EA046487B1

EA046487B1 - Бициклические пептидные лиганды, специфичные к mt1-mmp

Info

Publication number: EA046487B1
Application number: EA202191660
Authority: EA
Inventors: Люхун Чэнь; Юэн Ричардз; Рашид Лани; Джемма Мадд; Кэтрин СТЕЙС; Дэниел ТЬЮФЕЛ; Эдвард УОКЕР
Original assignee: Байсиклтэкс Лимитед
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2024-03-20

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к полипептидам, ковалентно связанным с молекулярными каркасами, так что между точками прикрепления к каркасу расположены две или более пептидные петли. В частности, в изобретении описаны пептиды, способные с высокой аффинностью связываться с мембранной металлопротеазой типа 1 (MT1-MMP). В изобретении также описаны лекарственные конъюгаты, содержащие указанные пептиды, конъюгированные с одной или более эффекторными и/или функциональными группами, которые можно использовать для визуализации и направленной терапии рака.

Уровень техники изобретения

Циклические пептиды способны связываться с белками-мишенями с высокой аффинностью и специфичностью, и следовательно, представляют собой перспективный класс молекул для разработки терапевтических средств. Фактически несколько циклических пептидов уже успешно используются в клинике, например, противобактериальный пептид ванкомицин, иммунодепрессант циклоспорин или противораковый препарат октреотид (Driggers et al. (2008), Nat Rev Drug Discov 7 (7), 608-24). Хорошие связывающие свойства обуславливаются относительно большой поверхностью взаимодействия между пептидом и мишенью, а также пониженной конформационной гибкостью циклических структур. Обычно макроциклы связываются с поверхностями площадью в несколько сотен квадратных ангстрем, как, например, антагонист CVX15 циклического пептида CXCR4 (400 A²; Wu et al. (2007), Science 330, 1066-71), циклический пептид с мотивом Arg-Gly-Asp, связывающийся с интегрином aVb3 (355 A²) (Xiong et al. ( 2002), Science 296 (5565), 151-5), или циклический пептидный ингибитор упаин-1, связывающийся с активатором плазминогена урокиназного типа (603 A²; Zhao et al. (2007), J Struct Biol 160 (1), 1-10).

Вследствие циклической конфигурации пептидные макроциклы менее гибки, чем линейные пептиды, что обуславливает уменьшение потери энтропии при связывании с мишенями и более высокое сродство связывания. Пониженная гибкость также приводит к фиксации специфичных для мишени конформаций, повышая специфичность связывания по сравнению с линейными пептидами. Данный эффект можно проиллюстрировать на примере мощного и селективного ингибитора матриксной металлопротеиназы 8 (MMP-8), который теряет избирательность по сравнению с другими MMP после раскрытия цикла (Cherney et al. (1998), J Med Chem 41 (11), 1749-51). Благоприятные связывающие свойства, достигаемые за счет макроциклизации, еще более выражены у полициклических пептидов, содержащих более одного пептидного кольца, таких как, например, ванкомицин, низин и актиномицин.

Разные исследовательские группы ранее присоединяли полипептиды, содержащие остатки цистеина, к синтетической молекулярной структуре (Kemp and McNamara (1985), J. Org. Chem; Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Meloen и соавторы использовали трис(бромметил)бензол и родственные молекулы для быстрой и количественной циклизации множества пептидных петель на синтетических каркасах с целью структурной имитации белковых поверхностей (Timmerman et al. (2005), ChemBioChem). Способы получения лекарственных соединений-кандидатов, в которых указанные соединения получают путем присоединения цистеинсодержащих полипептидов к молекулярному каркасу, такому как, например, трис(бромметил)бензол, описаны в WO 2004/077062 и WO 2006/078161. Другие подходящие примеры молекулярных каркасов включают неароматические каркасы, описанные в Heinis et al (2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606.

Комбинаторные подходы с использованием фаговых дисплеев разработаны для получения и скрининга больших библиотек бициклических пептидов с целью выявления представляющих интерес мишеней (Heinis et al. (2009), Nat Chem Biol 5 (7), 502-7 и WO 2009/098450). Вкратце, комбинаторные библиотеки линейных пептидов, содержащих три остатка цистеина и два участка из шести произвольных аминокислот (Cys-(Xaa)₆-Cys-(Xaa)₆-Cys), представляют на фаге и подвергают циклизации путем ковалентного связывания боковых цепей цистеина с низкомолекулярным каркасом.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретение относится к пептидному лиганду, специфичному к MT1MMP, содержащему полипептид, содержащий по меньшей мере три остатка цистеина, разделенных по меньшей мере двумя петлеобразными последовательностями, и молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с остатками цистеина полипептида с получением по меньшей мере двух полипептидных петель на молекулярном каркасе, где указанный молекулярный каркас представляет собой 1,1',1(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен- 1-он (Т АТ А).

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к лекарственному конъюгату, содержащему описанный здесь пептидный лиганд, конъюгированный с одной или более эффекторными и/или функциональными группами.

В соответствии со следующим аспектом изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь пептидный лиганд или лекарственный конъюгат, в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к описанному здесь пептидному лиганду или лекарственному конъюгату для профилактики, подавления или лечения заболевания или расстройства, опосредованного MT1-MMP.

- 1 046487

Краткое описание чертежей

На чертеже изменение массы тела и регистрация объема опухоли после введения BT17BDC58 самкам голых мышей BALB/c, несущим ксенотрансплантат HT1080. Экспериментальные точки соответствуют средней массе тела в группе. Планки погрешностей обозначают стандартную ошибку для среднего значения (SEM).

Подробное описание изобретения

В одном варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат 2, 3, 5, 6, 7 или 9 аминокислот. В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат 3 или 7 аминокислот.

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 7 аминокислот, а вторая петля состоит из 2 аминокислот, например:

CEESFYPECDHC (SEQ ID NO: 1);

в частности

A-(SEQ ID NO: 1)-A (обозначаемый здесь 17-108-02).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 3 аминокислот, а вторая петля состоит из 6 аминокислот, например:

CPDLCLDLFPNC (SEQ ID NO: 2); и

CPELCVDLYPHC (SEQ ID NO: 3);

в частности:

A-(SEQ ID NO: 2)-A (обозначаемый здесь 17-111-01).

A-(SEQ ID NO: 3)-A (обозначаемый здесь 17-111-02).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 6 аминокислот, а вторая петля состоит из 3 аминокислот, например:

CHPEWVSCEFHC (SEQ ID NO: 4);

в частности

A-(SEQ ID NO: 4)-A (обозначаемый здесь 17-116-01).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 3 аминокислот, а вторая петля состоит из 7 аминокислот, например

CSHECALLFPKTC (SEQ ID NO: 5);

CFDECQLLFPKTC (SEQ ID NO: 6);

CLDECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 7);

CREECMLLFPKTC (SEQ ID NO: 8);

CETECALLFPRSC (SEQ ID NO: 9);

CADECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 10);

CDVECRLLFPRSC (SEQ ID NO: 11);

CIDECRLLFPRSC (SEQ ID NO: 12);

CVRECALLFPKTC (SEQ ID NO: 13);

CV[HArg]ECALLFPKTC (SEQ ID NO: 14);

CVRECALLFPRTC (SEQ ID NO: 15);

CVRECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 16);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 17);

CV[HArg]ECALLFPATC (SEQ ID NO: 18);

CVAECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 19);

CVTECQLLFPKTC (SEQ ID NO: 20);

CRHECELLFPKTC (SEQ ID NO: 21);

CQRECALLFPKTC (SEQ ID NO: 22);

CVRECTLLFPKTC (SEQ ID NO: 23);

CTIECALLFPKTC (SEQ ID NO: 24);

CARECALLFPKTC (SEQ ID NO: 25);

CINECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 26);

CYTECSLLFPKTC (SEQ ID NO: 27);

CHEECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 28);

CLEECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 29);

CIDECALLFPRTC (SEQ ID NO: 30);

CYEECRLLFPRTC (SEQ ID NO: 31);

CVRECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 32);

CHIECALLFPKTC (SEQ ID NO: 33);

CKRECMLLFPKTC (SEQ ID NO: 34);

- 2 046487

CYRECALLFPKTC (SEQ ID NO: 35);

CLTECALLFPKTC (SEQ ID NO: 36);

CEVECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 37);

CEAECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 38);

CVQECALLFPKTC (SEQ ID NO: 39);

CIRECSLLFPKTC (SEQ ID NO: 40);

CVTECALLFPKTC (SEQ ID NO: 41);

CVAECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 42);

CVGECALLFPKTC (SEQ ID NO: 43);

CVVECALLFPKTC (SEQ ID NO: 44);

CVFECALLFPKTC (SEQ ID NO: 45);

CA[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 46);

CV[HArg]ECALLFA[HArg]TC (SEQ ID NO: 47);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]AC (SEQ ID NO: 48);

CV[HArg]ECALL[1Nal]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 49);

CV[HArg]ECALL[Cha]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 50);

CV[HArg]ECALLF[Pip][HArg]TC (SEQ ID NO: 51);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]SC (SEQ ID NO: 52);

CV[HArg]ECALLFP[HArg][HSer]C (SEQ ID NO: 53);

CV[HArg]ECALLF[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 54);

CV[HArg]EC[Aib]LLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 55);

CV[HArg]ECAL[Nle]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 56);

CV[HArg]ECA[tBuAla]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 57);

CV[HArg]ECA[Nle]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 58);

CV[Aad2]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 59);

CP[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 60);

CV[HArg]ECALL[4FlPhe]P[HArg]TC (SEQ NO: 61);

CV[HArg]ECAL[tBuGly]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 62);

CV[HArg]ECAL[Cha]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 63);

CV[HArg]ECALL[2Nal]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 64);

CV[HArg]ECALLFP[HArg][HyV]C (SEQ ID NO: 65);

C[tBuGly][HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 66);

CVEECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 67);

CV[HArg]ECA[Cpa]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 68);

CV[HArg]ECA[Cba]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 69);

CV[HArg]ECA[C5A]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 70);

CV[HArg]ECA[Cha]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 71);

CV[HArg]ECA[tBuGly]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 72);

CV[HArg]ECALLF[cis-HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 73);

CV[HArg]ECAL[Cpa]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 74);

CV[HArg]ECAL[C5A]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 75);

CV[HArg]ECA [tBuAla]LF[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 76);

CV[HArg]ECA[tBuAla][tBuGly]F[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 77) и

C[tBuGly][HArg]ECA[tBuAla]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 78);

где Aad представляет собой альфа-Е-аминоадипиновую кислоту, Aib представляет собой аминоизомасляную кислоту, C5a представляет собой бета-циклопентил-Е-аланин, Cba представляет собой βциклобутилаланин, Cha представляет собой 3-циклогексил-Е-аланин, Cpa представляет собой бетациклопропил-Е-аланин, 4FlPhe представляет собой 4-фтор-Е-фенилаланин, HArg представляет собой гомоаргинин, HyP представляет собой гидроксипролин, HyV представляет собой 3-гидрокси-Е-валин, HSer представляет собой гомосерин, 1Nal представляет собой 1-нафтилаланин, 2Nal представляет собой 2-нафтилаланин, Nle представляет собой норлейцин, P представляет собой пипеколиновую кислоту, tBuAla представляет собой трет-бутилаланин, tBuGly представляет собой трет-бутилглицин;

в частности

A-(SEQ ID NO: 5)-A (обозначаемый здесь 17-120-00);

A-(SEQ ID NO: 6)-A (обозначаемый здесь 17-120-01);

A-(SEQ ID NO: 7)-A (обозначаемый здесь 17-120-02);

A-(SEQ ID NO: 8)-A (обозначаемый здесь 17-120-03);

A-(SEQ ID NO: 9)-A (обозначаемый здесь 17-120-04);

A-(SEQ ID NO: 10)-A (обозначаемый здесь 17-120-05);

A-(SEQ ID NO: 11)-A (обозначаемый здесь 17-120-07);

A-(SEQ ID NO: 12)-A (обозначаемый здесь 17-120-08);

APPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T01);

- 3 046487

QISP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T02);

ALPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T03 and BCY1124);

Ac-ALPP-(SEQ ID NO: 13) (обозначаемый здесь Ac-(17-120-09-T03) и BCY1125);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 13) (обозначаемый здесь Sar3-A-(17-120-09-T03));

GPPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T04);

SPPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T05);

NPPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T06);

EPPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T07);

HPPP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T08);

APNP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T09);

APDP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T10);

APLP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T11);

APAP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T12);

APHP-(SEQ ID NO: 13)-A (обозначаемый здесь 17-120-09-T13);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 14) (обозначаемый здесь Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg2);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 15) (обозначаемый здесь Sar3-A-(17-120-09-T03) Arg9);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 16) (обозначаемый здесь Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg9);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 HArg9);

Ac-(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь Ac-(B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 HArg9);

ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY3959);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY9933);

[Ac]APP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY9934);

[Ac]LAP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY9935);

[Ac]LPA-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY9936);

[Ac]-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY9968);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY11147);

[Ac]LPY-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY11148);

[Ac][dA]PP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY11165);

[Ac]L[dA]P-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY11166);

[Ac]LP[dA]-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемый здесь BCY11167);

ALPP-(SEQ ID NO: 17)-A (обозначаемый здесь BCY10288).

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 18) (обозначаемый здесь (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 Ala9);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 19) (обозначаемый здесь (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) Ala2 HArg9);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 19) (обозначаемый здесь BCY9938);

APMP-(SEQ ID NO: 20)-A (обозначаемый здесь 17-120-10-T01);

APSP-(SEQ ID NO: 21)-A (обозначаемый здесь 17-120-11-T01);

AALP-(SEQ ID NO: 22)-A (обозначаемый здесь 17-120-12-T01);

ALDP-(SEQ ID NO: 23)-A (обозначаемый здесь 17-120-13-T01);

ADRP-(SEQ ID NO: 24)-A (обозначаемый здесь 17-120-14-T01);

ATQP-(SEQ ID NO: 25)-A (обозначаемый здесь 17-120-15-T01);

SPPP-(SEQ ID NO: 25)-A (обозначаемый здесь 17-120-15-T02);

ARHP-(SEQ ID NO: 26)-A (обозначаемый здесь 17-120-16-T01);

ALPP-(SEQ ID NO: 27)-A (обозначаемый здесь 17-120-17-T01);

A-(SEQ ID NO: 28)-A (обозначаемый здесь 17-120-18);

A-(SEQ ID NO: 29)-A (обозначаемый здесь 17-120-19);

A-(SEQ ID NO: 30)-A (обозначаемый здесь 17-120-20);

A-(SEQ ID NO: 31)-A (обозначаемый здесь 17-120-21);

APPP-(SEQ ID NO: 31)-A (обозначаемый здесь 17-120-21-T01);

APSP-(SEQ ID NO: 32)-A (обозначаемый здесь 17-120-22-T01);

PLPP-(SEQ ID NO: 32)-A (обозначаемый здесь 17-120-22-T02);

APAP-(SEQ ID NO: 33)-A (обозначаемый здесь 17-120-23-T01);

AVEP-(SEQ ID NO: 34)-A (обозначаемый здесь 17-120-24-T01);

AEPA-(SEQ ID NO: 35)-A (обозначаемый здесь 17-120-25-T01);

ASPP-(SEQ ID NO: 36)-A (обозначаемый здесь 17-120-26-T01);

AAPP-(SEQ ID NO: 37)-A (обозначаемый здесь 17-120-27-T01);

APPP-(SEQ ID NO: 38)-A (обозначаемый здесь 17-120-28-T01);

AVPP-(SEQ ID NO: 39)-A (обозначаемый здесь 17-120-29-T01);

SPPP-(SEQ ID NO: 40)-A (обозначаемый здесь 17-120-30-T01);

- 4 046487

HLPP-(SEQ ID NO: 41)-A (обозначаемый здесь 17-120-31-T01);

RLPP-(SEQ ID NO: 41)-A (обозначаемый здесь 17-120-31-T02);

APPP-(SEQ ID NO: 41)-A (обозначаемый здесь 17-120-31-T03);

MPPP-(SEQ ID NO: 42)-A (обозначаемый здесь 17-120-32-T01);

SPPP-(SEQ ID NO: 43)-A (обозначаемый здесь 17-120-33-T01);

APPP-(SEQ ID NO: 44)-A (обозначаемый здесь 17-120-34-T01);

APPP-(SEQ ID NO: 45)-A (обозначаемый здесь 17-120-35-T01);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 46) (обозначаемый здесь BCY9937);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 47) (обозначаемый здесь BCY9943);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 48) (обозначаемый здесь BCY9945);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 49) (обозначаемый здесь BCY9946);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 50) (обозначаемый здесь BCY9949);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 51) (обозначаемый здесь BCY9951);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 52) (обозначаемый здесь BCY9952);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 53) (обозначаемый здесь BCY9953);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 54) (обозначаемый здесь BCY9954);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 55) (обозначаемый здесь BCY9955);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 56) (обозначаемый здесь BCY9957);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемый здесь BCY9959);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемый здесь BCY12401);

[Ac]EYP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемый здесь BCY12405);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 58) (обозначаемый здесь BCY9960);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 59) (обозначаемый здесь BCY9961);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 60) (обозначаемый здесь BCY9963);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 61) (обозначаемый здесь BCY9964);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 62) (обозначаемый здесь BCY9965);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 63) (обозначаемый здесь BCY9966);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 64) (обозначаемый здесь BCY10223);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 65) (обозначаемый здесь BCY10224);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 66) (обозначаемый здесь BCY11149);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 67) (обозначаемый здесь BCY11150);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 68) (обозначаемый здесь BCY11151);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 69) (обозначаемый здесь BCY11152);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 70) (обозначаемый здесь BCY11153);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 71) (обозначаемый здесь BCY11154);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 72) (обозначаемый здесь BCY11155);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 73) (обозначаемый здесь BCY11163);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 74) (обозначаемый здесь BCY11158);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 75) (обозначаемый здесь BCY11160);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 76) (обозначаемый здесь BCY12402);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 77) (обозначаемый здесь BCY12403); и

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 78) (обозначаемый здесь BCY12404).

