EA046432B1 - VIRAL VECTORS ENCODING RECOMBINANT FVIII VARIANTS WITH INCREASED EXPRESSION FOR GENE THERAPY OF HEMOPHILIA A - Google Patents
VIRAL VECTORS ENCODING RECOMBINANT FVIII VARIANTS WITH INCREASED EXPRESSION FOR GENE THERAPY OF HEMOPHILIA A Download PDFInfo
- Publication number
- EA046432B1 EA046432B1 EA202092049 EA046432B1 EA 046432 B1 EA046432 B1 EA 046432B1 EA 202092049 EA202092049 EA 202092049 EA 046432 B1 EA046432 B1 EA 046432B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- factor viii
- sequence
- identity
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 title claims description 42
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 title claims description 34
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 title claims description 24
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 42
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title description 20
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 title description 17
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title description 4
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 415
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 414
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 406
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 231
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 228
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 220
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 220
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 220
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 208
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 205
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 204
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 79
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 19
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 claims description 17
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 claims description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims 6
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 110
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 101
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 71
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 25
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 24
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 15
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 15
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 12
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 11
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 11
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 9
- 108010025139 recombinant factor VIII SQ Proteins 0.000 description 9
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 7
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 6
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 6
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 6
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 4
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 3
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220497982 Coagulation factor VIII_T2105N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000006890 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010072388 Methyl-CpG-Binding Protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 208000011664 congenital factor XI deficiency Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- -1 see Graw et al. Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220494582 60S ribosomal protein L10_S202N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101800000112 Acidic peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101100437118 Arabidopsis thaliana AUG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010089996 B-domain-deleted factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- 102220498811 Coagulation factor VIII_A1610S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498795 Coagulation factor VIII_A1720V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498754 Coagulation factor VIII_A1798P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498204 Coagulation factor VIII_A1853T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498233 Coagulation factor VIII_A1939T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497985 Coagulation factor VIII_A2058P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497461 Coagulation factor VIII_A2220P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527758 Coagulation factor VIII_A303E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220510125 Coagulation factor VIII_A97P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526942 Coagulation factor VIII_C172W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498257 Coagulation factor VIII_C1877R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497550 Coagulation factor VIII_C2193G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497721 Coagulation factor VIII_C2345S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527983 Coagulation factor VIII_C348R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498781 Coagulation factor VIII_D1727V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498745 Coagulation factor VIII_D1788H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498032 Coagulation factor VIII_D2286G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497737 Coagulation factor VIII_D2307A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220510142 Coagulation factor VIII_D75E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498788 Coagulation factor VIII_E1701K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498209 Coagulation factor VIII_E1848G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498227 Coagulation factor VIII_E1894G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498222 Coagulation factor VIII_E1904D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515324 Coagulation factor VIII_E2018G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497558 Coagulation factor VIII_E2200D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220510141 Coagulation factor VIII_E72K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527732 Coagulation factor VIII_E98K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498769 Coagulation factor VIII_F1762L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498208 Coagulation factor VIII_F1804S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515392 Coagulation factor VIII_F1982I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497964 Coagulation factor VIII_F2120C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497929 Coagulation factor VIII_F2145C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498039 Coagulation factor VIII_F2279C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527152 Coagulation factor VIII_F455C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527141 Coagulation factor VIII_F484C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498245 Coagulation factor VIII_G1869D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498248 Coagulation factor VIII_G1872E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515630 Coagulation factor VIII_G1942A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515372 Coagulation factor VIII_G2000A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515367 Coagulation factor VIII_G2013R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515325 Coagulation factor VIII_G2022D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515313 Coagulation factor VIII_G2028R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515332 Coagulation factor VIII_G2045E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497965 Coagulation factor VIII_G2107S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497546 Coagulation factor VIII_G2198V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497738 Coagulation factor VIII_G2304V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497720 Coagulation factor VIII_G2344C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527147 Coagulation factor VIII_G474E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526688 Coagulation factor VIII_G705V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526698 Coagulation factor VIII_G710W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527393 Coagulation factor VIII_G720D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220510135 Coagulation factor VIII_G92A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498803 Coagulation factor VIII_H1066Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527717 Coagulation factor VIII_H113R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498193 Coagulation factor VIII_H1867P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515388 Coagulation factor VIII_H1973L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515407 Coagulation factor VIII_H1980P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497986 Coagulation factor VIII_H2101D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497902 Coagulation factor VIII_H2174D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527768 Coagulation factor VIII_H275L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498746 Coagulation factor VIII_I1782R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498223 Coagulation factor VIII_I1901F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515310 Coagulation factor VIII_I2051S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497989 Coagulation factor VIII_I2056N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497967 Coagulation factor VIII_I2117F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497553 Coagulation factor VIII_I2204T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497552 Coagulation factor VIII_I2209N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498038 Coagulation factor VIII_I2281T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497718 Coagulation factor VIII_I2336F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527753 Coagulation factor VIII_I307S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527965 Coagulation factor VIII_I405F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527156 Coagulation factor VIII_I438F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527131 Coagulation factor VIII_I522Y_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527305 Coagulation factor VIII_I585R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498813 Coagulation factor VIII_K1289Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498767 Coagulation factor VIII_K1751Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498195 Coagulation factor VIII_K1864E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527967 Coagulation factor VIII_K427I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511028 Coagulation factor VIII_K67E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526957 Coagulation factor VIII_L117F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498771 Coagulation factor VIII_L1771P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498764 Coagulation factor VIII_L1777P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498250 Coagulation factor VIII_L1875P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498251 Coagulation factor VIII_L1882P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515636 Coagulation factor VIII_L1951F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515634 Coagulation factor VIII_L1963P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497534 Coagulation factor VIII_L2229F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511030 Coagulation factor VIII_L26P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527302 Coagulation factor VIII_L594Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526739 Coagulation factor VIII_L644V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511020 Coagulation factor VIII_L69P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527390 Coagulation factor VIII_L725Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515631 Coagulation factor VIII_M1945V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515373 Coagulation factor VIII_M1966I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515366 Coagulation factor VIII_M2007I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497921 Coagulation factor VIII_M2143V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497471 Coagulation factor VIII_M2183R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526924 Coagulation factor VIII_M339T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526732 Coagulation factor VIII_M633I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526695 Coagulation factor VIII_M699T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527391 Coagulation factor VIII_M721I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498807 Coagulation factor VIII_N1460K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515387 Coagulation factor VIII_N1971T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497924 Coagulation factor VIII_N2148S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497923 Coagulation factor VIII_N2157D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527781 Coagulation factor VIII_N254I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527408 Coagulation factor VIII_N609I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526730 Coagulation factor VIII_N637D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526703 Coagulation factor VIII_N713I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498749 Coagulation factor VIII_P1780L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498741 Coagulation factor VIII_P1801A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497987 Coagulation factor VIII_P2067L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497920 Coagulation factor VIII_P2162L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497919 Coagulation factor VIII_P2172L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497549 Coagulation factor VIII_P2196R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497556 Coagulation factor VIII_P2224L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527132 Coagulation factor VIII_P540T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220510131 Coagulation factor VIII_P83R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498809 Coagulation factor VIII_P947R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498812 Coagulation factor VIII_Q1336K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498787 Coagulation factor VIII_Q1705H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497968 Coagulation factor VIII_Q2106E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497969 Coagulation factor VIII_Q2119R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497713 Coagulation factor VIII_Q2330P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527314 Coagulation factor VIII_Q584H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526708 Coagulation factor VIII_Q664P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498772 Coagulation factor VIII_R1740G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498777 Coagulation factor VIII_R1768H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498228 Coagulation factor VIII_R1888I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515370 Coagulation factor VIII_R2016P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497970 Coagulation factor VIII_R2109C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511039 Coagulation factor VIII_R22T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497744 Coagulation factor VIII_R2326G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497717 Coagulation factor VIII_R2339T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527399 Coagulation factor VIII_R437P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511026 Coagulation factor VIII_R48C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527143 Coagulation factor VIII_R490G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527410 Coagulation factor VIII_R602G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526701 Coagulation factor VIII_R717L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526947 Coagulation factor VIII_S138R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498751 Coagulation factor VIII_S1799H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498192 Coagulation factor VIII_S1858C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498229 Coagulation factor VIII_S1907C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515640 Coagulation factor VIII_S1965I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515394 Coagulation factor VIII_S1968R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511038 Coagulation factor VIII_S19R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497474 Coagulation factor VIII_S2192I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526953 Coagulation factor VIII_T137A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498790 Coagulation factor VIII_T1714S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515365 Coagulation factor VIII_T2004R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497922 Coagulation factor VIII_T2141N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497898 Coagulation factor VIII_T2173A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498033 Coagulation factor VIII_T2264A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527142 Coagulation factor VIII_T479R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526692 Coagulation factor VIII_T686R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498808 Coagulation factor VIII_V1012L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526956 Coagulation factor VIII_V147D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498249 Coagulation factor VIII_V1876L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515326 Coagulation factor VIII_V2035A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527780 Coagulation factor VIII_V220G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497538 Coagulation factor VIII_V2251A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527319 Coagulation factor VIII_V556D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527389 Coagulation factor VIII_V727F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498226 Coagulation factor VIII_W1908L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515369 Coagulation factor VIII_W2015C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498045 Coagulation factor VIII_W2290L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220497723 Coagulation factor VIII_W2332R_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511025 Coagulation factor VIII_W33G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527960 Coagulation factor VIII_W401G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527962 Coagulation factor VIII_W412G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527133 Coagulation factor VIII_W532G_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498786 Coagulation factor VIII_Y1699C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498212 Coagulation factor VIII_Y1802C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220498239 Coagulation factor VIII_Y1909C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515352 Coagulation factor VIII_Y1998C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220515327 Coagulation factor VIII_Y2036C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511032 Coagulation factor VIII_Y24C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220511033 Coagulation factor VIII_Y25C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527137 Coagulation factor VIII_Y492H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220527406 Coagulation factor VIII_Y605H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526714 Coagulation factor VIII_Y683C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220526675 Coagulation factor VIII_Y742C_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010000437 Deamino Arginine Vasopressin Proteins 0.000 description 1
- 102220467494 Drebrin_S553P_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 241000713858 Harvey murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 206010023230 Joint stiffness Diseases 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102220517722 Microtubule-associated protein 9_N601D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091007871 OBI1 Proteins 0.000 description 1
- 102100035702 ORC ubiquitin ligase 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102220475346 Protein MCM10 homolog_T541S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 101100273112 Pseudomonas aeruginosa cap8 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220515607 Pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase 2_T454I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 208000026552 Severe hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 1
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000019291 X-linked disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 229940004970 bebulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102200003990 c.1094A>G Human genes 0.000 description 1
- 102200077346 c.1706C>G Human genes 0.000 description 1
- 102220349309 c.1786T>C Human genes 0.000 description 1
- 102220348314 c.1916A>G Human genes 0.000 description 1
- 102220397813 c.2043G>C Human genes 0.000 description 1
- 102200003655 c.2044G>T Human genes 0.000 description 1
- 102220411728 c.386A>T Human genes 0.000 description 1
- 102220362037 c.535T>C Human genes 0.000 description 1
- 102200004515 c.5954G>A Human genes 0.000 description 1
- 102200004341 c.6245G>A Human genes 0.000 description 1
- 102220360075 c.755C>T Human genes 0.000 description 1
- 102220357454 c.968G>A Human genes 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004281 desmopressin Drugs 0.000 description 1
- NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N desmopressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSCCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(N)=O)=O)CCC(=O)N)C1=CC=CC=C1 NFLWUMRGJYTJIN-NXBWRCJVSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150030491 eltA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 1
- 101150002378 gC gene Proteins 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 208000011309 nasal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102200059332 rs104894339 Human genes 0.000 description 1
- 102220220610 rs1060502522 Human genes 0.000 description 1
- 102220229725 rs1064793080 Human genes 0.000 description 1
- 102200004529 rs111033613 Human genes 0.000 description 1
- 102200004507 rs111033615 Human genes 0.000 description 1
- 102200012057 rs111033728 Human genes 0.000 description 1
- 102220007423 rs111033806 Human genes 0.000 description 1
- 102220038599 rs114901298 Human genes 0.000 description 1
- 102200075150 rs118204110 Human genes 0.000 description 1
- 102220328783 rs1192969297 Human genes 0.000 description 1
- 102200001682 rs121434542 Human genes 0.000 description 1
- 102200039395 rs121908403 Human genes 0.000 description 1
- 102220003017 rs121909185 Human genes 0.000 description 1
- 102200011608 rs121913087 Human genes 0.000 description 1
- 102220315636 rs1224235194 Human genes 0.000 description 1
- 102220307703 rs1309129145 Human genes 0.000 description 1
- 102200004163 rs137852355 Human genes 0.000 description 1
- 102200003958 rs137852359 Human genes 0.000 description 1
- 102200004536 rs137852362 Human genes 0.000 description 1
- 102200003997 rs137852364 Human genes 0.000 description 1
- 102200004113 rs137852365 Human genes 0.000 description 1
- 102200004334 rs137852366 Human genes 0.000 description 1
- 102200005694 rs137852367 Human genes 0.000 description 1
- 102200004452 rs137852369 Human genes 0.000 description 1
- 102200004534 rs137852373 Human genes 0.000 description 1
- 102200004398 rs137852375 Human genes 0.000 description 1
- 102200005898 rs137852378 Human genes 0.000 description 1
- 102200005861 rs137852379 Human genes 0.000 description 1
- 102200005595 rs137852380 Human genes 0.000 description 1
- 102200005603 rs137852382 Human genes 0.000 description 1
- 102200005555 rs137852383 Human genes 0.000 description 1
- 102200005556 rs137852384 Human genes 0.000 description 1
- 102200005557 rs137852385 Human genes 0.000 description 1
- 102200005647 rs137852387 Human genes 0.000 description 1
- 102200005648 rs137852388 Human genes 0.000 description 1
- 102200005649 rs137852389 Human genes 0.000 description 1
- 102200005650 rs137852390 Human genes 0.000 description 1
- 102200005630 rs137852393 Human genes 0.000 description 1
- 102200005686 rs137852395 Human genes 0.000 description 1
- 102200003892 rs137852396 Human genes 0.000 description 1
- 102200003905 rs137852397 Human genes 0.000 description 1
- 102200003951 rs137852399 Human genes 0.000 description 1
- 102200003956 rs137852400 Human genes 0.000 description 1
- 102200003968 rs137852402 Human genes 0.000 description 1
- 102200003934 rs137852404 Human genes 0.000 description 1
- 102200003935 rs137852405 Human genes 0.000 description 1
- 102200003936 rs137852406 Human genes 0.000 description 1
- 102200004019 rs137852407 Human genes 0.000 description 1
- 102200003567 rs137852413 Human genes 0.000 description 1
- 102200003569 rs137852414 Human genes 0.000 description 1
- 102200003555 rs137852415 Human genes 0.000 description 1
- 102200003556 rs137852416 Human genes 0.000 description 1
- 102200003557 rs137852417 Human genes 0.000 description 1
- 102200003586 rs137852420 Human genes 0.000 description 1
- 102200003619 rs137852425 Human genes 0.000 description 1
- 102200003621 rs137852426 Human genes 0.000 description 1
- 102200003625 rs137852428 Human genes 0.000 description 1
- 102200003605 rs137852430 Human genes 0.000 description 1
- 102200003651 rs137852433 Human genes 0.000 description 1
- 102200003653 rs137852434 Human genes 0.000 description 1
- 102200003483 rs137852436 Human genes 0.000 description 1
- 102200004532 rs137852439 Human genes 0.000 description 1
- 102200004414 rs137852440 Human genes 0.000 description 1
- 102200004416 rs137852441 Human genes 0.000 description 1
- 102200004401 rs137852443 Human genes 0.000 description 1
- 102200004406 rs137852444 Human genes 0.000 description 1
- 102200004408 rs137852445 Human genes 0.000 description 1
- 102200004511 rs137852450 Human genes 0.000 description 1
- 102200004310 rs137852454 Human genes 0.000 description 1
- 102200004307 rs137852455 Human genes 0.000 description 1
- 102200004342 rs137852456 Human genes 0.000 description 1
- 102200004343 rs137852457 Human genes 0.000 description 1
- 102200004333 rs137852459 Human genes 0.000 description 1
- 102200004326 rs137852460 Human genes 0.000 description 1
- 102200004104 rs137852464 Human genes 0.000 description 1
- 102200004107 rs137852467 Human genes 0.000 description 1
- 102200004194 rs137852468 Human genes 0.000 description 1
- 102200004169 rs137852469 Human genes 0.000 description 1
- 102200004242 rs137852470 Human genes 0.000 description 1
- 102200004214 rs137852472 Human genes 0.000 description 1
- 102200004216 rs137852473 Human genes 0.000 description 1
- 102200003896 rs137852475 Human genes 0.000 description 1
- 102200005858 rs137852476 Human genes 0.000 description 1
- 102220083766 rs140130291 Human genes 0.000 description 1
- 102220237115 rs144457722 Human genes 0.000 description 1
- 102220049521 rs147445499 Human genes 0.000 description 1
- 102220257935 rs1553768963 Human genes 0.000 description 1
- 102220250061 rs1553967623 Human genes 0.000 description 1
- 102200042586 rs1555167156 Human genes 0.000 description 1
- 102220252081 rs1555491645 Human genes 0.000 description 1
- 102220344016 rs1556486551 Human genes 0.000 description 1
- 102200003471 rs1800291 Human genes 0.000 description 1
- 102200004544 rs1800294 Human genes 0.000 description 1
- 102200004239 rs1800297 Human genes 0.000 description 1
- 102200020355 rs193302866 Human genes 0.000 description 1
- 102220050400 rs193921060 Human genes 0.000 description 1
- 102200038648 rs199472805 Human genes 0.000 description 1
- 102220211907 rs201773300 Human genes 0.000 description 1
- 102200003488 rs2228152 Human genes 0.000 description 1
- 102200145057 rs2288022 Human genes 0.000 description 1
- 102200004001 rs28933668 Human genes 0.000 description 1
- 102200003714 rs28933671 Human genes 0.000 description 1
- 102200003721 rs28933672 Human genes 0.000 description 1
- 102200003494 rs28933673 Human genes 0.000 description 1
- 102200004442 rs28933674 Human genes 0.000 description 1
- 102200004443 rs28933675 Human genes 0.000 description 1
- 102200004444 rs28933676 Human genes 0.000 description 1
- 102200004450 rs28933678 Human genes 0.000 description 1
- 102200004435 rs28933680 Human genes 0.000 description 1
- 102200003688 rs28937272 Human genes 0.000 description 1
- 102200003591 rs28937282 Human genes 0.000 description 1
- 102200003485 rs28937285 Human genes 0.000 description 1
- 102200004419 rs28937289 Human genes 0.000 description 1
- 102200004457 rs28937294 Human genes 0.000 description 1
- 102200043618 rs28939677 Human genes 0.000 description 1
- 102220005505 rs34629158 Human genes 0.000 description 1
- 102200081916 rs35937854 Human genes 0.000 description 1
- 102200004318 rs369414658 Human genes 0.000 description 1
- 102220069767 rs374675592 Human genes 0.000 description 1
- 102200142073 rs3757370 Human genes 0.000 description 1
- 102200050876 rs386833825 Human genes 0.000 description 1
- 102220020432 rs397508288 Human genes 0.000 description 1
- 102220039983 rs397509318 Human genes 0.000 description 1
- 102200075211 rs397515524 Human genes 0.000 description 1
- 102220013575 rs397516675 Human genes 0.000 description 1
- 102220234476 rs398123325 Human genes 0.000 description 1
- 102220074175 rs533055438 Human genes 0.000 description 1
- 102200053954 rs57155193 Human genes 0.000 description 1
- 102220259498 rs576890188 Human genes 0.000 description 1
- 102200018333 rs587779605 Human genes 0.000 description 1
- 102220045310 rs587782000 Human genes 0.000 description 1
- 102220048789 rs587783439 Human genes 0.000 description 1
- 102200054009 rs59642296 Human genes 0.000 description 1
- 102220032689 rs63750007 Human genes 0.000 description 1
- 102220027460 rs63751656 Human genes 0.000 description 1
- 102200101882 rs72556296 Human genes 0.000 description 1
- 102220236487 rs72658864 Human genes 0.000 description 1
- 102200077474 rs72768728 Human genes 0.000 description 1
- 102220250587 rs748964205 Human genes 0.000 description 1
- 102200031604 rs750730042 Human genes 0.000 description 1
- 102220327085 rs750741214 Human genes 0.000 description 1
- 102200061426 rs760101382 Human genes 0.000 description 1
- 102200037525 rs761954844 Human genes 0.000 description 1
- 102220248333 rs763060505 Human genes 0.000 description 1
- 102200007223 rs772416503 Human genes 0.000 description 1
- 102220341238 rs776355907 Human genes 0.000 description 1
- 102220218311 rs780434261 Human genes 0.000 description 1
- 102200005953 rs7823979 Human genes 0.000 description 1
- 102200004168 rs782654096 Human genes 0.000 description 1
- 102200128229 rs80055610 Human genes 0.000 description 1
- 102220081821 rs863223969 Human genes 0.000 description 1
- 102220093759 rs876661252 Human genes 0.000 description 1
- 102220122334 rs886043064 Human genes 0.000 description 1
- 102220138164 rs886055667 Human genes 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Description
Уровень техникиState of the art
Коагуляция крови протекает посредством сложного и динамического биологического пути взаимозависимых биохимических реакций, называемого каскадом коагуляции. Фактор коагуляции VIII (FVIII) является ключевым компонентом каскада. Фактор VIII поступает в места кровотечения и образует комплекс Хазы с активированным Фактором IX (FIXa) и Фактором X (FX). Комплекс Хазы активирует FX, который, в свою очередь, активирует превращение протромбина в тромбин, который затем активирует другие компоненты в коагуляционном каскаде для создания стабильного тромба (см. Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192 (1999); Lenting et al., Blood, 92:3983-3996 (1998)).Blood coagulation occurs through a complex and dynamic biological pathway of interdependent biochemical reactions called the coagulation cascade. Coagulation factor VIII (FVIII) is a key component of the cascade. Factor VIII enters the bleeding sites and forms a Khaza complex with activated Factor IX (FIXa) and Factor X (FX). The Khaza complex activates FX, which in turn activates the conversion of prothrombin to thrombin, which then activates other components in the coagulation cascade to create a stable thrombus (See Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192 (1999 ); Lenting et al., Blood, 92:3983-3996 (1998)).
Гемофилия А представляет собой врожденное X-сцепленное расстройство свертывания крови, характеризующееся дефицитом активности фактора VIII. Уменьшенная активность фактора VIII ингибирует контур положительной обратной связи в каскаде коагуляции. Это приводит к неполной коагуляции, которая проявляется в виде случаев кровотечения с повышенной продолжительностью, обширного кровоподтека, спонтанным оральных и назальных кровотечений, суставной жесткостью и хронической болью и, возможно, внутреннего кровотечения и анемии в тяжелых случаях (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009)).Hemophilia A is a congenital X-linked blood clotting disorder characterized by a deficiency of factor VIII activity. Decreased factor VIII activity inhibits the positive feedback loop in the coagulation cascade. This results in incomplete coagulation, which manifests as cases of prolonged bleeding, extensive bruising, spontaneous oral and nasal bleeding, joint stiffness and chronic pain, and possibly internal bleeding and anemia in severe cases (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009).
Обычно при гемофилии А применяется заместительная терапия фактора VIII, которая состоит из введения белка фактора VIII (например, полученного из плазмы или рекомбинантно фактора VIII) человеку с гемофилией А. Фактор VIII вводится профилактически для предотвращения или уменьшения частоты случаев кровотечения, в ответ на эпизод острого кровотечения и/или периоперационно, чтобы кровотечение было управляемым во время операции. Однако существует несколько нежелательных особенностей заместительной терапии фактора VIII.Typically for hemophilia A, factor VIII replacement therapy is used, which consists of administering factor VIII protein (eg, plasma-derived or recombinant factor VIII) to a person with hemophilia A. Factor VIII is given prophylactically to prevent or reduce the incidence of bleeding events in response to an episode of acute bleeding. bleeding and/or perioperatively to ensure bleeding is controlled during surgery. However, there are several undesirable features of factor VIII replacement therapy.
Во-первых, заместительная терапия фактора VIII используется для лечения или контроля гемофилии А, но не излечивает лежащий в основе дефицит фактора VIII. Из-за этого люди с гемофилией А требуют заместительной терапии фактора VIII на протяжении всей своей жизни. Непрерывное лечение является дорогостоящим и требует от человека соблюдения строгого режима терапии, поскольку отсутствие приема лишь нескольких профилактических доз может иметь серьезные последствия для лиц с тяжелой формой гемофилии А.First, factor VIII replacement therapy is used to treat or control hemophilia A, but does not cure the underlying factor VIII deficiency. Because of this, people with hemophilia A require factor VIII replacement therapy throughout their lives. Continuous treatment is expensive and requires a person to adhere to a strict treatment regimen, since failure to take just a few prophylactic doses can have serious consequences for people with severe hemophilia A.
