EA046732B1 - METHODS OF VIRAL INACTIVATION WITH ECOLOGICALLY COMPATIBLE DETERGENTS - Google Patents
METHODS OF VIRAL INACTIVATION WITH ECOLOGICALLY COMPATIBLE DETERGENTS Download PDFInfo
- Publication number
- EA046732B1 EA046732B1 EA202291402 EA046732B1 EA 046732 B1 EA046732 B1 EA 046732B1 EA 202291402 EA202291402 EA 202291402 EA 046732 B1 EA046732 B1 EA 046732B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- detergent
- feed stream
- simulsol
- protein
- minutes
- Prior art date
Links
- 239000003599 detergent Substances 0.000 title claims description 172
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 143
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 43
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 title description 82
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 117
- -1 alkyl glucosides Chemical class 0.000 claims description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 71
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims description 66
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 39
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical group CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 21
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 16
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 13
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 12
- ULDAPNVYSDTSFM-VDWCLKJHSA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-undecoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ULDAPNVYSDTSFM-VDWCLKJHSA-N 0.000 claims description 10
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 8
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 claims description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 72
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 25
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 11
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N alpha-D-glucopyranose Natural products OCC1OC(O)C(O)C(O)C1O WQZGKKKJIJFFOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 6
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- ISAVYTVYFVQUDY-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 ISAVYTVYFVQUDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 4
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 3
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000290 environmental risk assessment Toxicity 0.000 description 3
- 231100000584 environmental toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 3
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 3
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 3
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 239000004146 Propane-1,2-diol Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Natural products OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000010935 polish filtration Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000610 predicted environmental concentration Toxicity 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- DNGRSEDIJFQDKR-NQNKBUKLSA-N (2R,3R,4S,5S,6R)-6-(hydroxymethyl)-2-undecyloxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@@]1([C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O1)CO)O)O)O)O DNGRSEDIJFQDKR-NQNKBUKLSA-N 0.000 description 1
- BZANQLIRVMZFOS-ZKZCYXTQSA-N (3r,4s,5s,6r)-2-butoxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BZANQLIRVMZFOS-ZKZCYXTQSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- WGYZMNBUZFHYRX-UHFFFAOYSA-N 1-(1-methoxypropan-2-yloxy)propan-2-ol Chemical compound COCC(C)OCC(C)O WGYZMNBUZFHYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 5-aminoisoindole-1,3-dione Chemical compound NC1=CC=C2C(=O)NC(=O)C2=C1 PXRKCOCTEMYUEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010067572 Oestrogenic effect Diseases 0.000 description 1
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001076 estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000012006 liquid chromatography with tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229940051841 polyoxyethylene ether Drugs 0.000 description 1
- 229920000056 polyoxyethylene ether Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002553 single reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002948 undecyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области производства рекомбинантного белка. В частности, изобретение обеспечивает способ инактивации вирусов при подаче питательных веществ в процессе производства белков, предназначенных для введения пациенту, таких как терапевтические или диагностические белки. Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ, в котором экологически безопасный детергент эффективно обеспечивает противовирусную активность и поддерживает качество терапевтического или диагностического белка. Способы обеспечивают важные преимущества при производстве биологических продуктов в реальном мире, например, по сравнению со способами, использующими Тритон Х100, и/или способами, в которых не используется детергент.The invention relates to the field of production of recombinant protein. In particular, the invention provides a method for inactivating viruses when supplied with nutrients during the production of proteins intended for administration to a patient, such as therapeutic or diagnostic proteins. The present invention further provides a method in which an environmentally friendly detergent effectively provides antiviral activity and maintains the quality of a therapeutic or diagnostic protein. The methods provide important advantages in the production of biological products in the real world, for example, compared to methods using Triton X100 and/or methods that do not use detergent.
Детергенты являются ключевыми реагентами в процессе производства терапевтических или диагностических белков для обеспечения безопасности конечного биологического продукта. Вирусная контаминация конечного биологического продукта может иметь серьезные клинические последствия, возникающие, например, в результате контаминации исходных клеточных линий или адвентивного введения вирусов на различных стадиях производства. Таким образом, детергенты используются для удаления вирусных контаминантов, присутствующих в сырьевом потоке в процессе производства терапевтического или диагностического белка. После очистки желаемого белка ростовая среда и буферы, используемые в процессе производства и очистки продукта, инактивируются и сбрасываются в сточные воды. Однако, такие отходы содержащие детергенты, которые используются в процессе производства и очистки, могут вызвать экологические проблемы, согласно системе оценок рисков для окружающей среды (ERA) для детергентов.Detergents are key reagents during the production of therapeutic or diagnostic proteins to ensure the safety of the final biological product. Viral contamination of the final biological product can have serious clinical consequences, arising, for example, from contamination of the original cell lines or adventitious introduction of viruses at various stages of production. Thus, detergents are used to remove viral contaminants present in the feed stream during the production of a therapeutic or diagnostic protein. Once the desired protein is purified, the growth media and buffers used during the production and purification of the product are inactivated and discharged into wastewater. However, such waste containing detergents that are used in the production and cleaning process may cause environmental problems, according to the Environmental Risk Assessment (ERA) system for detergents.
Современные способы инактивации вирусов в процессе производства биопродуктов, таких как терапевтические или диагностические белки, в значительной степени зависят от использования детергента Тритон Х-100. Тритон Х-100 представляет собой полиоксиэтиленовый эфир, который обычно обеспечивает надежную инактивацию вируса с оболочкой, превышающую 4 log, в различных экспериментальных условиях. Однако 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенол (также известный как 4-трет-октилфенол), продукт разложения Тритон Х-100, был идентифицирован как потенциальный токсин окружающей среды для живой природы, включающий возможные эстрогенные эффекты. Таким образом, желательным является удаление 4-трет-октилфенола из потоков отходов, но потребует сложных, длительных и дорогостоящих действий. По этой причине, из-за проблем с токсичностью комитет EU-REACH проголосовал за добавление Тритон Х-100 в Приложение XIV - список запрещенных веществ в ЕС, запрещающий использование Тритон Х-100 в производстве рекомбинантных белков после 2021 года. Альтернативные агенты для замены Тритон Х-100 в производстве биопрепаратов недостаточно хорошо разработаны. Как следствие, существует острая, оперативная потребность в способах эффективной инактивации вирусов при процессе производства биологических препаратов, таких как терапевтические или диагностические белки, которые менее токсичны для окружающей среды, чем способы, с использованием Тритон Х-100.Modern methods of inactivating viruses during the production of bioproducts, such as therapeutic or diagnostic proteins, largely depend on the use of the detergent Triton X-100. Triton X-100 is a polyoxyethylene ether that typically provides robust inactivation of enveloped virus greater than 4 log under a variety of experimental conditions. However, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol (also known as 4-tert-octylphenol), a degradation product of Triton X-100, has been identified as a potential environmental toxin to wildlife, including possible estrogenic effects. Thus, the removal of 4-tert-octylphenol from waste streams is desirable, but will require complex, time-consuming and costly activities. For this reason, due to toxicity concerns, the EU-REACH committee voted to add Triton X-100 to Annex XIV, the EU's list of banned substances, prohibiting the use of Triton X-100 in the production of recombinant proteins after 2021. Alternative agents to replace Triton X-100 in biologics production are not well developed. As a result, there is an urgent, operational need for methods for efficiently inactivating viruses during the production of biological products, such as therapeutic or diagnostic proteins, that are less toxic to the environment than methods using Triton X-100.
Экологически совместимые альтернативы Тритон Х-100 для инактивации вирусов, особенно вирусов с оболочкой, в процессе производства белка были исследованы в WO 2019/121846, а также в WO 2015/073633. Однако эффекты использования различных детергентов для инактивации вирусов могут отличаться. Некоторые детергенты не подходят для использования в производственном процессе из-за их нерастворимости или их трудно удалить из потока сырья. Кроме того, некоторые детергенты увеличивают мутность и/или пенообразование потока питательных веществ, что требует дополнительных мер по снижению мутности и/или пенообразования потока сырья. Другие детергенты не так эффективны в широком диапазоне температур и значениях рН, а также требуют более высоких концентраций для инактивации вирусов. Комбинация этих вариантов может привести к дополнительным затратам и увеличении времени в процессе производства белка. Также, эффективность многих детергентов при производстве исходного потока белков различных типов и размеров недостаточна.Environmentally compatible alternatives to Triton X-100 for inactivating viruses, especially enveloped viruses, during protein production were investigated in WO 2019/121846 as well as WO 2015/073633. However, the effects of using different detergents to inactivate viruses may vary. Some detergents are not suitable for use in the manufacturing process because they are insoluble or difficult to remove from the feed stream. In addition, some detergents increase the turbidity and/or foaming of the nutrient stream, requiring additional measures to reduce the turbidity and/or foaming of the feed stream. Other detergents are not as effective over a wide range of temperatures and pH values and require higher concentrations to inactivate viruses. Combining these options can result in additional costs and time in the protein production process. Also, the effectiveness of many detergents in producing a feed stream of proteins of various types and sizes is insufficient.
Таким образом, сохраняется потребность в способах эффективной инактивации вирусов при производстве терапевтических или диагностических белков различных типов и размеров с использованием экологически безопасного детергента, который эффективно инактивирует различные вирусы с оболочкой как при низких, так и при высоких температурах и диапазонах рН, в разумные сроки и при рациональных концентрациях такого(их) детергента(ов), и/или является водным, растворимым и/или легко растворимым, и/или не влияет на мутность питательного потока, что делает его пригодным для промышленного производства. В дополнение к этому, предпочтительно, чтобы детергент был в достаточной степени удален из питательного потока продукта (для соответствия нормативным требованиям) на этапе очистки без добавления сложных, длительных и/или дорогостоящих мер, и чтобы сохранялось качество продукта терапевтического или диагностического белка.Thus, there remains a need for methods to effectively inactivate viruses in the production of therapeutic or diagnostic proteins of various types and sizes using an environmentally friendly detergent that effectively inactivates a variety of enveloped viruses at both low and high temperatures and pH ranges, within a reasonable time frame and at reasonable concentrations of such detergent(s), and/or is aqueous, soluble and/or readily soluble, and/or does not affect the turbidity of the feed stream, making it suitable for industrial production. In addition, it is preferable that the detergent be sufficiently removed from the product feed stream (to meet regulatory requirements) during the purification step without adding complex, time-consuming and/or costly measures, and that the quality of the therapeutic or diagnostic protein product is maintained.
Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение одной или нескольких из вышеперечисленных проблем путем предоставления методов инактивации вирусов в процессе производства терапевтических или диагностических белков. Удивительно, но способы данного изобретения обеспечивают экологически безопасные детергенты, которые высокоэффективны при инактивации вирусов в широком диапазоне температур и/или значениях рН при производстве различных типов белков, в разумные сроки и в рациональных диапазонах концентрации без токсического воздействия на окружающую среду. На удивление, способы текущего изобретения дополнительно обеспечивают использование экологическиAccordingly, the present invention is directed to solving one or more of the above problems by providing methods for inactivating viruses during the production of therapeutic or diagnostic proteins. Surprisingly, the methods of this invention provide environmentally friendly detergents that are highly effective in inactivating viruses over a wide range of temperatures and/or pH values while producing various types of proteins, in reasonable times and in rational concentration ranges without toxic effects on the environment. Surprisingly, the methods of the current invention further provide environmentally friendly
- 1 046732 безопасных детергентов, которые легко достигают полной инактивации вирусов, по меньшей мере, сравнимой с Тритон-Х 100, и в которых экологически безопасные детергенты не обладают известной токсичностью в используемых концентрациях для окружающей среды. К тому же, способы изобретения обеспечивают полную вирусную инактивацию с логарифмическим коэффициентом снижения вирусной нагрузки (LRF) от около более 3 до около более 6 чем в диапазоне температур около 4°С до, по меньшей мере, 30°С и в широком диапазоне рН, при производстве терапевтических или диагностических белков различных типов и размеров в умеренные сроки с надлежащим диапазоном концентраций без воздействия на окружающую среду. Удивительно, но использования способов текущего изобретения также позволило достичь вирусной инактивации во всех вирусах с оболочкой, протестированных в диапазоне температур начиная от около 4°С до по меньшей мере 30°С в пределах от более чем 1 до около 180 минут, в широком диапазоне рН, при производстве терапевтических или диагностических белков различных типов и размеров в пределах уместного диапазона концентраций.- 1,046,732 safe detergents that readily achieve complete virus inactivation at least comparable to Triton-X 100, and in which the environmentally safe detergents have no known environmental toxicity at the concentrations used. In addition, the methods of the invention provide complete viral inactivation with a logarithmic load reduction factor (LRF) of from about greater than 3 to about greater than 6 than over a temperature range of about 4°C to at least 30°C and over a wide pH range, in the production of therapeutic or diagnostic proteins of various types and sizes in a reasonable time and at an appropriate concentration range without impact on the environment. Surprisingly, using the methods of the current invention also achieved viral inactivation in all enveloped viruses tested over a temperature range ranging from about 4°C to at least 30°C, ranging from more than 1 to about 180 minutes, over a wide pH range , in the production of therapeutic or diagnostic proteins of various types and sizes within an appropriate concentration range.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ инактивации вирусов в потоке питательных веществ, включающий добавление в исходный поток детергентов, которые совместимы с окружающей средой. Детергенты, которые были использованы в способах данного изобретения, представляют собой водные растворы, которые незначительно влияют на мутность потока сырья и, таким образом, пригодны для крупномасштабного производства терапевтических или диагностических белков. Далее, детергенты, используемые в текущем изобретении, удаляются в достаточной степени и эффективно (в соответствии с нормативными требованиями) на стадии очистки с предварительной стадией фильтрации или без нее. Кроме того, не требуется никаких сложных, длительных и/или дорогостоящих действий по удалению детергентов из потока сырья. В дополнение, детергенты, которые использовались в текущих способах изобретения, не оказывают отрицательного влияния на конечное качество терапевтического или диагностического белка. Детергенты, используемые в способах по настоящему изобретению, эффективно инактивируют вирусы с оболочкой в широком диапазоне температур и значений рН без токсического воздействия на окружающую среду.Accordingly, the present invention provides a method for inactivating viruses in a nutrient stream, comprising adding detergents to the feed stream that are environmentally compatible. The detergents that have been used in the methods of this invention are aqueous solutions that have little effect on the turbidity of the feed stream and are thus suitable for large-scale production of therapeutic or diagnostic proteins. Further, the detergents used in the current invention are removed sufficiently and effectively (in accordance with regulatory requirements) in the purification step with or without a preliminary filtration step. In addition, no complex, time-consuming and/or expensive steps are required to remove detergents from the feed stream. In addition, the detergents used in the current methods of the invention do not adversely affect the final quality of the therapeutic or diagnostic protein. The detergents used in the methods of the present invention effectively inactivate enveloped viruses over a wide range of temperatures and pH values without causing environmental toxicity.