В другом варианте осуществления пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой (B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (в настоящем описании обозначается как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03)HArg2HArg9).

Данные, приведенные на фиг. 1 и в табл. 4 и 5, свидетельствуют о том, что бициклический пептидный лекарственный конъюгат, содержащий указанный пептидный лиганд (BT17BDC58), проявляет дозозависимую противоопухолевую активность.

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 7 аминокислот, а вторая петля состоит из 3 аминокислот, например:

CSSWDKLMCHPYC (SEQ ID NO: 79);

в частности

A-(SEQ ID NO: 79)-A (обозначаемый здесь 17-121-00).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 3 аминокислот, а вторая петля состоит из 9 аминокислот, например

CPEECFYLPPHPMSC (SEQ ID NO: 80);

CPQECFYLPGHSLYC (SEQ ID NO: 81);

CPGECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 82);

CPGECFYPTNHPLYC (SEQ ID NO: 83);

CPQECFYPIGHPLAC (SEQ ID NO: 84);

- 5 046487

CPEECFYPPGHKLHC (SEQ ID NO: 85);

CPQECFYPPGHRLRC (SEQ ID NO: 86);

CPQECFYPPGHPYHC (SEQ ID NO: 87);

CPQECFYPSTHPLYC (SEQ ID NO: 88);

CPGECFYPSNHRLYC (SEQ ID NO: 89);

CPDECFYPPEHPLAC (SEQ ID NO: 90);

CPGECFYPPGHHLSC (SEQ ID NO: 91);

CPGECFYPPGHHLGC (SEQ ID NO: 92);

CPEECFYPPNHPLYC (SEQ ID NO: 93);

CPGECFYPPDHPLYC (SEQ ID NO: 94);

CPGECFYPPGHPLYC (SEQ ID NO: 95);

CPGECFYPPNHPFYC (SEQ ID NO: 96);

CPGECFYPPNHPLYC (SEQ ID NO: 97);

CPEECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 98);

CWMECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 99);

CFEECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 100);

CPGECFYPPGHPLRC (SEQ ID NO: 101);

CPGECFYPPGHPREC (SEQ ID NO: 102);

CPGECFYPPGHRFHC (SEQ ID NO: 103) и

CPGECFYPPGHRLYC (SEQ ID NO: 104);

в частности

A-(SEQ ID NO: 80)-A (обозначаемый здесь 17-127-01);

A-(SEQ ID NO: 81)-A (обозначаемый здесь 17-129-00);

SQT-(SEQ ID NO: 82)-A (обозначаемый здесь 17-129-01-T01);

SMT-(SEQ ID NO: 82)-A (обозначаемый здесь 17-129-01-T02);

SLV-(SEQ ID NO: 82)-A (обозначаемый здесь 17-129-01-T03);

ISSYG-(SEQ ID NO: 82)-A (обозначаемый здесь 17-129-01-T04);

ENITT-(SEQ ID NO: 82)-A (обозначаемый здесь 17-129-01-T05);

A-(SEQ ID NO: 83)-A (обозначаемый здесь 17-129-02);

A-(SEQ ID NO: 84)-A (обозначаемый здесь 17-129-03);

A-(SEQ ID NO: 85)-A (обозначаемый здесь 17-129-04);

A-(SEQ ID NO: 86)-A (обозначаемый здесь 17-129-05);

A-(SEQ ID NO: 87)-A (обозначаемый здесь 17-129-06);

A-(SEQ ID NO: 88)-A (обозначаемый здесь 17-129-07);

A-(SEQ ID NO: 89)-A (обозначаемый здесь 17-129-08);

A-(SEQ ID NO: 90)-A (обозначаемый здесь 17-129-09);

A-(SEQ ID NO: 91)-A (обозначаемый здесь 17-129-10);

A-(SEQ ID NO: 92)-A (обозначаемый здесь 17-129-11);

L-(SEQ ID NO: 93)-HA (обозначаемый здесь 17-129-12-T01);

T-(SEQ ID NO: 94)-NA (обозначаемый здесь 17-129-13-T01);

Q-(SEQ ID NO: 95)-NA (обозначаемый здесь 17-129-14-T01);

A-(SEQ ID NO: 95)-NVI (обозначаемый здесь 17-129-14-T02);

N-(SEQ ID NO: 96)-NA (обозначаемый здесь 17-129-15-T01);

D-(SEQ ID NO: 97)-RA (обозначаемый здесь 17-129-16-T01);

SRM-(SEQ ID NO: 98)-A (обозначаемый здесь 17-129-17-T01);

SRS-(SEQ ID NO: 98)-A (обозначаемый здесь 17-129-17-T02);

RYMTR-(SEQ ID NO: 98)-A (обозначаемый здесь 17-129-17-T03);

REE-(SEQ ID NO: 99)-A (обозначаемый здесь 17-129-18-T01);

DNM-(SEQ ID NO: 99)-A (обозначаемый здесь 17-129-18-T02);

QES-(SEQ ID NO: 99)-A (обозначаемый здесь 17-129-18-T03);

ADY-(SEQ ID NO: 99)-A (обозначаемый здесь 17-129-18-T04);

MAN-(SEQ ID NO: 100)-A (обозначаемый здесь 17-129-19-T01);

SQN-(SEQ ID NO: 100)-A (обозначаемый здесь 17-129-19-T02);

A-(SEQ ID NO: 101)-TVL (обозначаемый здесь 17-129-20-T01);

A-(SEQ ID NO: 102)-SWL (обозначаемый здесь 17-129-21-T01);

A-(SEQ ID NO: 103)-LTE (обозначаемый здесь 17-129-22-T01);

A-(SEQ ID NO: 104)-YSE (обозначаемый здесь 17-129-23-T01) и

Ac-(SEQ ID NO: 104)-YSE (обозначаемый здесь Ac(17-129-23-T01)).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 6 аминокислот и вторая петля состоит из 6 аминокислот, например

CEEEFYPCGHPLYVC (SEQ ID NO: 105);

- 6 046487

CEEQFYPCTHALYTC (SEQ ID NO: 106);

CVEEFYPCDHPLYSC (SEQ ID NO: 107);

CEEEFYPCGHPMHPC (SEQ ID NO: 108);

CDEQFYPCHHRLYSC (SEQ ID NO: 109);

CEEEFYPCGHPFHPC (SEQ ID NO: 110);

CLEQFYPCEHPLFSC (SEQ ID NO: 111);

CVEQFYPCGHRHYIC (SEQ ID NO: 112);

CEEQFYPCSHPLYTC (SEQ ID NO: 113);

CEEQFYPCNHPLNVC (SEQ ID NO: 114);

CEEEFYPCSHPLNPC (SEQ ID NO: 115);

CEEQFYPCGHKLSPC (SEQ ID NO: 116);

CPEQFYPCDHRLYIC (SEQ ID NO: 117);

CQEQFYPCNHPLSPC (SEQ ID NO: 118);

CDEQFYPCNHRLNTC (SEQ ID NO: 119);

CEEAFYPCHHPLYRC (SEQ ID NO: 120);

CDEDFYPCGHYLNQC (SEQ ID NO: 121);

CEEQFYPCTHPLYVC (SEQ ID NO: 122);

CPEQFYPCTHRLYQC (SEQ ID NO: 123);

CEEQFYPCSHPLYRC (SEQ ID NO: 124);

CAEQFYPCDHPLYRC (SEQ ID NO: 125);

CAEEFYPCDHPLYRC (SEQ ID NO: 126);

CEEAFYPCNHPLYTC (SEQ ID NO: 127);

CAEAFYPCDHPLYVC (SEQ ID NO: 128);

CEEAFYPCSHPLFIC (SEQ ID NO: 129);

CEEAFYPCSHPLHPC (SEQ ID NO: 130);

CEEAFYPCSHPLFVC (SEQ ID NO: 131);

CEEQFYPCSHPLYSC (SEQ ID NO: 132);

CEEAFYPCEHPLYMC (SEQ ID NO: 133) и CEEQFYPCNHPLYMC (SEQ ID NO: 134); в частности

A-(SEQ ID NO: 105)-A (обозначаемый здесь 17-126-01);

A-(SEQ ID NO: 106)-A (обозначаемый здесь 17-126-02);

A-(SEQ ID NO: 107)-A (обозначаемый здесь 17-126-03);

A-(SEQ ID NO: 108)-A (обозначаемый здесь 17-126-06);

A-(SEQ ID NO: 109)-A (обозначаемый здесь 17-126-07);

A-(SEQ ID NO: 110)-A (обозначаемый здесь 17-126-08);

A-(SEQ ID NO: 111)-A (обозначаемый здесь 17-126-09);

A-(SEQ ID NO: 112)-A (обозначаемый здесь 17-126-10);

A-(SEQ ID NO: 113)-A (обозначаемый здесь 17-126-18);

A-(SEQ ID NO: 114)-A (обозначаемый здесь 17-126-19);

A-(SEQ ID NO: 115)-A (обозначаемый здесь 17-126-20);

A-(SEQ ID NO: 116)-A (обозначаемый здесь 17-126-21);

A-(SEQ ID NO: 117)-A (обозначаемый здесь 17-126-22);

A-(SEQ ID NO: 118)-A (обозначаемый здесь 17-126-23);

A-(SEQ ID NO: 119)-A (обозначаемый здесь 17-126-24);

A-(SEQ ID NO: 120)-A (обозначаемый здесь 17-126-25);

Ac-A-(SEQ ID NO: 120)-A (обозначаемый здесь Ac-(17-126-25));

A-(SEQ ID NO: 121)-A (обозначаемый здесь 17-126-26);

A-(SEQ ID NO: 122)-A (обозначаемый здесь 17-126-27);

A-(SEQ ID NO: 123)-A (обозначаемый здесь 17-126-28);

HSP-(SEQ ID NO: 124)-A (обозначаемый здесь 17-126-30-T01);

GPH-(SEQ ID NO: 125)-A (обозначаемый здесь 17-126-31-T01);

IHS-(SEQ ID NO: 126)-A (обозначаемый здесь 17-126-32-T01);

WSP-(SEQ ID NO: 127)-A (обозначаемый здесь 17-126-33-T01);

SHS-(SEQ ID NO: 127)-A (обозначаемый здесь 17-126-33-T02);

DLH-(SEQ ID NO: 128)-A (обозначаемый здесь 17-126-35-T01);

ANE-(SEQ ID NO: 129)-A (обозначаемый здесь 17-126-36-T01);

AVW-(SEQ ID NO: 130)-A (обозначаемый здесь 17-126-37-T01);

KVQ-(SEQ ID NO: 131)-A (обозначаемый здесь 17-126-38-T01);

A-(SEQ ID NO: 132)-PDVA (обозначаемый здесь 17-126-39-T01);

A-(SEQ ID NO: 133)-HQAA (обозначаемый здесь 17-126-40-T01) и A-(SEQ ID NO: 134)-RENA (обозначаемый здесь 17-126-41-T01).

- 7 046487

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 6 аминокислот, а вторая петля состоит из 5 аминокислот, например

CLEQFYPCGDPRLC (SEQ ID NO: 135) и CEEQFYPCGHHLLC (SEQ ID NO: 136);

в частности

A-(SEQ ID NO: 135)-A (обозначаемый здесь 17-126-11) и

A-(SEQ ID NO: 136)-A (обозначаемый здесь 17-126-12).

В другом варианте осуществления указанные петлеобразные последовательности содержат три остатка цистеина, разделенные двумя петлеобразными последовательностями, причем первая петля состоит из 5 аминокислот и вторая петля состоит из 5 аминокислот, например

CLEPDECFYPMEC (SEQ ID NO: 137);

CKEPQECFYPLKC (SEQ ID NO: 138) и

CDSPEECFYPLEC (SEQ ID NO: 139);

в частности

A-(SEQ ID NO: 137)-A (обозначаемый здесь 17-122-02);

A-(SEQ ID NO: 138)-A (обозначаемый здесь 17-122-03); и

A-(SEQ ID NO: 139)-A (обозначаемый здесь 17-122-04).

В одном варианте осуществления пептидный лиганд выбран из пептидных лигандов, перечисленных в табл. 2 или 3.

Если не указано иное, все используемые здесь технические и научные термины имеют традиционные значения, известные специалистам в данной области, например в области химии пептидов, клеточных культур и фаговых дисплеей, химии нуклеиновых кислот и биохимии. Используют стандартные методы молекулярной биологии, генетики и биохимии (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4^th ed., John Wiley & Sons, Inc.), которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

Номенклатура

Нумерация

При упоминании положений аминокислотных остатков в пептидных лигандах по настоящему изобретению остатки цистеина (Ci, Cii и Ciii) не включают в нумерацию, поскольку они являются инвариантными, поэтому нумерацию аминокислотных остатков в пептидных лигандах по настоящему изобретению осуществляют следующим образом:

C₁-Ei-E2-S3-F4-Y5-P6-E7-C₁₁-D8-H9-C₁₁₁ (SEQ ID NO: 1).

В целях настоящего изобретения принимают, что все бициклические пептиды циклизованы 1,1',1''(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипропан-1-оном (ТАТА) с получением тризамещенной структуры. Циклизацию с участием ТАТА проводят по Ci, Cii и Ciii. ТАТА является примером αβ-ненасыщенного карбонил-содержащего молекулярного каркаса (Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53 (6), 16021606).

Молекулярный формат

N- или C-концевые удлинения последовательности бициклического ядра добавляют к левой или правой стороне последовательности и отделяют дефисом. Например, N-концевой хвост eAla-Sar10-Ala обозначают следующим образом:

eAla-Sar10-A-(SEQ ID NO: X).

Инверсированные пептидные последовательности

Информация, приведенная в Nair et al (2003) J Immunol 170 (3), 1362-1373, позволяет предположить, что описанные здесь пептидные последовательности также найдут применение в их ретроинверсированной форме. Например, используют обратную последовательность (т.е. N-конец становится C-концом и наоборот), стереохимия которой также меняется на противоположную (т.е. D-аминокислоты становятся L-аминокислотами и наоборот).