Во-вторых, поскольку фактор VIII имеет относительно короткий период полувыведения in vivo, традиционная профилактическая заместительная терапия фактора VIII требует введения каждый второй или третий день. Это налагает нагрузку на человека в виде соблюдения терапии на протяжении всей его жизни. В то время как препараты третьего поколения длительного действия фактора VIII могут снизить частоту введения, профилактическая заместительная терапия фактора FVIII с этими препаратами попрежнему требует ежемесячного, еженедельного или более частого применения в течение неограниченного срока. Например, профилактическое лечение с помощью ELOCTATE™ [Antihemophilic Factor (Recombinant), Fc Fusion Protein] требует введения каждые три-пять дней (ELOCTATE™ Prescriptioning Information, Biogen Idec Inc., (2015)). Более того, долгосрочные эффекты химически модифицированных биологических препаратов (например, пегилированных полипептидов) еще не полностью изучены.Second, because factor VIII has a relatively short half-life in vivo, traditional prophylactic factor VIII replacement therapy requires administration every second or third day. This places a burden on the individual to adhere to therapy throughout their life. While third-generation long-acting factor VIII agents may reduce the frequency of administration, prophylactic FVIII replacement therapy with these agents still requires monthly, weekly, or more frequent dosing indefinitely. For example, prophylactic treatment with ELOCTATE™ [Antihemophilic Factor (Recombinant), Fc Fusion Protein] requires administration every three to five days (ELOCTATE™ Prescription Information, Biogen Idec Inc., (2015)). Moreover, the long-term effects of chemically modified biologics (eg, PEGylated polypeptides) are not yet fully understood.
В-третьих, от 15% до 30% всех лиц, получающих заместительную терапию фактора VIII, образуют ингибирующие антитела к фактору VIII, что делает терапию неэффективной. Обходная терапия фактора VIII (например, введение комплексных концентратов протромбинового комплекса из плазмы или полученного рекомбинантно) можно использовать для лечения гемофилии у индивидуумов, у которых образуются ингибирующие антитела. Однако обходная терапия фактора VIII менее эффективна, чем заместительная терапия фактора VIII (Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1 (7) : 1349-55 (2003)) и может быть связана с повышенным риском сердечно-сосудистых осложнений (Luu and Ewenstein, Haemophilia, 10 Suppl. 2:10-16 (2004)).Third, 15% to 30% of all individuals receiving factor VIII replacement therapy develop inhibitory antibodies to factor VIII, rendering the therapy ineffective. Factor VIII bypass therapy (eg, administration of plasma-derived or recombinantly derived prothrombin complex concentrates) can be used to treat hemophilia in individuals who develop inhibitory antibodies. However, factor VIII bypass therapy is less effective than factor VIII replacement therapy (Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1 (7): 1349-55 (2003)) and may be associated with an increased risk of cardiovascular complications (Luu and Ewenstein, Haemophilia, 10 Suppl. 2:10-16 (2004)).
Соматическая генная терапия имеет большие перспективы в лечении гемофилии А, потому что она устраняет лежащую в основе недостаточную экспрессию фактора VIII (например, из-за миссенс- или нонсенс-мутаций), а не обеспечивает одноразовую дозу активности фактора VIII для индивида. Из-за этой разницы в механизме действия по сравнению с заместительной терапией фактора VIII однократное введение вектора генной терапии фактора VIII может в течение нескольких лет обеспечивать индивидуума фактором VIII, снижая затраты на лечение и устраняя необходимость в продолжении соблюдения терапии пациентом.Somatic gene therapy holds great promise in the treatment of hemophilia A because it addresses the underlying underexpression of factor VIII (eg, due to missense or nonsense mutations) rather than providing a one-time dose of factor VIII activity to an individual. Because of this difference in mechanism of action compared to factor VIII replacement therapy, a single administration of a factor VIII gene therapy vector can provide an individual with factor VIII for several years, reducing treatment costs and eliminating the need for continued patient compliance with therapy.
- 1 046432- 1 046432
Генная терапия фактора коагуляции IX (FIX) была эффективно использована для лечения людей с гемофилией В, связанного с ней состояния свертывания крови, характеризующегося сниженной активностью фактора IX (Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006)). Однако генная терапия фактора VIII имеет несколько уникальных проблем. Например, полноразмерный полипептид фактора VIII дикого типа (2351 аминокислота, номер доступа UniProt P00451) в пять раз больше, чем полноразмерный полипептид фактора IX дикого типа (461 аминокислота, номер доступа UniProt P00740). По существу, кодирующая последовательность фактора VIII дикого типа представляет собой 7053 пары оснований, которые слишком велики для вставки в векторы генной терапии AAV. Кроме того, наблюдаемая экспрессия рекомбинантных вариантов с удаленным В-доменом фактора VIII (BDD-FVIII) была низкой. Таким образом, несколько групп пытались изменить использование кодонов конструкций BDD-FVIII с ограниченным успехом.Coagulation factor IX (FIX) gene therapy has been used effectively to treat people with hemophilia B, an associated blood clotting condition characterized by reduced factor IX activity (Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006)). However, factor VIII gene therapy has several unique challenges. For example, the full-length wild-type Factor VIII polypeptide (2351 amino acids, UniProt accession number P00451) is five times larger than the full-length wild-type Factor IX polypeptide (461 amino acids, UniProt accession number P00740). Essentially, the wild-type factor VIII coding sequence is 7053 base pairs, which is too large to be inserted into AAV gene therapy vectors. In addition, the observed expression of factor VIII B domain deleted (BDD-FVIII) recombinant variants was low. Thus, several groups have attempted to modify the codon usage of BDD-FVIII constructs with limited success.
Краткое описание сущности изобретенияBrief description of the invention
Соответственно, существует потребность в вариантах фактора VIII, кодирующие последовательности которых более эффективно упаковываются и переносятся с помощью векторов генной терапии. Существует также потребность в синтетических нуклеиновых кислотах с измененными кодонами, которые экспрессируют фактор VIII более эффективно. Такие варианты фактора VIII и нуклеиновые кислоты с измененными кодонами, позволяют улучшить лечение дефицитов фактора VIII (например, гемофилии А). Вышеупомянутые недостатки и другие проблемы, связанные с лечением дефицитов фактора VIII (например, гемофилии А), снижаются или устраняются описанными вариантами фактора VIII с измененными кодонами.Accordingly, there is a need for factor VIII variants whose coding sequences are more efficiently packaged and transferred using gene therapy vectors. There is also a need for synthetic codon-altered nucleic acids that express factor VIII more efficiently. Such factor VIII variants and codon-altered nucleic acids may improve the treatment of factor VIII deficiencies (eg, hemophilia A). The above-mentioned disadvantages and other problems associated with the treatment of factor VIII deficiencies (eg, hemophilia A) are reduced or eliminated by the disclosed codon-altered variants of factor VIII.
В соответствии с некоторыми вариантами реализации данное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим варианты фактора VIII, которые имеют высокую идентичность последовательности с описанными последовательностями с измененными кодонами тяжелой цепи фактора VIII (например, CS01-HC-NA, CS04-HC-NA или CS23-HC-NA) и легкой цепи (CS01-LC-NA, CS04-LC-NA или CS23-LC-NA). В некоторых вариантах реализации изобретения эти нуклеиновые кислоты дополнительно содержат последовательность, кодирующую линкерную последовательность, которая заменяет нативный В-домен фактора VIII (например, линкерные последовательности, содержащие фуриновый сайт расщепления) между последовательностями, кодирующими тяжелые и легкие цепи фактора VIII.In some embodiments, the invention provides nucleic acids encoding Factor VIII variants that have high sequence identity to the reported Factor VIII heavy chain codon altered sequences (e.g., CS01-HC-NA, CS04-HC-NA, or CS23- HC-NA) and light chain (CS01-LC-NA, CS04-LC-NA or CS23-LC-NA). In some embodiments, these nucleic acids further comprise a sequence encoding a linker sequence that replaces the native Factor VIII B domain (eg, linker sequences containing a furin cleavage site) between the factor VIII heavy and light chain encoding sequences.
В одном аспекте данное изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3). Легкая цепь полипептида фактора FVIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4). Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления.In one aspect, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a factor VIII polypeptide. A factor VIII polypeptide contains a light chain, a heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3). The light chain of the factor FVIII polypeptide is encoded by a second nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4). The polypeptide linker contains a furin cleavage site.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полипептидный линкер кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью BDLO04 (SEQ ID NO: 6).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polypeptide linker is encoded by a third nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence of BDLO04 (SEQ ID NO: 6).
В одном аспекте данное изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24). Легкая цепь полипептида фактора FVIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25). Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления.In one aspect, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a factor VIII polypeptide. A factor VIII polypeptide contains a light chain, a heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24). The light chain of the factor FVIII polypeptide is encoded by a second nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25). The polypeptide linker contains a furin cleavage site.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полипептидный линкер кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью BDLO01 (SEQ ID NO: 5).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polypeptide linker is encoded by a third nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence of BDLO01 (SEQ ID NO: 5).
В одном аспекте данное изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь, тяжелую цепь и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22). Легкая цепь полипептида фактора FVIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23). Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления.In one aspect, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a factor VIII polypeptide. A factor VIII polypeptide contains a light chain, a heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22). The light chain of the factor FVIII polypeptide is encoded by a second nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23). The polypeptide linker contains a furin cleavage site.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полипептидный линкер кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью BDLO23 (SEQ ID NO: 7).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polypeptide linker is encoded by a third nucleotide sequence having at least 95% identity with the sequence of BDLO23 (SEQ ID NO: 7).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последоваIn one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence
- 2 046432 тельность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 96% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID N0: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 9 6% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID N0: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).- 2046432 The factor VIII polypeptide heavy chain encoding activity has at least 96% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 9-6% identity with the corresponding light chain sequence (e.g., CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 97% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID N0: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 97% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID N0: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide has at least 97% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC- NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 97% identity with the corresponding light chain sequence (e.g. CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 98% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID N0: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 98% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide has at least 98% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC- NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 98% identity with the corresponding light chain sequence (e.g. CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 99% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 99% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide has at least 99% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC- NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 99% identity with the corresponding light chain sequence (e.g. CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide has at least 99.5% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC- NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 99.5% identity with the corresponding light chain sequence (e.g. CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с соответствующей последовательностью тяжелой цепи (например, CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24) или CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII, имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с соответствующей последовательностью легкой цепи (например, CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) или CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide has at least 99.9% identity with the corresponding heavy chain sequence (e.g., CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), CS01-HC- NA (SEQ ID NO: 24) or CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22)), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide has at least 99.9% identity with the corresponding light chain sequence (e.g. CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25) or CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, представляет собой последовательность CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII представляет собой последовательность CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide is the sequence CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide is the sequence CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, представляет собой последовательность CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII представляет собой последовательность CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide is the sequence CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide is the sequence CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, первая нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь полипептида фактора VIII, представляет собой последовательность CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь полипептида фактора FVIII представляет собой последовательность CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23).In one embodiment of the polynucleotides described above, the first nucleotide sequence encoding the heavy chain of the factor VIII polypeptide is the sequence CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), and the second nucleotide sequence encoding the light chain of the factor FVIII polypeptide is the sequence CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23).
В одном аспекте описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-FL-NA, причем полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII.In one aspect, the description provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS04-FL-NA, wherein the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide.
В одном аспекте описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS01-FL-NA, причем полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII.In one aspect, the description provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS01-FL-NA, wherein the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide.
В одном аспекте описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS23-FL-NA, причем полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII.In one aspect, the description provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS23-FL-NA, wherein the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide.
- 3 046432- 3 046432
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-nA (SEQ ID NO: 13) или CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 96% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-nA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) или CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 97% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) или CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 98% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-nA (SEQ ID NO: 13) или CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-nA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) или CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) или CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13 ) or CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 95% identity with the sequence CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 96% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 96% identity with the sequence CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 97% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 97% identity with the sequence of CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 98% identity with the sequence of CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 99% identity with the sequence of CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99.5% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide containing an amino acid sequence having at least 99.5% identity with the sequence CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 99.9% идентичности с последовательностью CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a factor VIII polypeptide containing an amino acid sequence having at least 99.9% identity with the sequence CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид кодирует полипептид фактора VIII, содержащий аминокислотную последовательность CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide encodes a Factor VIII polypeptide comprising the amino acid sequence CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
- 4 046432- 4 046432
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
В одном аспекте данное описание предлагает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющий по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29), причем полинуклеотид кодирует одноцепочечный полипептид фактора VIII.In one aspect, this disclosure provides a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 95% identity to the sequence of CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29), wherein the polynucleotide encodes a single-chain factor VIII polypeptide.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 96% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID no: 11 ), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)) .
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 97% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID no: 11 ), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)) .
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 98% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11 ), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)) .
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID nO: 11 ), CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29)) .
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11), CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11 ), CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2-NA (SEQ ID NO : 29)).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с соответствующей полноразмерной полинуклеотидной последовательностью (например, CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11), CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) или CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29)).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with the corresponding full-length polynucleotide sequence (e.g., CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9), CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11 ), CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26), CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27), CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28) or CS23-SC2-NA (SEQ ID NO : 29)).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28).
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29).In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is the sequence CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29).
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 95% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04-SC2NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 96% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04-SC2NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательIn one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence
- 5 046432 ность имеет по меньшей мере 97% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA и CS23-SC2-NA.- 5 046432 has at least 97% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 98% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04-SC2NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FLNA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04-SC2NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04SC2-NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04SC2-NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04SC2-NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with a sequence selected from the group consisting of CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA , CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2 -NA, CS04SC2-NA and CS23-SC2-NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из cSo1-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA и CS23-SC2-NA.In one embodiment of the polynucleotides described above, the nucleotide sequence is selected from the group consisting of cSo1-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04HC-NA, CS04-LC-NA , CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA and CS23-SC2 -NA.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, кодируемый полипептид фактора VIII содержит гликозилируемый полипептид, расположенный между двумя последовательными аминокислотами.In one embodiment of the polynucleotides described above, the encoded factor VIII polypeptide comprises a glycosylatable polypeptide located between two consecutive amino acids.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид также содержит промоторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид фактора VIII.In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide also contains a promoter element operably linked to the polynucleotide encoding a factor VIII polypeptide.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид также содержит энхансерный элемент, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид фактора VIII.In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide also contains an enhancer element operably linked to a polynucleotide encoding a factor VIII polypeptide.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид также содержит элемент полиаденилирования, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим полипептид фактора VIII.In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide also contains a polyadenylation element operably linked to the polynucleotide encoding a factor VIII polypeptide.
В одном варианте реализации полинуклеотидов, описанных выше, полинуклеотид также содержит интрон, оперативно связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид фактора VIII.In one embodiment of the polynucleotides described above, the polynucleotide also contains an intron operably linked to a nucleotide sequence encoding a factor VIII polypeptide.
В одном варианте реализации описанных выше полинуклеотидов интрон расположен между промоторным элементом и сайтом инициации трансляции (например, первым кодирующим ATG) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид фактора VIII.In one embodiment of the polynucleotides described above, the intron is located between the promoter element and the translation initiation site (eg, the first encoding ATG) of the nucleotide sequence encoding the factor VIII polypeptide.
В другом аспекте описание предлагает вектор генной терапии млекопитающих, содержащий полинуклеотид, как описано выше.In another aspect, the disclosure provides a mammalian gene therapy vector comprising a polynucleotide as described above.
В одном варианте реализации вектора генной терапии млекопитающих, описанного выше, вектор генной терапии млекопитающих представляет собой вектор аденоассоциированного вируса (AAV).In one embodiment of the mammalian gene therapy vector described above, the mammalian gene therapy vector is an adeno-associated virus (AAV) vector.
В одном варианте реализации вектора генной терапии млекопитающих, описанного выше, вектор AAV представляет собой вектор AAV-8.In one embodiment of the mammalian gene therapy vector described above, the AAV vector is an AAV-8 vector.
В другом аспекте описание предлагает способ лечения гемофилии А, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, вектора генной терапии млекопитающих, как описано выше.In another aspect, the disclosure provides a method of treating hemophilia A, comprising administering to a patient in need thereof a mammalian gene therapy vector as described above.
В другом аспекте описание предлагает вектор генной терапии млекопитающих, как описано выше для лечения гемофилии А.In another aspect, the disclosure provides a mammalian gene therapy vector as described above for the treatment of hemophilia A.
В другом аспекте описание предлагает использование вектора генной терапии млекопитающих, как описано выше, для изготовления лекарственного средства для лечения гемофилии А.In another aspect, the disclosure proposes the use of a mammalian gene therapy vector, as described above, for the manufacture of a medicament for the treatment of hemophilia A.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На фиг. 1 изображены схематические иллюстрации белковых конструкций фактора VIII человека дикого типа и ReFacto-типа.In fig. 1 shows schematic illustrations of wild-type and ReFacto-type human factor VIII protein constructs.
На фиг. 2А и 2В изображена нуклеотидная последовательность CS04 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 1), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-FL-NA для полноразмерной кодирующей последовательности).In fig. 2A and 2B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS04 (SEQ ID NO: 1) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS04-FL-NA for the full-length coding sequence).
- 6 046432- 6 046432
На фиг. 3 изображена аминокислотная последовательность фактора VIII (SEQ ID NO: 2), кодируемая нуклеотидной последовательностью CS04 с измененными кодонами, в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-FL-AA для полноразмерной аминокислотной последовательности).In fig. 3 depicts the amino acid sequence of Factor VIII (SEQ ID NO: 2) encoded by the codon-altered nucleotide sequence CS04, in accordance with certain embodiments (CS04-FL-AA for the full-length amino acid sequence).
На фиг. 4 изображена часть нуклеотидной последовательности CS04 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 3), кодирующая тяжелую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-HC-NA).In fig. 4 depicts a portion of the codon-altered nucleotide sequence of CS04 (SEQ ID NO: 3) encoding the heavy chain of a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS04-HC-NA).
На фиг. 5 изображена часть нуклеотидной последовательности CS04 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 4), кодирующая легкую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-LC-NA).In fig. 5 depicts a portion of the codon-altered nucleotide sequence of CS04 (SEQ ID NO: 4) encoding the light chain of a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS04-LC-NA).
На фиг. 6 изображены примерные кодирующие последовательности (SEQ ID NOS: 5-7) для линкеров, замещающих В-домен в соответствии с некоторыми вариантами реализации. BDLO01 (SEQ ID NO: 5), BDLO04 (SEQ ID NO: 6) и BDLO23 (SEQ ID NO: 7) являются соответствующими частями CS01, CS04 и CS23 нуклеотидных последовательностей с измененными кодонами, которые кодируют линкер, замещающий В-домен, соответственно.In fig. 6 depicts exemplary coding sequences (SEQ ID NOS: 5-7) for B domain replacement linkers in accordance with some embodiments. BDLO01 (SEQ ID NO: 5), BDLO04 (SEQ ID NO: 6) and BDLO23 (SEQ ID NO: 7) are the corresponding portions of the CS01, CS04 and CS23 nucleotide sequences with altered codons that encode the B domain replacement linker, respectively .
На фиг. 7А-7С изображена векторная последовательность AAV (SEQ ID NO: 8), содержащая нуклеотидную последовательность CS04 с измененными кодонами, в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-AV-NA).In fig. 7A-7C depict an AAV vector sequence (SEQ ID NO: 8) containing the codon-altered nucleotide sequence of CS04, in accordance with some embodiments (CS04-AV-NA).
На фиг. 8А и 8В изображена нуклеотидная последовательность CS04Δ с измененными кодонами (760-1667) (SPI; CS04Δ (741-1648), SPE) (SEQ ID NO: 9), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-SC1-NA).In fig. 8A and 8B depict the nucleotide sequence of CS04Δ with altered codons (760-1667) (SPI; CS04Δ (741-1648), SPE) (SEQ ID NO: 9), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain embodiments (CS04-SC1 -NA).
На фиг. 9 изображена аминокислотная последовательность варианта фактора VIII (SEQ ID NO: 10), кодируемая CS0U (760-1667) (SPI; CSOU (741-1648), SPE), CS04Δ (760-1667) (SPI, CS04Δ (741-1648), SPE) и CS23Δ (760-1667) (SPI; CS23Δ (741-1648), SPE) нуклеотидными последовательностями с измененными кодонами в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS01-SC1-AA CS04-SC1AA и CS23-SC1-AA соответственно).In fig. 9 shows the amino acid sequence of a factor VIII variant (SEQ ID NO: 10) encoded by CS0U (760-1667) (SPI; CSOU (741-1648), SPE), CS04Δ (760-1667) (SPI, CS04Δ (741-1648) , SPE) and CS23Δ (760-1667) (SPI; CS23Δ (741-1648), SPE) nucleotide sequences with altered codons in accordance with certain embodiments (CS01-SC1-AA CS04-SC1AA and CS23-SC1-AA, respectively) .
На фиг. 10А и 10В изображена нуклеотидная последовательность CS04Δ с измененными кодонами (772-1667) (SPI; CS04Δ (753-1648), SPE) (SEQ ID NO: 11), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS04-SC2-NA).In fig. 10A and 10B depict the nucleotide sequence of CS04Δ with altered codons (772-1667) (SPI; CS04Δ (753-1648), SPE) (SEQ ID NO: 11), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain embodiments (CS04-SC2 -NA).
На фиг. 11 изображена аминокислотная последовательность фактора VIII (SEQ ID NO: 12), кодируемая CS0M (772-1667) (SPI; CS0M (753-1648), SPE), CS04Δ (772-1667) (SPI, CS04Δ (753-1648), SPE) и CS23Δ (772-1667) (SPI; CS23Δ (753-1648), SPE) нуклеотидными последовательностями с измененными кодонами, в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS01-SC2-AA CS04-SC2-AA и CS23-SC2-AA соответственно).In fig. 11 shows the amino acid sequence of factor VIII (SEQ ID NO: 12) encoded by CS0M (772-1667) (SPI; CS0M (753-1648), SPE), CS04Δ (772-1667) (SPI, CS04Δ (753-1648), SPE) and CS23Δ (772-1667) (SPI; CS23Δ (753-1648), SPE) codon-altered nucleotide sequences, in accordance with certain embodiments (CS01-SC2-AA CS04-SC2-AA and CS23-SC2-AA respectively).
На фиг. 12А и 12В изображена нуклеотидная последовательность CS01 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 13), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS01-FL-NA).In fig. 12A and 12B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS01 (SEQ ID NO: 13) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS01-FL-NA).
На фиг. 13А и 13В изображена нуклеотидная последовательность CS08 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 14), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS08-FL-NA).In fig. 13A and 13B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS08 (SEQ ID NO: 14) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS08-FL-NA).
На фиг. 14А и 14В изображена нуклеотидная последовательность CS10 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 15), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS10-FL-NA).In fig. 14A and 14B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS10 (SEQ ID NO: 15) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS10-FL-NA).
На фиг. 15А и 15В изображена нуклеотидная последовательность CS11 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 16), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS11-FL-NA).In fig. 15A and 15B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS11 (SEQ ID NO: 16) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS11-FL-NA).
На фиг. 16А и 16В изображена кодирующая последовательность ReFacto дикого типа CS40 (SEQ ID NO: 17) в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS40-FL-NA).In fig. 16A and 16B depict the coding sequence of wild-type ReFacto CS40 (SEQ ID NO: 17) according to certain embodiments (CS40-FL-NA).
На фиг. 17А и 17В изображена нуклеотидная последовательность СН25 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 18), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CH25-FL-NA).In fig. 17A and 17B depict the codon-altered nucleotide sequence of CH25 (SEQ ID NO: 18) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CH25-FL-NA).
На фиг. 18 изображена аминокислотная последовательность фактора VIII дикого типа человека (SEQ ID NO: 19) в соответствии с некоторыми вариантами реализации (FVIII-FL-AA).In fig. 18 depicts the amino acid sequence of human wild-type Factor VIII (SEQ ID NO: 19) according to certain embodiments (FVIII-FL-AA).
На фиг. 19 изображена схема клонирования конструкций pCS40, pCS01, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11 и pCh25 путем вставки синтетических последовательностей ДНК BDD-FVIII типа Refacto в векторную основную цепь pCh-BB01 с помощью сайтов рестрикции AscI и NotI.In fig. 19 shows a scheme for cloning constructs pCS40, pCS01, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11 and pCh25 by inserting synthetic Refacto type BDD-FVIII DNA sequences into the pCh-BB01 vector backbone using AscI and NotI restriction sites.
На фиг. 20 изображена целостность препаратов генома AAV-вектора, анализируемая с помощью электрофореза в агарозном геле. Дорожка 1, маркер ДНК; дорожка 2, VCS40; дорожка 3, vCS01; дорожка 4, VCS04. AAV-векторы все имеют одинаковые размеры генома, мигрирующие примерно на 5 кб (стрелка, правая сторона). Шкала с левой стороны указывает размер фрагментов ДНК в килобазах (кб).In fig. 20 depicts the integrity of AAV vector genome preparations analyzed by agarose gel electrophoresis. Lane 1, DNA marker; track 2, VCS40; Lane 3, vCS01; track 4, VCS04. AAV vectors all have similar genome sizes, migrating approximately 5 kb (arrow, right side). The scale on the left side indicates the size of the DNA fragments in kilobases (kb).