В соответствии с одним аспектом изобретения, предоставлен способ для инактивации вирусов детергентом на основе алкилглюкозида в потоке сырья при процессе производства терапевтических или диагностических белков. В соответствии с другим аспектом изобретения, детергент, используемый в способах изобретения, содержит более чем около 40% ундецил алкил глюкозида. В другом аспекте изобретения, используемый детергент содержит более чем около 40% ундецил алкил глюкозида и менее чем около 20% других алкил глюкозидов. В еще одном составе изобретения, детергент содержит более чем около 40% ундецил алкил глюкозида и менее чем около 10% децил алкилглюкозида. В еще одном варианте осуществления изобретения, детергент содержал от около 40% до около 60% ундецил алкил глюкозида. Также в дополнительном варианте осуществления изобретения, используемый в способах детергент содержит от около 53% до около 57% ундецил алкил глюкозида. В еще одном аспекте изобретения, детергент данного изобретения содержит более чем около 50% ундецил алкил глюкозида. В другой модификации, детергент, используемый в способах изобретения, содержит от около 40% до около 60% ундецил алкил глюкозида и менее чем около 20% других алкилглюкозидов. В еще одном варианте, детергент изобретения содержит от около 40% до около 60% ундецил алкил глюкозида и менее чем около 10% децил алкилглюкозида. При другом варианте осуществления, в способе данного изобретения применялся детергент, содержащий от около 53% до около 57% ундецил алкил глюкозида и менее около 20% других алкилглюкозидов. В еще одном варианте осуществления, детергент используемый в способах по настоящему изобретению содержит от около 53% до около 57% ундецил алкил глюкозида и менее около 10% децил алкилглюкозида. В еще одном варианте осуществления способов данного изобретения, детергент содержит ноль или менее около 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% других алкил глюкозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения другие алкил глюкозиды включают смесь нонил алкил глюкозида, децил алкил глюкозида и/или лаурил алкил глюкозида. В другом варианте в способах изобретения использовался детергент, содержащий ноль или менее чем около 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% децил алкил глюкозида. В одном варианте применения изобретения используемый детергент содержит ундецил алкил глюкозид.In accordance with one aspect of the invention, a method is provided for inactivating viruses with an alkyl glucoside detergent in a feed stream during the production of therapeutic or diagnostic proteins. In accordance with another aspect of the invention, the detergent used in the methods of the invention contains more than about 40% undecyl alkyl glucoside. In another aspect of the invention, the detergent used contains more than about 40% undecyl alkyl glucoside and less than about 20% other alkyl glucosides. In yet another formulation of the invention, the detergent contains more than about 40% undecyl alkyl glucoside and less than about 10% decyl alkyl glucoside. In yet another embodiment of the invention, the detergent contains from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside. Also in a further embodiment of the invention, the detergent used in the methods contains from about 53% to about 57% undecyl alkyl glucoside. In another aspect of the invention, the detergent of this invention contains more than about 50% undecyl alkyl glucoside. In another modification, the detergent used in the methods of the invention contains from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside and less than about 20% other alkyl glucosides. In yet another embodiment, the detergent of the invention contains from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside and less than about 10% decyl alkyl glucoside. In another embodiment, the method of this invention uses a detergent containing from about 53% to about 57% undecyl alkyl glucoside and less than about 20% other alkyl glucosides. In yet another embodiment, the detergent used in the methods of the present invention contains from about 53% to about 57% undecyl alkyl glucoside and less than about 10% decyl alkyl glucoside. In yet another embodiment of the methods of this invention, the detergent contains zero or less of about 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% other alkyl glucosides. In some embodiments, other alkyl glucosides include a mixture of nonyl alkyl glucoside, decyl alkyl glucoside, and/or lauryl alkyl glucoside. In another embodiment, the methods of the invention used a detergent containing zero or less than about 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10% decyl alkyl glucoside. In one embodiment of the invention, the detergent used contains undecyl alkyl glucoside.
В одном варианте осуществления изобретения используемый детергент, имеет регистрационный номер CAS 98283-67-1. Другие варианты подразумевали использование детергента, который представляет собой SIMULSOL™ SL 11W. В другом варианте SIMULSOL™ SL 11W, используемый в способах настоящего изобретения содержит более чем около 40% ундецил алкил глюкозида. В еще одном варианте применения, SIMULSOL™ SL 11W, из числа в способов данного изобретения, содержит от около 40% до около 60% ундецил алкил глюкозида. В еще одном варианте, SIMULSOL™ SL 11W, используемый в способах, содержит от около 53% до около 57% ундецил алкил глюкозида. В дополнительном применении данного изобретения SIMULSOL™ SL 11W содержит от около 40% до около 60% ундецил алкил глюкозида и менее чем около 10% децил алкилглюкозида. Еще один вариант, используемый в способах данного изобретения, подразумевал использование SIMULSOL™ SL 11W, который содержит от околоIn one embodiment of the invention, the detergent used has CAS registration number 98283-67-1. Other options involved the use of a detergent, which is SIMULSOL™ SL 11W. In another embodiment, SIMULSOL™ SL 11W used in the methods of the present invention contains more than about 40% undecyl alkyl glucoside. In yet another embodiment, SIMULSOL™ SL 11W, among the methods of this invention, contains from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside. In yet another embodiment, SIMULSOL™ SL 11W used in the methods contains from about 53% to about 57% undecyl alkyl glucoside. In a further application of this invention, SIMULSOL™ SL 11W contains from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside and less than about 10% decyl alkyl glucoside. Another option used in the methods of this invention involved the use of SIMULSOL™ SL 11W, which contains from about
- 2 046732- 2 046732
53% до около 57% ундецил алкил глюкозида и менее около 10% децил алкил глюкозида. В других вариантах применения, SIMULSOL™ SL 11W содержал ноль или менее чем около 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% других алкил глюкозидов. В вариантах осуществления изобретения другие алкил глюкозиды в составе SIMULSOL™ SL 11W, содержали смесь нонил алкил глюкозида, децил алкил глюкозида и/или лаурил алкил глюкозида. В дополнительных вариантах, в способах данного изобретения использовался SIMULSOL™ SL 11W, содержащий ноль или менее чем около 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% децил алкил глюкозида. В одном из вариантов способов данного изобретения, SIMULSOL™ SL 11W представляет собой ундецил алкил глюкозид.53% to about 57% undecyl alkyl glucoside and less than about 10% decyl alkyl glucoside. In other applications, SIMULSOL™ SL 11W contained zero or less than about 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20% other alkyl glucosides. In embodiments of the invention, the other alkyl glucosides contained in SIMULSOL™ SL 11W contained a mixture of nonyl alkyl glucoside, decyl alkyl glucoside and/or lauryl alkyl glucoside. In additional embodiments, the methods of this invention used SIMULSOL™ SL 11W containing zero or less than about 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% , 8%, 9%, 10% decyl alkyl glucoside. In one embodiment of the methods of this invention, SIMULSOL™ SL 11W is an undecyl alkyl glucoside.
Еще один способ осуществлялся с использованием SIMULSOL™ SL 82. В другом варианте применялся SIMULSOL™ SL 82, содержащий от около 40% до около 60% ундецил алкилглюкозида.Another method was carried out using SIMULSOL™ SL 82. In another embodiment, SIMULSOL™ SL 82 was used containing from about 40% to about 60% undecyl alkyl glucoside.
В другом варианте осуществления, изобретение обеспечивает способы инактивации вирусов в потоке питательных веществ, включало добавление к потоку экологически безопасного детергента с конечной концентрацией от около 0,05% мас./мас. до около 1% мас./мас., при этом экологически безопасный очищающий компонент включает более чем около 40% децил алкилглюкозида. В некоторых вариантах осуществления, используемый в методах текущего изобретения детергент добавляют к питательному потоку до уровня конечной концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 1% мас./мас. При некоторых вариантах, использованный детергент добавляют к потоку питательных веществ до конечной концентрации от 0,1% мас./мас. до 1% мас./мас. При некоторых способах данного изобретения, детергент добавляют к потоку питательных веществ до достижения конечной концентрации от около 0,3% мас./мас. до около 1% мас./мас. В некоторых вариантах осуществления детергент, используемый в способах по настоящему изобретению, добавляют к питательному потоку до достижения конечной концентрации от 0,3% мас./мас. до 1% мас./мас. В некоторых вариантах, используемый в способах по настоящему изобретению, детергент добавляют к потоку исходных материалов до конечной концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 0,3% мас./мас. В некоторых примерах осуществления текущего изобретения, детергент добавляют к потоку исходных материалов до уровня конечной концентрации от 0,1% мас./мас. до 0,3% мас./мас. При других способах осуществления текущего изобретения, детергент добавляют к питательному потоку до конечной концентрации около 0,3% мас./мас. При других вариантах осуществления, используемый в способах детергент добавляют к потоку сырья до конечной концентрации 0,3%. В еще одном варианте осуществления, детергент, используемый в способах по данному изобретению, добавляют в сырьевой поток до конечной концентрации по массе около 0,01%, около 0,05%, около 0,1%, около 0,2%, около 0,3%, около 0,4%, около 0,5%, около 0,6%, около 0,7%, около 0,5%, около 0,9% или около 1%.In another embodiment, the invention provides methods for inactivating viruses in a nutrient stream, including adding an environmentally friendly detergent to the stream at a final concentration of about 0.05% w/w. to about 1% w/w, wherein the environmentally friendly cleansing component comprises greater than about 40% decyl alkyl glucoside. In some embodiments, the detergent used in the methods of the current invention is added to the feed stream to a final concentration level of about 0.1% w/w. to about 1% w/w In some embodiments, the used detergent is added to the nutrient stream to a final concentration of 0.1% w/w. up to 1% w/w In some methods of this invention, detergent is added to the nutrient stream to achieve a final concentration of about 0.3% w/w. to about 1% w/w In some embodiments, the detergent used in the methods of the present invention is added to the feed stream to achieve a final concentration of 0.3% w/w. up to 1% w/w In some embodiments, used in the methods of the present invention, the detergent is added to the feed stream to a final concentration of about 0.1% w/w. to about 0.3% w/w In some embodiments of the current invention, detergent is added to the feed stream to a final concentration level of 0.1% w/w. up to 0.3% w/w In other methods of implementing the current invention, detergent is added to the feed stream to a final concentration of about 0.3% w/w. In other embodiments, the detergent used in the methods is added to the feed stream to a final concentration of 0.3%. In yet another embodiment, the detergent used in the methods of this invention is added to the feed stream to a final concentration by weight of about 0.01%, about 0.05%, about 0.1%, about 0.2%, about 0 .3%, about 0.4%, about 0.5%, about 0.6%, about 0.7%, about 0.5%, about 0.9% or about 1%.
В некоторых вариантах изобретения, температура потока сырья составляет от около 4°С до около 30°С. В других вариантах осуществления изобретения, температура поток сырья составляет от 4°С до 30°С. В еще других вариантах осуществления, температура потока питательных веществ составляет от около 15°С до около 30°С. В другом варианте, питательный поток имеет температуру от около 15°С до около 20°С. В еще других вариантах осуществления изобретения, температура потока исходных материалов составляет от около 4°С, около 15°С, около 18°С, около 20°С, около 25°С или около 30°С.In some embodiments of the invention, the temperature of the feed stream is from about 4°C to about 30°C. In other embodiments of the invention, the temperature of the feed stream is from 4°C to 30°C. In yet other embodiments, the temperature of the nutrient flow is from about 15°C to about 30°C. In another embodiment, the feed stream has a temperature of from about 15°C to about 20°C. In still other embodiments of the invention, the temperature of the feed stream is from about 4°C, about 15°C, about 18°C, about 20°C, about 25°C, or about 30°C.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, значение рН сырьевого потока от около 5,5 до около 8,0. В других вариантах осуществления изобретения, значение рН потока исходных материалов было от 5,5 до 8,0. В еще других вариантах осуществления изобретения, исходный поток имел рН от около 5,5, около 6,0, около 6,5, около 7,0, около 7,5 или около 8,0.In some embodiments, the pH of the feed stream is from about 5.5 to about 8.0. In other embodiments of the invention, the pH value of the feed stream was from 5.5 to 8.0. In still other embodiments of the invention, the feed stream has a pH of about 5.5, about 6.0, about 6.5, about 7.0, about 7.5, or about 8.0.
В некоторых вариантах осуществления, сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение времени от менее около 1 минуты до около 180 минут. При другом осуществлении, сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение около от около 6 до около 180 минут. При других способах, сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение около от 10 до приблизительно 180 минут. Также, при других вариантах, питательный поток инкубируют с детергентом в течение от около 120 до около 180 минут. В других вариантах осуществления, питательный поток веществ инкубируют с детергентом на протяжении около 180 минут. При других вариантах осуществления, сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение приблизительно 120 минут. В других вариантах осуществления, сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение около 60 минут. В других вариантах осуществления сырьевой поток инкубируют с детергентом в течение около 1, около 5, около 6, около 10, около 15, около 30, около 45, около 60, около 75, около 90, около 105, около 120, около 135, около 150, около 165 или около 180 минут.In some embodiments, the feed stream is incubated with detergent for a time ranging from less than about 1 minute to about 180 minutes. In another embodiment, the feed stream is incubated with detergent for about 6 to about 180 minutes. In other methods, the feed stream is incubated with detergent for about 10 to about 180 minutes. Also, in other embodiments, the nutrient stream is incubated with detergent for about 120 to about 180 minutes. In other embodiments, the nutrient stream is incubated with detergent for about 180 minutes. In other embodiments, the feed stream is incubated with detergent for approximately 120 minutes. In other embodiments, the feed stream is incubated with detergent for about 60 minutes. In other embodiments, the feed stream is incubated with detergent for about 1, about 5, about 6, about 10, about 15, about 30, about 45, about 60, about 75, about 90, about 105, about 120, about 135, about 150, about 165 or about 180 minutes.
В вариантах осуществления изобретения, детергент в потоке питательных веществ имеет вирусную LRF более чем около 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, очищающее средство в питательном потоке имеет LRF вируса более чем около 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, детергент в питательном поток имеет LRF вируса более чем около 5. В некоторых вариантах применения изобретения, детергент в потоке исходных материалов имеет LRF вируса более чем около 6. В некоторых вариантах осуществления текущего изобретения, детергент в потоке питательных веществ имеет LRF вируса более чем около 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения детергент в потокеIn embodiments of the invention, the detergent in the nutrient stream has a viral LRF of greater than about 1. In some embodiments, the detergent in the nutrient stream has a viral LRF of greater than about 4. In some embodiments, the detergent in the nutrient stream has a viral LRF more than about 5. In some embodiments of the invention, the detergent in the feed stream has a virus LRF of more than about 6. In some embodiments of the current invention, the detergent in the nutrient stream has a virus LRF of more than about 7. In some embodiments of the invention, the detergent in the stream
- 3 046732 сырья обеспечивает полную инактивацию вирусов. В еще других вариантах осуществления изобретения детергент в потоке исходных материалов имеет вирусную LRF более около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6 или около 7.- 3 046732 raw materials ensure complete inactivation of viruses. In yet other embodiments, the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 1, about 2, about 3, about 4, about 5, about 6, or about 7.