Пептидные лиганды

Пептидный лиганд в соответствии с настоящим описанием относится к пептиду, ковалентно связанному с молекулярным каркасом. Как правило, такие пептиды содержат две или более реакционноспособных групп (таких как остатки цистеина), которые способны образовывать ковалентные связи с каркасом, и последовательность между указанными реакционноспособными группами, которая называется петлеобразной последовательностью, поскольку она образует петлю, когда пептид связывается с каркасом. В данном случае пептиды содержат по меньшей мере три остатка цистеина (обозначаемые здесь как Ci, Cii и Ciii) и образуют по меньшей мере две петли на каркасе.

Преимущества пептидных лигандов

Некоторые бициклические пептиды по настоящему изобретению обладают рядом полезных свойств, которые позволяют считать их лекарственными молекулами, подходящими для инъекционного,

- 8 046487 ингаляционного, назального, окулярного, перорального или местного введения. К таким полезным свойствам относятся:

Межвидовая перекрестная реактивность

Некоторые лиганды демонстрируют перекрестную реактивность в отношении PBP разных видов бактерий и, следовательно, могут использоваться для лечения инфекций, вызванных несколькими видами бактерий. Другие лиганды могут быть высокоспецифичными к PBP определенных видов бактерий, что может быть полезно для лечения инфекции без побочного ущерба для полезной флоры пациента;

Протеазная стабильность

Бициклические пептидные лиганды должны в идеале демонстрировать устойчивость к действию плазматических протеаз, эпителиальных (заякоренных в мембране) протеаз, протеаз желудка и кишечника, протеаз поверхности легких, внутриклеточных протеаз и т.п. Протеазная стабильность должна поддерживаться среди разных видов, чтобы основной бициклический кандидат можно было разрабатывать на животных моделях, а также с уверенностью вводить людям;

Желаемый профиль растворимости

Растворимость зависит от отношения заряженных и гидрофильных остатков к гидрофобным остаткам и числа внутри/межмолекулярных водородных связей, она является параметром, важным для получения композиций и достижения абсорбции;

Оптимальный период полужизни в плазме кровотока

В зависимости от клинических показаний и схемы лечения может потребоваться разработка бициклического пептида для кратковременного воздействия в условиях лечения острого заболевания, или разработка бициклического пептида с повышенным временем удержания в кровотоке, который является оптимальным для лечения хронических болезненных состояний. Другими факторами, определяющими желаемый период полужизни в плазме, являются требования длительного воздействия для обеспечения максимальной терапевтической эффективности по сравнению с сопутствующей токсикологией вследствие длительного воздействия средства.

Селективность: Некоторые пептидные лиганды по настоящему изобретению демонстрируют селективность в отношении MT1-MMP, но не способны перекрестно взаимодействовать с такими изоформами MMP, как MMP-1, MMP-2, MMP-15 и MMP-16.

Фармацевтически приемлемые соли

Следует понимать, что солевые формы входят в объем данного изобретения, и ссылки на пептидные лиганды включают солевые формы указанных лигандов.

Соли по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, содержащего основной или кислотный фрагмент, с помощью обычных химических методов, таких как методы, описанные в Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, твердый переплет, 388 страниц, август 2002 г. Обычно такие соли получают путем взаимодействия свободных кислотных или основных форм указанных соединений с подходящим основанием или подходящей кислотой в воде или в органическом растворителе, или в их смеси.

Кислотно-аддитивные соли (моно- или ди-соли) можно получить с использованием широкого ряда кислот, как неорганических, так и органических. Примеры кислотно-аддитивных солей включают моноили ди-соли, полученные с использованием кислоты, выбранной из группы, состоящей из уксусной, 2,2дихлоруксусной, адипиновой, альгиновой, аскорбиновой (например, L-аскорбиновой), L-аспарагиновой, бензолсульфоновой, бензойной, 4-ацетамидобензойной, бутановой, (+)камфорной, камфоросульфоновой, (+)-(Щ)-камфор-10-сульфоновой, каприновой, капроновой, каприловой, коричной, лимонной, цикламиновой, додецилсерной, этан-1,2-дисульфоновой, этансульфоновой, 2-гидроксиэтансульфоновой, муравьиной, фумаровой, галактарной, гентизиновой, глюкогептоновой, D-глюконовой, глюкуроновой (например, D-глюкуроновой кислоты), глутаминовой (например, L-глутаминовой), α-оксоглутаровой, гликолевой, гиппуровой, галогеноводородной кислоты (например, бромистоводородной, хлористоводородной, иодистоводородной), изетионовой, молочной (например, (+)-Ь-молочной, A-DL-молочной), лактобионовой, малеиновой, яблочной, (-)-Е-яблочной. малоновой, A-DL-миндальной, метансульфоновой, нафталин-2-сульфоновой, нафталин-1,5-дисульфоновой, 1-гидрокси-2-нафтойной, никотиновой, азотной, олеиновой, оротовой, щавелевой, пальмитиновой, памоиновой, фосфорной, пропионовой, пировиноградной, L-пироглутаминовой, салициловой, 4-аминосалициловой себациновой, стеариновой, янтарной, серной, дубильной, (+)-Ь-винной, тиоциановой, п-толуолсульфоновой, ундециленовой и валериановой кислот, а также ацилированных аминокислот и катионообменных смол.

Одна конкретная группа солей состоит из солей, полученных из уксусной, соляной, йодистоводородной, фосфорной, азотной, серной, лимонной, молочной, янтарной, малеиновой, яблочной, изетионовой, фумаровой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, серной, метансульфоновой (мезилат), этансульфоновой, нафталинсульфоновой, валериановой, пропановой, бутановой, малоновой, глюкуроновой и лактобионовой кислот. Конкретная соль представляет собой гидрохлорид. Другой конкретной солью является ацетат.

Если соединение является анионным или содержит функциональную группу, которая может быть

- 9 046487 анионной (например, -COOH может превращаться в -COO^-), то можно получить соль, образованную органическим или неорганическим основанием, генерирующим подходящий катион. Примеры подходящих неорганических катионов включают, без ограничения, ионы щелочных металлов, такие как Li⁺, Na⁺ и K⁺, катионы щелочно-земельных металлов, такие как Ca²⁺ и Mg²⁺, и другие катионы, такие как Al³⁺ или Zn⁺. Примеры подходящих органических катионов включают, без ограничения, ион аммония (т.е. NH4⁺) и замещенные ионы аммония (например, NH3R⁺, NH2R2⁺, NHR3⁺, NR₄ ⁺). Примерами некоторых подходящих замещенных ионов аммония являются ионы, полученные из метиламина, этиламина, диэтиламина, пропиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также из аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером обычного иона четвертичного аммония является N(CH3)4⁺.

Если пептиды по настоящему изобретению содержат аминогруппу, они могут образовывать соли четвертичного аммония, например, в результате взаимодействия с алкилирующим средством по способам, хорошо известным специалисту в данной области. Такие соединения четвертичного аммония входят в объем пептидов по настоящему изобретению.

Модифицированные производные

Следует понимать, что определенные здесь модифицированные производные пептидных лигандов входят в объем настоящего изобретения. Примеры таких подходящих модифицированных производных включают одну или более модификаций, выбранных из: N-концевых и/или C-концевых модификаций; замены одного или более аминокислотных остатков одним или более неприродными аминокислотными остатками (например, замены одного или более полярных аминокислотных остатков одной или более изостерическими или изоэлектронными аминокислотами; замены одного или более неполярных аминокислотных остатков другими неприродными изостерическими или изоэлектронными аминокислотами); добавления спейсерной группы; замены одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или более устойчивыми к окислению аминокислотными остатками; замены одного или более аминокислотных остатков на аланин, замены одного или более L-аминокислотных остатков одним или более D-аминокислотными остатками; N-алкилирования одной или более амидных связей внутри бициклического пептидного лиганда; замены одной или более пептидных связей суррогатной связью; изменения длины пептидного остова; замещения водорода на альфа-углероде одного или более аминокислотных остатков другой химической группой, модификации аминокислот, таких как цистеин, лизин, глутамат/аспартат и тирозин, подходящими аминами, тиолами, карбоновой кислотой и реагентами, взаимодействующими с фенолом, с целью функционализации указанных аминокислот, а также введения или замены аминокислот с достижением ортогональных реакционных свойств, обеспечивающих функционализацию, например, аминокислот, несущих азидные или алкиновые группы, которые делают возможной функционализацию алкиновыми или содержащими азид фрагментами соответственно.

В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит модификацию на Nконце и/или C-конце. В другом варианте осуществления модифицированное производное получают путем N-концевой модификации с использованием подходящих реагентов, взаимодействующих с аминогруппой, и/или C-концевой модификации с использованием подходящих реагентов, взаимодействующих с карбоксигруппой. В другом варианте осуществления указанная N-концевая или С-концевая модификация включает добавление эффекторной группы, неограничивающими примерами которой являются цитотоксическое средство, радиохелатор или хромофор.

В другом варианте осуществления модифицированное производное содержит N-концевую модификацию. В другом варианте осуществления N-концевая модификация включает введение N-концевой ацетильной группы. В данном варианте осуществления N-концевую цистеиновую группу (обозначаемую здесь как Ci) кэпируют уксусным ангидридом или другими подходящими реагентами во время пептидного синтеза с получением молекулы, ацетилированной по N-концу. Преимуществом данного варианта осуществления является удаление потенциального участка распознавания аминопептидазами и избежание возможной деградации бициклического пептида.

В альтернативном варианте осуществления N-концевая модификация включает добавление молекулярной спейсерной группы, которая облегчает конъюгацию эффекторных групп и сохранение активности бициклического пептида по отношению к его мишени.

В другом варианте осуществления модифицированное производное содержит С-концевую модификацию. В другом варианте осуществления C-концевая модификация включает в себя введение амидной группы. В данном варианте осуществления C-концевую цистеиновую группу (обозначаемую здесь Ciii) присоединяют во время пептидного синтеза в виде амида с получением молекулы, амидированной по Cконцу. Преимущество данного варианта осуществления заключается в удалении потенциального участка распознавания карбоксипептидазой и снижении возможности протеолитической деградации бициклического пептида.

В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит замену одного или более аминокислотных остатков одним или более неприродными аминокислотными остатками. В данном варианте осуществления могут быть выбраны неприродные аминокислоты, содержащие изостериче

- 10 046487 ские/изоэлектронные боковые цепи, которые не распознаются деградирующими протеазами и не оказывают какого-либо неблагоприятного воздействия на активность в отношении мишени.

Альтернативно можно использовать неприродные аминокислоты, содержащие пространственно ограниченные боковые цепи, обеспечивающие конформационные и стерические затруднения для протеолитического гидролиза соседней пептидной связи. В частности, в качестве таких аминокислот можно использовать аналогив пролина, аминокислоты с объемными боковыми цепями, C-дизамещенные производные (такие как аминоизомасляная кислота, Aib) и циклоаминокислоты, простое производное представляет собой аминоциклопропилкарбоновую кислоту.

В одном варианте осуществления модифицированное производное получают путем добавления спейсерной группы. В другом варианте осуществления модифицированное производное получают путем добавления спейсерной группы к N-концевому цистеину (Ci) и/или C-концевому цистеину (C_iii).

В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит замену одного или более чувствительных к окислению аминокислотных остатков одним или более устойчивыми к окислению аминокислотными остатками.

В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит замену одного или более заряженных аминокислотных остатков одним или более гидрофобными аминокислотными остатками. В альтернативном варианте осуществления модифицированное производное содержит замену одного или более гидрофобных аминокислотных остатков одним или более заряженными аминокислотными остатками. Правильный баланс заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков является важной характеристикой бициклических пептидных лигандов. Например, гидрофобные аминокислотные остатки влияют на степень связывания плазматических белков и, следовательно, на концентрацию свободной доступной фракции в плазме, тогда как заряженные аминокислотные остатки (в частности, аргинин) могут влиять на взаимодействие пептида с фосфолипидными мембранами на поверхности клеток. Сочетание двух указанных видов аминокислот может влиять на период полувыведения, объем распределения и экспозицию пептидного лекарственного средства и может быть оптимизировано в соответствии с клиническим результатом. Кроме того, правильное сочетание заряженных аминокислотных остатков и гидрофобных аминокислотных остатков и их число может уменьшить раздражение в месте инъекции (если пептидный препарат вводят подкожно).

В одном варианте осуществления модифицированное производное содержит замену одного или более остатков L-аминокислот одним или более остатками D-аминокислот. Считается, что данный вариант осуществления позволяет увеличивать протеолитическую стабильность за счет стерических затруднений и за счет способности D-аминокислот стабилизировать конформации β-изгибов (Tugyi et al. (2005) PNAS, 102 (2), 413-418).

В одном варианте модифицированное производное получают путем удаления любых аминокислотных остатков и замену их на остатки аланина. Преимуществом данного варианта осуществления является удаление потенциального сайта (сайтов) протеолитической атаки.

Следует отметить, что каждую из вышеупомянутых модификаций преднамеренно осуществляют для повышения активности или стабильности пептида. Дальнейшего, обусловленного модификациями, повышения активности, можно достичь с помощью следующих механизмов:

Введение гидрофобных фрагментов, гидрофобность которых приводит к снижению скоростей диссоциаци, и, как следствие, к повышению сродства;

Введение заряженных групп, которые характеризуются ионными взаимодействиями дальнего действия, приводящими к повышению скоростей ассоциации и, следовательно, сродства (см., например, Schreiber et al., Rapid, electrostatically assisted association of proteins (1996), Nature Struct. Biol. 3, 427-31); и

Введение в пептид дополнительного пространственного ограничения, например, путем надлежащего пространственного ограничения боковых цепей аминокислот, чтобы потеря энтропии была минимальной при связывании с мишенью, пространственного ограничения торсионных углов основной цепи так, чтобы потеря энтропии была минимальной при связывании с мишенью, и введения дополнительных циклизаций в молекулу по идентичным причинам.

(обзоры можно найти в Gentilucci et al, Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203 и Nestor et al., Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418).

Изотопные варианты

Настоящее изобретение включает все фармацевтически приемлемые (радио)изотоп-меченые пептидные лиганды по настоящему изобретению, в которых один или несколько атомов заменены атомами, имеющими такой же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличные от атомной массы или массового числа изотопа, обычно встречающегося в природе, а также пептидные лиганды по настоящему изобретению, к которым присоединены металлохелатирующие группы (называемые эффекторными), которые способны удерживать релевантные (радио)изотопы, и пептидные лиганды по настоящему изобретению, в которых определенные функциональные группы ковалентно замещены соответствующими (радио)изотопами или функциональными группами, меченными изотопами.

Примеры изотопов, подходящих для введения в пептидные лиганды по настоящему изобретению, включают изотопы водорода, такие как ²H (D) и ³H (T), углерода, такие как ¹¹C, ¹³C и ¹⁴C, хлора, такие

- 11 046487 как ³⁶Cl, фтора, такие как ¹⁸F, йода, такие как ¹²³I, ¹²⁵I и ¹³¹I, азота, такие как ¹³N и ¹⁵N, кислорода, такие как ¹⁵0,¹⁷O и ¹⁸O, фосфора, такие как ³²P, серы, такие как ³⁵S, меди, такие как ⁶⁴Cu, галлия, такие как ⁶⁷Ga или ⁶⁸Ga, иттрия, такие как ⁹⁰Y, лютеция, такие как ¹⁷⁷Lu, и висмута, такие как ²¹³Bi.

