EA046360B1 - ANTIBODIES TO OX40 AND METHODS OF THEIR APPLICATION - Google Patents
ANTIBODIES TO OX40 AND METHODS OF THEIR APPLICATION Download PDFInfo
- Publication number
- EA046360B1 EA046360B1 EA201792451 EA046360B1 EA 046360 B1 EA046360 B1 EA 046360B1 EA 201792451 EA201792451 EA 201792451 EA 046360 B1 EA046360 B1 EA 046360B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- amino acid
- seq
- acid sequence
- human
- Prior art date
Links
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 title claims description 381
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 title claims description 380
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 97
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 519
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 334
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 306
- 102000050320 human TNFRSF4 Human genes 0.000 claims description 300
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 190
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 189
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 188
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 187
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 173
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 169
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 169
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 150
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 150
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 139
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 126
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 113
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 110
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 110
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 102
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 88
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 88
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 claims description 85
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 79
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 78
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 76
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 76
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 claims description 76
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 claims description 75
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 70
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 58
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 claims description 56
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 43
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 43
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 30
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 22
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 19
- 101000764263 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 18
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 16
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 16
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 15
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 102000051450 human TNFSF4 Human genes 0.000 claims description 11
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 10
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 131
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 113
- 108010069768 negative elongation factor Proteins 0.000 description 110
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 85
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 84
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 76
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 76
- -1 IFNy Proteins 0.000 description 67
- 230000006870 function Effects 0.000 description 57
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 56
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 55
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 52
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 50
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 44
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 42
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 40
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 39
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 38
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 24
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 23
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 22
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 19
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 18
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 16
- 102220468007 HLA class II histocompatibility antigen, DP beta 1 chain_P115A_mutation Human genes 0.000 description 15
- 102220468513 Homeobox protein Meis2_L88A_mutation Human genes 0.000 description 15
- 102220626433 Methyl-CpG-binding domain protein 2_P93A_mutation Human genes 0.000 description 15
- 102220507057 Small vasohibin-binding protein_R62A_mutation Human genes 0.000 description 15
- 102220514840 Vacuolar protein sorting-associated protein 4A_R80A_mutation Human genes 0.000 description 15
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 15
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 15
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 15
- 102220220424 rs1060500863 Human genes 0.000 description 15
- 102220480127 Protein-tyrosine sulfotransferase 1_N60A_mutation Human genes 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 12
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 12
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 11
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 11
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 10
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 10
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 9
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 9
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 8
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 8
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 6
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 102220512993 Uncharacterized protein KIAA0040_W58A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 6
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 238000012004 kinetic exclusion assay Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 4
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 4
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 4
- YPBKTZBXSBLTDK-PKNBQFBNSA-N (3e)-3-[(3-bromo-4-fluoroanilino)-nitrosomethylidene]-4-[2-(sulfamoylamino)ethylamino]-1,2,5-oxadiazole Chemical group NS(=O)(=O)NCCNC1=NON\C1=C(N=O)/NC1=CC=C(F)C(Br)=C1 YPBKTZBXSBLTDK-PKNBQFBNSA-N 0.000 description 3
- 238000010599 BrdU assay Methods 0.000 description 3
- 210000005236 CD8+ effector T cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000693916 Gallus gallus Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010036652 HSC70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000012215 HSC70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000839657 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 3-73 Proteins 0.000 description 3
- 101001047627 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-28 Proteins 0.000 description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 3
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 3
- 102100027822 Immunoglobulin heavy variable 3-73 Human genes 0.000 description 3
- 102100022950 Immunoglobulin kappa variable 2-28 Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229950006370 epacadostat Drugs 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 210000002501 natural regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 3
- ZADWXFSZEAPBJS-SNVBAGLBSA-N (2r)-2-amino-3-(1-methylindol-3-yl)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2N(C)C=C(C[C@@H](N)C(O)=O)C2=C1 ZADWXFSZEAPBJS-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- YGACXVRLDHEXKY-WXRXAMBDSA-N O[C@H](C[C@H]1c2c(cccc2F)-c2cncn12)[C@H]1CC[C@H](O)CC1 Chemical compound O[C@H](C[C@H]1c2c(cccc2F)-c2cncn12)[C@H]1CC[C@H](O)CC1 YGACXVRLDHEXKY-WXRXAMBDSA-N 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000012893 effector ligand Substances 0.000 description 2
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229950009034 indoximod Drugs 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 101000642536 Apis mellifera Venom serine protease 34 Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940116741 CD137 agonist Drugs 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 1
- 229940124060 PD-1 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 229940123751 PD-L1 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 229940121678 PD-L2 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282576 Pan paniscus Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102220492414 Ribulose-phosphate 3-epimerase_H35A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009650 gentamicin protection assay Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000014136 immunodeficiency 16 Diseases 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920002859 polyalkenylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Перечень последовательностейList of sequences
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и тем самым включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте (указанная копия ASCII, созданная 5 мая 2016 г., называется 3617_003PC04_ST25.txt и имеет размер 120927 байтов).This application contains a sequence listing that was filed electronically in ASCII format and is hereby incorporated herein by reference in its entirety (the referenced ASCII copy created on May 5, 2016 is called 3617_003PC04_ST25.txt and is 120927 bytes in size) .
1. Область изобретения1. Field of the invention
Изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с рецептором ОХ40 человека (ОХ40), композициям, содержащим такие антитела, и способам получения и применения антител, которые специфически связываются с ОХ40.The invention relates to antibodies that specifically bind to the human OX40 receptor (OX40), compositions containing such antibodies, and methods for producing and using antibodies that specifically bind to OX40.
2. Предпосылки изобретения2. BACKGROUND OF THE INVENTION
Роль врожденного и адаптивного иммунного ответа в контроле опухолевого роста у человека хорошо описана (Vesely MD et al., (2011) Annu Rev Immunol 29: 235-271). В связи с этим появились стратегии на основе применения антител, которые направлены на усиление Т-клеточных ответов с целью терапии рака, такие как целенаправленное воздействие на экспрессируемые Т-клетками стимулирующие рецепторы агонистическими антителами или на ингибиторные рецепторы функциональными антагонистами (Mellman I et al., (2011) Nature 480: 480-489). Подходы на основе опосредованных антителами агонистов и антагонистов продемонстрировали доклиническую и в последнее время клиническую эффективность. Важным стимулирующим рецептором, который модулирует функцию Т-клеток, Т-клеток с активностью естественных киллеров (NKT) и NK-клеток, является рецептор ОХ40 (также известный как ОХ40, CD134, TNFRSF4, TXGP1L, АСТ35 и АСТ-4) (Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420431). OX40 является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF), и передача сигнала посредством ОХ40 может модулировать важные иммунные функции.The role of the innate and adaptive immune response in the control of human tumor growth is well described (Vesely MD et al., (2011) Annu Rev Immunol 29: 235-271). Antibody-based strategies have therefore emerged that aim to enhance T cell responses for cancer therapy, such as targeting T cell-expressed stimulatory receptors with agonistic antibodies or inhibitory receptors with functional antagonists (Mellman I et al., (2011) Nature 480: 480-489). Antibody-mediated agonist and antagonist approaches have demonstrated preclinical and more recently clinical efficacy. An important stimulatory receptor that modulates the function of T cells, natural killer T cells (NKT) cells and NK cells is the OX40 receptor (also known as OX40, CD134, TNFRSF4, TXGP1L, AST35 and AST-4) (Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420431). OX40 is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF), and signaling through OX40 can modulate important immune functions.
ОХ40 может быть активирован антиген-специфичными Т-клетками после стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR) профессиональными антигенпредставляющими клетками (АРС), экспонирующими молекулы МНС I или II класса, нагруженные когнатным пептидом (Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420-431). При созревании АРС, такие как дендритные клетки (DC), активируют стимулирующие члены семейства В7 (например, CD80 и CD86), а также дополнительные костимулирующие молекулы, в том числе лиганд ОХ40 (OX40L), которые способствуют корректировке кинетики и интенсивности Тклеточного иммунного ответа, а также эффективной дифференцировке клеток памяти. Примечательно, что другие типы клеток также могут экспрессировать конститутивные и/или индуцируемые уровни OX40L, такие как В-клетки, клетки эндотелия сосудов, тучные клетки и в некоторых случаях активированные Т-клетки (Soroosh P et al., (2006) J Immunol 176: 5975-5987). Предполагается, что взаимодействие OX40:OX40L обусловливает кластеризацию рецепторных тримеров более высокого порядка и последующую передачу сигнала (Compaan DM et al., (2006) Structure 14: 1321-1330).OX40 can be activated by antigen-specific T cells following stimulation of T cell receptors (TCRs) by professional antigen presenting cells (APCs) exhibiting class I or class II MHC molecules loaded with cognate peptide (Sugamura K et al., (2004) Nat Rev Immunol 4: 420-431). During maturation, APCs such as dendritic cells (DCs) activate stimulatory members of the B7 family (e.g., CD80 and CD86), as well as additional co-stimulatory molecules, including OX40 ligand (OX40L), which help adjust the kinetics and intensity of the T-cell immune response. as well as effective differentiation of memory cells. Notably, other cell types can also express constitutive and/or inducible levels of OX40L, such as B cells, vascular endothelial cells, mast cells and in some cases activated T cells (Soroosh P et al., (2006) J Immunol 176 : 5975-5987). The OX40:OX40L interaction is thought to mediate higher order clustering of receptor trimers and subsequent signal transduction (Compaan DM et al., (2006) Structure 14: 1321-1330).
Экспрессия ОХ40 Т-клетками в микроокружении опухоли наблюдалась в опухолевых тканях мыши и человека (Bulliard Y et al., (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-480 и Piconese S et al., (2014) Hepatology 60: 1494-1507). OX40 экспрессируется на высоком уровне внутриопухолевыми популяциями регуляторных Т-клеток (Treg) по сравнению с обычными популяциями Т-клеток, и эта характеристика связана с их пролиферативным статусом (Waight JD et al., (2015) J Immunol 194: 878-882 и Bulliard Y et al., (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-480). Ранние исследования показали, что агонистические антитела к ОХ40 были способны вызывать отторжение опухоли в мышиных моделях (Weinberg AD et al., (2000) J Immunol 164: 2160-2169 и Piconese S et al., (2008) J Exp Med 205: 825-839). Также было показано, что антитело мыши, которое выступает в роли агониста в отношении передачи сигнала с участием ОХ40 человека, усиливает иммунные функции у пациентов с раком (Curti BD et al., (2013) Cancer Res 73: 7189-7198).Expression of OX40 by T cells in the tumor microenvironment has been observed in mouse and human tumor tissues (Bulliard Y et al., (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-480 and Piconese S et al., (2014) Hepatology 60: 1494-1507) . OX40 is expressed at high levels by intratumoral regulatory T cell populations (Tregs) compared to conventional T cell populations, and this characteristic is associated with their proliferative status (Waight JD et al., (2015) J Immunol 194: 878-882 and Bulliard Y et al., (2014) Immunol Cell Biol 92: 475-480). Early studies showed that agonistic antibodies to OX40 were able to induce tumor rejection in mouse models (Weinberg AD et al., (2000) J Immunol 164: 2160-2169 and Piconese S et al., (2008) J Exp Med 205: 825 -839). A mouse antibody that acts as an agonist for human OX40 signaling has also been shown to enhance immune functions in cancer patients (Curti BD et al., (2013) Cancer Res 73: 7189-7198).
Взаимодействия ОХ40 и OX40L также были связаны с иммунными ответами при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях, в том числе мышиных моделях астмы/атопии, энцефаломиелита, ревматоидного артрита, колита/воспалительного заболевания кишечника, реакции траснплантат против хозяина (например, отторжение трансплантата), диабете у мышей с инсулинозависимым диабетом и атеросклерозе (Croft М et al., (2009) Immunol Rev 229(1): 173-191, и источники литературы, цитируемые в данном документе). Сниженная симптоматика, связанная с этими заболеваниями и нарушениями, была отмечена у мышей с недостаточностью ОХ40 и OX40L, у мышей, получающих липосомы с антителами к ОХ40, нагруженные цитостатическим препаратом, и у мышей, у которых взаимодействия ОХ40 и OX40L были блокированы блокирующим антителом к OX40L или рекомбинантным ОХ40, слитым с Fc-частью иммуноглобулина человека (Croft M et al.; Boot EPJ et al., (2005) Arthritis Res Ther 7: R604-615; Weinberg AD et al., (1999) J Immunol 162: 1818-1826). Было показано, что лечение блокирующим антителом к OX40L ингибирует опосредованное Th2 воспаление в модели астмы у макака-резуса (Croft M et al.; Seshasayee D et al., (2007) J Clin Invest 117: 3868-3878). Кроме того, полиморфизмы OX40L были связаны с волчанкой (Croft M et al.). Принимая во внимание роль ОХ40 человека в модулировании иммунных ответов, в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40, и применение этих антител для модулирования активности ОХ40.OX40 and OX40L interactions have also been associated with immune responses in inflammatory and autoimmune diseases, including mouse models of asthma/atopy, encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, colitis/inflammatory bowel disease, graft-versus-host disease (eg, allograft rejection), diabetes in mice with insulin-dependent diabetes and atherosclerosis (Croft M et al., (2009) Immunol Rev 229(1): 173-191, and references cited herein). Reduced symptoms associated with these diseases and disorders were observed in mice deficient in OX40 and OX40L, in mice receiving anti-OX40 liposomes loaded with a cytotoxic drug, and in mice in which OX40 and OX40L interactions were blocked by a blocking anti-OX40L antibody. or recombinant OX40 fused to the Fc portion of human immunoglobulin (Croft M et al.; Boot EPJ et al., (2005) Arthritis Res Ther 7: R604-615; Weinberg AD et al., (1999) J Immunol 162: 1818 -1826). Treatment with an anti-OX40L blocking antibody has been shown to inhibit Th2-mediated inflammation in a rhesus monkey model of asthma (Croft M et al.; Seshasayee D et al., (2007) J Clin Invest 117: 3868-3878). Additionally, OX40L polymorphisms have been associated with lupus (Croft M et al.). Given the role of human OX40 in modulating immune responses, this document provides antibodies that specifically bind to OX40 and the use of these antibodies to modulate OX40 activity.
3. Краткое описание3. Brief description
В одном аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываютсяIn one aspect, provided herein are antibodies that specifically bind
- 1 046360 с ОХ40 (например, ОХ40 человека).- 1 046360 with OX40 (for example, human OX40).
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), предусматривающую CDR1 VH в SEQ ID NO: 16, CDR2 VH, предусматривающую CDR2 VH в SEQ ID NO: 16, CDR3 VH, предусматривающую CDR3 VH в SEQ ID NO: 16, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), предусматривающую CDR1 VL в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, предусматривающую CDR2 VL в SEQ ID NO: 15, и CdR3 VL, предусматривающую CDR3 VL в SEQ ID NO: 15, где каждая CDR определяется согласно определению по Kabat, определению по Chothia, комбинации определения по Kabat и определения по Chothia, системе нумерации IMGT, определению по AbM или контактному определению CDR. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющую комплементарность область 1 (CDR1) тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3).In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a heavy chain variable region (VH) CDR1 comprising the CDR1 VH of SEQ ID NO: 16, a CDR2 VH comprising the CDR2 VH of SEQ ID NO: 16, a CDR3 VH comprising CDR3 VH in SEQ ID NO: 16, CDR1 light chain variable region (VL) comprising CDR1 VL in SEQ ID NO: 15, CDR2 VL comprising CDR2 VL in SEQ ID NO: 15, and CdR3 VL comprising CDR3 VL in SEQ ID NO: 15, where each CDR is defined according to a Kabat definition, a Chothia definition, a combination of a Kabat definition and a Chothia definition, an IMGT numbering system, an AbM definition, or a contact CDR definition. In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises (a) a heavy chain variable region comprising heavy chain complementarity determining region 1 (CDR1) containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); Heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); and a heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); and (b) a light chain variable region comprising a light chain CDR1 containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); light chain CDR2 containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3).
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSGSA (SEQ ID NO: 47); CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность IRSKANSYAT (SEQ ID NO: 48); и CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность TSGIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 49); и (b) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность QSLLHSNGYNY (SEQ ID NO: 44); CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность LGS (SEQ ID NO: 45); и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 46).In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises (a) a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 containing the amino acid sequence GFTFSGSA (SEQ ID NO: 47); Heavy chain CDR2 containing the amino acid sequence of IRSKANSYAT (SEQ ID NO: 48); and a heavy chain CDR3 containing the amino acid sequence TSGIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 49); and (b) a light chain variable region comprising a light chain CDR1 containing the amino acid sequence QSLLHSNGYNY (SEQ ID NO: 44); light chain CDR2 containing the amino acid sequence of LGS (SEQ ID NO: 45); and a light chain CDR3 containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 46).
В одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую каркасные области человека или человеческого происхождения.In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain variable region having framework regions of human or human origin.
В одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную каркасную область тяжелой цепи, которая происходит из аминокислотной последовательности, кодируемой геном человека, где указанная аминокислотная последовательность содержит IGHV3-73*01 (SEQ ID NO: 19).In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain variable framework region that is derived from an amino acid sequence encoded by a human gene, wherein said amino acid sequence comprises IGHV3-73*01 (SEQ ID NO: 19).
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи с каркасными областями человека или человеческого происхождения.In one embodiment, the antibody contains a light chain variable region sequence with framework regions of human or human origin.
В одном варианте осуществления антитело содержит вариабельную каркасную область легкой цепи, которая происходит из аминокислотной последовательности, кодируемой геном человека, где указанная аминокислотная последовательность содержит IGKV2-28*01 (SEQ ID NO: 18).In one embodiment, the antibody comprises a light chain variable framework region that is derived from an amino acid sequence encoded by a human gene, wherein said amino acid sequence comprises IGKV2-28*01 (SEQ ID NO: 18).
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21, 23, 51 и 52. В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60-63.In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21, 23, 51 and 52. In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain sequence comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of consisting of SEQ ID NO: 60-63.
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.In one embodiment, the antibody comprises a light chain variable region sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.In one embodiment, the antibody comprises a light chain sequence comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein the light chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21; and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60; and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотнуюIn one embodiment, the antibody contains a heavy chain containing an amino acid
- 2 046360 последовательность под SEQ ID NO: 23; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.- 2 046360 sequence under SEQ ID NO: 23; and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61; and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51 или 52; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 62 или 63; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 or 52; and a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 or 63; and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
В одном варианте осуществления антитело содержит константные области тяжелой и/или легкой цепей. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgGi, IgG2. IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2 человека. В одном варианте осуществления IgGi представляет собой нефукозилированный IgG1. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность IgG1 содержит мутацию N297A. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность IgGi содержит мутацию N297Q. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность IgG4 содержит мутацию S228P. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность IgG2 содержит мутацию C127S. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 32-37, 53-54 и 64-71. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgGK и IgGλ человека.In one embodiment, the antibody contains heavy and/or light chain constant regions. In one embodiment, the heavy chain constant region is selected from the group consisting of IgGi, IgG2 immunoglobulins. Human IgG 3 , IgG4, IgA 1 and IgA 2 . In one embodiment, the IgGi is non-fucosylated IgG1. In one embodiment, the IgG1 amino acid sequence contains the N297A mutation. In one embodiment, the IgG1 amino acid sequence contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In one embodiment, the amino acid sequence of IgG i contains the N297Q mutation. In one embodiment, the amino acid sequence of IgG 4 contains the S228P mutation. In one embodiment, the amino acid sequence of IgG 2 contains the C127S mutation. In one embodiment, the heavy chain constant region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 32-37, 53-54 and 64-71. In one embodiment, the light chain constant region is selected from the group consisting of human IgGK and IgGλ immunoglobulins.
В одном варианте осуществления антитело представляет собой антитело человека.In one embodiment, the antibody is a human antibody.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, связывается с тем же эпитопом ОХ40 человека, что и антитело, содержащее CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, связывается с тем же эпитопом ОХ40 человека, что и антитело, содержащее CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GFTFSGSA (SEQ ID NO: 47); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность IRSKANSYAT (SEQ ID NO: 48); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность TSGIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 49); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность QSLLHSNGYNY (SEQ ID NO: 44); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGS (SEQ ID NO: 45); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 46). В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, связывается с тем же эпитопом ОХ40 человека, что и антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В одном варианте осуществления антитело запускает, усиливает или индуцирует активность ОХ40 человека. В одном варианте осуществления антитело индуцирует пролиферацию CD4+ Т-клеток. В одном варианте осуществления пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антитела. В одном варианте осуществления пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование IL-2, TNFa, IFNy, IL-4, IL-10, IL-13 или их комбинации стимулированными антителом к CD3 Тклетками. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13 или их комбинации стимулированными антителом к CD3 мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС). В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13 стимулированными антителом к CD3 РВМС, где продуцирование TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антитела. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13 стимулированными антителом к CD3 РВМС, где продуцирование TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование IL-2 стимулированными SEA T-клеток и подавляет продукцию IL-10 стимулированными SEA Т-клеток. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование IL-2 стимулированными SEA мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) и подавляет продукцию IL-2 стимулированными SEA РВМС. В одном варианте осуществления антитело индуцируетIn one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 binds to the same human OX40 epitope as an antibody containing a CDR1 VH containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 binds to the same human OX40 epitope as an antibody containing a CDR1 VH containing the amino acid sequence GFTFSGSA (SEQ ID NO: 47); CDR2 VH containing the amino acid sequence of IRSKANSYAT (SEQ ID NO: 48); CDR3 VH containing the amino acid sequence TSGIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 49); CDR1 VL containing the amino acid sequence QSLLHSNGYNY (SEQ ID NO: 44); CDR2 VL containing the amino acid sequence of LGS (SEQ ID NO: 45); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 46). In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 binds to the same human OX40 epitope as an antibody comprising a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In one embodiment, the antibody is agonistic. In one embodiment, the antibody triggers, enhances or induces human OX40 activity. In one embodiment, the antibody induces proliferation of CD4+ T cells. In one embodiment, CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentration to a large extent. In one embodiment, the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve. In one embodiment, the antibody induces the production of IL-2, TNFa, IFNy, IL-4, IL-10, IL-13, or a combination thereof by anti-CD3 antibody-stimulated T cells. In one embodiment, the antibody induces the production of TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, or a combination thereof by anti-CD3 antibody-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). In one embodiment, the antibody induces production of TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13 by anti-CD3 antibody-stimulated PBMC, wherein the production of TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13 is a largely increasing function of antibody concentration. In one embodiment, the antibody induces production of TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13 by anti-CD3 antibody-stimulated PBMC, wherein the production of TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13 exhibits a sigmoidal dose-response curve. In one embodiment, the antibody induces the production of IL-2 by SEA-stimulated T cells and inhibits the production of IL-10 by SEA-stimulated T cells. In one embodiment, the antibody induces IL-2 production by SEA-stimulated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and inhibits IL-2 production by SEA-stimulated PBMCs. In one embodiment, the antibody induces
- 3 046360 продуцирование IL-2 стимулированными SEA РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антитела. В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование IL-2 стимулированными SEA РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ.- 3 046360 IL-2 production by SEA-stimulated PBMCs, where IL-2 production is an increasing function of antibody concentration to a large extent. In one embodiment, the antibody induces IL-2 production by SEA-stimulated PBMCs, where IL-2 production follows a sigmoidal dose-response curve.
В одном варианте осуществления антитело ослабляет подавление эффекторных Т-клеток, обусловленной регуляторными Т-клетками.In one embodiment, the antibody attenuates the suppression of effector T cells caused by regulatory T cells.
В одном варианте осуществления антитело индуцирует продуцирование IL-2 при совместном культивировании эффекторных Т-клеток и регуляторных Т-клеток и подавляет продуцирование IL-10 при совместном культивировании эффекторных Т-клеток и регуляторных Т-клеток.In one embodiment, the antibody induces the production of IL-2 when effector T cells and regulatory T cells are cocultured and inhibits the production of IL-10 when effector T cells and regulatory T cells are cocultured.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example by PBMC cells, when stimulated for , for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery ), where IL-2 production is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, 0.8 μg/ml ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example by PBMC cells, when stimulated for , for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery ), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0. 8 µg/ml to 20 µg/ml, 4 µg/ml to 20 µg/ml, 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg /ml to 4 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (for example, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (for example, 20, 4, 0.8 , 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5 % CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивиIn one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example by PBMC cells, when stimulated for , for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) wherein the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing
- 4 046360 рование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 4 046360 PBMC (e.g. 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g. 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg /ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and a CDR3 VL comprising the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the plate-bound antibody in combination with the plate-bound anti-CD3 antibody (e.g., 0.8 μg/ml) induces the production of one or more cytokines, e.g. , TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery) wherein the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, is a substantially increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg /ml to 50 µg/ml, 1.6 µg/ml to 50 µg/ml, 3.1 µg/ml to 50 µg/ml or 6.3 µg/ml to 50 µg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) plate-bound antibody for e.g. 4 days, for example, at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and a CDR3 VL comprising the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the plate-bound antibody in combination with the plate-bound anti-CD3 antibody (e.g., 0.8 μg/ml) induces the production of one or more cytokines, e.g. , TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery) wherein the production of one or more cytokines, for example TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0 .7 µg/ml to 50 µg/ml, from 1.6 µg/ml to 50 µg/ml, from 3.1 µg/ml to 50 µg/ml or from 6.3 µg/ml to 50 µg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3 , 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) plate bound antibody for e.g. 4 days, for example, at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and a CDR3 VL comprising the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 µg/ml up to 20
- 5 046360 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% CO2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% CO2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 5 046360 µg/ml or from 2 µg/ml to 20 µg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 µM succinimidyl complex carboxyfluorescein diacetate ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, wherein the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example , 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 comprises a VH CDR1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); CDR2 VH containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); CDR3 VH containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); CDR1 VL containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); CDR2 VL containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and CDR3 VL containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation when the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed by for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный амиIn one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured e.g. by electrochemiluminescence, e.g. using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, e.g. , from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20.4, 0.8, 0. 16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to amino acid sequence.
- 6 046360 нокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 6 046360 acid sequence under SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example by PBMC cells, when stimulated for, for example, 5 days, for example at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production IL-2 has a sigmoidal dose-response curve if the anti-OX40 antibody concentration is, for example, 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, 0.8 μg/ml up to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0, 16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and 97 % humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 105 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. by PBMCs, when stimulated for e.g. 5 days, e.g. at 37°C, 5% CO2 and humidity 97 %, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20.4, 0.8, 0. 16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps : (a) culturing PBMCs (e.g., 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g., 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg /ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75%In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical.
- 7 046360 идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 7 046360 identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example by PBMC cells, when stimulated for, for example, 5 days, for example at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20.4, 0.8, 0. 16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured e.g. by electrochemiluminescence, e.g. using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, e.g. , from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. by PBMCs, when stimulated for e.g. 5 days, e.g. at 37°C, 5% CO2 and humidity 97 %, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is , for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml , from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg/ ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетIn one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and 97 % humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. cells
- 8 046360 ками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 8 046360 kami PBMC, when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10 kit -Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, e.g. 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, 0.16 µg/ml to 20 µg /ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps : (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg /ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих конценграций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетIn one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. by PBMCs, when stimulated for e.g. 5 days, e.g. at 37°C, 5% CO2 and humidity 97 %, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. cells
- 9 046360 ками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 9 046360 kami PBMC, when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10 kit -Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml up to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMC (eg 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g. 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and e.g. 100 ng/ml SEA, for e.g. 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and 97 % humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g. 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g. by PBMCs, when stimulated for e.g. 5 days, e.g. at 37°C, 5% CO2 and humidity 97 %, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps : (a) culturing PBMCs (e.g., 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g., 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg /ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2,In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) induces the production of IL-2,
- 10 046360 например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 10 046360 e.g. PBMC cells, when stimulated for e.g. 5 days, e.g. at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, as measured by e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in the presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured e.g. by electrochemiluminescence, e.g. using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, e.g. , from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps : (a) culturing PBMCs (eg 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 µg/ml) antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 в присутствии 4 мкг/мл антитела является более высокой, чем в присутствии 0,032 мкг/мл антитела. Продуцирование IL-2 можно оценивать, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% CO2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg 100 ng/ml) induces IL-2 production, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity, which is measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 in the presence of 4 μg/ml antibody is higher than in presence of 0.032 μg/ml antibody. IL-2 production can be assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16 , 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97 % humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например,In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g.
- 11 046360 при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VHдомен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Тклетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy,- 11 046360 at 37°C and 5% CO2, which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) kit V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, e.g. TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml, or from 6.3 μg/ml ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0. 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) bound to antibody tablet for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured by e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml, or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMC in the presence of bound on the plate of anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 μg/ml or 0, 0.7, 1, 6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, bound on a plate the antibody, in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL- 13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 kit 10 -Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL -2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg, 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3, 1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured using e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 10Plex tissue kit culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy,
- 12 046360- 12 046360
GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% CO2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VHдомен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) куль- 13 046360 тивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Тклетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта иGM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg /ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) cultivation PBMC in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25, and 50 μg/ml or 0, 0. 7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured by e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml , from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3 ,1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1 kit TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF , IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, 3.1 μg/ml to 50 μg/ml, or 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25, and 50 μg/ml or 0, 0.7, 1 .6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, bound on a plate the antibody, in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL- 13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 kit 10 -Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL -2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, which is assessed, for example, in an analysis including the following stages: (a) culturing PBMC in the presence of bound on the plate of anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 μg/ml or 0, 0.7, 1, 6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10Plex kit tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2 , IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml , from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3 ,1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1 kit TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF , IL-2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMC in the presence of bound on the plate anti-CD3 antibodies (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 μg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured by e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml, or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMC in the presence of bound on the plate of anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 μg/ml or 0, 0.7, 1, 6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and
- 14 046360 измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VHдомен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Тклетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Me- 14 046360 measurement of the production of one or more cytokines, for example TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, bound on a plate the antibody, in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL- 13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 kit 10 -Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL -2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg, 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3, 1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured using e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 10Plex tissue kit culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg, 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3, 1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37°C and 5% CO2, as measured by e.g. electrochemiluminescence, e.g. Human TH1/TH2 kit 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml , from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or from 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound antibody to CD3 (eg 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3 ,1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Me
- 15 046360 so Scale Discovery).- 15 046360 so Scale Discovery).
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VHдомен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Тклеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein linked on the plate, the antibody, in combination with a plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, e.g., TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10, or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1 kit TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF , IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, 3.1 μg/ml to 50 μg/ml, or 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/mL) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25, and 50 μg/mL or 0, 0.7, 1 .6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) VPlex assay kit (Meso Scale Discovery). In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase proliferation of CD4+ T cells, wherein the proliferation of CD4+ T cells is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 70% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измеIn one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining cells, e.g., on day 4, e.g., with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, e.g., by measuring
- 16 046360 рения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 16 046360 percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 75% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 75% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стаIn one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 µg/ml, which is assessed, for example, in an analysis including the following hundred
- 17 046360 дии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 17 046360 diy: (a) labeling, for example, subjected to enrichment of CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 80% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 80% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 85% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 85% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, subjected to CD4+ enrichment T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
- 18 046360- 18 046360
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 90% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимиIn one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM succinimi
- 19 046360 дилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 19 046360 carboxyfluorescein diacetate ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 95% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 95% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In one embodiment, the antibody comprises a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит VL-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15, и VH-домен, на по меньшей мере 98% идентичный аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16, где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.In one embodiment, the antibody contains a VL domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a VH domain that is at least 98% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay involving the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В одном варианте осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи иммуногIn one embodiment, the antibody comprises an immunoglobulin heavy chain constant region
- 20 046360 лобулина IgG1 человека, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A и их комбинации. В одном варианте осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, где связывание между антителом и вариантным ОХ40 значительно ослаблено по сравнению со связыванием между антителом и последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, и где вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением аминокислотной мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, P115A и их комбинации.- 20 046360 human IgG1 lobulin, wherein the amino acid sequence of the IgG1 heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A and combinations thereof. In one embodiment, the antibody comprises an IgG1 heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG1 heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody wherein the binding between the antibody and the variant OX40 is significantly reduced compared to the binding between the antibody and the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, and where the variant OX40 contains the sequence under SEQ ID NO: 55, excluding an amino acid mutation selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and combinations thereof.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, где связывание между антителом и вариантным ОХ40 значительно ослаблено по сравнению со связыванием между антителом и последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, и где вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением аминокислотной мутации W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и P115A.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody wherein the binding between the antibody and the variant OX40 is significantly reduced compared to the binding between the antibody and the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, and where the variant OX40 contains the sequence under SEQ ID NO: 55, excluding amino acid mutation W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A and P115A.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, которое характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации, или не связывается с ним.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody that has, relative to binding to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, a reduced ability to bind to a protein identical to the sequence of SEQ ID NO: 55 , except for the presence of an amino acid mutation selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and a combination thereof, or does not bind thereto.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой выделенное антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, где антитело характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и Р115А, или не связывается с ним.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an isolated antibody that specifically binds to human OX40, wherein the antibody has, relative to binding to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, reduced protein binding ability , identical to the sequence under SEQ ID NO: 55, except for the presence of the amino acid mutation W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A and P115A, or does not bind to it.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, которое специфически связывается с эпитопом последовательности ОХ40 человека, содержащей остаток SEQ ID NO: 55, выбранный из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 и их комбинации.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody that specifically binds to an epitope of a human OX40 sequence containing the residue of SEQ ID NO: 55 selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 and their combinations.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, которое специфически связывается с эпитопом последовательности ОХ40 человека, содержащей остатки 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody that specifically binds to an epitope of the human OX40 sequence comprising residues 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 of SEQ ID NO: 55.
В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, представляет собой антитело, которое специфически связывается по меньшей мере с одним остатком SEQ ID NO: 55, выбранным из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 и их комбинации.In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 is an antibody that specifically binds to at least one residue of SEQ ID NO: 55 selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 and their combinations.
В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи антитела, предусмотренного в данном документе, и выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2 и scFv-фрагмента.In one embodiment, the antibody comprises a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence of an antibody provided herein and is selected from the group consisting of Fab, Fab', F(ab')2, and an scFv fragment.
В одном варианте осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1 человека, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgGi содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A и их комбинации. В одном варианте осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи IgG1, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, содержит (а) первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека; и (b) второй антигенсвязывающий домен, который специфически не связывается с антигеном, экспрессируемым иммунной клеткой человека.In one embodiment, the antibody comprises a human immunoglobulin IgG 1 heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgGi heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, and combinations thereof. In one embodiment, the antibody comprises an IgG1 heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG1 heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 comprises (a) a first antigen binding domain that specifically binds to human OX40; and (b) a second antigen-binding domain that does not specifically bind to an antigen expressed by a human immune cell.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит (а) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий определяющую комплементарность область (CDR) 1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO:4); VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); и VH-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); и (b) первый вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий VLCDR1, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VLCDR2, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, специфически связывается с тем же эпитопом ОХ40 человека, что и антитело, содержащее VH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, которыйIn one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises (a) a first heavy chain variable domain (VH) containing a VH complementarity determining region (CDR) 1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO:4); VH-CDR2 containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); and VH-CDR3 containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); and (b) a first light chain variable domain (VL) containing VLCDR1 containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VLCDR2 containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and VL-CDR3 containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). In one embodiment, an antigen binding domain that specifically binds to human OX40 specifically binds to the same human OX40 epitope as an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a VL containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 : 15. In one embodiment, an antigen binding domain that
- 21 046360 специфически связывается с ОХ40 человека, характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации, или не связывается с ним. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH и VL, где VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH и VL, где VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается антигеном, не являющимся человеческим. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с вирусным антигеном. В одном варианте осуществления вирусный антиген представляет собой антиген HIV. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с альбумином курицы или лизоцимом куриного яйца. В одном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 человека, содержит (а) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий определяющую комплементарность область (CDR) 1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); и VH-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); и (b) первый вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий VLCDR1, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VLCDR2, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, специфически связывается с тем же эпитопом ОХ40 человека, что и антитело, содержащее VH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.- 21 046360 specifically binds to human OX40, characterized, compared to binding to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, by a reduced ability to bind to a protein identical to the sequence of SEQ ID NO: 55, except for the presence of an amino acid mutation selected from group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and combinations thereof, or does not bind to it. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises VH and VL, wherein VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises VH and VL, wherein VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In one embodiment, the second antigen binding domain specifically binds to a non-human antigen. In one embodiment, the second antigen-binding domain specifically binds to a viral antigen. In one embodiment, the viral antigen is an HIV antigen. In one embodiment, the second antigen binding domain specifically binds to chicken albumin or chicken egg lysozyme. In one embodiment, an antibody that specifically binds to human OX40 comprises (a) a first heavy chain variable domain (VH) containing a VH complementarity determining region (CDR) 1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); VH-CDR2 containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); and VH-CDR3 containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); and (b) a first light chain variable domain (VL) containing VLCDR1 containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VLCDR2 containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and VL-CDR3 containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). In one embodiment, an antigen binding domain that specifically binds to human OX40 specifically binds to the same human OX40 epitope as an antibody comprising a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and a VL containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 : 15.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации, или не связывается с ним. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH и VL, где VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH и VL, где VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.In one embodiment, an antigen binding domain that specifically binds to human OX40 has, compared to binding to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, a reduced ability to bind to a protein identical to the sequence of SEQ ID NO: 55, except for the presence amino acid mutation selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and combinations thereof, or does not bind thereto. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises VH and VL, wherein VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises VH and VL, where VL contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
В одном варианте осуществления вторая тяжелая цепь представляет собой Fc-фрагмент.In one embodiment, the second heavy chain is an Fc moiety.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность, полученную из последовательности зародышевой линии человека IGHV3-73.In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VH comprising an amino acid sequence that is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO : 16. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VH comprising the amino acid sequence , derived from the human germline sequence IGHV3-73.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность, полученную из последовательности зародышевой линии человека IGKV2-28.In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VL comprising an amino acid sequence that is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO : 15. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VL containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 , contains a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises a VL containing an amino acid sequence derived from the human germline sequence IGKV2-28.
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит последовательности VH и VL, изложенные в SEQ ID NO: 16 и 15 соответственно. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связываетIn one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 comprises the VH and VL sequences set forth in SEQ ID NOs: 16 and 15, respectively. In one embodiment, an antigen binding domain that specifically binds
- 22 046360 ся с ОХ40 человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60.- 22 046360 with human OX40, contains a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 contains a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60.
В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A и их комбинации. В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, и вторая тяжелая цепь или ее фрагмент содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A и их комбинации. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека, и вторая тяжелая цепь или ее фрагмент содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации.In one embodiment, the first antigen binding domain and the second antigen binding domain contain an identical mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, and combinations thereof. In one embodiment, the first antigen binding domain and the second antigen binding domain contain an identical mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 and the second heavy chain or fragment thereof contain an identical mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, and combinations thereof. In one embodiment, the antigen binding domain that specifically binds to human OX40 and the second heavy chain or fragment thereof contain an identical mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof.
В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим по отношению к ОХ40 человека. В одном варианте осуществления антитело прекращает, снижает или ингибирует активность ОХ40 человека. В одном варианте осуществления антитело ингибирует или ослабляет связывание ОХ40 человека с лигандом ОХ40 человека. В одном варианте осуществления антитело ингибирует или ослабляет передачу сигнала с участием ОХ40. В одном варианте осуществления антитело ингибирует или ослабляет передачу сигнала с участием ОХ40 человека, индуцированную лигандом ОХ40 человека.In one embodiment, the antibody is antagonistic to human OX40. In one embodiment, the antibody stops, reduces or inhibits human OX40 activity. In one embodiment, the antibody inhibits or reduces the binding of human OX40 to a human OX40 ligand. In one embodiment, the antibody inhibits or reduces signaling involving OX40. In one embodiment, the antibody inhibits or attenuates human OX40 signaling induced by a human OX40 ligand.
В одном варианте осуществления антитело содержит выявляемую метку. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу по настоящему изобретению для применения в качестве диагностического средства. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению для in vitro выявления ОХ40 в образце. В одном варианте осуществления ОХ40 представляет собой ОХ40 человека. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению для активации, усиления или индукции активности ОХ40 человека in vitro. В одном варианте осуществления антитело индуцирует пролиферацию CD4+ Т-клеток in vitro.In one embodiment, the antibody contains a detectable label. In one embodiment, the present invention provides an antibody of the present invention for use as a drug. In one embodiment, the present invention provides an antibody of the present invention for use as a diagnostic agent. In one embodiment, the present invention relates to the use of an antibody of the present invention for in vitro detection of OX40 in a sample. In one embodiment, the OX40 is human OX40. In one embodiment, the present invention relates to the use of an antibody of the present invention to activate, enhance or induce human OX40 activity in vitro. In one embodiment, the antibody induces proliferation of CD4+ T cells in vitro.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь антитела к ОХ40, предусмотренного в данном документе. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела к ОХ40, предусмотренного в данном документе. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область тяжелой цепи или тяжелую цепь антитела к ОХ40, предусмотренного в данном документе, и вариабельную область легкой цепи или легкую цепь антитела. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. Выделенные антитела, кодируемые такими молекулами нуклеиновых кислот, также предусмотрены в данном документе.In one aspect, provided herein are isolated nucleic acid molecules encoding antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40). In one embodiment, the nucleic acid molecule encodes the heavy chain variable region or heavy chain of an anti-OX40 antibody provided herein. In one embodiment, the nucleic acid molecule encodes a light chain variable region or light chain of an anti-OX40 antibody provided herein. In one embodiment, the nucleic acid molecule encodes a heavy chain variable region or heavy chain of an anti-OX40 antibody provided herein and a light chain variable region or light chain of the antibody. In one embodiment, the nucleic acid molecule encodes a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In one embodiment, the nucleic acid molecule encodes a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. Isolated antibodies encoded by such nucleic acid molecules are also provided herein.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.In one aspect, provided herein are vectors containing such nucleic acid molecules.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены клетки-хозяева, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот или такие векторы. В одном варианте осуществления клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клетки Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, дрожжевой клетки, СНО, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10, клетки растения, клетки насекомого и клетки человека в культуре тканей.In one aspect, provided herein are host cells containing such nucleic acid molecules or such vectors. In one embodiment, the host cell is selected from the group consisting of an E. coli cell, Pseudomonas cell, Bacillus cell, Streptomyces cell, yeast cell, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK , Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10, plant cells, insect cells and human cells in tissue culture.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы получения антител, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека), включающие культивирование таких клетокхозяев таким образом, что обеспечивается экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты и выработка антитела.In one aspect, provided herein are methods of producing antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40), comprising culturing such host cells such that the nucleic acid molecule is expressed and the antibody is produced.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу по настоящему изобретению, молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектору по настоящему изобретению и/или клетке-хозяину по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата.In one embodiment, the present invention provides an antibody of the present invention, a nucleic acid molecule of the present invention, a vector of the present invention, and/or a host cell of the present invention for use as a drug.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу по настоящему изобретению, молекуле нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектору по настоящему изобретению и/или клетке-хозяину по настоящему изобретению для применения в качестве диагностического средства.In one embodiment, the present invention provides an antibody of the present invention, a nucleic acid molecule of the present invention, a vector of the present invention, and/or a host cell of the present invention for use as a diagnostic agent.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела по наIn one embodiment, the present invention relates to the use of an antibody to
- 23 046360 стоящему изобретению, молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению и/или клетки-хозяина по настоящему изобретению для выявления in vitro OX40 в образце. В одном варианте осуществления ОХ40 представляет собой ОХ40 человека.- 23 046360 of the present invention, a nucleic acid molecule of the present invention, a vector of the present invention and/or a host cell of the present invention for in vitro detection of OX40 in a sample. In one embodiment, the OX40 is human OX40.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению антитела по настоящему изобретению для активации, усиления или индукции активности ОХ40 человека in vitro. В одном варианте осуществления антитело индуцирует пролиферацию CD4+ Т-клеток in vitro.In one embodiment, the present invention relates to the use of an antibody of the present invention to activate, enhance or induce human OX40 activity in vitro. In one embodiment, the antibody induces proliferation of CD4+ T cells in vitro.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитело, которое специфически связывается с ОХ40, предусмотренным в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты или клетку-хозяина, содержащую такую молекулу нуклеиновой кислоты или вектор.In one aspect, provided herein are pharmaceutical compositions comprising an antibody that specifically binds to an OX40 provided herein, a nucleic acid molecule encoding an antibody that specifically binds to an OX40 (e.g., human OX40), a vector containing such a nucleic acid molecule or a host cell containing such a nucleic acid molecule or vector.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитело, которое специфически связывается с ОХ40, предусмотренным в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, которое специфически связывается с ОХ40, например, ОХ40 человека, вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты или клетку-хозяина, содержащую такую молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, для применения в качестве лекарственного препарата.In one aspect, provided herein are pharmaceutical compositions comprising an antibody that specifically binds to an OX40 provided herein, a nucleic acid molecule encoding an antibody that specifically binds to an OX40, e.g., human OX40, a vector containing such a nucleic acid molecule, or a host cell containing such a nucleic acid molecule or vector for use as a drug.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитело, которое специфически связывается с ОХ40, предусмотренным в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, которое специфически связывается с ОХ40, например, ОХ40 человека, вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты или клетку-хозяина, содержащую такую молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, для применения в качестве диагностического средства.In one aspect, provided herein are pharmaceutical compositions comprising an antibody that specifically binds to an OX40 provided herein, a nucleic acid molecule encoding an antibody that specifically binds to an OX40, e.g., human OX40, a vector containing such a nucleic acid molecule, or a host cell containing such a nucleic acid molecule or vector for use as a diagnostic agent.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы модулирования иммунного ответа у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе. В одном варианте осуществления способ направлен на усиление или индукцию иммунного ответа субъекта. В одном варианте осуществления модулирование иммунного ответа предусматривает усиление или индукцию иммунного субъекта.In one aspect, provided herein are methods of modulating an immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell, or pharmaceutical composition provided herein. In one embodiment, the method is directed to enhancing or inducing an immune response in a subject. In one embodiment, modulating the immune response involves enhancing or inducing an immune entity.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе модулирования иммунного ответа.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of modulating an immune response.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления или индукции иммунного ответа. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing or inducing an immune response. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе модулирования иммунного ответа у субъекта. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления или индукции иммунного ответа у субъекта. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе модулирования иммунного ответа у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции по настоящему изобретению.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of modulating an immune response in a subject. In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing or inducing an immune response in a subject. In one embodiment, the antibody is agonistic. In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of modulating an immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody, nucleic acid, vector, host cell or a pharmaceutical composition according to the present invention.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления или индукции иммунного ответа у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing or inducing an immune response in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody, nucleic acid, vector, cell -the host or pharmaceutical composition of the present invention. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы усиления размножения Т-клеток и эффекторной функции Т-клеток у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе.In one aspect, provided herein are methods of enhancing T cell expansion and T cell effector function in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell, or pharmaceutical composition provided herein.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления размножения Т-клеток и эффекторной функции Т-клеток. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления размножения Т-клеток и эффекторной функции Т-клеток у субъекта. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing T cell expansion and T cell effector function. In one embodiment, the antibody is agonistic. In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing T cell expansion and T cell effector function in a subject. In one embodiment, the antibody is agonistic.
- 24 046360- 24 046360
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе усиления размножения Т-клеток и эффекторной функции Т-клеток у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of enhancing T cell expansion and T cell effector function in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы лечения рака у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клеткихозяина или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки и рака предстательной железы. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака предстательной железы, рака толстой кишки и рака легкого. В некоторых вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). В одном примере способ дополнительно включает введение субъекту средства, целенаправленно воздействующего на контрольные точки. В одном примере средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, выбрано из группы, состоящей из антагонистического антитела к PD-1, антагонистического антитела к PD-L1, антагонистического антитела к PD-L2, антагонистического антитела к CTLA-4, антагонистического антитела к TIM-3, антагонистического антитела к LAG-3, антагонистического антитела к СЕАСАМ1, агонистического антитела к GITR, агонистического антитела к CD137 и агонистического антитела к ОХ40.In one aspect, provided herein are methods of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell, or pharmaceutical composition provided herein. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of melanoma, kidney cancer, and prostate cancer. In some embodiments, the cancer is selected from the group consisting of melanoma, kidney cancer, prostate cancer, colon cancer, and lung cancer. In some embodiments, the lung cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC). In one example, the method further includes administering to the subject an agent that specifically targets control points. In one example, the checkpoint-targeting agent is selected from the group consisting of an anti-PD-1 antagonist antibody, an anti-PD-L1 antagonist antibody, an anti-PD-L2 antagonist antibody, an anti-CTLA-4 antagonist antibody, an anti-TIM-antagonist antibody, 3, anti-LAG-3 antagonist antibody, anti-CEACAM1 antagonist antibody, anti-GITR agonist antibody, anti-CD137 agonist antibody, and anti-OX40 agonist antibody.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения рака. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating cancer. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения рака у субъекта. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating cancer in a subject. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения рака у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody, nucleic acid, vector, host cell, and /or a pharmaceutical composition according to the present invention. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) средству, целенаправленно воздействующему на контрольные точки, для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a checkpoint targeting agent for use as a drug. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) средству, целенаправленно воздействующему на контрольные точки, для применения в способе лечения рака. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention provides (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a checkpoint targeting agent for use in a method of treating cancer. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки. Антитело, описанное в данном документе, может быть использовано в комбинации с ингибитором IDO для лечения рака. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO). Описанный в данном документе ингибитор IDO для применения при лечении рака находится в твердой лекарственной форме фармацевтической композиции, такой как таблетка, пилюля или капсула, где фармацевтическая композиция содержит ингибитор IDO и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В связи с этим, антитело, описанное в данном документе, и ингибитор IDO, описанный в данном документе, могут быть введены отдельно, последовательно или одновременно в виде отдельных лекарственных форм. В одном варианте осуществления антитело вводят парентерально, а ингибитор IDO вводят перорально. В конкретных вариантах осуществления ингибитор выбран из группы, состоящей из эпакадостата (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences), индоксимода (NewLink Genetics) и NLG919 (NewLink Genetics). Эпакадостат был описан в публикации согласно РСТ № WO 2010/005958, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В одном варианте осуществления ингибитором является эпакадостат. В другом варианте осуществления ингибитором является F001287. В другом варианте осуществления ингибитором является индоксимод. В другом варианте осуществления ингибитором является NLG919.In one aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition, kit or composite kit containing (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a checkpoint targeting agent. The antibody described herein can be used in combination with an IDO inhibitor for the treatment of cancer. In one embodiment, the method further comprises administering to the subject an indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitor. An IDO inhibitor described herein for use in the treatment of cancer is in a solid dosage form of a pharmaceutical composition, such as a tablet, pill or capsule, wherein the pharmaceutical composition contains an IDO inhibitor and a pharmaceutically acceptable excipient. In this regard, the antibody described herein and the IDO inhibitor described herein can be administered separately, sequentially or simultaneously in separate dosage forms. In one embodiment, the antibody is administered parenterally and the IDO inhibitor is administered orally. In specific embodiments, the inhibitor is selected from the group consisting of epacadostat (Incyte Corporation), F001287 (Flexus Biosciences), indoximod (NewLink Genetics), and NLG919 (NewLink Genetics). Epacadostat has been described in PCT Publication No. WO 2010/005958, which is incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. In one embodiment, the inhibitor is epacadostat. In another embodiment, the inhibitor is F001287. In another embodiment, the inhibitor is indoximod. In another embodiment, the inhibitor is NLG919.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) ингибитору IDO для применения в качестве лекарственного препарата.In one aspect, the present invention provides (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor for use as a drug.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору,In one aspect, the present invention relates to (a) an antibody, nucleic acid, vector,
- 25 046360 клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) ингибитору IDO для применения в способе лечения рака. В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело, нуклеиновую кислоту, вектор, клеткухозяин и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) ингибитор IDO. Антитело, описанное в данном документе, может быть использовано в комбинации с вакциной. В конкретном варианте осуществления вакцина содержит комплекс белка теплового шока с пептидами (HSPPC), при этом HSPPC содержит белок теплового шока (например, белок gp96, белок hsp70 или белок hsc70), образующий комплекс с одним или несколькими антигенными пептидами (например, опухольассоциированными антигенными пептидами). В одном варианте осуществления белок теплового шока представляет собой белок gp96 и он образует комплекс с опухоль-ассоциированным антигенным пептидом. В одном варианте осуществления белок теплового шока представляет собой белок hsp70 или hsc70 и он образует комплекс с опухоль-ассоциированным антигенным пептидом. В одном варианте осуществления белок теплового шока представляет собой белок gp96 и он образует комплекс с опухольассоциированным антигенным пептидом, при этом HSPPC происходит из опухоли, полученной от субъекта. В одном варианте осуществления белок теплового шока представляет собой белок hsp70 или hsc70 и он образует комплекс с опухоль-ассоциированным антигенным пептидом, при этом HSPPC происходит из опухоли, полученной от субъекта.- 25 046360 to a host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor for use in a method of treating cancer. In one aspect, the present invention provides a composition, kit or composite kit containing (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor. The antibody described herein may be used in combination with a vaccine. In a specific embodiment, the vaccine comprises a heat shock protein peptide complex (HSPPC), wherein the HSPPC comprises a heat shock protein (e.g., gp96 protein, hsp70 protein, or hsc70 protein) complexed with one or more antigenic peptides (e.g., tumor-associated antigenic peptides ). In one embodiment, the heat shock protein is a gp96 protein and it forms a complex with a tumor-associated antigenic peptide. In one embodiment, the heat shock protein is an hsp70 or hsc70 protein and it forms a complex with a tumor-associated antigenic peptide. In one embodiment, the heat shock protein is a gp96 protein and it forms a complex with a tumor-associated antigenic peptide, wherein the HSPPC is derived from a tumor obtained from the subject. In one embodiment, the heat shock protein is an hsp70 or hsc70 protein and it forms a complex with a tumor-associated antigenic peptide, wherein the HSPPC is derived from a tumor obtained from the subject.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) вакцине для применения в качестве лекарственного препарата. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention relates to (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine for use as a drug. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) вакцине для применения в способе лечения рака. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим.In one aspect, the present invention relates to (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine for use in a method of treating cancer. In one embodiment, the antibody is agonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело, нуклеиновую кислоту, вектор, клетку-хозяина и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) вакцину. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предусмотрено применение антитела, описанного в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии предусмотрено антитело, описанное в данном документе, для применения в лечении рака. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии предусмотрено применение фармацевтической композиции, описанной в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака. В определенных вариантах осуществления в настоящем раскрытии предусмотрена фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, для применения в лечении рака.In one aspect, the present invention provides a composition, kit or composite kit containing (a) an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine. In one embodiment, the antibody is agonistic. In some embodiments, the present disclosure provides for the use of an antibody described herein in the manufacture of a drug for the treatment of cancer. In certain embodiments, the present disclosure provides an antibody described herein for use in the treatment of cancer. In certain embodiments, the present disclosure provides for the use of a pharmaceutical composition described herein in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer. In certain embodiments, the present disclosure provides a pharmaceutical composition described herein for use in the treatment of cancer.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из отторжения трансплантата, васкулита, астмы, ревматоидного артрита, дерматита, воспалительного заболевания кишечника, увеита и волчанки.In one aspect, provided herein are methods of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell, or pharmaceutical composition provided herein. In some embodiments, the disease or disorder is selected from the group consisting of transplant rejection, vasculitis, asthma, rheumatoid arthritis, dermatitis, inflammatory bowel disease, uveitis, and lupus.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения у субъекта. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder in a subject. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody, nucleic acid, vector , host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы лечения инфекционного заболевания у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе.In one aspect, provided herein are methods of treating an infectious disease in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of an antibody, nucleic acid, vector, host cell, or pharmaceutical composition provided herein.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения инфекционного заболевания. В одном варианте осуществления антитело является агонистичеIn one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an infectious disease. In one embodiment, the antibody is agonistic
- 26 046360 ским. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.- 26 046360 skim. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения инфекционного заболевания у субъекта.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an infectious disease in a subject.
В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.In one embodiment, the antibody is agonistic. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу, нуклеиновой кислоте, вектору, клетке-хозяину и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения инфекционного заболевания у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления антитело является агонистическим. В одном варианте осуществления антитело является антагонистическим.In one aspect, the present invention provides an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and/or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an infectious disease in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or the pharmaceutical composition of the present invention. In one embodiment, the antibody is agonistic. In one embodiment, the antibody is antagonistic.
В одном варианте осуществления способов, предусмотренных в данном документе, субъект представляет собой человека.In one embodiment of the methods provided herein, the subject is a human.
В одном аспекте предусмотрены способы выявления ОХ40 в образце, включающие приведение указанного образца в контакт с антителом, предусмотренным в данном документе.In one aspect, methods are provided for detecting OX40 in a sample, comprising contacting said sample with an antibody provided herein.
В одном аспекте предусмотрены способы in vitro выявления ОХ40 в образце, включающие приведение указанного образца в контакт с антителом, предусмотренным в данном документе. В одном варианте осуществления ОХ40 представляет собой ОХ40 человека.In one aspect, methods are provided for in vitro detection of OX40 in a sample, comprising contacting said sample with an antibody provided herein. In one embodiment, the OX40 is human OX40.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы in vitro выявления ОХ40 в образце, включающие приведение указанного образца в контакт с антителом, нуклеиновой кислотой, вектором, клеткой-хозяином и фармацевтической композицией, предусмотренными в данном документе. В одном варианте осуществления ОХ40 представляет собой ОХ40 человека.In one aspect, provided herein are methods for in vitro detection of OX40 in a sample, comprising contacting said sample with an antibody, nucleic acid, vector, host cell, and pharmaceutical composition provided herein. In one embodiment, the OX40 is human OX40.
В одном аспекте в данном документе предусмотрено применение антитела, нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина и/или фармацевтической композиции, предусмотренных в данном документе, предпочтительно антитела, предусмотренного в данном документе, для in vitro выявления ОХ40 в образце.In one aspect, provided herein is the use of an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition provided herein, preferably an antibody provided herein, for in vitro detection of OX40 in a sample.
В одном аспекте в данном документе предусмотрено антитело, нуклеиновая кислота, вектор, клетка-хозяин и/или фармацевтическая композиция, предусмотренные в данном документе, предпочтительно антитело, предусмотренное в данном документе, для применения при выявлении ОХ40 у субъекта. В одном варианте осуществления субъектом является человек.In one aspect, provided herein is an antibody, nucleic acid, vector, host cell and/or pharmaceutical composition provided herein, preferably an antibody provided herein, for use in detecting OX40 in a subject. In one embodiment, the subject is a human.
В одном аспекте в данном документе предусмотрены наборы, содержащие антитело, которое специфически связывается с ОХ40, предусмотренным в данном документе, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), вектор, содержащий такую молекулу нуклеиновой кислоты, клетку-хозяина, содержащую такую молекулу нуклеиновой кислоты или вектор, или фармацевтическую композицию, содержащую такое антитело, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или клетку-хозяина, и а) реагент для выявления, b) антиген ОХ40, с) уведомление, в котором отражено разрешение на применение или продажу для введения человеку, или d) их комбинацию.In one aspect, provided herein are kits comprising an antibody that specifically binds to OX40 provided herein, a nucleic acid molecule encoding an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40), a vector containing such nucleic acid molecule, a host cell containing such a nucleic acid molecule or vector, or a pharmaceutical composition containing such an antibody, nucleic acid molecule, vector or host cell, and a) a detection reagent, b) an OX40 antigen, c) a notification reflecting the authorization for use or sale for human administration, or d) a combination thereof.
4. Краткое описание графических материалов4. Brief description of graphic materials
Фиг. 1А, 1В, 1С, 1D и 1E: на фиг. 1А представлены две гистограммы, демонстрирующие связывание антитела к ОХ40 pab1949 и изотипического контроля с активированными CD4+ Т-клетками и CD8+ Т-клетками человека. На фиг. 1В представлены две гистограммы, демонстрирующие связывание pab1949-1 и изотипического контроля с нестимулированными и стимулированными (с помощью антитела к CD3) CD4+ Т-клетками. На фиг. 1С представлен график, демонстрирующий связывание pab1949-1 или изотипического контроля с титрованием дозы с активированными CD4+ Т-клетками человека. На фиг. 1D представлен набор гистограмм, на которых показано измерение связывания pab1949-1 и изотипического контроля с популяциями нестимулированных иммунных клеток человека, полученных из крови. На фиг. 1E представлена гистограмма, демонстрирующая связывание pab1949 и изотипического контроля с активированными CD4+ Т-клетками макака-крабоеда (Масаса fascicularis).Fig. 1A, 1B, 1C, 1D and 1E: FIG. 1A shows two histograms showing the binding of anti-OX40 antibody pab1949 and isotype control to activated human CD4+ T cells and CD8+ T cells. In fig. 1B shows two histograms showing the binding of pab1949-1 and isotype control to unstimulated and stimulated (with anti-CD3 antibody) CD4+ T cells. In fig. 1C is a graph showing dose-titrated binding of pab1949-1 or isotype control to activated human CD4+ T cells. In fig. 1D is a set of histograms showing binding measurements of pab1949-1 and isotype control to unstimulated blood-derived human immune cell populations. In fig. 1E is a histogram showing the binding of pab1949 and isotype control to activated CD4+ T cells from cynomolgus monkey (Macaca fascicularis).
На фиг. 2А, 2В и 2С представлены графики результатов анализов субоптимальной стимуляции CD3 для оценки эффектов стимуляции антителами к ОХ40 pab1949 (фиг. 2А и 2С) и pab2044 (фиг. 2В) в отношении пролиферации подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток. Антитело pab1949 представляет собой антитело IgG1 человека. Антитело pab2044 имеет такую же вариабельную область тяжелой цепи и такую же легкую цепь, что и pab1949, однако содержит константную область IgG4 человека. Клеточная пролиферация (CFSE; ось х) показана для каждого исследуемого антитела: изотипического контроля IgGi, pab1949 и антитела к CD28 в качестве положительного контроля на фиг. 2А; и изотипического контроля IgG4, pab2044 и антитела к CD28 на фиг. 2В. На фиг. 2С представлен линейный график, демонстрирующий титрование антитела к ОХ40 pab1949 (0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл) и эффект антитела в отношении пролиферации подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток при субоптимальной стимуляции антителом к CD3.In fig. 2A, 2B and 2C are graphs of the results of suboptimal CD3 stimulation assays to evaluate the effects of stimulation with anti-OX40 antibodies pab1949 (FIGS. 2A and 2C) and pab2044 (FIG. 2B) on the proliferation of enriched CD4+ T cells. Antibody pab1949 is a human IgG 1 antibody. Antibody pab2044 has the same heavy chain variable region and the same light chain as pab1949, but contains the human IgG 4 constant region. Cell proliferation (CFSE; x-axis) is shown for each antibody tested: the IgGi isotype control, pab1949, and anti-CD28 as a positive control in FIG. 2A; and isotype control IgG4, pab2044, and anti-CD28 in FIG. 2B. In fig. 2C is a line graph showing titration of anti-OX40 antibody pab1949 (0.002, 0.02, 0.2, 2, and 20 μg/ml) and the effect of the antibody on proliferation of enriched CD4+ T cells upon suboptimal stimulation with anti-CD3 antibody.
