению может составлять приблизительно 0,1 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг или приблизительно 10 мг/кг. Фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество конструкции для RNAi, можно вводить еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, ежеквартально или раз в два года. Точное определение того, что считается эффективным количеством и частотой введения, может основываться на нескольких факторах, включая вес пациента, его возраст и общее состояние, тип подлежащего лечению нарушения (например, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность, ишемическая болезнь сердца, гиперхолестеринемия), конкретную используемую конструкцию для RNAi и способ ее введения. Оценки эффективных дозировок и периодов полужизни in vivo для любой конкретной конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут быть установлены с использованием обычных методик и/или испытаний на соответствующих моделях животных.An effective amount of an RNAi construct of the present invention can be from about 0.01 to about 100 mg/kg body weight, from about 0.05 to about 75 mg/kg body weight, from about 0.1 to about 50 mg/kg body weight, from about 1 to about 30 mg/kg body weight, from about 2.5 to about 20 mg/kg body weight, or from about 5 to about 15 mg/kg body weight. In certain embodiments, a single effective dose of an RNAi construct of the present invention can be about 0.1 mg/kg, about 0.5 mg/kg, about 1 mg/kg, about 2 mg/kg, about 3 mg/kg, about 4 mg/kg, about 5 mg/kg, about 6 mg/kg, about 7 mg/kg, about 8 mg/kg, about 9 mg/kg, or about 10 mg/kg. A pharmaceutical composition comprising an effective amount of an RNAi construct may be administered weekly, biweekly, monthly, quarterly, or biennially. The precise determination of what is considered an effective amount and frequency of administration may be based on several factors, including the patient's weight, age, and general condition, the type of disorder being treated (e.g., myocardial infarction, heart failure, ischemic heart disease, hypercholesterolemia), the particular RNAi construct used, and the route of administration. Estimates of effective dosages and in vivo half-lives for any particular RNAi construct of the present invention may be determined using routine techniques and/or testing in appropriate animal models.
Введение фармацевтических композиций по настоящему изобретению можно осуществлять любым традиционным способом, если целевая ткань доступна при этом способе введения. Такие способы введения включают без ограничения парентеральный (например, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный или внутривенный), оральный, назальный, буккальный, внутрикожный, трансдермальный и сублингвальный способы или путем прямой инъекции в ткань печени или доставки через печеночную портальную вену. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят парентерально. К примеру, в определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В других вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят подкожно.Administration of the pharmaceutical compositions of the present invention can be accomplished by any conventional route, as long as the target tissue is accessible by that route of administration. Such routes of administration include, but are not limited to, parenteral (e.g., subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, or intravenous), oral, nasal, buccal, intradermal, transdermal, and sublingual routes, or by direct injection into liver tissue or delivery via the hepatic portal vein. In some embodiments, the pharmaceutical composition is administered parenterally. For example, in certain embodiments, the pharmaceutical composition is administered intravenously. In other embodiments, the pharmaceutical composition is administered subcutaneously.
- 21 047656- 21 047656
Коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы, могут использоваться в качестве средств доставки конструкций для RNAi по настоящему изобретению или векторов, кодирующих такие конструкции. Коммерчески доступные жировые эмульсии, которые подходят для доставки нуклеиновых кислот по изобретению, включают Intralipid®, Liposyn®, Liposyn®II, Liposyn®III, Nutrilipid и другие подобные липидные эмульсии. Предпочтительной коллоидной системой, предназначенной для использования в качестве средства для доставки in vivo, является липосома (т.е. везикула с искусственной мембраной). Конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать комплексы с ними, в частности с катионными липосомами. В качестве альтернативы конструкции для RNAi по настоящему изобретению могут образовывать комплексы с липидами, в частности с катионными липидами. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин) (DOPE), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) и дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC)), дистеароилфосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеоилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DO™A)) липиды и липосомы. Получение и использование таких коллоидных дисперсионных систем хорошо известны из уровня техники. Иллюстративные составы также раскрыты в патентах США № 5981505; 6217900; 6383512; 5783565; 7202227; 6379965; 6127170; 5837533; 6747014 и в публикации заявки по PCT № WO 03/093449.Colloidal dispersion systems such as macromolecular complexes, nanocapsules, microspheres, beads and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles and liposomes can be used as delivery vehicles for the RNAi constructs of the present invention or vectors encoding such constructs. Commercially available lipid emulsions that are suitable for delivering the nucleic acids of the invention include Intralipid®, Liposyn®, Liposyn®II, Liposyn®III, Nutrilipid and other similar lipid emulsions. A preferred colloidal system for use as an in vivo delivery vehicle is a liposome (i.e., an artificial membrane vesicle). The RNAi constructs of the present invention can be encapsulated in or complexed with liposomes, in particular cationic liposomes. Alternatively, the RNAi constructs of the present invention can be complexed with lipids, particularly cationic lipids. Suitable lipids and liposomes include neutral (e.g., dioleoylphosphatidylethanolamine) (DOPE), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) and dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)), distearoylphosphatidylcholine), negatively charged (e.g., dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG)) and cationic (e.g., dioleoyltetramethylaminopropyl (DOTAP) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DO™A)) lipids and liposomes. The preparation and use of such colloidal dispersion systems are well known in the art. Exemplary formulations are also disclosed in U.S. Pat. Nos. 5,981,505; 6,217,900; 6,383,512; 5783565; 7202227; 6379965; 6127170; 5837533; 6747014 and PCT Application Publication No. WO 03/093449.
В некоторых вариантах осуществления конструкции для RNAi по настоящему изобретению полностью инкапсулированы в липидный состав, например, для образования SPLP, pSPLP, SNALP или других частиц типа нуклеиновая кислота-липид. Используемый в данном документе термин SNALP относится к стабильной частице типа нуклеиновая кислота-липид, включая SPLP. Используемый в данном документе термин SPLP относится к частице типа нуклеиновая кислота-липид, которая содержит плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидную везикулу. SNALP и SPLP обычно содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предотвращает агрегацию частиц (например, конъюгат PEG-липид). SNALP и SPLP исключительно полезны для системных применений, поскольку после внутривенного введения они демонстрируют увеличенное время циркуляции в кровотоке и накапливаются в удаленных участках (например, физически отделенных от участка введения). SPLP включают pSPLP, которые включают инкапсулированный комплекс конденсирующего средства и нуклеиновой кислоты, как изложено в публикации по PCT № WO 00/03683. Частицы типа нуклеиновая кислота-липид обычно имеют средний диаметр, составляющий от приблизительно 50 до приблизительно 150 нМ, от приблизительно 60 до приблизительно 130 нМ, от приблизительно 70 до приблизительно 110 нМ или от приблизительно 70 до приблизительно 90 нМ, и по сути они не токсичны. Кроме того, когда нуклеиновые кислоты присутствуют в частицах типа нуклеиновая кислота-липид, в водном растворе они являются устойчивыми к деградации нуклеазой. Частицы типа нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в патентах США № 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432 и публикации заявки по PCT № WO 96/40964.In some embodiments, the RNAi constructs of the present invention are fully encapsulated in a lipid formulation, such as to form SPLPs, pSPLPs, SNALPs, or other nucleic acid-lipid particles. As used herein, the term SNALPs refers to a stable nucleic acid-lipid particle, including SPLPs. As used herein, the term SPLPs refers to a nucleic acid-lipid particle that contains plasmid DNA encapsulated in a lipid vesicle. SNALPs and SPLPs typically contain a cationic lipid, a non-cationic lipid, and a lipid that prevents particle aggregation (e.g., a PEG-lipid conjugate). SNALPs and SPLPs are particularly useful for systemic applications because they exhibit extended circulation times in the bloodstream after intravenous administration and accumulate at remote sites (e.g., physically separated from the site of administration). SPLPs include pSPLPs that include an encapsulated complex of a condensing agent and a nucleic acid as disclosed in PCT Publication No. WO 00/03683. The nucleic acid-lipid particles typically have an average diameter of from about 50 to about 150 nM, from about 60 to about 130 nM, from about 70 to about 110 nM, or from about 70 to about 90 nM, and are substantially non-toxic. Furthermore, when nucleic acids are present in the nucleic acid-lipid particles, they are resistant to nuclease degradation in aqueous solution. Nucleic acid-lipid particles and a method for making them are disclosed, for example, in U.S. Pat. Nos. 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6815432 and publication of PCT application No. WO 96/40964.
Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают, например, стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Как правило, данные препараты являются стерильными и жидкими до такой степени, что они способны легко проходить через иглу при введении. Препараты должны быть стабильными в условиях изготовления и хранения и должны быть предохранены от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Подходящие растворители или дисперсионные носители могут содержать, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может быть вызвано различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тиомерсалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительным включение изотонических средств, например, сахаров или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута за счет использования в композициях средств замедляющих абсорбцию, например моностеарата алюминия и желатина.Pharmaceutical compositions suitable for injection use include, for example, sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. As a rule, these preparations are sterile and fluid to such an extent that they are able to pass easily through a needle during administration. The preparations must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. Suitable solvents or dispersion vehicles may contain, for example, water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), suitable mixtures thereof and vegetable oils. Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thiomersal, etc. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of injectable compositions can be achieved by using absorption-retarding agents in the compositions, for example, aluminum monostearate and gelatin.
Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем добавления по мере необходимости активных соединений в соответствующем количестве в растворитель вместе с любыми другими ингредиентами (например, перечисленными выше) с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии получают путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из, например, перечисленных выше. В случае стерильных порошков, предназначенных для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительные способы получения включают метоSterile injectable solutions can be prepared by adding the active compounds in the appropriate amount to the solvent with any other ingredients (e.g., those enumerated above) as required, followed by filtered sterilization. Generally, dispersions are prepared by incorporating various sterilized active ingredients into a sterile carrier medium which contains the basic dispersion medium and the required other ingredients from, for example, those enumerated above. In the case of sterile powders intended for the preparation of sterile injectable solutions, preferred processes for their preparation include the method
- 22 047656 дики вакуумной сушки и лиофильной сушки, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента (ингредиентов) плюс любого дополнительного необходимого ингредиента из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.- 22 047656 vacuum drying and freeze drying machines which provide a powder of the active ingredient(s) plus any additional required ingredient from its previously sterile filtered solution.
Композиции по настоящему изобретению, как правило, могут быть составлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают, например, соли присоединения кислот (образованные со свободными аминогруппами), полученные из неорганических кислот (например, соляной или фосфорной кислот) или полученные из органических кислот (например, уксусной, щавелевой, винной, миндальной и т.п.). Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований (например, гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция или железа) или из органических оснований (например, изопропиламина, триметиламина, гистидина, прокаина и т.п.).The compositions of the present invention can generally be formulated in neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable salts include, for example, acid addition salts (formed with free amino groups) derived from inorganic acids (e.g., hydrochloric or phosphoric acids) or derived from organic acids (e.g., acetic, oxalic, tartaric, mandelic, etc.). Salts formed with free carboxyl groups can also be derived from inorganic bases (e.g., sodium, potassium, ammonium, calcium, or iron hydroxides) or from organic bases (e.g., isopropylamine, trimethylamine, histidine, procaine, etc.).
Например, для парентерального введения в водном растворе раствор, к примеру, в достаточной степени забуферен, а жидкий разбавитель сначала делают изотоническим, например, путем использования достаточного количества физиологического раствора или глюкозы. Такие водные растворы можно использовать, например, для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. Предпочтительно используют стерильные водные среды, известные специалистам в данной области, особенно в свете раскрытия настоящего изобретения. В качестве иллюстрации одну дозу можно растворять в 1 мл изотонического раствора NaCl и либо добавлять к 1000 мл жидкости для гиподермоклизиса, либо вводить в предлагаемый участок для инфузии (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 15th Edition, p. 1035-1038 и 1570-1580). Для введения человеку препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как того требуют стандарты FDA. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит или состоит из стерильного физиологического раствора и описанной в данном документе конструкции для RNAi. В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит или состоит из описанной в данном документе конструкции для RNAi и стерильной воды (например, воды для инъекции, WFI). В дополнительных других вариантах осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит или состоит из описанной в данном документе конструкции для RNAi и фосфатно-буферного солевого раствора (PBS).For example, for parenteral administration in an aqueous solution, the solution is, for example, sufficiently buffered and the liquid diluent is first rendered isotonic, for example, by using a sufficient amount of saline or glucose. Such aqueous solutions can be used, for example, for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration. Preferably, sterile aqueous media are used, as are known to those skilled in the art, especially in light of the disclosure of the present invention. By way of illustration, a single dose can be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and either added to 1000 ml of hypodermoclysis fluid or administered at the proposed infusion site (see, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences 15 th Edition, pp. 1035-1038 and 1570-1580). For human administration, the preparations must meet the standards of sterility, pyrogenicity, general safety and purity as required by FDA standards. In certain embodiments, a pharmaceutical composition of the present invention comprises or consists of sterile saline and an RNAi construct described herein. In other embodiments, a pharmaceutical composition of the present invention comprises or consists of an RNAi construct described herein and sterile water (e.g., water for injection, WFI). In still other embodiments, a pharmaceutical composition of the present invention comprises or consists of an RNAi construct described herein and phosphate buffered saline (PBS).
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции по настоящему изобретению упакованы или хранятся в устройстве для введения. Устройства для введения инъекционных составов включают без ограничения порт-системы для инъекций, предварительно заполненные шприцы, автоматические инъекторы, инъекционные помпы, нательные инъекторы и шприцы-ручки. Устройства для введения аэрозольных или порошковых составов включают без ограничения ингаляторы, инсуффляторы, аспираторы и т.п. Таким образом, в настоящее изобретение включены устройства для введения, содержащие фармацевтическую композицию по настоящему изобретению для лечения или профилактики одного или нескольких нарушений, описанных в данном документе.In some embodiments, the pharmaceutical compositions of the present invention are packaged or stored in an administration device. Devices for administering injectable formulations include, but are not limited to, injection port systems, prefilled syringes, automatic injectors, injection pumps, body injectors, and injection pens. Devices for administering aerosol or powder formulations include, but are not limited to, inhalers, insufflators, aspirators, and the like. Thus, the present invention includes administration devices containing a pharmaceutical composition of the present invention for the treatment or prevention of one or more disorders described herein.
Способы подавления экспрессии PNPLA3Methods for suppressing PNPLA3 expression
В настоящем изобретении также представлены способы подавления экспрессии гена PNPLA3 в клетке. Способы включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например двухнитевым средством для RNAi, в количестве, которое является эффективным для подавления экспрессии PNPLA3 внутри клетки, за счет чего подавляется экспрессия PNPLA3 внутри клетки. Приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например с двухнитевым средством для RNAi, можно осуществлять in vitro или in vivo. Приведение клетки в контакт со средством для RNAi in vivo включает приведение в контакт клетки или группы клеток внутри субъекта, например субъекта-человека, со средством для RNAi. Также возможны комбинации способов приведения клетки в контакт in vitro и in vivo.The present invention also provides methods for suppressing the expression of the PNPLA3 gene in a cell. The methods include contacting the cell with an RNAi agent, such as a double-stranded RNAi agent, in an amount that is effective to suppress the expression of PNPLA3 within the cell, thereby suppressing the expression of PNPLA3 within the cell. Contacting the cell with an RNAi agent, such as a double-stranded RNAi agent, can be performed in vitro or in vivo. Contacting the cell with an RNAi agent in vivo includes contacting a cell or a group of cells within a subject, such as a human subject, with the RNAi agent. Combinations of in vitro and in vivo cell contact methods are also possible.
В настоящем изобретении представлены способы снижения или подавления экспрессии PNPLA3 у нуждающегося в этом субъекта, а также способы лечения или предотвращения состояний, заболеваний или нарушений, ассоциированных с экспрессией или активностью PNPLA3. Выражение состояние, заболевание или нарушение, ассоциированное с экспрессией PNPLA3 относится к состояниям, заболеваниям или нарушениям, при которых наблюдаются изменения уровней экспрессии PNPLA3 или при которых повышенные уровни экспрессии PNPLA3 ассоциированы с повышенным риском развития состояния, заболевания или нарушения.The present invention provides methods for reducing or suppressing the expression of PNPLA3 in a subject in need thereof, as well as methods for treating or preventing conditions, diseases or disorders associated with the expression or activity of PNPLA3. The term condition, disease or disorder associated with the expression of PNPLA3 refers to conditions, diseases or disorders in which changes in the expression levels of PNPLA3 are observed or in which increased levels of PNPLA3 expression are associated with an increased risk of developing the condition, disease or disorder.
Приведение в контакт с клеткой может быть прямым или опосредованным, как обсуждалось выше. Кроме того, приведение в контакт с клеткой может быть осуществлено посредством нацеливающего лиганда, в том числе любого лиганда, описанного в данном документе или известного из уровня техники. В предпочтительных вариантах осуществления нацеливающий лиганд представляет собой углеводный фрагмент, например лиганд GalNAc3 или любой другой лиганд, который направляет средство для RNAi к представляющему интерес участку.Contacting the cell may be direct or indirect, as discussed above. In addition, contacting the cell may be via a targeting ligand, including any ligand described herein or known in the art. In preferred embodiments, the targeting ligand is a carbohydrate moiety, such as a GalNAc3 ligand or any other ligand that directs the RNAi agent to the site of interest.
В одном варианте осуществления приведение клетки в контакт с RNAi включает введение или доставку средства для RNAi в клетку путем облегчения или осуществления захвата клеткой или путем абсорбции внутрь клетки. Абсорбция или захват средства для RNAi может происходить в результате неконтролируемых диффузионных или активных клеточных процессов либо посредством вспомогательныхIn one embodiment, contacting the cell with the RNAi comprises introducing or delivering the RNAi agent into the cell by facilitating or effecting uptake by the cell or by absorption into the cell. The uptake or uptake of the RNAi agent may occur through uncontrolled diffusion or active cellular processes or through assisted
- 23 047656 средств или устройств. Введение средства для RNAi в клетку может быть осуществлено in vitro и/или in vivo. Например, для введения in vivo RNAi можно вводить в участок ткани или вводить системно. Введение в клетку in vitro включает способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны в данном документе ниже и/или известны из уровня техники.- 23 047656 means or devices. The introduction of the RNAi agent into the cell can be carried out in vitro and/or in vivo. For example, for in vivo administration, RNAi can be administered into a tissue site or administered systemically. In vitro introduction into the cell includes methods known in the art, such as electroporation and lipofection. Additional approaches are described herein below and/or are known in the art.
Термин подавление, используемый в данном документе, используется взаимозаменяемо с терминами снижение, сайленсинг, понижающая регуляция, супрессия и другими подобными терминами и включает любой уровень подавления.The term suppression as used in this document is used interchangeably with the terms reduction, silencing, down-regulation, suppression and other similar terms and includes any level of suppression.
Фраза подавление экспрессии PNPLA3 подразумевает подавление экспрессии любого гена PNPLA3 (например, такого, как ген PNPLA3 мыши, ген PNPLA3 крысы, ген PNPLA3 обезьяны или ген PNPLA3 человека), а также вариантов или мутантных вариантов гена PNPLA3. Таким образом, ген PNPLA3 может представлять собой ген дикого типа PNPLA3, мутантный ген PNPLA3 (такой как мутантный ген PNPLA3, вызывающий отложение амилоида) или генетически модифицированный ген PNPLA3 в контексте генетически модифицированных клетки, группы клеток или организма.The phrase suppressing the expression of PNPLA3 means suppressing the expression of any PNPLA3 gene (such as a mouse PNPLA3 gene, a rat PNPLA3 gene, a monkey PNPLA3 gene, or a human PNPLA3 gene), as well as variants or mutant variants of the PNPLA3 gene. Thus, the PNPLA3 gene may be a wild-type PNPLA3 gene, a mutant PNPLA3 gene (such as a mutant PNPLA3 gene that causes amyloid deposition), or a genetically modified PNPLA3 gene in the context of a genetically modified cell, group of cells, or organism.
Термин подавление экспрессии гена PNPLA3 включает любой уровень подавления гена PNPLA3, например, по меньшей мере частичную супрессию экспрессии гена PNPLA3. Экспрессия гена PNPLA3 может быть оценена на основе уровня или изменения уровня любого параметра, ассоциированного с экспрессией гена PNPLA3, например, уровня мРНК PNPLA3, белка PNPLA3 или количества или степени амилоидных отложений. Оценку этого уровня можно проводить в отдельной клетке или в группе клеток, включая, например, образец, полученный от субъекта.The term suppression of PNPLA3 gene expression includes any level of suppression of PNPLA3 gene, such as at least partial suppression of PNPLA3 gene expression. PNPLA3 gene expression can be assessed based on the level or change in the level of any parameter associated with PNPLA3 gene expression, such as the level of PNPLA3 mRNA, PNPLA3 protein, or the amount or extent of amyloid deposits. This level can be assessed in a single cell or in a group of cells, including, for example, a sample obtained from a subject.
Подавление можно оценивать по снижению абсолютного или относительного уровня одного или нескольких параметров, ассоциированных с экспрессией PNPLA3, по сравнению с контрольным уровнем. Контрольный уровень может быть любым типом контрольного уровня, который используется в данной области, например, исходным уровнем до введения дозы или уровнем, определенным для аналогичного субъекта, клетки или образца, который не подвергали обработке или обрабатывали с помощью контрольного раствора (такого как, например, контроль, представляющий собой только буфер, или контроль, представляющий собой неактивное средство). В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению экспрессия гена PNPLA3 подавляется по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%,Suppression can be assessed by a decrease in the absolute or relative level of one or more parameters associated with PNPLA3 expression compared to a control level. The control level can be any type of control level used in the art, such as a pre-dose baseline level or a level determined for a similar subject, cell, or sample that is untreated or treated with a control solution (such as, for example, a buffer-only control or an inactive agent control). In some embodiments of the methods of the present invention, PNPLA3 gene expression is suppressed by at least about 5%, at least about 10%, at least about 15%, at least about 20%, at least about 25%, at least about 30%,
или по меньшей мере приблизительно 99%.or at least approximately 99%.