Некоторые изотопно-меченные пептидные лиганды по настоящему изобретению, например, содержащие радиоактивный изотоп, можно использовать для исследования распределения лекарственных средств и/или субстратов в тканях. Пептидные лиганды по настоящему изобретению могут дополнительно обладать ценными диагностическими свойствами, благодаря которым их можно использовать для детекции или идентификации образования комплекса между меченым соединением и другими молекулами, такими как пептиды, белки, ферменты или рецепторы. В методах детекции или идентификации можно использовать соединения, меченные такими средствами, как радиоизотопы, ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества (например, люминол, производные люминола, люциферин, экворин и люцифераза) и др. Особенно широко используют такие радиоактивные изотопы, как тритий, т.е. ³H (T), и углерод-14, т.е. ¹⁴C, вследствие простоты их введения и детекции.

Замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий, например ²H (D), может дать определенные терапевтические преимущества, обусловленные большей метаболической стабильностью, например увеличенным периодом полужизни in vivo, или возможностью использования более низких доз, и, следовательно, может быть предпочтительным в некоторых обстоятельствах.

Замещение изотопами, излучающими позитроны, такими как ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O и ¹³N, можно использовать для изучения занятости мишени методом позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ).

Меченые изотопами соединения пептидных лигандов по настоящему изобретению, как правило, можно получить с помощью традиционных способов, известных специалистам в данной области, или способов, аналогичных описанным в прилагаемых примерах, с использованием меченого соответствующим изотопом реагента вместо ранее используемого немеченого реагента.

Эффекторные и функциональные группы

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к лекарственный конъюгат, содержащий определенный здесь пептидный лиганд, конъюгированный с одной или более эффекторными и/или функциональными группами.

Эффекторные и/или функциональные группы могут быть присоединены, например, к N- и/или Cконцу полипептида, к аминокислоте внутри полипептида или к молекулярному каркасу.

Соответствующие эффекторные группы включают антитела и их части или фрагменты. Например, эффекторная группа может содержать константный участок легкой цепи (CL) антитела, домен CH1 тяжелой цепи антитела, домен CH2 тяжелой цепи антитела, домен CH3 тяжелой цепи антитела, или любое их сочетание в дополнение к одному или нескольким доменам константного участка. Эффекторная группа может также содержать шарнирный участок антитела (такой участок обычно находится между доменами CH1 и CH2 молекулы IgG).

В следующем варианте осуществления этого аспекта изобретения эффекторная группа согласно настоящему изобретению представляет собой Fc-участок молекулы IgG. Предпочтительно пептидный лиганд-эффекторная группа согласно настоящему изобретению содержит или включает гибрид пептидный лиганд-Fc, имеющий период полужизни te день или более, два дня или более, 3 дня или более, 4 дня или более, 5 дней или более, 6 дней или более, или 7 дней или более. Наиболее предпочтительно пептидный лиганд согласно настоящему изобретению включает или содержит гибрид пептидный лиганд-Fc, имеющий период полужизни te, один день или более.

Функциональные группы включают, как правило, связывающие группы, лекарственные средства, реактивные группы для присоединения других фрагментов, функциональные группы, которые способствуют захвату макроциклических пептидов клетками и т.п.

Способность пептидов проникать в клетки позволяет пептидам действовать против внутриклеточных мишеней. Мишени, на которые могут быть направлены пептиды, способные проникать в клетки, включают факторы транскрипции, внутриклеточные сигнальные молекулы, такие как тирозинкиназы, и молекулы, участвующие в пути апоптоза. Функциональные группы, обеспечивающие проникновение в клетки, включают пептиды или химические группы, присоединенные либо к пептиду, либо к молекулярному каркасу. Можно использовать такие пептиды, как производные, например, VP22, HIV-Tat, гомеобоксного белка Drosophila (Antennapedia), например, как описано в Chen and Harrison, Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821; Gupta et al. in Advanced Drug Discovery Reviews (2004) Volume 57 9637. Примеры коротких пептидов, которые, как было показано, эффективно переносятся через плазматические мембраны, включают пептид пенетратин из белка Antennapedia Drosophila (Derossi et al (1994) J Biol. Chem. Volume 269 p10444), содержащий 16 аминокислот, модель амфипатического пептида (Oehlke et al (1998) Biochim Biophys Acts Volume 1414 p127), содержащую 18 аминокислот, и богатые аргинином участки белка ТАТ ВИЧ. Непептидные подходы включают использование низкомолекулярных имитаторов или SMOC, которые можно легко присоединять к биомолекулам (Okuyama et al (2007) Nature Methods Volume 4 p153). Другие химические стратегии, заключающиеся в добавлении гуанидиниевых групп к молекулам, также увеличивают проникновение в клетки (Elson-Scwab et al (2007) J Biol

- 12 046487

Chem Volume 282 p13585). Молекулы с низкой молекулярной массой, такие как стероиды, можно присоединить к молекулярному каркасу для увеличения поглощения клетками.

Один класс функциональных групп, которые могут быть присоединены к пептидным лигандам, включает антитела и их связывающие фрагменты, такие как Fab, Fv или однодоменные фрагменты. В частности, можно использовать антитела, которые связываются с белками, способными увеличивать период полужизни пептидного лиганда in vivo.

В одном варианте осуществления пептидный лиганд-эффекторная группа согласно изобретению имеет период полужизни te, выбранный из группы, состоящей из: 12 ч или более, 24 ч или более, 2 дней или более, 3 дней или более, 4 дней или более, 5 дней или более, 6 дней или более, 7 дней или более, 8 дней или более, 9 дней или более, 10 дней или более, 11 дней или более, 12 дней или более, 13 дней или более, 14 дней или более, 15 дней или более, или 20 дней или более. Предпочтительно пептидный лиганд-эффекторная группа или композиция по изобретению имеет период полужизни te в диапазоне от 12 до 60 ч. В другом варианте осуществления его период полужизни te составляет один день или более. В следующем варианте осуществления период полужизни находится в диапазоне от 12 до 26 ч.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения функциональная группа выбрана из хелатора металлов, способного образовывать комплексы с радиоизотопами металлов, используемыми в медицине.

Возможные эффекторные группы также включают ферменты, например, такие как карбоксипептидаза G2, для использования в ферментной/пролекарственной терапии, где пептидный лиганд заменяет антитела в ADEPT.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения функциональная группа выбрана из лекарственного средства, такого как цитотоксическое средство для лечения рака. Подходящие примеры включают алкилирующие средства, такие как цисплатин и карбоплатин, а также оксалиплатин, мехлорэтамин, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид; антиметаболиты, такие как аналоги пурина, азатиоприн и меркаптопурин, или аналоги пиримидина; растительные алкалоиды и терпеноиды, включающие в себя алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин; подофиллотоксин и его производные этопозид и тенипозид; таксаны, такие как паклитаксел, первоначально известный как таксол; ингибиторы топоизомеразы, такие как камптотецины: иринотекан и топотекан, и ингибиторы типа II, такие как амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид. Другие средства могут включать в себя противоопухолевые антибиотики, такие как иммунодепрессант дактиномицин (который используется при трансплантации почек), доксорубицин, эпирубицин, блеомицин, калихемицины и другие.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения цитотоксическое средство выбрано из майтансиноидов (таких как DM1) или монометилауристатинов (таких как MMAE).

DM1 представляет собой цитотоксическое средство, которое представляет собой тиолсодержащее производное майтансина и имеет следующую структуру:

Монометилауристатин E (MMAE) представляет собой синтетическое противоопухолевое средство и имеет следующую структуру:

- 13 046487

В следующем конкретном варианте осуществления изобретения цитотоксическое средство выбрано из монометилауристатина E (MMAE). Данные, представленные на фиг. 1 и в табл. 4 и 5, демонстрируют эффекты пептидных лигандов, конъюгированных с токсином, содержащим MMAE.

В одном варианте осуществления цитотоксическое средство связано с бициклическим пептидом расщепляемой связью, такой как дисульфидная связь или чувствительная к протеазе связь. В дополнительном варианте осуществления группы, смежные с дисульфидной связью, модифицируют, чтобы контролировать блокировку дисульфидной связи и, таким образом, скорость расщепления и сопутствующего высвобождения цитотоксического средства.

В опубликованной работе определяют возможность изменения чувствительности дисульфидной связи к восстановлению путем введения стерических препятствий с обеих сторон дисульфидной связи (Kellogg et al. (2011) Bioconjugate Chemistry, 22, 717). Более высокая степень стерических затруднений снижает скорость восстановления внутриклеточным глутатионом, а также внеклеточными (системными) восстанавливающими средствами, в результате чего снижается легкость высвобождения токсина как внутри, так и вне клетки. Таким образом, оптимальной степени стабильности дисульфида в кровотоке (которая сводит к минимуму нежелательные побочные эффекты токсина) по сравнению с эффективным высвобождением во внутриклеточную среду (которое максимизирует терапевтический эффект) можно достичь путем тщательного выбора степени стерических затруднений с обеих сторон дисульфидной связи.

Затрудненность с обеих сторон дисульфидной связи модулируют путем введения одной или более метильных групп либо на направляющем фрагменте (здесь бициклический пептид), либо на токсиновой стороне молекулярной конструкции.

В одном варианте осуществления цитотоксическое средство и линкер выбирают из любых сочетаний, описанных в WO 2016/067035 (цитотоксические агенты и линкеры включены в настоящее описание в качестве ссылки).

В одном варианте осуществления линкер между указанным цитотоксическим средством и указанным бициклическим пептидом содержит один или несколько аминокислотных остатков. Примеры аминокислотных остатков, подходящих в качестве линкеров включают Ala, Cit, Lys, Trp и Val.

В одном варианте осуществления цитотоксическое средство выбрано из MMAE, а указанный лекарственный конъюгат дополнительно содержит линкер, выбранный из -PABC-Cit-Val-глутарил- или -PABC-циkлобутил-Ala-Cit-βAla-, где PABC представляет собой п-аминобензилкарбамат. Полную информацию о циклобутил-содержащем линкере можно найти в Wei et al. (2018) J. Med. Chem. 61, 9891000. В другом варианте осуществления цитотоксическое средство выбрано из MMAE, а линкер представляет собой -PABC-Cit-Val-глутарил-.

В одном варианте осуществления цитотоксическое средство представляет собой MMAE, бициклический пептид выбран из (B-Ala)-Sar10-ALPP- (SEQ ID NO: 17), а линкер выбран из -PABC-Cit-Valглутарил-. Указанный BDC известен здесь как BT17BDC58, который схематически можно представить следующим образом:

- 14 046487

где BICYCLE-N007 обозначает (B-Ala)-SarlO-ALPP-(SEQ ID NO: 17), также известный как (B-Ala)Sar10-A-(17-120-09-T03)HArg2HArg9).

Данные, приведенные на фиг. 1 и в табл. 4 и 5, свидетельствуют о наличии противоопухолевой активности.

Синтез

Пептиды по настоящему изобретению можно получить синтетическим путем с помощью стандартных методов с последующим взаимодействием с молекулярным каркасом in vitro. затем можно использовать стандартные химические методы. Это обеспечивает быстрое крупномасштабное получение растворимого вещества для последующих экспериментов или проверки. Такие способы можно осуществить с использованием обычных химических методов, таких как описанные в Timmerman et al. (выше).

Таким образом, изобретение также относится к получению полипептидов, выбранных в соответствии с настоящим изобретением, где производство включает необязательные дополнительные стадии, описанные ниже. В одном варианте осуществления указанные стадии проводят на конечном продукте полипептида, полученном путем химического синтеза.

Пептиды также можно удлинить, например, для добавления другой петли и, следовательно, для введения нескольких специфичностей.

Пептид можно удлинить с помощью обычных химических методов по N-концу или С-концу, или внутри петель с использованием ортогонально защищенных лизинов (и их аналогов) с помощью стандартных методов твердофазной химии или жидкофазной химии. Стандартные методы (био)конъюгации можно использовать для введения активированного или активируемого N- или C-конца. Альтернативно можно ввести добавления путем конденсации фрагментов или методом нативного химического лигирования, например как описано в (Dawson et al. 1994. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779), или с использованием ферментов, таких как субтилигазы, как описано в (Chang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8, или Hikari et al Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Volume 18, Issue 22, 15 November 2008, Pages 6000-6003).

Альтернативно пептиды можно удлинить или модифицировать путем дальнейшей конъюгации посредством дисульфидных связей. Дополнительное преимущество такой конъюгации заключается в том, что она обеспечивает возможность отделения первого и второго пептида друг от друга в восстановительной среде клетки. В этом случае молекулярный каркас (например, ТАТА) может быть добавлен во время химического синтеза первого пептида так, чтобы он взаимодействовал с тремя цистеиновыми группами; затем к N- или C-концу первого пептида можно присоединить дополнительно остаток цистеина или тиол, так чтобы этот цистеин или тиол взаимодействовал только со свободным цистеином или тиолом второго пептида с образованием связанного дисульфидной связью бициклического пептид-пептидного конъюгата.

Подобные методы в равной степени применимы к синтезу/соединению двух бициклических и биспецифических макроциклов с возможным получением тетраспецифической молекулы.

Кроме того, добавление других функциональных или эффекторных групп можно проводить подобным образом, путем присоединения их к N- или C-концу или к боковым цепям с использованием соответствующих химических методов. В одном варианте осуществления присоединение осуществляют таким образом, что оно не блокирует активность ни одного фрагмента.

Фармацевтические композиции

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный здесь пептидный лиганд в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Как правило, пептидные лиганды по настоящему изобретению используют в очищенном виде вместе с фармакологически приемлемыми эксципиентами или носителями. Как правило, такие эксципиенты или носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, такие как физиологический раствор и/или забуференные среды. Среды для парентерального применения включают раствор хлорида натрия, раствор Рингера, содержащий декстрозу, раствор Рингера, содержащий декстрозу и хлорид натрия, а также лактат. Если нужно поддерживать полипептидный комплекс в суспензии, добавляют подходящие физиологически приемлемые эксципиенты, выбранные из загустителей, таких как карбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, желатин и альгинаты.

Среды для внутривенного применения включают жидкие и питательные восполняющие средства, а также восполняющие средства, содержащие электролиты, например, среды на основе раствора Рингера, содержащего декстрозу. Среды также могут содержать консерванты и другие добавки, такие как противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы (Mack (1982)

- 15 046487

Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 издание).

Соединения по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с другим средством или другими средствами. Другое средство для использования в комбинации может представлять собой, например, другой антибиотик или антибиотический адъювант, такой как средство, улучшающее проникновение в грамотрицательные бактерии, ингибитор детерминант устойчивости или ингибитор механизмов вирулентности.

Антибиотики, подходящие для применения в комбинации с соединениями по настоящему изобретению включают, без ограничения:

Бета-лактамы, такие как пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы или монобактамы. Подходящие пенициллины включают оксациллин, метициллин, ампициллин, клоксациллин, карбенициллин, пиперациллин, трикарциллин, флуклоксациллин и нафциллин; подходящие цефалоспорины включают цефазолин, цефалексин, цефалотин, цефтазидим, цефепим, цефтобипрол, цефтаролин, цефтолозан и цефидерокол; подходящие карбапенемы включают меропенем, дорипенем, имипенем, эртапенем, биапенем и тебипенем; подходящие монобактамы включают азтреонам;

Линкозамиды, такие как клиндамицин и линкомицин;

Макролиды, такие как азитромицин, кларитромицин, эритромицин, телитромицин и солитромицин;

Тетрациклины, такие как тигециклин, омадациклин, эравациклин, доксициклин и миноциклин;

Хинолоны, такие как ципрофлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин и делафлоксацин;

Рифамицины, такие как рифампицин, рифабутин, рифалазил, рифапентин и рифаксимин;

Аминогликозиды, такие как гентамицин, стрептомицин, тобрамицин, амикацин и плазомицин;

Г ликопептиды, такие как ванкомицин, тейхопланин, телаванцин, далбаванцин и оритаванцин, Плевромутилины, такие как лефамулин,

Оксазолидиноны, такие как линезолид или тедизолид,

Полимиксины, такие как полимиксин B или колистин;

триметоприм, иклаприм, сульфаметоксазол;

метронидазол;

фидаксомицин;

мупироцин;

фусидовая кислота;

даптомицин;

мурепавидин;

фосфомицин и нитрофурантоин.