На фиг. 3А, 3В, 3С, 3D, 3Е и 3F представлены репрезентативные результаты анализов продукцииIn fig. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E and 3F show representative product analysis results
- 27 046360 цитокинов IFNy и TNFa, индуцированной антителом к ОХ40 pab1949 или pab1949-1 в комбинации с различными субоптимальными концентрациями антитела к CD3 и IL-2. На фиг. 3А-3С показаны результаты тестирования РВМС от четырех различных доноров: донора KM, донора ТМ, донора GS и донора SB. На фиг. 3А и 3В представлены графики, на которых показано внутриклеточное окрашивание цитокинов (IFNY и TNFa) CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток от донора SB (фиг. 3А) и донора GS (фиг. 3В). Процентные доли IFNy+ TNFa+ полифункциональных CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток или TNFa+ монофункциональных CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток представлены на графике для антитела к ОХ40 pab1949 или изотипического контроля (фиг. 3С). Процентные доли, показанные на фиг. 3С, отображают наибольший эффект, полученный при стимуляции тремя различными концентрациями антитела к CD3. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (n=2). На фиг. 3D, 3Е и 3F представлен набор графиков, демонстрирующих процентные доли TNFa+ CD4+ Т клеток (фиг. 3D), IFNy+ TNFa+ полифункциональных CD8+ Т-клеток (фиг. 3Е) и IFNy+ CD8+ Т-клеток (фиг. 3F), индуцированных антителом к ОХ40 pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы в клетках, происходящих из РВМС донора GS, в аналогичном анализе со стимуляцией субоптимальными концентрациями антитела к CD3.- 27 046360 cytokines IFNy and TNFa induced by anti-OX40 antibody pab1949 or pab1949-1 in combination with various suboptimal concentrations of anti-CD3 and IL-2 antibodies. In fig. 3A-3C show the results of testing PBMCs from four different donors: donor KM, donor TM, donor GS and donor SB. In fig. 3A and 3B are graphs showing intracellular cytokine staining (IFNY and TNFa) of CD4+ T cells and CD8+ T cells from donor SB (FIG. 3A) and donor GS (FIG. 3B). The percentages of IFNy+ TNFa+ polyfunctional CD4+ T cells and CD8+ T cells or TNFa+ monofunctional CD4+ T cells and CD8+ T cells are plotted for the anti-OX40 antibody pab1949 or isotype control (Fig. 3C). The percentages shown in FIG. 3C depict the greatest effect obtained when stimulated with three different concentrations of anti-CD3 antibody. Error bars represent standard deviation (n=2). In fig. 3D, 3E and 3F are a set of graphs showing the percentages of TNFa+ CD4+ T cells (Fig. 3D), IFNy+ TNFa+ polyfunctional CD8+ T cells (Fig. 3E) and IFNy+ CD8+ T cells (Fig. 3F) induced by anti-OX40 antibody pab1949-1 or dose-titrated IgG 1 isotype control antibody in GS donor PBMC-derived cells in a similar assay stimulated with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody.
На фиг. 4А, 4В и 4С представлен набор графиков, демонстрирующих результаты анализа со стимуляцией субоптимальными концентрациями антитела к CD3 с использованием клеток, происходящих из РВМС от доноров 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9 и 10. Процентная доля IFNy+, TNFa+ или IFNy+ TNFa+ полифункциональных CD4+ или CD8+ Т-клеток представлена на графике в зависимости от диапазона концентраций антитела pab1949-1 или антитела изотипического контроля IgGi.In fig. 4A, 4B, and 4C are a set of graphs showing the results of assays stimulated with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody using PBMC-derived cells from donors 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, and 10. Percentage of IFNy+, TNFa+, or IFNy+ TNFa+ polyfunctional CD4+ or CD8+ T cells are plotted against the concentration range of pab1949-1 antibody or IgGi isotype control antibody.
На фиг. 5А представлен набор столбиковых диаграмм, демонстрирующих эффект антитела к ОХ40 pab1949 или изотипического контроля в отношении секреции панели цитокинов (IL-2, TNFa, IL-10, IL-4 и IL-13) в анализе со стимуляцией субоптимальными концентрациями антитела к CD3 с использованием РВМС от донора SB и донора GS. РВМС от здоровых доноров активировали с помощью различных субоптимальных концентраций антитела к CD3 (клон SP34), IL2 (20 ЕД/мл) и 5 мкг/мл антитела к ОХ40 или изотипического контроля IgG1, и цитокины измеряли через каждые 4 дня (SB#1A) или 3 дня (SB#1B, SB#2 и GS) после стимуляции. Столбики на фиг. 5А демонстрируют самую высокую секрецию цитокинов, индуцированную исследуемыми концентрациями антитела к CD3 при концентрации антитела к ОХ40, составляющей 5 мкг/мл. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (n=2).In fig. 5A is a set of bar graphs demonstrating the effect of anti-OX40 antibody pab1949 or an isotype control on the secretion of a panel of cytokines (IL-2, TNFa, IL-10, IL-4, and IL-13) in an assay stimulated with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody using PBMCs from donor SB and donor GS. PBMCs from healthy donors were activated with various suboptimal concentrations of anti-CD3 (clone SP34), IL2 (20 U/ml) and 5 μg/ml anti-OX40 or isotype control IgG 1 , and cytokines were measured every 4 days (SB#1A ) or 3 days (SB#1B, SB#2 and GS) after stimulation. Columns in Fig. 5A shows the highest cytokine secretion induced by the tested concentrations of anti-CD3 antibody at a concentration of 5 μg/ml anti-OX40 antibody. Error bars represent standard deviation (n=2).
На фиг. 5В, 5С и 5D представлен набор графиков, демонстрирующих количество секретируемых цитокинов (TNFa, IL-10 или IL-13), индуцированных различными концентрациями pab1949-1 или антитела изотипического контроля IgG1 в клетках, происходящих из РВМС донора GS в присутствии субоптимальных концентраций антитела к CD3.In fig. 5B, 5C and 5D are a set of graphs demonstrating the amount of secreted cytokines (TNFa, IL-10 or IL-13) induced by various concentrations of pab1949-1 or isotype control antibody IgG 1 in cells derived from PBMCs of a GS donor in the presence of suboptimal concentrations of antibody to CD3.
На фиг. 6А, 6В и 6С представлен набор графиков, демонстрирующих количество секретируемого GM-CSF, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля с титрованием дозы в клетках, происходящих из РВМС доноров 1-10, в анализе со стимуляцией субоптимальными концентрациями антитела к CD3. ECL относится к электрохемилюминесценции.In fig. 6A, 6B and 6C are a set of graphs showing the amount of secreted GM-CSF induced by pab1949-1 or a dose-titration isotype control antibody in cells derived from PBMCs from donors 1-10 in an assay stimulated with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody. ECL refers to electrochemiluminescence.
Фиг. 7А, 7В и 7С аналогичны фиг. 6А, 6В и 6С, где показано количество секретируемого IL-2, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1, с титрованием дозы. ECL относится к электрохемилюминесценции.Fig. 7A, 7B and 7C are similar to FIGS. 6A, 6B and 6C show the amount of IL-2 secreted induced by pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody with dose titration. ECL refers to electrochemiluminescence.
Фиг. 8А, 8В и 8С аналогичны фиг. 6А, 6В и 6С, где показано количество секретируемого TNFe, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1, с титрованием дозы.Fig. 8A, 8B and 8C are similar to FIGS. 6A, 6B and 6C show the amount of TNFe secreted induced by pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody with dose titration.
На фиг. 9А и 9В представлены столбиковые диаграммы, демонстрирующие продукцию IL-2 (фиг. 9А) и IL-10 (фиг. 9В), индуцированную либо растворимым или перекрестно сшитым (с помощью F(ab')2, связывающегося с Fc) pab1949-l, либо антителом изотипического контроля IgG1, регуляторными Тклетками (Treg) и эффекторными Т-клетками (Teff), культивируемыми совместно в соотношении 1:3 (Treg: Teff).In fig. 9A and 9B are bar graphs demonstrating the production of IL-2 (FIG. 9A) and IL-10 (FIG. 9B) induced by either soluble or cross-linked (by F(ab')2 binding to Fc) pab1949-l , or isotype control antibody IgG 1 , regulatory T cells (Treg) and effector T cells (Teff), cultured together in a 1:3 ratio (Treg: Teff).
На фиг. 10А, 10В, 10С, 10D, 10Е, 10F и 10G представлены графики, изображающие функциональную активность антител к ОХ40 по отношению к первичным РВМС человека при стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA). PBMC человека стимулировали SEA в отсутствии или в присутствии фиксированной концентрации (10 мкг/мл) или различных концентраций антитела к ОХ40 или его изотипического контроля и оценивали в отношении секреции цитокинов IL-2 или IL-10. Исследуемые антитела к ОХ40 включают pab1949, pab1949-1, pab2193-1, pab1949-1-N297A и эталонные антитела pab1784 и pab2045. Кратность изменения IL-2 (фиг. 10А) и IL-10 (фиг. 10В) при концентрации антитела к ОХ40, составляющей 10 мкг/мл, представлена на графике для исследуемых антител. На фиг. 10С, 10D и 10Е представлены кривые доза-ответ, демонстрирующие кратность изменения продукции IL-2 при различных концентрациях pab1949, pab1949-1 или эталонных антител pab1784 и pab2045. Статистическую значимость определяли с помощью критерия Стьюдента по сравнению с образцами изотипического контроля, указанными звездочкой. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение для трехкратных повторов. * на фиг. 10А представлено значение р < 0,001. * на фиг. 10В представлено значение р < 0,01. На фиг. 10F представлен график, демонстрирующий продукцию IL-2, индуцированнуюIn fig. 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, 10F and 10G are graphs depicting the functional activity of anti-OX40 antibodies against primary human PBMCs when stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA). Human PBMCs were stimulated with SEA in the absence or presence of a fixed concentration (10 μg/ml) or various concentrations of anti-OX40 antibody or its isotype control and assessed for secretion of the cytokines IL-2 or IL-10. The OX40 antibodies studied include pab1949, pab1949-1, pab2193-1, pab1949-1-N297A and the reference antibodies pab1784 and pab2045. The fold changes in IL-2 (FIG. 10A) and IL-10 (FIG. 10B) at 10 μg/ml anti-OX40 antibody concentration are plotted for the antibodies tested. In fig. 10C, 10D and 10E are dose-response curves demonstrating the fold change in IL-2 production at various concentrations of pab1949, pab1949-1 or the reference antibodies pab1784 and pab2045. Statistical significance was determined using Student's t test compared with isotype control samples indicated by an asterisk. Error bars represent the standard deviation of triplicates. * in fig. Figure 10A shows a p value < 0.001. * in fig. 10B represents a p value < 0.01. In fig. 10F is a graph showing IL-2 production induced
- 28 046360 pab1949-1, pab2193-1, антителом изотипического контроля IgGi или антителом изотипического контроля IgG2 с титрованием дозы. На фиг. 10G представлен график, демонстрирующий продукцию IL-2 в ответ на pab1949-1, pab1949-1-N297A с титрованием дозы или антитело изотипического контроля IgG1.- 28 046360 pab1949-1, pab2193-1, IgGi isotype control antibody or IgG 2 isotype control antibody with dose titration. In fig. 10G is a graph showing IL-2 production in response to dose-titrated pab1949-1, pab1949-1-N297A, or an IgG 1 isotype control antibody.
На фиг. 11А и 11В представлены результаты анализа, в котором растворимое (в растворимом состоянии, фиг. 11А) или перекрестносшитое (в связанном в комплекс состоянии, фиг. 11В) pab1949-1 или антитело изотипического контроля IgG1 исследовали с использованием клеточной линии с репортерной системой NF-кВ-люцифераза, экспрессирующей ОХ40. Относительные световые единицы (RLU) представлены на графике в зависимости от различных исследуемых концентраций антител.In fig. 11A and 11B show the results of an assay in which soluble (in a soluble state, FIG. 11A) or cross-linked (in a complexed state, FIG. 11B) pab1949-1 or isotype control antibody IgG 1 were assayed using a cell line with an NF reporter system -κB-luciferase expressing OX40. Relative light units (RLU) are plotted against the different antibody concentrations tested.
На фиг. 12А и 12В представлены результаты анализов с использованием репортерных генов, в которых антитела к ОХ40 исследовали на предмет их способности активировать клетки с репортерной системой, экспрессирующие FcyRIIIA (фиг. 12А) или вариант FcyRIIAH131 (фиг. 12В), при связывании антител с ОХ40-экспрессирующими целевыми клетками. На фиг. 12А значения Δ RLU представлены на графике в зависимости от различных концентраций pab1949-1 и pab2044-l. Δ RLU представляет разницу RLU антитела к ОХ40 и изотипического контроля. На фиг. 12В, значения RLU представлены на графике в зависимости от возрастающих концентраций pab1949-l, pab1949-l-S267E/L328F, pab2193-1, антитела изотипического контроля IgG1 или антитела изотипического контроля IgG2.In fig. 12A and 12B show the results of reporter gene assays in which anti-OX40 antibodies were tested for their ability to activate reporter cells expressing FcyRIIIA (FIG. 12A) or the FcyRIIA H131 variant (FIG. 12B) upon binding of the OX40-antibodies. expressing target cells. In fig. 12A Δ RLU values are plotted against different concentrations of pab1949-1 and pab2044-l. Δ RLU represents the difference in RLU of the anti-OX40 antibody and the isotype control. In fig. 12B, RLU values are plotted against increasing concentrations of pab1949-l, pab1949-l-S267E/L328F, pab2193-1, IgG 1 isotype control antibody, or IgG 2 isotype control antibody.
На фиг. 13А представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны значения Δ MFI OX40 человека на nTreg, CD4+ Т-клетках или CD8+ Т-клетках от здоровых доноров, активированных с использованием гранул с антителами к CD3/CD28, как измерено с помощью проточной цитометрии. Δ MFI представляет разницу MFI антитела к ОХ40 и MFI изотипического контроля. Используемым антителом к ОХ40 было РЕ-конъюгированное антитело мыши к ОХ40 человека (Biolegend: ACT35; каталог: 350004; партия: В181090). На фиг. 13В представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны значения Δ MFI OX40 человека на активированных nTreg и эффекторных Т-клетках от двух здоровых доноров. Клетки окрашивали коммерческим антителом к ОХ40 (клон BER-ACT35) или антителом изотипического контроля и анализировали с помощью проточной цитометрии. На фиг. 13С представлен график результатов исследования антитела к ОХ40 pab1949 с использованием репортерной клеточной линии, экспрессирующей Fc-гамма рецептор IIIA (FcyRIIIA). Клетки Jurkat с репортерной системой NFAT-люцифераза, сверхэкспрессирующие FcyRIIIA (полиморфизм 158 V/V) совместно культивировали с активированными первичными nTreg и эффекторными Т-клетками в течение 20 часов при температуре 37°С в присутствии pab1949 или изотипического контроля. Через 20 часов фиксировали относительные световые единицы (RLU), отображающие связывание FcyRIIIA. Δ RLU представляет разницу RLU антитела к ОХ40 и изотипического контроля. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение (n=2). Представленные данные характерны для экспериментов, в которых использовались клетки от трех доноров. Фиг. 13D аналогична фиг. 13С, где показаны результаты исследования, в котором изучают pab1949-1 с использованием модифицированного протокола. На фиг. 14А представлен набор гистограмм, показывающий поверхностную экспрессию ОХ40, измеренную с помощью проточной цитометрии. Образцы собирали из крови здоровых доноров-людей (а-с, n=3) или из опухолевых тканей пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC) (d-f, n=3). Популяции клеток определяли как Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25low и FOXP3-) или Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25high и FOXP3+). На фиг. 14В представлены две гистограммы из исследования, аналогичного представленному на фиг. 14А, в котором измеряется поверхностная экспрессия ОХ40 на CD8+ или CD4+ Т-клетках или клетках Treg из образцов рака эндометрия. На фиг. 14С представлена столбиковая диаграмма, демонстрирующая экспрессию ОХ40 на клетках Treg и клетках Teff различных типов опухолей. На фиг. 14D представлена таблица, обобщающая результаты по экспрессии ОХ40 на опухоль-ассоциированных CD4+ клетках Teff и клетках Treg. — представляет отрицательный результат по экспрессии/отсутствие экспрессии, + представляет слабую экспрессию, ++ представляет среднюю экспрессию и +++ представляет высокую экспрессию.In fig. 13A is a bar graph showing human OX40 Δ MFI values on nTregs, CD4+ T cells, or CD8+ T cells from healthy donors activated with anti-CD3/CD28 beads as measured by flow cytometry. Δ MFI represents the difference between the MFI of the anti-OX40 antibody and the MFI of the isotype control. The anti-OX40 antibody used was PE-conjugated mouse anti-human OX40 antibody (Biolegend: ACT35; catalog: 350004; lot: B181090). In fig. 13B is a bar graph showing human OX40 Δ MFI values on activated nTreg and effector T cells from two healthy donors. Cells were stained with a commercial anti-OX40 antibody (clone BER-ACT35) or an isotype control antibody and analyzed by flow cytometry. In fig. 13C is a graph of the results of a study of the anti-OX40 antibody pab1949 using a reporter cell line expressing Fc gamma receptor IIIA (FcyRIIIA). NFAT-luciferase reporter Jurkat cells overexpressing FcyRIIIA (158 V/V polymorphism) were cocultured with activated primary nTregs and effector T cells for 20 hours at 37°C in the presence of pab1949 or isotype control. After 20 hours, relative light units (RLU) representing FcyRIIIA binding were recorded. Δ RLU represents the difference in RLU of the anti-OX40 antibody and the isotype control. Error bars represent standard deviation (n=2). The data presented are representative of experiments in which cells from three donors were used. Fig. 13D is similar to FIG. 13C shows the results of a study examining pab1949-1 using a modified protocol. In fig. 14A is a set of histograms showing surface expression of OX40 measured by flow cytometry. Samples were collected from the blood of healthy human donors (a–c, n=3) or from tumor tissues of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) (d–f, n=3). Cell populations were defined as Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25low, and FOXP3-) or Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25high, and FOXP3+). In fig. 14B shows two histograms from a study similar to that shown in FIG. 14A, which measures the surface expression of OX40 on CD8+ or CD4+ T cells or Treg cells from endometrial cancer samples. In fig. 14C is a bar graph showing OX40 expression on Treg cells and Teff cells of various tumor types. In fig. 14D is a table summarizing the results of OX40 expression on tumor-associated CD4+ Teff cells and Treg cells. — represents negative expression/no expression, + represents weak expression, ++ represents moderate expression, and +++ represents high expression.
На фиг. 15А и 15В представлен набор графиков, демонстрирующих количество секретируемого GM-CSF, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы в клетках, происходящих из РВМС макака-крабоеда. Следует отметить, что Cyno 2 и Cyno 9 относятся к РВМС от одного и того же макака-крабоеда, исследованных в независимых экспериментах. Все остальные образцы РВМС собирали от других доноров-макаков-крабоедов.In fig. 15A and 15B are a set of graphs showing the amount of secreted GM-CSF induced by pab1949-1 or isotype control antibody IgG 1 with dose titration in cynomolgus macaque PBMC-derived cells. It should be noted that Cyno 2 and Cyno 9 are PBMCs from the same cynomolgus monkey studied in independent experiments. All other PBMC samples were collected from other cynomolgus monkey donors.
Фиг. 16А и 16В аналогичны фиг. 15А и 15В, где показано количество секретируемого IL-17, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы.Fig. 16A and 16B are similar to FIGS. 15A and 15B show the amount of secreted IL-17 induced by pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody with dose titration.
Фиг. 17А и 17В аналогичны фиг. 15А и 15В, где показано количество секретируемого TNFe, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы.Fig. 17A and 17B are similar to FIGS. 15A and 15B, which show the amount of secreted TNFe induced by pab1949-1 or isotype control antibody IgG 1 with dose titration.
Фиг. 18А и 18В аналогичны фиг. 15А и 15В, где показано количество секретируемого IL-5, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы.Fig. 18A and 18B are similar to FIGS. 15A and 15B show the amount of secreted IL-5 induced by pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody with dose titration.
Фиг. 19А и 19В аналогичны фиг. 15А и 15В, где показано количество секретируемого IL-10, индуцированного pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 с титрованием дозы.Fig. 19A and 19B are similar to FIGS. 15A and 15B show the amount of IL-10 secreted induced by pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody with dose titration.
На фиг. 20А и 20В представлены два графика, демонстрирующие результаты анализа, где исследуют функциональную активность антитела к ОХ40 pab1949-1 в отношении первичных РВМС макакаIn fig. 20A and 20B are two graphs showing the results of an assay examining the functional activity of the anti-OX40 antibody pab1949-1 against primary macaque PBMCs.
- 29 046360 крабоеда при стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA). Количество IL-2, секретируемого РВМС от двух доноров-макаков-крабоедов, представлено на графике в зависимости от титрования дозы pab1949-1 или антитела изотипического контроля IgGi.- 29 046360 crabeater when stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA). The amount of IL-2 secreted by PBMCs from two cynomolgus monkey donors is plotted as a function of dose titration of pab1949-1 or isotype control IgGi antibody.
На фиг. 21 представлена таблица, обобщающая результаты по связыванию моноклональных антител к ОХ40 pab1949-1 и pab1928 с клетками 1624-5, экспрессирующими мутантные по аланину варианты ОХ40 человека.In fig. 21 shows a table summarizing the binding results of the anti-OX40 monoclonal antibodies pab1949-1 and pab1928 to 1624-5 cells expressing alanine mutant human OX40 variants.
5. Подробное описание5. Detailed Description
В данном документе предусмотрены антитела (например, моноклональные антитела), которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и модулируют активность ОХ40. Например, в одном аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 и усиливают, индуцируют или повышают одну или несколько видов активности ОХ40. Например, в другом аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и устраняют, снижают или ингибируют одну или несколько видов активности ОХ40. В конкретном варианте осуществления антитела являются выделенными.Provided herein are antibodies (eg, monoclonal antibodies) that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and modulate the activity of OX40. For example, in one aspect, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 and enhance, induce, or enhance one or more activities of OX40. For example, in another aspect, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and eliminate, reduce, or inhibit one or more activities of OX40. In a specific embodiment, the antibodies are isolated.
В данном документе также предусмотрены выделенные нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), такие как комплементарная ДНК (кДНК), кодирующие такие антитела. Дополнительно предусмотрены векторы (например, векторы экспрессии) и клетки (например, клетки-хозяева), содержащие нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), кодирующие такие антитела. Также предусмотрены способы получения таких антител. В других аспектах в данном документе предусмотрены способы и применения индукции, повышения или усиления активности ОХ40 и лечения определенных состояний, таких как рак. Дополнительно предусмотрены способы и применения устранения, снижения или ингибирования активности ОХ40 (например, ОХ40 человека) и лечения определенных состояний, таких как воспалительные или аутоиммунные заболевания и нарушения. Также предусмотрены соответствующие композиции (например, фармацевтические композиции), наборы и способы выявления.Also provided herein are isolated nucleic acids (polynucleotides), such as complementary DNA (cDNA), encoding such antibodies. Additionally provided are vectors (eg, expression vectors) and cells (eg, host cells) containing nucleic acids (polynucleotides) encoding such antibodies. Methods for producing such antibodies are also provided. In other aspects, provided herein are methods and uses for inducing, enhancing or enhancing OX40 activity and treating certain conditions such as cancer. Additionally provided are methods and uses of eliminating, reducing or inhibiting OX40 activity (eg, human OX40) and treating certain conditions, such as inflammatory or autoimmune diseases and disorders. Suitable compositions (eg, pharmaceutical compositions), kits, and detection methods are also provided.
5.1 Терминология5.1 Terminology
Используемые в данном документе термины приблизительно и примерно при использовании с целью модификации числового значения или числового диапазона указывают на то, что отклонения от 5% до 10% выше и от 5% до 10% ниже значения или диапазона остаются в пределах подразумеваемого значения упомянутого значения или диапазона.As used herein, the terms approximately and approximately, when used to modify a numerical value or numerical range, indicate that deviations of 5% to 10% above and 5% to 10% below a value or range remain within the implied meaning of said value or range.
Как используется в данном документе, В представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от А в пределах определенной области значений А, если В существенно возрастает по мере того, как возрастает А в пределах определенной области, например, в определенном эксперименте, или при использовании средних значений из нескольких экспериментов. Это определение предусматривает, что значение В, соответствующее определенному значению А, должно быть до 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% или 20% включительно ниже по отношению к значению В, соответствующему любому более низкому значению А.As used herein, B is a substantially increasing function of A within a specified range of values of A if B increases substantially as A increases within a defined range, such as in a particular experiment, or using average values from several experiments. This definition provides that the value of B corresponding to a particular value of A must be up to and including 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15% or 20% lower than the value of B corresponding to any more low value A.
Используемые в данном документе термины антитело и антитела представляют собой термины из уровня техники и могут быть использованы взаимозаменяемо в данном документе, и они относятся к молекуле с антигенсвязывающим сайтом, который специфически связывает антиген.As used herein, the terms antibody and antibodies are prior art terms and may be used interchangeably herein, and refer to a molecule with an antigen-binding site that specifically binds an antigen.
Антитела могут включать, например, моноклональные антитела, полученные рекомбинантным путем антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, антитела с измененной поверхностью, химерные антитела, иммуноглобулины, синтетические антитела, тетрамерные антитела, содержащие молекулы из двух тяжелых цепей и двух легких цепей, мономер легкой цепи антитела, мономер тяжелой цепи антитела, димер легкой цепи антитела, димер тяжелой цепи антитела, пару легкая цепь антителатяжелая цепь антитела, интратела, гетероконъюгаты антител, однодоменные антитела, моновалентные антитела, одноцепочечные антитела или одноцепочечные Fv (scFv), камелизированные антитела, аффитела, Fab-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv), антиидиотипические (анти-Id) антитела (в том числе, например, антитела к анти-Id), биспецифические антитела и мультиспецифические антитела. В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, относятся к популяциям поликлональных антител. Антитела могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY), любому классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2) или любому подклассу (например, IgG2a или IgG2b) молекул иммуноглобулинов. В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, представляют собой IgGантитела или их класс (например, IgG1, IgG2 или IgG4 человека) или подкласс. В конкретном варианте осуществления антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. В другом конкретном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело человека, например, это иммуноглобулин. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, представляет собой IgG1-, IgG2- или IgG4-антитело.Antibodies may include, for example, monoclonal antibodies, recombinantly produced antibodies, human antibodies, humanized antibodies, surface-edited antibodies, chimeric antibodies, immunoglobulins, synthetic antibodies, tetrameric antibodies containing molecules of two heavy chains and two light chains, light chain monomer antibodies, antibody heavy chain monomer, antibody light chain dimer, antibody heavy chain dimer, antibody light chain pair, antibody heavy chain, intrabodies, antibody heteroconjugates, single domain antibodies, monovalent antibodies, single chain antibodies or single chain Fv (scFv), camellized antibodies, affibodies, Fab -fragments, F(ab') 2 -fragments linked by disulfide bonds Fv (sdFv), anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-Id antibodies), bispecific antibodies and multispecific antibodies. In certain embodiments, the antibodies described herein are polyclonal antibody populations. Antibodies may be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, or IgY), any class (eg, IgG 1 , IgG2, IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 , or IgA2), or any subclass (eg, IgG 2a or IgG 2b ) immunoglobulin molecules. In certain embodiments, the antibodies described herein are IgG antibodies or a class (eg, human IgG 1 , IgG 2 or IgG 4 ) or subclass thereof. In a specific embodiment, the antibody is a humanized monoclonal antibody. In another specific embodiment, the antibody is a human monoclonal antibody, such as an immunoglobulin. In certain embodiments, an antibody described herein is an IgG 1 , IgG 2 , or IgG 4 antibody.
Используемые в данном документе термины антигенсвязывающий домен, антигенсвязывающая область, антигенсвязывающий сайт и аналогичные термины относятся к части молекул антител, которая содержит аминокислотные остатки, которые придают молекуле антитела его специфичность к антигену (например, определяющие комплементарность области (CDR)). Антигенсвязывающая область моAs used herein, the terms antigen binding domain, antigen binding region, antigen binding site, and similar terms refer to the portion of antibody molecules that contains the amino acid residues that give the antibody molecule its specificity for an antigen (eg, complementarity determining regions (CDRs)). Antigen binding region
- 30 046360 жет быть получена от различных видов животных, таких как грызуны (например, мышь, крыса или хомяк) и люди.- 30 046360 can be obtained from various animal species, such as rodents (eg mouse, rat or hamster) and humans.
Используемые в данном документе термины вариабельная область или вариабельный домен используются взаимозаменяемо и являются общепринятыми в данной области техники. Вариабельная область обычно относится к части антитела, как правило, части легкой или тяжелой цепи, обычно приблизительно аминоконцевым 110-120 аминокислотам или 110-125 аминокислотам в зрелой тяжелой цепи и приблизительно 90-115 аминокислотам в зрелой легкой цепи, которые значительно отличаются по последовательности среди антител и отвечают за связывание и специфичность определенного антитела к своему определенному антигену. Вариабельность последовательности сконцентрирована в таких областях, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), тогда как более высококонсервативные области в вариабельном домене называются каркасными областями (FR). Без привязки к какому-либо конкретному механизму или теории, считается, что CDR легкой и тяжелой цепей преимущественно отвечают за взаимодействие антитела с антигеном и его специфичность. В определенных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область человека. В определенных вариантах осуществления вариабельная область содержит CDR грызуна или мыши и каркасные области (FR) человека. В конкретных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область примата (например, примата, отличного от человека). В определенных вариантах осуществления вариабельная область содержит CDR грызуна или мыши и каркасные области (FR) примата (например, примата, отличного от человека).As used herein, the terms variable region or variable domain are used interchangeably and are common in the art. A variable region generally refers to a portion of an antibody, typically a portion of the light or heavy chain, typically approximately the amino-terminal 110-120 amino acids or 110-125 amino acids in the mature heavy chain and approximately 90-115 amino acids in the mature light chain, which differ significantly in sequence among antibodies and are responsible for the binding and specificity of a particular antibody to its particular antigen. Sequence variability is concentrated in regions called complementarity determining regions (CDRs), while more highly conserved regions within the variable domain are called framework regions (FRs). Without being bound by any particular mechanism or theory, the light and heavy chain CDRs are believed to be primarily responsible for antibody-antigen interaction and specificity. In certain embodiments, the variable region is a human variable region. In certain embodiments, the variable region comprises a rodent or mouse CDR and human framework regions (FR). In specific embodiments, the variable region is a primate (eg, non-human primate) variable region. In certain embodiments, the variable region comprises rodent or mouse CDRs and primate (eg, non-human primate) framework regions (FRs).
Термины VL- и VL-домен используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области легкой цепи антитела.The terms VL and VL domain are used interchangeably to refer to the variable region of the light chain of an antibody.
Термины VH- и VH-домен используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области тяжелой цепи антитела.The terms VH and VH domain are used interchangeably to refer to the variable region of the heavy chain of an antibody.
Термин нумерация по Kabat и подобные термины являются общепризнанными в данной области техники и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающей части. В определенных аспектах CDR антитела могут быть определены согласно системе нумерации по Kabat (см., например, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 и Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). При использовании системы нумерации по Kabat CDR в молекуле тяжелой цепи антитела обычно присутствуют в пределах аминокислотных положений 31-35, которые необязательно могут включать одну или две дополнительные аминокислоты, расположенные после 35 (обозначаемые в схеме нумерации по Kabat как 35А и 35В) (CDR1), в пределах аминокислотных положений 50-65 (CDR2) и в пределах аминокислотных положений 95-102 (CDR3). При использовании системы нумерации по Kabat CDR в молекуле легкой цепи антитела обычно присутствуют в пределах аминокислотных положений 24-34 (CDR1), в пределах аминокислотных положений 50-56 (CDR2) и в пределах аминокислотных положений 89-97 (CDR3). В конкретном варианте осуществления CDR антител, описанных в данном документе, были определены согласно системе нумерации по Kabat.The term Kabat numbering and similar terms are generally recognized in the art and refer to a system for numbering amino acid residues in the variable regions of the heavy and light chains of an antibody or antigen-binding portion thereof. In certain aspects, antibody CDRs may be defined according to the Kabat numbering system (see, for example, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). When using the Kabat CDR numbering system in a heavy chain molecule, antibodies are typically present within amino acid positions 31-35, which may optionally include one or two additional amino acids located after 35 (referred to as 35A and 35B in the Kabat numbering scheme) (CDR1) , within amino acid positions 50-65 (CDR2) and within amino acid positions 95-102 (CDR3). When using the Kabat CDR numbering system in a light chain molecule, antibodies are typically present within amino acid positions 24-34 (CDR1), within amino acid positions 50-56 (CDR2), and within amino acid positions 89-97 (CDR3). In a specific embodiment, the CDRs of the antibodies described herein were determined according to the Kabat numbering system.
Используемый в данном документе термин константная область или константный домен являются взаимозаменяемыми и имеют их значение, общепринятое в данной области техники. Константная область представляет собой часть антитела, например, карбокси-концевую часть легкой и/или тяжелой цепи, которая непосредственно не участвует в связывании антитела с антигеном, но которая может характеризоваться различными эффекторными функциями, такими как взаимодействие с Fc-рецептором. Константная область молекулы иммуноглобулина, как правило, имеет более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с вариабельным доменом иммуноглобулина.As used herein, the term constant region or constant domain are used interchangeably and have their meaning commonly accepted in the art. A constant region is a portion of an antibody, such as the carboxy-terminal portion of the light and/or heavy chain, that is not directly involved in the binding of the antibody to an antigen, but which may have various effector functions, such as interaction with the Fc receptor. The constant region of an immunoglobulin molecule, as a rule, has a more conserved amino acid sequence compared to the variable domain of an immunoglobulin.
Используемый в данном документе термин тяжелая цепь при использовании по отношению к антителу может относиться к любому отдельному типу, например, альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основании аминокислотной последовательности константного домена, которые определяют классы IgA, IgD, IgE, IgG и IgM антител соответственно, в том числе подклассы IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.As used herein, the term heavy chain, when used in relation to an antibody, can refer to any single type, such as alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ), and mu (μ), based on amino acid constant domain sequences that define the classes of IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM antibodies, respectively, including IgG subclasses such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
Используемый в данном документе термин легкая цепь при использовании по отношению к антителу, может относиться к любому отдельному типу, например, каппа (к) или лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления легкая цепь представляет собой легкую цепь человека.As used herein, the term light chain, when used in relation to an antibody, can refer to any single type, such as kappa (k) or lambda (λ), based on the amino acid sequence of the constant domains. Light chain amino acid sequences are well known in the art. In specific embodiments, the light chain is a human light chain.
Аффинность связывания, как правило, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, аффинность связывания относится к присущей связывающей способности, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). В основном аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно представить константой диссоциации (KD). Аффинность может быть измеренаBinding affinity generally refers to the strength of the sum of all non-covalent interactions between one binding site of a molecule (such as an antibody) and its binding partner (such as an antigen). Unless otherwise specified as used herein, binding affinity refers to the inherent binding ability, which reflects the 1:1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). Basically, the affinity of a molecule X for its partner Y can be represented by the dissociation constant (KD). Affinity can be measured
- 31 046360 и/или выражена рядом способов, известных в данной области техники, в том числе без ограничения с помощью равновесной константы диссоциации (KD) и равновесной константы ассоциации (KA). KD рассчитывают исходя из отношения koff/kon, тогда как KA рассчитывают исходя из отношения kon/koff. kon относится к константе скорости ассоциации, например, антитела и антигена, и koff относится к диссоциации, например, антитела и антигена. kon и koff могут быть определены с помощью методик, известных специалисту в данной области техники, таких как BIAcore® или KinExA.- 31 046360 and/or expressed in a number of ways known in the art, including, without limitation, using the equilibrium dissociation constant (KD) and the equilibrium association constant (KA). KD is calculated from the koff/kon ratio, while K A is calculated from the kon/koff ratio. kon refers to the rate constant of association, for example, of antibody and antigen, and k off refers to the dissociation, for example, of antibody and antigen. kon and koff can be determined using techniques known to one skilled in the art, such as BIAcore® or KinExA.
Как используется в данном документе, консервативная аминокислотная замена представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком с аналогичной боковой цепью. В данной области техники были описаны семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В определенных вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков в CDR или в каркасной(каркасных) области(областях) антитела могут быть замещены аминокислотным остатком с аналогичной боковой цепью. Как используется в данном документе, эпитоп представляет собой термин из уровня техники и относится к ограниченной области антигена, с которым антитело может специфически связываться. Эпитоп могут образовывать, например, смежные аминокислоты полипептида (линейный или смежный эпитоп) или эпитоп может образовываться одновременно из двух или более несмежных областей полипептида или полипептидов (конформационный, нелинейный, прерывистый или несмежный эпитоп). В определенных вариантах осуществления эпитоп, с которым связывается антитело, может быть определен, например, с помощью ЯМР-спектроскопии, рентгенокристаллографических исследований, ELISA-анализов, водород-дейтериевого обмена в сочетании с массспектрометрией (например, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением), сканирующих анализов олигопептидов на основе массивов и/или картирования с помощью мутагенеза (например, картирования с помощью сайт-направленного мутагенеза). В случае рентгеновской кристаллографии кристаллизация может быть выполнена с помощью любого из известных способов в данной области техники (например, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Кристаллы антитело-антиген могут быть изучены с помощью хорошо известных методик рентгенодифракции и могут быть уточнены с помощью компьютерной программы, такой как X-PLOR (Yale University, 1992, продаваемой Molecular Simulations, Inc.; см., например, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al,; патентная заявка США № 2004/0014194), и BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Исследования с картированием с применением мутагенеза можно проводить с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники. См., например, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 и Cunningham ВС & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 касательно описания методик мутагенеза, в том числе методик аланин-сканирующего мутагенеза. В определенном варианте осуществления эпитоп для антитела определяют с помощью исследований с аланин-сканирующим мутагенезом.As used herein, a conservative amino acid substitution is a substitution in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues having side chains have been described in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, tryptophan), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g. tyrosine, phenylalanine , tryptophan, histidine). In certain embodiments, one or more amino acid residues in the CDR or framework region(s) of the antibody may be replaced by an amino acid residue with a similar side chain. As used herein, epitope is a prior art term and refers to a limited region of an antigen to which an antibody can specifically bind. An epitope can be formed, for example, from contiguous amino acids of a polypeptide (linear or contiguous epitope), or an epitope can be formed simultaneously from two or more non-contiguous regions of a polypeptide or polypeptides (conformational, non-linear, discontinuous or non-contiguous epitope). In certain embodiments, the epitope to which the antibody binds can be determined, for example, by NMR spectroscopy, X-ray crystallographic studies, ELISA assays, hydrogen-deuterium exchange coupled with mass spectrometry (e.g., liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry ), array-based oligopeptide scanning assays and/or mutagenesis mapping (eg, site-directed mutagenesis mapping). In the case of X-ray crystallography, crystallization can be performed using any of the known methods in the art (for example, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Antibody-antigen crystals can be studied using well-known X-ray diffraction techniques and can be refined using a computer program such as X-PLOR (Yale University, 1992, sold by Molecular Simulations, Inc.; see, for example, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al,; US Patent Application No. 2004/0014194, and BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323). Mutagenesis mapping studies can be carried out using any method known to one skilled in the art. See, for example, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 and Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 for a description of mutagenesis techniques, including alanine scanning mutagenesis techniques . In a certain embodiment, the epitope for the antibody is determined using alanine scanning mutagenesis studies.
Используемые в данном документе термины иммуноспецифично связывается, иммуноспецифично распознает, специфически связывается и специфически распознает являются аналогичными терминами в контексте антител и относятся к молекулам, которые связываются с антигеном (например, эпитопу или иммунному комплексу), в том смысле, в котором связывание понимается специалистом в данной области техники. Например, молекула, которая специфически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами, как правило, с более низкой аффинностью, что определяют, например, с помощью иммунологических анализов, BIAcore®, прибора KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Бойсе, Айдахо) или других анализов, известных в данной области техники. В конкретном варианте осуществления молекулы, которые иммуноспецифично связываются с антигеном, связываются с антигеном с KA, которая составляет по меньшей мере 2 log, 2,5 log, 3 log, 4 log или более чем KA в том случае, когда молекулы связываются неспецифично с другими антигеном. В контексте антител с антигенсвязывающим доменом антитела к ОХ40 и вторым антигенсвязывающим доменом, который не связывается специфически с антигеном, эскпрессируемым иммунной клеткой человека, выражения иммуноспецифично связывается, иммуноспецифично распознает, специфически связывается и специфически распознает относятся к антителам, которые характеризуются отличающимися видами специфичности в отношении нескольких антигенов (т.е., ОХ40 и антигена, ассоциированного со вторым антигенсвязывающим доменом). В другом конкретном варианте осуществления молекулы, которые иммуноспецифично связываются с антигеном, не реагируют перекрестно с другими белками в аналогичныхAs used herein, the terms immunospecifically binds, immunospecifically recognizes, specifically binds, and specifically recognizes are analogous terms in the context of antibodies and refer to molecules that bind to an antigen (eg, epitope or immune complex) as binding is understood by one skilled in the art. this field of technology. For example, a molecule that specifically binds an antigen may bind to other peptides or polypeptides, typically with lower affinity, as determined, for example, by immunoassays, BIAcore®, KinExA 3000 instrument (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho) or other assays known in the art. In a specific embodiment, molecules that immunospecifically bind an antigen bind the antigen with a K A that is at least 2 log, 2.5 log, 3 log, 4 log, or more than a K A when the molecules bind nonspecifically with other antigens. In the context of antibodies with an antigen-binding domain of an anti-OX40 antibody and a second antigen-binding domain that does not specifically bind to an antigen expressed by a human immune cell, the expressions immunospecifically binds, immunospecifically recognizes, specifically binds, and specifically recognizes refer to antibodies that have different types of specificity for several antigens (ie, OX40 and antigen associated with the second antigen binding domain). In another specific embodiment, molecules that immunospecifically bind to an antigen do not cross-react with other proteins in similar
- 32 046360 условиях связывания. В другом конкретном варианте осуществления молекулы, которые иммуноспецифично связываются с антигеном, не реагируют перекрестно с другими не относящимися к ОХ40 белками. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое связывается с ОХ40 с более высокой аффинностью, чем с другим неродственным антигеном. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека) с 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более высокой аффинностью по сравнению с другим, неродственным антигеном, что измеряют, например, с помощью радиоиммунологического анализа, поверхностного плазмонного резонанса или анализа кинетического исключения. В конкретном варианте осуществления степень связывания антитела к ОХ40, описанного в данном документе, с неродственным, не относящимся к ОХ40 белком, составляет менее 10%, 15% или 20% от связывания антитела с белком ОХ40, что определяют, например, с помощью радиоиммунологического анализа.- 32 046360 binding conditions. In another specific embodiment, molecules that immunospecifically bind to an antigen do not cross-react with other non-OX40 proteins. In a specific embodiment, provided herein is an antibody that binds to OX40 with higher affinity than to another unrelated antigen. In certain embodiments, provided herein is an antibody that binds to OX40 (e.g., human OX40) at 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or higher affinity compared to another, unrelated antigen, as measured, for example, by radioimmunoassay, surface plasmon resonance, or kinetic exclusion assay. In a specific embodiment, the extent of binding of an anti-OX40 antibody described herein to an unrelated, non-OX40 protein is less than 10%, 15%, or 20% of the binding of the antibody to the OX40 protein, as determined, for example, by a radioimmunoassay .
В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое связывается с ОХ40 человека с более высокой аффинностью, чем с ОХ40 других видов. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое связывается с ОХ40 человека с 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или более высокой аффинностью, чем с ОХ40 других видов, что измеряют, например, с помощью радиоиммунологического анализа, поверхностного плазмонного резонанса или анализа кинетического исключения. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое связывается с ОХ40 человека, будет связываться с белком ОХ40 других видов с менее 10%, 15% или 20% от связывания антитела по сравнению с белком ОХ40 человека, что измеряют, например, с помощью радиоиммунологического анализа, поверхностного плазмонного резонанса или анализа кинетического исключения.In a specific embodiment, provided herein is an antibody that binds to human OX40 with higher affinity than to OX40 from other species. In certain embodiments, provided herein is an antibody that binds to human OX40 at 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, or higher affinity than other species of OX40, as measured, for example, by radioimmunoassay, surface plasmon resonance, or kinetic exclusion assay. In a specific embodiment, an antibody described herein that binds to human OX40 will bind to the OX40 protein of other species with less than 10%, 15%, or 20% of the antibody binding compared to human OX40 protein, as measured by e.g. by radioimmunoassay, surface plasmon resonance, or kinetic exclusion assay.
Используемые в данном документе термины рецептор ОХ40, или ОХ40, или полипептид ОХ40 относятся к ОХ40, в том числе без ограничения к нативному ОХ40, изоформе ОХ40 или межвидовому гомологу ОХ40. ОХ40 также известен как член 4 суперсемейства факторов некроза опухоли (TNFRSF4), АСТ35, CD134, IMD16 и TXGP1L. Номера доступа в GenBank™ ВС105070 и ВС105072 представляют последовательности нуклеиновой кислоты ОХ40 человека. Номер в Refseq NP_003318.1 представляет аминокислотную последовательность ОХ40 человека. Незрелая аминокислотная последовательность ОХ40 человека представлена под SEQ ID NO: 17. Зрелая аминокислотная последовательность ОХ40 человека представлена под SEQ ID NO: 55. ОХ40 человека обозначается GeneID: 7293 согласно Entrez Gene. Номера в RefSeq ХМ_005545122.1 и ХР_005545179.1 представляют прогнозированные последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислотные последовательности ОХ40 макакакрабоеда соответственно. Также была описана растворимая изоформа ОХ40 человека (Taylor L et al., (2001) J Immunol Methods 255: 67-72). Используемый в данном документе термин ОХ40 человека относится к ОХ40, содержащему полипептидную последовательность под SEQ ID NO: 55.As used herein, the terms OX40 receptor, or OX40, or OX40 polypeptide refer to OX40, including, without limitation, native OX40, an OX40 isoform, or an interspecies OX40 homologue. OX40 is also known as tumor necrosis factor superfamily member 4 (TNFRSF4), ACT35, CD134, IMD16 and TXGP1L. GenBank™ accession numbers BC105070 and BC105072 represent human OX40 nucleic acid sequences. Refseq number NP_003318.1 represents the amino acid sequence of human OX40. The immature amino acid sequence of human OX40 is provided under SEQ ID NO: 17. The mature amino acid sequence of human OX40 is provided under SEQ ID NO: 55. Human OX40 is designated GeneID: 7293 according to Entrez Gene. RefSeq numbers XM_005545122.1 and XP_005545179.1 represent the predicted nucleic acid sequences and OX40 amino acid sequences of the cynomolgus macaque, respectively. A soluble isoform of human OX40 has also been described (Taylor L et al., (2001) J Immunol Methods 255: 67-72). As used herein, the term human OX40 refers to OX40 containing the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 55.
Используемые в данном документе термины лиганд ОХ40 и OX40L относится к члену 4 суперсемейства факторов некроза опухоли (TNFSF4). OX40L также известен как CD252, GP34, TXGP1 и CD134L. Номера доступа в GenBank™ D90224.1 и AK297932.1 представляют иллюстративные последовательности нуклеиновой кислоты OX40L человека. Номер в RefSeq NP_003317.1 и номер доступа в Swiss-Prot P23510-1 представляют иллюстративные аминокислотные последовательности OX40L человека для изоформы 1. Номер в RefSeq NP_001284491.1 и номер доступа в Swiss-Prot P23510-2 представляют иллюстративные аминокислотные последовательности OX40L человека для изоформы 2. OX40L человека обозначается GeneID: 7292 согласно Entrez Gene. В конкретном варианте осуществления OX40L представляет собой изоформу 1 OX40L человека под SEQ ID NO: 42 или изоформу 2 человека под SEQ ID NO: 43. Используемый в данном документе термин клетка-хозяин может означать клетку любого типа, например, первичную клетку, клетку в культуре или клетку из клеточной линии. В конкретных вариантах осуществления термин клетка-хозяин относится к клетке, трансфицируемой молекулой нуклеиновой кислоты, или потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, например, в связи с мутациями или воздействиями окружающей среды, которые могут иметь место в последующих поколениях, или интеграцией молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.As used herein, the terms OX40 ligand and OX40L refer to tumor necrosis factor superfamily member 4 (TNFSF4). OX40L is also known as CD252, GP34, TXGP1 and CD134L. GenBank™ accession numbers D90224.1 and AK297932.1 represent exemplary human OX40L nucleic acid sequences. RefSeq number NP_003317.1 and Swiss-Prot accession number P23510-1 represent exemplary human OX40L amino acid sequences for isoform 1. RefSeq number NP_001284491.1 and Swiss-Prot accession number P23510-2 represent exemplary human OX40L amino acid sequences for isoform 2. Human OX40L is designated GeneID: 7292 according to Entrez Gene. In a specific embodiment, OX40L is human OX40L isoform 1 of SEQ ID NO: 42 or human isoform 2 of SEQ ID NO: 43. As used herein, the term host cell can mean any type of cell, e.g., a primary cell, a cell in culture or a cell from a cell line. In specific embodiments, the term host cell refers to the cell transfected with the nucleic acid molecule, or the progeny or potential progeny of such a cell. The progeny of such a cell may not be identical to the parent cell transfected with the nucleic acid molecule, for example, due to mutations or environmental influences that may occur in subsequent generations, or integration of the nucleic acid molecule into the genome of the host cell.
Используемый в данном документе термин эффективное количество в контексте введения терапевтического средства субъекту относится к количеству терапевтического средства, которое обеспечивает желаемый профилактический или терапевтический эффект. Примеры эффективных количеств представлены в разделе 5.5.1.3 ниже.As used herein, the term effective amount, in the context of administering a therapeutic agent to a subject, refers to an amount of therapeutic agent that provides the desired prophylactic or therapeutic effect. Examples of effective amounts are presented in Section 5.5.1.3 below.
Используемые в данном документе термины субъект и пациент используются взаимозаменяемо. Субъектом может быть животное. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как млекопитающее, отличное от примата (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т. п.), или примата (например, обезьяна или человек), наиболее предпочтительно человека. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой макака-крабоеда. В определенных вариантах осуществления такие термины относятся к животному, отличному от человека (наAs used herein, the terms subject and patient are used interchangeably. The subject may be an animal. In some embodiments, the subject is a mammal, such as a non-primate mammal (e.g., cow, pig, horse, cat, dog, rat, etc.), or a primate (e.g., monkey or human), most preferably human . In some embodiments, the subject is a cynomolgus monkey. In certain embodiments, such terms refer to a non-human animal (in
- 33 046360 пример, животному, отличному от человека, такому как свинья, лошадь, корова, кошка или собака). В некоторых вариантах осуществления такие термины относятся к домашнему или сельскохозяйственному животному. В конкретных вариантах осуществления такие термины относятся к человеку. Как используется в данном документе, связывание между тестируемым антителом и первым антигеном является существенно ослабленным по сравнению со связыванием между тестируемым антителом и вторым антигеном, если связывание между тестируемым антителом и первым антигеном снижено на по меньшей мере 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% по сравнению со связыванием с тестируемым антителом и вторым антигеном, что измеряют, например, с помощью проточной цитометрии. Определение процентной идентичности между двумя последовательностями (например, аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот) может быть выполнено с помощью математического алгоритма. Конкретным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 22642268, модифицированный, как в Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. Поиски нуклеотидов в BLAST можно проводить с набором параметров программы NBLAST для нуклеотидов, установленными, например, для балла =100, длины слова =12, для нахождения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным в данном документе. Поиски белков в BLAST можно проводить с набором параметров программы XBLAST, установленными, например, для балла -50, длины слова = 3, для нахождения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка, описанной в данном документе. Для получения выравниваний с гэпами с целью сравнения можно использовать BLAST с гэпами, описанный в Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402. Альтернативно, PSI-BLAST можно использовать для проведения итеративного поиска, который выявляет дальние связи между молекулами (Id). При использовании программ BLAST, BLAST с гэпами и PSI Blast могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (см., например, Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) во всемирной сети, ncbi.nlm.nih.gov). Другим конкретным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения для выравнивания последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать таблицу весов замен остатков РАМ120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за внесение гэпа 4.- 33 046360 example, non-human animal such as a pig, horse, cow, cat or dog). In some embodiments, such terms refer to a domestic or farm animal. In specific embodiments, such terms refer to a person. As used herein, the binding between the test antibody and the first antigen is substantially reduced compared to the binding between the test antibody and the second antigen if the binding between the test antibody and the first antigen is reduced by at least 30%, 40%, 50%, 60 %, 70% or 80% compared to binding to the test antibody and the second antigen, as measured, for example, by flow cytometry. Determining the percentage identity between two sequences (eg, amino acid sequences or nucleic acid sequences) can be performed using a mathematical algorithm. A specific, non-limiting example of a mathematical algorithm used to compare two sequences is the algorithm of Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 22642268, modified as in Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Such an algorithm is included in the NBLAST and XBLAST programs Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. BLAST nucleotide searches can be performed with a set of NBLAST nucleotide program parameters set to, for example, score = 100, word length = 12 to find nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules described herein. BLAST protein searches can be conducted with a set of XBLAST program parameters set to, for example, score -50, word length = 3, to find amino acid sequences homologous to a protein molecule described herein. To obtain gap alignments for comparison purposes, gap BLAST, described in Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402, can be used. Alternatively, PSI-BLAST can be used to conduct iterative searches that identify long-range connections between molecules (Id). When using the BLAST, BLAST with gaps, and PSI Blast programs, the default parameters of the corresponding programs (for example, XBLAST and NBLAST) may be used (see, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the World Wide Web, ncbi.nlm.nih.gov ). Another specific, non-limiting example of a mathematical algorithm used for sequence comparison is the algorithm of Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Such an algorithm is included in the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, you can use the table of residue substitution weights RAM120, the penalty for continuing a gap is 12, and the penalty for introducing a gap is 4.
Процентная идентичность между двумя последовательностями может быть определена с помощью методик, аналогичных описанным выше, с разрешением или без разрешения гэпов. При расчете процентной идентичности обычно подсчитывают лишь точные совпадения.Percent identity between two sequences can be determined using techniques similar to those described above, with or without gap resolution. When calculating percent identity, only exact matches are usually counted.
Используемый в данном документе термин антигенсвязывающий домен, который не связывается с антигеном, экспрессируемым иммунной клеткой человека означает, что антигенсвязывающий домен не связывается с антигеном, экспрессируемым любой человеческой клеткой гематопоэтического происхождения, которая играет роль в иммунном ответе. Иммунные клетки включают лимфоциты, такие как Вклетки и Т-клетки; клетки-естественные киллеры; и миелоидные клетки, такие как моноциты, макрофаги, эозинофилы, тучные клетки, базофилы и гранулоциты. Например, такой связывающий домен не будет связываться с ОХ40 или любыми другими членами суперсемейства рецепторов TNF, которые экспрессируются иммунной клеткой человека. Однако антигенсвязывающий домен может связываться с антигеном, таким как без ограничения антиген, экспрессируемый в других организмах, но не у людей (т.е., не принадлежащий человеку антиген); антигеном, который не экспрессируется человеческими клетками дикого типа; или вирусным антигеном, включая без ограничения антиген из вируса, который не инфицирует человеческие клетки, или вирусным антигеном, который отсутствует в неинфицированной иммунной клетке человека.As used herein, the term antigen binding domain that does not bind to an antigen expressed by a human immune cell means that the antigen binding domain does not bind to an antigen expressed by any human cell of hematopoietic origin that plays a role in the immune response. Immune cells include lymphocytes such as B cells and T cells; natural killer cells; and myeloid cells such as monocytes, macrophages, eosinophils, mast cells, basophils and granulocytes. For example, such a binding domain will not bind to OX40 or any other members of the TNF receptor superfamily that are expressed by a human immune cell. However, the antigen binding domain can bind to an antigen, such as, but not limited to, an antigen expressed in other organisms but not in humans (ie, a non-human antigen); an antigen that is not expressed by wild-type human cells; or a viral antigen, including, without limitation, an antigen from a virus that does not infect human cells, or a viral antigen that is not present in an uninfected human immune cell.
5.2 Антитела5.2 Antibodies
В конкретном аспекте в данном документе предусмотрены антитела (например, моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела), которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с CD4+ Т-клетками человека и CD8+ Т-клетками человека. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, связывается с CD4+ Т-клетками человека и CD4+ Т-клетками макака-крабоеда. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую:In a specific aspect, provided herein are antibodies (eg, monoclonal antibodies, such as chimeric, humanized, or human antibodies) that specifically bind to OX40 (eg, human OX40). In certain embodiments, an antibody described herein binds to human CD4+ T cells and human CD8+ T cells. In certain embodiments, an antibody described herein binds to human CD4+ T cells and cynomolgus CD4+ T cells. In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain variable region (VL) comprising:
(a) CDR1 VL, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1), (b) CDR2 VL, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности LGSNRAS (SEQ ID NO: 2), и (c) CDR3 VL, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), как показано в табл. 1.(a) a CDR1 VL comprising, consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1), (b) a CDR2 VL containing, consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2 ), and (c) a CDR3 VL containing, consisting of, or consisting primarily of the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3), as shown in table. 1.
- 34 046360- 34 046360
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит каркасные области VL, описанные в данном документе. В конкретных вариантах осуществления антитело содержит каркасные области (FR) VL антитела, изложенные в табл. 3. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:In some embodiments, the antibody comprises the VL framework regions described herein. In specific embodiments, the antibody comprises the antibody VL framework regions (FRs) set forth in Table. 3. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain variable region (VH) comprising:
(a) CDR1 VH, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности GSAMH (SEQ ID NO: 4), (b) CDR2 VH, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5), и (c) CDR3 VH, содержащую, состоящую из или состоящую главным образом из аминокислотной последовательности GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6), как показано в табл. 2.(a) a CDR1 VH comprising, consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4), (b) a CDR2 VH containing, consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5 ), and (c) a CDR3 VH containing, consisting of, or consisting primarily of the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6), as shown in table. 2.
В некоторых вариантах осуществления антитело содержит каркасные области VH, описанные в данном документе. В конкретных вариантах осуществления антитело содержит каркасные области (FR) VH антитела, изложенные в таблице 4.In some embodiments, the antibody comprises the VH framework regions described herein. In specific embodiments, the antibody comprises the antibody VH framework regions (FRs) set forth in Table 4.
Таблица 1Table 1
Аминокислотные последовательности CDR VL1 Amino acid sequences of CDR VL 1
1 CDR VL в табл. 1 определены согласно системе по Kabat. 1 CDR VL in table. 1 are determined according to the Kabat system.
Таблица 2table 2
Аминокислотные последовательности CDR VH2 Amino acid sequences of CDR VH 2
2 CDR VH в табл. 2 определены согласно системе по Kabat. 2 CDR VH in table. 2 are determined according to the Kabat system.
Таблица 3Table 3
Аминокислотные последовательности FR VL3 Amino acid sequences of FR VL 3
3 Каркасные области VL, описанные в табл. 3, определены исходя из границ CDR согласно системе нумерации по Kabat. Другими словами, CDR VL определены по Kabat, и каркасные области представляют собой аминокислотные остатки, окружающие CDR в вариабельной области в формате FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 3 VL frame regions described in Table. 3 are determined based on the boundaries of the CDR according to the Kabat numbering system. In other words, the VL CDRs are defined by Kabat, and the framework regions are the amino acid residues surrounding the CDRs in the variable region in the format FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
Таблица 4Table 4
Аминокислотные последовательности FR VH4 Amino acid sequences of FR VH 4
4 Каркасные области VH, описанные в таблице 4, определены исходя из границ CDR согласно системе нумерации по Kabat. Другими словами, CDR VH определены по Kabat, и каркасные области представляют собой аминокислотные остатки, окружающие CDR в вариабельной области в формате FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 4 The VH frame regions described in Table 4 are defined based on the CDR boundaries according to the Kabat numbering system. In other words, the VH CDRs are defined by Kabat, and the framework regions are the amino acid residues surrounding the CDRs in the variable region in the format FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
В конкретных вариантах осуществления антитело содержит четыре каркасные области (FR) VL, изложенные в табл. 3, и четыре каркасные области (FR) VH, изложенные в табл. 4.In specific embodiments, the antibody contains four VL framework regions (FRs) set forth in Table. 3, and the four frame regions (FR) VH set out in table. 4.
- 35 046360- 35 046360
В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержит CDR вариабельной области легкой цепи (VL) и CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) pab1949 или pab2044, например, как изложено в табл. 1 и 2 (т.е., SEQ ID NO: 1-6). В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержит CDR вариабельной области легкой цепи (VL) и CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) pab1949 или pab2044, например, как изложено в табл. 1 и 2 (т. е., SEQ ID NO: 1-6) и каркасные области VL и каркасные области VH, изложенные в табл. 3 и 4.In certain embodiments, provided herein is an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) and contains a light chain variable region (VL) CDR and a heavy chain variable region (VH) CDR pab1949 or pab2044, for example, as set forth in table . 1 and 2 (ie, SEQ ID NO: 1-6). In certain embodiments, provided herein is an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) and contains a light chain variable region (VL) CDR and a heavy chain variable region (VH) CDR pab1949 or pab2044, for example, as set forth in table . 1 and 2 (ie, SEQ ID NO: 1-6) and the framework regions VL and framework regions VH set forth in table. 3 and 4.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как изложено в табл. 1, и каркасные области VL, изложенные в табл. 3. В определенных вариантах осуществления антитело содержит вариабельную каркасную область легкой цепи, которая происходит из аминокислотной последовательности, кодируемой геном человека, где аминокислотная последовательность представляет собой IGKV2-28*01 (SEQ ID NO: 18).In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) contains a light chain variable region (VL) comprising CDR1 VL, CDR2 VL, and CDR3 VL, as set forth in Table. 1, and the frame regions VL set out in table. 3. In certain embodiments, the antibody comprises a light chain variable framework region that is derived from an amino acid sequence encoded by a human gene, wherein the amino acid sequence is IGKV2-28*01 (SEQ ID NO: 18).
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как изложено в табл. 2 и каркасные области VH, изложенные в табл. 4.In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) contains a heavy chain variable region (VH) comprising CDR1 VH, CDR2 VH, and CDR3 VH, as set forth in Table. 2 and the framework regions VH, set out in table. 4.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит вариабельную каркасную область тяжелой цепи, которая происходит из аминокислотной последовательности, кодируемой геном человека, где аминокислотная последовательность представляет собой IGHV3-73*01 (SEQ ID NO: 19).In certain embodiments, the antibody comprises a heavy chain variable framework region that is derived from an amino acid sequence encoded by a human gene, wherein the amino acid sequence is IGHV3-73*01 (SEQ ID NO: 19).
В конкретном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В конкретном варианте осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, состоящий из или состоящий главным образом из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15.In a specific embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In a specific embodiment, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) , contains a VL domain consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, состоящий из или состоящий главным образом из аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16.In certain embodiments, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) , contains a VH domain consisting of or consisting primarily of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
В определенных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен и VL-домен, где VH-домен и VL-домен содержат аминокислотные последовательности под SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 15 соответственно. В определенных вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен и VL-домен, где VH-домен и VL-домен состоят из или состоят главным образом из аминокислотных последовательностей под SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 15 соответственно.In certain embodiments, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VH domain and a VL domain, wherein the VH domain and VL domain comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 15 respectively. In certain embodiments, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VH domain and a VL domain, wherein the VH domain and the VL domain consist of or consist primarily of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 15, respectively.