При некоторых способах осуществления изобретения, вирус представляет собой оболочечный вирус. При некоторых вариантах осуществления, вирус представляет собой ретровирус, герпесвирус, флавивирус, поксвирус, гепаднавирус, вирус гепатита, ортомиксовирус, парамиксовирус, рабдовирус или тогавирус.In some embodiments of the invention, the virus is an enveloped virus. In some embodiments, the virus is a retrovirus, herpesvirus, flavivirus, poxvirus, hepadnavirus, hepatitis virus, orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus, or togavirus.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ инактивации вируса в сырьевом потоке включает стадию инкубации питательного потока и экологически безопасного детергента в течение от около 15 минут до около 180 минут при температуре от около 4°С до около 30°С. Значение рН было от около 5,5 до около 8,0, при этом детергент добавляют к потоку сырья в конечной концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 1,0% мас./мас., и при этом детергент в питательном потоке имеет вирусный LRF больше чем около 2.In some embodiments, a method of inactivating a virus in a feed stream includes the step of incubating the feed stream and an environmentally friendly detergent for about 15 minutes to about 180 minutes at a temperature of about 4°C to about 30°C. The pH was from about 5.5 to about 8.0, with detergent added to the feed stream at a final concentration of about 0.1% w/w. to about 1.0% w/w, and wherein the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ инактивации вируса в сырьевом потоке включает стадию инкубации питательного потока и экологически безопасного детергента в течение от около 6 минут до около 180 минут при температуре от около 4°С до около 30°С. Значение рН было от около 5,5 до около 8,0, при этом детергент добавляют к потоку сырья в конечной концентрации от около 0,3% мас./мас. до около 1,0% мас./мас., и при этом детергент в питательном потоке имеет вирусный LRF больше чем около 4.In some embodiments, a method of inactivating a virus in a feed stream includes the step of incubating the feed stream and an environmentally friendly detergent for about 6 minutes to about 180 minutes at a temperature of about 4°C to about 30°C. The pH was from about 5.5 to about 8.0, with detergent added to the feed stream at a final concentration of about 0.3% w/w. to about 1.0% w/w, and wherein the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 4.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение предоставляет способ инактивации вируса в сырьевом потоке включающий стадию инкубации питательного потока и экологически безопасного детергента в течение около 180 минут при температуре от около 4°С до около 30°С, а также при значении рН от около 5,5 до около 8,0, при этом детергент добавляют к потоку сырья в конечной концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 1,0% мас./мас., и при этом детергент в питательном потоке имеет вирусный LRF больше чем около 5.In some embodiments, the invention provides a method of inactivating a virus in a feed stream comprising the step of incubating the feed stream and an environmentally friendly detergent for about 180 minutes at a temperature of from about 4°C to about 30°C, and at a pH value of about 5.5 to about 8.0, wherein the detergent is added to the feed stream at a final concentration of about 0.1% w/w. to about 1.0% w/w, and wherein the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ инактивации вируса в сырьевом потоке включает стадию инкубации питательного потока и экологически безопасного детергента в течение от около 60 минут до около 180 минут при температуре от около 4°С до около 30°С, при значении рН от около 5,5 до около 8,0, при этом детергент добавляют к потоку сырья в конечной концентрации от около 0,3% мас./мас, а также детергент в питательном потоке имеет вирусный LRF больше, чем около 5.In some embodiments, the method of inactivating a virus in a feed stream includes the step of incubating the feed stream and an environmentally friendly detergent for about 60 minutes to about 180 minutes at a temperature of about 4°C to about 30°C, at a pH of about 5 .5 to about 8.0, wherein the detergent is added to the feed stream at a final concentration of about 0.3% w/w and the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 5.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ инактивации вируса в сырьевом потоке включает стадию инкубации питательного потока и экологически безопасного детергента в течение от около 120 минут до около 180 минут при температуре от около 4°С до около 30°С, при значении рН от около 5,5 до около 8,0, при этом детергент добавляют к потоку сырья в конечной концентрации около 0,3% мас./мас, а также детергент в питательном потоке имеет вирусный LRF больше, чем около 6.In some embodiments, the method of inactivating a virus in a feed stream includes the step of incubating the feed stream and an environmentally friendly detergent for about 120 minutes to about 180 minutes at a temperature of about 4°C to about 30°C, at a pH value of about 5 .5 to about 8.0, wherein the detergent is added to the feed stream at a final concentration of about 0.3% w/w and the detergent in the feed stream has a viral LRF greater than about 6.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает инактивацию вируса в питательном потоке, при этом поток питательных веществ включает собранную культуральную жидкость клеток, пул улавливания или пул извлеченных продуктов. В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает способы инактивации вируса в потоке питательных веществ, где поток включает собранную культуральную жидкость клеток, пул улавливания или пул выделенных продуктов, и где пул улавливания или пул выделенных продуктов представляет собой пул аффинной хроматографии. В еще одном варианте, пул улавливания или пул извлеченных продуктов представляет собой пул белка А, пул белка G или пул белка L. В других вариантах осуществления пул улавливания или пул извлеченных продуктов представляет собой пул хроматографии смешанного режима.In some embodiments, the invention provides for virus inactivation in a nutrient stream, wherein the nutrient stream includes a collected cell culture fluid, a capture pool, or an extracted product pool. In some embodiments, the invention provides methods for inactivating a virus in a nutrient stream, wherein the stream includes a collected cell culture fluid, a capture pool, or a recovery pool, and where the capture pool or recovery pool is an affinity chromatography pool. In yet another embodiment, the capture pool or recovery pool is a protein A pool, protein G pool, or protein L pool. In other embodiments, the capture pool or recovery pool is a mixed mode chromatography pool.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение предлагает способы, где исходный поток, инкубированный с детергентом, не подвергают стадии фильтрации. В некоторых вариантах, изобретение предоставляет способы, при которых питательный поток, инкубированный с детергентом, подвергают минимум одной стадии фильтрации. В других вариантах осуществления, изобретение предлагает способы, при которых поток сырья инкубируют с детергентами подвергают по меньшей мере одной, или по меньшей мере двум, или по меньшей мере трем стадиям фильтрации. В некоторых вариантах, исходный поток, инкубированный с детергентом, подвергают первому этапу фильтрации с фильтром 0,22 мкм, за которым следуют второй и третий этапы фильтрации с PVDF фильтром 0,45 мкм. Согласно конкретному варианту осуществления, метод изобретения использует фильтрующую мембрану на первой, и/или на второй, и/или третьей стадиях фильтрации, включает, но не ограничен поливинилиденфторидом, (PVDF), ацетатом целлюлозы, нитратом целлюлозы, политетрафторэтиленом (PTFE, тефлон), поливинилхлоридом, полиэфирсульфоном или другими фильтрующими материалами, подходящими для применения в производственной среде в соответствии с cGMP. Согласно предпочтительному варианту, изобретение предлагает способы, при которых мембрана фильтра как на втором, так и на третьем этапе фильтрации содержит PVDF. Согласно специфическому варианту осуществления, изобретение предоставляет метод при котором фильтрующая мембрана имеет размер пор около 0,45 мкм как на второй, так и на третьей стадии фильтрации. Согласно предпочтительному варианту осуществления, фильтрующая мембраIn some embodiments, the invention provides methods where the detergent-incubated feed stream is not subjected to a filtration step. In some embodiments, the invention provides methods in which a nutrient stream incubated with a detergent is subjected to at least one filtration step. In other embodiments, the invention provides methods in which the feed stream is incubated with detergents and subjected to at least one, or at least two, or at least three stages of filtration. In some embodiments, the feed stream incubated with the detergent is subjected to a first 0.22 μm filtration step followed by a second and third 0.45 μm PVDF filtration step. According to a specific embodiment, the method of the invention uses a filter membrane in the first and/or second and/or third stages of filtration, including, but not limited to, polyvinylidene fluoride (PVDF), cellulose acetate, cellulose nitrate, polytetrafluoroethylene (PTFE, Teflon), polyvinyl chloride, polyethersulfone or other filter media suitable for use in a cGMP manufacturing environment. According to a preferred embodiment, the invention provides methods in which the filter membrane in both the second and third filtration stages contains PVDF. According to a specific embodiment, the invention provides a method in which the filter membrane has a pore size of about 0.45 microns in both the second and third stages of filtration. According to a preferred embodiment, the filter membrane
- 4 046732 на на второй и третьей стадиях фильтрации является мембраной из PVDF с размером пор 0,45 мкм. В специфическом варианте применения, изобретение использует способ, при котором фильтрующая мембрана имеет размер пор около 0,22 мкм на первой стадии фильтрации.- 4 046732 in the second and third stages of filtration is a PVDF membrane with a pore size of 0.45 microns. In a specific application, the invention uses a method in which the filter membrane has a pore size of about 0.22 microns in the first stage of filtration.
При некоторых вариантах осуществления, изобретение предлагает способы, в которых питательный поток, инкубированный с детергентом, подвергают аффинной хроматографии. В некоторых примерах выполнения, аффинная хроматография представляет собой аффинную колонку с белком А.In some embodiments, the invention provides methods in which a nutrient stream incubated with a detergent is subjected to affinity chromatography. In some embodiments, the affinity chromatography is a Protein A affinity column.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение предлагает способы, в которых сырьевой поток содержащий детергент, подвергается воздействию хроматографической колонки. В некоторых вариантах, хроматографическая колонка представляет собой одну или несколько аффинных колонок, ионообменных колонок, колонок гидрофобного взаимодействия, колонок с гидроксиапатитом или колонок смешанного типа. В некоторых вариантах осуществления, колонка для аффинной хроматографии представляет собой колонку с белком А, колонку с белком G или колонку с белком L. В других вариантах осуществления, колонка для ионообменной хроматографии представляет собой анионообменную колонку или катионообменную колонку. В некоторых вариантах, изобретение предлагает способы, при которых детергент в достаточной степени удаляется из конечного продукта. В некоторых способах осуществления изобретения, обеспечивается полное удаление детергента из конечного продукта.In some embodiments, the invention provides methods in which a detergent-containing feed stream is exposed to a chromatography column. In some embodiments, the chromatography column is one or more affinity columns, ion exchange columns, hydrophobic interaction columns, hydroxyapatite columns, or mixed columns. In some embodiments, the affinity chromatography column is a protein A column, a protein G column, or a protein L column. In other embodiments, the ion exchange chromatography column is an anion exchange column or a cation exchange column. In some embodiments, the invention provides methods in which the detergent is sufficiently removed from the final product. In some methods of carrying out the invention, complete removal of the detergent from the final product is ensured.
В некоторых вариантах осуществления, изобретение обеспечивает способы инактивации вируса в питательном потоке, при этом способ включает стадию добавления детергента в указанный исходный поток и инкубацию детергента, а также питательного потока, в котором терапевтический или диагностический белок представляет собой антитело, гибридный белок Fc, иммуноадгезин, фермент, фактор роста, рецептор, гормон, регуляторный фактор, цитокин, антиген или связывающий агент. В дополнительных вариантах осуществления, антитело являет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, биспецифическое антитело или фрагмент антитела. В некоторых вариантах, терапевтический или диагностический белок продуцируется в клетках млекопитающих. В некоторых примерах осуществления, клетка млекопитающего представляет собой клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки мышиной гибридомы или клетки мышиной миеломы. В некоторых вариантах, терапевтический или диагностический белок продуцируется в бактериальных клетках. В других вариантах осуществления, терапевтический или диагностический белок продуцируется в дрожжевых клетках.In some embodiments, the invention provides methods for inactivating a virus in a feed stream, the method comprising the step of adding detergent to said feed stream and incubating the detergent as well as the feed stream, wherein the therapeutic or diagnostic protein is an antibody, an Fc fusion protein, an immunoadhesin, enzyme, growth factor, receptor, hormone, regulatory factor, cytokine, antigen or binding agent. In additional embodiments, the antibody is a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, a bispecific antibody, or an antibody fragment. In some embodiments, the therapeutic or diagnostic protein is produced in mammalian cells. In some embodiments, the mammalian cell is Chinese hamster ovary (CHO) cells or baby hamster kidney (BHK) cells, murine hybridoma cells, or murine myeloma cells. In some embodiments, the therapeutic or diagnostic protein is produced in bacterial cells. In other embodiments, the therapeutic or diagnostic protein is produced in yeast cells.
В нескольких примерах осуществления изобретения, питательный поток содержит детергент, используемый в методах данного изобретения, и имеет низкую мутность. В некоторых вариантах осуществления, добавление детергента к потоку сырья не приводит к значительному увеличению или изменению мутности потока питательных веществ. В другом варианте, очищающее средство, используемое в способах изобретения, не влияет на качество продукта терапевтического или диагностического белка.In several embodiments of the invention, the feed stream contains the detergent used in the methods of this invention and has low turbidity. In some embodiments, adding detergent to the feed stream does not significantly increase or change the turbidity of the nutrient stream. In another embodiment, the cleansing agent used in the methods of the invention does not affect the quality of the therapeutic or diagnostic protein product.
В некоторых вариантах, детергент, используемый в способах изобретения, содержит консервант и/или стабилизатор. Для некоторых примеров осуществления, стабилизатор представляет собой монопропиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления, стабилизатор в детергенте составляет от около 1% до около 5%. В дополнительном вариант осуществления изобретения, стабилизирующий агент, используемый в способах изобретения, не влияет на свойства детергента инактивировать вирусы и не влияет на качество продукта терапевтического или диагностического белка. В дополнительном варианте осуществления изобретения, монопропиленгликоль не влияет на свойства детергента инактивировать вирусы и не влияет на качество продукта терапевтического или диагностического белка.In some embodiments, the detergent used in the methods of the invention contains a preservative and/or stabilizer. For some embodiments, the stabilizer is monopropylene glycol. In some embodiments, the stabilizer in the detergent is from about 1% to about 5%. In a further embodiment of the invention, the stabilizing agent used in the methods of the invention does not affect the virus inactivating properties of the detergent and does not affect the quality of the therapeutic or diagnostic protein product. In a further embodiment of the invention, monopropylene glycol does not affect the virus inactivating properties of the detergent and does not affect the quality of the therapeutic or diagnostic protein product.
В вариантах осуществления изобретения, используемый в способах изобретения детергент, является экологически безопасным. При одном варианте осуществления изобретения, использовался детергент из способов изобретения, который не содержит и не образует 4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенол (он же 4трет-октилфенол). В других вариантах осуществления, детергент, используемый в способах по изобретению, не содержит и не образует пероксид. В других вариантах осуществления изобретения, используемый в способах изобретения детергент, является биоразлагаемым.In embodiments of the invention, the detergent used in the methods of the invention is environmentally friendly. In one embodiment of the invention, a detergent from the methods of the invention is used that does not contain or produce 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol (aka 4-tert-octylphenol). In other embodiments, the detergent used in the methods of the invention does not contain or form peroxide. In other embodiments, the detergent used in the methods of the invention is biodegradable.