На фиг. 21 изображен белковый анализ векторных препаратов AAV с помощью PAGE и окрашивания серебром. Дорожка 1, маркер белка (М); дорожка 2, VCS40; дорожка 3, vCS01; и дорожка 4, vCS04.In fig. 21 depicts protein analysis of AAV vector preparations by PAGE and silver staining. Lane 1, protein marker (M); track 2, VCS40; Lane 3, vCS01; and track 4, vCS04.
- 7 046432- 7 046432
Все конструкции имеют одинаковые капсиды AAV8, состоящие из VP1, VP2 и VP3 (стрелки справа). Шкала на левой стороне указывает размер маркера белка в килодальтонах (кДа).All constructs have the same AAV8 capsids, consisting of VP1, VP2, and VP3 (arrows on the right). The scale on the left side indicates the size of the protein marker in kilodaltons (kDa).
На фиг. 22А и 22В изображена нуклеотидная последовательность CS23 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 20), кодирующая вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS23-FL-NA).In fig. 22A and 22B depict the codon-altered nucleotide sequence of CS23 (SEQ ID NO: 20) encoding a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS23-FL-NA).
На фиг. 23 изображена аминокислотная последовательность фактора VIII (SEQ ID NO: 21), кодируемая нуклеотидной последовательностью CS23 с измененными кодонами, в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS23-FL-AA).In fig. 23 depicts the amino acid sequence of Factor VIII (SEQ ID NO: 21) encoded by the codon-altered nucleotide sequence CS23, in accordance with certain embodiments (CS23-FL-AA).
На фиг. 24 изображена часть нуклеотидной последовательности CS23 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 22), кодирующая тяжелую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS23-HC-NA).In fig. 24 depicts a portion of the codon-altered nucleotide sequence of CS23 (SEQ ID NO: 22) encoding the heavy chain of a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS23-HC-NA).
На фиг. 25 изображена часть нуклеотидной последовательности CS23 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 23), кодирующая легкую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS23-LC-NA).In fig. 25 depicts a codon-altered portion of the nucleotide sequence of CS23 (SEQ ID NO: 23) encoding a factor VIII variant light chain in accordance with certain embodiments (CS23-LC-NA).
На фиг. 26 изображена часть нуклеотидной последовательности CS01 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 24), кодирующая тяжелую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS01-HC-NA).In fig. 26 depicts a portion of the codon-altered nucleotide sequence of CS01 (SEQ ID NO: 24) encoding the heavy chain of a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS01-HC-NA).
На фиг. 27 изображена часть нуклеотидной последовательности CS01 с измененными кодонами (SEQ ID NO: 25), кодирующая легкую цепь варианта фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS01-LC-NA).In fig. 27 depicts a portion of the codon-altered nucleotide sequence of CS01 (SEQ ID NO: 25) encoding the light chain of a factor VIII variant in accordance with certain embodiments (CS01-LC-NA).
На фиг. 28А и 28В изображена нуклеотидная последовательность C.'S01A (760-1667) (SPI; C.'S01A (741-1648), SPE) с измененными кодонами (SEQ ID NO: 26), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми варианты реализации (CS01-SC1-NA).In fig. 28A and 28B depict the nucleotide sequence of C.'S01A (760-1667) (SPI; C.'S01A (741-1648), SPE) with altered codons (SEQ ID NO: 26), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain implementation options (CS01-SC1-NA).
На фиг. 29А и 29В изображена нуклеотидная последовательность C.'S01A (772-1667) (SPI; C.'S01A (753-1648), SPE) с измененными кодонами (SEQ ID NO: 27), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми варианты реализации (CS01-SC2-NA).In fig. 29A and 29B depict the nucleotide sequence of C.'S01A (772-1667) (SPI; C.'S01A (753-1648), SPE) with altered codons (SEQ ID NO: 27), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain implementation options (CS01-SC2-NA).
На фиг. 30А и 30В изображена нуклеотидная последовательность CS23Δ(760-1667) (SPI; CS23Δ(741-1648), SPE) с измененными кодонами (SEQ ID NO: 28), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми варианты реализации (CS23-SC1-NA).In fig. 30A and 30B depict the nucleotide sequence of CS23Δ(760-1667) (SPI; CS23Δ(741-1648), SPE) with altered codons (SEQ ID NO: 28), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain embodiments (CS23-SC1 -NA).
На фиг. 31А и 31В изображена нуклеотидная последовательность CS23Δ с измененными кодонами (772-1667) (SPI; CS23Δ (753-1648), SPE) (SEQ ID NO: 29), кодирующая одноцепочечный вариант фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации (CS23-SC2-NA).In fig. 31A and 31B depict the nucleotide sequence of CS23Δ with altered codons (772-1667) (SPI; CS23Δ (753-1648), SPE) (SEQ ID NO: 29), encoding a single-chain variant of factor VIII in accordance with certain embodiments (CS23-SC2 -NA).
Подробное описание сущности изобретенияDetailed description of the invention
Введение.Introduction.
Генная терапия на основе AAV имеет большие перспективы для лечения гемофилии. Для гемофилии В первые клинические данные обнадеживают тем, что уровни FIX около 10% могут поддерживаться, по крайней мере, у некоторых пациентов более 1 года. Однако для гемофилии А достижение терапевтических уровней экспрессии 5-10% с помощью векторов AAV остается сложным по различным причинам. Во-первых, кодирующая последовательность фактора VIII слишком велика для обычных векторов на основе AAV.AAV-based gene therapy holds great promise for the treatment of hemophilia. For hemophilia B, early clinical data are encouraging in that FIX levels of about 10% can be maintained in at least some patients for more than 1 year. However, for hemophilia A, achieving therapeutic expression levels of 5–10% using AAV vectors remains challenging for various reasons. First, the factor VIII coding sequence is too large for conventional AAV-based vectors.
Во-вторых, сконструированные конструкции фактора VIII с удаленным или укороченным Вдоменом проявляют слабую экспрессию in vivo, даже при оптимизации кодонов. В-третьих, эти варианты фактора VIII с удаленным или укороченным В-доменом имеют короткий период полураспада in vivo, что усугубляет последствия слабой экспрессии. В-четвертых, даже при экспрессии FVIII эффективно не секретируется из клеток, как и другие факторы свертывания, такие как фактор IX.Second, engineered factor VIII constructs with the B-domain deleted or truncated exhibit poor expression in vivo, even with codon optimization. Third, these factor VIII variants with the B domain deleted or truncated have a short half-life in vivo, exacerbating the consequences of poor expression. Fourth, even when expressed, FVIII is not efficiently secreted from cells, like other coagulation factors such as factor IX.
Более того, эти проблемы не могут быть решены путем простого введения более высоких доз конструкции генной терапии. Согласно современным знаниям, доза вектора генной терапии на основе AAV должна быть увеличена выше 2х 1012 vg/кг массы тела (векторных геномов/кг). Это связано с тем, что при таких высоких дозах активируется Т-клеточный иммунный ответ, который разрушает трансфектированные клетки и, как следствие, трансгенная экспрессия уменьшается или даже пропадает. Поэтому необходимы стратегии улучшения экспрессии FVIII, чтобы сделать генную терапию FVIII жизнеспособным вариантом терапии для пациентов с гемофилией А.Moreover, these problems cannot be solved by simply administering higher doses of the gene therapy construct. According to current knowledge, the dose of AAV-based gene therapy vector should be increased above 2x 10 12 vg/kg body weight (vector genomes/kg). This is due to the fact that at such high doses, a T-cell immune response is activated, which destroys the transfected cells and, as a result, transgene expression is reduced or even lost. Therefore, strategies to improve FVIII expression are needed to make FVIII gene therapy a viable therapeutic option for patients with hemophilia A.
Данное описание относится к обнаружению вариантов кодирующих последовательностей фактора VIII с измененными кодонами, которые решают эти и другие проблемы, связанные с генной терапией фактора VIII. Например, описанные в данном документе полинуклеотиды обеспечивают заметно улучшенную экспрессию в клетках млекопитающих и демонстрируют улучшенную упаковку вириона из-за стабилизированных взаимодействий упаковки. В некоторых вариантах реализации эти преимущества реализованы с использованием кодирующих последовательностей для тяжелых и легких цепей фактора VIII с высокой идентичностью последовательностей с конструкциями с измененными кодонами CS01, CS04 и CS23 (например, с высокой идентичностью последовательности в сравнении с одной из CS01-HC, CS04-HC и CS23-HC тяжелой цепи и высокой идентичностью последовательности в сравнении с однойThis disclosure relates to the discovery of factor VIII coding sequence variants with altered codons that address these and other problems associated with factor VIII gene therapy. For example, the polynucleotides described herein provide markedly improved expression in mammalian cells and exhibit improved virion packaging due to stabilized packaging interactions. In some embodiments, these advantages are realized by using coding sequences for factor VIII heavy and light chains with high sequence identity to codon altered constructs CS01, CS04, and CS23 (e.g., high sequence identity to one of CS01-HC, CS04- HC and CS23-HC heavy chain and high sequence identity compared to one
- 8 046432 из последовательностей CS01-LC, CS04-LC и CS23-LC, кодирующих легкую цепь).- 8 046432 from the light chain coding sequences CS01-LC, CS04-LC and CS23-LC).
В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы фактора VIII, кодируемые описанными в данном документе полинуклеотидами, были укорочены путем усечения, удаления или замены В-домена дикого типа. Как таковые, полинуклеотиды лучше подходят для экспрессии фактора VIII с помощью обычных векторов генной терапии, которые неэффективно экспрессируют более крупные полипептиды, такие как фактор VIII дикого типа.In some embodiments, the factor VIII molecules encoded by the polynucleotides described herein have been truncated by truncation, deletion, or replacement of the wild-type B domain. As such, polynucleotides are better suited for expression of factor VIII using conventional gene therapy vectors, which do not efficiently express larger polypeptides such as wild-type factor VIII.
Преимущественно в данном документе показано, что кодирующие последовательности CS01, CS04 и CS23 с измененными кодонами, кодирующие фактор VIII, обеспечивают превосходную экспрессию конструкции фактора VIII с удаленным В-доменом in vivo. Например, в примере 2 и в табл. 4 показано, что внутривенное введение векторов генной терапии на основе AAV, имеющих CS01 (SEQ ID NO: 13), CS04 (SEQ ID NO: 1) и CS23 (SEQ ID NO: 20) обеспечивают 18-кратное, 74-кратное и 30-кратное увеличение экспрессии фактора VIII по сравнению с соответствующей конструкцией CS40, кодированной полинуклеотидной последовательностью дикого типа (SEQ ID NO: 17), в нокаутных мышах по фактору VIII (табл. 4).Advantageously, this document shows that the codon-altered coding sequences CS01, CS04 and CS23 encoding factor VIII provide superior expression of the B-domain deleted factor VIII construct in vivo. For example, in example 2 and in table. 4 shows that intravenous administration of AAV-based gene therapy vectors having CS01 (SEQ ID NO: 13), CS04 (SEQ ID NO: 1) and CS23 (SEQ ID NO: 20) provides 18-fold, 74-fold and 30-fold -fold increase in factor VIII expression compared to the corresponding CS40 construct, encoded by the wild-type polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 17), in factor VIII knockout mice (Table 4).
Кроме того, в данном документе также показано, что вариабельные кодирующие последовательности CS01 и CS04 фактора VIII с измененными кодонами, обеспечивают превосходную упаковку вирионов и производство вирусов. Например, в примере 1 показано, что векторные конструкции AAV, содержащие конструкции CS01 и CS04, обеспечивают в 5-7 раз больший вирусный выход по сравнению с соответствующей конструкцией CS40, кодируемой полинуклеотидной последовательностью дикого типа, при выделении из того же количества клеточного осадка.In addition, this paper also shows that factor VIII variable coding sequences CS01 and CS04 with altered codons provide superior virion packaging and virus production. For example, Example 1 shows that AAV vector constructs containing constructs CS01 and CS04 provide 5-7 times greater viral yield compared to the corresponding construct CS40, encoded by the wild-type polynucleotide sequence, when isolated from the same amount of cell pellet.
Определения.Definitions.
Как используется в данном документе, следующие термины имеют значения, приписываемые им, если не указано иное.As used herein, the following terms have the meanings ascribed to them unless otherwise noted.
Используемые в данном документе термины Фактор VIII и FVIII используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку с активностью фактора VIII (например, активному FVIII, часто называемому FVIIIa) или предшественнику (например, про-белку или пре-про-белку) белка с активностью Фактора VIII, в частности кофакторной активностью Фактора IXa. В типовом варианте реализации полипептид фактора VIII относится к полипептиду, который имеет последовательности с высокой идентичностью последовательности (например, по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% и более) тяжелых и легких цепей полипептида фактора VIII дикого типа. В некоторых вариантах реализации Вдомен полипептида фактора VIII удаляют, усекают или заменяют линкерным полипептидом, чтобы уменьшить размер полинуклеотида, кодирующего полипептид фактора VIII. В типовом варианте реализации изобретения аминокислоты 20-1457 CS04-FL-AA составляют полипептид фактора VIII.As used herein, the terms Factor VIII and FVIII are used interchangeably and refer to any protein with Factor VIII activity (e.g., active FVIII, often referred to as FVIIIa) or a precursor (e.g., pro-protein or pre-pro-protein) of a protein with Factor VIII activity , in particular the cofactor activity of Factor IXa. In an exemplary embodiment, a Factor VIII polypeptide refers to a polypeptide that has sequences with high sequence identity (e.g., at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or greater) of heavy and mild wild-type factor VIII polypeptide chains. In some embodiments, the B domain of the factor VIII polypeptide is removed, truncated, or replaced with a linker polypeptide to reduce the size of the polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide. In an exemplary embodiment, amino acids 20-1457 of CS04-FL-AA constitute a Factor VIII polypeptide.
Неограничивающие примеры полипептидов фактора VIII дикого типа включают в себя пре-проФактор VIII человека (например, согласно номерам доступа GenBank AAA52485, САА25619, ААА58466, ААА52484, ААА52420, AAV85964, BAF82636, BAG36452, CAI41660, CAI41666, CAI41672, CAI43241, САО03404, EAW72645, ААН22513, ААН64380, ААН98389, AAI11968, AAI11970 или ААВ61261), соответствующий про-Фактор VIII и их природные варианты; свиной пре-про-Фактор VIII (например, согласно номерам доступа UniProt F1RZ36 или K7GSZ5), соответствующий про-Фактора VIII и их природные варианты; пре-про-Фактор VIII мыши (например, согласно номерам доступа GenBank ААА37385, САМ15581, САМ26492 или EDL29229), соответствующий про-Фактор VIII и их природные варианты; пре-про-Фактор VIII крысы (например, согласно номеру доступа GenBank AAQ21580), соответствующий про-Фактор VIII и их природные варианты; пре-про-Фактор VIII крысы; и другие гомологи Фактора VIII млекопитающих (например, обезьяны, примата, хомяка, морской свинки и т.д.).Non-limiting examples of wild-type Factor VIII polypeptides include human pre-proFactor VIII (e.g., under GenBank accession numbers AAA52485, CAA25619, AAA58466, AAA52484, AAA52420, AAV85964, BAF82636, BAG36452, CAI41660, CAI41666, CAI4 1672, CAI43241, САО03404, EAW72645, AAH22513, AAH64380, AAH98389, AAI11968, AAI11970 or AAB61261), the corresponding pro-Factor VIII and their natural variants; porcine pre-pro-Factor VIII (eg, according to UniProt accession numbers F1RZ36 or K7GSZ5), the corresponding pro-Factor VIII and natural variants thereof; mouse pre-pro-Factor VIII (eg, GenBank accession numbers AAA37385, CAM15581, CAM26492, or EDL29229), the corresponding pro-Factor VIII, and natural variants thereof; rat pre-pro-Factor VIII (eg, according to GenBank accession number AAQ21580), the corresponding pro-Factor VIII, and natural variants thereof; rat pre-pro Factor VIII; and other mammalian homologs of Factor VIII (eg, monkey, primate, hamster, guinea pig, etc.).
Используемый в данном документе термин полипептид фактора VIII включает естественные варианты и искусственные конструкции с кофакторной активностью Фактора IX. Как используется в данном описании, термин фактор VIII охватывает любые природные варианты, альтернативные последовательности, изоформы или мутантные белки, которые сохраняют базальную кофакторную активность фактора IX (например, по меньшей мере 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, или более соответствующей активности дикого типа). Примеры вариаций аминокислот фактора VIII (относительно FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 19)), обнаруженные в популяции человека, включают, но не ограничиваются ими,As used herein, the term Factor VIII polypeptide includes natural variants and artificial constructs with Factor IX cofactor activity. As used herein, the term factor VIII encompasses any naturally occurring variants, alternative sequences, isoforms, or mutant proteins that retain the basal cofactor activity of factor IX (e.g., at least 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, or more corresponding to wild-type activity). Examples of factor VIII amino acid variations (relative to FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 19)) found in the human population include, but are not limited to,
S19R, R22T, Y24C, Y25C,S19R, R22T, Y24C, Y25C,
- 9 046432- 9 046432
L26P/R, E30V, W33G, Y35C/H, G41C, R48C/K, K67E/N, L69P, E72K, D75E/V/Y, P83R, G89D/V, G92A/V, A97P, E98K, V99D, D101G/H/V, V104D, K108T, M110V, A111T/V, H113R/Y, L117F/R, G121S, E129V, G130R, E132D, Y133C, D135G/Y, T137A/I, S138R, E141K, D145H, V147D, Y155H, V159A, N163K, G164D/V, P165S, C172W, S176P, S179P, V181E/M, K185T, D186G/N/Y, S189L, L191F, G193R, L195P, C198G, S202N/R, F214V, L217H, A219D/T, V220G, D222V, E223K, G224W, T252I, V253F, N254I, G255V, L261P, P262L, G263S, G266F, C267Y, W274C, H275L, G278R, G280D, E284K, V285G, E291G/K, T294I, F295L, V297A, N299I, R301C/H/L, A303E/P, I307S, S308L, F312S, T314A/I, A315V, G323E, L326P, L327P/V, C329F, I331V, M339T, E340K, V345A/L, C348R/S/Y, Y365C, R391C/H/P, S392L/P, A394S, W401G, I405F/S, E409G, W412G/R, K427I, L431F/S, R437P/W, I438F, G439D/S/V, Y442C, K444R, Y450D/N, T454I, F455C, G466E, P470L/R/T, G474E/R/V, E475K, G477V, D478N, T479R, F484C, A488G, R490G, Y492C/H, Y492H, I494T, P496R, G498R, R503H, G513S/V, I522Y, K529E, W532G, P540T, T541S, D544N, R546W, R550C/G/H, S553P, S554C/G, V556D, R560T, D561G/H/Y, I567T, P569R, S577F, V578A, D579A/H, N583S, Q584H/K/R, I585R/T, M586V, D588G/Y, L594Q, S596P, N601D/K, R602G, S603I/R, W604C, Y605H/S, N609I, R612C, N631K/S, M633I, S635N, N637D/I/S, Y639C, L644V, L650F, V653A/M, L659P, A663V, Q664P, F677L, M681I, V682F, Y683C/N, T686R, F698L, M699T/V, M701I, G705V, G710W, N713I, R717L/W, G720D/S, M721I/L, A723T, L725Q, V727F, E739K, Y742C, R795G, P947R, V1012L, E1057K, H1066Y, D1260E, K1289Q, Q1336K, N1460K, L1481P, A1610S, I1698T, Y1699C/F, E1701K, Q1705H, R1708C/H, T1714S, R1715G, A1720V, E1723K, D1727V, Y1728C, R1740G, K1751Q, F1762L, R1768H, G1769R, L1771P, L1775F/V, L1777P, G1779E/R, P1780L, I1782R, D1788H, M1791T, A1798P, S1799H, R1800C/G/H, P1801A, Y1802C, S1803Y, F1804S, L1808F, M1842I, P1844S, T1845P, E1848G, A1853T/V, S1858C, K1864E, D1865N/Y, H1867P/R, G1869D/V, G1872E, P1873R, L1875P, V1876L, C1877R/Y, L1882P, R1888I, E1894G, I1901F, E1904D/K, S1907C/R, W1908L, Y1909C, A1939T/V,L26P/R, E30V, W33G, Y35C/H, G41C, R48C/K, K67E/N, L69P, E72K, D75E/V/Y, P83R, G89D/V, G92A/V, A97P, E98K, V99D, D101G/ H/V, V104D, K108T, M110V, A111T/V, H113R/Y, L117F/R, G121S, E129V, G130R, E132D, Y133C, D135G/Y, T137A/I, S138R, E141K, D145H, V147D, Y155H, V159A, N163K, G164D/V, P165S, C172W, S176P, S179P, V181E/M, K185T, D186G/N/Y, S189L, L191F, G193R, L195P, C198G, S202N/R, F214V, L217H, A219D/ T, V220G, D222V, E223K, G224W, T252I, V253F, N254I, G255V, L261P, P262L, G263S, G266F, C267Y, W274C, H275L, G278R, G280D, E284K, V285G, E291G/K, T2 94I, F295L, V297A, N299I, R301C/H/L, A303E/P, I307S, S308L, F312S, T314A/I, A315V, G323E, L326P, L327P/V, C329F, I331V, M339T, E340K, V345A/L, C348R/S/Y, Y365C, R391C/H/P, S392L/P, A394S, W401G, I405F/S, E409G, W412G/R, K427I, L431F/S, R437P/W, I438F, G439D/S/V, Y442C, K444R, Y450D/N, T454I, F455C, G466E, P470L/R/T, G474E/R/V, E475K, G477V, D478N, T479R, F484C, A488G, R490G, Y492C/H, Y492H, I494T, P496R, G498R, R503H, G513S/ V, I522Y, K529E, W532G, P540T, T541S, D544N, R546W, R550C/G/H, S553P, S554C/G, V556D, R560T, D561G/H/Y, I567T, P569R, S577F, V578A, D579A/H, N583 S, Q584H/K/R, I585R/T, M586V, D588G/Y, L594Q, S596P, N601D/K, R602G, S603I/R, W604C, Y605H/S, N609I, R612C, N631K/S, M633I, S635N, N637D/ I/S, Y639C, L644V, L650F, V653A/M, L659P, A663V, Q664P, F677L, M681I, V682F, Y683C/N, T686R, F698L, M699T/V, M701I, G705V, G710W, N713I, R717L/ W, G720D/S, M721I/L, A723T, L725Q, V727F, E739K, Y742C, R795G, P947R, V1012L, E1057K, H1066Y, D1260E, K1289Q, Q1336K, N1460K, L1481P, A1610S, I16 98T, Y1699C/F, E1701K, Q1705H, R1708C/H, T1714S, R1715G, A1720V, E1723K, D1727V, Y1728C, R1740G, K1751Q, F1762L, R1768H, G1769R, L1771P, L1775F/V, L1777P, G1779E/R, P1780L , I1782R, D1788H, M1791T, A1798P, S1799H, R1800C/G/H, P1801A, Y1802C, S1803Y, F1804S, L1808F, M1842I, P1844S, T1845P, E1848G, A1853T/V, S1858C, K1864E, D1865N/Y, H1867P/R, G1869D/V, G1872E, P1873R, L1875P, V1876L, C1877R/Y, L1882P, R1888I, E1894G, I1901F, E1904D/K, S1907C/R, W1908L, Y1909C, A1939T/V,
- 10 046432- 10 046432
N1941D/S, G1942A, M1945V, L1951F, R1960L/Q, L1963P, S1965I, M1966I/V, G1967D, S1968R, N1971T, H1973L, G1979V, H1980P/Y, F1982I, R1985Q, L1994P, Y1998C, G2000A, T2004R, M2007I, G2013R, W2015C, R2016P/W, E2018G, G2022D, G2028R, S2030N, V2035A, Y2036C, N2038S, 2040Y, G2045E/V, I2051S, I2056N, A2058P, W2065R, P2067L, A2070V, S2082N, S2088F, D2093G/Y, H2101D, T2105N, Q2106E/P/R, G2107S, R2109C, I2117F/S, Q2119R, F2120C/L, Y2124C, R2135P, S2138Y, T2141N, M2143V, F2145C, N2148S, N2157D, P2162L, R2169C/H, P2172L/Q/R, T2173A/I, H2174D, R2178C/H/L, R2182C/H/P, M2183R/V, L2185S/W, S2192I, C2193G, P2196R, G2198V, E2200D,N1941D/S, G1942A, M1945V, L1951F, R1960L/Q, L1963P, S1965I, M1966I/V, G1967D, S1968R, N1971T, H1973L, G1979V, H1980P/Y, F1982I, R1985Q, L199 4P, Y1998C, G2000A, T2004R, M2007I, G2013R, W2015C, R2016P/W, E2018G, G2022D, G2028R, S2030N, V2035A, Y2036C, N2038S, 2040Y, G2045E/V, I2051S, I2056N, A2058P, W2065R, P2067L, A 2070V, S2082N, S2088F, D2093G/Y, H2101D, T2105N, Q2106E/P/R, G2107S, R2109C, I2117F/S, Q2119R, F2120C/L, Y2124C, R2135P, S2138Y, T2141N, M2143V, F2145C, N2148S, N2157D, P2162L, R216 9C/H, P2172L/Q/R, T2173A/I, H2174D, R2178C/H/L, R2182C/H/P, M2183R/V, L2185S/W, S2192I, C2193G, P2196R, G2198V, E2200D,
I2204T, I2209N, A2211P, A2220P, P2224L, R2228G/L/P/Q, L2229F,I2204T, I2209N, A2211P, A2220P, P2224L, R2228G/L/P/Q, L2229F,
V2242M, W2248C/S, V2251A/E, M2257V, T2264A, Q2265R, F2279C/I,V2242M, W2248C/S, V2251A/E, M2257V, T2264A, Q2265R, F2279C/I,
I2281T, D2286G, W2290L, G2304V, D2307A, P2319L/S, R2323C/G/H/L, R2326G/L/P/Q, Q2330P, W2332R, I2336F, R2339T, G2344C/D/S иI2281T, D2286G, W2290L, G2304V, D2307A, P2319L/S, R2323C/G/H/L, R2326G/L/P/Q, Q2330P, W2332R, I2336F, R2339T, G2344C/D/S and
C2345S/Y.C2345S/Y.