В определенных аспектах антитело, описанное в данном документе, может быть описано только по своему VL-домену или только по своему VH-домену или только по своим 3 CDR VL или только по своим 3 CdR VH. См., например, Rader С et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и в которой описывается гуманизация антитела мыши к ave3 с помощью идентификации комплементарной легкой цепи или тяжелой цепи, соответственно, из библиотеки легких цепей или тяжелых цепей человека, с обеспечением гуманизированных вариантов антитела, характеризующихся показателями аффинности, которые являются такими же или более высокими по сравнению с аффинностью исходного антитела. См. также Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и в которой описываются способы получения антител, которые связывают определенный антиген с помощью определенного VL-домена (или VH-домена) и скрининга библиотеки на наличие комплементарных вариабельных доменов. В результате скрининга было получено 14 новых партнеров для определенного VHдомена и 13 новых партнеров для определенного VL-домена, которые являлись сильными связывающими элементами, что было определено с помощью ELISA. См. также Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, и в которой описываются способы получения антител, которые связывают определенный антиген с помощью определенного VH-домена, и скрининга библиотеки (например, библиотеки VL человека) на наличие комплементарных VL-доменов; выбранные VL-домены, в свою очередь, можно использовать для направления отбора дополнительных комплементарных VH-доменов (например, человека).In certain aspects, an antibody described herein may be described by its VL domain only, or its VH domain only, or its 3 VL CDRs only, or its 3 VH CdRs only. See, for example, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, which is incorporated herein by reference in its entirety, and which describes the humanization of a mouse anti-ave3 antibody by identifying a complementary light chain or heavy chain. chains, respectively, from a library of human light chains or heavy chains, providing humanized antibody variants having affinities that are the same as or higher than those of the parent antibody. See also Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, which is incorporated herein by reference in its entirety, and which describes methods for producing antibodies that bind a specific antigen via a specific VL domain ( or VH domain) and screening the library for the presence of complementary variable domains. The screening resulted in 14 new partners for a specific VH domain and 13 new partners for a specific VL domain that were strong binders as determined by ELISA. See also Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, which is incorporated herein by reference in its entirety, and which describes methods for producing antibodies that bind a specific antigen using a specific VH domain , and screening a library (eg, a human VL library) for complementary VL domains; the selected VL domains can in turn be used to guide the selection of additional complementary VH domains (eg, human).
В определенных аспектах CDR антитела могут быть определены согласно системе нумерации по Chothia, которая обращается к расположению структурных петель иммуноглобулинов (см., например, Chothia С & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani В et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia С et al, (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; и патент США № 7709226). Как правило, при использовании системы нумерации по Kabat петля CDR-H1In certain aspects, CDR antibodies can be defined according to the Chothia numbering system, which refers to the location of the structural loops of immunoglobulins (see, for example, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; and US Patent No. 7709226). Typically, when using the Kabat numbering system, the CDR-H1 loop
- 36 046360 согласно системе по Chothia находится в пределах аминокислот 26-32, 33 или 34 тяжелой цепи, петля CDR-H2 по Chothia находится в пределах аминокислот 52-56 тяжелой цепи, и петля CDR-H3 по Chothia находится в пределах аминокислот 95-102 тяжелой цепи, в то время как петля CDR-L1 по Chothia находится в пределах аминокислот 24-34 легкой цепи, петля CDR-L2 по Chothia находится в пределах аминокислот 50-56 легкой цепи, и петля CDR-L3 по Chothia находится в пределах аминокислот 89-97 легкой цепи. Конец петли CDR-H1 по Chothia при нумерации с использованием правила нумерации по Kabat варьирует от Н32 до Н34, в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что согласно схеме нумерации по Kabat вставки размещаются в Н35А и Н35В; при этом если как 35А, так и 35В отсутствуют, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35А, то петля заканчивается на 33; если присутствуют как 35А, так и 35В, то петля заканчивается на 34). В определенных аспектах в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR VL из VL pab1949 или pab2044 согласно Chothia. В определенных аспектах в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR VH из VH pab1949 или pab2044 согласно Chothia. В определенных аспектах в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR VL из VL pab1949 или pab2044 согласно Chothia, и содержат CDR VH из VH pab1949 или pab2044 согласно Chothia. В определенных вариантах осуществления антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержат одну или несколько CDR, при этом CDR согласно Chothia и Kabat имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат комбинации CDR согласно Kabat и CDR согласно Chothia.- 36 046360 according to the Chothia system is within amino acids 26-32, 33 or 34 of the heavy chain, the Chothia CDR-H2 loop is within the heavy chain amino acids 52-56, and the Chothia CDR-H3 loop is within amino acids 95- 102 of the heavy chain, while the Chothia CDR-L1 loop is within amino acids 24-34 of the light chain, the Chothia CDR-L2 loop is within amino acids 50-56 of the light chain, and the Chothia CDR-L3 loop is within amino acids 89-97 light chain. The end of the Chothia CDR-H1 loop, when numbered using the Kabat numbering rule, varies from H32 to H34, depending on the length of the loop (this is due to the fact that according to the Kabat numbering scheme, inserts are placed at H35A and H35B; however, if both 35A, and 35B are absent, then the loop ends at 32; if only 35A is present, then the loop ends at 33; if both 35A and 35B are present, then the loop ends at 34). In certain aspects, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and comprise a VL CDR from the Chothia VL pab1949 or pab2044. In certain aspects, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and comprise a VH CDR from the Chothia VH pab1949 or pab2044. In certain aspects, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and comprise a VL CDR from the Chothia VL pab1949 or pab2044, and comprise a VH CDR from the Chothia VH pab1949 or pab2044. In certain embodiments, antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) contain one or more CDRs, wherein the Chothia and Kabat CDRs have the same amino acid sequence. In certain embodiments, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and contain combinations of Kabat CDRs and Chothia CDRs.
В определенных аспектах CDR антитела могут быть определены согласно системе нумерации IMGT, как описано в Lefranc М-Р, (1999) The Immunologist 7: 132-136 и Lefranc М-Р et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. Согласно схеме нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VHCDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52 и VL-CDR3 находится в положениях 89-97. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR pab1949 или pab2044, что определяют согласно системе нумерации IMGT, например, как описано в Lefranc М-Р (1999) выше и Lefranc М-Р et al., (1999) выше).In certain aspects, CDR antibodies can be defined according to the IMGT numbering system, as described in Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 and Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209- 212. According to the IMGT numbering scheme, VH-CDR1 is in positions 26-35, VHCDR2 is in positions 51-57, VH-CDR3 is in positions 93-102, VL-CDR1 is in positions 27-32, VL-CDR2 is in positions 50- 52 and VL-CDR3 is in positions 89-97. In a specific embodiment, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and contain CDR pab1949 or pab2044, as defined according to the IMGT numbering system, for example, as described in Lefranc M-P (1999) supra and Lefranc M-R et al., (1999) supra).
В определенных аспектах CDR антитела могут быть определены согласно MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. См. также, например, Martin A. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, в Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR pab1949 или pab2044, что определяют с помощью способа в MacCallum RM et al.In certain aspects, antibody CDRs may be defined according to MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. See also, for example, Martin A. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, in Antibody Engineering, Kontermann and Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). In a specific embodiment, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and contain the CDR pab1949 or pab2044, as determined by the method in MacCallum RM et al.
В определенных аспектах CDR антитела могут быть определены согласно системе нумерации AbM, которая обращается к определению гипервариабельных областей согласно AbM, которое представляют собой компромисс между определением CDR согласно Kabat и структурных петель согласно Chothia, и используется в программном обеспечении для моделирования антител с помощью Oxford Molecular's AbM (Oxford Molecular Group, Inc.). В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены антитела, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат CDR pab1949 или pab2044, что определяют согласно системе нумерации AbM.In certain aspects, antibody CDRs may be defined according to the AbM numbering system, which refers to the AbM definition of hypervariable regions, which represents a compromise between the Kabat definition of CDR and Chothia structural loops, and is used in antibody modeling software using Oxford Molecular's AbM (Oxford Molecular Group, Inc.). In a specific embodiment, provided herein are antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) and contain CDR pab1949 or pab2044, as defined by the AbM numbering system.
В конкретном варианте осуществления расположение одной или нескольких CDR в VH-области (например, CDR1, CDR2 или CDR3) и/или VL-области (например, CDR1, CDR2 или CDR3) антитела, описанного в данном документе, может изменяться на одно, два, три, четыре, пять или шесть аминокислотных положений, при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). Например, в одном варианте осуществления расположение, определяющее CDR антитела, описанного в данном документе, может изменяться за счет сдвига N-концевой и/или С-концевой границы CDR на одну, две, три, четыре, пять или шесть аминокислот по отношению к расположению CDR антитела, описанного в данном документе (например, pab1949 или pab2044), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В другом варианте осуществления длина одного или нескольких CDR в VH-области (например, CDR1, CDR2 или CDR3) и/или VL-области (например, CDR1, CDR2 или CDR3) антитела, описанного в данном документе, может изменяться (например, быть меньше или больше) на одну, два, три, четыре, пять или более аминокислот, при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мереIn a specific embodiment, the location of one or more CDRs in the VH region (e.g., CDR1, CDR2, or CDR3) and/or the VL region (e.g., CDR1, CDR2, or CDR3) of an antibody described herein may vary by one, two , three, four, five or six amino acid positions, provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). For example, in one embodiment, the location defining the CDR of an antibody described herein may be changed by shifting the N-terminal and/or C-terminal boundary of the CDR by one, two, three, four, five, or six amino acids relative to the location CDR of an antibody described herein (e.g., pab1949 or pab2044), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50%, at least 60% , at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the length of one or more CDRs in the VH region (e.g., CDR1, CDR2, or CDR3) and/or the VL region (e.g., CDR1, CDR2, or CDR3) of an antibody described herein may vary (e.g., be less or more) by one, two, three, four, five or more amino acids, provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50%, at least at least 60%, at least 70%, at least
- 37 046360- 37 046360
80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%).80%, at least 90%, at least 95%).
В одном варианте осуществления CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанные в данном документе, могут быть на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот короче, чем одна или несколько из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 1-6), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В другом варианте осуществления CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанные в данном документе, могут быть на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот длиннее, чем одна или несколько из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 1-6), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В другом варианте осуществления аминоконец CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанных в данном документе, может быть удлинен на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот по сравнению с одной или несколькими из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 1-6), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В другом варианте осуществления карбокси-конец CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанных в данном документе, может быть удлинен на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот по сравнению с одной или несколькими из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 1-6), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В другом варианте осуществления амино-конец CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанных в данном документе, может быть укорочен на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот по сравнению с одной или несколькими из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 16), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). В одном варианте осуществления карбокси-конец CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH и/или CDR3 VH, описанных в данном документе, может быть укорочен на одну, две, три, четыре, пять или более аминокислот по сравнению с одной или несколькими из CDR, описанных в данном документе (например, SEQ ID NO: 1-6), при условии, что иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) сохраняется (например, значительно сохраняется, например, на по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%). Для определения того, сохраняется ли иммуноспецифичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека), можно использовать любой способ, известный в данной области техники, например, в данном документе предусмотрены анализы связывания и условия, описанные в разделе Примеры (раздел 6).In one embodiment, the CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH and/or CDR3 VH described herein may be one, two, three, four, five or more amino acids shorter than one or more from the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NO: 1-6), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50%, according to at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH and/or CDR3 VH described herein may be one, two, three, four, five or more amino acids longer than one or more from the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NO: 1-6), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50%, according to at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the amino terminus of CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH and/or CDR3 VH described herein may be extended by one, two, three, four, five or more amino acids compared to one or more than one of the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NOs: 1-6), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50% , at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the carboxy terminus of CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH and/or CDR3 VH described herein may be extended by one, two, three, four, five or more amino acids over with one or more of the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NOs: 1-6), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., for at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In another embodiment, the amino terminus of CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH and/or CDR3 VH described herein may be shortened by one, two, three, four, five or more amino acids compared to with one or more of the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NO: 16), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., at least 50% , at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). In one embodiment, the carboxy terminus of CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH, and/or CDR3 VH described herein may be shortened by one, two, three, four, five or more amino acids relative to with one or more of the CDRs described herein (e.g., SEQ ID NOs: 1-6), provided that immunospecific binding to OX40 (e.g., human OX40) is retained (e.g., significantly retained, e.g., for at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%). To determine whether immunospecific binding to OX40 (eg, human OX40) is retained, any method known in the art can be used, for example, the binding assays and conditions described in the Examples section (Section 6) are provided herein.
В конкретных аспектах в данном документе предусмотрено антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь антитела, например, отдельную легкую цепь и тяжелую цепь. Что касается легкой цепи, в конкретном варианте осуществления легкая цепь антитела, описанного в данном документе, представляет собой легкую каппа-цепь. В другом конкретном варианте осуществления легкая цепь антитела, описанного в данном документе, представляет собой легкую лямбда-цепь. Согласно еще одному конкретному варианту осуществления легкая цепь антитела, описанного в данном документе, представляет собой легкую каппа-цепь человека или легкую лямбда-цепь человека. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с полипептидом ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, где аминокислотная последовательность VLдомена предусматривает последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и где константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи человека. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, где аминокислотная последовательность VL-домена предусматривает последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и где константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой лямбда-цепи человека. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, где аминокислотная последовательность VL-домена предусматривает последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и где константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа- или лямбда-цепи человека. Неограничивающие примеры последовательностей константных областей человека были описаны в данной области техники, например, см. патент США № 5693780 и Kabat EA et al., (1991) выше.In specific aspects, provided herein is an antibody comprising a light chain and a heavy chain of an antibody, eg, a separate light chain and a heavy chain. With respect to the light chain, in a particular embodiment, the light chain of the antibody described herein is a kappa light chain. In another specific embodiment, the light chain of an antibody described herein is a lambda light chain. In yet another specific embodiment, the light chain of an antibody described herein is a human kappa light chain or a human lambda light chain. In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to an OX40 polypeptide (e.g., human OX40) comprises a light chain, wherein the amino acid sequence of the VL domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and wherein the light chain constant region comprises amino acid sequence of the human kappa light chain constant region. In another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain, wherein the amino acid sequence of the VL domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and wherein the light chain constant region chain contains the amino acid sequence of the human lambda light chain constant region. In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain, wherein the amino acid sequence of the VL domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and wherein the light chain constant region contains the amino acid sequence of the human kappa or lambda light chain constant region. Non-limiting examples of human constant region sequences have been described in the art, for example, see US Pat. No. 5,693,780 and Kabat EA et al., (1991) supra.
- 38 046360- 38 046360
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20.In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
Что касается тяжелой цепи, в конкретном варианте осуществления тяжелая цепь антитела, описанного в данном документе, может представлять собой тяжелую альфа- (α), дельта- (δ), эпсилон- (ε), гамма- (γ) или мю- (μ) цепь. В другом конкретном варианте осуществления тяжелая цепь антитела, описанного в данном документе, может представлять собой тяжелую альфа- (α), дельта- (δ), эпсилон- (ε), гамма- (γ) или мю- (μ) цепь человека. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность VH-домена может содержать последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой гамма- (γ) цепи человека. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность VH-домена содержит последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи человека, описанной в данном документе и известной в данной области техники. Неограничивающие примеры последовательностей константных областей человека были описаны в данной области техники, например, см. патент США № 5693780 и Kabat EA et al., (1991) выше.With respect to the heavy chain, in a particular embodiment, the heavy chain of an antibody described herein may be alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ), or mu (μ) heavy chain. ) chain. In another specific embodiment, the heavy chain of an antibody described herein may be a human alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ), or mu (μ) heavy chain. In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a heavy chain, wherein the amino acid sequence of the VH domain may comprise the sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and wherein the heavy chain constant region chain contains the amino acid sequence of the human gamma (γ) heavy chain constant region. In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a heavy chain, wherein the amino acid sequence of the VH domain comprises the sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and wherein the heavy chain constant region contains the amino acid sequence of a human heavy chain described herein and known in the art. Non-limiting examples of human constant region sequences have been described in the art, for example, see US Pat. No. 5,693,780 and Kabat EA et al., (1991) supra.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 21. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 60. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 61. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 51. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 62. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 52. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную b SEQ ID NO: 63.In a specific embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21. In a specific embodiment, the antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 60. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) , contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 61. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51. In another embodiment, the antibody antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 52. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a heavy chain, containing the amino acid sequence set forth by b SEQ ID NO: 63.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен и VH-домен, содержащие любые аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY или молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY человека. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен и VH-домен, содержащие любые аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY, молекулы иммуноглобулина любого класса (например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b). В конкретном варианте осуществления константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина человека IgG, IgE, IgM, IgD, IgA или IgY, молекулы иммуноглобулина любого класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или любого подкласса (например, IgG2a и IgG2b).In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL domain and a VH domain comprising any of the amino acid sequences described herein, and wherein the constant regions comprise the amino acid sequences constant regions of an IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY immunoglobulin molecule or a human IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY immunoglobulin molecule. In another embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL domain and a VH domain comprising any of the amino acid sequences described herein, and wherein the constant regions comprise the amino acid sequences constant regions of an immunoglobulin molecule IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY, an immunoglobulin molecule of any class (for example, IgGi, IgG2, IgG 3 , IgG 4 , IgAi and IgA 2 ) or any subclass (for example, IgG 2a and IgG 2b ) . In a specific embodiment, the constant regions comprise the amino acid sequences of the constant regions of a human immunoglobulin molecule IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY, an immunoglobulin molecule of any class (for example, IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgA1 and IgA2 ) or any subclass (for example, IgG2a and IgG2b).
В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен и VH-домен, содержащие любые аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей IgG1 человека (например, аллотипы Glm3, Glm17,1 или Glm17,1,2), IgG2 человека или IgG4 человека. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40In another embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL domain and a VH domain comprising any of the amino acid sequences described herein, and wherein the constant regions comprise the amino acid sequences human IgG1 constant regions (eg, Glm3, Glm17.1 or Glm17.1,2 allotypes), human IgG 2 or human IgG 4 . In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40
- 39 046360 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен и VH-домен, содержащие любые аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей IgG1 человека (аллотип Glm3). Неограничивающие примеры константных областей человека описаны в уровне техники, например, см. Kabat EA et al., (1991) выше.- 39 046360 (for example, human OX40), contains a VL domain and a VH domain containing any of the amino acid sequences described herein, and wherein the constant regions contain the amino acid sequences of human IgG 1 constant regions (Glm3 allotype). Non-limiting examples of human constant regions are described in the prior art, for example, see Kabat EA et al., (1991) supra.
В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 21. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 60. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 23. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 61. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 51 или 52. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 20, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 62 или 63.In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 and a heavy chain containing the amino acid the sequence set forth in SEQ ID NO: 60. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 61. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 51 or 52. In another embodiment, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a light chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20, and a heavy chain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 or 63.
В определенных вариантах осуществления одну, две или более мутаций (например, аминокислотные замены) вводят в Fc-область антитела, описанного в данном документе (например, СН2-домен (остатки 231-340 IgG| человека) и/или СН3-домен (остатки 341-447 IgG1 человека) и/или шарнирную область, при этом нумерация приведена согласно системе нумерации по Kabat (например, EU-индексу по Kabat)) с целью изменения одного или нескольких функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке крови, связывание комплемента, связывание Fc-рецептора и/или антигензависимая клеточная цитотоксичность.In certain embodiments, one, two, or more mutations (e.g., amino acid substitutions) are introduced into the Fc region of an antibody described herein (e.g., CH2 domain (residues 231-340 of human IgG|) and/or CH3 domain (residues 341-447 human IgG1) and/or hinge region, wherein the numbering is according to the Kabat numbering system (e.g. Kabat EU index)) to change one or more functional properties of the antibody, such as serum half-life, binding complement, Fc receptor binding and/or antigen-dependent cellular cytotoxicity.
В определенных вариантах осуществления одну, две или более мутаций (например, аминокислотные замены) вводят в шарнирную область Fc-области (СН1-домен) так, что число цистеиновых остатков в шарнирной области изменяется (например, повышается или снижается), как описано, например, в патенте США № 5677425. Число цистеиновых остатков в шарнирной области СН1-домена может быть изменено, например, для облегчения сборки легкой и тяжелой цепей или для изменения (например, повышения или снижения) стабильности антитела.In certain embodiments, one, two, or more mutations (e.g., amino acid substitutions) are introduced into the hinge region of the Fc region (CH1 domain) such that the number of cysteine residues in the hinge region changes (e.g., increases or decreases) as described, for example. , in US Pat. No. 5,677,425. The number of cysteine residues in the hinge region of the CH1 domain can be changed, for example, to facilitate the assembly of light and heavy chains or to change (eg, increase or decrease) the stability of the antibody.
В некоторых вариантах осуществления одну, две или более мутаций (например, аминокислотные замены) вводят в Fc-область антитела, описанного в данном документе (например, СН2-домен (остатки 231-340 IgG1 человека) и/или СН3-домен (остатки 341-447 IgG1 человека) и/или шарнирную область, при этом нумерация приведена согласно системе нумерации по Kabat (например, EU-индексу по Kabat)), с целью повышения или снижения аффинности антитела к Fc-рецептору (например, активированному Fcрецептору) на поверхности эффекторной клетки. Мутации в Fc-области антитела, которые обеспечивают снижение или повышение аффинности антитела к Fc-рецептору, и методики введения таких мутаций в Fc-рецептор или его фрагмент, известны специалисту в данной области техники. Примеры мутаций в Fcобласти антитела, которые могут быть введены с целью изменения аффинности антитела к Fc-рецептору, описаны, например, в Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186, патенте США №6737056 и международных публикациях №№ WO 02/060919; WO 98/23289; и WO 97/34631, которые включены в данный документ посредством ссылки.In some embodiments, one, two, or more mutations (e.g., amino acid substitutions) are introduced into the Fc region of an antibody described herein (e.g., CH2 domain (residues 231-340 of human IgG1) and/or CH3 domain (residues 341 -447 human IgG1) and/or hinge region, numbered according to the Kabat numbering system (e.g., Kabat EU index)) to increase or decrease the affinity of the antibody for the Fc receptor (e.g., activated Fc receptor) on the surface effector cell. Mutations in the Fc region of an antibody that provide a decrease or increase in the affinity of the antibody for the Fc receptor, and techniques for introducing such mutations into the Fc receptor or fragment thereof, are known to one skilled in the art. Examples of mutations in the Fc region of an antibody that can be introduced to change the affinity of the antibody for the Fc receptor are described, for example, in Smith P et al., (2012) PNAS 109: 6181-6186, US patent No. 6737056 and international publications nos. WO 02/060919; WO 98/23289; and WO 97/34631, which are incorporated herein by reference.
В конкретном варианте осуществления одну, две или более аминокислотных мутаций (т.е., замен, вставок или делеций) вводят в константный домен IgG или его FcRn-связывающий фрагмент (предпочтительно Fc или фрагмент шарнир-Рс-домен) с целью изменения (например, уменьшения или увеличения) времени полужизни антитела in vivo. См., например, международные публикации №№ WO 02/060919; WO 98/23289; и WO 97/34631; и патенты США №№ 5869046, 6121022, 6277375 и 6165745 касательно примеров мутаций, которые будут изменять (например, увеличивать или уменьшать) время полужизни антитела in vivo. В некоторых вариантах осуществления одну, две или более аминокислотных мутаций (т.е., замен, вставок или делеций) вводят в константный домен IgG или его FcRn-связывающий фрагмент (предпочтительно Fc или фрагмент шарнир-Ес-домен) с целью уменьшения времени полужизни антитела in vivo. В других вариантах осуществления одну, две или более аминокислотных мутаций (т.е., замен, вставок или делеций) вводят в константный домен IgG или его FcRn-связывающий фрагментIn a specific embodiment, one, two, or more amino acid mutations (i.e., substitutions, insertions, or deletions) are introduced into an IgG constant domain or an FcRn-binding fragment thereof (preferably an Fc or hinge-Pc domain fragment) to alter (e.g. , decrease or increase) the half-life of the antibody in vivo. See, for example, international publications No. WO 02/060919; WO 98/23289; and WO 97/34631; and US Patent Nos. 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 and 6,165,745 regarding examples of mutations that will alter (eg, increase or decrease) the half-life of an antibody in vivo. In some embodiments, one, two, or more amino acid mutations (i.e., substitutions, insertions, or deletions) are introduced into the IgG constant domain or FcRn-binding fragment thereof (preferably an Fc or hinge-EC domain fragment) to reduce the half-life antibodies in vivo. In other embodiments, one, two, or more amino acid mutations (i.e., substitutions, insertions, or deletions) are introduced into the IgG constant domain or FcRn-binding fragment thereof
- 40 046360 (предпочтительно Fc или фрагмент шарнир-Ес-домен) с целью уменьшения времени полужизни антитела in vivo. В конкретном варианте осуществления антитела могут иметь одну или несколько аминокислотных мутаций (например, замен) во втором константном (СН2)-домене (остатки 231-340 IgG1 человека) и/или третьем константном (СНЗ)-домене (остатки 341-447 IgG1 человека), при этом нумерация приведена согласно EU-индексу по Kabat (Kabat EA et al., (1991) выше). В конкретном варианте осуществления константная область IgG1 -антитела, описанного в данном документе, содержит замену метионина (М) на тирозин (Y) в положении 252, замену серина (S) на треонин (Т) в положении 254 и замену треонина (Т) на глутаминовую кислоту (Е) в положении 256, пронумерованных согласно EU-индексу по Kabat. См. патент США № 7658921, который включен в данный документ посредством ссылки. Было показано, что данный тип мутантного IgG, обозначаемый как мутант YTE, характеризовался четырехкратным увеличением времени полужизни по сравнению с вариантами дикого типа того же антитела (см. Dall'Acqua WF et al, (2006) J Biol Chem 281: 23514-24). В определенных вариантах осуществления антитело содержит константный домен IgG, содержащий одну, две, три или более замен аминокислотных остатков в положениях 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 и 428-436, пронумерованных согласно EU-индексу по Kabat.- 40 046360 (preferably Fc or hinge-Ec domain fragment) to reduce the half-life of the antibody in vivo. In a specific embodiment, the antibodies may have one or more amino acid mutations (e.g., substitutions) in the second constant (CH2) domain (residues 231-340 of human IgG1) and/or third constant (CH3) domain (residues 341-447 of human IgG1 ), while the numbering is given according to the EU index according to Kabat (Kabat EA et al., (1991) above). In a specific embodiment, the constant region of an IgG1 antibody described herein comprises a methionine (M) to tyrosine (Y) substitution at position 252, a serine (S) to threonine (T) substitution at position 254, and a threonine (T) substitution to glutamic acid (E) at position 256, numbered according to the EU index according to Kabat. See US Pat. No. 7,658,921, which is incorporated herein by reference. This type of mutant IgG, referred to as the YTE mutant, has been shown to have a fourfold increase in half-life compared to wild-type variants of the same antibody (see Dall'Acqua WF et al, (2006) J Biol Chem 281: 23514-24) . In certain embodiments, the antibody comprises an IgG constant domain containing one, two, three, or more amino acid residue substitutions at positions 251-257, 285-290, 308-314, 385-389, and 428-436, numbered according to the Kabat EU index .
В дополнительном варианте осуществления одну, две или более замен водят в Fc-область константного домена IgG с целью изменения эффекторной(эффекторных) функции(функций) антитела. Например, одну или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, пронумерованных согласно EU-индексу по Kabat, можно заместить остатком другой аминокислоты, вследствие чего антитело характеризуется измененной аффинностью к эффекторному лиганду, но при этом сохраняет антигенсвязывающую способность исходного антитела. Эффекторным лигандом, аффинность к которому изменяют, может быть, например, Fc-рецептор или С1-компонент системы комплемента. Этот подход описан более подробно в патентах США №№ 5624821 и 5648260. В некоторых вариантах осуществления делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других средств) домена константной области может ослаблять связывание циркулирующего антитела с Fcрецепторами, усиливая таким образом локализацию в опухоли. См., например, патенты США №№ 5585097 и 8591886 касательно описания мутаций, которые приводят к удалению или инактивации константного домена, и таким образом, усиливают локализацию в опухоли. В определенных вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен могут быть введены в Fc-область антитела, описанного в данном документе, для удаления потенциальных сайтов гликозилирования в Fc-области, которые могут ослаблять связывание Fc-рецептора (см., например, Shields RL et al, (2001) J Biol Chem 276: 6591-604). В различных вариантам осуществления могут быть выполнены одна или несколько из следующих мутаций в константной области антитела, описанного в данном документе: замена N297A; замена N297Q; замена L235A и замена L237A; замена L234A и замена L235A; замена Е233Р; замена L234V; замена L235A; делеция С236; замена Р238А; замена D265A; замена A327Q; или замена Р329А, пронумерованные согласно EU-индексу по Kabat. В определенных вариантах осуществления мутация, выбранная из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации, может быть выполнена в константной области антитела, описанного в данном документе.In a further embodiment, one, two or more substitutions are introduced into the Fc region of the IgG constant domain to alter the effector function(s) of the antibody. For example, one or more amino acids selected from amino acid residues 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 and 322, numbered according to the Kabat EU index, can be replaced by another amino acid residue, whereby the antibody has altered affinity for the effector ligand , but at the same time retains the antigen-binding ability of the original antibody. The effector ligand, the affinity for which is changed, can be, for example, an Fc receptor or a C1 component of the complement system. This approach is described in more detail in US Pat. Nos. 5,624,821 and 5,648,260. In some embodiments, deletion or inactivation (via point mutations or other means) of the constant region domain can reduce the binding of circulating antibody to F receptors, thereby enhancing tumor localization. See, for example, US Pat. Nos. 5,585,097 and 8,591,886 for descriptions of mutations that remove or inactivate the constant domain and thus enhance tumor localization. In certain embodiments, one or more amino acid substitutions may be introduced into the Fc region of an antibody described herein to remove potential glycosylation sites in the Fc region that may impair Fc receptor binding (see, e.g., Shields RL et al , (2001) J Biol Chem 276: 6591-604). In various embodiments, one or more of the following mutations may be made in the constant region of an antibody described herein: N297A substitution; replacement N297Q; replacement of L235A and replacement of L237A; replacement of L234A and replacement of L235A; replacement of E233P; replacement L234V; replacement L235A; deletion C236; replacing P238A; replacement D265A; A327Q replacement; or replacement P329A, numbered according to the EU index according to Kabat. In certain embodiments, a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof may be made in the constant region of an antibody described herein.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константный домен IgGj с аминокислотной заменой N297Q или N297A. В одном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константный домен IgG1 с мутацией, выбранной из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации.In a specific embodiment, the antibody described herein contains an IgGj constant domain with an amino acid substitution N297Q or N297A. In one embodiment, the antibody described herein contains an IgG1 constant domain with a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof.
В определенных вариантах осуществления одна или несколько аминокислот, выбранных из аминокислотных остатков 329, 331 и 322 в константной области антитела, описанного в данном документе, пронумерованные согласно EU-индексу по Kabat, могут быть заменены другим аминокислотным остатком таким образом, что антитело характеризуется измененным связыванием с C1q и/или сниженной комплементзависимой цитотоксичностью (CDC), или она отсутствует. Этот подход описан более подробно в патенте США № 6194551 (Idusogie et al.). В некоторых вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков в пределах аминокислотных положений 231-238 в N-концевой области СН2-домена антитела, описанного в данном документе, изменяют с целью изменения тем самым способности антитела связывать комплемент. Этот подход описан более подробно в международной публикации № WO 94/29351. В определенных вариантах осуществления Fc-область антитела, описанного в данном документе, модифицируют с целью повышения способности антитела опосредовать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или с целью повышения аффинности антитела к Fcyрецептору за счет мутирования одной или нескольких аминокислот (например, введения аминокислотных замен) в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439, пронумерованных согласно EU-индексу по Kabat. Этот подход описан более подробно в международной публикации № WO 00/42072.In certain embodiments, one or more amino acids selected from amino acid residues 329, 331, and 322 in the constant region of an antibody described herein, numbered according to the Kabat EU index, may be replaced by another amino acid residue such that the antibody exhibits altered binding with C1q and/or reduced complement-dependent cytotoxicity (CDC), or absent. This approach is described in more detail in US patent No. 6194551 (Idusogie et al.). In some embodiments, one or more amino acid residues within amino acid positions 231-238 in the N-terminal region of the CH2 domain of an antibody described herein is altered to thereby alter the ability of the antibody to fix complement. This approach is described in more detail in international publication No. WO 94/29351. In certain embodiments, the Fc region of an antibody described herein is modified to enhance the ability of the antibody to mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and/or to increase the affinity of the antibody for the Fcy receptor by mutating one or more amino acids (e.g., introducing amino acid substitutions ) in the following positions: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290 , 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 3 35 , 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 or 439, numbered according to the Kabat EU index. This approach is described in more detail in international publication No. WO 00/42072.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константный домен IgGi с мутацией (например, заменой) в положении 267, 328 или их комбинации, пронумерованным согласно EU-индексу по Kabat. В определенных вариантах осуществления антитело, опиIn certain embodiments, an antibody described herein comprises an IgGi constant domain with a mutation (eg, substitution) at position 267, 328, or a combination thereof, numbered according to the Kabat EU index. In certain embodiments, the antibody, opi
- 41 046360 санное в данном документе, содержит константный домен IgG1 с мутацией (например, заменой), выбранной из группы, состоящей из S267E, L328F и их комбинации. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константный домен IgG1 с мутацией S267E/L328F (например, заменой). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержащее константный домен IgG1 с мутацией S267E/L328F (например, заменой), характеризуется повышенной аффинностью связывания в отношении FcyRIIA, FcyRIIB или FcyRIIA и FcyRIIB.- 41 046360 herein contains an IgG 1 constant domain with a mutation (eg, substitution) selected from the group consisting of S267E, L328F, and combinations thereof. In certain embodiments, an antibody described herein contains an IgG1 constant domain with an S267E/L328F mutation (eg, substitution). In certain embodiments, an antibody described herein containing an IgG1 constant domain with an S267E/L328F mutation (eg, substitution) has increased binding affinity for FcyRIIA, FcyRIIB, or FcyRIIA and FcyRIIB.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константную область IgG4-антитела и серин, соответствующий аминокислотному остатку 228 тяжелой цепи, пронумерованный согласно EU-индексу по Kabat, замещен на пролин.In certain embodiments, an antibody described herein comprises an IgG 4 antibody constant region and the serine corresponding to heavy chain amino acid residue 228, numbered according to the Kabat EU index, is replaced by a proline.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит константную область IgG2-ангитела и цистеин, соответствующий аминокислотному остатку 127 тяжелой цепи, пронумерованный по Kabat, замещен на серин.In certain embodiments, the antibody described herein contains the constant region of an IgG 2 antibody and the cysteine corresponding to Kabat heavy chain amino acid residue 127 is replaced by serine.
Сообщалось, что антитела со сниженным содержанием фукозы характеризуются повышенной аффинностью к Fc-рецепторам, таким как, например, FcyRIIIA. Соответственно, в определенных вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, имеют сниженное содержание фукозы или не содержат фукозу. Такие антитела могут быть получены с помощью методик, известных специалисту в данной области техники. Например, антитела могут экспрессироваться в клетках с недостаточной способностью к фукозилированию или ее отсутствием. В конкретном примере клеточные линии с нокаутом обоих аллелей гена а1,6-фукозилтрансферазы могут быть использованы для получения антител со сниженным содержанием фукозы. Система Potelligent® (Lonza) представляет собой пример такой системы, которая может быть использована для получения антител со сниженным содержанием фукозы. Альтернативно, антитела со сниженным содержанием фукозы могут быть получены, например, путем: (i) культивирования клеток в условиях, которые обеспечивают предотвращение или снижение степени фукозилирования; (ii) посттрансляционного удаления фукозы (например, с помощью фермента фукозидазы); (iii) посттрансляционного добавления требуемого углевода, например, после рекомбинантной экспрессии негликозилированного гликопротеина; или (iv) очистки гликопротеина с тем, чтобы выбрать антитела с ним, которые не являются фукозилированными. См, например, Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100: 365-92 и Imai-Nishiya H et al., (2007) BMC Biotechnol. 7: 84 в отношении способов получения антител без фукозы или со сниженным содержанием фукозы.Antibodies with reduced fucose content have been reported to have increased affinity for Fc receptors such as, for example, FcyRIIIA. Accordingly, in certain embodiments, the antibodies described herein have reduced fucose content or do not contain fucose. Such antibodies can be prepared using techniques known to one skilled in the art. For example, antibodies may be expressed in cells with insufficient or absent fucosylation capacity. In a specific example, cell lines with knockout of both alleles of the α1,6-fucosyltransferase gene can be used to produce antibodies with reduced fucose content. The Potelligent® system (Lonza) is an example of such a system that can be used to produce antibodies with reduced fucose content. Alternatively, antibodies with reduced fucose content can be obtained, for example, by: (i) culturing cells under conditions that prevent or reduce the degree of fucosylation; (ii) post-translational removal of fucose (eg by the enzyme fucosidase); (iii) post-translational addition of the desired carbohydrate, for example, after recombinant expression of a non-glycosylated glycoprotein; or (iv) purifying the glycoprotein in order to select antibodies with it that are not fucosylated. See, for example, Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100: 365-92 and Imai-Nishiya H et al., (2007) BMC Biotechnol. 7: 84 regarding methods for producing antibodies without fucose or with reduced fucose content.
Сконструированные гликоформы могут быть пригодными для разнообразных целей, в том числе без ограничения для повышения или снижения эффекторной функции.The engineered glycoforms may be useful for a variety of purposes, including, but not limited to, increasing or decreasing effector function.
Способы получения сконструированных гликоформ антитела, описанного в данном документе, включают без ограничения раскрытые, например, в Umana P et al., (1999) Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies J et al, (2001) Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields RL et al, (2002) J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa T et al., (2003) J Biol Chem 278: 3466-3473; Niwa R et al., (2004) Clin Cancer Res 1: 6248-6255; Presta LG et al., (2002) Biochem Soc Trans 30: 487-490; Kanda Y et al., (2007) Glycobiology 17: 104-118; патентах №№6602684; 6946292; и 7214775; патентных публикациях США №№ US 2007/0248600; 2007/0178551; 2008/0060092; и 2006/0253928; международных заявках №№ WO 00/61739; WO 01/292246; WO 02/311140; и WO 02/30954; технологию Potillegent™ (Biowa, Inc. Принстон, Нью-Джерси); и инженерную технологию гликозилирования GlycoMAb® (Glycart biotechnology AG, Цюрих, Швейцария). См. также, например, Ferrara С et al., (2006) Biotechnol Bioeng 93: 851-861; международные публикации №№ WO 07/039818; WO 12/130831; WO 99/054342; WO 03/011878; и WO 04/065540.Methods for preparing engineered glycoforms of the antibody described herein include, but are not limited to, those disclosed in, for example, Umana P et al., (1999) Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies J et al, (2001) Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields RL et al, (2002) J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa T et al., (2003) J Biol Chem 278: 3466-3473; Niwa R et al., (2004) Clin Cancer Res 1: 6248-6255; Presta LG et al., (2002) Biochem Soc Trans 30: 487-490; Kanda Y et al., (2007) Glycobiology 17: 104-118; patents No. 6602684; 6946292; and 7214775; US Patent Publications No. US 2007/0248600; 2007/0178551; 2008/0060092; and 2006/0253928; international applications No. WO 00/61739; WO 01/292246; WO 02/311140; and WO 02/30954; Potillegent™ technology (Biowa, Inc. Princeton, NJ); and the engineered glycosylation technology GlycoMAb® (Glycart biotechnology AG, Zurich, Switzerland). See also, for example, Ferrara C et al., (2006) Biotechnol Bioeng 93: 851-861; international publications No. WO 07/039818; WO 12/130831; WO 99/054342; WO 03/011878; and WO 04/065540.
В определенных вариантах осуществления технология, используемая для конструирования Fcдомена антитела, описанного в данном документе, представляет собой технологию Xmab® от компании Xencor (Монровия, Калифорния). См., например, патенты США №№ 8367805; 8039592; 8124731; 8188231; патентную публикацию США № 2006/0235208; международные публикации №№ WO 05/077981; WO 11/097527; и Richards JO et al., (2008) Mol Cancer Ther 7: 2517-2527.In certain embodiments, the technology used to construct the Fc domain of the antibody described herein is Xmab® technology from Xencor (Monrovia, Calif.). See, for example, US Pat. Nos. 8,367,805; 8039592; 8124731; 8188231; US Patent Publication No. 2006/0235208; international publications No. WO 05/077981; WO 11/097527; and Richards JO et al., (2008) Mol Cancer Ther 7: 2517-2527.
В определенных вариантах осуществления аминокислотные остатки в константной области антитела, описанного в данном документе, в положениях L234, L235 и D265 в тяжелой цепи IgG1 человека, пронумерованных согласно нумерации по EU-индексу, не являются L, L и D соответственно. Этот подход описан подробно в международной публикации № WO 14/108483. В конкретном варианте осуществления аминокислоты, соответствующие положениям L234, L235 и D265 в тяжелой цепи IgG1 человека, представляют собой F, Е и А; или А, А и А соответственно. В определенных вариантах осуществления любая из мутаций или модификаций в константной области, описанных в данном документе, может быть введена в константные области одной или обеих тяжелых цепей антитела, описанного в данном документе, содержащего константные области двух тяжелых цепей.In certain embodiments, the amino acid residues in the constant region of the antibody described herein at positions L234, L235 and D265 in the human IgG1 heavy chain, numbered according to the EU index numbering, are not L, L and D, respectively. This approach is described in detail in international publication No. WO 14/108483. In a specific embodiment, the amino acids corresponding to positions L234, L235 and D265 in the human IgG1 heavy chain are F, E and A; or A, A and A respectively. In certain embodiments, any of the mutations or modifications in the constant region described herein can be introduced into the constant regions of one or both heavy chains of an antibody described herein containing the constant regions of two heavy chains.
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, изложенные в SEQ ID NO: 1-3 (например, приведенные в табл. 1); (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VH, CDR2 VH иIn another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequences CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL set forth in SEQ ID NOs: 1-3 (eg, those shown in Table 1); (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequences CDR1 VH, CDR2 VH and
- 42 046360- 42 046360
CDR3 VH, изложенные в SEQ ID NO: 4-6 (например, приведенные в табл. 2); (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG1 человека (необязательно IgG1 (аллотип Glm3)).CDR3 VH set forth in SEQ ID NO: 4-6 (eg, those shown in Table 2); (iii) the light chain further comprises a light chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a heavy chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human IgG 1 heavy chain constant domain (optionally IgG 1 (Glm3 allotype)).
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15; (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16; (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG1 человека (необязательно IgG1 (аллотип Glm3)).In another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; (iii) the light chain further comprises a constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a constant domain containing the amino acid sequence of a human IgG1 heavy chain constant domain (optionally IgG1 (Glm3 allotype)).
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, изложенные в SEQ ID NO: 1-3 (например, приведенные в табл. 1); (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, изложенные в SEQ ID NO: 4-6 (например, приведенные в табл. 2); (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG4 человека.In another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequences CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL set forth in SEQ ID NOs: 1-3 (eg, those shown in Table 1); (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequences CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH set forth in SEQ ID NO: 4-6 (for example, shown in table. 2); (iii) the light chain further comprises a light chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a heavy chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human IgG 4 heavy chain constant domain.
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15; (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG4 человека. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, изложенные в SEQ ID NO: 1-3 (например, приведенные в табл. 1); (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, изложенные в SEQ ID NO: 4-6 (например, приведенные в табл. 2); (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG2 человека.In another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (iii) the light chain further comprises a constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a constant domain containing the amino acid sequence of a human IgG4 heavy chain constant domain. In another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequences CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL set forth in SEQ ID NO: 1-3 (eg, those shown in Table 1); (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequences CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH set forth in SEQ ID NO: 4-6 (for example, shown in table. 2); (iii) the light chain further comprises a light chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a heavy chain constant domain comprising the amino acid sequence of a human IgG 2 heavy chain constant domain.
В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь и тяжелую цепь, где (i) легкая цепь содержит VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15; (ii) тяжелая цепь содержит VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16; (iii) легкая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой каппа-цепи человека; и (iv) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG2 человека. В определенных вариантах осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50 и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В определенных вариантах осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50 и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 62. В определенных вариантах осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 51. В определенных вариантах осуществления легкая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20 и тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 62. В другом конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 с аминокислотной заменой N на А или Q в аминокислотном положении 297; и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В другом конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (наIn another specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain and a heavy chain, wherein (i) the light chain comprises a VL domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; (ii) the heavy chain contains a VH domain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; (iii) the light chain further comprises a constant domain comprising the amino acid sequence of a human kappa light chain constant domain; and (iv) the heavy chain further comprises a constant domain containing the amino acid sequence of a human IgG 2 heavy chain constant domain. In certain embodiments, the light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 and the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51. In certain embodiments, the light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 and the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. In certain embodiments, the light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51. In certain embodiments, the light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 and the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62. In another specific embodiment, provided herein is an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprising (a) a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 with an amino acid substitution of N for A or Q at amino acid position 297; and (b) a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In another specific embodiment, provided herein is an antibody that specifically binds to OX40 (at
- 43 046360 пример, ОХ40 человека), содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60 с аминокислотной заменой N на А или Q в аминокислотном положении 297; и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20.- 43 046360 example, human OX40), contains (a) a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 with an amino acid substitution of N for A or Q at amino acid position 297; and (b) a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
В другом конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21 с аминокислотной заменой, выбранной из группы, состоящей из S на Е в аминокислотном положении 267, L на F в аминокислотном положении 328, и как S на Е в аминокислотном положении 267, так и L на F в аминокислотном положении 328; и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В другом конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60 с аминокислотной заменой, выбранной из группы, состоящей из S на Е в аминокислотном положении 267, L на F в аминокислотном положении 328, и как S на Е в аминокислотном положении 267, так и L на F в аминокислотном положении 328; и (b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуется активностью в виде антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), инициирует опосредованное клетками-естественными киллерами истощение клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), используют для лечения опухоли, инфильтрованной клетками-естественными киллерами. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуется активностью в виде антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), инициирует опосредованное макрофагами истощение клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), используют для лечения опухоли, инфильтрованной макрофагами. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), избирательно истощает внутриопухолевые регуляторные Т-клетки.In another specific embodiment, provided herein is an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40), contains (a) a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 with an amino acid substitution selected from the group consisting of S on E at amino acid position 267, L on F at amino acid position 328, and both S on E at amino acid position 267 and L on F at amino acid position 328; and (b) a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In another specific embodiment provided herein, an antibody that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises (a) a heavy chain comprising the amino acid sequence under SEQ ID NO: 60 with an amino acid substitution selected from the group consisting of S to E at amino acid position 267, L to F at amino acid position 328, and both S to E at amino acid position 267 and L to F at amino acid position 328; and (b) a light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity. . In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) initiates natural killer cell-mediated cell depletion. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) is used to treat a tumor infiltrated by natural killer cells. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) has antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) activity. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) initiates macrophage-mediated cell depletion. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) is used to treat a tumor infiltrated by macrophages. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) selectively depletes intratumoral regulatory T cells.
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит каркасные области (например, каркасные области VL-домена и/или VH-домена), которые представляют собой каркасные области человека или каркасные области человеческого происхождения. Неограничивающие примеры каркасных областей человека описаны в уровне техники, например, см. Kabat EA et al., (1991) выше. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, содержит каркасные области (например, каркасные области VL-домена и/или VH-домена), которые представляют собой каркасные области примата (например, примата, отличного от человека) или каркасные области, полученные от примата (например, примата, отличного от человека).In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains framework regions (e.g., VL domain and/or VH domain framework regions) that are human or human OX40 framework regions. areas of human origin. Non-limiting examples of human framework regions are described in the prior art, for example, see Kabat EA et al., (1991) supra. In certain embodiments, an antibody described herein comprises framework regions (e.g., VL domain and/or VH domain framework regions) that are primate (e.g., non-human primate) framework regions or framework regions derived from from a primate (eg, a non-human primate).
Например, CDR из антигенспецифичных антител, отличных от человеческих, как правило, происходящие от грызунов (например, мыши или крысы), прививают на гомологичные акцепторные каркасные области человека или примата, отличного от человека. В одном варианте осуществления акцепторные каркасные области примата, отличного от человека, происходят от человекообразных обезьян Старого Света. В конкретном варианте осуществления акцепторная каркасная область человекообразной обезьяны Старого Света происходит от Pan troglodytes, Pan paniscus или Gorilla gorilla. В конкретном варианте осуществления акцепторные каркасные области примата, отличного от человека, происходят от шимпанзе Pan troglodytes. В конкретном варианте осуществления акцепторные каркасные области примата, отличного от человека, происходят из акцепторных каркасных областей обезьян Старого Света. В конкретном варианте осуществления акцепторные каркасные области обезьяны Старого Света происходят от рода Масаса. В определенном варианте осуществления акцепторные каркасные области примата, отличного от человека, происходят от макака-крабоеда Масаса cynomolgus. Последовательности каркасных областей примата, отличного от человека, описаны в опубликованной патентной заявке США № US 2005/0208625. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну, две или более каркасных областей (FR) VL, содержащих аминокислотные последовательности, описанные в данном документе для антитела, изложенные в таблице 3 выше. В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну, две или более каркасных областей (FR) VH, содержащих аминокислотные последовательности, описанные в данном документе для антитела, изложенные в таблице 4 выше. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну, две или более каркасных областей VL, содержащихFor example, CDRs from non-human antigen-specific antibodies, typically derived from rodents (eg, mouse or rat), are grafted onto homologous human or non-human primate acceptor framework regions. In one embodiment, the non-human primate acceptor framework regions are derived from Old World apes. In a specific embodiment, the Old World ape acceptor framework region is derived from Pan troglodytes, Pan paniscus, or Gorilla gorilla. In a specific embodiment, the non-human primate acceptor framework regions are derived from the chimpanzee Pan troglodytes. In a specific embodiment, the non-human primate acceptor framework regions are derived from the acceptor framework regions of Old World monkeys. In a specific embodiment, the Old World monkey acceptor framework regions are derived from the Masasa genus. In a certain embodiment, the non-human primate acceptor framework regions are derived from the cynomolgus cynomolgus macaque. Non-human primate framework region sequences are described in US Patent Application Published No. US2005/0208625. In certain embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one, two, or more VL framework regions (FRs) containing the amino acid sequences described herein for the antibody set forth in Table 3 above. In some embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one, two, or more VH framework regions (FRs) containing the amino acid sequences described herein for the antibody set forth in Table 4 above. In specific embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one, two, or more VL framework regions containing
- 44 046360 аминокислотные последовательности, описанные в данном документе для антитела, изложенные в таблице 3 выше, и одну, две или более каркасных областей VH, содержащих аминокислотные последовательности, описанные в данном документе для антитела, изложенные в табл. 4 выше.- 44 046360 amino acid sequences described herein for the antibody set forth in Table 3 above, and one, two or more VH framework regions containing the amino acid sequences described herein for the antibody set forth in Table. 4 above.
В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну, две, три или четыре каркасные области VL-домена, содержащие аминокислотную последовательность pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 7-10) с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотными мутациями (например, аминокислотными заменами, такими как консервативные аминокислотные замены) и/или каркасные области VHдомена, содержащие аминокислотную последовательность pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 11-14). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну, две, три или четыре каркасные области VH-домена, содержащие аминокислотную последовательность pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 11-14) с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислотными мутациями (например, аминокислотными заменами, такими как консервативные аминокислотные замены) и/или каркасные области VL-домена, содержащие аминокислотную последовательность pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 7-10).In some embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one, two, three, or four VL domain framework regions containing the amino acid sequence pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 7-10) with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more amino acid mutations (e.g., amino acid substitutions, such as conservative amino acid substitutions) and/or VH domain framework regions containing the amino acid sequence pab1949 or pab2044 (eg SEQ ID NO: 11-14). In certain embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one, two, three, or four VH domain framework regions containing the amino acid sequence pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 11-14) with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more amino acid mutations (e.g., amino acid substitutions, such as conservative amino acid substitutions) and/or VL domain framework regions containing the amino acid sequence pab1949 or pab2044 (for example, SEQ ID NO: 7-10).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит каркасные области (FR) VL, характеризующиеся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей с каркасными областями VL, описанными в данном документе в табл. 3 выше. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит каркасные области (FR) VH, характеризующиеся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей с каркасными областями VH, описанными в данном документе в табл. 4 выше. В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит каркасные области (FR) VH, характеризующиеся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей с каркасными областями VH, описанными в данном документе в табл. 4 выше, и каркасные области (FR) VL, характеризующиеся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательностей с каркасными областями VL, описанными в данном документе в табл. 3 выше.In certain embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains VL framework regions (FRs) characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the VL framework regions described herein in Table. 3 above. In certain embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains VH framework regions (FRs) characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the VH framework regions described herein in table. 4 above. In some embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains VH framework regions (FRs) characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the VH framework regions described herein in table. 4 above, and framework regions (FR) VL characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least At least 98% sequence identity with the VL framework regions described herein in table. 3 above.
Определение процентной идентичности между двумя последовательностями (например, аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот) может быть выполнено с помощью математического алгоритма. Конкретным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, модифицированный, как в Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. Поиски нуклеотидов в BLAST можно проводить с набором параметров программы NBLAST для нуклеотидов, установленными, например, для балла =100, длины слова =12, для нахождения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновой кислоты, описанным в данном документе. Поиски белков в BLAST можно проводить с набором параметров программы XBLAST, установленными, например, для балла -50, длины слова = 3, для нахождения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекуле белка, описанной в данном документе. Для получения выравниваний с гэпами с целью сравнения можно использовать BLAST с гэпами, описанный в Altschul SF et al, (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402. Альтернативно, PSI-BLAST можно использовать для проведения итеративного поиска, который выявляет дальние связи между молекулами (Id). При использовании программ BLAST, BLAST с гэпами и PSI Blast могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST) (см., например, Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) во всемирной сети, ncbi.nlm.nih.gov). Другим конкретным неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения для выравнивания последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать таблицу весов замен остатков РАМ120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за внесение гэпа 4.Determining the percentage identity between two sequences (eg, amino acid sequences or nucleic acid sequences) can be performed using a mathematical algorithm. A specific, non-limiting example of a mathematical algorithm used to compare two sequences is the algorithm of Karlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268, modified as in Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877. Such an algorithm is included in the NBLAST and XBLAST programs Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403. BLAST nucleotide searches can be performed with a set of NBLAST nucleotide program parameters set to, for example, score = 100, word length = 12 to find nucleotide sequences homologous to the nucleic acid molecules described herein. BLAST protein searches can be conducted with a set of XBLAST program parameters set to, for example, score -50, word length = 3, to find amino acid sequences homologous to a protein molecule described herein. To obtain gap alignments for comparison purposes, gap BLAST, described in Altschul SF et al, (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402, can be used. Alternatively, PSI-BLAST can be used to perform iterative searches that identify long-range connections between molecules (Id). When using the BLAST, BLAST with gaps, and PSI Blast programs, the default parameters of the corresponding programs (for example, XBLAST and NBLAST) may be used (see, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the World Wide Web, ncbi.nlm.nih.gov ). Another specific, non-limiting example of a mathematical algorithm used for sequence comparison is the algorithm of Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11 17. Such an algorithm is included in the ALIGN program (version 2.0), which is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, you can use the table of residue substitution weights RAM120, the penalty for continuing a gap is 12, and the penalty for introducing a gap is 4.
Процентная идентичность между двумя последовательностями может быть определена с помощью методик, аналогичных описанным выше, с разрешением или без разрешения гэпов. При расчете процентной идентичности обычно подсчитывают лишь точные совпадения.Percent identity between two sequences can be determined using techniques similar to those described above, with or without gap resolution. When calculating percent identity, only exact matches are usually counted.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое им- 45 046360 муноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), где антитело содержит CDR VL, которые идентичны CDR VL pab1949 или pab2044. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело содержит CDR VH, которые идентичны CDR VH pab1949 или pab2044. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело содержит CDR VL и CDR VH, которые идентичны CDR VL и CDR VH pab1949 или pab2044.In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain of at least 70%, at least 75%, at least 80% at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the pab1949 or pab2044 VL domain (e.g., SEQ ID NO: 15), where the antibody contains the VL CDR , which are identical to CDR VL pab1949 or pab2044. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the pab1949 or pab2044 VH domain (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody contains VH CDRs that are identical to the CDRs VH pab1949 or pab2044. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain of at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 16), where the antibody contains a CDR VL and a CDR VH that are identical to the CDR VL and CDR VH of pab1949 or pab2044.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15, wherein the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) (eg 100 ng/ml) induces the production of IL-2, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured by eg , using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 μg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg /ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), where the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) induces IL-2 production, e.g., by PBMCs, where IL-2 production is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, 0.16 μg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg /ml or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as determined, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg , 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VLIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), where the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) (eg, 100 ng/ml) induces IL-2 production, for example, by PBMCs when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured by, for example , using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg /ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml up to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains VL
- 46 046360 домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 46 046360 domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least 98% sequence identity with amino acid sequence of the VL domain pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), where the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose curve answer if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.8 μg/ml to 20 μg/ml, from 4 μg/ml to 20 μg/ml, 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as determined by e.g. , in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0 .00128 and 0.000256 μg/ml) antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16, wherein the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) (eg 100 ng/ml) induces the production of IL-2, eg by PBMCs, when stimulated for eg 5 days, eg at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured by eg , using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 μg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg /ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), where the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) induces IL-2 production, e.g., by PBMCs, where IL-2 production is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, 0.16 μg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg /ml or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as determined, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg , 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VHдомен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), where the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A ( SEA) (eg, 100 ng/ml) induces IL-2 production, for example, by PBMCs when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured by, for example , using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg /ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml up to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain of at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), where the antibody is in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.032
- 47 046360 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).- 47 046360 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as determined, for example, in an assay comprising the following steps: (a ) culturing PBMCs (e.g., 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g., 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16, при этом антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например клетками РВМС, при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антител, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16, wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g., 100 ng/ml) induces IL-2 production, e.g., by PBMCs, when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, 0 .8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 16), where the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where the production of IL-2 is increasing significantly as a function of antibody concentrations, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.8 μg/ml to 20 μg/ml, from 4 μg/ml to 20 μg/ml, 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as determined by e.g. , in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0 .00128 and 0.000256 μg/ml) antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мереIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 16), wherein the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (eg, 100 ng/ml) induces IL-2 production, for example, by PBMCs when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml , from 0.8 µg/ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least
- 48 046360- 48 046360
95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, как определяют, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).95% or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), where the antibody in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) induces IL-2 production, for example, by PBMC cells, where IL-2 production is characterized by a sigmoidal pattern dose-response curve if the concentration of anti-OX40 antibody is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.8 μg/ml to 20 μg/ml , from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml to 4 µg/ml, as determined, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (eg, 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg, 20.4, 0.8, 0.16, 0.032, 0. 0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit V-Plex (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, хаIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the pab1949 or pab2044 VL domain (e.g., SEQ ID NO: 15), wherein the antibody bound on the plate in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, eg TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, eg PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit V-Plex (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, 3. 1 μg/ml to 50 μg/ml or 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (e.g. , 0.8 µg/ml) and varying concentrations (for example, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6 ,3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO2; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the pab1949 or pab2044 VL domain (e.g., SEQ ID NO: 15), wherein the antibody bound on the plate in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, eg TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, eg PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL -10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1 , 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a Human TH1 kit /TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain, ha
- 49 046360 растеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit V-Plex (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).- 49 046360 rasterizable with at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence pab1949 or pab2044 VH domain (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the plated antibody in combination with the plated anti-CD3 antibody (e.g., 0.8 μg/ml) induces the production of one or more cytokines, e.g. , TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, for example PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example at 37°C and 5% CO 2 , which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit V-Plex (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, e.g. TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL2, IL-10 or IL-13, is a largely increasing function of antibody concentrations, e.g. 0.7 µg/ml to 50 µg/ml, 1.6 µg/ml to 50 µg/ml, 3.1 µg/ml to 50 µg/ml or 6.3 µg/ml to 50 µg/ml, as assessed , for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6 , 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) plate-bound antibody for e.g. 4 days , for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody bound on the plate in combination with plate-bound anti-CD3 antibody (eg 0.8 μg/ml), induces the production of one or more cytokines, eg TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, eg PBMC or T cells, when stimulated for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 , as measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL -10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the antibody to OX40 is, for example, from 0.7 μg/ml to 50 μg/ml, from 1.6 μg/ml to 50 μg/ml, from 3.1 μg/ml to 50 μg/ml or 6.3 μg/ml to 50 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1 , 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit VPlex (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела кIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain of at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the plate-bound antibody in combination with the plate-bound anti-CD3 antibody (e.g., 0.8 μg/ml) induces the production of one or several cytokines, e.g. TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37° C and 5% CO 2 , which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit VPlex (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, e.g. TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is an increasing function of antibody concentrations, e.g. , from 0.7 µg/ml to 50 µg/ml, from 1.6 µg/ml to 50 µg/ml, from 3.1 µg/ml to 50 µg/ml or from 6.3 µg/ml to 50 µg /ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of an antibody to
- 50 046360- 50 046360
CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом связанное на планшете антитело в комбинации со связанным на планшете антителом к CD3 (например, 0,8 мкг/мл), индуцирует продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, например РВМС или Т-клетками, при стимулировании в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2, что измеряют с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,7 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 1,6 мкг/мл до 50 мкг/мл, от 3,1 мкг/мл до 50 мкг/мл или от 6,3 мкг/мл до 50 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС в присутствии связанного на планшете антитела к CD3 (например, 0,8 мкг/мл) и варьирующих концентраций (например, 0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25 и 50 мкг/мл или 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) связанного на планшете антитела в течение, например, 4 дней, например, при 37°С и 5% СО2; и (b) сбор супернатанта и измерение продуцирования одного или нескольких цитокинов, например, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 или IL-13, с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) или набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).CD3 (eg, 0.8 µg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3, 1, 6.3, 12.5, 25 or 50 μg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the plate-bound antibody in combination with the plate-bound anti-CD3 antibody (e.g., 0.8 μg/ml) induces the production of one or several cytokines, e.g. TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, e.g. PBMC or T cells, when stimulated for e.g. 4 days, e.g. at 37° C and 5% CO 2 , which is measured using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery), where the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is eg 0.7 µg/ml to 50 µg/ml, 1.6 µg/ml to 50 µg/ml, 3.1 µg/ml to 50 µg/ml or 6.3 µg/ml to 50 μg/ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs in the presence of plate-bound anti-CD3 antibody (eg, 0.8 μg/ml) and varying concentrations (eg, 0, 0, 3, 1, 3, 6, 12, 25 and 50 µg/ml or 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) plate-bound antibody for, for example, 4 days, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (b) collecting the supernatant and measuring the production of one or more cytokines, for example, TNFa, TNFe, IFNy, GM-CSF, IL-2, IL-10 or IL-13, using, for example, electrochemiluminescence, for example, using a kit Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery) or Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Тклеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VLдомен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, приIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), and the antibody provides increased proliferation of CD4+ T- cells where the proliferation of CD4+ T cells is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed by e.g. in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain of at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation , if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml, rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, the plate-bound antibody described herein, e.g.
