EA047139B1

EA047139B1 - Составы

Info

Publication number: EA047139B1
Application number: EA202090868
Authority: EA
Inventors: Кристи М. ВУД; Ной Пол Гарднер; Ручи Рудрапрасад Шах; Стивен С. Скалли; Рэмзи Маджзоб
Original assignee: Интеллиа Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2024-06-06

Description

Изобретение испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/566240, поданной 29 сентября 2017 г., содержание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.

В данном документе предложены композиции липидных наночастиц (LNP) с улучшенными свойствами для доставки биологически активных агентов, в частности РНК, мРНК и гидовых РНК. Композиции LNP облегчают доставку агентов РНК через клеточные мембраны, и в конкретных вариантах осуществления они вводят компоненты и композиции для редактирования генов в живые клетки.

Биологически активные агенты, которые особенно трудно доставить в клетки, включают белки, лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот и их производные. Особый интерес представляют композиции для доставки в клетки перспективных технологий редактирования генов, например, для доставки компонентов системы CRISPR/Cas9.

В настоящее время существует целый ряд компонентов и систем для редактирования генов в клетках in vivo, обеспечивающих огромный потенциал для лечения заболеваний. Системы редактирования генов CRISPR/Cas активны в клетке в виде рибонуклеопротеиновых комплексов. В клетке РНКнаправленная нуклеаза связывается с последовательностью ДНК и направляет ее расщепление. Эта сайтспецифическая активность нуклеазы облегчает редактирование генов посредством собственных естественных процессов клетки. Например, клетка реагирует на двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) подверженным ошибкам процессом репарации, известным как негомологичное соединение концов (NHEJ). Во время NHEJ нуклеотиды могут быть добавлены или удалены клеткой с концов ДНК, что приводит к изменению последовательности из расщепленной последовательности. В других случаях клетки восстанавливают DSB с помощью механизмов направляемой гомологией репарации (HDR) или гомологичной рекомбинации (HR), в которых эндогенная или экзогенная матрица может быть использована для прямой репарации разрыва. Некоторые из этих технологий редактирования используют клеточные механизмы для репарации одноцепочечных разрывов (SSB) или DSB.

Существует необходимость в композициях для доставки белковых компонентов и компонентов нуклеиновых кислот CRISPR/Cas в клетку, например в клетку пациента. В частности, особый интерес представляют композиции для доставки мРНК, кодирующей белковый компонент CRISPR, и для доставки гидовых РНК CRISPR. Композиции с полезными свойствами для доставки in vitro и in vivo, которые могут стабилизировать и доставлять РНК-компоненты, также представляют особый интерес.

В данном документе авторы предоставляют композиции на основе липидных наночастиц с полезными свойствами, в частности, для доставки компонентов для редактирования генов CRISPR/Cas.

В определенных вариантах осуществления композиции LNP содержат: РНК-компонент и липидный компонент, причем липидный компонент содержит: (1) около 50-60 мол.% аминолипида; (2) около 8-10 мол.% нейтрального липида; и (3) около 2,5-4 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 6. В дополнительных вариантах осуществления композиции LNP содержат (1) РНК-компонент; (2) около 50-60 мол.% аминолипида; (3) около 27-39,5 мол.% вспомогательного липида; (4) около 8-10 мол.% нейтрального липида; и (5) около 2,5-4 мол.% ПЭГ-липида, где соотношение N/P композиции LNP составляет около 5-7.

В других вариантах осуществления композиции LNP содержат РНК-компонент и липидный компонент, причем липидный компонент содержит: (1) около 50-60 мол.% аминолипида; (2) около 5-15 мол.% нейтрального липида; и (3) около 2,5-4 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 3-10. В дополнительных вариантах осуществления композиции LNP содержат липидный компонент, который содержит (1) около 40-60 мол.% аминолипида; (2) около 5-15 мол.% нейтрального липида; и (3) около 2,5-4 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 6. В другом варианте осуществления композиции LNP содержат липидный компонент, который содержит (1) около 50-60 мол.% аминолипида; (2) около 5-15 мол.% нейтрального липида; и (3) около 1,5-10 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 6.

В некоторых вариантах осуществления композиции LNP содержат РНК-компонент и липидный компонент, причем липидный компонент содержит: (1) около 40-60 мол.% аминолипида; (2) около 0-5 мол.% нейтрального липида, например, фосфолипида; и (3) около 1,5-10 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 3 -10. В некоторых вариантах осуществления композиции LNP содержат РНКкомпонент и липидный компонент, причем липидный компонент содержит: (1) около 40-60 мол.% аминолипида; (2) менее чем около 1 мол.% нейтрального липида, например, фосфолипида; и (3) около 1,5-10 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, и где соотношение N/P композиции LNP составляет около 3-10. В определенных вариантах осуществления композиция LNP по существу не содержит нейтрального липида. В некоторых вариантах осуществления композиции LNP содержат РНК-компонент и липидный компонент, причем липидный компонент со

- 1 047139 держит: (1) около 40-60 мол.% аминолипида; и (2) около 1,5-10 мол.% ПЭГ-липида, где остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, где соотношение N/P композиции LNP составляет около 3-10, и где композиция LNP не содержит нейтрального липида, например, фосфолипида. В определенных вариантах осуществления композиция LNP по существу не содержит или не содержит нейтральный фосфолипид. В определенных вариантах осуществления композиция LNP по существу не содержит или не содержит нейтральный липид, например, фосфолипид.

В определенных вариантах осуществления РНК-компонент содержит мРНК, такую как РНКнаправляемый ДНК-связывающий агент (например, Cas-нуклеазу или Cas-нуклеазу класса 2). В определенных вариантах осуществления РНК-компонент содержит гРНК.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показан процент редактирования гена TTR, достигнутого в печени мыши после доставки компонентов, мРНК Cas9 и гРНК, для редактирования генов CRISPR/Cas в композициях LNP, как указано при однократном введении 1 мг/кг массы тела (фиг. 1 А) или 0,5 мг/кг массы тела (фиг. 1В).

На фиг. 2 показаны данные о распределении частиц для композиций LNP, содержащих мРНК Cas9 и гРНК.

На фиг. 3 показаны физико-химические свойства композиций LNP путем сравнения log производных молярных масс (фиг. 3А) и значений средних молекулярных масс (фиг. 3В) для этих композиций.

На фиг. 4 показаны расчеты полидисперсности (фиг. 4А) и анализ Бурхарда-Штокмайера (фиг. 4В), в котором анализируются композиции LNP из фиг. 3.

На фиг. 5 представлены результаты эксперимента по оценке влияния композиций LNP с повышенными концентрациями ПЭГ-липидов на нокдаун TTR в сыворотке, редактирование генов в печени и уровни цитокинов МСР-1 после введения однократной дозы у крыс. На фиг. 5А показана диаграмма уровней TTR в сыворотке; на фиг. 5В показана диаграмма процента редактирования в образцах печени; и на фиг. 5С представлены уровни МСР-1 в пг/мл.

На фиг. 6 показано, что композиции LNP сохраняют способность к редактированию генов с различными ПЭГ-липидами (как измерено по уровням TTR в сыворотке (фиг. 6А и 6В) и проценту редактирования (фиг. 6С).

На фиг. 7 показано, что аналоги Липида А эффективно доставляют карго для редактирования генов в композициях LNP, как измерено по % редактирования в печени после введения однократной дозы у мыши.

На фиг. 8 показана кривая зависимости ответа от дозы в процентах редактирования для различных композиций LNP в первичных гепатоцитах яванского макака.

На фиг. 9А и 9В показаны результаты анализа TTR в сыворотке и процент редактирования, когда изменяется соотношение гРНК к мРНК, и на фиг. 9С и фиг. 9D показаны результаты анализа TTR в сыворотке и процент редактирования в печени, когда количество мРНК Cas9 поддерживается постоянным, а гРНК варьируется после однократного введения у мыши.

На фиг. 10А и 10В показаны результаты анализа TTR в сыворотке и редактирования в печени после введения композиций LNP с нейтральным липидом и без него.

Подробное описание сущности изобретения

Данное описание обеспечивает варианты осуществления композиций РНК на основе липидных наночастиц (LNP), включающих РНК-компоненты CRISPR/Cas (карго), для доставки в клетку, и способы их применения. Композиции LNP могут проявлять улучшенные свойства по сравнению с предшествующими технологиями доставки. Композиция LNP может содержать РНК-компонент и липидный компонент, как определено в данном документе. В определенных вариантах осуществления РНК-компонент включает в себя Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2. В определенных вариантах осуществления компонент карго или РНК-компонент включает в себя мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу класса 2, и гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовые РНК. Также предложены способы редактирования генов и способы создания сконструированных клеток.

Карго CRISPR/Cas.

Карго CRISPR/Cas, доставляемый с помощью состава LNP, может содержать молекулу мРНК, кодирующую представляющий интерес белок. Например, в карго включена мРНК для экспрессии белка, например зеленого флуоресцентного белка (GFP), и РНК-направляемого ДНК-связывающего агента или Cas-нуклеазы. Предложены композиции LNP, которые содержат мРНК Cas-нуклеазы, например мРНК Cas-нуклеазы класса 2, которая обеспечивает экспрессию белка Cas9 в клетке. Кроме того, карго может содержать одну или более гидовых РНК или нуклеиновых кислот, кодирующих гидовые РНК. Матричная нуклеиновая кислота, например, для репарации или рекомбинации, также может быть включена в композицию, или матричная нуклеиновая кислота может быть использована в описанных в данном документе способах.

Термин мРНК относится к полинуклеотиду, который содержит открытую рамку считывания, которая может транслироваться в полипептид (то есть может служить субстратом для трансляции с помощью рибосомы и аминоацилированной тРНК). мРНК может содержать сахарофосфатный остов, включающий остатки рибозы или их аналоги, например остатки 2'-метоксирибозы. В некоторых вариантах

- 2 047139 осуществления сахара сахарофосфатного остова мРНК состоят по существу из остатков рибозы, остатков 2'-метоксирибозы или их комбинации. Как правило, мРНК не содержат существенного количества остатков тимидина (например, 0 остатков или менее 30, 20, 10, 5, 4, 3 или 2 остатков тимидина; или содержание тимидина менее 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 или 0,1%). мРНК может содержать модифицированные уридины в некоторых или во всех своих положениях уридина.

Нуклеазная система CRISPR/Cas.

Один компонент из раскрытых составов представляет собой мРНК, кодирующую РНКнаправляемый ДНК-связывающий агент, такой как Cas-нуклеаза.

Используемый в данный документ термин РНК-направляемый ДНК-связывающий агент означает полипептид или комплекс полипептидов, обладающих активностью связывания РНК и ДНК, или ДНКсвязывающую субъединицу такого комплекса, причем ДНК-связывающая активность специфична для последовательности и зависит от последовательности РНК. Иллюстративные РНК-направляемые ДНКсвязывающие агенты включают Cas-клевазы/никазы и их инактивированные формы (ДНК-связывающие агенты dCas). Термин Cas-нуклеаза , используемая в данном документе, охватывает Cas-клевазы, Casниказы и ДНК-связывающие агенты dCas. Cas-клевазы/никазы и ДНК-связывающие агенты dCas включают в себя комплекс Csm или Cmr системы CRISPR типа III, ее субъединицу Cas10, Csm1 или Cmr2, комплекс Cascade системы CRISPR типа I, ее субъединицу Cas3 и Cas-нуклеазы класса 2. Используемый в данном документе термин Cas-нуклеаза класса 2 представляет собой одноцепочечный полипептид с РНК-направляемой ДНК-связывающей активностью. Cas-нуклеазы класса 2 включают Casклевазы/никазы класса 2 (например, варианты Н840А, D10A или N863A), которые дополнительно обладают РНК-направляемой клевазной или никазной активностью в отношении ДНК, и ДНК-связывающие агенты dCas 2 класса, в которых активность клевазы/никазы инактивируется. Cas-нуклеазы класса 2 включают, например, Cas9, Cpf1, C2c1, С2с2, С2с3, HF Cas9 (например, варианты N497A, R661A, Q695A, Q926A), HypaCas9 (например, варианты N692A, М694А, Q695A, Н698А), eSPCas9(1.0) (например, варианты К81ОА, К1ООЗА, R1060A) и eSPCas9(1.1) (например, варианты К848А, К1ООЗА, R1060A) и их модификации. Белок Cpf1, Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015), гомологичен Cas9 и содержит RuvCподобный нуклеазный домен. Последовательности Cpf1 из Zetsche включены посредством ссылки во всей их полноте. См., например, Zetsche, таблицы S1 и S3. См., например, Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).

В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент представляет собой нуклеазу класса 2. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент обладает клевазной активностью, которая также может упоминаться как двухцепочечная эндонуклеазная активность. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент содержит Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза 2 класса (которая может быть, например, Cas-нуклеазой типа II, V или VI). Cas-нуклеазы класса 2 включают в себя, например, белки Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 и С2с3, и их модификации. Примеры нуклеаз Cas9 включают в себя системы CRISPR типа II S. pyogenes, S. aureus и других прокариот (см., например, перечень в следующем параграфе) и их модифицированные (например, сконструированные или мутантные) варианты. См., например, U.S. 2016/0312198 A1; U.S. 2016/0312199 A1. Другие примеры Cas-нуклеаз включают комплекс Csm или Cmr системы CRISPR типа III или ее субъединицу Cas10, Csm1 или Cmr2; и комплекс Cascade системы CRISPR типа I или ее субъединицу Cas3. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может происходить из системы типа IIA, типа IIB или типа IIC. Для обсуждения различных систем CRISPR и нуклеаз Cas, см., например, Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).

Неограничивающие иллюстративные виды, из которых может быть получена Cas-нуклеаза, включают Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Lactobacillus gasseri, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Sutterella wadsworthensis, Gammaproteobacterium, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Fibrobacter succinogene, Rhodospirillum rubrum, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buchneri, Treponema denticola, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Streptococcus pasteurianus, Neisseria cinerea, Campylobacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corynebacterium diphtheria, Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae sp. ND2006, и Acaryochloris marina.

- 3 047139

В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9 из Streptococcus pyogenes. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9 из Streptococcus thermophilus. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9 из Neisseria meningitidis. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cas9 из Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1 из Francisella novicida. В некоторых вариантах осуществления Casнуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1 из Acidaminococcus sp. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1 из Lachnospiraceae sp ND2006. В других вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1 из Francisella tularensis, Lachnospiraceae sp., Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium, Parcubacteria bacterium, Smithella, Acidaminococcus, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi, Leptospira inadai, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens или Porphyromonas macacae. В определенных вариантах осуществления Cas-нуклеаза представляет собой нуклеазу Cpf1 из Acidaminococcus или Lachnospiraceae.

Cas9 дикого типа имеет два нуклеазных домена RuvC и HNH. Домен RuvC расщепляет нецелевую цепь ДНК, а домен HNH расщепляет целевую цепь ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas9 содержит более одного домена RuvC и/или более одного домена HNH. В некоторых вариантах нуклеаза Cas9 представляет собой Cas9 дикого типа. В некоторых вариантах осуществления Cas9 способна индуцировать разрыв двухцепочечной цепи в целевой ДНК. В определенных вариантах осуществления Cas-нуклеаза может расщеплять дцДНК, она может расщеплять одну цепь дцДНК или может не обладать клевазной или никазной активностью в отношении ДНК. Иллюстративная аминокислотная последовательность Cas9 представлена в виде SEQ ID NO: 3. Иллюстративная последовательность ОРС мРНК Cas9, которая содержит старт- и стоп-кодоны, представлена в виде SEQ ID NO: 4. Иллюстративная кодирующая последовательность мРНК Cas9, подходящая для включения в слитый белок, представлена в виде SEQ ID NO: 10.

В некоторых вариантах осуществления применяются химерные Cas-нуклеазы, где один домен или область белка заменены частью другого белка. В некоторых вариантах осуществления домен Casнуклеазы может быть заменен доменом из другой нуклеазы, такой как Fok1. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может представлять собой модифицированную нуклеазу.

В других вариантах осуществления Cas-нуклеаза может происходить из системы CRISPR/Cas типа I. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может представлять собой компонент комплекса Cascade системы CRISPR/Cas типа I. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может представлять собой белок Cas3. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может происходить из системы CRISPR/Cas типа III. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может иметь активность расщепления РНК.

В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент обладает одноцепочечной никазной активностью, то есть может разрезать одну цепь ДНК с образованием разрыва одной цепи, также известного как одноцепочечный разрыв. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент содержит Cas-никазу. Никаза представляет собой фермент, который создает одноцепочечный разрыв в дцДНК, то есть разрезает одну цепь, но не другую цепь двойной спирали ДНК. В некоторых вариантах осуществления Cas-никаза представляет собой вариант Casнуклеазы (например, Cas-нуклеазы, описанной выше), в котором эндонуклеолитический активный центр инактивирован, например, одним или более изменениями (например, точечными мутациями) в каталитическом домене. См., например, патент США № 8889356 по обсуждению Cas-никаз и иллюстративных изменений каталитического домена. В некоторых вариантах осуществления Cas-никаза, такая как никаза Cas9, имеет инактивированный домен RuvC или HNH. Иллюстративная аминокислотная последовательность никазы Cas9 представлена в виде SEQ ID NO: 6.

Иллюстративная последовательность ОРС мРНК никазы Cas9, которая содержит старт- и стопкодоны, представлена в виде SEQ ID NO: 7. Иллюстративная кодирующая последовательность мРНК никазы Cas9, подходящая для включения в слитый белок, представлена в виде SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент модифицируют так, что он содержит только один функциональный домен нуклеазы. Например, белок-агент может быть модифицирован таким образом, что один из доменов нуклеазы мутирует или полностью, или частично удаляется, чтобы снизить его активность по расщеплению нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления используют никазу, имеющую домен RuvC с пониженной активностью. В некоторых вариантах осуществления используют никазу, имеющую неактивный домен RuvC. В некоторых вариантах осуществления используют никазу, имеющую домен HNH с пониженной активностью. В некоторых вариантах осуществления используют никазу, имеющую неактивный домен HNH.

В некоторых вариантах осуществления консервативную аминокислоту в домене белка-нуклеазы Cas замещают для снижения или изменения нуклеазной активности. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может содержать аминокислотную замену в RuvC или RuvC-подобном нуклеазном домене. Иллюстративные аминокислотные замены в RuvC или RuvC-подобном нуклеазном домене включают D10A (на основе белка Cas9 S. pyogenes). См., например, Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3):

- 4 047139

759-771. В некоторых вариантах осуществления Cas-нуклеаза может содержать аминокислотную замену в HNH или HNH-подобном нуклеазном домене. Иллюстративные аминокислотные замены в HNH или HNH-подобном нуклеазном домене включают Е762А, Н840А, N863 А, Н983 А и D986A (на основе белка Cas9 S. pyogenes). См., например, Zetsche et al. (2015). Другие иллюстративные аминокислотные замены включают D917A, Е1006А и D1255A (на основе последовательности Cpf1 Francisella novicida U112 (FnCpf1) (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)).

В некоторых вариантах осуществления мРНК, кодирующая никазу, предложена в комбинации с парой гидовых РНК, которые комплементарны смысловой и антисмысловой цепям целевой последовательности, соответственно. В данном варианте осуществления гидовые РНК направляют никазу на целевую последовательность и вводят DSB путем образования одноцепочечных разрывов на противоположных цепях целевой последовательности (то есть, двойной одноцепочечный разрыв). В некоторых вариантах осуществления использование двойного одноцепочечного разрыва может улучшать специфичность и уменьшать побочные эффекты. В некоторых вариантах осуществления никаза используется вместе с двумя отдельными гидовыми РНК, нацеленными на противоположные цепи ДНК, для создания двойного одноцепочечного разрыва в целевой ДНК. В некоторых вариантах осуществления никаза используется вместе с двумя отдельными гидовыми РНК, которые выбраны так, чтобы они находились в непосредственной близости, для создания двойного одноцепочечного разрыва в целевой ДНК.

В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент не обладает клевазной и никазной активностью. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент содержит ДНК-связывающий полипептид dCas. Полипептид dCas обладает ДНКсвязывающей активностью, при этом по существу не обладает каталитической (клевазной/никазной) активностью. В некоторых вариантах осуществления полипептид dCas представляет собой полипептид dCas9. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, не обладающий клевазной или никазной активностью, или ДНК-связывающий полипептид dCas представляет собой вариант Cas-нуклеазы (например, описанной выше Cas-нуклеазы), в котором ее эндонуклеолитические активные центры инактивированы, например путем одного или более изменений (например, точечных мутаций) в ее каталитических доменах. См., например, U.S. 2014/0186958 A1; U.S. 2015/0166980 A1. Иллюстративная аминокислотная последовательность dCas9 представлена в виде SEQ ID NO: 8. Иллюстративная последовательность ОРС мРНК Cas9, которая содержит старт- и стоп-кодоны, представлена в виде SEQ ID NO: 9. Иллюстративная кодирующая последовательность мРНК Cas9, подходящая для включения в слитый белок, представлена в виде SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент содержит один или более гетерологичных функциональных доменов (например, представляет собой или содержит слитый полипептид).

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может облегчать транспорт РНК-направляемого ДНК-связывающего агента в ядро клетки. Например, гетерологичный функциональный домен может представлять собой сигнал ядерной локализации (NLS). В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с 1-10 NLS. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с 15 NLS. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с одним NLS. Если используется один NLS, то NLS может быть связан на N-конце или С-конце последовательности РНК-направляемого ДНК-связывающего агента. Он также может быть вставлен в последовательность РНК-направляемого ДНК-связывающего агента. В других вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с более чем одним NLS. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с 2, 3, 4 или 5 NLS. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с двумя NLS. В определенных обстоятельствах два NLS могут быть одинаковыми (например, два NLS SV40) или разными. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент сливают с двумя последовательностями NLS SV40, связанными на С-конце. В некоторых вариантах осуществления РНК-направляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с двумя NLS, один из которых связан на N-конце, а другой - на С-конце. В некоторых вариантах осуществления РНКнаправляемый ДНК-связывающий агент может быть слит с 3 NLS. В некоторых вариантах осуществления РНК-направленный ДНК-связывающий агент может быть слит без NLS. В некоторых вариантах осуществления NLS может представлять собой одинарную последовательность, такую как, например, SV40 NLS, PKKKRKV или PKKKRRV. В некоторых вариантах NLS может представлять собой двойную последовательность, такую как NLS нуклеоплазмина, KRPAATKKAGQAKKKK. В конкретном варианте осуществления один NLS PKKKRKV может быть связан на С-конце РНК-направляемого ДНКсвязывающего агента. В сайт слияния необязательно включены один или более линкеров.

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может быть способен модифицировать внутриклеточное время полужизни РНК-направляемого ДНК-связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления период полужизни РНК-направляемого ДНК-связывающего агента может быть увеличен. В некоторых вариантах осуществления период полужизни РНК-направляемого

- 5 047139

ДНК-связывающего агента может быть уменьшен. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может быть способен повышать стабильность РНК-направляемого ДНКсвязывающего агента. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может быть способен снижать стабильность РНК-направляемого ДНК-связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может действовать как сигнальный пептид для деградации белка. В некоторых вариантах осуществления разложение белка может быть опосредовано протеолитическими ферментами, такими как, например, протеасомы, лизосомальные протеазы или кальпаин-протеазы. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может содержать PEST-последовательность. В некоторых вариантах осуществления РНКнаправляемый ДНК-связывающий агент может быть модифицирован путем добавления убиквитина или полиубиквитиновой цепи. В некоторых вариантах осуществления убиквитин может представлять собой убиквитин-подобный белок (UBL). Неограничивающие примеры убиквитин-подобных белков включают малый убиквитин-подобный модификатор (SUMO), убиквитиновый перекрестно-реактивный белок (UCRP, также известный как стимулируемый интерфероном ген-15 (ISG15)), связанный с убиквитином модификатор-1 (URM1), белок 8, подавляющий экспрессию набора генов в предшественниках нервных клеток в процессе развития (NEDD8, также называемый Rub1 в S. cerevisiae), белок, ассоциированный с антигеном F лейкоцитов человека (FAT10), белок аутофагии-8 (ATG8) и -12 (ATG12), убиквитинподобный белок Fau (FUB1), закрепленный на мембране UBL (MUB), убиквитин-свернутый модификатор-1 (UFM1) и убиквитин-подобный белок-5 (UBL5).

В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может представлять собой маркерный домен. Неограничивающие примеры маркерных доменов включают в себя флуоресцентные белки, метки для очистки, эпитопные метки и последовательности репортерных генов. В некоторых вариантах осуществления маркерный домен может представлять собой флуоресцентный белок. Неограничивающие примеры подходящих флуоресцентных белков включают зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), синие флуоресцентные белки (например, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mStrawberry, Jred) и оранжевые флуоресцентные белки (mOrange, mKO, KusabiraOrange, мономерный Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) или любой другой подходящий флуоресцентный белок. В других вариантах осуществления маркерный домен может представлять собой метку для очистки и/или эпитопную метку. Неограничивающие иллюстративные метки включают глутатион-Sтрансферазу (GST), хитин-связывающий белок (СВР), мальтозосвязывающий белок (МВР), тиоредоксин (TRX), no.in(NANP). метку для тандемной аффинной очистки (ТАР), myc, AcV5, AU1, AU5, Е, ECS, E2, FLAG, НА, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, белок-носитель биотин-карбоксила (ВССР), поли-His и кальмодулин. Неограничивающие иллюстративные репортерные гены включают глутатион^-трансферазу (GST), пероксидазу хрена (HRP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, люциферазу или флуоресцентные белки.

В дополнительных вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может нацеливать РНК-направляемый ДНК-связывающий агент на конкретную органеллу, тип клетки, ткань или орган. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может нацеливать РНК-направляемый ДНК-связывающий агент на митохондрии.

В дополнительных вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен может представлять собой эффекторный домен. Если РНК-направляемый ДНК-связывающий агент направлен на его целевую последовательность, например, если Cas-нуклеаза направлена на целевую последовательность с помощью гРНК, эффекторный домен может модифицировать или влиять на целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен может быть выбран из связывающего нуклеиновые кислоты домена, домена нуклеазы (например, домена отличной от Cas нуклеазы), домена эпигенетической модификации, активирующего транскрипцию домена или домена транскрипционного репрессора. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен представляет собой нуклеазу, такую как нуклеаза FokI. См., например, патент США №. 9023649. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный функциональный домен представляет собой транскрипционный активатор или репрессор. См., например, Qi et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression, Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors, Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering, Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes, Cell 154:442-51 (2013). Как таковой, РНК-направляемый ДНК-связывающий агент по существу становится фактором транскрипции, который может быть направлен на связывание

- 6 047139 желаемой целевой последовательности с использованием гидовой РНК. В определенных вариантах осуществления домен модификации ДНК представляет собой домен метилирования, такой как домен деметилирования или метилтрансферазы. В определенных вариантах осуществления эффекторный домен представляет собой домен модификации ДНК, такой как домен, редактирующий основания. В конкретных вариантах осуществления домен модификации ДНК представляет собой домен, редактирующий нуклеиновые кислоты, который вводит специфическую модификацию в ДНК, такой как дезаминазный домен. См., например, WO 2015/089406; US. 2016/0304846. Домены, редактирующие нуклеиновую кислоту, дезаминазные домены и варианты Cas9, описанные в WO 2015/089406 и US 2016/0304846, включены в данный документ посредством ссылки.

Нуклеаза может содержать по меньшей мере один домен, который взаимодействует с гидовой РНК (гРНК). Кроме того, нуклеаза может быть направлена на целевую последовательность с помощью гРНК. В системах Cas-нуклеаз класса 2 гРНК взаимодействует с нуклеазой, а также с целевой последовательностью, так что она направляет связывание с целевой последовательностью. В некоторых вариантах осуществления гРНК обеспечивает специфичность для целевого расщепления, и нуклеаза может быть универсальной и в паре с разными гРНК расщеплять разные целевые последовательности. Cas-нуклеаза класса 2 может соединяться с каркасной структурой гРНК типов, ортологов и иллюстративных видов, перечисленных выше.

Гидовая РНК (гРНК).

В некоторых вариантах осуществления данного описания карго для состава LNP содержит по меньшей мере одну гРНК. гРНК может направлять Cas-нуклеазу или Cas-нуклеазу класса 2 к целевой последовательности на молекуле целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления гРНК связывается и обеспечивает специфичность расщепления с помощью Cas-нуклеазы класса 2. В некоторых вариантах осуществления гРНК и Cas-нуклеаза могут образовывать рибонуклеопротеид (РНП), например, комплекс CRISPR/Cas, такой как комплекс CRISPR/Cas9, который может быть доставлен композицией LNP. В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR/Cas может представлять собой комплекс CRISPR/Cas9 типа II. В некоторых вариантах осуществления комплекс CRISPR/Cas может представлять собой комплекс CRISPR/Cas типа V, такой как комплекс Cpf1/ гидовая РНК. Cas-нуклеазы и родственные гРНК могут быть спарены. Каркасные структуры гРНК, которые связываются с каждой Cas-нуклеазой класса 2, варьируются в зависимости от конкретной системы CRISPR/Cas.

Термины гидовая РНК, гРНК и просто гид используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения или сгРНК (также известной как CRISPR РНК), или комбинации сгРНК и trPHK (также известной как tracrPHK). сгРНК и trPHK могут быть связаны в виде одиночной молекулы РНК (одиночная гидовая РНК, огРНК) или в виде двух отдельных молекул РНК (двойная гидовая РНК, дгРНК). Термин гидовая РНК или гРНК относится к каждому типу. trPHK может быть встречающейся в природе последовательностью или последовательностью trPHK с модификациями или вариациями по сравнению со встречающимися в природе последовательностями.

Используемый в данном документе термин гидовая последовательность относится к последовательности в гидовой РНК, которая является комплементарной целевой последовательности и функционирует для направления гидовой РНК к целевой последовательности для связывания или модификации (например, расщепления) РНК-направляемым ДНК-связывающим агентом. Гидовая последовательность может также упоминаться как нацеливающая последовательность или спейсерная последовательность. Гидовая последовательность может иметь длину 20 пар оснований, например в случае Streptococcus pyogenes (то есть Spy Cas9) и родственных гомологов/ортологов Cas9. Более короткие или более длинные последовательности также могут быть использованы в качестве гидов, например длиной 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность, например, находится в гене или в хромосоме и является комплементарной гидовой последовательности. В некоторых вариантах степень комплементарности или идентичности между гидовой последовательностью и соответствующей ей целевой последовательностью может составлять около 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления гидовая последовательность и целевая область могут быть на 100% комплементарны или идентичны. В других вариантах осуществления гидовая последовательность и целевая область могут содержать по меньшей мере одно несовпадение. Например, гидовая последовательность и целевая последовательность могут содержать 1, 2, 3 или 4 несовпадения, причем общая длина целевой последовательности составляет по меньшей мере 17, 18, 19, 20 или более пар оснований. В некоторых вариантах осуществления гидовая последовательность и целевая область могут содержать 1-4 несовпадения, когда гидовая последовательность содержит по меньшей мере 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления гидовая последовательность и целевая область могут содержать 1, 2, 3 или 4 несовпадения, когда гидовая последовательность содержит 20 нуклеотидов.

Целевые последовательности для белков Cas включают как положительные, так и отрицательные цепи геномной ДНК (то есть заданную последовательность и обратный комплемент последовательности), поскольку субстрат нуклеиновой кислоты для белка Cas представляет собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту. Соответственно, когда говорят, что гидовая последовательность является компле

- 7 047139 ментарной целевой последовательности, следует понимать, что гидовая последовательность может направлять гидовую РНК для связывания с обратным комплементом целевой последовательности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, где гидовая последовательность связывает обратный комплемент целевой последовательности, целевая последовательность идентична некоторым нуклеотидам целевой последовательности (например, целевой последовательности, не содержащей РАМ), за исключением замены U на Т в гидовой последовательности.

Длина целевой последовательности может зависеть от системы CRISPR/Cas и используемых компонентов. Например, разные Cas-нуклеазы класса 2 из разных видов бактерий имеют различные оптимальные длины нацеливающих последовательностей. Соответственно, нацеливающая последовательность может содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или более 50 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления длина нацеливающей последовательности составляет 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов длиннее или короче, чем гидовая последовательность из встречающейся в природе системы CRISPR/Cas. В определенных вариантах осуществления каркас Cas-нуклеазы и гРНК будет происходить из одной и той же системы CRISPR/Cas. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая последовательность может содержать или состоять из 18-24 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая последовательность может содержать или состоять из 19-21 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления нацеливающая последовательность может содержать или состоять из 20 нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления огРНК представляет собой огРНК Cas9, способную опосредовать РНК-направляемое расщепление ДНК при помощи белка Cas9. В некоторых вариантах осуществления огРНК представляет собой огРНК Cpf1, способную опосредовать РНК-направляемое расщепление ДНК при помощи белка Cpf1. В определенных вариантах осуществления гРНК содержит сгРНК и tracrPHK, достаточные для образования активного комплекса с белком Cas9 и опосредования РНКнаправляемого расщепления ДНК. В определенных вариантах осуществления гРНК содержит сгРНК, достаточную для образования активного комплекса с белком Cpf1 и опосредования РНК-направляемого расщепления ДНК. См. Zetsche 2015.

Определенные варианты осуществления изобретения также обеспечивают нуклеиновые кислоты, например кассеты экспрессии, кодирующие описанную в данном документе гРНК. Нуклеиновая кислота гидовой РНК используется в данном документе для обозначения гидовой РНК (например, огРНК или дгРНК) и кассеты экспрессии гидовой РНК, которая представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует одну или более гидовых РНК.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может представлять собой молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую сгРНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая сгРНК, содержит нацеливающую последовательность, фланкированную всей или частью повторяющейся последовательности из встречающейся в природе системы CRISPR/Cas. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую tracrPHK. В некоторых вариантах осуществления сгРНК и tracrPHK могут кодироваться двумя отдельными нуклеиновыми кислотами. В других вариантах осуществления сгРНК и tracrPHK могут кодироваться одной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления сгРНК и tracrPHK могут кодироваться противоположными цепями одной нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления сгРНК и tracrPHK могут кодироваться одной и той же цепью одной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК кодирует огРНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК кодирует огРНК Cas9-нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК кодирует огРНК нуклеазы Cpf1.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая гидовую РНК, может быть функционально связана с по меньшей мере одной транскрипционной или регуляторной контрольной последовательностью, такой как промотор, 3'-НТО или 5'-НТО. В одном примере промотор может представлять собой промотор тРНК, например, mPHK^Lys3 или тРНК-химеру. См. Mefferd et al., RNA 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628. В некоторых вариантах осуществления промотор может распознаваться РНК-полимеразой III (Pol III). Неограничивающие примеры промоторов Pol III также включают промоторы U6 и H1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая гидовую РНК, может быть функционально связана с промотором U6 мыши или человека. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК представляет собой модифицированную нуклеиновую кислоту. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК содержит модифицированный нуклеозид или нуклеотид. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота гРНК содержит 5'-концевую модификацию, например модифицированный нуклеозид или нуклеотид для стабилизации и предотвращения интеграции нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК содержит двухцепочечную ДНК, имеющую 5'-концевую модификацию на каждой цепи. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота гРНК содержит в качестве 5'-концевой модификации инвертированный дидезокси-Т или инвертированный нуклеозид с удаленным азотистым основанием или нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота

- 8 047139 гРНК содержит метку, такую как биотин, дестиобиотен-TEG, дигоксигенин и флуоресцентные маркеры, включая, например, FAM, ROX, TAMRA и AlexaFluor.