Подавление экспрессии гена PNPLA3 может проявляться уменьшением количества мРНК, экспрессируемой первой клеткой или группой клеток (такие клетки могут присутствовать, например, в образце, полученном от субъекта), в которых транскрибируется ген PNPLA3 и которая была или которые были обработаны (например, путем приведения клетки или клеток в контакт со средством для RNAi по настоящему изобретению или путем введения средства для RNAi по настоящему изобретению субъекту, у которого клетки присутствуют или присутствовали), так что происходит подавление экспрессии гена PNPLA3 по сравнению со второй клеткой или группой клеток, по сути идентичной первой клетке или группе клеток, но которую не подвергали или которые не подвергали такой обработке (контрольная клетка (клетки)). В предпочтительных вариантах осуществления подавление экспрессии оценивают, выражая уровень мРНК в обработанных клетках в виде процентного содержания от уровня мРНК в контрольных клетках, используя следующую формулу:The downregulation of the expression of the PNPLA3 gene may be exhibited by a decrease in the amount of mRNA expressed by a first cell or group of cells (such cells may be present, for example, in a sample obtained from a subject) in which the PNPLA3 gene is transcribed and which has been or has been treated (for example, by contacting the cell or cells with an RNAi agent of the invention or by administering an RNAi agent of the invention to a subject in which the cells are or were present) such that the expression of the PNPLA3 gene is downregulated compared to a second cell or group of cells that is substantially identical to the first cell or group of cells but which has not been or has not been so treated (control cell(s)). In preferred embodiments, the downregulation is assessed by expressing the mRNA level in the treated cells as a percentage of the mRNA level in the control cells using the following formula:
|(мРНК в контрольных клетках) - (мРНК в обработанных клетках) ।qqo/ (мРНК в контрольных клетках)|(mRNA in control cells) - (mRNA in treated cells) ।qqo/ (mRNA in control cells)
В качестве альтернативы подавление экспрессии гена PNPLA3 можно оценивать с точки зрения уменьшения параметра, который функционально связан с экспрессией гена PNPLA3, например экспрессии белка PNPLA3 или активности белка сигнального пути Hedgehog. Сайленсинг гена PNPLA3 может быть определен в любой клетке, экспрессирующей PNPLA3 либо конститутивно, либо в результате генной инженерии и с помощью любого анализа, известного в данной области.Alternatively, suppression of PNPLA3 gene expression can be assessed in terms of a decrease in a parameter that is functionally related to PNPLA3 gene expression, such as PNPLA3 protein expression or Hedgehog signaling pathway protein activity. PNPLA3 gene silencing can be determined in any cell that expresses PNPLA3 either constitutively or as a result of genetic engineering and by any assay known in the art.
Подавление экспрессии белка PNPLA3 может проявляться снижением уровня белка PNPLA3, экспрессируемого клеткой или группой клеток (например, уровня белка, экспрессируемого в образце, полученном от субъекта). Как было объяснено выше, для оценки степени супрессии мРНК подавление уровней экспрессии белка в обработанной клетке или группе клеток может быть аналогичным образом выраSuppression of PNPLA3 protein expression may be demonstrated by a decrease in the level of PNPLA3 protein expressed by a cell or group of cells (e.g., the level of protein expressed in a sample obtained from a subject). As explained above, to assess the degree of mRNA suppression, the suppression of protein expression levels in a treated cell or group of cells may be similarly expressed as
- 24 047656 жено в процентах от уровня белка в контрольной клетке или группе клеток.- 24 047656 as a percentage of the protein level in a control cell or group of cells.
Контрольные клетка или группа клеток, которые могут быть использованы для оценки степени подавления экспрессии гена PNPLA3, включают клетку или группу клеток, которые еще не были приведены в контакт со средством для RNAi по настоящему изобретению. Например, контрольная клетка или группа клеток могут быть получены от отдельного субъекта (например, субъекта-человека или субъектаживотного) до лечения субъекта средством для RNAi.A control cell or group of cells that can be used to assess the degree of suppression of PNPLA3 gene expression includes a cell or group of cells that have not yet been contacted with the RNAi agent of the present invention. For example, a control cell or group of cells can be obtained from an individual subject (e.g., a human subject or an animal subject) prior to treating the subject with the RNAi agent.
Уровень мРНК PNPLA3, который экспрессируется клеткой или группой клеток, или уровень циркулирующей в крови мРНК PNPLA3 могут быть определены с использованием любой методики, известной в данной области, для оценки экспрессии мРНК. В одном варианте осуществления уровень экспрессии PNPLA3 в образце определяют путем выявления транскрибированного полинуклеотида или его части, например, мРНК гена PNPLA3. РНК может быть выделена из клеток с использованием методов экстракции РНК, включая, например, экстракцию кислым фенолом/изотиоцианатом гуанидина (RNAzol B; Biogenesis), наборами для выделения РНК RNeasy (Qiagen) или PAXgene (PreAnalytix, Швейцария). Типичные форматы анализа, использующие гибридизацию с рибонуклеиновой кислотой, включают кинетические анализы экспрессии генов, ПЦР с обратной транскрипцией, анализы с защитой от действия РНКазы (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), нозерн-блоттинг, гибридизацию in situ и микроматричный анализ. Циркулирующая в крови мРНК PNPLA3 может быть выявлена с использованием методик, описанных в заявке PCT/US2012/043584, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.The level of PNPLA3 mRNA expressed by a cell or group of cells or the level of PNPLA3 mRNA circulating in the blood can be determined using any technique known in the art for assessing mRNA expression. In one embodiment, the level of PNPLA3 expression in a sample is determined by detecting a transcribed polynucleotide or a portion thereof, such as PNPLA3 gene mRNA. RNA can be isolated from cells using RNA extraction methods, including, for example, acid phenol/guanidine isothiocyanate extraction (RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA isolation kits (Qiagen) or PAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Typical assay formats using ribonucleic acid hybridization include kinetic gene expression assays, reverse transcription-PCR, RNase protection assays (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), Northern blotting, in situ hybridization, and microarray analysis. Circulating PNPLA3 mRNA can be detected using the methods described in PCT/US2012/043584, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
В одном варианте осуществления уровень экспрессии PNPLA3 определяют с помощью зонда на основе нуклеиновой кислоты. Термин зонд, используемый в данном документе, относится к любой молекуле, которая способна избирательно связываться с конкретным PNPLA3. Зонды могут быть синтезированы специалистом в данной области или получены из соответствующих биологических препаратов. Зонды могут быть специально сконструированы для введения метки. Примеры молекул, которые можно использовать в качестве зондов, включают без ограничения РНК, ДНК, белки, антитела и органические молекулы.In one embodiment, the level of PNPLA3 expression is determined using a nucleic acid probe. The term probe as used herein refers to any molecule that is capable of selectively binding to a particular PNPLA3. Probes can be synthesized by one skilled in the art or obtained from appropriate biological preparations. Probes can be specially designed to introduce a label. Examples of molecules that can be used as probes include, but are not limited to, RNA, DNA, proteins, antibodies, and organic molecules.
Выделенная мРНК может быть использована в анализах гибридизации или амплификации, которые включают без ограничения блоттинг по Саузерну и нозерн-блоттинг, анализы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и матрицы зондов. Одна из методик определения уровней мРНК включает приведение в контакт выделенной мРНК с молекулой нуклеиновой кислоты (зондом), которая может гибридизоваться с мРНК PNPLA3. В одном варианте осуществления мРНК иммобилизована на твердой поверхности и ее приводят в контакт с зондом, например, путем разгона выделенной мРНК в агарозном геле и переноса мРНК из геля на мембрану, такую как нитроцеллюлозную мембрану. В альтернативном варианте осуществления зонд (зонды) иммобилизованы на твердой поверхности и мРНК вступает в контакт с зондом (зондами), например, на ДНК-чипе Affymetrix. Специалист в данной области может легко адаптировать известные способы выявления мРНК для использования при определении уровня мРНК PNPLA3.The isolated mRNA can be used in hybridization or amplification assays, which include, but are not limited to, Southern and Northern blotting, polymerase chain reaction (PCR)-based assays, and probe arrays. One technique for detecting mRNA levels involves contacting the isolated mRNA with a nucleic acid molecule (probe) that can hybridize to PNPLA3 mRNA. In one embodiment, the mRNA is immobilized on a solid surface and contacted with the probe, such as by running the isolated mRNA on an agarose gel and transferring the mRNA from the gel to a membrane, such as a nitrocellulose membrane. In an alternative embodiment, the probe(s) are immobilized on a solid surface and the mRNA is contacted with the probe(s), such as on an Affymetrix DNA chip. One skilled in the art can readily adapt known mRNA detection methods for use in determining PNPLA3 mRNA levels.
Альтернативный способ определения экспрессии PNPLA3 в образце включает процесс амплификации нуклеиновой кислоты и/или действия обратной транскриптазой (для получения кДНК), например мРНК в образце, например, при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (экспериментальный вариант осуществления изложен у Mullis, 1987, патент США № 4683202), лигазной цепной реакции (Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), самоподдерживающейся репликации последовательности (Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878), системы транскрипционной амплификации (Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177), Q-бета репликазы (Lizardi et al. (1988), Bio/Technology, 6:1197), репликации по типу катящегося кольца (Lizardi et al., патент США № 5854033) или любого другого способа амплификации нуклеиновых кислот с последующим выявлением амплифицированных молекул с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Эти схемы выявления особенно полезны для выявления молекул нуклеиновых кислот, когда такие молекулы присутствуют в очень небольших количествах. В конкретных аспектах изобретения уровень экспрессии PNPLA3 определяют с помощью количественной флуорогенной ПЦР с обратной транскрипцией (т.е. системы TaqMan™). Мониторинг уровней экспрессии мРНК PNPLA3 можно проводить с использованием мембранного блоттинга (такого как используемый в гибридизационном анализе, например, нозернблоттинг, блоттинг по Саузерну, дот-блоттинг и т.п.) или микролунок, пробирок для образцов, гелей, гранул или волокон (или любой твердой подложки, содержащей связанные нуклеиновые кислоты). См. патенты США № 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 и 5445934, которые включены в данный документ посредством ссылки. Определение уровней экспрессии PNPLA3 может также включать использование зондов нуклеиновых кислот в растворе.An alternative method for determining PNPLA3 expression in a sample involves a nucleic acid amplification process and/or reverse transcriptase action (to produce cDNA) on, for example, mRNA in the sample, such as by reverse transcription-PCR (an experimental embodiment is described in Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202), ligase chain reaction (Barany (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), self-sustained sequence replication (Guatelli et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878), transcription amplification system (Kwoh et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173-1177), Q-beta replicase (Lizardi et al. (1988), Bio/Technology, 6:1197), rolling circle replication (Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033), or any other method of amplifying nucleic acids, followed by detection of the amplified molecules using techniques well known to those skilled in the art. These detection schemes are particularly useful for detecting nucleic acid molecules when such molecules are present in very low amounts. In particular aspects of the invention, the level of PNPLA3 expression is determined using quantitative fluorogenic reverse transcription-PCR (i.e., the TaqMan™ system). Monitoring PNPLA3 mRNA expression levels can be performed using membrane blots (such as those used in hybridization assays, e.g., Northern blots, Southern blots, dot blots, etc.) or microwells, sample tubes, gels, beads, or fibers (or any solid support containing bound nucleic acids). See U.S. Patent Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195, and 5,445,934, which are incorporated herein by reference. Determining PNPLA3 expression levels can also include the use of nucleic acid probes in solution.
В предпочтительных вариантах осуществления уровень экспрессии мРНК оценивают с использованием анализов разветвленной ДНК (bDNA) или ПЦР в режиме реального времени (qPCR). Использование этих способов описано и проиллюстрировано в примерах, представленных в данном документе.In preferred embodiments, the level of mRNA expression is assessed using branched DNA (bDNA) or real-time PCR (qPCR) assays. The use of these methods is described and illustrated in the examples provided herein.
Уровень экспрессии белка PNPLA3 может быть определен с использованием любого способа, известного в данной области, для измерения уровней белка. Такие способы включают, например, электроThe expression level of the PNPLA3 protein can be determined using any method known in the art for measuring protein levels. Such methods include, for example, electrophoresis.
- 25 047656 форез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), тонкослойную хроматографию (TLC), гипердиффузионную хроматографию, жидкостные или гелевые реакции преципитации в жидкости или в геле, абсорбционную спектроскопию, колориметрические анализы, спектрофотометрические анализы, проточную цитометрию, иммунодиффузию (одинарную или двойную), иммуноэлектрофорез, вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), иммунофлуоресцентные анализы, электрохемилюминесцентные анализы и т.п.- 25 047656 phoresis, capillary electrophoresis, high-performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography (TLC), hyperdiffusion chromatography, liquid or gel precipitation reactions in liquid or in gel, absorption spectroscopy, colorimetric assays, spectrophotometric assays, flow cytometry, immunodiffusion (single or double), immunoelectrophoresis, Western blotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), immunofluorescence assays, electrochemiluminescence assays, etc.
В некоторых вариантах осуществления эффективность способов по настоящему изобретению можно контролировать, выявляя или отслеживая уменьшение симптомов заболевания, связанного с PNPLA3, например, уменьшение отечности конечностей, лица, гортани, верхних дыхательных путей, живота, туловища и половых органов, продрома; отека гортани; не зудящей сыпи; тошноты; рвоты или боли в животе. Данные симптомы можно оценивать in vitro или in vivo с использованием любого способа, известного в данной области.In some embodiments, the efficacy of the methods of the present invention can be monitored by detecting or monitoring a reduction in symptoms of a disease associated with PNPLA3, such as a reduction in swelling of the extremities, face, larynx, upper respiratory tract, abdomen, trunk and genitals, prodrome; laryngeal edema; non-pruritic rash; nausea; vomiting or abdominal pain. These symptoms can be assessed in vitro or in vivo using any method known in the art.
В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению средство для RNAi вводят субъекту таким образом, что средство для RNAi поступает в конкретный участок внутри субъекта. Подавление экспрессии PNPLA3 может быть оценено с использованием измерений уровня или изменений уровня мРНК PNPLA3 или белка PNPLA3 в образце, полученном из жидкости или ткани в определенном участке субъекта. В предпочтительных вариантах осуществления участок выбран из группы, состоящей из печени, сосудистого сплетения, сетчатки и поджелудочной железы. Участок также может быть частью или подгруппой клеток из любых вышеупомянутых участков. Участок может также включать клетки, которые экспрессируют определенный тип рецептора.In some embodiments of the methods of the present invention, the RNAi agent is administered to a subject such that the RNAi agent is delivered to a specific site within the subject. Suppression of PNPLA3 expression can be assessed using measurements of the level or changes in the level of PNPLA3 mRNA or PNPLA3 protein in a sample obtained from a fluid or tissue in a specific site of the subject. In preferred embodiments, the site is selected from the group consisting of the liver, choroid plexus, retina, and pancreas. The site can also be a portion or subset of cells from any of the aforementioned sites. The site can also include cells that express a specific type of receptor.
Способы лечения или предотвращения заболеваний, ассоциированных с PNPLA3.Methods for treating or preventing diseases associated with PNPLA3.
В настоящем изобретении представлены терапевтические и профилактические способы, которые включают введение субъекту с заболеванием, нарушением и/или состоянием, ассоциированным с PNPLA3, или склонному к развитию заболевания, нарушения и/или состояния, ассоциированного с PNPLA3, композиции, содержащей средство для RNAi, или фармацевтических композиций, содержащих средство для RNAi, или векторов, экспрессирующих средство для RNAi по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры заболеваний, ассоциированных с PNPLA3, включают, например, жировой гепатоз (стеатоз), неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз печени, накопление жира в печени, воспаление печени, гепатоцеллюлярный некроз, фиброз печени, ожирение или неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD). В одном варианте осуществления заболевание, ассоциированное с PNPLA3, представляет собой NAFLD. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с PNPLA3, представляет собой NASH. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с PNPLA3, представляет собой жировой гепатоз (стеатоз). В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с PNPLA3, представляет собой инсулинорезистентность. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с PNPLA3, не представляет собой инсулинорезистентность.The present invention provides therapeutic and prophylactic methods that comprise administering to a subject with a disease, disorder and/or condition associated with PNPLA3 or prone to developing a disease, disorder and/or condition associated with PNPLA3 a composition comprising an RNAi agent or pharmaceutical compositions comprising an RNAi agent or vectors expressing an RNAi agent of the present invention. Non-limiting examples of diseases associated with PNPLA3 include, for example, fatty liver disease (steatosis), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), liver cirrhosis, liver fat accumulation, liver inflammation, hepatocellular necrosis, liver fibrosis, obesity, or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In one embodiment, the disease associated with PNPLA3 is NAFLD. In another embodiment, the disease associated with PNPLA3 is NASH. In another embodiment, the disease associated with PNPLA3 is fatty liver disease (steatosis). In another embodiment, the disease associated with PNPLA3 is insulin resistance. In another embodiment, the disease associated with PNPLA3 is not insulin resistance.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ снижения экспрессии PNPLA3 у нуждающегося в этом пациента, предусматривающий введение пациенту любой из описанных в данном документе конструкций для RNAi. Термин пациент, используемый в данном документе, относится к млекопитающему, в том числе к человеку, и может использоваться взаимозаменяемо с термином субъект. Предпочтительно уровень экспрессии PNPLA3 в гепатоцитах у пациента снижается после введения конструкции для RNAi по сравнению с уровнем экспрессии PNPLA3 у пациента, не получавшего конструкцию для RNAi.In certain embodiments, the present invention provides a method for reducing the expression of PNPLA3 in a patient in need thereof, comprising administering to the patient any of the RNAi constructs described herein. The term patient, as used herein, refers to a mammal, including a human, and may be used interchangeably with the term subject. Preferably, the level of PNPLA3 expression in hepatocytes in the patient is reduced following administration of the RNAi construct, compared to the level of PNPLA3 expression in a patient that has not received the RNAi construct.
Способы по настоящему изобретению применимы для лечения субъекта с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, например, субъекта, который может получить пользу от снижения экспрессии гена PNPLA3 и/или продуцирования белка PNPLA3. В одном аспекте настоящего изобретения представлены способы снижения уровня экспрессии гена, кодирующего белок 3, содержащий пататин-подобный фосфолипазный домен (PNPLA3), у субъекта с неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD). В другом аспекте настоящего изобретения представлены способы снижения уровня белка PNPLA3 у субъекта с NAFLD. В настоящем изобретении также представлены способы снижения уровня активности сигнального пути hedgehog у субъекта с NAFLD.The methods of the present invention are useful for treating a subject with a disease associated with PNPLA3, such as a subject that can benefit from reducing the expression of the PNPLA3 gene and/or the production of PNPLA3 protein. In one aspect, the present invention provides methods for reducing the expression level of the gene encoding the patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3) in a subject with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). In another aspect, the present invention provides methods for reducing the level of PNPLA3 protein in a subject with NAFLD. The present invention also provides methods for reducing the level of hedgehog signaling pathway activity in a subject with NAFLD.
В другом аспекте настоящего изобретения представлены способы лечения субъекта с NAFLD. В одном аспекте настоящего изобретения представлены способы лечения субъекта с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, например с жировым гепатозом (стеатозом), неалкогольным стеатогепатитом (NASH), циррозом печени, накоплением жира в печени, воспалением печени, гепатоцеллюлярным некрозом, фиброзом печени, ожирением или неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD). Способы лечения (и применения) по настоящему изобретению включают введение субъекту, например человеку, терапевтически эффективного количества средства для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующего на ген PNPLA3, или фармацевтической композиции, содержащей средство для RNAi по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, или вектор по настоящему изобретению, экспрессирующий средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3.In another aspect, the present invention provides methods of treating a subject with NAFLD. In one aspect, the present invention provides methods of treating a subject with a disease associated with PNPLA3, such as fatty liver disease (steatosis), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), liver cirrhosis, liver fat accumulation, liver inflammation, hepatocellular necrosis, liver fibrosis, obesity, or non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). The methods of treatment (and uses) of the present invention comprise administering to a subject, such as a human, a therapeutically effective amount of an RNAi agent of the present invention that targets a PNPLA3 gene, or a pharmaceutical composition comprising an RNAi agent of the present invention that targets a PNPLA3 gene, or a vector of the present invention expressing an RNAi agent that targets a PNPLA3 gene.
- 26 047656- 26 047656
В одном аспекте настоящего изобретения представлены способы предотвращения по меньшей мере одного симптома у субъекта с NAFLD, например, наличия повышенной активности сигнальных путей hedgehog, усталости, слабости, потери веса, потери аппетита, тошноты, боли в животе, сосудистых звездочек, пожелтения кожи и глаз (желтуха), зуда, накопления жидкости и отека ног (отека), отека живота (асцита) и спутанности сознания. Способы включают введение субъекту терапевтически эффективного количества средства для RNAi, например dsRNA, фармацевтических композиций или векторов по настоящему изобретению, за счет чего предотвращается возникновение по меньшей мере одного симптома у субъекта с нарушением, которое может быть улучшено за счет снижения экспрессии гена PNPLA3.In one aspect, the present invention provides methods for preventing at least one symptom in a subject with NAFLD, such as the presence of increased activity of hedgehog signaling pathways, fatigue, weakness, weight loss, loss of appetite, nausea, abdominal pain, spider veins, yellowing of the skin and eyes (jaundice), itching, fluid accumulation and swelling of the legs (edema), swelling of the abdomen (ascites), and confusion. The methods comprise administering to the subject a therapeutically effective amount of an RNAi agent, such as dsRNA, pharmaceutical compositions, or vectors of the present invention, thereby preventing the occurrence of at least one symptom in a subject with a disorder that can be improved by reducing the expression of the PNPLA3 gene.
В другом аспекте настоящего изобретения представлены варианты применения терапевтически эффективного количества средства для RNAi по настоящему изобретению для лечения субъекта, например, субъекта, который может получить пользу от снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3. В дополнительном аспекте настоящего изобретения представлены варианты применения средства для RNAi, например dsRNA, по настоящему изобретению, целенаправленно воздействующей на ген PNPLA3, или фармацевтической композиции, содержащей средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, в производстве лекарственного препарата, предназначенного для лечения субъекта, например, субъекта, который может получить пользу от снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3 и/или продуцирования белка PNPLA3, как, например, субъекта с нарушением, которое может быть улучшено за счет снижения экспрессии гена PNPLA3, например, заболевания, ассоциированного с PNPLA3.In another aspect, the present invention provides embodiments of using a therapeutically effective amount of an RNAi agent of the present invention to treat a subject, such as a subject that can benefit from reducing and/or suppressing the expression of a PNPLA3 gene. In a further aspect, the present invention provides embodiments of using an RNAi agent, such as a dsRNA, of the present invention that targets a PNPLA3 gene, or a pharmaceutical composition comprising an RNAi agent that targets a PNPLA3 gene, in the manufacture of a medicament for treating a subject, such as a subject that can benefit from reducing and/or suppressing the expression of a PNPLA3 gene and/or the production of a PNPLA3 protein, such as a subject with a disorder that can be ameliorated by reducing the expression of a PNPLA3 gene, such as a disease associated with PNPLA3.