В одном аспекте изобретения, предлагается способ инактивации вируса в питательном потоке, содержащий следующие стадии:In one aspect of the invention, a method of inactivating a virus in a feed stream is provided, comprising the following steps:
добавление к питательному потоку ундецил алкилглюкозида в концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 0,3% мас./мас.;adding to the feed stream undecyl alkyl glucoside at a concentration of about 0.1% wt./wt. up to about 0.3% w/w;
инкубация ундецил алкилглюкозида в питательном потоке в течение около 180 минут, при этом логарифмический коэффициент снижения вирусной нагрузки (LRF) ундецил алкилглюкозида в потоке превышает около 5;incubating the undecyl alkyl glucoside in the feed stream for about 180 minutes such that the logarithmic load reduction factor (LRF) of the undecyl alkyl glucoside in the feed stream is greater than about 5;
фильтрацию указанного питательного потока, содержащего ундецил алкилглюкозид; и обработку указанного отфильтрованного исходного потока на колонке аффинной хроматографии с белком А;filtering said feed stream containing undecyl alkyl glucoside; and treating said filtered feed stream on a Protein A affinity chromatography column;
при этом на указанной стадии добавления и инкубации поток сырья имеет температуру от около 4°С до около 30°С и рН от около 5,5 до около 8,0.wherein during said addition and incubation step, the feed stream has a temperature of about 4°C to about 30°C and a pH of about 5.5 to about 8.0.
В одном аспекте изобретения, предлагается способ инактивации вируса в питательном потоке, содержащий следующие стадии:In one aspect of the invention, a method of inactivating a virus in a feed stream is provided, comprising the following steps:
- 5 046732 добавление к исходному потоку SIMULSOL™ SL 11W в концентрации от около 0,1% мас./мас. до около 0,3% мас./мас.;- 5 046732 addition to the feed stream of SIMULSOL™ SL 11W in a concentration of about 0.1% w/w. up to about 0.3% w/w;
инкубация SIMULSOL™ SL 11W в питательном потоке на протяжении около 180 минут, при этом логарифмический коэффициент снижения вирусной нагрузки (LRF) SIMULSOL™ SL 11W в потоке превышает около 5;incubation of SIMULSOL™ SL 11W in the nutrient flow for about 180 minutes, while the logarithmic viral load reduction factor (LRF) of SIMULSOL™ SL 11W in the flow exceeds about 5;
фильтрацию указанного потока, содержащего SIMULSOL™ SL 11W; обработку указанного отфильтрованного потока на колонке аффинной хроматографии с белком А;filtering said stream containing SIMULSOL™ SL 11W; processing said filtered stream on a protein A affinity chromatography column;
при этом на стадии добавления и инкубации питательный поток имеет температуру от около 4°С до около 30°С и значение рН от около 5,5 до около 8,0. В еще одном аспекте изобретения, стадия фильтрации в способах изобретения включает первую стадию фильтрации с использованием фильтра 0,22 мкм. В другом аспекте стадия фильтрации из способов изобретения содержит вторую стадию фильтрации с 0,45 мкм PVDF фильтром. В еще одном аспекте, стадия фильтрации включает третью стадию фильтрации с 0,45 мкм PVDF фильтром. Согласно определённому варианту осуществления способа изобретения, фильтрующая мембрана используется на первой, и/или на второй, и/или третьей стадиях фильтрации, содержит, но не ограничена поливинилиденфторидом, (PVDF), ацетатом целлюлозы, нитратом целлюлозы, политетрафторэтиленом (PTFE, тефлон), поливинилхлоридом, полиэфирсульфоном или другими фильтрующими материалами, подходящими для применения в производственной среде в соответствии с cGMP. Согласно предпочтительному варианту осуществления, фильтрующая мембрана содержит PVDF. Согласно конкретному варианту осуществления, фильтрующая мембрана, как на второй, так и на третьей стадии фильтрации, представляет собой мембрану с размером пор около 0,45 мкм. Согласно предпочтительному варианту осуществления, фильтрующая мембрана представляет собой мембрану из PVDF с размером пор 0,45 мкм.wherein during the addition and incubation stage, the nutrient stream has a temperature of from about 4°C to about 30°C and a pH value of from about 5.5 to about 8.0. In another aspect of the invention, the filtration step in the methods of the invention includes a first filtration step using a 0.22 micron filter. In another aspect, the filtration step of the methods of the invention comprises a second filtration step with a 0.45 μm PVDF filter. In yet another aspect, the filtration step includes a third filtration step with a 0.45 μm PVDF filter. According to a certain embodiment of the method of the invention, the filter membrane used in the first and/or second and/or third stages of filtration contains, but is not limited to, polyvinylidene fluoride (PVDF), cellulose acetate, cellulose nitrate, polytetrafluoroethylene (PTFE, Teflon), polyvinyl chloride, polyethersulfone or other filter media suitable for use in a cGMP manufacturing environment. According to a preferred embodiment, the filter membrane contains PVDF. According to a specific embodiment, the filter membrane in both the second and third filtration stages is a membrane with a pore size of about 0.45 μm. According to a preferred embodiment, the filter membrane is a PVDF membrane with a pore size of 0.45 μm.
Используемый здесь термин экологически совместимый детергент или соединение, или вещество, или агент, упоминающийся в настоящем документе, вызывает минимальный и/или приемлемый уровень вредного воздействия на окружающую среду. Например, Организация экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) предоставляет рекомендации по проверке химической безопасности. Варианты экологически безопасных агентов согласно текущим отчетностям также могут быть биоразлагаемыми. Способы определения того, совместим ли агент, такой как детергент, с окружающей средой, например, в условиях производства белка, известны в области техники. Экологическая совместимость также может быть оценена с помощью оценки экологического риска, которая представляет собой процесс оценки того, насколько вероятно воздействие на окружающую среду в результате воздействия одного или нескольких факторов стресса окружающей среды, таких как химические вещества, изменение земли, болезни, инвазивные виды и изменение климата. Эти рекомендации можно найти, например, на веб-сайте Агентства по охране окружающей среды США. Кроме того, на веб-сайте Европейской комиссии REACH можно найти инструкции по регистрации, оценке, разрешению и ограничению использования химических веществ в ЕС.As used herein, the term environmentally compatible detergent or compound or substance or agent referred to herein causes a minimal and/or acceptable level of harmful effects on the environment. For example, the Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) provides guidance on chemical safety testing. Green agent options according to current reports may also be biodegradable. Methods for determining whether an agent, such as a detergent, is compatible with the environment, for example, under protein production conditions, are known in the art. Environmental compatibility can also be assessed through environmental risk assessment, which is the process of assessing how likely the environment is to be affected by one or more environmental stressors such as chemicals, land change, disease, invasive species, and change. climate. These recommendations can be found, for example, on the US Environmental Protection Agency website. In addition, guidance on the registration, evaluation, authorization and restriction of chemicals in the EU can be found on the European Commission's REACH website.
Прогнозируемая концентрация в окружающей среде представляет собой прогнозируемую концентрацию вещества в отходах, сбрасываемых в принимающий водный объект в окружающей среде. Например, прогнозируемая концентрация в окружающей среде детергента, используемого для инактивации вирусов при подготовке терапевтического или диагностического белка, представляет собой концентрацию детергента в потоке отходов, который выбрасывается в окружающую среду.The predicted environmental concentration is the predicted concentration of a substance in a waste discharged to a receiving water body in the environment. For example, the predicted environmental concentration of a detergent used to inactivate viruses in the preparation of a therapeutic or diagnostic protein is the concentration of the detergent in the waste stream that is released into the environment.
Термин детергент, используемый в данном документе, относится к агенту, который может содержать соли длинноцепочечных алифатических оснований или кислот, или гидрофильные фрагменты, такие как сахара, и который обладает как гидрофильными, так и гидрофобными свойствами. Используемые здесь детергенты могут обладать способностью разрушать вирусные оболочки и инактивировать вирусы. Механизм инактивации вируса детергентами объясняется взаимодействием между детергентом и липидными компонентами внешней мембраны вируса, что приводит к разрушению мембраны и, в конечном итоге, к потере вирулентности. В некоторых примерах, детергент может представлять собой композицию, включающую поверхностно-активное вещество или поверхностно-действующий агент и один или несколько других агентов, таких как хелатирующие агенты, консерванты или стабилизаторы. Детергенты или поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы в зависимости от заряда. Поверхностно-активные вещества могут быть неионогенными, катионогенными или анионогенными. Используемое здесь поверхностно-активное вещество обладает способностью разрушать вирусные оболочки и инактивировать вирусы. Варианты осуществления детергентов в соответствии с настоящим изобретением содержат алкил глкозид, при котором алкил глюкозид может представлять собой алкилглюкозид.The term detergent as used herein refers to an agent that may contain salts of long chain aliphatic bases or acids, or hydrophilic moieties such as sugars, and which has both hydrophilic and hydrophobic properties. The detergents used here may have the ability to break down viral envelopes and inactivate viruses. The mechanism of virus inactivation by detergents is explained by the interaction between the detergent and the lipid components of the outer membrane of the virus, which leads to membrane destruction and ultimately loss of virulence. In some examples, the detergent may be a composition comprising a surfactant or surfactant and one or more other agents, such as chelating agents, preservatives or stabilizers. Detergents or surfactants can be classified according to their charge. Surfactants can be non-ionic, cationic or anionic. The surfactant used here has the ability to break down viral envelopes and inactivate viruses. Embodiments of the detergents of the present invention contain an alkyl glucoside, wherein the alkyl glucoside may be an alkyl glucoside.
Алкил глюкозид в соответствии с настоящим изобретением относится к любому сахару, соединенному связью с любым гидрофобным алкилом. Алкил глюкозид, используемый здесь, состоит из алкильной группы, связанной с сахаром, где сахар представляет собой глюкозу. Алкил глюкозидом может быть, например, ундецил алкилглюкозид. Ундецил алкилглюкозид может содержать ундецильную цепь с О-гликозидной связью с моно^-глюкопиранозой (например, n-ундецил-β-D-глюкопиранозой)An alkyl glucoside, as used herein, refers to any sugar linked by a bond to any hydrophobic alkyl. The alkyl glucoside used here consists of an alkyl group linked to a sugar, where the sugar is glucose. The alkyl glucoside may be, for example, an undecyl alkyl glucoside. An undecyl alkyl glucoside may contain an undecyl chain with an O-glycosidic bond to a mono-N-glucopyranose (e.g. n-undecyl-β-D-glucopyranose)
- 6 046732 или олиго- или полисахаридами D-глюкопиранозы или их смесями. Химический синтез алкил глюкозидов, таких которые используются в способах данного изобретения, может привести к гетерогенному смешиванию соединений, а не к полностью гомогенному препарату. Таким образом, если не указано иное, используемые здесь ссылки на конкретную форму алкил глюкозида означают, что, по меньшей мере, большинство компонентов любой гетерогенной смеси представляет собой форму алкил глюкозида, такую как ундецил алкил глюкозид. Примеры таких алкил глюкозидов, которые содержат ундецил алкил глюкозиды включают, но не ограничиваются SIMULSOL™ SL 11W и SIMULSOL™ SL 82.- 6 046732 or D-glucopyranose oligo- or polysaccharides or mixtures thereof. Chemical synthesis of alkyl glucosides, such as those used in the methods of this invention, can result in a heterogeneous mixture of compounds rather than a completely homogeneous preparation. Thus, unless otherwise indicated, references herein to a specific alkyl glucoside form mean that at least the majority of the components of any heterogeneous mixture are an alkyl glucoside form, such as undecyl alkyl glucoside. Examples of such alkyl glucosides that contain undecyl alkyl glucosides include, but are not limited to, SIMULSOL™ SL 11W and SIMULSOL™ SL 82.
Питательный поток продуктов или поток питательных веществ представляет собой материал или раствор, предназначенный для метода очистки, который содержит представляющий интерес терапевтический или диагностический белок и который также может содержать различные примеси. Неограниченные примеры могут включать, например, собранную жидкость клеточной культуры, собранный материал клеточной культуры, осветленную жидкость клеточной культуры, осветленный материал клеточной культуры, пул захвата, восстановленный пул и/или собранный пул, содержащий терапевтический или представляющий интерес диагностический белок после одной или нескольких стадий центрифугирования и/или стадий фильтрации, пул улавливания, восстановленный пул белка и/или собранный пул, содержащий представляющий интерес терапевтический или диагностический белок, после одной или нескольких стадий очистки.A nutrient product stream or nutrient stream is a material or solution intended for a purification method that contains a therapeutic or diagnostic protein of interest and which may also contain various impurities. Non-limiting examples may include, for example, a pooled cell culture fluid, pooled cell culture material, clarified cell culture fluid, clarified cell culture material, a capture pool, a recovered pool, and/or a pooled pool containing a therapeutic or diagnostic protein of interest after one or more steps centrifugation and/or filtration steps, a capture pool, a recovered protein pool, and/or a collected pool containing a therapeutic or diagnostic protein of interest after one or more purification steps.
Термин примеси относится к материалам, которые отличаются от желаемого белкового продукта. Примесь включает, без ограничений: материалы клетки-хозяина, такие как CHOP; выщелоченный белок А; нуклеиновую кислоту; вариант, вариант размера, фрагмент, агрегат или производное желаемого белка; другой белок; эндотоксин; вирусный контаминант; компонент среды для культивирования клеток и т. д.The term impurities refers to materials that differ from the desired protein product. Impurity includes, but is not limited to: host cell materials such as CHOP; leached protein A; nucleic acid; a variant, size variant, fragment, aggregate or derivative of the desired protein; other protein; endotoxin; viral contaminant; component of cell culture medium, etc.
Термины белок и полипептид используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может быть прерван не аминокислотами. Эти термины также охватывают полимер аминокислоты, который был модифицирован естественным путем или путем искусственного вмешательства; например, вследствие образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или с помощью любых других манипуляций или модификаций, таких как конъюгация с метящим компонентом. Также в данное определение включены, например, белки, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т. д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Примеры белков включают, но не ограничиваются ими, антитела, пептиды, ферменты, рецепторы, гормоны, регуляторные факторы, антигены, связывающие агенты, цитокины, гибридные Fc-белки, молекулы иммуноадгезина и т. д.The terms protein and polypeptide are used interchangeably herein to refer to polymers of amino acids of any length. The polymer may be linear or branched, it may contain modified amino acids, and it may be interrupted by non-amino acids. These terms also cover an amino acid polymer that has been modified naturally or by artificial intervention; for example, due to disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation, or any other manipulation or modification such as conjugation with a labeling moiety. Also included in this definition are, for example, proteins containing one or more amino acid analogues (including, for example, unnatural amino acids, etc.), as well as other modifications known in the art. Examples of proteins include, but are not limited to, antibodies, peptides, enzymes, receptors, hormones, regulatory factors, antigens, binding agents, cytokines, Fc fusion proteins, immunoadhesin molecules, etc.
Термин антитело или антитела используется в самом широком смысле и конкретно охватывает, например, моноклональные антитела (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, композиции антител с полиэпитопной специфичностью, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), иммуноадгезины и фрагменты антител пока они проявляют желаемую биологическую или иммунологическую активность. Термин иммуноглобулин (Ig) используется здесь взаимозаменяемо с антителом.The term antibody or antibodies is used in the broadest sense and specifically covers, for example, monoclonal antibodies (including agonistic, antagonistic and neutralizing antibodies), chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, polyepitope specific antibody compositions, polyclonal antibodies, single chain antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), immunoadhesins and antibody fragments as long as they exhibit the desired biological or immunological activity. The term immunoglobulin (Ig) is used here interchangeably with antibody.