В определенных вариантах осуществления с системой CRISPR/Cas-нуклеаз может быть использовано более одной нуклеиновой кислоты гРНК, такой как гРНК.

Каждая нуклеиновая кислота гРНК может содержать различные нацеливающие последовательности, так что система CRISPR/Cas расщепляет более одной целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления одна или более гРНК могут иметь одинаковые или разные свойства, такие как активность или стабильность в комплексе CRISPR/Cas. Если используется более одной гРНК, каждая гРНК может кодироваться одной или разными нуклеиновыми кислотами гРНК. Промоторы, используемые для управления экспрессией более чем одной гРНК, могут быть одинаковыми или разными.

Модифицированные РНК.

В определенных вариантах осуществления композиции LNP содержат модифицированные РНК.

Модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды могут присутствовать в РНК, например гРНК или мРНК. гРНК или мРНК, содержащая, например, один или более модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, называется модифицированной РНК для описания присутствия одного или более не встречающихся в природе и/или встречающихся в природе компонентов или конфигураций, которые используются вместо или в дополнение к каноническим остаткам A, G, С и U. В некоторых вариантах осуществления модифицированная РНК синтезируется с неканоническим нуклеозидом или нуклеотидом, называемым в данном документе модифицированным.

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать один или более из следующего: (i) изменение, например замена одного или обоих не связывающих кислородов фосфата и/или одного или более связывающих кислородов фосфата в сложной фосфодиэфирной связи остова (иллюстративная модификация остова); (ii) изменение, например замена компонента рибозного сахара, например 2'гидроксила на рибозном сахаре (иллюстративная модификация сахара); (iii) полная замена фосфатного фрагмента дефосфо линкерами (иллюстративная модификация остова); (iv) модификация или замена встречающегося в природе нуклеинового основания, в том числе неканоническим нуклеиновым основанием (иллюстративная модификация основания); (v) замена или модификация рибозофосфатного остова (иллюстративная модификация остова); (vi) модификация 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида, например удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента, кэпа или линкера (такие модификации 3'- или 5'-кэпа могут включать в себя модификацию сахара и/или остова); и (vii) модификация или замена сахара (иллюстративная модификация сахара). Некоторые варианты осуществления содержат модификацию 5'-конца мРНК, гРНК или нуклеиновой кислоты. Некоторые варианты осуществления содержат модификацию 3'-конца мРНК, гРНК или нуклеиновой кислоты. Модифицированная РНК может содержать модификации 5'-конца и 3'-конца. Модифицированная РНК может содержать один или более модифицированных остатков в нетерминальных положениях. В определенных вариантах осуществления гРНК содержит по меньшей мере один модифицированный остаток. В определенных вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере один модифицированный остаток.

Как используется в данном документе, считается, что первая последовательность содержит последовательность с по меньшей мере Х% идентичности со второй последовательностью, если выравнивание первой последовательности со второй последовательностью демонстрирует, что Х% или более из положений во второй последовательности полностью соответствуют первой последовательности. Например, последовательность AAGA содержит последовательность со 100%-ной идентичностью последовательности AAG, поскольку выравнивание даст 100%-ную идентичность в том смысле, что имеются совпадения для всех трех положений второй последовательности. Различия между РНК и ДНК (обычно обмен уридина на тимидин или наоборот) и присутствие нуклеозидных аналогов, таких как модифицированные уридины, не способствуют различиям в идентичности или комплементарности среди полинуклеотидов поскольку соответствующие нуклеотиды (такие как тимидин, уридин или модифицированный уридин) имеют один и тот же комплемент (например, аденозин для всех из тимидина, уридина или модифицированного уридина; другим примером являются цитозин и 5-метилцитозин, оба из которых содержат в качестве комплементарного основания гуанозин или модифицированный гуанозин). Так, например, последовательность 5'-AXG, где X представляет собой любой модифицированный уридин, такой как псевдоуридин, Ы1-метилпсевдоуридин или 5-метоксиуридин, считается на 100% идентичным AUG, поскольку оба они полностью комплементарны одной и той же последовательности (5'-CAU). Примерами алгоритмов выравнивания являются алгоритмы Смита-Уотермана и Нидлмана-Вунша, которые хорошо известны в данной области техники. Специалисту в данной области техники будет понятно, какой алгоритм выбрать и какие настройки параметров подходят для данной пары последовательностей, которые должны быть выровнены; для последовательностей в общем одинаковой длины и ожидаемой идентичности >50% для аминокислот или >75% для нуклеотидов, как правило, подходит алгоритм НидлманаВунша со стандартными настройками интерфейса алгоритма Нидлмана-Вунша, предоставляемого EBI на вебсервере www.ebi.ac.uk.

- 9 047139 мРНК.

В некоторых вариантах осуществления композиция или состав, раскрытые в данном документе, содержат мРНК, содержащую открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент, такой как Cas-нуклеаза или Cas-нуклеаза класса 2, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления предоставляется, используется или вводится мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, такой как Cas-нуклеаза или Casнуклеаза класса 2. В некоторых вариантах осуществления ОРС, кодирующая РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент, представляет собой модифицированную ОРС РНК-направляемого ДНКсвязывающего агента или просто модифицированную ОРС, которые используются для краткого обозначения того, что ОРС модифицирована одним или более из следующих способов: (1) модифицированная ОРС имеет содержание уридина в диапазоне от минимального содержания уридина до 150% от минимального содержания уридина; (2) модифицированная ОРС имеет содержание уридинового динуклеотида в диапазоне от минимального содержания уридинового динуклеотида до 150% от минимального содержания уридинового динуклеотида; (3) модифицированная ОРС имеет по меньшей мере 90% идентичности с любой из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66; (4) модифицированная ОРС состоит из набора кодонов, из которых по меньшей мере 75% кодонов являются кодон(ы) с минимальным содержанием уридинов для данной аминокислоты, например кодон(ы) с наименьшим количеством уридинов (обычно 0 или 1, за исключением кодона для фенилаланина, причем этот кодон с минимальным содержанием уридинов имеет 2 уридина); или (5) модифицированная ОРС содержит по меньшей мере один модифицированный уридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированная ОРС модифицируется по меньшей мере двумя, тремя или четырьмя из вышеуказанных способов. В некоторых вариантах осуществления модифицированная ОРС содержит по меньшей мере один модифицированный уридин и модифицирована по меньшей мере одним, двумя, тремя или всеми способами из (1)-(4), описанными выше.

Модифицированный уридин используется в данном документе для обозначения нуклеозида, отличного от тимидина, с теми же акцепторами водородных связей, что и уридин, и одним или более структурными отличиями от уридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой замещенный уридин, то есть уридин, в котором один или более непротонных заместителей (например, алкокси, такой как метокси) занимает место протона. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой замещенный псевдоуридин, то есть псевдоуридин, в котором один или более непротонных заместителей (например, алкил, такой как метил) занимает место протона. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой любой из замещенного уридина, псевдоуридина или замещенного псевдоуридина.

В контексте данного документа положение уридина относится к положению в полинуклеотиде, занимаемом уридином или модифицированным уридином. Так, например, полинуклеотид, в котором 100% положений уридина представляют собой модифицированные уридины, содержит модифицированный уридин в каждом положении, которое было бы уридином в обычной РНК (где все основания являются стандартными основаниями A, U, С или G) той же последовательности. Если не указано иное, U в полинуклеотидной последовательности из таблицы последовательностей или перечня последовательностей, включенных в данное описание или сопровождающих его, может представлять собой уридин или модифицированный уридин.

Таблица 1

Кодоны с минимальным содержанием уридина

Аминокислота

Кодон с минимальным содержанием

- 10 047139

		уридина
А	Аланин	GCA или GCC, или GCG
G	Глицин	GGA или GGC, или GGG
V	Валин	GUC или GUA, или GUG
D	Аспарагиновая кислота	GAC
Е	Глутаминовая кислота	GAA или GAG
I	Изолейцин	AUC или AUA, или AUG
т	Треонин	АСА или АСС, или ACG
N	Аспарагин	ААС
К	Лизин	AAG или ААА
S	Серин	AGC
R	Аргинин	AGA или AGG
L	Лейцин	CUG или CUA, или CUC
Р	Пролин	CCG или ССА, или ССС
Н	Г истидин	САС или САА, или CAG
Q	Глутамин	CAG или САА
F	Фенилаланин	иис
Y	Тирозин	UAC
С	Цистеин	UGC
W	Триптофан	UGG
м	Метионин	AUG

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может состоять из набора кодонов, из которых по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% кодонов являются кодонами, перечисленными в таблице кодонов с минимальным содержанием уридина. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может содержать последовательность с по меньшей мере 90, 95, 98, 99 или 100% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 1,4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может содержать последовательность с по меньшей мере 90, 95, 98, 99 или 100% идентичностью с любой из SEQ ГО NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может иметь содержание уридина в диапазоне от ее минимального содержания уридина до 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 104, 103, 102 или 101% от минимального содержания уридина.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может иметь содержание уридинового динуклеотида в диапазоне от ее минимального содержания уридинового динуклеотида до 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 104, 103, 102 или 101% от минимального содержания уридинового динуклеотида.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может содержать модифицированный уридин по меньшей мере в одном, множестве или во всех положениях уридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой уридин, модифицированный в положении 5, например, галогеном, метилом или этилом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин, модифицированный в положении 1, например, галогеном, метилом или этилом. Модифицированный уридин может представлять собой, например, псевдоуридин, М-метил-псевдоуридин, 5-метоксиуридин, 5-йодоуридин или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой 5метоксиуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой 5-йодоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой М-метил-псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и М-метилпсевдоуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5-метоксиуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию N1метилпсевдоуридина и 5-метоксиуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-йодоуридина и М-метилпсевдоуридина. В некоторых вариан

- 11 047139 тах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5йодоуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-йодоуридина и 5-метоксиуридина.

В некоторых вариантах по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой модифицированные уридины. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 5565%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой модифицированные уридины, например, 5-метоксиуридин, 5-йодоуридин, N1метилпсевдоуридин, псевдоуридин или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой 5-метоксиуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой Ю-метилпсевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой 5-йодоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой 5метоксиуридин, а остальные представляют собой Ю-метилпсевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в мРНК согласно описанию представляют собой 5-йодоуридин, а остальные представляют собой Ю-метилпсевдоуридин.

В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления модифицированная ОРС может иметь пониженное содержание уридинового динуклеотида, такое как минимально возможное содержание уридинового динуклеотида (UU), например ОРС, в которой (а) используется кодон с минимальным содержанием уридина (как обсуждалось выше) в каждом положении и (b) кодирует ту же аминокислотную последовательность, что и данная ОРС. Содержание уридинового динуклеотида (UU) может быть выражено в абсолютных единицах в виде суммы динуклеотидов UU в ОРС или на основе частоты в виде процентной доли положений, занимаемых уридинами в уридиновых динуклеотидах (например, AUUAU будет иметь содержание уридинового динуклеотида 40%, потому что 2 из 5 положений занимают уридины уридинового динуклеотида). Модифицированные остатки уридина считаются эквивалентными уридинам с целью оценки минимального содержания уридиновых динуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере одну нетранслируемую последовательность (НТО) из экспрессируемой мРНК млекопитающего, такой как конститутивно экспрессируемой мРНК. мРНК считается конститутивно экспрессируемой у млекопитающего, если она непрерывно транскрибируется по меньшей мере в одной ткани здорового взрослого млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5'-НТО, 3'-НТО или 5'- и 3'-НТО из экспрессируемой РНК млекопитающего, такой как конститутивно экспрессируемой мРНК млекопитающего. мРНК актина представляет собой пример конститутивно экспрессируемой мРНК.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере одну НТО из 17гидроксистероид-бета-дегидрогеназы 4 (HSD17B4 или HSD), например, 5'-НТО из HSD. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит по меньшей мере одну НТО из мРНК глобина, например мРНК альфа-глобина человека (НВА), мРНК бета-глобина человека (НВВ) или мРНК бета-глобина Xenopus laevis (XBG). В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5'-НТО, 3'-НТО или 5'- и 3'-НТО из мРНК глобина, такого как НВА, НВВ или XBG. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5'-НТО из бычьего гормона роста, цитомегаловируса (CMV), мышиного Hba-a1, HSD, гена альбумина, НВА, НВВ или XBG. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 3'-НТО из бычьего гормона роста, цитомегаловируса, мышиного Hba-a1, HSD, гена альбумина, НВА, НВВ или XBG. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5'- и 3'-НТО из бычьего гормона роста, цитомегаловируса, мышиного Hba-a1, HSD, гена альбумина, НВА, НВВ, XBG, белка теплового шока 90 (Hsp90), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), бета-актина, альфа-тубулина, опухолевого белка (р53) или рецептора эпидермального фактора роста (EGFR).

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит 5'- и 3'-НТО, которые происходят из одного и того же источника, например, конститутивно экспрессируемой мРНК, например, актина, альбумина или глобина, такого как НВА, НВВ или XBG.

В некоторых вариантах осуществления мРНК не содержит 5'-НТО, например, нет никаких дополнительных нуклеотидов между 5'-кэпом и старт-кодоном. В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит последовательность Козак (описанную ниже) между 5'-кэпом и старт-кодоном, но не имеет никакого дополнительного 5'-НТО. В некоторых вариантах осуществления мРНК не содержит 3'-НТО, например нет никаких дополнительных нуклеотидов между стоп-кодоном и поли(А)-хвостом.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит последовательность Козак. Последователь

- 12 047139 ность Козак может влиять на инициацию трансляции и общий выход полипептида, транслированного с мРНК. Последовательность Козак содержит кодон метионина, который может функционировать в качестве старт-кодона. Минимальная последовательность Козак представляет собой NNNRUGN, где по меньшей мере одно из следующего является истинным: первый N представляет собой А или G, а второй N представляет собой G. В контексте нуклеотидной последовательности R означает пурин (А или G). В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак представляет собой RNNRUGN, NNNRUGG, RNNRUGG, RNNAUGN, NNNAUGG или RNNAUGG. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак имеет вид rccRUGg с нулевым несовпадением или с максимально одним или двумя несовпадениями с положениями в нижнем регистре. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак имеет вид rccAUGg с нулевым несовпадением или максимально с одним или двумя несовпадениями с положениями в нижнем регистре. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак имеет вид gccRccAUGG с нулевым несовпадением или максимально с одним, двумя или тремя несовпадениями с положениями в нижнем регистре. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак имеет вид gccAccAUG с нулевым несовпадением или максимально с одним, двумя, тремя или четырьмя несовпадениями с положениями в нижнем регистре. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак представляет собой GCCACCAUG. В некоторых вариантах осуществления последовательность Козак имеет вид gccgccRccAUGG с нулевым несоответствием или максимально с одним, двумя, тремя или четырьмя несовпадениями с положениями в нижнем регистре.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 43, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 43 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 44, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 44 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 56, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 56 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 57, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 57 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 58 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 59, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 59 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 60, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 60 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, содержащая ОРС, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность с SEQ ID NO: 61, причем необязательно ОРС SEQ ID NO: 61 (то есть SEQ ID NO: 4) замещена альтернативной ОРС любой из SEQ ID NO: 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления мРНК содержит альтернативную ОРС любой из SEQ ID NO: 7,9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18,20,21,23,24,26,27,29,30,50, 52, 54, 65 или 66.

В некоторых вариантах осуществления степень идентичности с необязательно замещенными по

- 13 047139 следовательностями SEQ ID NO: 43, 44 или 56-61 составляет 95%. В некоторых вариантах осуществления степень идентичности с необязательно замещенными последовательностями SEQ ID NO: 43, 44 или 56-61 составляет 98%. В некоторых вариантах осуществления степень идентичности с необязательно замещенными последовательностями SEQ ID NO: 43, 44 или 56-61 составляет 99%. В некоторых вариантах осуществления степень идентичности с необязательно замещенными последовательностями SEQ ID NO: 43, 44 или 56-61 составляет 100%.

В некоторых вариантах осуществления мРНК, описанная в данном документе, содержит 5'-кэп, такой как кэп 0, кэп 1 или кэп 2. Как правило, 5'-кэп представляет собой 7-метилгуаниновый рибонуклеотид (который может быть дополнительно модифицирован, как обсуждается ниже, например, в отношении ARCA), связанный через 5'-трифосфат с положением 5' первого нуклеотида 5'-3' цепи мРНК, т. е. первого кэп-проксимального нуклеотида. В кэпе 0 рибозы первого и второго кэп-проксимальных нуклеотидов мРНК содержат 2'-гидроксил. В кэпе 1 рибозы первого и второго транскрибируемых нуклеотидов мРНК содержат 2'-метокси и 2'-гидроксил, соответственно. В кэпе 2 рибозы первого и второго кэппроксимальных нуклеотидов мРНК содержат 2'-метокси. См., например, Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33): 12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11): E2106-E2115. Большинство эндогенных мРНК высших эукариот, включая мРНК млекопитающих, таких как мРНК человека, содержат кэп 1 или кэп 2. Кэп 0 и другие кэп-структуры, отличающиеся от кэпа 1 и кэпа 2, могут быть иммуногенными для млекопитающих, таких как люди, из-за распознавания как чужие компонентами врожденной иммунной системы, такими как IFIT-1 и IFIT-5, что может приводить к повышенным уровням цитокинов, включая интерферон I типа. Компоненты врожденной иммунной системы, такие как IFIT-1 и IFIT-5, могут также конкурировать с eIF4E за связывание мРНК с кэпом, отличным от кэпа 1 или кэпа 2, потенциально ингибируя трансляцию мРНК.

Кэп может быть включен во время транскрипции. Например, ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией; Thermo Fisher Scientific, кат. № АМ8045) представляет собой аналог кэпа, содержащий 7'-метилгуанин 3'-метокси-5'-трифосфат, связанный с положением 5' гуанинового рибонуклеотида, который может быть включен in vitro в транскрипт во время инициации. ARCA приводит к кэпструктуре кэп 0, в которой положение 2' первого кэп-проксимального нуклеотида представляет собой гидроксил. См., например, Stepinski et al., (2001) Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG, RNA7: 1486-1495. Структура ARCA приведена ниже.

_{H Ν}··\ ' । О P (Ao P-О- Г ьГ'ЮН < ООО ..... J оУосн, он он

CleanCap™ AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies, кат. № N-7113) или CleanCap™ GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies, кат. № N-7133) могут использоваться для обеспечения структуры кэп 1 во время транскрипции. 3'-О-метилированные версии CleanCap™ AG и CleanCap™ GG также доступны от TriLink Biotechnologies как кат. №№ N-7413 и N-7433, соответственно. Структура CleanCap™ AG приведена ниже.

Альтернативно, кэп может быть добавлен к РНК после транскрипции. Например, кэпирующий фермент вируса осповакцины является коммерчески доступным (New England Biolabs, кат. № M2080S) и имеет активности РНК-трифосфатазы и гуанилилтрансферазы, обеспечиваемые его субъединицей D1, и гуанинметилтрансферазы, обеспечиваемой его субъединицей D12. Поэтому он может добавлять 7метилгуанин к РНК, так что образуется кэп 0, в присутствии S-аденозилметионина и GTP. См, например, Guo, P. and Moss, В. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. and Shuman, S.(1994) J. Biol.

- 14 047139

Chem. 269, 24472-24479.

В некоторых вариантах осуществления мРНК дополнительно содержит полиадениловый (поли(А)) хвост. В некоторых вариантах осуществления поли(А)-хвост содержит по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 аденинов, необязательно до 300 аденинов. В некоторых вариантах осуществления поли(А)-хвост содержит 95, 96, 97, 98, 99 или 100 адениновых нуклеотидов. В некоторых случаях поли(А)-хвост прерывается одним или более неадениновыми нуклеотидными якорями в одном или более местах внутри поли(А)-хвоста. Поли(А)-хвосты могут содержать по меньшей мере 8 последовательных адениновых нуклеотидов, но также могут содержать один или боле неадениновых нуклеотидов. Используемый в данном документе термин неадениновые нуклеотиды относится к любым природным или не встречающимся в природе нуклеотидам, которые не содержат аденин. Гуаниновые, тиминовые и цитозиновые нуклеотиды являются примерами неадениновых нуклеотидов. Таким образом, поли(А)хвосты в мРНК, описанной в данном документе, могут содержать последовательные адениновые нуклеотиды, расположенные на 3'-конце по отношению к нуклеотидам, кодирующим РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент или представляющую интерес последовательность. В некоторых случаях поли-Ахвосты на мРНК содержат непоследовательные адениннуклеотиды, расположенные на 3'-конце по отношению к нуклеотидам, кодирующим РНК-направляемый ДНК-связывающий агент или представляющую интерес последовательность, причем неадениновые нуклеотиды прерывают адениновые нуклеотиды с регулярными или нерегулярно расположенными интервалами.

В некоторых вариантах осуществления один или более неадениновых нуклеотидов расположены так, чтобы прерывать последовательные адениновые нуклеотиды, так что поли(А) -связывающий белок может связываться с целым рядом последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более неадениновых нуклеотидов находятся после по меньшей мере 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более неадениновых нуклеотидов находятся после по меньшей мере 8-50 последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более неадениновых нуклеотидов находятся после по меньшей мере 8-100 последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления неадениновый нуклеотид находится после одного, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи адениновых нуклеотидов и сопровождается по меньшей мере 8 последовательными адениновыми нуклеотидами.

Поли(А)-хвост может содержать одну последовательность последовательных адениновых нуклеотидов, за которыми следуют один или более неадениновых нуклеотидов, за которыми, необязательно, следуют дополнительные адениновые нуклеотиды.

В некоторых вариантах осуществления поли(А)-хвост имеет или содержит один неадениновый нуклеотид или одну последовательную вставку из 2-10 неадениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления неадениновый(е) нуклеотид(ы) находится после по меньшей мере 8, 9, 10, 11 или 12 последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых случаях один или более неадениновых нуклеотидов расположены после по меньшей мере 8-50 последовательных адениновых нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления один или более неадениновых нуклеотидов расположены после по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 последовательных адениновых нуклеотидов.

В некоторых вариантах осуществления неадениновый нуклеотид представляет собой гуанин, цитозин или тимин. В некоторых случаях неадениновый нуклеотид представляет собой гуаниновый нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления неадениновый нуклеотид представляет собой цитозиновый нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления неадениновый нуклеотид представляет собой тиминовый нуклеотид. В некоторых случаях, когда присутствует более одного неаденинового нуклеотида, не

- 15 047139 адениновый нуклеотид может быть выбран из: а) гуаниновых и тиминовых нуклеотидов; b) гуаниновых и цитозиновых нуклеотидов; с) тиминовых и цитозиновых нуклеотидов; или d) гуаниновых, тиминовых и цитозиновых нуклеотидов. Иллюстративный поли(А)-хвост, содержащий неадениновые нуклеотиды, представлен как SEQ ID NO: 62.

В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают. В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают с использованием способа осаждения (например, осаждения LiCl, осаждения спиртом или эквивалентного способа, например, как описано в данном документе). В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают с использованием способа на основе хроматографии, такого как способ на основе ВЭЖХ, или эквивалентный способ (например, как описано в данном документе). В некоторых вариантах осуществления мРНК очищают с использованием как способа осаждения (например, осаждения LiCl), так и способа на основе ВЭЖХ.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна гРНК предложена в комбинации с мРНК, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления гРНК предложена в виде молекулы, отдельной от мРНК. В некоторых вариантах осуществления гРНК предложена как часть, такая как часть НТО мРНК, описанной в данном документе.

Химически модифицированная гРНК.

В некоторых вариантах осуществления гРНК является химически модифицированной. гРНК, содержащая один или более модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, называется модифицированной гРНК или химически модифицированной гРНК для описания присутствия одного или более не встречающихся в природе и/или встречающихся в природе компонентов или конфигураций, которые используются вместо или в дополнение к каноническим остаткам A, G, С и U. В некоторых вариантах осуществления модифицированная гРНК синтезируется с неканоническим нуклеозидом или нуклеотидом, называемым в данном документе модифицированным. Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать один или более из следующего: (i) изменение, например замена одного или обоих не связывающих кислородов фосфата и/или одного или более связывающих кислородов фосфата в сложной фосфодиэфирной связи остова (иллюстративная модификация остова); (ii) изменение, например замена компонента рибозного сахара, например 2'-гидроксила на рибозном сахаре (иллюстративная модификация сахара); (iii) полная замена фосфатного фрагмента дефосфо линкерами (иллюстративная модификация остова); (iv) модификация или замена встречающегося в природе нуклеинового основания, в том числе неканоническим нуклеиновым основанием (иллюстративная модификация основания); (v) замена или модификация рибозофосфатного остова (иллюстративная модификация остова); (vi) модификация 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида, например удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента, кэпа или линкера (такие модификации 3'- или 5'-кэпа могут включать в себя модификацию сахара и/или остова); и (vii) модификация или замена сахара (иллюстративная модификация сахара).

В некоторых вариантах осуществления гРНК содержит модифицированный уридин в некоторых или во всех положениях уридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой уридин, модифицированный в положении 5, например, галогеном или С1-С6 алкокси. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин, модифицированный в положении 1, например, С1-С6 алкилом. Модифицированный уридин может представлять собой, например, псевдоуридин, Ш-метил-псевдоуридин, 5-метоксиуридин, 5-йодоуридин или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой 5-метоксиуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой 5-йодоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой Ю-метил-псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и Ш-метилпсевдоуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5метоксиуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию ^-метилпсевдоуридина и 5-метоксиуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-йодоуридина и Ю-метилпсевдоуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5-йодоуридина. В некоторых вариантах осуществления модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-йодоуридина и 5-метоксиуридина.

В некоторых вариантах по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 или 100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой модифицированные уридины. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 5565%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой модифицированные уридины, например, 5-метоксиуридин, 5-йодоуридин, N1метилпсевдоуридин, псевдоуридин или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой 5-метоксиуридин. В некоторых вариантах осуществления

- 16 047139

10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой псевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой Ю-метилпсевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой 5-йодоуридин. В некоторых вариантах осуществления 10-25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 8595% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой 5-метоксиуридин, а остальные представляют собой Ю-метилпсевдоуридин. В некоторых вариантах осуществления 1025%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95% или 90-100% положений уридина в гРНК согласно описанию представляют собой 5-йодоуридин, а остальные представляют собой N1метилпсевдоуридин.

Химические модификации, такие как перечисленные выше, могут быть объединены для получения модифицированных гРНК, содержащих нуклеозиды и нуклеотиды (все вместе именуемые остатки), которые могут иметь две, три, четыре или более модификаций. Например, модифицированный остаток может иметь модифицированный сахар и модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления каждое основание гРНК модифицировано, например все основания имеют модифицированную фосфатную группу, такую как фосфоротиоатная группа. В определенных вариантах осуществления все или по существу все фосфатные группы молекулы гРНК заменены фосфоротиоатными группами. В некоторых вариантах осуществления модифицированные гРНК содержат по меньшей мере один модифицированный остаток на 5'-конце РНК или вблизи него. В некоторых вариантах осуществления модифицированные гРНК содержат по меньшей мере один модифицированный остаток на 3'-конце РНК или вблизи него.

В некоторых вариантах осуществления гРНК содержит один, два, три или более модифицированных остатков. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5% (например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100%) положений в модифицированной гРНК представляют собой модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды.

Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации, например, внутриклеточными нуклеазами или нуклеазами, обнаруженными в сыворотке. Например, нуклеазы могут гидролизовать фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот. Соответственно, в одном аспекте гРНК, описанные в данном документе, могут содержать один или более модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, например, для придания стабильности к внутриклеточным или сывороточным нуклеазам. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном документе модифицированные молекулы гРНК могут вызывать пониженный врожденный иммунный ответ при введении в популяцию клеток как in vivo, так и ex vivo. Термин врожденный иммунный ответ включает клеточный ответ на экзогенные нуклеиновые кислоты, включая одноцепочечные нуклеиновые кислоты, который включает индукцию экспрессии и высвобождения цитокинов, особенно интерферонов, и гибель клеток.

В некоторых вариантах осуществления модификации остова фосфатная группа модифицированного остатка может быть модифицирована путем замены одного или более атомов кислорода другим заместителем. Кроме того, модифицированный остаток, например модифицированный остаток, присутствующий в модифицированной нуклеиновой кислоте, может включать полную замену немодифицированной фосфатной группы модифицированной фосфатной группой, как описано в данном документе. В некоторых вариантах осуществления модификация фосфатного остова может включать в себя изменения, которые приводят или к незаряженному линкеру, или к заряженному линкеру с несимметричным распределением заряда.

Примеры модифицированных фосфатных групп включают фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные сложные эфиры, гидрофосфонаты, фосфороамидаты, алкил- или арилфосфонаты и сложные фосфотриэфиры. Атом фосфора в немодифицированной фосфатной группе является ахиральным. Однако замена одного из немостиковых атомов кислорода на один из указанных выше атомов или групп атомов может сделать атом фосфора хиральным. Стереогенный атом фосфора может иметь или конфигурацию R (в данном документе Rp), или конфигурацию S (в данном документе Sp). Остов также можно модифицировать путем замены мостикового кислорода (то есть кислорода, который связывает фосфат с нуклеозидом) на азот (мостиковые фосфороамидаты), серу (мостиковые фосфоротиоаты) и углерод (мостиковые метиленфосфонаты). Замена может происходить или в линкерном кислороде, или в обоих линкерных кислородах.

В некоторых модификациях остова фосфатная группа может быть заменена соединительными группами, не содержащими фосфор. В некоторых вариантах осуществления заряженная фосфатная группа может быть заменена нейтральным фрагментом. Примеры фрагментов, которые могут заменить фос- 17 047139 фатную группу, могут включать, без ограничения, например, метилфосфонат, гидроксиламино, силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметилимино.

Матричная нуклеиновая кислота.

Композиции и способы, описанные в данном документе, могут включать матричную нуклеиновую кислоту. Матрица может быть использована для изменения или вставки последовательности нуклеиновой кислоты в целевой сайт для Cas-нуклеазы или около него. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение матрицы в клетку. В некоторых вариантах осуществления может быть предложена одна матрица. В других вариантах осуществления могут быть предложены две или более матриц, так что редактирование может происходить на двух или более целевых сайтах. Например, могут быть предложены разные матрицы для редактирования одного гена в клетке или двух разных генов в клетке.

В некоторых вариантах осуществления матрица может использоваться в гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления гомологичная рекомбинация может приводить к интеграции последовательности матрицы или части последовательности матрицы в молекулу целевой нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления матрица может быть использована в направляемой гомологией репарации, которая включает внедрение цепи ДНК в сайте расщепления в нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах осуществления направляемая гомологией репарация может приводить к включению последовательности матрицы в отредактированную молекулу целевой нуклеиновой кислоты. В еще других вариантах осуществления матрица может использоваться при редактировании генов, опосредованном негомологичным соединением концов. В некоторых вариантах осуществления последовательность матрицы не имеет сходства с последовательностью нуклеиновой кислоты вблизи сайта расщепления. В некоторых вариантах осуществления включены матрица или часть последовательности матрицы. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит фланкирующие последовательности инвертированных концевых повторов (ITR).

В некоторых вариантах осуществления матрица может содержать первое плечо гомологии и второе плечо гомологии (также называемые первой и второй нуклеотидной последовательностью), которые комплементарны последовательностям, расположенным в прямом и обратном направлении от сайта расщепления, соответственно. Когда матрица содержит два плеча гомологии, каждое плечо может иметь одинаковую длину или разные длины, и последовательность между плечами гомологии может быть практически аналогичной или идентичной целевой последовательности между плечами гомологии, или она может быть совершенно неродственной. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности или процент идентичности между первой нуклеотидной последовательностью на матрице и последовательностью в прямом направлении от сайта расщепления и между второй нуклеотидной последовательностью на матрице и последовательностью в обратном направлении от сайта расщепления может обеспечивать гомологичную рекомбинацию, такую как, например, гомологичная рекомбинация высокой точности между матрицей и молекулой целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности может составлять около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности может составлять около 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности может составлять по меньшей мере 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности может составлять 100%. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности может составлять около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности может составлять около 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности может составлять по меньшей мере 98%, 99% или 100%. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности может составлять 100%.

В некоторых вариантах осуществления последовательность матрицы может соответствовать, содержать или состоять из эндогенной последовательности целевой клетки. Она также может или альтернативно соответствовать, содержать или состоять из экзогенной последовательности целевой клетки. Используемый в данном документе термин эндогенная последовательность относится к последовательности, которая является нативной для клетки. Термин экзогенная последовательность относится к последовательности, которая не является нативной для клетки, или к последовательности, чье нативное расположение в геноме клетки находится в другом месте. В некоторых вариантах осуществления эндогенная последовательность может представлять собой геномную последовательность клетки. В некоторых вариантах осуществления эндогенная последовательность может представлять собой хромосомную или внехромосомную последовательность. В некоторых вариантах осуществления эндогенная последовательность может представлять собой плазмидную последовательность клетки. В некоторых вариантах осуществления последовательность матрицы может быть по существу идентичной части эндогенной последовательности в клетке в сайте расщепления или около, но содержать по меньшей мере одно нуклеотидное изменение. В некоторых вариантах осуществления редактирование расщепленной молекулы целевой нуклеиновой кислоты с помощью матрицы может приводить к мутации, включающей вставку,

- 18 047139 делецию или замену одного или более нуклеотидов молекулы целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к одному или более аминокислотным изменениям в белке, экспрессируемом геном, содержащим целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к одному или более нуклеотидным изменениям в РНК, экспрессируемой целевым геном. В некоторых вариантах осуществления мутация может изменять уровень экспрессии целевого гена. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к повышенной или пониженной экспрессии целевого гена. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к нокдауну гена. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к нокауту гена. В некоторых вариантах осуществления мутация может приводить к восстановлению функции гена. В некоторых вариантах осуществления редактирование расщепленной молекулы целевой нуклеиновой кислоты с помощью матрицы может приводить к изменению последовательности экзона, последовательности интрона, регуляторной последовательности, последовательности транскрипционной контрольной последовательности, трансляционной контрольной последовательности, сайта сплайсинга или некодирующей последовательности молекулы целевой нуклеиновой кислоты, такой как ДНК.