В другом аспекте настоящего изобретения представлены варианты применения средства для RNAi, например dsRNA, по настоящему изобретению для предотвращения возникновения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, которое может быть улучшено за счет снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3 и/или продуцирования белка PNPLA3.In another aspect of the present invention, embodiments are provided of the use of an RNAi agent, such as a dsRNA, of the present invention to prevent the occurrence of at least one symptom in a subject suffering from a disorder that can be ameliorated by reducing and/or suppressing PNPLA3 gene expression and/or PNPLA3 protein production.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения представлены варианты применения средства для RNAi по настоящему изобретению в производстве лекарственного препарата, предназначенного для предотвращения возникновения по меньшей мере одного симптома у субъекта, страдающего нарушением, которое может быть улучшено за счет снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3 и/или продуцирования белка PNPLA3, например, заболеванием, ассоциированным с PNPLA3.In a further aspect of the present invention, embodiments are provided for using the RNAi agent of the present invention in the manufacture of a medicament intended to prevent the occurrence of at least one symptom in a subject suffering from a disorder that can be ameliorated by reducing and/or suppressing PNPLA3 gene expression and/or PNPLA3 protein production, such as a PNPLA3-associated disease.
В одном варианте осуществления средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на PNPLA3, вводится субъекту с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, например. неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD), вследствие чего экспрессия гена PNPLA3, например, в клетке, ткани, крови или другой ткани или жидкости у субъекта снижается по меньшей мере приблизительно на 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно 99% или больше, если субъекту вводится средство на основе dsRNA.In one embodiment, an RNAi agent that targets PNPLA3 is administered to a subject with a PNPLA3-associated disease, such as. non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), whereby expression of the PNPLA3 gene, for example, in a cell, tissue, blood or other tissue or fluid in the subject is reduced by at least about 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 62, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or at least about 99% or more if a dsRNA-based agent is administered to the subject.
Способы и варианты применения по настоящему изобретению включают введение композиции, описанной в данном документе, вследствие чего экспрессия целевого гена PNPLA3 снижается, например, в течение приблизительно 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 или приблизительно 80 ч. В одном варианте осуществления экспрессия целевого гена PNPLA3 снижается в течение длительного периода, например, в течение по меньшей мере приблизительно двух, трех, четырех, пяти, шести, семи дней или больше, например, в течение приблизительно одной недели, двух недель, трех недель или приблизительно четырех недель или дольше.The methods and uses of the present invention comprise administering a composition as described herein, whereby the expression of a PNPLA3 target gene is reduced, such as for about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, or about 80 hours. In one embodiment, the expression of a PNPLA3 target gene is reduced over an extended period, such as for at least about two, three, four, five, six, seven days or more, such as for about one week, two weeks, three weeks, or about four weeks or longer.
Введение dsRNA в соответствии со способами и вариантами применения по настоящему изобретению может привести к снижению тяжести, признаков, симптомов и/или уровня маркеров заболеваний или нарушений у пациента с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, например неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD). Под снижением в данном контексте подразумевается статистически значимое снижение такого уровня. Снижение может составлять, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или приблизительно 100%. Эффективность лечения или предотвращения заболевания можно оценить, например, путем измерения прогрессирования заболевания, ремиссии заболевания, тяжести симптомов, уменьшения боли, качества жизни, дозы лекарственного препарата, необходимого для поддержания эффекта лечения, уровня маркера заболевания или любого другого измеримого параметра, соответствующего данному заболеванию, которое лечат или которое пытаются нацеленно предотвратить. Специалист в данной области вполне способен контролировать эффективность лечения или предотвращения путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. Например, эффективность лечения NAFLD можно оценивать, например, путем периодического мониторинга симптомов NAFLD, уровней жира в печени или экспрессии генов, регулирующих последующие звенья сигнальных каскадов. Сравнение более поздних показаний с первоначальными показаниями предоставляет врачу указание на то, является ли лечение эффективным. Специалист в данной области вполне способен контролировать эффективность лечения или предотвращения путем измерения любого из таких параметров или любой комбинации параметров. В связи с введением средства для RNAi, целенаправленно воздействующего на PNPLA3, или его фармаAdministration of dsRNA according to the methods and uses of the present invention may result in a reduction in the severity, signs, symptoms and/or level of markers of diseases or disorders in a patient with a disease associated with PNPLA3, such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). By reduction in this context is meant a statistically significant reduction in such level. The reduction may be, for example, at least about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 or about 100%. The effectiveness of treating or preventing a disease may be assessed, for example, by measuring disease progression, disease remission, symptom severity, pain relief, quality of life, the dose of drug needed to maintain the treatment effect, the level of a disease marker, or any other measurable parameter relevant to the disease being treated or targeted for prevention. One of skill in the art is well placed to monitor the effectiveness of the treatment or prevention by measuring any one or a combination of such parameters. For example, the effectiveness of treatment for NAFLD may be assessed, for example, by periodically monitoring NAFLD symptoms, liver fat levels, or the expression of genes that regulate downstream signaling cascades. Comparison of the later readings with the initial readings provides the physician with an indication of whether the treatment is effective. One of skill in the art is well placed to monitor the effectiveness of the treatment or prevention by measuring any one or a combination of such parameters. In connection with the administration of an RNAi agent targeting PNPLA3 or its pharma
- 27 047656 цевтической композиции эффективность относительно заболевания, ассоциированного с PNPLA3, указывает на то, что введение клинически приемлемым образом приводит к положительному эффекту для по меньшей мере статистически значимой доли пациентов, например, к улучшению симптомов, излечению, снижению тяжести заболевания, продлению жизни, улучшению качества жизни или к другому эффекту, который является общепризнанно положительным среди врачей, знакомых с лечением NAFLD и/или заболевания, ассоциированного с PNPLA3 и связанных с ним причин.- 27 047656 ceutical composition efficacy against a PNPLA3-associated disease indicates that administration in a clinically acceptable manner results in a beneficial effect in at least a statistically significant proportion of patients, such as improvement in symptoms, cure, reduction in disease severity, prolongation of life, improvement in quality of life, or other effect that is generally recognized as beneficial by physicians familiar with the treatment of NAFLD and/or PNPLA3-associated disease and related causes.
Лечебный или превентивный эффект проявляется тогда, когда наблюдается статистически значимое улучшение одного или нескольких параметров статуса заболевания, или когда не происходит ухудшение или развитие симптомов в тех случаях, в которых иначе их можно было бы ожидать. В качестве примера благоприятное изменение по меньшей мере на 10% в измеряемом параметре заболевания, и предпочтительно по меньшей мере на 20, 30, 40, 50% или больше может свидетельствовать об эффективном лечении. Эффективность данного лекарственного средства на основе RNAi или состава с этим лекарственным средством также можно оценивать путем использования экспериментальной модели животного для данного заболевания, известной в данной области. При использовании экспериментальной модели животного эффективность лечения подтверждается, когда наблюдается статистически значимое снижение маркера или симптома.A therapeutic or preventive effect is demonstrated when a statistically significant improvement in one or more disease status parameters is observed, or when symptoms do not worsen or develop where they would otherwise be expected. As an example, a favorable change of at least 10% in a measurable disease parameter, and preferably at least 20, 30, 40, 50% or more, may indicate an effective treatment. The efficacy of a given RNAi-based medicinal product or formulation of the medicinal product may also be assessed using an animal model known in the art for the disease. When using an animal model, the efficacy of the treatment is confirmed when a statistically significant reduction in a marker or symptom is observed.
Субъектам может быть введено терапевтическое количество средства для RNAi, как, например, приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9,The subjects may be administered a therapeutic amount of the RNAi agent, such as about 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9,
3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5,3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4, 2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5,
5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6, 8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1,
8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 9,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или приблизительно 50 мг/кг dsRNA. В одном варианте осуществления субъектам можно вводить 0,5 мг/кг dsRNA. Значения и диапазоны, промежуточные по отношению к указанным значениям, также рассматриваются как часть данного изобретения.8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 9.0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or about 50 mg/kg dsRNA. In one embodiment, 0.5 mg/kg dsRNA can be administered to subjects. Values and ranges intermediate to these values are also contemplated as part of this invention.
Введение средства для RNAi может снижать уровни присутствующего белка PNPLA3, например, в клетке, ткани, крови, моче или другом компартменте организма пациента по меньшей мере приблизительно на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или по меньшей мере приблизительно на 99% или больше.Administration of the RNAi agent can reduce the levels of PNPLA3 protein present, for example, in a cell, tissue, blood, urine, or other compartment of the patient's body by at least about 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 or at least about 99% or more.
Перед введением полной дозы средства для RNAi пациентам можно вводить меньшую дозу, например 5% инфузию, и проводить мониторинг на наличие побочных эффектов, таких как аллергическая реакция. В другом примере можно проводить мониторинг пациента на наличие нежелательных иммуностимулирующих эффектов, таких как повышение уровня цитокинов (например, TNF-альфа или INF-альфа).Before administering the full dose of RNAi agent, patients may be given a smaller dose, such as a 5% infusion, and monitored for side effects such as an allergic reaction. In another example, the patient may be monitored for unwanted immune-stimulatory effects such as increased cytokine levels (e.g., TNF-alpha or INF-alpha).
Из-за ингибирующих эффектов в отношении экспрессии PNPLA3 композиция по настоящему изобретению или полученная из нее фармацевтическая композиция может улучшить качество жизни.Due to the inhibitory effects on the expression of PNPLA3, the composition of the present invention or a pharmaceutical composition obtained therefrom can improve the quality of life.
Средство для RNAi по настоящему изобретению можно вводить в голой форме, где модифицированное или немодифицированное средство для RNAi непосредственно суспендировано в водном или подходящем буферном растворителе в виде свободного средства для RNAi. Свободное средство для RNAi вводят в отсутствие фармацевтической композиции. Свободное средство для RNAi может находиться в подходящем буферном растворе. Буферный раствор может содержать ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления буферный раствор представляет собой фосфатно-буферный солевой раствор (PBS). Показатель pH и осмоляльность буферного раствора, содержащего средство для RNAi, можно откорректировать таким образом, чтобы он подходил для введения субъекту.The RNAi agent of the present invention can be administered in a naked form, wherein the modified or unmodified RNAi agent is directly suspended in an aqueous or suitable buffer solvent as a free RNAi agent. The free RNAi agent is administered in the absence of a pharmaceutical composition. The free RNAi agent can be in a suitable buffer solution. The buffer solution can contain acetate, citrate, prolamine, carbonate or phosphate, or any combination thereof. In one embodiment, the buffer solution is phosphate-buffered saline (PBS). The pH and osmolality of the buffer solution containing the RNAi agent can be adjusted so that it is suitable for administration to a subject.
В качестве альтернативы средство для RNAi по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтической композиции, такой как липосомальный состав с dsRNA.Alternatively, the RNAi agent of the present invention may be administered as a pharmaceutical composition, such as a liposomal formulation of dsRNA.
Субъектами, которые могут получить пользу от снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3, являются субъекты с неалкогольной жировой болезнью печени (NAFLD) и/или заболеванием или нарушением, ассоциированными с PNPLA3, описанными в данном документе.Subjects who may benefit from reduction and/or suppression of PNPLA3 gene expression include subjects with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and/or a PNPLA3-associated disease or disorder described herein.
Лечение субъекта, который может получить пользу от снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3, включает терапевтическое и профилактическое лечение.Treatment of a subject who may benefit from reduction and/or suppression of PNPLA3 gene expression includes therapeutic and prophylactic treatment.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы и варианты применения средства для RNAi или фармацевтической композиции на его основе для лечения субъекта, который может получить пользу от снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3, например субъекта с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, в комбинации с другими фармацевтическими средствами и/или другими терапевтическими способами, например с известными фармацевтическими средствами и/или известными терапевтическими способами, такими как, например, те, которые в настоящее время используют для лечения данных нарушений.The present invention further provides methods and uses of an RNAi agent or a pharmaceutical composition thereof for treating a subject that may benefit from reducing and/or suppressing the expression of a PNPLA3 gene, such as a subject with a disease associated with PNPLA3, in combination with other pharmaceuticals and/or other therapeutic methods, such as known pharmaceuticals and/or known therapeutic methods, such as, for example, those currently used to treat these disorders.
Например, в определенных вариантах осуществления средство для RNAi, целенаправленно воздейFor example, in certain embodiments, an RNAi agent that specifically targets
- 28 047656 ствующее на ген PNPLA3, вводят в комбинации с, например, средством, которое является применимым в лечении заболевания, ассоциированного с PNPLA3, описанного в другом месте данного документа. Например, дополнительные терапевтические средства и терапевтические способы, подходящие для лечения субъекта, который может получить пользу от снижения экспрессии PNPLA3, например, субъекта с заболеванием, ассоциированным с PNPLA3, включают средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на другую часть гена PNPLA3, терапевтическое средство и/или процедуры для лечения заболевания, ассоциированного с PNPLA3, или комбинацию любого из вышеизложенного.- 28 047656 acting on the PNPLA3 gene, is administered in combination with, for example, an agent that is useful in the treatment of a disease associated with PNPLA3, described elsewhere herein. For example, additional therapeutic agents and therapeutic methods suitable for treating a subject that may benefit from a decrease in PNPLA3 expression, such as a subject with a disease associated with PNPLA3, include an RNAi agent that targets another portion of the PNPLA3 gene, a therapeutic agent and/or procedures for treating a disease associated with PNPLA3, or a combination of any of the foregoing.
В определенных вариантах осуществления первое средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, вводят в комбинации со вторым средством для RNAi, целенаправленно воздействующим на другую часть гена PNPLA3. Например, первое средство для RNAi содержит первую смысловую нить и первую антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где по сути все нуклеотиды указанной первой смысловой нити и по сути все нуклеотиды первой антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, где указанная первая смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным на 3'-конце и где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера; а второе средство для RNAi содержит вторую смысловую нить и вторую антисмысловую нить, образующие двухнитевой участок, где по сути все нуклеотиды второй смысловой нити и по сути все нуклеотиды второй антисмысловой нити являются модифицированными нуклеотидами, где вторая смысловая нить конъюгирована с лигандом, присоединенным на 3'-конце, и где лиганд представляет собой одно или несколько производных GalNAc, присоединенных посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.In certain embodiments, a first RNAi agent that targets a PNPLA3 gene is administered in combination with a second RNAi agent that targets another portion of the PNPLA3 gene. For example, the first RNAi agent comprises a first sense strand and a first antisense strand that form a double-stranded region, wherein substantially all of the nucleotides of said first sense strand and substantially all of the nucleotides of the first antisense strand are modified nucleotides, wherein said first sense strand is conjugated to a ligand attached at the 3' end, and wherein the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a divalent or trivalent branched linker; and the second RNAi agent comprises a second sense strand and a second antisense strand forming a double-stranded region, wherein substantially all of the nucleotides of the second sense strand and substantially all of the nucleotides of the second antisense strand are modified nucleotides, wherein the second sense strand is conjugated to a ligand attached at the 3' end, and wherein the ligand is one or more GalNAc derivatives attached via a divalent or trivalent branched linker.
В одном варианте осуществления все нуклеотиды первой и второй смысловых нитей и/или все нуклеотиды первой и второй антисмысловых нитей содержат модификацию.In one embodiment, all nucleotides of the first and second sense strands and/or all nucleotides of the first and second antisense strands comprise a modification.
В одном варианте осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из 3'-концевого нуклеотида дезокситимина (dT), 2'-O-метилмодифицированного нуклеотида, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, закрытого нуклеотида, открытого нуклеотида, конформационно ограниченного нуклеотида, конформационно затрудненного этилом нуклеотида, нуклеотида с удаленным азотистым основанием, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-O-аллил-модифицированного нуклеотида, 2'-C-алкuл-модифицuрованного нуклеотида, 2'-гидроксил-модифицированного нуклеотида, 2'-метоксиэтил-модифицированного нуклеотида, 2'-O-алкил-модифицuрованного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата, нуклеотида, содержащего неприродное основание, тетрагидропиранмодифицированного нуклеотида, 1,5-ангидроксигекситол-модифицированного нуклеотида, циклогексенил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего фосфоротиоатную группу, нуклеотида, содержащего метилфосфонатную группу, нуклеотида, содержащего 5'-фосфат, и нуклеотида, содержащего миметик 5'-фосфата.In one embodiment, at least one of the modified nucleotides is selected from the group consisting of a 3'-terminal deoxythymine (dT) nucleotide, a 2'-O-methyl-modified nucleotide, a 2'-fluoro-modified nucleotide, a 2'-deoxy-modified nucleotide, a closed nucleotide, an open nucleotide, a conformationally constrained nucleotide, an ethyl-constrained nucleotide, a base-deleted nucleotide, a 2'-amino-modified nucleotide, a 2'-O-allyl-modified nucleotide, a 2'-C-alkyl-modified nucleotide, a 2'-hydroxyl-modified nucleotide, a 2'-methoxyethyl-modified nucleotide, a 2'-O-alkyl-modified nucleotide, a morpholine nucleotide, a phosphoramidate, a nucleotide containing non-natural base, tetrahydropyran-modified nucleotide, 1,5-anhydroxyhexitol-modified nucleotide, cyclohexenyl-modified nucleotide, nucleotide containing a phosphorothioate group, nucleotide containing a methylphosphonate group, nucleotide containing a 5'-phosphate, and nucleotide containing a 5'-phosphate mimetic.
В определенных вариантах осуществления первое средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, вводят в комбинации со вторым средством для RNAi, целенаправленно воздействующим на ген, отличающийся от гена PNPLA3. Например, средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, можно вводить в комбинации со средством для RNAi, целенаправленно воздействующим на ген SCAP. Первое средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, и второе средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген, отличающийся от гена PNPLA3, например на ген SCAP, могут быть введены как части одной и той же фармацевтической композиции. В качестве альтернативы первое средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген PNPLA3, и второе средство для RNAi, целенаправленно воздействующее на ген, отличающийся от гена PNPLA3, например на ген SCAP, могут быть введены как части разных фармацевтических композиций.In certain embodiments, a first RNAi agent that targets a PNPLA3 gene is administered in combination with a second RNAi agent that targets a gene other than the PNPLA3 gene. For example, an RNAi agent that targets a PNPLA3 gene can be administered in combination with an RNAi agent that targets a SCAP gene. The first RNAi agent that targets a PNPLA3 gene and the second RNAi agent that targets a gene other than the PNPLA3 gene, such as the SCAP gene, can be administered as part of the same pharmaceutical composition. Alternatively, the first RNAi agent that targets a PNPLA3 gene and the second RNAi agent that targets a gene other than the PNPLA3 gene, such as the SCAP gene, can be administered as part of different pharmaceutical compositions.
Средство для RNAi и дополнительное терапевтическое средство и/или препарат можно вводить одновременно и/или в такой же комбинации, например парентерально, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельной композиции, или в разные моменты времени, и/или другим способом, известным в данной области или описанным в данном документе.The RNAi agent and the additional therapeutic agent and/or drug may be administered simultaneously and/or in the same combination, such as parenterally, or the additional therapeutic agent may be administered as part of a separate composition, or at different times, and/or in another manner known in the art or described herein.
В настоящем изобретении также представлены способы применения средства для RNAi по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей средство для RNAi по настоящему изобретению, для снижения и/или подавления экспрессии PNPLA3 в клетке. В других аспектах настоящего изобретения представлены средство для RNAi по настоящему изобретению и/или композиция, содержащая средство для RNAi по настоящему изобретению, для применения с целью снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3 в клетке. В еще одних аспектах представлено применение средства RNAi по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей средство для RNAi по настоящему изобретению, или изготовление лекарственного препарата для снижения и/или подавления экспрессии гена PNPLA3 в клетке. В других аспектах настоящего изобретения представлены средство для RNAi по настоящему изобретению и/или композиция, содержащая средство для RNAi по настоящему изобретению, для применения в снижении и/или подавлении продуцирования белка PNPLA3 в клетке. В еще одних аспектах представлено применение средства для RNAi по настоящему изобретению и/или композиции, содержащей RNAi поThe present invention also provides methods of using an RNAi agent of the present invention and/or a composition comprising an RNAi agent of the present invention to reduce and/or suppress the expression of PNPLA3 in a cell. In other aspects, the present invention provides an RNAi agent of the present invention and/or a composition comprising an RNAi agent of the present invention for use in reducing and/or suppressing the expression of a PNPLA3 gene in a cell. In yet other aspects, the present invention provides a use of an RNAi agent of the present invention and/or a composition comprising an RNAi agent of the present invention or the manufacture of a medicament for reducing and/or suppressing the expression of a PNPLA3 gene in a cell. In other aspects, the present invention provides an RNAi agent of the present invention and/or a composition comprising an RNAi agent of the present invention for use in reducing and/or suppressing the production of a PNPLA3 protein in a cell. In yet other aspects, the present invention provides a use of an RNAi agent of the present invention and/or a composition comprising an RNAi agent of the present invention
- 29 047656 настоящему изобретению, для изготовления лекарственного препарата для снижения и/или подавления продуцирования белка PNPLA3 в клетке. Способы и варианты применения включают приведение клетки в контакт со средством для RNAi, например dsRNA, по настоящему изобретению и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения деградации транскрипта мРНК гена PNPLA3, за счет чего обеспечивается подавление экспрессии гена PNPLA3 или подавление продуцирования белка PNPLA3 в клетке.- 29 047656 of the present invention, for the manufacture of a medicament for reducing and/or suppressing the production of PNPLA3 protein in a cell. The methods and uses include contacting the cell with an RNAi agent, such as dsRNA, of the present invention and maintaining the cell for a time sufficient to achieve degradation of the mRNA transcript of the PNPLA3 gene, thereby suppressing the expression of the PNPLA3 gene or suppressing the production of PNPLA3 protein in the cell.
Снижение экспрессии гена можно оценить любыми способами, известными в данной области. Например, снижение экспрессии PNPLA3 может быть установлено путем определения уровня экспрессии мРНК PNPLA3 с помощью способов, являющихся обычной практикой для специалиста в данной области, например, с помощью нозерн-блоттинга, qRT-PCR, путем определения уровня белка PNPLA3 с помощью способов, являющихся обычной практикой для специалиста в данной области, таких как вестернблоттинг, иммунологические методики, методики проточной цитометрии, ELISA и/или путем определения биологической активности PNPLA3.The decrease in gene expression can be assessed by any methods known in the art. For example, a decrease in PNPLA3 expression can be determined by determining the level of PNPLA3 mRNA expression using methods routinely practiced by a person skilled in the art, such as Northern blotting, qRT-PCR, by determining the level of PNPLA3 protein using methods routinely practiced by a person skilled in the art, such as Western blotting, immunological techniques, flow cytometric techniques, ELISA, and/or by determining the biological activity of PNPLA3.