Белки фактора VIII также содержат полипептиды, содержащие посттрансляционные модификации.Factor VIII proteins also contain polypeptides containing post-translational modifications.
Как правило, полинуклеотиды, кодирующие фактор VIII, кодируют неактивный одноцепочечный полипептид (например, пре-про-белок), который подвергается посттрансляционной обработке с образованием активного белка фактора VIII (например, FVIIIa). Например, в соответствии с фиг. 1, предварительно пре-про-белок фактора VIII человека сначала расщепляется для высвобождения кодируемого сигнального пептида (не показан), образуя первый одноцепочечный про-белок (показанный как FVIII дикого типа человека). Про-белок затем расщепляется между доменами В и A3 с образованием первого полипептида, который содержит тяжелую цепь фактора VIII (например, домены А1 и А2) и В-домен, и второй полипептид, который содержит легкую цепь фактора VIII (например, содержит домены A3, С1 и С3). Первый полипептид далее расщепляется для удаления В-домена, а также для отделения доменов А1 и А2, которые остаются связанными с легкой цепью фактора VIII в зрелом протеине фактора Villa. Для обзора процесса созревания фактора VIII см. Graw et al., Nat Rev Genet., 6 (6): 488-501 (2005), содержание которого включено в данное описание посредством ссылки во всей его полноте для всех целей.Typically, factor VIII-encoding polynucleotides encode an inactive single-chain polypeptide (eg, a pre-pro protein) that is post-translationally processed to produce an active factor VIII protein (eg, FVIIIa). For example, according to FIG. 1, the human factor VIII pre-pro-protein is first cleaved to release the encoded signal peptide (not shown), generating the first single-chain pro-protein (shown as wild-type human FVIII). The pro protein is then cleaved between the B and A3 domains to produce a first polypeptide that contains the factor VIII heavy chain (eg, the A1 and A2 domains) and the B domain, and a second polypeptide that contains the factor VIII light chain (eg, contains the A3 domains , C1 and C3). The first polypeptide is further cleaved to remove the B domain and also to separate the A1 and A2 domains, which remain associated with the factor VIII light chain in the mature factor Villa protein. For a review of the maturation process of factor VIII, see Graw et al., Nat Rev Genet., 6 (6): 488-501 (2005), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.
Однако в некоторых вариантах реализации изобретения полипептид фактора VIII представляет собой одноцепочечный полипептид фактора VIII. Одноцепочечные полипептиды фактора VIII сконструированы с удалением природных сайтов расщепления и, необязательно, удалением, укорочением или заменой В-домена фактора VIII. Как таковые, они не созревают при расщеплении (кроме отщепления необязательного сигнального и/или лидерного пептида) и активны как одна цепь. Неограничивающие примеры одноцепочечных полипептидов фактора VIII описаны в Zollner et al. (Thromb Res, 134(1):125-31 (2014)) и Donath et al. (Biochem J., 312 (1): 49-55 (1995)), описание которых включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.However, in some embodiments, the factor VIII polypeptide is a single chain factor VIII polypeptide. Single-chain factor VIII polypeptides are designed to remove natural cleavage sites and optionally remove, shorten or replace the factor VIII B domain. As such, they are not matured by cleavage (other than cleavage of an optional signal and/or leader peptide) and are active as a single chain. Non-limiting examples of single chain factor VIII polypeptides are described in Zollner et al. (Thromb Res, 134(1):125-31 (2014)) and Donath et al. (Biochem J., 312 (1): 49-55 (1995)), the description of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.
Используемый в данном документе термин тяжелая цепь фактора VIII или просто тяжелая цепь относится к объединению доменов А1 и А2 полипептида фактора VIII. В примерном варианте реализации изобретения аминокислоты 20-759 CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) составляют тяжелую цепь фактора VIII.As used herein, the term factor VIII heavy chain or simply heavy chain refers to the union of the A1 and A2 domains of a factor VIII polypeptide. In an exemplary embodiment, amino acids 20-759 of CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) constitute the factor VIII heavy chain.
Используемый в данном документе термин легкая цепь фактора VIII или просто легкая цепь относится к объединению доменов A3, С1 и С2 полипептида фактора VIII. В примерном варианте реализации изобретения аминокислоты 774-1457 CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) составляют легкую цепь фактора VIII. В некоторых вариантах реализации изобретения легкая цепь фактора VIII не содержит кислый пептид аЗ, который высвобождается во время созревания in vivo.As used herein, the term factor VIII light chain or simply light chain refers to the union of the A3, C1 and C2 domains of a factor VIII polypeptide. In an exemplary embodiment, amino acids 774-1457 of CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2) constitute the factor VIII light chain. In some embodiments, the factor VIII light chain does not contain the acidic peptide α3, which is released during in vivo maturation.
Как правило, тяжелые и легкие цепи фактора VIII экспрессируются в виде одной полипептидной цепи, например, вместе с необязательным В-доменом или замещающим В-домен линкером. Однако в некоторых вариантах реализации изобретения тяжелая цепь фактора VIII и легкая цепь фактора VIII экспрессируются как отдельные полипептидные цепи (например, ко-экспрессированные) и восстанавливаются с образованием белка фактора VIII (например, in vivo или in vitro).Typically, the factor VIII heavy and light chains are expressed as a single polypeptide chain, for example, together with an optional B domain or a B domain replacement linker. However, in some embodiments, factor VIII heavy chain and factor VIII light chain are expressed as separate polypeptide chains (eg, co-expressed) and are reduced to form factor VIII protein (eg, in vivo or in vitro).
Используемые в данном документе термины В-домен замещающий линкер и линкер фактора VIII используются взаимозаменяемо и относятся к укороченным версиям В-домена фактора VIII дикого типа (например, аминокислоты 760-1667 FVIII-FL- AA (SEQ ID NO: 19)) или пептиды, сконструированные для замены В-домена полипептида фактора VIII. Как используется в данном документе, линкер фактора VIII расположен между С-концом тяжелой цепи фактора VIII и N-концом легкой цепи фактора VIII в варианте полипептида фактора VIII в соответствии с некоторыми вариантами реализации. Неограничивающие примеры В-домен замещающих линкеров описаны в патентах США № 4,868,112, 5,112,950,As used herein, the terms B domain replacement linker and Factor VIII linker are used interchangeably and refer to shortened versions of wild-type Factor VIII B domain (e.g., amino acids 760-1667 FVIII-FL-AA (SEQ ID NO: 19)) or peptides , designed to replace the B domain of the factor VIII polypeptide. As used herein, the Factor VIII linker is located between the C-terminus of the Factor VIII heavy chain and the N-terminus of the Factor VIII light chain in a variant Factor VIII polypeptide in accordance with some embodiments. Non-limiting examples of B-domain replacement linkers are described in US Patent Nos. 4,868,112, 5,112,950,
- 11 046432- 11 046432
5,171,844, 5,543,502, 5,595,886, 5,610,278, 5,789,203, 5,972,885, 6,048,720, 6,060,447, 6,114,148, 6,228,620, 6,316,226, 6,346,513, 6,458,563, 6,924,365, 7,041,635 и 7,943,374; Публикациях патентных заявок США № 2013/024960, 2015/0071883 и 2015/0158930; и в публикациях РСТ WO 2014/064277 и WO 2014/127215, описание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.5,171,844, 5,543,502, 5,595,886, 5,610,278, 5,789,203, 5,972,885, 6,048,720, 6,060,447, 6,114,148, 6,228,620, 6,316,226, 6, 346,513, 6,458,563, 6,924,365, 7,041,635 and 7,943,374; US Patent Application Publications No. 2013/024960, 2015/0071883 and 2015/0158930; and in PCT publications WO 2014/064277 and WO 2014/127215, the description of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes.
Если не указано иное, нумерация аминокислот фактора VIII относится к соответствующей аминокислоте в полноразмерной последовательности человеческого фактора VIII дикого типа (FVIII-FL-AA), представленной в виде SEQ ID NO: 19 на фиг. 18. Таким образом, когда речь идет о замещении аминокислоты в варианте белка VIII фактора, описанном в данном документе, указанное количество аминокислот относится к аналогичной (например, структурно или функционально эквивалентной) и/или гомологичной (например, эволюционно консервативной в первичной аминокислотной последовательности) полноразмерной аминокислотной последовательности фактора VIII дикого типа. Например, аминокислотная замена T2105N относится к замещению T-N в положении 2105 полноразмерной последовательности фактора VIII дикого типа человека (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19) и замещению Т на N в положении 1211 варианта белка фактора VIII, кодируемого CS04 (CS04-FL-AA, SEQ ID NO: 2).Unless otherwise noted, Factor VIII amino acid numbering refers to the corresponding amino acid in the full-length wild-type human Factor VIII sequence (FVIII-FL-AA) shown as SEQ ID NO: 19 in FIG. 18. Thus, when referring to an amino acid substitution in a variant of the Factor VIII protein described herein, the number of amino acids specified refers to similar (e.g., structurally or functionally equivalent) and/or homologous (e.g., evolutionarily conserved in the primary amino acid sequence) full-length amino acid sequence of wild-type factor VIII. For example, amino acid substitution T2105N refers to a T-N substitution at position 2105 of the full-length wild-type human factor VIII sequence (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19) and a T to N substitution at position 1211 of the variant factor VIII protein encoded by CS04 (CS04- FL-AA, SEQ ID NO: 2).
Как описано в данном документе, система нумерации аминокислот фактора VIII зависит от того, входит ли в состав сигнальный пептид фактора VIII (например, аминокислоты 1-19 полноразмерной последовательности фактора VIII дикого типа человека). Когда сигнальный пептид входит в состав, нумерация обозначается как включительно с сигнальным пептидом или SPI. Когда сигнальный пептид не входит в состав, нумерация обозначается как без сигнального пептида или SPE. Например, F328S в SPI нумерации обозначает ту же аминокислоту, что и F309S в нумерации SPE. Если не указано иное, вся нумерация аминокислот относится к соответствующей аминокислоте в полноразмерной последовательности фактора VIII дикого типа человека (FVIII-FL-AA), представленной в виде SEQ ID NO: 19 на фиг. 18.As described herein, the factor VIII amino acid numbering system depends on whether the factor VIII signal peptide is included (eg, amino acids 1-19 of the full-length wild-type human factor VIII sequence). When a signal peptide is included, the numbering is designated as inclusive of the signal peptide or SPI. When no signal peptide is included, the numbering is designated as no signal peptide or SPE. For example, F328S in SPI numbering represents the same amino acid as F309S in SPE numbering. Unless otherwise indicated, all amino acid numbering refers to the corresponding amino acid in the full-length wild-type human factor VIII sequence (FVIII-FL-AA) shown as SEQ ID NO: 19 in FIG. 18.
Как описано в данном документе, полинуклеотиды с измененными кодонами обеспечивают повышенную экспрессию трансгенного фактора VIII in vivo (например, при введении в качестве части вектора генной терапии) по сравнению с уровнем экспрессии фактора VIII, обеспечиваемым природной кодируемой конструкцией фактора VIII (например, полинуклеотид, кодирующий ту же самую конструкцию фактора VIII человека с использованием кодонов дикого типа). Используемый в данном документе термин повышенная экспрессия относится к повышенному уровню активности трансгенного фактора VIII в крови животного, которому вводили полинуклеотид с измененными кодонами, кодирующий фактор VIII, по сравнению с уровнем активности в крови животного трансгенного фактора VIII вводимого в виде природно закодированной конструкции фактора VIII. Уровни активности можно измерять с использованием любой активности фактора VIII, известной в данной области. Типовый анализ для определения активности фактора VIII представляет собой анализ Technochrome FVIII (Technoclone, Вена, Австрия).As described herein, codon altered polynucleotides provide increased expression of a transgenic factor VIII in vivo (eg, when administered as part of a gene therapy vector) compared to the level of factor VIII expression provided by a naturally occurring factor VIII encoded construct (eg, a polynucleotide encoding the same human factor VIII construct using wild-type codons). As used herein, the term increased expression refers to the increased level of activity of a transgenic factor VIII in the blood of an animal that has been administered a codon-altered polynucleotide encoding factor VIII, compared to the level of activity in the blood of an animal of a transgenic factor VIII administered as a naturally encoded factor VIII construct. Activity levels can be measured using any factor VIII activity known in the art. A typical assay for determining factor VIII activity is the Technochrome FVIII assay (Technoclone, Vienna, Austria).
В некоторых вариантах реализации изобретения повышенная экспрессия относится к по меньшей мере на 25% большей трансгенной активности фактора VIII в крови животного, которому вводили полинуклеотид фактора VIII с измененными кодонами, по сравнению с уровнем трансгенной активности фактора VIII в крови животного, которому вводили природно кодированный полинуклеотид фактора VIII. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенная экспрессия относится к по меньшей мере, на 50% большей, по меньшей мере на 75% большей, по меньшей мере на 100% большей, по меньшей мере в 3 раза большей, по меньшей мере в 4 раза большей, по меньшей мере в 5 раз большей, по меньшей мере 6 большей, по меньшей мере в 7 раз большей, по меньшей мере в 8 раз большей, по меньшей мере в 9 раз большей, по меньшей мере в 10 раз большей, по меньшей мере в 15 раз большей, по меньшей мере в 20 раз большей, по меньшей мере в 25 раз большей, по меньшей мере в 30 раз большей, по меньшей мере в 40 раз большей, по меньшей мере в 50 раз большей, по меньшей мере в 60 раз большей, по меньшей мере в 70 раз большей, по меньшей мере в 80 раз большей, по меньшей мере в 90 раз большей, по меньшей мере в 100 раз большей, по меньшей мере в 125 раз большей, по меньшей мере в 150 раз большей, по меньшей мере в 175 раз большей, по меньшей мере в 200 раз большей, по меньшей мере в 225 раз большей или, по меньшей мере, в 250 раз более высокой активности трансгенного фактора VIII в крови животного, которым вводили полинуклеотид фактора VIII с измененными кодонами, по сравнению с уровнем активности трансгенного фактора VIII в крови животного, которым вводили природно кодируемый полинуклеотид фактора VIII.In some embodiments, increased expression refers to at least 25% greater transgenic factor VIII activity in the blood of an animal administered a codon-altered factor VIII polynucleotide compared to the level of factor VIII transgenic activity in the blood of an animal administered a naturally encoded polynucleotide factor VIII. In some embodiments, increased expression refers to at least 50% greater, at least 75% greater, at least 100% greater, at least 3 times greater, at least 4 times greater, at least 5 times greater, at least 6 times greater, at least 7 times greater, at least 8 times greater, at least 9 times greater, at least 10 times greater, at least 15 times larger, at least 20 times larger, at least 25 times larger, at least 30 times larger, at least 40 times larger, at least 50 times larger, at least 60 times larger greater, at least 70 times greater, at least 80 times greater, at least 90 times greater, at least 100 times greater, at least 125 times greater, at least 150 times greater, at least 175 times greater, at least 200 times greater, at least 225 times greater, or at least 250 times greater transgenic factor VIII activity in the blood of an animal injected with a factor VIII polynucleotide with altered codons , compared with the level of transgenic factor VIII activity in the blood of an animal that was injected with a naturally encoded factor VIII polynucleotide.
Как описано в данном документе, полинуклеотиды с измененными кодонами обеспечивают увеличенное векторное продуцирование по сравнению с уровнем векторного продуцирования, обеспечиваемым природно кодируемой конструкцией фактора VIII (например, полинуклеотидом, кодирующим ту же самую конструкцию фактора VIII человека с использованием кодонов дикого типа). Используемый в данном документе термин повышенное продуцирование вируса относится к увеличению выхода вектора в культуре клеток (например, титр на литр культуры), инокулированном полинуклеотидом с измененными кодонами, кодирующим фактор VIII, по сравнению с выходом вектора в культуре клеток, инокулированным природно кодируемой конструкцией фактора VIII. Данные о выходе вектора могут быть получены с использованием любого анализа титра вектора, известного в данной области. Типовый анализ для определения выхода вектора (например, вектора AAV) представляет собой qPCR с использоваAs described herein, codon altered polynucleotides provide increased vector production compared to the level of vector production provided by a naturally encoded factor VIII construct (eg, a polynucleotide encoding the same human factor VIII construct using wild-type codons). As used herein, the term increased virus production refers to an increase in vector yield in cell culture (e.g., titer per liter of culture) inoculated with a codon-altered polynucleotide encoding factor VIII, compared to vector yield in cell culture inoculated with a naturally encoded factor VIII construct. . Vector yield data can be obtained using any vector titer assay known in the art. A typical assay for determining the yield of a vector (e.g., AAV vector) is qPCR using
- 12 046432 нием инвертированных терминальных повторов AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part В 23:18-28 (2012)).- 12 046432 by inverted terminal repeats of AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012)).
В некоторых вариантах реализации изобретения увеличение производства вируса относится к по меньшей мере на 25% большему выходу вектора с измененными кодонами, по сравнению с выходом природно кодируемой конструкции фактора VIII в культуре того же типа. В некоторых вариантах реализации изобретения увеличенное векторное производство относится к по меньшей мере, на 50% большему, по меньшей мере на 75% большему, по меньшей мере на 100% большему, по меньшей мере в 3 раза большему, по меньшей мере в 4 раза большему, по меньшей мере в 5 раз большему, по меньшей мере в 6 раз большему, по меньшей мере в 7 раз большему, по меньшей мере в 8 раз большему, по меньшей мере в 9 раз большему, по меньшей мере в 10 раз большему, по меньшей мере в 15 раз большему или, по меньшей мере, в 20 раз большему выходу вектора по сравнению с выходом природно кодируемой конструкции фактора VIII в культуре одного и того же типа.In some embodiments, increased virus production refers to at least 25% greater yield of the codon-mutated vector compared to the yield of a naturally encoded factor VIII construct in the same type of culture. In some embodiments, increased vector production refers to at least 50% more, at least 75% more, at least 100% more, at least 3 times more, at least 4 times more , at least 5 times larger, at least 6 times larger, at least 7 times larger, at least 8 times larger, at least 9 times larger, at least 10 times larger, according to at least 15 times greater or at least 20 times greater vector yield compared to the yield of a naturally encoded factor VIII construct in a culture of the same type.
Используемый в данном документе термин гемофилия относится к группе болезненных состояний, широко характеризующихся сниженной свертываемостью крови или коагуляции. Гемофилия может относиться к гемофилии типа А, типа В или типа С или к совокупности всех трех типов заболеваний. Гемофилия типа А (гемофилия А) вызвана снижением или потерей активности фактора VIII (FVIII) и является наиболее известным из подтипов гемофилии. Гемофилия типа В (гемофилия В) является результатом потери или уменьшения функции фактора свертывания IX (FIX). Гемофилия типа С (гемофилия С) является следствием потери или снижения активности фактора свертывания XI (FXI). Гемофилия А и В являются Х-связанными заболеваниями, тогда как гемофилия С является аутосомной. Обычные способы лечения гемофилии включают как профилактическое введение, так и введение по необходимости факторов свертывания крови, таких как FVIII, FIX, включая Bebulin®-VH и FXI, а также инфузии FEIBA-VH, десмопрессина и плазмы.As used herein, the term hemophilia refers to a group of disease conditions broadly characterized by decreased blood clotting or coagulation. Hemophilia can refer to hemophilia type A, type B, or type C, or a combination of all three types of diseases. Hemophilia type A (hemophilia A) is caused by a decrease or loss of factor VIII (FVIII) activity and is the best known of the hemophilia subtypes. Hemophilia type B (hemophilia B) results from loss or decreased function of clotting factor IX (FIX). Hemophilia type C (hemophilia C) results from the loss or decreased activity of coagulation factor XI (FXI). Hemophilia A and B are X-linked diseases, while hemophilia C is autosomal. Conventional treatments for hemophilia include both prophylactic and as-needed administration of coagulation factors such as FVIII, FIX, including Bebulin®-VH and FXI, as well as infusions of FEIBA-VH, desmopressin and plasma.
Используемый в данном документе термин генная терапия FVIII включает в себя любой терапевтический подход к предоставлению пациенту нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор VIII, для облегчения, уменьшения или предотвращения повторения одного или нескольких симптомов (например, клинических факторов), связанных с гемофилией. Термин включает проведение процедуры, соблюдение режима, введение любого соединения, лекарственного средства, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу фактора VIII, включая любую модифицированную форму фактора VIII (например, вариант фактора VIII) для поддержания или улучшения здоровья человека, больного гемофилией. Специалист в данной области поймет, что либо курс терапии FVIII, либо дозу терапевтического агента FVIII можно изменить, например, на основании результатов, полученных в соответствии с данным изобретением.As used herein, the term FVIII gene therapy includes any therapeutic approach to provide a patient with a nucleic acid encoding factor VIII to alleviate, reduce, or prevent the recurrence of one or more symptoms (eg, clinical factors) associated with hemophilia. The term includes performing a procedure, maintaining a regimen, administering any compound, drug containing a nucleic acid encoding a factor VIII molecule, including any modified form of factor VIII (eg, a variant of factor VIII) to maintain or improve the health of a person with hemophilia. One skilled in the art will appreciate that either the course of FVIII therapy or the dose of the FVIII therapeutic agent may be modified, for example, based on the results obtained in accordance with the present invention.
Используемый в данном документе термин обходная терапия включает в себя любой терапевтический подход, предусматривающий предоставление гемостатических агентов, не относящихся к фактору VIII, соединений или факторов коагуляции пациенту для облегчения, уменьшения или предотвращения повторения одного или нескольких симптомов (например, клинических факторов) связанных с гемофилией. Соединения, не относящиеся к фактору VIII и факторы коагуляции включают, но не ограничиваются ими, обходную активность фактора VIII (FEIBA), рекомбинантный активированный фактор VII (FVIIa), протромбиновые комплексные концентраты и активированные комплексные концентраты протромбина. Эти соединения, не относящиеся к фактору VIII и факторы коагуляции могут быть получены рекомбинантно или из плазмы. Специалист в данной области поймет, что либо курс обходной терапии, либо доза обходной терапии могут быть изменены, например, на основании результатов, полученных в соответствии с данным изобретением.As used herein, the term bypass therapy includes any therapeutic approach that provides non-factor VIII hemostatic agents, compounds, or coagulation factors to a patient to alleviate, reduce, or prevent the recurrence of one or more symptoms (eg, clinical factors) associated with hemophilia . Non-factor VIII compounds and coagulation factors include, but are not limited to, factor VIII bypass activity (FEIBA), recombinant activated factor VII (FVIIa), prothrombin complex concentrates and activated prothrombin complex concentrates. These non-factor VIII compounds and coagulation factors can be obtained recombinantly or from plasma. One skilled in the art will appreciate that either the course of bypass therapy or the dose of bypass therapy may be modified, for example, based on the results obtained in accordance with the present invention.
Используемый в данном документе термин комбинированная терапия, включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу фактора VIII и традиционных терапевтических агентов для лечения гемофилии А, включает любой терапевтический подход, обеспечивающий как нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу фактора VIII, так и молекулу фактора VIII и/или гемостатический агент, не относящийся к фактору VIII (например, обходной терапевтический агент) пациенту для облегчения, уменьшения или предотвращения повторения одного или нескольких симптомов (например, клинических факторов), связанных с гемофилией. Термин включает проведение процедуры или соблюдение режима, введение любого соединения, лекарственного средства, включая нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу фактора VIII, включая любую модифицированную форму фактора VIII, которая полезна для поддержания или улучшения здоровья человека, больного гемофилией и включая любой из агентов, которые описаны в данном документе.As used herein, the term combination therapy includes the administration of a nucleic acid encoding a factor VIII molecule and conventional therapeutic agents for the treatment of hemophilia A, includes any therapeutic approach that provides both a nucleic acid encoding a factor VIII molecule and a factor VIII molecule and/or hemostatic a non-factor VIII agent (eg, bypass therapeutic agent) to a patient to relieve, reduce, or prevent the recurrence of one or more symptoms (eg, clinical factors) associated with hemophilia. The term includes the performance of a procedure or regimen, the administration of any compound, drug, including a nucleic acid encoding a factor VIII molecule, including any modified form of factor VIII, that is useful for maintaining or improving the health of a person with hemophilia and including any of the agents that are described in this document.