Термин ультрафильтрация или фильтрация представляет собой форму мембранной фильтрации, при которой гидростатическое давление прижимает жидкость к полупроницаемой мембране. Взвешенные вещества и растворенные вещества с высокой молекулярной массой задерживаются, а вода и растворенные вещества с низкой молекулярной массой проходят через мембрану. В некоторых примерах ультрафильтрационные мембраны имеют размеры пор в диапазоне от 1 мкм до 100 мкм. Термины ультрафильтрационная мембрана, ультрафильтрационный фильтр, фильтрационная мембрана и фильтрационный фильтр могут использоваться взаимозаменяемо. Примеры фильтрующих мембран включают, но не ограничены мембраной из поливинилиденфторида (PVDF), ацетата целлюлозы, нитрата целлюлозы, политетрафторэтилена (PTFE, тефлон), поливинилхлорида, полиэфирсульфона, стекловолокна или других фильтрующих материалов, подходящих для использования в соответствии cGMP в производственной среде.The term ultrafiltration or filtration is a form of membrane filtration in which hydrostatic pressure forces liquid against a semi-permeable membrane. Suspended solids and high molecular weight solutes are retained, while water and low molecular weight solutes pass through the membrane. In some examples, ultrafiltration membranes have pore sizes ranging from 1 μm to 100 μm. The terms ultrafiltration membrane, ultrafiltration filter, filtration membrane and filtration filter can be used interchangeably. Examples of filtration membranes include, but are not limited to, polyvinylidene fluoride (PVDF), cellulose acetate, cellulose nitrate, polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinyl chloride, polyethersulfone, fiberglass, or other filtration materials suitable for cGMP use in a manufacturing environment.
Используемый здесь числовой диапазон включает числа, определяющие диапазон.The numeric range used here includes the numbers that define the range.
Термин вирус с оболочкой или вирус, содержащий липидную оболочку относится к любому вирусу, содержащему мембрану или оболочку, включающую липид, такой как, например, оболочечный вирус. Капсид вирусов с оболочкой заключен в липопротеиновую мембрану или оболочку. Эта оболочка происходит от клетки-хозяина, когда вирус отпочковывается от ее поверхности, и состоит в основном из липидов, не кодируемых вирусным геномом. Несмотря на то, что он несет молекулярные детерминанты для прикрепления и проникновения в клетки-мишени и необходим для инфекционности оболочечных вирусов, он не подвержен лекарственной устойчивости или антигенному сдвигу. Размер вирусов с оболочкой варьируется от около 45-55 нм до около 120-200 нм. Неограничивающие примеры вирусов, содержащих липидную оболочку, которые могут инфицировать клетки млекопитающих, включают ДНКThe term enveloped virus or lipid enveloped virus refers to any virus containing a membrane or envelope including a lipid, such as, for example, an enveloped virus. The capsid of enveloped viruses is enclosed in a lipoprotein membrane or envelope. This envelope is derived from the host cell when the virus buds from its surface and consists primarily of lipids not encoded by the viral genome. Although it carries molecular determinants for attachment and entry into target cells and is essential for the infectivity of enveloped viruses, it is not susceptible to drug resistance or antigenic shift. The size of enveloped viruses varies from about 45-55 nm to about 120-200 nm. Non-limiting examples of lipid enveloped viruses that can infect mammalian cells include DNA
- 7 046732 вирусы, такие как вирус герпеса, вирус поксвируса или вирус гепаднавируса; РНК-вирусы, такие как вирус флавивирусов, вирус тогавирусов, вирус коронавирусов, вирус дельтавирусов, вирус ортомиксовирусов, вирус парамиксовирусов, вирус рабдовирусов, вирус буньявирусов или вирус филовирусов; и вирусы с обратной транскрипцией, такие как вирус ретровирусов или вирус гепаднавирусов. В одном из вариантов, изобретение предлагает способы инактивации субвирусного агента в потоке сырья продукта, включающие обработку потока сырья экологически безопасным детергентом. В некоторых аспектах субвирусный агент представляет собой вироид или сателлит. В другом варианте, изобретение обеспечивает способы инактивации вирусоподобного агента в питательном потоке продукта, включающие обработку исходного потока экологически безопасным моющим средством.- 7 046732 viruses, such as herpes virus, poxvirus virus or hepadnavirus virus; RNA viruses such as flavivirus virus, togavirus virus, coronavirus virus, deltavirus virus, orthomyxovirus virus, paramyxovirus virus, rhabdovirus virus, bunyavirus virus or filovirus virus; and reverse transcription viruses such as retroviral virus or hepadnavirus virus. In one embodiment, the invention provides methods for inactivating a subviral agent in a product feed stream, comprising treating the feed stream with an environmentally friendly detergent. In some aspects, the subviral agent is a viroid or satellite. In another embodiment, the invention provides methods for inactivating a virus-like agent in a product feed stream comprising treating the feed stream with an environmentally friendly detergent.
Способы измерения вирусной активности или вирусной инфекционности известны в данной области. Примеры включают, но не ограничиваются ими, анализом TCID 50 (т.е. определение средней инфекционной дозы культуры тканей, которая вызывает патологические изменения в 50% инокулированных клеточных культур) и анализы бляшек. Другие известные способы могут включать, например, анализ трансформации, который можно использовать для определения титров биологической активности не образующих бляшек вирусов, обладающих способностью вызывать трансформацию клеточного роста; или анализ флуоресцентного фокуса, который основан на использовании методов окрашивания антител для обнаружения вирусных антигенов в инфицированных клетках в монослое, или анализ конечного разведения, который можно использовать для определения титров многих вирусов, включая вирусы, которые не инфицируют монослой клетки (в качестве альтернативы пробы бляшек); или анализы вирусных ферментов, в которых измеряют кодируемые вирусом ферменты, такие как обратные транскриптазы или вирусные протеазы. Кроме того, обнаружение конкретного вируса можно осуществить с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров и зондов, предназначенных для обнаружения конкретного вируса.Methods for measuring viral activity or viral infectivity are known in the art. Examples include, but are not limited to, the TCID 50 assay (ie, determination of the average tissue culture infectious dose that produces pathological changes in 50% of inoculated cell cultures) and plaque assays. Other known methods may include, for example, a transformation assay, which can be used to determine the biological activity titers of non-plaque-forming viruses that have the ability to cause cell growth transformation; or a fluorescence focus assay, which relies on the use of antibody staining techniques to detect viral antigens in infected cells in a monolayer, or a terminal dilution assay, which can be used to determine titers of many viruses, including viruses that do not infect a cell monolayer (alternatively, plaque assays ); or viral enzyme assays, which measure virus-encoded enzymes such as reverse transcriptases or viral proteases. In addition, detection of a specific virus can be done using polymerase chain reaction (PCR) using primers and probes designed to detect a specific virus.
Инактивацию вируса в питательном потоке продукта можно измерить, используя способы, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения, вирусная инактивация выражается в виде логарифмического коэффициента снижения (LRF) или логарифмического снижения значения (LRV). LRF рассчитывается как:Virus inactivation in the product feed stream can be measured using methods known in the art. In some embodiments, viral inactivation is expressed as a log reduction factor (LRF) or a log reduction value (LRV). LRF is calculated as:
VT tf = log10^ 10 ут , , где R - логарифмический коэффициент уменьшения (LRF); Vi - входной объем, мл; Ti - входной титр вируса; Vo - выходной объем и To - выходной титр вируса.VT tf = log 10 ^ 10 yt , , where R is the logarithmic reduction factor (LRF); Vi - input volume, ml; Ti is the input titer of the virus; Vo is the output volume and To is the output virus titer.
ПримерыExamples
Пример 1. Инактивация вирусов неионогенными гликозидными детергентамиExample 1. Inactivation of viruses by nonionic glycosidic detergents
Детерагенты и реагентыDetergents and reagents
Исходный раствор для приведенных в качестве примера детергентов, перечисленных в табл. 1 (Seppic Inc. Fairfield, NJ), и 1,2-пропандиола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) готовят в воде в процентном соотношении масса/объем (мас./мас.).The stock solution for the example detergents listed in table. 1 (Seppic Inc. Fairfield, NJ), and 1,2-propanediol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) were prepared in water at a percentage weight/volume (w/w) ratio.
Таблица 1 Типы детергентовTable 1 Types of detergents
Вирусы и индикаторные клеткиViruses and indicator cells
Ксенотропный мышиный лейкоз (XMuLV), парвовирус свиней (PPV), штамм NADL-2 и вирус псевдобешенства (PRV) для использования в этих исследованиях можно приобрести в АТСС, Manassas,Xenotropic murine leukemia (XMuLV), porcine parvovirus (PPV), NADL-2 strain, and pseudorabies virus (PRV) for use in these studies can be purchased from ATCC, Manassas,
- 8 046732- 8 046732
VA. В табл. 2 показаны свойства этих вирусов.V.A. In table 2 shows the properties of these viruses.
Таблица 2 Характеристики вирусаTable 2 Virus characteristics
PK13 (эпителиальные клетки свиньи), PG-4 (клетки головного мозга кошек) и Vero (клетки африканской зеленой обезьяны) для использования в этих исследованиях можно приобрести в АТСС, Manassas, VA. Клетки PK-13 культивируют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, Gibco, Grand Island, NY). Клетки PG-4 культивируют в среде McCoy's 5а (АТСС, Manassas, VA), а клетки Vero культивируют в модифицированной Earl's среде Игла (ЕМЕМ, Gibco, Grand Island, NY). Все клетки дополняют 10% FBS (HyClone, Logan, UT).PK13 (porcine epithelial cells), PG-4 (feline brain cells), and Vero (African green monkey cells) for use in these studies are available from ATCC, Manassas, VA. PK-13 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY). PG-4 cells were cultured in McCoy's 5a medium (ATCC, Manassas, VA), and Vero cells were cultured in Earl's modified Eagle's medium (EMEM, Gibco, Grand Island, NY). All cells were supplemented with 10% FBS (HyClone, Logan, UT).
Анализ титрования вируса TCID50 на основе клетокCell-based TCID50 virus titration assay
Анализ инфекционной дозы 50 на основе клеточной культуры ткани (TCID50) используется для титрования вируса XMuLV с индикаторными клетками PG-4, PPV с индикаторными клетками PK-13 и PRV с индикаторными клетками Vero. 96-луночные планшеты для тканевых культур засевают 2,5х104 клеток/мл индикаторными клетками по 200 мкл/лунку и инкубируют при 37°С в течение ночи или около 1624 часов. Затем планшеты инокулируют вирусом в серии 10-кратных разведений по 50 мкл/лунку при минимуме n=8 на разведение. Засеянные чашки инкубируют в течение 7-9 дней (XMuLV и PRV) и 10-13 дней (PPV) при 37°С. Затем планшеты исследуют и оценивают положительно или отрицательно по лункам под микроскопом на цитопатические эффекты (СРЕ), титры вируса рассчитывают стандартными методами.The Tissue Culture Infectious Dose 50 (TCID50) assay is used to titrate XMuLV with PG-4 indicator cells, PPV with PK-13 indicator cells, and PRV with Vero indicator cells. 96-well tissue culture plates are seeded with 2.5 x 10 4 cells/ml indicator cells at 200 µl/well and incubated at 37°C overnight or about 1624 hours. The plates are then inoculated with virus in a series of 10-fold dilutions of 50 μl/well with a minimum of n=8 per dilution. Inoculated plates are incubated for 7-9 days (XMuLV and PRV) and 10-13 days (PPV) at 37°C. The plates are then examined and scored positive or negative on the wells under a microscope for cytopathic effects (CPE), and virus titers are calculated using standard methods.
Вирусная цитотоксичность и интерференция в очищенном материале биореактораViral cytotoxicity and interference in purified bioreactor material
Анализ TCID50, приведенный в качестве примера выше, используется для определения цитотоксического действия вирусов в осветленном биореакторном собранном материале моноклонального антитела (mAb), биспецифического антитела и Fc-гибридных белков. Материалы сбора биореактора очищают центрифугированием с последующей полирующей фильтрацией. Примеси, такие как белки клеткихозяина, липиды и ДНК клетки-хозяев, также автоматически концентрируются в процессе центрифугирования. Очищенный собранный биореакторный материал для различных белков, содержащих от 0,05% мас./мас. до 1% мас./мас. детергентов, разводят в инокуляционной среде в 10, 50 и 100 раз. Каждое разведение добавляют при n=8 в 96-луночные планшеты с засеянными индикаторными клетками и инкубируют в соответствии с анализом TCID50. В конце периода инкубации каждую лунку осматривают под микроскопом на наличие СРЕ и определяют соответствующее разведение, необходимое для каждого детергента. Результаты показали, что 50-кратного разведения было достаточно для преодоления цитотоксичности детергента.The TCID50 assay exemplified above is used to determine the cytotoxic effects of viruses in clarified bioreactor harvested monoclonal antibody (mAb), bispecific antibody, and Fc fusion protein material. Bioreactor collection materials are purified by centrifugation followed by polishing filtration. Impurities such as host cell proteins, lipids and host cell DNA are also automatically concentrated during the centrifugation process. Purified collected bioreactor material for various proteins containing from 0.05% w/w. up to 1% w/w detergents, diluted in the inoculation medium 10, 50 and 100 times. Each dilution is added at n=8 to 96-well plates seeded with indicator cells and incubated according to the TCID50 assay. At the end of the incubation period, each well is examined under a microscope for the presence of CPE and the appropriate dilution required for each detergent is determined. The results showed that a 50-fold dilution was sufficient to overcome the cytotoxicity of the detergent.
Очищенные материалы сбора биореактора для различных типов белков оценивают на любые внутренние эффекты репликации вируса собранного материала клеточной культуры. Каждый вирус разбавляют в 10 раз в очищенном собранном материале биореактора и инокулируют в планшеты, засеянные индикаторными клетками, и проводят эксперимент в соответствии с анализом TCID50. Включен положительный контроль (вирус, добавленный в материал культуры ткани). Титры вируса сравнивают с вирусом положительного контроля. Титры, которые находятся в пределах ± 0,5 log10 от титров положительного контроля, не вызывают вирусной интерференции. Все титры вирусных тестов находились в пределах ± 0,5 log10 от титров положительного контроля, и, таким образом, не наблюдалось вирусной интерференции ни для одного из материалов сбора биореактора, независимо от типа белка.Purified bioreactor collection materials for various types of proteins are assessed for any intrinsic effects of virus replication of the collected cell culture material. Each virus is diluted 10-fold in purified bioreactor harvest material and inoculated into plates seeded with indicator cells and experimented according to the TCID50 assay. A positive control (virus added to tissue culture material) was included. Virus titers are compared with positive control virus. Titers that are within ±0.5 log 10 of the positive control titers do not cause viral interference. All viral test titers were within ±0.5 log10 of the positive control titers, and thus no viral interference was observed for any of the bioreactor collection materials, regardless of protein type.