- 51 046360- 51 046360
37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 15), and the antibody provides increased proliferation of CD4+ T- cells where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37° C. ; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Тклеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VHдомен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например,In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), and the antibody provides increased proliferation of CD4+ T- cells where the proliferation of CD4+ T cells is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed by e.g. in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain of at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation , if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml, rather than at a concentration of 2 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a VH domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), and the antibody provides increased proliferation of CD4+ T- cells where the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, which is assessed for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells with, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37° C. ; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g. 10 cells per well), e.g.
- 52 046360 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 52 046360 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (for example, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein , for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Тклеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VH-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), где антитело обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит: (i) VL-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VL-домена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 15); и (ii) VH-домен, характеризующийся по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью VHдомена pab1949 или pab2044 (например, SEQ ID NO: 16), при этом антитело обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл или от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процентаIn certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g. 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example , 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity to the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), where the antibody provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 2 μg/ml ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, with 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains: (i) a VL domain characterized by at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VL domain of pab1949 or pab2044 (eg, SEQ ID NO: 15); and (ii) a VH domain having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 98% sequence identity with the amino acid sequence of the VH domain of pab1949 or pab2044 (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody provides an increase in the proliferation of CD4+ T cells, wherein the proliferation of CD4+ T cells is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the OX40 antibody is, for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml or from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, CD4+ T-enriched cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining cells, e.g., on day 4, e.g., with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, e.g., by measuring percentage
- 53 046360 меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 53,046,360 CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry.
В другом аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом ОХ40 (например, эпитопом ОХ40 человека), как антитело, описанное в данном документе (например, pab1949 или pab2044). В определенных вариантах осуществления эпитоп антитела может быть определен, например, с помощью ЯМР-спектроскопии, рентгенографокристаллографических исследований, ELISA-анализов, водород-дейтериевого обмена в сочетании с массспектрометрией (например, жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением), сканирующих анализов олигопептидов на основе массивов и/или картирования с помощью мутагенеза (например, картирования с помощью сайт-направленного мутагенеза). В случае рентгеновской кристаллографии кристаллизация может быть выполнена с помощью любого из известных способов в данной области техники (например, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Кристаллы антитело-антиген могут быть изучены с помощью хорошо известных методик рентгенодифракции и могут быть уточнены с помощью компьютерной программы, такой как X-PLOR (Yale University, 1992, продаваемой Molecular Simulations, Inc.; см., например, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.; патентная заявка США № 2004/0014194), и BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316-1323). Исследования с картированием с применением мутагенеза можно проводить с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники. См., например, Champe M et al., (1995) выше и Cunningham ВС & Wells JA (1989) выше касательно описания методик мутагенеза, в том числе методик аланин-сканирующего мутагенеза. В определенном варианте осуществления эпитоп для антитела определяют с помощью исследований с аланин-сканирующим мутагенезом. Кроме того, антитела, которые распознают одни и те же или перекрывающиеся эпитопы ОХ40 (например, ОХ40 человека) или связываются с ними, могут быть идентифицированы с помощью стандартных методик, таких как иммунологический анализ, например, путем обнаружения способности одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном, т.е., анализ конкурентного связывания. Анализы конкурентного связывания также могут быть использованы для определения того, характеризуются ли два антитела одинаковой специфичностью связывания в отношении эпитопа. Конкурентное связывание может быть определено в анализе, в котором исследуемый иммуноглобулин ингибирует специфичное связывание эталонного антитела с общим антигеном, таким как ОХ40. Известно множество типов анализов конкурентного связывания, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), конкурентный анализ сэндвич-типа (см. Stahli С et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); твердофазный прямой EIA с использованием биотин-авидиновой системы (см. Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); твердофазный прямой анализ с использованием меток, твердофазный прямой анализ сэндвич-типа с использованием меток (см. Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный прямой RIA с использованием меток с применением метки I-125 (см. Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); твердофазный прямой EIA с использованием биотин-авидиновой системы (Cheung RC et al, (1990) Virology 176: 546-52); и прямой RIA с использованием меток (Moldenhauer G et al, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Как правило, такой анализ включает применение очищенного антигена (например, ОХ40, такого как ОХ40 человека), связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими каждое из следующего: немеченный исследуемый иммуноглобулин и меченный эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование может быть измерено с помощью определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками в присутствии исследуемого иммуноглобулина. Обычно исследуемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно в случае, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфичное связывание эталонного антитела с общим антигеном на меньшей мере 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или больше. Анализ конкурентного связывания может быть сконфиругирован в большом количестве различных форматов с использованием меченого антигена или меченого антитела. В распространенном варианте данного анализа антиген иммобилизуют в 96-луночном планшете. Способность немеченных антител блокировать связывание меченых антител с антигеном затем измеряют с помощью радиоактивных или ферментативных меток. Дополнительные подробности см., например, в Wagener С et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener С et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 и Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors выше, pp. 386-389.In another aspect, provided herein are antibodies that bind to the same or overlapping OX40 epitope (eg, human OX40 epitope) as the antibody described herein (eg, pab1949 or pab2044). In certain embodiments, an antibody epitope may be determined, for example, by NMR spectroscopy, X-ray crystallographic studies, ELISA assays, hydrogen-deuterium exchange coupled with mass spectrometry (e.g., liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry), oligopeptide scanning assays array-based and/or mutagenesis mapping (eg, site-directed mutagenesis mapping). In the case of X-ray crystallography, crystallization can be performed using any of the known methods in the art (for example, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Antibody-antigen crystals can be studied using well-known X-ray diffraction techniques and can be refined using a computer program such as X-PLOR (Yale University, 1992, sold by Molecular Simulations, Inc.; see, for example, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.; US Patent Application No. 2004/0014194), and BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Pt 10): 1316-1323). Mutagenesis mapping studies can be carried out using any method known to one skilled in the art. See, for example, Champe M et al., (1995) supra and Cunningham BC & Wells JA (1989) supra for descriptions of mutagenesis techniques, including alanine scanning mutagenesis techniques. In a certain embodiment, the epitope for the antibody is determined using alanine scanning mutagenesis studies. In addition, antibodies that recognize or bind to the same or overlapping epitopes of OX40 (e.g., human OX40) can be identified using standard techniques such as immunoassays, for example, by detecting the ability of one antibody to block the binding of another antibody with the target antigen, i.e., competitive binding assay. Competitive binding assays can also be used to determine whether two antibodies have the same binding specificity for an epitope. Competitive binding can be determined in an assay in which the immunoglobulin of interest inhibits the specific binding of a reference antibody to a common antigen, such as OX40. Many types of competitive binding assays are known, for example: direct or indirect radioimmunoassay (RIA), direct or indirect enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), sandwich competitive assay (see Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); solid phase direct EIA using the biotin-avidin system (see Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); label-assisted solid-phase direct assay, label-assisted sandwich-type solid-phase direct assay (see Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); solid phase direct RIA using labels using the I-125 label (see Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1): 7-15); solid phase direct EIA using the biotin-avidin system (Cheung RC et al, (1990) Virology 176: 546-52); and direct RIA using labels (Moldenhauer G et al, (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Typically, such an assay involves the use of purified antigen (eg, OX40, such as human OX40) bound to a solid surface or cells bearing each of the following: an unlabeled test immunoglobulin and a labeled reference immunoglobulin. Competitive inhibition can be measured by determining the amount of label bound to a solid surface or cells in the presence of the immunoglobulin of interest. Usually the immunoglobulin being tested is present in excess. Typically, if the competing antibody is present in excess, it will inhibit the specific binding of the reference antibody to the common antigen by at least 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% or more . The competitive binding assay can be configured in a variety of different formats using labeled antigen or labeled antibody. In a common version of this assay, the antigen is immobilized in a 96-well plate. The ability of unlabeled antibodies to block the binding of labeled antibodies to antigen is then measured using radioactive or enzymatic labels. For further details see, for example, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 and Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors supra, pp. 386-389.
В одном варианте осуществления конкурентный анализ выполняют с применением поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore®), например, с помощью тандемного подхода, например, описанного Abdiche YN et al., (2009) Analytical Biochem 386: 172-180, при этом антиген ОХ40 иммобилизуют на поверхности чипа, например, сенсорного чипа СМ5, и антитела к ОХ40 затем пропускают над чипом. Чтобы определить, конкурирует ли антитело с антителом к ОХ40, описанным в данном документе, антитело к ОХ40 сначала пропускают над поверхностью чипа для достижения насыщения, а затем добавляют поIn one embodiment, the competition assay is performed using surface plasmon resonance (BIAcore®), for example, using a tandem approach, for example, described by Abdiche YN et al., (2009) Analytical Biochem 386: 172-180, wherein the OX40 antigen is immobilized on surface of the chip, for example a CM5 sensor chip, and anti-OX40 antibodies are then passed over the chip. To determine whether an antibody competes with the anti-OX40 antibody described herein, the anti-OX40 antibody is first passed over the surface of the chip to saturate and then added
- 54 046360 тенциальное конкурирующее антитело. Связывание конкурирующего антитела затем может быть определено и рассчитано количественно относительно неконкурирующего контроля.- 54 046360 potential competing antibody. Competing antibody binding can then be determined and quantified relative to a non-competing control.
В определенных аспектах анализы конкурентного связывания могут быть использованы для определения того, происходит ли конкурентное блокирование антитела, например, дозозависимым образом, другим антителом, например, антитело связывает, по сути, тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы, что и эталонное антитело, если два антитела распознают идентичные или стерически перекрывающиеся эпитопы в анализах конкурентного связывания, таких как конкурентные ELISA-анализы, которые могут быть сконфигурированы во всех из различных форматов, с применением меченого антигена или меченого антитела. В конкретном варианте осуществления антитело может быть исследовано в анализах конкурентного связывания с антителом, описанным в данном документе (например, антителом pab1949 или pab2044), или его вариантом в виде химерного или Fab-антитела, или антителом, содержащим CDR VH и CDR VL антитела, описанного в данном документе (например, pab1949 или pab2044).In certain aspects, competitive binding assays can be used to determine whether an antibody is competitively blocked, e.g., in a dose-dependent manner, by another antibody, e.g., the antibody binds substantially the same epitope or overlapping epitopes as the reference antibody if the two antibodies recognize identical or sterically overlapping epitopes in competitive binding assays, such as competitive ELISA assays, which can be configured in any of a variety of formats, using a labeled antigen or a labeled antibody. In a specific embodiment, the antibody may be tested in competitive binding assays with an antibody described herein (e.g., pab1949 or pab2044 antibody), or a chimeric or Fab antibody variant thereof, or an antibody comprising the CDR VH and CDR VL antibodies, described in this document (for example, pab1949 or pab2044).
В другом аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые конкурируют (например, дозозависимым образом) за связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) с антителом, описанным в данном документе (например, pab 1949 или pab2044), что определяют с помощью анализов, известных специалисту в данной области техники или описанных в данном документе (например, конкурентные ELISA-анализы или поверхностный плазмонный резонанс). В другом аспекте в данном документе предусмотрены антитела, которые конкурентно ингибируют (например, дозозависимым образом) связывание антитела, описанного в данном документе (например, pab1949 или pab2044), с ОХ40 (например, ОХ40 человека), что определяют с помощью анализов, известных специалисту в данной области техники или описанных в данном документе (например, конкурентных ELISA-анализов, или технологии suspension array, или анализа поверхностного плазмонного резонанса). В конкретных вариантах осуществления такое конкурентно блокирующее антитело запускает, индуцирует или усиливает одну или несколько видов активности ОХ40. В конкретных аспектах в данном документе предусмотрено антитело, которое конкурирует (например, дозозависимым образом) за специфичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) с антителом, содержащим аминокислотные последовательности, описанные в данном документе (например, аминокислотные последовательности VL и/или VH антитела pab1949 или pab2044), что определяют с помощью анализов, известных специалисту в данной области техники или описанных в данном документе (например, конкурентных ELISA-анализов, или технологии suspension array, или анализа поверхностного плазмонного резонанса). В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено антитело, которое конкурирует с антителом, описанным в данном документе, за связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) в той же степени, в которой антитело, описанное в данном документе, самоконкурирует за связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрено первое антитело, которое конкурирует с антителом, описанным в данном документе, за связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека), где первое антитело конкурирует за связывание в анализе, включающем следующие стадии: (а) инкубирование трансфицированных ОХ40 клеток с первым антителом в немеченной форме в контейнере; и (b) добавление в контейнер описанного в данном документе антитела в меченой форме и инкубирование клеток в контейнере; и (с) выявление связывания описанного в данном документе антитела в меченой форме в клетках. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрено первое антитело, которое конкурирует с антителом, описанным в данном документе, за связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека), где конкуренция проявляется в виде сниженной степени связывания первого антитела с ОХ40 на более чем 80% (например, 85%, 90%, 95% или 98%, или от 80% до 85%, от 80% до 90%, от 85% до 90% или от 85% до 95%).In another aspect, provided herein are antibodies that compete (e.g., in a dose-dependent manner) for binding to OX40 (e.g., human OX40) with an antibody described herein (e.g., pab 1949 or pab2044), as determined by assays known in the art. one skilled in the art or described herein (eg, competitive ELISA assays or surface plasmon resonance). In another aspect, provided herein are antibodies that competitively inhibit (e.g., in a dose-dependent manner) the binding of an antibody described herein (e.g., pab1949 or pab2044) to OX40 (e.g., human OX40), as determined by assays known to one of ordinary skill in the art. in the art or described herein (eg, competitive ELISA assays, or suspension array technology, or surface plasmon resonance assays). In specific embodiments, such a competitive blocking antibody triggers, induces, or enhances one or more activities of OX40. In specific aspects, provided herein is an antibody that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for specific OX40 binding (e.g., human OX40) with an antibody comprising amino acid sequences described herein (e.g., VL and/or VH amino acid sequences of an antibody pab1949 or pab2044), as determined by assays known to one skilled in the art or described herein (eg, competitive ELISA assays, or suspension array technology, or surface plasmon resonance assays). In certain embodiments, an antibody is provided herein that competes with an antibody described herein for binding to OX40 (e.g., human OX40) to the same extent that an antibody described herein self-competes for binding to OX40 ( for example, human OX40). In some embodiments, provided herein is a first antibody that competes with an antibody described herein for binding to OX40 (e.g., human OX40), wherein the first antibody competes for binding in an assay comprising the following steps: (a) incubating the transfected OX40 cells with the first antibody in unlabeled form in a container; and (b) adding the antibody described herein in labeled form to the container and incubating the cells in the container; and (c) detecting binding of an antibody described herein in a labeled form in cells. In certain embodiments, a first antibody is provided herein that competes with an antibody described herein for binding to OX40 (e.g., human OX40), wherein the competition results in a reduced degree of binding of the first antibody to OX40 by greater than 80% ( for example, 85%, 90%, 95% or 98%, or 80% to 85%, 80% to 90%, 85% to 90%, or 85% to 95%).
В конкретных аспектах в данном документе предусмотрено антитело, которое конкурирует (например, дозозависимым образом) за специфичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) с антителом, содержащим VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16. В конкретных аспектах в данном документе предусмотрено антитело, которое конкурирует (например, дозозависимым образом) за специфичное связывание с ОХ40 (например, ОХ40 человека) с антителом, содержащим (i) VL-домен, содержащий CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, содержащие аминокислотные последовательности CDR VL, приведенные в табл. 1; и (ii) VH-домен, содержащий CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, содержащие аминокислотные последовательности CDR, приведенные в табл. 2. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело, которое конкурентно блокируется (например, дозозависимым образом) антителом, содержащим VLдомен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, в отношении специфичного связывания с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело, которое конкурентно блокируется (например, дозозависимым образом) антителом, содержащим (i) VL-домен, содержащий CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, содержащие аминокислотные последовательности CDR, приведенные в табл. 1; и (ii) VH-домен, содержащий CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, содержащие аминокислотные последоваIn specific aspects, provided herein is an antibody that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for specific binding to OX40 (e.g., human OX40) with an antibody comprising a VL domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and VH -domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. In specific aspects, provided herein is an antibody that competes (e.g., in a dose-dependent manner) for specific binding to OX40 (e.g., human OX40) with an antibody comprising (i) VL domain containing CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL, containing the amino acid sequences of CDR VL given in table. 1; and (ii) a VH domain containing CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH containing the amino acid sequences of the CDRs shown in table. 2. In a specific embodiment, the antibody described herein is an antibody that is competitively blocked (e.g., in a dose-dependent manner) by an antibody comprising a VL domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and a VH domain containing the amino acid the sequence set forth in SEQ ID NO: 16 for specific binding to OX40 (eg, human OX40). In another specific embodiment, an antibody described herein is an antibody that is competitively blocked (e.g., in a dose-dependent manner) by an antibody comprising (i) a VL domain comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 containing CDR amino acid sequences, given in table. 1; and (ii) a VH domain containing CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH containing amino acid sequences
- 55 046360 тельности CDR, приведенные в табл. 2. В конкретных аспектах в данном документе предусмотрено антитело, которое иммуноспецифично связывается с тем же эпитопом, что и pab1949 или pab2044 при специфичном связывании с ОХ40 (например, ОХ40 человека). Анализы, известные специалисту в данной области техники или описанные в данном документе (например, рентгеновская кристаллография, водороддейтериевый обмен в сочетании с масс-спектрометрией (например, жидкостная хроматография-массспектрометрия с ионизацией электрораспылением), сканирование аланином, ELISA-анализы и т.п.), могут быть использованы для определения того, связываются ли антитела с одним и тем же эпитопом. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, иммуноспецифично связывается с тем же эпитопом, который связывается pab1949 или pab2044, или эпитопом, который перекрывает этот эпитоп. В другом конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, иммуноспецифично связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее (i) VL-домен, содержащий CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, содержащие аминокислотные последовательности CDR, приведенные в табл. 1; и (ii) VH-домен, содержащий CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, содержащие аминокислотные последовательности CDR, приведенные в табл. 2.- 55 046360 CDR details given in table. 2. In specific aspects, provided herein is an antibody that immunospecifically binds to the same epitope as pab1949 or pab2044 when specifically binding to OX40 (eg, human OX40). Assays known to one skilled in the art or described herein (e.g., X-ray crystallography, hydrogen-deuterium exchange coupled with mass spectrometry (e.g., liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry), alanine scanning, ELISA assays, and the like. ), can be used to determine whether antibodies bind to the same epitope. In a specific embodiment, an antibody described herein immunospecifically binds to the same epitope that pab1949 or pab2044 binds, or an epitope that overlaps that epitope. In another specific embodiment, an antibody described herein immunospecifically binds to the same epitope as an antibody comprising (i) a VL domain comprising VL CDR1, VL CDR2, and VL CDR3 containing the CDR amino acid sequences set forth in Table. 1; and (ii) a VH domain containing CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH containing the amino acid sequences of the CDRs shown in table. 2.
В конкретном аспекте связывание между антителом, описанным в данном документе, и вариантным ОХ40 значительно ослаблено по сравнению со связыванием между антителом и последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, и при этом вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением аминокислотной мутации (например, замены), выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением любой мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и Р115А. В некоторых вариантах осуществления вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением любых двух, трех, четырех, пяти, шести или семи мутаций, выбранных из группы, состоящей из W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и Р115А. В некоторых вариантах осуществления вариантный ОХ40 содержит последовательность под SEQ ID NO: 55, за исключением аминокислотной мутации W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и P115A. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с эпитопом последовательности ОХ40 человека, содержащей, состоящей главным образом из или состоящей из остатка SEQ ID NO: 55, выбранного из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из любого одного остатка, выбранного из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из любых двух, трех, четырех, пяти, шести или семи остатков, выбранных из группы, состоящей из 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из остатков 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55.In a particular aspect, the binding between the antibody described herein and the variant OX40 is significantly reduced compared to the binding between the antibody and the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, and wherein the variant OX40 contains the sequence of SEQ ID NO: 55, except an amino acid mutation (eg, substitution) selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A, and combinations thereof. In some embodiments, the variant OX40 comprises the sequence of SEQ ID NO: 55, excluding any mutation selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, and P115A. In some embodiments, the variant OX40 comprises the sequence of SEQ ID NO: 55, excluding any two, three, four, five, six or seven mutations selected from the group consisting of W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A and P115A. In some embodiments, the variant OX40 contains the sequence of SEQ ID NO: 55, excluding the amino acid mutation W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, and P115A. In a specific aspect, the antibody described herein specifically binds to an epitope of a human OX40 sequence comprising, consisting primarily of, or consisting of the residue of SEQ ID NO: 55 selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 and their combinations. In some embodiments, the epitope contains, consists primarily of, or consists of any one residue selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 of SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the epitope contains, consists primarily of or consists of any two, three, four, five, six or seven residues selected from the group consisting of 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 and 115 SEQ ID NO: 55. In some in embodiments, the epitope contains, consists primarily of, or consists of residues 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 of SEQ ID NO: 55.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с эпитопом последовательности под SEQ ID NO: 55, содержащим, состоящим главным образом из или состоящим из остатка, выбранного из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из любого одного остатка, выбранного из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из любых двух, трех, четырех, пяти, шести или семи остатков, выбранных из группы, состоящей из 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит, состоит главным образом из или состоит из остатков 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55.In a specific embodiment, the antibody described herein specifically binds to an epitope of the sequence SEQ ID NO: 55 containing, consisting primarily of, or consisting of a residue selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 and their combinations. In some embodiments, the epitope contains, consists primarily of, or consists of any one residue selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 of SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the epitope contains, consists primarily of or consists of any two, three, four, five, six or seven residues selected from the group consisting of 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 and 115 SEQ ID NO: 55. In some in embodiments, the epitope contains, consists primarily of, or consists of residues 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 of SEQ ID NO: 55.
В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, специфически связывается по меньшей мере с одним остатком SEQ ID NO: 55, выбранным из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с любым одним остатком или любыми двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью остатками, выбранными из группы, состоящей из 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с любыми двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или семью остатками, выбранными из группы, состоящей из 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99 и 115 SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, специфически связывается с остатками 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 SEQ ID NO: 55. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации (например, замены), выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации, или не связывается с ним. В некоторых вариантах осуществления белок является идентичным SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации, включающей любую одну мутацию или любые две, три, четыре, пять, шесть или семь мутаций, выбранных из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и Р115А. В некоторых вариантах осуществления белок является идентичным SEQ ID NO: 55, за исключением наIn a specific aspect, the antibody described herein specifically binds to at least one residue of SEQ ID NO: 55 selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115, and combinations thereof. In some embodiments, an antibody described herein specifically binds to any one residue or any two, three, four, five, six, or seven residues selected from the group consisting of 60, 62, 80, 88, 93, 99, and 115 SEQ ID NO: 55. In some embodiments, an antibody described herein specifically binds to any two, three, four, five, six, or seven residues selected from the group consisting of 58, 60, 62, 80, 88 , 93, 99, and 115 SEQ ID NO: 55. In some embodiments, the antibody described herein specifically binds to residues 58, 60, 62, 80, 88, 93, 99, 115 of SEQ ID NO: 55. In particular In one aspect, the antibody described herein is characterized, compared to binding to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, by a reduced ability to bind to a protein identical to the sequence of SEQ ID NO: 55, except for the presence of an amino acid mutation (eg, substitution ), selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and combinations thereof, or does not bind thereto. In some embodiments, the protein is identical to SEQ ID NO: 55 except for the presence of an amino acid mutation including any one mutation or any two, three, four, five, six or seven mutations selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A and P115A. In some embodiments, the protein is identical to SEQ ID NO: 55 except for
- 56 046360 личия аминокислотной мутации, включающей любые две, три, четыре, пять, шесть или семь мутаций, выбранных из группы, состоящей из W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и Р115А. В некоторых вариантах осуществления белок является идентичным SEQ ID NO: 55, за исключением присутствия аминокислотной замены, включающей мутации W58A, N6OA, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А и P115A.- 56 046360 the presence of an amino acid mutation, including any two, three, four, five, six or seven mutations selected from the group consisting of W58A, N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A and P115A. In some embodiments, the protein is identical to SEQ ID NO: 55 except for the presence of an amino acid substitution comprising the mutations W58A, N6OA, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, and P115A.
В определенных вариантах осуществления эпитоп для антитела, описанного в данном документе, используется в качестве иммуногена для получения антител. См., например, раздел 5.3 ниже касательно способов получения антител.In certain embodiments, an epitope for an antibody described herein is used as an immunogen to produce antibodies. See, for example, section 5.3 below regarding methods for producing antibodies.
В конкретных аспектах антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), функционирует в качестве агониста.In specific aspects, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) functions as an agonist.
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), повышает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе и/или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), повышает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека) на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе и/или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). Неограничивающие примеры активности ОХ40 (например, ОХ40 человека) могут включать передачу сигнала с участием ОХ40 (например, ОХ40 человека), клеточную пролиферацию, выживаемость клеток и продукцию цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), индуцирует, усиливает или повышает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека). В конкретных вариантах осуществления повышение активности ОХ40 оценивают, как описано в примерах ниже. В определенных аспектах антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), индуцирует, усиливает или повышает клеточную пролиферацию клеток, которые экспрессируют ОХ40 и которые реагируют на передачу сигнала с участием ОХ40 (например, клетки, которые пролиферируют в ответ на стимуляцию ОХ40 и передачу сигнала с участием ОХ40, такие как Т-клетки). Анализы клеточной пролиферации описаны в данной области техники, как, например, анализ с включением 3Нтимидина, анализ с включением BrdU или анализ с использованием CFSE, как, например, описанный в примере 2, и могут быть легко осуществимы специалистом в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4' или CD8' эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCRкомплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются повышенной клеточной пролиферацией по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, таким как фитогемагглютинин (РНА) и/или форболмиристатацетат (РМА), или стимулирующим TCRкомплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28.In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) increases the activity of OX40 (e.g., human OX40) by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times, as assessed using the methods described herein and/or known to one skilled in the art, according to compared to the activity of OX40 (eg, human OX40) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) increases the activity of OX40 (e.g., human OX40) by at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99%, which assessed using methods described herein and/or known to one skilled in the art, compared to the activity of OX40 (e.g., human OX40) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (e.g., an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). Non-limiting examples of OX40 (e.g., human OX40) activity may include OX40 (e.g., human OX40) signaling, cell proliferation, cell survival, and cytokine production (e.g., IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4 , IL-10 and/or IL-13). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) induces, enhances, or enhances the activity of OX40 (eg, human OX40). In specific embodiments, increases in OX40 activity are assessed as described in the examples below. In certain aspects, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) induces, enhances, or increases cellular proliferation of cells that express OX40 and that respond to signaling involving OX40 (e.g., cells that proliferate in response to OX40 stimulation and OX40-mediated signaling such as T cells). Cell proliferation assays are described in the art, such as the 3- Nthymidine assay, the BrdU assay, or the CFSE assay, such as those described in Example 2, and can be easily performed by one skilled in the art. In specific embodiments, T cells (e.g., CD4' or CD8' effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex-stimulating antibody, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), are characterized by increased cellular proliferation compared to T cells stimulated with T alone -a cell mitogen or a T-cell receptor complex stimulating agent such as phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody.
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение клеточной пролиферации (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с включением 3Н-тимидина, анализа с включением BrdU или анализа с использованием CFSE, таких как описанные в примере 2 ниже), по сравнению с пролиферацией при стимуляции активности ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение клеточной пролиферации (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с включением 3Н-тимидина, аналиIn specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in cell proliferation (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) of at least about 1 ,2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times, as assessed by the methods described herein document or known to one skilled in the art (e.g., 3 H-thymidine incorporation assay, BrdU incorporation assay, or CFSE assay, such as those described in Example 2 below), versus proliferation upon stimulation of OX40 activity (e.g., OX40 human) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in cell proliferation (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) by at least about 5 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., 3 H-thymidine assay,
- 57 046360 за с включением BrdU или анализа с использованием CFSE, таких как описанные в примере 2 ниже), по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Тклеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Тклеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, где пролиферация CD4+ Т-клеток характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 2 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 105 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с) окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает более значительное повышение пролиферации CD4+ Т-клеток, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 2 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) мечение, например, подвергнутых обогащению CD4+ Т-клеток, например, 10 мкМ сукцинимидилового сложного эфира диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE) в течение, например, 7 минут, например, при 37°С; (b) после тщательных промывок, стимулирование клеток (например, 10 клеток в лунке), например, 3 мкг/мл, например, связанного на планшете антитела к CD3 и варьирующими концентрациями (например, 0,002, 0,02, 0,2, 2 и 20 мкг/мл), например, связанного на планшете антитела, описанного в данном документе, например, при 37°С и 5% СО2; и (с)- 57 046360 for incorporating BrdU or CFSE assays such as those described in Example 2 below) compared to the activity of OX40 (eg human OX40) without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg antibody that does not binds immunospecifically to OX40). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0 .2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is an increasing function of antibody concentrations, e.g. from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) in for example, 7 minutes, for example at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the anti-OX40 antibody is , for example, from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM succinimidyl ester diacetate carboxyfluorescein (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO2; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in CD4+ T cell proliferation, wherein CD4+ T cell proliferation is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of the anti-OX40 antibody is , for example, from 2 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester ( CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (e.g., 10 5 cells per well), e.g., 3 μg/ml, e.g., plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (e.g., 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c) staining the cells, for example, on day 4, for example, with an anti-CD4 antibody, and examining CD4+ T cell proliferation, for example, by measuring the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells by flow cytometry. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides a greater increase in CD4+ T cell proliferation when the antibody is present at a concentration of 20 μg/mL rather than at a concentration of 2 μg/mL. ml, which is assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) labeling, for example, enriched CD4+ T cells, for example, with 10 μM carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) for, for example, 7 minutes, for example, at 37°C; (b) after thorough washes, stimulate the cells (eg, 10 cells per well), for example, 3 μg/ml, for example, plate-bound anti-CD3 antibody and varying concentrations (eg, 0.002, 0.02, 0.2, 2 and 20 μg/ml), for example, plate-bound antibody described herein, for example, at 37°C and 5% CO 2 ; and (c)
- 58 046360 окрашивание клеток, например, в день 4, например, антителом к CD4, и исследование пролиферации CD4+ Т-клеток, например, с помощью измерения процента меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ посредством проточной цитометрии.- 58 046360 staining cells, for example on day 4, for example with an anti-CD4 antibody, and examining the proliferation of CD4+ T cells, for example by measuring the percentage of CFSE-labeled cells with low CD4+ content by flow cytometry.
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном (например, антителом к CD3 или форболовым эфиром) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной пролиферацией, повышенной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с включением 3Н-тимидина, анализа с включением BrdU или анализа с использованием CFSE, таких как описанные в примере 2 ниже). В некоторых вариантах осуществления Тклетки (например, CD4+ или CD8+ эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной пролиферацией, повышенной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с включением Н-тимидина, анализа с включением BrdU или анализа с использованием CFSE, таких как описанные в примере 2 ниже). В конкретном варианте осуществления клеточную пролиферацию оценивают, как описано в примере 2 ниже. В конкретных вариантах осуществления 5 мкг/мл антитела к ОХ40, описанного в данном документе, обеспечивает повышение пролиферации CD4 Т-клеток человека, обработанных 3 мкг/мл антитела к CD3, на по меньшей мере 20%. В конкретных вариантах осуществления 5 мкг/мл антитела к ОХ40, описанного в данном документе, обеспечивает повышение пролиферации CD4 Т-клеток человека, обработанных 3 мкг/мл антитела к CD3, на по меньшей мере 30%. В конкретных вариантах осуществления 5 мкг/мл антитела к ОХ40, описанного в данном документе, обеспечивает повышение пролиферации CD4 Т-клеток человека, обработанных 3 мкг/мл антитела к CD3, на по меньшей мере 40%. В конкретных вариантах осуществления 5 мкг/мл антитела к ОХ40, описанного в данном документе, обеспечивает повышение пролиферации CD4 Т-клеток человека, обработанных 3 мкг/мл антитела к CD3, на по меньшей мере 50%.In some embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen (e.g., anti-CD3 antibody or phorbol ester) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g. , human OX40), characterized by cellular proliferation increased by at least approximately 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold , 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times , 90-fold or 100-fold compared to T cells stimulated with T cell mitogen alone, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., 3 H-thymidine assay, incorporation of BrdU or CFSE assays such as those described in Example 2 below). In some embodiments, T cells (e.g., CD4+ or CD8+ effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or TCR-stimulating agent complex with an antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), are characterized by cellular proliferation increased by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 98% or 99%, compared to T cells stimulated with a T cell mitogen alone or a T cell receptor complex stimulating agent (eg, phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating agent antibody, such as anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody) that are assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., H-thymidine assay, BrdU assay, or CFSE assay, such as those described in example 2 below). In a specific embodiment, cell proliferation is assessed as described in Example 2 below. In specific embodiments, 5 μg/ml of the anti-OX40 antibody described herein provides an increase in the proliferation of human CD4 T cells treated with 3 μg/ml of the anti-CD3 antibody by at least 20%. In specific embodiments, 5 μg/ml of the anti-OX40 antibody described herein provides an increase in the proliferation of human CD4 T cells treated with 3 μg/ml of the anti-CD3 antibody by at least 30%. In specific embodiments, 5 μg/ml of the anti-OX40 antibody described herein provides an increase in the proliferation of human CD4 T cells treated with 3 μg/ml of the anti-CD3 antibody by at least 40%. In specific embodiments, 5 μg/ml of the anti-OX40 antibody described herein provides an increase in the proliferation of human CD4 T cells treated with 3 μg/ml of the anti-CD3 antibody by at least 50%.
В определенных аспектах антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение выживаемости клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки). В конкретном варианте осуществления Тклетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются повышенной выживаемостью по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном. Анализы выживаемости клеток описаны в уровне техники (например, анализ с исключением окрашивания трипановым синим) и могут быть легко осуществимы специалистом в данной области техники.In certain aspects, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) provides increased cell survival (eg, T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells). In a specific embodiment, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or TCR-stimulating agent complex with an antibody, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), have increased survival compared to T cells stimulated with T cell mitogen alone . Cell survival assays are described in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay) and can be easily performed by one skilled in the art.
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение выживаемости клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение выживаемости клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим), по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какоIn specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in cell survival (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) of at least about 1 ,2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times, as assessed by the methods described herein document or known to one skilled in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides an increase in cell survival (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) by at least about 5 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., trypan blue stain exclusion assay), compared to OX40 activity (e.g., human OX40 ) without any
- 59 046360 го-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).- 59 046360 other antibody or in the presence of an unrelated antibody (for example, an antibody that does not bind immunospecifically to OX40).
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4+ или CD8+ эффекторные Тклетки), стимулированные Т-клеточным митогеном (например, антителом к CD3 или форболовым эфиром) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной выживаемостью, повышенной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Тклеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной выживаемостью, повышенной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Тклеточным митогеном, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим).In some embodiments, T cells (e.g., CD4+ or CD8+ effector T cells) stimulated with a T cell mitogen (e.g., anti-CD3 antibody or phorbol ester) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., OX40 human) are characterized by cell survival increased by at least approximately 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100-fold compared to T cells stimulated with a T cell mitogen alone or a T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody), as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay). In some embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or TCR-stimulating agent complex with an antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), have cell survival increased by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 98% or 99% compared to T cells stimulated with T cell mitogen alone, as assessed using methods described herein or known to one of ordinary skill in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay).
В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает защиту эффекторных Т-клеток (например, CD4' и CD8' эффекторных Т-клеток) от индуцированной активацией клеточной гибели.In certain embodiments, an antibody described herein that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) provides protection to effector T cells (eg, CD4' and CD8' effector T cells) from activation-induced cell death.
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), индуцирует, усиливает или повышает продукцию цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией цитокинов в присутствии или в отсутствии стимуляции OX40L (например, OX40L человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), индуцирует или усиливает продукцию цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией цитокинов в присутствии или в отсутствии стимуляции OX40L (например, OX40L человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) induces, enhances, or enhances the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL -10 and/or IL-13) by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%, as assessed by methods described herein (see examples below, such as example 2) or known one skilled in the art, compared to cytokine production in the presence or absence of OX40L stimulation (eg, human OX40L) without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) induces or enhances the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) by at least about 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times , 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100-fold, as assessed by methods described herein (see examples below, such as Example 2) or known to one skilled in the art, compared to cytokine production in the presence or absence of OX40L stimulation (e.g., human OX40L ) without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40).
В определенных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4+ или CD8+ эффекторные Тклетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13), повышенной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, по сравнению с Тклетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Тклеточный рецепторный комплекс, (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, способа ELISA или как описано в примерах ниже). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCRIn certain embodiments, T cells (e.g., CD4+ or CD8+ effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or TCR-stimulating agent complex with an antibody, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), are characterized by the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α, IFN- γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) increased by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99%, compared to T cells stimulated with T cell mitogen or agent alone, T cell receptor complex stimulating antibody (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody), as assessed by methods described herein or known one skilled in the art (eg, ELISA method or as described in the examples below). In some embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or stimulating TCR
- 60 046360 комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13), повышенной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, (например, фито гемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, способа ELISA или как описано в примерах ниже).- 60 046360 complex with an antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), characterized by the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α , IFN-γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) increased by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2 ,5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50-fold, 60-fold, 70-fold, 80-fold, 90-fold, or 100-fold, compared to T cells stimulated with a T cell mitogen or a T cell receptor complex stimulating agent alone (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and /or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody), as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., ELISA method or as described in the examples below).
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает повышение продукции IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином A (SEA) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией IL-2 без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В определенных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 Тклетки), стимулированные стафилококковым энтеротоксином A (SEA) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией IL-2, повышенной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз по сравнению с Т-клетками, стимулированными только SEA, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа ELISA или как описано в примерах ниже).In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides at least about a 1.2-fold increase in IL-2 production in response to stimulation with staphylococcal enterotoxin A (SEA). ,3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times, as assessed using the methods described herein (see examples below, such as Example 2) or known to one skilled in the art, compared to IL-2 production without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In certain embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 T cells) stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) are characterized by the production of IL-2, increased by at least approximately 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times compared to T cells stimulated with SEA alone, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (eg, ELISA assay or as described in the examples below).
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления продукция IL-2, индуцированная антителом в комбинации с SEA, представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA), индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA), индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 представляет собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций антитела, например, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титров IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), привоIn specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g., 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example, by PBMCs when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where IL-2 production is an increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml. In certain embodiments, IL-2 production induced by an antibody in combination with SEA is an increasing function of antibody concentrations, e.g., 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, 0.8 μg/ml to 20 µg/ml, 4 µg/ml to 20 µg/ml, 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or 0.8 µg/ml to 4 µg /ml. In another embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA), induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where the production of IL-2 is is a largely increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMC (for example, 10 5 cells per well) in in the absence or presence of varying concentrations (for example, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) of antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA), induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where the production of IL-2 is is a largely increasing function of antibody concentrations, for example, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.8 μg/ml to 20 μg/ml, from 4 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a ) culturing PBMCs (e.g., 10 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (e.g., 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128, and 0.000256 μg/ml) antibodies, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring IL-2 titers using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40)
- 61 046360 дит к более высокой продукции IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) при стимуляции в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 0,032 мкг/мл. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), приводит к более высокой продукции IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) при стимуляции в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 0,16 мкг/мл. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС при стимулировании в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, что измеряют, например, с помощью электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human ТН1/ТН2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл. В определенных вариантах осуществления продукция IL-2, индуцированная антителом в комбинации с SEA, характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл. В другом варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA), индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,032 мкг/мл до 20 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 10 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титра IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В определенных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в комбинации со стафилококковым энтеротоксином A (SEA), индуцирует продуцирование IL-2, например, клетками РВМС, где продуцирование IL-2 характеризуется сигмоидальной кривой доза-ответ, если концентрация антитела к ОХ40 составляет, например, от 0,16 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,8 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 4 мкг/мл до 20 мкг/мл, от 0,032 мкг/мл до 4 мкг/мл, от 0,16 мкг/мл до 4 мкг/мл или от 0,8 мкг/мл до 4 мкг/мл, что оценивают, например, в анализе, включающем следующие стадии: (а) культивирование РВМС (например, 105 клеток в лунке) в отсутствии или в присутствии варьирующих концентраций (например, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064, 0,00128 и 0,000256 мкг/мл) антитела, и, например, 100 нг/мл SEA, в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности; и (b) сбор очищенного супернатанта и измерение титров IL-2 с помощью, например, электрохемилюминесценции, например, с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), приводит к более высокой продукции IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином А (SEA) (например, 100 нг/мл) при стимуляции в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 0,032 мкг/мл. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), приводит к более высокой продукции IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином A (SEA) (например, 100 нг/мл) при стимуляции в течение, например, 5 дней, например, при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%, если антитело присутствует в концентрации 20 мкг/мл, а не в концентрации 0,16 мкг/мл.- 61 046360 dit to higher production of IL-2 in response to stimulation with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (for example, 100 ng/ml) when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 0.032 μg/ml. In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) results in higher IL-2 production in response to staphylococcal enterotoxin A (SEA) stimulation (e.g., 100 ng/ml) at stimulation for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 0.16 μg/ml. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA) (e.g., 100 ng/ml) induces the production of IL-2, for example, by PBMCs when stimulated for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, as measured, for example, using electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery), where the production of IL-2 is characterized by a sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml. In certain embodiments, IL-2 production induced by an antibody in combination with SEA exhibits a sigmoidal dose-response curve when the concentration of the anti-OX40 antibody is, for example, 0.16 μg/mL to 20 μg/mL, 0.8 μg /ml to 20 µg/ml, from 4 µg/ml to 20 µg/ml, from 0.032 µg/ml to 4 µg/ml, from 0.16 µg/ml to 4 µg/ml or from 0.8 µg/ml up to 4 μg/ml. In another embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA), induces the production of IL-2, for example, by PBMC cells, where IL-2 production is characterized by sigmoidal dose-response curve if the concentration of anti-OX40 antibody is, for example, from 0.032 μg/ml to 20 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps: (a) culturing PBMCs (for example, 10 cells per well ) in the absence or presence of varying concentrations (eg 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) of antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for example 5 days, for example at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring the IL-2 titer using, for example, electrochemiluminescence, for example using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In certain embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), in combination with staphylococcal enterotoxin A (SEA), induces the production of IL-2, for example, by PBMCs, where IL-2 production is characterized by sigmoidal dose-response curve if the concentration of antibody to OX40 is, for example, from 0.16 μg/ml to 20 μg/ml, from 0.8 μg/ml to 20 μg/ml, from 4 μg/ml to 20 μg/ ml, from 0.032 μg/ml to 4 μg/ml, from 0.16 μg/ml to 4 μg/ml, or from 0.8 μg/ml to 4 μg/ml, as assessed, for example, in an assay comprising the following steps : (a) culturing PBMCs (eg 10 5 cells per well) in the absence or presence of varying concentrations (eg 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064, 0.00128 and 0.000256 μg/ml) antibody, and, for example, 100 ng/ml SEA, for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity; and (b) collecting the purified supernatant and measuring IL-2 titers using, for example, electrochemiluminescence, for example, using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) results in higher IL-2 production in response to staphylococcal enterotoxin A (SEA) stimulation (e.g., 100 ng/ml) at stimulation for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 0.032 μg/ml. In a specific embodiment, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) results in higher IL-2 production in response to staphylococcal enterotoxin A (SEA) stimulation (e.g., 100 ng/ml) at stimulation for, for example, 5 days, for example, at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity, if the antibody is present at a concentration of 20 μg/ml rather than at a concentration of 0.16 μg/ml.
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), снижает продукцию IL-10 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином А (SEA) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см., примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией IL-10 без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) reduces IL-10 production in response to staphylococcal enterotoxin A (SEA) stimulation by at least about 5%, 10%, 15 %, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% or 50%, as assessed using the methods described herein (see examples below, such as Example 2) or known to one skilled in the art art, compared to production of IL-10 without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40).
В определенных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4+ или CD8+ Т-клетки), стимулированные стафилококковым энтеротоксином A (SEA) в присутствии антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией IL-10, сниженной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% по сравнению с Т-клетками, стимулированными только SEA, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техниIn certain embodiments, T cells (e.g., CD4+ or CD8+ T cells) stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA) in the presence of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) are characterized by the production of IL- 10, reduced by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50% compared to T cells stimulated with SEA alone, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art
- 62 046360 ки (например, анализа ELISA или как описано в примерах ниже). В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), в случае связывания с активированными регуляторными Т-клетками, связывается с активирующими Fc-гамма-рецепторами, выбранными из группы, состоящей из CD16, CD32A и CD64, в большей степени (например, в 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз), чем антитело, в случае связывания с активированными эффекторными Т-клетками, связывается с активирующими Fc-гамма рецепторами, выбранными из группы, состоящей из CD16, CD32A и CD64, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с применением репортерного Fc-гамма рецептора IIIA (CD16) или как описано в примерах ниже). В конкретных вариантах осуществления активирующие Fc-гамма рецепторы экспрессируются на клетке, выбранной из группы, состоящей из эффекторных клеток миелоидного происхождения и эффекторных клеток лимфоцитарного происхождения. В конкретном варианте осуществления активирующим Fc-гамма рецептором является CD16. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), при связывании с активированными регуляторными Тклетками, вызывает более сильную активацию активирующих Fc-гамма рецепторов, выбранных из группы, состоящей из CD16, CD32A и CD64, по сравнению с активацией активирующих-Fc гамма рецепторов, выбранных из группы, состоящей из CD16, CD32A и CD64, которую вызывает антитело при связывании с активированными эффекторными Т-клетками. В конкретных вариантах осуществления активация активирующих Fc-гамма рецепторов в случае, когда антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), связано с активированными регуляторными Т-клетками, является по меньшей мере приблизительно в 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз сильнее, чем активация активирующих Fcгамма рецепторов в случае, когда антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), связано с активированными эффекторными Т-клетками, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с использованием репортерного Fc-гамма рецептора IIIA (CD16) или как описано в примерах ниже). В конкретных вариантах осуществления активирующие Fcгамма рецепторы экспрессируются на клетке, выбранной из группы, состоящей из эффекторных клеток миелоидного происхождения и эффекторных клеток лимфоцитарного происхождения. В конкретном варианте осуществления активирующим Fc-гамма рецептором является CD16.- 62 046360 ki (for example, ELISA analysis or as described in the examples below). In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), when bound to activated regulatory T cells, binds to activating Fc-gamma receptors selected from the group consisting of CD16, CD32A and CD64, to a greater extent (eg, 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold, 4-fold, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times) than the antibody, when bound to activated effector T cells, binds to Fc-gamma activating receptors selected from the group consisting of CD16, CD32A and CD64, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art. in the art (eg, Fc-gamma receptor IIIA (CD16) reporter assay or as described in the examples below). In specific embodiments, the Fc gamma activating receptors are expressed on a cell selected from the group consisting of myeloid-derived effector cells and lymphocytic-derived effector cells. In a specific embodiment, the Fc-gamma activating receptor is CD16. In specific embodiments, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), when bound to activated regulatory T cells, causes greater activation of Fc-gamma activating receptors selected from the group consisting of CD16, CD32A, and CD64, compared to the activation of activating Fc gamma receptors selected from the group consisting of CD16, CD32A and CD64, which the antibody causes upon binding to activated effector T cells. In specific embodiments, the activation of Fc-gamma activating receptors when an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) is bound to activated regulatory T cells is at least about 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times stronger than the activation of Fcgamma activating receptors when the antibody , described herein, which immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) is associated with activated effector T cells, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., reporter assay Fc gamma receptor IIIA (CD16) or as described in the examples below). In specific embodiments, Fcgamma activating receptors are expressed on a cell selected from the group consisting of myeloid-derived effector cells and lymphocytic-derived effector cells. In a specific embodiment, the Fc-gamma activating receptor is CD16.
В конкретном аспекте в данном документе предусмотрены антагонистические антитела, которые иммуноспецифично связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека). Активация передачи сигнала с участием ОХ40 зависит от кластеризации рецепторов с образованием рецепторных комплексов более высокого порядка, которые эффективно привлекают апикальные адапторные белки для регуляции внутриклеточной передачи сигнала. Не вдаваясь в теорию, агонистическое антитело к ОХ40 может опосредовать кластеризацию рецепторов посредством плеч бивалентных антител (т.е., двух плеч антител, каждое из которых связывает антиген ОХ40) и/или при одновременном вовлечении Fc-Fc-рецептора (FcR) на антигенпрезентирующих миелоидных или лимфоидных клетках. Соответственно, один подход к разработке антагонистического антитела к ОХ40 заключается в выборе антитела, которое конкурирует с лигандом ОХ40 (OX40L) за связывание с ОХ40, ослаблении или устранении связывания Fc-области антитела с Fcрецепторами и/или применении формата моновалентного антитела. Формат моновалентного антитела может включать антитела, которые являются структурно моновалентными, такие как без ограничения антитела к ОХ40, содержащие только один антигенсвязывающий домен (например, только один Fabфрагмент), или антитела, содержащие только один антигенсвязывающий домен, который связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), который образует пару с тяжелой цепью или который образует пару с фрагментом тяжелой цепи (например, Fc-фрагментом). Формат моновалентного антитела также может включать антитела, которые являются функционально моновалентными, например, антитела, содержащие только один антигенсвязывающий домен, который связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), который образует пару со вторым антигенсвязывающим доменом, который не связывается с антигеном, экспрессируемым иммунной клеткой человека (т.е., антитело содержит два антигенсвязывающих домена, но только один антигенсвязывающий домен связывается с ОХ40).In a specific aspect, provided herein are antagonistic antibodies that immunospecifically bind to OX40 (eg, human OX40). Activation of OX40 signaling depends on receptor clustering to form higher order receptor complexes that effectively recruit apical adapter proteins to regulate intracellular signaling. Without being bound by theory, an OX40 agonistic antibody may mediate receptor clustering via bivalent antibody arms (i.e., two antibody arms that each bind an OX40 antigen) and/or by simultaneously engaging the Fc-Fc receptor (FcR) on antigen presenting myeloid or lymphoid cells. Accordingly, one approach to developing an OX40 antagonist antibody is to select an antibody that competes with an OX40 ligand (OX40L) for binding to OX40, attenuating or eliminating the binding of the Fc region of the antibody to Fc receptors, and/or using a monovalent antibody format. The monovalent antibody format may include antibodies that are structurally monovalent, such as, but not limited to, antibodies to OX40 containing only one antigen binding domain (e.g., only one Fab fragment), or antibodies containing only one antigen binding domain that binds to OX40 (e.g., OX40 human) that pairs with a heavy chain or that pairs with a fragment of a heavy chain (eg, an Fc fragment). The monovalent antibody format may also include antibodies that are functionally monovalent, for example, antibodies containing only one antigen binding domain that binds to OX40 (e.g., human OX40), which pairs with a second antigen binding domain that does not bind to an antigen expressed by the immune system. human cell (ie, the antibody contains two antigen-binding domains, but only one antigen-binding domain binds to OX40).
Примеры мутаций в Fc-области константного домена IgG, которые могут приводить к ослаблению связывания Fc-рецептора или в результате которых могут удаляться потенциальные сайты гликозилирования, описаны выше. В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P и их комбинации. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой N297A, N297Q, D265A или их комбинацию. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой C127S. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой S228P. В одномExamples of mutations in the Fc region of the IgG constant domain that may result in decreased Fc receptor binding or which may remove potential glycosylation sites are described above. In certain embodiments, the heavy chain constant region of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P, and combinations thereof. In certain embodiments, the mutation is N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the mutation is C127S. In certain embodiments, the mutation is S228P. In one
- 63 046360 варианте осуществления константная область тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В определенных вариантах осуществления иммуноглобулины представляют собой иммуноглобулины человека. Иммуноглобулины человека, содержащие мутации (например, замены), также обозначаются в данном документе как иммуноглобулины человека. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A или их комбинации. В одном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина IgG1, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина IgG2, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG2 содержит мутацию C127S. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина IgG4, где аминокислотная последовательность константной области тяжелой цепи IgG4 содержит мутацию S228P. В определенных вариантах осуществления антитело является антагонистическим.- 63 046360 embodiment, the heavy chain constant region of an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In certain embodiments, the heavy chain constant region is selected from the group consisting of immunoglobulins IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1, and IgA2 . In certain embodiments, the immunoglobulins are human immunoglobulins. Human immunoglobulins containing mutations (eg, substitutions) are also referred to herein as human immunoglobulins. In a specific aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises an IgG1 immunoglobulin heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG1 heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q , D265A or combinations thereof. In one aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises an IgG1 immunoglobulin heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG1 heavy chain constant region contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A and their combinations. In a particular aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) comprises an IgG 2 heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG 2 heavy chain constant region contains a C127S mutation. In a particular aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) comprises an IgG 4 heavy chain constant region, wherein the amino acid sequence of the IgG 4 heavy chain constant region contains the S228P mutation. In certain embodiments, the antibody is antagonistic.
В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), выбрано из группы, состоящей из Fab-, Fab'-, F(ab')2- и scFv-фрагмента, где Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFv фрагмент содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающего домена антитела к ОХ40 или антитела, описанного в данном документе. Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFvфрагмент может быть получен с помощью любой методики, известной специалистам в данной области техники, в том числе без ограничения методики, рассматриваемой в разделе 5.3 ниже. В определенных вариантах осуществления Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFv-фрагмент дополнительно содержит компонент, который увеличивает время полужизни антитела in vivo. Этот компонент также называется увеличивающим время полужизни компонентом. Может быть использован любой компонент для увеличения времени полужизни Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFv-фрагмента in vivo, известный специалистам в данной области техники. Например, увеличивающий время полужизни компонент может включать Fc-область, полимер, альбумин или альбуминсвязывающий белок или соединение. Полимер может включать встречающийся в природе или синтетический, необязательно замещенный полиалкилен, полиалкенилен, полиоксиалкилен, полисахарид, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт, метоксиполиэтиленгликоль, лактозу, амилозу, декстран, гликоген с прямой или разветвленной цепью или их производное. Заместители могут включать одну или несколько гидроксильных, метальных или метоксигрупп. В определенных вариантах осуществления Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFv-фрагмент может быть модифицирован путем добавления одной или нескольких С-концевых аминокислот для возможности присоединения увеличивающего время полужизни компонента. В определенных вариантах осуществления увеличивающий время полужизни компонент представляет собой полиэтиленгликоль или сывороточный альбумин человека. В определенных вариантах осуществления Fab-, Fab'-, F(ab')2- или scFvфрагмент слит с Fc-областью. В определенных вариантах осуществления антитело является антагонистическим. В конкретном аспекте антитело, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит одну тяжелую цепь и одну легкую цепь (т.е., антитело не содержит какойлибо дополнительной тяжелой цепи или легкой цепи и содержит, состоит из или состоит главным образом из одной пары тяжелая цепь-легкая цепь), где тяжелая цепь и легкая цепь содержат соответственно последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи антигенсвязывающего домена антитела к ОХ40 или антитела, описанного в данном документе. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P и их комбинации. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой N297A, N297Q, D265A или их комбинацию. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой C127S. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой S228P. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь выбрана из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В определенных вариантах осуществления иммуноглобулины представляют собой иммуноглобулины человека. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь IgG1, содержащую мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A или их комбинации. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжеIn a specific aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) is selected from the group consisting of Fab-, Fab'-, F(ab') 2 - and scFv fragment, where Fab- The Fab'-, F(ab') 2 - or scFv fragment contains the heavy chain variable region sequence and the light chain variable region sequence of the antigen binding domain of an anti-OX40 antibody or an antibody described herein. The Fab-, Fab'-, F(ab') 2 - or scFv fragment can be obtained using any technique known to those skilled in the art, including without limitation the technique discussed in section 5.3 below. In certain embodiments, the Fab, Fab', F(ab') 2 or scFv fragment further comprises a component that increases the half-life of the antibody in vivo. This component is also called a half-life extending component. Any component known to those skilled in the art to increase the half-life of a Fab, Fab', F(ab') 2 or scFv fragment in vivo can be used. For example, the half-life increasing component may include an Fc region, a polymer, albumin, or an albumin-binding protein or compound. The polymer may include naturally occurring or synthetic, optionally substituted polyalkylene, polyalkenylene, polyoxyalkylene, polysaccharide, polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyvinyl alcohol, methoxy polyethylene glycol, lactose, amylose, dextran, straight or branched chain glycogen, or a derivative thereof. Substituents may include one or more hydroxyl, methyl or methoxy groups. In certain embodiments, a Fab, Fab', F(ab') 2 or scFv fragment may be modified by the addition of one or more C-terminal amino acids to allow attachment of a half-life increasing component. In certain embodiments, the half-life increasing component is polyethylene glycol or human serum albumin. In certain embodiments, the Fab, Fab', F(ab')2, or scFv fragment is fused to the Fc region. In certain embodiments, the antibody is antagonistic. In a particular aspect, an antibody that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains one heavy chain and one light chain (i.e., the antibody does not contain any additional heavy chain or light chain and contains, consists of, or consists primarily of of a single heavy chain-light chain pair), wherein the heavy chain and the light chain comprise, respectively, a heavy chain variable region sequence and a light chain variable region sequence of an antigen binding domain of an anti-OX40 antibody or an antibody described herein. In certain embodiments, the heavy chain contains a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P, and combinations thereof. In certain embodiments, the mutation is N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the mutation is C127S. In certain embodiments, the mutation is S228P. In certain embodiments, the heavy chain contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In certain embodiments, the heavy chain is selected from the group consisting of immunoglobulins IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgA1 and IgA2. In certain embodiments, the immunoglobulins are human immunoglobulins. In certain embodiments, the heavy chain is an IgG1 heavy chain containing a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the heavy chain is heavier
- 64 046360 лую цепь IgG2, содержащую мутацию C127S. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь IgG4, содержащую мутацию S228P. В определенных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь IgGi, содержащую мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления антитело является антагонистическим.- 64 046360 IgG2 low chain containing the C127S mutation. In certain embodiments, the heavy chain is an IgG 4 heavy chain containing the S228P mutation. In certain embodiments, the heavy chain is an IgGi heavy chain containing a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In certain embodiments, the antibody is antagonistic.