Термины терапевтически эффективное количество или доза или терапевтически достаточное количество или доза или эффективное или достаточное количество, или доза относятся к дозе, которая дает терапевтические эффекты, для достижения которых она вводится. Например, терапевтически эффективное количество лекарственного средства, полезного для лечения гемофилии, может быть количеством, которое способно предотвращать или облегчать один или несколько симптомов, связанных с гемофилией. Точная доза будет зависеть от цели лечения и будет определена специалистом в данной области с использованием известных методов (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.The terms therapeutically effective amount or dose or therapeutically sufficient amount or dose or effective or sufficient amount or dose refer to a dose that produces the therapeutic effects for which it is administered. For example, a therapeutically effective amount of a drug useful for treating hemophilia may be an amount that is capable of preventing or ameliorating one or more symptoms associated with hemophilia. The exact dosage will depend on the purpose of treatment and will be determined by one skilled in the art using known methods (see, for example, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols.
- 13 046432- 13 046432
3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Используемый в данном документе термин ген относится к сегменту молекулы ДНК, которая кодирует полипептидную цепь (например, кодирующая область). В некоторых вариантах реализации изобретения ген расположен в областях, непосредственно предшествующих, следующих за и/или перекрывающихся с кодирующей областью, которая участвует в получении полипептидной цепи (например, регуляторные элементы, такие как промотор, энхансер, последовательность полиаденилирования, 5'нетранслируемая область, 3'-нетранслируемая область или интрон).As used herein, the term gene refers to a segment of a DNA molecule that encodes a polypeptide chain (eg, a coding region). In some embodiments, the gene is located in regions immediately preceding, following and/or overlapping a coding region that is involved in producing the polypeptide chain (e.g., regulatory elements such as a promoter, enhancer, polyadenylation sequence, 5' untranslated region, 3 '-untranslated region or intron).
Используемый в данном документе термин регуляторные элементы относится к нуклеотидным последовательностям, таким как промоторы, энхансеры, терминаторы, последовательности полиаденилирования, интроны и т.д., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке.As used herein, the term regulatory elements refers to nucleotide sequences, such as promoters, enhancers, terminators, polyadenylation sequences, introns, etc., that enable expression of a coding sequence in a cell.
Используемый в данном документе термин промоторный элемент относится к нуклеотидной последовательности, которая помогает контролировать экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, промоторные элементы расположены на 5'-конце начального сайта трансляции гена. Однако в некоторых вариантах реализации изобретения промоторный элемент может быть расположен внутри последовательности интрона или 3'-конца кодирующей последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения промотор, полезный для вектора генной терапии, получен из гена нативного белкамишени (например, промотор фактора VIII). В некоторых вариантах реализации изобретения промотор, полезный для вектора генной терапии, специфичен для экспрессии в конкретной клетке или ткани целевого организма (например, промотор, специфичный для печени). В других вариантах реализации изобретения один из множества хорошо охарактеризованных промоторных элементов используется в векторе генной терапии, описанном в данном документе. Неограничивающие примеры хорошо охарактеризованных промоторных элементов включают ранний промотор CMV, промотор β-актина и промотор метилCpG-связывающего белка 2 (МеСР2). В некоторых вариантах реализации изобретения промотор представляет собой конститутивный промотор, который обеспечивает по существу постоянную экспрессию белка-мишени. В других вариантах реализации изобретения промотор представляет собой индуцибельный промотор, который стимулирует экспрессию белка-мишени в ответ на конкретный стимул (например, воздействие конкретного лечения или агента). Для обзора получения промоторов для AAVопосредованной генной терапии см. Gray et al. (Human Gene Therapy 22: 1143-53 (2011)), чье содержание явно включено в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.As used herein, the term promoter element refers to a nucleotide sequence that helps control the expression of a coding sequence. Typically, promoter elements are located at the 5' end of the initial translation site of a gene. However, in some embodiments, the promoter element may be located within an intron sequence or 3' end of the coding sequence. In some embodiments, the promoter useful for the gene therapy vector is derived from a native target protein gene (eg, the factor VIII promoter). In some embodiments, the promoter useful for the gene therapy vector is specific for expression in a particular cell or tissue of the target organism (eg, a liver-specific promoter). In other embodiments, one of a variety of well-characterized promoter elements is used in a gene therapy vector described herein. Non-limiting examples of well-characterized promoter elements include the CMV early promoter, the β-actin promoter, and the methylCpG binding protein 2 (MeCP2) promoter. In some embodiments, the promoter is a constitutive promoter that provides substantially constant expression of the target protein. In other embodiments, the promoter is an inducible promoter that stimulates expression of a target protein in response to a particular stimulus (eg, exposure to a particular treatment or agent). For a review of the preparation of promoters for AAV-mediated gene therapy, see Gray et al. (Human Gene Therapy 22: 1143-53 (2011)), the contents of which are expressly incorporated by reference in their entirety for all purposes.
Используемый в данном документе термин вектор относится к любому носителю, используемому для переноса нуклеиновой кислоты (например, кодирующей конструкцию генной терапии фактора VIII) в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор содержит репликон, который функционирует для репликации носителя вместе с нуклеиновой кислотой-мишенью. Неограничивающие примеры векторов, полезных для генной терапии включают плазмиды, фаги, космиды, искусственные хромосомы и вирусы, которые функционируют как автономные единицы репликации in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор представляет собой вирусный носитель для введения нуклеиновой кислоты-мишени (например, полинуклеотид с измененными кодонами, кодирующий вариант фактора VIII). Многие модифицированные эукариотические вирусы, полезные для генной терапии, известны в данной области. Например, аденоассоциированные вирусы (AAV) особенно хорошо подходят для использования в генной терапии человека, потому что люди являются естественным хозяином этого вируса, природные вирусы, как известно, не способствуют каким-либо заболеваниям и эти вирусы вызывают незначительный иммунный ответ.As used herein, the term vector refers to any carrier used to transfer a nucleic acid (eg, encoding a factor VIII gene therapy construct) into a host cell. In some embodiments, the vector contains a replicon that functions to replicate the carrier along with the target nucleic acid. Non-limiting examples of vectors useful for gene therapy include plasmids, phages, cosmids, artificial chromosomes and viruses that function as autonomous replication units in vivo. In some embodiments, the vector is a viral carrier for introducing a target nucleic acid (eg, a codon-altered polynucleotide encoding a factor VIII variant). Many modified eukaryotic viruses useful for gene therapy are known in the art. For example, adeno-associated viruses (AAVs) are particularly well suited for use in human gene therapy because humans are the virus's natural host, naturally occurring viruses are not known to cause any disease, and these viruses elicit little immune response.
Используемый в данном документе термин островок CpG относится к области внутри полинуклеотида, имеющей статистически повышенную плотность CpG-динуклеотидов. Как используется в данном документе, область полинуклеотида (например, полинуклеотида с измененными кодонами, кодирующего белок фактора VIII) представляет собой остров CpG, если среди 200 оснований: (i) область имеет содержание GC более 50%, и (ii) отношение наблюдаемых CpG-динуклеотидов к ожидаемым CpGдинуклеотидам составляет по меньшей мере 0.6, как определено соотношением:As used herein, the term CpG island refers to a region within a polynucleotide that has a statistically increased density of CpG dinucleotides. As used herein, a region of a polynucleotide (eg, a codon-swapped polynucleotide encoding a factor VIII protein) is a CpG island if, among 200 bases: (i) the region has a GC content greater than 50%, and (ii) the ratio of observed CpG- dinucleotides to expected CpG dinucleotides is at least 0.6, as determined by the ratio:
A'ltpA'Ii:, 0.6.A'ltpA'Ii:, 0.6.
Дополнительную информацию о методах идентификации островков CpG см. в Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196 (2): 261-82 (1987), чье содержание прямо включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме, для всех целей.For further information on methods for identifying CpG islands, see Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196 (2): 261-82 (1987), the contents of which are expressly incorporated herein by reference in their entirety, for all purposes.
Используемый в данном документе термин нуклеиновая кислота относится к дезоксирибонуклеотидам или рибонуклеотидам и их полимерам в одно- или двухцепочечной форме и их комплементарным молекулам. Этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги нуклеотидов или модифицированные остатки или связи, которые являются синтетическими, встречающимися в природе и не встречающимися в природе, которые имеют сходные связывающие свойства, как референтнаяAs used herein, the term nucleic acid refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides and their polymers in single- or double-stranded form and their complementary molecules. This term covers nucleic acids containing known nucleotide analogues or modified residues or linkages that are synthetic, naturally occurring and non-naturally occurring, that have similar binding properties as the reference
- 14 046432 нуклеиновая кислота, и которые метаболизируются способом, подобным референтным нуклеотидам. Примеры таких аналогов включают, но не ограничиваются ими, фосфоротиоаты, фосфорамидаты, метилфосфонаты, хираль-метилфосфонаты, 2-O-метил-рибонуклеотиды и пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК).- 14 046432 nucleic acid, and which are metabolized in a manner similar to the reference nucleotides. Examples of such analogues include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2-O-methylribonucleotides and peptide nucleic acids (PNAs).
Термин аминокислота относится к природным и неприродным аминокислотам, включая аминокислотные аналоги и аминокислотные миметики, которые функционируют аналогично природным аминокислотам. Естественно встречающиеся аминокислоты включают те, которые кодируются генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицированы, например, гидроксипролин, укарбоксиглутамат и О-фосфосерин. Естественно встречающиеся аминокислоты могут включать, например, D- и L-аминокислоты. Используемые в данном документе аминокислоты могут также включать неприродные аминокислоты. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, то есть любой углерод, связанный с водородом, карбоксильная группа, аминогруппа и группа R, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид или метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные Rгруппы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные скелеты, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но их функция аналогична природной аминокислоте. Аминокислоты могут быть обозначены их общеизвестными трехбуквенными обозначениями, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Нуклеотиды также могут упоминаться их общепринятыми однобуквенными обозначениями.The term amino acid refers to natural and non-natural amino acids, including amino acid analogs and amino acid mimetics, which function similarly to naturally occurring amino acids. Naturally occurring amino acids include those encoded by the genetic code as well as those amino acids that are later modified, such as hydroxyproline, carboxyglutamate, and O-phosphoserine. Naturally occurring amino acids may include, for example, D- and L-amino acids. Amino acids used herein may also include unnatural amino acids. Amino acid analogues refer to compounds that have the same basic chemical structure as a naturally occurring amino acid, that is, any carbon bonded to a hydrogen, a carboxyl group, an amino group, and an R group, such as homoserine, norleucine, methionine sulfoxide, or methionine methylsulfonium. Such analogues have modified R groups (eg, norleucine) or modified peptide backbones, but retain the same basic chemical structure as the naturally occurring amino acid. Amino acid mimetics refer to chemical compounds that have a structure that differs from the general chemical structure of an amino acid, but their function is similar to that of a naturally occurring amino acid. Amino acids can be designated by their commonly used three-letter symbols, or by the single-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature. Nucleotides may also be referred to by their common single-letter designations.
Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту в данной области техники будет понятно, что индивидуальные замены, делеции или вставки в нуклеиновой кислоте или пептидной последовательности, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности является консервативно модифицированным вариантом, где изменение приводит к замещению аминокислоты химически подобной аминокислотой. Таблицы консервативных замещений, представляющие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Такие консервативно модифицированные варианты являются дополнением и не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели в данном описании.With regard to amino acid sequences, one skilled in the art will appreciate that individual substitutions, deletions or insertions in a nucleic acid or peptide sequence that alter, add or remove one amino acid or a small percentage of amino acids in the encoded sequence are conservatively modified variants where the change results in to the replacement of an amino acid with a chemically similar amino acid. Conservative substitution tables representing functionally similar amino acids are well known in the art. Such conservatively modified variants are in addition to and do not exclude polymorphic variants, interspecific homologs and alleles in this description.
Консервативные аминокислотные замещения, обеспечивающие функционально сходные аминокислоты, хорошо известны в данной области. В зависимости от функциональности конкретной аминокислоты, например, для каталитических, структурных или стерически важных аминокислот, различные группы аминокислот могут рассматриваться как консервативные замены друг для друга. В табл. 1 представлены группы аминокислот, которые считаются консервативными заменами на основе заряда и полярности аминокислоты, гидрофобности аминокислоты, поверхностным воздействиям/структурным характеристикам аминокислоты и влиянию аминокислоты на вторичную структуру.Conservative amino acid substitutions that provide functionally similar amino acids are well known in the art. Depending on the functionality of a particular amino acid, for example for catalytic, structural or sterically important amino acids, different groups of amino acids can be considered conservative replacements for each other. In table 1 shows groups of amino acids that are considered conservative substitutions based on the charge and polarity of the amino acid, the hydrophobicity of the amino acid, the surface effects/structural characteristics of the amino acid, and the effect of the amino acid on secondary structure.
Таблица 1Table 1
Группы консервативных аминокислотных замен на основе функциональности остатка в белкеGroups of conservative amino acid substitutions based on the functionality of the residue in the protein
- 15 046432- 15 046432
Термины идентичная или процентная идентичность в контексте двух или более нуклеиновых кислот или пептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, около 60% идентичности, предпочтительно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентичности в определенной области при сравнении и выравнивании для максимального соответствия участка сравнения или выделенной области) при измерении, например, с использованием алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или путем ручного выравнивания и визуального осмотра.The terms identical or percentage identity in the context of two or more nucleic acid or peptide sequences refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a certain percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (e.g., about 60% identity, preferably 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more identity in a specific area when compared and alignment to closely match the comparison site or highlighted region) when measured, for example, using the BLAST or BLAST 2.0 sequence comparison algorithms with the default parameters described below, or by manual alignment and visual inspection.
Как известно в данной области, множество различных программ могут быть использованы для определения идентичности или сходства последовательности белка (или нуклеиновой кислоты, как описано ниже) при сравнении с известной последовательностью. Идентичность последовательности и/или сходство определяются с использованием стандартных методов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь им, алгоритм идентичности локальной последовательности Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), by the sequence identity alignment algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), by the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988), посредством компьютерных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в программном пакете Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), программы для последовательностей Best Fit описанной Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 (1984), предпочтительно с использованием настроек по умолчанию или путем проверки. Предпочтительно, процентная идентичность вычисляется с помощью FastDB на основе следующих параметров: штраф несоответствия 1; штраф пропуска 1; штраф размера пропуска 0,33; и штраф вставки 30, Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc, все из которых включены посредством ссылки.As is known in the art, a variety of different programs can be used to determine the identity or similarity of a protein (or nucleic acid, as described below) sequence when compared to a known sequence. Sequence identity and/or similarity is determined using standard methods known in the art, including, but not limited to, the local sequence identity algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), by the sequence identity alignment algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970), by the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 (1988), through computer implementations of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics software package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), the Best Fit sequence program described by Devereux et al ., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 (1984), preferably using default settings or by checking. Preferably, percent identity is calculated using FastDB based on the following parameters: mismatch penalty 1; omission penalty 1; omission penalty 0.33; and Box 30 fine, Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc, all of which are incorporated by reference.
Примером полезного алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы связанных последовательностей с использованием прогрессивных парных выравниваний. Он также может отображать дерево, показывающее отношения кластеризации, используемые для создания выравнивания. PILEUP использует упрощение прогрессивного метода выравнивания Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987); метод аналогичен методу, описанному Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153 (1989), оба включены посредством ссылки. Полезные параметры PILEUP включают значение пропуска по умолчанию 3.00, значение длины пропуска по умолчанию 0.10, и взвешенные конечные пропуски.An example of a useful algorithm is PILEUP. PILEUP generates multiple sequence alignments from a group of related sequences using progressive pairwise alignments. It can also display a tree showing the clustering relationships used to create the alignment. PILEUP uses a simplification of the progressive alignment method Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987); the method is similar to that described by Higgins & Sharp CABIOS 5: 151-153 (1989), both incorporated by reference. Useful PILEUP parameters include a default skip value of 3.00, a default skip length value of 0.10, and weighted trailing skips.
Другим примером полезного алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); и Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993), оба включены посредством ссылки. Особенно полезной программой BLAST является программа WU-BLAST-2, полученная от Altschul et al., Methods in Enzymology,Another example of a useful algorithm is the BLAST algorithm, described in: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); and Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993), both incorporated by reference. A particularly useful BLAST program is the WU-BLAST-2 program from Altschul et al., Methods in Enzymology.
- 16 046432- 16 046432
266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]. WU-BLAST-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых имеют значения по умолчанию. Регулируемые параметры задаются со следующими значениями: интервал перекрытия=1, доля перекрытия=0,125, порог слова (Т)=11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими значениями и определяются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, с которой осуществляется поиск последовательности интереса; однако значения могут быть скорректированы для повышения чувствительности.266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html]. WU-BLAST-2 uses several search parameters, most of which have default values. The adjustable parameters are set with the following values: overlap interval=1, overlap fraction=0.125, word threshold (T)=11. The HSP S and HSP S2 parameters are dynamic values and are determined by the program itself, depending on the composition of a specific sequence and the composition of a specific database with which the sequence of interest is searched; however, values can be adjusted to improve sensitivity.
Дополнительным полезным алгоритмом является gapped BLAST, как сообщается в Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402, включена посредством ссылки. Gapped BLAST использует баллы замещения BLOSUM-62; пороговый параметр Т установлен в 9; two-hit метод для запуска расширений без пропусков; оценка длины к пропусков равна 10+k; Xu установлен на 16, а Xg установлен на 40 для этапа поиска базы данных и на 67 для выходного этапа алгоритмов. Выравнивания с разрывами запускаются с помощью оценки, соответствующей ~ 22 бит.An additional useful algorithm is gapped BLAST, as reported in Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402, incorporated by reference. Gapped BLAST uses BLOSUM-62 substitution scores; threshold parameter T is set to 9; two-hit method for running extensions without skipping; the estimate of the length k of gaps is 10+k; Xu is set to 16 and Xg is set to 40 for the database search stage and 67 for the output stage of the algorithms. Alignments with gaps are triggered using an estimate corresponding to ~22 bits.
Значения процентной идентичности аминокислотной последовательности определяются количеством совпадающих идентичных остатков, деленными на общее количество остатков более длинной последовательности в выровненной области. Более длинная последовательность - та, которая имеет больше значимых остатков в выровненной области (пробелы, введенные WU-Blast-2, чтобы максимизировать оценку выравнивания, игнорируются). Аналогичным образом, процентная идентичность последовательности нуклеиновой кислоты (%) по отношению к кодирующей последовательности идентифицированных полипептидов определяется как процентное содержание нуклеотидных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам нуклеотидов в кодирующей последовательности белка клеточного цикла. Предпочтительный метод использует модуль BLASTN для WU-BLAST-2, заданный по умолчанию, с интервалом перекрытия и долей перекрытия, установленным в 1 и 0,125 соответственно.Percentage amino acid sequence identity values are determined by the number of matching identical residues divided by the total number of residues of the longer sequence in the aligned region. The longer sequence is the one that has more significant residues in the aligned region (gaps introduced by WU-Blast-2 to maximize the alignment score are ignored). Similarly, percent nucleic acid sequence identity (%) to the coding sequence of the identified polypeptides is defined as the percentage of nucleotide residues in the candidate sequence that are identical to nucleotide residues in the cell cycle protein coding sequence. The preferred method uses the default BLASTN module of WU-BLAST-2 with the overlap interval and overlap fraction set to 1 and 0.125, respectively.
Выравнивание может включать введение пробелов в последовательностях, которые должны быть выровнены. Кроме того, для последовательностей, которые содержат либо больше или меньше аминокислот, чем белок, кодируемый последовательностью, изображенной на фиг. 2 (SEQ ID NO: 1), понятно, что в одном варианте реализации изобретения процент идентичности последовательности будет определяться на основе количества идентичных аминокислот или нуклеотидов по отношению к общему количеству аминокислот или нуклеотидов. Таким образом, например, идентичность последовательностей, которые короче, чем изображенная на фиг. 2 (SEQ ID NO: 1), как обсуждается ниже, будет определяться с использованием количества нуклеотидов в более короткой последовательности в одном варианте реализации изобретения. В подсчетах процентной идентичности относительный вес не присваивается различным проявлениям вариации последовательности, таким как вставки, удаления, замены и т.д.Alignment may involve introducing gaps in sequences to be aligned. Additionally, for sequences that contain either more or fewer amino acids than the protein encoded by the sequence depicted in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1), it is understood that in one embodiment of the invention, the percentage of sequence identity will be determined based on the number of identical amino acids or nucleotides relative to the total number of amino acids or nucleotides. Thus, for example, the identity of sequences that are shorter than that shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 1), as discussed below, will be determined using the number of nucleotides in a shorter sequence in one embodiment of the invention. In percent identity calculations, relative weights are not assigned to different manifestations of sequence variation such as insertions, deletions, substitutions, etc.
В одном варианте реализации изобретения только тождества оцениваются положительно (+1), и всем формам изменения последовательности, включая промежутки, присваивается значение 0, что устраняет необходимость в взвешенной шкале или параметрах, как описано ниже для расчетов подобия последовательности. Идентичность последовательности может быть рассчитана, например, путем деления количества совпадающих идентичных остатков на общее количество остатков более короткой последовательности в выровненной области и умножения на 100. Более длинная последовательность - это та, которая имеет больше остатков в выровненной области.In one embodiment of the invention, only identities are scored positively (+1), and all forms of sequence variation, including gaps, are assigned a value of 0, eliminating the need for weighted scales or parameters as described below for sequence similarity calculations. Sequence identity can be calculated, for example, by dividing the number of matching identical residues by the total number of residues of the shorter sequence in the aligned region and multiplying by 100. The longer sequence is the one that has more residues in the aligned region.
Термин аллельные варианты относится к полиморфным формам гена в определенном генетическом локусе, а также кДНК, полученным из мРНК транскриптов генов, и полипептидов, кодируемых ими. Термин предпочтительный кодон млекопитающих относится к подмножеству кодонов из множества кодонов, кодирующих аминокислоту, которые наиболее часто используются в белках, экспрессируемых в клетках млекопитающих, как показано в следующем списке: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn (AAC); Met (ATG); Ile (АТС); Thr (ACC); Trp (TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); и Pro (CCC).The term allelic variants refers to polymorphic forms of a gene at a specific genetic locus, as well as cDNAs derived from the mRNA of gene transcripts and the polypeptides they encode. The term mammalian preferred codon refers to a subset of codons from the set of amino acid-encoding codons that are most commonly used in proteins expressed in mammalian cells, as shown in the following list: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn(AAC); Met (ATG); Ile (PBX); Thr(ACC); Trp(TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); and Pro (CCC).
Используемый в данном документе термин измененный кодон относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид (например, вариант белка варианта VIII), где по меньшей мере один кодон природного полинуклеотида, кодирующего полипептид, был изменен для улучшения свойства полинуклеотидной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения улучшенное свойство способствует увеличению транскрипции мРНК, кодирующей полипептид, повышенной стабильности мРНК (например, увеличению периода полувыведения мРНК), увеличению трансляции полипептида и/или улучшению упаковки полинуклеотида внутри вектора. Неограничивающие примеры изменений, которые могут быть использованы для получения улучшенных свойств, включают в себя изменение использования и/или распределения кодонов для определенных аминокислот, регулирование глобального и/или локального содержания GC, удаление последовательностей, с высоким содержанием AT, удаление повторяющихся элементов последовательности, корректировку глобального и/или локального содержания динуклеотида CpG, удаление критических регулирующих элементов (например, ТАТАбокс и ССААТ-бокс), удаление сайтов сплайсинга интрон/экзон, улучшение регуляторных последоваAs used herein, the term altered codon refers to a polynucleotide sequence encoding a polypeptide (eg, a variant VIII protein) wherein at least one codon of the naturally occurring polynucleotide encoding the polypeptide has been altered to improve the property of the polynucleotide sequence. In some embodiments, the improved property results in increased transcription of the mRNA encoding the polypeptide, increased stability of the mRNA (eg, increased half-life of the mRNA), increased translation of the polypeptide, and/or improved packaging of the polynucleotide within the vector. Non-limiting examples of changes that can be used to obtain improved properties include changing codon usage and/or distribution for certain amino acids, adjusting global and/or local GC content, removing sequences with high AT content, removing repetitive sequence elements, adjusting global and/or local CpG dinucleotide content, removal of critical regulatory elements (for example, TATA box and CCAAT box), removal of intron/exon splice sites, improvement of regulatory sequences
- 17 046432 тельностей (например, введение консенсусной последовательности Козака) и удаление элементов последовательности, способных образовывать вторичную структуру (например, шпильки) в транскрибируемой мРНК.- 17 046432 activities (for example, the introduction of a Kozak consensus sequence) and the removal of sequence elements capable of forming secondary structure (for example, hairpins) in the transcribed mRNA.