В других вариантах осуществления последовательность матрицы может содержать экзогенную последовательность. В некоторых вариантах осуществления экзогенная последовательность может содержать кодирующую белок или РНК последовательность, функционально связанную с экзогенной промоторной последовательностью, так что при интеграции экзогенной последовательности в молекулу целевой нуклеиновой кислоты клетка способна экспрессировать белок или РНК, кодируемую интегрированной последовательностью. В других вариантах осуществления после интеграции экзогенной последовательности в молекулу целевой нуклеиновой кислоты экспрессия интегрированной последовательности может регулироваться эндогенной промоторной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления экзогенная последовательность может обеспечивать последовательность кДНК, кодирующую белок или часть белка. В еще других вариантах осуществления экзогенная последовательность может содержать или состоять из последовательности экзона, последовательности интрона, регуляторной последовательности, транскрипционной контрольной последовательности, трансляционной контрольной последовательности, сайта сплайсинга или некодирующей последовательности. В некоторых вариантах осуществления интеграция экзогенной последовательности может приводить к восстановлению функции гена. В некоторых вариантах осуществления интеграция экзогенной последовательности может приводить к нокину гена. В некоторых вариантах осуществления интеграция экзогенной последовательности может приводить к нокауту гена.

Матрица может быть любой подходящей длины. В некоторых вариантах осуществления матрица может содержать 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000 или более нуклеотидов в длину. Матрица может представлять собой одноцепочечную нуклеиновую кислоту. Матрица может представлять собой двухцепочечную или частично двухцепочечную нуклеиновую кислоту. В определенных вариантах осуществления длина одноцепочечной матрицы составляет 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 или 200 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления матрица может содержать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна части молекулы целевой нуклеиновой кислоты, содержащей целевую последовательность (то есть плечо гомологии). В некоторых вариантах осуществления матрица может содержать плечо гомологии, которое комплементарно последовательности, расположенной в прямом и обратном направлении от сайта расщепления на молекуле целевой нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления матрица содержит оцДНК или дцДНК, содержащие фланкирующие последовательности инвертированных концевых повторов (ITR). В некоторых вариантах осуществления матрица предложена в виде вектора, плазмиды, миникольца, нанокольца или продукта ПЦР.

Очистка нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту очищают. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту очищают с использованием метода осаждения (например, осаждения LiCl, осаждения спиртом или эквивалентного способа, например, как описано в данном документе). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту очищают с использованием метода на основе хроматографии, такого как метод на основе ВЭЖХ, или эквивалентный метод (например, как описано в данном документе). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту очищают с использованием как метода осаждения (например, осаждения LiCl), так и метода на основе ВЭЖХ.

Целевые последовательности.

В некоторых вариантах осуществления система CRISPR/Cas согласно данному описанию может быть направлена на целевую последовательность в молекуле целевой нуклеиновой кислоты и расщепляет ее. Например, целевая последовательность может распознаваться и расщепляться Cas-нуклеазой. В определенных вариантах осуществления целевая последовательность для Cas-нуклеазы расположена рядом с родственной последовательностью РАМ нуклеазы. В некоторых вариантах осуществления Casнуклеаза 2 класса может быть направлена при помощи гРНК на целевую последовательность молекулы целевой нуклеиновой кислоты, где гРНК гибридизуется с целевой последовательностью, и белок Cas

- 19 047139 класса 2 расщепляет ее. В некоторых вариантах осуществления гидовую РНК гибридизуют, и Casнуклеаза класса 2 расщепляет целевую последовательность, прилегающую к ее родственному РАМ или содержащую его. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может быть комплементарной нацеливающей последовательности гидовой РНК. В некоторых вариантах осуществления степень комплементарности между нацеливающей последовательностью гидовой РНК и частью соответствующей целевой последовательности, которая гибридизуется с гидовой РНК, может составлять около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности между нацеливающей последовательностью гидовой РНК и частью соответствующей целевой последовательности, которая гибридизуется с гидовой РНК, может составлять около 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 или 100%. В некоторых вариантах осуществления область гомологии мишени является смежной с родственной последовательностью РАМ. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать последовательность на 100% комплементарную нацеливающей последовательности гидовой РНК. В других вариантах осуществления целевая последовательность может содержать по меньшей мере одно несоответствие, делецию или вставку по сравнению с нацеливающей последовательностью гидовой РНК.

Длина целевой последовательности может зависеть от используемой нуклеазной системы. Например, нацеливающая последовательность гидовой РНК для системы CRISPR/Cas может содержать 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 или более 50 нуклеотидов в длину, и целевую последовательность имеет соответствующую длину, необязательно смежную с последовательностью РАМ. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать 15-24 нуклеотида в длину. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать 17-21 нуклеотид в длину. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать 20 нуклеотидов в длину. Когда используются никазы, целевая последовательность может содержать пару целевых последовательностей, распознаваемых парой никаз, которые расщепляют противоположные цепи молекулы ДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать пару целевых последовательностей, распознаваемых парой никаз, которые расщепляют одни и те же цепи молекулы ДНК. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать часть целевых последовательностей, распознаваемых одной или более Cas-нуклеазами.

Молекула целевой нуклеиновой кислоты может представлять собой любую молекулу ДНК или РНК, которая является эндогенной или экзогенной для клетки. В некоторых вариантах осуществления молекула целевой нуклеиновой кислоты может представлять собой эписомальную ДНК, плазмиду, геномную ДНК, вирусный геном, митохондриальную ДНК или хромосомную ДНК из клетки или в клетке. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность молекулы целевой нуклеиновой кислоты может представлять собой геномную последовательность из клетки или в клетке, включая клетку человека.

В дополнительных вариантах осуществления целевая последовательность может представлять собой вирусную последовательность. В других вариантах осуществления целевая последовательность может представлять собой последовательность патогена. В еще других вариантах осуществления целевая последовательность может представлять собой синтезированную последовательность. В дополнительных вариантах осуществления целевая последовательность может представлять собой хромосомную последовательность. В определенных вариантах осуществления целевая последовательность может содержать транслокационную вставку, например транслокацию, связанную с раком. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может находиться на эукариотической хромосоме, такой как человеческая хромосома. В определенных вариантах осуществления целевая последовательность представляет собой специфическую для печени последовательность, в которой она экспрессируется в клетках печени.

В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может быть расположена в кодирующей последовательности гена, интронной последовательности гена, регуляторной последовательности, транскрипционной контрольной последовательности гена, трансляционной контрольной последовательности гена, сайте сплайсинга или некодирующей последовательности между генами. В некоторых вариантах осуществления ген может представлять собой ген, кодирующий белок. В других вариантах осуществления ген может представлять собой ген, который не кодирует РНК. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может содержать весь ген, ассоциированный с заболеванием, или его часть. В некоторых вариантах осуществления целевая последовательность может быть расположена в негенном функциональном сайте в геноме, например в сайте, который контролирует аспекты организации хроматина, такие как сайт каркаса или локусные регуляторные области.

В вариантах осуществления, включающих Cas-нуклеазу, такую как нуклеаза класса 2, целевая последовательность может быть смежной с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (РАМ). В некоторых вариантах осуществления РАМ может находиться рядом или в пределах 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов 3'конца последовательности. Длина и последовательность РАМ могут зависеть от используемого белка Cas. Например, РАМ может быть выбран из консенсусной или конкретной последовательности РАМ для

- 20 047139 конкретного белка Cas9 или ортолога Cas9, включая те, которые приведены на фиг. 1 из Ran et al., Nature, 520: 186-191 (2015) и на фиг. S5 из Zetsche 2015, соответствующее описание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления РАМ может иметь длину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Неограничивающие иллюстративные последовательности РАМ включают NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN и NNNNGATT (где N определен как любой нуклеотид, a W определен или как А, или как Т). В некоторых вариантах осуществления последовательность РАМ может представлять собой NGG. В некоторых вариантах осуществления последовательность РАМ может представлять собой NGGNG. В некоторых вариантах осуществления последовательность РАМ может представлять собой TTN. В некоторых вариантах осуществления последовательность РАМ может представлять собой NNAAAAW.

Липидный состав.

В данном документе описаны различные варианты составов LNP для РНК, включая карго CRISPR/Cas. Такие составы LNP содержат аминолипид наряду со вспомогательным липидом, нейтральным липидом и ПЭГ-липидом. В некоторых вариантах осуществления такие составы LNP содержат аминолипид вместе с вспомогательным липидом и ПЭГ-липидом. В некоторых вариантах осуществления составы LNP содержат менее 1 процент нейтрального фосфолипида. В некоторых вариантах осуществления составы LNP содержат менее 0,5 процент нейтрального фосфолипида. Под липидной наночастицей подразумевается частица, которая содержит множество (то есть более одной) молекул липидов, физически связанных друг с другом межмолекулярными силами.

Аминолипиды.

Композиции LNP для доставки биологически активных агентов содержат аминолипид, который определяется как Липид А или его эквиваленты, включая ацеталевые аналоги Липида А.

В некоторых вариантах осуществления аминолипид представляет собой Липид А, который представляет собой (9Z, 12Z)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил) пропилооктадека-9,12-диеноат, также называемый 3((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил (9Z, 122)-октадека-9,12-диеноат.

Липид А может быть изображен как:

О

Липид А может быть синтезирован в соответствии с WO 2015/095340 (например, с. 84-86). В определенных вариантах осуществления аминолипид представляет собой эквивалент Липида А.

В определенных вариантах осуществления аминолипид представляет собой аналог Липида А. В определенных вариантах осуществления аналог Липида А представляет собой ацеталевый аналог Липида А. В конкретных композициях LNP ацеталевый аналог представляет собой С4-С12 ацеталевый аналог. В некоторых вариантах осуществления ацеталевый аналог представляет собой С5-С12 ацеталевый аналог. В дополнительных вариантах осуществления ацеталевый аналог представляет собой С5-С10 ацеталевый аналог. В других вариантах осуществления ацеталевый аналог выбирают из С4, С5, С6, С7, С9, С10, С11 и С12 ацеталевого аналога.

Аминолипиды, подходящие для применения в LNP, описанных в данном документе, являются биоразлагаемыми in vivo и пригодными для доставки биологически активного агента, такого как РНК, в клетку. Аминолипиды имеют низкую токсичность (например, переносятся на животных моделях без вредного воздействия в количестве, превышающем или равном 10 мг/кг РНК-карго). В определенных вариантах осуществления LNP, содержащие аминолипид, включают те, для которых по меньшей мере 75% аминолипида выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 суток. В определенных вариантах осуществления LNP, содержащие аминолипид, включают те, для которых по меньшей мере 50% мРНК или гРНК выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 суток. В определенных вариантах осуществления LNP, содержащие аминолипид, включают те, для которых по меньшей мере 50% LNP выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 суток, например, путем измерения липида (например, аминолипида), РНК (например, мРНК) или другого компонента. В определенных вариантах осуществления измеряется инкапсулированный в липид и свободный от липида, компонент из LNP в виде РНК или нуклеиновой кислоты.

Клиренс липидов может быть измерен, как описано в литературе. См. Maier, М.А., et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 (Maier). Например, в Maier системы LNP-киРНК, содержащие киРНК, нацеленную на люциферазы, вводили самцам мышей С57В1/6 в возрасте от шести до восьми недель в дозе 0,3 мг/кг путем внутривенной болюсной инъекции через латеральную хвостовую вену. Образцы крови,

- 21 047139 печени и селезенки отбирали через 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 и 168 ч после введения дозы. Мышей перфузировали физиологическим раствором перед отбором ткани, и образцы крови обрабатывали для получения плазмы. Все образцы обрабатывали и анализировали методом ЖХ/МС. Кроме того, в Maier описывают процедуру оценки токсичности после введения составов LNP-киРНК. Например, киРНК, нацеленную на люциферазу, вводили в дозах 0, 1, 3, 5 и 10 мг/кг (5 животных на группу) путем однократного внутривенного болюсного введения в объеме дозы 5 мл/кг самцам крыс линии СпрегДоули. Через 24 ч из яремной вены у бодрствующих животных получали около 1 мл крови и выделяли сыворотку. Через 72 ч после введения дозы всех животных подвергали умерщвлению для вскрытия. Были проведены оценки клинических проявлений, массы тела, химического состава сыворотки, массы органов и гистопатологии. Хотя в Maier описывают методы оценки составов киРНК-LNP, эти методы могут применяться для оценки клиренса, фармакокинетики и токсичности введения композиций LNP согласно данному изобретению.

Аминолипиды могут приводить к увеличению скорости клиренса. В некоторых вариантах осуществления скорость клиренса представляет собой скорость клиренса липидов, например скорость, с которой липид выводится из крови, сыворотки или плазмы. В некоторых вариантах осуществления скорость клиренса представляет собой скорость клиренса РНК, например скорость, с которой мРНК или гРНК выводится из крови, сыворотки или плазмы. В некоторых вариантах осуществления скорость клиренса представляет собой скорость, с которой LNP выводится из крови, сыворотки или плазмы. В некоторых вариантах осуществления скорость клиренса представляет собой скорость, с которой LNP выводится из ткани, такой как ткань печени или ткани селезенки. В определенных вариантах осуществления высокая скорость клиренса приводит к профилю безопасности без существенных побочных эффектов. Аминолипиды могут уменьшать накопление LNP в системе кровообращения и в тканях. В некоторых вариантах осуществления уменьшение накопления LNP в системе кровообращения и в тканях приводит к профилю безопасности без существенных побочных эффектов.

Аминолипиды согласно данному описанию являются ионизируемыми (например, могут образовывать соль) в зависимости от рН среды, в которой они находятся. Например, в слабокислой среде аминолипиды могут протонироваться и, таким образом, нести положительный заряд. И наоборот, в слабоосновной среде, такой как, например, кровь, где рН составляет приблизительно 7,35, аминолипиды могут не протонироваться и, следовательно, не нести заряд. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному описанию могут быть протонированы при рН по меньшей мере около 9. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному описанию могут быть протонированы при рН по меньшей мере около 9. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному описанию могут быть протонированы при рН по меньшей мере около 10.

рН, при котором аминолипид преимущественно протонирован, связан с его собственным рКа. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному изобретению могут, каждый независимо, иметь рКа в диапазоне от около 5,1 до около 7,4. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному изобретению могут, каждый независимо, иметь рКа в диапазоне от около 5,5 до около 6,6. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному изобретению могут, каждый независимо, иметь рКа в диапазоне от около 5,6 до около 6,4. В некоторых вариантах осуществления аминолипиды согласно данному изобретению могут, каждый независимо, иметь рКа в диапазоне от около 5,8 до около 6,2. Например, аминолипиды согласно данному изобретению могут, каждый независимо, иметь рКа в диапазоне от около 5,8 до около 6,5. Значение рКа аминолипида может быть важным фактором при составлении LNP, поскольку было обнаружено, что катионные липиды с рКа в диапазоне от около 5,1 до около 7,4 эффективны для доставки карго in vivo, например, в печень. Кроме того, было обнаружено, что катионные липиды с рКа в диапазоне от около 5,3 до около 6,4 эффективны для доставки in vivo, например в опухоли. См., например, WO 2014/136086.

Дополнительные липиды.

Нейтральные липиды, подходящие для применения в липидной композиции согласно описанию, включают, например, различные нейтральные, незаряженные или цвиттер-ионные липиды. Примеры нейтральных фосфолипидов, пригодных для применении в данном описании, включают, но не ограничиваются ими, 5-гептадецилбензол-1,3-диол (резорцин), дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ), фосфохолин (ДОФХ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), фосфатидилхолин (ПЛФХ), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДАФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), яичный фосфатидилхолин (яФХ), дилаурилоилфосфатидилхолин (ДЛФХ), димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (МПФХ), 1-пальмитоил-2миристоилфосфатидилхолин (ПМФХ), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (ПСФХ), 1,2диарахиgоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДБФХ) 1-стеароил-2-пальмитоил фосфатидилхолин (СПФХ), 1,2-диэйкозеноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (ДЭФХ), пальмитоилолеоил фосфатидилхолин (ПОФХ), лизофосфатидилхолин, диолеоил фосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), дилинолеоилфосфатидилхолин дистеароилфосфатидилэтаноламин (ДСФЭ), димиристоил фосфатидилэтаноламин (ДМФЭ), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (ДПФЭ), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (ПОФЭ), лизофосфатидилэтаноламин и их комбинации. В одном варианте осуществления нейтральный фосфолипид может быть

- 22 047139 выбран из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (ДСФХ) и димиристоилфосфатидилэтаноламина (ДМФЭ). В другом варианте осуществления нейтральный фосфолипид может представлять собой дистеароилфосфатидилхолин (ДСФХ). В другом варианте осуществления нейтральный фосфолипид может представлять собой дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ).

Вспомогательные липиды включают стеролы, стерины и алкилрезорцины.

Вспомогательные липиды, подходящие для применения в данном описании, включают, но не ограничиваются ими, холестерин, 5-гептадецилрезорцин и гемисукцинат холестерина. В одном варианте осуществления вспомогательный липид может представлять собой холестерин. В одном варианте осуществления вспомогательный липид может представлять собой гемисукцинат холестерина.

ПЭГ-липиды представляют собой липиды-невидимки, которые изменяют продолжительность времени, в течение которого наночастицы могут существовать in vivo (например, в крови). ПЭГ-липиды могут способствовать процессу изготовления состава, например, путем снижения агрегации частиц и контроля размера частиц. Используемые в данном документе ПЭГ-липиды могут модулировать фармакокинетические свойства LNP. Как правило, ПЭГ-липид содержит липидный фрагмент и полимерный фрагмент на основе ПЭГ.

В некоторых вариантах осуществления липидный фрагмент может быть получен из диацилглицерина или диацилгликамида, включая те, которые содержат диалкилглицериновую или диалкилгликамидную группу, имеющую длину алкильной цепи, независимо содержащую от около С4 до около С40 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, причем цепь может содержать одну или более функциональных групп, таких как, например, амид или сложный эфир. В некоторых вариантах осуществления длина алкильной цепи составляет от около С10 до С20. Диалкилглицериновая или диалкилгликамидная группа может дополнительно содержать одну или более замещенных алкильных групп. Длина цепи может быть симметричной или асимметричной.

Если не указано иное, термин ПЭГ, используемый в данном документе, означает любой полиэтиленгликоль или другой полиалкиленэфирный полимер. В одном варианте осуществления фрагмент ПЭГ представляет собой необязательно замещенный линейный или разветвленный полимер этиленгликоля или этиленоксида. В определенных вариантах осуществления фрагмент ПЭГ представляет собой альтернативно фрагмент ПЭГ может быть замещен, например, одной или более алкильными, алкокси, ацильными, гидрокси или арильными группами. В одном варианте осуществления фрагмент ПЭГ включает сополимер ПЭГ, такой как ПЭГ-полиуретан или ПЭГ-полипропилен (см., например, J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)); альтернативно, фрагмент ПЭГ не включает сополимеры ПЭГ, например, он может быть монополимером ПЭГ. В одном варианте осуществления ПЭГ имеет молекулярную массу от около 130 до около 50000, в подварианте осуществления от около 150 до около 30000, в подварианте осуществления около 150 до около 20000, в подварианте осуществления от около 150 до около 15000, в подварианте осуществления от около 150 до около 10000, в подварианте осуществления от около 150 до около 6000, в подварианте осуществления от около 150 до около 5000, в подварианте осуществления от около 150 до около 4000 в подварианте осуществления от около 150 до около 3000, в подварианте осуществления от около 300 до около 3000, в подварианте осуществления от около 1000 до около 3000 и в подварианте осуществления от около 1500 до около 2500.

В определенных вариантах осуществления ПЭГ (например, конъюгированный с липидным фрагментом или липидом, таким как липид-невидимка) представляет собой ПЭГ-2К, также называемый ПЭГ 2000, который имеет среднюю молекулярную массу около 2000 дальтон. ПЭГ-2К представлен в данном документе следующей формулой (I), где n равен 45, что означает, что среднечисловая степень (I) полимеризации составляет около 45 субъединиц ^п . Однако могут быть использованы другие варианты осуществления ПЭГ, известные в данной области техники, включая, например, те, где среднечисловая степень полимеризации составляет около 23 субъединиц (n=23) и/или 68 субъединиц (n=68). В некоторых вариантах осуществления n может варьироваться от около 30 до около 60. В некоторых вариантах осуществления n может варьироваться от около 35 до около 55. В некоторых вариантах осуществления n может варьироваться от около 40 до около 50. В некоторых вариантах осуществления n может варьироваться от около 42 до около 48. В некоторых вариантах осуществления n может составлять 45. В некоторых вариантах осуществления R может быть выбран из Н, замещенного алкила и незамещенного алкила. В некоторых вариантах осуществления R может представлять собой незамещенный алкил. В некоторых вариантах осуществления R может представлять собой метил.

В любом из вариантов осуществления, описанных в данном документе, ПЭГ-липид может быть выбран из ПЭГ-дилауроилглицерина, ПЭГ-димиристоилглицерина (ПЭГ-ДМГ) (кат. № GM-020 от NOF, г. Токио, Япония), ПЭГ-дипальмитоилглицерин, ПЭГ-дистеароилглицерин (ПЭГ-ДСФЭ) (кат. № DSPE020CN, NOF, г. Токио, Япония), ПЭГ-дилаурилгликамид, ПЭГ-димиристилгликамид, ПЭГдипальмитоилгликамид и ПЭГ-дистеароилгликамид, ПЭГ-холестерин (1-[8'-(холест-5-ен-3 [бета]окси)карбоксамидо-3', 6'-диоксаоктанил] карбамоил-[омега]-метил-поли(этиленгликоль), ПЭГ-ДМБ (3,4

- 23 047139 дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликолевый)эфир), 1,2-димиристоил^п-глицеро-3фосфоэтаноламин^-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000| (ПЭГ2к-ДМГ) (кат. № 880150Р от Avanti Polar Lipids, г. Алабастер, штат Алабама, США), 1,2-дистеароил^п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-№ [метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (ПЭГ2к-ДСФЭ) (кат. № 880120С от Avanti Polar Lipids, г. Алабастер, штат Алабама, США), 1.2-дистеароил^п-глицерин. метоксиполиэтиленгликоль (ПЭГ2к-ДСГ; GS-020, NOF, г. Токио, Япония), поли(этиленгликоль)-2000-диметакрилат (ПЭГ2к-ДМА) и 1,2дистеарилоксипропил-.3-амин^-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000| (ПЭГ2к-ДСА). В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-ДМГ. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-ДСГ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-ДСФЭ. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-ДМА. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-С-ДСФЭ. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой соединение S027, описанное в WO2016/010840 в параграфах с [00240] по [00244]. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-ДСА. В одном варианте осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-С11. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-С14. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-С16. В некоторых вариантах осуществления ПЭГ-липид может представлять собой ПЭГ2к-С18.

Составы LNP.

Варианты осуществления обеспечивают липидные композиции, описанные в соответствии с соответствующими молярными соотношениями компонентов липидов в составе. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 30 до около 60 мол.% мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 40 до около 60 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 45 до около 60 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 50 до около 60 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 55 до около 60 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять от около 50 до около 55 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять около 50 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% аминолипида может составлять около 55 мол.%. В некоторых вариантах осуществления мол.% аминолипида в партии LNP будет составлять ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% или ±2,5% от целевого мол.%. В некоторых вариантах осуществления мол.% аминолипида в партии LNP будет составлять ±4 мол.%, ±3 мол.%, ±2 мол.%, ±1,5 мол.%, ±1 мол.%, ±0,5 мол.% мол.% или ±0,25 мол.% от целевого мол.%. Все числа мол.% приведены в виде доли липидного компонента в композициях LNP. В определенных вариантах осуществления вариабельность между партиями LNP мол.% аминолипида будет составлять менее 15%, менее 10% или менее 5%.

В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 5 до около 15 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 7 до около 12 мол.% В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 0 до около 5 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 0 мол.% до около 10 мол.% В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 5 до около 10 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 8 мол.% до около 10 мол.%.

В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14 или около 15 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять около 9 мол.%.

В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять от около 1 до около 5 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида может составлять от около 0,1 до около 1 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, такого как нейтральный фосфолипид, может составлять около 0,1, около 0,2, около 0,5, 1, около 1,5, около 2, около 2,5, около 3, около 3,5, около 4, около 4,5 или около 5 мол.%.

В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять менее чем около 1 мол.%. В одном варианте осуществления моль.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять менее чем 0,5 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида, может составлять около 0 мол.%, около 0,1 мол.%, около 0,2 мол.%, около 0,3 мол.%, около 0,4 мол.%, около 0,5 мол.%, около 0,6 мол.%, около 0,7 мол.%, около 0,8 мол.%, около 0,9 мол.% или около 1 мол.%. В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, не содержат нейтральный липид (то есть 0 мол.% нейтрального липида). В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в дан

- 24 047139 ном документе, по существу не содержат нейтральный липид (то есть около 0 мол.% нейтрального липида). В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, не содержат нейтральный фосфолипид (то есть 0 мол.% нейтрального фосфолипида). В некоторых вариантах осуществления составы, описанные в данном документе, по существу не содержат нейтральный фосфолипид (то есть около 0 мол.% нейтрального фосфолипида).

В некоторых вариантах осуществления мол.% нейтрального липида в партии LNP будет составлять ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% или ±2,5% от целевого мол.% нейтрального липида. В определенных вариантах осуществления вариабельность между партиями LNP будет составлять менее 15%, менее 10% или менее 5%.

В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 20 мол.% до около 60 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 25 мол.% до около 55 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 25 мол.% до около 50 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 25 мол.% до около 40 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 30 мол.% до около 50 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида может составлять от около 30 мол.% до около 40 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида регулируют на основе концентраций аминолипида, нейтрального липида и ПЭГ-липида, чтобы довести липидный компонент до 100 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида регулируют на основе концентраций аминолипида и ПЭГ-липида, чтобы довести липидный компонент до 100 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% вспомогательного липида регулируют на основе концентраций аминолипида и ПЭГ, чтобы довести липидный компонент до 99 мол.%. В некоторых вариантах осуществления мол.% вспомогательного липида в партии LNP будет составлять ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% или ±2,5% от целевого мол.%. В определенных вариантах осуществления вариабельность между партиями LNP будет составлять менее 15%, менее 10% или менее 5%.

В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять от около 1 до около 10 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять от около 2 до около 10 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять от около 2 до около 8 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять от около 2 до около 4 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять от около 2,5 до около 4 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять около 3 мол.%. В одном варианте осуществления мол.% ПЭГ-липида может составлять около 2,5 мол.%. В некоторых вариантах осуществления мол.% ПЭГ-липида в партии LNP будет составлять ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% или ±2,5% от целевого мол.% ПЭГ-липида. В определенных вариантах осуществления вариабельность между партиями LNP будет составлять менее 15%, менее 10% или менее 5%.

В определенных вариантах осуществления карго содержит мРНК, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент (например, Cas-нуклеазу, Cas-нуклеазу класса 2 или Cas9), и гРНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гРНК, или комбинацию мРНК и гРНК. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать Липид А или его эквиваленты. В некоторых аспектах аминолипид представляет собой Липид А. В некоторых аспектах аминолипид представляет собой эквивалент Липида А, например аналог Липида А. В некоторых аспектах аминолипид представляет собой ацеталевый аналог Липида А. В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, нейтральный липид, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В определенных вариантах осуществления вспомогательный липид представляет собой холестерин. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДСФХ. В конкретных вариантах осуществления ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать Липид А, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, ДСФХ, холестерин и ПЭГ-липид. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP содержит ПЭГ-липид, содержащий ДМГ. В определенных вариантах осуществления аминолипид выбран из Липида А и эквивалента Липида А, включая ацеталевый аналог Липида А. В дополнительных вариантах осуществления композиция LNP содержит Липид А, холестерин, ДСФХ и ПЭГ2к-ДМГ.

В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный фосфолипид и ПЭГ-липид. В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит липидный компонент, который состоит из аминолипида, вспомогательного липида, нейтрального липида и ПЭГ-липида. В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В определенных вариантах осуществления композиция LNP не содержит нейтральный липид, такой как нейтральный фосфолипид. В различных вариантах осуществления композиция LNP содержит липидный компонент, который состоит из аминолипида, вспомогательного липида и ПЭГ-липида. В определенных вариантах

- 25 047139 осуществления нейтральный липид выбирают из одного или более из ДСФХ, ДПФХ, ДАФХ, ДМФХ, ДОФХ, ДОФЭ, и ДСФЭ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДСФХ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДПФХ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДАФХ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДМФХ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДОФХ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДОФЭ. В определенных вариантах осуществления нейтральный липид представляет собой ДСФЭ. В определенных вариантах осуществления вспомогательный липид представляет собой холестерин. В конкретных вариантах осуществления ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать Липид А, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, который состоит из Липида А, вспомогательного липида и ПЭГлипида. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP содержит аминолипид, холестерин и ПЭГ-липид. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP содержит липидный компонент, который состоит из аминолипида, холестерина и ПЭГ-липида. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP содержит ПЭГ-липид, содержащий ДМГ. В определенных вариантах осуществления аминолипид выбран из Липида А и эквивалента Липида А, включая ацеталевый аналог Липида А. В определенных вариантах осуществления аминолипид представляет собой С5-С12 или С4-С12 ацеталевый аналог Липида А. В дополнительных вариантах осуществления композиция LNP содержит Липид А, холестерин и ПЭГ2к-ДМГ.

Варианты осуществления данного изобретения также обеспечивают липидные композиции, описанные в соответствии с молярным соотношением между положительно заряженными аминогруппами аминолипида (N) и отрицательно заряженными фосфатными группами (Р) нуклеиновой кислоты, которая должна быть инкапсулирована. Это может быть математически представлено уравнением N/P. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, который содержит аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид; и компонент нуклеиновой кислоты, причем соотношение N/P составляет от около 3 до 10. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, который содержит аминолипид, вспомогательный липид и ПЭГ-липид; и компонент нуклеиновой кислоты, причем соотношение N/P составляет от около 3 до 10. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, который содержит аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный липид и вспомогательный липид; и РНК-компонент, причем соотношение N/P составляет от около 3 до 10. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, который содержит аминолипид, вспомогательный липид, и ПЭГ-липид; и РНК-компонент, причем соотношение N/P составляет от около 3 до 10. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять от около 5 до 7. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять от около 3 до 7. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять от около 4,5 до 8. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять около 6. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять 6 ±1. В одном варианте осуществления соотношение N/P может составлять 6±0,5. В некоторых вариантах осуществления соотношение N/P будет составлять ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% или ±2,5% от целевого соотношения N/P. В определенных вариантах осуществления вариабельность между партиями LNP будет составлять менее 15%, менее 10% или менее 5%.

В некоторых вариантах осуществления компонент нуклеиновой кислоты, например РНКкомпонент, может содержать мРНК, такую как мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу. РНК-компонент включает РНК, необязательно с дополнительной нуклеиновой кислотой и/или белком, например, РНПкарго. В одном варианте осуществления РНК содержит мРНК Cas9. В некоторых композициях, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, LNP дополнительно содержит нуклеиновую кислоту гРНК, такую как гРНК. В некоторых вариантах осуществления РНК-компонент содержит мРНК Cas-нуклеазы и гРНК. В некоторых вариантах осуществления РНК-компонент содержит мРНК Cas-нуклеазы 2 класса и гРНК.

В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, аминолипид, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В некоторых композициях LNP, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, вспомогательный липид представляет собой холестерин. В других композициях, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, нейтральный липид представляет собой ДСФХ. В дополнительных вариантах осуществления, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза 2 класса, ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ или ПЭГ2к-С11. В конкретных композициях, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Casнуклеаза класса 2, аминолипид выбран из Липида А и его эквивалентов, таких как ацеталевый аналог

- 26 047139

Липида А.

В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать гРНК. В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать аминолипид, гРНК, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать аминолипид, гРНК, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В некоторых композициях LNP, содержащих гРНК, вспомогательный липид представляет собой холестерин. В некоторых композициях, содержащих гРНК, нейтральный липид представляет собой ДСФХ. В дополнительных вариантах осуществления, содержащих гРНК, ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ или ПЭГ2к-С11. В определенных вариантах осуществления аминолипид выбран из Липида А и его эквивалентов, таких как ацеталевый аналог Липида А.

В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать огРНК. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать огРНК Cas9. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать огРНК Cpf1. В некоторых композициях, содержащих огРНК, LNP содержит аминолипид, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В некоторых композициях, содержащих огРНК, LNP содержит аминолипид, вспомогательный липид и ПЭГ-липид. В определенных композициях, содержащих огРНК, вспомогательный липид представляет собой холестерин. В других композициях, содержащих огРНК, нейтральный липид представляет собой ДСФХ. В дополнительных вариантах осуществления, содержащих огРНК, ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ или ПЭГ2кС11. В определенных вариантах осуществления аминолипид выбран из Липида А и его эквивалентов, таких как ацеталевые аналоги Липида А.

В определенных вариантах осуществления композиция LNP содержит мРНК, кодирующую Casнуклеазу, и гРНК, которая может представлять собой огРНК. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать аминолипид, мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, гРНК, вспомогательный липид, нейтральный липид и ПЭГ-липид. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, состоящий из аминолипида, вспомогательного липида, нейтрального липида и ПЭГ-липида; и компонент нуклеиновой кислоты, состоящий из мРНК, кодирующей Cas-нуклеазу, и гРНК. В одном варианте осуществления композиция LNP может содержать липидный компонент, состоящий из аминолипида, вспомогательного липида и ПЭГ-липида; и компонент нуклеиновой кислоты, состоящий из мРНК, кодирующей Cas-нуклеазу, и гРНК. В некоторых композициях, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, и гРНК, вспомогательный липид представляет собой холестерин. В некоторых композициях, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, и гРНК, нейтральный липид представляет собой ДСФХ. Некоторые композиции, содержащие мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, и гРНК, содержат менее чем около 1 мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида. Некоторые композиции, содержащие мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, и гРНК, содержат менее чем около 0,5 мол.% нейтрального липида, например нейтрального фосфолипида. В некоторых композициях LNP не содержит нейтральный липид, например нейтральный фосфолипид. В дополнительных вариантах осуществления, содержащих мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, и гРНК, ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ или ПЭГ2к-С11. В определенных вариантах осуществления аминолипид выбран из Липида А и его эквивалентов, таких как ацеталевые аналоги Липида А.

В определенных вариантах осуществления композиции LNP содержат мРНК Cas-нуклеазы, такую как мРНК Cas класса 2, и по меньшей мере одну гРНК. В определенных вариантах осуществления композиция LNP имеет соотношение гРНК к мРНК Cas-нуклеазы, такой как мРНК Cas-нуклеазы класса 2, от около 25:1 до около 1:25. В определенных вариантах осуществления состав LNP имеет соотношение гРНК к мРНК Cas-нуклеазы, такой как мРНК Cas-нуклеазы класса 2, от около 10:1 до около 1:10. В определенных вариантах осуществления состав LNP имеет соотношение гРНК к мРНК Cas-нуклеазы, такой как мРНК Cas-нуклеазы класса 2, от около 8:1 до около 1:8. Измеряемые в данном документе соотношения являются массовыми. В некоторых вариантах осуществления состав LNP имеет соотношение гРНК к мРНК Cas-нуклеазы, такой как мРНК Cas класса 2, от около 5:1 до около 1:5. В некоторых вариантах осуществления диапазон соотношений составляет от около 3:1 до 1:3, от около 2:1 до 1:2, от около 5:1 до 1:2, от около 5:1 до 1:1, от около 3:1 до 1:2, от около 3:1 до 1:1, около 3:1, от около 2:1 до 1:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение гРНК к мРНК составляет около 3:1 или около 2:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение гРНК к мРНК Cas-нуклеазы, такой как Cas-нуклеаза класса 2, составляет около 1:1. Соотношение может составлять около 25:1, 10:1,5:1,3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 или 1:25.