В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывается с ОХ40, описанным в данном документе, и второй антигенсвязывающий домен, которые не связывается специфически с антигеном, экспрессируемым иммунной клеткой человека (т.е., второй антигенсвязывающий домен не связывается с ОХ40 или любым другим антигеном, экспрессируемым иммунной клеткой человека), как описано в данном документе. В определенных вариантах осуществления первый и второй антигенсвязывающие домены содержат комплементарные СНЗ-домены. Например, комплементарные СН3-домены способствуют тому, чтобы между тяжелой цепью первого антигенсвязывающего домена и тяжелой цепью второго антигенсвязывающего домена происходила гетеродимеризация, а не гомодимеризация соответствующих антигенсвязывающих доменов. Любая методика, известная специалистам в данной области техники, может быть использована для получения комплементарных СНЗ-доменов, в том числе без ограничения технология выступ во впадине, как описано в Ridgway JBB et al., (1996) Protein Eng 9(7): 617-621 и Merchant M et al. Например, согласно технологии выступ во впадине небольшая аминокислота замещается более крупной аминокислотой (т.е., выступ) в первом СНЗдомене и крупная аминокислота замещается меньшей аминокислотой (т.е., впадина) во втором СНЗдомене. Полипептиды, содержащие СНЗ-домены, затем могут димеризоваться на основании взаимодействия выступа и впадины. В определенных вариантах осуществления один из антигенсвязывающих доменов содержит первый СНЗ-домен IgG1, содержащий замену, выбранную из группы, состоящей из T366Y и T366W, и другой антигенсвязывающий домен содержит второй СНЗ-домен IgG1, содержащий замену, выбранную из группы, состоящей из Y407T, T366S, L368A и Y407V. В определенных вариантах осуществления антиген, с которым связывается второй антигенсвязывающий домен, не экспрессируется в естественных условиях иммунной клеткой человека. В определенных вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки (например, CD4+ Т-клетки или CD8+ Тклетки), В-клетки, клетки-естественного киллера, дендритной клетки, макрофага и эозинофила. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40, содержит первую VH и первую VL, и второй антигенсвязывающий домен содержит вторую VH и вторую VL. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40, содержит первую тяжелую цепь и первую легкую цепь, и второй антигенсвязывающий домен содержит вторую тяжелую цепь и вторую легкую цепь. В определенных вариантах осуществления антитело предназначено для введения в образец или субъекту, у которого второй антигенсвязывающий домен является неактивным (т.е., антиген, с которым связывается второй антигенсвязывающий домен, не присутствует в образце или у субъекта). В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен не связывается специфически с антигеном на клетке, экспрессирующей ОХ40 (например, второй антигенсвязывающий домен не связывается с антигеном, который в естественных условиях экспрессируется клеткой, которая экспрессирует ОХ40). В определенных вариантах осуществления антитело функционирует в виде моновалентного антитела (т.е., моновалентного антитела к ОХ40) в образце или у субъекта, где первый антигенсвязывающий домен антитела связывается с ОХ40, в то время как второй антигенсвязывающий домен является неактивным в образце или у субъекта (например, в связи с отсутствием антигена, с которым связывается второй антигенсвязывающий домен в образце или у субъекта). В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с антигеном, не являющимся человеческим (т.е., антигеном, экспрессируемым у других организмов, а не у человека). В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с вирусным антигеном. В определенных вариантах осуществления вирусный антиген происходит из вируса, который не инфицирует человека (т.е., не поражающего человека вируса). В определенных вариантах осуществления вирусный антиген отсутствует в иммунной клетке человека (например, иммунная клетка человека не инфицирована вирусом, ассоциированным с вирусным антигеном). В определенных вариантах осуществления вирусный антиген представляет собой антиген HIV. В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с альбумином курицы или лизоцимом куриного яйца. В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с антигеном, который не экспрессируется клетками дикого типа (например, человеческими клетками дикого типа) (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с опухоль-ассоциированным антигеном, который не экспрессируется нормальными клетками (например, клетками дикого типа, например, человеческими клетками дикого типа) (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления опухоль-ассоциированный антиген не экспрессируется клетками человека (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи второго антигенсвязывающего домена содержит мутацию, выбранную из группы,In a specific aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a first antigen binding domain that binds to the OX40 described herein and a second antigen binding domain that does not bind specifically to an antigen expressed by a human immune cell (ie, the second antigen binding domain does not bind OX40 or any other antigen expressed by a human immune cell) as described herein. In certain embodiments, the first and second antigen binding domains contain complementary CH3 domains. For example, complementary CH3 domains cause heterodimerization rather than homodimerization of the respective antigen binding domains to occur between the heavy chain of the first antigen binding domain and the heavy chain of the second antigen binding domain. Any technique known to those skilled in the art can be used to produce complementary CH3 domains, including, without limitation, the ridge-in-hole technique as described in Ridgway JBB et al., (1996) Protein Eng 9(7): 617 -621 and Merchant M et al. For example, in the knob-in-gap technology, a small amino acid is replaced by a larger amino acid (ie, a knob) in the first CH3 domain, and a large amino acid is replaced by a smaller amino acid (ie, a hole) in a second CH3 domain. Polypeptides containing CH3 domains can then dimerize based on knob-groove interactions. In certain embodiments, one of the antigen binding domains comprises a first IgG 1 CH3 domain containing a substitution selected from the group consisting of T366Y and T366W, and the other antigen binding domain comprises a second IgG 1 CHC domain containing a substitution selected from the group consisting of Y407T, T366S, L368A and Y407V. In certain embodiments, the antigen to which the second antigen-binding domain binds is not naturally expressed by a human immune cell. In certain embodiments, the immune cell is selected from the group consisting of a T cell (eg, CD4+ T cells or CD8+ T cells), a B cell, a natural killer cell, a dendritic cell, a macrophage, and an eosinophil. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 comprises a first VH and a first VL, and a second antigen binding domain comprises a second VH and a second VL. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 comprises a first heavy chain and a first light chain, and a second antigen binding domain comprises a second heavy chain and a second light chain. In certain embodiments, the antibody is for administration to a sample or subject in which the second antigen binding domain is inactive (ie, the antigen to which the second antigen binding domain binds is not present in the sample or subject). In certain embodiments, the second antigen binding domain does not specifically bind to an antigen on a cell that expresses OX40 (eg, the second antigen binding domain does not bind to an antigen that is naturally expressed by a cell that expresses OX40). In certain embodiments, the antibody functions as a monovalent antibody (i.e., a monovalent anti-OX40 antibody) in a sample or subject, wherein the first antigen binding domain of the antibody binds to OX40 while the second antigen binding domain is inactive in the sample or subject (eg, due to the absence of an antigen to which the second antigen binding domain binds in the sample or subject). In certain embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to a non-human antigen (ie, an antigen expressed in organisms other than humans). In certain embodiments, the second antigen-binding domain specifically binds to a viral antigen. In certain embodiments, the viral antigen is derived from a virus that does not infect humans (ie, a non-human virus). In certain embodiments, the viral antigen is not present in the human immune cell (eg, the human immune cell is not infected with a virus associated with the viral antigen). In certain embodiments, the viral antigen is an HIV antigen. In certain embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to chicken albumin or chicken egg lysozyme. In certain embodiments, the second antigen binding domain specifically binds to an antigen that is not expressed by (eg, wild-type human cells) (ie, absent from them). In certain embodiments, the second antigen-binding domain specifically binds to a tumor-associated antigen that is not expressed by (eg, wild-type, human, wild-type) cells. In certain embodiments, the tumor-associated antigen is not expressed by (ie, absent from) human cells. In certain embodiments, the heavy chain constant region of the second antigen binding domain contains a mutation selected from the group,
- 65 046360 состоящей из N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P и их комбинации. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой N297A, N297Q, D265A или их комбинацию. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой C127S. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой S228P. В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи второго антигенсвязывающего домена содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления константная область тяжелой цепи первого и второго антигенсвязывающих доменов выбрана из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В определенных вариантах осуществления иммуноглобулины представляют собой иммуноглобулины человека. В определенных вариантах осуществления константные области тяжелой цепи первого и второго антигенсвязывающих доменов представляют собой один и тот же изотип. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит константную область первой тяжелой цепи IgG1 и второй антигенсвязывающий домен содержит константную область второй тяжелой цепи IgG1, где константные области первой и второй тяжелых цепей содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A или их комбинации. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит константную область первой тяжелой цепи IgG1 и второй антигенсвязывающий домен содержит константную область второй тяжелой цепи IgG1, где константные области первой и второй тяжелых цепей содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А или их комбинации. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит константную область первой тяжелой цепи IgG2 и второй антигенсвязывающий домен содержит константную область второй тяжелой цепи IgG2, где константные области первой и второй тяжелых цепей содержат мутацию C127S. В определенных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен содержит константную область первой тяжелой цепи IgG4 и второй антигенсвязывающий домен содержит константную область второй тяжелой цепи IgG4, где константные области первой и второй тяжелых цепей содержат мутацию S228P. В определенных вариантах осуществления антитело является антагонистическим. В конкретном аспекте антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40, содержащий первую тяжелую цепь и первую легкую цепь; и вторую тяжелую цепь или ее фрагмент. В определенных вариантах осуществления первая и вторая тяжелая цепь или фрагмент второй тяжелой цепи содержат комплементарные СН3-домены. Например, комплементарные СН3домены способствуют тому, чтобы между тяжелыми цепями происходила гетеродимеризация, а не гомодимеризация соответствующих тяжелых цепей. В определенных вариантах осуществления одна из тяжелых цепей содержит первый СН3-домен IgG1, содержащий замену, выбранную из группы, состоящей из T366Y и T366W, и другая тяжелая цепь содержит второй СН3-домен IgG1, содержащий замену, выбранную из группы, состоящей из Y407T, T366S, L368A, Y407V. В некоторых вариантах осуществления фрагмент второй тяжелой цепи представляет собой Fc-фрагмент. В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент происходят из антигенсвязывающего домена, который специфически связывается с антигеном, не являющимся человеческим (т.е., антигеном, экспрессируемым у других организмов, а не у человека). В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент происходят из антигенсвязывающего домена, который специфически связывается с вирусным антигеном. В определенных вариантах осуществления вирусный антиген отсутствует в иммунной клетке человека (например, иммунная клетка человека не инфицирована вирусом, ассоциированным с вирусным антигеном). В определенных вариантах осуществления вирусный антиген представляет собой антиген HIV. В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент происходят из антигенсвязывающего домена, который специфически связывается с альбумином курицы или лизоцимом куриного яйца. В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент происходят из антигенсвязывающего домена, который специфически связывается с антигеном, который не экспрессируется клетками дикого типа (например, человеческими клетками дикого типа) (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент происходят из антигенсвязывающего домена, который специфически связывается с опухоль-ассоциированным антигеном, который не экспрессируется нормальными клетками (например, клетками дикого типа, например, человеческими клетками дикого типа) (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления опухоль-ассоциированный антиген не экспрессируется клетками человека (т.е., отсутствует у них). В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент содержат мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P и их комбинации. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой N297A, N297Q, D265A или их комбинацию. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой C127S. В определенных вариантах осуществления мутация представляет собой S228P. В определенных вариантах осуществления вторая тяжелая цепь или ее фрагмент содержат мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей выбраны из группы, состоящей из иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В определенных вариантах осуществления иммуноглобулины представляют собой иммуног- 65 046360 consisting of N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P and their combinations. In certain embodiments, the mutation is N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the mutation is C127S. In certain embodiments, the mutation is S228P. In certain embodiments, the heavy chain constant region of the second antigen binding domain contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In certain embodiments, the heavy chain constant region of the first and second antigen binding domains is selected from the group consisting of the immunoglobulins IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG4, IgA1 and IgA 2 . In certain embodiments, the immunoglobulins are human immunoglobulins. In certain embodiments, the heavy chain constant regions of the first and second antigen binding domains are the same isotype. In certain embodiments, the first antigen binding domain comprises a first IgG1 heavy chain constant region and the second antigen binding domain comprises a second IgG1 heavy chain constant region, wherein the first and second heavy chain constant regions contain an identical mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, or their combinations. In certain embodiments, the first antigen binding domain comprises a first IgG 1 heavy chain constant region and the second antigen binding domain comprises a second IgG 1 heavy chain constant region, wherein the first and second heavy chain constant regions contain an identical mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, or their combinations. In certain embodiments, the first antigen binding domain comprises a first IgG 2 heavy chain constant region and the second antigen binding domain comprises a second IgG 2 heavy chain constant region, wherein the first and second heavy chain constant regions contain the C127S mutation. In certain embodiments, the first antigen binding domain comprises a first IgG4 heavy chain constant region and the second antigen binding domain comprises a second IgG4 heavy chain constant region, wherein the first and second heavy chain constant regions contain the S228P mutation. In certain embodiments, the antibody is antagonistic. In a specific aspect, an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) comprises a first antigen binding domain that specifically binds to OX40, comprising a first heavy chain and a first light chain; and a second heavy chain or fragment thereof. In certain embodiments, the first and second heavy chains or a fragment of the second heavy chain contain complementary CH3 domains. For example, complementary CH3 domains promote heterodimerization between heavy chains rather than homodimerization of the corresponding heavy chains. In certain embodiments, one of the heavy chains contains a first IgG1 CH3 domain containing a substitution selected from the group consisting of T366Y and T366W, and the other heavy chain contains a second IgG1 CH3 domain containing a substitution selected from the group consisting of Y407T, T366S, L368A, Y407V. In some embodiments, the second heavy chain fragment is an Fc fragment. In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof is derived from an antigen binding domain that specifically binds to a non-human antigen (ie, an antigen expressed in organisms other than humans). In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof is derived from an antigen binding domain that specifically binds to a viral antigen. In certain embodiments, the viral antigen is not present in the human immune cell (eg, the human immune cell is not infected with a virus associated with the viral antigen). In certain embodiments, the viral antigen is an HIV antigen. In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof is derived from an antigen binding domain that specifically binds to chicken albumin or chicken egg lysozyme. In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof is derived from an antigen-binding domain that specifically binds to an antigen that is not expressed by (eg, wild-type human cells) (ie, absent from them). In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof is derived from an antigen-binding domain that specifically binds to a tumor-associated antigen that is not expressed by normal cells (e.g., wild-type cells, e.g., wild-type human cells) (i.e., is absent at them). In certain embodiments, the tumor-associated antigen is not expressed by (ie, absent from) human cells. In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof comprises a mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, C127S, S228P, and combinations thereof. In certain embodiments, the mutation is N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the mutation is C127S. In certain embodiments, the mutation is S228P. In certain embodiments, the second heavy chain or fragment thereof comprises a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are selected from the group consisting of immunoglobulins IgG1, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA1 and IgA2 . In certain embodiments, the immunoglobulins are immunoglobulins
- 66 046360 лобулины человека. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей представляют собой один и тот же изотип. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей представляют собой константные области IgG1 и содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из N297A, N297Q, D265A или их комбинации. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей представляют собой константные области IgG| и содержат идентичную мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей представляют собой константные области тяжелой цепи IgG2 и содержат мутацию C127S. В определенных вариантах осуществления константные области первой и второй тяжелых цепей представляют собой константные области тяжелой цепи IgG4 и содержат мутацию S228P. В определенных вариантах осуществления антитело является антагонистическим.- 66 046360 human lobulins. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are the same isotype. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are IgG 1 constant regions and contain an identical mutation selected from the group consisting of N297A, N297Q, D265A, or a combination thereof. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are IgG constant regions | and contain an identical mutation selected from the group consisting of D265A, P329A and combinations thereof. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are IgG 2 heavy chain constant regions and contain the C127S mutation. In certain embodiments, the first and second heavy chain constant regions are IgG4 heavy chain constant regions and contain the S228P mutation. In certain embodiments, the antibody is antagonistic.
В вышеуказанных аспектах, относящихся к антителу, содержащему антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), и либо второй антигенсвязывающий фрагмент, либо вторую тяжелую цепь или ее фрагмент, антигенсвязывающий домен может содержать любую из последовательностей, связывающихся с ОХ40, описанных в данном документе. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 человека (например, ОХ40 человека), содержит (а) первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий определяющую комплементарность область (CDR) 1 VH, содержащую аминокислотную последовательность GSAMH (SEQ ID NO: 4); VH-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); и VH-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); и (b) первый вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий VL-CDR1, содержащую аминокислотную последовательность RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VL-CDR2, содержащую аминокислотную последовательность LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); и VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), специфически связывается с тем же эпитопом ОХ40 (например, ОХ40 человека), что и антитело, содержащее VH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16, и VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуется, по сравнению со связыванием с последовательностью ОХ40 человека под SEQ ID NO: 55, пониженной способностью к связыванию с белком, идентичным последовательности под SEQ ID NO: 55, за исключением наличия аминокислотной мутации, выбранной из группы, состоящей из N60A, R62A, R80A, L88A, Р93А, Р99А, Р115А и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH и VL, где VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH и VL, где VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с ОХ40, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 16. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который связывается с ОХ40, содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность, полученную из последовательности зародышевой линии человека IGHV3-73 (например, IGHV3-73*01, например, с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 19). В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 15. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL-CDR3, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 20. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит VL, содержащий аминокислотную последовательность, полученную из последовательности зародышевой линии человека IGKV2-28 (например, IGKV2-28*01, например, с аминокислотной последовательноIn the above aspects relating to an antibody comprising an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40), and either a second antigen binding fragment or a second heavy chain or fragment thereof, the antigen binding domain may comprise any of the OX40 binding sequences, described in this document. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to human OX40 (e.g., human OX40) comprises (a) a first heavy chain variable domain (VH) containing a VH complementarity determining region (CDR) 1 containing the amino acid sequence GSAMH (SEQ ID NO: 4); VH-CDR2 containing the amino acid sequence RIRSKANSYATAYAASVKG (SEQ ID NO: 5); and VH-CDR3 containing the amino acid sequence GIYDSSGYDY (SEQ ID NO: 6); and (b) a first light chain variable domain (VL) comprising VL-CDR1 containing the amino acid sequence RSSQSLLHSNGYNYLD (SEQ ID NO: 1); VL-CDR2 containing the amino acid sequence LGSNRAS (SEQ ID NO: 2); and VL-CDR3 containing the amino acid sequence MQALQTPLT (SEQ ID NO: 3). In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) specifically binds to the same epitope of OX40 (e.g., human OX40) as an antibody comprising a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. and VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) has, relative to the human OX40 sequence of SEQ ID NO: 55, reduced binding the ability to bind to a protein identical to the sequence under SEQ ID NO: 55, except for the presence of an amino acid mutation selected from the group consisting of N60A, R62A, R80A, L88A, P93A, P99A, P115A and combinations thereof. In some embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises VH and VL, wherein VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In some embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g. , human OX40), comprises VH and VL, wherein VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In certain embodiments, the antigen binding domain that binds to OX40 comprises a VH comprising an amino acid sequence that is at least 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16. In certain embodiments, the antigen binding domain that binds to OX40 comprises a VH containing an amino acid sequence derived from the human germline sequence IGHV3-73 (e.g., IGHV3-73*01, e.g., with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19). In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL comprising an amino acid sequence that is at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99% identical to the sequences of SEQ ID NO: 15. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a VL-CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40), comprises a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain comprising the amino acid sequence under SEQ ID NO: 20. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. In certain embodiments, an antigen binding domain that specifically binds with OX40 (e.g., human OX40), contains a VL containing an amino acid sequence derived from the human germline sequence IGKV2-28 (e.g., IGKV2-28*01, e.g., with the amino acid sequence
- 67 046360 стью под SEQ ID NO: 18). В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит последовательности VH и VL, изложенные в SEQ ID NO: 16 и 15 соответственно. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 21. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутации N297A, N297Q, D265A или их комбинации. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из D265A, Р329А и их комбинации.- 67 046360 under SEQ ID NO: 18). In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) comprises the VH and VL sequences set forth in SEQ ID NOs: 16 and 15, respectively. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) comprises a heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40 ), contains a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) contains a mutation selected from the group consisting of the N297A, N297Q, D265A mutation or combinations thereof. In certain embodiments, the antigen binding domain that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) contains a mutation selected from the group consisting of D265A, P329A, and combinations thereof.
В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, является антагонистическим по отношению к ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления антитело прекращает, снижает или ингибирует активность ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления антитело ингибирует или ослабляет связывание ОХ40 (например, ОХ40 человека) с лигандом ОХ40 (например, лигандом ОХ40 человека).In certain embodiments, the antagonist antibody described herein is antagonistic to OX40 (eg, human OX40). In certain embodiments, the antibody stops, reduces, or inhibits the activity of OX40 (eg, human OX40). In certain embodiments, the antibody inhibits or reduces the binding of OX40 (eg, human OX40) to an OX40 ligand (eg, human OX40 ligand).
В определенных вариантах осуществления антитело ингибирует или ослабляет передачу сигнала с участием ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления антитело ингибирует или ослабляет активность ОХ40 (например, ОХ40 человека) (например, передачу сигнала с участием ОХ40), индуцированную лигандом ОХ40 (например, лигандом ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, ингибирует или снижает пролиферацию Т-клеток. В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, ингибирует или снижает пролиферацию Т-клеток. В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, ингибирует или снижает продукцию цитокинов (например, ингибирует или снижает продукцию IL-2, TNFa, IFNy, IL-4, IL-10, IL-13 или их комбинацию стимулированными Т-клетками). В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, ингибирует или снижает продукцию IL-2 стимулированными SEA Т-клетками. В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, блокирует взаимодействие ОХ40 и OX40L (например, блокирует связывание OX40L и ОХ40 друг с другом, например, блокирует связывание лиганда ОХ40 человека и ОХ40 человека)).In certain embodiments, the antibody inhibits or attenuates signaling involving OX40 (eg, human OX40). In certain embodiments, the antibody inhibits or attenuates OX40 (eg, human OX40) activity (eg, OX40 signaling) induced by an OX40 ligand (eg, human OX40 ligand). In certain embodiments, an antagonist antibody described herein inhibits or reduces the proliferation of T cells. In certain embodiments, an antagonist antibody described herein inhibits or reduces the proliferation of T cells. In certain embodiments, an antagonist antibody described herein inhibits or reduces the production of cytokines (e.g., inhibits or reduces the production of IL-2, TNFa, IFNy, IL-4, IL-10, IL-13, or a combination thereof by stimulated T cells ). In certain embodiments, an antagonist antibody described herein inhibits or reduces the production of IL-2 by SEA-stimulated T cells. In certain embodiments, an antagonist antibody described herein blocks the interaction of OX40 and OX40L (eg, blocks OX40L and OX40 from binding to each other, eg, blocks human OX40 ligand binding to human OX40)).
В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), снижает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе и/или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), снижает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека) на по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе и/или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). Неограничивающие примеры активности ОХ40 (например, ОХ40 человека) могут включать передачу сигнала с участием ОХ40 (например, ОХ40 человека), клеточную пролиферацию, выживаемость клеток и продукцию цитокинов (например, IL-2, TNF-a, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13). В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), ингибирует, снижает или прекращает активность ОХ40 (например, ОХ40 человека). В конкретных вариантах осуществления активность ОХ40 оценивают, как описано в примерах ниже.In certain embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) reduces the activity of OX40 (e.g., human OX40) by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1. 4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times, as assessed by methods described herein and/or known to one skilled in the art, compared to the activity of OX40 (eg, human OX40) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In certain embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) reduces the activity of OX40 (e.g., human OX40) by at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99%, that is assessed using methods described herein and/or known to one skilled in the art, compared to the activity of OX40 (e.g., human OX40) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (e.g., an antibody that does not bind immunospecifically with OX40). Non-limiting examples of OX40 (e.g., human OX40) activity may include OX40 (e.g., human OX40) signaling, cell proliferation, cell survival, and cytokine production (e.g., IL-2, TNF-a, IFN-γ, IL-4 , IL-10 and/or IL-13). In certain embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) inhibits, reduces, or abolishes the activity of OX40 (eg, human OX40). In specific embodiments, OX40 activity is assessed as described in the examples below.
В определенных аспектах антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), ингибирует, снижает или прекращает клеточную пролиферацию клеток, которые экспрессируют ОХ40 и которые реагируют на передачу сигнала с участием ОХ40 (например, клетки, которые пролиферируют в ответ на стимуляцию ОХ40 и передачу сигнала с участием ОХ40, такие как Т-клетки). Анализы клеточной пролиферации описаны в данной области техники, как, например, анализ с включением 3Н-тимидина, анализ с включением BrdU или анализ с использованием CFSE, как, например, описанный в примерах ниже, и могут быть легкоIn certain aspects, an antagonistic antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) inhibits, reduces, or abolishes cellular proliferation of cells that express OX40 and that respond to OX40-mediated signaling (e.g., cells that proliferate in response to OX40 stimulation and OX40 signaling, such as T cells). Cell proliferation assays are described in the art, such as the 3 H-thymidine assay, the BrdU assay, or the CFSE assay, such as those described in the examples below, and can be easily
- 68 046360 осуществимы специалистом в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются сниженной клеточной пролиферацией по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Тклеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, таким как фитогемагглютинин (РНА) и/или форболмиристатацетат (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28.- 68 046360 can be carried out by a person skilled in the art. In specific embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or stimulating TCR-complex antibodies, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), are characterized by reduced cell proliferation compared to T cells stimulated alone A cell mitogen or a T cell receptor complex stimulating agent, such as phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody.
В определенных аспектах антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), снижает выживаемость клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки). В конкретном варианте осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются сниженной выживаемостью по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном. Анализы выживаемости клеток описаны в уровне техники (например, анализ с исключением окрашивания трипановым синим) и могут быть легко осуществимы специалистом в данной области техники.In certain aspects, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40) reduces the survival of cells (eg, T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells). In a specific embodiment, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or stimulating TCR complex antibodies, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) have reduced survival compared to T cells stimulated with T alone -cellular mitogen. Cell survival assays are described in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay) and can be easily performed by one skilled in the art.
В конкретных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает снижение выживаемости клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает снижение выживаемости клеток (например, Т-клеток, таких как CD4 и CD8 эффекторные Т-клетки) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим), по сравнению с активностью ОХ40 (например, ОХ40 человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).In specific embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides a reduction in cell survival (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) by at least about 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times, as assessed by the methods described in herein or known to one skilled in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In specific embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides a reduction in cell survival (e.g., T cells, such as CD4 and CD8 effector T cells) by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 98%, or 99%, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., trypan blue stain exclusion assay), compared to OX40 activity (e.g., OX40 human) in the absence of any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40).
В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4' или CD8' эффекторные Тклетки), стимулированные Т-клеточным митогеном (например, антителом к CD3 или форболовым эфиром) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной выживаемостью, повышенной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Тклеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCRкомплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются клеточной выживаемостью, сниженной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа с исключением окрашивания трипановым синим).In some embodiments, T cells (e.g., CD4' or CD8' effector T cells) stimulated with a T cell mitogen (e.g., anti-CD3 antibody or phorbol ester) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 ( e.g. human OX40) have cell survival increased by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times compared to T cells stimulated with a T cell mitogen alone or a T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as anti-CD3 and anti-CD28), which are assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (eg, trypan blue stain exclusion assay). In some embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or stimulating A TCR complex antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), exhibits cellular survival reduced by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 98%, or 99% compared to T cells stimulated with T cell mitogen alone, as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., trypan blue stain exclusion assay) .
В определенных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном докуIn certain embodiments, an antagonist antibody described herein
- 69 046360 менте, которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), не обеспечивает защиту эффекторных Т-клеток (например, CD4+ и CD8+ эффекторных Т-клеток) от индуцированной активацией клеточной гибели. В конкретных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), ингибирует, снижает или прекращает продукцию цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13) на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией цитокинов в присутствии или в отсутствии стимуляции OX40L (например, OX40L человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40). В конкретных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), ингибирует или снижает продукцию цитокинов (например, IL-2, TNFα, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией цитокинов в присутствии или в отсутствии стимуляции OX40L (например, OX40L человека) без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).- 69 046360 agent that specifically binds to OX40 (eg, human OX40) does not protect effector T cells (eg, CD4+ and CD8+ effector T cells) from activation-induced cell death. In specific embodiments, an antagonistic antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) inhibits, reduces, or abolishes the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99%, as assessed using the methods described herein (see examples below) or known to one skilled in the art technique, compared with cytokine production in the presence or absence of OX40L stimulation (eg, human OX40L) without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40). In specific embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) inhibits or reduces the production of cytokines (e.g., IL-2, TNFα, IFN-γ, IL-4, IL-10, and /or IL-13) by at least about 1.2 times, 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times, as assessed using the methods described herein (see examples below, such as Example 2) or known to one skilled in the art, compared to cytokine production in the presence or absence of OX40L stimulation (e.g., human OX40L) without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40).
В определенных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Тклетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13), сниженной на по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, способа ELISA или как описано в примерах ниже). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4 или CD8 эффекторные Т-клетки), стимулированные Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией цитокинов (например, IL-2, TNF-α, IFNγ, IL-4, IL-10 и/или IL-13), сниженной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, по сравнению с Т-клетками, стимулированными только Т-клеточным митогеном или средством, стимулирующим Т-клеточный рецепторный комплекс, (например, фитогемагглютинином (РНА) и/или форболмиристатацетатом (РМА), или стимулирующим TCR-комплекс антителом, таким как антитело к CD3 и антитело к CD28), что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, способа ELISA или как описано в примерах ниже).In certain embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or TCR-stimulating agent complex with an antibody, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), are characterized by the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α, IFN -γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) reduced by at least about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%, compared to T cells stimulated with T cell mitogen alone or a T cell receptor complex stimulating agent (eg, phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex stimulating antibody such as anti-CD3 and anti-CD28), as assessed by the methods described herein or known to one skilled in the art (eg, ELISA methods or as described in the examples below). In some embodiments, T cells (e.g., CD4 or CD8 effector T cells) stimulated with a T cell mitogen or T cell receptor complex stimulating agent (e.g., phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or stimulating A TCR complex antibody, such as anti-CD3 and anti-CD28) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), is characterized by the production of cytokines (e.g., IL-2, TNF-α , IFNγ, IL-4, IL-10 and/or IL-13) reduced by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times . (PMA), or TCR complex stimulating antibody, such as anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody), as assessed using methods described herein or known to one skilled in the art (e.g., ELISA method or as described in the examples below ).
В конкретных вариантах осуществления антагонистическое антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), обеспечивает снижение продуцирования IL-2 в ответ на стимуляцию стафилококковым энтеротоксином A (SEA) по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе (см. примеры ниже, такие как пример 2) или известных специалисту в данной области техники, по сравнению с продукцией IL-2 без какого-либо антитела или в присутствии неродственного антитела (например, антитела, которое не связывается иммуноспецифично с ОХ40).In specific embodiments, an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) provides at least about a 1.2-fold reduction in IL-2 production in response to staphylococcal enterotoxin A (SEA) stimulation. 1.3 times, 1.4 times, 1.5 times, 2 times, 2.5 times, 3 times, 3.5 times, 4 times, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times , 9 times, 10 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times, or 100 times, as assessed using the methods described herein (see examples below, such as example 2) or known to one skilled in the art, compared to IL-2 production without any antibody or in the presence of an unrelated antibody (eg, an antibody that does not immunospecifically bind to OX40).
В определенных вариантах осуществления Т-клетки (например, CD4' или CD8' Т-клетки), стимулированные стафилококковым энтеротоксином A (SEA) в присутствии антагонистического антитела, описанного в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), характеризуются продукцией IL-2, сниженной по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, 1,3 раза, 1,4 раза, 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10In certain embodiments, T cells (e.g., CD4' or CD8' T cells) stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA) in the presence of an antagonist antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) are characterized by IL-2 production reduced by at least about 1.2-fold, 1.3-fold, 1.4-fold, 1.5-fold, 2-fold, 2.5-fold, 3-fold, 3.5-fold, 4-fold, 4.5 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10
- 70 046360 раз, 15 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или 100 раз по сравнению с Тклетками, стимулированными только SEA, что оценивают с помощью способов, описанных в данном документе или известных специалисту в данной области техники (например, анализа ELISA или как описано в примерах ниже). Антитело к ОХ40 может быть слитым или конъюгированным (например, ковалентно или нековалентно связанным) с выявляемой меткой или веществом. Примеры выявляемых меток или веществ включают ферментные метки, такие как глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (125I, 121I), углерод (14С), сера (35S), тритий (3Н), индий (121In) и технеций (99Тс); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин, родамин и биотин. Такие меченые антитела могут быть использованы для выявления белка ОХ40 (например, ОХ40 человека). См., например, раздел 5.5.2 ниже.- 70 046360 times, 15 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times, 60 times, 70 times, 80 times, 90 times or 100 times compared to T cells stimulated with SEA alone, as assessed using the methods described herein or known to one skilled in the art (eg, ELISA assay or as described in the examples below). The anti-OX40 antibody may be fused or conjugated (eg, covalently or non-covalently linked) to a detectable label or substance. Examples of detectable tags or substances include enzyme tags such as glucose oxidase; radioisotopes such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 121 In) and technetium ( 99 Tc); luminescent tags such as luminol; and fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine and biotin. Such labeled antibodies can be used to detect OX40 protein (eg, human OX40). See for example section 5.5.2 below.
5.3 Получение антител5.3 Obtaining antibodies
Антитела, которые иммуноспецифично связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека) могут быть получены с помощью любого известного в данной области техники способа синтеза антител, например, химического синтеза или с помощью методик рекомбинантной экспрессии. В способах, описанных в данном документе, применяются, если не указано иное, стандартные методики молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПЦР, олигонуклеотидного синтеза и модификации, гибридизации нуклеиновых кислот и смежных областей, которые находятся в пределах компетентности специалиста в данной области. Эти методики описаны, например, в источниках литературы, цитируемых в данном документе, и полностью изложены в литературе. См., например, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et ah, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные дополнения); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 и ежегодные дополнения) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren В et ah, (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело (например, рекомбинантное антитело), полученное, экспрессируемое, созданное или выделенное с помощью любых способов, которые включают создание, например, посредством синтеза, генной инженерии последовательностей ДНК. В определенных вариантах осуществления такое антитело содержит последовательности (например, последовательности ДНК или аминокислотные последовательности), которые не встречаются в природе в зародышевом репертуаре антител животного или млекопитающего (например, человека) in vivo. В определенном аспекте в данном документе предусмотрен способ получения антитела, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), включающий культивирование клетки или клетки-хозяина, описанных в данном документе. В определенном аспекте в данном документе предусмотрен способ получения антитела, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), включающий экспрессию (например, рекомбинантную экспрессию) антитела клеткой или клеткой-хозяином, описанными в данном документе (например, клеткой или клеткойхозяином, содержащими полинуклеиотиды, кодирующие антитело, описанное в данном документе). В конкретном варианте осуществления клетка представляет собой выделенную клетку. В конкретном варианте осуществления экзогенные полинуклеотиды были введены в клетку. В конкретном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию очистки антитела, полученного из клетки или клеткихозяина. Способы получения поликлональных антител известны в данной области техники (см., например главу 11 в Short Protocols в Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, New York).Antibodies that immunospecifically bind to OX40 (eg, human OX40) can be produced using any antibody synthesis method known in the art, such as chemical synthesis or recombinant expression techniques. The methods described herein employ, unless otherwise noted, standard techniques of molecular biology, microbiology, genetic analysis, recombinant DNA, organic chemistry, biochemistry, PCR, oligonucleotide synthesis and modification, nucleic acid hybridization and related fields that are in within the competence of a specialist in this field. These techniques are described, for example, in the literature cited herein and are fully described in the literature. See, for example, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et ah, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual additions); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual supplements) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et ah, (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. In a specific embodiment, an antibody described herein is an antibody (eg, a recombinant antibody) produced, expressed, generated, or isolated by any methods that include the creation, for example, by synthesis, of genetically engineering DNA sequences. In certain embodiments, such an antibody contains sequences (eg, DNA sequences or amino acid sequences) that do not naturally occur in the germline antibody repertoire of an animal or mammal (eg, human) in vivo. In a certain aspect, provided herein is a method of producing an antibody that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40), comprising culturing a cell or host cell described herein. In a certain aspect, provided herein is a method of producing an antibody that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), comprising expressing (e.g., recombinant expression) the antibody by a cell or host cell described herein (e.g., a cell or host cell containing polynucleotides encoding the antibody described herein). In a specific embodiment, the cell is an isolated cell. In a specific embodiment, exogenous polynucleotides have been introduced into the cell. In a specific embodiment, the method further includes the step of purifying an antibody obtained from a host cell or cell. Methods for producing polyclonal antibodies are known in the art (see, for example, Chapter 11 in Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley and Sons, New York).
Моноклональные антитела могут быть получены с помощью множества методик, известных в данной области техники, в том числе с использованием гибридомы, рекомбинантных технологий и технологий фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик с использованием гибридомы, в том числе известных в данной области техники и описанных, например, в Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). Термин моноклональное антитело, используемый в данном документе, не ограничен антителами, получаемыми с помощью гибридомной технологии. Например, моноклональные антитела могут быть получены рекомбинантным путем из клеток-хозяев, экзогенно экспрессирующих антитело, описанное в данном документе.Monoclonal antibodies can be produced using a variety of techniques known in the art, including the use of hybridoma, recombinant technologies and phage display technologies, or combinations thereof. For example, monoclonal antibodies can be produced using hybridoma techniques, including those known in the art and described, for example, in Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). The term monoclonal antibody as used herein is not limited to antibodies produced by hybridoma technology. For example, monoclonal antibodies can be produced recombinantly from host cells exogenously expressing an antibody described herein.
В конкретных вариантах осуществления моноклональное антитело, как используется в данном документе, представляет собой антитело, продуцируемое одной клеткой (например, гибридомой или клеткой-хозяином, продуцирующими рекомбинантное антитело), где антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), что определяют, например, с помощью ELISA или другого анализа на основе связывания с антигеном или анализа конкурентного связывания, известных в данной области техники или описанных в примерах, представленных в данном документе. В конкретных вариIn specific embodiments, a monoclonal antibody, as used herein, is an antibody produced by a single cell (e.g., a hybridoma or a host cell producing a recombinant antibody), wherein the antibody immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), as determined by for example, using an ELISA or other antigen binding or competitive binding assay known in the art or described in the examples presented herein. In specific variations
- 71 046360 антах осуществления моноклональное антитело может представлять собой химерное антитело или гуманизированное антитело. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой моновалентное антитело или поливалентное (например, бивалентное) антитело. В определенных вариантах осуществления моноклональное антитело может представлять собой Fab-фрагмент или F(ab')2-фрагмент. Моноклональные антитела, описанные в данном документе, например, могут быть получены с помощью способа с использованием гибридомы, как описано в Kohler G & Milstein С (1975) Nature 256: 495, или например, могут быть выделены из фаговых библиотек с помощью методик, например, описанных в данном документе. Другие способы получения клональных клеточных линий и моноклональных антител, экспрессируемых ими, хорошо известны в данной области техники (см., например, главу 11 в Short Protocols в Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., выше).- 71 046360 In this embodiment, the monoclonal antibody may be a chimeric antibody or a humanized antibody. In certain embodiments, the monoclonal antibody is a monovalent antibody or a multivalent (eg, bivalent) antibody. In certain embodiments, the monoclonal antibody may be a Fab fragment or an F(ab') 2 fragment. The monoclonal antibodies described herein, for example, can be produced using the hybridoma method as described in Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495, or for example, can be isolated from phage libraries using techniques such as described in this document. Other methods for producing clonal cell lines and the monoclonal antibodies expressed by them are well known in the art (see, for example, Chapter 11 in Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., supra).
Способы получения и скрининга в отношении специфических антител с использованием гибридомной технологии являются обычными и хорошо известными из уровня техники. Например, в способе с использованием гибридомы мышь или другое подходящее животное-хозяина, такое как овца, коза, кролик, крыса, хомяк или макак, иммунизируют с целью получения лимфоцитов, которые вырабатывают или способны вырабатывать антитела, которые будут специфически связываться с белком (например, ОХ40 (например, ОХ40 человека)), используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно подвергать иммунизации in vitro. Лимфоциты затем сливают с клетками миеломы с помощью подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Кроме того, для иммунизации животного может быть использована методика RIMMS (с применением нескольких сайтов повторной иммунизации) (Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9, включенная посредством ссылки во всей своей полноте).Methods for producing and screening for specific antibodies using hybridoma technology are conventional and well known in the art. For example, in a hybridoma method, a mouse or other suitable host animal, such as a sheep, goat, rabbit, rat, hamster, or macaque, is immunized to produce lymphocytes that produce or are capable of producing antibodies that will specifically bind to the protein (e.g. , OX40 (e.g. human OX40)) used for immunization. Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. The lymphocytes are then fused with the myeloma cells using a suitable fusion agent such as polyethylene glycol to produce a hybridoma cell (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Additionally, the RIMMS (multiple boost site) technique can be used to immunize an animal (Kilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16:381-9, incorporated by reference in its entirety).
В некоторых вариантах осуществления мыши (или другие животные, такие как крысы, обезьяны, ослы, свиньи, овцы, хомяки или собаки) могут быть иммунизированы антигеном (например, ОХ40 (например, ОХ40 человека)) и непосредственно после выявления иммунного ответа, например, после выявления в сыворотке мышей антител, специфичных в отношении антигена, селезенку мыши извлекают и выделяют спленоциты. Спленоциты затем сливают с помощью хорошо известных методик с любыми подходящими клетками миеломы, например, клетками клеточной линии SP20, доступной из Американской коллекции типовых культур (АТСС®) (Манассас, Вирджиния), с получением гибридом. Гибридомы отбирают и клонируют посредством предельного разведения. В определенных вариантах осуществления лимфатические узлы иммунизированных мышей извлекают и сливают с клетками миеломы NS0. Клетки гибридомы, полученные таким образом, высевают и выращивают в подходящей среде для культивирования, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых исходных клеток миеломы. Например, если у исходных клеток миеломы отсутствует фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (HGPRT или HPRT), среда для культивирования гибридомы, как правило, будет включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), вещества, которые препятствуют росту клеток с недостаточностью HGPRT. В конкретных вариантах осуществления используются клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильную выработку антител на высоком уровне отобранными продуцирующими антитела клетками и являются чувствительными к среде, такой как среда HAT. Среди этих клеточных линий миеломы имеются мышиные миеломные линии, такие как клеточная линия NS0 или полученные из опухолей мышей МОРС-21 и МРС-11, доступные от Центра распределения клеток при институте Солка, Сан-Диего, Калифорния, США, и клетки SP-2 или X63-Ag8.653, доступные от Американской коллекции типовых культур, Роквилль, Мериленд, США. Клеточные линии миеломы человека или гетеромиеломные клеточные линии мыши и человека также были описаны в отношении получения моноклональных антител человека (Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Среду для культивирования, в которой растут клетки гибридомы, анализируют в отношении выработки моноклональных антител, направленных против ОХ40 (например, ОХ40 человека). Специфичность связывания моноклональных антител, вырабатываемых клетками гибридомы, определяют с помощью способов, известных в данной области техники, например, иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунологический анализ (RIA) или ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA).In some embodiments, mice (or other animals such as rats, monkeys, donkeys, pigs, sheep, hamsters, or dogs) may be immunized with an antigen (e.g., OX40 (e.g., human OX40)) and immediately upon eliciting an immune response, e.g. After antigen-specific antibodies are detected in mouse serum, the mouse spleen is removed and splenocytes are isolated. The splenocytes are then fused using well-known techniques with any suitable myeloma cells, for example, cells of the SP20 cell line available from the American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA), to produce hybridomas. Hybridomas are selected and cloned through limiting dilution. In certain embodiments, lymph nodes from immunized mice are removed and fused with NS0 myeloma cells. The hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium, which preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells. For example, if the original myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma culture medium will typically include hypoxanthine, aminopterin, and thymidine (HAT medium), substances that inhibit the growth of HGPRT-deficient cells. In particular embodiments, myeloma cells are used that efficiently fuse, support stable high-level antibody production by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium, such as a HAT medium. Among these myeloma cell lines are murine myeloma lines such as the NS0 cell line or mouse tumor-derived MOPC-21 and MPC-11, available from the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, and SP-2 cells or X63-Ag8.653, available from the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Human myeloma cell lines or mouse and human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-5 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). The culture medium in which hybridoma cells grow is assayed for the production of monoclonal antibodies directed against OX40 (eg, human OX40). The binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is determined using methods known in the art, for example, immunoprecipitation or using an in vitro binding assay such as a radioimmunoassay (RIA) or an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
После идентификации клеток гибридомы, которые вырабатывают антитела с требуемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны могут быть субклонированы с помощью процедур предельного разведения и выращены с помощью стандартных способов (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, выше). Подходящие среды для культивирования с этой целью включают, например, среду D-MEM или RPMI 1640. Кроме того, клетки гибридомы могут быть выращены in vivo в виде асцитных опухолей у животного.After identifying hybridoma cells that produce antibodies with the desired specificity, affinity and/or activity, clones can be subcloned using limiting dilution procedures and grown using standard methods (Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, supra). Suitable culture media for this purpose include, for example, D-MEM or RPMI 1640. In addition, hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in an animal.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, подходящим образом отделяют от среды для культивирования, асцитной жидкости или сыворотки крови с помощью стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, хроматография с гидроксиапатитом с использованием белка А на сефарозе, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография.The monoclonal antibodies secreted by the subclones are suitably separated from the culture medium, ascites fluid, or serum by standard immunoglobulin purification procedures, such as, for example, hydroxyapatite chromatography using Protein A Sepharose, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography.
- 72 046360- 72 046360
Антитела, описанные в данном документе, могут быть получены с помощью любой методики, известной специалистам в данной области техники. Например, Fab- и F(ab')2-фрагменты, описанные в данном документе, могут быть получены с помощью протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). Fab-фрагмент соответствует одному из двух идентичных плеч тетрамерной молекулы антитела и содержит всю легкую цепь, образующую пару с VH- и СН1-доменами тяжелой цепи. F(ab')2-фрагмент содержит два антигенсвязывающих плеча тетрамерной молекулы антитела, связанных дисульфидными связями в шарнирной области.The antibodies described herein can be prepared using any technique known to those skilled in the art. For example, the Fab and F(ab') 2 fragments described herein can be produced by proteolytic digestion of immunoglobulin molecules using enzymes such as papain (to produce Fab fragments) or pepsin (to produce F(ab') 2 fragments. ') 2 -fragments). The Fab fragment corresponds to one of two identical arms of the tetrameric antibody molecule and contains the entire light chain, forming a pair with the VH and CH1 domains of the heavy chain. The F(ab') 2 fragment contains two antigen-binding arms of a tetrameric antibody molecule linked by disulfide bonds at the hinge region.
Кроме того, антитела, описанные в данном документе, также могут быть получены с помощью различных способов фагового дисплея, известных в данной области техники. В способах фагового дисплея белки представлены на поверхности фаговых частиц, которые несут последовательности полинуклеотидов, кодирующие их. В частности, последовательности ДНК, кодирующие VH- и VL-домены, амплифицируют из библиотек кДНК животных (например, библиотек кДНК пораженных тканей человека и мыши). Осуществляют рекомбинацию ДНК, кодирующей домены VH и VL, вместе с линкером scFv с помощью ПЦР и ее клонируют в фагмидный вектор. Вектор вводят в Е. coli путем электропорации, и Е. coli инфицируют фагом-помощником. Фаг, используемый в этих способах, как правило, представляет собой нитевидный фаг, в том числе fd и М13, и VH- или VL-домены обычно сливают рекомбинантным путем либо с геном III, либо с геном VIII фага. Фаг, экспрессирующий антитело, которое связывается с определенным антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или зафиксированного на них. Примеры способов с использованием фагового дисплея, которые могут быть использованы для получения антител, описанных в данном документе, включают раскрытые в Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; заявке согласно РСТ № PCT/GB91/001134; международных публикациях №№ WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 и WO 97/13844; и патентах США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753,5821047, 5571698, 5427908,5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108.In addition, the antibodies described herein can also be produced using various phage display methods known in the art. In phage display methods, proteins are presented on the surface of phage particles that carry polynucleotide sequences encoding them. In particular, DNA sequences encoding the VH and VL domains are amplified from animal cDNA libraries (eg, human and mouse diseased tissue cDNA libraries). The DNA encoding the VH and VL domains is recombined along with the scFv linker using PCR and cloned into the phagemid vector. The vector is introduced into E. coli by electroporation, and the E. coli is infected with a helper phage. The phage used in these methods is typically filamentous phage, including fd and M13, and the VH or VL domains are typically fused recombinantly to either gene III or gene VIII of the phage. A phage expressing an antibody that binds to a particular antigen can be selected or identified by the antigen, for example, using a labeled antigen or an antigen bound to or fixed to a solid surface or bead. Examples of phage display methods that can be used to produce the antibodies described herein include those disclosed in Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; application according to PCT No. PCT/GB91/001134; international publications Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401 and WO 97/13844; and US patents Nos. 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753,5821047, 5571698, 5427908,5516637, 5780225, 5658727, 5733743 and 59 69108.
Как описано в указанных выше источниках, после отбора фага кодирующие антитело участки можно выделять из фага и использовать их для получения антител, в том числе антител человека, и экспрессировать у любого требуемого хозяина, в том числе в клетках млекопитающих, клетках насекомых, растительных клетках, у дрожжей и бактерий, например, как описано ниже. Методики рекомбинантного получения антител, таких как Fab-, Fab'- и F(ab')2-фрагменты, также могут быть использованы с применением способов, известных в данной области техники, таких как раскрытые в публикации согласно РСТ № WO 92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; и Better M et al, (1988) Science 240: 1041-1043.As described in the above references, once a phage has been selected, antibody coding regions can be isolated from the phage and used to produce antibodies, including human antibodies, and expressed in any desired host, including mammalian cells, insect cells, plant cells, in yeast and bacteria, for example, as described below. Techniques for the recombinant production of antibodies such as Fab, Fab' and F(ab') 2 fragments can also be used using methods known in the art, such as those disclosed in PCT Publication No. WO 92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; and Better M et al, (1988) Science 240: 1041-1043.
В одном аспекте для получения антител праймеры для ПЦР, в том числе нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующая последовательность для защиты сайта рестрикции, могут быть использованы для амплификации последовательностей VH или VL из матрицы, например, клонов scFv. Используя технологии клонирования, известные специалистам в данной области техники, VH-домены, амплифицированные с помощью ПЦР, могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область VH, и VL-домены, амплифицированные с помощью ПЦР, могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область VL, например, константные области каппа- или лямбда-цепи человека. VH- и VL-домены также могут быть клонированы в один вектор, экспрессирующий необходимые константные домены. Векторами превращения тяжелой цепи и векторами превращения легкой цепи затем совместно трансфицируют клеточные линии с получением стабильных или транзиентных клеточных линий, которые экспрессируют антитела, например, IgG, с помощью методик, известных специалистам в данной области техники. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела получены из различных молекул иммуноглобулинов. Например, химерное антитело может содержать вариабельную область моноклонального антитела мыши или крысы, слитую с константной областью антитела человека. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; и патенты США №№5807715, 4816567, 4816397 и 6331415.In one aspect, for antibody production, PCR primers, including VH or VL nucleotide sequences, a restriction site, and a flanking sequence to protect the restriction site, can be used to amplify VH or VL sequences from a template, for example, scFv clones. Using cloning technologies known to those skilled in the art, PCR-amplified VH domains can be cloned into vectors expressing the VH constant region, and PCR-amplified VL domains can be cloned into vectors expressing the constant region VL, for example, human kappa or lambda chain constant regions. The VH and VL domains can also be cloned into a single vector expressing the required constant domains. The heavy chain conversion vectors and the light chain conversion vectors are then co-transfected into cell lines to produce stable or transient cell lines that express antibodies, eg, IgG, using techniques known to those skilled in the art. A chimeric antibody is a molecule in which different parts of the antibody are derived from different immunoglobulin molecules. For example, a chimeric antibody may comprise the variable region of a mouse or rat monoclonal antibody fused to the constant region of a human antibody. Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. See, for example, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; and US Patent Nos. 5807715, 4816567, 4816397 and 6331415.
Гуманизированное антитело способно связываться с предварительно определенным антигеном и содержит каркасную область, имеющую, по сути, аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека и CDR, имеющие, по сути, аминокислотную последовательность иммуноглобулина, не являющегося человеческим (например, иммуноглобулина мыши). В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Антитело также может включать СН1, шарнир, СН2, СН3 и СН4-области тяжелой цепи. Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, в том числе IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, в том числе IgGi, IgG2, IgG3The humanized antibody is capable of binding to a predetermined antigen and contains a framework region having essentially the amino acid sequence of a human immunoglobulin and CDRs having essentially the amino acid sequence of a non-human immunoglobulin (eg, mouse immunoglobulin). In specific embodiments, the humanized antibody also contains at least a portion of the constant region (Fc) of an immunoglobulin, typically human immunoglobulin. The antibody may also include the CH1, hinge, CH2, CH3 and CH4 regions of the heavy chain. The humanized antibody may be selected from any class of immunoglobulins, including IgM, IgG, IgD, IgA and IgE, and any isotype, including IgGi, IgG2, IgG3
- 73 046360 и IgG4. Гуманизированные антитела могут быть получены с помощью ряда методик, известных в данной области техники, в том числе без ограничения прививания CDR (европейский патент № ЕР 239400; международная публикация №91/09967; и патенты США №№ 5225539, 5530101 и 5585089), венирования или изменения поверхности (европейские патенты №№ ЕР 592106 и ЕР 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; и Roguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969-973), перестановки цепей (патент США № 5565332) и методик, раскрытых, например, в патенте США № 6407213, патенте США № 5766886, международной публикации № WO 93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas С et al., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al, (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 и Pedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. См. также публикацию заявки США № US 2005/0042664 A1 (24 февраля 2005 г.), которая включена посредством ссылки во всей своей полноте. Однодоменные антитела, например, антитела, у которых отсутствуют легкие цепи, могут быть получены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. См. Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; патент США №6005079; и международные публикации №№ WO 94/04678, WO 94/25591 и WO 01/44301.- 73 046360 and IgG 4 . Humanized antibodies can be produced using a number of techniques known in the art, including, but not limited to, CDR grafting (European Patent No. EP 239400; International Publication No. 91/09967; and US Patent Nos. 5225539, 5530101 and 5585089), veining or surface changes (European patents Nos. EP 592106 and EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al., (1994) Prot Engineering 7(6): 805- 814; and Roguska MA et al., (1994) PNAS 91: 969-973), strand permutation (US Pat. No. 5,565,332) and techniques disclosed, for example, in US Pat. No. 6,407,213, US Pat. No. 5,766,886, International Publication No. WO 93/17105; Tan P et al., (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al., (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al, (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al., (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al., (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al., (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al., (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 and Pedersen JT et al., (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73. See also US Application Publication No. US2005/0042664 A1 (February 24, 2005), which is incorporated by reference in its entirety. Single domain antibodies, for example, antibodies that lack light chains, can be produced using methods well known in the art. See Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al., (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyldermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; US Patent No. 6005079; and international publications Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 and WO 01/44301.
Кроме того, антитела, которые иммуноспецифично связываются с антигеном ОХ40, могут, в свою очередь, быть использованы для получения антиидиотипических антител, которые имитируют антиген, с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области техники. (См., например, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; и Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438).In addition, antibodies that immunospecifically bind to the OX40 antigen can in turn be used to generate anti-idiotypic antibodies that mimic the antigen using techniques well known to those skilled in the art. (See, for example, Greenspan NS & Bona CA (1989) FASEB J 7(5): 437-444; and Nissinoff A (1991) J Immunol 147(8): 2429-2438).
В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое связывается с тем же эпитопом ОХ40 (например, ОХ40 человека), что и антитело к ОХ40, описанное в данном документе, представляет собой антитело человека. В конкретных вариантах осуществления антитело, описанное в данном документе, которое конкурентно блокирует (например, дозозависимым образом) связывание любого из антител, описанных в данном документе (например, pab1949 или pab2044), с ОХ40 (например, ОХ40 человека), представляет собой антитело человека. Антитела человека могут быть получены с помощью любого способа, известного в данной области техники. Например, могут быть использованы трансгенные мыши, у которых не могут экспрессироваться функциональные эндогенные иммуноглобулины, но у которых могут экспрессироваться гены иммуноглобулинов человека. В частности, генные комплексы иммуноглобулинов с тяжелой и легкой цепями человека могут быть введены случайным образом или с помощью гомологичной рекомбинации в мышиные эмбриональные стволовые клетки. Альтернативно, вариабельная область, константная область и область разнообразия человека могут быть введены в эмбриональные стволовые клетки мыши в дополнение к генам тяжелой и легкой цепей человека. Гены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов мыши можно сделать нефункциональными отдельно или одновременно с введением локусов иммуноглобулинов человека с помощью гомологичной рекомбинации. В частности, гомозиготная делеция JH-области предотвращает выработку эндогенных антител. Для получения химерных мышей модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и подвергают микроинъекции в бластоцисты. Затем химерных мышей скрещивают с получением гомозиготного потомства, у которого экспрессируются антитела человека. Трансгенных мышей иммунизируют обычным путем с помощью выбранного антигена, например, всего антигена или его части (например, ОХ40). Моноклональные антитела, направленные против антигена, могут быть получены от иммунизированных трансгенных мышей с помощью стандартной гибридомной технологии. Трансгены иммуноглобулинов человека, которые несут трансгенные мыши, перегруппировываются в ходе дифференцировки В-клеток, а затем подвергаются переключению классов и соматической мутации. Таким образом, с помощью такой методики можно получать терапевтически пригодные IgG, IgA, IgM и IgEантитела. Обзор этой технологии получения антител человека см. в Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. Подробное описание этой технологии получения антител человека, моноклональных антител человека и протоколы получения таких антител см., например, в международных публикациях №№ WO 98/24893, WO 96/34096 и WO 96/33735; и патентах США №№5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 и 5939598. Примеры мышей, у которых возможна выработка антител человека, включают Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; патенты США №№ 6075181 и 6150184), HuAbMouse™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; патенты США №№ 5545806 и 5569825), Trans Chromo Mouse™ (Kirin) и KM Mouse™ (Medarex/Kirin). Антитела человека, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека), могут быть получены с помощью ряда способов, известных в данной области техники, в том числе способов фагового дисплея, описанных выше, с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также патенты США №№ 4444887, 4716111 и 5885793; и международные публикации №№ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741.In specific embodiments, an antibody described herein that binds to the same OX40 epitope (eg, human OX40) as an anti-OX40 antibody described herein is a human antibody. In specific embodiments, an antibody described herein that competitively blocks (e.g., in a dose-dependent manner) the binding of any of the antibodies described herein (e.g., pab1949 or pab2044) to OX40 (e.g., human OX40) is a human antibody . Human antibodies can be obtained using any method known in the art. For example, transgenic mice may be used which cannot express functional endogenous immunoglobulins but which can express human immunoglobulin genes. In particular, gene complexes of human heavy and light chain immunoglobulins can be introduced randomly or by homologous recombination into mouse embryonic stem cells. Alternatively, human variable region, constant region and human diversity region can be introduced into mouse embryonic stem cells in addition to human heavy and light chain genes. The mouse immunoglobulin heavy and light chain genes can be rendered nonfunctional separately or simultaneously with the introduction of human immunoglobulin loci by homologous recombination. In particular, homozygous deletion of the JH region prevents the production of endogenous antibodies. To generate chimeric mice, modified embryonic stem cells are expanded and microinjected into blastocysts. The chimeric mice are then crossed to produce homozygous offspring that express human antibodies. Transgenic mice are immunized in the usual manner with the selected antigen, for example all or part of the antigen (eg OX40). Monoclonal antibodies directed against an antigen can be generated from immunized transgenic mice using standard hybridoma technology. Human immunoglobulin transgenes carried by transgenic mice rearrange during B cell differentiation and then undergo class switching and somatic mutation. Thus, using this technique, it is possible to obtain therapeutically useful IgG, IgA, IgM and IgE antibodies. For a review of this technology for producing human antibodies, see Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13:65-93. For a detailed description of this technology for the production of human antibodies, human monoclonal antibodies and protocols for the production of such antibodies, see, for example, international publications Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 and WO 96/33735; and US Patent Nos. 5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318 and 5939598. Examples of mice that can produce human antibodies include Xenomouse™ (Abgenix, Inc.; US Patent Nos. 6,075,181 and 615 0184), HuAbMouse ™ (Mederex, Inc./Gen Pharm; US Patent Nos. 5,545,806 and 5,569,825), Trans Chromo Mouse™ (Kirin), and KM Mouse™ (Medarex/Kirin). Human antibodies that specifically bind to OX40 (eg, human OX40) can be generated by a number of methods known in the art, including the phage display methods described above using antibody libraries derived from human immunoglobulin sequences. See also US Pat. Nos. 4,444,887, 4,716,111, and 5,885,793; and international publications Nos. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 and WO 91/10741.
В некоторых вариантах осуществления антитела человека могут быть получены с помощью гибридом мышь-человек. Например, лимфоциты периферической крови человека, трансформированные вируIn some embodiments, human antibodies can be generated using mouse-human hybridomas. For example, human peripheral blood lymphocytes transformed with virus
- 74 046360 сом Эпштейна-Барр (EBV), могут быть слиты с клетками миеломы мыши с получением гибридом мышьчеловек, секретирующих моноклональные антитела человека, и эти гибридомы мышь-человек могут быть подвергнуты скринингу для определения таковых, которые секретируют моноклональные антитела человека, которые иммуноспецифично связываются с целевым антигеном (например, ОХ40 (например, ОХ40 человека)). Такие способы известны и описаны в данной области техники, см., например, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.- 74 046360 Epstein-Barr catfish (EBV) can be fused with mouse myeloma cells to produce mouse-human hybridomas that secrete human monoclonal antibodies, and these mouse-human hybridomas can be screened for those that secrete human monoclonal antibodies that are immunospecific bind to the target antigen (eg OX40 (eg human OX40)). Such methods are known and described in the art, see, for example, Shinmoto H et al., (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al., (2005) Human Antibodies 14: 27-31.
5.3.1 Полинуклеотиды5.3.1 Polynucleotides
В определенных аспектах в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в данном документе, или его фрагмент (например, вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи), которое иммуноспецифично связывается с антигеном ОХ40 (например, ОХ40 человека), и векторы, например, векторы, содержащие такие полинуклеотиды для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах (например, Е. coli и клетках млекопитающих). В данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие любое из антител, предусмотренных в данном документе, а также векторы, содержащие такие полинуклеотидные последовательности, например, векторы экспрессии, для их эффективной экспрессии в клетках-хозяевах, например, клетках млекопитающих. Как используется в данном документе, выделенный полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты представляет собой таковую, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в естественном источнике (например, у мыши или человека) молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может практически не содержать другого клеточного материала или среды для культивирования, в случае получения с помощью рекомбинантных методик, или практически не содержать предшественников химических веществ или других химических веществ, в случае химического синтеза. Например, выражение практически не содержать включает препараты полинуклеотида или молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие менее чем приблизительно 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% (в частности, менее чем приблизительно 10%) другого материала, например, клеточного материала, среды для культивирования, других молекул нуклеиновой кислоты, предшественников химических веществ и/или других химических веществ. В конкретном варианте осуществления молекула(молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующая(кодирующие) антитело, описанное в данном документе, является(являются) выделенной(выделенными) или очищенной(очищенными).In certain aspects, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding an antibody described herein, or a fragment thereof (e.g., a light chain variable region and/or a heavy chain variable region) that immunospecifically binds to an OX40 antigen (e.g., OX40 human), and vectors, for example, vectors containing such polynucleotides for recombinant expression in host cells (eg, E. coli and mammalian cells). Provided herein are polynucleotides containing nucleotide sequences encoding any of the antibodies provided herein, as well as vectors containing such polynucleotide sequences, such as expression vectors, for efficient expression thereof in host cells, such as mammalian cells. As used herein, an isolated polynucleotide or nucleic acid molecule is one that is separated from other nucleic acid molecules that are present in a natural source (eg, mouse or human) of the nucleic acid molecule. Moreover, the isolated nucleic acid molecule, such as a cDNA molecule, may contain substantially no other cellular material or culture medium, if produced by recombinant techniques, or substantially no precursor chemicals or other chemicals, if chemically synthesized. For example, the expression substantially free of includes preparations of polynucleotide or nucleic acid molecules containing less than about 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% or 0.1% (in particular, less than about 10 %) other material, such as cellular material, culture medium, other nucleic acid molecules, precursor chemicals and/or other chemicals. In a specific embodiment, the nucleic acid molecule(s) encoding the antibody described herein are isolated or purified.
В конкретных аспектах в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, которые иммуноспецифично связываются с полипептидом ОХ40 (например, ОХ40 человека) и содержат аминокислотную последовательность, описанную в данном документе, а также антитела, которые конкурируют с такими антителами за связывание с полипептидом ОХ40 (например, дозозависимым образом), или которые связываются с тем же эпитопом, что и такие антитела.In specific aspects, provided herein are polynucleotides comprising nucleotide sequences encoding antibodies that immunospecifically bind to an OX40 polypeptide (e.g., human OX40) and containing the amino acid sequence described herein, as well as antibodies that compete with such antibodies for binding to OX40 polypeptide (eg, in a dose-dependent manner), or that bind to the same epitope as such antibodies.
В конкретных аспектах в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую или тяжелую цепь антитела, описанного в данном документе. Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие легкую цепь, содержащую FR и CDR VL антител, описанных в данном документе (см., например, табл. 1 и 3). Полинуклеотиды могут содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь, содержащую FR и CDR VH антител, описанных в данном документе (см., например, табл. 2 и 4). В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, кодирует VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, кодирует VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16. В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к ОХ40, содержащее три CDR VL цепи, например, содержащие CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL любого из антител, описанных в данном документе (например, см. табл. 1). В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие три CDR VH цепи, например, содержащие CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH любого из антител, описанных в данном документе (например, см. табл. 2). В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к ОХ40, содержащее три CDR VH цепи, например, содержащие CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL любого из антител, описанных в данном документе (например, см. табл. 1) и три CDR VH цепи, например, содержащие CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH любого из антител, описанных в данном документе (например, см. табл. 2).In specific aspects, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding a light or heavy chain of an antibody described herein. The polynucleotides may contain nucleotide sequences encoding a light chain containing the FR and CDR of the VL antibodies described herein (see, for example, Tables 1 and 3). The polynucleotides may contain nucleotide sequences encoding a heavy chain containing the FR and CDR of the VH antibodies described herein (see, for example, Tables 2 and 4). In certain embodiments, the polynucleotide described herein encodes a VL domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15. In certain embodiments, the polynucleotide described herein encodes a VH domain containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16. In specific embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody comprising three CDR VL chains, for example, comprising CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL of any of the antibodies described herein (for example, see Table 1). In specific embodiments, provided herein are polynucleotides comprising three CDR VH chains, for example, comprising the CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH of any of the antibodies described herein (eg, see Table 2). In specific embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody comprising three CDR VH chains, for example, comprising CDR1 VL, CDR2 VL and CDR3 VL of any of the antibodies described herein (for example, see Table 1) and three CDR VH chains, for example, containing CDR1 VH, CDR2 VH and CDR3 VH of any of the antibodies described herein (for example, see Table 2).
В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к ОХ40 или его фрагмент, содержащий VL-домен, например, содержащий FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, содержащий аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, см. табл. 1 и 3, например, CDR VL и FR VL конкретного антитела, идентифицируемого по названию в таблицах). В конкретныхIn specific embodiments, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody or a VL domain-containing fragment thereof, for example, comprising FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, comprising the amino acid sequence described in this document (eg, see Tables 1 and 3, for example, CDR VL and FR VL of a particular antibody identified by name in the tables). In specific
- 75 046360 вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к ОХ40 или его фрагмент, содержащий VH-домен, например, содержащий FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, содержащий аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, см. табл. 2 и 4, например, CDR VH и FR VH конкретного антитела, идентифицируемого по названию в таблицах).- 75 046360 embodiments provided herein are polynucleotides containing a nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody or a fragment thereof containing a VH domain, for example, containing FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, containing the amino acid sequence described herein (eg, see Tables 2 and 4, for example, CDR VH and FR VH of a particular antibody identified by name in the tables).
В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, предусмотренное в данном документе, содержащее вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, SEQ ID NO: 15), где антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело pab1949 или pab2044, предусмотренное в данном документе, или его фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, SEQ ID NO: 15). В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, предусмотренное в данном документе, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, SEQ ID NO: 16), где антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенном варианте осуществления полинуклеотид, описанный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело pab1949 или pab2044, предусмотренное в данном документе, или его фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, SEQ ID NO: 16).In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody provided herein, comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO: 15), wherein the antibody is immunospecific binds to OX40 (e.g. human OX40). In a certain embodiment, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody pab1949 or pab2044 provided herein, or a fragment thereof, containing a light chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO : 15). In certain embodiments, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody provided herein, comprising a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO: 16), wherein the antibody is immunospecific binds to OX40 (e.g. human OX40). In a certain embodiment, a polynucleotide described herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody pab1949 or pab2044 provided herein, or a fragment thereof, containing a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described herein (e.g., SEQ ID NO : 16).