Как обсуждалось в данном документе, существуют различные номенклатуры для обозначения компонентов, описанных в данном документе. CS-номер (например, CS04, CS01, CS23 и т.д.) относятся к полинуклеотидам с измененными кодонами, кодирующим полипептиды FVIII и/или кодируемые полипептиды, включая варианты. Например, CS01-FL относится к полинуклеотидной полноразмерной (Full Length) последовательности CS01 с измененными кодонами, или аминокислотной последовательности (иногда называемой в данном документе как CS01-FL-AA для аминокислотной последовательности (Amino Acid sequence) и CS01-FL-NA для последовательности нуклеиновой кислоты (Nucleic Acid sequenc)), кодируемой полинуклеотидной последовательностью CS01. Аналогично, CS01-LC относится либо к последовательности нуклеиновой кислотой с измененными кодонами (CS01-LC-NA), кодирующей легкую цепь полипептида FVIII, или аминокислотной последовательности (также иногда упоминаемой в данном документе как CS01-LC- АА) легкой цепи FVIII, кодируемой полинуклеотидной последовательностью CS01. Аналогично, CS01-HC, CS01-HC-AA и CS01-HC-NA одинаковы для тяжелой цепи FVIII. Как будет понятно специалистам в данной области, для конструкций, таких как CS01, CS04, CS23 и т.д., которые модифицированы только лишь за счет измененных кодонов (например, они не содержат дополнительных аминокислотных замен по сравнению с Refacto) аминокислотные последовательности будут идентичными, поскольку аминокислотные последовательности не изменяются при оптимизации кодонов. Таким образом, конструкции последовательности описания включают, но не ограничиваются ими, CS01-FL-NA, CS01-FL-AA, CS01-LC-NA, CS01-LC-AA, CS01-HC-AA, CS01-HC-NA, CS04-FL-NA, CS04-FL-AA, CS04-LC-NA, CS04-LC-AA, CS04-HC-AA, CS04-HC-NA, CS23-FL-NA, CS23-FL-AA, CS23 -LC-NA, CS23-LC-AA, CS23-HC-AA и CS23-HC-NA.As discussed herein, there are various nomenclatures to refer to the components described in this document. CS number (eg, CS04, CS01, CS23, etc.) refers to codon altered polynucleotides encoding FVIII polypeptides and/or encoded polypeptides, including variants. For example, CS01-FL refers to the Full Length polynucleotide sequence of CS01 with altered codons, or amino acid sequence (sometimes referred to herein as CS01-FL-AA for the Amino Acid sequence and CS01-FL-NA for the sequence nucleic acid sequence (Nucleic Acid sequence) encoded by the polynucleotide sequence CS01. Likewise, CS01-LC refers to either a codon altered nucleic acid sequence (CS01-LC-NA) encoding the light chain of a FVIII polypeptide, or an amino acid sequence (also sometimes referred to herein as CS01-LC-AA) of the FVIII light chain encoded by polynucleotide sequence CS01. Similarly, CS01-HC, CS01-HC-AA and CS01-HC-NA are the same for FVIII heavy chain. As will be appreciated by those skilled in the art, for constructs such as CS01, CS04, CS23, etc., which are modified only by altered codons (e.g., they do not contain additional amino acid substitutions compared to Refacto), the amino acid sequences will be identical , since amino acid sequences do not change during codon optimization. Thus, description sequence constructs include, but are not limited to, CS01-FL-NA, CS01-FL-AA, CS01-LC-NA, CS01-LC-AA, CS01-HC-AA, CS01-HC-NA, CS04 -FL-NA, CS04-FL-AA, CS04-LC-NA, CS04-LC-AA, CS04-HC-AA, CS04-HC-NA, CS23-FL-NA, CS23-FL-AA, CS23 -LC -NA, CS23-LC-AA, CS23-HC-AA and CS23-HC-NA.
Варианты Фактора VIII с измененными кодонами.Factor VIII variants with altered codons.
В некоторых вариантах реализации изобретения данное описание предлагает полинуклеотиды с измененными кодонами, кодирующие варианты фактора VIII. Эти полинуклеотиды с измененными кодонами обеспечивают значительно улучшенную экспрессию фактора VIII при введении в конструкции генной терапии на основе AAV. Полинуклеотиды с измененными кодонами также демонстрируют улучшенную упаковку AAV-вирионов по сравнению с конструкциями с традиционной оптимизацией кодонов. Как показано в примере 2 и табл. 4, заявители достигают этих преимуществ благодаря открытию трех полинуклеотидов с измененными кодонами (CS01-FL-NA, CS04-FL-NA и CS23-FL-NA), кодирующих полипептид фактора VIII с тяжелой и легкой цепями фактора VIII человека и коротким 14аминокислотным замещающий В-домен линкером (линкер SQ), содержащий фуриновый сайт расщепления для облегчения созревания активного белка FVIIIa in vivo.In some embodiments, this disclosure provides codon altered polynucleotides encoding variants of factor VIII. These codon-altered polynucleotides provide significantly improved factor VIII expression when incorporated into AAV-based gene therapy constructs. Codon-altered polynucleotides also demonstrate improved packaging of AAV virions compared to traditional codon-optimized constructs. As shown in example 2 and table. 4, Applicants achieve these advantages through the discovery of three codon altered polynucleotides (CS01-FL-NA, CS04-FL-NA and CS23-FL-NA) encoding a factor VIII polypeptide with human factor VIII heavy and light chains and a short 14 amino acid substituent B -linker domain (SQ linker) containing a furin cleavage site to facilitate maturation of active FVIIIa protein in vivo.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами, представленный в данном документе, имеет нуклеотидные последовательности с высокой идентичностью, по меньшей мере, с последовательностями CS01, CS04 или CS23 (SEQ ID NO 13, 1 и 20 соответственно), кодирующими тяжелую цепь фактора VIII и легкие цепь фактора VIII. Как известно в данной области, Вдомен фактора VIII является непригодным для активности in vivo. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, полностью не содержат В-домен фактора VIII. В некоторых вариантах реализации изобретения нативный В-домен фактора VIII заменен на короткий аминокислотный линкер, содержащий фуриновый сайт расщепления, например, линкер SQ, состоящий из аминокислот 760-773 CS01, CS04 или CS23 (SEQ ID NO 2, 2 и 21 соответственно). Линкер SQ также относится к последовательности BDLO04 (-АА для аминокислотной последовательности и -NA для нуклеотидной последовательности).In one embodiment of the invention, the codon altered polynucleotide provided herein has nucleotide sequences with high identity to at least the sequences CS01, CS04 or CS23 (SEQ ID NOs 13, 1 and 20, respectively) encoding the factor VIII heavy chain and factor VIII light chain. As is known in the art, the Factor VIII B domain is unsuitable for in vivo activity. Thus, in some embodiments, the codon altered polynucleotides provided herein lack the Factor VIII B domain entirely. In some embodiments, the native Factor VIII B domain is replaced with a short amino acid linker containing a furin cleavage site, for example, an SQ linker consisting of amino acids 760-773 CS01, CS04 or CS23 (SEQ ID NOs 2, 2 and 21, respectively). The SQ linker also refers to the sequence BDLO04 (-AA for amino acid sequence and -NA for nucleotide sequence).
В одном варианте реализации изобретения тяжелая и легкая цепи фактора VIII, кодируемые полинуклеотидом с измененными кодонами, представляют собой тяжелую и легкую цепи фактора VIII человека, соответственно. В других вариантах реализации изобретения тяжелая и легкая цепи фактора VIII, кодируемые полинуклеотидом с измененными кодонами представляют собой последовательности тяжелой и легкой цепей другого млекопитающего (например, фактора VIII свиньи). В других вариантах реализации изобретения тяжелая и легкая цепи фактора VIII представляют собой химерные тяжелую и легкую цепи (например, комбинацию первой человеческой последовательности и второй последовательности млекопитающего). В других вариантах реализации изобретения тяжелая и легкая цепи фактора VIII представляют собой гуманизированную версию тяжелой и легкой цепей другого млекопитающего, например, последовательности тяжелой и легкой цепей другого млекопитающего, в котором остатки последовательности человека замещены в выбранных положениях, чтобы уменьшить иммуногенность получаемого пептида при введении человеку.In one embodiment, the factor VIII heavy and light chains encoded by the codon-altered polynucleotide are human factor VIII heavy and light chains, respectively. In other embodiments, the factor VIII heavy and light chains encoded by the codon-altered polynucleotide are heavy and light chain sequences from another mammal (eg, porcine factor VIII). In other embodiments, the factor VIII heavy and light chains are chimeric heavy and light chains (eg, a combination of a first human sequence and a second mammalian sequence). In other embodiments, the factor VIII heavy and light chains are a humanized version of the heavy and light chains of another mammal, for example, the heavy and light chain sequences of another mammal, in which human sequence residues are substituted at selected positions to reduce the immunogenicity of the resulting peptide when administered to a human .
Содержание GC в генах человека варьирует в широких пределах: от менее 25% до более 90%. Однако, как правило, человеческие гены с более высоким содержанием GC экспрессируются на более высоких уровнях. Например, в Kudla et al. (PLoS Biol., 4 (6): 80 (2006)) показано, что увеличение содержания GC гена увеличивает экспрессию кодируемого полипептида, в первую очередь за счет усиления транскрипции и достижения более высокого уровня устойчивости транскрипта мРНК. Как правило, желаемоеThe GC content of human genes varies widely: from less than 25% to more than 90%. However, in general, human genes with higher GC content are expressed at higher levels. For example, in Kudla et al. (PLoS Biol., 4 (6): 80 (2006)) it is shown that increasing the content of the GC gene increases the expression of the encoded polypeptide, primarily by increasing transcription and achieving a higher level of stability of the mRNA transcript. As a rule, what is desired
- 18 046432 содержание GC в конструкции гена с оптимизацией кодонов равно или превышает 60%. Однако, родные геномы AAV имеют содержание GC около 56%.- 18 046432 the GC content in the codon optimized gene construct is equal to or greater than 60%. However, native AAV genomes have a GC content of about 56%.
Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, имеют содержание CG, которое более соответствует содержанию GC в нативных AAV-вирионах (например, около 56% GC), которое ниже, чем предпочтительное содержание CG полинуклеотидов, которые обычно проходят оптимизацию кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (например, 60% GC или выше). Как указано в примере 1, CS04-FLNA(SEQ ID NO: 1), которая имеет содержание GC около 56%, имеет улучшенную упаковку вирионов по сравнению с аналогичными последовательностями с измененными кодонами с более высоким содержанием GC.Accordingly, in some embodiments, the codon altered polynucleotides provided herein have a CG content that more closely matches the GC content of native AAV virions (e.g., about 56% GC) that is lower than the preferred CG content of polynucleotides that typically undergo codon optimization for expression in mammalian cells (eg, 60% GC or higher). As indicated in Example 1, CS04-FLNA(SEQ ID NO: 1), which has a GC content of approximately 56%, has improved virion packaging compared to similar codon-edited sequences with higher GC content.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет менее 60%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет менее 59%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет менее 58%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет менее 57%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет не более 56%.Thus, in some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is less than 60%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is less than 59%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is less than 58%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is less than 57%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is no more than 56%.
В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 54% до 59%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 55% до 59%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 56% до 59%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 54% до 58%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 55% до 58%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 56% до 58%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 54% до 57%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 55% до 57%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 56% до 57%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 54% до 56%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет от 55% до 56%.In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 54% and 59%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is between 55% and 59%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 56% and 59%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is between 54% and 58%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is between 55% and 58%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is between 56% and 58%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 54% and 57%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 55% and 57%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 56% and 57%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is between 54% and 56%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is between 55% and 56%.
В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет 56±0.5%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет 56±0.4%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет 56±0.3%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет 56±0.2%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид Фактора VIII, составляет 56±0.1%. В некоторых вариантах реализации изобретения общее содержание GC в полинуклеотиде с измененными кодонами, кодирующем полипептид фактора VIII, составляет 56%.In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is 56±0.5%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is 56±0.4%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the factor VIII polypeptide is 56±0.3%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is 56±0.2%. In some embodiments, the total GC content of the codon-altered polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is 56±0.1%. In some embodiments, the total GC content of the codon-mutated polynucleotide encoding the Factor VIII polypeptide is 56%.
Линкер, замещающий В-домен Фактора VIII.Linker replacing the B domain of Factor VIII.
В некоторых вариантах реализации изобретения связь между тяжелой цепью FVIII и легкой цепью (например, В-доменом в Факторе VIII дикого типа) дополнительно изменяется. Из-за ограничений по размеру упаковочной емкости AAV, варианты с удаленным, усеченным и/или замещенным на линкер Вдоменом должны улучшить эффективность конструкции генной терапии FVIII. Наиболее традиционно используемый замещающий В-домен линкер относится к SQ FVIII, который сохраняет только 14 аминокислот домена В в качестве линкерной последовательности. Другой вариант VIII свиньи (OBI-1, описанный в патенте США № 6,458,563) хорошо экспрессируется в клетках СНО и имеет более длинный линкер из 24 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения конструкции фактора VIII, кодируемые полинуклеотидами с измененными кодонами, описанные в данном документе, содержат в себе линкерную последовательность типа SQ В-домена. В других вариантах реализации изобретенияIn some embodiments, the association between the FVIII heavy chain and the light chain (eg, the B domain in wild-type Factor VIII) is further altered. Due to packaging capacity limitations of AAV, variants with the Bdomain deleted, truncated, and/or linker substituted should improve the efficacy of FVIII gene therapy designs. The most traditionally used B domain replacement linker is SQ FVIII, which retains only the 14 amino acids of the B domain as a linker sequence. Another porcine VIII variant (OBI-1, described in US Pat. No. 6,458,563) is well expressed in CHO cells and has a longer linker of 24 amino acids. In some embodiments, the factor VIII constructs encoded by the codon-altered polynucleotides described herein comprise a B domain SQ type linker sequence. In other embodiments of the invention
- 19 046432 конструкции фактора VIII, кодируемые полинуклеотидами с измененными кодонами, описанные в данном документе, содержат в себе линкерную последовательность типа 0BI-1 В-домена.- 19 046432 factor VIII constructs encoded by codon altered polynucleotides described herein contain a B domain type 0BI-1 linker sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат В-доменный линкер типа SQ (SFSQNPPVLKRHQR; BDL-SQ-AA; SEQ ID NO: 30), включая аминокислоты 760-762/1657-1667 В-домена фактора VIII дикого типа человека (FVIIIFL-AA, SEQ ID NO: 19) (Sandberg et al., Thromb. Haemost. 85:93 (2001)). В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер SQ-типа имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения Вдоменный линкер SQ-типа имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded factor VIII polypeptides described herein comprise an SQ type B domain linker (SFSQNPPVLKRHQR; BDL-SQ-AA; SEQ ID NO: 30), including B domain amino acids 760-762/1657-1667 human wild-type factor VIII (FVIIIFL-AA, SEQ ID NO: 19) (Sandberg et al., Thromb. Haemost. 85:93 (2001)). In some embodiments, the SQ-type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the SQ-type V-domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат в себе линкер В-домена типа Greengene, включая аминокислоты 760/15821667 В-домена фактора VIII дикого типа человека (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19) (Oh et al., Biotechnol. Prog., 17:1999 (2001)). В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер Greengeneтипа имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер Greengene-типа имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded Factor VIII polypeptides described herein comprise a Greengene-type B domain linker, including amino acids 760/15821667 of the human wild-type Factor VIII B domain (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19 ) (Oh et al., Biotechnol. Prog., 17:1999 (2001)). In some embodiments, the Greengene-type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the Greengene-type B domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат расширенный линкер В-домена SQ-типа, включая аминокислоты 760769/1657-1667 Фактора VIII дикого типа человека (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19) (Thim et al., Haemophilia, 16: 349 (2010)). В некоторых вариантах реализации изобретения удлиненный В-доменный линкер SQ-типа имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения удлиненный В-доменный линкер SQ-типа имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded Factor VIII polypeptides described herein comprise an extended SQ-type B-domain linker, including human wild-type Factor VIII amino acids 760769/1657-1667 (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19) (Thim et al., Haemophilia, 16: 349 (2010)). In some embodiments, the extended SQ-type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the extended SQ-type B domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат В-доменный линкер типа OBI-1 свиньи, включая аминокислоты SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO: 31) из В-домена свиного фактора VIII дикого типа (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа OBI-1 свиньи имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа OBI1 свиньи имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded factor VIII polypeptides described herein comprise a porcine OBI-1 type B domain linker, including the amino acids SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (SEQ ID NO: 31) from the wild type porcine factor VIII B domain (Toschi et al. , Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). In some embodiments, the porcine OBI-1 type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the porcine OBI1 B-domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат В-доменный линкер типа OBI-1 человека, включая аминокислоты 760772/1655-1667 В-домена фактора VIII дикого типа человека (FVIII-FL- АА, SEQ ID NO: 19). В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа OBI-1 человека имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа OBI-1 человека имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded Factor VIII polypeptides described herein comprise a human OBI-1 type B domain linker, including amino acids 760772/1655-1667 of the human wild-type Factor VIII B domain (FVIII-FL-AA, SEQ ID NO: 19). In some embodiments, the human OBI-1 type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the human OBI-1 type B domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
В некоторых вариантах реализации изобретения кодируемые полипептиды фактора VIII, описанные в данном документе, содержат В-доменный линкер типа 08, включая аминокислоты SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO: 32) из В-домена фактора VIII дикого типа свиньи (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа OBI-1 свиньи имеет одну аминокислотную замену относительно соответствующей последовательности дикого типа. В некоторых вариантах реализации изобретения В-доменный линкер типа 0BI-1 свиньи имеет две аминокислотные замены относительно соответствующей последовательности дикого типа.In some embodiments, the encoded factor VIII polypeptides described herein comprise a type 08 B domain linker including the amino acids SFSQNSRHQAYRYRRG (SEQ ID NO: 32) from the porcine wild type Factor VIII B domain (Toschi et al., Curr. Opin Mol Ther 12:517 (2010). In some embodiments, the porcine OBI-1 type B domain linker has one amino acid substitution relative to the corresponding wild-type sequence. In some embodiments, the porcine 0BI-1 B domain linker has two amino acid substitutions relative to the corresponding wild-type sequence.
Удаление В-домена из конструкций фактора VIII, по-видимому, не влияет на активность активированного фермента (например, FVIIIa), по-видимому, потому, что В-домен удаляется во время активации. Однако В-домен фактора VIII содержит несколько остатков, которые посттрансляционно модифицированы, например, путем N- или О-опосредованного гликозилирования. Анализ in silico (предсказание сайтов N-гликозилирования в белках человека, R. Gupta, E. Jung and S. Brunak, в подготовке (2004)) Вдомена фактора VIII дикого типа, предсказывает, что по меньшей мере четыре из этих сайтов гликозилируются in vivo. Считается, что эти модификации внутри В-домена вносят вклад в посттрансляционное регулирование и/или период полураспада фактора VIII in vivo.Removal of the B domain from factor VIII constructs does not appear to affect the activity of the activated enzyme (eg, FVIIIa), presumably because the B domain is removed during activation. However, the factor VIII B domain contains several residues that are post-translationally modified, for example, by N- or O-mediated glycosylation. In silico analysis (prediction of N-glycosylation sites in human proteins, R. Gupta, E. Jung and S. Brunak, in preparation (2004)) of the wild-type factor VIII domain predicts that at least four of these sites are glycosylated in vivo . These modifications within the B domain are thought to contribute to the post-translational regulation and/or half-life of factor VIII in vivo.
Хотя В-домен фактора VIII отсутствует в зрелом белке фактора Villa, гликозилирование в В-домене молекулы предшественника фактора VIII может увеличить период полувыведения белка до активации. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер кодируемой конструкции фактора VIII, описанный в данном документе, содержит одну или несколько гликозилируемых последовательностей, чтобы обеспечить гликозилирование in vivo. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере одну консенсусную гликозилируемую последовательность (например, консенсусную последовательность с N- или O-опосредованным глиAlthough the factor VIII B domain is absent from the mature factor Villa protein, glycosylation in the B domain of the factor VIII precursor molecule can increase the half-life of the protein before activation. Thus, in some embodiments, the polypeptide linker of the encoded factor VIII construct described herein contains one or more glycosylation sequences to enable glycosylation in vivo. In some embodiments, the polypeptide linker comprises at least one glycosylatable consensus sequence (e.g., an N- or O-mediated glycation consensus sequence
- 20 046432 козилированием). В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере две консенсусные гликозилируемые последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере три консенсусные гликозилируемые последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере четыре консенсусные гликозилируемые последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере пять консенсусных гликозилируемых последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10 или более консенсусных гликозилируемых последовательностей.- 20 046432 cosylation). In some embodiments, the polypeptide linker comprises at least two consensus glycosylation sequences. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least three consensus glycosylation sequences. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least four consensus glycosylation sequences. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least five consensus glycosylation sequences. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least 6, 7, 8, 9, 10 or more consensus glycosylation sequences.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере одну последовательность для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере две последовательности для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере три последовательности для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере четыре последовательности для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере пять последовательностей для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер содержит по меньшей мере 6, 7, 8, 9, 10 или более последовательностей для N-опосредованного гликозилирования NXS/T, где X представляет собой любую аминокислоту, отличную от Р, S или Т.In some embodiments, the polypeptide linker contains at least one sequence for N-mediated glycosylation NXS/T, where X is any amino acid other than P, S, or T. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least two sequences for N-mediated glycosylation of NXS/T, where X is any amino acid other than P, S, or T. In some embodiments, the polypeptide linker comprises at least three sequences for N-mediated glycosylation of NXS/T, where X is any amino acid other than P, S, or T. In some embodiments, the polypeptide linker comprises at least four sequences for N-mediated glycosylation NXS/T, where X is any amino acid other than P, S, or T. In some In embodiments, the polypeptide linker contains at least five sequences for N-mediated glycosylation of NXS/T, where X is any amino acid other than P, S, or T. In some embodiments, the polypeptide linker contains at least 6, 7, 8, 9, 10 or more sequences for N-mediated glycosylation of NXS/T, where X is any amino acid other than P, S or T.
Полинуклеотиды с измененными кодонами, кодирующие вариант Фактора VIII с расщепляемым линкером.Codon-altered polynucleotides encoding a variant of Factor VIII with a cleavable linker.
CS04 полинуклеотиды с измененными кодонами.CS04 polynucleotides with altered codons.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида фактора VIII, с линкером, который расщепляется in vivo. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), которая представляет собой часть CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), которая представляет собой часть CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления, который позволяет созревать in vivo (например, после экспрессии in vivo или введения полипептида-предшественника).In one embodiment, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a variant Factor VIII polypeptide with a linker that is cleaved in vivo. A factor VIII polypeptide contains a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), which is part of CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) encoding the factor VIII heavy chain . The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), which is a portion of CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) encoding the factor VIII light chain. The polypeptide linker contains a furin cleavage site that allows for in vivo maturation (eg, following in vivo expression or introduction of a precursor polypeptide).
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID N0 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NOS 3 и 4) соответственно.In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID N0 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOS 3 and 4), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер конструкции фактора VIII кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6), которая кодирует 14-аминокислотный линкер, соответствующий аминкислотам 760-773 CS04 -FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеетIn some embodiments, the polypeptide linker of the Factor VIII construct is encoded by a third nucleotide sequence having high sequence identity to BDLO04 (SEQ ID NO: 6), which encodes a 14-amino acid linker corresponding to amino acids 760-773 of CS04 -FL-AA (SEQ ID NO : 2). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 95% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has
- 21 046432 по меньшей мере 96% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность идентична BDLO04 (SEQ ID NO: 6).- 21 046432 at least 96% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 97% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 98% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence is identical to BDLO04 (SEQ ID NO: 6).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).In some embodiments, the codon-altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS04FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS04-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
CS01 полинуклеотиды с измененными кодонами В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида фактора VIII, с линкером, который расщепляется in vivo. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), которая представляет собой часть CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25), которая представляет собой часть CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления, который позволяет созревать in vivo (например, после экспрессии in vivo или введения полипептида-предшественника).CS01 codon altered polynucleotides In one embodiment, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a variant factor VIII polypeptide with a linker that is cleaved in vivo. A factor VIII polypeptide contains a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), which is part of CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) encoding the factor VIII heavy chain . The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25), which is a portion of CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) encoding the factor VIII light chain. The polypeptide linker contains a furin cleavage site that allows for in vivo maturation (eg, following in vivo expression or introduction of a precursor polypeptide).
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS01-HC-NA иIn some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS01-HC-NA and
- 22 046432- 22 046432
CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 24 и 25) соответственно.CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 24 and 25), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер конструкции фактора VIII кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6), которая кодирует 14-аминокислотный линкер, соответствующий аминокислотам 760-773 CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность идентична BDLO04 (SEQ ID NO: 6).In some embodiments, the polypeptide linker of the Factor VIII construct is encoded by a third nucleotide sequence having high sequence identity to BDLO04 (SEQ ID NO: 6), which encodes a 14-amino acid linker corresponding to amino acids 760-773 of CS01-FL-AA (SEQ ID NO : 2). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 95% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 96% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 97% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 98% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence is identical to BDLO04 (SEQ ID NO: 6).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13).