В способах и вариантах применения по настоящему изобретению клетка может быть приведена в контакт in vitro или in vivo, т. е. клетка может быть внутри субъекта.In the methods and uses of the present invention, the cell may be contacted in vitro or in vivo, i.e., the cell may be within a subject.
Клеткой, подходящей для лечения с применением способов по настоящему изобретению, может быть любая клетка, которая экспрессирует ген PNPLA3, например, клетка от субъекта с NAFLD, или клетка, которая содержит вектор экспрессии, содержащий ген PNPLA3 или часть гена PNPLA3. Клетка, подходящая для использования в способах и вариантах применения по настоящему изобретению, может представлять собой клетку млекопитающего, например, клетку примата (такую как клетка человека или клетка нечеловекообразного примата, например, клетку обезьяны или клетку шимпанзе), клетку животного, отличного от примата (такую как клетку коровы, клетку свиньи, клетку верблюда, клетку ламы, клетку лошади, клетку козы, клетку кролика, клетку овцы, клетку хомяка, клетку морской свинки, клетку кошки, клетку собаки, клетку крысы, клетку мыши, клетку льва, клетку тигра, клетку медведя или клетку буйвола), клетку птицы (например, клетку утки или клетку гуся) или клетку кита. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку человека.A cell suitable for treatment using the methods of the present invention can be any cell that expresses the PNPLA3 gene, such as a cell from a subject with NAFLD, or a cell that contains an expression vector containing the PNPLA3 gene or a portion of the PNPLA3 gene. A cell suitable for use in the methods and uses of the present invention can be a mammalian cell, such as a primate cell (such as a human cell or a non-human primate cell, such as a monkey cell or a chimpanzee cell), a non-primate animal cell (such as a cow cell, a pig cell, a camel cell, a llama cell, a horse cell, a goat cell, a rabbit cell, a sheep cell, a hamster cell, a guinea pig cell, a cat cell, a dog cell, a rat cell, a mouse cell, a lion cell, a tiger cell, a bear cell, or a buffalo cell), a bird cell (such as a duck cell or a goose cell), or a whale cell. In one embodiment, the cell is a human cell.
Экспрессия гена PNPLA3 в клетке может быть снижена по меньшей мере приблизительно на 5, 6,The expression of the PNPLA3 gene in the cell can be reduced by at least approximately 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98, 99 или приблизительно на 100%.98, 99 or approximately 100%.
Продуцирование белка PNPLA3 в клетке может быть снижено по меньшей мере приблизительно на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно на 100%.The production of PNPLA3 protein in a cell can be reduced by at least about 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or approximately 100%.
Способы и варианты применения in vivo по настоящему изобретению могут включать введение субъекту композиции, содержащей средство для RNAi, где средство для RNAi включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарпо меньшей мере на части РНК-транскрипта гена PNPLA3 млекопитающего, подлежащего лечению. Когда организм, подлежащий лечению, представляет собой организм человека, композицию можно вводить любым способом, известным в данной области, включая без ограничения подкожный, внутривенный, пероральный, внутрибрюшинный или парентеральный пути, включая внутричерепной путь введения (например, внутрижелудочковый, интрапаренхиматозный и интратекальный), внутримышечное, трансдермальное, введение через дыхательные пути (аэрозоль), назальное, ректальное и местное (включая буккальное и сублингвальное) введение. В определенных вариантах осуществления композиции вводят путем подкожной или внутривенной инфузии или инъекции. В одном варианте осуществления композиции вводят путем подкожной инъекции.The in vivo methods and uses of the present invention may comprise administering to a subject a composition comprising an RNAi agent, wherein the RNAi agent comprises a nucleotide sequence that is complementary to at least a portion of an RNA transcript of a PNPLA3 gene of a mammal to be treated. When the organism to be treated is a human organism, the composition may be administered by any route known in the art, including, but not limited to, subcutaneous, intravenous, oral, intraperitoneal, or parenteral routes, including intracranial (e.g., intraventricular, intraparenchymal, and intrathecal), intramuscular, transdermal, respiratory (aerosol), nasal, rectal, and topical (including buccal and sublingual) administration. In certain embodiments, the compositions are administered by subcutaneous or intravenous infusion or injection. In one embodiment, the compositions are administered by subcutaneous injection.
В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют путем инъекции вещества замедленного всасывания. При инъекции вещества замедленного всасывания средство для RNAi может высвобождаться последовательным образом в течение длительного периода времени. Таким образом, инъекция вещества замедленного всасывания может снижать частоту введения доз, необходимую для достижения требуемого эффекта, например, требуемого подавления PNPLA3 или терапевтического или профилактического эффекта. Инъекция вещества замедленного всасывания может также обеспечить более постоянные концентрации в сыворотке крови. Инъекции веществ замедленного всасывания могут включать подкожные инъекции или внутримышечные инъекции. В предпочтительных вариантах осуществления инъекция вещества замедленного всасывания представляет собой подкожную инъекцию.In some embodiments, the administration is performed by injection of a depot agent. When injecting a depot agent, the RNAi agent can be released in a consistent manner over a long period of time. Thus, injection of a depot agent can reduce the frequency of dosing required to achieve the desired effect, such as the desired suppression of PNPLA3 or a therapeutic or prophylactic effect. Injection of a depot agent can also provide more constant serum concentrations. Injections of depot agents can include subcutaneous injections or intramuscular injections. In preferred embodiments, the injection of a depot agent is a subcutaneous injection.
В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством инъекционной помпы. Помпа может представлять собой внешнюю помпу или хирургически имплантированную помпу. В определенных вариантах осуществления помпа представляет собой подкожно имплантированную осмотическую помпу. В других вариантах осуществления помпа представляет собой инфузионную помпу. Инфузионную помпу можно использовать для внутривенных, подкожных, артериальных или эпидуральных инфузий. В предпочтительных вариантах осуществления инфузионная помпа представляет собой подIn some embodiments, the administration is performed via an injection pump. The pump may be an external pump or a surgically implanted pump. In certain embodiments, the pump is a subcutaneously implanted osmotic pump. In other embodiments, the pump is an infusion pump. The infusion pump may be used for intravenous, subcutaneous, arterial, or epidural infusions. In preferred embodiments, the infusion pump is a
- 30 047656 кожную инфузионную помпу. В других вариантах осуществления помпа представляет собой хирургически имплантированную помпу, которая осуществляет доставку средства для RNAi субъекту.- 30 047656 skin infusion pump. In other embodiments, the pump is a surgically implanted pump that delivers an RNAi agent to a subject.
Способ введения может быть выбран в зависимости от того, требуется местное или системное лечение, и в зависимости от области, подлежащей лечению. Способ и участок введения могут быть выбраны для усиления целенаправленного воздействия.The route of administration may be selected depending on whether local or systemic treatment is required and the area to be treated. The route and site of administration may be selected to enhance the targeted effect.
В одном аспекте настоящего изобретения также представлены способы подавления экспрессии гена PNPLA3 у млекопитающего, например, у человека. В настоящем изобретении также представлена композиция, содержащая средство для RNAi, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген PNPLA3 в клетке млекопитающего, для применения в подавлении экспрессии гена PNPLA3 у млекопитающего. В другом аспекте настоящего изобретения представлены варианты применения средства для RNAi, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген PNPLA3 в клетке млекопитающего, в производстве лекарственного препарата для подавления экспрессии гена PNPLA3 у млекопитающего.In one aspect, the present invention also provides methods for suppressing the expression of a PNPLA3 gene in a mammal, such as a human. The present invention also provides a composition comprising an RNAi agent, such as a dsRNA, that targets a PNPLA3 gene in a mammalian cell for use in suppressing the expression of a PNPLA3 gene in a mammal. In another aspect, the present invention provides uses of an RNAi agent, such as a dsRNA, that targets a PNPLA3 gene in a mammalian cell, in the manufacture of a medicament for suppressing the expression of a PNPLA3 gene in a mammal.
Способы и варианты применения включают введение млекопитающему, например человеку, композиции, содержащей средство для RNAi, например dsRNA, которая целенаправленно воздействует на ген PNPLA3 в клетке млекопитающего, и поддержание млекопитающего в течение времени, достаточного для достижения деградации транскрипта мРНК гена PNPLA3, за счет чего обеспечивается подавление экспрессии гена PNPLA3 у млекопитающего.Methods and uses include administering to a mammal, such as a human, a composition comprising an RNAi agent, such as dsRNA, that specifically targets a PNPLA3 gene in a cell of the mammal, and maintaining the mammal for a time sufficient to achieve degradation of the mRNA transcript of the PNPLA3 gene, thereby suppressing expression of the PNPLA3 gene in the mammal.
Снижение экспрессии гена можно оценить в образце периферической крови субъекта, которому вводили средство для RNAi, при помощи любых способов, известных в данной области, например qRTPCR, описанной в данном документе. Снижение продуцирования белка можно оценить при помощи любых способов, известных в данной области, например, при помощи ELISA или вестерн-блоттинга, описанных в данном документе. В одном варианте осуществления образец ткани служит в качестве тканевым материалом для мониторинга снижения экспрессии гена и/или белка PNPLA3. В другом варианте осуществления образец крови служит тканевым материалом для мониторинга снижения экспрессии гена и/или белка PNPLA3.A decrease in gene expression can be assessed in a peripheral blood sample from a subject who has been administered an RNAi agent using any method known in the art, such as qRTPCR described herein. A decrease in protein production can be assessed using any method known in the art, such as ELISA or Western blotting described herein. In one embodiment, the tissue sample serves as a tissue material for monitoring a decrease in PNPLA3 gene and/or protein expression. In another embodiment, the blood sample serves as a tissue material for monitoring a decrease in PNPLA3 gene and/or protein expression.
В одном варианте осуществления верификацию RISC-опосредованного расщепления мишени in vivo после введения средства для RNAi осуществляют с помощью 5'-RACE или модификаций из протокола, известных из уровня техники (Lasham A et al., (2010), Nucleic Acid Res., 38(3), p-e19) (Zimmermann et al. (2006), Nature, 441:111-4).In one embodiment, verification of RISC-mediated target cleavage in vivo following administration of the RNAi agent is performed using 5'-RACE or modifications of the protocol known in the art (Lasham A et al., (2010), Nucleic Acid Res., 38(3), p-e19) (Zimmermann et al. (2006), Nature, 441:111-4).
Понятно, что все последовательности рибонуклеиновой кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть преобразованы в последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты путем замены тиминового основания в составе последовательности урациловым основанием. Аналогичным образом все последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть преобразованы в последовательности рибонуклеиновой кислоты путем замены урацилового основания в составе последовательности тиминовым основанием. В настоящее изобретение включены последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, последовательности рибонуклеиновой кислоты и последовательности, содержащие смеси дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов в составе всех последовательностей, раскрытых в данном документе.It is understood that all ribonucleic acid sequences disclosed herein can be converted into deoxyribonucleic acid sequences by replacing the thymine base in the sequence with a uracil base. Similarly, all deoxyribonucleic acid sequences disclosed herein can be converted into ribonucleic acid sequences by replacing the uracil base in the sequence with a thymine base. The present invention includes deoxyribonucleic acid sequences, ribonucleic acid sequences, and sequences containing mixtures of deoxyribonucleotides and ribonucleotides in all sequences disclosed herein.
Кроме того, любые последовательности нуклеиновых кислот, раскрытые в данном документе, могут быть модифицированы с помощью любой комбинации химических модификаций. Специалист в данной области легко поймет, что такое обозначение, как РНК или ДНК для описания модифицированных полинуклеотидов в некоторых случаях является произвольным. Например, полинуклеотид, содержащий нуклеотид, имеющий заместитель 2'-OH на рибозном сахаре и тиминовое основание, можно описать как молекулу ДНК, имеющую модифицированный сахар (2'-OH вместо природного атома 2'-H ДНК) или как молекулу РНК, имеющую модифицированное основание (тимин (метилированный урацил) вместо природного урацила РНК).In addition, any nucleic acid sequences disclosed herein may be modified by any combination of chemical modifications. One skilled in the art will readily appreciate that the designation RNA or DNA to describe modified polynucleotides is arbitrary in some instances. For example, a polynucleotide comprising a nucleotide having a 2'-OH substituent on the ribose sugar and a thymine base may be described as a DNA molecule having a modified sugar (2'-OH instead of the natural 2'-H atom of DNA) or as an RNA molecule having a modified base (thymine (methylated uracil) instead of the natural uracil of RNA).
Соответственно, последовательности нуклеиновых кислот, представленные в данном документе, включающие без ограничения те, которые указаны в перечне последовательностей, предназначены для охвата нуклеиновых кислот, содержащих любую комбинацию природной или модифицированной РНК и/или ДНК, включая без ограничения такие нуклеиновые кислоты, имеющие модифицированные нуклеиновые основания. В качестве дополнительного примера и без ограничения полинуклеотид, имеющий последовательность ATCGATCG, охватывает любые полинуклеотиды, имеющие такую последовательность, модифицированные или немодифицированные, включая без ограничения такие соединения, содержащие основания РНК, такие как соединения, имеющие последовательность AUCGAUCG, и те соединения, которые имеют некоторые основания ДНК и некоторые основания РНК, такие как AUCGATCG, а также полинуклеотиды, имеющие другие модифицированные основания, такие как ATmeCGAUCG, где meC обозначает цитозиновое основание, содержащее метильную группу в 5положении.Accordingly, the nucleic acid sequences provided herein, including but not limited to those recited in the sequence listing, are intended to encompass nucleic acids comprising any combination of natural or modified RNA and/or DNA, including but not limited to such nucleic acids having modified nucleobases. By way of further example and without limitation, a polynucleotide having the sequence ATCGATCG encompasses any polynucleotides having such a sequence, whether modified or unmodified, including but not limited to those compounds comprising RNA bases, such as those having the sequence AUCGAUCG, and those compounds having some DNA bases and some RNA bases, such as AUCGATCG, as well as polynucleotides having other modified bases, such as ATmeCGAUCG, where meC is a cytosine base containing a methyl group at the 5 position.
Следующие примеры, в том числе проведенные эксперименты и достигнутые результаты, предоставлены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем прилагаемой формулы изобретения.The following examples, including experiments performed and results achieved, are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the appended claims.
- 31 047656- 31 047656
Включение посредством ссылкиInclusion via link
Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые в данном описании, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была специально и индивидуально указана для включения посредством ссылки. Однако цитирование ссылки в данном документе не должно рассматриваться как подтверждение того, что такая ссылка является предшествующим уровнем техники для настоящего изобретения. В том случае, если любое из определений или терминов, представленных в ссылочных материалах, включенных посредством ссылки, отличается от терминов и обсуждений, представленных в данном документе, преобладающими являются термины и определения по настоящему описанию.All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference. However, citation of a reference herein should not be construed as an admission that such reference is prior art to the present invention. To the extent that any of the definitions or terms provided in the references incorporated by reference differ from the terms and discussions provided herein, the terms and definitions in this specification control.
ЭквивалентыEquivalents
Вышеизложенное письменное описание считается достаточным для того, чтобы позволить специалисту в данной области реализовать настоящее изобретение на практике. В вышеизложенном описании и примерах подробно описаны некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и описан наилучший способ, предусматриваемый авторами настоящего изобретения. Однако следует иметь в виду, что независимо от того, насколько подробно вышеизложенное может появиться в тексте, настоящее изобретение может быть осуществлено многими способами, поэтому настоящее изобретение следует истолковывать в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.The foregoing written description is considered sufficient to enable one skilled in the art to practice the present invention. The foregoing description and examples have described in detail certain preferred embodiments of the present invention and have described the best mode contemplated by the inventors of the present invention. However, it should be understood that no matter how detailed the foregoing may appear in the text, the present invention may be practiced in many ways, and therefore the present invention should be construed in accordance with the appended claims and any equivalents thereof.
Следующие примеры, в том числе проведенные эксперименты и достигнутые результаты, предоставлены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение.The following examples, including experiments performed and results achieved, are provided for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the present invention.
Все описанные в данном документе эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) компании Amgen и были проведены в соответствии с Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th Edition (National Research Council (U.S.), Committee for the Update Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) и National Academies Press (U.S.) (2011), Guide for the care and use of laboratory animals. 8th Ed., National Academies Press, Washington, D.C. Мышей содержали в одном помещении в комнате с кондиционированным воздухом с температурой 22±2°C и циклом света-темноты с двенадцатичасовым освещением и двенадцатью часами темноты (0600-1800 ч). Животные имели свободный доступ к стандартному корму (Envigo, 2920X, или корм, как указано иначе) и к воде (очищенной обратным осмосом) через автоматическую поилку, если не указано иное. По окончании установленного периода кровь собирали посредством пункции сердца под глубоким наркозом, а затем, следуя рекомендациям Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных (AAALAC), животных подвергали эвтаназии вторичным физическим методом.All animal experiments described in this paper were approved by the Amgen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) and were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th Edition (National Research Council (US), Committee for the Update Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (US) and National Academies Press (US) (2011), Guide for the care and use of laboratory animals. 8th Ed., National Academies Press, Washington, DC Mice were housed indoors in an air-conditioned room maintained at 22 ± 2°C and maintained on a 12-hour light/12-hour dark cycle (0600–1800 h). Animals had free access to standard chow (Envigo, 2920X, or chow as otherwise indicated) and water (reverse osmosis purified) via an automatic waterer unless otherwise indicated. otherwise specified. At the end of the specified period, blood was collected by cardiac puncture under deep anesthesia, and then, following the recommendations of the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC), the animals were euthanized by a secondary physical method.
Пример 1. Отбор, конструирование и синтез модифицированных молекул siRNA PNPLA3.Example 1. Selection, design and synthesis of modified PNPLA3 siRNA molecules.
Идентификация и отбор оптимальных последовательностей терапевтических молекул siRNA, целенаправленно воздействующих на пататин-подобный фосфолипазный домен 3 (PNPLA3), идентифицировали с использованием биоинформационного анализа транскрипта PNPLA3 человека (NM_025225.2). В табл. 1 показаны последовательности, идентифицированные как имеющие терапевтические свойства. По всей длине различных последовательностей {INVAB} обозначает инвертированное основание A, {INVDA} обозначает инвертированный дезокситимидин, GNA обозначает гликолевую нуклеиновую кислоту, dT означает дезокситимидин и dC означает дезоксицитозин.Identification and selection of optimal sequences of therapeutic siRNA molecules targeting patatin-like phospholipase domain 3 (PNPLA3) were identified using bioinformatic analysis of the human PNPLA3 transcript (NM_025225.2). Table 1 shows the sequences identified as having therapeutic properties. Throughout the various sequences, {INVAB} denotes inverted base A, {INVDA} denotes inverted deoxythymidine, GNA denotes glycolic nucleic acid, dT denotes deoxythymidine, and dC denotes deoxycytosine.