Подходящие антибиотические адъюванты включают, без ограничения средства, которые, как известно, улучшают проникновение в бактерии, такие как средства, повышающие проницаемость внешней мембраны, или ингибиторы эффлюксного насоса; пермеабилизаторы внешней мембраны могут включать нонапептид полимиксина B или другие аналоги полимиксина, или эдетат натрия;

ингибиторы механизмов резистентности, такие как ингибиторы бета-лактамазы; подходящие ингибиторы бета-лактамазы включают клавулановую кислоту, тазобактам, сульбактам, авибактам, релебактам и накубактам и ингибиторы механизмов вирулентности, таких как токсины и системы секреции, включающие в себя антитела.

Соединения по настоящему изобретению также можно использовать в комбинации с биологическими методами лечения, такими как способы лечения с использованием нуклеиновых кислот, антител, бактериофаговых или фаговых лизинов.

Способ введения фармацевтических композиций согласно изобретению может представлять собой любой из обычных способов, известных специалистам в данной области. С целью лечения пептидные лиганды согласно изобретению можно вводить любому пациенту в соответствии со стандартными методами. Способы введения включают, без ограничения, пероральный (например, путем приема внутрь); буккальный; сублингвальный; трансдермальный (например, с использованием пластыря, гипса и т.д.); трансмукозальный (например, с использованием пластыря, гипса и т.д.); интраназальный (например, с использованием назального спрея); глазной (например, с использованием глазных капель); легочный (например, путем ингаляционной или инсуффляционной терапии с использованием, например, аэрозоля, например, через рот или нос); ректальный (например, с использованием суппозитория или клизмы); вагинальный (например, с использованием пессария); парентеральный, например, путем инъекции, такой как подкожная, внутрикожная, внутримышечная, внутривенная, внутриартериальная, интракардиальная, интратекальная, интраспинальная, интракапсулярная, субкапсулярная, внутриглазная, внутрибрюшинная, интратрахеальная, подкожная, внутрисуставная, субарахноидальная и внутригрудинная; путем имплантации депо или резервуара, например, подкожно или внутримышечно. Предпочтительно фармацевтические композиции согласно изобретению вводят парентерально. Дозировка и частота введения зависят от возраста, пола и состояния пациента, одновременного приема других лекарств, противопоказаний

- 16 046487 и других параметров, которые должны учитываться клиницистом.

Пептидные лиганды по настоящему изобретению можно лиофилизировать для хранения с перерастворением их в подходящем носителе перед использованием. Показано, что данный способ является эффективным, и для его осуществления можно использовать известные в данной области методы лиофилизации и перерастворения. Специалистам в данной области известно, что лиофилизация и перерастворение могут приводить к разным степеням потери активности, для компенсации которой, возможно, потребуется корректировка доз в сторону увеличения.

Композиции, содержащие пептидные лиганды по настоящему изобретению, или их смесь, можно вводить с целью терапевтического лечения. При определенных терапевтических применениях количество, достаточное для достижения, по меньшей мере, частичного ингибирования, подавления, модуляции, уничтожения или другого измеримого параметра популяции выбранных клеток, определяют как терапевтически эффективная доза. Количество, необходимое для достижения этой дозы, зависит от тяжести заболевания и общего состояния собственной иммунной системы пациента, но обычно варьирует от 10 мкг до 250 мг выбранного пептидного лиганда на килограмм массы тела, причем обычно используют дозу от 100 мкг до 25 мг/кг/дозу.

Композицию, содержащую пептидный лиганд по настоящему изобретению, можно использовать в терапевтических целях для лечения микробной инфекции, или для профилактики у индивидуума, подверженного риску заражения, например, перенесшего операцию, химиотерапию, искусственную вентиляцию легких или другое состояние или запланированное вмешательство. Кроме того, описанные здесь пептидные лиганды можно использовать экстракорпорально или in vitro для селективного уничтожения, истощения или иного эффективного уменьшения популяции клеток-мишеней в гетерогенной смеси клеток. Кровь млекопитающего можно экстракорпорально объединить с выбранными пептидными лигандами, чтобы уничтожить или иным образом удалить из крови нежелательные клетки, с последующим возвращением крови млекопитающему в соответствии со стандартными методами.

Терапевтическое применение

Бициклические пептиды по настоящему изобретению имеют конкретное применение в качестве высокоаффинных средств, связывающих мембранную металлопротеиназу типа 1 (MT1-MMP, также известную как MMP14). MT1-MMP представляет собой трансмембранную металлопротеиназу, которая играет важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса, непосредственно путем разрушения некоторых его компонентов и косвенно путем активации про-ММР2. MT1-MMP также играет ключевую роль в опухолевом ангиогенезе (Sounni et al. (2002) FASEB J. 16 (6), 555-564) и экспрессируется на повышенном уровне в ряде солидных опухолей, поэтому лекарственные конъюгаты, содержащие MT1-MMPсвязывающие бициклические пептиды по настоящему изобретению могут конкретно использоваться для направленного лечения рака, в частности солидных опухолей, таких как немелкоклеточные карциномы легких. В одном варианте осуществления бициклический пептид по настоящему изобретению специфичен к человеческому MT1-MMP. В следующем варианте осуществления бициклический пептид по настоящему изобретению специфичен к мышиному MT1-MMP. В другом варианте осуществления бициклический пептид по настоящему изобретению специфичен к человеческому и мышиному MT1-MMP. В следующем варианте осуществления бициклический пептид по настоящему изобретению специфичен к человеческому, мышиному и собачьему МТ1-ММП.

Полипептидные лиганды по настоящему изобретению можно использовать в терапевтических и профилактических целях in vivo, в диагностических целях in vitro и in vivo, в анализах in vitro, в качестве реагентов и т.п. Лиганды, обладающие определенным уровнем специфичности, можно использовать в способах применения, которые включают тестирование отличных от человека животных, где желательно наличие перекрестной реактивности, или в диагностических способах, где перекрестная реактивность с гомологами или паралогами должна тщательно контролироваться. В некоторых способах применения, например, в составе вакцин, способность вызывать иммунный ответ на заранее определенные диапазоны антигенов может использоваться для адаптации вакцины к конкретным заболеваниям и патогенам.

По существу чистые пептидные лиганды с гомогенностью по меньшей мере от 90 до 95% предпочтительны для введения млекопитающему, а гомогенность от 98 до 99% или более является наиболее предпочтительной для фармацевтического применения, особенно когда млекопитающее представляет собой человека. После очистки, частично или до желаемой степени гомогенности, выбранные полипептиды можно использовать в диагностических или терапевтических целях (в том числе экстракорпорально), или для разработки и проведения аналитических процедур, иммунофлуоресцентного окрашивания и т.п. (Lefkovite and Pernis, (1979 and 1981) Immunological Methods, Volumes I and II, Academic Press, NY).

Конъюгаты пептидных лигандов по настоящему изобретению обычно находят применение в способах предотвращения, подавления или лечения рака, в частности солидных опухолей, таких как немелкоклеточные карциномы легких.

Таким образом, в соответствии с другим аспектом изобретение относится к лекарственным конъюгатам, содержащим описанный здесь пептидный лиганд, для применения в способах профилактики, подавления или лечения рака, в частности солидных опухолей, таких как немелкоклеточные карциномы легких.

- 17 046487

В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу профилактики, подавления или лечения рака, в частности солидных опухолей, таких как немелкоклеточные карциномы легких, который включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, лекарственного конъюгата, содержащего описанный здесь пептидный лиганд.

Примеры рака (и его доброкачественных аналогов), которые можно лечить (или подавлять), включают, без ограничения, опухоли эпителиального происхождения (аденомы и карциномы разных типов, в том числе аденокарциномы, плоскоклеточные, переходноклеточные и другие карциномы), такие как карциномы мочевого пузыря и мочевыводящих путей, молочной железы, желудочно-кишечного тракта (включающего в себя пищевод, желудок, тонкий кишечник, толстую кишку, прямую кишку и анус), печени (гепатоцеллюлярная карцинома), желчного пузыря и желчевыводящей системы, экзокринной части поджелудочной железы, почки, легкого (например, аденокарциномы, мелкоклеточные карциномы легких, немелкоклеточные карциномы легких, бронхоальвеолярные карциномы и мезотелиомы), головы и шеи (например, рак языка, ротовой полости, гортани, глотки, носоглотки, миндалин, слюнных желез, носовой полости и придаточных пазух носа), яичника, маточных труб, брюшины, влагалища, вульвы, пениса, шейки матки, миометрия, эндометрия, щитовидной железы (например, фолликулярная карцинома щитовидной железы), надпочечников, предстательной железы, кожи и придатков (например, меланома, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, кератоакантома, диспластический невус); гематологические злокачественные заболевания (такие как лейкозы, лимфомы) и предраковые гематологические расстройства и пограничные злокачественные заболевания, такие как гематологические злокачественные заболевания и родственные состояния лимфоидной линии (например, острый лимфолейкоз [ALL], хронический лимфолейкоз [CLL], B-клеточные лимфомы, такие как диффузная Вкрупноклеточная лимфома [DLBCL], фолликулярная лимфома, лимфома Беркитта, мантийноклеточная лимфома, Т-клеточные лимфомы и лейкозы, лимфомы естественных клеток-киллеров [NK], лимфомы Ходжкина, волосатоклеточный лейкоз, моноклональная гаммапатия неясного генеза, плазмоцитома, множественная миелома и посттрансплантационные лимфопролиферативные расстройства), гематологические злокачественные заболевания и родственные состояния миелоидного происхождения (например, острый миелогенный лейкоз [AML], хронический миелогенный лейкоз [CML], хронический миеломоноцитарный лейкоз [CMML], гиперэозинофильный синдром, миелопролиферативные расстройства, такие как истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз, миелопролиферативный синдром, миелодиспластический синдром и промиелоцитарный лейкоз); опухоли мезенхимального происхождения, например саркомы мягких тканей, костей или хрящей, такие как остеосаркомы, фибросаркомы, хондросаркомы, рабдомиосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, ангиосаркомы, саркома Капоши, саркома Юинга, синовиальные саркомы, эпителиоидные саркомы, гастроинтестинальные стромальные опухоли, доброкачественные и злокачественные гистиоцитомы и возвышающиеся дерматофибросаркомы; опухоли центральной или периферической нервной системы (например, астроцитомы, глиомы и глиобластомы, менингиомы, эпендимомы, опухоли шишковидной железы и шванномы); эндокринные опухоли (например, опухоли гипофиза, опухоли надпочечников, опухоли островковых клеток, опухоли паращитовидной железы, карциноидные опухоли и медуллярная карцинома щитовидной железы); опухоли глаза и придатков (например, ретинобластома); опухоли зародышевых клеток и трофобластов (например, тератомы, семиномы, дисгерминомы, доброкачественная гестационная трофобластическая болезнь и хориокарциномы); а также педиатрические и эмбриональные опухоли (например, медуллобластома, нейробластома, опухоль Вильмса и примитивные нейроэктодермальные опухоли); или синдромы, врожденные или иные, которые делают пациента восприимчивым к злокачественным новообразованиям (например, пигментная ксеродерма).

Ссылки в настоящем описании на термин профилактика включают введение защитной композиции до индукции заболевания. Термин подавление относится к введению композиции после индукционного события, но перед клиническим проявлением заболевания. Термин лечение включает введение защитной композиции после появления симптомов заболевания.

Существуют животные модельные системы, которые можно использовать для скрининга эффективности лекарственных конъюгатов в отношении профилактики или лечения заболевания. Настоящее изобретение облегчает использование животных модельных систем, поскольку полипептидные лиганды, предлагаемые изобретением, могут перекрестно взаимодействовать с человеческими и животными мишенями.

Далее изобретение описывается со ссылкой на нижеследующие примеры.

Примеры

Материалы и методы Синтез пептидов

Синтез пептидов проводят с использованием Fmoc-стратегии на пептидном синтезаторе Symphony, произведенном Peptide Instruments, и синтезаторе Syro II, произведенном MultiSynTech. Используют стандартные Fmoc-аминокислоты (Sigma, Merck) с соответствующими защитными группами боковых цепей: в каждом случае по возможности используют стандартные условия конденсации с последующим удалением защитных групп стандартными методами.

- 18 046487

Альтернативно пептиды очищают методом ВЭЖХ и после выделения их модифицируют 1,3,5триакрилоилгексагидро-1,3,5-триазином (TATA, Sigma). Для этого линейный пептид разводят 50:50 MeCN:H2O до -35 мл, добавляют -500 мкл 100 мМ ТАТА в ацетонитриле и инициируют реакцию 5 мл 1 М NH4HCO3 в H2O. Реакции дают протекать в течение -30-60 мин при комнатной температуре и после завершения реакции (определяемого методом MALDI) лиофилизируют. После завершения реакции к реакционной смеси добавляют 1 мл 1 М раствора моногидрата гидрохлорида L-цистеина (Sigma) в H2O и держат в течение -60 мин при комнатной температуре, чтобы погасить какой-либо избыток ТАТА.

После лиофилизации модифицированный пептид очищают описанным выше способом, с заменой колонки Luna C8 на колонку Gemini C18 (Phenomenex) и кислоты на 0,1% трифторуксусную кислоту. Чистые фракции, содержащие целевое ТАТА-модифицированное вещество, объединяют, лиофилизируют и хранят при -20 °C.

Если не указано иное, все используемые аминокислоты имеют L-конфигурациию.

В некоторых случаях перед связыванием со свободной тиольной группой токсина пептиды превращают в активированные дисульфиды с помощью следующего метода: раствор 4-метил(сукцинимидил-4(2-пиридилтио)пентаноата) (100 мМ) в сухом ДМСО (1,25 моль-экв.) добавляют к раствору пептида (20 мМ) в сухом ДМСО (1 моль-экв.). Реакционную смесь тщательно перемешивают и добавляют DIPEA (20 моль-экв.). Протекание реакции отслеживают методом ЖХ/МС до завершения.

Получение бициклического лекарственного конъюгата BT17BDC58

Круглодонную колбу объемом 50 мл, содержащую BICYCLE-NH2 ((B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17), также известный как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03)HArg2HArg9) (66 мг, 22,4 мкмоль, 1,00 экв.) в DMA (5 мл) продувают азотом из баллона. Затем при 25°C добавляют DIEA (2,91 мг, 112,4 мкмоль, 19,6 мкл, 5 экв.) при перемешивании. Затем добавляют соединение 8 (которое можно получить по способу, описанному для получения соединения 8 в WO 2018/127699) (30,00 мг, 22,48 мкмоль, 1,00 экв.) и реакционную смесь перемешивают в атмосфере с повышенным содержанием азота при 25°C в течение 16 ч. Результаты ЖХ-МС демонстрируют, что соединение 8 полностью израсходовано и присутствует один основной пик с желаемой МС. Полученную реакционную смесь очищают препаративной ВЭЖХ (в присутствии TFA). Соединение BT17BDC58 (20,2 мг, 4,85 мкмоль, выход 21,56%) получают в виде белого твердого вещества.

Результаты биологических анализов

Анализ конкурентного связывания MT1-MMP с поляризацией флуоресценции

Вследствие их высокого сродства к гемопексиновому домену MT1-MMP (PEX) меченные флуоресцеином производные 17-69-07 и 17-69-12 (обозначаемые 17-69-07-N040, 17-69-07-N041 и 17-69-12-N004) можно использовать для конкурентных анализов (детекция с использованием FP). В данном описании заранее полученный комплекс PEX с флуоресцентной PEX-связывающей меткой титруют свободным не содержащим флуоресцеина бициклическим пептидом. Поскольку предполагается, что все пептиды на основе 17-69 связываются по одному и тому же участку, титрант вытеснит флуоресцентную метку из PEX. Диссоциацию комплекса можно измерить количественно и определить Kd конкурента (титранта) целевого белка. Преимущество метода конкуренции заключается в том, что сродство не содержащих флуоресцеина бициклических пептидов можно определять точно и быстро.