Композиции LNP, описанные в данном документе, могут содержать матричную нуклеиновую кислоту. Матричную нуклеиновую кислоту можно комбинировать в составе с мРНК, кодирующей Casнуклеазу, такой как мРНК Cas-нуклеазы класса 2. В некоторых вариантах осуществления матрична я нуклеиновая кислота может быть совместно составлена с гидовой РНК. В некоторых вариантах осуществления матричная нуклеиновая кислота может быть комбинирована в составе как с мРНК, кодирующей Cas-нуклеазу, так и с гидовой РНК. В некоторых вариантах осуществления матричная нуклеиновая кислота может быть составлена отдельно от мРНК, кодирующей Cas-нуклеазу, или гидовой РНК. Матричная нуклеиновая кислота может быть доставлена вместе или отдельно от композиций LNP. В некоторых

- 27 047139 вариантах осуществления матричная нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной, в зависимости от желаемого механизма репарации. Матрица может иметь области гомологии с целевой ДНК или с последовательностями, смежными с целевой ДНК.

В некоторых вариантах осуществления LNP получают путем смешивания водного раствора РНК с раствором липида на основе органического растворителя, например 100% этанола. Подходящие растворы или растворители включают или могут содержать: воду, PBS, Трис-буфер, NaCl, цитратный буфер, этанол, хлороформ, диэтиловый эфир, циклогексан, тетрагидрофуран, метанол, изопропанол. Может быть использован фармацевтически приемлемый буфер, например, для введения LNP in vivo. В определенных вариантах осуществления буфер используется для поддержания рН композиции, содержащей LNP, при рН 6,5 или выше. В определенных вариантах осуществления буфер используется для поддержания рН композиции, содержащей LNP, при рН 7,0 или выше. В определенных вариантах осуществления композиция имеет рН в диапазоне от около 7,2 до около 7,7. В дополнительных вариантах осуществления композиция имеет рН в диапазоне от около 7,3 до около 7,7 или в диапазоне от около 7,4 до около 7,6. В других вариантах осуществления композиция имеет рН около 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6 или 7,7. Значение рН композиции может быть измерено с помощью микродетектора рН. В определенных вариантах осуществления криопротектор включен в композицию. Неограничивающие примеры криопротекторов включают сахарозу, трегалозу, глицерин, ДМСО и этиленгликоль. Иллюстративные композиции могут содержать до 10% криопротектора, такого как, например, сахароза. В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% криопротектора. В определенных вариантах осуществления композиция LNP может содержать около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% сахарозы. В некоторых вариантах осуществления композиция LNP может содержать буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер может содержать фосфатный буфер (PBS), Трис-буфер, цитратный буфер или их смеси. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления буфер содержит NaCl. В определенных вариантах осуществления NaCl не используется. Иллюстративные количества NaCl могут варьироваться от около 20 до около 45 мМ. Иллюстративные количества NaCl могут варьироваться от около 40 до около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления количество NaCl составляет около 45 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер представляет собой Трис-буфер. Иллюстративные количества Трис могут варьироваться от около 20 до около 60 мМ. Иллюстративные количества Трис могут варьироваться от около 40 до около 60 мМ. В некоторых вариантах осуществления количество Трис составляет около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер содержит NaCl и Трис. Некоторые иллюстративные варианты осуществления композиций LNP содержат 5% сахарозы и 45 мМ NaCl в Трис-буфере. В других иллюстративных вариантах осуществления композиции содержат сахарозу в количестве около 5% мас./об., около 45 мМ NaCl и около 50 мМ Трис при рН 7,5. Количество соли, буфера и криопротектора может варьироваться таким образом, чтобы поддерживать осмоляльность всего состава. Например, конечная осмоляльность может поддерживаться на уровне менее 450 мОсм/л. В других вариантах осуществления осмоляльность составляет от 350 до 250 мОсм/л. Некоторые варианты осуществления имеют конечную осмоляльность 300 +/- 20 мОсм/л.

В некоторых вариантах осуществления используют микрожидкостное смешивание, Т-смешивание или перекрестное смешивание. В определенных аспектах могут варьироваться скорости потока, размер соединения, геометрия соединения, форма соединения, диаметр трубки, растворы и/или концентрации РНК и липидов. LNP или композиции LNP можно концентрировать или очищать, например, с помощью диализа, тангенциальной поточной фильтрации или хроматографии. LNP могут храниться, например, в виде суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка. В некоторых вариантах осуществления композицию LNP хранят при 2-8°С, в определенных аспектах композиции LNP хранят при комнатной температуре. В дополнительных вариантах осуществления композицию LNP хранят в замороженном виде, например при -20 или -80°С. В других вариантах осуществления композицию LNP хранят при температуре в диапазоне от около 0 до около -80°С. Замороженные композиции LNP можно размораживать перед использованием, например на льду, при комнатной температуре или при 25°С.

LNP могут представлять собой, например, микросферические частицы (включая однослойные и многослойные везикулы, например липосомы - липидные бислои с ламеллярной фазой, которые, в некоторых вариантах осуществления, являются по существу сферическими и, в более конкретных вариантах осуществления, могут содержать водное ядро, например, содержащее значительную часть молекул РНК), дисперсную фазу в эмульсии, мицеллы или дисперсную фазу в суспензии.

Более того, композиции LNP являются биоразлагаемыми, поскольку они не накапливаются до цитотоксических уровней in vivo в терапевтически эффективной дозе. В некоторых вариантах осуществления композиции LNP не вызывают врожденный иммунный ответ, который приводит к существенным побочным эффектам на уровне терапевтической дозы. В некоторых вариантах осуществления композиции LNP, предложенные в данном документе, не вызывают токсичности на уровне терапевтической дозы.

В некоторых вариантах осуществления значение pdi может находиться в диапазоне от около 0,005 до около 0,75. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около 0,01 до

- 28 047139 около 0,5. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,4. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,35. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,35. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,3. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,25. В некоторых вариантах осуществления pdi может находиться в диапазоне от около нуля до около 0,2. В некоторых вариантах осуществления pdi может составлять менее чем около 0,08, 0,1, 0,15, 0,2 или 0,4.

Описанные в данном документе LNP имеют размер (например, Z-средний диаметр) от около 1 до около 250 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 10 до около 200 нм. В дополнительных вариантах осуществления LNP имеют размер от около 20 до около 150 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 50 до около 150 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 50 до около 100 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 50 до около 120 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 60 до около 100 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 75 до около 150 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 75 до около 120 нм. В некоторых вариантах осуществления LNP имеют размер от около 75 до около 100 нм. Если не указано иное, все размеры, упомянутые в данном документе, представляют собой средние размеры (диаметры) полностью сформированных наночастиц, измеренные путем динамического рассеяния света на приборе Malvern Zetasizer. Образец наночастиц разбавляют в фосфатно-солевом буфере (PBS), так что интенсивность составляет приблизительно 200-400 килоимпульсов в секунду. Данные представлены в виде средневзвешенного показателя интенсивности (Z-средний диаметр).

В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней эффективностью инкапсуляции в диапазоне от около 50 до около 100%. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней эффективностью инкапсуляции в диапазоне от около 50 до около 70%. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней эффективностью инкапсуляции в диапазоне от около 70 до около 90%. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней эффективностью инкапсуляции в диапазоне от около 90 до около 100%. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней эффективностью инкапсуляции в диапазоне от около 75 до около 95%.

В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней молекулярной массой в диапазоне от около 1,00Е+05 г/моль до около 1,00Е+10 г/моль. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней молекулярной массой в диапазоне от около 5,00Е+05 г/моль до около 7,00Е+07 г/моль. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней молекулярной массой в диапазоне от около 1,00Е+06 г/моль до около 1,00Е+10 г/моль. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней молекулярной массой в диапазоне от около 1,00Е+07 г/моль до около 1,00Е+09 г/моль. В некоторых вариантах осуществления LNP образуются со средней молекулярной массой в диапазоне от около 5,00Е+06 г/моль до около 5,00Е+09 г/моль.

В некоторых вариантах осуществления полидисперсность (Mw/Mn; соотношение среднемассовой молярной массы (Mw) к среднечисловой молярной массе (Mn)) может составлять от около 1,000 до около 2,000. В некоторых вариантах осуществления Mw/Mn может находиться в диапазоне от около 1,00 до около 1,500. В некоторых вариантах осуществления Mw/Mn может находиться в диапазоне от около 1,020 до около 1,400. В некоторых вариантах осуществления Mw/Mn может находиться в диапазоне от около 1,010 до около 1,100. В некоторых вариантах осуществления Mw/Mn может находиться в диапазоне от около 1,100 до около 1,350.

Способы конструирования клеток; сконструированные клетки.

Композиции LNP, описанные в данном документе, могут быть использованы в способах конструирования клеток посредством редактирования генов как in vivo, так и in vitro. В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение в контакт клетки с композицией LNP, описанной в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение в контакт клетки с субъектом, таким как млекопитающее, такое как человек. В некоторых вариантах осуществления клетка находится в органе, таком как печень, такой как печень млекопитающего, такой как печень человека. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку печени, такую как клетка печени млекопитающего, такая как клетка печени человека. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой гепатоцит, такой как гепатоцит млекопитающего, такой как гепатоцит человека. В некоторых вариантах осуществления клетка печени представляет собой стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка печени человека может представлять собой синусоидальную эндотелиальную клетку печени (LSEC). В некоторых вариантах осуществления клетка печени человека может представлять собой клетку Купфера. В некоторых вариантах осуществления клетка печени человека может представлять собой звездчатую клетку печени. В некоторых вариантах осуществления клетка печени человека может представлять собой опухолевую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка печени человека может представлять собой стволовую клетку печени. В дополнительных вариантах

- 29 047139 осуществления клетка содержит АроЕ-связывающие рецепторы. В некоторых вариантах осуществления клетка печени, такая как гепатоцит, находится in situ. В некоторых вариантах осуществления клетку печени, такую как гепатоцит, выделяют, например, в культуре, такой как в первичной культуре. Также предложены способы, соответствующие применениям, раскрытым в данном документе, которые включают введение композиций LNP, описанных в данном документе, субъекту или приведение в контакт клетки, подобной описанным выше, с композициями LNP, описанными в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления предложены сконструированные клетки, например сконструированная клетка, полученная из любого типа клеток в предыдущем абзаце. Такие сконструированные клетки получают в соответствии со способами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления сконструированная клетка находится внутри ткани или органа, например печени у субъекта.

В некоторых способах и клетках, описанных в данном документе, клетка содержит модификацию, например инсерцию или делецию (индел), или замену нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит вставку 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов в целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит вставку 1 или 2 нуклеотидов в целевую последовательность. В других вариантах осуществления модификация содержит делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 или более нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит делецию 1 или 2 нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит индел, который приводит к мутации со сдвигом рамки считывания в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 или более нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит замену 1 или 2 нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит одну или более из вставки, делеции или замены нуклеотидов, возникающих в результате включения матричной нуклеиновой кислоты, например любой из матричных нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления предложена популяция клеток, содержащая сконструированные клетки, например популяция клеток, содержащая клетки, сконструированные в соответствии со способами, описанными в данном документе. В некоторых вариантах осуществления популяция содержит сконструированные клетки, культивируемые in vitro. В некоторых вариантах осуществления популяция находится внутри ткани или органа, например печени у субъекта. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или более клеток в популяции сконструированы. В определенных вариантах осуществления способ, описанный в данном документе, дает по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% эффективность редактирования (или процент редактирования), определяемую обнаружением инделов. В других вариантах осуществления способ, описанный в данном документе, дает по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% эффективности модификации ДНК, определяемой путем обнаружения изменения в последовательности, будь то вставка, делеция, замена или иное. В определенных вариантах осуществления способ, описанный в данном документе, приводит к уровню эффективности редактирования или уровню эффективности модификации ДНК от около 5 до около 100%, от около 10 до около 50%, от около 20 до около 100%, от около 20 до около 80%, от около 40 до около 100% или от около 40 до около 80% в клеточной популяции.

В некоторых способах и клетках, описанных в данном документе, клетки в популяции содержат модификацию, например индел или замену в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит вставку 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов в целевую последовательность. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит вставку 1 или 2 нуклеотидов в целевую последовательность. В других вариантах осуществления модификация содержит делецию 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 или более нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит делецию 1 или 2 нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация приводит к мутации со сдвигом рамки считывания в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содер

- 30 047139 жит индел, который приводит к мутации со сдвигом рамки считывания в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% или более сконструированных клеток в популяции содержат мутацию со сдвигом рамки считывания. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 или более нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит замену 1 или 2 нуклеотидов в целевой последовательности. В некоторых вариантах осуществления модификация содержит одну или более из вставки, делеции или замены нуклеотидов, возникающих в результате включения матричной нуклеиновой кислоты, например любой из матричных нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.

Способы редактирования генов.

Композиции LNP, описанные в данном документе, могут быть использованы для редактирования генов in vivo и in vitro. В одном варианте осуществления одну или более композиций LNP, описанных в данном документе, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом. В одном варианте осуществления одна или более композиций LNP, описанных в данном документе, могут быть приведены в контакт с клеткой. В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество композиции, описанной в данном документе, может быть приведено в контакт с клеткой субъекта, нуждающегося в этом. В одном варианте осуществления генетически сконструированная клетка может быть получена путем приведения в контакт клетки с композицией LNP, описанной в данном документе. В различных вариантах осуществления способы включают введение матричной нуклеиновой кислоты в клетку или субъекту, как изложено выше.

В некоторых вариантах осуществления способы включают введение композиции LNP в клетку, связанную с заболеванием печени. В некоторых вариантах осуществления способы включают лечение заболевания печени. В определенных вариантах осуществления способы включают приведение в контакт клетки печени с композицией LNP. В определенных вариантах осуществления способы включают приведение в контакт гепатоцитов с композицией LNP. В некоторых вариантах осуществления способы включают приведение в контакт клетки, связывающей АроЕ, с композицией LNP.

В одном варианте осуществления композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Casнуклеазу класса 2, и гРНК, можно вводить в клетку, такую как клетка, связывающая АроЕ. В дополнительных вариантах осуществления матричную нуклеиновую кислоту также вводят в клетку. В некоторых случаях композицию LNP, содержащую Cas-нуклеазу класса 2 и огРНК, можно вводить в клетку, такую как клетка, связывающая АроЕ. В одном варианте осуществления можно вводить в клетку композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу класса 2, гРНК и матрицу. В некоторых случаях композицию LNP, содержащую Cas-нуклеазу и огРНК, можно вводить в клетку печени. В некоторых случаях клетка печени находится в субъекте.

В определенных вариантах осуществления субъект может получать однократную дозу композиции LNP. В других примерах субъект может получать многократные дозы композиции LNP. В некоторых вариантах осуществления композицию LNP вводят 2-5 раз. Когда вводится более одной дозы, дозы можно вводить с интервалом в около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 или 28 суток; с интервалом в около 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев; или с интервалом в около 1, 2, 3, 4 или 5 лет. В некоторых вариантах осуществления редактирование улучшается после повторного введения композиции LNP.

В одном варианте осуществления композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Casнуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, можно вводить в клетку отдельно от введения композиции, содержащей гРНК. В одном варианте осуществления композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, и гРНК, можно вводить в клетку отдельно от введения матричной нуклеиновой кислоты в клетку. В одном варианте осуществления композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, такую как Cas-нуклеаза класса 2, можно вводить в клетку с последующим последовательным введением композиции LNP, содержащей гРНК, а затем введением матрицы в клетку. В вариантах осуществления, в которых композицию LNP, содержащую мРНК, кодирующую Cas-нуклеазу, вводят перед композицией LNP, содержащей гРНК, введения могут быть разделены на около 4, 6, 8, 12 или 24 ч; или 2, 3, 4, 5, 6 или 7 суток.

В одном варианте осуществления композиции LNP можно использовать для редактирования гена, что приводит к нокауту гена. В одном варианте осуществления композиции LNP можно использовать для редактирования гена, приводящего к нокдауну гена в популяции клеток. В другом варианте осуществления композиции LNP можно использовать для редактирования гена, что приводит к коррекции гена. В дополнительном варианте осуществления композиции LNP можно использовать для редактирования клетки, что приводит к вставке гена.

В одном варианте осуществления введение композиций LNP может приводить к редактированию генов, что приводит к стойкому ответу. Например, введение может приводить к продолжительности ответа в сутки, месяц, год или более. Используемый в данном документе термин продолжительность ответа означает, что после того, как клетки были отредактированы с использованием описанной в данном

- 31 047139 документе композиции LNP, получающаяся в результате модификация все еще присутствует в течение определенного периода времени после введения композиции LNP. Модификация может быть обнаружена путем измерения уровней целевого белка. Модификация может быть обнаружена путем обнаружения целевой ДНК. В некоторых вариантах продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 1 неделю. В других вариантах продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 2 недели. В одном варианте осуществления продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 1 месяц. В некоторых вариантах продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 2 месяца. В одном варианте осуществления продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 4 месяца. В одном варианте осуществления продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 6 месяцев. В определенных вариантах осуществления продолжительность ответа может составлять около 26 недель. В некоторых вариантах осуществления продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 1 год. В некоторых вариантах продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 5 лет. В некоторых вариантах продолжительность ответа может составлять по меньшей мере 10 лет. В некоторых вариантах осуществления стойкий ответ обнаруживается через по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21 или 24 месяца, или путем измерения уровней целевого белка или путем обнаружения целевой ДНК. В некоторых вариантах осуществления стойкий ответ обнаруживается через по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 лет, или путем измерения уровней целевого белка или путем обнаружения целевой ДНК.

Композиции LNP можно вводить парентерально. Композиции LNP можно вводить непосредственно в кровоток, в ткань, в мышцу или во внутренний орган. Введение может быть системным, например, для инъекции или инфузии. Применение может быть местным. Подходящие пути для введения включают внутривенный, внутриартериальный, интратекальный, интравентрикулярный, интрауретральный, интрастернальный, внутричерепной, субретинальный, интравитреальный, в переднюю камеру, внутримышечный, интрасиновиальный, интрадермальный и подкожный. Подходящие устройства для введения включают игольчатые (включая микроиглы) инъекторы, безыгольные инъекторы, осмотические насосы и инфузионные устройства.

Композиции LNP обычно, но не обязательно, вводят в виде состава в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми наполнителями. Термин вспомогательное вещество включает в себя любой ингредиент, отличный от соединения(й) согласно данному описанию, другого(их) липидного(ых) компонента(ов) и биологически активного агента. Вспомогательное вещество может придавать составам функциональную (например, регуляция скорости высвобождения лекарственного средства) и/или нефункциональную (например, технологическое вспомогательное вещество или разбавитель) характеристики. Выбор вспомогательного вещества будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, влияние вспомогательного вещества на растворимость и стабильность, а также природа дозированной формы.

Парентеральные составы обычно представляют собой водные или масляные растворы или суспензии. Когда состав является водным, вспомогательные вещества, такие как сахара (включая, но не ограничиваясь ими, глюкозу, маннит, сорбит и т.д.), соли, углеводы и буферные агенты (предпочтительно для рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут быть более подходящим образом составлены со стерильным неводным раствором или в виде высушенной формы для применения в комбинации с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода (WFI).

Хотя изобретение описано в связи с проиллюстрированными вариантами осуществления, понятно, что они не предназначены для ограничения изобретения этими вариантами осуществления. Напротив, изобретение предназначено для охвата всех альтернатив, модификаций и эквивалентов, включая эквиваленты конкретных признаков, которые могут быть включены в изобретение, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Как вышеприведенное общее описание, так и подробное описание, а также следующие примеры являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают данное описание. Заголовки разделов, используемые в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие желаемый объект изобретения каким-либо образом. В случае, если любая литература, включенная посредством ссылки, противоречит любому термину, определенному в данном описании, приведенный в данном описании термин является превалирующим. Все диапазоны, указанные в мол.%, охватывают конечные точки, если не указано иное.

Следует отметить, что, как используется в данном изобретении, формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Таким образом, например, ссылка на композицию включает в себя множество композиций, а ссылка на клетку включает в себя множество клеток и тому подобное. Использование или является включающим и означает и/или, если не указано иное.

Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Измеряемые и измеримые значения считаются приблизительными с учетом значащих цифр и ошибки, связанной с измерением. Термин около или приблизительно означает приемлемую ошибку для конкретного значения, как определено специалистом в данной области техники, которая частично зависит от того, как измеряется или опреде

- 32 047139 ляется значение. Использование модификатора, такого как около перед диапазоном или перед перечнем значений, изменяет каждую конечную точку диапазона или каждое значение в перечне. Около также включает значение или конечную точку. Например, около 50-55 охватывает от около 50 до около 55. Кроме того, использование содержат, содержит, содержащий, состоят из, состоит из, состоящий из, включают, включает и включающий не является ограничивающим.

Если специально не указано в приведенном выше описании, варианты осуществления в описании, которые упоминаются как содержащие различные компоненты, также рассматриваются как состоящие из или состоящие по существу из упомянутых компонентов; варианты осуществления в описании, которые упоминаются как состоящие из различных компонентов, также рассматриваются как содержащие или состоящие по существу из перечисленных компонентов; варианты осуществления в описании, в которых упоминается о различных компонентах, также рассматриваются как в перечисленных компонентах; и варианты осуществления в описании, которые упоминают слова состоящие по существу из различных компонентов, также рассматриваются как состоящие из или содержащие перечисленные компоненты (эта взаимозаменяемость не применяется к использованию этих терминов в формуле изобретения).

Примеры

Пример 1. Композиции LNP для редактирования in vivo у мышей.

Были получены препараты различных композиций LNP в малом масштабе для исследования их свойств. В анализах процентного редактирования в печени у мышей мРНК Cas9 и химически модифицированная огРНК, нацеленные на последовательность TTR мыши, были составлены в виде LNP с различными мол.% ПЭГ, мол.% Липида А и соотношениями N:P, как описано в табл. 2 ниже.

Таблица 2 ________________________Композиции LNP________________________

LNP №	%мол. Липида А	%мол. ПЭГ-ДМГ	Соотношение N:P
(различные)	45	2, 2,5, 3, 4, 5	4,5
(различные)	45	2, 2,5, 3, 4, 5	6
(различные)	50	2, 2,5, 3, 4, 5	4,5
(различные)	50	2, 2,5, 3, 4, 5	6
(различные)	55	2, 2,5, 3, 4, 5	4,5
(различные)	55	2, 2,5, 3, 4, 5	6

На фиг. 1 составы LNP идентифицированы по оси X на основе их мол.% Липида А и соотношений N:P, помеченных как % CL; N:P. Как указано в условных обозначениях к фиг. 1, концентрации ПЭГ2к-ДМГ 2, 2,5, 3, 4 или 5 мол.% были составлены с (1) 45 мол.% Липида А; 4,5 N:P (45; 4,5); (2) 45 мол.% Липида А; 6 N:P (45; 6); (3) 50 мол.% Липида А; 4.5 N:P (50; 4,5); (4) 50 мол.% Липида А; 6 N:P (50; 6); (5) 55 мол.% Липида А; 4.5 N:P (55; 4,5); и (6) 55 мол.% Липида А; 6 N:P (55; 6). мол.% ДСФХ поддерживали постоянным на уровне 9 мол.%, и добавляли мол.% холестерина, чтобы довести баланс липидного компонента каждого состава до 100 мол.%. Каждый из 30 составов составляли, как описано ниже, и вводили в виде однократной дозы 1 мг на кг или 0,5 мг на кг доз суммарной РНК (фиг. 1А и фиг. 1В, соответственно).

Состав LNP - NanoAssemblr.

Компоненты липидных наночастиц растворяли в 100% этаноле с молярными соотношениями липидного компонента, приведенными выше. РНК-карго растворяли в 25 мМ цитрате, 100 мМ NaCl, pH 5,0, в результате чего концентрация РНК-карго составляла приблизительно 0,45 мг/мл. LNP составляли с молярным соотношением аминолипида к фосфату РНК (N:P), равным около 4,5 или около 6, с массовым соотношением мРНК к гРНК, равным 1:1.

LNP были получены путем микрожидкостного смешивания растворов липидов и РНК с использованием настольного прибора Precision Nanosystems NanoAssemblr™ в соответствии с протоколом производителя. Соотношение водного и органического растворителя 2:1 поддерживали во время перемешивания с использованием дифференциальных скоростей потока. После смешивания LNP собирали, разбавляли водой (приблизительно 1:1 об./об.), выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре и дополнительно разбавляли водой (приблизительно 1:1 об./об.) перед конечной заменой буфера. Конечную замену буфера на 50 мМ Трис, 45 мМ NaCl, 5% (мас./об.) сахарозы, рН 7,5 (TSS) завершали с помощью колонок для обессоливания PD-10 (GE). При необходимости составы концентрировали центрифугированием с помощью центробежных фильтров Amicon с отсечением 100 кДа (Millipore). Полученную смесь затем фильтровали с использованием 0,2 мкм стерильного фильтра. Конечный LNP хранили при 80°С до дальнейшего применения.

Анализ составов.

Динамическое рассеяние света (DLS) используется для определения индекса полидисперсности

- 33 047139 (pdi) и размера LNP согласно данному описанию. DLS измеряет рассеяние света, возникающее в результате воздействия образца на источник света. PDI, как определено из измерений DLS, представляет собой распределение размера частиц (относительно среднего размера частиц) в популяции, причем совершенно однородная популяция имеет PDI, равный нулю.

Электрофетическое рассеяние света используется для определения поверхностного заряда LNP при заданном рН. Поверхностный заряд, или дзета-потенциал, является мерой величины электростатического отталкивания/притяжения между частицами в суспензии LNP.

Асимметричное фракционирование потока в поле потока - многоугловое рассеяние света (AF4MALS) используется для разделения частиц в составе по гидродинамическому радиусу и затем последующего измерения молекулярных масс, гидродинамических радиусов и среднеквадратичных радиусов фракционированных частиц. Это позволяет оценивать молекулярно-массовое распределение и распределение частиц по размеру, а также вторичные характеристики, такие как построение БурхардаШтокмайера (соотношение среднеквадратичного значения (СКЗ) радиуса и гидродинамического радиуса во времени, которое указывает на внутреннюю плотность ядра частицы) и конфомарционную карту (логарифм СКЗ в зависимости от логарифма молекулярного веса, где угловой коэффициент полученной линейной аппроксимации дает степень компактности в зависимости от удлинения).

Анализ траекторий наночастиц (NTA, Malvern Nanosight) можно использовать для определения распределения частиц состава по размеру, а также концентрации частиц. Образцы LNP разбавляют соответствующим образом и наносят на микропрепарат. Камера регистрирует рассеянный свет, когда частицы медленно диффундируют через поле зрения. После записи видео при помощи анализа траекторий наночастиц обрабатывается видео, отслеживая пиксели и вычисляя коэффициент диффузии. Этот коэффициент диффузии может быть преобразован в гидродинамический радиус частицы. Прибор также подсчитывает количество отдельных частиц, подсчитанных в анализе, чтобы определить концентрацию частиц.

Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) может быть использована для определения размера частиц, морфологии и структурных характеристик LNP.

Анализ липидного состава LNP можно проводить с помощью жидкостной хроматографии с последующей детекцией заряженного аэрозоля (LC-CAD). Данный анализ может обеспечить сравнение фактического содержания липидов с теоретическим содержанием липидов.

Составы LNP анализируют на средний размер частиц, индекс полидисперсности (pdi), общее содержание РНК, эффективность инкапсуляции РНК и дзета-потенциал. Составы LNP могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью анализа липидов, AF4-MALS, NTA и/или крио-ЭМ. Средний размер частиц и полидисперсность измеряют с помощью динамического рассеяния света (DLS) с использованием прибора для определения DLS Malvern Zetasizer. Образцы LNP разбавляли в 30 раз в PBS перед измерением при помощи DLS. Наряду со среднечисловым диаметром и pdi был приведен Z-средний диаметр, который является основанным на интенсивности показателем среднего размера частиц. Прибор Malvern Zetasizer также используется для измерения дзета-потенциала LNP. Образцы разбавляют 1:17 (50 мкл на 800 мкл) в ОДХ PBS, рН 7,4 перед измерением.

Анализ на основе флуоресценции (Ribogreen®, ThermoFisher Scientific) используется для определения концентрации общей РНК и свободной РНК. Эффективность инкапсуляции рассчитывается как (Общая РНК - Свободная РНК)/Общая РНК. Образцы LNP разбавляют соответствующим образом 1х буфером ТЕ, содержащим 0,2% Тритон-Х 100, для определения общей РНК или 1х буфером ТЕ для определения свободной РНК. Стандартные кривые получают с использованием исходного раствора РНК, используемого для составления композиций, и разводят в 1х буфере ТЕ +/- 0,2% Тритон-Х 100. Затем добавляют разбавленный краситель RiboGreen® (в соответствии с инструкциями производителя) к каждому из стандартов и образцов и оставляют для инкубации в течение приблизительно 10 минут при комнатной температуре в отсутствие света. Микропланштетный ридер SpectraMax M5 (Molecular Devices) используется для считывания образцов с длинами волн возбуждения, отсечки и излучения, равными 488 нм, 515 нм и 525 нм, соответственно. Общую РНК и свободную РНК определяют по соответствующим стандартным кривым.

Эффективность инкапсуляции рассчитывается как (Общая РНК - Свободная РНК)/Общая РНК. Та же процедура может быть использована для определения эффективности инкапсуляции компонента на основе ДНК или карго, содержащего нуклеиновую кислоту. Для одноцепочечной ДНК можно использовать краситель Oligreen, а для двухцепочечной ДНК - краситель PicoGreen.

AF4-MALS используется для определения распределений по молекулярному весу молекулярной массы и размерам частиц, а также вторичных статистических данных из этих расчетов. LNP разбавляют соответствующим образом и вводят в разделяющий канал AF4 с использованием автосамплера ВЭЖХ, где они фокусируются, а затем элюируются экспоненциальным градиентом в поперечном потоке через канал. Вся жидкость приводится в действие насосом ВЭЖХ и прибором Wyatt Eclipse. Частицы, элюирующиеся из канала AF4, проходят через УФ-детектор, детектор многоуглового лазерного светорассеяния, детектор квазиупругого рассеяния света и дифференциальный рефрактометрический детектор. Не

- 34 047139 обработанные данные обрабатывают с использованием модели Дебая для определения молекулярной массы и СКЗ радиуса по сигналам детекторов.

Липидные компоненты в LNP количественно анализируют с помощью ВЭЖХ с присоединенным детектором заряженных аэрозолей (CAD). Хроматографическое разделение 4 липидных компонентов достигают с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. CAD представляет собой разрушающий массдетектор, который обнаруживает все нелетучие соединения, и сигнал является постоянным независимо от структуры аналита.

Карго мРНК Cas9 и гРНК.

Карго мРНК Cas9 получали путем транскрипции in vitro. Кэппированная и полиаденилированная мРНК Cas9, содержащая 1X NLS (SEQ ID NO: 48), была получена транскрипцией in vitro с использованием линеаризованной плазмидной ДНК-матрицы и РНК-полимеразы Т7. Плазмидную ДНК, содержащую промотор Т7 и поли(А/Т)-область из 100 нуклеотидов, линеаризовали путем инкубации при 37°С в течение 2 часов с XbaI в следующих условиях: 200 нг/мкл плазмиды, 2 ед/мкл XbaI (NEB), и 1х реакционный буфер. XbaI инактивировали нагреванием реакционной смеси при 65°С в течение 20 минут. Линеаризованную плазмиду очищали от фермента и буферных солей с использованием кремниевой спинколонки Maxi Spin (Epoch Life Sciences) и анализировали в агарозном геле для подтверждения линеаризации. Реакционную смесь IVT для получения модифицированной мРНК Cas9 инкубировали при 37°С в течение 4 часов в следующих условиях: 50 нг/мкл линеаризованной плазмиды; 2 мМ каждого из GTP, АТР, СТР и Ш-метил псевдо-UTP (Trilink); 10 мМ ARCA (Trilink); 5 ед/мкл Т7 РНК-полимеразы (NEB); 1 ед/мкл ингибитора мышиной РНКазы (NEB); 0,004 ед/мкл неорганической пирофосфатазы E.coli (NEB); и 1х реакционный буфер. После 4-часовой инкубации добавляли ДНКазу TURBO (ThermoFisher) до конечной концентрации 0,01 ед/мкл и реакционную смесь инкубировали в течение дополнительных 30 минут для удаления матрицы ДНК. мРНК Cas9 очищали от фермента и нуклеотидов с использованием набора MegaClear Transcription Clean-up в соответствии с протоколом производителя (ThermoFisher). Альтернативно, мРНК Cas9 очищали методом осаждения LiCl.

В данном примере огРНК была химически синтезирована и получена от коммерческого поставщика. Последовательность sg282 представлена ниже с 2'-О-метильными модификациями и фосфоротиоатными связями, как представлено ниже (m=2'-OMe; * = фосфоротиоат):

mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU.

(SEQ ID NO:42).

LNP

Конечные LNP были охарактеризованы для определения эффективности инкапсуляции, индекса полидисперсности и среднего размера частиц согласно аналитическим методам, представленным выше.

LNP вводили мышам (однократная доза 1 мг/кг или 0,5 мг/кг) и выделяли геномную ДНК для анализа секвенированием нового поколения (NGS), как описано ниже.

Доставка LNP in vivo.

В каждом исследовании использовали самок мышей CD-1 в возрасте от 6 до 10 недель. Животных взвешивали и группировали в соответствии с массой тела для приготовления растворов для дозирования на основе средней массы в группе. LNP вводили через латеральную хвостовую вену в объеме 0,2 мл на животное (приблизительно 10 мл на килограмм массы тела). Животных обследовали на наличие нежелательных явлений приблизительно через 6 ч после введения дозы. Массу тела измеряли через двадцать четыре часа после введения, и животных подвергали эвтаназии в различные моменты времени обескровливанием посредством пункции сердца под изофлурановой анестезией. Кровь собирали в пробирки для отделения сыворотки или в пробирки, содержащие забуференный раствор цитрата натрия, для получения плазмы, как описано в данном документе. Для исследований, включающих редактирование in vivo, ткани печени отбирали из средней доли или из трех независимых долей (например, правой медиальной, левой медиальной и левой латеральной доли) у каждого животного для выделения и анализа ДНК.

Когорты мышей исследовали в отношении редактирования в печени с помощью секвенирования нового поколения (NGS) и уровней TTR в сыворотке (данные не представлены).

Анализ транстиретина (TTR) методом ИФА.