- 32 047656- 32 047656
Таблица 1Table 1
Последовательности siRNA, направленные на PNPLA3siRNA sequences targeting PNPLA3
- 33 047656- 33 047656
- 34 047656- 34 047656
- 35 047656- 35 047656
- 36 047656- 36 047656
- 37 047656- 37 047656
- 38 047656- 38 047656
- 39 047656- 39 047656
- 40 047656- 40 047656
- 41 047656- 41 047656
- 42 047656- 42 047656
- 43 047656- 43 047656
- 44 047656- 44 047656
- 45 047656- 45 047656
- 46 047656- 46 047656
- 47 047656- 47 047656
- 48 047656- 48 047656
- 49 047656- 49 047656
- 50 047656- 50 047656
- 51 047656- 51 047656
- 52 047656- 52 047656
- 53 047656- 53 047656
- 54 047656- 54 047656
- 55 047656- 55 047656
- 56 047656- 56 047656
- 57 047656- 57 047656
- 58 047656- 58 047656
- 59 047656- 59 047656
- 60 047656- 60 047656
- 61 047656- 61 047656
- 62 047656- 62 047656
- 63 047656- 63 047656
- 64 047656- 64 047656
- 65 047656- 65 047656
- 66 047656- 66 047656
- 67 047656- 67 047656
- 68 047656- 68 047656
- 69 047656- 69 047656
- 70 047656- 70 047656
- 71 047656- 71 047656
- 72 047656- 72 047656
- 73 047656- 73 047656
- 74 047656- 74 047656
- 75 047656- 75 047656
- 76 047656- 76 047656
- 77 047656- 77 047656
- 78 047656- 78 047656
- 79 047656- 79 047656
- 80 047656- 80 047656
- 81 047656- 81 047656
- 82 047656- 82 047656
- 83 047656- 83 047656
- 84 047656- 84 047656
- 85 047656- 85 047656
- 86 047656- 86 047656
- 87 047656- 87 047656
- 88 047656- 88 047656
- 89 047656- 89 047656
- 90 047656- 90 047656
- 91 047656- 91 047656
- 92 047656- 92 047656
- 93 047656- 93 047656
- 94 047656- 94 047656
- 95 047656- 95 047656
- 96 047656- 96 047656
- 97 047656- 97 047656
- 98 047656- 98 047656
- 99 047656- 99 047656
- 100 047656- 100 047656
Чтобы повысить активность и стабильность in vivo последовательностей siRNA PNPLA3, встраивали химические модификации в молекулы siRNA PNPLA3. В частности, встраивали 2'-O-метил- и 2'-фтор-модификации рибозного сахара в определенные положения siRNA PNPLA3. Также встраивали фосфоротиоатные межнуклеотидные связи в концевые участки антисмысловых и/или смысловых последовательностей. В нижеприведенной таблице 2 изображены модификации в смысловой и антисмысловой последовательностях для каждой из модифицированных siRNA PNPLA3. Нуклеотидные последовательности в таблице 2 и других частях заявки перечислены в соответствии со следующими обозначениями: A, U, G и C = соответствующий рибонуклеотид; dT = дезокситимидин; dA = дезоксиаденозин; dC = дезоксицитидин; dG = дезоксигуанозин; invDT = инвертированный дезокситимидин; invDA = инвертированный дезоксиаденозин; invDC = инвертированный дезоксицитидин; invDG = инвертированный дезоксигуанозин; a, u, g и c = соответствующий 2'-O-метилрибонуклеотид; Af, Uf, Gf и Cf = соответствующий 2'-дезокси-2'-фтор(2'-фтор)рибонуклеотид; Ab = нуклеотид с удаленным азотистым основанием; MeO-I = 2'-метоксиинозин; GNA = гликолевая нуклеиновая кислота; sGNA = гликолевая нуклеиновая кислота с 3'-фосфоротиоатом; LNA = закрытая нуклеиновая кислота. Вставка s в последовательность означает, что два соседних нуклеотида связаны фосфоротиодиэфирной группой (например, фосфоротиоатной межнуклеотидной связью). Если не указано иное, все другие нуклеотиды связаны 3'-5'-фосфодиэфирными группами. Каждое из соединений на основе siRNA в табл. 2 содержит дуплексный участок длиной в 19 пар оснований, содержащий либо липкий конец из двух нуклеотидов на 3'-конце обеих нитей, либо тупой конец на одном или на обоих концах. GalNAc3K2AhxC6 представляет собой:To enhance the activity and in vivo stability of the PNPLA3 siRNA sequences, chemical modifications were introduced into the PNPLA3 siRNA molecules. Specifically, 2'-O-methyl and 2'-fluoro modifications of the ribose sugar were introduced into specific positions of the PNPLA3 siRNA. Phosphorothioate internucleotide linkages were also introduced into the termini of the antisense and/or sense sequences. Table 2 below shows the modifications in the sense and antisense sequences for each of the modified PNPLA3 siRNAs. The nucleotide sequences in Table 2 and elsewhere in the application are listed according to the following notations: A, U, G, and C = the corresponding ribonucleotide; dT = deoxythymidine; dA = deoxyadenosine; dC = deoxycytidine; dG = deoxyguanosine; invDT = inverted deoxythymidine; invDA = inverted deoxyadenosine; invDC = inverted deoxycytidine; invDG = inverted deoxyguanosine; a, u, g, and c = the corresponding 2'-O-methylribonucleotide; Af, Uf, Gf, and Cf = the corresponding 2'-deoxy-2'-fluoro(2'-fluoro)ribonucleotide; Ab = base-deleted nucleotide; MeO-I = 2'-methoxyinosine; GNA = glycolic nucleic acid; sGNA = glycolic nucleic acid with 3'-phosphorothioate; LNA = locked nucleic acid. The insertion of s in the sequence indicates that two adjacent nucleotides are linked by a phosphorothioate group (e.g., a phosphorothioate internucleotide linkage). Unless otherwise noted, all other nucleotides are linked by 3'-5'-phosphodiester groups. Each of the siRNA-based compounds in Table 2 contains a 19-bp duplex region containing either a two-nucleotide sticky end at the 3' end of both strands or a blunt end at one or both ends. GalNAc3K2AhxC6 is:
- 101 047656- 101 047656
Таблица 2Table 2
Последовательности siRNA, направленные на PNPLA3 с модификациямиsiRNA sequences targeting PNPLA3 with modifications
- 102 047656- 102 047656
- 103 047656- 103 047656
- 104 047656- 104 047656
- 105 047656- 105 047656
- 106 047656- 106 047656
- 107 047656- 107 047656
- 108 047656- 108 047656
- 109 047656- 109 047656
- 110 047656- 110 047656
- 111 047656- 111 047656
- 112 047656- 112 047656
- 113 047656- 113 047656
- 114 047656- 114 047656
- 115 047656- 115 047656
- 116 047656- 116 047656
- 117 047656- 117 047656
- 118 047656- 118 047656
- 119 047656- 119 047656
- 120 047656- 120 047656
- 121 047656- 121 047656
- 122 047656- 122 047656
- 123 047656- 123 047656
- 124 047656- 124 047656
- 125 047656- 125 047656
- 126 047656- 126 047656
- 127 047656- 127 047656
- 128 047656- 128 047656
- 129 047656- 129 047656
- 130 047656- 130 047656
- 131 047656- 131 047656
- 132 047656- 132 047656
- 133 047656- 133 047656
- 134 047656- 134 047656
- 135 047656- 135 047656
- 136 047656- 136 047656
- 137 047656- 137 047656
- 138 047656- 138 047656
- 139 047656- 139 047656
- 140 047656- 140 047656
- 141 047656- 141 047656
- 142 047656- 142 047656
- 143 047656- 143 047656
- 144 047656- 144 047656
- 145 047656- 145 047656
- 146 047656- 146 047656
- 147 047656- 147 047656
- 148 047656- 148 047656
- 149 047656- 149 047656
- 150 047656- 150 047656
- 151 047656- 151 047656
- 152 047656- 152 047656
- 153 047656- 153 047656
- 154 047656- 154 047656
- 155 047656- 155 047656
- 156 047656- 156 047656
Пример 2. Эффективность отобранных молекул siRNA PNPLA3 в анализе RNA FISH.Example 2. Efficiency of selected PNPLA3 siRNA molecules in RNA FISH analysis.
Получали панель полностью химически модифицированной siRNA, включая siRNA, охватывающую rs738409 и/или rs738408 SNP PNPLA3, и тестировали ее на активность и селективность нокдауна мРНК in vitro. Каждый дуплекс siRNA состоял из двух нитей: смысловой или 'пассажирской' нити и антисмысловой или 'направляющей' нити. Нити имели длину 21 или 23 нуклеотида с 19 комплементарными парами оснований. В некоторых случаях присутствовали 3'-липкие концы, состоящие из двух пар оснований. Получали siRNA с заменой природной группы 2'-OH в рибозе каждого нуклеотида на 2'-OMeлибо 2'-Р-группу. Сложные фосфодиэфирные межнуклеотидные связи в одной или обеих нитях необязательно были заменены фосфоротиоатами для уменьшения деградации молекулы экзонуклеазами.A panel of fully chemically modified siRNAs, including siRNA spanning rs738409 and/or rs738408 of the PNPLA3 SNP, was generated and tested for mRNA knockdown activity and selectivity in vitro. Each siRNA duplex consisted of two strands: a sense or 'passenger' strand and an antisense or 'guide' strand. The strands were 21 or 23 nucleotides long with 19 complementary base pairs. In some cases, 3' overhangs consisting of two base pairs were present. siRNAs were generated with the natural 2'-OH group in the ribose of each nucleotide replaced by either 2'-OMe or 2'-P group. Phosphodiester internucleotide linkages in one or both strands were optionally replaced with phosphorothioates to reduce degradation of the molecule by exonucleases.
Эффективность каждой из молекул siRNA в снижении экспрессии PNPLA3 оценивали с использованием анализа трансфекции siRNA in vitro в 384-луночном формате с последующей флуоресцентной гибридизацией in situ, нацеленной на молекулы рибонуклеиновой кислоты (RNA FISH), для определения значений IC50 и максимальной активности. Данный анализ выполняли на линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека Hep3B (ATCC HB-8064) и на клетках яичника китайского хомячка (CHO), экспрессирующих PNPLA3 I148I человека. Линию клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepB3 поддерживали в среде EMEM (ATCC 30-2003), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой и 1% антибиотиком/антимикотиком, при 37°C и 5% CO2. Клетки линии CHO, экспрессирующие PNPLA3 I148I человека, поддерживали в среде, содержащей 50% CD-CHO (Life Technologies), 50% Ex-Cell CHOThe potency of each siRNA molecule in reducing PNPLA3 expression was assessed using an in vitro siRNA transfection assay in a 384-well format followed by RNA-targeted fluorescence in situ hybridization (RNA FISH) to determine IC 50 values and maximal activity. The assay was performed on the human hepatocellular carcinoma cell line Hep3B (ATCC HB-8064) and on Chinese hamster ovary (CHO) cells expressing human PNPLA3 I148I. The human hepatocellular carcinoma cell line HepB3 was maintained in EMEM (ATCC 30-2003) supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic/antimycotic at 37°C and 5% CO 2 . CHO cells expressing human PNPLA3 I148I were maintained in medium containing 50% CD-CHO (Life Technologies), 50% Ex-Cell CHO
- 157 047656- 157 047656
Medium (Sigma), 8 мМ L-глутамин, 1x HT, 1% антибиотик/антимикотик и 10 мкг/мл пуромицина, приMedium (Sigma), 8 mM L-glutamine, 1x HT, 1% antibiotic/antimycotic and 10 µg/ml puromycin, at
37°C и 5% CO2.37°C and 5% CO2.
Для анализов клеток Hep3B трансфекционные комплексы, состоящие из молекул siRNA и реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) в среде EMEM (ATCC 30-2003), вносили в 384-луночные планшеты (PerkinElmer) из расчета 10 мкг на лунку в соответствии с рекомендациями производителя. Для анализов с клетками CHO человека трансфекционные комплексы, состоящие из молекул siRNA и реагента для трансфекции Lipofectamine RNAiMAX в среде F12K (Mediatech), вносили в 384-луночные планшеты из расчета 10 мкг/лунка в соответствии с рекомендациями производителя. Клетки разбавляли до 67000 клеток/мл в среде с антибиотиком/без антибиотика и 30 мкл добавляли в каждую лунку, конечная плотность составляла 2000 клеток/лунка в 40 мкл среды. После 20-минутной инкубации при комнатной температуре планшеты переносили в инкубатор с условиями 37°C и 5% CO2. Трансфекционные смеси с клетками Hep3B инкубировали в течение 72 ч, а трансфекционные смеси с клетками CHO с PNPLA3 I148I человека инкубировали в течение 48 ч.For Hep3B cell assays, transfection complexes consisting of siRNA molecules and Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent (Life Technologies) in EMEM (ATCC 30-2003) were added to 384-well plates (PerkinElmer) at 10 μg/well according to the manufacturer's recommendations. For human CHO cell assays, transfection complexes consisting of siRNA molecules and Lipofectamine RNAiMAX transfection reagent in F12K medium (Mediatech) were added to 384-well plates at 10 μg/well according to the manufacturer's recommendations. Cells were diluted to 67,000 cells/mL in antibiotic/no antibiotic medium and 30 μL were added to each well for a final density of 2,000 cells/well in 40 μL of medium. After 20 min incubation at room temperature, the plates were transferred to an incubator with 37°C and 5% CO2 conditions. Transfection mixtures with Hep3B cells were incubated for 72 h, and transfection mixtures with CHO cells with human PNPLA3 I148I were incubated for 48 h.
При сборе клетки фиксировали в 8% фиксирующем растворе формальдегида (Thermo Scientific) в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем планшеты подвергали дегидратации с последовательной промывкой 50, 70 и 100% этанолом. Затем планшеты запечатывали и хранили при -20°C.Upon harvest, cells were fixed in 8% formaldehyde fixative (Thermo Scientific) for 15 min at room temperature. Plates were then dehydrated with sequential washes of 50, 70, and 100% ethanol. Plates were then sealed and stored at -20°C.
Анализ RNA FISH выполняли с использованием набора для скрининга Affymetrix QuantiGene® View RNA HC Screening Assay (QVP0011), набора для усиления сигнала Affymetrix View HC Signal Amplification Kit 3-plex (QVP0213) от Affymetrix и геноспецифических зондов от Affymetrix: 0,33 мл View RNA тип 6 (метка 650) VA6-20279-01 PNPLA3 человека и 0,44 мл View RNA тип 1 (метка 488) VA1-10148-01 PPIB человека.RNA FISH analysis was performed using the Affymetrix QuantiGene® View RNA HC Screening Assay (QVP0011), the Affymetrix View HC Signal Amplification Kit 3-plex (QVP0213) from Affymetrix, and gene-specific probes from Affymetrix: 0.33 ml View RNA type 6 (650 tag) human VA6-20279-01 PNPLA3 and 0.44 ml View RNA type 1 (488 tag) human VA1-10148-01 PPIB.
Сначала содержимое планшетов регидратировали с последовательными промывками 100, 70 и 50% этанолом. Затем клетки промывали PBS, а затем подвергали пермеабилизации и расщеплению протеазой в соответствии с инструкциями к набору. Целевые наборы рабочих зондов готовили в соответствии с протоколом производителя, вносили в лунки и инкубировали в течение 3 ч при 40°C. Протокол производителя использовали для последовательных гибридизаций с наборами рабочих зондов, рабочими предварительными усилителями, рабочими усилителями и рабочими LP. В завершении проводили контрокрашивание ядер (Hoechst 33342 и Cell Mask Blue; Molecular Probes). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, промывали PBS, вносили 80 мкл PBS, а затем планшеты запечатывали для визуализации.Plate contents were first rehydrated with sequential washes with 100, 70, and 50% ethanol. Cells were then washed with PBS and then permeabilized and protease digested according to kit instructions. Targeted working probe sets were prepared according to the manufacturer's protocol, added to wells, and incubated for 3 h at 40°C. The manufacturer's protocol was used for sequential hybridizations with working probe sets, working preamplifiers, working amplifiers, and working LPs. Finally, nuclei were counterstained (Hoechst 33342 and Cell Mask Blue; Molecular Probes). Plates were incubated for 30 min at room temperature, washed with PBS, added with 80 μl PBS, and then sealed for visualization.
Все планшеты подвергали визуализации с помощью системы скрининга высокого разрешения pera Phenix High Content Screening System (PerkinElmer) с использованием УФ-канала для Hoechst 33342 и Cell Mask Blue, канала с длиной волны 488 нм для зондов типа 1, а также канала с длиной волны 647 нм для зондов типа 6.All plates were visualized using the pera Phenix High Content Screening System (PerkinElmer) using the UV channel for Hoechst 33342 and Cell Mask Blue, the 488 nm channel for type 1 probes, and the 647 nm channel for type 6 probes.
Данные RNA FISH анализировали с использованием программного обеспечения Columbus, и изображения были получены с помощью Genedata Screener. Результаты анализа для клеток CHO, трансфицированных PNPLA3 I148I, показаны в табл. 3. Результаты анализа для клеток CHO, трансфицированных PNPLA3 I148M, показаны в табл. 4. Нокдаун PNPLA3 приведен в виде процента нокдауна по сравнению с контролем. Отрицательные значения указывают на снижение уровней PNPLA3.RNA FISH data were analyzed using Columbus software and images were generated using Genedata Screener. The assay results for CHO cells transfected with PNPLA3 I148I are shown in Table 3. The assay results for CHO cells transfected with PNPLA3 I148M are shown in Table 4. PNPLA3 knockdown is shown as percent knockdown compared to control. Negative values indicate decreased PNPLA3 levels.
Таблица 3Table 3
Анализ RNA FISH клеток CHO, трансфицированных PNPLA3 I148IRNA FISH analysis of CHO cells transfected with PNPLA3 I148I
- 158 047656- 158 047656
- 159 047656- 159 047656
- 160 047656- 160 047656
RNA FISH также проводили на линии клеток печени, содержащей двойную мутацию PNPLA3rs738408-rs738409, а также на контрольной линии клеток Hep3B дикого типа. Клетки Hep3B и HepG2 (приобретенные у ATCC) культивировали в минимальной поддерживающей среде (MEM от Corning для клеток Hep3B и EMEM от ATCC для клеток HepG2), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS, Sigma) и 1% раствором пенициллина-стрептомицина (P-S, Corning). Трансфекцию siRNA проводили следующим образом: 1 мкл тестируемых siRNA и 4 мкл простой MEM или EMEM, в зависимости от клеточной линии, добавляли в планшеты для анализа CellCarrier-384 Ultra, покрытые PDL (PerkinElmer), от BioMek FX (Beckman Coulter). 5 мкл Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific), предварительно разбавленного в простой MEM или EMEM (а именно, 0,035 мкл RNAiMAX в 5 мкл MEM для клеток Hep3B и 0,06 мкл RNAiMAX в 5 мкл EMEM для клеток HepG2), затем дозировали в планшеты для анализа с помощью дозатора для реагентов Multidrop Combi Reagent Dispenser (Thermo Fisher Scientific). После 20 мин инкубации смеси siRNA/RNAiMAX при комнатной температуре (RT) в трансфекционный комплекс с помощью дозатора для реагентов Multidrop Combi добавляли 30 мкл клеток Hep3B либо клеток HepG2 (2000 клеток на лунку) в MEM или EMEM, дополненной 10% FBS и 1% P-S. Планшеты для анализа инкубировали в течение 20 мин при RT до помещения в инкубатор. Затем клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°C и 5% CO2. Анализ клеток ViewRNA ISH проводили в соответствии с протоколом производителя (Thermo Fisher Scientific) с использованием самостоятельно собранной автоматизированной платформы для анализа FISH, предназначенной для работы с жидкостями. Вкратце клетки фиксировали в 4% формальдегиде (Thermo Fisher Scientific) в течение 15 мин при RT, пермеабилизировали при помощи детергента в течение 3 мин при RT, а затем обрабатывали раствором протеазы в течение 10 мин при RT. Инкубацию мишень-специфических пар зондов (Thermo Fisher Scientific) проводили в течение 3 ч, в то время как для предусилителей, усилителей и зондов с метками (Thermo Fisher Scientific) ее проводили по 1 ч. Все стадии гибридизации выполняли при 40°C в автоматизированном инкубаторе Cytomat 2 C-LIN (Thermo Fisher Scientific). После реакций гибридизации проводили окрашивание клеток Hoechst и CellMask Blue (Thermo Fisher Scientific) в течение 30 мин, а затем проводили визуализацию с помощью Opera Phenix (PerkinElmer). Изображения анализировали с использованием системы для хранения и анализа данных Columbus Image (PerkinElmer) с получением среднего значения числа пятен на клетку. Подсчет пятен нормализовали с использованием контрольных лунок с высоким значением (содержащих фосфатно-буферный солевой раствор от Corning) и с низким значением (без пар целевых зондов). Нормализованные значения по отношению к концентрациям общей siRNA наносили на график, и данные сопоставляли с четырехпараметрической сигмоидальной моделью в Genedata Screener (Genedata) для получения значений IC50 и максимальной активности. Результаты анализов для клеток HepG2 показаны в табл. 5, а результаты анализов для клеток Hep3B показаны в табл. 6.RNA FISH was also performed on a liver cell line containing the double mutation PNPLA3rs738408-rs738409, as well as on a wild-type control cell line Hep3B. Hep3B and HepG2 cells (purchased from ATCC) were cultured in minimal essential medium (MEM from Corning for Hep3B cells and EMEM from ATCC for HepG2 cells) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma) and 1% penicillin-streptomycin (PS, Corning). siRNA transfection was performed as follows: 1 μl of test siRNAs and 4 μl of plain MEM or EMEM, depending on the cell line, were added to PDL (PerkinElmer) coated CellCarrier-384 Ultra assay plates from BioMek FX (Beckman Coulter). 5 μl of Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) pre-diluted in plain MEM or EMEM (i.e., 0.035 μl RNAiMAX in 5 μl MEM for Hep3B cells and 0.06 μl RNAiMAX in 5 μl EMEM for HepG2 cells) were then dispensed into the assay plates using the Multidrop Combi Reagent Dispenser (Thermo Fisher Scientific). After 20 min of siRNA/RNAiMAX mixture incubation at room temperature (RT), 30 μl of Hep3B cells or HepG2 cells (2000 cells per well) in MEM or EMEM supplemented with 10% FBS and 1% PS were added to the transfection complex using the Multidrop Combi Reagent Dispenser. The assay plates were incubated for 20 min at RT before being placed in the incubator. Cells were then incubated for 72 h at 37°C and 5% CO 2 . ViewRNA ISH analysis of cells was performed according to the manufacturer's protocol (Thermo Fisher Scientific) using a self-assembled automated liquid-based FISH assay platform. Briefly, cells were fixed in 4% formaldehyde (Thermo Fisher Scientific) for 15 min at RT, permeabilized with detergent for 3 min at RT, and then treated with protease solution for 10 min at RT. Target-specific probe pairs (Thermo Fisher Scientific) were incubated for 3 h, while preamplifiers, amplifiers, and labeled probes (Thermo Fisher Scientific) were incubated for 1 h each. All hybridization steps were performed at 40°C in a Cytomat 2 C-LIN automated incubator (Thermo Fisher Scientific). Following hybridization reactions, cells were stained with Hoechst and CellMask Blue (Thermo Fisher Scientific) for 30 min and then visualized with Opera Phenix (PerkinElmer). Images were analyzed using the Columbus Image Data Storage and Analysis System (PerkinElmer) to obtain the mean number of spots per cell. Spot counts were normalized using high-count (containing phosphate-buffered saline from Corning) and low-count (no target probe pairs) control wells. Normalized values against total siRNA concentrations were plotted, and the data were fitted with a four-parameter sigmoid model in Genedata Screener (Genedata) to obtain IC 50 and maximum activity values. The assay results for HepG2 cells are shown in Table 5, and the assay results for Hep3B cells are shown in Table 6.
- 161 047656- 161 047656
Нокдаун PNPLA3 приведен в виде процента нокдауна по сравнению с контролем. Отрицательные значения указывают на снижение уровней PNPLA3. В тех случаях, когда дуплекс проходил анализ более одного раза, со стандартным отклонением показано среднее значение IC50.PNPLA3 knockdown is shown as percent knockdown compared to control. Negative values indicate decreased PNPLA3 levels. In cases where a duplex was assayed more than once, the mean IC50 value is shown with standard deviation.
Таблица 5Table 5
Анализ RNA FISH гепатоцитов HepG2RNA FISH analysis of HepG2 hepatocytes
- 162 047656- 162 047656
- 163 047656- 163 047656
- 164 047656- 164 047656
- 165 047656- 165 047656
- 166 047656- 166 047656
- 167 047656- 167 047656
- 168 047656- 168 047656
- 169 047656- 169 047656
- 170 047656- 170 047656
- 171 047656- 171 047656
- 172 047656- 172 047656
- 173 047656- 173 047656
- 174 047656- 174 047656
- 175 047656- 175 047656
- 176 047656- 176 047656
Таблица 6Table 6
Анализ RNA FISH гепатоцитов Hep3BRNA FISH analysis of Hep3B hepatocytes
- 177 047656- 177 047656
- 178 047656- 178 047656
- 179 047656- 179 047656
- 180 047656- 180 047656
- 181 047656- 181 047656
Пример 3. Анализ с помощью капельной цифровой ПЦР siRNA для PNPLA3-rs738409 и PNPLA3-rs738409-rs738408.Example 3. Droplet digital PCR analysis of siRNA for PNPLA3-rs738409 and PNPLA3-rs738409-rs738408.