Концентрация метки обычно находится на уровне Kd или ниже (здесь 1 нМ), а связывающий белок (здесь гемопексин MT1-MMP) находится в 15-кратном избытке, так что связывается >90% метки. Затем титруют нефлуоресцентный конкурирующий бициклический пептид (обычно только последовательность бициклического ядра) так, чтобы он вытеснил флуоресцентную метку с белка-мишени. Измеряют замещение метки и соотносят его с уменьшением поляризации флуоресценции. Уменьшение поляризации флуоресценции пропорционально доле белка-мишени, связанной с нефлуоресцентным титрантом, и, следовательно, является мерой сродства титранта к белку-мишени.

В некоторых экспериментах соединения, связывающие коллаген (т.е. 17-88-N006 и 17-88-226

- 19 046487

N002), используют аналогично соединениям, связывающим гемопексин.

Исходные данные подгоняют к аналитическому решению кубического уравнения, которое описывает равновесие между флуоресцентной меткой, титрантом и связывающим белком. Подгонка требует значения сродства флуоресцентной метки к белку-мишени, которое можно определить отдельно с помо щью экспериментов по изучению непосредственного связывания FP (см. предыдущий раздел). Подгонку кривой проводят с помощью Sigmaplot 12.0 и используют как адаптированную версию уравнения, описанного Zhi-Xin Wang (FEBS Letters 360 (1995), 111-114).

Таблица 1. Характеристические параметры меток, используемых в конкурентном анализе с поляризацией флуоресценции

Название	Последовательность	Каркас	K_d (hM) (непосредственно e связывание)	Участок связывания
17-69-07-	ACYNEFGCEDFYDICA[S	TBMB	0,52	Гемопексин
N040	ar]₆[KFl] ((SEQ ID NO: 140)[Sar]₆[KFl])
17-69-12- N004	[Fl]G[Sar]₅ACMNQFGCED FYDICA ([Fl]G[Sar]₅-(SEQ ID NO: 141))	TBMB	1,0	Гемопексин
17-69-07- N041	[Fl]G[Sar]₅ACYNEFACED FYDICA ([Fl]G[Sar]₅-(SEQ ID NO: 142))	TBMB	3,4	Гемопексин
17-88- N006	ACPYSWETCLFGDYRCA [Sar]₆[KFl] ((SEQ ID NO: 143)-[Sar]₆[KFl])	TBMB	14	Коллаген
17-88- 226-N002	ACPYDWATCLFGDYRCA [Sar]₆[KFl] ((SEQ ID NO: 144)- [Sar]₆[KFl])	TBMB	50	Коллаген

Результаты тестирования некоторых пептидных лигандов по изобретению с помощью вышеупомянутого анализа связывания показаны в табл. 2.

Таблица 2. Результаты анализа конкурентного связывания выбранных __________пептидных лигандов по настоящему изобретению__________

Название бициклического фрагмента	Метка	Kd (нМ±95% С1)
17-108-02	17-88-N006	4488,4±545,85
17-111-01	17-69-07-N041	1800 п=1
17-111-02	17-69-07-N041	2300 п=1
17-116-01	17-69-07-N040	352 п=1
17-120-00	17-88-N006	923±287,43
17-120-01	17-88-N006	310,33±30,89
17-120-02	17-88-N006	190,2±37,57
17-120-03	17-88-N006	603,56±35
17-120-04	17-88-N006	224,5 п=1
17-120-05	17-69-07-N040	>279,5±69,3
17-120-07	17-88-N006	273±119,56
17-120-08	17-88-N006	258±101,92
17-120-09-Т01	17-88-N006	53,83±13,33

- 20 046487

17-120-09-ΊΌ2	17-88-N006	55,2 n=l
17-120-09-T03 (BCY1124)	17-88-N006	35,6 n=l
17-120-09-ΊΌ3 (BCY1124)	17-88-226-N002	32+20,24
Ac-(17-120-09-T03) (BCY1125)	17-88-226-N002	18,65+6,96
Sar3-A-(17-120-09-T03)	17-88-226-N002	16,33+5,73
Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg2	17-88-226-N002	26,63+9,31
Sar3-A-(17-120-09-T03) Arg9	17-88-226-N002	8,28+3,53
Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg9	17-88-226-N002	30,9+10
(B-Ala)-Sarl0-A-(17-120-09-T03) HArg2 HArg9	17-88-226-N002	39,5+16,43
(B-Ala)-Sarl0-A-(17-120-09-T03) HArg2 Ala9	17-88-226-N002	189,55+32,24
(B-Ala)-Sarl0-A-(17-120-09-T03) Ala2 HArg9	17-88-226-N002	89,55+10,09
Ac-(B-Ala)-Sarl0-A-(17-120-09- T03) HArg2 HArg9	17-88-226-N002	43,9+15,48
17-120-09-T04	17-88-N006	34,15+10,2
17-120-09-T05	17-88-N006	32,3+6,81
17-120-09-ΊΌ6	17-88-N006	49,8 n=l
17-120-09-ΊΌ7	17-88-N006	48,1 n=l
17-120-09-T08	17-88-N006	37,5 n=l
17-120-09-T09	17-88-N006	77,2 n=l
17-120-09-T10	17-88-N006	38,5 n=l
17-120-09-T11	17-88-N006	44,2 n=l
17-120-09-T12	17-88-N006	62,2 n=l
17-120-09-T13	17-88-N006	69,3 n=l
17-120-10-T01	17-88-N006	132,3+103,29
17-120-11-T01	17-88-N006	612+760,47
17-120-12-T01	17-88-N006	183 n=l
17-120-13-T01	17-88-N006	189+123,48
17-120-14-T01	17-88-N006	148 n=l
17-120-15-T01	17-88-N006	178 n=l
17-120-15-T02	17-88-N006	76,67+72,87
17-120-16-T01	17-88-N006	74,4+17,64

- 21 046487

17-120-17-T01	17-88-N006	157 n=l
17-120-18	17-88-N006	252±92,12
17-120-19	17-88-N006	303±258,72
17-120-20	17-88-N006	248,5±14,7
17-120-21	17-88-N006	>82,75±4,61
17-120-21-TOI	17-88-N006	113 п=1
17-120-22-ТО 1	17-88-N006	62,35±30,48
17-120-22-T02	17-88-N006	46,1±26,5
17-120-23-ТО 1	17-88-N006	127±7,84
17-120-24-ТО 1	17-88-N006	126±35,28
17-120-25-T01	17-88-N006	194,5±161,7
17-120-26-ТО 1	17-88-N006	598 п=1
17-120-27-ТО 1	17-88-N006	394 п=1
17-120-28-ТО 1	17-88-N006	191,5±4,9
17-120-29-ТО 1	17-88-N006	162±68,6
17-120-30-Т01	17-88-N006	78,7 п=1
17-120-31-Т01	17-88-N006	50,2 п=1
17-120-31-Т02	17-88-N006	68,3 п=1
17-120-31-ТОЗ	17-88-N006	41,47±5,32
17-120-32-Т01	17-88-N006	63,8±26,49
17-120-33-Т01	17-88-N006	77,6 п=1
17-120-34-Т01	17-88-N006	59,87±8,58
17-120-35-Т01	17-88-N006	23,33±9,48
17-121-00	17-69-07-N040	678 п=1
17-122-02	17-69-07-N040	>929 п=3
17-122-03	17-69-07-N040	>378 п=3
17-122-04	17-69-07-N040	>2100
17-126-01	17-69-07-N041	>316±9,8
17-126-02	17-69-07-N041	>282± 172,48
17-126-03	17-69-07-N041	>43 0± 11,76
17-126-06	17-69-07-N040	675±192,08
17-126-07	17-69-07-N040	197,5±85,26
17-126-08	17-69-07-N040	711 п=1
17-126-09	17-69-07-N040	165 п=1

- 22 046487

17-126-10	17-69-07-N040	737 n=l
17-126-11	17-69-07-N040	971 n=l
17-126-12	17-69-07-N040	2900 n=l
17-126-18	17-69-07-N040	147 n=l
17-126-19	17-69-07-N040	199 n=l
17-126-20	17-69-07-N040	246 n=1
17-126-21	17-69-07-N040	131 n=l
17-126-22	17-69-07-N040	295 n=l
17-126-23	17-69-07-N040	409 n=l
17-126-24	17-69-07-N040	200 n=l
17-126-25	17-69-07-N040	>138,76
Ac-( 17-126-25)	17-69-12-N004	60,5 n=l
17-126-26	17-69-07-N040	1200 n=l
17-126-27	17-69-07-N040	143 n=l
17-126-28	17-69-07-N040	250 n=l
17-126-30-T01	17-69-07-N040	239 n=l
17-126-31-T01	17-69-07-N040	295 n=l
17-126-32-T01	17-69-07-N040	390 n=l
17-126-33-T01	17-69-07-N040	244 n=l
17-126-33-T02	17-69-07-N040	296 n=l
17-126-35-T01	17-69-07-N040	263 n=l
17-126-36-T01	17-69-07-N040	149 n=l
17-126-37-T01	17-69-07-N040	155 n=l
17-126-38-T01	17-69-07-N040	162 n=l
17-126-39-T01	17-69-07-N040	187 n=l
17-126-40-T01	17-69-07-N040	310 n=l
17-126-41-TOI	17-69-07-N040	202 n=1
17-127-01	17-69-07-N040	2200 n=l
17-129-00	17-69-07-N040	446,0
17-129-01-T01	17-69-07-N040	499 n=l
17-129-01-T02	17-69-07-N040	525 n=l
17-129-01-T03	17-69-07-N040	598 n=l
17-129-01-T04	17-69-07-N040	705 n=l
17-129-01-T05	17-69-07-N040	324 n=l

- 23 046487

17-129-02	17-69-07-N040	877±650,71
17-129-03	17-69-07-N040	536,5±126,42
17-129-04	17-69-07-N040	595±372,39
17-129-05	17-69-07-N040	136,17±22,27
17-129-06	17-69-07-N040	566 п=1
17-129-07	17-69-07-N040	582 п=1
17-129-08	17-69-07-N040	516 п=1
17-129-09	17-69-07-N040	1092 п=1
17-129-10	17-69-07-N040	781 п=1
17-129-11	17-69-07-N040	912 п=1
17-129-12-Т01	17-69-07-N040	187±86,24
17-129-13-Т01	17-69-07-N040	248 п=1
17-129-14-Т01	17-69-07-N040	245,5±46,06
17-129-14-Т02	17-69-07-N040	318±27,44
17-129-15-Т01	17-69-07-N040	278 п=1
17-129-16-Т01	17-69-07-N040	263 п=1
17-129-17-Т01	17-69-07-N040	418 п=1
17-129-17-Т02	17-69-07-N040	369 п=1
17-129-17-ТОЗ	17-69-07-N040	312 п=1
17-129-18-Т01	17-69-07-N040	138,33±43,96
17-129-18-Т02	17-69-07-N040	334 п=1
17-129-18-ТОЗ	17-69-07-N040	202±92,96
17-129-18-Т04	17-69-07-N040	171,5±53,9
17-129-19-Т01	17-69-07-N040	754 п=1
17-129-19-Т02	17-69-07-N040	458 п=1
17-129-20-ТО 1	17-69-07-N040	213 п=1
17-129-21-Т01	17-69-07-N040	110,8±33,71
17-129-22-ТО 1	17-69-07-N040	53,7
17-129-23-Т01	17-69-07-N040	54,8
Ас-(17-129-23-Т01)	17-69-12-N004	8,9 п=1

Анализ связывания методом SPR

Эксперименты Biacore проводят, чтобы определить значения KD (нМ) для мономерных пептидов, связывающихся с гемопексиновым доменом человеческого белка МТ1 MMP14, (полученным от Merck Millipore).

Белок произвольно биотинилируют в PBS с использованием реагента EZ-Link ™ Sulfo-NHS-LC-LCбиотин (Thermo Fisher) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Белок подвергают тщательному обессоливанию для удаления несвязанного биотина с использованием спин-колонок в PBS.

Для анализа связывания пептидов используют прибор Biacore 3000 с чипом CM5 (GE Healthcare). Стрептавидин иммобилизуют на чипе с помощью стандартных химических методов присоединения аминов при 25°C с использованием HBS-N (10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4) в качестве рабочего буфера. Вкратце, поверхность карбоксиметилдекстрана активируют путем 7-минутной инъекции 0,4 M гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC)/0,1 M N-гидроксисукцинимида (NHS) в соотношении 1:1 при скорости потока 10 мкл/мин. Для улавливания стрептавидина белок разводят до 0,2 мг/мл в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5), улавливание проводят путем инъекции 120 мкл стрептавидина на активированную поверхность чипа. Оставшиеся активированные группы блокируют путем 7-минутной инъекции 1 М этаноламина (pH 8,5) и улавливают биотинилированный MT1 MMP14 до уровня 12001800 RU. Буфер заменяют на PBS/0,05% Твин 20 и осуществляют серию разведений пептидов в этом буфере с конечной концентрацией ДМСО 0,5%. Максимальная концентрация пептида составляет 100 нМ с 6 дополнительными 2-кратными разведениями. Анализ SPR проводят при 25°C при скорости потока 50 мкл/мин, времени ассоциации 60 с и времени диссоциации от 400 до 1200 с в зависимости от индивидуального пептида. Данные корректируют с учетом влияния ДМСО. Все данные получают с использованием двойного контроля по пустым инъекциям и контрольной поверхности, с использованием стандартных методов, обработку данных и подгонку кинетических результатов проводят с использованием программного обеспечения Scrubber, версия 2.0c (программное обеспечение BioLogic). Данные подгоняют с ис

- 24 046487 пользованием простой модели связывания 1:1, учитывающей эффекты переноса массы, если это необходимо.

Результаты тестирования некоторых пептидных лигандов по настоящему изобретению с помощью вышеупомянутых анализов SPR и конкурентного связывания показаны в табл. 3.

Таблица 3. Результаты анализа выбранных пептидных лигандов настоящего изобретения _____________методами SPR и конкурентного связывания_____________

		Планшет 1	Планшет 2
Название бициклического фрагмента	KD (SPR)/hM	Ki (РР-соед,)/нМ	Ki (РР-соед,)/нМ
BCY1124	14,8	78	107
BCY1125	15,1
BCY3959	27,7
BCY9933	30,7
BCY9934	36,9
BCY9935	39,2
BCY9936	38		is*
BCY9937	77,8
BCY9938	80,9
BCY9943	299
BCY9945	1360
BCY9946	372
BCY9949	190
BCY9951	364
BCY9952	870
BCY9953	296
BCY9954	28,3
BCY9955	73,5
BCY9957	304,2
BCY9959	5,87
BCY9960	72,7
BCY9961	13000
BCY9963	7100
BCY9964	35
BCY9965	77,6
BCY9966	240
BCY9968	163
BCY10223	400
BCY10224	97,8
BCY9965		76
BCY11147		53
BCY11148		45
BCY11149		80
BCY11150		396	Ж*.
BCY11151		35
BCY11152		68
BCY11153		43
BCY11154		129

- 25 046487

BCY11155		459
BCY11163		54
BCY11158		124
BCY11160	—	—	289
BCY11165	—	—	72
BCY11166			92
BCY11167			135
BCY10288	52,5
BCY12401	10,834
BCY12402	8,9004
BCY12403	56,125
BCY12404	27,44
BCY12405	14,7

In vivo тестирование эффективности BT17BDC58 в отношении лечения ксенотрансплантата HT1080 у голых мышей BALB/c

1. Цель исследования

Целью данного исследования является анализ in vivo противоопухолевой эффективности BT17BDC58 в отношении лечения модели ксенотрансплантата HT1080 у голых мышей BALB/c.

2. Схема эксперимента

Гр.	Обработка	Доза (мг/кг)	η	Объем дозы (мкл/г)	Способ введения	Схема
1	Среда	-	3	10	в.в.	biw*2 нед.
2	BT17BDC58	1	3	10	в.в.	biw*2 нед.
3	BT17BDC58	3	3	10	в.в.	biw*2 нед.
4	BT17BDC58	10	3	10	в.в.	biw*2 нед.