Кровь отбирали и сыворотку выделяли, как указано. Общие уровни TTR в мышиной сыворотке определяли с использованием набора для ИФА на мышиный преальбумин (транстиретин) (Aviva Systems Biology, кат. OKIA00111). Уровни TTR в сыворотке крови крыс измеряли с использованием специфического для крыс набора для ИФА (Aviva Systems Biology, номер OKIA00159 по каталогу) в соответствии с протоколом изготовления. Вкратце, сыворотки серийно разводили разбавителем для образца из набора до конечного разведения в 10000 раз. Этот разведенный образец затем добавляли в планшеты для ИФА, и затем анализ проводили в соответствии с указаниями.

Секвенирование NGS.

Вкратце, для количественного определения эффективности редактирования в целевом расположе

- 35 047139 ние в геноме была выделена геномная ДНК, и использовано глубокое секвенирование для выявления наличия вставок и делеций, введенных путем редактирования генов.

Праймеры для ПНР конструировали вокруг целевого сайта (например, TTR), и представляющую интерес область генома амплифицировали. Последовательности праймеров приведены ниже. Дополнительную ПЦР проводили в соответствии с протоколами производителя (Illumina) для добавления необходимых химических компонентов для секвенирования. Ампликоны секвенировали на приборе Illumina MiSeq. Чтения были выровнены в отношении эталонного генома человека (например, hg38) после исключения тех, которые имели низкие баллы качества. Полученные файлы, содержащие чтения, были сопоставлены с эталонным геномом (файлы ВАМ), где были выбраны чтения, которые перекрывали представляющую интерес целевую область, и было рассчитано количество чтений дикого типа по сравнению с количеством чтений, которые содержат вставку, замену или делецию.

Процент редактирования (например, эффективность редактирования или процентное редактирование) определяется как общее количество чтений последовательности со вставками или делециями по отношению к общему количеству чтений последовательности, включая дикий тип.

На фиг. 1 показан процент редактирования в печени мыши, измеренный с помощью NGS. Как показано на фиг. 1А, когда вводится 1 мг на кг РНК, проценты редактирования in vivo составляют от около 20 до более 60% редактирования в печени. При дозе 0,5 мг на кг, фиг. 1В, наблюдали редактирование в печени от около 10 до 60%. В этом тесте in vivo на мышах все композиции эффективно доставляли мРНК Cas9 и гРНК в клетки печени, что свидетельствует о высокой активности CRISPR/Cas-нуклеазы в целевом сайте, измеренной с помощью NGS для каждой композиции LNP. LNP, содержащие 5% ПЭГлипида, имели более низкую инкапсуляцию (данные не показаны) и несколько сниженную эффективность.

Пример 2. Анализ композиции LNP.

Аналитическая характеристика LNP демонстрирует улучшенные физико-химические параметры для LNP, составленных с увеличением количества Липида А и ПЭГ-липида. Композиции, которые содержат 2 мол.% или 3 мол.% ПЭГ-липида (ПЭГ2к-ДМГ), представлены в табл. 3 ниже.

Таблица 3

	LNP898	LNP897	LNP966	LNP969
CL/холестерин/ДСФХ/ПЭГ (теоретический %мол.)	45/44/9/2	45/43/9/3	50/38/9/3	55/33/9/3
мРНК	Cas9 SEQ ГО NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 U-dep SEQ ID NO:43	Cas9 U-dep SEQ ID NO:43
гРНК	G502 SEQ ID NO:70	G502 SEQ ID NO:70	G534 SEQ ID NO:72	G534 SEQ ID NO:72
N/P	4,5	4,5	6,0	6,0

Состав LNP - Поперечный поток.

LNP были получены путем струйного смешивания с соударением липида в этаноле с двумя объемами растворов РНК и одним объемом воды. Липид в этаноле смешивают через узел смешивания с двумя объемами раствора РНК. Четвертый поток воды смешивается с выходным потоком узла через Тобразное соединение. (См. WO 2016010840 на фиг. 2). LNP поддерживали при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем дополнительно разбавляли водой (приблизительно 1:1 об./об.). Разбавленные LNP концентрировали, используя тангенциальную поточную фильтрацию, на картридже с плоским листом (Sartorius, НОММ 100 кДа) и затем заменяли буфер путем диафильтрации на 50 мМ Трис, 45 мМ NaCl, 5% (мас./об.) сахарозы, рН 7,5 (TSS). Альтернативно, последний обмен буфера в TSS был завершен с помощью колонок для обессоливания PD-10 (GE). При необходимости составы концентрировали центрифугированием с помощью центробежных фильтров Amicon с отсечением 100 кДа (Millipore). Полученную смесь затем фильтровали с использованием 0,2 мкм стерильного фильтра. Конечный LNP хранили при 4°С или -80°С до дальнейшего применения.

мРНК Cas9 и огРНК получали, как в примере 1, за исключением того, что кэппированная и полиаденилированная U-обедненная мРНК Cas9 (Cas9 Udep) содержит SEQ ID N: 43. Sg282 описана в примере 1, и последовательность для sg534 (G534) представлена ниже:

mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:72)

- 36 047139

Составы LNP анализировали на средний размер частиц, полидисперсность (pdi), содержание общей РНК и эффективность инкапсуляции РНК, как описано в примере 1.

Анализ среднего размера частиц, полидисперсности (PDI), содержания общей РНК и эффективности инкапсуляции РНК приведен в табл. 4. В дополнение к теоретическим концентрациям липидов в композициях LNP, анализ липидов продемонстрировал фактические уровни содержания липидов в мол.%, как указано в табл. 5 ниже.

Таблица 4

LNP ИН№	N/P	Z-сред. (нм)	PDI	Среднечисл. (нм)	Конц. РНК (мг/мл)	Инкапс. (%)
LNP898	4,5	87,91	0,030	71,33	1,53	98
LNP897	4,5	74,05	0,036	58,55	1,43	98
LNP966	6,0	82,78	0,010	67,86	2,12	98
LNP969	6,0	92,97	0,042	75,52	2,09	97

Таблица 5

LNP ИН №	Соотношение липидов (Липид А/холест./ ДСФХ/ПЭГ) (теоретическое и фактическое)	Липид А, мг/мл (теоретичес кая и фактическая )	Хол ест., мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ДСФХ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ПЭГ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )
LNP8 98	45/44/9/2 46,1/42,6/9,2/2	18,0 18,3	8,0 7,7	3,3 3,4	2,3 2,4
LNP8 97	45/43/9/3 44,8/42,9/9,2/3,1	18,0 17,8	7,8 7,7	3,3 3,4	3,5 3,6
LNP9 66	50/38/9/3 50,0/38,0/8,8/3,1	33,4 35,6	11,5 12,3	5,6 5,8	5,8 6,5
LNP9 69	55/33/9/3 54,8/33,2/8,8/3,2	33,4 31,6	9,1 8,7	5,1 4,7	5,3 5,4

Для дальнейшего анализа физико-химических свойств LNP897, LNP898, LNP966 и LNP969 были подвергнуты анализу методом асимметричного фракционирование потока в поле потока - многоуглового рассеяния света (AF4-MALS). Прибор AF4-MALS измеряет распределение частиц по размеру и молекулярной массе и обеспечивает информацию о конформации и плотности частиц.

LNP вводят в разделяющий канал AF4 с использованием автосамплера ВЭЖХ, где они фокусируются, а затем элюируются экспоненциальным градиентом в поперечном потоке через канал. Вся жидкость приводится в действие насосом ВЭЖХ и прибором Wyatt Eclipse. Частицы, элюирующиеся из канала AF4, проходят через УФ-детектор, детектор многоуглового лазерного светорассеяния Wyatt Heleos II, детектор квазиупругого рассеяния света и дифференциальный рефрактометрический детектор Wyatt Optilab T-rEX. Необработанные данные обрабатывают в программном обеспечении Wyatt Astra 7 с использованием модели Дебая для определения молекулярной массы и СКЗ радиуса из сигналов детектора.

График логарифмической производной молярной массы для LNP приведен на фиг. 2А. Вкратце, по оси X указана молярная масса (г/моль), а по оси Y указана производная мольной доли. График логарифмической производной молярной массы демонстрирует распределение различных молекулярных масс, измеренных для конкретной композиции. Это дает данные о моде молекулярных масс, а также общем распределении молекулярных масс в составе, что обеспечивает лучшую картину гетерогенности частиц, чем средняя молекулярная масса.

Гетерогенность различных составов LNP определяют путем измерения молярной массы в различ

- 37 047139 ные моменты и вычисления соотношения средневзвешенной молярной массы (Mw) к среднечисловой молярной массе (Mn) с получением полидисперсности Mw/Mn. График полидисперсности для этих различных составов представлен на фиг. 2В.

Данные демонстрируют более плотное распределение частиц с 3 мол.% ПЭГ и с 50 и 55 мол.% Липидом А при N/P 6,0, как показано на фиг. 2А. Это отражается в плотной полидисперсности, как показано на фиг. 2В.

Пример 3. Данные AF4 MALS - Дополнительные составы.

Аналитическая характеристика LNP демонстрирует улучшенные физико-химические параметры в LNP, составленных с увеличением количества липида А. Композиции, которые содержат или 45 мол.%, 50 мол.% или 55 мол.% Липида А с двумя разными гРНК, представлены в табл. 6 ниже.

Таблица 6

	LNP1021	LNP1022	LNP1023	LNP1024	LNP1025
CL/холестерин/ДСФХ/ПЭГ (теоретический %мол.)	50/38/9/3	55/33/9/3	45/43/9/3	50/38/9/3	55/33/9/3
мРНК	Cas9 Udep SEQID NO:43	Cas9 Udep SEQID NO:43	Cas9 Udep SEQID NO:43	Cas9 Udep SEQID NO:43	Cas9 Udep SEQID NO:43
гРНК	G502 SEQID NO:70	G502 SEQID NO:70	G502 SEQID NO:70	G509 SEQID NO:71	G509 SEQID NO:71
N/P	6,0	6,0	4,5	6,0	6,0

LNP были составлены, как описано в примере 2.

мРНК Cas9 и огРНК получали, как описано выше.

Композиции LNP были охарактеризованы для определения эффективности инкапсуляции, индекса полидисперсности и среднего размера частиц, как описано в примере 1.

Анализ среднего размера частиц, полидисперсности (PDI), содержания общей РНК и эффективно сти инкапсуляции РНК приведен в табл. 7. В дополнение к теоретическим концентрациям липидов в композициях LNP, анализ липидов продемонстрировал фактические уровни содержания липидов в мол.%, как указано в табл. 8 ниже.

Таблица 7

LNP HH№	N/P	Z-сред. (нм)	PDI	Среднечисл. (нм)	Конц. РНК (мг/мл)	Инкапс. (%)
LNP1021	6,0	83,18	0,027	67,15	1,63	98
LNP1022	6,0	94,08	0,005	78,28	1,60	97
LNP1023	4,5	74,01	0,017	61,11	1,61	97
LNP1024	6,0	85,37	0,002	70,42	1,59	97
LNP1025	6,0	94,47	0,018	77,71	1,60	98

- 38 047139

Таблица 8

LNP ИН №	Соотношение липидов (Липид А/холест./ ДСФХ/ПЭГ) (теоретическое и фактическое)	Липид А, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	Хол ест., мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ДСФХ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ПЭГ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )
LNP1 021	50/38/9/3 50,9/37,4/8,6/3, 1	23,6 21,6	8,1 7,2	3,9 3,4	4,1 3,8
LNP1 022	55/33/9/3 55,2/33,0/8,7/3, 1	23,6 20,4	6,4 5,5	3,6 3,0	3,7 3,4
LNP1 023	45/43/9/3 45,9/42,4/8,6/3, 1	17,7 15,3	7,7 6,4	3,3 2,7	3,4 3,0
LNP1 024	50/38/9/3 50,5/37,9/8,5/3, 0	23,6 22,4	8,1 7,6	3,9 3,5	4,1 3,9
LNP1 024	55/33/9/3 55,5/33,1/8,5/3, 0	23,6 21,3	6,4 5,8	3,6 3,0	3,7 3,4

Для дальнейшего анализа физико-химических свойств LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024 и LNP1025 были подвергнуты анализу методом асимметричного фракционирование потока в поле потока многоуглового рассеяния света (AF4-MALS). Прибор AF4-MALS измеряет распределение частиц по размеру и молекулярной массе и обеспечивает информацию о конформации и плотности частиц.

LNP исследовали при помощи AF4-MALS, как описано в примере 1.

График логарифмической производной молярной массы для LNP приведен на фиг. 3А. Вкратце, по оси X указана молярная масса (г/моль), а по оси Y указана производная мольной доли. График логарифмической производной молярной массы демонстрирует распределение различных молекулярных масс, рассчитанных для конкретной композиции. Это дает данные о моде молекулярных масс, а также общем распределении молекулярных масс в составе, что обеспечивает лучшую картину гетерогенности частиц, чем средняя молекулярная масса.

Средняя молекулярная масса приведена на фиг. 3В. Средняя молекулярная масса является средней по всему распределению, но не дает информации о форме этого распределения. LNP1022 и LNP1025 имеют одинаковую среднюю молекулярную массу, но LNP1022 имеет немного более широкое распределение.

Гетерогенность различных составов LNP рассчитывают путем определения молярной массы в различные моменты и вычисления соотношения средневзвешенной молярной массы (Mw) к среднечисловой молярной массе (Мп) с получением полидисперсности Mw/Mn. График полидисперсности для этих различных составов представлен на фиг. 4А.

Кроме того, построение Бурхарда-Штокмайера для составов LNP представлено на фиг. 4В. Построение Бурхарда-Штокмайера демонстрирует СКЗ радиуса к гидродинамическому радиусу при элюировании состава из канала AF4. Это дает информацию о внутренней плотности липидных наночастиц. На фиг. 4В показано, что LNP1021, LNP1022 и LNP1023 имеют в этом измерении разные профили.

Пример 4. Увеличенное содержание ПЭГ-липида поддерживает эффективность при уменьшенном цитокиновым ответом.

В другом исследовании липид ПЭГ-ДМГ сравнивали в составах LNP, содержащих 2 мол.% или 3 мол.% ПЭГ-липида. Композиции, которые содержат или 2 мол.%, или 3 мол.% ПЭГ-ДМГ, представлены в табл. 9 ниже.

- 39 047139

Таблица 9

	LNP809	LNP810
CL/холестерин/ДСФХ/ПЭГ (теоретический %мол.)	45/44/9/2	45/43/9/3
мРНК	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48
гРНК	G390	G390
	SEQ ID NO:69	SEQ ID NO:69
N/P	4,5	4,5

LNP были получены способом, описанным в примере 2. мРНК Cas9 и огРНК получали, как в примере 1, с последовательностью sg390 (G390), представленной ниже:

mG*mC*mC*GAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmA mUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm

AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:69).

Анализ среднего размера частиц, полидисперсности (PDI), содержания общей РНК и эффективности инкапсуляции РНК приведен в табл. 10. В дополнение к теоретическим концентрациям липидов в композициях LNP, анализ липидов продемонстрировал фактические уровни содержания липидов в мол.%, как указано в табл. 11 ниже.

Таблица 10

LNP HH№	N/P	Z-сред. (нм)	PDI	Среднечисл. (нм)	Конц. РНК (мг/мл)	Инкапс. (%)
LNP809	4,5	89,85	0,060	72,10	2,45	97
LNP810	4,5	75,26	0,025	61,17	2,14	97

Таблица 11

LNP ИН №	Соотношение липидов (Липид А/холест./ ДСФХ/ПЭГ) (теоретическое и фактическое)	Липид А, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	Хол ест., мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ДСФХ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )	ПЭГ, мг/мл (теоретическ ая и фактическая )
LNP8 09	45/44/9/2 45,7/43,3/9,0/2, 1	28,6 30,5	12,7 13,1	5,3 5,6	3,7 4,0
LNP8 10	45/43/9/3 45,0/42,3/9,7/3, 0	25,2 24,7	10,9 10,5	4,7 4,9	4,9 4,7

Цитокины сыворотки крови крыс оценивали при помощи мультиплексного анализа с использованием магнитных гранул Luminex (анализ магнитных гранул Milliplex MAP от Millipore Sigma, номер RECYTMAG-65K по каталогу) с анализом МСР-1, ИЛ-6, ФНО-альфа и ИФН-гамма. Гранулы для анализа считывали на BioRad BioPlex-200, и концентрации цитокинов рассчитывали по стандартной кривой, используя 4-параметрическую логистическую регрессию с программным обеспечением BioPlex Manager версии 6.1. Данные представлены на фиг. 5. См. фиг. 5А (сывороточный TTR), фиг. 5В (редактирование в печени) и фиг. 5С (цитокин р МСР1).

- 40 047139

Уровни TTR в сыворотке крови крыс измеряли с использованием специфического для крыс набора для ИФА (Aviva Systems Biology, номер OKIA00159 по каталогу) в соответствии с протоколом изготовления. Вкратце, сыворотки серийно разводили разбавителем для образца из набора до конечного разведения в 10000 раз. Этот разведенный образец затем добавляли в планшеты для ИФА, и затем анализ проводили в соответствии с указаниями.

Геномную ДНК выделяли из приблизительно 10 мг ткани печени и анализировали с использованием NGS, как описано выше. Последовательности праймеров для ПЦР для амплификации описаны ниже.

На фиг. 5А и фиг. 5В показано, что нокдаун TTR в сыворотке и редактирование в печени были достаточными при составах с 2 мол.% и 3 мол.% ПЭГ. На Фиг. 5С показано, что ответ МСР-1 уменьшается с использованием составов с 3 мол.% ПЭГ.

Пример 5. Доставка LNP приматам, не являющимся людьми

Три исследования были проведены с составами LNP, полученными, как описано в примере 1. Конкретные молярные количества и карго приведены в таблицах 12-26. Каждая композиция, содержащая мРНК Cas9 и гидовую РНК (гРНК), имела соотношение мРНК:гРНК 1:1 по массе. Дозы LNP (в мг/кг, содержание общей РНК), способ введения и получение животными предварительного лечения дексаметазоном указаны в таблицах. Для животных, получающих предварительное лечение дексаметазоном (Dex), Dex вводили в дозе 2 мг/кг внутривенной болюсной инъекцией за 1 час до введения LNP или введения носителя.

Для анализа химического состава крови отбирали у животных кровь в моменты времени, указанные в таблицах ниже, для каждого измеряемого фактора. Индукцию цитокинов измеряли до и после обработки NHP. Минимум 0,5 мл цельной крови собирали из периферической вены обездвиженных, бодрствующих животных в пробирку для разделения сыворотки объемом 4 мл. Крови позволяли сворачиваться в течение как минимум 30 минут при комнатной температуре с последующим центрифугированием при 2000 xg в течение 15 минут. Сыворотку аликвотировали в 2 полипропиленовые микропробирки по 120 мкл каждая и хранили при температуре от -60 до -86°С до анализа. Для анализа использовали нестандартный набор U-Plex Cytokine для приматов, отличных от людей, от Meso Scale Discovery (MSD). Следующие параметры были включены в анализ ИФН-гамма, ИЛ-1Ь, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ12р40, МСР-1 и ФНО-альфа, уделяя особое внимание ИЛ-6 и МСР-1. Реагенты и стандарты набора готовили в соответствии с указаниями в протоколе производителя. Сыворотку NHP использовали в чистом виде. Планшеты считывали на MSD Sector Imager 6000 и анализировали с помощью программного обеспечения MSD Discovery Workbench версии 4012.

Уровни комплемента измеряли у животных до и после лечения при помощи иммуноферментного анализа. Цельную кровь (0,5 мл) собирали из периферической вены обездвиженных, бодрствующих животных в пробирку, содержащую 0,5 мл ЭДТА-К2-Кровь центрифугировали при 2000 xg в течение 15 минут. Плазму аликвотировали в 2 полипропиленовые микропробирки по 120 мкл каждая и хранили при температуре от -60 до -86°С до анализа. Для анализа использовали набор EIA Quidel MicroVue Complement Plus (С3а -кат. № A031) или (Bb-кат. № А027). Реагенты и стандарты набора получали в соответствии с указаниями в протоколе производителя. Планшеты считывали на MSD Sector Imager 6000 при оптической плотности 450 нм. Результаты были проанализированы с использованием 4-параметрической логистической регрессии.

Данные для индукции цитокинов и активации комплемента представлены в таблицах ниже. BLQ означает ниже предела количественного определения.

- 41 047139

Таблица 12

Исследование 1

Г руппа лечения	Молярные соотношения (Липид А, холестерин, ДСФХ и ПЭГ2кДМГ, соответственно	N:P	Карго	Объе M выбо рки (η)	Способ введени я	Уровень дозы, содержав не общей РНК (мг/кг)	Декса метаз он
(1) TSS (носитель )	н/д	н/д	н/д	3	в/в - инфузия	н/д	нет
(2) LNP699 G502	45/44/9/2	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	3	в/в - инфузия	3	нет
(3) LNP688 G506	45/44/9/2	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000506	3	в/в - инфузия	3	нет
(4) LNP689 G509	45/44/9/2	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000509	3	в/в - инфузия	3	нет
(5) LNP690 G510	45/44/9/2	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000510	3	в/в - инфузия	3	нет

- 42 047139

Таблица 13

Исследование 2

Г руппа лечения	Молярные соотношения (Липид А, холестерин, ДСФХ и ПЭГ2кДМГ, соответственно	N:P	Карго	Объем выборк и (η)	Спосо б введен ня	Уровень дозы, содержав не общей РНК (мг/кг)	Дек саме тазо н
(1) TSS (носитель )	н/д	н/д		1	в/в болюс	н/д	да
(2) TSS (носитель )	н/д	н/д		1	в/в болюс	н/д	нет
(3) LNP898 G502	45/44/9/2	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	1	в/в инфузи я	3	да
(4)	45/44/9/2	4,5	мРНК	1	в/в -	3	нет

- 43 047139

LNP898 G502			Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502		инфузи я
(5) LNP897 G502	45/43/9/3	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	1	в/в - болюс	3	да
(6) LNP897 G502	45/43/9/3	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	1	в/в - болюс	3	нет
(7) LNP897 G502	45/43/9/3	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	1	в/в инфузи я	3	да
(8) LNP897 G502	45/43/9/3	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:2); G000502	1	в/в инфузи я	3	нет
(9) LNP916 GFP	45/43/9/3	4,5	мРНК eGFP (SEQ ID NO:)	1	в/в инфузи я	6	да
(10) LNP916 GFP	45/43/9/3	4,5	мРНК eGFP (SEQ ID NO:)	1	в/в инфузи я	6	нет

Таблица 14

Исследование 3

Г руппа лечения

Молярные соотношения

N:P

Карго

Объем выбор

Спос об

Уровень дозы,

Декс амет

- 44 047139

	(Липид A, холестерин, ДСФХ и ПЭГ2к- ДМГ, соответственно			KII (n)	введе НИЯ	содержа ние общей РНК (мг/кг)	азон
(l)TSS	н/д	н/д	н/д	3	в/в болю с	н/д	нет
(2) LNP1021 G502	50/38/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 2	3	в/в болю с	1	нет
(3) LNP1021 G502	50/38/9/4	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 2	1	в/в болю с	1	да
(4) LNP1022 G502	55/33/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 2	3	в/в болю с	1	нет
(5) LNP1023 G502	45/43/9/3	4,5	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050	3	в/в болю с	3	нет

- 45 047139

			2
(6) LNP1024 G509	50/38/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 9	3	b/b - болю c	1	нет
(7) LNP1024 G509	50/38/9/4	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 9	1	b/b - болю c	1	да
(8) LNP1025 G509	55/33/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 9	3	b/b - болю c	1	нет
(9) LNP1021 G502	50/38/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050 2	1	b/b - болю c	3	нет
(10) LNP1022 G502	50/38/9/3	6	мРНК Cas9 (SEQ ID NO:1); G00050	1	b/b - болю c	3	нет
			2

Таблица 15

Измерения ИЛ-6 из исследования 1

Группа лечения	Предварительный забор крови	6 ч	24 ч
(1) TSS (носитель)	5,71±2,70	29,1±20,37	7,05±3,49
(2) LNP699 G502	9,73±8,34	1296,41±664,71	5,43±7,68
(3) LNP688 G506	16,83±4,08	1749,47± 1727,22	38,57±39,39
(4) LNP689 G509	18,11±11,51	1353,49±766,66	32,42±18,40
(5) LNP690 G510	13,95±1,85	11838=1=17161,74	90,07±96,02

- 46 047139

Таблица 16

Измерения МСР-1 из исследования 1

Группа лечения	Предварительный забор крови	6 ч	24 ч
(1) TSS (носитель)	810,49± 178,27	1351,16=1=397,31	745,25±56,49
(2) LNP699 G502	842,31±350,65	19298,49± 11981,14	2092,89± 171,21
(3) LNP688 G506	1190,79±383,64	13500,17±12691,60	1414,71±422,43
(4) LNP689 G509	838,63±284,42	14427,7±8715,48	1590±813,23
(5) LNP690 G510	785,32±108,97	52557,24±48034,68	6319,77±983,37

Таблица 17

Измерения комплемента С3а из исследования 1

Группа лечения	Предварительный забор крови	6 ч	7 сутки
(1) TSS (носитель)	23,9±11,95	25,51±14,79	30,67±18,36
(2) LNP699 G502	32,36±11,29	94,33±58,45	38,50±12,69
(3) LNP688 G506	22,30±1,73	127,00±22,34	37,80±6,86
(4) LNP689 G509	35,83±21,94	174,00±44,51	50,83±21,92
(5) LNP690 G510	36,30±8,21	163,00±40,60	42,50± 12,44

Таблица 18

Измерения комплемента bb из исследования 1

Г руппа лечения	04-bb	Предварительный забор крови	6 ч	7 сутки
(1) TSS (носитель)	Контроль	1,53±0,19	3,37±2,13	1,43±0,71
(2) LNP699 G502	G502	1,45±0,39	9,01±5,28	1,57±0,54
(3) LNP688	G506	1,45±0,78	11,78±2,33	1,78±0,84
G506
(4) LNP689 G509	G509	1,95±0,99	15,73±2,23	2,83±0,88
(5) LNP690 G510	G510	2,12±0,44	13,57±1,23	2,21±0,72

- 47 047139

Таблица 19

Измерения ИЛ-6 из исследования 2

Г руппа лечения	Предварительный забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS (носитель)	1,77	11,46	4,2	2,76	3,01
(2) TSS (носитель)	5,23	18,11	20,36	13,2	6,36
(3) LNP898 G502	2,02	1305,75	1138,22	383,32	16,02
(4) LNP898 G502	2,34	37,19	91,59	14,11	3,07
(5) LNP897 G502	2,1	55,79	6,89	2,26	2,01
(6) LNP897 G502	6,8	10,1	44,72	5,4	2,01
(7) LNP897 G502	1,97	44,87	32,61	2,97	1,11
(8) LNP897 G502	3,14	37,68	73,41	8,58	2,22
(9) LNP916 GFP	1,6	BLQ	95,32	27,58	BLQ
(10) LNP916 GFP	2,43	BLQ	883,01	66,71	BLQ

Таблица 20

Измерения МСР-1 из исследования 2

Г руппа лечения	Предварительный забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS (носитель)	312,12	197,24	145,36	177,02	403,82

- 48 047139

(2) TSS (носитель)	232,44	175,08	187,72	136,64	325,69
(3) LNP898 G502	249,1	2183,5	1814,64	1887,41	372,38
(4) LNP898 G502	349,51	430,49	5635,55	953,05	236,6
(5) LNP897 G502	492,3	989,98	409,08	302,97	506,82
(6) LNP897 G502	283,79	225,1	1141,08	484,59	259,46
(7) LNP897 G502	223,16	349,79	398,57	172,67	287,09
(8) LNP897 G502	584,42	853,51	3880,81	1588,46	692,99
(9) LNP916 GFP	325,84	BLQ	1189,97	2279,82	BLQ
(10) LNP916 GFP	175,47	BLQ	3284,16	2023,53	BLQ

Таблица 21

Измерения комплемента С3а из исследования 2

Г руппа лечения	Предварительный забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS (носитель)	0,087	0,096	0,048	0,033	0,038
(2) TSS (носитель)	0,369	0,311	0,146	0,1	0,106
(3) LNP898 G502	0,087	0,953	0,647	0,277	0,065
(4) LNP898 G502	0,099	0,262	0,123	0,049	0,044
(5) LNP897 G502	0,067	0,479	0,209	0,036	0,036
(6) LNP897 G502	0,141	0,433	0,34	0,11	0,074
(7) LNP897 G502	0,1	0,345	0,396	0,096	0,127
(8) LNP897 G502	0,261	0,458	0,409	0,244	0,313
(9) LNP916 GFP	0,149	BLQ	0,714	0,382	BLQ
(10) LNP916 GFP	0,117	BLQ	0,752	0,723	BLQ

- 49 047139

Таблица 22

Измерения комплемента bb из исследования 2

Таблица 23

Измерения ИЛ-6 из исследования 3

Группа лечения	Предвари тельный забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(l)TSS	1,89±0,97	2,56±1,41	0,90±0,71	BLQ	0,08
(2) LNP1021 G502	210±0,35	7,44±5,16	6,94±8,45	1,07±1,11	1,76±0,98
(3) LNP1021 G502	0,79	2,96 20,42±31,6	4,25 13,94±10,1	0,67	0,27
(4) LNP1022 G502	1,54±1,32	0	0	0,98±0,41	2,04±0,65
(5) LNP1023 G502	2,92±1,68	6,28±7,18	6,06±2,31	3,62±4,68	2,00±1,21
(6) LNP1024 G509	1,43±0,62	2,64±1,92	7,72±11,96	0,45±0,19	0,88±0,79
(7) LNP1024 G509	1,35±0,74	2,64±2,35	1,71±0,41	0,36±0,58	0,51±0,32
(8) LNP1025 G509	1,64	2,68	25,65	0,58	2,00
(9) LNP1021 G502 (10) LNP1022	0,56	6,15	28,80	0,85	0,61
G502	1,76	8,66	2907,86	11,26	1,72

- 50 047139

Таблица 24

Измерения МСР-1 из исследования 2

Г руппа лечения	Предвари тельный забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS	204,01±46, 39	197,62±19,5 4	310,84±45,87	179,07±20,77	234,61±71,79
(2) LNP1021 G502	303,67±36, 37	337,63±195, 18	755,20±581,4 5	339,75±206,2 0	214,82±40,81
(3) LNP1021 G502	229,30	358,10	3182,00	413,56	178,30
(4) LNP1022 G502	393,63±187 ,81	467,72±221, 61	1852,94±219 9,66	497,12±412,3 0	382,19±67,27
(5) LNP1023 G502	213,72±8,8 5	196,18±62,8 1	1722,18±141 3,90	197,83±74,01	156,16±18,87
(6) LNP1024 G509	237,76±96, 36	210,37±95,1 7	468,53±250,4 2	22,32±69,06	141,20±71,90
(7) LNP1024 G509	207,36	183,07	1885,66	235,70	163,11
(8) LNP1025 G509	259,57±112 ,98	299,21±304, 89	1193,10±974, 04	258,82±88,53	219,86±219,86
(9) LNP1021 G502	199,29	286,04	2001,23	197,57	196,44
(Ю) LNP1022 G502	305,81	970,65	7039,06	8379,05	203,47

- 51 047139

Таблица 25

Измерения комплемента С3а из исследования 3

Групп а лечени я	Предварительны й забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS	42,47±10,30	55,40±13,58	29,30±14,46	41,70±23,65	27,43±12,43
(2) LNP10 21 G502	34,37±0,50	86,50±3,66	90,07±4,85	56,60±2,25	32,53±0,93
(3) LNP10 21 G502	34,30	128,00	93,30	33,40	28,20
(4) LNP10 22 G502	41,55±13,51	151,37±109,98	82,00±31,82	45,57±18,58	32,77±6,45
(5) LNP10 23 G502	31,67±3,19	74,40±22,08	74,13±48,61	33,83±9,75	27,70±8,05
(6) LNP10 24 G509	56,60±25,61	100,37±77,95	74,73±70,15	55,20±48,34	49,97±39,94
(7) LNP10 24 G509	33,80	33,90	33,70	26,10	20,90
(8) LNP10 25 G509	39,90±13,01	75,73±1,38	46,13±30,56	25,00±3,80	23,90±7,18
(9) LNP10 21 G502	34	85,70	133,00	62,00	25,50
(Ю) LNP10 22 G502	29,8	68,10	113,00	71,70	23,30

- 52 047139

Таблица 26

Измерения комплемента bb из исследования 3

Группа лечения	Предварительн ый забор крови	90 мин	6 ч	24 ч	7 сутки
(1) TSS	1,46±0,70	2,18±0,78	1,96±0,64	0,945±0,1 5	1,34±0,50
(2) LNP1021 G502	1,77±0,60	6,51±3,66	11,00±4,8 5	3,59±2,25	2,07±0,93
(3) LNP1021 G502	1,24	2,90	11,50	2,97	1,24
(4) LNP1022 G502	1,52±0,34	5,67±2,28	10,2±3,36	3,66±1,68	1,84±0,24
(5) LNP1023 G502	1,65±0,94	4,4±1	7,68±4,67	2,64±1,18	2,08±1,32
(6) LNP1024 G509	1,61=1=0,13	4,52±1,81	4,50±3,22	1,63±0,84	1,63±0,32
(7) LNP1024 G509	0,96	2,99	2,64	1,13	1,07
(8) LNP1025 G509	1,37±0,17	4,9±4,51	3,79±3,84	1,66±1,43	1,35±0,44
(9) LNP1021 G502	1,41	5,67	11,50	4,64	1,38
(10) LNP1022 G502	1,28	5,22	14,10	5,64	1,87

Пример 6. Скрининг ПЭГ-липидов.

В другом исследовании альтернативные ПЭГ-липиды сравнивались в составах LNP, содержащих 2 мол.% или 3 мол.% ПЭГ-липида.

В исследовании были использованы три ПЭГ-липида: Липид 1 (ДМГ-ПЭГ2к; Nof) изображен как:

О

DMG-PEG

Липид 2, синтезированный, как описано в Heyes, et al., J. Controlled Release 107 (2005), pp. 278-279 (см. Синтез PEG2000-C-DMA), может быть изображен как:

PEG-C-DMA и Липид 3, раскрытый в WO 2016/010840 (см. соединение S027, пункты [00240] -[00244]) и WO 2011/076807, может быть изображен как:

..... .. .. .... ...... ..... ...... -... ...... I i.C I .- ·... -..· ...... ·....- 'у у у у -. - ]_{| СН}

Липид А был составлен с каждым ПЭГ-липидом в количестве 2 мол.% и 3 мол.%. Компоненты липидных наночастиц растворяли в 100% этаноле с молярными соотношениями липидного компонента, приведенными выше. Вкратце, РНК-карго получали в 25 мМ цитрате, 100 мМ NaCl, pH 5,0, в результате чего концентрация РНК-карго составляла приблизительно 0,45 мг/мл. LNP составляли с молярным соотношением аминолипида к фосфату РНК (N:P), равным около 4,5 с массовым соотношением мРНК к гРНК, равным 1:1.