Следуя протоколу производителя, размороженные первичные гепатоциты человека (Xenotech/донорская партия Sekisui HC3-38) в среде OptiThaw (№ по кат. K8000 Xenotech) центрифугировали и после аспирации среды ресуспендировали в среде для гепатоцитов OptiPlate (№ по кат. K8200 Xenotech), после чего вносили в 96-луночные планшеты с коллагеновым покрытием (№ по кат. Greiner 655950). После 2-4-часового периода инкубации среду удаляли и заменяли средой для гепатоцитов OptiCulture (№ по кат. K8300 Xenotech). Через 2-4 ч после добавления среды OptiCulture в клетки поступали siRNA, конъюгированные с GalNAc, путем свободного захвата клетками (без реагента для трансфекции). Клетки инкубировали в течение 24-72 ч при 37°C и 5% CO2. Затем клетки лизировали буфером Qiagen RLT (79216) + 1% 2-меркаптоэтанол (Sigma, M-3148), и лизаты хранили при -20°C. Очистку РНК проводили с использованием прибора Qiagen QIACube HT (9001793) и набора Qiagen RNeasy 96 QIACube HT Kit (74171) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы анализировали с использованием системы QIAxpert (9002340). кДНК синтезировали из образцов РНК с использованием набора для высокопроизводительной обратной транскрипции кДНК Applied Biosystems (4368813), при этом реакции проводили в соответствии с инструкциями производителя, а концентрация вносимой РНК зависела от образца. Обратную транскрипцию проводили на термоциклере BioRad tetrad (модель № PTC-0240G) в следующих условиях: 25°C 10 мин, 37°C 120 мин, 85°C 5 мин с последующим (необязательно) неограниченным по времени выдерживанием при 4°C.Following the manufacturer's protocol, thawed primary human hepatocytes (Xenotech/Sekisui donor lot HC3-38) in OptiThaw medium (Cat# K8000 Xenotech) were centrifuged and aspirated, resuspended in OptiPlate Hepatocyte Medium (Cat# K8200 Xenotech) and added to 96-well collagen-coated plates (Cat# Greiner 655950). After a 2-4 hour incubation period, the medium was removed and replaced with OptiCulture Hepatocyte Medium (Cat# K8300 Xenotech). GalNAc-conjugated siRNA was freely taken up by the cells (without transfection reagent) 2-4 hours after addition of OptiCulture medium. Cells were incubated for 24-72 h at 37°C and 5% CO2. Cells were then lysed with Qiagen RLT buffer (79216) + 1% 2-mercaptoethanol (Sigma, M-3148) and lysates were stored at -20°C. RNA purification was performed using a Qiagen QIACube HT instrument (9001793) and a Qiagen RNeasy 96 QIACube HT Kit (74171) according to the manufacturer's instructions. Samples were analyzed using the QIAxpert system (9002340). cDNA was synthesized from RNA samples using the Applied Biosystems cDNA High Throughput Reverse Transcription Kit (4368813), with reactions performed according to the manufacturer's instructions and the concentration of RNA added depending on the sample. Reverse transcription was performed in a BioRad tetrad thermal cycler (model no. PTC-0240G) under the following conditions: 25°C for 10 min, 37°C for 120 min, 85°C for 5 min, followed by an optional indefinite hold at 4°C.
Капельную цифровую ПЦР (ddPCR) проводили с использованием системы для капельной цифровой ПЦР AutoDG QX200 от BioRad в соответствии с инструкциями производителя. Реакционные смеси составляли в прозрачном 96-луночном планшете для ПЦР от Eppendorf (951020303) с использованием BioRad ddPCR Supermix для зондов (1863010) и флуоресцентно меченых смесей для анализов qPCR для PNPLA3 (IDT Hs.PT.58.21464637, соотношение праймера и зонда 3.6:1 и TBP (IDT Hs.PT.53a.20105486, соотношение праймера и зонда 3.6:1) и воды, не содержащей РНКаз (Ambion, AM9937). Конечная концентрация праймера/зонда составляла 900 нМ/250 нМ соответственно, начальная концентрация кДНК отличалась для разных лунок. Капли формировали с использованием генератора капель BioRad Auto DG (1864101), настроенного с учетом рекомендуемых производителем расходных материалов (картриджи BioRad DG32 1864108, наконечники BioRad 1864121, 96-луночный планшет для ПЦР Eppendorf blue 951020362, масло для генерации капель для зондов BioRad 1864110 и собранная панель для капельDroplet digital PCR (ddPCR) was performed using the BioRad AutoDG QX200 Droplet Digital PCR System according to the manufacturer's instructions. Reaction mixtures were prepared in a clear 96-well PCR plate from Eppendorf (951020303) using BioRad ddPCR Supermix for probes (1863010) and fluorescently labeled qPCR assay mixes for PNPLA3 (IDT Hs.PT.58.21464637, primer to probe ratio 3.6:1 and TBP (IDT Hs.PT.53a.20105486, primer to probe ratio 3.6:1) and RNase-free water (Ambion, AM9937). The final primer/probe concentration was 900 nM/250 nM, respectively, and the starting cDNA concentration varied among wells. Droplets were generated using a BioRad Auto DG droplet generator (1864101) configured for manufacturer's recommended consumables (BioRad DG32 cartridges 1864108, BioRad tips 1864121, Eppendorf blue 96-well PCR plate 951020362, BioRad probe droplet generation oil 1864110 and droplet assembly
- 182 047656- 182 047656
BioRad). Капли подвергали амплификации на термоциклере BioRad C1000 touch (1851197), используя следующие условия: активация фермента при 95°C в течение 10 мин, денатурация при 94°C в течение 30 с с последующим отжигом/элонгацией при 60°C в течение 1 мин, 40 циклов со скоростью нагрева/охлаждения 2°C/c, инактивация фермента при 98°C в течение 10 мин с последующим (необязательно) неограниченным по времени выдерживанием при 4°C. Затем образцы считывали на устройстве для считывания BioRad QX200 Droplet Reader, измеряющем сигнал FAM/HEX, который коррелирует с концентрацией PNPLA3 или TBP. Анализ данных проводили с использованием программного пакета BioRad QuantaSoft. Образцы гейтировали по каналу (флуоресцентная метка) для определения концентрации на образец. Каждый образец затем выражали как соотношение концентрации гена, представляющего интерес (PNPLA3), и концентрации конститутивного гена (TBP) для контроля разницы в загрузке образца. Затем данные импортировали в Genedata Screener, где каждая тестируемая siRNA нормализуется по медианным значениям нейтральных контрольных лунок (содержащих только буфер). Значения IC50 представлены в табл. 7.BioRad). Droplets were amplified on a BioRad C1000 touch thermal cycler (1851197) using the following conditions: enzyme activation at 95°C for 10 min, denaturation at 94°C for 30 sec followed by annealing/elongation at 60°C for 1 min, 40 cycles at a heating/cooling rate of 2°C/sec, enzyme inactivation at 98°C for 10 min followed (optionally) by an indefinite hold at 4°C. Samples were then read on a BioRad QX200 Droplet Reader measuring the FAM/HEX signal, which correlates with the concentration of PNPLA3 or TBP. Data analysis was performed using the BioRad QuantaSoft software package. Samples were gated by channel (fluorescent label) to determine the concentration per sample. Each sample was then expressed as a ratio of the gene of interest (PNPLA3) concentration to the housekeeping gene (TBP) concentration to control for differences in sample loading. The data were then imported into Genedata Screener, where each siRNA tested was normalized to the median values of the neutral control wells (containing buffer only). IC 50 values are presented in Table 7.
Таблица 7Table 7
Анализ ddPCR, выполненный на первичных гепатоцитахddPCR analysis performed on primary hepatocytes
- 183 047656- 183 047656
- 184 047656- 184 047656
- 185 047656- 185 047656
- 186 047656- 186 047656
- 187 047656- 187 047656
Пример 4. Скрининг эффективности выбранных молекул siRNA PNPLA3 на модели гуманизированой мыши.Example 4. Screening the efficacy of selected PNPLA3 siRNA molecules in a humanized mouse model.
Аденоассоциированный вирус (AAV; серотип AAV8 или AAV7; свободный от эндотоксинов, получаемый в лаборатории компании Amgen), разведенный в фосфатно-буферном солевом растворе (Thermo Fisher Scientific,14190-136) до уровня, не превышающего 4e11-1e12 вирусных частиц на животное, вводили внутривенно в хвостовую вену самцам мышей C57BL/6NCrl (Charles River Laboratories Inc.) для стимуляции экспрессии либо PNPLA3WT (PNPLA3-WT), PNPLA3rs738409 (PNPLA3-I148M) человека, либо PNPLA3rs738409-rs738408 (PNPLA3-I148M DM) в печени. Возраст мышей в среднем составлял 10-12 недель и в группу включали n=4-6 животных. Каждая стадия скрининга включала как минимум две контрольные группы, которым вводили среду-носитель: пустой вектор на основе AAV и AAV-PNPLA3WT или PNPLA3rs738409 и PNPLA3rs738409-rs738408, обработанный средой-носителем. Все siRNA проверяли на функциональность в отношении AAV-PNPLA3WT, PNPLA3rs738409 и/или PNPLA3rs738409-rs738408. Через две недели после инъекции AAV мышей обрабатывали путем введения однократной дозы siRNA D-2324 (0,5 мМ) посредством подкожной инъекции в дозе 0,5, 1,0, 3,0 или 5,0 мг на 1 кг животного, разведенной в фосфатно-буферном солевом растворе (Thermo Fisher Scientific, 14190-136). В дни 8, 15, 22, 28 или 42 после инъекции siRNA у животных отбирали ткани печени, быстро замораживали их в жидком азоте, обрабатывали для выделения очищенной РНК с использованием прибора QIACube HT (Qiagen, 9001793) и набора RNeasy 96 QIACube HT (Qiagen, 74171) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы анализировали с использованием системы QIAxpert (Qiagen, 9002340). РНК обрабатывали ДНКазой RQ1, свободной от РНКаз (Promega, M6101), и подготавливали для Real-Time qPCR (количественной ПЦР в режиме реального времени) с использованием набора RNA-to-CT™ 1-Step kit TaqMan™ (Applied Biosystems, 4392653). Real-Time qPCR проводили на приборе QuantStudio Real-Time PCR. Результаты вычисляли, исходя из экспрессии PNPLA3 человека, нормализованной к Gapdh мыши (наборы TaqMan™ от Invitrogen, hs00228747_m1 и 4352932E соответственно), и их представляли в виде относительного нокдауна экспрессии мРНК PNPLA3 человека по сравнению с контрольными животными, которым вводили среду-носитель. Для сравнения определяли эндогенную экспрессию гена Pnpla3 мыши (Invitrogen, Mm00504420_m1).Adeno-associated virus (AAV; serotype AAV8 or AAV7; endotoxin-free, Amgen) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) to levels not exceeding 4e11-1e12 viral particles per animal was injected intravenously into the tail vein of male C57BL/6NCrl mice (Charles River Laboratories Inc.) to stimulate expression of either human PNPLA3 WT (PNPLA3-WT), PNPLA3 rs738409 (PNPLA3-I148M), or PNPLA3 rs738409-rs738408 (PNPLA3-I148M DM) in the liver. Mice were on average 10-12 weeks old and n=4-6 animals per group. Each screening step included at least two control groups treated with vehicle: empty AAV vector and AAV-PNPLA3 WT or PNPLA3 rs738409 and PNPLA3 rs738409-rs738408 treated with vehicle. All siRNAs were tested for functionality against AAV-PNPLA3 WT , PNPLA3 rs738409 and/or PNPLA3 rs738409 -rs738408 . Two weeks after AAV injection, mice were treated with a single dose of D-2324 siRNA (0.5 mM) via subcutaneous injection at a dose of 0.5, 1.0, 3.0, or 5.0 mg/kg animal diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136). On days 8, 15, 22, 28, or 42 after siRNA injection, liver tissues were collected from animals, snap-frozen in liquid nitrogen, processed for purified RNA extraction using the QIACube HT instrument (Qiagen, 9001793) and the RNeasy 96 QIACube HT kit (Qiagen, 74171) according to the manufacturer's instructions. Samples were analyzed using the QIAxpert system (Qiagen, 9002340). RNA was treated with RNase-free RQ1 DNase (Promega, M6101) and prepared for Real-Time qPCR using the RNA-to-C T ™ 1-Step kit TaqMan™ (Applied Biosystems, 4392653). Real-Time qPCR was performed on a QuantStudio Real-Time PCR instrument. Results were calculated from human PNPLA3 expression normalized to mouse Gapdh (Invitrogen TaqMan™ kits, hs00228747_m1 and 4352932E, respectively) and are presented as relative knockdown of human PNPLA3 mRNA expression compared to vehicle-treated controls. For comparison, endogenous expression of the mouse Pnpla3 gene was determined (Invitrogen, Mm00504420_m1).
Для анализа содержания триглицеридов в печени гомогенизировали примерно 0,05-0,1 мг замороженной печени, отобранной у животного, в 1 мл изопропанола. После 1 ч инкубации на льду образцы центрифугировали при 10000 об/мин в микроцентрифуге и супернатанты переносили в чистый 96-луночный планшет с глубокими лунками. Содержание триглицеридов определяли с использованием колориметрического реагента Infinity Triglyceride Reagent (Thermo Fisher Scientific, TR22421) и Triglyceride Standard (Pointe Scientific, T7531-STD) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты представлены в виде миллиграммов триглицеридов на миллиграммы ткани.For liver triglyceride analysis, approximately 0.05–0.1 mg of frozen liver collected from an animal was homogenized in 1 mL of isopropanol. After 1 h of incubation on ice, samples were centrifuged at 10,000 rpm in a microcentrifuge and the supernatants were transferred to a clean 96-well deep-well plate. Triglyceride content was determined using Infinity Triglyceride Reagent (Thermo Fisher Scientific, TR22421) and Triglyceride Standard (Pointe Scientific, T7531-STD) according to the manufacturer's instructions. Results are presented as milligrams of triglyceride per milligram of tissue.
Фиг. 1A-1D. Пример пяти молекул siRNA, которые подвергали скринингу в отношении как дозозависимого нокдауна мРНК, так и функциональной стабильности in vivo. Мышей, экспрессирующих PNPLA3rs738409-rs738408 человека, обрабатывали siRNA через две недели после внутривенных инъекций AAV. N=6 мышей на группу; данные представлены в виде среднего значения и стандартной погрешности среднего. (A) siRNA вводили в дозе 0,5, 1,0, 3,0 или 5,0 мг на 1 кг веса тела подкожно в область живота мыши. Через четыре недели после обработки с помощью siRNA мышей умерщвляли, а ткани печени отбирали и подвергали обработке для анализа экспрессии генов. Данные представляют усредненный относительный нокдаун PNPLA3rs738409-rs738408 человека в каждой группе мышей по сравнению с контрольной группой, обработанной средой-носителем. (B) Ткани печени, отобранные из той же группы, получавшей лечение в течение четырех недель, также подвергали обработке для определения содержания триглицеридов с целью оценки функциональной эффективности средства. Данные представляют усредненное содержание триглицеридов, выраженное в миллиграммах на грамм ткани, подвергнутой обработке. (C) siRNA вводили в дозе 1,0 и 3,0 мг на 1 кг веса тела подкожно в области живота животным из параллельной когорты. У мышей отбирали ткани через шесть недель после введения siRNA для сравнения стабильности молекул siRNA in vivo. Печень собирали и подвергали обработке для анализа экспрессии генов. Данные представляют усредненный относительный нокдаун PNPLA3rs738409,-rs738408 человека в каждой группе мышей по сравнению с контрольной группой, обработанной средой-носителем. (D) Ткани печени, выделенные из той же группы, получавшей лечение в течение шести недель, также подвергали обработке для определения содержания триглицеридов с целью оценки функциональной эффективности средства с течением времени. Данные представляют усредненное содержание триглицеридов, выраженное в миллиграммах на грамм ткани, подвергнутой обработке.Fig. 1A-1D. Examples of five siRNA molecules that were screened for both dose-dependent mRNA knockdown and functional stability in vivo. Mice expressing human PNPLA3 rs738409-rs738408 were treated with siRNA two weeks after intravenous injections of AAV. N=6 mice per group; data are presented as mean and standard error of the mean. (A) siRNA was administered at 0.5, 1.0, 3.0, or 5.0 mg/kg body weight subcutaneously into the abdomen of the mouse. Four weeks after siRNA treatment, mice were sacrificed and liver tissues were collected and processed for gene expression analysis. Data represent the average relative knockdown of human PNPLA3 rs 7 38 4 09-rs 7 38 4 08 in each group of mice compared to the vehicle-treated control group. (B) Liver tissues collected from the same four-week treatment group were also processed for triglyceride content to assess the functional efficacy of the agent. Data represent the average triglyceride content expressed as milligrams per gram of treated tissue. (C) siRNA was administered at 1.0 and 3.0 mg/kg body weight subcutaneously in the abdomen of parallel cohort animals. Tissue was collected from mice six weeks after siRNA administration to compare the stability of the siRNA molecules in vivo. Livers were collected and processed for gene expression analysis. Data represent the average relative knockdown of human PNPLA3 rs 7 38 4 09,-rs 7 38 4 08 in each group of mice compared to vehicle-treated controls. (D) Liver tissues isolated from the same six-week-treated group were also processed for triglyceride content to assess functional efficacy over time. Data represent average triglyceride content expressed as milligrams per gram of treated tissue.
Данные для относительного нокдауна приведены в табл. 8-12 и показывают относительный нокдаун в дни 8, 15, 22, 28 и 42 соответственно и разные дозы. Нокдаун PNPLA3 выражен в процентной доле с отрицательными значениями, указывающими на снижение уровней PNPLA3.Relative knockdown data are shown in Tables 8–12 and show relative knockdown at days 8, 15, 22, 28, and 42, respectively, and across doses. PNPLA3 knockdown is expressed as a percentage with negative values indicating decreased PNPLA3 levels.
- 188 047656- 188 047656
День 8, анализ нокдауна PNPLA3Day 8, PNPLA3 knockdown assay
Таблица 8Table 8
- 189 047656- 189 047656
- 190 047656- 190 047656
Таблица 9Table 9
День 15, анализ нокдауна PNPLA3Day 15, PNPLA3 knockdown assay
- 191 047656- 191 047656
- 192 047656- 192 047656
- 193 047656- 193 047656
Таблица 10Table 10
День 22, анализ нокдауна PNPLA3Day 22, PNPLA3 knockdown assay
- 194 047656- 194 047656
День 28, анализ нокдауна PNPLA3Day 28, PNPLA3 knockdown assay
Таблица 11Table 11
- 195 047656- 195 047656
- 196 047656- 196 047656
Таблица 12Table 12
День 42, анализ нокдауна PNPLA3Day 42, PNPLA3 knockdown assay
Пример 5. Предотвращение возникновения и спасение от NAFLD путем применения молекул siRNA в гуманизированной модели мыши с PNPLA3rs738409-rs738408.Example 5. Prevention of occurrence and rescue of NAFLD by application of siRNA molecules in a humanized mouse model with PNPLA3 rs738409-rs738408 .
Модель NAFLD/NASH Американский синдром ожирения, вызванный образом жизни, или модель ALIOS была разработана путем скармливания мышам рациона с высоким содержанием транс-жиров (45% от общего количества жира) и сахара (Tetri 2008). Для этих исследований самцам мышей линии C57BL/6NCrl (Charles River Laboratories Inc.) возрастом от восьми до десяти недель вводили пустой вектор AAV или вектор AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, как описано ранее. Во время инъекции AAV мышей либо содержали на нормальном корме, либо им скармливали рацион ALIOS (Envigo, TD.06303) в сочетании с питьевой водой, дополненной смесью из 55% фруктозы и 45% глюкозы (Sigma, F0127 и G7021 соответственно), до отбора тканей. В предыдущих экспериментах было установлено, что сверхэкспрессия PNPLA3rs738409-rs738408 в данном контексте как ускоряет, так и ухудшает фенотипы NAFLD (данные не показаны).The NAFLD/NASH American Lifestyle-Induced Obesity Syndrome or ALIOS model was developed by feeding mice a diet high in trans fat (45% of total fat) and sugar (Tetri 2008). For these studies, eight- to ten-week-old male C57BL/6NCrl mice (Charles River Laboratories Inc.) were injected with either the empty AAV vector or the AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector as described previously. At the time of AAV injection, mice were either maintained on normal chow or were fed the ALIOS diet (Envigo, TD.06303) in combination with drinking water supplemented with a mixture of 55% fructose and 45% glucose (Sigma, F0127 and G7021, respectively) until tissue collection. Previous experiments have shown that overexpression of PNPLA3 rs738409-rs738408 in this context both accelerates and worsens NAFLD phenotypes (data not shown).
Через две недели после инъекции AAV и начала скармливания указанного рациона мышей обрабатывали путем подкожной инъекции однократной дозы siRNA D-2324 (0,5 мМ), разведенной в фосфатнобуферном солевом растворе (Thermo Fisher Scientific, 14190-136), в дозе 5,0 мг на 1 кг животного, либо среды-носителя в качестве контроля. Введение дозы повторяли каждые две недели до отбора тканей. КTwo weeks after AAV injection and initiation of the indicated diet, mice were treated with a single subcutaneous injection of siRNA D-2324 (0.5 mM) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) at 5.0 mg/kg animal or vehicle control. Dosing was repeated every two weeks until tissue collection.
- 197 047656 моменту отбора тканей регистрировали вес тела, затем собирали сыворотку крови путем пункции сердца под анестезией изофлураном, после чего регистрировали показатели веса печени. Срединную долю фиксировали с помощью 10% нейтрального забуференного формалина с последующей обработкой и заливкой парафином. Остаток печени быстро замораживали для анализа содержимого и экспрессии генов, как было описано ранее.- 197 047656 At the time of tissue collection, body weights were recorded, serum was collected by cardiac puncture under isoflurane anesthesia, and liver weights were recorded. The median lobe was fixed with 10% neutral buffered formalin, processed, and embedded in paraffin. The remainder of the liver was snap frozen for content and gene expression analysis as previously described.
Быстрозамороженную ткань печени обрабатывали для анализа экспрессии РНК и генов, как это было описано ранее. Результаты представлены как для необработанного значения Ct, так и для относительной экспрессии мРНК указанного гена, нормализованной по отношению к Gapdh мыши. (Анализы TaqMan™ от Invitrogen: PNPLA3 человека, hs00228747_m1; Pnpla3 мыши, Mm00504420_m1; Gapdh мыши, 4352932E).Snap-frozen liver tissue was processed for RNA and gene expression analysis as previously described. Results are shown for both raw Ct value and relative mRNA expression of the indicated gene normalized to mouse Gapdh. (Invitrogen TaqMan™ Assays: human PNPLA3, hs00228747_m1; mouse Pnpla3, Mm00504420_m1; mouse Gapdh, 4352932E).
Фиксированные в формалине ткани обрабатывали для окрашивания гематоксилином и эозином (Dako, CS70030-2, CS70130-2 соответственно) в соответствии с инструкциями производителя. Балльную оценку стеатоза и воспаления проводил сертифицированный патолог.Formalin-fixed tissues were processed for hematoxylin and eosin staining (Dako, CS70030-2, CS70130-2, respectively) according to the manufacturer's instructions. Scoring for steatosis and inflammation was performed by a board-certified pathologist.