Примечание: n - число животных;

Объем дозы - объем дозы корректируют по массе тела 10 мкл/г;

biw - дважды в неделю.

3. Материалы

3.1 Животные и условия их содержания

3.1.1. Животные

Вид: Mus Musculus

Штамм: Balb/c голые

Возраст: 6-8 недель

Пол: женский

Масса тела: 18-22 г

Количество животных: 21 мышь плюс запас

Поставщик животных: Shanghai LC Laboratory Animal Co., LTD.

3.1.2. Условия содержания

Мышей держат в индивидуальных вентилируемых клетках при постоянной температуре и влажности по 3 животных в каждой клетке.

Температура: 20-26°C.

Влажность: 40-70%.

Клетки: Изготовлены из поликарбоната. Размер 300 мм х 180 мм х 150 мм. В качестве подстилки используют кукурузные початки, которые меняют два раза в неделю.

Рацион: животные имеют свободный доступ к стерилизованному облучением сухому гранулированному корму в течение всего периода исследования.

Вода: животные имеют свободный доступ к стерильной питьевой воде.

Идентификация клетки: идентификационные этикетки для каждой клетки содержат следующую информацию: количество животных, пол, линия, дата получения, обработка, номер исследования, номер группы и дата начала лечения.

Идентификация животных: животных метят путем маркирования ушей.

3.2 Экспериментальные образцы и образцы положительных контролей

Идентификация продукта: BT17BDC58

Производитель: Bicycle Therapeutics

Номер лота: 1

- 26 046487

Физические характеристики: лиофилизированный порошок

Молекулярная масса: 7,6 мг

Чистота: 98,36%

Упаковка и условия хранения: хранят при -80°C.

4. Экспериментальные методы и процедуры

4.1 Культивирование клеток

Опухолевые клетки HT1080 поддерживают in vitro в виде однослойной культуры в среде, содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки при 37°C в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2. Опухолевые клетки традиционно субкультивируют дважды в неделю путем обработки трипсином-ЭДТА. Клетки, растущие в фазе экспоненциального роста, собирают и считают, после чего проводят инокуляцию опухоли.

4.2 Инокуляция опухоли

Каждой мыши подкожно в правый бок инокулируют опухолевые клетки HT1080 (5x 10⁶) в 0,2 мл PBS для развития опухоли. 21 животное произвольно распределяют по группам, когда средний объем опухоли достигает 174 мм³. Введение тестируемого вещества и количество животных в каждой группе показаны в таблице Схема эксперимента.

4.3 Получение композиции тестируемого вещества

Обработка	Доза (мг/мл)	Композиция
Среда	-	25 мМ гистидин pH 7,0, 10% сахароза (в отсутствии ДМСО)
BT17BDC58	1	Растворяют 7,6 мг BT17BDC58 в 7,475 мл буфера для разведения композиции
BT17BDC58	0,3	Разводят 240 мкл раствора BT17BDC58, 1 мг/мл, в 560 мкл буфера для разведения композиции
BT17BDC58	ОД	Разводят 80 мкл раствора BT17BDC58, 1 мг/мл, в 720 мкл буфера для разведения композиции

4.4 Наблюдения

Все процедуры исследования, связанные с обращением с животными, уходом за животными и лечением животных, проводят в соответствии с руководствами, утвержденными Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) WuXi AppTec, следуя указаниям Международной ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC). Во время рутинного мониторинга животных ежедневно проверяют на влияние роста опухоли и лечения на нормальное поведение, такое как подвижность, потребление пищи и воды (только визуально), прибавку/потерю массы тела, появление тусклых глаз/свалявшейся шерсти и любые другие аномальные эффекты, указанные в протоколе. Смерть и наблюдаемые клинические симптомы регистрируют на основе числа животных в каждой подгруппе.

4.5 Измерения опухоли и результаты

Основным результатом является наблюдаемая задержка роста опухоли или вылечивание мышей. Объем опухоли измеряют три раза в неделю в двух измерениях с помощью штангенциркуля, объем выражают в мм³ по формуле:

V=0,5axb², где a и b обозначают длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Затем размер опухоли используют для расчета значения T/C. Значение T/C (в процентах) указывает на противоопухолевую эффективность; Т и С - средние объемы опухолей в экспериментальной и контрольной группах, соответственно, в конкретный день.

TGI рассчитывали для каждой группы по формуле:

TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100;

Ti обозначает средний объем опухоли в экспериментальной группе в конкретный день, T0 обозначает средний объем опухоли в экспериментальной группе в день начала лечения, Vi обозначает средний объем опухоли в контрольной группе, получающей среду, в день определения Ti, и V0 обозначает средний объем опухоли в группе, получающей среду, в день начала лечения.

4.6 Сбор образцов

В конце исследования плазму собирают через 5, 15, 30, 60 и 120 мин после введения дозы.

4.7 Статистический анализ

Итоговая статистика, включающая среднее значение и стандартную ошибку среднего значения (SEM), предоставляется для оценки объема опухоли в каждой группе в каждый момент времени.

Статистический анализ различия в объеме опухоли среди разных групп проводят на основе данных, полученных в лучший терапевтический момент времени после введения последней дозы.

-

Claims

Для сравнения объема опухоли среди разных групп проводят односторонний ANOVA, после получения значимой F-статистики (отношение дисперсии экспериментальных результатов к дисперсии ошибок) проводят сравнение разных групп с помощью теста Геймса-Хауэлла. Все данные анализируют с помощью Prism. Значения, соответствующие Р<0,05, считают статистически значимыми.

5. Результаты

5.1 Изменение массы тела и кривая роста опухоли

Масса тела и рост опухоли показаны на фиг. 1.

5.2 Регистрация объема опухоли

Средний объем опухоли с течением времени у самок голых мышей Balb/c, несущих ксенотрансплантат HT1080, показан в табл. 4.

Таблица 4. Регистрация объема опухоли с течением времени

Обработка Число дней после начала лечения

0 2 4 7 9 И 14

Среда, biw 174±1 8 318±30 473±31 688±87 859±148 975±167 1075±164

BT17BDC58, 1 мг/кг, biw 174±2 2 265±46 351±69 488±75 577±62 676±79 785±58

BT17BDC58, 3 мг/кг, biw 174±2 5 151=1=16 73±19 42±11 50±4 67±9 128=1=16

BT17BDC58, 10 мг/кг, biw 173±2 5 153±29 58±20 27±1 18±4 10±1 2±2

5.3 Анализ ингибирования роста опухоли

Скорость ингибирования роста опухоли под действием BT17BDC58 у модели ксенотрансплантата HT1080 рассчитывают на основании измерений объема опухоли на 14 день после начала лечения.

Таблица 5. Анализ ингибирования роста опухоли

Гр- Обработка Объем опухоли (мм³)^а Т/С^ь (%) TGI (%) Р-значение

1 Среда, biw 1075±164 - - -

2 BT17BDC58, 1 мг/кг, biw 785±58 73 32 р>0,05

3 BT17BDC58, 3 мг/кг, biw 128±16 12 105 р<0,001

4 BT17BDC58, 10 мг/кг, biw 2±2 0,2 119 р<0,001

a) Среднее значение±SEM.

b) Ингибирование роста опухоли рассчитывают путем деления среднего объема опухоли в экспериментальной группе на средний объем опухоли в контрольной группе (T/C).

6. Результаты и их обсуждение

В данном исследовании оценивают терапевтическую эффективность BT17BDC58 на модели ксенотрансплантата HT1080. Измеренные значения массы тела и объема опухоли во всех экспериментальных группах в разные моменты времени показаны на фиг. 1 и в табл. 4 и 5.

Средний размер опухоли у мышей, получающих среду, достигает 1075 мм³ на 14 день.

BT17BDC58 в дозах 1 мг/кг (TV=785 мм³, TGI=32,2%, p>0,05), 3 мг/кг (TV=128 мм³, TGI=105,1%, p<0,001) и 10 мг/кг (TV=2 мм³, TGI=84,3%, p<0,001) проявляет дозозависимую противоопухолевую активность. Среди них BT17BDC58 в дозе 10 мг/кг вызвает полную ремиссию 2/3 опухолей и регрессию 1/3 опухоли до 7 мм³ на 14 день.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептидный лиганд, специфичный к МТ1-ММР, содержащий полипептид, содержащий по меньшей мере три остатка цистеина, разделенных по меньшей мере двумя петлеобразными последовательностями, и молекулярный каркас, который образует ковалентные связи с остатками цистеина полипептида с получением по меньшей мере двух полипептидных петель на молекулярном каркасе, где указанный молекулярный каркас представляет собой 1,1',1''-(1,3,5-триазинан-1,3,5-триил)трипроп-2-ен-1-он (ТАТА), и указанный пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

- 28 046487

CEESFYPECDHC (SEQ ID NO:1);

CPDLCLDLFPNC (SEQ ID NO:2);

CPELCVDLYPHC (SEQ ID NO:3);

CHPEWVSCEFHC (SEQ ID NO:4);

CSHECALLFPKTC (SEQ ID NO: 5);

CFDECQLLFPKTC (SEQ ID NO: 6);

CLDECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 7);

CREECMLLFPKTC (SEQ ID NO: 8);

CETECALLFPRSC (SEQ ID NO: 9);

CADECRLLFPKTC (SEQ ID NO:10);

CDVECRLLFPRSC (SEQ ID NO:11);

CIDECRLLFPRSC (SEQ ID NO:12);

CVRECALLFPKTC (SEQ ID NO:13);

CV[HArg]ECALLFPKTC (SEQ ID NO: 14);

CVRECALLFPRTC (SEQ ID NO: 15);

CVRECALLFP[HArg]TO (SEQ ID NO: 16);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]TO (SEQ ID NO: 17);

CV[HArg]ECALLFPATC (SEQ ID NO: 18);

CVAECALLFP[HArg]TO (SEQ ID NO: 19);

CVTECQLLFPKTC (SEQ ID NO:20);

CRHECELLFPKTC (SEQ ID NO:21);

CQRECALLFPKTC (SEQ ID NO:22);

CVRECTLLFPKTC (SEQ ID NO:23);

CTIECALLFPKTC (SEQ ID NO:24);

- 29 046487

CARECALLFPKTC (SEQ ID NO: 25) ;

CINECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 26) ;

CYTECSLLFPKTC (SEQ ID NO: 27) ;

CHEECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 28) ;

CLEECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 29) ;

CIDECALLFPRTC (SEQ ID NO: 30) ;

CYEECRLLFPRTC (SEQ ID NO: 31) ;

CVRECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 32) ;

CHIECALLFPKTC (SEQ ID NO: 33) ;

CKRECMLLFPKTC (SEQ ID NO: 34) ;

CYRECALLFPKTC (SEQ ID NO: 35) ;

CLTECALLFPKTC (SEQ ID NO: 36) ;

CEVECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 37) ;

CEAECRLLFPKTC (SEQ ID NO: 38) ;

CVQECALLFPKTC (SEQ ID NO: 39) ;

CIRECSLLFPKTC (SEQ ID NO: 40) ;

CVTECALLFPKTC (SEQ ID NO: 41) ;

CVAECKLLFPKTC (SEQ ID NO: 42) ;

CVGECALLFPKTC (SEQ ID NO: 43) ;

CWECALLFPKTC (SEQ ID NO: 44) ;

CVFECALLFPKTC (SEQ ID NO: 45) ;

CA[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 46);

CVfHArg]ECALLFA[HArg]TC (SEQ ID NO: 47);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]AC (SEQ ID NO: 48);

CV[HArg]ECALL[INal]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 49);

CV[HArg]ECALL[Cha]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 50);

CV[HArg]ECALLF[Pip][HArg]TC (SEQ ID NO: 51);

CV[HArg]ECALLFP[HArg]SC (SEQ ID NO: 52);

CV[HArg]ECALLFP[HArg][HSer]C (SEQ ID NO: 53);

CV[HArg]ECALLF[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 54);

CV[HArg]EC[Aib]LLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 55);

CV[HArg]ECAL[Nie]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 56);

CV[HArg]ECA[tBuAla]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 57)

CV[HArg]ECA[Nle]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 58);

CV[Aad2]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 59);

- 30 046487

CP[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 60);

CV[HArg]ECALL[4FlPhe]P[HArg]TC (SEQ NO: 61);

CV[HArg]ECAL[tBuGly]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 62);

CV[HArg]ECAL[Cha]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 63);

CV[HArg]ECALL[2Nal]P[HArg]TC (SEQ ID NO: 64);

CV[HArg]ECALLFP[HArg][HyV]C (SEQ ID NO: 65);

C[tBuGly][HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 66);

CVEECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 67);

CV[HArg]EGA[Cpa]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 68);

CV[HArg]EGA[Cba]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 69);

CV[HArg]ЕСА[C5A]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 70);

CV[HArg]EGA[Cha]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 71);

CV[HArg]ECA[tBuGly]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 72);

CV[HArg]ECALLF[Cis-HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 73);

CV[HArg]ECAL[Cpa]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 74);

CV[HArg]ECAL[C5A]FP[HArg]TC (SEQ ID NO: 75);

CV[HArg]ECA[tBuAla]LF[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 76);

CV[HArg]EGA[tBuAla][tBuGly]F[HyP][HArg]TC (SEQ ID NO: 77);

C[tBuGly][HArg]ECA[tBuAla]LFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 78);

CSSWDKLMCHPYC (SEQ ID NO: 79) ;

CPEECFYLPPHPMSC (SEQ ID NO: 80) ;

CPQECFYLPGHSLYC (SEQ ID NO: 81) ;

CPGECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO:82);

CPGECFYPTNHPLYC (SEQ ID NO:83);

CPQECFYPIGHPLAC (SEQ ID NO:84);

CPEECFYPPGHKLHC (SEQ ID NO:85) ;

CPQECFYPPGHRLRC (SEQ ID NO: 8 6) ;

CPQECFYPPGHPYHC (SEQ ID NO:87);

CPQECFYPSTHPLYC (SEQ ID NO:88);

CPGECFYPSNHRLYC (SEQ ID NO:89) ;

CPDECFYPPEHPLAC (SEQ ID NO:90);

CPGECFYPPGHHLSC (SEQ ID NO:91);

CPGECFYPPGHHLGC (SEQ ID NO:92);

CPEECFYPPNHPLYC (SEQ ID NO:93);

CPGECFYPPDHPLYC (SEQ ID NO:94);

- 31 046487

CPGECFYPPGHPLYC (SEQ ID NO: 95) ;

CPGECFYPPNHPFYC (SEQ ID NO: 96) ;

CPGECFYPPNHPLYC (SEQ ID NO: 97) ;

CPEECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 98) ;

CWMECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 99) ;

CFEECFYPPGHPLAC (SEQ ID NO: 10 0) ;

CPGECFYPPGHPLRC (SEQ ID NO: 101);

CPGECFYPPGHPREC (SEQ ID NO: 102) ;

CPGECFYPPGHRFHC (SEQ ID NO: 103) ;

CPGECFYPPGHRLYC (SEQ ID NO: 104) ;

CEEEFYPCGHPLYVC (SEQ ID NO: 105) ;

CEEQFYPCTHALYTC (SEQ ID NO: 10 6);

CVEEFYPCDHPLYSC (SEQ ID NO: 107) ;

CEEEFYPCGHPMHPC (SEQ ID NO: 10 8);

CDEQFYPCHHRLYSC (SEQ ID NO: 10 9) ;

CEEEFYPCGHPFHPC (SEQ ID NO: 110);

CLEQFYPCEHPLFSC (SEQ ID NO: ill) ;

CVEQFYPCGHRHYIC (SEQ ID NO: 112) ;

CEEQFYPCSHPLYTC (SEQ ID NO: 113);

CEEQFYPCNHPLNVC (SEQ ID NO: 114);

CEEEFYPCSHPLNPC (SEQ ID NO: 115) ;

CEEQFYPCGHKLSPC (SEQ ID NO: 11 6) ;