В определенных аспектах полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, содержащие VL-домен, содержащий одну или несколько FR VL, содержащих аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, см. табл. 3), где антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных аспектах полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, содержащие VH-домен, содержащий одну или несколько FR VH, содержащих аминокислотную последовательность, описанную в данном документе (например, см. табл. 4), где антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека).In certain aspects, the polynucleotide comprises a nucleotide sequence encoding an antibody or fragment thereof described herein comprising a VL domain comprising one or more VL FRs comprising an amino acid sequence described herein (e.g., see Table 3), wherein the antibody immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40). In certain aspects, the polynucleotide comprises a nucleotide sequence encoding an antibody or fragment thereof described herein comprising a VH domain comprising one or more VH FRs comprising an amino acid sequence described herein (e.g., see Table 4), wherein the antibody immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40).
В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрен полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, содержащие каркасные области (например, каркасные области VL-домена и VHдомена), которые представляют собой каркасные области человека, при этом антитело иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его фрагмент (например, CDR или вариабельный домен), описанный в разделе 5.2 выше.In specific embodiments, provided herein is a polynucleotide that contains a nucleotide sequence encoding an antibody or fragment thereof described herein containing framework regions (e.g., VL domain and VH domain framework regions) that are human framework regions, wherein the antibody immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40). In certain embodiments, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody or fragment thereof (eg, a CDR or variable domain) described in section 5.2 above.
В конкретных аспектах в данном документе предусмотрен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, например, отдельно легкую цепь и тяжелую цепь. Что касается легкой цепи, в конкретном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую каппа-цепь. В другом конкретном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую лямбда-цепь. В еще одном конкретном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в данном документе, содержащее легкую каппа-цепь человека или легкую лямбда-цепь человека. В конкретном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), где антитело содержит легкую цепь, и где аминокислотная последовательность VL-домена может содержать аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и где константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи человека. В другом варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), и содержит легкую цепь, где аминокислотная последовательность VL-домена может содержать аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 15, и где константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой лямбда-цепи человека. Например, последовательности константных областей человека могут быть такими, как описано в патенте США № 5693780.In specific aspects, provided herein is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding an antibody comprising a light chain and a heavy chain, for example, a light chain and a heavy chain separately. With respect to the light chain, in a particular embodiment, the polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a kappa light chain. In another specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding a lambda light chain. In yet another specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody described herein comprising a human kappa light chain or a human lambda light chain. In a specific embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), wherein the antibody comprises a light chain, and wherein the amino acid sequence of the VL domain may comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and wherein the light chain constant region comprises the amino acid sequence of a human kappa light chain constant region. In another embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40) and comprises a light chain, wherein the amino acid sequence of the VL domain may comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15, and wherein the light chain constant region comprises the amino acid sequence of a human lambda light chain constant region. For example, human constant region sequences may be as described in US Pat. No. 5,693,780.
В конкретном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в данном документе, коIn a specific embodiment, the polynucleotide provided herein contains a nucleotide sequence encoding an antibody described herein, which
- 76 046360 торое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), где антитело содержит тяжелую цепь, где аминокислотная последовательность VH-домена может содержать аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 16, и где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой гамма- (γ) цепи человека.- 76 046360 which immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), wherein the antibody comprises a heavy chain, wherein the amino acid sequence of the VH domain may comprise the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and wherein the heavy chain constant region comprises the amino acid sequence of the constant human gamma (γ) heavy chain regions.
В определенном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную (нуклеотидные) последовательность (последовательности), кодирующую (кодирующие) VH-домен и/или VL-домен антитела, описанного в данном документе (например, pab1949 или pab2044, такие как SEQ ID NO: 16 в случае VH-домена или SEQ ID NO: 15 в случае VL-домена), которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека).In a certain embodiment, a polynucleotide provided herein comprises nucleotide sequence(s) encoding the VH domain and/or VL domain of an antibody described herein (e.g., pab1949 or pab2044, such as SEQ ID NO: 16 for the VH domain or SEQ ID NO: 15 for the VL domain) that immunospecifically binds to OX40 (eg, human OX40).
В еще одном варианте осуществления полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, описанное в данном документе, которое иммуноспецифично связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), где антитело содержит VLдомен и VH-домен, содержащие любые аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей IgGi человека (например, аллотип 1,17 или 3), IgG2 человека или IgG4 человека. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело к ОХ40 или его домен, обозначенный в данном документе, см., например, табл. 1-4, например, антитело pab1949 или pab2044.In yet another embodiment, a polynucleotide provided herein comprises a nucleotide sequence encoding an antibody described herein that immunospecifically binds to OX40 (e.g., human OX40), wherein the antibody contains a VL domain and a VH domain containing any amino acid sequences, described herein, and wherein the constant regions comprise the amino acid sequences of human IgGi (eg, allotype 1.17 or 3), human IgG 2 , or human IgG 4 constant regions. In a specific embodiment, provided herein are polynucleotides comprising a nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody or domain thereof as defined herein, see, for example, Table. 1-4, for example, antibody pab1949 or pab2044.
Также в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие антитело к ОХ40 или его фрагмент, которые оптимизированы, например, с помощью оптимизации кодона/РНК, замещения гетерологичными сигнальными последовательностями и удаления элементов нестабильности мРНК. Способы получения оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело к ОХ40 или его фрагмент (например, легкую цепь, тяжелую цепь, VH-домен или VL-домен) для рекомбинантной экспрессии, с помощью введения изменений по кодонам и/или удаления ингибирующих областей в мРНК, могут быть выполнены путем адаптации способов оптимизации, описанных, например, в патентах США №№ 5965726; 6174666; 6291664; 6414132; и 6794498 соответственно. Например, потенциальные сайты сплайсинга и элементы нестабильности (например, элементы с высоким содержанием А/Т или A/U) в РНК могут быть подвержены мутации без изменения аминокислот, кодируемых последовательностями нуклеиновых кислот, с целью повышения стабильности РНК для рекомбинантной экспрессии. Изменения предусматривают вырожденность генетического кода, например, с помощью альтернативного кодона для идентичной аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления может быть желательным изменить один или несколько кодонов для кодирования консервативной мутации, например, аналогичной аминокислоты с аналогичной химической структурой и свойствами и/или функцией, что и исходная аминокислота.Also provided herein are polynucleotides encoding an anti-OX40 antibody or fragment thereof that are optimized, for example, by codon/RNA optimization, substitution with heterologous signal sequences, and removal of mRNA instability elements. Methods for producing optimized nucleic acids encoding an anti-OX40 antibody or fragment thereof (e.g., light chain, heavy chain, VH domain, or VL domain) for recombinant expression by introducing codon changes and/or removing inhibitory regions in the mRNA can be performed by adapting optimization methods described, for example, in US patents No. 5965726; 6174666; 6291664; 6414132; and 6794498 respectively. For example, potential splice sites and instability elements (eg, high A/T or A/U content elements) in RNA can be mutated without changing the amino acids encoded by the nucleic acid sequences to increase the stability of the RNA for recombinant expression. The changes involve degeneracy of the genetic code, for example by using an alternative codon for an identical amino acid. In some embodiments, it may be desirable to change one or more codons to encode a conservative mutation, for example, a similar amino acid with similar chemical structure and properties and/or function as the original amino acid.
В определенных вариантах осуществления оптимизированная полинуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент (например, VLдомен или VH-домен) могут гибридизироваться с антисмысловым (например, комплементарным) полинуклеотидом неоптимизированной полинуклеотидной последовательности, кодирующей антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент (например, VL-домен или VH-домен). В конкретных вариантах осуществления оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент, гибридизируется в условиях высокой жесткости с антисмысловым полинуклеотидом неоптимизированной полинуклеотидной последовательности, кодирующей антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент. В конкретном варианте осуществления оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент, гибридизируется в условиях гибридизации высокой жесткости, промежуточной или пониженной жесткости с антисмысловым полинуклеотидом неоптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент. Информация касательно условий гибридизации была описана, см., например, публикацию патентной заявки США № US 2005/0048549 (например, абзацы 72-73), которая включена в данный документ с помощью ссылки.In certain embodiments, an optimized polynucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof (e.g., a VL domain or a VH domain) may hybridize to an antisense (e.g., complementary) polynucleotide of a non-optimized polynucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein. herein, or a fragment thereof (for example, a VL domain or a VH domain). In specific embodiments, an optimized nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof, is hybridized under high stringency conditions to an antisense polynucleotide of a non-optimized polynucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof. In a specific embodiment, an optimized nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof, is hybridized under high stringency, intermediate, or reduced stringency hybridization conditions with an antisense polynucleotide of a non-optimized nucleotide sequence encoding an anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof. Information regarding hybridization conditions has been described, see, for example, US Patent Application Publication No. US 2005/0048549 (eg, paragraphs 72-73), which is incorporated herein by reference.
С помощью любого способа, известного из уровня техники, можно получить полинуклеотиды и можно определить нуклеотидную последовательность полинуклеотидов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела, описанные в данном документе, например, антитела, описанные в табл. 14, и модифицированные варианты этих антител, могут быть определены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники, т.е., нуклеотидные кодоны, для которых известно, что они кодируют определенные аминокислоты, собирают таким образом, чтобы получить нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело. Такой полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из синтезированных химическим путем олигонуклеотидов (например, как описано в Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-246), который, вкратце, включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитела, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент, описанные в данном документе, может быть полу- 77 046360 чен из нуклеиновой кислоты, происходящей из подходящего источника (например, гибридомы), с помощью способов, хорошо известных в данной области техники (например, ПЦР и других способов молекулярного клонирования). Например, ПЦР-амплификация с применением синтетических праймеров, гибридизируемых с 3'- и 5'-концами известной последовательности, может быть выполнена с применением геномной ДНК, полученной из клеток гибридом, вырабатывающих представляющее интерес антитело. Такие способы ПЦР-амплификации могут быть использованы для получения нуклеиновых кислот, содержащих последовательность, кодирующую легкую цепь и/или тяжелую цепь антитела. Такие способы ПЦР-амплификации могут быть использованы для получения нуклеиновых кислот, содержащих последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела. Амплифицированные нуклеиновые кислоты могут быть клонированы в векторы для экспрессии в клетках-хозяевах и для дальнейшего клонирования, например, с получением химерных и гуманизированных антител.Using any method known in the art, polynucleotides can be prepared and the nucleotide sequence of the polynucleotides can be determined. Nucleotide sequences encoding the antibodies described herein, for example, the antibodies described in table. 14, and modified versions of these antibodies, can be determined using methods well known in the art, i.e., nucleotide codons known to encode specific amino acids are assembled so as to obtain a nucleic acid that codes for an antibody. Such an antibody-encoding polynucleotide can be assembled from chemically synthesized oligonucleotides (for example, as described in Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-246), which, in brief, involves the synthesis of overlapping oligonucleotides containing portions of the sequence , encoding antibodies, annealing and ligating these oligonucleotides, and then amplifying the ligated oligonucleotides using PCR. Alternatively, a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof described herein can be prepared from a nucleic acid derived from a suitable source (eg, a hybridoma) using methods well known in the art (eg, PCR and other molecular cloning methods). For example, PCR amplification using synthetic primers hybridizing to the 3' and 5' ends of a known sequence can be performed using genomic DNA obtained from hybridoma cells producing the antibody of interest. Such PCR amplification methods can be used to produce nucleic acids containing the sequence encoding the light chain and/or heavy chain of an antibody. Such PCR amplification methods can be used to produce nucleic acids containing a sequence encoding a light chain variable region and/or a heavy chain variable region of an antibody. The amplified nucleic acids can be cloned into vectors for expression in host cells and for further cloning, for example, to produce chimeric and humanized antibodies.
Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую определенное антитело или его фрагмент, недоступен, а последовательность молекулы антитела или его фрагмента известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин или его фрагмент, можно химически синтезировать или получить из подходящего источника (например, библиотеки кДНК антител, или библиотеки кДНК, полученной из, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно поли(А)+ РНК, выделенной из любой ткани или клеток, экспрессирующих антитело, таких как клетки гибридомы, выбранные для экспрессии антитела, описанного в данном документе) с помощью ПЦР-амплификации с применением синтетических праймеров, гибридизируемых с 3'- и 5'-концами последовательности, или с помощью клонирования с применением олигонуклеотидного зонда, специфичного в отношении конкретной последовательности гена, подлежащей идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, кодирующего антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные с помощью ПЦР, затем можно клонировать в клонирующие векторы, реплицируемые с помощью любого способа, хорошо известного из уровня техники.If a clone containing the nucleic acid encoding a particular antibody or fragment thereof is not available and the sequence of the antibody molecule or fragment thereof is known, then the nucleic acid encoding the immunoglobulin or fragment thereof can be chemically synthesized or obtained from a suitable source (for example, antibody cDNA libraries, or a cDNA library derived from, or nucleic acid, preferably poly(A)+ RNA, isolated from any tissue or cells expressing the antibody, such as hybridoma cells selected to express the antibody described herein) by PCR amplification with using synthetic primers that hybridize to the 3' and 5' ends of the sequence, or by cloning using an oligonucleotide probe specific for the particular sequence of the gene to be identified, for example, a cDNA clone from a cDNA library encoding an antibody. The amplified nucleic acids obtained by PCR can then be cloned into cloning vectors that can be replicated using any method well known in the art.
ДНК, кодирующую антитела к ОХ40, описанные в данном документе, может быть легко выделена и секвенирована с помощью стандартных процедур (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антител к ОХ40). Клетки гибридомы могут выступать в роли источника такой ДНК. Непосредственно после выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируют в клеткихозяева, такие как клетки Е. coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) (например, клетки СНО из системы СНО GS System™ (Lonza)) или клетки миеломы, которые в иных случаях не вырабатывают белковый иммуноглобулин, для достижения синтеза антител к ОХ40 в рекомбинантных клетках-хозяевах. Для получения антител праймеры для ПЦР, в том числе нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующая последовательность для защиты сайта рестрикции могут быть использованы для амплификации последовательностей VH или VL в клонах scFv. Используя технологии клонирования, известные специалистам в данной области техники, VH-домены, амплифицированные с помощью ПЦР, могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область тяжелой цепи, например, константную область гамма-4-цепи человека, и VL-домены, амплифицированные с помощью ПЦР, могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область легкой цепи, например, константные области каппа- или лямбда-цепи. В определенных вариантах осуществления векторы для экспрессии VH- или VL-доменов содержат промотор EF-1a, сигнал секреции, сайт клонирования для вариабельного домена, константные домены и селектируемый маркер, такой как неомицин. VH- и VL-домены также могут быть клонированы в один вектор, экспрессирующий необходимые константные домены. Векторы конверсии тяжелой цепи и векторы конверсии легкой цепи затем трансфицируют совместно в клеточные линии с получением стабильных или транзиентных клеточных линий, которые экспрессируют полноразмерные антитела, например, IgG, с помощью методик, известных специалистам в данной области техники.DNA encoding the anti-OX40 antibodies described herein can be readily isolated and sequenced using standard procedures (eg, using oligonucleotide probes that are capable of specifically binding to genes encoding the heavy and light chains of anti-OX40 antibodies). Hybridoma cells can act as a source of such DNA. Directly after isolation, the DNA can be placed into expression vectors, which are then transfected into host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells (e.g. CHO cells from the CHO GS System™ (Lonza)) or myeloma cells that do not otherwise produce immunoglobulin protein to achieve the synthesis of OX40 antibodies in recombinant host cells. To generate antibodies, PCR primers, including VH or VL nucleotide sequences, a restriction site, and a flanking sequence to protect the restriction site, can be used to amplify VH or VL sequences in scFv clones. Using cloning technologies known to those skilled in the art, PCR-amplified VH domains can be cloned into vectors expressing a heavy chain constant region, such as the human gamma 4 chain constant region, and VL domains amplified from using PCR, can be cloned into vectors expressing a light chain constant region, for example, kappa or lambda chain constant regions. In certain embodiments, the VH or VL domain expression vectors comprise an EF-1a promoter, a secretion signal, a cloning site for the variable domain, constant domains, and a selectable marker such as neomycin. The VH and VL domains can also be cloned into a single vector expressing the required constant domains. The heavy chain conversion vectors and the light chain conversion vectors are then co-transfected into cell lines to produce stable or transient cell lines that express full-length antibodies, eg IgG, using techniques known to those skilled in the art.
ДНК также может быть модифицирована, например, с помощью замены последовательностей мыши на последовательность, кодирующую константные домены тяжелой и легкой цепей человека, или с помощью ковалентного связывания с кодирующей иммуноглобулин последовательностью всей или части из кодирующей последовательности не относящегося к иммуноглобулину полипептида. Также предусмотрены полинуклеотиды, которые гибридизируются в условиях гибридизации высокой жесткости, промежуточной и пониженной жесткости с полинуклеотидами, которые кодируют антитело, описанное в данном документе. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотиды, описанные в данном документе, гибридизируются в условиях гибридизации высокой жесткости, промежуточной и пониженной жесткости с полинуклеотидами, кодирующими VH-домен (например, SEQ ID NO: 16) и/или VL-домен (например, SEQ ID NO: 15), предусмотренные в данном документе.The DNA may also be modified, for example, by replacing mouse sequences with sequence encoding human heavy and light chain constant domains, or by covalently linking all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide to an immunoglobulin coding sequence. Also provided are polynucleotides that hybridize under high, intermediate, and low stringency hybridization conditions with polynucleotides that encode an antibody described herein. In specific embodiments, the polynucleotides described herein hybridize under high, intermediate, and low stringency hybridization conditions with polynucleotides encoding a VH domain (e.g., SEQ ID NO: 16) and/or a VL domain (e.g., SEQ ID NO : 15) provided for in this document.
Условия гибридизации были описаны в данной области техники и известны специалисту в данной области техники. Например, гибридизация в жестких условиях может включать гибридизацию со связанной на фильтре ДНК в растворе 6х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45°С, с последующей одной или двумя промывками в растворе 0,2xSSC/0,1% SDS при приблизительно 50-65°С;Hybridization conditions have been described in the art and are known to one skilled in the art. For example, hybridization under stringent conditions may involve hybridization to filter-bound DNA in 6x sodium chloride/sodium citrate (SSC) at approximately 45°C, followed by one or two washes in 0.2xSSC/0.1% SDS at approximately 50-65°C;
- 78 046360 гибридизация в условиях высокой жесткости может включать гибридизацию со связанной на фильтре нуклеиновой кислотой в растворе 6xSSC при приблизительно 45°С с последующей одной или двумя промывками в растворе 0,1xSSC/0,2% SDS при приблизительно 68°С. Гибридизация в других жестких условиях гибридизации также известна специалистам в данной области техники, и была описана, см., например, Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York на страницах 6.3.1-6.3.6 и 2.10.3.- 78 046360 hybridization under high stringency conditions may include hybridization with the filter bound nucleic acid in a solution of 6xSSC at approximately 45°C followed by one or two washes in a solution of 0.1xSSC/0.2% SDS at approximately 68°C. Hybridization under other stringent hybridization conditions is also known to those skilled in the art and has been described, see, for example, Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York on pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3.
5.3.2 Клетки и векторы5.3.2 Cells and vectors
В определенных аспектах в данном документе предусмотрены клетки (например, клетки-хозяева), экспрессирующие (например, рекомбинантно) антитела, описанные в данном документе, которые специфически связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека), и родственные полинуклеотиды и векторы экспрессии. В данном документе предусмотрены векторы (например, векторы экспрессии), содержащие полинуклеотиды, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к ОХ40 или их фрагменты для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, предпочтительно в клетках млекопитающих. Также в данном документе предусмотрены клетки-хозяева, содержащие такие векторы, для рекомбинантной экспрессии антител к ОХ40, описанных в данном документе (например, человеческого или гуманизированного антитела). В конкретном аспекте в данном документе предусмотрены способы получения антитела, описанного в данном документе, включающие экспрессию такого антитела в клетке-хозяине.In certain aspects, provided herein are cells (eg, host cells) expressing (eg, recombinantly) antibodies described herein that specifically bind to OX40 (eg, human OX40), and related polynucleotides and expression vectors. Provided herein are vectors (eg, expression vectors) containing polynucleotides containing nucleotide sequences encoding anti-OX40 antibodies or fragments thereof for recombinant expression in host cells, preferably mammalian cells. Also provided herein are host cells containing such vectors for recombinant expression of the anti-OX40 antibodies described herein (eg, a human or humanized antibody). In a specific aspect, provided herein are methods of producing an antibody described herein, comprising expressing such antibody in a host cell.
Рекомбинантная экспрессия антитела или его фрагмента, описанных в данном документе (например, тяжелой или легкой цепи антитела, описанного в данном документе), которое специфически связывается с ОХ40 (например, ОХ40 человека), предусматривает конструирование вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело или его фрагмент. После получения полинуклеотида, кодирующего антитело или его фрагмент (например, вариабельные домены тяжелой или легкой цепей), описанные в данном документе, вектор для продукции молекулы антитела может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Таким образом, способы получения белка с помощью экспрессии полинуклеотида, содержащего кодирующую нуклеотидную последовательность антитела или его фрагмента (например, легкую цепь или тяжелую цепь), описаны в данном документе. Способы, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности антител или фрагментов антител (например, легкой цепи или тяжелой цепи) и соответствующие сигналы регуляции транскрипции и трансляции. Эти способы включают, например, in vitro методики рекомбинантных ДНК, методики синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Также предусмотрены реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела, описанного в данном документе, тяжелую или легкую цепь антитела, вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи антитела или его часть или CDR тяжелой или легкой цепи, функционально связанную с промотором. Такие векторы, например, могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, международные публикации №№ WO 86/05807 и WO 89/01036; и патент США № 5122464), а вариабельные домены антитела могут быть клонированы в такой вектор для экспрессии всей тяжелой, всей легкой цепи или всей тяжелой и легкой цепей. Вектор экспрессии может быть перенесен в клетку (например, клетку-хозяина) с помощью стандартных методик, и полученные клетки затем могут быть культивированы с помощью стандартных методик для выработки антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044) или его фрагмента. Таким образом, в данном документе предусмотрены клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий антитело, описанное в данном документе (например, антитело, содержащее CDR pab1949 или pab2044), или его фрагменты (например, его тяжелую или легкую цепь или их фрагмент), функционально связанные с промотором для экспрессии таких последовательностей в клетке-хозяине. В определенных вариантах осуществления для экспрессии антител с двумя цепями векторы, кодирующие как тяжелую, так и легкую цепи отдельно, можно совместно экспрессировать в клетке-хозяине для экспрессии целой молекулы иммуноглобулина, как подробно описано ниже. В определенных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий как тяжелую цепь, так и легкую цепь антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044), или его фрагмента. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин содержит два различных вектора, при этом первый вектор содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044), или его фрагмента, и второй вектор содержит полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044), или его фрагмента. В других вариантах осуществления первая клетка-хозяин содержит первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или вариабельную область тяжелой цепи антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044), или его фрагмента, и вторая клетка-хозяин содержит второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь или вариабельную область легкой цепи анRecombinant expression of an antibody or fragment thereof described herein (e.g., the heavy or light chain of an antibody described herein) that specifically binds to OX40 (e.g., human OX40) involves constructing an expression vector containing a polynucleotide that encodes the antibody or its fragment. Once a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof (eg, heavy or light chain variable domains) described herein is obtained, a vector for producing the antibody molecule can be produced by recombinant DNA technology using techniques well known in the art. Thus, methods for producing a protein by expressing a polynucleotide containing the coding nucleotide sequence of an antibody or a fragment thereof (eg, a light chain or a heavy chain) are described herein. Methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing coding sequences for antibodies or antibody fragments (eg, light chain or heavy chain) and corresponding transcriptional and translational regulatory signals. These methods include, for example, in vitro recombinant DNA techniques, synthesis techniques, and in vivo genetic recombination. Also provided are replicable vectors containing a nucleotide sequence encoding an antibody molecule described herein, an antibody heavy or light chain, an antibody heavy chain or light chain variable domain or portion thereof, or a heavy or light chain CDR operably linked to a promoter. Such vectors, for example, may include a nucleotide sequence encoding the constant region of an antibody molecule (see, for example, International Publications Nos. WO 86/05807 and WO 89/01036; and US Pat. No. 5,122,464), and the antibody variable domains may be cloned into such a vector for expressing the entire heavy chain, the entire light chain, or all the heavy and light chains. The expression vector can be transferred into a cell (eg, a host cell) using standard techniques, and the resulting cells can then be cultured using standard techniques to produce an antibody described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR) or its fragment. Thus, provided herein are host cells containing a polynucleotide encoding an antibody described herein (e.g., an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR), or fragments thereof (e.g., a heavy or light chain or fragment thereof), functionally linked to a promoter for expression of such sequences in a host cell. In certain embodiments, for the expression of dual chain antibodies, vectors encoding both the heavy and light chains separately can be co-expressed in a host cell to express the entire immunoglobulin molecule, as described in detail below. In certain embodiments, the host cell contains a vector containing a polynucleotide encoding both the heavy chain and the light chain of an antibody described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR), or a fragment thereof. In specific embodiments, the host cell contains two different vectors, wherein the first vector contains a polynucleotide encoding the heavy chain or heavy chain variable region of an antibody described herein (e.g., an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR), or a fragment thereof, and the second vector contains a polynucleotide encoding the light chain or light chain variable region of an antibody described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR), or a fragment thereof. In other embodiments, the first host cell comprises a first vector containing a polynucleotide encoding the heavy chain or heavy chain variable region of an antibody described herein (e.g., an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR), or a fragment thereof, and a second host cell contains a second vector containing a polynucleotide encoding a light chain or an an light chain variable region
- 79 046360 титела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044). В конкретных вариантах осуществления тяжелая цепь/вариабельная область тяжелой цепи, экспрессируемая первой клеткой, связывается с легкой цепью/вариабельной областью легкой цепи второй клетки с образованием антитела к ОХ40, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044). В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрена популяция клеток-хозяев, предусматривающая такую первую клетку-хозяина и такую вторую клеткухозяина. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрена популяция векторов, предусматривающая первый вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий легкую цепь/вариабельную область легкой цепи антитела к ОХ40, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044), и второй вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь/вариабельную область тяжелой цепи антитела к ОХ40, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044). Множество систем хозяинвектор экспрессии может быть использовано для экспрессии молекул антител, описанных в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044) (см., например, патент США № 5807715). Такие системы хозяин-вектор экспрессии представлены носителями, с помощью которых кодирующие последовательности, представляющие интерес, можно получать и затем очищать, но также представлены клетками, которые, будучи трансформированными или трансфицированными с помощью подходящих нуклеотидных кодирующих последовательностей, могут экспрессировать молекулу антитела, описанного в данном документе, in situ. Они включают без ограничения микроорганизмы, такие как бактерии (например, Е. coli и В. subtilis), трансформированные векторами экспрессии на основе рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие антитела последовательности; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные векторами экспрессии на основе рекомбинантных дрожжей, содержащими кодирующие антитела последовательности; системы клеток насекомых, инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии на основе вируса (например, бакуловирусов), содержащие кодирующие антитела последовательности; системы растительных клеток (например, зеленых водорослей, таких как Chlamydomonas reinhardtii), инфицированные рекомбинантными векторами экспрессии на основе вируса (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии на основе плазмиды (например, Ti-плазмиды), содержащими кодирующие антитела последовательности; или системы клеток млекопитающих (например, клетки COS (например, COS1 или COS), CHO, BHK, MDCK, НЕК 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa и NIH 3Т3, HEK293Т, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 и ВМТ10), несущие рекомбинантные конструкции для экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор 7.5K вируса осповакцины). В конкретных вариантах осуществления клетки для экспрессии антител, описанных в данном документе (например, антитела, содержащего CDR из любого из антител pab1949 или pab2044), представляют собой клетки СНО, например, клетки СНО из системы CHO GS System™ (Lonza). В конкретном варианте осуществления клетки для экспрессии антител, описанных в данном документе, представляют собой клетки человека, например, линии клеток человека. В конкретном варианте осуществления вектор экспрессии млекопитающих представляет собой pOptiVEC™ или pcDNA3.3. В конкретном варианте осуществления для экспрессии рекомбинантной молекулы антитела применяют бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, или эукариотические клетки (например, клетки млекопитающих), в частности, для экспрессии всей рекомбинантной молекулы антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО), совместно с вектором, таким как главный промоторный элемент гена средне-раннего ответа из цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему экспрессии антител (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105; и Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667). В определенных вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, получены с использованием клеток СНО или клеток NS0. В конкретном варианте осуществления экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела, описанные в данном документе, которые иммуноспецифично связываются с ОХ40 (например, ОХ40 человека), регулируется с помощью конститутивного промотора, индуцируемого промотора или тканеспецифичного промотора.- 79 046360 antibody described in this document (for example, an antibody containing CDR pab1949 or pab2044). In specific embodiments, the heavy chain/heavy chain variable region expressed by the first cell binds to the light chain/light chain variable region of the second cell to form an anti-OX40 antibody described herein (e.g., an antibody comprising the pab1949 or pab2044 CDR). In certain embodiments, a population of host cells is provided herein, including such a first host cell and such a second host cell. In a specific embodiment, provided herein is a vector population comprising a first vector comprising a polynucleotide encoding the light chain/light chain variable region of an anti-OX40 antibody described herein (e.g., an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR) and a second vector containing a polynucleotide encoding the heavy chain/heavy chain variable region of an anti-OX40 antibody described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR). A variety of host vector expression systems can be used to express the antibody molecules described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR) (see, eg, US Pat. No. 5,807,715). Such host-vector expression systems include vehicles from which coding sequences of interest can be produced and then purified, but also include cells that, when transformed or transfected with suitable nucleotide coding sequences, can express an antibody molecule described herein. document, in situ. These include, but are not limited to, microorganisms such as bacteria (eg, E. coli and B. subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or cosmid DNA expression vectors containing antibody coding sequences; yeast (eg, Saccharomyces Pichia) transformed with recombinant yeast expression vectors containing antibody coding sequences; insect cell systems infected with recombinant virus-based expression vectors (eg, baculoviruses) containing antibody coding sequences; plant cell systems (eg, green algae such as Chlamydomonas reinhardtii) infected with recombinant virus-based expression vectors (eg, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or transformed with recombinant plasmid-based expression vectors (eg, Ti -plasmids) containing antibody coding sequences; or mammalian cell systems (e.g. COS cells (e.g. COS1 or COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa and NIH 3T3, HEK293T, HepG2, SP210, R1 .1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 and BMT10) carrying recombinant expression constructs containing promoters derived from the genome of mammalian cells (e.g. metallothionein promoter) or mammalian viruses (e.g. adenovirus late promoter; promoter 7.5 K vaccinia virus). In specific embodiments, the cells for expressing the antibodies described herein (eg, an antibody comprising a CDR from any of the pab1949 or pab2044 antibodies) are CHO cells, for example, CHO cells from the CHO GS System™ (Lonza). In a specific embodiment, the cells for expressing the antibodies described herein are human cells, for example, human cell lines. In a specific embodiment, the mammalian expression vector is pOptiVEC™ or pcDNA3.3. In a specific embodiment, bacterial cells such as Escherichia coli or eukaryotic cells (eg, mammalian cells) are used to express the recombinant antibody molecule, particularly to express the entire recombinant antibody molecule. For example, mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells, together with a vector such as the major promoter element of the mid-early response gene from human cytomegalovirus, provide an efficient antibody expression system (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45 : 101-105; and Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667). In certain embodiments, the antibodies described herein are produced using CHO cells or NS0 cells. In a specific embodiment, the expression of nucleotide sequences encoding antibodies described herein that immunospecifically bind to OX40 (eg, human OX40) is regulated by a constitutive promoter, an inducible promoter, or a tissue-specific promoter.
В случае бактериальных систем можно преимущественно выбирать целый ряд векторов экспрессии в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемой молекулы антитела. Например, если необходимо получить большое количество такого антитела для получения фармацевтических композиций на основе молекулы антитела, могут быть желательны векторы, которые управляют экспрессией высоких уровней продуктов в виде белков слияния, которые легко очистить. Такие векторы включают без ограничения вектор экспрессии для Е. coli pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill В (1983) EMBO J 2: 17911794), в котором кодирующая антитело последовательность может быть лигирована отдельно в вектор в рамку с кодирующей областью гена lac Z таким образом, что продуцируется белок слияния; векторы pIN (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol ChemIn the case of bacterial systems, a variety of expression vectors can advantageously be selected depending on the intended use of the antibody molecule being expressed. For example, if large quantities of such an antibody are needed to produce pharmaceutical compositions based on the antibody molecule, vectors that drive the expression of high levels of fusion protein products that are easy to purify may be desirable. Such vectors include, but are not limited to, the expression vector for E. coli pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 17911794), in which the antibody coding sequence can be ligated separately into the vector in frame with the coding region of the lac Z gene such in a manner that a fusion protein is produced; pIN vectors (Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem
- 80 046360- 80 046360
24: 5503-5509) и т.п. Например, также можно использовать векторы pGEX для экспрессии чужеродных полипептидов в виде белков, слитых с глутатион-5-трансферазой (GST). В целом, такие белки слияния являются растворимыми, и их можно легко очищать из лизированных клеток посредством адсорбции и связывания с матрицей на основе глутатион-агарозных гранул с последующим элюированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX разработаны таким образом, что они включают сайты расщепления для протеаз тромбина или фактора Ха, так что клонируемый целевой продукт гена можно освобождать от GST-фрагмента.24: 5503-5509), etc. For example, pGEX vectors can also be used to express foreign polypeptides as glutathione 5-transferase (GST) fused proteins. In general, such fusion proteins are soluble and can be easily purified from lysed cells by adsorption and binding to a glutathione agarose bead matrix followed by elution in the presence of free glutathione. pGEX vectors are designed to include cleavage sites for thrombin or factor Xa proteases so that the target gene product to be cloned can be freed from the GST moiety.
В системе на основе клеток насекомых, как правило, в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов может быть использован, например, вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующую антитело последовательность можно отдельно клонировать в несущественные области вируса (например, ген полиэдрина) и поместить под контроль промотора AcNPV (например, промотора гена полиэдрина).In a system based on insect cells, typically, for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) can be used as a vector for the expression of foreign genes. The virus grows in Spodoptera frugiperda cells. The antibody coding sequence can be separately cloned into non-essential regions of the virus (eg, the polyhedrin gene) and placed under the control of the AcNPV promoter (eg, the polyhedrin gene promoter).
В клетках-хозяевах, являющихся клетками млекопитающих, можно использовать множество вирусных систем экспрессии. В случаях, когда в качестве вектора экспрессии применяют аденовирус, кодирующую антитело последовательность, представляющую интерес, можно лигировать с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например, содержащим поздний промотор и лидерную последовательность из трех частей. Данный химерный ген можно затем вставлять в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) будет приводить к образованию рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать молекулу антитела в инфицированных хозяевах (например, см. Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81: 3655-3659). Для эффективной трансляции вставленных последовательностей, кодирующих антитело, также могут быть необходимы конкретные сигналы инициации. Эти сигналы предусматривают инициирующий кодон ATG и прилежащие последовательности. Кроме того, кодон инициации должен находиться в рамке считывания желаемой кодирующей последовательности с целью обеспечения трансляции всей вставки. Эти экзогенные сигналы контроля трансляции и инициирующие кодоны могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения соответствующих транскрипционных энхансерных элементов, терминаторов транскрипции и т.п. (см., например, Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol 153: 516-544).A variety of viral expression systems can be used in mammalian host cells. In cases where an adenovirus is used as the expression vector, the antibody coding sequence of interest can be ligated to an adenovirus transcription/translation control complex, for example, containing a three-part late promoter and leader sequence. This chimeric gene can then be inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into a non-essential region of the viral genome (eg, the E1 or E3 region) will result in the formation of a recombinant virus that is viable and capable of expressing the antibody molecule in infected hosts (eg, see Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81: 3655- 3659). Specific initiation signals may also be required for efficient translation of inserted antibody coding sequences. These signals include an ATG start codon and adjacent sequences. In addition, the initiation codon must be in frame of the desired coding sequence to ensure translation of the entire insert. These exogenous translation control signals and start codons can have various origins, both natural and synthetic. Expression efficiency can be increased by including appropriate transcription enhancer elements, transcription terminators, and the like. (See, for example, Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol 153: 516-544).
Кроме того, может быть выбран такой штамм клеток-хозяев, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и осуществляет процессинг продукта гена определенным требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Различные клетки-хозяева имеют характерные и специфические механизмы посттрансляционного процессинга и модификаций белков, а также продуктов генов. Можно выбрать подходящие линии клеток или системы экспрессии в хозяине для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка. В связи с этим можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для надлежащего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения клетки СНО, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3Т3, W138, ВТ483, Hs578T, HTB2, ВТ2О и T47D, NS0 (клеточная линия миеломы мыши, которая не продуцирует эндогенно каких-либо цепей иммуноглобулинов), CRL7O3O, COS (например, COS1 или COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, bSc40, YB/20, BMT10 и HsS78Bst. В определенных вариантах осуществления антитела к ОХ40, описанные в данном документе (например, антитело, содержащее CDR pab1949 или pab2044), вырабатываются в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО.In addition, a host cell strain may be selected that modulates the expression of the inserted sequences or modifies and processes the gene product in a particular desired manner. Such modifications (eg, glycosylation) and processing (eg, cleavage) of protein products may be important for protein function. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for post-translational processing and modification of proteins and gene products. Suitable cell lines or host expression systems can be selected to ensure proper modification and processing of the foreign protein being expressed. In this regard, it is possible to use eukaryotic host cells that possess the cellular machinery for proper processing of the primary transcript, glycosylation and phosphorylation of the gene product. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O, and T47D, NS0 cells (a mouse myeloma cell line that does not endogenously produce any or immunoglobulin chains), CRL7O3O, COS (for example, COS1 or COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, bSc40, YB/20, BMT10 and HsS78Bst. In certain embodiments, the anti-OX40 antibodies described herein (eg, an antibody comprising the pab1949 or pab2044 CDR) are produced in mammalian cells, such as CHO cells.
В конкретном варианте осуществления антитела, описанные в данном документе, имеют сниженное содержание фукозы или не содержат фукозу. Такие антитела могут быть получены с помощью методик, известных специалисту в данной области техники. Например, антитела могут экспрессироваться в клетках с недостаточной способностью к фукозилированию или ее отсутствием. В конкретном примере клеточные линии с нокаутом обоих аллелей гена а1,6-фукозилтрансферазы могут быть использованы для получения антител со сниженным содержанием фукозы. Система Potelligent® (Lonza) представляет собой пример такой системы, которая может быть использована для получения антител со сниженным содержанием фукозы.In a specific embodiment, the antibodies described herein have reduced fucose content or do not contain fucose. Such antibodies can be prepared using techniques known to one skilled in the art. For example, antibodies may be expressed in cells with insufficient or absent fucosylation capacity. In a specific example, cell lines with knockout of both alleles of the α1,6-fucosyltransferase gene can be used to produce antibodies with reduced fucose content. The Potelligent® system (Lonza) is an example of such a system that can be used to produce antibodies with reduced fucose content.
Для долгосрочной выработки рекомбинантных белков с высоким выходом могут быть получены клетки для стабильной экспрессии. Например, могут быть разработаны клеточные линии, которые стабильно экспрессируют антитело к ОХ40, описанное в данном документе (например, антитело, содержащее CDR pab1949 или pab2044). В конкретных вариантах осуществления клетка, предусмотренная в данном документе, стабильно экспрессирует легкую цепь/вариабельный домен легкой цепи и тяжелую цепь/вариабельный домен тяжелой цепи, которые связываются с образованием антитела, описанного в данном документе (например, антитела, содержащего CDR pab1949 или pab2044).For long-term production of recombinant proteins in high yield, cells can be produced for stable expression. For example, cell lines can be developed that stably express the anti-OX40 antibody described herein (eg, an antibody containing the pab1949 or pab2044 CDR). In specific embodiments, a cell provided herein stably expresses a light chain/light chain variable domain and a heavy chain/heavy chain variable domain that bind to form an antibody described herein (e.g., an antibody comprising the pab1949 or pab2044 CDR) .
В определенных аспектах вместо применения векторов экспрессии, которые содержат вирусныеIn certain aspects, instead of using expression vectors that contain viral
- 81 046360 точки начала репликации, клетки-хозяева можно трансформировать с помощью ДНК, контролируемой подходящими элементами контроля экспрессии (например, последовательностями промотора, энхансера, терминаторов транскрипции, сайтов полиаденилирования и т.д.), и содержащей селектируемый маркер. После введения чужеродной ДНК/полинуклеотида сконструированные клетки могут расти в течение 1-2 дней на обогащенной среде, а затем их переводят на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к селекции и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать, и количество которых можно увеличить с получением клеточных линий. Данный способ может быть преимущественно использован для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют антитело к ОХ40, описанное в данном документе, или его фрагмент. Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно пригодны при скрининге и оценке композиций, которые взаимодействуют прямо или косвенно с молекулой антитела.- 81 046360 origins of replication, host cells can be transformed with DNA controlled by suitable expression control elements (eg promoter sequences, enhancer sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and containing a selectable marker. After the introduction of foreign DNA/polynucleotide, the engineered cells can grow for 1-2 days in an enriched medium, and then they are transferred to a selective medium. A selectable marker in a recombinant plasmid confers resistance to selection and allows cells to stably integrate the plasmid into their chromosomes and grow into foci, which in turn can be cloned and expanded into cell lines. This method can be advantageously used to construct cell lines that express the anti-OX40 antibody described herein, or a fragment thereof. Such engineered cell lines may be particularly useful in the screening and evaluation of compositions that interact directly or indirectly with an antibody molecule.
Может быть использован ряд систем для селекции, в том числе без ограничения могут быть использованы гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-232), гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-823) в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, устойчивость к антиметаболитам может быть использована в качестве основы отбора для следующих генов: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler М et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-3570; O'Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-1531); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; и Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Feigner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156). Способы, общеизвестные в области технологии рекомбинантных ДНК, можно применять обычным путем для выбора желаемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в Ausubel FM et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); и в главах 12 и 13 Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14, которые включены посредством ссылки в данный документ во всей своей полноте.A number of selection systems can be used, including but not limited to the herpes simplex virus thymidine kinase genes (Wigler M et al., (1977) Cell 11(1): 223-232), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase genes (Szybalska EH & Szybalski W (1962) PNAS 48(12): 2026-2034) and adenine phosphoribosyltransferase (Lowy I et al., (1980) Cell 22(3): 817-823) in tk-, hgprt- or aprt-cells, respectively. In addition, antimetabolite resistance can be used as a basis for selection for the following genes: dhfr, which confers resistance to methotrexate (Wigler M et al., (1980) PNAS 77(6): 3567-3570; O'Hare K et al. ., (1981) PNAS 78: 1527-1531); gpt, which confers resistance to mycophenolic acid (Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076); neo, which confers resistance to aminoglycoside G-418 (Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926 -932; and Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Feigner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215); and hygro, which confers resistance to hygromycin (Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156). Methods generally known in the field of recombinant DNA technology can be used in the usual way to select the desired recombinant clone, and such methods are described, for example, in Ausubel FM et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in chapters 12 and 13 of Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al., (1981) J Mol Biol 150: 1-14, which are incorporated by reference herein in their entirety.
Уровни экспрессии молекулы антитела могут быть повышены посредством амплификации вектора (обзор см. в Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Если маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, то при повышении уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, будет повышаться число копий маркерного гена. Поскольку амплифицируемая область связана с геном антитела, выработка антитела также будет повышаться (Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).Expression levels of an antibody molecule can be increased by vector amplification (for a review, see Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). If the marker in the vector system expressing the antibody is amplifiable, then as the level of inhibitor present in the host cell culture increases, the copy number of the marker gene will increase. Since the amplified region is associated with the antibody gene, antibody production will also be increased (Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66).
Клетка-хозяин также может быть трансфицирована совместно двумя или более векторами экспрессии, описанными в данном документе, при этом первый вектор кодирует полипептид, происходящий из тяжелой цепи, и второй вектор кодирует полипептид, происходящий из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые обеспечивают равную экспрессию полипептидов тяжелой и легкой цепей. Клетки-хозяева могут быть трансфицированы совместно различными количествами двух или более векторов экспрессии. Например, клетки-хозяева могут быть трансфицированы любым одним из следующих соотношений первого вектора экспрессии и второго вектора экспрессии: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 или 1:50.A host cell can also be co-transfected with two or more expression vectors described herein, the first vector encoding a heavy chain-derived polypeptide and the second vector encoding a light chain-derived polypeptide. The two vectors may contain identical selectable markers that provide equal expression of the heavy and light chain polypeptides. Host cells can be co-transfected with varying amounts of two or more expression vectors. For example, host cells can be transfected with any one of the following ratios of the first expression vector and the second expression vector: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1 :8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 or 1:50.
Альтернативно, может быть использован один вектор, который кодирует и способен экспрессировать полипептиды как легкой, так и тяжелой цепей. В таких случаях легкая цепь должна быть расположена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсической свободной тяжелой цепи (Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; и Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). Кодирующие последовательности для тяжелой и легкой цепей могут включать кДНК или геномную ДНК. Вектор экспрессии может быть моноцистронным или мультицистронным. Мультицистронная конструкция нуклеиновой кислоты может кодировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, или в диапазоне от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 20 генов/нуклеотидных последовательностей. Например, бицистронная конструкция нуклеиновой кислоты может содержать в следующем порядке промотор, первый ген (например, кодирующий тяжелую цепь антитела, описанного в данном документе) и второй ген (например, кодирующий легкую цепь антитела, описанного в данном документе). В таком векторе экспрессии транскрипция обоих генов может контролироваться промотором, в то время как трансляция мРНК первого гена может контролироваться с помощью кэп-зависимого сканирующего механизма, а трансляция мРНК второго гена может контролироваться с помощью кэп-независимого механизма, например, с помощью IRES.Alternatively, a single vector may be used that encodes and is capable of expressing both light and heavy chain polypeptides. In such cases, the light chain must be positioned before the heavy chain to avoid excess toxic free heavy chain (Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; and Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). The coding sequences for the heavy and light chains may include cDNA or genomic DNA. The expression vector can be monocistronic or multicistronic. A multicistronic nucleic acid construct may encode 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more, or in the range of 2 to 5, 5 to 10, or 10 to 20 genes/nucleotide sequences. For example, a bicistronic nucleic acid construct may comprise, in the order of a promoter, a first gene (eg, encoding the heavy chain of an antibody described herein) and a second gene (eg, encoding a light chain of an antibody described herein). In such an expression vector, the transcription of both genes can be controlled by a promoter, while the translation of the mRNA of the first gene can be controlled by a cap-dependent scanning mechanism, and the translation of the mRNA of the second gene can be controlled by a cap-independent mechanism, such as an IRES.
После получения молекулы антитела, описанного в данном документе, путем рекомбинантной экспрессии, оно может быть очищено любым известным в данной области техники способом очистки молеOnce the antibody molecule described herein has been produced by recombinant expression, it can be purified by any molecular purification method known in the art.
- 82 046360 кулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной, в частности, по аффинности в отношении специфического антигена после хроматографии с белком А и эксклюзионной колоночной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики очистки белков. Кроме того, антитела, описанные в данном документе, могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом известными из уровня техники, для облегчения очистки.- 82 046360 immunoglobulin samples, for example, by chromatography (for example, ion exchange, affinity, in particular affinity for a specific antigen after protein A chromatography and size exclusion column chromatography), centrifugation, differential solubility or any other standard purification technique proteins. In addition, the antibodies described herein can be fused to heterologous polypeptide sequences described herein or otherwise known in the art to facilitate purification.
В конкретном варианте осуществления антитело, описанное в данном документе, является выделенным или очищенным. Как правило, выделенное антитело является таковым, которое практически не содержит других антител с другой антигенной специфичностью, чем выделенное антитело. Например, в конкретном варианте осуществления препарат антитела, описанного в данном документе, практически не содержит клеточного материала и/или предшественников химических веществ. Выражение практически не содержит клеточного материла включает препараты антитела, в которых антитело отделено от клеточных компонентов клеток, из которых оно выделено или получено рекомбинантным путем. Таким образом, антитело, которое практически не содержит клеточного материала, включает препараты антитела, содержащие менее чем приблизительно 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% (от сухого веса) гетерологичного белка (также обозначаемого в данном документе как загрязняющий белок) и/или вариантов антитела, например, различных пост-трансляционно модифицированных форм антитела. Если антитело или его фрагмент получены рекомбинантным путем, они, как правило, также практически не содержат среды для культивирования, т.е., среда для культивирования составляет менее чем приблизительно 20%, 10%, 2%, 1%, 0,5% или 0,1% от объема препарата белка. Если антитело или его фрагмент получены с помощью химического синтеза, они, как правило, практически не содержат предшественников химических веществ или других химических веществ, т.е., они отделены от предшественников химических веществ или других химических веществ, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно такие препараты антитела или его фрагмента содержат менее чем приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (от сухого веса) предшественников химических веществ или соединений, отличных от представляющего интерес антитела или его фрагмента. В конкретном варианте осуществления антитела, описанные в данном документе, являются выделенными или очищенными.In a specific embodiment, the antibody described herein is isolated or purified. Typically, an isolated antibody is one that contains substantially no other antibodies with a different antigenic specificity than the isolated antibody. For example, in a particular embodiment, the antibody preparation described herein contains substantially no cellular material and/or chemical precursors. The expression substantially free of cellular material includes antibody preparations in which the antibody is separated from the cellular components of the cells from which it is isolated or recombinantly produced. Thus, an antibody that is substantially free of cellular material includes antibody preparations containing less than about 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, or 0.1% (dry basis) weight) of a heterologous protein (also referred to herein as a contaminant protein) and/or antibody variants, for example, various post-translationally modified forms of the antibody. If the antibody or fragment thereof is produced recombinantly, it typically also contains substantially no culture medium, i.e., the culture medium is less than about 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5% or 0.1% of the volume of the protein preparation. If an antibody or fragment thereof is produced by chemical synthesis, it typically contains substantially no precursor chemicals or other chemicals, i.e., it is separate from precursor chemicals or other chemicals that are involved in protein synthesis. Accordingly, such preparations of an antibody or fragment thereof contain less than about 30%, 20%, 10% or 5% (by dry weight) of precursor chemicals or compounds other than the antibody or fragment thereof of interest. In a specific embodiment, the antibodies described herein are isolated or purified.
5.4 Фармацевтические композиции5.4 Pharmaceutical compositions
В данном документе предусмотрены композиции, содержащие антитело, описанное в данном документе, характеризующееся необходимой степенью чистоты, в физиологически приемлемом носителе, вспомогательном веществе или стабилизаторе (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при применяемых дозах и концентрациях.Provided herein are compositions containing the antibody described herein, of the required degree of purity, in a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to recipients at the doses and concentrations used.
Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут быть пригодны для усиления, индукции или запуска активности ОХ40 и лечения состояния, такого как рак или инфекционное заболевание. Примеры рака, который можно лечить в соответствии со способами, описанными в данном документе, включают без ограничения виды В-клеточной лимфомы (например, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, В-клеточную неходжкинскую лимфому, В-клеточную лимфому кожи, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, базальноклеточную карциному, рак мочевого пузыря, бластому, метастазы в головной мозг, рак молочной железы, лимфому Беркитта, карциному (например, аденокарциному (например, гастроэзофагеального соединения)), рак шейки матки, рак толстой кишки, колоректальный рак (рак толстой кишки и рак прямой кишки), карциному эндометрия, рак пищевода, саркому Юинга, фолликулярную лимфому, рак желудка, карциному гастроэзофагеального соединения, рак желудочно-кишечного тракта, глиобластому (например, мультиформную глиобластому, например, впервые диагностированную или рекуррентную), глиому, рак головы и шеи (например, плоскоклеточную карциному головы и шеи), метастазы в печень, лимфому Ходжкина и неходжкискую лимфому, рак почки (например, почечно-клеточную карциному и опухоли Вильмса), рак гортани, лейкоз (например, хронический миелоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз), рак печени (например, гепатокарциному и гепатому), рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого и мелкоклеточный рак легкого), лимфобластную лимфому, лимфому, мантийноклеточную лимфому, метастатическую опухоль головного мозга, метастатический рак, миелому (например, множественную миелому), нейробластому, меланому глаза, рак ротоглотки, остеосаркому, рак яичников, рак поджелудочной железы (например, аденокарциному протоков поджелудочной железы), рак предстательной железы (например, гормонально-рефрактерный (например, кастрационно-резистентный), метастатический, метастатический гормонально-рефрактерный (например, кастрационно-резистентный, андроген-независимый)), почечноклеточную карциному (например, метастатическую), карциному слюнных желез, саркому (например, рабдомиосаркому), рак кожи (например, меланому (например, метастатическую меланому)), саркому мягких тканей, солидную опухоль, плоскоклеточную карциному, саркому синовиальных оболочек, рак яичка, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак (рак уротелиальных клеток), увеальную меланому (например, метастатическую), веррукозную карциному, рак вульвы и макроглобулинемию Вальденстрема. В одном варианте осуществления примеры рака, который можно лечить в соответствии со способами, описанными в данном документе, включают без ограничения прогрессирующую, рекуррентThe pharmaceutical compositions described herein may be useful for enhancing, inducing or triggering OX40 activity and treating a condition such as cancer or an infectious disease. Examples of cancers that can be treated in accordance with the methods described herein include, but are not limited to, types of B-cell lymphoma (eg, B-cell chronic lymphocytic leukemia, B-cell non-Hodgkin's lymphoma, cutaneous B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, cell lymphoma, basal cell carcinoma, bladder cancer, blastoma, brain metastases, breast cancer, Burkitt's lymphoma, carcinoma (eg, adenocarcinoma (eg, gastroesophageal junction)), cervical cancer, colon cancer, colorectal cancer (colon cancer) colon and rectal cancer), endometrial carcinoma, esophageal cancer, Ewing's sarcoma, follicular lymphoma, gastric cancer, gastroesophageal junction carcinoma, gastrointestinal cancer, glioblastoma (eg, glioblastoma multiforme, eg, newly diagnosed or recurrent), glioma, cancer head and neck (eg, squamous cell carcinoma of the head and neck), liver metastases, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, kidney cancer (eg, renal cell carcinoma and Wilms tumors), laryngeal cancer, leukemia (eg, chronic myelocytic leukemia, hairy cell leukemia ), liver cancer (eg, hepatocarcinoma and hepatoma), lung cancer (eg, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer), lymphoblastic lymphoma, lymphoma, mantle cell lymphoma, metastatic brain tumor, metastatic cancer, myeloma (eg, multiple myeloma), neuroblastoma, ocular melanoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer (eg, pancreatic ductal adenocarcinoma), prostate cancer (eg, hormone-refractory (eg, castration-resistant), metastatic, metastatic hormone-refractory (eg , castration-resistant, androgen-independent)), renal cell carcinoma (eg, metastatic), salivary gland carcinoma, sarcoma (eg, rhabdomyosarcoma), skin cancer (eg, melanoma (eg, metastatic melanoma)), soft tissue sarcoma, solid tumor , squamous cell carcinoma, synovial sarcoma, testicular cancer, thyroid cancer, transitional cell carcinoma (urothelial cell cancer), uveal melanoma (eg, metastatic), verrucous carcinoma, vulvar cancer, and Waldenström's macroglobulinemia. In one embodiment, examples of cancer that can be treated in accordance with the methods described herein include, but are not limited to, progressive, recurrent
- 83 046360 ную или метастатическую солидную опухоль, лимфому (например, диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому или лимфому Беркитта), рак молочной железы, рак предстательной железы, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак толстой кишки, меланому (например, метастатическую меланому), рак эндометрия, почечно-клеточную карциному, светлоклеточную карциному, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого или аденокарциному легких), рак яичников, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак желудка, рак матки, феохромоцитому, метастатическую плоскоклеточную карциному кожи (например, у пациентов с трансплантацией), карциному из клеток Меркеля, Тклеточную лимфому кожи, нейроэндокринную опухоль, опухоль костного происхождения (например, остеосаркому), гемангиоперицитому, опухоль, связанную с генетическими синдромами (NF1 или VHL), хордому, эпендимому, медуллобластому, герминому, опухоль тонкой кишки, опухоль аппендикса и опухоль, связанную с вирусами (например, саркому Капоши). Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, предусмотрены в одном варианте осуществления для применения в качестве лекарственного препарата или диагностического средства. Фармацевтические композиции, которые содержат агонистическое антитело, описанное в данном документе, предусмотрены в одном варианте осуществления для применения в способе лечения рака. Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, которые содержат антагонистическое антитело, могут быть пригодны для ослабления, ингибирования или прекращения активности ОХ40 и лечения состояния, такого как воспалительное или аутоиммунное заболевание или нарушение или инфекционное заболевание. Фармацевтические композиции, которые содержат антагонистическое антитело, описанное в данном документе, предусмотрены в одном варианте осуществления для применения в способе лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания или нарушения или инфекционного заболевания.- 83 046360 new or metastatic solid tumor, lymphoma (for example, diffuse large cell lymphoma or Burkitt's lymphoma), breast cancer, prostate cancer, head and neck cancer, colorectal cancer, colon cancer, melanoma (for example, metastatic melanoma), endometrial cancer, renal cell carcinoma, clear cell carcinoma, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer or lung adenocarcinoma), ovarian cancer, gastrointestinal cancer, bladder cancer, stomach cancer, uterine cancer, pheochromocytoma, metastatic squamous cell carcinoma of the skin ( eg, transplant patients), Merkel cell carcinoma, Cutaneous T-cell lymphoma, neuroendocrine tumor, tumor of bone origin (eg, osteosarcoma), hemangiopericytoma, tumor associated with genetic syndromes (NF1 or VHL), chordoma, ependymoma, medulloblastoma, germinoma , tumor of the small intestine, tumor of the appendix, and tumor associated with viruses (eg, Kaposi's sarcoma). The pharmaceutical compositions described herein are provided in one embodiment for use as a drug or diagnostic agent. Pharmaceutical compositions that contain an agonistic antibody described herein are provided in one embodiment for use in a method of treating cancer. Pharmaceutical compositions described herein that contain an antagonistic antibody may be useful for attenuating, inhibiting or stopping OX40 activity and treating a condition such as an inflammatory or autoimmune disease or disorder or infectious disease. Pharmaceutical compositions that contain an antagonistic antibody described herein are provided in one embodiment for use in a method of treating an inflammatory or autoimmune disease or disorder or infectious disease.
Фармацевтические композиции, описанные в данном документе, которые содержат антагонистическое антитело, описанное в данном документе, могут быть пригодны в ослаблении, прекращении или ингибировании активности ОХ40 и лечении состояния, выбранного из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, ассоциированного с инфекций, артрита, ревматоидного артрита, астмы, хронической обструктивной болезни легких (COPD), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта, диабета I типа, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, увеита, аутоиммунного увеита, иммуноопосредованных воспалительных заболеваний центральной и периферической нервной системы, таких как рассеянный склероз, волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, дерматита, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, базедовой болезни, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, грануломатоза Вегенера, панкреатита, физического повр еждения (хирургического), болезни трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца (т.е., сердечнососудистого заболевания), в том числе ишемических заболеваний, таких как инфаркт миокарда, а также атеросклероз и внутрисосудистая коагуляция, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии, нейромиелита зрительного нерва, целиакии, нарушения, связанного с соединительной тканью (например, волчанки), постинфекционного воспалительного нарушения (например, синдром Гийена-Барре) и паранеопластических синдромов.Pharmaceutical compositions described herein that contain an antagonistic antibody described herein may be useful in attenuating, stopping or inhibiting OX40 activity and treating a condition selected from the group consisting of infections (viral, bacterial, fungal and parasitic), endotoxic shock associated with infections, arthritis, rheumatoid arthritis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), pelvic inflammatory disease, Alzheimer's disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disease, pilonidal disease, peritonitis, psoriasis, vasculitis, surgical adhesions, stroke, type I diabetes, Lyme disease, arthritis, meningoencephalitis, uveitis, autoimmune uveitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system such as multiple sclerosis, lupus (such as systemic erythematosus) lupus) and giyen-barre syndrome, dermatitis, atopic dermatitis, autoimmune hepatitis, fibrosing alveolitis, based disease, iga-nefropathy, idiopathic thrombocytopenic purple, Meniere's disease, primary biliary cirrhosis, sarcoidosis, granulomatosis, granulomas Vegenera, pancreatitis, physical disease (surgical), graft-versus-host disease, graft rejection, heart disease (i.e., cardiovascular disease), including ischemic diseases such as myocardial infarction, as well as atherosclerosis and intravascular coagulation, bone resorption, osteoporosis, osteoarthritis, periodontitis, hypochlorhydria, neuromyelitis optica, celiac disease, connective tissue disorders (eg, lupus), post-infectious inflammatory disorder (eg, Guillain-Barré syndrome) and paraneoplastic syndromes.
Композиции, подлежащие применению для in vivo введения, могут быть стерильными. Это легко достигается с помощью фильтрации, например, через стерильные фильтрующие мембраны.Compositions to be used for in vivo administration may be sterile. This is easily achieved by filtration, for example through sterile filter membranes.
5.5 Применения и способы5.5 Applications and methods
5.5.1 Терапевтические применения и способы5.5.1 Therapeutic uses and methods
В одном аспекте в данном документе предусмотрены способы модулирования одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40, описанного в данном документе, или композиции на его основе. В конкретном аспекте в данном документе предусмотрены способы активации, усиления или индукции одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы предупреждения и/или лечения заболеваний, при которых желательно активировать или усиливать одну или несколько иммунных функций или ответов, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40, описанного в данном документе, или композиции на его основе. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения инфекционного заболевания, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. Рак может быть выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки и рака предстательной железы. Рак может быть выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака предстательной железы, рака толстой кишки и рака легкого. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения меланомы, включающие введениеIn one aspect, provided herein are methods of modulating one or more immune functions or responses in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody described herein, or a composition thereof. In a specific aspect, provided herein are methods of activating, enhancing or inducing one or more immune functions or responses in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In a specific embodiment, provided herein are methods of preventing and/or treating diseases in which it is desirable to activate or enhance one or more immune functions or responses, comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody described herein or a composition on its basis. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating an infectious disease, comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating cancer comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. The cancer may be selected from the group consisting of melanoma, kidney cancer and prostate cancer. The cancer may be selected from the group consisting of melanoma, kidney cancer, prostate cancer, colon cancer and lung cancer. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating melanoma, comprising administering
- 84 046360 субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака почки, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака предстательной железы, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака толстой кишки, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака легкого, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В одном примере способ дополнительно включает введение субъекту средства, целенаправленно воздействующего на контрольные точки. В одном примере средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, выбрано из группы, состоящей из антагонистического антитела к PD-1, антагонистического антитела к PD-L1, антагонистического антитела к PD-L2, антагонистического антитела к CTLA-4, антагонистического антитела к TIM-3, антагонистического антитела к LAG-3, антагонистического антитела к СЕАСАМ1, агонистического антитела к GITR, агонистического антитела к CD137 и агонистического антитела к ОХ40. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антагонистическое антитело к PD-1. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антагонистическое антитело к PD-L1. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой агонистическое антитело к GITR. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой агонистическое антитело к CD137.- 84 046360 to a subject in need thereof, antibodies to OX40 or compositions based on it. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating kidney cancer comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating prostate cancer comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In certain embodiments, provided herein are methods of treating colon cancer comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In certain embodiments, provided herein are methods of treating lung cancer comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In certain embodiments, provided herein are methods of treating non-small cell lung cancer (NSCLC) comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antibody or a composition thereof. In one example, the method further includes administering to the subject an agent that specifically targets control points. In one example, the checkpoint-targeting agent is selected from the group consisting of an anti-PD-1 antagonist antibody, an anti-PD-L1 antagonist antibody, an anti-PD-L2 antagonist antibody, an anti-CTLA-4 antagonist antibody, an anti-TIM-antagonist antibody, 3, anti-LAG-3 antagonist antibody, anti-CEACAM1 antagonist antibody, anti-GITR agonist antibody, anti-CD137 agonist antibody, and anti-OX40 agonist antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-PD-1 antagonist antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-PD-L1 antagonist antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-GITR agonist antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-CD137 agonistic antibody.