В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2).In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS01-FL-AA (SEQ ID NO: 2).
CS23 полинуклеотиды с измененными кодонами.CS23 polynucleotides with altered codons.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант полипептида фактора VIII, с линкером, который расщепляется in vivo. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), которая представляет собой часть CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23), которая представляет собой часть CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Полипептидный линкер содержит фуриновый сайт расщепления, который позволяет созревать in vivo (например, после экспрессии in vivo или введения полипептида-предшественника).In one embodiment, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a variant Factor VIII polypeptide with a linker that is cleaved in vivo. A factor VIII polypeptide contains a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), which is part of CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20) encoding the factor VIII heavy chain . The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23), which is a portion of CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20) encoding the factor VIII light chain. The polypeptide linker contains a furin cleavage site that allows for in vivo maturation (eg, following in vivo expression or introduction of a precursor polypeptide).
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеютIn some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are
- 23 046432 по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 22 и 23) соответственно.- 23 046432 at least 99% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs: 22 and 23), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептидный линкер конструкции фактора VIII кодируется третьей нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6), которая кодирует 14-аминокислотный линкер, соответствующий аминокислотам 760-773 CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с BDLO04 (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения третья нуклеотидная последовательность идентична BDLO04 (SEQ ID NO: 6).In some embodiments, the polypeptide linker of the factor VIII construct is encoded by a third nucleotide sequence having high sequence identity to BDLO04 (SEQ ID NO: 6), which encodes a 14-amino acid linker corresponding to amino acids 760-773 of CS23-FL-AA (SEQ ID NO : 21). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 95% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 96% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 97% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence has at least 98% identity with BDLO04 (SEQ ID NO: 6). In some embodiments, the third nucleotide sequence is identical to BDLO04 (SEQ ID NO: 6).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20).
В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23FL-AA (SEQ ID NO: 21). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21).In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS23FL-AA (SEQ ID NO: 21). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS23-FL-AA (SEQ ID NO: 21).
Полинуклеотиды с измененными кодонами, кодирующие одноцепочечный белок Фактора VIII.Polynucleotides with altered codons encoding single-stranded Factor VIII protein.
Конструкции фактора VIII, в которых фуриновый сайт расщепления, расположенный на С-конце В-домена удален, сохраняют активность в виде одноцепочечного полипептида, несмотря на то, что нормальное созревание молекулы фактора VIII не может происходить (Leyte et al. (1991)). Аналогично, конструкция Фактора VIII с отсутствующим В-доменом с аттенуированным фуриновым сайтом (содержащим аминокислотную замену R1664H) более биологически активна, чем соответствующая конструкция фактора VIII с фуриновым сайтом расщепления дикого типа (Siner et al. (2013)). Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариант полипептида фактора VIII. Одноцепочечный полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с Nконцом легкой цепи. Полипептидный линкер не содержит фуриновый сайт расщепления.Factor VIII constructs in which the furin cleavage site located at the C-terminus of the B domain is removed retain single-chain polypeptide activity despite the fact that normal maturation of the factor VIII molecule cannot occur (Leyte et al. (1991)). Similarly, a Factor VIII construct lacking the B domain with an attenuated furin site (containing the R1664H amino acid substitution) is more biologically active than the corresponding Factor VIII construct with a wild-type furin cleavage site (Siner et al. (2013)). Accordingly, in some embodiments, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a single-strand variant of a Factor VIII polypeptide. A single-chain factor VIII polypeptide contains a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The polypeptide linker does not contain a furin cleavage site.
CS04 одноцепочечные полинуклеотиды с измененными кодонами.CS04 single-stranded polynucleotides with altered codons.
В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариант полипептида фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII,In one embodiment, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a single-strand variant of a Factor VIII polypeptide. Factor VIII polypeptide contains factor VIII light chain,
- 24 046432 тяжелую цепь фактора VIII и, необязательно, полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), которая представляет собой часть CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), которая представляет собой часть CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Необязательный полипептидный линкер не содержит фуриновый сайт расщепления.- 24 046432 factor VIII heavy chain and, optionally, a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS04-HC-NA (SEQ ID NO: 3), which is part of CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) encoding the factor VIII heavy chain . The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS04-LC-NA (SEQ ID NO: 4), which is a portion of CS04-FL-NA (SEQ ID NO: 1) encoding the factor VIII light chain. The optional polypeptide linker does not contain a furin cleavage site.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NO 3 и 4) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS04-HC-NA и CS04-LC-NA (SEQ ID NOS 3 и 4) соответственно.In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOs 3 and 4), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS04-HC-NA and CS04-LC-NA (SEQ ID NOS 3 and 4), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS04-SC1NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS04-SC1NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS04-SC1-NA (SEQ ID NO: 9).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS04-SC2NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS04SC2-NA (SEQ ID NO: 11).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS04-SC2NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS04-SC2-NA (SEQ ID NO: 11). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS04SC2-NA (SEQ ID NO: 11).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, фактор VIIIA человека (760-1667) (SPI; HsFVIIIA (741-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность сIn some embodiments, the single-strand variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, human factor VIIIA (760-1667) (SPI; HsFVIIIA (741 -1648), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with
- 25 046432 высокой идентичностью с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотнаяпоследовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).- 25 046432 high identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS04-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, фактор FVIIIA человека (7721667) (SPI; HsFVIIIA (753-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS04SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).In some embodiments, the single-strand variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, human factor FVIIIA (7721667) (SPI; HsFVIIIA (753-1648) ), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS04SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS04-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).
CS01 одноцепочечные полинуклеотиды с измененными кодонами В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариант полипептида фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и, необязательно, полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), которая представляет собой часть CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25), которая представляет собой часть CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Необязательный полипептидный линкер не содержит фуриновый сайт расщепления.CS01 single-stranded codon altered polynucleotides In one embodiment of the invention, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a single-stranded variant of a factor VIII polypeptide. A factor VIII polypeptide comprises a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and optionally a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS01-HC-NA (SEQ ID NO: 24), which is part of CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) encoding the factor VIII heavy chain . The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 25), which is a portion of CS01-FL-NA (SEQ ID NO: 13) encoding the factor VIII light chain. The optional polypeptide linker does not contain a furin cleavage site.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO 24 и 25) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS01-HC-NA и CS01-LC-NA (SEQ ID NO: 24 и 25) соответственно.In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs 24 and 25), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS01-HC-NA and CS01-LC-NA (SEQ ID NOs: 24 and 25), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS01-SC1NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательностьIn some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS01-SC1NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence
- 26 046432 имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26).- 26046432 has at least 97% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS01-SC1-NA (SEQ ID NO: 26). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS01SC1-NA (SEQ ID NO: 26).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS01-SC2NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS01SC2-NA (SEQ ID NO: 27).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS01-SC2NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS01-SC2-NA (SEQ ID NO: 27). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS01SC2-NA (SEQ ID NO: 27).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, фактор FVIIIA человека (7601667) (SPI; HsFVIIIA (741-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).In some embodiments, the single-strand variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, human factor FVIIIA (7601667) (SPI; HsFVIIIA (741-1648) ), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS01SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS01-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, фактор FVIIIA человека (7721667) (SPI; HsFVIIIA (753-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS01SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).In some embodiments, the single-chain variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, human factor FVIIIA (7721667) (SPI; HsFVIIIA (753-1648) ), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS01SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS01-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).
CS23 одноцепочечные полинуклеотиды с измененными кодонами В одном варианте реализации изобретения полинуклеотиды с измененными кодонами, представленные в данном документе, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариант полипептида фактора VIII. Полипептид фактора VIII содержит легкую цепь фактора VIII, тяжелую цепь фактора VIII и, необязательно, полипептидный линкер, соединяющий С-конец тяжелой цепи с N-концом легкой цепи. Тяжелая цепь полипептида фактора VIII кодируется первой нуклеотидной последовательностью, имеющей высокую идентичность последовательности с CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), которая представляет собойCS23 single-stranded codon altered polynucleotides In one embodiment of the invention, the codon altered polynucleotides provided herein comprise a nucleotide sequence encoding a single-stranded variant of a factor VIII polypeptide. A factor VIII polypeptide comprises a factor VIII light chain, a factor VIII heavy chain, and optionally a polypeptide linker connecting the C-terminus of the heavy chain to the N-terminus of the light chain. The factor VIII polypeptide heavy chain is encoded by the first nucleotide sequence having high sequence identity with CS23-HC-NA (SEQ ID NO: 22), which is
- 27 046432 часть CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20), кодирующей тяжелую цепь фактора VIII. Легкая цепь полипептида фактора VIII кодируется второй нуклеотидной последовательностью с высокой идентичностью последовательности с CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23), которая представляет собой часть CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20) кодирующей легкую цепь фактора VIII. Необязательный полипептидный линкер не содержит фуриновый сайт расщепления.- 27 046432 part of CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20), encoding the heavy chain of factor VIII. The factor VIII polypeptide light chain is encoded by a second nucleotide sequence with high sequence identity to CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 23), which is a portion of CS23-FL-NA (SEQ ID NO: 20) encoding the factor VIII light chain. The optional polypeptide linker does not contain a furin cleavage site.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 95% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 96% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 97% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 98% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.5% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности имеют по меньшей мере 99.9% идентичности последовательности с CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO 22 и 23) соответственно. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и вторая нуклеотидные последовательности идентичны CS23-HC-NA и CS23-LC-NA (SEQ ID NO: 22 и 23) соответственно.In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 95% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 96% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 97% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 98% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.5% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences have at least 99.9% sequence identity with CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs 22 and 23), respectively. In some embodiments, the first and second nucleotide sequences are identical to CS23-HC-NA and CS23-LC-NA (SEQ ID NOs: 22 and 23), respectively.
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS23-SC1NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS23SC1-NA (SEQ ID NO: 28).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS23-SC1NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS23-SC1-NA (SEQ ID NO: 28). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS23SC1-NA (SEQ ID NO: 28).
В некоторых вариантах реализации изобретения полинуклеотид с измененными кодонами имеет нуклеотидную последовательность с высокой идентичностью последовательности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 95% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 96% идентичности с CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная последовательность идентична CS23SC2-NA (SEQ ID NO: 29).In some embodiments, the codon altered polynucleotide has a nucleotide sequence with high sequence identity to CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 95% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 96% identity with CS23-SC2NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 97% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 98% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.5% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence has at least 99.9% identity with CS23-SC2-NA (SEQ ID NO: 29). In some embodiments, the nucleotide sequence is identical to CS23SC2-NA (SEQ ID NO: 29).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, фактор FVIIIA человека (7601667) (SPI; HsFVIIIA (741-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последоваIn some embodiments, the single-strand variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10, human factor FVIIIA (7601667) (SPI; HsFVIIIA (741-1648) ), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS23SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence
- 28 046432 тельность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).- 28 046432 has at least 98% identity with CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS23-SC1-AA (SEQ ID NO: 10).
В некоторых вариантах реализации изобретения одноцепочечный вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с последовательностью CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, фактор VIIIA человека (772-1667) (SPI; HsFVIIIA (753-1648), SPE)). В некоторых вариантах реализации изобретения вариант фактора VIII, кодируемый полинуклеотидом с измененными кодонами, имеет аминокислотную последовательность с высокой идентичностью с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 97% идентичности с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 98% идентичности с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99% идентичности с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.5% идентичности с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 99.9% идентичности с CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислотная последовательность идентична CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).In some embodiments, the single-strand variant of factor VIII encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high sequence identity to CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12, human factor VIIIA (772-1667) (SPI; HsFVIIIA (753 -1648), SPE)). In some embodiments, the factor VIII variant encoded by the codon-altered polynucleotide has an amino acid sequence with high identity to CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 97% identity with CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 98% identity with CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99% identity with CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.5% identity with CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence has at least 99.9% identity with CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12). In some embodiments, the amino acid sequence is identical to CS23-SC2-AA (SEQ ID NO: 12).
Экспрессирующие векторы Фактора VIII.Factor VIII expression vectors.
В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе полинуклеотиды с измененными кодонами, интегрированы в экспрессирующие векторы.In some embodiments, the codon altered polynucleotides described herein are integrated into expression vectors.
Неограничивающие примеры экспрессирующих векторов включают вирусные векторы (например, векторы, подходящие для генной терапии), векторы в виде плазмид, векторы в виде бактериофагов, космиды, фазмиды, искусственные хромосомы и тому подобное.Non-limiting examples of expression vectors include viral vectors (eg, vectors suitable for gene therapy), plasmid vectors, bacteriophage vectors, cosmids, phasmids, artificial chromosomes, and the like.
Неограничивающие примеры вирусных векторов включают ретровирус, например, вирус мышиной лейкемии Молони (MMLV), вирус мышиной саркомы Харви, вирус мышиной опухоли молочной железы и вирус саркомы Роуса; аденовирусы, аденоассоциированные вирусы; вирусы типа SV40; полиомавирусы; вирусы Эпштейна-Барра; вирусы папилломы; вирусы герпеса; вирусы осповакцины; и вирусы полиомиелита.Non-limiting examples of viral vectors include a retrovirus, such as Moloney murine leukemia virus (MMLV), Harvey murine sarcoma virus, murine mammary tumor virus, and Rous sarcoma virus; adenoviruses, adeno-associated viruses; viruses like SV40; polyomaviruses; Epstein-Barr viruses; papilloma viruses; herpes viruses; vaccinia viruses; and polio viruses.
В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе полинуклеотиды с измененными кодонами интегрированы в векторы генной терапии. В некоторых вариантах реализации изобретения вектор генной терапии является ретровирусом и, в частности, ретровирусом с дефективной репликацией. Протоколы для производства ретровирусов с дефицитной репликацией известны в данной области техники. Для обзора см. Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).In some embodiments, the codon altered polynucleotides described herein are integrated into gene therapy vectors. In some embodiments, the gene therapy vector is a retrovirus and, in particular, a replication-defective retrovirus. Protocols for the production of replication-deficient retroviruses are known in the art. For review, see Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
В одном варианте реализации изобретения вектор генной терапии представляет собой вектор генной терапии, основанный на аденоассоциированном вирусе (AAV). AAV-системы были описаны ранее и, как правило, хорошо известны в данной области (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17 (6):1110-17 (1994); Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89 (13): 6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); и Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4): 699-708 (2012), которые включены в данное описание посредством ссылки во всей полноте для всех целей). Подробная информация о генерации и использовании векторов rAAV описана, например, в патентах США № 5,139,941 и 4,797,368, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки во всей их полноте для всех целей. В конкретном варианте реализации изобретения вектор AAV представляет собой вектор AAV-8.In one embodiment of the invention, the gene therapy vector is an adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy vector. AAV systems have been described previously and are generally well known in the art (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17 (6):1110-17 (1994); Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89 (13) : 6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); and Asokan A, et al. , Mol. Ther., 20(4): 699-708 (2012), which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes). Details regarding the generation and use of rAAV vectors are described, for example, in US Patent Nos. 5,139,941 and 4,797,368, each of which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. In a specific embodiment of the invention, the AAV vector is an AAV-8 vector.
В некоторых вариантах реализации изобретения описанные в данном документе полинуклеотиды с измененными кодонами, интегрированы в ретровирусный вектор экспрессии. Эти системы были описаны ранее и, как правило, хорошо известны в данной области (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). В конкретном варианте реализации изобретения ретровирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор (см., Например, Naldini et al., Science, 272 (5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71 (9):6641-6649, 1997; патенты США № 6,013,516 и 5,994,136).In some embodiments, the codon altered polynucleotides described herein are integrated into a retroviral expression vector. These systems have been described previously and are generally well known in the art (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). In a specific embodiment, the retroviral vector is a lentiviral vector (see, for example, Naldini et al., Science, 272 (5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871- 875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; US Patent Nos. 6,013,516 and 5,994,136).
Широкое разнообразие векторов может быть использовано для экспрессии полипептида фактора VIII из полипептида с измененными кодонами в культуре клеток, включая эукариотические и прокариотические экспрессирующие векторы. В некоторых вариантах реализации изобретения предполагается,A wide variety of vectors can be used to express factor VIII polypeptide from a codon-altered polypeptide in cell culture, including eukaryotic and prokaryotic expression vectors. In some embodiments of the invention it is assumed that
- 29 046432 что плазмидный вектор используется для экспрессии полипептида фактора VIII в культуре клеток. В общем, плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, которые получены от видов, совместимых с клеткой-хозяином, используются в связи с этими хозяевами. Вектор может содержать сайт репликации, а также маркирующие последовательности, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Плазмида будет содержать полинуклеотид с измененными кодонами, кодирующий полипептид фактора VIII, функционально связанный с одной или несколькими контрольными последовательностями, например, промотором.- 29 046432 that the plasmid vector is used to express factor VIII polypeptide in cell culture. In general, plasmid vectors containing replicon and control sequences that are derived from species compatible with the host cell are used in connection with these hosts. The vector may contain a replication site, as well as marking sequences that are capable of providing phenotypic selection in transformed cells. The plasmid will contain a codon-altered polynucleotide encoding a factor VIII polypeptide operably linked to one or more control sequences, such as a promoter.
Неограничивающие примеры векторов для прокариотической экспрессии включают плазмиды, такие как pRSET, рЕТ, pBAD и т.д., где промоторы, используемые в прокариотических экспрессирующих векторах, содержат lac, trc, trp, recA, araBAD и т.д. Примеры векторов для эукариотической экспрессии включают: (i) для экспрессии в дрожжах векторы, такие как pAO, pPIC, pYES, pMET, с использованием промоторов, таких как АОХ1, GAP, GAL1, AUG1 и т.д.; (ii) для экспрессии в клетках насекомых векторы, такие как рМТ, рАс5, pIB, pMIB, pBAC и т.д., с использованием промоторов, таких как РН, р10, МТ, Ас5, OpIE2, gp64, polh и т.д. и (iii) для экспрессии в клетках млекопитающих векторы, такие как pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV и т.д., и векторы, полученные из вирусных систем, таких как вирус осповакцины, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и т.д., с использованием промоторов таких как CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV и β-актин.Non-limiting examples of prokaryotic expression vectors include plasmids such as pRSET, pET, pBAD, etc., where the promoters used in the prokaryotic expression vectors contain lac, trc, trp, recA, araBAD, etc. Examples of eukaryotic expression vectors include: (i) for expression in yeast, vectors such as pAO, pPIC, pYES, pMET using promoters such as AOX1, GAP, GAL1, AUG1, etc.; (ii) for expression in insect cells, vectors such as pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC, etc., using promoters such as PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh, etc. . and (iii) for expression in mammalian cells, vectors such as pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV, etc., and vectors derived from viral systems such as vaccinia virus, adeno-associated viruses, herpes viruses, retroviruses etc., using promoters such as CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV and β-actin.
ПримерыExamples
Пример 1. Конструирование экспрессирующей последовательности с измененными кодонами варианта Фактора VIII.Example 1. Construction of an expression sequence with modified Factor VIII variant codons.
Необходимо было преодолеть два препятствия, чтобы создать кодирующую последовательность фактора VIII, которая эффективна для генной терапии гемофилии А. Во-первых, из-за ограничений размера генома обычных векторов доставки генной терапии (например, AAV-вирионов) полипептид, кодирующий фактор VIII, должен быть значительно укорочен. Во-вторых, кодирующую последовательность необходимо было изменить, чтобы: (i) стабилизировать взаимодействия при упаковке внутри вектора доставки, (ii) стабилизировать промежуточную мРНК и (iii) улучшить стабильность транскрипции/трансляции мРНК.Two obstacles had to be overcome to create a factor VIII coding sequence that is effective for gene therapy for hemophilia A. First, due to the genome size limitations of conventional gene therapy delivery vectors (eg, AAV virions), the polypeptide coding for factor VIII must be significantly shortened. Second, the coding sequence needed to be modified to: (i) stabilize packaging interactions within the delivery vector, (ii) stabilize the intermediate mRNA, and (iii) improve mRNA transcription/translation stability.
Для достижения первой цели заявители начали с конструкции варианта фактора VIII с удаленным В-доменом, называемой в данном документе FVIII-BDD-SQ. В этой конструкции В-домен заменяется последовательностью из 14 аминокислот, называемой последовательностью SQ. Рекомбинантный FVIII-BDD-SQ продается под торговым названием REFACTO® и, как было показано, эффективен для лечения гемофилии А. Однако нативная кодирующая последовательность для FVIII-BDD-SQ, которая содержит нуклеотидную последовательность дикого типа человека для тяжелой и легкой цепей фактора VIII, неэффективно экспрессируется в векторах генной терапии.To achieve the first goal, applicants began with the design of a B-domain deleted variant of Factor VIII, referred to herein as FVIII-BDD-SQ. In this design, the B domain is replaced with a 14 amino acid sequence called the SQ sequence. Recombinant FVIII-BDD-SQ is sold under the trade name REFACTO® and has been shown to be effective in the treatment of hemophilia A. However, the native coding sequence for FVIII-BDD-SQ, which contains the wild-type human nucleotide sequence for the factor VIII heavy and light chains, inefficiently expressed in gene therapy vectors.
Чтобы усилить слабую экспрессию нативного FVIII-BDD-SQ, алгоритм оптимизации кодонов, описанный в Fath et al. (PLoS ONE, 6:е17596 (2011)), модифицированный, как описано в Ward et al. (Blood, 117:798 (2011)) и в McIntosh et al. (Blood, 121, 3335-3344 (2013)) применяли к последовательности FVIIIBDD-SQ для создания первой промежуточной кодирующей последовательности CS04a. Однако заявители признали, что последовательность CS04a, созданная с использованием модифицированного алгоритма, может быть улучшена путем дальнейшей модификации последовательности. Соответственно, заявители повторно вводили CpG-динуклеотиды, повторно вводили кодон CGC для аргинина, меняли распределения лейцинового и серинового кодона, повторно вводили высококонсервативные пары кодонов и удаляли скрытый блок ТАТА, блок ССААТ и элементы сайта сплайсинга, избегая при этом CpGостровков и локального преобладания AT и GC-богатых участков.To enhance the weak expression of native FVIII-BDD-SQ, the codon optimization algorithm described in Fath et al. (PLoS ONE, 6:e17596 (2011)), modified as described in Ward et al. (Blood, 117:798 (2011)) and McIntosh et al. (Blood, 121, 3335-3344 (2013)) was applied to the FVIIIBDD-SQ sequence to create the first intermediate coding sequence CS04a. However, the applicants acknowledged that the CS04a sequence generated using the modified algorithm could be improved by further modification of the sequence. Accordingly, applicants reintroduced CpG dinucleotides, reintroduced the CGC codon for arginine, changed the leucine and serine codon distributions, reintroduced highly conserved codon pairs, and removed the cryptic TATA box, CCAAT box, and splice site elements while avoiding CpG islands and local predominance of AT and GC-rich areas.
Во-первых, модифицированный алгоритм систематически заменяет кодоны, содержащие CpGдинуклеотиды (например, аргининовые кодоны) на не-CpG динуклеотидные кодоны, и исключает/избегает CpG-динуклеотидов, формируемых соседними кодонами. Это строгое избегание CpGдинуклеотидов обычно делается для предотвращения индуцированного TLR иммунитета после внутримышечной инъекции ДНК-вакцин. Однако это ограничивает возможности оптимизации кодонов. Например, модифицированный алгоритм исключает использование полного набора кодонов CGX аргинина. Это особенно разрушительно в кодировании генов для экспрессии в клетках человека, поскольку CGC является наиболее часто используемым аргининовым кодоном в высоко экспрессируемых генах человека. Кроме того, предотвращение создания CpGs соседними кодонами дополнительно ограничивает возможности оптимизации (например, ограничивает количество пар кодонов, которые могут использоваться вместе).First, the modified algorithm systematically replaces codons containing CpG dinucleotides (eg, arginine codons) with non-CpG dinucleotide codons, and eliminates/avoids CpG dinucleotides generated by adjacent codons. This strict avoidance of CpG dinucleotides is usually done to prevent TLR-induced immunity after intramuscular injection of DNA vaccines. However, this limits the possibilities for codon optimization. For example, the modified algorithm eliminates the use of the full set of arginine CGX codons. It is particularly disruptive in encoding genes for expression in human cells, since CGC is the most commonly used arginine codon in highly expressed human genes. In addition, preventing neighboring codons from creating CpGs further limits optimization opportunities (eg, limiting the number of codon pairs that can be used together).