Общая процедура вирусной инактивацииGeneral procedure for viral inactivation
Вирусная инактивация различных оболочечных вирусов каждым детергентом оценивается в диапазоне различных концентраций, температур и рН в очищеных материалах биореактора, содержащих mAb, биспецифические и гибридные Fc-белки. Вирусы XMuLV, PPV или PRV вносятся в собранный материал в концентрации не более 5% мас./мас., а раствор детергента добавляется к материалу для достижения заданной конечной концентрации детергента. Затем образцы инкубируют при определенных диапазонах температуры и значениях рН. Инактивация вируса начинается, как только детергент добавляется к материалу, содержащему вирус. Кинетику инактивации вируса отслеживают путем отбора аликвот в различные моменты времени из собранных образцов, а титр вируса оценивают с помощью анализа TCID50. Контрольные матрицы включены в исследования, чтобы продемонстрировать, что инактивация вируса является результатом обработки детергентом, а не самой матрицей.Viral inactivation of various enveloped viruses by each detergent was assessed over a range of different concentrations, temperatures and pH in purified bioreactor materials containing mAbs, bispecific and Fc fusion proteins. XMuLV, PPV or PRV viruses are added to the collected material at a concentration of no more than 5% w/w, and a detergent solution is added to the material to achieve the desired final detergent concentration. The samples are then incubated at specific temperature ranges and pH values. Inactivation of the virus begins as soon as the detergent is added to the material containing the virus. The kinetics of virus inactivation is monitored by aliquoting at different time points from the collected samples, and the virus titer is assessed using the TCID50 assay. Control matrices are included in studies to demonstrate that virus inactivation is a result of detergent treatment and not the matrix itself.
- 9 046732- 9 046732
Инактивация XMuLV при 30°С неионогенными детергентамиInactivation of XMuLV at 30°C by nonionic detergents
Вирусную инактивацию XMuLV детергентами, перечисленными в табл. 1, тестируют при оптимальных условиях, определенных для инактивации XMuLV. В соответствии с процедурой вирусной инактивации, приведенной в качестве примера выше, каждый детергент добавляют в количестве 0,6% мас./мас. к собранному очищенному материалу биореактора mAb с добавлением XMuLV при 30°С. Инактивацию вируса отслеживают в различные моменты времени, при этом максимальное время инактивации составляет 180 минут после инокуляции вируса.Viral inactivation of XMuLV by detergents listed in table. 1 are tested under optimal conditions determined for XMuLV inactivation. In accordance with the viral inactivation procedure exemplified above, each detergent was added in an amount of 0.6% w/w. to the collected purified mAb bioreactor material with the addition of XMuLV at 30°C. Virus inactivation is monitored at various time points, with a maximum inactivation time of 180 minutes after virus inoculation.
Результаты, представленные в табл. 3, показывают, что для инактивации XMuLV при оптимальных условиях, XMuLV быстро и полностью инактивируется для всех протестированных моющих средств через 180 минут, за исключением SIMULSOL™ SL 4 и SIMULSOL™ AS 48. Поскольку при использовании SIMULSOL™ SL 4 инактивации вируса не наблюдалось, концентрацию SIMULSOL™ SL 4 повышают до 30 мМ (1%) и контролируют инактивацию XMuLV при 30°С в течение 180 минут. Однако инактивации XMuLV не наблюдалось при повышенной концентрации SIMULSOL™ SL 4 (данные не представлены). Удивительно, но эти результаты свидетельствуют о том, что не все глюкозиды способны к надежной инактивации вирусов или что для достижения надежной инактивации требуются чрезвычайно высокие концентрации, как это наблюдалось для SIMULSOL™ AS 48. Тем не менее, SIMULSOL™ SL 11W продемонстрировал полную вирусную инактивацию, превышающую LRF, равную 4, в течение 0-5 минут после добавления его к очищенному собранному материалу биореактора mAb. Кроме того, хотя другие глюкозиды эффективно инактивировали XMuLV, другие факторы ограничивают применимость некоторых из этих детергентов в крупномасштабном производственном процессе. Такие характеристики детергента включали растворимость, влияние на мутность собранного материала, активность при различных температурах и диапазонах рН, неизвестные или ограниченные данные о токсичности для окружающей среды и простоту обращения.The results presented in table. 3 show that for XMuLV inactivation under optimal conditions, XMuLV was rapidly and completely inactivated for all detergents tested after 180 minutes, with the exception of SIMULSOL™ SL 4 and SIMULSOL™ AS 48. Since no virus inactivation was observed with SIMULSOL™ SL 4, the concentration of SIMULSOL™ SL 4 is increased to 30 mM (1%) and the inactivation of XMuLV is monitored at 30°C for 180 minutes. However, no inactivation of XMuLV was observed at elevated concentrations of SIMULSOL™ SL 4 (data not shown). Surprisingly, these results suggest that not all glucosides are capable of reliable virus inactivation or that extremely high concentrations are required to achieve reliable inactivation, as was observed for SIMULSOL™ AS 48. However, SIMULSOL™ SL 11W demonstrated complete viral inactivation greater than an LRF of 4 within 0-5 minutes of adding it to the purified harvested mAb bioreactor material. Additionally, although other glucosides were effective in inactivating XMuLV, other factors limit the applicability of some of these detergents in a large-scale production process. Such detergent characteristics included solubility, influence on the turbidity of collected material, activity at different temperatures and pH ranges, unknown or limited environmental toxicity data, and ease of handling.
Таблица 3Table 3
Инактивация XMuLV при 30°С неионогенными детергентами в очищенном собранном материале биоре____________________ актора mAb________________________Inactivation of XMuLV at 30°C by nonionic detergents in purified collected material of the biore____________________ actor mAb________________________
Мутность SIMULSOL™ SL 11W в очищенном собранном материале биореактора mAb.SIMULSOL™ SL 11W turbidity in purified collected mAb bioreactor material.
Мутность оценивали при концентрациях SIMULSOL™ SL 11W 0 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,3 %, 0,5 % и 1 % мас./мас. в XMuLV, добавленном в очищенный собранный материал биореактора mAb при 18°С. Вирусная инактивация отслеживается в течение 180 минут, а мутность измеряется в нефелометрических единицах мутности (NTU) с использованием портативного турбидометра 2100P (Hach®).Turbidity was assessed at SIMULSOL™ SL 11W concentrations of 0%, 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5% and 1% w/w. in XMuLV added to purified harvested mAb bioreactor material at 18°C. Viral inactivation is monitored over 180 minutes and turbidity is measured in nephelometric turbidity units (NTU) using a 2100P portable turbidometer (Hach®).
Результаты, показанные в табл. 4, показывают, что SIMULSOL™ SL 11W при концентрациях в диапазоне от 0% до 1% мас./мас. был стабилен с течением времени, и в собранном материале не наблюдалось больших осадков в течение 180 минут.The results shown in table. 4 show that SIMULSOL™ SL 11W at concentrations ranging from 0% to 1% w/w. was stable over time and no major precipitation was observed in the collected material for 180 minutes.
Таблица 4Table 4
Мутность SIMULSOL™ SL 11W в очищенном собранном материале биореактора mAb, инкубированном _____________ при 18°С___________________Turbidity of SIMULSOL™ SL 11W in purified harvested mAb bioreactor material incubated _____________ at 18°C___________________
Характеристика и оптимизация вирусной инактивации с помощью SIMULSOL™ SL 11WCharacterization and optimization of viral inactivation using SIMULSOL™ SL 11W
- 10 046732- 10 046732
Использование SIMULSOL™ SL 11W в качестве пригодного экологически безопасного детергента для применения в процессах производства белков дополнительно оценивается на очищенном собранном материале mAb в биореакторе в соответствии с описанной выше процедурой вирусной инактивации. Вкратце, активность SIMULSOL™ SL 11W оценивают при концентрациях 0,05%, 0,1%, 0,3%, 0,5% и 1% мас./мас. в очищенном материале биореактора mAb с добавлением XMuLV при 4 различных температурах 4°С, 18°С, 25°С и 30°С. Вирусную инактивацию отслеживают через 0, 10, 30, 60, 120 и 180 минут после инокуляции XMuLV в содержащий SIMULSOL™ SL 11W очищенный материал сбора биореактора mAb. Результаты, как показано в табл. 5-9 показывают, что концентрация SIMULSOL™ SL 11W, время инкубации и температура являются факторами, влияющими на инактивацию XMuLV. SIMULSOL™ SL 11W достиг полной инактивации вируса XMuLV при концентрациях > 0,1 % мас./мас. (> 3 мМ) через 120 минут и при концентрациях > 0,3 % мас./мас. через 10 минут при всех 4 оцениваемых температурах.The use of SIMULSOL™ SL 11W as a suitable environmentally friendly detergent for use in protein production processes is further evaluated on purified collected mAb material in a bioreactor according to the viral inactivation procedure described above. Briefly, the activity of SIMULSOL™ SL 11W was assessed at concentrations of 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5% and 1% w/w. in purified mAb bioreactor material with the addition of XMuLV at 4 different temperatures 4°C, 18°C, 25°C and 30°C. Viral inactivation was monitored at 0, 10, 30, 60, 120 and 180 minutes after inoculation of XMuLV into SIMULSOL™ SL 11W-containing purified mAb bioreactor collection material. The results are as shown in Table. 5-9 show that SIMULSOL™ SL 11W concentration, incubation time and temperature are factors affecting XMuLV inactivation. SIMULSOL™ SL 11W achieved complete inactivation of the XMuLV virus at concentrations > 0.1% w/w. (> 3 mM) after 120 minutes and at concentrations > 0.3% w/w. after 10 minutes at all 4 temperatures assessed.
Таблица 5Table 5
Инактивация XMuLV 1,5 мМ (0,05%) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV 1.5 mM (0.05%) SIMULSOL™ SL 11W in purified mAb bioreactor collection material
Таблица 6Table 6
Инактивация XMuLV 3,0 мМ (0,1%) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV 3.0 mM (0.1%) SIMULSOL™ SL 11W in purified mAb bioreactor collection material
Таблица 7Table 7
Инактивация XMuLV 9,0 мМ (0,3%) SIMULSOL™ SL 11W в осветленный материал урожая биореактора mAbInactivation of XMuLV 9.0 mM (0.3%) SIMULSOL™ SL 11W into clarified mAb bioreactor harvest material
Таблица 8Table 8
Инактивация XMuLV 15 мМ (0,5%) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV 15 mM (0.5%) SIMULSOL™ SL 11W in purified mAb bioreactor collection material
- 11 046732- 11 046732
Таблица 9Table 9
Инактивация XMuLV 30 мМ (1,0%) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV 30 mM (1.0%) SIMULSOL™ SL 11W in purified mAb bioreactor collection material
Инактивация XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11W в различных исходных матрицахInactivation of XMuLV using SIMULSOL™ SL 11W in various parent matrices
Оценена способность SIMULSOL™ SL 11W инактивировать вирус в концентрации 9 мМ (0,3% мас./мас.) в различных исходных матрицах, таких как вода, среда для культивирования клеток и фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) при 4°С и 30°С. Инактивацию вируса отслеживают через 0, 60, 120 и 180 минут после инокуляции XMuLV.The ability of SIMULSOL™ SL 11W to inactivate virus at a concentration of 9 mM (0.3% w/w) in various starting matrices such as water, cell culture medium and Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) at 4°C and 30°C. Virus inactivation was monitored at 0, 60, 120, and 180 min after XMuLV inoculation.
Результаты, показанные в табл. 10, показывают устойчивую инактивацию XMuLV как при 4°С, так и при 30°С через 120 минут во всех трех исходных матрицах. DPBS при 4°С через 180 минут выявил несколько живых вирусных частиц в анализе TCID50, но LRF 5,63 все же был достигнут. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что SIMULSOL™ SL 11W способен эффективно инактивировать вирус независимо от исходной матрицы. Это предполагает потенциальное использование SIMULSOL™ SL 11W на биофармацевтических производственных платформах и гибкость использования SIMULSOL™ SL 11W на разных этапах процесса производства белка.The results shown in table. 10 show robust inactivation of XMuLV at both 4°C and 30°C after 120 minutes in all three starting matrices. DPBS at 4°C after 180 minutes detected few live virus particles in the TCID50 assay, but an LRF of 5.63 was still achieved. Overall, these results indicate that SIMULSOL™ SL 11W is able to effectively inactivate the virus regardless of the starting matrix. This suggests the potential use of SIMULSOL™ SL 11W in biopharmaceutical production platforms and the flexibility of using SIMULSOL™ SL 11W at different stages of the protein production process.
Таблица 10Table 10
Инактивация XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11W в различных исходных матрицахInactivation of XMuLV using SIMULSOL™ SL 11W in various parent matrices
Кинетика инактивации XMuLV при 0,3% SIMULSOL™ SL 11W при 4°С и 30°СKinetics of XMuLV inactivation at 0.3% SIMULSOL™ SL 11W at 4°C and 30°C
Оценивается способность SIMULSOL™ SL 11W инактивировать вирус в более короткие промежутки времени. SIMULSOL™ SL 11W добавляют в концентрации 9 мМ (0,3% мас./мас.) к очищенному материалу, собранному в биореакторе при 4°С и 30°С. Инактивацию вируса отслеживают через 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 и 180 минут после инокуляции XMuLV.The ability of SIMULSOL™ SL 11W to inactivate the virus in shorter periods of time is assessed. SIMULSOL™ SL 11W is added at a concentration of 9 mM (0.3% w/w) to the purified material collected in the bioreactor at 4°C and 30°C. Virus inactivation was monitored at 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, and 180 min after XMuLV inoculation.
Результаты, показанные в табл. 11, показывают, что полная инактивация XMuLV происходит через > 6 минут при 4°С и через > 2 минут при 30°С с 9 мМ (0,3% вес./вес.) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном собранном материале моноклональных антител в биореакторе.The results shown in table. 11 show that complete inactivation of XMuLV occurs after >6 minutes at 4°C and after >2 minutes at 30°C with 9 mM (0.3% w/w) SIMULSOL™ SL 11W in purified monoclonal antibody pool material in a bioreactor.