В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 используют в способах, раскрытых в данном документе. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой ниволумаб, также известный как BMS-936558 или MDX1106, разработанный компанией Bristol-Myers Squibb. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб, также известный как ламбролизумаб или MK-3475, разработанный компанией Merck & Со. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой пидилизумаб, также известный как СТ011, разработанный компанией CureTech. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой MEDI0680, также известный как АМР-514, разработанный компанией Medimmune. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой PDR001, разработанный компанией Novartis Pharmaceuticals. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой REGN2810, разработанный компанией Regeneron Pharmaceuticals. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой PF-06801591, разработанный компанией Pfizer. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой BGB-A317, разработанный компанией BeiGene. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой TSR-042, разработанный компаниями AnaptysBio и Tesaro. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой SHR-1210, разработанный компанией Hengrui.In certain embodiments, an anti-PD-1 antibody is used in the methods disclosed herein. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is nivolumab, also known as BMS-936558 or MDX1106, developed by Bristol-Myers Squibb. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is pembrolizumab, also known as lambrolizumab or MK-3475, developed by Merck & Co. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is pidilizumab, also known as CT011, developed by CureTech. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is MEDI0680, also known as AMP-514, developed by Medimmune. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is PDR001 developed by Novartis Pharmaceuticals. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is REGN2810, developed by Regeneron Pharmaceuticals. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is PF-06801591 developed by Pfizer. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is BGB-A317, developed by BeiGene. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is TSR-042, developed by AnaptysBio and Tesaro. In certain embodiments, the anti-PD-1 antibody is SHR-1210 developed by Hengrui.
Дополнительные неограничивающие примеры антител к PD-1, которые могут быть использованы в способах лечения, раскрытых в данном документе, раскрыты в следующих патентах и патентных заявках, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей: патенте США № 6808710; патенте США № 7332582; патенте США № 7488802; патенте США № 8008449; патенте США № 8114845; патенте США № 8168757; патенте США №8354509; патенте США № 8686119; патенте США № 8735553; патенте США № 8747847; патенте США № 8779105; патенте США № 8927697; патенте США № 8993731; патенте США №9102727; патенте США №9205148; публикации США № US 2013/0202623 А1; публикации США № US 2013/0291136 А1; публикации США № US 2014/0044738 А1; публикации США № US 2014/0356363 А1; публикации США № US 2016/0075783 А1; и публикации согласно РСТ № WO 2013/033091 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/036394 А1; публикации согласно РСТ № WO 2014/179664 А2; публикации согласно РСТ №WO 2014/209804 А1; публикации согласно РСТ № WO 2014/206107 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/058573 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/085847 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/200119 А1; публикации согласно РСТ № WO 2016/015685 А1; и публикации согласно РСТ № WO 2016/020856 А1. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 используют в способах, раскрытых в данном документе. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой атезолизумаб, разработанный компанией Genentech. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой дурвалумаб, разработанный компаниями AstraZeneca, Celgene и Medimmune. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой авелумаб, также известный как MSB0010718C, разработанный компаниями Merck Serono и Pfizer. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой MDX-1105, разработанный компанией Bristol-MyersAdditional non-limiting examples of anti-PD-1 antibodies that may be used in the treatments disclosed herein are disclosed in the following patents and patent applications, which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes: US Patent No. 6,808,710; US Patent No. 7332582; US Patent No. 7488802; US Patent No. 8008449; US Patent No. 8114845; US Patent No. 8168757; US patent No. 8354509; US Patent No. 8686119; US Patent No. 8735553; US Patent No. 8747847; US Patent No. 8779105; US Patent No. 8927697; US Patent No. 8993731; US patent No. 9102727; US patent No. 9205148; US publication No. US 2013/0202623 A1; US publication No. US 2013/0291136 A1; US publication No. US 2014/0044738 A1; US publication No. US 2014/0356363 A1; US publication No. US 2016/0075783 A1; and publications according to PCT No. WO 2013/033091 A1; publications according to PCT No. WO 2015/036394 A1; publications according to PCT No. WO 2014/179664 A2; publications according to PCT No. WO 2014/209804 A1; publications according to PCT No. WO 2014/206107 A1; publications according to PCT No. WO 2015/058573 A1; publications according to PCT No. WO 2015/085847 A1; publications according to PCT No. WO 2015/200119 A1; publications according to PCT No. WO 2016/015685 A1; and publications in accordance with PCT No. WO 2016/020856 A1. In certain embodiments, an anti-PD-L1 antibody is used in the methods disclosed herein. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody is atezolizumab developed by Genentech. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody is durvalumab developed by AstraZeneca, Celgene and Medimmune. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody is avelumab, also known as MSB0010718C, developed by Merck Serono and Pfizer. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody is MDX-1105, developed by Bristol-Myers
- 85 046360- 85 046360
Squibb. В определенных вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой AMP-224, разработанный компаниями Amplimmune и GSK. Неограничивающие примеры антител к PD-L1, которые могут быть использованы в способах лечения, раскрытых в данном документе, раскрыты в следующих патентах и патентных заявках, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей: патенте США № 7943743; патенте США № 8168179; патенте США № 8217149; патенте США № 8552154; патенте США № 8779108; патенте США № 8981063; патенте США № 9175082; публикации США № US 2010/0203056 А1; публикации США № US 2003/0232323 А1; публикации США № 2013/0323249 А1; публикации США № US 2014/0341917 А1; публикации США № US 2014/0044738 А1; публикации США № US 2015/0203580 А1; публикации США № US 2015/0225483 А1; публикации США № US 2015/0346208 А1; публикации США № US 2015/0355184 А1; и публикации согласно РСТ № WO 2014/100079 А1; публикации согласно РСТ № WO 2014/022758 А1; публикации согласно РСТ № WO 2014/055897 А2; публикации согласно РСТ № WO 2015/061668 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/109124 А1; публикации согласно РСТ № WO 2015/195163 А1; публикации согласно РСТ № WO 2016/000619 А1; и публикации согласно РСТ № WO 2016/030350 А1. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака, выбранного из группы, состоящей из видов В-клеточной лимфомы (например, В-клеточной хронической лимфоцитарной лимфомы, В-клеточной неходжкинской лимфомы, В-клеточной лимфомы кожи, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, базальноклеточной карциномы, рака мочевого пузыря, бластомы, метастазов в головной мозг, рака молочной железы, лимфомы Беркитта, карциномы (например, аденокарциномы (например, гастроэзофагеального соединения)), рака шейки матки, рака толстой кишки, колоректального рака (рака толстой кишки и рака прямой кишки), карциномы эндометрия, рака пищевода, саркомы Юинга, фолликулярной лимфомы, рака желудка, карциномы гастроэзофагеального соединения, рака желудочно-кишечного тракта, глиобластомы (например, мультиформной глиобластомы, например, впервые диагностированной или рекуррентной), глиомы, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи), метастазов в печень, лимфомы Ходжкина и неходжкиской лимфомы, рака почки (например, почечно-клеточной карциномы и опухоли Вильмса), рака гортани, лейкоза (например, хронического миелоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза), рака печени (например, гепатокарциномы и гепатомы), рака легких (например, немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого), лимфобластной лимфомы, лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, метастатической опухоли головного мозга, метастатического рак, миеломы (например, множественной миеломы), нейробластомы, меланомы глаза, рака ротоглотки, остеосаркомы, рака яичников, рака поджелудочной железы (например, аденокарциномы протоков поджелудочной железы), рака предстательной железы (например, гормонально-рефрактерного (например, кастрационно-резистентного), метастатического, метастатического гормонально-рефрактерного (например, кастрационно-резистентного, андроген-независимого)), почечноклеточной карциномы (например, метастатической), карциномы слюнных желез, саркомы (например, рабдомиосаркомы), рака кожи (например, меланомы (например, метастатической меланомы)), саркомы мягких тканей, солидной опухоли, плоскоклеточной карциномы, саркомы синовиальных оболочек, рака яичка, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака (рака уротелиальных клеток), увеальной меланомы (например, метастатической), веррукозной карциномы, рака вульвы и макроглобулинемии Вальденстрема. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения рака, выбранного из группы, состоящей из прогрессирующей, рекуррентной или метастатической солидной опухоли, лимфомы (например, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы или лимфомы Беркитта), рака молочной железы, рака предстательной железы, рака головы и шеи, колоректального рака, рака толстой кишки, меланомы (например, метастатической меланомы), рака эндометрия, почечно-клеточной карциномы, светлоклеточной карциномы, рака легких (например, немелкоклеточного рака легкого или аденокарциномы легких), рака яичников, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака матки, феохромоцитомы, метастатической плоскоклеточной карциномы кожи (например, у пациентов с трансплантацией), карциномы из клеток Меркеля, Т-клеточной лимфомы кожи, нейроэндокринной опухоли, опухоли костного происхождения (например, остеосаркомы), гемангиоперицитомы, опухоли, связанной с генетическими синдромами (NF1 или VHL), хордомы, эпендимомы, медуллобластомы, герминомы, опухоли тонкой кишки, опухоли аппендикса и опухоли, связанной с вирусами (например, саркомы Капоши).Squibb. In certain embodiments, the anti-PD-L1 antibody is AMP-224, developed by Amplimmune and GSK. Non-limiting examples of anti-PD-L1 antibodies that may be used in the treatments disclosed herein are disclosed in the following patents and patent applications, which are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes: US Patent No. 7,943,743; US Patent No. 8168179; US Patent No. 8217149; US Patent No. 8552154; US Patent No. 8779108; US Patent No. 8981063; US Patent No. 9175082; US publication No. US 2010/0203056 A1; US publication No. US 2003/0232323 A1; US Publication No. 2013/0323249 A1; US publication No. US 2014/0341917 A1; US publication No. US 2014/0044738 A1; US publication No. US 2015/0203580 A1; US publication No. US 2015/0225483 A1; US publication No. US 2015/0346208 A1; US publication No. US 2015/0355184 A1; and publications according to PCT No. WO 2014/100079 A1; publications according to PCT No. WO 2014/022758 A1; publications according to PCT No. WO 2014/055897 A2; publications according to PCT No. WO 2015/061668 A1; publications according to PCT No. WO 2015/109124 A1; publications according to PCT No. WO 2015/195163 A1; publications according to PCT No. WO 2016/000619 A1; and publications in accordance with PCT No. WO 2016/030350 A1. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating a cancer selected from the group consisting of types of B-cell lymphoma (e.g., B-cell chronic lymphocytic lymphoma, B-cell non-Hodgkin's lymphoma, cutaneous B-cell lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, basal cell carcinoma, bladder cancer, blastoma, brain metastases, breast cancer, Burkitt's lymphoma, carcinoma (eg, adenocarcinoma (eg, gastroesophageal junction)), cervical cancer, colon cancer, colorectal cancer (colon cancer and rectal cancer), endometrial carcinoma, esophageal cancer, Ewing's sarcoma, follicular lymphoma, gastric cancer, gastroesophageal junction carcinoma, gastrointestinal cancer, glioblastoma (eg, glioblastoma multiforme, eg, new or recurrent), glioma, head cancer and neck (eg, squamous cell carcinoma of the head and neck), liver metastases, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, kidney cancer (eg, renal cell carcinoma and Wilms tumor), laryngeal cancer, leukemia (eg, chronic myelocytic leukemia, hairy cell leukemia) , liver cancer (eg, hepatocarcinoma and hepatoma), lung cancer (eg, non-small cell lung cancer and small cell lung cancer), lymphoblastic lymphoma, lymphoma, mantle cell lymphoma, metastatic brain tumor, metastatic cancer, myeloma (eg, multiple myeloma), neuroblastoma , ocular melanoma, oropharyngeal cancer, osteosarcoma, ovarian cancer, pancreatic cancer (eg, pancreatic ductal adenocarcinoma), prostate cancer (eg, hormone-refractory (eg, castration-resistant), metastatic, metastatic hormone-refractory (eg, castration-resistant, androgen-independent)), renal cell carcinoma (eg, metastatic), salivary gland carcinoma, sarcoma (eg, rhabdomyosarcoma), skin cancer (eg, melanoma (eg, metastatic melanoma)), soft tissue sarcoma, solid tumor, squamous cell carcinoma, synovial sarcoma, testicular cancer, thyroid cancer, transitional cell carcinoma (urothelial cell cancer), uveal melanoma (eg, metastatic), verrucous carcinoma, vulvar cancer, and Waldenström's macroglobulinemia. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating a cancer selected from the group consisting of advanced, recurrent or metastatic solid tumor, lymphoma (eg, diffuse large B-cell lymphoma or Burkitt's lymphoma), breast cancer, prostate cancer, cancer head and neck, colorectal cancer, colon cancer, melanoma (eg, metastatic melanoma), endometrial cancer, renal cell carcinoma, clear cell carcinoma, lung cancer (eg, non-small cell lung cancer or lung adenocarcinoma), ovarian cancer, gastrointestinal cancer tract, bladder cancer, gastric cancer, uterine cancer, pheochromocytoma, metastatic squamous cell carcinoma of the skin (eg, in transplant patients), Merkel cell carcinoma, T-cell lymphoma of the skin, neuroendocrine tumor, tumor of bone origin (eg, osteosarcoma), hemangiopericytoma, tumor associated with genetic syndromes (NF1 or VHL), chordoma, ependymoma, medulloblastoma, germinoma, tumor of the small intestine, tumor of the appendix and tumor associated with viruses (eg, Kaposi's sarcoma).
В другом варианте осуществления антитело к ОХ40 вводят пациенту, у которого диагностировали рак, с целью повышения пролиферации и/или эффекторной функции одной или нескольких популяций клеток (например, эффекторных Т-клеток, таких как CD4 и CD8 Т-клетки) у пациента.In another embodiment, an anti-OX40 antibody is administered to a patient who has been diagnosed with cancer to enhance the proliferation and/or effector function of one or more cell populations (eg, effector T cells, such as CD4 and CD8 T cells) in the patient.
В конкретном варианте осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, активирует, усиливает или индуцирует одну или несколько иммунных функций или ответов у субъекта на по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 10%, или на значение в диапазоне от 10% до 25%, от 25% до 50%, от 50% до 75% или от 75% до 95% поIn a specific embodiment, an anti-OX40 antibody described herein activates, enhances or induces one or more immune functions or responses in a subject to at least 99%, at least 98%, at least 95%, at least 90 %, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 45%, at least 40%, at least 45%, at least 35%, at least 30%, at least 25%, at least 20% or at least 10%, or a value in the range from 10% to 25%, from 25 % to 50%, from 50% to 75% or from 75% to 95% according to
- 86 046360 сравнению с иммунной функцией у субъекта, которому не вводят антитело к ОХ40, описанное в данном документе, на основании анализов, хорошо известных в данной области техники, например, ELISPOT, ELISA и анализов клеточной пролиферации. В конкретном варианте осуществления иммунная функция представляет собой продукцию цитокинов (например, продукцию IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13). В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой пролиферацию/размножение Т-клеток, которые могут быть оценены, например, с помощью проточной цитометрии с обнаружением числа клеток, экспрессирующих маркеры Т-клеток (например, CD3, CD4 или CD8). В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой выработку антитела, которая может быть определена, например, с помощью ELISA. В некоторых вариантах осуществления иммунная функция представляет собой эффекторную функцию, которая может быть определена, например, с помощью анализа цитотоксичности или других анализов, хорошо известных в данной области техники. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой Th1-ответ. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой Th2-ответ. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой анамнестическую реакцию.- 86 046360 compared with immune function in a subject not administered the anti-OX40 antibody described herein, based on assays well known in the art, for example, ELISPOT, ELISA and cell proliferation assays. In a specific embodiment, the immune function is the production of cytokines (eg, the production of IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13). In another embodiment, the immune function is the proliferation/expansion of T cells, which can be assessed, for example, using flow cytometry to detect the number of cells expressing T cell markers (eg, CD3, CD4 or CD8). In another embodiment, the immune function is antibody production, which can be determined, for example, using ELISA. In some embodiments, the immune function is an effector function, which can be determined, for example, using a cytotoxicity assay or other assays well known in the art. In another embodiment, the immune function is a Th1 response. In another embodiment, the immune function is a Th2 response. In another embodiment, the immune function is an anamnestic response.
В конкретных вариантах осуществления неограничивающие примеры иммунных функций, которые могут быть усилены или индуцированы антителом к ОХ40, представляют собой пролиферацию/размножение эффекторных лимфоцитов (например, повышение числа эффекторных Т-лимфоцитов) и ингибирование апоптоза эффекторных лимфоцитов (например, эффекторных Т-клеток). В конкретных вариантах осуществления иммунная функция, усиленная или индуцированная антителом к ОХ40, описанным в данном документе, представляет собой пролиферацию/размножение числа или активацию CD4 Т-клеток (например, Th1 и Th2 хелперных Т-клеток), CD8 Т-клеток (например, цитотоксических Тлимфоцитов, альфа/бета Т-клеток и гамма/дельта Т-клеток), В-клеток (например, плазматических клеток), Т-клеток памяти, В-клеток памяти, населяющих опухоль Т-клеток, CD122' Т-клеток, клетокестественных киллеров (NK)), макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов, базофилов или полиморфноядерных лейкоцитов. В одном варианте осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, активирует или усиливает пролиферацию/размножение или число предшественников лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, обеспечивает повышение числа CD4 Т-клеток (например, Th1 и Th2 хелперных Тклеток), CD8+ Т-клеток (например, цитотоксических Т-лимфоцитов, альфа/бета Т-клеток и гамма/дельта Т-клеток), В-клеток (например, плазматических клеток), Т-клеток памяти, В-клеток памяти, Т-клеток, населяющих опухоль, CD122 Т-клеток, клеток-естественных киллеров (NK-клеток), макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов, базофилов или полиморфноядерных лейкоцитов примерно на по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 10% или в диапазоне от 10% до 25%, от 25% до 50%, от 50% до 75% или от 75% до 95% по сравнением с отрицательным контролем (например, числом соответствующих необработанных клеток, культивированных или приведенных в контакт с антителом к ОХ40, описанным в данном документе).In specific embodiments, non-limiting examples of immune functions that may be enhanced or induced by an anti-OX40 antibody are proliferation/expansion of effector lymphocytes (eg, increasing the number of effector T lymphocytes) and inhibition of apoptosis of effector lymphocytes (eg, effector T cells). In specific embodiments, the immune function enhanced or induced by the anti-OX40 antibody described herein is proliferation/expansion in number or activation of CD4 T cells (e.g., Th1 and Th2 helper T cells), CD8 T cells (e.g., cytotoxic T lymphocytes, alpha/beta T cells and gamma/delta T cells), B cells (e.g. plasma cells), memory T cells, memory B cells, tumor inhabiting T cells, CD122' T cells, natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils or polymorphonuclear leukocytes. In one embodiment, an anti-OX40 antibody described herein activates or enhances the proliferation/multiplication or number of lymphocyte precursors. In some embodiments, an anti-OX40 antibody described herein provides an increase in CD4 T cells (e.g., Th1 and Th2 helper T cells), CD8+ T cells (e.g., cytotoxic T lymphocytes, alpha/beta T cells, and gamma /delta T cells), B cells (eg, plasma cells), memory T cells, memory B cells, tumor-inhabiting T cells, CD122 T cells, natural killer (NK) cells, macrophages , monocytes, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils or polymorphonuclear leukocytes by about at least 99%, at least 98%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 45%, at least 40%, at least 45%, at least 35% , at least 30%, at least 25%, at least 20% or at least 10% or in the range from 10% to 25%, from 25% to 50%, from 50% to 75% or from 75 % up to 95% compared to a negative control (eg, the number of corresponding untreated cells cultured or contacted with the anti-OX40 antibody described herein).
В некоторых вариантах осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, вводят субъекту в комбинации с соединением, которое целенаправленно воздействует на иммуномодулирующий (иммуномодулирующие) фермент(ферменты), такой(такие) как IDO (индоламин-(2,3)-диоксигеназа) и TDO (триптофан-2,3-диоксигеназа). В конкретных вариантах осуществления такое соединение выбрано из группы, состоящей из эпакадостата (Incyte Corp), F001287 (Flexus Biosciences), индоксимода (NewLink Genetics) и NLG919 (NewLink Genetics). В одном варианте осуществления соединением является эпакадостат. В другом варианте осуществления соединением является F001287. В другом варианте осуществления соединением является индоксимод. В другом варианте осуществления соединением является NLG919. В некоторых вариантах осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, вводят субъекту в комбинации с вакциной.In some embodiments, an anti-OX40 antibody described herein is administered to a subject in combination with a compound that specifically targets immunomodulatory enzyme(s), such as IDO (indoleamine (2,3) dioxygenase) and TDO (tryptophan 2,3-dioxygenase). In specific embodiments, such a compound is selected from the group consisting of epacadostat (Incyte Corp), F001287 (Flexus Biosciences), indoximod (NewLink Genetics), and NLG919 (NewLink Genetics). In one embodiment, the compound is epacadostat. In another embodiment, the compound is F001287. In another embodiment, the compound is indoximod. In another embodiment, the compound is NLG919. In some embodiments, an anti-OX40 antibody described herein is administered to a subject in combination with a vaccine.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, вводят субъекту в комбинации с антителом к CD137, ритуксимабом, циклофосфамидом, химиотерапией или лучевой терапией.In some embodiments, an anti-OX40 antibody described herein is administered to a subject in combination with an anti-CD137 antibody, rituximab, cyclophosphamide, chemotherapy, or radiation therapy.
В некоторых вариантах осуществления антитело к ОХ40, описанное в данном документе, вводят субъекту в комбинации с противоопухолевой вакциной на основе белка теплового шока или противопатогенной вакциной на основе белка теплового шока. В конкретном варианте осуществления антитело к ОХ40 вводят субъекту в комбинации с противоопухолевой вакциной на основе белка теплового шока. Белки теплового шока (HSP) представляют собой семейство высококонсервативных белков, встречающихся повсеместно среди всех видов. Их экспрессия может быть сильно индуцирована до намного более высоких уровней в результате теплового шока или других форм стресса, в том числе воздействия токсинов, окислительного стресса или глюкозной депривации. Пять семейств были классифицированы в соответствии с молекулярной массой: HSP-110, -90, -70, -60 и -28. HSP доставляют иммуногенные пептидыIn some embodiments, an anti-OX40 antibody described herein is administered to a subject in combination with a heat shock protein antitumor vaccine or a heat shock protein antipathogen vaccine. In a specific embodiment, the anti-OX40 antibody is administered to a subject in combination with a heat shock protein-based tumor vaccine. Heat shock proteins (HSPs) are a family of highly conserved proteins found ubiquitously across all species. Their expression can be strongly induced to much higher levels by heat shock or other forms of stress, including exposure to toxins, oxidative stress, or glucose deprivation. Five families have been classified according to molecular weight: HSP-110, -90, -70, -60 and -28. HSPs deliver immunogenic peptides
- 87 046360 посредством кросс-презентационного пути в антигенпредставляющих клетках (АРС), таких как макрофаги и дендритные клетки (DC), приводя к активации Т-клеток. HSP функционируют в качестве шапероновых носителей опухоль-ассоциированных антигенных пептидов, образующих комплексы, способные индуцировать опухоль-специфичный иммунитет. При высвобождении из погибающих опухолевых клеток комплексы HSP-антиген захватываются антигенпредставляющими клетками (АРС), при этом антигены подвергаются превращению в пептиды, которые связываются с молекулами МНС класса I и класса II, приводя к активации противоопухолевых CD8+ и CD4+ Т-клеток. Иммунитет, вызванный комплексами HSP, полученными из препаратов опухоли, является специфически направленным против уникального репертуара антигенных пептидов, экспрессируемых злокачественной опухолью каждого субъекта.- 87 046360 via the cross-presentation pathway in antigen presenting cells (APCs) such as macrophages and dendritic cells (DC), leading to T cell activation. HSPs function as chaperone carriers of tumor-associated antigenic peptides, forming complexes capable of inducing tumor-specific immunity. When released from dying tumor cells, HSP-antigen complexes are captured by antigen presenting cells (APCs), and the antigens are converted into peptides that bind to MHC class I and class II molecules, leading to the activation of antitumor CD8+ and CD4+ T cells. The immunity induced by HSP complexes derived from tumor preparations is specifically directed against the unique repertoire of antigenic peptides expressed by each subject's malignant tumor.
Комплекс белка теплового шока с пептидами (HSPPC) представляет собой белково-пептидный комплекс, состоящий из белка теплового шока, нековалентно связанного с антигенными пептидами. HSPPC вызывают врожденные и адаптивные иммунные ответы. В конкретном варианте осуществления антигенный (антигенные) пептид (пептиды) характеризуется (характеризуются) антигенностью в отношении злокачественной опухоли, подлежащей лечению. HSPPC эффективно захватываются АРС посредством мембранных рецепторов (главным образом CD91) или посредством связывания с Toll-подобными рецепторами. Интернализация HSPPC приводит к функциональному созреванию АРС с продукцией хемокинов и цитокинов, приводя к активации клеток-естественных киллеров (NK), моноцитов и Th1- и Th2-опосредованных иммунных ответов. В некоторых вариантах осуществления HSPPC, используемые в способах, раскрытых в данном документе, содержат один или несколько белков теплового шока из семейства белков стрессов hsp60, hsp70 или hsp90, образующих комплексы с антигенными пептидами. В некоторых вариантах осуществления HSPPC содержат hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, кальретикулин или комбинации из двух или более из них.Heat shock protein-peptide complex (HSPPC) is a protein-peptide complex consisting of heat shock protein non-covalently associated with antigenic peptides. HSPPCs trigger innate and adaptive immune responses. In a specific embodiment, the antigenic peptide(s) are antigenic to the cancer being treated. HSPPCs are efficiently captured by APCs through membrane receptors (mainly CD91) or through binding to Toll-like receptors. Internalization of HSPPC leads to the functional maturation of APCs with the production of chemokines and cytokines, leading to the activation of natural killer (NK) cells, monocytes, and Th1- and Th2-mediated immune responses. In some embodiments, the HSPPCs used in the methods disclosed herein contain one or more heat shock proteins from the hsp60, hsp70, or hsp90 family of stress proteins complexed with antigenic peptides. In some embodiments, the HSPPCs comprise hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, calreticulin, or combinations of two or more of them.
В конкретном варианте осуществления антитело к ОХ40 вводят субъекту в комбинации с комплексом белка теплового шока с пептидами (HSPPC), например, комплексом белка теплового шока с пептидами 96 (HSPPC-96), для лечения рака. HSPPC-96 содержит белок теплового шока массой 96 кДа (Hsp), gp96, образующий комплекс с антигенными пептидами. HSPPC-96 представляет собой противоопухолевый иммунотерапевтический препарат, полученный из опухоли субъекта, и содержит антигенный отпечаток злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления этот отпечаток содержит уникальные антигены, которые присутствуют только в определенных раковых клетках данного конкретного пациента, и введение вакцины предусматривает стимулирование иммунной системы субъекта с целью распознавания и атаки любых клеток с определенным отпечатком злокачественной опухоли.In a specific embodiment, an anti-OX40 antibody is administered to a subject in combination with a heat shock protein-peptide complex (HSPPC), such as heat shock protein-peptide complex 96 (HSPPC-96), for the treatment of cancer. HSPPC-96 contains a 96-kDa heat shock protein (Hsp), gp96, that forms a complex with antigenic peptides. HSPPC-96 is an antitumor immunotherapy drug derived from a subject's tumor and contains the antigenic fingerprint of the malignant tumor. In some embodiments, this fingerprint contains unique antigens that are present only in certain cancer cells of that particular patient, and administration of the vaccine involves stimulating the subject's immune system to recognize and attack any cells with a particular cancer fingerprint.
В некоторых вариантах осуществления HSPPC, например, HSPPC-96, продуцируется опухолевой тканью субъекта. В конкретном варианте осуществления HSPPC (например, HSPPC-96) продуцируется опухолью, относящейся к злокачественному образованию или его метастазу, подлежащей лечению. В другом конкретном варианте осуществления HSPPC (например, HSPPC-96) является аутологичным по отношению к субъекту, подлежащему лечению. В некоторых вариантах осуществления опухолевая ткань представляет собой опухолевую ткань, не являющуюся некротической. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1 грамм (например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 грамм) опухолевой ткани, не являющейся некротической, используется для получения схемы введения вакцины. В некоторых вариантах осуществления после хирургической резекции опухолевая ткань, не являющаяся некротической, замораживается перед использованием для получения вакцины. В некоторых вариантах осуществления HSPPC, например, HSPPC-96, выделяют из опухолевой ткани с помощью методик очистки, фильтруют и готовят для инъекционной вакцины. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят 6-12 доз HSPPC, например, HSPCC-96. В таких вариантах осуществления дозы HSPPC, например, HSPPC-96, можно вводить каждую неделю для первых 4 доз и затем через неделю для 2-8 дополнительных доз.In some embodiments, HSPPC, for example, HSPPC-96, is produced by tumor tissue of the subject. In a specific embodiment, HSPPC (eg, HSPPC-96) is produced by a tumor related to the malignancy or metastasis thereof being treated. In another specific embodiment, the HSPPC (eg, HSPPC-96) is autologous to the subject being treated. In some embodiments, the tumor tissue is non-necrotic tumor tissue. In some embodiments, at least 1 gram (e.g., at least 1, at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9 or at least 10 grams) of tumor tissue that is not necrotic is used to prepare the vaccine regimen. In some embodiments, following surgical resection, non-necrotic tumor tissue is frozen prior to use for vaccine production. In some embodiments, HSPPC, such as HSPPC-96, is isolated from tumor tissue using purification techniques, filtered, and prepared for an injectable vaccine. In some embodiments, the subject is administered 6-12 doses of HSPPC, such as HSPCC-96. In such embodiments, doses of HSPPC, for example, HSPPC-96, can be administered every week for the first 4 doses and then every other week for 2-8 additional doses.
Дополнительные примеры HSPPC, которые могут быть использованы в соответствии со способами, описанными в данном документе, раскрыты в следующих патентах и патентных заявках, которые включены в данный документ посредством ссылки для всех целей, патентах США №№ 6391306, 6383492, 6403095, 6410026, 6436404, 6447780, 6447781 и 6610659.Additional examples of HSPPC that can be used in accordance with the methods described herein are disclosed in the following patents and patent applications, which are incorporated herein by reference for all purposes, US Patent Nos. 6391306, 6383492, 6403095, 6410026, 6436404 , 6447780, 6447781 and 6610659.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения рака. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения рака у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества антитела или фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) средству, целенаправленно воздействующему на контрольные точки, для применения в качестве лекарственного препарата. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) средству, целенаправленноIn some embodiments, the present invention provides an antibody or pharmaceutical composition of the present invention for use as a drug. In some aspects, the present invention provides an antibody or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating cancer. In some aspects, the present invention provides an antibody or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of the antibody or pharmaceutical composition of the present invention. In some aspects, the present invention provides (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a checkpoint targeting agent for use as a drug. In some aspects, the present invention relates to (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an agent that specifically targets
- 88 046360 воздействующему на контрольные точки, для применения в способе лечения рака. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки. В одном аспекте настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) ингибитору IDO для применения в качестве лекарственного препарата. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) ингибитору IDO для применения в способе лечения рака. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) ингибитор IDO. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) вакцине для применения в качестве лекарственного препарата. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к (а) антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и (b) вакцине для применения в способе лечения рака. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, набору или составному набору, содержащему (а) антитело или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и (b) вакцину. В предпочтительном варианте осуществления антитела или фармацевтической композиции для применения в способе лечения рака антитело является агонистическим. В одном аспекте способы модулирования одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, как представлено в данном документе, представляют собой способы прекращения, ослабления или ингибирования одной или нескольких иммунных функций или ответов у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антагонистического антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы предупреждения и/или лечения заболеваний, при которых желательным является прекращение, ослабление или ингибирование одной или нескольких иммунных функций или ответов, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, антагонистического антитела к ОХ40, описанного в данном документе, или композиции на его основе. В определенном варианте осуществления в данном документе предусмотрены способы лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагонистического антитела к ОХ40 или композиции на его основе. В определенных вариантах осуществления субъектом является человек. В определенных вариантах осуществления заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из инфекций (вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных), эндотоксического шока, ассоциированного с инфекций, артрита, ревматоидного артрита, астмы, хронической обструктивной болезни легких (COPD), воспалительного заболевания органов малого таза, болезни Альцгеймера, воспалительной болезни кишечника, болезни Крона, язвенного колита, болезни Пейрони, целиакии, заболевания желчного пузыря, пилонидальной болезни, перитонита, псориаза, васкулита, хирургических спаек, инсульта, диабета I типа, болезни Лайма, артрита, менингоэнцефалита, увеита, аутоиммунного увеита, иммунноопосредованных воспалительных заболеваний центральной и периферической нервной системы, таких как рассеянный склероз, волчанка (такая как системная красная волчанка) и синдром Гийена-Барре, дерматита, атопического дерматита, аутоиммунного гепатита, фиброзирующего альвеолита, базедовой болезни, IgA-нефропатии, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, болезни Меньера, пузырчатки, первичного билиарного цирроза, саркоидоза, склеродермии, грануломатоза Вегенера, панкреатита, физического повреждения (хирургического), болезни трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, заболевания сердца (т.е., сердечнососудистого заболевания), в том числе ишемических заболеваний, таких как инфаркт миокарда, а также атеросклероз и внутрисосудистая коагуляция, резорбции кости, остеопороза, остеоартрита, периодонтита, гипохлоргидрии, нейромиелита зрительного нерва, целиакии, нарушений, связанных с соединительной тканью (например, волчанки), постинфекционных воспалительных нарушений (например, синдром Гийена-Барре) и паранеопластических синдромов. В определенных вариантах осуществления заболевание или нарушение выбрано из группы, состоящей из отторжения трансплантата, васкулита, астмы, ревматоидного артрита, дерматита, воспалительного заболевания кишечника, увеита и волчанки. В определенных вариантах осуществления любой из способов в данном документе (например, способы лечения инфекционного заболевания или способы лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения) включает введение субъекту антитела, описанного в данном документе, и средства, целенаправленно воздействующего на контрольные точки. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антитело (например, антитело к PD-1, антитело к PD-L1, антитело к PD-L2, антитело к CTLA-4, антитело к TIM-3, антитело к LAG-3, антитело к СЕАСАМ1, антитело к GITR, антитело к CD137 или антитело к ОХ40). В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антагонистическое или агонистическое антитело. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антитело к PD-1. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, представляет собой антитело к GITR. В определенных вариантах осуществления средство, целенаправленно воздействующее на контрольные- 88 046360 acting on control points, for use in a method for treating cancer. In some aspects, the present invention provides a composition, kit, or composite kit containing (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a checkpoint targeting agent. In one aspect, the present invention relates to (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor for use as a drug. In some aspects, the present invention provides (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor for use in a method of treating cancer. In some aspects, the present invention provides a composition, kit, or composite kit containing (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) an IDO inhibitor. In some aspects, the present invention relates to (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine for use as a drug. In some aspects, the present invention provides (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine for use in a method of treating cancer. In some aspects, the present invention provides a composition, kit, or composite kit containing (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention and (b) a vaccine. In a preferred embodiment of the antibody or pharmaceutical composition for use in a method of treating cancer, the antibody is agonistic. In one aspect, methods of modulating one or more immune functions or responses in a subject, as presented herein, are methods of stopping, attenuating, or inhibiting one or more immune functions or responses in a subject, comprising administering to a subject in need thereof an antagonistic antibody to OX40 or compositions based on it. In a specific embodiment, provided herein are methods of preventing and/or treating diseases in which it is desired to terminate, attenuate, or inhibit one or more immune functions or responses, comprising administering to a subject in need thereof an anti-OX40 antagonist antibody described herein , or compositions based on it. In a certain embodiment, provided herein are methods of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an OX40 antagonist antibody or a composition thereof. In certain embodiments, the subject is a human. In certain embodiments, the disease or disorder is selected from the group consisting of infections (viral, bacterial, fungal and parasitic), endotoxic shock associated with infections, arthritis, rheumatoid arthritis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), inflammatory disease of the small organs pelvic disease, Alzheimer's disease, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, Peyronie's disease, celiac disease, gallbladder disease, pilonidal disease, peritonitis, psoriasis, vasculitis, surgical adhesions, stroke, type I diabetes, Lyme disease, arthritis, meningoencephalitis, uveitis , autoimmune uveitis, immune-mediated inflammatory diseases of the central and peripheral nervous system such as multiple sclerosis, lupus (such as systemic lupus erythematosus) and Guillain-Barré syndrome, dermatitis, atopic dermatitis, autoimmune hepatitis, fibrosing alveolitis, Graves' disease, IgA nephropathy, idiopathic thrombocytopenic purpura, Meniere's disease, pemphigus, primary biliary cirrhosis, sarcoidosis, scleroderma, Wegener's granulomatosis, pancreatitis, physical injury (surgical), graft-versus-host disease, graft rejection, heart disease (i.e., cardiovascular disease), including including ischemic diseases such as myocardial infarction, as well as atherosclerosis and intravascular coagulation, bone resorption, osteoporosis, osteoarthritis, periodontitis, hypochlorhydria, neuromyelitis optica, celiac disease, connective tissue disorders (eg, lupus), post-infectious inflammatory disorders (eg , Guillain-Barré syndrome) and paraneoplastic syndromes. In certain embodiments, the disease or disorder is selected from the group consisting of transplant rejection, vasculitis, asthma, rheumatoid arthritis, dermatitis, inflammatory bowel disease, uveitis, and lupus. In certain embodiments, any of the methods herein (eg, methods of treating an infectious disease or methods of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder) comprises administering to a subject an antibody described herein and a checkpoint targeting agent. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an antibody (e.g., anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti- LAG-3, anti-CEACAM1, anti-GITR, anti-CD137, or anti-OX40). In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an antagonistic or agonistic antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-PD-1 antibody. In certain embodiments, the checkpoint-targeting agent is an anti-GITR antibody. In certain embodiments, an agent that specifically targets control
- 89 046360 точки, представляет собой антитело к CD 137.- 89 046360 dots, is an antibody to CD 137.
В другом варианте осуществления антагонистическое антитело к ОХ40 вводят пациенту, у которого было диагностировано аутоиммунное или воспалительное заболевание или нарушение, с целью снижения пролиферации и/или эффекторной функции одной или нескольких популяций иммунных клеток (например, Т-клеточных эффекторных клеток, таких как CD4+ и CD8+ Т-клетки), у пациента.In another embodiment, an anti-OX40 antagonist antibody is administered to a patient who has been diagnosed with an autoimmune or inflammatory disease or disorder to reduce the proliferation and/or effector function of one or more immune cell populations (e.g., T cell effector cells such as CD4+ and CD8+ T cells) in a patient.
В конкретном варианте осуществления антагонистическое антитело к ОХ40, описанное в данном документе, прекращает, или ослабляет, или ингибирует одну или несколько иммунных функций или ответов у субъекта на по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 10%, или на значение в диапазоне от 10% до 25%, от 25% до 50%, от 50% до 75% или от 75% до 95% по сравнению с иммунной функцией у субъекта, которому не вводят антагонистическое антитело к ОХ40, описанное в данном документе, на основании анализов, хорошо известных в данной области техники, например, ELISPOT, ELISA и анализов клеточной пролиферации. В конкретном варианте осуществления иммунная функция представляет собой продукцию цитокинов (например, продукцию IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 и/или IL-13). В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой пролиферацию/размножение Т-клеток, которые могут быть оценены, например, с помощью проточной цитометрии с обнаружением числа клеток, экспрессирующих маркеры Т-клеток (например, CD3, CD4 или CD8). В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой выработку антитела, которая может быть определена, например, с помощью ELISA. В некоторых вариантах осуществления иммунная функция представляет собой эффекторную функцию, которая может быть определена, например, с помощью анализа цитотоксичности или других анализов, хорошо известных в данной области техники. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой Th1-ответ. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой Th2-ответ. В другом варианте осуществления иммунная функция представляет собой анамнестическую реакцию.In a specific embodiment, an anti-OX40 antagonist antibody described herein abolishes, or attenuates, or inhibits one or more immune functions or responses in a subject by at least 99%, at least 98%, at least 95%, by at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 45%, at least 40%, at least 45%, at least 35%, at least 30%, at least 25%, at least 20% or at least 10%, or a value in the range from 10% to 25% , from 25% to 50%, from 50% to 75%, or from 75% to 95% compared to the immune function of a subject not administered the OX40 antagonist antibody described herein, based on assays well known in the art. fields of technology, for example, ELISPOT, ELISA and cell proliferation assays. In a specific embodiment, the immune function is the production of cytokines (eg, the production of IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10 and/or IL-13). In another embodiment, the immune function is the proliferation/expansion of T cells, which can be assessed, for example, using flow cytometry to detect the number of cells expressing T cell markers (eg, CD3, CD4 or CD8). In another embodiment, the immune function is antibody production, which can be determined, for example, using ELISA. In some embodiments, the immune function is an effector function, which can be determined, for example, using a cytotoxicity assay or other assays well known in the art. In another embodiment, the immune function is a Th1 response. In another embodiment, the immune function is a Th2 response. In another embodiment, the immune function is an anamnestic response.
В конкретных вариантах осуществления неограничивающие примеры иммунных функций, которые могут быть ослаблены или ингибированы антагонистическим антителом к ОХ40, представляют собой пролиферацию/размножение эффекторных лимфоцитов (например, снижение числа эффекторных Тлимфоцитов) и стимуляцию апоптоза эффекторных лимфоцитов (например, эффекторных Т-клеток). В конкретных вариантах осуществления иммунная функция, ослабленная или ингибированная антагонистическим антителом к ОХ40, описанным в данном документе, представляет собой пролиферацию/размножение числа или активацию CD4 Т-клеток (например, Th1 и Th2 хелперных Т-клеток), CD8+ Т-клеток (например, цитотоксических Т-лимфоцитов, альфа/бета Т-клеток и гамма/дельта Т-клеток), Вклеток (например, плазматических клеток), Т-клеток памяти, В-клеток памяти, населяющих опухоль Тклеток, CD122' Т-клеток, клеток-естественных киллеров (NK)), макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов, базофилов или полиморфноядерных лейкоцитов. В одном варианте осуществления антагонистическое антитело к ОХ40, описанное в данном документе, прекращает, ослабляет или ингибирует пролиферацию/размножение или обеспечивает снижение числа предшественников лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления антагонистическое антитело к ОХ40, описанное в данном документе, обеспечивает снижение числа CD4+ Т-клеток (например, Th1 и Th2 хелперных Тклеток), CD8 Т-клеток (например, цитотоксических Т-лимфоцитов, альфа/бета Т-клеток и гамма/дельта Т-клеток), В-клеток (например, плазматических клеток), Т-клеток памяти, В-клеток памяти, Т-клеток, населяющих опухоль, CD122 Т-клеток, клеток-естественных киллеров (NK-клеток), макрофагов, моноцитов, дендритных клеток, тучных клеток, эозинофилов, базофилов или полиморфноядерных лейкоцитов примерно на по меньшей мере 99%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 20% или по меньшей мере 10% или в диапазоне от 10% до 25%, от 25% до 50%, от 50% до 75% или от 75% до 95% по сравнением с отрицательным контролем (например, числом соответствующих необработанных клеток, культивированных или приведенных в контакт с антагонистическим антителом к ОХ40, описанным в данном документе). В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в способе лечения инфекционного заболевания. В предпочтительном варианте осуществления антитела или фармацевтической композиции для применения в способе лечения аутоиммунного или воспалительного заболевания или нарушения антитело является антагонистическим.In specific embodiments, non-limiting examples of immune functions that may be attenuated or inhibited by an antagonistic OX40 antibody are proliferation/expansion of effector lymphocytes (e.g., reduction in the number of effector T lymphocytes) and stimulation of apoptosis of effector lymphocytes (e.g., effector T cells). In specific embodiments, the immune function attenuated or inhibited by the anti-OX40 antagonist antibody described herein is proliferation/expansion in number or activation of CD4 T cells (e.g., Th1 and Th2 helper T cells), CD8+ T cells (e.g. , cytotoxic T lymphocytes, alpha/beta T cells and gamma/delta T cells), B cells (e.g. plasma cells), memory T cells, memory B cells, tumor inhabiting T cells, CD122' T cells, cells -natural killer (NK) cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils or polymorphonuclear leukocytes. In one embodiment, an anti-OX40 antagonist antibody described herein stops, attenuates, or inhibits the proliferation/multiplication of or reduces the number of lymphocyte precursors. In some embodiments, an anti-OX40 antagonist antibody described herein provides a reduction in CD4+ T cells (e.g., Th1 and Th2 helper T cells), CD8 T cells (e.g., cytotoxic T lymphocytes, alpha/beta T cells, and gamma/delta T cells), B cells (eg plasma cells), memory T cells, memory B cells, tumor-inhabiting T cells, CD122 T cells, natural killer cells (NK cells), macrophages, monocytes, dendritic cells, mast cells, eosinophils, basophils or polymorphonuclear leukocytes by about at least 99%, at least 98%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least at least 80%, at least 75%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 45%, at least 40%, at least 45%, at least 35 %, at least 30%, at least 25%, at least 20% or at least 10% or in the range from 10% to 25%, from 25% to 50%, from 50% to 75% or from 75% to 95% compared to a negative control (eg, the number of corresponding untreated cells cultured or contacted with the OX40 antagonist antibody described herein). In some aspects, the present invention provides an antibody or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder. In one aspect, the present invention provides an antibody or pharmaceutical composition of the present invention for use in a method of treating an infectious disease. In a preferred embodiment of the antibody or pharmaceutical composition for use in a method of treating an autoimmune or inflammatory disease or disorder, the antibody is antagonistic.
5.5.1.1 Пути введения и дозировка5.5.1.1 Routes of administration and dosage
Антитело или композиция, описанные в данном документе, могут быть доставлены субъекту различными путями, такими как парентеральный, подкожный, внутривенный, внутрикожный, трансдерThe antibody or composition described herein can be delivered to a subject by various routes, such as parenteral, subcutaneous, intravenous, intradermal, transdermal
- 90 046360 мальный, интраназальный, внутриопухолевый, и путем введения в дренирующий опухоль лимфатический узел. В одном варианте осуществления антитело или композиция вводят внутривенным или внутриопухолевым путем.- 90 046360 small, intranasal, intratumoral, and by injection into the lymph node draining the tumor. In one embodiment, the antibody or composition is administered by the intravenous or intratumoral route.
Количество антитела или композиции, которое будет эффективным в лечении и/или предупреждении состояния, будет зависеть от природы заболевания и может быть определено с помощью стандартных клинических методик.The amount of antibody or composition that will be effective in treating and/or preventing the condition will depend on the nature of the disease and can be determined using standard clinical techniques.
Точная доза для применения в композиции будет зависеть от пути введения и тяжести заболевания, и должна определяться в соответствии с решением лечащего врача и состоянием отдельного пациента. Например, эффективные дозы могут также варьироваться в зависимости от способов введения, целевого участка, физиологического состояния пациента (в том числе возраста, веса тела и состояния здоровья), от того, является ли пациент человеком или животным, других вводимых лекарственных препаратов или от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим.The exact dosage to be used in the composition will depend on the route of administration and the severity of the disease, and should be determined in accordance with the judgment of the attending physician and the condition of the individual patient. For example, effective doses may also vary depending on the route of administration, the target site, the physiological condition of the patient (including age, body weight and health status), whether the patient is human or animal, other drugs administered, or whether whether the treatment is preventive or therapeutic.
Обычно пациентом является человек, однако также можно лечить отличных от человека млекопитающих, в том числе трансгенных млекопитающих. Лечебные дозы оптимально подбираются с целью оптимизации безопасности и эффективности.Typically the patient is a human, but non-human mammals, including transgenic mammals, can also be treated. Treatment doses are optimally selected to optimize safety and effectiveness.
В определенных вариантах осуществления in vitro анализ используется для облегчения идентификации диапазонов оптимальных доз. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых дозаответ, полученных из in vitro тест-систем или тест-систем на основе животных моделей.In certain embodiments, an in vitro assay is used to facilitate the identification of optimal dosage ranges. Effective doses can be extrapolated from dose response curves obtained from in vitro test systems or test systems based on animal models.
Как правило, антитела человека имеют более продолжительное время полужизни в организме человека, чем антитела других видов вследствие иммунного ответа на чужеродные полипептиды. Таким образом, во многих случаях возможно применение более низких доз антител человека и меньшая частота введения.In general, human antibodies have a longer half-life in the human body than antibodies of other species due to the immune response to foreign polypeptides. Thus, in many cases, it is possible to use lower doses of human antibodies and lower frequency of administration.
5.5.2 Выявление и варианты диагностического применения5.5.2 Identification and diagnostic application options
Антитело к ОХ40, описанное в данном документе (см., например, раздел 5.2), может быть использовано для определения уровней белка ОХ40 в биологическом образце с помощью классических иммуногистологических способов, известных специалистам в данной области техники, в том числе иммунологических анализов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммунопреципитация или вестерн-блоттинг. Подходящие метки для анализа антител известны в данной области техники и включают ферментные метки, такие как глюкозооксидаза; радиоизотопы, такие как йод (125I, 121I), углерод (14С), сера (35S), тритий (3Н), индий (121In) и технеций (99Тс); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин, родамин и биотин. Такие метки могут быть использованы для мечения антитела, описанного в данном документе. Альтернативно, второе антитело, которое распознает антитело к ОХ40, описанное в данном документе, можно пометить и использовать в комбинации с антителом к ОХ40 для выявления уровней белка ОХ40. Определение уровня экспрессии белка ОХ40 включает качественное или количественное измерение уровня белка ОХ40 в первом биологическом образце непосредственно (например, путем определения или оценки абсолютного уровня белка) или относительно (например, путем сравнения уровня ассоциированного с заболеванием белка во втором биологическом образце). Уровень экспрессии полипептида ОХ40 в первом биологическом образце можно измерить или оценить и сравнить со стандартным уровнем белка ОХ40, при этом стандарт берут из второго биологического образца, полученного от индивидуума, не имеющего нарушения, или определяют путем усреднения уровней от группы индивидуумов, не имеющих нарушения. Как будет понятно в данной области техники, после того как стандартный уровень полипептида ОХ40 становится известен, его можно применять многократно в качестве стандарта для сравнения.The anti-OX40 antibody described herein (see, for example, section 5.2) can be used to determine levels of OX40 protein in a biological sample using classical immunohistological methods known to those skilled in the art, including immunoassays such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunoprecipitation or Western blotting. Suitable labels for antibody assays are known in the art and include enzyme labels such as glucose oxidase; radioisotopes such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 121 In) and technetium ( 99 Tc); luminescent tags such as luminol; and fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine and biotin. Such labels can be used to label the antibodies described herein. Alternatively, a second antibody that recognizes the anti-OX40 antibody described herein can be labeled and used in combination with the anti-OX40 antibody to detect OX40 protein levels. Determining the level of OX40 protein expression involves qualitatively or quantitatively measuring the level of OX40 protein in a first biological sample, directly (eg, by determining or assessing the absolute level of the protein) or relatively (eg, by comparing the level of a disease-associated protein in a second biological sample). The expression level of an OX40 polypeptide in a first biological sample may be measured or assessed and compared to a standard level of OX40 protein, wherein the standard is taken from a second biological sample obtained from an individual without the disorder or determined by averaging levels from a group of individuals without the disorder. As will be understood in the art, once a standard level of OX40 polypeptide is known, it can be used repeatedly as a reference standard.
Используемый в данном документе термин биологический образец относится к любому биологическому образцу, полученному от субъекта, из клеточной линии, ткани или другого источника клеток, потенциально экспрессирующих ОХ40. Способы получения биоптатов тканей и биологических жидкостей от животных (например, человека) хорошо известны в данной области техники. Биологические образцы включают мононуклеарные клетки периферической крови.As used herein, the term biological sample refers to any biological sample obtained from a subject, cell line, tissue, or other source of cells potentially expressing OX40. Methods for obtaining tissue biopsies and biological fluids from animals (eg, humans) are well known in the art. Biological samples include peripheral blood mononuclear cells.
Антитело к ОХ40, описанное в данном документе, может быть использовано для прогностических, диагностических, мониторинговых и скрининговых вариантов применения, в том числе in vitro и in vivo вариантов применения, хорошо известных, являющихся стандартными для специалиста в данной области техники и основанных на настоящем описании. Прогностические, диагностические, мониторинговые и скринговые анализы и наборы для in vitro определения и оценки статуса иммунной системы и/или иммунного ответа могут быть использованы для прогнозирования, диагностирования и мониторинга с целью оценки образцов от пациентов, в том числе пациентов с дисфункцией иммунной системы или подозрением на дисфункцию иммунной системы, или в связи с предполагаемым или желательным иммунным ответом, ответом на антигены или ответом на вакцины. Определение и оценка статуса иммунной системы и/или иммунного ответа также является полезной при определении соответствия пациента для клинического исследования лекарственного препарата или для введения определенного химиотерапевтического средства или антитела, в том числе их комбинаций, по сравнению с другим средством или антителом. Такой тип прогностического и диагностического мониторинга и оценки уже используется в практике применения антител к белку HER2 при раке молочной железы (HercepTest™, Dako), где анализ такжеThe anti-OX40 antibody described herein can be used for prognostic, diagnostic, monitoring and screening applications, including in vitro and in vivo applications well known and standard to those skilled in the art and based on the present disclosure. . Prognostic, diagnostic, monitoring and screening assays and kits for in vitro determination and assessment of the status of the immune system and/or immune response can be used for prognosis, diagnosis and monitoring for the evaluation of samples from patients, including patients with immune system dysfunction or suspected to dysfunction of the immune system, or in connection with a suspected or desired immune response, response to antigens, or response to vaccines. Determining and assessing the status of the immune system and/or immune response is also useful in determining a patient's suitability for a clinical drug trial or for administration of a particular chemotherapeutic agent or antibody, including combinations thereof, versus another agent or antibody. This type of prognostic and diagnostic monitoring and evaluation is already used in the practice of using antibodies to the HER2 protein in breast cancer (HercepTest™, Dako), where the analysis also
- 91 046360 используется для оценки пациентов в случае терапии антителами с применением Herceptin®. In vivo варианты применения включают целевую клеточную терапию, и модулирование иммунной системы, и визуализацию иммунных ответов с помощью радиоактивных меток. В одном варианте осуществления антитело к ОХ40 может быть использовано в иммуногистохимическом анализе образцов биоптата.- 91 046360 is used to evaluate patients in the case of antibody therapy using Herceptin®. In vivo applications include targeted cell therapy, and modulation of the immune system, and imaging of immune responses using radioactive tracers. In one embodiment, an anti-OX40 antibody may be used in immunohistochemical analysis of biopsy specimens.
В другом варианте осуществления антитело к ОХ40 может быть использовано для выявления уровней ОХ40 или содержания клеток, которые содержат ОХ40 на своей мембранной поверхности, уровни которого затем могут быть связаны с симптомами определенных заболеваний. Антитела к ОХ40, описанные в данном документе, могут нести выявляемую или функциональную метку. В случае использования флуоресцентных меток доступные в настоящее время микроскопический анализ и анализ с использованием клеточного сортера с активацией флуоресценции (FACS) или комбинация обоих способов, известных в данной области техники, могут быть использованы для выявления и количественного определения специфичных связывающихся элементов. Антитела к ОХ40, описанные в данном документе, могут нести флуоресцентную метку. Иллюстративные флуоресцентные метки включают, например, реактивные или конъюгированные зонды, например, красители Aminocoumarin, Fluorescein и Texas red, красители Alexa Fluor, красители Су и красители DyLight. Антитело к ОХ40 может нести радиоактивную метку, такую как изотопы 3Н, 14С, 32Р, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, mIn, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac и 186Re. В случае использования радиоактивных меток доступные в настоящее время процедуры подсчета, известные в данной области техники, могут быть использованы для идентификации и количественного определения специфичного связывания антитела к ОХ40 с ОХ40 (например, ОХ40 человека). В случае, когда метка представляет собой фермент, выявление может сопровождаться любой из используемых в настоящее время колориметрических, спектрофотометрических, амперометрических или газометрических методик, известных в данной области техники. Это может быть достигнуто при приведении образца или контрольного образца в контакт с антителом к ОХ40 в условиях, которые способствуют образованию комплекса между антителом и ОХ40. Любые комплексы, образованные между антителом и ОХ40, выявляются и сравниваются в образце и контроле. С учетом специфического связывания антител, описанных в данном документе, в отношении ОХ40, антитела к нему могут быть использованы для специфического выявления экспрессии ОХ40 на поверхности клеток. Антитела, описанные в данном документе, также могут быть использованы для очистки ОХ40 посредством иммуноаффинной очистки.In another embodiment, an anti-OX40 antibody can be used to detect levels of OX40 or the content of cells that contain OX40 on their membrane surface, the levels of which can then be associated with symptoms of certain diseases. The anti-OX40 antibodies described herein may carry a detectable or functional tag. When fluorescent labels are used, currently available microscopic analysis and fluorescence activated cell sorter (FACS) analysis, or a combination of both methods known in the art, can be used to identify and quantify specific binding elements. The anti-OX40 antibodies described herein may carry a fluorescent label. Exemplary fluorescent labels include, for example, reactive or conjugated probes such as Aminocoumarin, Fluorescein and Texas red dyes, Alexa Fluor dyes, Su dyes and DyLight dyes. The antibody to OX40 can carry a radioactive label, such as the isotopes 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 67 Cu, 90 Y, 99 Tc, m In, 117 Lu, 121 I, 124 I, 125 I, 131 I, 198 Au, 211 At, 213 Bi, 225 Ac and 186 Re. When radioactive labels are used, currently available counting procedures known in the art can be used to identify and quantify the specific binding of an anti-OX40 antibody to OX40 (eg, human OX40). In the case where the label is an enzyme, detection may be accompanied by any of the currently used colorimetric, spectrophotometric, amperometric or gasometric techniques known in the art. This can be achieved by bringing the sample or control into contact with an anti-OX40 antibody under conditions that promote the formation of a complex between the antibody and OX40. Any complexes formed between the antibody and OX40 are detected and compared in the sample and control. Given the specific binding of the antibodies described herein to OX40, antibodies thereto can be used to specifically detect cell surface expression of OX40. The antibodies described herein can also be used to purify OX40 by immunoaffinity purification.
Также в данный документ включена система анализа, которая может быть разработана в форме тест-набора для количественного анализа степени присутствия, например, ОХ40 или комплексов OX40/OX40L. Система или тест-набор могут содержать меченый компонент, например, меченое антитело и один или несколько дополнительных иммунохимических реагентов. См., например, раздел 5.6 ниже с более детальной информацией о наборах.Also included in this document is an assay system that can be developed in the form of a test kit to quantify the presence of, for example, OX40 or OX40/OX40L complexes. The system or test kit may contain a labeled component, for example, a labeled antibody and one or more additional immunochemical reagents. See for example section 5.6 below for more detailed information on kits.
В некоторых аспектах в данном документе предусмотрены способы in vitro выявления ОХ40 в образце, включающие приведение указанного образца в контакт с антителом. В некоторых аспектах в данном документе предусмотрено применение антитела, предусмотренного в данном документе, для in vitro выявления ОХ40 в образце. В одном аспекте в данном документе предусмотрено антитело и/или фармацевтическая композиция, предусмотренные в данном документе, для применения в выявлении ОХ40 у субъекта. В одном аспекте в данном документе предусмотрено антитело и/или фармацевтическая композиция, предусмотренные в данном документе, для применения в качестве диагностического средства. В одном предпочтительном варианте осуществления антитело содержит выявляемую метку. В одном предпочтительном варианте осуществления ОХ40 представляет собой ОХ40 человека. В одном предпочтительном варианте осуществления субъектом является человек.In some aspects, provided herein are methods for in vitro detection of OX40 in a sample, comprising contacting said sample with an antibody. In some aspects, this document provides for the use of an antibody provided herein for in vitro detection of OX40 in a sample. In one aspect, provided herein is an antibody and/or pharmaceutical composition provided herein for use in detecting OX40 in a subject. In one aspect, provided herein is an antibody and/or pharmaceutical composition provided herein for use as a diagnostic agent. In one preferred embodiment, the antibody contains a detectable label. In one preferred embodiment, the OX40 is human OX40. In one preferred embodiment, the subject is a human.
5.6 Наборы5.6 Sets
В данном документе предусмотрены наборы, содержащие одно или несколько антител, описанных в данном документе, или их конъюгаты. В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрен фармацевтический пакет или набор, содержащие один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими из ингредиентов фармацевтических композиций, описанных в данном документе, такими как одно или несколько антител, предусмотренных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат фармацевтическую композицию, описанную в данном документе, и любое профилактическое или терапевтическое средство, такое как описанные в данном документе. В определенных вариантах осуществления наборы могут содержать Т-клеточный митоген, такой как, например, фитогемагглютинин (РНА) и/или форболмиристатацетат (РМА), или стимулирующее TCR-комплекс антитело, такое как антитело к CD3 и антитело к CD28. Необязательно, совместно с таким (такими) контейнером (контейнерами) может прилагаться уведомление в форме, предписанной государственным органом, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, и в таком уведомлении отражено разрешение органа в отношении производства, применения или продажи для введения человеку.Provided herein are kits containing one or more of the antibodies described herein or conjugates thereof. In a specific embodiment, provided herein is a pharmaceutical package or kit containing one or more containers filled with one or more of the ingredients of the pharmaceutical compositions described herein, such as one or more antibodies provided herein. In some embodiments, the kits contain a pharmaceutical composition described herein and any prophylactic or therapeutic agent such as those described herein. In certain embodiments, the kits may contain a T cell mitogen, such as, for example, phytohemagglutinin (PHA) and/or phorbol myristate acetate (PMA), or a TCR complex-stimulating antibody, such as an anti-CD3 antibody and an anti-CD28 antibody. Optionally, such container(s) may be accompanied by a notice in a form prescribed by a government agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceutical or biological products, and such notice reflects the agency's approval for the manufacture, use, or sale for human administration. .