- 53 047139

Таблица 27

LNP №	LNP 784	LNP 785	LNP 786	LNP 787	LNP 788	LNP 789
CL/холестерин/ДСФ Х/ПЭГ (теоретический %мол.)	45/44/9/2	45/43/9/3	45/44/9/2	45/43/9/3	45/44/9/2	45/43/9/3
мРНК	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48	Cas9 SEQ ID NO:48
гРНК	G282	G282	G282	G282,	G282,	G282
	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:42	SEQ ID NO:42
Тип ПЭГ	Липид 1	Липид 1	Липид 2	Липид 2	Липид 3	Липид 3
N/P	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5	4,5

мРНК Cas9, sg282 и LNP получали, как описано в примере 1.

Композиции LNP с липидом 1, липидом 2 или липидом 3 вводили самкам мышей CD-1 и оценивали, как описано в примере 1, в дозах 1 мг/кг и 0,5 мг/кг массы тела. Когорты мышей измеряли для редактирования в печени с помощью секвенирования нового поколения (NGS) и уровней TTR в сыворотке в соответствии со способами из примера 1.

На фиг. 6А и 6В между составами с ПЭГ-липидами сравниваются уровни TTR в сыворотке. На фиг. 6А показан TTR сыворотки в мкг/мл, а на фиг. 6В представлены данные в виде нокдауна в процентах (% TSS). На фиг. 6С показан процент редактирования, достигнутый в печени. Данные указывают на то, что композиции LNP с каждым из тестируемых ПЭГ-липидов исследовали на эффективность при 2 мол.% и 3 мол.%, причем липид 1 неизменно демонстрировал несколько лучшие результаты, чем липид 2 и липид 3.

Пример 7. Аналоги Липида А.

Ряд структурных аналогов Липида А был синтезирован и испытан в композициях LNP, описанных в данном документе.

Синтез: Липид А получают взаимодействием 4,4-бис(октилокси)бутановой кислоты (промежуточное соединение 13b в примере 13 WO 2015/095340) с (9Z, 12Z)-3-гидрокси-2(гидроксиметил)пропилооктадека-9,12-диеноатом (промежуточное соединение 13 с) перед добавлением концевой группы путем взаимодействия продукта промежуточного соединения 13b и промежуточного соединения 13с с 3-диэтиламино-1-пропанолом. (См. с. 84-86 WO 2015/095340).

Промежуточное соединение 13b из WO 2015/095340 (4,4-бис(октилокси)бутановая кислота) было синтезировано через 4,4-бис(октилокси)бутаннитрил следующим образом:

Промежуточное соединение 13а: 4,4-бис(октилокси)бутаннитрил

К смеси 4,4-диэтоксибутаннитрила (9,4 г, 60 ммоль) и октан-1-ола (23,1 г, 178 ммоль) добавляли птолуолсульфонат пиридиния (748 мг, 3,0 ммоль) при комнатной температуре. Смесь нагревали до 105°С и перемешивали в течение 18 часов в реакционном сосуде, открытым для воздуха, и не снабженным обратным холодильником. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и очищали на силикагеле (градиент 0-5% этилацетата в гексане) с получением 10,1 г (31,0 ммоль) промежуточного соединения 13а в виде прозрачного масла. ¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,55 (т, J=5,3 Гц, 1H), 3,60 (дт, J=9,2, 6,6 Гц, 2Н), 3,43 (дт, J=9,2, 6,6 Гц, 2Н), 2,42 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,94 (тд, J=7,4, 5,3 Гц, 2Н), 1,63-1,50 (м, 4Н), 1,38-1,19 (м, 20Н), 0,93-0,82 (м, 6Н) м.д.

Затем к раствору промежуточного соединения 13а (8,42 г, 31 ммоль) в этаноле (30 мл) добавляли 31 мл водного гидроксида калия (2,5 М, 30,9 мл, 77,3 ммоль) при комнатной температуре. После оснащения сосуда обратным холодильником смесь нагревали до 110°С и перемешивали в течение 24 ч. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, подкисляли водной хлористоводородной кислотой (1Н) до рН 5 и трижды экстрагировали в гексаны. Объединенные органические экстракты промывали водой (дважды) и солевым раствором, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют в вакууме, получая 8,15 г (23,6 ммоль) промежуточного соединения 13b в виде прозрачного масла, которое использовали без до

- 54 047139 полнительной очистки. ¹Н-ЯМР (400 МГц, CDC13) δ 4,50 (т, J=5,5 Гц, 1H), 3,57 (дт, J=9,4, 6,7 Гц, 2Н), 3,41 (дт, J=9,3, 6,7 Гц, 2Н), 2,40 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,92 (тд, J=7,4, 5,3 Гц, 2Н), 1,56 (м, 4Н), 1,37-1,21 (м, 20Н), 0,92-0,83 (м, 6Н) м.д. (структура ниже).

Промежуточное соединение 13b

Используя способы, описанные выше, промежуточные соединения С(5, 6, 7, 9 и 10)ацеталькарбоновой кислоты, называемые промежуточными соединениями B3-F3 и приведенные ниже, были получены с использованием соответствующих алкан-1-оловых реагентов.

Промежуточное соединение В3 4,4-бис(пентилокси)бутановая кислота

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,52 (т, J=5,5 Гц, 1H), 3,58 (дт, J=9,3, 6,6 Гц, 2Н), 3,41 (дт, J=9,3, 6,7 Гц, 2Н), 2,45 (т, J=7,4 Гц, 2Н), 1,94 (м, 2Н), 1,57 (м, 4Н), 1,32 (м, J=3,7 Гц, 8Н), 0,95-0,83 (м, 6Н) м.д.

Промежуточное соединение С3: 4,4-бис(гексилокси)бутановая кислота

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,44 (т, J=5,6 Гц, 1H), 3,49 (дт, J=9,3, 6,9 Гц, 2Н), 3,39 (дт, J=9,3, 6,8 Гц, 2Н), 2,12 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 1.79 (кв, J=7,0 Гц, 2Н), 1,54 (м, 4Н), 1,29 (м, 12Н), 0,94-0,82 (м, 6Н) м.д.

Промежуточное соединение D3: 4,4-бис(гептилокси)бутановая кислота

1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,85 (уш. с, 1H), 4,46 (т, J=5,6 Гц, 1H), 3,52 (дт, J=9,4, 6,8 Гц, 2Н), 3,39 (дт, J=9,3, 6,8 Гц, 2Н), 2,26 (т, J=7,6 Гц, 2Н), 1,85 (кв, J=7,0 Hz, 2H), 1.53 (м, 4Н), 1,29 (м, 16Н), 0,94-0,80 (м, 6Н) м.д..

Промежуточное соединение Е3: 4,4-бис(нонилокси)бутановая кислота

¹Н-ЯМР (400 МГц, CDC13) δ 5,32 (уш. с, 1H), 4,44 (т, J=5,6 Гц, 1H), 3,49 (дт, J=9,3, 6,9 Гц, 2Н), 3,38 (дт, J=9,4, 6,9 Гц, 2Н), 2,10 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 1,78 (кв, J=7,0 Гц, 2Н), 1,53 (м, 4Н), 1,27 (м, 24Н), 0,88 (т, J=6,6 Гц, 6Н) м.д.

Промежуточное соединение F3: 4,4-бис(децилокси)бутановая кислота: ' О

ОН ,0 ¹Н-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 4,48 (т, J=5,5 Гц, 1H), 3,55 (м, 2Н), 3,42 (м, 2Н), 2,29 (дд, J=10,8, 7,5 Гц, 2Н), 1,90-1,82 (м, 2Н), 1,55 (м, 4Н), 1,27 (м, 28Н), 0,88 (т, J=6,7 Гц, 6Н) м.д.

Ацеталевые аналоги Липида А (С(8)) были синтезированы путем взаимодействия промежуточных соединений С(5, 6, 7, 9 или 10)-ацеталькарбоновой кислоты (B3-F3) с промежуточным соединением 13с перед реакцией продукта этой стадии с 3-диэтиламино-1-пропанолом. (См. с. 84-86 WO2015/095340). Каждый аналог был синтезирован и охарактеризован при помощи ¹Н-ЯМР (данные не показаны).

Аналоги С7, С9 и С10 были составлены из 45 моль.% аналога Липида А, 2 моль.% ДМГ-ПЭГ2к, 9 моль.% ДСФХ и 44 моль.% холестерина с соотношением N:P, равным 4,5. Каждый аналог также был составлен из 55 мол.% аналога Липида А, 2,5 мол.% ДМГ-ПЭГ2к, 9 мол.% ДСФХ и 38,5 мол.% холестерина с соотношением N:P, равным 6. Компоненты липидных наночастиц растворяли в 100% этаноле с молярными соотношениями липидного компонента, приведенными выше. РНК-карго получали в 25 мМ цитрате, 100 мМ NaCl, pH 5,0, в результате чего концентрация РНК-карго составляла приблизительно 0,45 мг/мл.

РНК-карго содержит мРНК Cas9, содержащую SEQ ID NO: 43, и sg282, полученную, как описано выше. LNP были составлены, как описано в примере 1.

- 55 047139

Расширенная панель ацеталевых аналогов, включая композиции LNP, содержащие С(5) и С(6) аналоги Липида А, были испытаны вместе с предыдущей панелью. Два новых аналога были составлены с 55 мол.% аналога Липида А, 2,5 мол.% ДМГ-ПЭГ2к, 9 мол.% ДСФХ и 33,5 мол.% холестерина с соотношением N/P, равным 6, как описано выше. Анализ продемонстрировал, что размеры всех LNP меньше 120 нм, PDI ниже 0,2 и % инкапсулированной РНК выше 80%. Результаты анализов для составов представлены в табл. 28 ниже.

Таблица 28

ИН LNP	Аналоги Липида А	Аналог, %мол.	ПЭГ %	N/P	РНК Конц, (мг/м л)	%ЕЕ	Z- сред. (нм)	PDI	Среднее значение (нм)
LNP 1122	Аналог С 5 (LP000030001)	55	2,5	6	0,063	88	118,8	0,103	88,17
LNP 1123	Аналог С6 (LP000031001)	55	2,5	6	0,067	95	107,6	0,038	88,1
LNP 1004	Аналог С7 (LP000020001)	55	2,5	6	0,068	98	100	0,012	81,55
LNP 1002	LP000001- 011	55	2,5	6	0,067	98	95,06	0,01	78,95
LNP 1006	Аналог С9 (LP000021001)	55	2,5	6	0,067	97	95,43	0,022	80,35
LNP 1008	Аналог СЮ (LP000022001)	55	2,5	6	0,069	95	103,9	0,008	86,79

Аналоги были оценены на pKa с использованием 6-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS), растворенной в воде. В данном анализе 0,1 М фосфатный буфер готовили при различных значениях рН в диапазоне от 4,5 до 10,5. Каждый аналог был отдельно приготовлен в 100% этаноле. Затем липид и TNS добавляли в отдельный рН-буфер и переносили в планшет для анализа на планшет-ридере SpectraMax при длине волны 321-488 нм. Значения были нанесены на график для получения pKa, logIC₅₀используется в качестве pKa.

Самкам мышей CD-1 вводили дозу, как описано в примере 1, 0,3 мг/кг (фиг. 7А-7Е) или 0,1 мг/кг (фиг. 7F-7G). Вкратце, самкам мышей CD-1 из Charles River Laboratories, n=5 на группу, вводили композиции LNP в различных дозах. При вскрытии (7 суток после введения дозы) сыворотку собирали для анализа TTR, а печень собирали для анализа редактирования. Анализ TTR в сыворотке и процент редактирования проводили, как описано в примере 1. Уровни TTR в сыворотке и редактирование в печени из фиг. 7А-7Е указывают, что все аналоги действовали сопоставимо с Липидом А при 0,3 милиграммах на килограмм массы тела. На фиг. 7Б-фиг. 7G показано, что, хотя Липид А обладал наибольшей эффективностью, все вновь синтезированные аналоги имеют подходящий нокдаун TTR и редактирование в печени.

Пример 8. Кривая зависимости ответа от дозы - первичные гепатоциты яванского макака

Первичные гепатоциты печени. Первичные гепатоциты печени яванского макака (РСН) (Gibco) оттаивали и ресуспендировали в среде для размораживания гепатоцитов с добавками (Gibco, кат. СМ7000) с последующим центрифугированием при 80 g в течение 4 минут. Супернатант отбрасывали, а осаждаемые клетки ресуспендировали в среде для выращивания гепатоцитов с комплексом добавок (Invitrogen, кат. А1217601 и СМ3000). Клетки подсчитывали и высевали на 96-луночные планшеты BioCoat Collagen I (ThermoFisher, кат. 877272) при плотности 50000 клеток/лунка. Высеянным клеткам давали осесть и прилипнуть в течение 24 часов в инкубаторе для тканевых культур (37°С и в атмосфере 5% СО₂) до применения LNP. После инкубации клетки проверяли на образование монослоя и среду заменяли на культуральную среду для гепатоцитов с бессывороточным комплексом добавок (Invitrogen, кат. А1217601 и СМ4000).

- 56 047139

Составы LNP для этого исследования (LNP1021, LNP1022, LNP1023, LNP1024, LNP1025 и LNP897) получали, как описано выше.

Различные дозы составов липидных наночастиц, содержащих модифицированные огРНК, тестировали на первичных гепатоцитах яванского макака для получения кривой зависимости ответа от дозы. После посева и 24-часового культивирования LNP инкубировали в среде для поддержания гепатоцитов, содержащей 6% сыворотки яванского макака, при 37°С в течение 5 минут. После инкубации LNP добавляли к первичным гепатоцитам яванского макака в виде 8-точечной кривой зависимости ответа от 2кратной дозы, начиная со 100 нг мРНК. Клетки лизировали через 72 часа после обработки для анализа NGS, как описано в примере 1. Процент редактирования был определен для различных композиций LNP, и данные представлены на фиг. 8А. Значение % редактирования с помощью мРНК Cas9 (SEQ ID NO 48) и U-обедненной мРНК Cas9 (SEQ I NO: 43) представлен на фиг. 8В. Композиции LNP описаны в табл. 2 (LNP 897) и табл. 5 (LNP 1021, 1022, 1023, 1024 и 1025).

Результаты демонстрируют результаты количественного анализа для сравнительных оценок эффективности, которые демонстрируют, что как мРНК, так и состав LNP влияют на эффективность.

Пример 9. РНК-карго: совместные составы мРНК и гРНК.

В этом исследовании оценивали in vivo эффективность у мышей различных соотношений гРНК и мРНК. CleanCap™ кэппированные мРНК Cas9 с ОРС SEQ ID NO: 4, 5'-НТО HSD, человеческий альбумин 3'-НТО, последовательность Козак и поли-А-хвост были получены с помощью синтеза IVT, как указано в примере 1, с трифосфатом М-метилпсевдоуридина вместо трифосфата уридина.

Составы LNP получали из описанной мРНК и sg282 (SEQ ID NO: 42; G282), как описано в примере 2, с Липидом А, холестерином, ДСФХ и ПЭГ2к-ДМГ в молярном соотношении 50:38:9:3 и соотношении N:P, равном 6. Массовые соотношения мРНК Cas9:гРНК в составах были такими, как показано в табл. 29.

Таблица 29

ИН LNP	Соотношение Гид: мРНК Cas9 (мас./мас.)	Конц. РНК (мг/мл)	ЕЕ (%)	Z-средний размер (нм)	PDI частиц	Среднечисл (нм)
1110	8:1	0,92	99	69,52	0,022	56,47
1111	4:1	0,86	97	76,65	0,065	57,36
1112	2:1	0,90	99	76,58	0,036	63,11
1113	1:1	0,97	99	76,60	0,071	58,92
1114	1:2	1,05	99	76,34	0,018	62,82
1115	1:4	0,65	99	82,64	0,018	66,63
1116	1:8	0,75	100	82,01	0,039	65,05

Для характеристики in vivo вышеуказанные LNP вводили мышам в количестве 0,1 мг общей РНК (мг гидовой РНК+мг мРНК) на кг (n=5 на группу). Через 7-9 суток после введения дозы животных умерщвляли, отбирали кровь и печень и измеряли TTR в сыворотке и редактирование в печени, как описано в примере 1. TTR сыворотки и результаты редактирования в печени показаны на фиг. 9А и 9В. Мышам отрицательного контроля вводили носитель TSS.

Кроме того, вышеуказанные LNP вводили мышам в постоянной дозе мРНК 0,05 мг мРНК на кг (n=5 на группу), при этом варьируя дозу мРНК от 0,06 мг на кг до 0,4 мг на кг. Через 7-9 суток после введения дозы животных умерщвляли, отбирали кровь и печень и измеряли TTR в сыворотке и редактирование в печени. TTR сыворотки и результаты редактирования в печени показаны на фиг. 9С и 9D. Мышам отрицательного контроля вводили носитель TSS.

Пример 10. Нейтральные липиды.

Для оценки эффективности LNP in vivo получали составы LNP с мРНК из примера 2 и sg534 (SEQ ID NO: 72; G534), как описано в примере 2. Компоненты липидных наночастиц растворяли в 100% этаноле с молярными соотношениями липидного компонента, приведенными ниже. Вкратце, РНК-карго получали в буфере из 25 мМ цитрата и 100 мМ NaCl при рН 5,0, в результате чего концентрация РНКкарго составляла приблизительно 0,45 мг/мл. LNP составляли с молярным соотношением аминолипида к фосфату РНК (N:P), равным около 6 с массовым соотношением гРНК к мРНК, равным 1:2.

Составы LNP анализировали на средний размер частиц, полидисперсность (pdi), содержание общей

- 57 047139

РНК и эффективность инкапсуляции РНК, как описано в примере 1. Анализ среднего размера частиц, полидисперсности (PDI), содержания общей РНК и эффективности инкапсуляции РНК приведен в табл. 30. Молярные соотношения липидов представлены в виде аминолипида (Липид А)/нейтрального липида/вспомогательного липида (холестерина)/ПЭГ-липида (ПЭГ2к-ДМГ). Нейтральный липид представлял собой ДСФ, ДПФХ или отсутствовал, как указано.

Таблица 30

Композиции LNP и их данные. (Молярные соотношения липидов представлены в виде аминолипида (Липид А)/нейтрального липида/вспомогательного липида (холестерина)/ПЭГ-липида (ПЭГ2к-ДМГ))

ИН образца	Нейт ральн ый липид	Молярн ые соотно шения	РНК КОНЦ (мг/м л)	%ЕЕ	Z- сред. (нм)	PDI	Среднее знамени е (нм)	% редакт ирован ня в печени	ТТР сыворо тки (мкг/мл )	% нокд ауна TTR
Контроль TSS								0,0	1248,9
СО241	-	50,0/0,0/ 47,0/3,0	1,46	94	75,64	0,090	54,21	1,8	1070,2	14,3
СО242	-	59,0/0,0/ 38,0/3,0	1,51	94	92,25	0,019	75,56	12,0	819,6	34,4
СО243	-	54,5/0,0/ 42,5/3,0	1,62	94	78,90	0,052	61,49	3,3	1260,5	-0,9
СО244	ДСФ X	50,0/9,0/ 39,0/2,0	1,50	93	101,3	0,044	80,73	27,4	741,0	40,7
СО034	ДСФХ	50,0/9,0/ 38,0/3,0	1,48	97	84,23	0,040	66,96	34,2	630,1	49,6
СО245	ДСФ X	52,5/4,0/ 42,5/3,0	1,55	95	81,88	0,054	64,54	5,8	846,6	32,2
СО246	ДПФ X	50,0/9,0/ 38,0/3,0	1,52	96	87,11	0,040	70,04	35,9	528,6	57,7
СО247	ДПФ X	52,5/4,0/ 42,5/3,0	1,54	97	83,67	0,050	66,43	18,3	726,6	41,8

Для характеристики in vivo вышеуказанные LNP вводили внутривенно самкам крыс линии СпрегДоули в количестве 0,3 мг общей РНК (гидовой РНК и мРНК) на кг массы тела. В группе было пять крыс. Через семь суток после введения дозы животных умерщвляли, отбирали кровь и печень и измеряли TTR в сыворотке и редактирование в печени, как описано в примере 1. Животным отрицательного контроля вводили носитель TSS. TTR сыворотки и результаты редактирования в печени показаны на фиг. 10А и 10В, и в табл. 30 (выше).

- 58 047139

Краткое описание раскрытых последовательностей

SEQ ID NO	Описание
1	Кодирующая последовательность ДНК Cas9 с использованием аналога тимидина для кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3, со старт- и стоп- кодонами
2	ДНК-кодирующая последовательность Cas9 с использованием кодонов с обычно высокой экспрессией у людей
3	Аминокислотная последовательность Cas9 с одним сигналом ядерной локализации (IxNLS) в качестве С-концевых 7 аминокислот
4	ОРС мРНК Cas9 с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами
5	ОРС мРНК Cas9 с использованием кодонов с обычно высокой экспрессией у людей, со старт- и стоп-кодонами
6	Аминокислотная последовательность никазы Cas9 с IxNLS в качестве С-концевых 7 аминокислот
7	ОРС мРНК никазы Cas9, кодирующая SEQ Ш NO: 6, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
8	Аминокислотная последовательность dCas9 с IxNLS в качестве Сконцевых 7 аминокислот
9	ОРС мРНК dCas9, кодирующая SEQ Ш NO: 8, с использованием

- 59 047139

	кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
10	Кодирующая последовательность мРНК Cas9 с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
11	Кодирующая последовательность мРНК никазы Cas9 с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
12	Кодирующая последовательность мРНК dCas9 с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
13	Аминокислотная последовательность Cas9 (без NLS)
14	ОРС мРНК Cas9, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
15	Са89-кодирующая последовательность, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
16	Аминокислотная последовательность никазы Cas9 (без NLS)
17	ОРС мРНК никазы Cas9, кодирующая SEQ ГО NO: 16, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
18	Кодирующая никазу Cas9 последовательность, кодирующая SEQ ГО NO: 16, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)

- 60 047139

19	Аминокислотная последовательность dCas9 (без NLS)
20	ОРС мРНК dCas9, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
21	dCas9-κoдиpyющaя последовательность, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
22	Аминокислотная последовательность Cas9 с двумя сигналами ядерной локализации (2xNLS) в качестве С-концевых аминокислот
23	ОРС мРНК Cas9, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
24	Са89-кодирующая последовательность, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
25	Аминокислотная последовательность никазы Cas9 с двумя сигналами ядерной локализации в качестве С-концевых аминокислот
26	ОРС мРНК никазы Cas9, кодирующая SEQ ГО NO: 16, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
27	Кодирующая никазу Cas9 последовательность, кодирующая SEQ ГО NO: 16, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
28	Аминокислотная последовательность dCas9 с двумя сигналами ядерной локализации в качестве С-концевых аминокислот
29	ОРС мРНК dCas9, кодирующая SEQ ГО NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице

- 61 047139

	3, со старт- и стоп-кодонами
30	йСа89-кодирующая последовательность, кодирующая SEQ Ш NO: 13, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
31	Промотор Т7
32	5’-НТО человеческого бета-глобина
33	З’-НТО человеческого бета-глобина
34	5’-НТО человеческого альфа-глобина
35	З’-НТО человеческого альфа-глобина
36	5’-НТО бета-глобина Xenopus laevis
37	З’-НТО бета-глобина Xenopus laevis
38	5’-НТО гормона роста крупного рогатого скота
39	З’-НТО гормона роста крупного рогатого скота
40	З’-НТО альфа, зрелой цепи 1 гемоглобина Mus musculus (Hba-al)
41	5’-НТО HSD17B4
42	Одиночная гидовая РНК G282, нацеленная на ген TTR мыши
43	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО ALB
44	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 4, и З’-НТО ALB
45	Альтернативная ОРС Cas9 с содержанием U 19,36%
46	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 45, последовательность Козак и З’-НТО ALB
47	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 45, и З’-НТО ALB
48	Транскрипт Cas9, содержащий ОРС Cas9 с использованием кодонов с обычно высокой экспрессией у людей

- 62 047139

49	Транскрипт Cas9, содержащий последовательность Козак с ОРС Cas9 с использованием кодонов с обычно высокой экспрессией у людей
50	ОРС Cas9 с удаленными точками сплайсинга; содержание U 12,75%
51	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 50, последовательность Козак и З’-НТО ALB
52	ОРС Cas9 с кодонами с минимальным содержанием уридина, часто используемыми у людей в целом; содержание U 12,75%
53	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 52, последовательность Козак и З’-НТО ALB
54	ОРС Cas9 с кодонами с минимальным содержанием уридина, редко используемыми у людей в целом; содержание U 12,75%
55	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 54, последовательность Козак и З’-НТО ALB
56	Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов для использования с CleanCap™, 5’-НТО HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО ALB
57	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от CMV, ОРС, соответствующая SEQ ID NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО ALB
58	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от НВВ, ОРС, соответствующая SEQ ID NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО НВВ
59	Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от XBG, ОРС, соответствующая SEQ ID NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО XBG
60	Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов для использования с CleanCap™, 5’-НТО от XBG, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО XBG
61	Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов для использования с CleanCap™, 5’-НТО от HSD, ОРС, соответствующая SEQ Ш NO: 4, последовательность Козак и З’-НТО ALB
62	30/30/39 последовательность поли-А
63	последовательность поли-А 100

- 63 047139

64	Одиночная гидовая РНК G209, нацеленная на ген TTR мыши
65	ОРС, кодирующая Cas9 Neisseria meningitidis, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стоп-кодонами
66	ОРС, кодирующая Cas9 Neisseria meningitidis, с использованием кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленных в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последовательность, кодирующую слитый белок)
67	Транскрипт, содержащий SEQ ГО NO: 65 (кодирующую Cas9 Neisseria meningitidis)
68	Аминокислотная последовательность Cas9 Neisseria meningitidis
69	Одиночная гидовая РНК G390, нацеленная на ген TTR крысы
70	Одиночная гидовая РНК G502, нацеленная на ген TTR яванского макака
71	Одиночная гидовая РНК G509, нацеленная на ген TTR яванского макака
72	Одиночная гидовая РНК G534, нацеленная на ген TTR крысы

См. таблицу последовательностей ниже для самих последовательностей. Последовательности транскриптов, как правило, содержат GGG в качестве первых трех нуклеотидов для использования с ARCA или AGG в качестве первых трех нуклеотидов для использования с CleanCap™. Соответственно, первые три нуклеотида могут быть модифицированы для использования с другими подходами кэппирования, например, кэппирующим ферментом вируса коровьей оспы. Промоторы и последовательности поли-А не включены в последовательности транскрипта. Промотор, такой как промотор Т7 (SEQ ID NO: 31), и последовательность поли-А, такая как SEQ ID NO: 62 или 63, могут быть присоединены к описанным последовательностям транскриптов на 5'- и 3'-концах, соответственно. Большинство нуклеотидных последовательностей представлены в виде ДНК, но могут быть легко преобразованы в РНК путем изменения Т на U.

Таблица последовательностей.

Следующая таблица последовательностей обеспечивает перечень последовательностей, описанных в данном документе. Понятно, что если последовательность ДНК (содержащая Т) упоминается относительно РНК, то Т следует заменять на U (которые могут быть модифицированы или немодифицированы в зависимости от контекста), и наоборот.

- 64 047139

Описание	Последовательность	SEQ ID No.
Кодирующая последователь ность 2 ДНК Cas9	ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAAC AAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACA AGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACA GACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACT GCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGAC TGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAA GAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACG AAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTG GAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGA AAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCG CATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGA AAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAG ACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAG AGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACA ACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGA CATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCA AGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACT GAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGC TGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTG ATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAG CAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGA GCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTG GCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGC AGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACA TCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTG AGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCA GGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGC TGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGC AAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAG CCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGA AAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGA ACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGAC	1

- 65 047139

AACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACT GCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTT CCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGA CATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAG GAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAA GAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGA CAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGA CAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTG CCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTAC AACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAAT GAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGG CAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTC ACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGAT CGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAG ACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTG CTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGA AGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACAC TGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGA CTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATG AAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAA GACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAG CAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGA CGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGA CGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCAC AGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATC GCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAAT CCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGG TCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAA ATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGA AGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGG AATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACC CGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTAC CTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGA CCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACG TCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACA

- 66 047139

GCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAAC AGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGT CAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACG CAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACA AAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGG CAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAG ATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAAT GAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAG AAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGC GACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGA AATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGA ACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCG AAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGT CTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGG AAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGC AACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCA AACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAA CGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGA GACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCA GGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAG GATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAA GAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACA GCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGC AAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCAC AATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCG ACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAG GACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAA CTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC

- 67 047139

	AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
Кодирующая последователь ность 1 ДНК Cas9	ATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAAC TAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAA AGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCG ATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTG CTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTC AAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAA TCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAAT GGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAG AATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGG CATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTAC CACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAA GTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGAT CTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACA CTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGA CGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAA CCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGT CGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTC GCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAG AGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCT CACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACC TGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACC TACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGC GATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTT TCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAAC ACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATT AAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTC AAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAA GGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGG	2

- 68 047139

GTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATA AGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACC GAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCT CCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCA CCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCG CCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGA AAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTA CGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTG GATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGA ATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAA AGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTC CCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTAC GAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAA TACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCC GGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAA GACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGG ACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAA TCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGA ACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGAC TTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGA TATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGAT GATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGA CGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACA CTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTA TTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCC TCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAAT TGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCC AAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCAT GAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAG AAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCT GGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCG TGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAG GGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGA AGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAG AGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAG

- 69 047139

CTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTAC GTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTAC GACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGAT GACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAA GAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGG TCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTG AATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTC ACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAA GGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGC AGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCA TGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGG GAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTC GGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGA AATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAA CGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAA ACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTA CGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAA TCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACA TCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATG GAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGA GAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTT CGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAA TATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTC AAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGC TCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTAC GGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTC GTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCT CAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGA ACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGA GGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCA TCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATG GTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAA AAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAA CTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGG GTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGG

- 70 047139

	AGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAA ATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCC AACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGA GATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCA CTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTT CAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACAC GTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCA AAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTC GCAGCTGGGTGGCGATGGCGGTGGATCTCCGAAAAAGA AGAGAAAGGTGTAATGA
Аминокислот ная последователь ность Cas9	MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD	3

- 71 047139

	VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
Открытая рамка считывания (ОРС) 2 мРНК Cas9	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA	4

- 72 047139

GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC

- 73 047139

GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG

- 74 047139

	AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGA AGAAGAGAAAGGUCUAG
OPC 1 мРНК Cas9	AUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAA CUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUA CAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAAC ACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAG CCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACC CGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCG GAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCG AACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACC GCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAA GCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGAC GAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCA UCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCC GACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAU CAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUG AACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUC AACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAA CCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCC UGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAAC CUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGAC	5

- 75 047139

UUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACU CCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGC GAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACU UGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGC GGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCA AUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAA UAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCG GUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAG CGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGA GAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGG UACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUA AGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC CGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUG CUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCC CCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGC GGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAAC CGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCC CGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGC UUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCA CUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGC UUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUC GACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGC ACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAA CUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGA AGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAU UGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACC GUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCG AGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGA CAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCC UGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGA GGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACC UUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGA GGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGU CAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGG GGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGA

- 76 047139

UAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAA UCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGA UCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAA AAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUG AACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAA GAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAG CUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUA UCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCA GAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGG AUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCC UGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAA CGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGG GACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGU UGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCC UUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGA CUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGU GCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUAC UGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGA GAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGG ACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGG CAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGG CGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGAC GAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUA CCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGA CUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUAC CAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGG UACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCG GAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGA GGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAA AGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUG AACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAG AAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGA AACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUC GCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCA AUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUU

- 77 047139

	UUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGAC AAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGA AGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUC CGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGC AAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUA CCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAU UGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAG AAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGU UCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUC GGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUG CCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCA CUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAA CAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUC UGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAA GCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCC UGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAG AGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUG ACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGA UACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAG GAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCAC UGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUG GGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAA AGGUGUAAUGA
Аминокислот ная последователь ность никазы Cas9 (D10A)	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER	6

- 78 047139

	MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
ОРС мРНК никазы Cas9 (D10A)	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG	7

- 79 047139

AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC

- 80 047139

GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA

- 81 047139

	AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGA AGAAGAGAAAGGUCUAG
Аминокислот ная последователь ность dCas9 (D10A Н840А)	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG	8

- 82 047139

	LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV
ОРС мРНК dCas9 (D10A H840A)	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA	9

- 83 047139

GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC

- 84 047139

AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA

- 85 047139

GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGA AGAAGAGAAAGGUCUAG

- 86 047139

Голая кодирующая последователь ность Cas9

GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA

10

- 87 047139

ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC

- 88 047139

GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA

- 89 047139

	UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAA GAGAAAGGUC
Голая кодирующая последователь ность никазы Cas9	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA	11

- 90 047139

AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG

- 91 047139

AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC

- 92 047139

	AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAA GAGAAAGGUC
Голая кодирующая последователь ность dCas9	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC	12

- 93 047139

AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC

- 94 047139

UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA

- 95 047139

	AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAA GAGAAAGGUC
Аминокислот ная последователь ность Cas9 (без NLS)	MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKA1LSARLSKSRRLENL1AQLPGEKKNGLFGNL1ALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE	13

- 96 047139

	CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
ОРС мРНК Cas9, кодирующая SEQ ID NO: 13, c использование M кодонов c минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC	14

- 97 047139

CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU

- 98 047139

CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC

- 99 047139

	AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
Cas9кодирующая последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 13, с использование м кодонов с	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG	15

- 100 047139

минимальным содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)

CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA

- 101 047139

AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC

- 102 047139

	UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGAC
Аминокислот ная последователь	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV	16

- 103 047139

ность никазы Cas9 (без NLS)	DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
ОРС мРНК никазы Cas9, кодирующая SEQ ID NO:	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG	17

- 104 047139

16, с использование м кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами

CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA

- 105 047139

GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU

- 106 047139

CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA

- 107 047139

	GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
Кодирующая никазу Cas9 последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 16, с использование м кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC	18

- 108 047139

CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA

- 109 047139

GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG

- 110 047139

	CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGAC
Аминокислот ная последователь ность dCas9 (без NLS)	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE	19

- 111 047139

	VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
ОРС мРНК dCas9, кодирующая SEQ ID NO: 19, c использование M кодонов c минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA	20

- 112 047139

GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA

- 113 047139

UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG

- 114 047139

	CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
dCas9кодирующая последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 19, с использование м кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC	21

- 115 047139

CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU

- 116 047139

CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA

- 117 047139

	CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGC
Аминокислот ная последователь ность Cas9 с двумя сигналами ядерной локализации в качестве Сконцевых аминокислот	MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR	22

- 118 047139

	YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD GSGSPKKKRKVDGSPKKKRKVDSG
ОРС мРНК Cas9, кодирующая SEQ ID NO: 22, с использование м кодонов с минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA	23

- 119 047139

ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC

- 120 047139

GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA

- 121 047139

	AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGA AGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAG AAAGGUCGACAGCGGAUAG
Cas9- кодирующая последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 23, с использование	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG	24

- 122 047139

м кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)

ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG

- 123 047139

AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA

- 124 047139

GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAA GAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAG GUCGACAGCGGA