Анализ сыворотки крови включал анализ содержания TIMP1, биомаркера, ассоциированного с NASH, и фиброза, связанного с NASH (Youssani 2011). ELISA TIMP1 (R&D Systems, M™100) проводили в соответствии с инструкциями производителя.Serum analysis included analysis of TIMP1, a biomarker associated with NASH, and NASH-associated fibrosis (Youssani 2011). TIMP1 ELISA (R&D Systems, M™100) was performed according to the manufacturer's instructions.
Фиг. 2A-2G. Для оценки способности молекулы siRNA D-2324, специфичной к PNPLA3rs738409' rs738408 предотвращать развитие фенотипов, ассоциированных с NAFLD и сверхэкспрессиейFig. 2A-2G. To assess the ability of the siRNA molecule D-2324, specific for PNPLA3 rs738409 ' rs738408, to prevent the development of phenotypes associated with NAFLD and overexpression
PNPLA3rs738409-rs738408, мышам вводили пустой вектор (EV) AAV8, или вектор AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408 или среду-носитель и их содержали на стандартном корме или переводили на рацион ALIOS. Через две недели после инъекций AAV мышей обрабатывали siRNA или средой-носителем раз в две недели в течение шести недель; в общей сложности проводили три цикла инъекций. У мышей отбирали ткани в мо мент времени восемь недель. Результаты представлены в виде усредненного значения по группе и стандартной погрешности, при N=8 на группу. Звездочки означают статистическую значимость для когорты AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, которую рассчитали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием критерия множественных сравнений Даннетта. (A) Соотношение веса печени (грамм) и веса тела (грамм) на момент отбора тканей. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среданоситель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, **=0,0018, AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (B) Подтверждение экспрессии и сайленсинга мРНК PNPLA3 человека в печени с помощью qPCR. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение групп, которым скармливали рацион ALIOS, а именно PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель и PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA. (C) Анализ экспрессии мРНК Pnpla3 мыши в печени с помощью qPCR указывает на то, что уровень экспрессии эндогенного Pnpla3 существенно не изменяется при сверхэкспрессии, опосредованной AAV, или при сайленсинге, индуцированном siRNA. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение группы со стандартным рационом без AAV с группами, которым скармливали рацион ALIOS, а именно PNPLA3rs738409-rs738408+среданоситель и PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA. (D) Содержание триглицеридов в печени представлено в миллиграммах триглицеридов на 1 г ткани печени. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среданоситель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, *=0,0393, AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **=0,0063. (E) Уровни TIMP1 в сыворотке крови представлены в пикограммах на миллилитр сыворотки крови. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среданоситель, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (F) Гистологический признак стеатоза по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAVPNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **=0,0012. (G) Гистологический признак воспаления по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-PNPLA3rs738409rs738408+siRNA, ****<0,0001.PNPLA3 rs738409-rs738408 , mice were injected with the AAV8 empty vector (EV) or the AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector or vehicle and maintained on standard chow or switched to the ALIOS diet. Two weeks after AAV injections, mice were treated with siRNA or vehicle every other week for six weeks for a total of three injection cycles. Tissue was collected from mice at the eight-week time point. Results are presented as group mean and standard error, with N=8 per group. Asterisks denote statistical significance for the AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 cohort, which was calculated by one-way analysis of variance with Dunnett’s multiple comparison test. (A) Ratio of liver weight (gram) to body weight (gram) at tissue collection. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, **=0.0018, AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (B) Confirmation of human PNPLA3 mRNA expression and silencing in liver by qPCR. (Left) Raw Ct value and (Right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh; comparison between ALIOS diet-fed groups, namely PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA. (C) qPCR analysis of mouse Pnpla3 mRNA expression in liver indicates that the expression level of endogenous Pnpla3 is not significantly altered by AAV-mediated overexpression or siRNA-induced silencing. (Left) Raw Ct value and (Right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh comparing the standard diet without AAV group with the ALIOS diet, namely PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA groups. (D) Liver triglyceride content is expressed as milligrams of triglyceride per gram of liver tissue. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, *=0.0393, AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **=0.0063. (E) Serum TIMP1 levels are expressed as picograms per milliliter of serum. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, ****<0.0001, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (F) Histologic evidence of steatosis by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAVPNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **=0.0012. (G) Histologic evidence of inflammation by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-PNPLA3 rs738409rs738408 +siRNA, ****<0.0001.
Фиг. 3A-3G. Для оценки способности молекулы siRNA, специфичной к PNPLA3rs738409-rs738408, предотвращать дальнейшее прогрессирование заболевания, опосредованного PNPLA3rs738409-rs738408, после начала заболевания мышам вводили пустой вектор (EV) AAV8, или вектор AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, или среду-носитель, и их содержали на стандартном корме или переводили на рацион ALIOS. Через восемь недель после инъекций AAV и изменений рациона мышей обрабатывали siRNA или средойносителем, раз в две недели в течение дополнительных восьми недель; в общей сложности проводили четыре цикла инъекций. У мышей отбирали ткани в момент времени шестнадцать недель. Хотя не наблюдали каких-либо изменений в стеатозе, если обработку с использованием siRNA начинали после индукции заболевания, некоторые другие конечные эффекты, ассоциированные с заболеванием, были значительно снижены. Результаты представлены в виде усредненных значений и стандартной по- 198 047656 грешности, при N=8 на группу. Звездочки означают статистическую значимость для когорты AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, которую рассчитали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием критерия множественных сравнений Даннетта. (A) Соотношение веса печени (грамм) и веса тела (грамм) на момент отбора тканей. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среданоситель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ***=0,0006. (B) Подтверждение экспрессии и сайленсинга мРНК PNPLA3 человека в печени с помощью qPCR. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение групп, которым скармливали рацион ALIOS, а именно PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель и PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA. (C) Анализ экспрессии мРНК Pnpla3 мыши в печени с помощью qPCR указывает на то, что уровень экспрессии эндогенного Pnpla3 существенно не изменяется при сверхэкспрессии, опосредованной AAV, или при сайленсинге, индуцированном siRNA. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение группы со стандартным рационом без AAV с группами, которым скармливали рацион ALIOS, а именно PNPLA3rs738409-rs738408+среданоситель и PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA. (D) Содержание триглицеридов в печени представлено в миллиграммах триглицеридов на грамм ткани печени. Скорректированные P-значения: AAV-EV+среданоситель, не значимо, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, *=0,0403. (E) Уровни TIMP1 в сыворотке крови представлены в пикограммах на миллилитр сыворотки крови. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, **=0,0027, AAV-PNPLA3rs738409rs738408+siRNA, **=0,002. (F) Гистологический признак стеатоза по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, не значимо. (G) Гистологический признак воспаления по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **=0,0068.Fig. 3A-3G. To assess the ability of the PNPLA3 rs738409-rs738408 -specific siRNA molecule to prevent further progression of PNPLA3 rs738409-rs738408 -mediated disease, mice were injected with an AAV8 empty vector (EV) or an AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector or vehicle after disease onset and maintained on a standard chow or switched to the ALIOS diet. Eight weeks after the AAV injections and diet changes, mice were treated with siRNA or vehicle biweekly for an additional eight weeks for a total of four injection cycles. Mice were harvested for tissue at the sixteen-week time point. Although no changes in steatosis were observed when siRNA treatment was initiated after disease induction, several other disease-associated endpoints were significantly reduced. Results are presented as means and standard errors, with N=8 per group. Asterisks indicate statistical significance for the AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 cohort, which was calculated by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test. (A) Ratio of liver weight (grams) to body weight (grams) at tissue collection. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ***=0.0006. (B) Confirmation of human PNPLA3 mRNA expression and silencing in liver by qPCR. (Left) Raw Ct value and (right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh; comparison between ALIOS diet-fed groups, namely PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA. (C) qPCR analysis of mouse Pnpla3 mRNA expression in liver indicates that the expression level of endogenous Pnpla3 is not significantly altered by AAV-mediated overexpression or siRNA-induced silencing. (Left) Raw Ct value and (Right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh comparing the standard diet without AAV group with the ALIOS diet, namely PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA groups. (D) Liver triglyceride content is presented as milligrams of triglyceride per gram of liver tissue. Adjusted P-values: AAV-EV+vehicle, not significant, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, *=0.0403. (E) Serum TIMP1 levels are expressed as picograms per milliliter of serum. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, **=0.0027, AAV-PNPLA3 rs738409rs73840 8+siRNA, **=0.002. (F) Histologic evidence of steatosis by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, not significant. (G) Histological evidence of inflammation by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **=0.0068.
Фиг. 4A-4D. Для оценки способности молекулы siRNA, специфичной к PNPLA3rs738409-rs738408, спасать ассоциированные с заболеванием фенотипы, обусловленные сверхэкспрессией PNPLA3rs738409-rs738408, проводили сравнение печени и сыворотки крови, полученные от мышей, которым скармливали рацион ALIOS, которых в течение восьми недель обрабатывали AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408 со средойносителем, с образцами печени и сыворотки крови мышей с AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408, которым скармливали рацион ALIOS, которым в течение шестнадцати недель вводили siRNA. Хотя к данному моменту времени обработки с использованием siRNA не наблюдали каких-либо изменений в стеатозе, уровни триглицеридов в печени, TIMP1 в сыворотке крови и воспаление были статистически ниже на момент времени шестнадцать недель по сравнению с контрольными группами на момент времени восемь недель, которым вводили среду-носитель. Результаты представлены в виде усредненных значений и стандартной погрешности, при N=8 на группу. Звездочки означают статистическую значимость для когорты, которой в течение восьми недель вводили AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408 со средой-носителем, которую рассчитали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием критерия множественных сравнений Даннетта. (А) Содержание триглицеридов в печени представлено в миллиграммах триглицеридов на грамм ткани печени. Скорректированные P-значения: 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+среданоситель, не значимо; 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **=0,0011. (В) Уровни Timp1 в сыворотке крови представлены в пикограммах на миллилитр сыворотки крови. Скорректированные P-значения: 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель, не значимо; 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, *=0,0134. (С) Гистологический признак стеатоза по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель, не достоверно; 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, не значимо. (D) Гистологический признак воспаления по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, выражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: 16 недель AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+среданоситель, не значимо; 16 недель AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, *=0,0112.Fig. 4A-4D. To assess the ability of the PNPLA3 rs738409-rs738408 -specific siRNA molecule to rescue disease-associated phenotypes caused by PNPLA3 rs738409-rs738408 overexpression, livers and serum from ALIOS diet-fed mice treated with AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 plus vehicle for eight weeks were compared with livers and serum from AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 -fed ALIOS diet-fed mice treated with siRNA for sixteen weeks. Although no changes in steatosis were observed at this time point with siRNA treatment, liver triglyceride levels, serum TIMP1, and inflammation were statistically lower at the sixteen-week time point compared to the eight-week vehicle-treated control groups. Results are presented as mean values and standard errors, with N=8 per group. Asterisks denote statistical significance for the eight-week AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 with vehicle cohort, which was calculated by one-way ANOVA with Dunnett’s multiple comparisons test. (A) Liver triglyceride content is presented as milligrams of triglyceride per gram of liver tissue. Adjusted P-values: 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 + vehicle, not significant; 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **= 0.0011. (B) Serum Timp1 levels are expressed as picograms per milliliter of serum. Adjusted P-values: 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle, not significant; 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, *= 0.0134. (C) Histologic evidence of steatosis by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle, not significant; 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, not significant. (D) Histologic evidence of inflammation by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: 16 weeks AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle, not significant; 16 weeks AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, *=0.0112.
Пример 6. Предотвращение возникновения фиброза печени путем применения молекул siRNA в гуманизированной модели мыши с PNPLA3rs738409-rs738408.Example 6. Prevention of liver fibrosis by using siRNA molecules in a humanized mouse model with PNPLA3 rs738409-rs738408 .
Рацион AMLN, разработанный Amylin Pharmaceuticals (Clapper 2013), представляет собой модифицированный вариант рациона ALIOS. Такая пища предусматривает уровень холестерина, повышенный в десять раз (2%), и дополнительную сахарозу. У мышей, находящихся на рационе AMLN, через 20-30 недель развивался фиброз со степенью от легкой или умеренной (публикации Clapper, Mells and Kristiansen). Для этих исследований самцам мышей линии C57BL/6NCrl (Charles River Laboratories Inc.) возрастом от восьми до десяти недель вводили пустой вектор AAV или вектор AAV-PNPLA3rs738409-rs738408, как было описано ранее, для ускорения начала заболевания. Во время инъек- 199 047656 ции AAV мышей продолжали содержать на стандартном корме или им скармливали рацион EnvigoThe AMLN diet, developed by Amylin Pharmaceuticals (Clapper 2013), is a modified version of the ALIOS diet. The diet contains ten-fold increased cholesterol (2%) and additional sucrose. Mice fed the AMLN diet developed mild to moderate fibrosis after 20 to 30 weeks (Clapper, Mells and Kristiansen). For these studies, eight- to ten-week-old male C57BL/6NCrl mice (Charles River Laboratories Inc.) were injected with either an empty AAV vector or an AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector, as described previously, to accelerate disease onset. During AAV injection, mice were maintained on standard chow or were fed the Envigo diet
TD.170748 в сочетании с питьевой водой, дополненной смесью из 55% фруктозы и 45% глюкозы (Sigma,TD.170748 in combination with drinking water supplemented with a mixture of 55% fructose and 45% glucose (Sigma,
F0127 и G7021 соответственно), до умерщвления.F0127 and G7021, respectively), until killed.
Через две недели после инъекции AAV и начала скармливания указанного рациона мышей обрабатывали путем подкожной инъекции однократной дозы siRNA D-2324 (0,5 мМ), разведенной в фосфатнобуферном солевом растворе (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) в дозе 5,0 мг на 1 кг животного, либо среды-носителя в качестве контроля. Введение дозы повторяли каждые две недели до отбора тканей. К моменту отбора тканей регистрировали вес тела, затем собирали сыворотку крови путем пункции сердца под анестезией изофлураном, после чего регистрировали показатели веса печени. Срединную долю фиксировали с помощью 10% нейтрального забуференного формалина с последующей обработкой и заливкой парафином. Остаток печени быстро замораживали для анализа экспрессии генов.Two weeks after AAV injection and initiation of the indicated diet, mice were treated with a single subcutaneous injection of siRNA D-2324 (0.5 mM) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136) at 5.0 mg/kg or vehicle control. Dosing was repeated every two weeks until tissue collection. Body weights were recorded at tissue collection, serum was collected by cardiac puncture under isoflurane anesthesia, and liver weights were recorded. The median lobe was fixed with 10% neutral buffered formalin, processed, and embedded in paraffin. The remainder of the liver was snap frozen for gene expression analysis.
Быстрозамороженную ткань печени обрабатывали для анализа экспрессии РНК и генов, как это было описано ранее. Результаты представлены как для необработанного значения Ct, так и для относительной экспрессии мРНК указанного гена, нормализованной по отношению к Gapdh мыши. (Анализы TaqMan™ от Invitrogen: PNPLA3 человека, hs00228747_m1; Pnpla3 мыши, Mm00504420_m1; Col1a1 мыши, Mm00801666_g1; Col3a1 мыши, Mm01254471_g1; Col4a1, Mm01210125_m1; Gapdh мыши, 4352932E). Col1a1, Col3a1 и Col4a1 представляют собой маркеры внеклеточного матрикса, связанные с активацией звездчатых клеток печени и фиброзом печени (Baiocchini 2016).Snap-frozen liver tissue was processed for RNA and gene expression analysis as described previously. Results are shown as both raw Ct value and relative mRNA expression of the indicated gene normalized to mouse Gapdh. (Invitrogen TaqMan™ Assays: human PNPLA3, hs00228747_m1; mouse Pnpla3, Mm00504420_m1; mouse Col1a1, Mm00801666_g1; mouse Col3a1, Mm01254471_g1; Col4a1, Mm01210125_m1; mouse Gapdh, 4352932E). Col1a1, Col3a1 and Col4a1 are extracellular matrix markers associated with hepatic stellate cell activation and liver fibrosis (Baiocchini 2016).
Фиксированные в формалине ткани обрабатывали для окрашивания гематоксилином, эозином и трихромом Массона (Dako, CS70030-2, CS70130-2, AR17311-2 соответственно) в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание актина гладких мышц выполняли без демаскировки антигена и с использованием устройства для автоматического окрашивания DAKO. Срезы обрабатывали с использованием пероксидазы-1 и Sniper (Biocare, PX968 и BS966 соответственно) и окрашивали моноклональными антителами к альфа-актину гладких мышц (Sigma, F3777), затем кроличьим антителом к FITC (Invitrogen, 711900), полимером Envision-Rabbit HRP (Dako, K4003), DAB+ (Dako, K3468) и гематоксилином. Оценку степени стеатоза, воспаления, гиперплазии овальных клеток/желчных протоков и количества aSMA-положительных клеток проводил сертифицированный патолог.Formalin-fixed tissues were processed for hematoxylin and eosin and Masson's trichrome staining (Dako, CS70030-2, CS70130-2, AR17311-2, respectively) according to the manufacturer's instructions. Smooth muscle actin staining was performed without antigen retrieval and using a DAKO automated stainer. Sections were processed with peroxidase-1 and Sniper (Biocare, PX968 and BS966, respectively) and stained with monoclonal alpha-smooth muscle actin antibodies (Sigma, F3777), followed by rabbit anti-FITC antibody (Invitrogen, 711900), Envision-Rabbit HRP polymer (Dako, K4003), DAB+ (Dako, K3468) and hematoxylin. The degree of steatosis, inflammation, oval cell/bile duct hyperplasia, and aSMA-positive cell count were assessed by a board-certified pathologist.
Проводили анализ сыворотки крови на содержание TIMP1 мыши (R&D Systems, M™100) и мышиного цитокератина 18-M30 (Cusabio, CSB-E14265m) в соответствии с инструкциями производителя. В дополнение к TIMP1 цитокератин 18-M30 был идентифицирован как потенциальный биомаркер NAFLD/NASH, в том числе раннего фиброза (Neuman 2014 и Yang 2015).Serum levels of mouse TIMP1 (R&D Systems, M™100) and mouse cytokeratin 18-M30 (Cusabio, CSB-E14265m) were assayed according to the manufacturer's instructions. In addition to TIMP1, cytokeratin 18-M30 has been identified as a potential biomarker for NAFLD/NASH, including early fibrosis (Neuman 2014 and Yang 2015).
Фиг. 5A-5L. Для оценки способности молекулы siRNA, специфичной к PNPLA3rs738409-rs738408, предотвращать развитие раннего фиброза, мышам вводили пустой вектор (EV) AAV8, или вектор AAV8PNPLA3rs738409-rs738408, или среду-носитель, и их содержали на стандартном корме или переводили на рацион AMLN. Через две недели после инъекций AAV мышей обрабатывали siRNA D-2324 или средойносителем раз в две недели в течение шести недель; в общей сложности проводили шесть циклов инъекций. У мышей отбирали ткани в момент времени десять недель. Результаты представлены в виде усредненных значений и стандартной погрешности, стандартный корм без AAV+среда-носитель и корм AMLN с вектором AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель, N=8 на группу; рацион AMLN с вектором AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель и с вектором AAV8-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, N=12 на группу. Звездочки означают статистическую значимость для когорты, которую обрабатывали AAV8PNPLA3rs738409-rs738408 со средой-носителем, которую рассчитали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с использованием критерия множественных сравнений Даннетта. (A) Соотношение веса печени (грамм) и веса тела (грамм) на момент отбора тканей. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV- PNPLA3rs738409rs738408+siRNA, ****<0,0001.Fig. 5A-5L. To evaluate the ability of the PNPLA3 rs738409-rs738408 -specific siRNA molecule to prevent the development of early fibrosis, mice were injected with the AAV8 empty vector (EV), AAV8PNPLA3 rs738409-rs738408 vector, or vehicle and maintained on standard chow or AMLN diet. Two weeks after AAV injections, mice were treated with D-2324 siRNA or vehicle every other week for six weeks, for a total of six injection cycles. Tissue was collected from mice at the ten-week time point. Results are presented as mean values and standard error, standard chow without AAV + vehicle and AMLN chow with AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector + vehicle, N=8 per group; AMLN diet with AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector +vehicle and with AAV8-PNPLA3 rs738409-rs738408 vector +siRNA, N=12 per group. Asterisks indicate statistical significance for the AAV8PNPLA3 rs738409-rs738408 plus vehicle treated cohort, which was calculated by one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparisons test. (A) Ratio of liver weight (grams) to body weight (grams) at the time of tissue collection. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV- PNPLA3 rs738409rs738408 +siRNA, ****<0.0001.