Таблица 11Table 11
Инактивация XMuLV с помощью 9 мМ (0,3%) SIMULSOL™ SL 11W при 4°С и 30°С в очищенном мате___________риале сбора биореактора mAb___________Inactivation of XMuLV with 9 mM (0.3%) SIMULSOL™ SL 11W at 4°C and 30°C in purified mAb___________bioreactor collection material___________
Влияние стабилизирующего агента монопропиленгликоля на инактивацию вирусаEffect of the stabilizing agent monopropylene glycol on virus inactivation
Оценено влияние монопропиленгликоля на инактивацию вирусов в концентрациях 0,1% и 0,5% в очищенных материалах сбора биореактора mAb при 30°С. Инактивацию вируса отслеживают через 0 иThe effect of monopropylene glycol on virus inactivation at concentrations of 0.1% and 0.5% in purified mAb bioreactor collection materials at 30°C was assessed. Virus inactivation is monitored after 0 and
- 12 046732- 12 046732
180 минут после инокуляции XMuLV. SIMULSOL™ SL 11W содержит от 1% до 5% монопропиленгликоля. Максимальная концентрация монопропиленгликоля, приведённая здесь в процедурах инактивации, составляет 0,05%. Результаты, продемонстрированные в табл. 12, показывают, что монопропиленгликоль в концентрациях 0,1% и 0,5% не инактивирует XMuLV в очищенном материале сбора биореактора mAb при 30°С. Кроме того, концентрации монопропиленгликоля, представленные в табл. 11, как минимум в 10 раз превышают максимальную концентрацию, которая может быть обнаружена в очищенном материале сбора биореактора mAb, обработанном SIMULSOL™ SL 11W. Это указывает на то, что SIMULSOL™ SL 11W отвечает за наблюдаемую инактивацию вируса.180 minutes after XMuLV inoculation. SIMULSOL™ SL 11W contains from 1% to 5% monopropylene glycol. The maximum monopropylene glycol concentration given in the inactivation procedures here is 0.05%. The results shown in table. 12 show that monopropylene glycol at concentrations of 0.1% and 0.5% does not inactivate XMuLV in purified mAb bioreactor harvest material at 30°C. In addition, the concentrations of monopropylene glycol presented in Table. 11 are at least 10 times the maximum concentration that can be detected in purified mAb bioreactor collection material treated with SIMULSOL™ SL 11W. This indicates that SIMULSOL™ SL 11W is responsible for the observed virus inactivation.
Таблица 12Table 12
Инактивация XMuLV монопропиленгликолем в очищнном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV by monopropylene glycol in purified mAb bioreactor collection material
Инактивация вирусов с оболочкой и без оболочки с помощью SIMULSOL™ SL 11WInactivation of enveloped and non-enveloped viruses with SIMULSOL™ SL 11W
Оценивается способность SIMULSOL™ SL 11W инактивировать PRV, оболочечный вирус, и PPV, вирус без оболочки. SIMULSOL™ SL 11W добавляют в концентрации 9 мМ (0,3% мас./мас.) к очищенному материалу, собранному в биореакторе при 4°С, 18°С и 30°С. Инактивацию вируса контролируют через 0, 10, 30, 60, 120 и 180 минут после инокуляции.The ability of SIMULSOL™ SL 11W to inactivate PRV, an enveloped virus, and PPV, a non-enveloped virus, is evaluated. SIMULSOL™ SL 11W is added at a concentration of 9 mM (0.3% w/w) to purified material collected in a bioreactor at 4°C, 18°C and 30°C. Virus inactivation is monitored at 0, 10, 30, 60, 120 and 180 minutes after inoculation.
Результаты, показанные в табл. 13, показывают устойчивую инактивацию вируса с оболочкой PRV, происходящую через 10 минут при всех трех температурах, при этом устойчивая инактивация вируса с оболочкой PRV происходит даже при более низких временных точках в пределах от 0 до 5 минут при 30°С. Инактивация PPV не наблюдалась для SIMULSOL™ SL 11W. Эти результаты в совокупности позволяют предположить, что SIMULSOL™ SL 11W не только надежно инактивирует различные оболочечные вирусы в осветленных материалах, собранных в биореакторе, но и что вирусная инактивация с помощью SIMULSOL™ SL 11W специфична для оболочечных вирусов.The results shown in table. 13 show robust inactivation of PRV enveloped virus occurring after 10 minutes at all three temperatures, with robust inactivation of PRV enveloped virus occurring even at lower time points ranging from 0 to 5 minutes at 30°C. PPV inactivation was not observed for SIMULSOL™ SL 11W. These results collectively suggest that SIMULSOL™ SL 11W not only reliably inactivates a variety of enveloped viruses in clarified materials collected in the bioreactor, but also that viral inactivation by SIMULSOL™ SL 11W is specific to enveloped viruses.
Таблица 13Table 13
PRV инактивация 9 мМ (0,3% мас./мас.) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале сбора биореактора mAbPRV inactivation 9 mM (0.3% w/w) SIMULSOL™ SL 11W in purified mAb bioreactor harvest material
Влияние рН на инактивацию XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11WEffect of pH on XMuLV inactivation using SIMULSOL™ SL 11W
Оценивается способность SIMULSOL™ SL 11W инактивировать XMuLV при рН 5,5 и рН 8,0. SIMULSOL™ SL 11W добавляют в концентрации 9 мМ (0,3% мас./мас.) к очищенному материалу сбора биореактора mAb при 18°С. Вирусную инактивацию отслеживают через 0, 10, 30, 60, 120 и 180 минут после инокуляции XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11W, содержащийся в материале сбора биореактора mAb.The ability of SIMULSOL™ SL 11W to inactivate XMuLV at pH 5.5 and pH 8.0 was assessed. SIMULSOL™ SL 11W is added at a concentration of 9 mM (0.3% w/w) to the purified mAb bioreactor harvest material at 18°C. Viral inactivation was monitored at 0, 10, 30, 60, 120 and 180 minutes after XMuLV inoculation using SIMULSOL™ SL 11W contained in mAb bioreactor harvest material.
Результаты, показанные в табл. 14, показывают быструю и полную инактивацию XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11W как при рН 5,5, так и при рН 8,0 за 10 минут, что указывает на потенциальную применимость SIMULSOL™ SL 11W в широком диапазоне рН в процессе производства белков.The results shown in table. 14 show rapid and complete inactivation of XMuLV by SIMULSOL™ SL 11W at both pH 5.5 and pH 8.0 in 10 minutes, indicating the potential applicability of SIMULSOL™ SL 11W over a wide pH range in protein production processes.
Таблица 14Table 14
Инактивация XMuLV 9 мМ (0,3%) SIMULSOL™ SL 11W при 18°С, рН 5,5 и рН 8,0 в очищенном материале сбора биореактора mAbInactivation of XMuLV 9 mM (0.3%) SIMULSOL™ SL 11W at 18°C, pH 5.5 and pH 8.0 in purified mAb bioreactor harvest material
Влияние источника собранного материала биореактора на инактивацию XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11WInfluence of source of harvested bioreactor material on XMuLV inactivation using SIMULSOL™ SL 11W
- 13 046732- 13 046732
Оценивается способность SIMULSOL™ SL 11W инактивировать XMuLV в очищенных биореакторных материалах, содержащих различные рекомбинантные белки, такие как mAb, биспецифические антитела и гибридные Fc-белки. SIMULSOL™ SL 11W добавляется в концентрации 9 мМ (0,3% мас./мас.) к очищенным материалам сбора биореактора различных белков при 4°С и 18°С. Инактивацию вируса отслеживают в моменты времени инкубации 0, 10, 30, 60, 120 и 180 минут. Результаты, показанные в табл. 15, показывают полную инактивацию XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11W за 120 минут как при 4°С, так и при 30°С во всех трех очищенных собранных материалах биореактора. Кроме того, полная инактивация Fc-гибридного материала и белка mAb, содержащего собранный материал, наблюдалась через 10 минут при 4°С. Кинетика инактивации биспецифического антитела была немного медленнее при 4°С, чем у двух других очищенных материалов, собранных в биореакторе, при 4°С. Однако при 18°С полная инактивация SIMULSOL™ SL 11W наблюдалась для всех 3 белков в течение 10 минут.The ability of SIMULSOL™ SL 11W to inactivate XMuLV in purified bioreactor materials containing various recombinant proteins such as mAbs, bispecific antibodies and Fc fusion proteins is evaluated. SIMULSOL™ SL 11W is added at a concentration of 9 mM (0.3% w/w) to purified bioreactor collection materials of various proteins at 4°C and 18°C. Virus inactivation was monitored at incubation time points of 0, 10, 30, 60, 120, and 180 minutes. The results shown in table. 15 show complete inactivation of XMuLV by SIMULSOL™ SL 11W in 120 minutes at both 4°C and 30°C in all three purified harvested bioreactor materials. In addition, complete inactivation of the Fc-fusion material and the protein mAb containing the collected material was observed after 10 minutes at 4°C. The inactivation kinetics of the bispecific antibody was slightly slower at 4°C than that of the other two purified materials collected in the bioreactor at 4°C. However, at 18°C, complete inactivation of SIMULSOL™ SL 11W was observed for all 3 proteins within 10 minutes.
Таблица 15Table 15
Инактивация XMuLV 9 мМ (0,3%) SIMULSOL™ SL 11W в очищенном материале рекомбинантного бел_____________________________ка биореактора_____________________________Inactivation of XMuLV 9 mM (0.3%) SIMULSOL™ SL 11W in purified recombinant protein bioreactor material________________________
Влияние уровней примесей на вирусную инактивацию в очищенном биореакторном собранном материале различных белковEffect of impurity levels on viral inactivation in purified bioreactor harvested material of various proteins
Оценивается влияние уровней примесей в материалах сбора биореактора на три различных рекомбинантных белка: слитый белок Fc, биспецифическое антитело и mAb.The impact of impurity levels in bioreactor harvest materials on three different recombinant proteins is assessed: an Fc fusion protein, a bispecific antibody, and a mAb.
Собранные материалы очищают центрифугированием с последующей полирующей фильтрацией. Примеси, такие как белки клетки-хозяина, липиды и ДНК клетки-хозяина, также автоматически концентрируются в процессе центрифугирования. Образец очищенного материала сбора mAb дополнительно концентрируют около в 4 раза с помощью процесса тангенциальной проточной фильтрации (TFF) с отсечкой молекулярной массы 5 кДа. Измеряют рекомбинантный белок, ДНК и другие примеси НСР в трех очищенных материалах и концентрированном материале TFF. Результаты, показанные в Таблице 16, показывают профили содержания рекомбинантного белка, ДНК клетки-хозяина и НСР в трех очищенных материалах рекомбинантного белка и концентрированном очищенном материале mAb. Наблюдалось более чем 3-кратное увеличение примесей ДНК и НСР в собранном концентрированном очищенном материале mAb по сравнению с неконцентрированным очищенным материалом собранного mAb.The collected materials are purified by centrifugation followed by polishing filtration. Impurities such as host cell proteins, lipids, and host cell DNA are also automatically concentrated during the centrifugation process. A sample of purified mAb collection material is further concentrated approximately 4-fold using a tangential flow filtration (TFF) process with a molecular weight cutoff of 5 kDa. Recombinant protein, DNA and other HCP contaminants in three purified materials and concentrated TFF material are measured. The results shown in Table 16 show the recombinant protein, host cell DNA and HCP content profiles of the three purified recombinant protein materials and the concentrated purified mAb material. There was a greater than 3-fold increase in DNA and HCP contaminants in collected concentrated purified mAb material compared to unconcentrated purified collected mAb material.
Таблица 16Table 16
Количество компонентов в очищенном материале, собранном в биореакторе рекомбинантного белкаAmount of components in purified material collected in recombinant protein bioreactor
Влияние концентрированного биореакторного собранного материала на инактивацию XMuLV с помощью SIMULSOL™ SL 11WEffect of concentrated bioreactor harvested material on XMuLV inactivation using SIMULSOL™ SL 11W
Испытывается влияние SIMULSOL™ SL 11W на инактивацию вирусов в концентрированном очищенном материале mAb собранном в биореакторе. Очищенный материал mAb, собранный в биореакторе, содержащий mAb и другие примеси, концентрируют около в четыре раза с помощью процесса тангенциально-поточной фильтрации (TFF) с отсечкой молекулярной массы 5 кДа. Затем концентрированный материал, содержащий mAb и примеси, немедленно подвергают стерильной фильтрации. Затем к очищенному концентрированному отфильтрованному материалу добавляют SIMULSOL™ SL 11W в конечной концентрации 0,1% мас./мас. (3 мМ). Материал, содержащий SIMULSOL™ 11 W, затем инкубируютThe effect of SIMULSOL™ SL 11W on the inactivation of viruses in concentrated purified mAb material collected in a bioreactor is tested. The purified mAb material collected in the bioreactor, containing the mAb and other impurities, is concentrated approximately fourfold using a tangential flow filtration (TFF) process with a molecular weight cutoff of 5 kDa. The concentrated material containing the mAb and impurities is then immediately subjected to sterile filtration. SIMULSOL™ SL 11W is then added to the purified concentrated filter material at a final concentration of 0.1% w/w. (3 mM). The material containing SIMULSOL™ 11 W is then incubated
- 14 046732 при 3 различных температурах: 4°С, 18°С и 30°С. Вирусная инактивация при различных температурах измеряется в моменты времени в диапазоне от 0 до 180 минут. Результаты, показанные в табл. 17, показывают полную инактивацию XMuLV через 180 минут при всех 3 протестированных температурах, даже несмотря на то, что кинетика инактивации снижается при более низких температурах по сравнению с образцом при 30°С. Не наблюдалось влияния на кинетику инактивации концентрированного материала биореактора по сравнению с неконцентрированным собранным материалом биореактора (данные не показаны). Это говорит о том, что повышенный уровень примесей не влияет на инактивацию вирусов с помощью SIMULSOL™ SL 11W.- 14 046732 at 3 different temperatures: 4°C, 18°C and 30°C. Viral inactivation at various temperatures is measured at time points ranging from 0 to 180 minutes. The results shown in table. 17 show complete inactivation of XMuLV after 180 minutes at all 3 temperatures tested, even though the inactivation kinetics are reduced at lower temperatures compared to the 30°C sample. There was no effect on the inactivation kinetics of concentrated bioreactor material compared to unconcentrated collected bioreactor material (data not shown). This suggests that increased levels of impurities do not affect virus inactivation by SIMULSOL™ SL 11W.
Таблица 17Table 17
Инактивация вируса 3 мМ (0,1%) SIMULSOL™ SL 11W в собранном в 4-кратном концентрировании очищенном mAb материале биореактораVirus inactivation with 3 mM (0.1%) SIMULSOL™ SL 11W in bioreactor material collected at 4-fold concentration of purified mAb
Пример 2. Определение удаления SIMULSOL™ SL 11W при последующей очистке рекомбинантных белковExample 2 Determination of removal of SIMULSOL™ SL 11W during subsequent purification of recombinant proteins
Количественное определение ундецил глюкозида с помощью жидкостной хроматографии и массспектрометрии (ЖХ-МС) - Метод АQuantitative determination of undecyl glucoside using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) - Method A
Количественное определение ЖХ-МС проводят на очищенных образцах mAb, собранных в биореакторе, содержащих SIMULSOL™ SL 11W в диапазоне концентраций от 0,03 мМ до 3 мМ.LC-MS quantitation is performed on purified mAb samples collected in a bioreactor containing SIMULSOL™ SL 11W at concentrations ranging from 0.03 mM to 3 mM.