- 125 047139

Аминокислот ная последователь ность никазы Cas9 с двумя сигналами ядерной локализации в качестве Сконцевых аминокислот

MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSGSPKKKRKVDGSPKKK RKVDSG

25

- 126 047139

ОРС мРНК никазы Cas9, кодирующая SEQ ID NO: 25, c использование M кодонов c минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами

AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG

26

- 127 047139

ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG

- 128 047139

ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA

- 129 047139

	GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGA AGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAG AAAGGUCGACAGCGGAUAG
Кодирующая никазу Cas9 последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 25, с использование м кодонов с минимальным содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG	27

- 130 047139

CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC

- 131 047139

ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC

- 132 047139

	UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA
Аминокислот ная последователь ность dCas9 с двумя сигналами ядерной локализации в качестве Сконцевых аминокислот	MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDR HSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICY LQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIV DEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIK FRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASG VDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLG LTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYA DLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHH QDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQ EEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIP HQ1HLGELHA1LRRQEDFYPFLKDNREK1EK1LTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIER MTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEG MRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIE CFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDI LEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRR YTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQ LIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGI LQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKN	28

- 133 047139

	SRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQ NGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVL TRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRK FDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDS RMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYD VRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRK RPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTE VQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTV AYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPID FLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQ KGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQ HKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIR EQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDA TLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSGSPKKKRKVDGSPKKK RKVDSG
ОРС мРНК dCas9, кодирующая SEQ ID NO: 28, c использование M кодонов c минимальным содержанием уридина, как указано в таблице 3, со старт- и стопкодонами	AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAA CAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUA CAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAAC ACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAG CACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAAC AAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGA AGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCA GCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCA CAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAG AAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCG ACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUAC CACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGG CAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUG AUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACC UGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUC CAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAA ACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUC CUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAA ACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGG	29

- 134 047139

ACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUG ACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAG ACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGA CGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGU ACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGAC GCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAG AAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAA GAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGA AGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAA GGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCA GGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCU ACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGG AACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGAC CUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCA UCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUC CUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGG ACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAG AAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAAC AGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAA CAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAA GGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACA AACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCC GAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUAC AACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAA UGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAA GGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAG GUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGA AGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGU CGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCAC GACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGG ACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGU CCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUC GAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACG ACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACAC AGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGA

- 135 047139

AUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACU UCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAU GCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAA GACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACA GCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCG GCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCG UCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCC GGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAG ACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAA UGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAG CCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGC UGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAA CGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUC AACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCC GCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAG GUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCG ACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAA GAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUC ACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGA GAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAU CAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAG CACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAA AGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAA GGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUC AGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCA ACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCA GUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGC UGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUA CGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAA AUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCA ACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGC AAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACA AACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAA GAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCC GCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACA

- 136 047139

	GGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAA ACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGA CCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUC GCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGG GAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCU GGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAG AACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGG AAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUA CAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUG CUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAAC UGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUG GCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAG ACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAA GCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAA UUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGG ACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAA GCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUG UUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAA GUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACA AGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCA GAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUG AGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUA G
dCas9кодирующая последователь ность, кодирующая SEQ ID NO: 28, с использование м кодонов с минимальным	GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAA ACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAA GGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACA GACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCAC UGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGA AAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCA ACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAG ACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAG CACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGA	30

- 137 047139

содержанием уридина, перечисленны х в таблице 3 (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в последователь ность, кодирующую слитый белок)

AGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACC UGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGA CCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCA AGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAA CCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGC UGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCC GAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUG AGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACC UGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACU GUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACA CCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGC AAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGAC CUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGC AGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCA AUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAA UCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAG AUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGG CACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGA AAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGA UACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACA AGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAAC AGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUG CUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCC CGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUG AGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACA ACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAU CCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCA GAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAU CACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGA GCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACU UCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAA GCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACG AACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAG AAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA AUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCA

- 138 047139

CAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAU CGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAA GACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCU GCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAAC GAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGA CACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGA AAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAG GUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAU GGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAG AGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUG AAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGC UGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAU CCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUG CACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAU CAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGAC GAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAA ACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAAC ACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAG AGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGA UCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAG AACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAA GAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAG ACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGA GCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCU GACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAAC GUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACU ACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACA GAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGA GGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGA GACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGU CGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUAC GACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCA UCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAA GGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAAC UACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGU

- 139 047139

	CGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAA AGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACG UCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGG AAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUC AUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACG GAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGG AGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGAC UUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGG UCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGG AUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGA AGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUA CAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAG AGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAA UCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCC GAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUC AAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCC UGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGC AAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCA CUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAG CCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAAC GAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACU ACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAG CAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAG GUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGA UCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCAC ACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUAC UUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCA CAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGC AUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCC AGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA
Промотор Т7	TAATACGACTCACTATA	31
5’-НТО	ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTC	32

- 140 047139

человеческого бета-глобина	AAACAGACACC
З’-НТО человеческого бета-глобина	GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTT TGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATG AAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACA TTTATTTTCATTGC	33
5’-НТО человеческого альфаглобина	CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCTGG TCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC	34
З’-НТО человеческого альфаглобина	GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCC TCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCC GTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC	35
5’-НТО бетаглобина Xenopus laevis	AAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCC	36
З’-НТО бетаглобина Xenopus laevis	ACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTAC ATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAA AATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGT TTCTTCACATTCT	37
5’-НТО гормона роста крупного рогатого скота	CAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCAGCT	38
З’-НТО гормона роста крупного рогатого скота	TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCC TTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT AAAATGAGGAAATTGCATCGCA	39
З’-НТО альфа, зрелой цепи 1 гемоглобина Mus musculus (Hba-al)	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCT TCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAG CCTGAGTAGGAAG	40

- 141 047139

5’-HTO HSD17B4	TCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTG TGTGTCGTTGCAGGCCTTATTC	41
Гидовая РНК G282, нацеленная на TTR	mUmUmACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmC mUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCU AGU СС GUU AU C AmAmCmU mU mGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUm UmUmU	42
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAA ACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAG GTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGA CAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGC TGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTG AAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGA ACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAA ATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGA AGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAA GACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCAT ACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAG AAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACT GATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGG ACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACA GCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACAT ACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGC GGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAG CAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGC CGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATC GCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAA CTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCA AGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCA CAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGC AAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCC TGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGC GCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGA	43

- 142 047139

CCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCC GGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGA ACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAG GAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAA GATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACA GAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAAC GGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCA CGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCT GAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACAT TCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGA AACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGA AACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACA AGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACA AACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCC GAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAA CGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGA GAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA ATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCAC AGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCG AATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGAC AGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCT GAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAG AAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTG ACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACT GAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGA AGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAG ACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGC AGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGAC GGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC GACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACA GGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCG CAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATC CTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGT CATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAA TGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAA

- 143 047139

GAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGA ATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCC GGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGAC CAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGT CGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACA GCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAAC AGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGT CAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACG CAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACA AAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGG CAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAG ATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAAT GAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAG AAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGC GACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGA AATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGA ACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCG AAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGT CTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGG AAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGC AACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCA AACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAA CGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGA GACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCA GGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAG GATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAA GAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACA GCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGC AAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCAC AATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCG ACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAG GACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAA CTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG

- 144 047139

	AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATC ACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAG AAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTC TTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTC AATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, и 3’НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGACAA GAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCG TCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCG AGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACA CAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCG ACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAG AACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGA ATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCA AAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAG CTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACC CGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACG AAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTG GTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTA CCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTT CCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACG TCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACC	44

- 145 047139

AGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTC GACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAG CAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAG AAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTG AGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGA CCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACA CATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATC GGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAA CCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGT CAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCA TGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACA CTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAA GTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGAT ACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAA TTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGAC GGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGA CCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCA TCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCC TGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGAC AACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAAT CCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCA GATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATC ACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGC AAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCG ACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCAC AGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTG ACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCC GGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCG ACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAG CAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTT CGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCA ACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATC ATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGA AGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTT CGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACAT

- 146 047139

ACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTG AAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCA GAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGA AAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGC AAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCC TGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGC GGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCT GGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGA CAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGA AGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAG AGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGC AGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGG AACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAA AACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTA CCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAAC TGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCAC ATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGAC AACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAA AGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAG ATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCT GATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAG AGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTC ATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAA GCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAA AGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAG GTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAG AAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACA ACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTC GTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGA AAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGT CAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAA AGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGA ACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAA ATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAAC AGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAA

- 147 047139

	CAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATC GTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAA GGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGA TCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGA GGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTC GTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGA AGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAA AGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGA AGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCA TCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAAC GGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCA GAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCA ACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGG GAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTC GAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACA GATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACG CAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCAC AGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCAT CCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGC ATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGAT ACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATC CACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGA CCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGA AGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAA AGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAAT GAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTG GTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCT TTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAA AAAATGGAAAGAACCTCGAG
Альтернативна я ОРС Cas9 с содержанием U 19,36%	ATGGATAAGAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAAC TAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAA AGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCG ATAGACACAGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTG CTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTC AAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAA	45

- 148 047139

TCGCATCTGCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAAT GGCAAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAG AATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGG CATCCTATCTTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTAC CACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAA GTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGAT CTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACA CTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGA CGTGGATAAGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAA CCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCG TCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGT CGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGA GAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTC TCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGAC CTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACAC CTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGG CGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCT TTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAA CACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGAT TAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCT CAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACA AGGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAG GGTACATCGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTAT AAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAAC CGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGC TCCGCAAACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCA CACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGG CGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGG GAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTAT TACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCG TGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTG GAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCAC AATCCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATC TCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTT ACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGA

- 149 047139

AATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGA GCGGAGAACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTC AAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGA GGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGA AATCAGCGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGG GAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGG ACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAA GATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAG ATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTC GACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTA CACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGG TATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTT CCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCA GTTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACAT CCAGAAAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCC ATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTA AGAAGGGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAG CTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATAT CGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGA AGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATC GAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAA AGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGA AGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGT ACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATT ACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGG ATGACTCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACA AGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAG GTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCT GAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCT CACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATA AGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGG CAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGC ATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCG GGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGT CGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAG

- 150 047139

	AAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCA ACGCTGTGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTA AACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCT ACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAA ATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAAC ATCATGAACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAAT GGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGG AGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACT TCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCA ATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTT TCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAA GCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGT ACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCC TCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAG CTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATG GAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTG GAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGAT CATCAAACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAA TGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCA GAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCA ACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAG GGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTG GAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACA AATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGC CAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAG AGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCC ACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCT TCAAGTACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACA CGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACC AAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGT CGCAGCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCAT ACGACGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCA AGAAGAAACGGAAGGTGTGATAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCTGCCACCAT	46

- 151 047139

HSD, OPC, соответствую щая SEQ ID NO: 45, последователь ность Козак и З’-НТО ALB

GGATAAGAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAACTA ATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAA GTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGA TAGACACAGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTGCT GTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCA AACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAAT CGCATCTGCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAATG GCAAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGA ATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGC ATCCTATCTTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTACC ACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAG TTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATC TACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACAC TTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGAC GTGGATAAGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAAC CAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCGT CGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTC GCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAG AGAAGAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCT CACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACC TGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACC TACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGC GATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTT TCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAAC ACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATT AAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTC AAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAA GGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGG GTACATCGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTATA AGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACC GAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCT CCGCAAACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCAC ACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGC GCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGG AAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATT

- 152 047139

ACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGT GGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGG AATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACA ATCCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCT CCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTA CGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAA ATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGAG CGGAGAACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTCA AGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAG GACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAA ATCAGCGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGG AACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGA CTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAG ATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGA TGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCG ACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTAC ACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGT ATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTC CTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAG TTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATC CAGAAAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCCA TGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAA GAAGGGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAGC TGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATC GTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAA GGGCCAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCG AAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAA GAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAA GCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTA CGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTA CGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGA TGACTCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAA GAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGG TCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTG AATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTC

- 153 047139

ACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAA GGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGC AGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGCA TGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGG GAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTC GGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGA AATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAA CGCTGTGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTAA ACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTA CGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAA TCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACA TCATGAACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATG GAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGA GAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTT CGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAA TATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTC AAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGC TCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTAC GGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTC GTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAGCT CAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGA ACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTGGA GGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCA TCAAACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATG GTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAG AAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAA CTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAGG GTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGG AGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAA ATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCC AACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGA GATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCA CTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCTT CAAGTACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACAC GTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCA

- 154 047139

	AAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTC GCAGCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCATA CGACGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCAA GAAGAAACGGAAGGTGTGATAGCTAGCCATCACATTTA AAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAA ATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGT TGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTT CTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATA AAAAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 45, и 3’НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCTATGGATAA GAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGT GGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGT CCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACAC AGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGAC TCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTAC CGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCT GCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGG TGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCC TGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATC TTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTACCACGAAAA GTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGA CTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGC CCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGAT CGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATA AGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGT TCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCGTCGATGCC AAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGC CTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAGAA GAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGG ACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGA GGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACG ACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGT ACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACG CAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAA	47

- 155 047139

TAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGT ACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCG CTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGAT TTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACAT CGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCA TCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAA CTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGCAA ACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCACACCAGA TCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGG AGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAG ATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTG GGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATG ACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTC GAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAATCCTTC ATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAA CGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATA CTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGT TACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGAGCGGAG AACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACC AACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTA CTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAG CGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCT ATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCC TTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATC GTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATC GAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGAT AAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGG TTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCG CGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAA ATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAGTTGAT CCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAGA AAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAA CACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAG GGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGT GAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGA

- 156 047139

TTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGC CAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGA AGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGC ACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTC TACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTG GACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGAC GTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGAC TCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAA CAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCG TGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAAT GCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACT AAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGC TGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGAT TACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGCATGAA CACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAG TGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACT TTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCA ACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTG TGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTAAACTTG AATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACG TGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGG AAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATG AACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAA ATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAAC GGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAA CTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTG TGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAG GAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCAT TGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAG GATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGG TGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTCAA ATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACG ATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTGGAGGC GAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCA AACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTC

- 157 047139

	GGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAGAAA GGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTC CTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAGGGTCA CCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCA GCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTC CGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCT CGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATA AGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTG TTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCTTCAAG TACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACACGTCC ACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAG CATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCA GCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCATACGA CGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCAAGAA GAAACGGAAGGTGTGATAGCTAGCCATCACATTTAAAA GCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATG AAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGG TGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTT TAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAA AAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9, содержащий ОРС Cas9 с использование м кодонов с обычно высокой экспрессией у людей	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGCCTAA GAAAAAGCGGAAGGTCGACGGGGATAAGAAGTACTCAA TCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAG TGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTC AAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAA AAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAAC CGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGAC GCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAG AGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGC TTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAG GACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATC GTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCAT CTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAA GGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATAT	48

- 158 047139

GATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCT GAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCA ACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACC CAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGT CCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGA TCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTC GGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAAT TTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTG CAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAA TTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTT CCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTC CGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGC CGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATC ACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGC AACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGT CCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCT AGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTG GAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCT GAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTG ACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGC TGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCAT TCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTG ACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGC GGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGA GGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGA TAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGA CCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTC CTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACA ACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATG AGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGC AATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGAC CGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCG AGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGAC AGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTG AAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGA

- 159 047139

GAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGAC CCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAA GACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACA ACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTC CCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCG GTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCG CTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCC TGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCC GGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCT GGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAA CTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGA CGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCG AGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCC GCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGA GCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAA ACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATT TGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTG GACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATC GTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAAC AAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTC AGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGA AGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTA CCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGC GGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAA ACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACG TGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACG ACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATT ACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGAC TTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCAT CACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACC GCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTT GTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGAT GATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTG CGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAA GACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGA

- 160 047139

	GGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATC GTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAA AGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAAC CGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCT CCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGA AAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCG CCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTG GAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGA GCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGA GAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACA AGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAG TACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATG CTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCT GGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCT TCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAA CGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATT ATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAA AGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCC TGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGA GAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACT AACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACT ACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGT TCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACT CTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGA TTGATAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCT ACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGC TTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAAC ACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCC TCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAA CCTCGAG
Транскрипт Cas9, содержащий последователь ность Козак с	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GCCTAAGAAAAAGCGGAAGGTCGACGGGGATAAGAAGT ACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTT GGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAG	49

- 161 047139

ОРС Cas9 с использование м кодонов с обычно высокой экспрессией у людей

AAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCAT CAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGG CGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGA GGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATC TGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGAC GACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTG GAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGG AAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACC CGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAA CTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCG CCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAG GCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTT TCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAG AAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCC ATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAA AACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGG ACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACT CCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCG AAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTT GGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGG ATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTT GCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAA AGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGA GCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAG ACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGA CCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAG GCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAA TCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTC AAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAAC CTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGG TGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTA CCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAA TTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGG CGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAAT CAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTG

- 162 047139

TGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGA ATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGT GCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTC TACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGG AATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGA AAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGG TGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAG ATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGA GGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCT CCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACG AGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACC TTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGG CTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATG AAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCG CCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACA GAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGG CTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGA CAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAG TGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCG AATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTG CAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCAT GGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGG CCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAAC TCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAA GGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGG AAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTAC TATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGA GCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCA CATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGA TAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGA AGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAG ATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCT GATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGA GCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCAT CAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGC

- 163 047139

ACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAAT ACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTG ATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAG GACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTAC CATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGT ACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAG TTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAA GATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAA CTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTT CAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGA AGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAA ATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGC AAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAA ACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGAT CCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCA AGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGAT TCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAG GTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAA AGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTT CGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTT ACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCC AAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCG CATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATG AGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATC TTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAA GATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAA GCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTT TTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAA AGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGAT CAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCT GACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGA TACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGA AGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGG ACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGG CGATTGATAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAG

- 164 047139

	CCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAT AGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCC AACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTT GCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAA GAACCTCGAG
ОРС Cas9 с удаленными точками сплайсинга; содержание U 12,75%	ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAAC AAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACA AGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACA GACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACT GCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGAC TGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAA GAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACG AAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGG AAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAA AGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGC ATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAA AGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGA CTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGA GGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAA CAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGAC ATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAA GCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTG AGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCT GCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGA TCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGC AACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAG CAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGG CACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCA GCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACAT CCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGA GCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAG GACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCT GCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCA AGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGC CAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAA	50

- 165 047139

AAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAA CAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACA ACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTG CACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTC CTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGAC ATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGG AAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAG AAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGAC AAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGAC AAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGC CGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACA ACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATG AGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGC AATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCA CAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATC GAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGA CAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCT GAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAG AAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTG ACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACT GAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGA AGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAG ACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGC AGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGAC GGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC GACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACA GGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCG CAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATC CTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGT CATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAA TGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAA GAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGA ATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCC GGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACC

- 166 047139

AGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTC GACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAG CATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACA GAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTC AAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGC AAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAA AGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGC AGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGA TCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATG AACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGA AGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCG ACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAA ATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAA CGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGA AGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTC TACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGA AATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCA ACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAA ACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAAC GGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAG ACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAG GTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGG ATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCG ACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAG AAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAG CGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCA AGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACA ATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGA CTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGG ACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAAC TGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT

- 167 047139

	CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 50, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAA ACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAG GTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGA CAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGC TGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTG AAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGA ACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAA ATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGGAA GAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAG ACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATA CCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGA AGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTG ATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGA CACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAG CGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATA CAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCG GAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGC AAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCC GGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCG CACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAAC TTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAA GGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCAC AGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCA AAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCT	51

- 168 047139

GAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCG CAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGAC CTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCC GGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGA ACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAG GAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAA GATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACA GAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAAC GGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCA CGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCT GAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACAT TCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGA AACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGA AACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACA AGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACA AACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCC GAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAA CGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGA GAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA ATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCAC AGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCG AATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGAC AGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCT GAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAG AAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTG ACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACT GAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGA AGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAG ACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGC AGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGAC GGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC GACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACA GGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCG CAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATC CTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGT

- 169 047139

CATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAA TGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAA GAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGA ATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCC GGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACC AGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTC GACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAG CATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACA GAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTC AAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGC AAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAA AGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGC AGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGA TCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATG AACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGA AGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCG ACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAA ATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAA CGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGA AGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTC TACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGA AATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCA ACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAA ACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAAC GGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAG ACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAG GTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGG ATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCG ACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAG AAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAG CGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCA AGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACA ATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGA CTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGG

- 170 047139

	ACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAAC TGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATC ACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAG AAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTC TTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTC AATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
OPC Cas9 c кодонами c минимальным содержанием уридина, часто используемым и у людей в целом; содержание U 12,75%	ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCAC CAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACA AGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACC GACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCT GCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGAC TGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAA GAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACG AGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTG GAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGA GAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGG CCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAA AGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGA CTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGA GGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAAC AGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACC	52

- 171 047139

TACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAG CGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGA GCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTG CCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGAT CGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAA CTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCA AGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCC CAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCC AAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTG AGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGC CAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACC TGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCG AGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAAC GGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGA GGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGAT GGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAG AGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGC AGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCC ATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAG GACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAG AATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAG CAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCA TCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGC GCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTC GACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCA CAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCT GACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGC CCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTG GACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAA GCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCT TCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTC AACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATC ATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGA GGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTT CGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCT

- 172 047139

ACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTG AAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAG AAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCA AGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCA ACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTG ACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGG CCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGG CCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACC GTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAG ACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAG AGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAG AGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAG CTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAA CACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCT GCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGG ACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATC GTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAA CAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGA GCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATG AAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGAT CACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGA GAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATC AAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCA CGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGT ACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTG ATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAA GGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACT ACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGG GCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGC GAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAG AAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGG CCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACT TCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCA GAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGC GAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGT

- 173 047139

	GAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGA AGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAG AGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGC CAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCT TCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGG CCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAG CGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAA GCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCA AGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAG CTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAG AAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGG GCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCC TGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGC CCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCA GCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCA GCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAAC CTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGA CAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACC TGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCA AGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACC AGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCA GAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGA GCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAG AAGAGAAAGGTGTGA
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 52, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCA ACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAG GTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGA CAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGC TGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTG AAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGA ACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAG ATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGA GGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGA	53

- 174 047139

GACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCT ACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAG AAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACT GATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGG CCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAG CGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTA CAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCG GCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGC AAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCC CGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCG CCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACT TCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAG GACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCA GATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAA GAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAG AGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCA GCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTG ACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGA GAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACG GCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAG GAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATG GACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGA GGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCA GCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCA TCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGG ACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGA ATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGC AGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCAT CACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCG CCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCG ACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCAC AGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTG ACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCC CGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGG ACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAG

- 175 047139

CAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTT CGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCA ACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCA TCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAG GACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTC GAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTA CGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGA AGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGA AAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAA GACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAA CAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGAC CTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCC AGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCC GGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGT GAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGAC ACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAG AACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAG AGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTG GGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACAC CCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCA GAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACA TCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTG CCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAA GGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCG ACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAG AACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCAC CCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAG GCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAG AGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGT GGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACG ACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATC ACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGA CTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCA CCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCAC CGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGT

- 176 047139

TCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAG ATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCAC CGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTT CAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAA AGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAG ATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAG AAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGA AGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGC ATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAG AAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCG ACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCA AGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGT GAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCA GCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAG GGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCT GCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAA AGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGC AACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTG TACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCC CGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGC ACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGC GAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCT GGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACA AGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTG TTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAG TACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAG CACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGA GCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGC CAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAA GAGAAAGGTGTGACTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTC AGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCA ATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAG CCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCAT TTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGA AAGAACCTCGAG

- 177 047139

ОРС Cas9 с кодонами с минимальным содержанием уридина, редко используемым и у людей в целом; содержание U 12,75%

ATGGACAAAAAATACAGCATAGGGCTAGACATAGGGAC GAACAGCGTAGGGTGGGCGGTAATAACGGACGAATACA AAGTACCGAGCAAAAAATTCAAAGTACTAGGGAACACG GACCGACACAGCATAAAAAAAAACCTAATAGGGGCGCT ACTATTCGACAGCGGGGAAACGGCGGAAGCGACGCGAC TAAAACGAACGGCGCGACGACGATACACGCGACGAAAA AACCGAATATGCTACCTACAAGAAATATTCAGCAACGA AATGGCGAAAGTAGACGACAGCTTCTTCCACCGACTAG AAGAAAGCTTCCTAGTAGAAGAAGACAAAAAACACGAA CGACACCCGATATTCGGGAACATAGTAGACGAAGTAGC GTACCACGAAAAATACCCGACGATATACCACCTACGAA AAAAACTAGTAGACAGCACGGACAAAGCGGACCTACGA CTAATATACCTAGCGCTAGCGCACATGATAAAATTCCGA GGGCACTTCCTAATAGAAGGGGACCTAAACCCGGACAA CAGCGACGTAGACAAACTATTCATACAACTAGTACAAA CGTACAACCAACTATTCGAAGAAAACCCGATAAACGCG AGCGGGGTAGACGCGAAAGCGATACTAAGCGCGCGACT AAGCAAAAGCCGACGACTAGAAAACCTAATAGCGCAAC TACCGGGGGAAAAAAAAAACGGGCTATTCGGGAACCTA ATAGCGCTAAGCCTAGGGCTAACGCCGAACTTCAAAAG CAACTTCGACCTAGCGGAAGACGCGAAACTACAACTAA GCAAAGACACGTACGACGACGACCTAGACAACCTACTA GCGCAAATAGGGGACCAATACGCGGACCTATTCCTAGC GGCGAAAAACCTAAGCGACGCGATACTACTAAGCGACA TACTACGAGTAAACACGGAAATAACGAAAGCGCCGCTA AGCGCGAGCATGATAAAACGATACGACGAACACCACCA AGACCTAACGCTACTAAAAGCGCTAGTACGACAACAAC TACCGGAAAAATACAAAGAAATATTCTTCGACCAAAGC AAAAACGGGTACGCGGGGTACATAGACGGGGGGGCGAG CCAAGAAGAATTCTACAAATTCATAAAACCGATACTAG AAAAAATGGACGGGACGGAAGAACTACTAGTAAAACTA AACCGAGAAGACCTACTACGAAAACAACGAACGTTCGA CAACGGGAGCATACCGCACCAAATACACCTAGGGGAAC TACACGCGATACTACGACGACAAGAAGACTTCTACCCGT TCCTAAAAGACAACCGAGAAAAAATAGAAAAAATACTA

54

- 178 047139

ACGTTCCGAATACCGTACTACGTAGGGCCGCTAGCGCGA GGGAACAGCCGATTCGCGTGGATGACGCGAAAAAGCGA AGAAACGATAACGCCGTGGAACTTCGAAGAAGTAGTAG ACAAAGGGGCGAGCGCGCAAAGCTTCATAGAACGAATG ACGAACTTCGACAAAAACCTACCGAACGAAAAAGTACT ACCGAAACACAGCCTACTATACGAATACTTCACGGTATA CAACGAACTAACGAAAGTAAAATACGTAACGGAAGGGA TGCGAAAACCGGCGTTCCTAAGCGGGGAACAAAAAAAA GCGATAGTAGACCTACTATTCAAAACGAACCGAAAAGT AACGGTAAAACAACTAAAAGAAGACTACTTCAAAAAAA TAGAATGCTTCGACAGCGTAGAAATAAGCGGGGTAGAA GACCGATTCAACGCGAGCCTAGGGACGTACCACGACCT ACTAAAAATAATAAAAGACAAAGACTTCCTAGACAACG AAGAAAACGAAGACATACTAGAAGACATAGTACTAACG CTAACGCTATTCGAAGACCGAGAAATGATAGAAGAACG ACTAAAAACGTACGCGCACCTATTCGACGACAAAGTAA TGAAACAACTAAAACGACGACGATACACGGGGTGGGGG CGACTAAGCCGAAAACTAATAAACGGGATACGAGACAA ACAAAGCGGGAAAACGATACTAGACTTCCTAAAAAGCG ACGGGTTCGCGAACCGAAACTTCATGCAACTAATACACG ACGACAGCCTAACGTTCAAAGAAGACATACAAAAAGCG CAAGTAAGCGGGCAAGGGGACAGCCTACACGAACACAT AGCGAACCTAGCGGGGAGCCCGGCGATAAAAAAAGGGA TACTACAAACGGTAAAAGTAGTAGACGAACTAGTAAAA GTAATGGGGCGACACAAACCGGAAAACATAGTAATAGA AATGGCGCGAGAAAACCAAACGACGCAAAAAGGGCAA AAAAACAGCCGAGAACGAATGAAACGAATAGAAGAAG GGATAAAAGAACTAGGGAGCCAAATACTAAAAGAACAC CCGGTAGAAAACACGCAACTACAAAACGAAAAACTATA CCTATACTACCTACAAAACGGGCGAGACATGTACGTAG ACCAAGAACTAGACATAAACCGACTAAGCGACTACGAC GTAGACCACATAGTACCGCAAAGCTTCCTAAAAGACGA CAGCATAGACAACAAAGTACTAACGCGAAGCGACAAAA ACCGAGGGAAAAGCGACAACGTACCGAGCGAAGAAGTA GTAAAAAAAATGAAAAACTACTGGCGACAACTACTAAA

- 179 047139

CGCGAAACTAATAACGCAACGAAAATTCGACAACCTAA CGAAAGCGGAACGAGGGGGGCTAAGCGAACTAGACAA AGCGGGGTTCATAAAACGACAACTAGTAGAAACGCGAC AAATAACGAAACACGTAGCGCAAATACTAGACAGCCGA ATGAACACGAAATACGACGAAAACGACAAACTAATACG AGAAGTAAAAGTAATAACGCTAAAAAGCAAACTAGTAA GCGACTTCCGAAAAGACTTCCAATTCTACAAAGTACGAG AAATAAACAACTACCACCACGCGCACGACGCGTACCTA AACGCGGTAGTAGGGACGGCGCTAATAAAAAAATACCC GAAACTAGAAAGCGAATTCGTATACGGGGACTACAAAG TATACGACGTACGAAAAATGATAGCGAAAAGCGAACAA GAAATAGGGAAAGCGACGGCGAAATACTTCTTCTACAG CAACATAATGAACTTCTTCAAAACGGAAATAACGCTAGC GAACGGGGAAATACGAAAACGACCGCTAATAGAAACGA ACGGGGAAACGGGGGAAATAGTATGGGACAAAGGGCG AGACTTCGCGACGGTACGAAAAGTACTAAGCATGCCGC AAGTAAACATAGTAAAAAAAACGGAAGTACAAACGGGG GGGTTCAGCAAAGAAAGCATACTACCGAAACGAAACAG CGACAAACTAATAGCGCGAAAAAAAGACTGGGACCCGA AAAAATACGGGGGGTTCGACAGCCCGACGGTAGCGTAC AGCGTACTAGTAGTAGCGAAAGTAGAAAAAGGGAAAAG CAAAAAACTAAAAAGCGTAAAAGAACTACTAGGGATAA CGATAATGGAACGAAGCAGCTTCGAAAAAAACCCGATA GACTTCCTAGAAGCGAAAGGGTACAAAGAAGTAAAAAA AGACCTAATAATAAAACTACCGAAATACAGCCTATTCGA ACTAGAAAACGGGCGAAAACGAATGCTAGCGAGCGCGG GGGAACTACAAAAAGGGAACGAACTAGCGCTACCGAGC AAATACGTAAACTTCCTATACCTAGCGAGCCACTACGAA AAACTAAAAGGGAGCCCGGAAGACAACGAACAAAAAC AACTATTCGTAGAACAACACAAACACTACCTAGACGAA ATAATAGAACAAATAAGCGAATTCAGCAAACGAGTAAT ACTAGCGGACGCGAACCTAGACAAAGTACTAAGCGCGT ACAACAAACACCGAGACAAACCGATACGAGAACAAGCG GAAAACATAATACACCTATTCACGCTAACGAACCTAGG GGCGCCGGCGGCGTTCAAATACTTCGACACGACGATAG

- 180 047139

	ACCGAAAACGATACACGAGCACGAAAGAAGTACTAGAC GCGACGCTAATACACCAAAGCATAACGGGGCTATACGA AACGCGAATAGACCTAAGCCAACTAGGGGGGGACGGGG GGGGGAGCCCGAAAAAAAAACGAAAAGTATGA
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 54, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAAAAATACAGCATAGGGCTAGACATAGGGACGA ACAGCGTAGGGTGGGCGGTAATAACGGACGAATACAAA GTACCGAGCAAAAAATTCAAAGTACTAGGGAACACGGA CCGACACAGCATAAAAAAAAACCTAATAGGGGCGCTAC TATTCGACAGCGGGGAAACGGCGGAAGCGACGCGACTA AAACGAACGGCGCGACGACGATACACGCGACGAAAAAA CCGAATATGCTACCTACAAGAAATATTCAGCAACGAAAT GGCGAAAGTAGACGACAGCTTCTTCCACCGACTAGAAG AAAGCTTCCTAGTAGAAGAAGACAAAAAACACGAACGA CACCCGATATTCGGGAACATAGTAGACGAAGTAGCGTA CCACGAAAAATACCCGACGATATACCACCTACGAAAAA AACTAGTAGACAGCACGGACAAAGCGGACCTACGACTA ATATACCTAGCGCTAGCGCACATGATAAAATTCCGAGGG CACTTCCTAATAGAAGGGGACCTAAACCCGGACAACAG CGACGTAGACAAACTATTCATACAACTAGTACAAACGTA CAACCAACTATTCGAAGAAAACCCGATAAACGCGAGCG GGGTAGACGCGAAAGCGATACTAAGCGCGCGACTAAGC AAAAGCCGACGACTAGAAAACCTAATAGCGCAACTACC GGGGGAAAAAAAAAACGGGCTATTCGGGAACCTAATAG CGCTAAGCCTAGGGCTAACGCCGAACTTCAAAAGCAAC TTCGACCTAGCGGAAGACGCGAAACTACAACTAAGCAA AGACACGTACGACGACGACCTAGACAACCTACTAGCGC AAATAGGGGACCAATACGCGGACCTATTCCTAGCGGCG AAAAACCTAAGCGACGCGATACTACTAAGCGACATACT ACGAGTAAACACGGAAATAACGAAAGCGCCGCTAAGCG CGAGCATGATAAAACGATACGACGAACACCACCAAGAC CTAACGCTACTAAAAGCGCTAGTACGACAACAACTACC GGAAAAATACAAAGAAATATTCTTCGACCAAAGCAAAA ACGGGTACGCGGGGTACATAGACGGGGGGGCGAGCCAA	55