CPEQFYPCDHRLYIC (SEQ ID NO: 117) ;

CQEQFYPCNHPLSPC (SEQ ID NO: 118 ) ;

CDEQFYPCNHRLNTC (SEQ ID NO: 119) ;

CEEAFYPCHHPLYRC (SEQ ID NO: 120) ;

CDEDFYPCGHYLNQC (SEQ ID NO: 121) ;

CEEQFYPCTHPLYVC (SEQ ID NO: 122) ;

CPEQFYPCTHRLYQC (SEQ ID NO: 12 3) ;

CEEQFYPCSHPLYRC (SEQ ID NO: 12 4) ;

CAEQFYPCDHPLYRC (SEQ ID NO: 12 5) ;

CAEEFYPCDHPLYRC (SEQ ID NO: 12 6) ;

CEEAFYPCNHPLYTC (SEQ ID NO: 127) ;

CAEAFYPCDHPLYVC (SEQ ID NO: 128) ;

CEEAFYPCSHPLFIC (SEQ ID NO: 129) ;

CEEAFYPCSHPLHPC (SEQ ID NO: 130) ;

CEEAFYPCSHPLFVC (SEQ ID NO: 131) ;

CEEQFYPCSHPLYSC (SEQ ID NO: 132) ;

CEEAFYPCEHPLYMC (SEQ ID NO: 133) ;

CEEQFYPCNHPLYMC (SEQ ID NO: 134) ;

CLEQFYPCGDPRLC (SEQ ID NO: : 135);

CEEQFYPCGHHLLC (SEQ ID NO: : 136) ;

CLEPDECFYPMEC (SEQ ID NO: 137) ;

CKEPQECFYPLKC (SEQ ID NO: 138); и

CDSPEECFYPLEC (SEQ ID NO: 139) ;

где Aad обозначает альфаА-аминоадипиновую кислоту, Aib обозначает аминоизомасляную кисло- 32 046487 ту, С5а обозначает бета-циклопентил-к-аланин, Cba обозначает β-циклобутилаланин, Cha обозначает 3циклогексил-к-аланин, Сра обозначает бета-циклопентил-к-аланин, 4FlPhe обозначает 4-фтор-кфенилаланин, HArg обозначает гомоаргинин, НуР обозначает гидроксипролин, HyV обозначает 3гидрокси-к-валин, HSer обозначает гомосерин, 1Nal обозначает 1-нафтилаланин, 2Nal обозначает 2нафтилаланин, Nle обозначает норлейцин, Pip обозначает пипеколиновую кислоту, tBuAla обозначает тбутилаланин, tBuGly обозначает т-бутилглицин.
2. Пептидный лиганд по п.1, где пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой CV[HArg]ECALLFP[HArg]TC (SEQ ID NO: 17).
3. Пептидный лиганд по п.1, где пептидный лиганд содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

A-(SEQ ID NO: 1)-А (обозначаемой здесь как 17-108-02);

A-(SEQ ID NO: 2)-А (обозначаемой здесь как 17-111-01);

A-(SEQ ID NO: 3)-А (обозначаемой здесь как 17-111-02);

A-(SEQ ID NO: 4)-А (обозначаемой здесь как 17-116-01);

A-(SEQ ID NO: 5)-А (обозначаемой здесь как 17-120-00);

A-(SEQ ID NO: 6)-А (обозначаемой здесь как 17-120-01);

A-(SEQ ID NO: 7)-А (обозначаемой здесь как 17-120-02);

A-(SEQ ID NO: 8)-А (обозначаемой здесь как 17-120-03);

A-(SEQ ID NO: 9)-А (обозначаемой здесь как 17-120-04);

A-(SEQ ID NO: 10)-А (обозначаемой здесь как 17-120-05);

A-(SEQ ID NO: 11)-А (обозначаемой здесь как 17-120-07);

A-(SEQ ID NO: 12)-А (обозначаемой здесь как 17-120-08);

APPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т01);

QISP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-T02);

ALPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-T03 и BCY1124);

Ac-ALPP-(SEQ ID NO: 13) (обозначаемой здесь как Ас-(17-120-09-Т03) и BCY1125);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 13) (обозначаемой здесь как Sar3-A-(17-120-09-T03));

GPPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т04);

SPPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т05);

NPPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т06);

EPPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т07);

HPPP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т08);

APNP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т09);

APDP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т10);

APLP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т11);

APAP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т12);

APHP-(SEQ ID NO: 13)-А (обозначаемой здесь как 17-120-09-Т13);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 14) (обозначаемой здесь как Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg2);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 15) (обозначаемой здесь как Sar3-A-(17-120-09-Т03) Arg9);

Sar3-ALPP-(SEQ ID NO: 16) (обозначаемой здесь как Sar3-A-(17-120-09-T03) HArg9);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 HArg9);

Ac-(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как Ac-(B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09T03) HArg2 HArg9);

ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY3959);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY9933);

[Ac]APP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY9934);

[Ac]LAP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY9935);

[Ac]LPA-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY9936);

[Ac]-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY9968);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY11147);

[Ac]LPY-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY11148);

[Ac][dA]PP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY11165);

[Ac]L[dA]P-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY11166);

[Ac]LP[dA]-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как BCY11167);

ALPP-(SEQ ID NO: 17)-А (обозначаемой здесь как BCY10288);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 17) (обозначаемой здесь как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 HArg9);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 18) (обозначаемой здесь как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) HArg2 Ala9);

(B-Ala)-Sar10-ALPP-(SEQ ID NO: 19) (обозначаемой здесь как (B-Ala)-Sar10-A-(17-120-09-T03) Ala2 HArg9);

- 33 046487

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 19) (обозначаемой здесь как BCY9938); APMP-(SEQ ID NO: 20)-А (обозначаемой здесь как 17-120-10-T01); APSP-(SEQ ID NO: 21)-А (обозначаемой здесь как 17-120-11-T01); AALP-(SEQ ID NO: 22)-А (обозначаемой здесь как 17-120-12-T01); ALDP-(SEQ ID NO: 23)-А (обозначаемой здесь как 17-120-13-T01); ADRP-(SEQ ID NO: 24)-А (обозначаемой здесь как 17-120-14-Т01); ATQP-(SEQ ID NO: 25)-А (обозначаемой здесь как 17-120-15-T01); SPPP-(SEQ ID NO: 25)-А (обозначаемой здесь как 17-120-15-T02); ARHP-(SEQ ID NO: 26)-А (обозначаемой здесь как 17-120-16-T01); ALPP-(SEQ ID NO: 27)-А (обозначаемой здесь как 17-120-17-T01); A-(SEQ ID NO: 28)-А (обозначаемой здесь как 17-120-18);

A-(SEQ ID NO: 29)-А (обозначаемой здесь как 17-120-19);

A-(SEQ ID NO: 30)-А (обозначаемой здесь как 17-120-20);

A-(SEQ ID NO: 31)-А (обозначаемой здесь как 17-120-21); APPP-(SEQ ID NO: 31)-А (обозначаемой здесь как 17-120-21-T01); APSP-(SEQ ID NO: 32)-А (обозначаемой здесь как 17-120-22-T01); PLPP-(SEQ ID NO: 32)-А (обозначаемой здесь как 17-120-22-T02); APAP-(SEQ ID NO: 33)-А (обозначаемой здесь как 17-120-23-T01); AVEP-(SEQ ID NO: 34)-А (обозначаемой здесь как 17-120-24-T01); AEPA-(SEQ ID NO: 35)-А (обозначаемой здесь как 17-120-25-T01); ASPP-(SEQ ID NO: 36)-А (обозначаемой здесь как 17-120-26-T01); AAPP-(SEQ ID NO: 37)-А (обозначаемой здесь как 17-120-27-T01); APPP-(SEQ ID NO: 38)-А (обозначаемой здесь как 17-120-28-T01); AVPP-(SEQ ID NO: 39)-А (обозначаемой здесь как 17-120-29-T01); SPPP-(SEQ ID NO: 40)-А (обозначаемой здесь как 17-120-30-T01); HLPP-(SEQ ID NO: 41)-А (обозначаемой здесь как 17-120-31-T01); RLPP-(SEQ ID NO: 41)-А (обозначаемой здесь как 17-120-31-T02); APPP-(SEQ ID NO: 41)-А (обозначаемой здесь как 17-120-31-T03); MPPP-(SEQ ID NO: 42)-А (обозначаемой здесь как 17-120-32-T01); SPPP-(SEQ ID NO: 43)-А (обозначаемой здесь как 17-120-33-T01); APPP-(SEQ ID NO: 44)-А (обозначаемой здесь как 17-120-34-T01); APPP-(SEQ ID NO: 45)-А (обозначаемой здесь как 17-120-35-T01); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 46) (обозначаемой здесь как BCY9937); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 47) (обозначаемой здесь как BCY9943); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 48) (обозначаемой здесь как BCY9945); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 49) (обозначаемой здесь как BCY9946); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 50) (обозначаемой здесь как BCY9949); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 51) (обозначаемой здесь как BCY9951); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 52) (обозначаемой здесь как BCY9952); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 53) (обозначаемой здесь как BCY9953); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 54) (обозначаемой здесь как BCY9954); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 55) (обозначаемой здесь как BCY9955); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 56) (обозначаемой здесь как BCY9957); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемой здесь как BCY9959);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемой здесь как BCY12401); [Ac]EYP-(SEQ ID NO: 57) (обозначаемой здесь как BCY12405); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 58) (обозначаемой здесь как BCY9960); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 59) (обозначаемой здесь как BCY9961); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 60) (обозначаемой здесь как BCY9963); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 61) (обозначаемой здесь как BCY9964); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 62) (обозначаемой здесь как BCY9965); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 63) (обозначаемой здесь как BCY9966); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 64) (обозначаемой здесь как BCY10223); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 65) (обозначаемой здесь как BCY10224); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 66) (обозначаемой здесь как BCY11149); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 67) (обозначаемой здесь как BCY11150); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 68) (обозначаемой здесь как BCY11151); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 69) (обозначаемой здесь как BCY11152); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 70) (обозначаемой здесь как BCY11153); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 71) (обозначаемой здесь как BCY11154); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 72) (обозначаемой здесь как BCY11155); [Ac]LPP-(SEQ ID NO: 73) (обозначаемой здесь как BCY11163);

- 34 046487

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 74) (обозначаемой здесь как BCY11158);

[Ac]LPP-(SEQ ID NO: 75) (обозначаемой здесь как BCY11160);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 76) (обозначаемой здесь как BCY12402);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 77) (обозначаемой здесь как BCY12403);

[Ac]LYP-(SEQ ID NO: 78) (обозначаемой здесь как BCY12404);

A-(SEQ ID NO: 79)-А (обозначаемой здесь как 17-121-00);

A-(SEQ ID NO: 80)-А (обозначаемой здесь как 17-127-01);

A-(SEQ ID NO: 81)-А (обозначаемой здесь как 17-129-00);

SQT-(SEQ ID NO: 82)-А (обозначаемой здесь как 17-129-01-Т01);

SMT-(SEQ ID NO: 82)-А (обозначаемой здесь как 17-129-01-Т02);

SLV-(SEQ ID NO: 82)-А (обозначаемой здесь как 17-129-01-T03);

ISSYG-(SEQ ID NO: 82)-А (обозначаемой здесь как 17-129-01-T04);

ENITT-(SEQ ID NO: 82)-А (обозначаемой здесь как 17-129-01-T05);

A-(SEQ ID NO: 83)-А (обозначаемой здесь как 17-129-02);

A-(SEQ ID NO: 84)-А (обозначаемой здесь как 17-129-03);

A-(SEQ ID NO: 85)-А (обозначаемой здесь как 17-129-04);

A-(SEQ ID NO: 86)-А (обозначаемой здесь как 17-129-05);

A-(SEQ ID NO: 87)-А (обозначаемой здесь как 17-129-06);

A-(SEQ ID NO: 88)-А (обозначаемой здесь как 17-129-07);

A-(SEQ ID NO: 89)-А (обозначаемой здесь как 17-129-08);

A-(SEQ ID NO: 90)-А (обозначаемой здесь как 17-129-09);

A-(SEQ ID NO: 91)-А (обозначаемой здесь как 17-129-10);

A-(SEQ ID NO: 92)-А (обозначаемой здесь как 17-129-11);

L-(SEQ ID NO: 93)-НА (здесь обозначается как 17-129-12-Т01);

T-(SEQ ID NO: 94)-NA (обозначаемой здесь как 17-129-13-Т01);

Q-(SEQ ID NO: 95)-NA (обозначаемой здесь как 17-129-14-Т01);

A-(SEQ ID NO: 95)-NVI (обозначаемой здесь как 17-129-14-Т02);

N-(SEQ ID NO: 96)-NA (обозначаемой здесь как 17-129-15-Т01);

D-(SEQ ID NO: 97)-RA (обозначаемой здесь как 17-129-16-Т01);

SRM-(SEQ ID NO: 98)-А (обозначаемой здесь как 17-129-17-Т01);

SRS-(SEQ ID NO: 98)-А (обозначаемой здесь как 17-129-17-Т02);

RYMTR-(SEQ ID NO: 98)-А (обозначаемой здесь как 17-129-17-T03);

REE-(SEQ ID NO: 99)-А (обозначаемой здесь как 17-129-18-Т01);

DNM-(SEQ ID NO: 99)-А (обозначаемой здесь как 17-129-18-Т02);

QES-(SEQ ID NO: 99)-А (обозначаемой здесь как 17-129-18-T03);

ADY-(SEQ ID NO: 99)-А (обозначаемой здесь как 17-129-18-Т04);

MAN-(SEQ ID NO: 100)-А (обозначаемой здесь как 17-129-19-T01);

SQN-(SEQ ID NO: 100)-А (обозначаемой здесь как 17-129-19-T02);

A-(SEQ ID NO: 101)-TVL (обозначаемой здесь как 17-129-20-T01);

A-(SEQ ID NO: 102)-SWL (обозначаемой здесь как 17-129-21-T01);

A-(SEQ ID NO: 103)-LTE (обозначаемой здесь как 17-129-22-T01);

A-(SEQ ID NO: 104)-YSE (обозначаемой здесь как 17-129-23-T01);

Ac-(SEQ ID NO: 104)-YSE (обозначаемой здесь как Ас (17-129-23-T01));

A-(SEQ ID NO: 105)-А (обозначаемой здесь как 17-126-01);

A-(SEQ ID NO: 106)-А (обозначаемой здесь как 17-126-02);

A-(SEQ ID NO: 107)-А (обозначаемой здесь как 17-126-03);

A-(SEQ ID NO: 108)-А (обозначаемой здесь как 17-126-06);

A-(SEQ ID NO: 109)-А (обозначаемой здесь как 17-126-07);

A-(SEQ ID NO: 110)-А (обозначаемой здесь как 17-126-08);

A-(SEQ ID NO: 111)-А (обозначаемой здесь как 17-126-09);

A-(SEQ ID NO: 112)-А (обозначаемой здесь как 17-126-10);

A-(SEQ ID NO: 113)-А (обозначаемой здесь как 17-126-18);

A-(SEQ ID NO: 114)-А (обозначаемой здесь как 17-126-19);

A-(SEQ ID NO: 115)-А (обозначаемой здесь как 17-126-20);

A-(SEQ ID NO: 116)-А (обозначаемой здесь как 17-126-21);

A-(SEQ ID NO: 117)-А (обозначаемой здесь как 17-126-22);

A-(SEQ ID NO: 118)-А (обозначаемой здесь как 17-126-23);

A-(SEQ ID NO: 119)-А (обозначаемой здесь как 17-126-24);

A-(SEQ ID NO: 120)-А (обозначаемой здесь как 17-126-25);

Ac-A-(SEQ ID NO: 120)-А (обозначаемой здесь как Ас-(17-126-25));

A-(SEQ ID NO: 121)-А (обозначаемой здесь как 17-126-26);

A-(SEQ ID NO: 122)-А (обозначаемой здесь как 17-126-27);

-