Поскольку не ожидается, что индуцированный TLR иммунитет будет проблемой, связанной с печеночной генной терапией на основе AAV, кодоны, содержащие CpG, и соседние кодоны, формирующие CpG, были повторно введены в промежуточную кодирующую последовательность CS04a, предпочтительно в последовательности, кодирующей легкую цепь фактора VIII (например, на 3'-конце кодирующей последовательности FVIII-BDD-SQ). Это позволило применять более частое использование предпочтительных кодонов человека, особенно для аргинина. Однако была предпринята осторожность, чтобыSince TLR-induced immunity is not expected to be a problem associated with hepatic AAV-based gene therapy, CpG-containing codons and adjacent CpG-forming codons were reintroduced into the intermediate coding sequence of CS04a, preferably into the factor VIII light chain coding sequence (eg at the 3' end of the FVIII-BDD-SQ coding sequence). This allowed for increased use of human preferred codons, especially for arginine. However, care has been taken to
- 30 046432 избежать создания островков CpG, которые являются областями кодирующей последовательности, имеющими высокую частоту CpG-сайтов. Это противоречит учениям Krinner et al. (Nucleic Acids Res., 42 (6): 3551-64 (2014)), где предполагается, что домены CpG ниже сайтов начала транскрипции способствуют высоким уровням экспрессии генов.- 30 046432 avoid the creation of CpG islands, which are regions of the coding sequence that have a high frequency of CpG sites. This is contrary to the teachings of Krinner et al. (Nucleic Acids Res., 42 (6): 3551-64 (2014)), which suggests that CpG domains downstream of transcription start sites contribute to high levels of gene expression.
Во-вторых, модифицированный алгоритм применяет исключительно кодоны, такие как CTG для лейцина, GTG для валина и CAG для глутамина. Однако это нарушает принципы сбалансированного использования кодонов, например, как предложено в Haas et al. (Current Biology, 6(3):315-24 (1996)). Для учета чрезмерного использования предпочтительных кодонов с помощью модифицированного алгоритма, альтернативные кодоны лейцина были повторно введены, если это позволялось другими правилами, применяемыми к изменению кодона (например, частота CpG и содержание GC).Second, the modified algorithm exclusively uses codons such as CTG for leucine, GTG for valine, and CAG for glutamine. However, this violates the principles of codon balancing, for example, as proposed in Haas et al. (Current Biology, 6(3):315-24 (1996)). To account for overuse of preferred codons by the modified algorithm, alternative leucine codons were reintroduced if allowed by other rules applied to codon variation (e.g., CpG frequency and GC content).
В-третьих, модифицированный алгоритм заменяет пары кодонов независимо от того, насколько они консервативны, когда выполняются определенные условия (например, наличие CG-динуклеотидов). Для учета полезных свойств, которые могли быть сохранены путем эволюции, наиболее консервативные пары кодонов, которые были заменены алгоритмом и наиболее консервативные предпочтительные пары кодонов, например, как описано в Tats et al. (ВМС Genomics 9:463 (2008)), были проанализированы и скорректированы там, где это позволялось другими правилами, применяемыми к изменению кодонов (например, частота CpG и содержание GC).Third, the modified algorithm replaces codon pairs no matter how conserved they are when certain conditions are met (for example, the presence of CG dinucleotides). To account for beneficial properties that may have been conserved by evolution, the most conserved codon pairs that were replaced by the algorithm and the most conserved preferred codon pairs, for example, as described in Tats et al. (BMC Genomics 9:463 (2008)) were analyzed and adjusted where allowed by other rules applying to codon changes (eg, CpG frequency and GC content).
В-четвертых, сериновые кодоны, используемые в промежуточной кодирующей последовательности, также были повторно модифицированы. В частности, сериновые кодоны AGC, ТСС и ТСТ были введены в модифицированную кодирующую последовательность с более высокой частотой, чтобы лучше соответствовать природному распределению кодонов человека (Haas et al., supra).Fourth, the serine codons used in the intermediate coding sequence were also re-modified. In particular, the serine codons AGC, TCC and TCT were introduced into the modified coding sequence at higher frequency to better match the natural human codon distribution (Haas et al., supra).
В-пятых, элементы ТАТА-бокса, ССААТ-бокса и сайты сплайна интрон/экзон были выявлены и удалены из модифицированной кодирующей последовательности. При модификации кодирующей последовательности была предпринята осторожность, чтобы избежать локального избыточного увеличения встречаемости AT- или GC-насыщенных участков.Fifth, TATA box elements, CCAAT box elements, and intron/exon spline sites were identified and removed from the modified coding sequence. When modifying the coding sequence, care was taken to avoid local over-increase in the occurrence of AT- or GC-rich regions.
Наконец, помимо оптимизации использования кодонов в кодирующей последовательности, структурные требования для AAV-вириона были рассмотрены при дальнейшей модификации промежуточной кодирующей последовательности CS04a. AAV-векторы (например, часть нуклеиновой кислоты AAVвириона) упаковываются в виде одноцепочечных молекул ДНК в их капсиды (для обзора см. Daya and Berns, Clin. Microbiol Rev., 21(4):583-93 (2008)). Следовательно, содержание GC в векторе, вероятно, будет влиять на упаковку генома и, следовательно, на выход вектора во время продукции. Как и многие алгоритмы, модифицированный алгоритм, используемый в данном документе, создает оптимизированную последовательность генов с содержанием GC не менее 60% (см. Fath et al., PLoS One, 6 (3): е17596 (2011) (erratum in: PLoS One, (6) 3 (2011)). Однако капсидный белок AAV8 кодируется нуклеотидной последовательностью, имеющей более низкое содержание GC около 56%. Таким образом, чтобы лучше имитировать природную кодирующую последовательность белка капсидного AAV8, содержание GC в промежуточной кодирующей последовательности CS04a было снижено до 56%.Finally, in addition to optimizing codon usage in the coding sequence, the structural requirements for the AAV virion were considered by further modifying the intermediate coding sequence CS04a. AAV vectors (eg, the nucleic acid portion of the AAV virion) are packaged as single-stranded DNA molecules in their capsids (for review, see Daya and Berns, Clin. Microbiol Rev., 21(4):583-93 (2008)). Therefore, the GC content of the vector is likely to influence genome packaging and therefore vector yield during production. Like many algorithms, the modified algorithm used here produces an optimized gene sequence with at least 60% GC content (see Fath et al., PLoS One, 6 (3): e17596 (2011) (erratum in: PLoS One , (6) 3 (2011). However, the AAV8 capsid protein is encoded by a nucleotide sequence that has a lower GC content of about 56%. Thus, to better mimic the natural coding sequence of the AAV8 capsid protein, the GC content of the intermediate coding sequence CS04a was reduced to 56%.
Полученная CS04 кодирующая последовательность, изображенная на фиг. 2, имеет общее содержание GC равное 56%.The resulting CS04 coding sequence shown in FIG. 2, has a total GC content of 56%.
Содержание CpG-динуклеотида в последовательности является умеренным. Однако CpGдинуклеотиды преимущественно присутствуют в нижерасположенной части кодирующей последовательности, например, части, кодирующей легкую цепь фактора VIII. Последовательность CS04 имеет идентичность нуклеотидной последовательности 79,77% с соответствующими кодирующими последовательностями фактора VIII дикого типа (номер доступа Genbank M14113).The content of CpG dinucleotide in the sequence is moderate. However, CpG dinucleotides are predominantly present in the downstream portion of the coding sequence, for example, the portion encoding the factor VIII light chain. The CS04 sequence has 79.77% nucleotide sequence identity with the corresponding wild-type factor VIII coding sequences (Genbank accession number M14113).
Для сравнения были подготовлены несколько других конструкций ReFacto с оптимизированными кодонами. CS01 был сконструирован путем применения алгоритма оптимизации кодонов Fath et al., модифицированного согласно Ward et al., как это сделано для CS04. Однако, в отличие от CS04, конструкция CS01 не содержит никаких островков CpG. Конструкция CS08 ReFacto была подвергнута оптимизации кодонов, как описано в Radcliff P.M. et al., Gene Therapy, 15: 289-97 (2008), чье содержание полностью включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Конструкцию ReFacto с оптимизированными кодонами, основанную на кодонах CS10, была получена от Eurofins Genomics (Эберсберг, Германия). Конструкция CS11 ReFacto с оптимизированными кодонами, была получена от Integrated DNA Technologies, Inc. (Коралвилль, США). Конструкция СН25 ReFacto с оптимизированными кодонами, была получена от ThermoFischer Scientific's GeneArt services (Регенсбург, Германия). Конструкция CS4 0 ReFacto состоит из кодирующей последовательности фактора VIII дикого типа. Алгоритм, используемый для построения CS23, основан на JCAT tool (www.jcat.de), онлайн инструмент для оптимизации кодонов (Grote et al., 2005; Nucl. Acids Res. W526-31). Последовательность была дополнительно модифицирована, чтобы больше соответствовать использованию кодонов надсемейства альбумина (Mirsafian et al., 2014: Sc. Word Journal 2014, ID 639682). Идентификаторы последовательностей, общие для каждой из кодирующих последовательностей ReFacto, показаны в табл. 2 ниже.Several other codon optimized ReFacto constructs were prepared for comparison. CS01 was designed by applying the codon optimization algorithm of Fath et al., modified according to Ward et al., as done for CS04. However, unlike CS04, the CS01 construct does not contain any CpG islands. The CS08 ReFacto construct was subjected to codon optimization as described in Radcliff P.M. et al., Gene Therapy, 15: 289-97 (2008), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes. The codon-optimized ReFacto construct based on CS10 codons was obtained from Eurofins Genomics (Ebersberg, Germany). The codon optimized CS11 ReFacto construct was obtained from Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, USA). The codon optimized CH25 ReFacto construct was obtained from ThermoFischer Scientific's GeneArt services (Regensburg, Germany). The CS4 0 ReFacto construct consists of the wild-type factor VIII coding sequence. The algorithm used to construct CS23 is based on the JCAT tool (www.jcat.de), an online tool for codon optimization (Grote et al., 2005; Nucl. Acids Res. W526-31). The sequence was further modified to be more consistent with the use of albumin superfamily codons (Mirsafian et al., 2014: Sc. Word Journal 2014, ID 639682). Sequence identifiers common to each of the ReFacto coding sequences are shown in Table 1. 2 below.
- 31 046432- 31 046432
Таблица 2table 2
Плазмиды каждой конструкции были сконструированы путем клонирования различных синтетических фрагментов ДНК в одну и ту же векторную основную плазмиду (pCh-BB01). Синтез ДНК фрагментов BDD-FVIII Refacto-типа с фланкирующими сайтами рестрикции ферментов AscI и NotI были выполнены с помощью ThermoFischer Scientific (Регенсбург, Германия). Основа вектора содержит два фланкирующих инвертированных концевых повторов AAV2 (ITR), которые содержат последовательность промотора/энхансера, полученную из мышиного транстиретина печени, сайты рестрикции фермента AscI и NotI для вставки соответствующего BDD-FVIII типа Refacto и синтетический полиА-сайт. После лигирования подготовленной векторной основы и вставок с помощью сайтов AscI и NotI полученные плазмиды амплифицировали в миллиграммном масштабе. Последовательности конструкций BDD-FVIII типа Refacto были подтверждены прямым секвенированием (Microsynth, Balgach, Switzerland). Клонирование приводило к созданию семи различных плазмидных конструкций с именем pCS40, pCS0l, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11, pCh25 и pCS23 (фиг. 19). Конструкции имеют одинаковую векторную основу и кодируют один и тот же белок FVIII с отсутствующим В-доменом (Refacto-тип BDD-FVIII), но отличаются по своей кодирующей последовательности FVIII.The plasmids of each construct were constructed by cloning different synthetic DNA fragments into the same vector master plasmid (pCh-BB01). Synthesis of BDD-FVIII Refacto-type DNA fragments with flanking AscI and NotI restriction enzyme sites was performed using ThermoFischer Scientific (Regensburg, Germany). The vector backbone contains two flanking AAV2 inverted terminal repeats (ITRs) that contain a promoter/enhancer sequence derived from murine liver transthyretin, AscI and NotI enzyme restriction sites for insertion of the corresponding Refacto type BDD-FVIII, and a synthetic polyA site. After ligation of the prepared vector backbone and inserts with AscI and NotI sites, the resulting plasmids were amplified on a milligram scale. The sequences of the Refacto type BDD-FVIII constructs were confirmed by direct sequencing (Microsynth, Balgach, Switzerland). Cloning resulted in the creation of seven different plasmid constructs named pCS40, pCS0l, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11, pCh25 and pCS23 (Fig. 19). The constructs have the same vector backbone and encode the same FVIII protein with the B domain missing (Refacto-type BDD-FVIII), but differ in their FVIII coding sequence.
Векторы AAV8 были получены с помощью трех способов трансфекции плазмидами, как описано в Grieger J.C., et al. (Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, Mol Ther., Oct 6. (2015) doi: 10.1038/mt.2015.187. [Epub перед печатью]), чье содержание полностью включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Суспензированные клетки HEK293 использовали для трансфекции плазмидами с использованием соответствующей векторной плазмиды FVIII, хелперной плазмиды рХХ6-80 (несущей аденовирусные хелперные гены) и упаковочной плазмиды pGSK2/8 (вносящей гены rep2 и сар8). Чтобы изолировать конструкции AAV8, клеточный осадок из одного литра культуры обрабатывали с использованием градиентов йодиксанола, как описано в Grieger et al. (2015, Supra). Процедура привела к получению векторных препаратов, называемых vCS01, vCS04, vCS08, vCS10, vCS11 и vCH25. Векторы были количественно оценены с помощью qPCR, используя универсальную процедуру qPCR, с использованием инвертированных концевых повторов AAV2 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part В 23:18-28 (2012)). Контрольная векторная плазмида, несущая инвертированные концевые повторы AAV2, использовалась для получения стандартной кривой. Результирующая конструкция VCS04 представлена как SEQ ID NO: 8 на фиг. 7А-7С.AAV8 vectors were generated by three plasmid transfection methods as described in Grieger J.C., et al. (Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, Mol Ther., Oct 6. (2015) doi: 10.1038/mt.2015.187. [Epub ahead of print]), whose the contents are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes. Suspended HEK293 cells were used for plasmid transfection using the corresponding FVIII vector plasmid, helper plasmid pXX6-80 (carrying adenoviral helper genes) and packaging plasmid pGSK2/8 (containing the rep2 and cap8 genes). To isolate AAV8 constructs, cell pellets from one liter of culture were treated using iodixanol gradients as described in Grieger et al. (2015, Supra). The procedure resulted in vector drugs called vCS01, vCS04, vCS08, vCS10, vCS11 and vCH25. Vectors were quantified by qPCR using the generic qPCR procedure using AAV2 inverted terminal repeats (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012)). A control vector plasmid carrying AAV2 inverted terminal repeats was used to generate a standard curve. The resulting VCS04 design is shown as SEQ ID NO: 8 in FIG. 7A-7C.
Целостность векторных геномов анализировали с помощью электрофореза AAV в агарозном геле. Электрофорез проводили, как описано в Fagone et al., Human Gene Therapy Methods 23:1-7 (2012). Вкратце, препараты AAV-вектора инкубировали при температуре 75°С в течение 10 мин в присутствии 0,5% SDS и затем охлаждали до комнатной температуры. Приблизительно 1.5Е10 векторных геномов (vg) загружали на дорожку 1% 1xTAE агарозного геля и подвергали электрофорезу в течение 60 мин при напряженности электрического поля 7 В/см длины геля. Затем гель окрашивали с помощью раствора 2х GelRed (Biotium Cat # 41003) и визуализировали с помощью ChemiDocTMMP (Biorad). Результаты, изображенные на фиг. 20, показывают, что вирусные векторы vCS0l, vCS04 и vCS40 имеют геном одинакового размера, обозначенный отдельной полосой в диапазоне 5 кб (фиг. 20, дорожки 2-4). Несмотря на размер вектора около 5,2 кб, геном проявляется в виде однородной полоски, подтверждающей правильную упаковку генома несколько завышенного размера (относительно AAV генома дикого типа 4,7 т.п.н.). Все остальные векторы vCS демонстрируют тот же геномный размер (данные не показаны).The integrity of the vector genomes was analyzed by AAV agarose gel electrophoresis. Electrophoresis was performed as described in Fagone et al., Human Gene Therapy Methods 23:1-7 (2012). Briefly, AAV vector preparations were incubated at 75°C for 10 min in the presence of 0.5% SDS and then cooled to room temperature. Approximately 1.5E10 vector genomes (vg) were loaded onto a 1% 1xTAE agarose gel lane and electrophoresed for 60 min at an electric field strength of 7 V/cm of gel length. The gel was then stained with 2x GelRed solution (Biotium Cat #41003) and visualized with ChemiDocTMMP (Biorad). The results shown in FIG. 20 show that the viral vectors vCS0l, vCS04 and vCS40 have a genome of the same size, indicated by a distinct band in the 5 kb range (Fig. 20, lanes 2-4). Despite the vector size of about 5.2 kb, the genome appears as a uniform stripe, confirming the correct packaging of the somewhat oversized genome (relative to the wild-type AAV genome of 4.7 kb). All other vCS vectors exhibit the same genomic size (data not shown).
Чтобы подтвердить ожидаемый паттерн капсидных белков, SDS PAGE с последующим окрашиванием серебром проводили с векторами vCS01, vCS04 и vCS40 (фиг. 21). Как показано на чертеже, дальнейшая процедура очистки привела к получению высокоочищенного препарата, демонстрирующегоTo confirm the expected pattern of capsid proteins, SDS PAGE followed by silver staining was performed with vectors vCS01, vCS04 and vCS40 (Fig. 21). As shown in the drawing, a further purification procedure resulted in a highly purified preparation exhibiting
- 32 046432 ожидаемый паттерн белков VP1, VP2 и VP3 (фиг. 21, дорожки 2-4). Тот же паттерн была получен для всех других вирусных препаратов (не показаны). Процедура SDS-PAGE препаратов AAV проводилась в соответствии со стандартными протоколами. Каждая дорожка содержала 1Е10 vg соответствующей вирусной конструкции и разделялась на 4-12% геле Bis-Tris (NuPAGE® Novex, Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Окрашивание серебром выполнялось с помощью набора SilverQuestTM (Novex, Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя.- 32 046432 expected pattern of proteins VP1, VP2 and VP3 (Fig. 21, lanes 2-4). The same pattern was obtained for all other viral preparations (not shown). The SDS-PAGE procedure of AAV preparations was performed according to standard protocols. Each lane contained 1E10 vg of the corresponding viral construct and was separated on a 4-12% Bis-Tris gel (NuPAGE® Novex, Life Technologies) according to the manufacturer's instructions. Silver staining was performed using the SilverQuestTM kit (Novex, Life Technologies) according to the manufacturer's instructions.
Удивительно, но AAV-векторы vCS01 и VCS04 имели более плотную упаковку вирионов, измеряемую более высокими выходами при производстве вируса AAV по сравнению с кодирующей конструкцией дикого типа VCS40 и другими конструкциями с оптимизированными кодонами. Как показано в табл. 3, векторы vCS01 и vCS04 реплицируются значительно лучше, чем VCS40, что обеспечивает увеличение выхода AAV в 5-7 раз.Surprisingly, the AAV vectors vCS01 and VCS04 had denser virion packaging, as measured by higher yields in AAV virus production compared to the wild-type VCS40 coding construct and other codon-optimized constructs. As shown in table. 3, vectors vCS01 and vCS04 replicate significantly better than VCS40, resulting in a 5- to 7-fold increase in AAV yield.
Таблица 3Table 3
Выход на 1 л клеточной культуры, полученной с помощью векторных конструкций AAV vCS01, vCS04 и vCD40 при очищении от клеточного осадкаYield per 1 liter of cell culture obtained using AAV vector constructs vCS01, vCS04 and vCD40 when purified from cell sediment
Пример 2. Экспрессия In Vivo вариантов экспрессирующих последовательностей фактора VIII с измененными кодонами.Example 2. In Vivo Expression of Codon-Altered Factor VIII Expression Sequence Variants.
Для проверки биологической активности вариантов последовательностей фактора VIII с измененными кодонами, конструкции FVIII типа ReFacto, описанные в примере 1, вводили мышам, не имеющим фактора VIII. Вкратце, анализы проводили с использованием нокаутных по С57В1/6 FVIII мышей (на) (68 животных на группу) путем инъекции в хвостовую вену 4Е12 векторных геномов (vg) на килограмм массы тела мыши. Кровь отбирали через 14 дней после инъекции путем ретроорбитальной пункции, плазму готовили и замораживали, используя стандартные процедуры. Уровни экспрессии измеряли на 14-й день из-за минимального влияния ингибирующих антител в это время, которое наблюдаются у некоторых животных этой мышиной модели в более поздние сроки. Активность FVIII в мышиной плазме определяли с использованием анализа Technochrome FVIII с незначительными модификациями, как это было предложено производителем (Technoclone, Вена, Австрия). Для анализа образцы плазмы соответствующим образом разбавляли и смешивали с аналитическими реагентами, содержащими тромбин, активированный фактор IX (FIXa), фосфолипиды, фактор X и кальций. После активации FVIII тромбином образуется комплекс с FIXa, фосфолипидами и кальцием. Этот комплекс активирует FX приводя к образованию активного FX (FXa), который, в свою очередь, отщепляет пара-нитроанилид (pNA) от хромогенного субстрата. Кинетику образования pNA измеряют при 405 нм. Скорость прямо пропорциональна концентрации FVIII в образце. Концентрации FVIII считываются с контрольной кривой, и результаты приведены в виде IU FVIII/миллилитр.To test the biological activity of codon-altered factor VIII sequence variants, the ReFacto type FVIII constructs described in Example 1 were administered to factor VIII null mice. Briefly, assays were performed using C57B1/6 FVIII knockout mice (na) (68 animals per group) by tail vein injection of 4E12 vector genomes (vg) per kilogram of mouse body weight. Blood was collected 14 days after injection by retroorbital puncture, and plasma was prepared and frozen using standard procedures. Expression levels were measured on day 14 due to the minimal effect of inhibitory antibodies at this time, which is observed in some animals in this mouse model at later times. FVIII activity in mouse plasma was determined using the Technochrome FVIII assay with minor modifications as suggested by the manufacturer (Technoclone, Vienna, Austria). For analysis, plasma samples were appropriately diluted and mixed with analytical reagents containing thrombin, activated factor IX (FIXa), phospholipids, factor X and calcium. After activation of FVIII by thrombin, a complex is formed with FIXa, phospholipids and calcium. This complex activates FX resulting in the formation of active FX (FXa), which in turn cleaves para-nitroanilide (pNA) from the chromogenic substrate. The kinetics of pNA formation is measured at 405 nm. The rate is directly proportional to the concentration of FVIII in the sample. FVIII concentrations are read from the control curve and the results are reported as IU FVIII/milliliter.
Результаты, представленные в табл. 4 ниже, демонстрируют, что последовательности с измененными кодонами, разработанные с использованием коммерческих алгоритмов (CS10, CS11 и СН25), обеспечили лишь небольшое увеличение BDD-фактора VIII (в 3-4 раза) по сравнению с конструкцией BDDфактора VIII дикого типа (CS40). Аналогично, конструкция BDD-фактора VIII с измененными кодонами, полученная, как описано в Radcliffe et al. (CS08) обеспечила лишь 3-4-кратное увеличение экспрессии BDD-FVIII. Этот результат согласуется с результатами, полученными в Radcliff et al. Удивительно, что конструкции CS01, CS04 и CS23 обеспечивали значительно более высокую экспрессию BDD-FVIII в исследованиях активности in vivo (соответственно в 18, 74 и 30 раз).The results presented in table. 4 below demonstrate that the codon-altered sequences designed using commercial algorithms (CS10, CS11 and CH25) provided only a small increase in BDD factor VIII (3- to 4-fold) compared to the wild-type BDD factor VIII construct (CS40). . Similarly, a codon-altered BDD factor VIII construct prepared as described in Radcliffe et al. (CS08) provided only a 3- to 4-fold increase in BDD-FVIII expression. This result is consistent with the results obtained in Radcliff et al. Surprisingly, constructs CS01, CS04, and CS23 provided significantly higher expression of BDD-FVIII in in vivo activity assays (18-, 74-, and 30-fold, respectively).
- 33 046432- 33 046432
Таблица 4Table 4
Экспрессия FVIII в плазме нокаутных по FVIII мышей, индуцированная различными векторными конструкциями AAVFVIII expression in plasma of FVIII knockout mice induced by different AAV vector constructs
Понятно, что примеры и варианты реализации изобретения, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в свете этого будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в объем применения данной заявки и объем прилагаемой формула изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей.It is understood that the examples and embodiments of the invention described herein are for illustrative purposes only and that various modifications or changes in light thereof will be suggested to those skilled in the art and should be included within the scope of this application and the scope of the appended claims. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated by reference in their entirety for all purposes.
Claims (11)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US62/255,323 | 2015-11-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA046432B1 true EA046432B1 (en) | 2024-03-14 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11254731B2 (en) | Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A | |
US10189889B2 (en) | Viral vectors encoding recombinant FVIII variants with increased expression for gene therapy of hemophilia A | |
CA3127065A1 (en) | Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a | |
US20220333135A1 (en) | Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression | |
US20230023826A1 (en) | Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression | |
EA046432B1 (en) | VIRAL VECTORS ENCODING RECOMBINANT FVIII VARIANTS WITH INCREASED EXPRESSION FOR GENE THERAPY OF HEMOPHILIA A | |
EA047302B1 (en) | VIRAL VECTORS ENCODING RECOMBINANT FVIII VARIANTS WITH INCREASED EXPRESSION FOR GENE THERAPY OF HEMOPHILIA A |