- 181 047139

GAAGAATTCTACAAATTCATAAAACCGATACTAGAAAA AATGGACGGGACGGAAGAACTACTAGTAAAACTAAACC GAGAAGACCTACTACGAAAACAACGAACGTTCGACAAC GGGAGCATACCGCACCAAATACACCTAGGGGAACTACA CGCGATACTACGACGACAAGAAGACTTCTACCCGTTCCT AAAAGACAACCGAGAAAAAATAGAAAAAATACTAACGT TCCGAATACCGTACTACGTAGGGCCGCTAGCGCGAGGG AACAGCCGATTCGCGTGGATGACGCGAAAAAGCGAAGA AACGATAACGCCGTGGAACTTCGAAGAAGTAGTAGACA AAGGGGCGAGCGCGCAAAGCTTCATAGAACGAATGACG AACTTCGACAAAAACCTACCGAACGAAAAAGTACTACC GAAACACAGCCTACTATACGAATACTTCACGGTATACAA CGAACTAACGAAAGTAAAATACGTAACGGAAGGGATGC GAAAACCGGCGTTCCTAAGCGGGGAACAAAAAAAAGCG ATAGTAGACCTACTATTCAAAACGAACCGAAAAGTAAC GGTAAAACAACTAAAAGAAGACTACTTCAAAAAAATAG AATGCTTCGACAGCGTAGAAATAAGCGGGGTAGAAGAC CGATTCAACGCGAGCCTAGGGACGTACCACGACCTACTA AAAATAATAAAAGACAAAGACTTCCTAGACAACGAAGA AAACGAAGACATACTAGAAGACATAGTACTAACGCTAA CGCTATTCGAAGACCGAGAAATGATAGAAGAACGACTA AAAACGTACGCGCACCTATTCGACGACAAAGTAATGAA ACAACTAAAACGACGACGATACACGGGGTGGGGGCGAC TAAGCCGAAAACTAATAAACGGGATACGAGACAAACAA AGCGGGAAAACGATACTAGACTTCCTAAAAAGCGACGG GTTCGCGAACCGAAACTTCATGCAACTAATACACGACGA CAGCCTAACGTTCAAAGAAGACATACAAAAAGCGCAAG TAAGCGGGCAAGGGGACAGCCTACACGAACACATAGCG AACCTAGCGGGGAGCCCGGCGATAAAAAAAGGGATACT ACAAACGGTAAAAGTAGTAGACGAACTAGTAAAAGTAA TGGGGCGACACAAACCGGAAAACATAGTAATAGAAATG GCGCGAGAAAACCAAACGACGCAAAAAGGGCAAAAAA ACAGCCGAGAACGAATGAAACGAATAGAAGAAGGGAT AAAAGAACTAGGGAGCCAAATACTAAAAGAACACCCGG TAGAAAACACGCAACTACAAAACGAAAAACTATACCTA

- 182 047139

TACTACCTACAAAACGGGCGAGACATGTACGTAGACCA AGAACTAGACATAAACCGACTAAGCGACTACGACGTAG ACCACATAGTACCGCAAAGCTTCCTAAAAGACGACAGC ATAGACAACAAAGTACTAACGCGAAGCGACAAAAACCG AGGGAAAAGCGACAACGTACCGAGCGAAGAAGTAGTAA AAAAAATGAAAAACTACTGGCGACAACTACTAAACGCG AAACTAATAACGCAACGAAAATTCGACAACCTAACGAA AGCGGAACGAGGGGGGCTAAGCGAACTAGACAAAGCG GGGTTCATAAAACGACAACTAGTAGAAACGCGACAAAT AACGAAACACGTAGCGCAAATACTAGACAGCCGAATGA ACACGAAATACGACGAAAACGACAAACTAATACGAGAA GTAAAAGTAATAACGCTAAAAAGCAAACTAGTAAGCGA CTTCCGAAAAGACTTCCAATTCTACAAAGTACGAGAAAT AAACAACTACCACCACGCGCACGACGCGTACCTAAACG CGGTAGTAGGGACGGCGCTAATAAAAAAATACCCGAAA CTAGAAAGCGAATTCGTATACGGGGACTACAAAGTATA CGACGTACGAAAAATGATAGCGAAAAGCGAACAAGAAA TAGGGAAAGCGACGGCGAAATACTTCTTCTACAGCAAC ATAATGAACTTCTTCAAAACGGAAATAACGCTAGCGAA CGGGGAAATACGAAAACGACCGCTAATAGAAACGAACG GGGAAACGGGGGAAATAGTATGGGACAAAGGGCGAGA CTTCGCGACGGTACGAAAAGTACTAAGCATGCCGCAAG TAAACATAGTAAAAAAAACGGAAGTACAAACGGGGGGG TTCAGCAAAGAAAGCATACTACCGAAACGAAACAGCGA CAAACTAATAGCGCGAAAAAAAGACTGGGACCCGAAAA AATACGGGGGGTTCGACAGCCCGACGGTAGCGTACAGC GTACTAGTAGTAGCGAAAGTAGAAAAAGGGAAAAGCAA AAAACTAAAAAGCGTAAAAGAACTACTAGGGATAACGA TAATGGAACGAAGCAGCTTCGAAAAAAACCCGATAGAC TTCCTAGAAGCGAAAGGGTACAAAGAAGTAAAAAAAGA CCTAATAATAAAACTACCGAAATACAGCCTATTCGAACT AGAAAACGGGCGAAAACGAATGCTAGCGAGCGCGGGG GAACTACAAAAAGGGAACGAACTAGCGCTACCGAGCAA ATACGTAAACTTCCTATACCTAGCGAGCCACTACGAAAA ACTAAAAGGGAGCCCGGAAGACAACGAACAAAAACAA

- 183 047139

	CTATTCGTAGAACAACACAAACACTACCTAGACGAAAT AATAGAACAAATAAGCGAATTCAGCAAACGAGTAATAC TAGCGGACGCGAACCTAGACAAAGTACTAAGCGCGTAC AACAAACACCGAGACAAACCGATACGAGAACAAGCGGA AAACATAATACACCTATTCACGCTAACGAACCTAGGGGC GCCGGCGGCGTTCAAATACTTCGACACGACGATAGACC GAAAACGATACACGAGCACGAAAGAAGTACTAGACGCG ACGCTAATACACCAAAGCATAACGGGGCTATACGAAAC GCGAATAGACCTAAGCCAACTAGGGGGGGACGGGGGGG GGAGCCCGAAAAAAAAACGAAAAGTATGACTAGCCATC ACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAG AAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTC TTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTC AATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов ДЛЯ использовани я с CleanCap™, 5’-НТО HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	AGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAA ACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAG GTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGA CAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGC TGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTG AAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGA ACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAA ATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGA AGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAA GACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCAT ACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAG AAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACT GATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGG ACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACA GCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACAT ACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGC GGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAG CAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGC	56

- 184 047139

CGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATC GCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAA CTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCA AGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCA CAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGC AAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCC TGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGC GCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGA CCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCC GGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGA ACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAG GAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAA GATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACA GAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAAC GGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCA CGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCT GAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACAT TCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGA AACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGA AACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACA AGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACA AACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCC GAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAA CGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGA GAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA ATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCAC AGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCG AATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGAC AGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCT GAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAG AAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTG ACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACT GAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGA AGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAG ACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGC

- 185 047139

AGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGAC GGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC GACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACA GGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCG CAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATC CTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGT CATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAA TGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAA GAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGA ATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCC GGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGAC CAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGT CGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACA GCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAAC AGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGT CAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACG CAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACA AAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGG CAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAG ATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAAT GAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAG AAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGC GACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGA AATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGA ACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCG AAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGT CTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGG AAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGC AACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCA AACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAA CGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGA GACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCA GGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAG GATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGC

- 186 047139

	GACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAA GAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACA GCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGC AAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCAC AATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCG ACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAG GACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAA CTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATC ACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAG AAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTC TTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTC AATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от CMV, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО ALB	GGGCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGAC CTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGG CCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCA AGAGTGACTCACCGTCCTTGACACGGCCACCATGGACAA GAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCG TCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCG AGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACA CAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCG ACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAG	57

- 187 047139

AACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGA ATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCA AAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAG CTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACC CGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACG AAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTG GTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTA CCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTT CCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACG TCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACC AGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTC GACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAG CAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAG AAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTG AGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGA CCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACA CATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATC GGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAA CCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGT CAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCA TGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACA CTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAA GTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGAT ACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAA TTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGAC GGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGA CCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCA TCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCC TGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGAC AACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAAT CCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCA GATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATC ACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGC AAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCG ACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCAC

- 188 047139

AGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTG ACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCC GGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCG ACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAG CAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTT CGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCA ACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATC ATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGA AGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTT CGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACAT ACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTG AAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCA GAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGA AAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGC AAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCC TGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGC GGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCT GGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGA CAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGA AGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAG AGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGC AGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGG AACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAA AACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTA CCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAAC TGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCAC ATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGAC AACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAA AGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAG ATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCT GATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAG AGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTC ATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAA GCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAA AGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAG

- 189 047139

GTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAG AAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACA ACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTC GTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGA AAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGT CAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAA AGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGA ACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAA ATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAAC AGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAA CAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATC GTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAA GGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGA TCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGA GGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTC GTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGA AGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAA AGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGA AGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCA TCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAAC GGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCA GAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCA ACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGG GAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTC GAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACA GATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACG CAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCAC AGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCAT CCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGC ATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGAT ACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATC CACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGA CCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGA AGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAA AGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAAT

- 190 047139

	GAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTG GTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCT TTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAA AAAATGGAAAGAACCTCGAG
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от НВВ, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО НВВ	GGGacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccggatctgcc accATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGA ACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATA CAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACA CAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCA CTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAG ACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGA AAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAA CGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACT GGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACG AAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTC GCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAG AAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGA GACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCA GAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGAC AACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAG ACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGC AAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGAC TGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAG CTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCT GATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGA GCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTG AGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCT GGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGG CAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGAC ATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCT GAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACC AGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAG CTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAG CAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAA GCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGG	58

- 191 047139

AAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTG AACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGA CAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAAC TGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGT TCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTG ACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGA GGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGA AGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCG ACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATG ACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCT GCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTA CAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAA TGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAG GCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGT CACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGA TCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAA GACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCT GCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACG AAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACA CTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAG ACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCAT GAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGA AGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAA GCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCG ACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACG ACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCA CAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACAT CGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAA TCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAG GTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGA AATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAG AAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAG GAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACAC CCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTA CCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCG

- 192 047139

ACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGAC GTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGAC AGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAA CAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCG TCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAAC GCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGAC AAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAG GCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACA GATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAA TGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGA GAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAG CGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGA AATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGA ACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCG AAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGT CTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGG AAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGC AACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCA AACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAA CGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGA GACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCA GGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAG GATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAA GAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACA GCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGC AAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCAC AATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCG ACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAG GACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAA CTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT

- 193 047139

	CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGctagcgctcgctttct tgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatg aagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcctcgag
Транскрипт Cas9 с 5’-НТО от XBG, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО XBG	GGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccacCATGGACAAGA AGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTC GGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAG CAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACA GCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGAC AGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAA CAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAAT CTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAA AGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGC TTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCC GATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGA AAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGG TCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTAC CTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTC CTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGT CGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCA GCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCG ACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGC AGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGA AAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGA GCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACC TGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACA TACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGG AGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACC	59

- 194 047139

TGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCA ACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATG ATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACT GCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGT ACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATAC GCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATT CTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACG GAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGAC CTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCAT CCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCT GAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACA ACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATC CCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAG ATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCA CACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCA AGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGA CAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACA GCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGA CAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCG GCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGA CCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGC AGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTC GACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAA CGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCA TCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAA GACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTC GAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATA CGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGA AGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAG AAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAA AGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCA AACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCT GACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCG GACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTG GCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGAC

- 195 047139

AGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAA GACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGA GAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCA GAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGA ACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAA ACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTAC CTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACT GGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACA TCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACA ACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAA GAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGA TGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTG ATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGA GAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCA TCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAG CACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAA GTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGG TCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGA AAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAA CTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGT CGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAA GCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCA GAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAA GGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAA CTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAA TCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACA GGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAAC AGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCG TCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAG GAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGAT CGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGA GGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTC GTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGA AGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAA AGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGA

- 196 047139

	AGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCA TCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAAC GGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCA GAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCA ACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGG GAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTC GAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACA GATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACG CAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCAC AGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCAT CCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGC ATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGAT ACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATC CACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGA CCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGA AGAAGAAGAGAAAGGTCTAGctagcaccagcctcaagaacacccgaat ggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccat tcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctctcgag
Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов ДЛЯ использовани я с CleanCap™, 5’-НТО от XBG, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО XBG	AGGaagctcagaataaacgctcaactttggccggatctgccacCATGGACAAGA AGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTC GGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAG CAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACA GCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGAC AGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAA CAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAAT CTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAA AGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGC TTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCC GATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGA AAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGG TCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTAC CTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTC CTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGT CGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCA GCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCG	60

- 197 047139

ACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGC AGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGA AAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGA GCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACC TGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACA TACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGG AGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACC TGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCA ACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATG ATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACT GCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGT ACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATAC GCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATT CTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACG GAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGAC CTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCAT CCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCT GAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACA ACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATC CCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAG ATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCA CACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCA AGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGA CAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACA GCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGA CAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCG GCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGA CCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGC AGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTC GACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAA CGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCA TCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAA GACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTC GAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATA CGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGA

- 198 047139

AGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAG AAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAA AGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCA AACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCT GACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCG GACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTG GCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGAC AGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAA GACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGA GAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCA GAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGA ACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAA ACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTAC CTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACT GGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACA TCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACA ACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAA GAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGA TGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTG ATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGA GAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCA TCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAG CACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAA GTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGG TCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGA AAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAA CTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGT CGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAA GCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCA GAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAA GGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAA CTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAA TCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACA GGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAAC AGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCG

- 199 047139

	TCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAG GAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGAT CGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGA GGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTC GTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGA AGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAA AGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGA AGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCA TCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAAC GGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCA GAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCA ACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGG GAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTC GAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACA GATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACG CAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCAC AGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCAT CCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGC ATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGAT ACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATC CACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGA CCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGA AGAAGAAGAGAAAGGTCTAGctagcaccagcctcaagaacacccgaat ggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccat tcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacattctctcgag
Транскрипт Cas9 с AGG в качестве первых трех нуклеотидов ДЛЯ использовани я с CleanCap™, 5’-НТО от	AGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGT GTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCAT GGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAA ACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAG GTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGA CAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGC TGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTG AAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGA ACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAA ATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGA	61

- 200 047139

HSD, ОРС, соответствую щая SEQ ID NO: 4, последователь ность Козак и З’-НТО ALB

AGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAA GACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCAT ACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAG AAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACT GATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGG ACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACA GCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACAT ACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGC GGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAG CAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGC CGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATC GCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAA CTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCA AGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCA CAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGC AAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCC TGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGC GCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGA CCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCC GGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGA ACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAG GAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAA GATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACA GAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAAC GGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCA CGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCT GAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACAT TCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGA AACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGA AACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACA AGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACA AACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCC GAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAA CGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGA GAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCA

- 201 047139

ATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCAC AGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCG AATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGAC AGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCT GAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAG AAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTG ACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACT GAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGA AGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAG ACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGC AGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGAC GGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGAC GACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACA GGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCG CAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATC CTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGT CATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAA TGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAA GAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGA ATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCC GGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACC TGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGAC CAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGT CGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACA GCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAAC AGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGT CAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACG CAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACA AAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGG CAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAG ATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAAT GAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAG AAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGC GACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGA AATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGA

- 202 047139

ACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCG AAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGT CTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGG AAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGC AACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCA AACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAA CGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGA GACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCA GGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAG GATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGC GACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAA GAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACA GCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGC AAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCAC AATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCG ACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAG GACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAA CTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGG AGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCA AGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAA AGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCA GCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAAT CATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCC TGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATAC AACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAG AAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAG CACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACA GAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCA ACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAAC AAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAG GAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATC ACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAG AAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTC TTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTC

- 203 047139

	AATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
30/30/39 последователь ность поли-А	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCGAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	62
последователь ность поли-А 100	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA	63
Гидовая РНК G209	mCmCmAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUA GAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmUmUmUU	64
ОРС, кодирующая Cas9 Neisseria meningitidis	ATGGCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTG GGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAAT GGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGA TCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTC CCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACT GGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCAC ACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAA GGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACT GATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAG CAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGG TCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATAC CTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACA AGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAAC GCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGC AGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGAC ACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCT CGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTC GAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGG AGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACAC AGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATG CTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGC AGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGC TGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGA TCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACT GATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACG	65

- 204 047139

CACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCA TTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGA AGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAA TCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAG AAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGA AATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAG ACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAA ATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAG TTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTC CCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATG CGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACA CAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGAC GAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCA GGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACG GATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAA GTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAA GAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCA GCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGA GAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTA CGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGG AAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTC GAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGA CGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGA AAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACT TCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTC AAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAA GAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACG GATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTC AACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGA CTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAA CGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGAC TGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCA CTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATG CAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAAT GAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAG

- 205 047139

	GAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCG TGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTC GGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAG ACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAG CTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCAC ACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTC GGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGA GACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTG ACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAA CAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGG CAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCA TTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAA CAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGG TCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGA ATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTT CGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTC GTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAG TCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATC GACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAAC GACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTT CGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACA TCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGA AAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGC ACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAA AGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCG GTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATT CGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAATGA
OPC, кодирующая Cas9 Neisseria meningitidis (без старт- или стоп-кодонов; подходит для включения в	GCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTGGGA CTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAATGGTC GAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGATCGA CCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTCCCGA AGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACTGGCA AGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCACACAG ACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAAGGAG TCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACTGATC	66

- 206 047139

последователь ность, кодирующую слитый белок)

AAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAGCAGC AGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGGTCGG CAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATACCTGT CGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGA ACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAACGCAC ACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGCAGAA CTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGACACAT CAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCTCGA GAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTCGAA AAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGGAGG ACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACACAGA GACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATGCTG GGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGC AAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGCTGA CAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGATCG GAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACTGAT GGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACGCAC AGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCATTC TTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGAAGC ATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAATCT CGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAGAA GTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGAAA TCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAGAC ATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAAAT CCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAGTT CGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTCCC GCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATGCG CAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACACA GAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGACGA AATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCAGG CAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACGGA TCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAAGT CGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAAGA GACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGC AGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGAGA

- 207 047139

ACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTACG AACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGGAA ATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTCGA AATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGACG ACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGAAA ACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACTTC AACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTCAA GGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAAGA AGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACGGA TTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTCAA CAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGACT GACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAACG GACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGACTG AGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACT GGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATGCA GCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAATGA ACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAGGA GAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCGTG GGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTCGG AAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAGACA CACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAGCTG TCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCACACC GCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTCGG GACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGAGA CTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTGACA CAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAACAG AGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGGCAA GACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCATTC GCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAACAG AACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGGTCC AGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGAATC GCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTTCGA AAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTCGTG GCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAGTCG TCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATCGAC

- 208 047139

	GACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAACGAC CTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTTCGG ATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACATCA ACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGAAAG AACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGCACT GTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAAAGG AAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCGGTC AGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATTCGA ATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAA
Транскрипт, содержащий SEQ ID NO: 65 (кодирующую Cas9 Neisseria meningitidis)	GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGG ATCCGCCACCATGGCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAA CTACATCCTGGGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGG ATGGGCAATGGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGA TCAGACTGATCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGA GCAGAAGTCCCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGC AAGAAGACTGGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAA GAAGAGCACACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTG AAGAGAGAAGGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGA AAACGGACTGATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGC AGCTGAGAGCAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCG CTGGAATGGTCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCAC AGAGGATACCTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAAC AGCAGACAAGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCG CAGGAAACGCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGA ACACCGGCAGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGA ATCGGGACACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGC ACACATTCTCGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATC CTGCTGTTCGAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCA CGTCTCGGGAGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGC TGATGACACAGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTC CAGAAGATGCTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGA ACCGAAGGCAGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGAT TCATCTGGCTGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGG AACAGGGATCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGA GCAACACTGATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCT	67

- 209 047139

GACATACGCACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAG ACACAGCATTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGAC AACGCAGAAGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATA CCACGCAATCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGA AGGACAAGAAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTG CAGGACGAAATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGAC AGACGAAGACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCC AGCCGGAAATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGT TCGACAAGTTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAA GAATCGTCCCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGAC GAAGCATGCGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAA GAAGAACACAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCC CGGCAGACGAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCA CTGTCGCAGGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAG AAGATACGGATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAG CAAGAGAAGTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAA ATCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAG AAAAGGCAGCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAAC TTCGTCGGAGAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCT GAGACTGTACGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACT CGGGAAAGGAAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAG GGATACGTCGAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGA ACATGGGACGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTG GGATCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTA CGAATACTTCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGC AGGAATTCAAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCG AGATCGAAGAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGA CGAAGACGGATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAA GATACGTCAACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACA GAATGAGACTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTC GCATCGAACGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATT CTGGGGACTGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGAC ACCACGCACTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAG TCGCAATGCAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATAC AAGGAAATGAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAA

- 210 047139

GGAAACAGGAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCC CGCAGCCGTGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCA GAGTCTTCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAA GAAGCAGACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGC AGAAAAGCTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAAT ACGTCACACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAA AGATGTCGGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCG GCAAAGAGACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGT CCCGCTGACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGA TGGTCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCA CTGAAGGCAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGC AAAGGCATTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGG CAGGAAACAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTC GAACAGGTCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCA CAACGGAATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAG ACGTCTTCGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCG ATCTACTCGTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGAC AGAGCAGTCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCA GCTGATCGACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCA CCCGAACGACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAA GAATGTTCGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAG GAAACATCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAG ATCGGAAAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAA GACAGCACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACT GGGAAAGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGAC CGCCGGTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCG GAATTCGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAATG ATAGCTAGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCT GATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTG TTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAAT TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGG GGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGG GAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTC TATGG

- 211 047139

Аминокислот ная последователь ность Cas9 Neisseria meningitidis	MAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLG VRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRT RRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKL TPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGV AGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHT FSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQR PALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKL NNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLL GLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKE GLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQP EILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAE IYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVIN GVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDR EKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSG KEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSE NQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKK QRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTG KGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAV VVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLH QKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRT LLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVK SAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEAL KARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQ VQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYS WQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDL VEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILE GIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTAD GSEFESPKKKRKVE	68
Гидовая РНК G390	mGmCmCGAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmC mU mAmGmAmAmAmU mAmGmC A AGUU A A A AU AAGGCU AGU CC GUU AU C AmAmCmU mU mGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUm UmUmU	69
Гидовая РНК G502	mAmCmA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC mU mAmGmAmAmAmU mAmGmC A AGUU A A A AU AAGGCU	70

- 212 047139

	AGU СС GUU AU С AmAmCmU mU mGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUm UmU*mU
Гидовая РНК G509	mAmAmAGUUCUAGAUGCCGUCCGGUUUUAGAmGmC mU mAmGmAmAmAmU mAmGmC A AGUU A A A AU AAGGCU AGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUm UmUmU	71
Гидовая РНК G534	mAmCmGCAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmC mU mAmGmAmAmAmU mAmGmC A AGUU A A A AU AAGGCU AGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUm UmUmU	72

* = связь PS; 'm' = 2'-O-Me нуклеотид.

Последовательности праймеров для NGS G000282 мыши.

Прямой праймер:

CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTTTGTTCCAGAGTCTATCACCG

Обратный праймер:

GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACACGAATAAGAGCAAATGGGAAC

Последовательности праймеров для NGS G000390 крысы

Прямой праймер:

CACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCATTTCATGAGACCGAAAACA

Обратный праймер:

GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTACAGTAGAGCTGTACATAAAACTT Последовательность GFP:

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGA GACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCG CGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAG ATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAG AAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGC GATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCA AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGAC GGCCAGTGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCT CTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGTGAGCAAGGG CGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAA ACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTC GTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAG

- 213 047139

CAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATC TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGA CACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACA TCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCC GACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGG ACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGA CCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGA TCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATAGGAATTATGCAGTCTAGCCATCA CATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAT AGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAA CATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGG AAAGAACCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAATCTAGACTTAAGCTTGATGAGCTCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCT GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAG CATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT GCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAAT CGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCT CACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAA GGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAG CAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTG GCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCG TGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTC GGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGT CGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGC CTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACT GGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAG AGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCT GCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCA AACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGT GGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTC ACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAG TAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATC TGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATAC GGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCA CCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAG TGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAG

- 214 047139

AGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCAT CGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCA AGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCT CCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCA CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGT ACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGG CGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTG GAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTT CGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGT TTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCG ACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATC AGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAA TAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTA TTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCG

Claims

1. Фармацевтическая композиция липидных наночастиц, содержащая:

РНК-компонент, где РНК-компонент содержит (i) мРНК, кодирующую РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент, и (ii) нуклеиновую кислоту гРНК; и липидный компонент, причем липидный компонент содержит:

50-60 мол.% аминолипида;

8-10 мол.% нейтрального липида; и

2,5- 4 мол.% ПЭГ-липида, при этом остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, аминолипид представлен следующей структурной формулой:

где R¹ и R², каждый независимо, представляет собой C₄-C₁₂ алкил, и при этом соотношение N/P композиции LNP составляет 6.

2. Фармацевтическая композиция LNP, содержащая:

РНК-компонент, где РНК-компонент содержит (i) мРНК, кодирующую РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент, и (ii) нуклеиновую кислоту гРНК; и липидный компонент, при этом липидный компонент содержит:

50-60 мол.% аминолипида;

27-39,5 мол.% вспомогательного липида;

8-10 мол.% нейтрального липида; и

2,5- 4 мол.% ПЭГ-липида, аминолипид представлен следующей структурной формулой:

где R¹ и R², каждый независимо, представляет собой C.|-C|₂ii.n<H.i, и причем соотношение N/P композиции LNP составляет 5-7.

3. Композиция по п.6, причем липидный компонент содержит:

50-60 мол.% аминолипида;

5-10 мол.% нейтрального липида; и

2,5- 4 мол.% ПЭГ-липида.

4. Фармацевтическая композиция LNP, содержащая:

40-60 мол.% аминолипида;

- 215 047139

5-15 мол.% нейтрального липида; и

2,5-4 мол.% ПЭГ-липида, при этом остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, аминолипид представлен следующей структурной формулой:

где R¹ и R², каждый независимо, представляет собой С₄-С₁₂алкил, и при этом соотношение N/P композиции LNP составляет 6.

5. Фармацевтическая композиция LNP, содержащая:

РНК-компонент, где РНК-компонент содержит (i) мРНК, кодирующую РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент, и (ii) нуклеиновую кислоту гРНК;и липидный компонент, причем липидный компонент содержит:

50-60 мол.% аминолипида;

5-15 мол.% нейтрального липида; и

1,5- 10 мол.% ПЭГ -липида, при этом остаток липидного компонента представляет собой вспомогательный липид, аминолипид представлен следующей структурной формулой:

6. Фармацевтическая композиция LNP, содержащая:

40-60 мол.% аминолипида;

менее 10 мол.% нейтрального липида; и

где R¹ и R², каждый независимо, представляет собой С₄-С₁₂алкил, и при этом соотношение N/P композиции LNP составляет 5-7.

7. Композиция по п.6, причем липидный компонент содержит:

менее чем 1 мол.% нейтрального липида.

8. Фармацевтическая композиция LNP, содержащая:

50-60 мол.% аминолипида;

8-10 мол.% нейтрального липида; и

- 216 047139

9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой РНК-направляемый ДНКсвязывающий агент представляет собой Cas-нуклеазу.

10. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой РНК-компонент содержит мРНК Cas-нуклеазы класса 2, такой как мРНК нуклеазы Cas9.

11. Композиция по п.9 или 10, в которой мРНК представляет собой модифицированную мРНК.

12. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой мРНК содержит открытую рамку считывания, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, при этом открытая рамка считывания имеет содержание уридина в диапазоне от минимального содержания уридина до 150% от минимального содержания уридина или открытую рамку считывания, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент, при этом открытая рамка считывания имеет содержание уридинового динуклеотида в диапазоне от минимального содержания уридинового динуклеотида до 150% от минимального содержания уридинового динуклеотида.

13. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой мРНК содержит последовательность с по меньшей мере 90% идентичностью с любой из SEQ ID NO: 1, 4, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 или 66 и, при этом, мРНК содержит открытую рамку считывания, кодирующую РНК-направляемый ДНК-связывающий агент.

14. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой нуклеиновая кислота гРНК представляет собой гРНК.

15. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой РНК-компонент содержит мРНК нуклеазы Cas класса 2 и гРНК.

16. Композиция по п.14 или 15, в которой нуклеиновая кислота гРНК представляет собой или кодирует двойную гидовую РНК (дгРНК) или огРНК.

17. Композиция по любому из пп.14-16, в которой гРНК содержит модификацию, такую как модификация, выбранная из 2'-О-метил (2'-О-Ме)-модифицированного нуклеотида, фосфоротиоатной (PS) связи между нуклеотидами; и 2'-фтор (2'^)-модифицированного нуклеотида.

18. Композиция по п.17, в которой гРНК содержит модификацию на одном или более из первых пяти нуклеотидов на 5'-конце или гРНК содержит модификацию на одном или более из последних пяти нуклеотидов на 3'-конце.

19. Композиция по п.17 или 18, в которой гРНК содержит PS связи между первыми четырьмя нуклеотидами или гРНК содержит PS связи между последними четырьмя нуклеотидами.

20. Композиция по любому из пп.17-19, дополнительно содержащая 2'-О-Ме-модифицированные нуклеотиды в первых трех нуклеотидах на 5'-конце или 2'-О-Ме-модифицированные нуклеотиды в последних трех нуклеотидах на 3'-конце.

21. Композиция по любому из пп.14-20, в которой гРНК и мРНК Cas-нуклеазы класса 2 присутствуют в массовом соотношении от 10:1 до 1:10, от 5:1 до 1:5, от 3:1 до 1:1 или от 2:1 до 1:1.

22. Композиция по любому из пп.14-20, в которой гРНК и мРНК Cas-нуклеазы класса 2 присутствуют в массовом соотношении 2:1 или в массовом соотношении 1:1.

23. Композиция по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащая по меньшей мере одну матричную нуклеиновую кислоту.

24. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой липидный компонент содержит 3 мол.% ПЭГ-липида.

25. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой липидный компонент содержит 50 или 55 мол.% аминолипида.

26. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой липидный компонент содержит 47-53, 48-53 или 53-57 мол.% аминолипида.

27. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой соотношение N/P равно 6±1.

28. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой соотношение N/P равно 6±0,5.

29. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой каждый из R¹ и R² независимо представляет собой ^-^алкил.

30. Композиция по любому из пп.1-28, где R¹ и R², каждый независимо, представляет собой С₅С1₀алкил.

31. Композиция по любому из пп.1-28, где ацеталевый аналог выбран из С4, С5, С6, С7, С9, С10,

- 217 047139

С11 и С12 аналога.

32. Композиция по любому из пп.1-28, в которой аминолипид представляет собой Липид А, где Липид А представлен следующей структурной формулой:

33. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где вспомогательный липид выбран из холестерина, 5-гептадецилрезорцина и гемисукцината холестерина.

34. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой вспомогательный липид представляет собой холестерин.

35. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где нейтральный липид выбран из дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), диолеилфосфатидилхолина (DOPC), димиристоилфосфатидилхолина (DMPC), 1-пальмитоил-2-линолеоил-sn-глицеро-3фосфохолина (PLPC), 1,2-диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина (DAPC), фосфатидилэтаноламина (РЕ), яичного фосфатидилхолина (ЕРС), дилауроилфосфатидилхолина (DLPC), 1-миристоил-2пальмитоилфосфатидилхолина (МРРС), 1-пальмитоил-2-миристоилфосфатидилхолина (РМРС), 1пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолина (PSPC), 1,2-дибегеноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DBPC), 1стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолина (SPPC), 1,2-диэйкозеноил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (РОРС), лизофосфатидилхолина, диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE), дилинолеоилфосфатидилхолина, дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE), димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламина (POPE), лизофосфатидилэтаноламина и их комбинации.

36. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой нейтральный липид представляет собой DSPC или DPPC.

37. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где нейтральный липид представляет собой DSPC.

38. Композиция по любому одному из пп.1-36, где нейтральный липид представляет собой DPPC.

39. Композиция по любому одному из пп.1-35, где нейтральный липид представляет собой димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE).

40. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой ПЭГ-липид содержит димиристоилглицерин (ДМГ) и/или ПЭГ-липид содержит ПЭГ-2к.

41. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ-ДМГ.

42. Композиция по п.41, в которой ПЭГ-ДМГ представляет собой ПЭГ2к-ДМГ.

43. Композиция по п.40, в которой ПЭГ-липид представляет собой ПЭГ2к-ДМГ.

44. Композиция по любому одному из пп.1-39, где ПЭГ-липид выбран из ПЭГ-дилауроилглицерина, ПЭГ-димиристоилглицерина (ПЭГ-ДМГ), ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистеароилглицерина (ПЭГ -ДСФЭ), ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистеароилгликамида, ПЭГ-холестерина (1-[8'-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метил-поли(этиленгликоля), ПЭГ-ДМБ (3,4-дитетрадекоксилбензил[омега]-метил-поли(этиленгликоль)эфира), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-

[метокси(полиэтиленгликоля)-2000] (ПЭГ2к-ДМГ), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N[метокси(полиэтиленгликоля)-2000] (ПЭГ2к-ДСФЭ), 1,2-дистеароил-sn-глицерин метоксиполиэтиленгликоля (ПЭГ2к-ДСГ), полиэтиленгликоль-2000-диметакрилата (ПЭГ2к-ДМА) и 1,2дистеарилоксипропил-3-амин-№[метокси(полиэтиленгликоля)-2000] (ПЭГ2к-ДСА).

45. Способ редактирования генов или получения генетически сконструированной клетки, включающий приведение в контакт клетки с композицией LNP по любому из предшествующих пунктов.

46. Способ по п.45, в котором композицию LNP вводят по меньшей мере два раза, таким образом, как 2-5 раз.

47. Способ по п.46, в котором редактирование улучшается при повторном введении.

48. Способ по любому из пп.45-47, дополнительно включающий введение по меньшей мере одной матричной нуклеиновой кислоты в клетку.