Один микролитр инкубированного образца вводят в ВЭЖХ Waters Acquity®, соединенную с Waters SYNAPT® G2-Si масс-спектрометром. Для количественного определения, разделение проводят на обращенно-фазовой колонке Varian PLRP-S (1 х 50 мм, 300 А, 5 мкм) при 80°С с использованием 0,05% трифторуксусной кислоты (TFA) с использованием H2O в качестве подвижной фазы А и 0,04 % TFA в ацетонитриле (ACN) в качестве подвижной фазы Б. Колонку уравновешивают 15% подвижной фазы Б в течение 1 минуты и линейно увеличивают от 15% до 30%в течение 3 минут, затем выдерживают при 30% фазы Б в течение 2 минут, а затем удерживается на 100% в течение 1 минуты. После того, как колонка выдерживается при 100% в течение 1 минуты, она повторно уравновешивается на 15% подвижной фазы Б. SIMULSOL™ SL 11W отделяется со скоростью 0,3 мл/мин, от 1 до 6 минут и анализируется с использованием источника ионизации электрораспылением (ESI). Масс-спектрометр работает при положительной модели чувствительности, в диапазоне сканирования от 100 до 1000 а.е.м., капиллярном напряжении 3,2 кВ, температуре десольватации 450°С, потоке десольватирующего газа 900 л/ч, температуре источника 150°С и напряжением на конусе с образцом 40 В. Для характеризации разделение проводят на колонке Waters Acquity® UPLC ВНЕ 300 А С4 (2,1 х 100 мм, размер частиц 1,7 мкм) с теми же подвижными фазами. Уравновешивают колонку при 20% подвижной фазы Б в течение 1 минуты, линейно увеличивая от 20% до 25% в течение 14 минут, а затем до 90% в течение 1 минуты. После выдержки при 100 % в течение 1,0 минуты повторно уравновешивают колонку при 20 % подвижной фазы Б.One microliter of incubated sample is injected into a Waters Acquity® HPLC coupled to a Waters SYNAPT® G2-Si mass spectrometer. For quantitation, separation is carried out on a Varian PLRP-S reverse phase column (1 x 50 mm, 300 A, 5 µm) at 80°C using 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) using H 2 O as mobile phase A and 0.04% TFA in acetonitrile (ACN) as mobile phase B. The column is equilibrated with 15% mobile phase B for 1 minute and ramped from 15% to 30% over 3 minutes, then maintained at 30% phase B for 2 minutes and then held at 100% for 1 minute. After the column is held at 100% for 1 minute, it is re-equilibrated with 15% mobile phase B. SIMULSOL™ SL 11W is separated at a rate of 0.3 ml/min, from 1 to 6 minutes and analyzed using an electrospray ionization source (ESI). The mass spectrometer operates with a positive sensitivity model, scanning range from 100 to 1000 amu, capillary voltage 3.2 kV, desolvation temperature 450°C, desolvation gas flow 900 l/h, source temperature 150°C and the sample cone voltage is 40 V. For characterization, separation is carried out on a Waters Acquity® UPLC OUT 300 A C4 column (2.1 x 100 mm, particle size 1.7 µm) with the same mobile phases. Equilibrate the column at 20% mobile phase B for 1 minute, increasing linearly from 20% to 25% over 14 minutes and then to 90% over 1 minute. After holding at 100% for 1.0 minutes, re-equilibrate the column with 20% mobile phase B.
Выделенную пиковую зону насыщенного ундецил глюкозида измеряют. В условиях анализа ЖХМС наблюдалась линейная зависимость между областью пика извлеченных ионов и концентрациями SIMULSOL™ SL 11W от 0,03 до 3 мМ. Когда концентрация SIMULSOL™ SL 11W превышала 3 мМ, детектор МС насыщался.The isolated peak region of saturated undecyl glucoside is measured. Under LCMS analysis conditions, a linear relationship was observed between the extracted ion peak region and SIMULSOL™ SL 11W concentrations from 0.03 to 3 mM. When the concentration of SIMULSOL™ SL 11W exceeded 3 mM, the MS detector saturated.
Количественное определение ундецил глюкозида с помощью жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) — метод БQuantitative determination of undecyl glucoside using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) - method B
Стандартные растворы, содержащие SIMULSOL™ SL 11W в диапазоне концентраций от 0,0008 мМ до 0,012 мМ, готовят в основном потоке воды или белка А. После добавления SIMULSOL™ SL 11W эти образцы подвергали анализу ЖХ-МС/МС (MRM). Инкубированный образец (100 мкл) вводят в ЖХ и разделяют 1/20 постколонки на МС. Для анализа использовали ВЭЖХ Agilent 1260 Infinity II, соединенную с масс-спектрометром Sciex Triple Quad 5500. Для количественного определения разделение проводят на колонке с обращенной фазой Agilent Zorbax, 300SB-C8 (4,6 х 50 мм, 300А, 3,5 мкм) при 80°С с использованием 0,5 мМ ацетата натрия в воде в качестве подвижной фазы А и 0,5 мМ ацетата натрия в разведении 95:5 ацетонитрил: вода в качестве подвижной фазы Б. Колонку уравновешивают при 20% подвижной фазы Б в течение 2 минут, линейно увеличивают от 20% до 90% в течение 10 минут, выдерживают при 90% фазы Б в течение 2 минут, колонка повторно уравновешивается при 20% подвижной фазы Б. SIMULSOL™ SL 11 W отделяется со скоростью 1,0 мл/мин в течение от 4,5 до 5,5 минут и анализируется с использованием источника ионизации электрораспылением (ESI). Масс-спектрометр рабоStandard solutions containing SIMULSOL™ SL 11W in the concentration range from 0.0008 mM to 0.012 mM are prepared in bulk water or protein A. After addition of SIMULSOL™ SL 11W, these samples were subjected to LC-MS/MS (MRM) analysis. The incubated sample (100 µl) is injected into the LC and 1/20 of the post-column is separated onto the MS. An Agilent 1260 Infinity II HPLC coupled to a Sciex Triple Quad 5500 mass spectrometer was used for analysis. For quantitative determination, separation was performed on an Agilent Zorbax reverse phase column, 300SB-C8 (4.6 x 50 mm, 300 A, 3.5 µm) at 80°C using 0.5 mM sodium acetate in water as mobile phase A and 0.5 mM sodium acetate in a 95:5 dilution of acetonitrile:water as mobile phase B. The column is equilibrated at 20% mobile phase B for 2 minutes, linearly increase from 20% to 90% over 10 minutes, hold at 90% phase B for 2 minutes, column re-equilibrate at 20% mobile phase B. SIMULSOL™ SL 11 W separates at a rate of 1.0 ml/ min for 4.5 to 5.5 minutes and analyzed using an electrospray ionization (ESI) source. Mass spectrometer working
- 15 046732 тает в положительном режиме MRM со сканированием переходных ионов (от 357,0 до 185,0), капиллярным напряжением 5,5 кВ, температурой десольватации 450°С и потоком газа десольватации 55 л/ч.- 15 046732 melts in positive MRM mode with transition ion scanning (357.0 to 185.0), capillary voltage 5.5 kV, desolvation temperature 450°C and desolvation gas flow 55 l/h.
Мониторинг выбранных реакций (SRM/MRM (мониторинг множественных реакций)), метод ЖХМС/МС, используется для селективного обнаружения насыщенного солями SIMULSOL™ SL 11W. Сканирование SRM для одиночного иона-предшественника (масса натриевого SIMULSOL™ SL 11W, 357,0 m/z) и после фрагментации обнаруживается ион-продукт (наиболее преобладающий фрагмент натриевого SIMULSOL™ SL 11W, 185,0 m/z) и пиковая зона соответствует этому выделенному переходному иону.Selected Reaction Monitoring (SRM/MRM) LCMS/MS method is used for the selective detection of salt-saturated SIMULSOL™ SL 11W. SRM scan for a single precursor ion (mass of sodium SIMULSOL™ SL 11W, 357.0 m/z) and after fragmentation the product ion is detected (most predominant fragment of sodium SIMULSOL™ SL 11W, 185.0 m/z) and the peak zone corresponds to to this isolated transition ion.
В условиях анализа ЖХ-МС/МС графики линейны между концентрациями SIMULSOL™ SL 11W от 0,0008 мМ до 0,012 мМ в воде и основным потоком белка А. Эти результаты показывают, что ЖХМС/МС способна обнаруживать SIMULSOL™ SL 11W в диапазоне концентраций от 0,0008 до 0,012 мМ, а линейность графиков не зависит от матрицы. Следовательно, этот метод ЖХ-МС/МС (SRM/MRM) является чувствительным и специфичным для обнаружения SIMULSOL™ SL 11W и не зависит от матрицы, в которой находится детергент. Предел обнаружения (LOD) составляет 0,001 мМ, рассчитанный по линейности.Under LC-MS/MS analysis conditions, the plots are linear between concentrations of SIMULSOL™ SL 11W from 0.0008 mM to 0.012 mM in water and the bulk protein A flow. These results indicate that LCMS/MS is capable of detecting SIMULSOL™ SL 11W over a concentration range from 0.0008 to 0.012 mM, and the linearity of the graphs does not depend on the matrix. Therefore, this LC-MS/MS (SRM/MRM) method is sensitive and specific for the detection of SIMULSOL™ SL 11W and is independent of the detergent matrix. The limit of detection (LOD) is 0.001 mM, calculated from linearity.
Хроматография с белком А и обнаружение SIMULSOL™ SL 11WProtein A chromatography and detection SIMULSOL™ SL 11W
Очищенные растворы собранного материала биореактора mAb, содержащие 0 % (контроль), 0,3 % и 1,0 % мас./мас. SIMULSOL™ SL 11W, подвергают хроматографии MabSelect™ с белком А. Хроматографию с белком А проводят на нефильтрованном очищенном собранном материале mAb, содержащем SIMULSOL™ SL 11W. После того, как колонка загружена, шесть объемов колонки Tris/NaCl используются для промывки колонки перед элюированием mAb буфером уксусной/лимонной кислоты. Элюированный основной поток mAb собирают и анализируют с помощью ЖХ-МС на присутствие SIMULSOL™ SL 11W.Purified solutions of collected mAb bioreactor material containing 0% (control), 0.3% and 1.0% w/w. SIMULSOL™ SL 11W is subjected to MabSelect™ Protein A chromatography. Protein A chromatography is performed on unfiltered purified mAb harvest material containing SIMULSOL™ SL 11W. Once the column is loaded, six Tris/NaCl column volumes are used to wash the column before eluting the mAb with acetic/citric acid buffer. The eluted mAb bulk stream is collected and analyzed by LC-MS for the presence of SIMULSOL™ SL 11W.
Результаты анализа с использованием ЖХ-МС (метод А) показывают <0,03 мМ уровней SIMULSOL™ SL 11W в основном потоке белка А из растворов собранного материала биореактора mAb, содержащих 0,3% и 1,0% мас./мас. SIMULSOL™ SL 11W. С помощью ЖХ-МС/МС (метод Б) было обнаружено, что количество SIMULSOL™ SL 11W составляет 0,0005 мМ в основном потоке белка А из растворов собранного материала биореактора mAb, содержащих 0,3% мас./мас. SIMULSOL™ SL 11W, что ниже предела обнаружения (LOD) 0,001 мМ. Эти результаты показывают, что хроматография с белком А способна удалять SIMULSOL™ SL 11W Simulsol SL 11W из потока питательных веществ до уровня следовых количеств, даже без стадий фильтрации перед загрузкой колонки.Results from LC-MS analysis (Method A) show <0.03 mM levels of SIMULSOL™ SL 11W in the bulk Protein A stream from bioreactor harvest mAb solutions containing 0.3% and 1.0% w/w. SIMULSOL™ SL 11W. Using LC-MS/MS (Method B), the amount of SIMULSOL™ SL 11W was found to be 0.0005 mM in the main protein A stream from mAb bioreactor harvest solutions containing 0.3% w/w. SIMULSOL™ SL 11W, which is below the limit of detection (LOD) of 0.001 mM. These results demonstrate that Protein A chromatography is capable of removing SIMULSOL™ SL 11W from the nutrient stream to trace levels, even without filtration steps prior to column loading.
Пример 3. Влияние SIMULSOL™ SL 11W на качество рекомбинантного белкаExample 3. Effect of SIMULSOL™ SL 11W on the quality of recombinant protein
Влияние SIMULSOL™ SL 11W на качество рекомбинантных белков проверяется путем сравнения очищенных образцов mAb, собранных в биореакторе, с 0,3% SIMULSOL™ SL 11W и без него при 20°С в течение 3 ч, с последующим инкубированием при 4°С в течение 16 ч. Образцы сначала фильтруют через фильтры из стекловолокна 0,2 мкм, затем через фильтры из ПВДФ 0,45 мкм, а затем подвергают очистке с использованием белка А. Образцы анализируют на аналитические свойства, как показано в табл. 18, с использованием методов, известных в данной области техники, таких как капиллярный электрофорез (КЭ), эксклюзионная хроматография (ЭХ), измерение изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) на приборе iCE ™. Результаты, показанные в табл. 18, показывают, что обработка SIMULSOL™ SL 11W не оказывала значительного влияния ни на одно из измеряемых качеств по сравнению с отсутствием обработки SIMULSOL™ SL 11W.The effect of SIMULSOL™ SL 11W on the quality of recombinant proteins is tested by comparing purified mAb samples collected in a bioreactor with and without 0.3% SIMULSOL™ SL 11W at 20°C for 3 hours, followed by incubation at 4°C for 16 hours. Samples are first filtered through 0.2 µm glass fiber filters, then through 0.45 µm PVDF filters, and then purified using Protein A. Samples are analyzed for analytical properties as shown in Table 1. 18, using methods known in the art, such as capillary electrophoresis (CE), size exclusion chromatography (SEC), isoelectric focusing (IEF) measurements on the iCE™ instrument. The results shown in table. 18 show that SIMULSOL™ SL 11W treatment did not have a significant effect on any of the measured qualities compared to no SIMULSOL™ SL 11W treatment.
Таблица 18Table 18
Аналитические данные качества продукта mAb с SIMULSOL™ SL 11W и без негоAnalytical mAb product quality data with and without SIMULSOL™ SL 11W
Claims (43)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/947,276 | 2019-12-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA046732B1 true EA046732B1 (en) | 2024-04-17 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2697369B1 (en) | Novel protein purification methods | |
EP2412817B2 (en) | Method for removing viruses in high-concentration monoclonal antibody solution | |
EP2350271B1 (en) | Arginine inactivation of enveloped viruses | |
JP5711369B2 (en) | Method for producing protein preparation | |
KR20150023297A (en) | Selective binding of biological targets to solid phase ureides | |
KR20170138462A (en) | Aseptic purification method for viruses | |
US20220295791A1 (en) | Methods for viral inactivation by environmentally compatible detergents | |
EA034347B1 (en) | Method of inactivating viruses in preparing antibodies | |
CN105745218A (en) | Removal of residual cell culture impurities | |
EA046732B1 (en) | METHODS OF VIRAL INACTIVATION WITH ECOLOGICALLY COMPATIBLE DETERGENTS | |
CN113015795B (en) | Virus inactivation method for continuous preparation of antibodies | |
RU2648143C2 (en) | Methods for release of virus-like particles | |
WO2024115344A1 (en) | Method for inactivating enveloped viruses | |
KR20160117628A (en) | Methods for reducing aggregate content of protein preparations by treatment with aryl anions | |
US20220348608A1 (en) | Purification of proteins and viral inactivation | |
WO2022203044A1 (en) | Viral clearance test method | |
NZ615579B2 (en) | Novel protein purification methods | |
EA044919B1 (en) | METHODS FOR REDUCING OR ELIMINATING PROTEIN MODIFICATION AND DECOMPOSITION CAUSED BY EXPOSURE TO UV RADIATION |