(B) Подтверждение экспрессии и сайленсинга мРНК PNPLA3 человека в печени с помощью qPCR. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение групп PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель и PNPLA3rs738409rs738408+siRNA. (C) Анализ экспрессии мРНК Pnpla3 мыши в печени с помощью qPCR указывает на то, что уровень экспрессии эндогенного Pnpla3 существенно не изменяется при сверхэкспрессии, опосредованной AAV, или при сайленсинге, индуцированном siRNA. (слева) Необработанное значение Ct и (справа) относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши; сравнение группы со стандартным рационом без AAV с группами, которым скармливали рацион AMLN, а именно PNPLA3rs738409-rs738408+среда-носитель и PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA. (D) Уровни Timp1 в сыворотке крови представлены в пикограммах на миллилитр сыворотки крови. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409rs738408+siRNA, ****<0,0001. (E) Уровни CK18m30 в сыворотке крови представлены в пикограммах на миллилитр сыворотки крови. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (F) Гистологический признак воспаления по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, вы- 200 047656 ражаемый в баллах как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, *=0,0108, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (G) Гистологический признак гиперплазии овальных клеток/желчных протоков по результатам окрашивания гематоксилином и эозином, оцениваемый как: в пределах нормы (0), минимальный (1), легкий (2), умеренный (3) и сильно выраженный (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **=0,0081. (H) Иммуногистохимическое окрашивание антителом к актину гладких мышц, оцениваемое как: в пределах нормы (0), минимальное (1), легкое (2), умеренное (3) и сильно выраженное (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, *=0,0101, AAV- PNPLA3rs738409rs738408+siRNA, ***=0,0002. (I) Окрашивание трихромом Массона на фиброз, оцениваемое как: в пределах нормы (0), минимальное (1), легкое (2), умеренное (3) и сильно выраженное (4). Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, не значимо, AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, не значимо. (J) Экспрессия мРНК Col1a1 мыши в печени, оцениваемая с помощью qPCR. Относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среданоситель, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (K) Экспрессия мРНК Col3a1 мыши в печени, оцениваемая с помощью qPCR. Относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV- PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, ****<0,0001. (L) Экспрессия мРНК Col4a1 мыши в печени, оцениваемая с помощью qPCR. Относительная кратность экспрессии мРНК, нормализованная по отношению к Gapdh мыши. Скорректированные P-значения: группа без AAV+среда-носитель, ****<0,0001, AAV-EV+среда-носитель, ***<0,0005, AAV-PNPLA3rs738409-rs738408+siRNA, **<0,0041.(B) Confirmation of human PNPLA3 mRNA expression and silencing in liver by qPCR. (Left) Raw Ct value and (Right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh; comparison between PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409rs73840 8 +siRNA groups. (C) qPCR analysis of mouse Pnpla3 mRNA expression in liver indicates that the expression level of endogenous Pnpla3 is not significantly altered by AAV-mediated overexpression or siRNA-induced silencing. (Left) Raw Ct value and (Right) relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh; Comparison of the standard diet group without AAV with the groups fed the AMLN diet, namely PNPLA3 rs738409-rs738408 +vehicle and PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA. (D) Serum Timp1 levels are presented as picograms per milliliter of serum. Adjusted P-values: no AAV +vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV +vehicle, ****<0.0001, AAV- PNPLA3 rs738409rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (E) Serum CK18m30 levels are presented as picograms per milliliter of serum. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, ****<0.0001, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (F) Histological evidence of inflammation by hematoxylin and eosin staining, scored as: within normal range (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, *=0.0108, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (G) Histologic evidence of oval cell/bile duct hyperplasia by hematoxylin and eosin staining graded as: within normal (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **=0.0081. (H) Immunohistochemistry staining with anti-smooth muscle actin antibody graded as: within normal (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, *=0.0101, AAV- PNPLA3 rs738409rs738408 +siRNA, ***=0.0002. (I) Masson's trichrome staining for fibrosis scored as: within normal limits (0), minimal (1), mild (2), moderate (3), and severe (4). Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, not significant, AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, not significant. (J) Mouse Col1a1 mRNA expression in liver assessed by qPCR. Relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, ****<0.0001, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (K) Mouse Col3a1 mRNA expression in liver assessed by qPCR. Relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, ****<0.0001, AAV- PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, ****<0.0001. (L) Mouse Col4a1 mRNA expression in liver assessed by qPCR. Relative fold expression of mRNA normalized to mouse Gapdh. Adjusted P-values: No AAV+vehicle group, ****<0.0001, AAV-EV+vehicle, ***<0.0005, AAV-PNPLA3 rs738409-rs738408 +siRNA, **<0.0041.
Пример 7. Скрининг молекул siRNA PNPLA3 с применением мышиной модели визуализации биолюминисценции.Example 7. Screening of PNPLA3 siRNA molecules using a mouse bioluminescence imaging model.
Самцам мышей BALB/c (Charles River Laboratories Inc.) в целом возрастом 10-12 недель вводили аденоассоциированный вирус (AAV; серотип AAVDJ8; без эндотоксина, получен внутри компании Amgen), разбавленный фосфатно-солевым буферным раствором (Thermo Fisher Scientific,14190-136). AAV вводили в количестве от 5e11 до 7,5e11 вирусных частиц на животное и вводили внутривенно путем инъекции в хвостовую вену. Конструкции на основе AAV конструировали с промотором CMV мышиного цитомегаловируса и репортерным геном люциферазы светляка, в котором на 3'-конце присутствует ряд нуклеотидов, содержащий участки либо PNPLA3WT человека (эталонный аллель), либо целевые последовательности PNPLA3rs738409-rs738408 человека (минорный аллель), и другие представляющие интерес целевые последовательности PNPLA3 человека, не охватывающие SNP, как подробно показано на фиг. 6 и 7.Male BALB/c mice (Charles River Laboratories Inc.), generally 10–12 weeks old, were challenged with adeno-associated virus (AAV; serotype AAVDJ8; endotoxin-free, Amgen in-house) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136). AAV was administered at 5e11 to 7.5e11 viral particles per animal and was administered intravenously by tail vein injection. AAV-based constructs were constructed with the murine cytomegalovirus CMV promoter and a firefly luciferase reporter gene containing at the 3' end a series of nucleotides containing regions of either the human PNPLA3 WT (reference allele) or the human PNPLA3 rs738409-rs738408 (minor allele) target sequences and other human PNPLA3 target sequences of interest not spanning the SNPs, as detailed in Figs. 6 and 7.
Через две недели после инъекции AAV мышам путем инъекции вводили D-люциферин RediJect (PerkinElmer, 770504) в соответствии с инструкциями производителя. Биолюминесцентный сигнал у мышей определяли с применением системы визуализации спектра in vivo IVIS (PerkinElmer) и анализировали с применением программного обеспечения Living Image (PerkinElmer). Мышей затем рандомизировали на группы с n=5 на основании общего сигнала потока [фотоны/секунда] в области печени. После рандомизации на группы, подвергающиеся лечению, мышам вводили одну дозу siRNA (0,5 мМ), разбавленной фосфатно-солевым буферным раствором (Thermo Fisher Scientific,14190-136). siRNA вводили путем подкожной инъекции при указанных миллиграммах на килограмм веса животного. Для каждого цикла скрининга и каждого типа AAV включали контрольную группу, обработанную средой-носителем.Two weeks after AAV injection, mice were injected with RediJect D-luciferin (PerkinElmer, 770504) according to the manufacturer's instructions. The bioluminescent signal in mice was determined using the IVIS In Vivo Spectral Imaging System (PerkinElmer) and analyzed using Living Image software (PerkinElmer). Mice were then randomized into groups with n=5 based on total flux signal [photons/second] in the liver region. Following randomization to treatment groups, mice were injected with a single dose of siRNA (0.5 mM) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190-136). siRNA was injected subcutaneously at the indicated milligrams per kilogram of animal weight. A vehicle-treated control group was included for each screening cycle and each AAV type.
Через 1, 2, 3 и 4 недели после инъекции siRNA мышей повторно визуализировали и собирали результаты измерений общей интенсивности потока [ф/с] с применением того же определенного участка, представляющего интерес, установленного для исходных данных. Для каждого животного относительный процент нокдауна определяли посредством расчета изменения интенсивности общего потока в процентах через 1, 2, 3 или 4 недели относительно общей интенсивности потока для этого животного на исходном уровне, нормализованного относительно среднего изменения общей интенсивности потока относительно исходного уровня в контрольной группе, обработанной средой-носителем, для одного и того же момента времени. Например, животное, обработанное с помощью siRNA, характеризуется относительным нокдауном, рассчитанным следующим образом: (общая интенсивность потока для животного на 2 неделе)/(общая интенсивность потока для животного на исходном уровне) с нормализацией относительно среднего значения (общая интенсивность потока для животных, обработанных средой-носителем на 2 неделе/общая интенсивность потока для животных, обработанных средой-носителем на исходном уровне). На фиг. 8 показаны иллюстративные изображения животных, которым путем инъекции вводили AAV, экспрессирующий либо целевые последовательности минорного аллеля PNPLA3 человека, либо целевые последовательности эталонного аллеля, и изменение общей интенсивности потока с течением времени как до, так и после обработки с помощью siRNA.At 1, 2, 3, and 4 weeks after siRNA injection, mice were re-imaged and total flux intensity [f/s] measurements were collected using the same defined region of interest established for baseline. For each animal, the relative percent knockdown was determined by calculating the percent change in total flux intensity at 1, 2, 3, or 4 weeks relative to the total flux intensity for that animal at baseline, normalized to the mean change in total flux intensity relative to baseline in the vehicle-treated control group for the same time point. For example, an animal treated with siRNA has a relative knockdown calculated as follows: (total flux intensity for the animal at week 2)/(total flux intensity for the animal at baseline), normalized to the mean of (total flux intensity for vehicle-treated animals at week 2/total flux intensity for vehicle-treated animals at baseline). 8 shows illustrative images of animals injected with AAV expressing either target sequences of the human PNPLA3 minor allele or target sequences of the reference allele, and the change in overall flux intensity over time both before and after siRNA treatment.
- 201 047656- 201 047656
Анализ нокдауна PNPLA3PNPLA3 knockdown assay
Таблица 13Table 13
- 202 047656- 202 047656
- 203 047656- 203 047656
- 204 047656- 204 047656
- 205 047656- 205 047656
- 206 047656- 206 047656
Пример 8. Подтверждение эффективности PNPLA3rs738409-rs738408-селективной молекулы siRNA на модели печени химерной гуманизированной мыши.Example 8. Confirmation of the efficacy of PNPLA3 rs738409-rs738408 -selective siRNA molecule in a chimeric humanized mouse liver model.
Для оценки эффективности siRNA, селективной в отношении минорного аллеля PNPLA3 человека, в гепатоцитах in vivo применяли печень химерных гуманизированных мышей PXB от PhoenixBio Co., Ltd (Japan) (Miyamoto et al. (2017), Xenobiotica, 47(12):1052-1063; Tateno et al. (2015), PLoS One, 10(11):e0142145. doi: 10.1371/journal.pone.0142145). На момент начала исследования возраст самцов мышей составлял примерно четыре месяца; по меньшей мере три месяца после трансплантации. Посредством PhoenixBio определяли, что мыши характеризуются показателем замещения гепатоцитами человека, составляющим 90-95% и, на основе предыдущего генотипирования, что мыши были гетерозиготными по PNPLA3rs738409 (партия BD195). По прибытии мышей кормили стандартным кормом ProLab RMH 3000, как рекомендовано компанией PhoenixBio. После периода акклиматизации, составляющего одну неделю, рацион заменяли на NASH-индуцирующий рацион с высоким содержанием жиров и богатый фруктозой (Research Diets, D19021301). Через неделю на NASH-индуцирующем рационе мышей рандомизировали на основании измерений веса тела. Мышей обрабатывали путем подкожной инъекции однократной дозы siRNA (0,5 мМ), разбавленной фосфатно-солевым буферным раствором (Thermo Fisher Scientific, 14190136), в дозе 3,0 или 10,0 мг на 1 кг веса животного, либо мыши получали только среду-носитель. Через две или четыре недели после инъекции siRNA у животных собирали ткани печени, быстро замораживали в жидком азоте, обрабатывали для выделения очищенной РНК с применением автоматизированной системы выделения и очистки ДНК/РНК QIAcube (Qiagen) и набора RNeasy Mini QIAcube (Qiagen, 74116) в соответствии инструкциями производителя. Образцы анализировали с применением спектрофотометра NanoDrop™ 8000 (Thermo Scientific, ND-8000-GL). РНК обрабатывалиTo evaluate the efficacy of siRNA targeting the human PNPLA3 minor allele in hepatocytes in vivo, livers from chimeric humanized PXB mice from PhoenixBio Co., Ltd (Japan) were used (Miyamoto et al. (2017), Xenobiotica, 47(12):1052–1063; Tateno et al. (2015), PLoS One, 10(11):e0142145. doi: 10.1371/journal.pone.0142145). The male mice were approximately four months old at the start of the study; at least three months after transplantation. Mice were determined to have a human hepatocyte replacement rate of 90-95% by PhoenixBio and, based on previous genotyping, were heterozygous for PNPLA3 rs738409 (lot BD195). Upon arrival, mice were fed standard ProLab RMH 3000 chow as recommended by PhoenixBio. After a one-week acclimation period, the diet was changed to a high-fat, high-fructose NASH-inducing diet (Research Diets, D19021301). After one week on the NASH-inducing diet, mice were randomized based on body weight measurements. Mice were treated with a single subcutaneous injection of siRNA (0.5 mM) diluted in phosphate-buffered saline (Thermo Fisher Scientific, 14190136) at a dose of 3.0 or 10.0 mg/kg body weight, or mice received vehicle only. Two or four weeks after siRNA injection, liver tissues were collected from animals, snap-frozen in liquid nitrogen, processed for purified RNA extraction using the QIAcube Automated DNA/RNA Isolation and Purification System (Qiagen) and the RNeasy Mini QIAcube Kit (Qiagen, 74116) according to the manufacturer's instructions. Samples were analyzed using a NanoDrop™ 8000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, ND-8000-GL). RNA was processed
ДНКазой без РНКаз RQ1 (Promega, M6101) и подготавливали для цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в соответствии с инструкциями изготовителя. Набор для синтеза 1-ой нити cDNA AccuScript High Fidelity (Thermo Fisher, 200820) применяли для осуществления реакции обратной транскрипции и ПЦР-реакции проводили с применением ddPCR Supermix for Probes (BioRad, 1863010). ddPCR проводили с применением системы для капельной цифровой ПЦР AutoDG (BioRad, QX200). Следующие анализы TaqMan™ приобретали у Invitrogen: PNPLA3 человека (Hs00228747_m1), ASGR1 человека (Hs1005019 m1), Asgr1 мыши (Mm01245581 m1) и анализ для различения минорного/эталонного аллеля PNPLA3 rs738409 человека (C 7241 10). Следующие анализы приобретали у Integrated DNA Technologies Inc.: TBP человека (Hs. PT 53a.20105486; соотношение праймеров к зондам составляет 3.6:1), HPRT1 человека (Hs.PT.39a.22214821; соотношение праймеров к зондам составляет 3.6:1) и Hprt мыши (Mm.PT.39a.22214828; соотношение праймеров к зондам составляет 3.6:1). Результаты для PNPLA3, HPRT и ASGR1 человека и Hprt и Asgr1 мыши представлены в виде копий на реакцию в объеме 20 микролитров, нормализованных относительно TBP человека. Данные для PNPLA3 человека, HPRT человека и Hprt мыши также представлены в виде относительного процента нокдауна экспрессии мРНК по сравнению с таковым у контрольных животных, обработанных средой-носителем.DNA was purified with RNase-free RQ1 DNase (Promega, M6101) and prepared for droplet digital PCR (ddPCR) according to the manufacturer's instructions. AccuScript High Fidelity Single Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, 200820) was used to perform the reverse transcription reaction and PCR reactions were performed using ddPCR Supermix for Probes (BioRad, 1863010). ddPCR was performed using the AutoDG Droplet Digital PCR System (BioRad, QX200). The following TaqMan™ assays were purchased from Invitrogen: human PNPLA3 (Hs00228747_m1), human ASGR1 (Hs1005019 m1), mouse Asgr1 (Mm01245581 m1), and human PNPLA3 rs738409 minor/reference allele discrimination assay (C 7241 10). The following assays were purchased from Integrated DNA Technologies Inc.: human TBP (Hs. PT 53a.20105486; primer to probe ratio is 3.6:1), human HPRT1 (Hs.PT.39a.22214821; primer to probe ratio is 3.6:1), and mouse Hprt (Mm.PT.39a.22214828; primer to probe ratio is 3.6:1). Results for human PNPLA3, HPRT, and ASGR1 and mouse Hprt and Asgr1 are presented as copies per 20 microliter reaction, normalized to human TBP. Data for human PNPLA3, human HPRT, and mouse Hprt are also presented as the relative percentage of mRNA expression knockdown compared to vehicle-treated controls.
Для анализа содержания триглицеридов в печени гомогенизировали примерно 0,05-0,1 мг замороженной печени, отобранной у мышей, в 1 мл изопропанола. После одного часа инкубации на льду образцы центрифугировали при 10000 об/мин в микроцентрифуге и супернатанты переносили в чистыйFor liver triglyceride analysis, approximately 0.05-0.1 mg of frozen liver collected from mice was homogenized in 1 ml of isopropanol. After one hour of incubation on ice, the samples were centrifuged at 10,000 rpm in a microcentrifuge and the supernatants were transferred to clean
- 207 047656- 207 047656
96-луночный планшет с глубокими лунками. Содержание триглицеридов определяли с применением colorimetric Infinity Triglyceride Reagent (Thermo Fisher Scientific, TR22421) и Triglyceride Standard (Pointe96-well deep well plate. Triglyceride content was determined using colorimetric Infinity Triglyceride Reagent (Thermo Fisher Scientific, TR22421) and Triglyceride Standard (Pointe
Scientific, T7531-STD) в соответствии с инструкциями производителя, и микропланшет-ридераScientific, T7531-STD) in accordance with the manufacturer's instructions, and a microplate reader
SpectraMax Plus с программным обеспечением SoftMax Pro6 (Molecular Devices). Результаты представлены в виде миллиграммов триглицеридов на грамм ткани печени.SpectraMax Plus with SoftMax Pro6 software (Molecular Devices). Results are presented as milligrams of triglycerides per gram of liver tissue.
На фиг. 9 показан пример молекулы siRNA, D-2419, демонстрирующий как дозозависимый, так и аллель-селективный нокдаун мРНК и функциональной эффективности in vivo. После одной недели на NASH-индуцирующем рационе мышей, гетерозиготных по PNPLA3rs738409-rs738408 человека, обрабатывали с помощью siRNA или носителя. (A) Молекулу siRNA, D-2419, вводили при 3,0 и 10,0 мг на 1 кг веса тела подкожно в область живота мыши. Через две и четыре недели после обработки с помощью siRNA мышей умерщвляли, а ткани печени отбирали и подвергали обработке для анализа. С применением ddPCR и аллель-специфического реагента TaqMan® с двумя красителями для различения минорных и эталонных аллелей PNPLA3 данные демонстрируют как дозозависимый, так и аллель-селективный нокдаун PNPLA3rs738409-rs738408 и неизмеримое изменение для PNPLA3WT. N=5 мышей на группу; данные представлены в виде среднего значения и стандартной погрешности среднего. Двухфакторный ANOVA, ** 0,001, *** < 0,001, **** < 0,0001, NS=re значимо. (B) Данные представляют собой средний относительный процент нокдауна мРНК и стандартную ошибку среднего для аллеля PNPLA3rs738409-rs738408 человека по сравнению с PNPLA3WT, установленным в контрольной группе, обработанной средой-носителем. Значения представлены относительно среднего значения для контроля, обработанного средой-носителем за две недели до анализа, при этом все значения нормализованы относительно TBP человека. (C) Ткани печени, выделенные из группы, получавшей лечение в течение двух недель, подвергали обработке для определения содержания триглицеридов с целью оценки функциональной эффективности. Данные представляют собой миллиграммы триглицеридов на 1 г печени. N=5 мышей на группу; данные представлены в виде среднего значения и стандартной погрешности среднего. Однофакторный ANOVA, **=0,01, NS=re значимо. (D) Для контроля эффективной GalNAc-опосредованной доставки siRNA D-2787, siRNA, перекрестно реагирующую с HPRT и Hprt человека и мыши соответственно, доставляли при 10 мг на 1 кг и ткани печени собирали через две недели. Данные представляют собой копии мРНК HPRT и мРНК Hprt у мышей, обработанных с помощью D-2787 (N=4), по сравнению с мышами, обработанными средойносителем (N=5). Данные представлены в виде среднего значения и стандартной погрешности среднего. Однофакторный ANOVA, *=0,01. (E) Данные представляют собой средний относительный процент нокдауна мРНК и стандартную ошибку среднего для мРНК HPRT человека и Hprt мыши соответственно, установленные для контрольной группы, обработанной средой-носителем; все данные нормализованы относительно TBP человека. (F) Для подтверждения экспрессии рецептора GalNAc на гепатоцитах мышей PXB® уровни мРНК Asgr1 мыши и мРНК ASGR1 человека оценивали в отсутствие и в присутствии D-2419 как через две недели, так и через четыре недели после инъекции siRNA. N=5 мышей на группу; данные представлены в виде среднего значения и стандартной погрешности среднего.Figure 9 shows an example of an siRNA molecule, D-2419, demonstrating both dose-dependent and allele-selective knockdown of mRNA and functional efficacy in vivo. After one week on a NASH-inducing diet, mice heterozygous for human PNPLA3 rs738409-rs738408 were treated with siRNA or vehicle. (A) The siRNA molecule, D-2419, was administered at 3.0 and 10.0 mg/kg body weight subcutaneously into the abdomen of the mouse. Two and four weeks after siRNA treatment, mice were sacrificed and liver tissues were collected and processed for analysis. Using ddPCR and the TaqMan® two-dye allele-specific reagent to distinguish between minor and reference alleles of PNPLA3, data demonstrate both dose-dependent and allele-selective knockdown of PNPLA3 rs738409-rs738408 and no measurable change for PNPLA3 WT . N=5 mice per group; data are presented as mean and standard error of the mean. Two-way ANOVA, ** 0.001, *** < 0.001, **** < 0.0001, NS=re significant. (B) Data represent mean relative percentage mRNA knockdown and standard error of the mean for the human PNPLA3 rs738409-rs738408 allele compared to PNPLA3 WT determined in the vehicle-treated control group. Values are expressed relative to the mean of vehicle-treated control two weeks prior to assay, with all values normalized to human TBP. (C) Liver tissues isolated from the two-week treatment group were processed for triglyceride content to assess functional efficacy. Data represent milligrams of triglyceride/g liver. N=5 mice per group; data are presented as mean and standard error of the mean. One-way ANOVA, **=0.01, NS=re significant. (D) To control for efficient GalNAc-mediated siRNA delivery, D-2787, siRNA cross-reacting with human and mouse HPRT and Hprt, respectively, was delivered at 10 mg/kg and liver tissues were harvested after two weeks. Data represent HPRT mRNA and Hprt mRNA copies in D-2787-treated mice (N=4) compared to vehicle-treated mice (N=5). Data are presented as mean and SEM. One-way ANOVA, *=0.01. (E) Data represent mean relative percentage mRNA knockdown and SEM for human HPRT and mouse Hprt mRNA, respectively, adjusted for vehicle-treated controls; all data are normalized to human TBP. (F) To confirm GalNAc receptor expression on hepatocytes in PXB® mice, mouse Asgr1 mRNA and human ASGR1 mRNA levels were assessed in the absence and presence of D-2419 at both two weeks and four weeks after siRNA injection. N=5 mice per group; data are presented as mean and SEM.
Claims (43)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/777,714 | 2018-12-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA047656B1 true EA047656B1 (en) | 2024-08-21 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210139912A1 (en) | Rnai constructs for inhibiting pnpla3 expression and methods of use thereof | |
US20220017906A1 (en) | Rnai constructs for inhibiting pnpla3 expression and methods of use thereof | |
US20220307022A1 (en) | Rnai constructs for inhibiting scap expression and methods of use thereof | |
US20230279399A1 (en) | Rnai constructs for inhibiting hsd17b13 expression and methods of use thereof | |
EA047656B1 (en) | RNAi CONSTRUCTS DESIGNED TO SUPPRESS PNPLA3 EXPRESSION | |
TW202345869A (en) | Rnai constructs for inhibiting pnpla3 expression and methods of use thereof | |
TW202413642A (en) | Rnai constructs for inhibiting scap expression and methods of use thereof | |
KR20240090496A (en) | RNAI constructs for suppressing GPAM expression and methods of using the same | |
AU2020329286A1 (en) | RNAi constructs for inhibiting SLC30A8 expression and methods of use thereof |