В данном документе также предусмотрены наборы, которые можно использовать в вышеописанных способах. В одном варианте осуществления набор содержит антитело, описанное в данном документе, предпочтительно очищенное антитело, в одном или нескольких контейнерах. В конкретном вариантеAlso provided herein are kits that can be used in the methods described above. In one embodiment, the kit contains an antibody described herein, preferably a purified antibody, in one or more containers. In a specific version
- 92 046360 осуществления наборы, описанные в данном документе, содержат, по сути, выделенный антиген ОХ40 (например, ОХ40 человека), который может быть использован в качестве контроля. В другом конкретном варианте осуществления наборы, описанные в данном документе, дополнительно содержат контрольное антитело, которое не реагирует с антигеном ОХ40. В другом конкретном варианте осуществления наборы, описанные в данном документе, содержат один или несколько элементов для выявления связывания антитела с антигеном ОХ40 (например, антитело может быть конъюгировано с выявляемым субстратом, таким как флуоресцентное соединение, ферментный субстрат, радиоактивное соединение или люминесцентное соединение, или второе антитело, которое распознает первое антитело, может быть конъюгировано с выявляемым субстратом). В конкретных вариантах осуществления в данном документе предусмотрен набор, который может включать полученный рекомбинантным путем или синтезированный химическим путем антиген ОХ40. Антиген ОХ40, предусмотренный в наборе, также может быть соединен с твердой подложкой. В еще одном конкретном варианте осуществления средства выявления вышеуказанного набора включают твердую подложку, к которой присоединяется антиген ОХ40. Такой набор также может включать неприсоединяемое репортерное меченое антитело к человеческому антителу или мышиному/крысиному антителу. В этом варианте осуществления связывание антитела с антигеном ОХ40 может быть выявлено по связыванию указанного репортерного меченого антитела. Кроме того, предусмотрен набор или составной набор, содержащий (а) антитело или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, и (b) средство, целенаправленно воздействующее на контрольные точки, ингибитор IDO и/или вакцина.- 92 046360 embodiments, the kits described herein contain essentially an isolated OX40 antigen (eg human OX40) which can be used as a control. In another specific embodiment, the kits described herein further contain a control antibody that does not react with the OX40 antigen. In another specific embodiment, the kits described herein contain one or more elements for detecting the binding of an antibody to an OX40 antigen (for example, the antibody may be conjugated to a detectable substrate, such as a fluorescent compound, an enzyme substrate, a radioactive compound, or a luminescent compound, or a second antibody that recognizes the first antibody may be conjugated to the substrate being detected). In specific embodiments, a kit is provided herein that may include a recombinantly produced or chemically synthesized OX40 antigen. The OX40 antigen provided in the kit can also be attached to a solid support. In yet another specific embodiment, the detection means of the above kit include a solid support to which the OX40 antigen is attached. Such a kit may also include a non-linked reporter labeled antibody against a human antibody or a mouse/rat antibody. In this embodiment, binding of the antibody to the OX40 antigen can be detected by binding of said reporter labeled antibody. In addition, a kit or composite kit is provided containing (a) an antibody or pharmaceutical composition of the present invention, and (b) a checkpoint targeting agent, an IDO inhibitor, and/or a vaccine.
Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.The following examples are provided for illustrative purposes and not as limitations.
6. Примеры6. Examples
Примеры в данном разделе (т.е., разделе 6) представлены для иллюстративных целей, а не для ограничения.The examples in this section (ie, Section 6) are presented for illustrative purposes and not for limitation.
6.1 Пример 1. Получение новых антител к ОХ40 человека6.1 Example 1. Production of new antibodies to human OX40
В этом примере описывается получение и характеристика антител, которые связываются с ОХ40 человека. В частности, в этом примере описывается получение антител человека, которые специфически связываются с ОХ40 человека и оказывают костимулирующий эффект на Т-клетки.This example describes the preparation and characterization of antibodies that bind to human OX40. In particular, this example describes the production of human antibodies that specifically bind to human OX40 and have a co-stimulatory effect on T cells.
6.1.1 Получение библиотеки6.1.1 Getting the library
Получение библиотеки Retrocyte Display™ описано в данном документе. Для получения вставок из библиотеки полную РНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ из отсортированных с помощью FACS CD19-положительных В-лимфоцитов человека, происходящих из двух образцов пуповинной крови. Полную РНК каждого образца пуповинной крови (1 мкг) использовали для синтеза первой цепи кДНК с помощью набора для синтеза первой цепи кДНК RevertAid Synthesis от Fermentas (№ по кат. K1621 и K1622). Вариабельные области антитела амплифицировали из кДНК с помощью ПЦР и клонировали в векторы экспрессии на основе ретровирусов (рСМА). Затем эти конструкции использовали для трансдукции пре-В-клеток для экспрессии антител на поверхности с помощью технологии Retrocyte Display™. Вектор экспрессии на основе ретровируса содержал 5'- и 3'-LTR, при этом константная область иммуноглобулина (IGHG1 или IGKC) содержала часть в качестве мембранного якоря (IGHG1) и ген маркера поверхности CD4.Preparation of the Retrocyte Display™ library is described herein. To obtain library inserts, total RNA was extracted with phenol/chloroform from FACS-sorted human CD19-positive B cells derived from two umbilical cord blood samples. Total RNA from each cord blood sample (1 μg) was used to synthesize first-strand cDNA using the RevertAid Synthesis First-Strand cDNA Synthesis Kit from Fermentas (cat. nos. K1621 and K1622). Antibody variable regions were amplified from cDNA by PCR and cloned into retroviral expression vectors (rVAs). These constructs were then used to transduce pre-B cells to express antibodies on the surface using Retrocyte Display™ technology. The retrovirus-based expression vector contained 5' and 3' LTRs, with an immunoglobulin constant region (IGHG1 or IGKC) containing a membrane anchor portion (IGHG1) and a CD4 surface marker gene.
Вариабельные области легкой цепи (VL) амплифицировали с помощью полугнездовой ПЦР с применением специфичных в отношении серии Vk прямых праймеров и смеси обратных праймеров. С помощью прямых праймеров вводили сайт клонирования HindIII и с помощью прямых праймеров вводили сайт клонирования Есо47Ш.Light chain variable regions (VL) were amplified by semi-nested PCR using Vk series-specific forward primers and a mixture of reverse primers. Using forward primers, the HindIII cloning site was introduced, and using forward primers, the Eco47III cloning site was introduced.
Вариабельные области тяжелой цепи (VH) амплифицировали с помощью ПЦР с применением специфичных в отношении серии VH прямых праймеров и смеси обратных праймеров. С помощью прямых праймеров вводили сайт клонирования HindIII и с помощью прямых праймеров вводили сайт клонирования Есо47Ш.Heavy chain variable regions (VH) were amplified by PCR using VH series-specific forward primers and a mixture of reverse primers. Using forward primers, the HindIII cloning site was introduced, and using forward primers, the Eco47III cloning site was introduced.
Амплифицированные области VH и Vk расщепляли при 37°С в течение ночи. После расщепления получали полосу, соответствующую размерам 400-450 п.о., и очищали на геле (Macherey&Nagel, NucleoSpin Gel and PCR clean-up). Для клонирования вариабельных областей тяжелой цепи конструкцию 3181 (pCMA-InsX Cg(iso3) loxP2-I-tr_huCD4-loxP) переваривали HindIII/Eco47III при 37°С в течение 4 часов и полосу размером 8362 п.о., очищали из геля. Для клонирования вариабельных областей легкой к-цепи конструкцию 3204 (pCMA-InsX Ck-I-CD4) расщепляли с помощью HindIII/Eco47III при 37°С в течение 4 часов и полосу, соответствующую размеру 7465 п. о., очищали из геля.The amplified VH and Vk regions were digested at 37°C overnight. After digestion, a band corresponding to the size of 400-450 bp was obtained and purified on a gel (Macherey & Nagel, NucleoSpin Gel and PCR clean-up). To clone the heavy chain variable regions, construct 3181 (pCMA-InsX Cg(iso3) loxP2-I-tr_huCD4-loxP) was digested with HindIII/Eco47III at 37°C for 4 hours and the 8362 bp band was purified from the gel. For cloning of light chain variable regions, construct 3204 (pCMA-InsX Ck-I-CD4) was digested with HindIII/Eco47III at 37°C for 4 hours and the 7465 bp band was gel purified.
Вариабельные области расщепленного и очищенного антитела лигировали в рамку считывания в соответствующие векторы экспрессии с применением соотношения вектора и вставки 1:3. Каждую серию VH и Vk по отдельности лигировали в векторы экспрессии на основе ретровирусов и концентрировали в 10 раз осаждением. Осажденные продукты реакции лигирования VH и Vk также по отдельности переносили в клетки Е. coli DH10B для получения библиотеки. Лигирование, осаждение и трансформация каждой серии VH и Vk по отдельности позволили получить библиотеку, которая отражает естественное распределение функциональных генов зародышевой линии, гарантируя, что семейства VH илиThe variable regions of the cleaved and purified antibody were ligated in frame into the appropriate expression vectors using a vector to insert ratio of 1:3. Each series of VH and Vk were individually ligated into retroviral expression vectors and concentrated 10-fold by precipitation. The precipitated products of the VH and Vk ligation reaction were also individually transferred into E. coli DH10B cells for library preparation. Ligation, sedimentation, and transformation of each VH and Vk series separately produced a library that reflects the natural distribution of germline functional genes, ensuring that VH or Vk families
- 93 046360- 93 046360
Vk с большим числом функциональных генов зародышевой линии значительно представлены в конечной библиотеке по сравнению с семействами с более низким числом функциональных генов зародышевой линии. После трансформации клетки E.coli собирали и объединяли для получения конечной библиотеки. Качество каждой библиотеки контролировали посредством диагностического расщепления рестриктазами и анализа данных секвенирования. Разнообразие библиотеки рассчитывали на основе данных анализа последовательностей.Vk with a higher number of functional germline genes are significantly represented in the final library compared to families with a lower number of functional germline genes. After transformation, E. coli cells were harvested and pooled to obtain the final library. The quality of each library was controlled by diagnostic restriction enzyme digestion and analysis of sequencing data. Library diversity was calculated from sequence analysis data.
6.1.2 Извлечение тяжелой и легкой цепей из предварительно отобранных клонов пре-В-клеток6.1.2 Extraction of heavy and light chains from pre-selected pre-B cell clones
Материал библиотеки, полученный, как описано выше, использовали для идентификации антител с высокой аффинностью связывания с ОХ40. Клоны В-клеток лизировали, и вариабельные области тяжелой и легкой цепей амплифицировали из вставленного вектора на основе ретровируса, стабильного интегрированного в геномную ДНК, с помощью способов ПЦР, стандартных в данной области техники. Амплифицированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей затем клонировали в векторы экспрессии млекопитающих, содержащие константные области тяжелой цепи и легкой цепи человека. Препараты ДНК-плазмид затем использовали для трансфекции клеток СНО и экспрессируемые антитела исследовали с помощью технологии suspension array. Тяжелые и легкие цепи антител секвенировали в компании Microsynth (Бальгах, Швейцария).Library material prepared as described above was used to identify antibodies with high binding affinity to OX40. B cell clones were lysed and the heavy and light chain variable regions were amplified from the inserted retrovirus vector stably integrated into the genomic DNA using PCR methods standard in the art. The amplified heavy and light chain variable regions were then cloned into mammalian expression vectors containing human heavy chain and light chain constant regions. DNA plasmid preparations were then used to transfect CHO cells, and the expressed antibodies were examined using suspension array technology. Antibody heavy and light chains were sequenced at Microsynth (Balgach, Switzerland).
6.1.3 Определение биофизических характеристик антител к ОХ406.1.3 Determination of biophysical characteristics of antibodies to OX40
Антитело, обозначенное pab1949, было отобрано и охарактеризовано в ряде анализов, описанных ниже. Антитело к ОХ40 pab1949 содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 60, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. Антитело pab1949 представляет собой антитело IgG1 человека, содержащее замену T109S в константном домене легкой цепи (т.е., замену треонина на серин в положении 109 по отношению к константному домену легкой цепи дикого типа), пронумерованном по Kabat, что облегчает клонирование вариабельной области в рамку считывания к константной области. Эта мутация представляет собой консервативную модификацию, которая не влияет на связывание и функцию антитела. Также был получен аналог дикого типа, названный pab1949-1, который содержит треонин в положении 109, пронумерованном по Kabat. Антитело pab1949-1 представляет собой антитело IgG1 человека, содержащее тяжелую цепь под SEQ ID NO: 60, и легкую цепь под SEQ ID NO: 20.The antibody, designated pab1949, was selected and characterized in a series of assays described below. Anti-OX40 antibody pab1949 contains a heavy chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, and a light chain containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50. Antibody pab1949 is a human IgG 1 antibody containing the T109S substitution in the light chain constant domain ( i.e., a replacement of threonine with serine at position 109 relative to the wild-type light chain constant domain) numbered according to Kabat, which facilitates cloning of the variable region in frame to the constant region. This mutation is a conservative modification that does not affect antibody binding or function. A wild-type analog named pab1949-1 was also prepared, which contains a threonine at position 109, numbered Kabat. Antibody pab1949-1 is a human IgG 1 antibody containing the heavy chain of SEQ ID NO: 60 and the light chain of SEQ ID NO: 20.
6.1.3.1 Измерение аффинности с помощью интерферометрии биослоя6.1.3.1 Affinity measurement using biolayer interferometry
Аффинность pab1949-1 определяли с помощью интерферометрии биослоя (BLI). Вкратце, рекомбинантный антиген ОХ40 человека (OX40-Fc, R&D) разводили с помощью 1xPBS с получением 1000 мкл 0,2 мкМ и добавляли в 96-луночный планшет. pab1949-1 разводили в 1xPBS до концентрации 50 нМ. Серийные разведения pab1949-1 по шести точкам осуществляли исходя из 50 нМ раствора с применением 1xPBS с получением разведений антитела в диапазоне от 50 нМ до 0,78 нМ, и добавляли 100 мкл на лунку серийных разведений соответствующего антитела в 96-луночном планшете. Сенсоры покрывали антигеном ОХ40 человека с помощью 16-канального режима Octet® при 25°С в течение 5 минут с пороговой величиной 1,0 нм в соответствии с инструкциями производителя. Для блокирования 0,5 мг/мл неспецифичного антитела IgG1 инкубировали в течение 10 минут. Планшет, содержащий серийные разведения антитела pab1949-1, помещали в прибор Octet®. Анализы проводили в соответствии с инструкциями производителя. Связывание и диссоциацию pab1949-1 в отношении антигена ОХ40 фиксировали в течение 3 минут и 10 минут соответственно. Данные анализировали с применением программного обеспечения для анализа данных системы Octet®, и результаты показаны в табл. 5.The affinity of pab1949-1 was determined using biolayer interferometry (BLI). Briefly, recombinant human OX40 antigen (OX40-Fc, R&D) was diluted with 1xPBS to obtain 1000 μl of 0.2 μM and added to a 96-well plate. pab1949-1 was diluted in 1xPBS to a concentration of 50 nM. Six-point serial dilutions of pab1949-1 were performed from a 50 nM solution using 1xPBS to obtain antibody dilutions ranging from 50 nM to 0.78 nM, and 100 μl per well of serial dilutions of the appropriate antibody in a 96-well plate were added. The sensors were coated with human OX40 antigen using Octet® 16-channel mode at 25°C for 5 minutes with a threshold of 1.0 nm according to the manufacturer's instructions. For blocking, 0.5 mg/ml nonspecific IgG 1 antibody was incubated for 10 minutes. A plate containing serial dilutions of the pab1949-1 antibody was placed in an Octet® instrument. Assays were performed according to the manufacturer's instructions. The binding and dissociation of pab1949-1 to the OX40 antigen was recorded for 3 minutes and 10 minutes, respectively. Data were analyzed using Octet® system data analysis software and the results are shown in Table. 5.
Таблица 5Table 5
Измерение аффинности pab1949-1Affinity measurement pab1949-1
6.1.3.2 Связывание антител с активированными Т-клетками человека или макака-крабоеда6.1.3.2 Antibody binding to activated human or cynomolgus macaque T cells
Характеристики связывания антител к ОХ40 pab1949 и pab1949-1 с ОХ40 человека или макакакрабоеда анализировали с помощью проточной цитометрии. РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), обогащали необработанными CD4+ и CD8+ Т-клетками с помощью разделения в магнитном поле (Miltenyi Biotec). Подвергнутые обогащению популяции Т-лимфоцитов затем активировали с помощью гранул для экспансии CD3-CD28 (Miltenyi Biotec) с использованием 500 ЕД. rIL-2 (R&D Systems) в течение 3 дней при рекомендованных условиях культивирования и после этого 50 ЕД. rIL-2. Рекомендованные условия культивирования определяли при культивировании клеток в среде RPMI-1640, обогащенной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 10 мМ HEPES и смесью 1X пенициллин/стрептомицин-глутамин при 37°С и 5% СО2. После активации клетки инкубировали со смесью поверхностных антител, содержащей конъюгированные антитела к CD3 (BV711, OKT3), CD4 (BV605, OKT4), CD8a (BV650, RPA-T8) и предварительно конъюгированные антитела к ОХ40 или изотипический контроль (оба Afluor488, 10 мкг/мл), разведенные в буфере для FACS (PBS с 2% FBS) в течение 30 минут при 4°С. Дополнительные образцыThe binding characteristics of anti-OX40 antibodies pab1949 and pab1949-1 to human or cynomolgus OX40 were analyzed by flow cytometry. Human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from buffy coats of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were enriched for naïve CD4+ and CD8+ T cells by magnetic field separation (Miltenyi Biotec). Enriched T cell populations were then activated with CD3-CD28 expansion beads (Miltenyi Biotec) using 500 U. rIL-2 (R&D Systems) for 3 days under recommended culture conditions and thereafter 50 U. rIL-2. Recommended culture conditions were determined by culturing cells in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 10 mM HEPES, and 1X penicillin/streptomycin-glutamine at 37°C and 5% CO2. After activation, cells were incubated with a surface antibody mixture containing conjugated antibodies to CD3 (BV711, OKT3), CD4 (BV605, OKT4), CD8a (BV650, RPA-T8) and preconjugated antibodies to OX40 or isotype control (both Afluor488, 10 μg /ml) diluted in FACS buffer (PBS with 2% FBS) for 30 minutes at 4°C. Additional samples
- 94 046360 оставляли для окрашенных одним красителем компенсаторных контролем (CD45-BV650, CD45Afluor488, CD45-BV605 и CD45-BV711). Клетки затем дважды промывали буфером для FACS и анализировали с помощью проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences). Графики на основе данных проточной цитометрии анализировали с применением комбинации программного обеспечения FACS DIVA и WEHI Weasel. Антитело к ОХ40 pab1949 связывалось с активированными CD4+ Т-клетками и CD8+ Т-клетками человека (фиг. 1 А).- 94 046360 was retained for the single dye-stained compensatory controls (CD45-BV650, CD45Afluor488, CD45-BV605 and CD45-BV711). Cells were then washed twice with FACS buffer and analyzed using an LSRFortessa flow cytometer (BD Biosciences). Plots from flow cytometry data were analyzed using a combination of FACS DIVA and WEHI Weasel software. Anti-OX40 antibody pab1949 bound to activated human CD4+ T cells and CD8+ T cells (Fig. 1 A).
Ряд концентраций pab1949-1 исследовали на предмет связывания с активированными Т-клетками для характеристики взаимосвязи доза-ответ. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) размораживали и промывали PBS. Отрицательное выделение Т-клеток выполняли с помощью магнитных гранул (Miltenyi Biotec) и очищенные Т-клетки ресуспендировали в RPMI +10% FBS и стимулировали с использованием гранул с антителом к CD3/антителом к CD28 в течение 72 часов при 37°С и 5% СО2. Клетки промывали и блокировали с использованием блокирующего Fc-рецепторы раствора (Trustain, Biolegend) в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки промывали повторно и окрашивали с помощью серийного разведения pab 1949-1 (от 10 до 0,00003 мкг/мл) в течение 45 минут при 4°С в темноте. Клетки промывали и затем окрашивали антителами-маркерами клеточной линии, в том числе флуоресцеина изотиоционатом (FITC) для антитела к CD3 (клон SP34) и бриллиантовым фиолетовым (BV) 510 для антитела к CD4 (клон OKT4), совместно с вторичным антителом с выявлением pab1949-1 (РЕ-конъюгированное антитело к каппа-цепи IgG). Клетки промывали, фиксировали 1,6% параформальдегидом и обнаруживали с применением проточного цитометра Becton Dickinson Fortessa. pab1949-1 характеризовалось связыванием только со стимулированными Т-клетками, но не с нестимулированными Т-клетками (фиг. 1В). Связывание pab1949-1 с активированными CD4+ Т-клетками человека было дозозависимым (фиг. 1С).A range of concentrations of pab1949-1 were examined for binding to activated T cells to characterize the dose-response relationship. Briefly, human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were thawed and washed with PBS. Negative T cell isolation was performed using magnetic beads (Miltenyi Biotec) and purified T cells were resuspended in RPMI +10% FBS and stimulated using anti-CD3/anti-CD28 beads for 72 hours at 37°C and 5% CO 2 . Cells were washed and blocked using Fc receptor blocking solution (Trustain, Biolegend) for 15 minutes at room temperature. Cells were washed again and stained with serial dilution of pab 1949-1 (10 to 0.00003 μg/ml) for 45 minutes at 4°C in the dark. Cells were washed and then stained with cell line marker antibodies, including fluorescein isothiocyanate (FITC) for anti-CD3 (clone SP34) and brilliant violet (BV) 510 for anti-CD4 (clone OKT4), together with a secondary antibody detecting pab1949 -1 (PE-conjugated antibody to the kappa chain of IgG). Cells were washed, fixed with 1.6% paraformaldehyde, and detected using a Becton Dickinson Fortessa flow cytometer. pab1949-1 exhibited binding only to stimulated T cells but not to unstimulated T cells (Fig. 1B). Binding of pab1949-1 to activated human CD4+ T cells was dose-dependent (Fig. 1C).
Затем несколько подтипов покоящихся иммунных клеток исследовали на предмет связывания с pab1949-1. РВМС человека размораживали и промывали PBS. Для окрашивания мертвых клеток краситель для оценки жизнеспособности в инфракрасном (ИК) свете добавляли и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Клетки промывали и окрашивали связывающимся с аминогруппой красителем для использования в инфракрасном свете (Life Technologies) в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки промывали и блокировали Fc-рецепторы (Trustain FcX, Biolegend) в течение 10 минут при комнатной температуре. После промывки клетки инкубировали с 1 мкг/мл pab1949-1 или изотипическим контролем IgG1 в течение 30 минут при 4°С в защищенном от света месте. Клетки промывали и окрашивали вторичным реагентом (конъюгированным с РЕ антителом к Fc F(ab'), Jackson Immune Research Laboratories), затем проводили окрашивание антителом-маркером клеточной линии, которое включало фикоэритрина цианин 7 для антитела к CD3 (РЕСу7, клон SP34.2), BV510 для антитела к CD8 (клон SK1), перидинин-хлорофилл-белковый комплекс (PerCP) Су5 (клон Ly200) для антитела к CD4 и FITC для антитела к CD14 (клон TUK4). Клетки промывали, фиксировали 1,6% параформальдегидом и определяли с помощью проточного цитометра Becton Dickinson. Как показано на фиг. 1D, антитело к ОХ40 pab1949-1 не характеризовалось выявляемым связыванием с CD14+ клетками, CD4+ Т-клетками, CD8+ Т-клетками, CD20+ В-клетками или CD3-CD20-клетками.Several subtypes of resting immune cells were then examined for binding to pab1949-1. Human PBMCs were thawed and washed with PBS. To stain dead cells, infrared (IR) viability dye was added and incubated for 15 min at room temperature, protected from light. Cells were washed and stained with amine-binding infrared dye (Life Technologies) for 15 minutes at room temperature. Cells were washed and Fc receptor blocked (Trustain FcX, Biolegend) for 10 minutes at room temperature. After washing, cells were incubated with 1 μg/ml pab1949-1 or IgG 1 isotype control for 30 minutes at 4°C, protected from light. Cells were washed and stained with a secondary reagent (PE-conjugated anti-Fc F(ab'), Jackson Immune Research Laboratories), followed by staining with a cell line marker antibody that included phycoerythrin cyanine 7 for anti-CD3 antibody (PECy7, clone SP34.2 ), BV510 for anti-CD8 (clone SK1), peridinin-chlorophyll-protein complex (PerCP) Cy5 (clone Ly200) for anti-CD4 and FITC for anti-CD14 (clone TUK4). Cells were washed, fixed with 1.6% paraformaldehyde, and detected using a Becton Dickinson flow cytometer. As shown in FIG. 1D, anti-OX40 antibody pab1949-1 did not bind detectably to CD14+ cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells, CD20+ B cells, or CD3-CD20 cells.
Для исследования перекрестной реактивности в отношении видов выполняли анализ клеточного связывания с применением активированных РВМС макака-крабоеда (Масаса fascicularis). Вкратце, жизнеспособные РВМС макака-крабоеда (Worldwide Primates Inc.) активировали конкавалином A (Sigma Aldrich, 5 мкг/мл) и рекомбинантным IL-2 (Miltenyi, 20 ЕД./мл) в течение 3 дней в среде RPMI, дополненной 10% термоинактивированной FBS при 37°С в 5% СО2 увлажненной камере. После активации клетки инкубировали блокирующим Fc-рецепторы человека раствором (Biolegend) в течение 15 минут при комнатной температуре для снижения неспецифичного связывания. Антитело к ОХ40 pab1949 или изотипический контроль IgG1 человека (10 мкг/мл) добавляли к образцам и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. После одной промывки буфером для FACS смесь антител, содержащую АРСконъюгированное антитело к каппа-цепи человека, а также антитела, специфичные в отношении CD4 (BV605, OKT4) и CD8a (PE, RPA-T8), все при концентрации 2,5 мкг/мл, разводили в буфере для FACS (PBS, 2 мМ EDTA, 0,5% BSA и рН 7,2), добавляли к каждому образцу и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Перед окрашиванием дополнительные образцы оставляли для окрашенных одним красителем компенсаторных контролей (реагирующие в случае макака-крабоеда: CD4-BV605, CD4-PE и CD4APC). Образцы промывали дважды в буфере для FACS и анализировали с помощью проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences). Как показано на фигуре 1E, pab1949 связывалось с активированными CD4+ Т-клетками макака-крабоеда.To investigate species cross-reactivity, a cell binding assay was performed using activated cynomolgus macaque (Macaca fascicularis) PBMCs. Briefly, viable cynomolgus monkey PBMCs (Worldwide Primates Inc.) were activated with concavalin A (Sigma Aldrich, 5 μg/ml) and recombinant IL-2 (Miltenyi, 20 U/ml) for 3 days in RPMI medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS at 37°C in a 5% CO 2 humidified chamber. After activation, cells were incubated with a human Fc receptor blocking solution (Biolegend) for 15 minutes at room temperature to reduce nonspecific binding. Anti-OX40 antibody pab1949 or human IgG1 isotype control (10 μg/ml) was added to the samples and incubated for 30 minutes at 4°C. After one wash with FACS buffer, an antibody mixture containing anti-human kappa chain APC-conjugated antibody, as well as antibodies specific for CD4 (BV605, OKT4) and CD8a (PE, RPA-T8), all at a concentration of 2.5 μg/ml , diluted in FACS buffer (PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA and pH 7.2), added to each sample and incubated for 30 minutes at 4°C. Before staining, additional samples were reserved for single-dye-stained compensatory controls (cynomolgus monkey responders: CD4-BV605, CD4-PE, and CD4APC). Samples were washed twice in FACS buffer and analyzed using an LSRFortessa flow cytometer (BD Biosciences). As shown in Figure 1E, pab1949 bound to activated CD4+ T cells from cynomolgus monkey.
6.1.3.3 Анализ избирательности антитела к ОХ406.1.3.3 Anti-OX40 selectivity assay
Избирательность pab1949-1 в отношении ОХ40 оценивали по сравнению с другими членами суперсемейства TNFR с помощью технологии suspension array в качестве мультиплексного анализа. Ряд членов семейства TNFR химически связывали с микросферами Luminex® с применением стандартного химического реагента NHS-эфир. Очищенный материал pab1949-1 разводили в буфере для анализа (Roche 11112589001) до 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1000 нг/мл. Вкратце, 25 мкл каждого разведения инкубировали вThe selectivity of pab1949-1 for OX40 was assessed in comparison with other members of the TNFR superfamily using suspension array technology as a multiplex assay. A number of TNFR family members were chemically coupled to Luminex® microspheres using the standard chemical reagent NHS-ether. Purified pab1949-1 material was diluted in assay buffer (Roche 11112589001) to 10 ng/ml, 100 ng/ml and 1000 ng/ml. Briefly, 25 μl of each dilution was incubated in
- 95 046360 темноте (20°С, 650 об/мин) с 1500 микросферами Luminex® в 5 мкл буфера для анализа в течение 1 часа в 96-луночных фильтровальных планшетах с половинным объемом лунок (Millipore, MABVN1250). Микросферы Luminex® (Luminex Corp, LC10001-01, LC10005-01, LC10010-01, LC10014-01, LC10015-01, LC10018-01, LC10022-01, LC10026-01, LC10052-01, LC10053-01 и LC10055-01) связывали с рекомбинантным LTBR-Fc человека (Acros Biosystems, LTR-H5251), антителом к IgG человека (F(ab)2специфичным, JIR, 105-006-097), рекомбинантным OX40-Fc человека (R&D systems, 3388-OX), рекомбинантным GITR-Fc человека (R&D, 689-GR), рекомбинантным DR6-Fc человека (SinoBiological, 10175Н02Н), рекомбинантным DR3-Fc человека (R&D, 943-D3), рекомбинантным GITR-His человека (SinoBiological, 13643-H08H), рекомбинантным TWEAK R-Fc человека (SinoBiological, 10431-H01H), рекомбинантным OX40-His человека (SinoBiological, 10481-Н08Н), рекомбинантным 4-1BB-His человека (SinoBiological, 10041-H08H) или рекомбинантным BAFFR-Fc человека (R&D, 1162-BR) посредством аминного связывания на поверхности гранул с СООН-группой. Стандартные кривые получали для двух повторов 25 мкл стандарта IgG1 человека (Sigma, I5154) при серийном разведении 1:3 (0,08-540 нг/мл). Выявление осуществляли с использованием 60 мкл антитела козы к IgG F(ab)2 человека, меченого R-PE (2,5 мкг/мл; JIR 109-116-098, набор AbDSerotec Rapid RPE Antibody Conjugation Kit, LNK022RPE) и дополнительной инкубации в течение одного часа (20°С, 650 об/мин). Планшеты анализировали с помощью системы Luminex® 200 (Millipore). Всего отсчитывали по 100 гранул на лунку в объеме образца, составляющем 48 мкл. Значения РЕ MFI использовали для определения специфичного или неспецифичного связывания с рекомбинантными белками, упомянутыми выше.- 95 046360 in the dark (20°C, 650 rpm) with 1500 Luminex® microspheres in 5 µl assay buffer for 1 hour in 96-well half-well filter plates (Millipore, MABVN1250). Luminex® microspheres (Luminex Corp, LC10001-01, LC10005-01, LC10010-01, LC10014-01, LC10015-01, LC10018-01, LC10022-01, LC10026-01, LC10052-01, LC10053-01 and LC10055-01 ) was associated with recombinant human LTBR-Fc (Acros Biosystems, LTR-H5251), anti-human IgG antibody (F(ab) 2 specific, JIR, 105-006-097), recombinant human OX40-Fc (R&D systems, 3388-OX ), recombinant human GITR-Fc (R&D, 689-GR), recombinant human DR6-Fc (SinoBiological, 10175Н02Н), recombinant human DR3-Fc (R&D, 943-D3), recombinant human GITR-His (SinoBiological, 13643-H08H ), recombinant human TWEAK R-Fc (SinoBiological, 10431-H01H), recombinant human OX40-His (SinoBiological, 10481-H08H), recombinant human 4-1BB-His (SinoBiological, 10041-H08H) or recombinant human BAFFR-Fc ( R&D, 1162-BR) through amine bonding on the surface of the granules with a COOH group. Standard curves were prepared from duplicates of 25 μl of human IgG1 standard (Sigma, I5154) at a serial dilution of 1:3 (0.08-540 ng/ml). Detection was performed using 60 μl of goat anti-human IgG F(ab) 2 antibody labeled with R-PE (2.5 μg/ml; JIR 109-116-098, AbDSerotec Rapid RPE Antibody Conjugation Kit, LNK022RPE) and additional incubation in for one hour (20°C, 650 rpm). The plates were analyzed using the Luminex® 200 system (Millipore). A total of 100 beads per well were counted in a sample volume of 48 μl. PE MFI values were used to determine specific or nonspecific binding to the recombinant proteins mentioned above.
Антитело pab1949-1 характеризовалось специфичным связыванием с ОХ40 человека, при этом не наблюдалось специфичного связывания с другими членами семейства TNFR при исследуемых концентрациях (данные не показаны).Antibody pab1949-1 had specific binding to human OX40, but no specific binding to other TNFR family members at the concentrations tested (data not shown).
6.2 Пример 2. Определение функциональных характеристик антител к ОХ406.2 Example 2. Determination of the functional characteristics of antibodies to OX40
Этот пример демонстрирует способность антител к ОХ40 pab1949 и pab 1949-1, полученных с помощью способов, описанных выше, функционировать в качестве агонистов ОХ40. Антитела pab1949 и pab1949-1 анализировали для определения их способности костимулировать первичные CD4+ или CD8+ Т-клетки человека. Кроме того, pab1949 и pab 1949-1, которые представляют собой антитела IgGi человека, превращали в антитела IgG4 человека, pab2044 и pab2044-1 соответственно. Антитело pab2044 имеет такую же вариабельную область тяжелой цепи и такую же легкую цепь, что и pab1949, однако содержит константную область IgG4 человека. Антитело pab2044 содержит последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 61 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 50. Аналогично pab1949, pab2044 содержит одну аминокислотную замену T109S, представляющую собой консервативную модификацию в константной области легкой цепи, которая не влияет на связывание или функцию антитела, для облегчения клонирования. Аналог дикого типа, pab2044-1, содержит треонин в положении 109, пронумерованном по Kabat, и содержит последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 61 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 20. Аналогично, pab1949 и pab1949-1 также превращали в антитела IgG2 человека, pab2193 и pab2193-1 соответственно. Антитело pab2193 содержит последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 62 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 50. Антитело pab2193-1 содержит последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO: 62 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO: 20. В некоторых анализах исследовали функциональную активность pab1949, pab1949-1, pab2044, pab2044-l, pab2193 или pab2193-1.This example demonstrates the ability of the OX40 antibodies pab1949 and pab 1949-1, obtained using the methods described above, to function as OX40 agonists. Antibodies pab1949 and pab1949-1 were assayed to determine their ability to costimulate primary human CD4+ or CD8+ T cells. In addition, pab1949 and pab 1949-1, which are human IgGi antibodies, were converted into human IgG 4 antibodies, pab2044 and pab2044-1, respectively. Antibody pab2044 has the same heavy chain variable region and the same light chain as pab1949, but contains the human IgG4 constant region. Antibody pab2044 contains the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 61 and the light chain sequence of SEQ ID NO: 50. Similar to pab1949, pab2044 contains a single amino acid substitution T109S, which is a conservative modification in the light chain constant region that does not affect binding or function antibodies to facilitate cloning. The wild-type analog, pab2044-1, contains a threonine at position 109, numbered by Kabat, and contains the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 61 and the light chain sequence of SEQ ID NO: 20. Similarly, pab1949 and pab1949-1 were also converted to human IgG 2 antibodies, pab2193 and pab2193-1, respectively. Antibody pab2193 contains the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 62 and the light chain sequence of SEQ ID NO: 50. Antibody pab2193-1 contains the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 62 and the light chain sequence of SEQ ID NO: 20. In some assays examined the functional activity of pab1949, pab1949-1, pab2044, pab2044-l, pab2193, or pab2193-1.
В некоторых из анализов агонистическую активность антител к ОХ40 по настоящему изобретению сравнивали с таковой эталонных антител pab1784 и pab2045. Антитело pab1784 получали на основе вариабельных областей антитела 11D4, представленного в патенте США № 7960515 (включенного в данный документ посредством ссылки). Тяжелая цепь pab1784 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи 11D4 (SEQ ID NO: 26) и константную область IgG1 человека под SEQ ID NO: 65. Легкая цепь pab1784 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи 11D4 (SEQ ID NO: 24) и константную область под SEQ ID NO: 25.In some of the assays, the agonistic activity of the anti-OX40 antibodies of the present invention was compared with that of the reference antibodies pab1784 and pab2045. The pab1784 antibody was derived from the variable regions of the 11D4 antibody disclosed in US Pat. No. 7,960,515 (incorporated herein by reference). The pab1784 heavy chain contains the amino acid sequence of the 11D4 heavy chain variable region (SEQ ID NO: 26) and the human IgG1 constant region of SEQ ID NO: 65. The pab1784 light chain contains the amino acid sequence of the 11D4 light chain variable region (SEQ ID NO: 24) and the constant region area under SEQ ID NO: 25.
Антитело pab2045 получали на основе вариабельных областей антитела 20Е5, представленного в международной публикации № WO 13/038191 (включенной в данный документ посредством ссылки). Тяжелая цепь pab2045 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи 20Е5 (SEQ ID NO: 30) и константную область IgG1 человека под SEQ ID NO: 65. Легкая цепь pab2045 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи 20Е5 (SEQ ID NO: 28) и константную область под SEQ ID NO: 41.The pab2045 antibody was derived from the variable regions of the 20E5 antibody presented in International Publication No. WO 13/038191 (incorporated herein by reference). The pab2045 heavy chain contains the amino acid sequence of the 20E5 heavy chain variable region (SEQ ID NO: 30) and the human IgG1 constant region of SEQ ID NO: 65. The pab2045 light chain contains the amino acid sequence of the 20E5 light chain variable region (SEQ ID NO: 28) and the constant region area under SEQ ID NO: 41.
6.2.1 Влияние антител к ОХ40 на стимулированную антителом к CD3 пролиферацию CD4+ Тклеток6.2.1 Effect of anti-OX40 antibodies on anti-CD3-stimulated proliferation of CD4+ T cells
Для исследования влияния pab1949 на пролиферацию Т-клеток, РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), обогащали необработанными CD4+ T-клетками с помощью разделения в магнитном поле (Stemcell Technologies). Клеточную пролиферацию определяли путем контроля разведения красителя, представляющего собой сукцинимидиловый сложный эфир диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE), для делящихсяTo examine the effect of pab1949 on T cell proliferation, human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from healthy donor buffy coats (Research Blood Components, LLC) were enriched for untreated CD4+ T cells by magnetic field separation (Stemcell Technologies). Cell proliferation was determined by monitoring the dilution of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) dye for dividing cells.
- 96 046360 клеток (Quah BJ et al., (2007) Nat Protoc, 2(9): 2049-56). Подвергнутые обогащению CD4+ Т-клетки метили 10 мкМ CellTrace™ CFSE (Life Technologies) в течение 7 минут при 37°С. После тщательных промывок клетки суспендировали в среде RPMI1640, дополненной 10% термоинактивированной FBS при концентрации 1 х 106 клеток/мл. Всего 100 мкл (1х 105 клеток) высевали в каждую лунку 96-луночных планшетов с лунками с плоским дном, предварительно покрытых антителом к CD3 (3 мкг/мл, BD Biosciences), совместно с 5 мкг/мл pab1949, 5 мкг/мл изотипического контроля IgG1 или 2 мкг/мл антитела к CD28 (BD Biosciences) и культивировали при 37°С и 5% СО2. В день 5 клетки окрашивали меченым PerCP-Су5.5 антителом к CD4 в буфере для FACS (2% FBS в PBS) в концентрации 0,5 мкл/лунку при 4°С в течение 30 минут и процентную долю меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ определяли с помощью проточной цитометрии на LSRFortessa (BD Biosciences). Данные проточной цитометрии анализировали с помощью FlowJo.- 96 046360 cells (Quah BJ et al., (2007) Nat Protoc, 2(9): 2049-56). Enriched CD4+ T cells were labeled with 10 μM CellTrace™ CFSE (Life Technologies) for 7 minutes at 37°C. After thorough washes, cells were suspended in RPMI1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS at a concentration of 1 x 10 6 cells/ml. A total of 100 µl (1 x 10 5 cells) was seeded into each well of 96-well flat-bottom plates pre-coated with anti-CD3 antibody (3 µg/ml, BD Biosciences) together with 5 µg/ml pab1949, 5 µg/ml isotype control IgG1 or 2 μg/ml anti-CD28 antibody (BD Biosciences) and cultured at 37°C and 5% CO 2 . On day 5, cells were stained with PerCP-Cy5.5 labeled anti-CD4 antibody in FACS buffer (2% FBS in PBS) at a concentration of 0.5 μl/well at 4°C for 30 minutes and the percentage of CFSE-labeled cells with low CD4+ was determined by flow cytometry on an LSRFortessa (BD Biosciences). Flow cytometry data were analyzed using FlowJo.
Активность pab2044 определяли с помощью аналогичного анализа, как описано выше, где CD4+ Тклетки, меченые CFSE, высевали в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые антителом к CD3 (3 мкг/мл, BD Biosciences), совместно с 5 мкг/мл pab2044, 5 мкг/мл изотипического контроля IgG4 (pab2031) или 2 мкг/мл антитела к CD28 (BD Biosciences). Процентную долю меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ определяли с помощью проточной цитометрии в день 5.Pab2044 activity was determined using a similar assay as described above, where CFSE-labeled CD4+ T cells were seeded into 96-well plates precoated with anti-CD3 antibody (3 μg/ml, BD Biosciences) together with 5 μg/ml pab2044, 5 μg/ml isotype control IgG 4 (pab2031) or 2 μg/ml anti-CD28 antibody (BD Biosciences). The percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells was determined by flow cytometry at day 5.
На фиг. 2А и 2В представлены гистограммы на основе данных репрезентативного анализа с применением проточной цитометрии пролиферации CD4+ Т-клеток, индуцированных при костимуляции антителами к ОХ40, на которых показано число клеток (ось Y) и уровень испускаемой флуоресценции (ось X) меченых CFSE CD4+ Т-клеток. Усиленная пролиферация CD4+ Т-клеток показана как повышенный процент клеток с уменьшенным уровнем флуоресценции, испускаемой CFSE. На гистограммах указаны процентные доли меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+. Как pab1949 (фиг. 2А), так и pab2044 (фиг. 2В) при связывании на планшете индуцировали пролиферацию CD4+ Т-клеток при добавлении к клеткам, активированным субоптимальными концентрациями антитела к CD3.In fig. 2A and 2B are histograms from representative flow cytometry analysis of CD4+ T cell proliferation induced by costimulation with anti-OX40 antibodies, showing cell number (Y-axis) and fluorescence emission level (X-axis) of CFSE-labeled CD4+ T cells . Increased proliferation of CD4+ T cells is shown as an increased percentage of cells with decreased levels of fluorescence emitted by CFSE. The histograms indicate the percentages of CFSE-labeled cells with low CD4+ counts. Both pab1949 (Fig. 2A) and pab2044 (Fig. 2B), when bound on the plate, induced CD4+ T cell proliferation when added to cells activated with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody.
Затем измеряли дозозависимый ответ на pab1949 при индуцировании пролиферации Т-клеток. РВМС, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), обогащали необработанными CD4+ Т-клетками с помощью разделения в магнитном поле (Stemcell Technologies). Подвергнутую обогащению популяцию CD4+ Т-клеток затем метили 10 мкМ CellTrace™ CFSE (Life Technologies) в течение 7 минут при 37°С. После тщательных промывок клетки суспендировали в среде RPMI1640, дополненной 10% термоинактивированной FBS при концентрации 1х106/мл. 100 мкл (1х105) клеток высевали в каждую лунку 96-луночных планшетов с лунками с плоским дном, предварительно покрытых антителом к CD3 (3 мкг/мл, BD Biosciences), совместно с различными концентрациями pab1949 или изотипического контроля IgG1 и культивировали при 37°С и 5% СО2. В день 4 клетки окрашивали меченым АРС антителом к CD4 в буфере для FACS (2% FBS в PBS) в концентрации 0,5 мкл/лунку при 4°С в течение 30 минут и процентную долю меченых CFSE клеток с низким содержанием CD4+ определяли с помощью проточной цитометрии на LSRFortessa (BD Biosciences). Как показано на фиг. 2С, антитело к ОХ40 pab1949 было способно поддерживать высокий уровень пролиферации Т-клеток при фармакологически приемлемых концентрациях антител. Пролиферация CD4+ Т-клеток представляла собой возрастающую в значительной степени функцию от концентраций pab1949, составляющих от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл (фиг. 2С).The dose-dependent response to pab1949 in inducing T cell proliferation was then measured. PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from buffy coats of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were enriched for untreated CD4+ T cells by magnetic field separation (Stemcell Technologies). The enriched CD4+ T cell population was then labeled with 10 μM CellTrace™ CFSE (Life Technologies) for 7 minutes at 37°C. After thorough washings, the cells were suspended in RPMI1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS at a concentration of 1x10 6 /ml. 100 μl (1 × 10 5 ) cells were seeded into each well of 96-well flat-bottom plates precoated with anti-CD3 antibody (3 μg/ml, BD Biosciences) along with varying concentrations of pab1949 or IgG1 isotype control and cultured at 37°C. C and 5% CO 2 . On day 4, cells were stained with APC-labeled anti-CD4 antibody in FACS buffer (2% FBS in PBS) at a concentration of 0.5 μl/well at 4°C for 30 minutes and the percentage of CFSE-labeled low CD4+ cells was determined using flow cytometry on an LSRFortessa (BD Biosciences). As shown in FIG. 2C, the anti-OX40 antibody pab1949 was able to support high levels of T cell proliferation at pharmacologically acceptable antibody concentrations. CD4+ T cell proliferation was a largely increasing function of pab1949 concentrations ranging from 0.2 μg/ml to 20 μg/ml (Fig. 2C).
6.2.2 Влияние антител к ОХ40 на стимулированную антителом к CD3 продукцию цитокинов РВМС человека6.2.2 Effect of anti-OX40 antibodies on anti-CD3-stimulated cytokine production by human PBMCs
В качестве дополнительного доказательства агонистической активности антител к ОХ40 pab1949 и pab1949-1 измеряли продукцию цитокинов при субоптимальной концентрации антитела к CD3.As further evidence of the agonistic activity of anti-OX40 antibodies pab1949 and pab1949-1, cytokine production was measured at suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody.
Для эксперимента по внутриклеточному окрашиванию цитокинов РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% FBS + 20 ЕД./мл IL-2) и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования, которые содержали связанное на планшете антитело к CD3 при различных субоптимальных концентрациях совместно с 5 мкг/мл антитела к ОХ40 pab1949 или антитела изотипического контроля IgGi. Образцы инкубировали в течение 3 дней при 37°С и 5% СО2. После активации для ингибирования транспорта внутриклеточных белков клетки обрабатывали брефелдином A (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя и образцы инкубировали в течение 6 часов при 37°С и 5% СО2. После инкубации клетки окрашивали связывающимся с аминогруппой красителем для оценки жизнеспособности (Life technologies) на наличие мертвых клеток. После промывки буфером для FACS (PBS, 2% FBS, рН 7,2), смесь антител, содержащую антитела, специфичные в отношении CD3 (АРС Су7, SP34.2), CD4 (PercP Cy5.5, L200) и CD8a (РЕ Су7, SK1), разведенные в холодном буфере для FACS, добавляли к каждому образцу и инкубировали в течение 10 минут при 4°С. Клетки фиксировали и пермеабилизовали Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) для внутриклеточного окрашивания в соответствии с инструкциями производителя. РВМС окрашивали антителами, специфичными в отношении IFNy (Alexa647, B27) и TNFa (PE, Mab11), и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут.For the intracellular cytokine staining experiment, human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from the buffy coat of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Cells were resuspended in cell culture medium (RPMI + 10% FBS + 20 U/ml IL-2) and added to 96-well culture plates that contained plate-bound anti-CD3 antibody at various suboptimal concentrations along with 5 μg/ ml anti-OX40 antibody pab1949 or IgGi isotype control antibody. Samples were incubated for 3 days at 37°C and 5% CO 2 . After activation to inhibit intracellular protein transport, cells were treated with brefeldin A (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions and samples were incubated for 6 hours at 37°C and 5% CO2. After incubation, cells were stained with an amine-binding viability dye (Life technologies) for the presence of dead cells. After washing with FACS buffer (PBS, 2% FBS, pH 7.2), an antibody mixture containing antibodies specific for CD3 (APC Cy7, SP34.2), CD4 (PercP Cy5.5, L200) and CD8a (PE Cy7, SK1), diluted in cold FACS buffer, were added to each sample and incubated for 10 minutes at 4°C. Cells were fixed and permeabilized with Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) for intracellular staining according to the manufacturer's instructions. PBMCs were stained with antibodies specific for IFNy (Alexa647, B27) and TNFa (PE, Mab11) and incubated at room temperature for 10 minutes.
- 97 046360- 97 046360
Перед окрашиванием гранулы, связывающие легкие каппа-цепи антител IgG мыши окрашивали антителами, применяемыми для окрашивания клеток с использованием окрашенных одним красителем компенсаторных контролей. Образцы промывали промывочным буфером 1xPerm (BD Biosciences) и анализировали с помощью проточного цитометра FACS Canto (BD Biosciences). Графики на основе данных проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения Flojo. Исследовали РВМС от четырех различных доноров: донора KM, донора ТМ, донора GS и донора SB. Для всех доноров pab1949 характеризовалось костимулирующей активностью в отношении Т-клеток человека, индуцируя IFNy+ TNFa+ полифункциональные CD4+ Т-клетки, CD8+ Т-клетки, и TNFa+ монофункциональные CD4+ Тклетки и CD8+ Т-клетки (фиг. 3А, 3В и 3C). В случае РВМС от донора GS pab1949 также было способно повышать процентную долю IFNy+ монофункциональных Т-клеток (фиг. 3В).Before staining, mouse IgG kappa light chain binding beads were stained with antibodies used to stain cells using single-dye compensatory controls. Samples were washed with 1xPerm wash buffer (BD Biosciences) and analyzed using a FACS Canto flow cytometer (BD Biosciences). Graphs from flow cytometry data were analyzed using Flojo software. PBMCs from four different donors were studied: donor KM, donor TM, donor GS, and donor SB. For all donors, pab1949 had co-stimulatory activity on human T cells, inducing IFNy+ TNFa+ polyfunctional CD4+ T cells, CD8+ T cells, and TNFa+ monofunctional CD4+ T cells and CD8+ T cells (Figures 3A, 3B, and 3C). In the case of PBMCs from the GS donor, pab1949 was also able to increase the percentage of IFNy+ monofunctional T cells (Fig. 3B).
Затем антитело к ОХ40 pab1949-1 с титрованием дозы исследовали в анализе стимуляции субоптимальными концентрациями антитела к CD3, аналогичном описанному выше с использованием клеток, происходящих из РВМС донора GS. Вкратце, РВМС инкубировали со связанным на планшете антителом к CD3 (0,8 мкг/мл) и связанным на планшете pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 (0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25, или 50 мкг/мл) в течение 4 дней при 37°С и 5% СО2. После активации для ингибирования транспорта внутриклеточных белков клетки обрабатывали брефелдином A (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя и образцы инкубировали в течение 6 часов при 37°С и 5% СО2. После инкубации клетки окрашивали связывающимся с аминогруппой красителем FITC для оценки жизнеспособности (Life technologies) для различения живых и мертвых клеток. После промывки холодным буфером (1xPBS + 2% FBS, рН 7,2), смесь антител, содержащую антитела к CD3 (АРС Су7, SP34.2), антитела к CD4 (PercP Cy5.5, L200) и антитела к CD8a (PE Cy7, SK1), добавляли к каждому образцу и инкубировали в течение 10 минут при 4°С. Клетки фиксировали и пермеабилизовали Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) для внутриклеточного окрашивания в соответствии с инструкциями производителя. РВМС окрашивали антителами к IFNy (Alexa647, B27) и антителами к TNFa (РЕ, Mab11), и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Образцы промывали промывочным буфером 1xPerm (BD Biosciences) и анализировали с помощью проточного цитометра FACScanto (BD Biosciences). Графики на основе данных проточной цитометрии анализировали с помощью программного обеспечения Flojo. Как показано на фиг. 3D-3F, антитело к ОХ40 pab1949-1 характеризовалось костимулирующей активностью и повышало процентую долю TNFa+ CD4+ Т-клеток, ZFNy+ TNFa+ полифункциональных CD8+ Тклеток и IFNy+ CD8+ Т-клеток дозозависимым образом.Anti-OX40 pab1949-1 dose titration was then tested in a stimulation assay with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody similar to that described above using GS donor PBMC-derived cells. Briefly, PBMCs were incubated with plate-bound anti-CD3 antibody (0.8 μg/ml) and plate-bound pab1949-1 or IgG 1 isotype control antibody (0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25, or 50 µg/ml) for 4 days at 37°C and 5% CO 2 . After activation to inhibit intracellular protein transport, cells were treated with brefeldin A (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions and samples were incubated for 6 hours at 37°C and 5% CO2. After incubation, cells were stained with the amine-binding viability dye FITC (Life technologies) to distinguish between living and dead cells. After washing with cold buffer (1xPBS + 2% FBS, pH 7.2), an antibody mixture containing anti-CD3 (APC Cy7, SP34.2), anti-CD4 (PercP Cy5.5, L200) and anti-CD8a (PE Cy7, SK1) were added to each sample and incubated for 10 minutes at 4°C. Cells were fixed and permeabilized with Cytofix-Cytoperm (BD Biosciences) for intracellular staining according to the manufacturer's instructions. PBMCs were stained with anti-IFNy antibodies (Alexa647, B27) and anti-TNFa antibodies (PE, Mab11) and incubated at room temperature for 10 minutes. Samples were washed with 1xPerm wash buffer (BD Biosciences) and analyzed using a FACScanto flow cytometer (BD Biosciences). Graphs from flow cytometry data were analyzed using Flojo software. As shown in FIG. 3D-3F, anti-OX40 antibody pab1949-1 had co-stimulatory activity and increased the percentage of TNFa+ CD4+ T cells, ZFNy+ TNFa+ polyfunctional CD8+ T cells and IFNy+ CD8+ T cells in a dose-dependent manner.
Костимулирующую активность pab1949-1 при варьирующих дозах дополнительно исследовали с использованием клеток, происходящих из РВМС дополнительных доноров, в анализе стимуляции субоптимальными концентрациями антитела к CD3, описанном выше. Антитело к ОХ40 pab1949-1 и антитело изотипического контроля IgGi исследовали при концентрациях 0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл. Антитело к ОХ40 pab1949-1 последовательно повышало процентную долю IFNy+ и/или TNFa+ Т-клеток в РВМС от нескольких доноров (фиг. 4А-4С).The costimulatory activity of pab1949-1 at varying doses was further examined using PBMC-derived cells from additional donors in the stimulation assay with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody described above. Anti-OX40 antibody pab1949-1 and IgGi isotype control antibody were tested at concentrations of 0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, or 50 μg/ml. Anti-OX40 antibody pab1949-1 consistently increased the percentage of IFNy+ and/or TNFa+ T cells in PBMCs from multiple donors (Figures 4A-4C).
Примечательно, что для РВМС от многих доноров процент IFNy+ и/или TNFa+ Т-клеток, индуцированных антителом ОХ40 pab1949-1, представлял собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антител в широком диапазоне исследуемых концентраций антител (фиг. 3D-3F и 4А-4С).Notably, for PBMCs from multiple donors, the percentage of IFNy+ and/or TNFa+ T cells induced by the OX40 pab1949-1 antibody was a largely increasing function of antibody concentration over the wide range of antibody concentrations tested (Figures 3D-3F and 4A- 4C).
Для дополнительного исследования агонистической активности антитела к ОХ40 pab1949 измеряли количество секретируемых цитокинов. РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% FBS + 20 ЕД./мл IL-2) и добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования, которые содержали связанное на планшете антитело к CD3 при различных субоптимальных концентрациях совместно с 5 мкг/мл антитела к ОХ40 pab1949 или антитела изотипического контроля IgG1. Образцы инкубировали при 37°С и 5% СО2 и супернатант клеточных культур собирали через каждые 4 дня (SB#1A) или 3 дня (SB#1B, SB#2 и GS). Образцы исследовали с использованием набора V-PLEX Proinflammatory Panel 1 (для человека) (Meso Scale Discovery) на наличие продукции IL-2, TNFa, IL-10, IL-4 и IL-13 в соответствии с инструкциями производителя. Как показано на фиг. 5А, антитело к ОХ40 pab1949 костимулировало продукцию цитокинов РВМС человека от двух различных доноров: донора SB и донора GS. Продукцию цитокинов РВМС от донора SB исследовали в двух отдельных экспериментах: Для SB#1A и SB#1B показаны результаты первого эксперимента, где цитокины измеряли через 4 дня и через 3 дня после стимуляции соответственно; и для SB#2 показаны результаты второго эксперимента, где цитокины измеряли через 3 дня после стимуляции.To further investigate the agonistic activity of the anti-OX40 antibody pab1949, the amount of secreted cytokines was measured. Human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from the buffy coat of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Cells were resuspended in cell culture medium (RPMI + 10% FBS + 20 U/ml IL-2) and added to 96-well culture plates that contained plate-bound anti-CD3 antibody at various suboptimal concentrations along with 5 μg/ ml of anti-OX40 antibody pab1949 or IgG1 isotype control antibody. Samples were incubated at 37°C and 5% CO 2 and cell culture supernatant was collected every 4 days (SB#1A) or 3 days (SB#1B, SB#2 and GS). Samples were assayed using the V-PLEX Proinflammatory Panel 1 (Human) Kit (Meso Scale Discovery) for IL-2, TNFa, IL-10, IL-4, and IL-13 production according to the manufacturer's instructions. As shown in FIG. 5A, anti-OX40 antibody pab1949 co-stimulated cytokine production from human PBMCs from two different donors: donor SB and donor GS. Cytokine production by PBMC from the SB donor was examined in two separate experiments: For SB#1A and SB#1B, the results of the first experiment are shown, where cytokines were measured 4 days and 3 days after stimulation, respectively; and for SB#2, the results of a second experiment where cytokines were measured 3 days after stimulation are shown.
Затем секрецию цитокинов, индуцированную pab1949-1 с титрованием дозы, исследовали с использованием клеток, происходящих из РВМС от донора GS, в анализе стимуляции субоптимальными концентрациями антитела к CD3, аналогичном описанному выше. Вкратце, РВМС инкубировали со связанным на планшете антителом к CD3 (0,8 мкг/мл) и связанным на планшете pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 (0, 0,3, 1, 3, 6, 12, 25, или 50 мкг/мл) в течение 4 дней при 37°С и 5% СО2. ПоDose-titration induced cytokine secretion by pab1949-1 was then examined using PBMC-derived cells from the GS donor in a stimulation assay with suboptimal concentrations of anti-CD3 antibody similar to that described above. Briefly, PBMCs were incubated with plate-bound anti-CD3 antibody (0.8 μg/ml) and plate-bound pab1949-1 or IgG1 isotype control antibody (0, 0.3, 1, 3, 6, 12, 25, or 50 µg/ml) for 4 days at 37°C and 5% CO 2 . By
- 98 046360 сле активации супернатант клеточных культур собирали для выявления цитокинов с помощью набора Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). Как показано на фиг. 5B-5D, антитело к ОХ40 pab1949-1 стимулировало продукцию TNFa, IL-10 и IL-13 дозозависимым образом.- 98 046360 After activation, cell culture supernatant was collected for cytokine detection using the Human TH1/TH2 10-Plex tissue culture kit (Meso Scale Discovery). As shown in FIG. 5B-5D, anti-OX40 antibody pab1949-1 stimulated the production of TNFa, IL-10 and IL-13 in a dose-dependent manner.
Костимулирующую активность pab1949-1 в индукции секреции цитокинов дополнительно подтверждали с использованием клеток, происходящих из РВМС дополнительных доноров. Вкратце, РВМС инкубировали со связанным на планшете антителом к CD3 (0,8 мкг/мл) и связанным на планшете pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgG1 (0, 0,7, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25, или 50 мкг/мл) в течение 4 дней при 37°С и 5% СО2. После активации количество цитокинов, секретированных в супернатант, измеряли с помощью набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).The costimulatory activity of pab1949-1 in inducing cytokine secretion was further confirmed using cells derived from PBMCs from additional donors. Briefly, PBMCs were incubated with plate-bound anti-CD3 antibody (0.8 μg/ml) and plate-bound pab1949-1 or IgG1 isotype control antibody (0, 0.7, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, or 50 μg/ml) for 4 days at 37°C and 5% CO 2 . After activation, the amount of cytokines secreted into the supernatant was measured using the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery).
Для всех исследуемых доноров pab1949-1 дозозависимым образом повышало секрецию GM-CSF (фиг. 6А-6С), IL-2 (фиг. 7А-7С) и TNFe (фиг. 8А-8С). Для РВМС от многих доноров секреция цитокинов (GM-CSF, IL-2, TNFa, TNFe, IL-10 и IL-13), индуцированных антителом ОХ40 pab1949-1, представляла собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антител в широком диапазоне исследуемых концентраций антитела (фиг. 5B-5D, 6А-6С, 7А-7С и 8А-8С).For all donors tested, pab1949-1 dose-dependently increased the secretion of GM-CSF (Figures 6A-6C), IL-2 (Figures 7A-7C) and TNFe (Figures 8A-8C). For PBMCs from multiple donors, the secretion of cytokines (GM-CSF, IL-2, TNFa, TNFe, IL-10 and IL-13) induced by the OX40 antibody pab1949-1 was an increasing function of antibody concentration to a large extent over a wide range of assays. antibody concentrations (FIGS. 5B-5D, 6A-6C, 7A-7C and 8A-8C).
6.2.3 Влияние антитела к ОХ40 в анализе с совместным культивированием эффекторных Т-клеток: регуляторных Т -клеток6.2.3 Effect of anti-OX40 antibody in effector T cell coculture assay: regulatory T cells
Затем антитело к ОХ40 pab1949-1 исследовали на предмет его активности в анализе с совместным культивированием эффекторных Т-клеток (Teff): регуляторных Т-клеток (Treg). Вкратце, РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Регуляторные Тклетки и эффекторные Т-клетки выделяли с помощью разделения с использованием магнитных гранул (набор для выделения CD4+CD25+CD127dim/- регулярных Т-клеток II и набор для выделения общих Тклеток соответственно, Miltenyi Biotec). Затем регуляторные Т-клетки активировали в течение 2 дней путем инкубирования с гранулами с антителами к CD3/антителами к CD28/антителами к CD2 (Miltenyi Biotec) в соотношении 1:2 (Т-клетка:гранула) в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% FBS). После активации регуляторные Т-клетки и эффекторные Т-клетки добавляли в 96-луночные планшеты для культивирования в соотношении 1:3 (Treg:Teff) в присутствии гранул с антителами к CD3/антителами к CD28/антителами к CD2, растворимыми или перекрестносшитыми (с использованием антитела к Fc F(ab')2, Jackson ImmunoResearch) pab1949-1 или изотипического контроля IgGi (10 мкг/мл). Образцы инкубировали в течение 4 дней при 37°С и 5% СО2. После активации супернатант собирали и IL-10 или IL-2 измеряли с использованием AlphaLISA® (Perkin Elmer).The anti-OX40 antibody pab1949-1 was then tested for its activity in an effector T cell (Teff): regulatory T cell (Treg) coculture assay. Briefly, human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from the buffy coat of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Regulatory T cells and effector T cells were isolated by magnetic bead separation (CD4 + CD25 + CD127 dim/- Regular T Cell Isolation Kit II and Total T Cell Isolation Kit, respectively, Miltenyi Biotec). Regulatory T cells were then activated for 2 days by incubation with anti-CD3/anti-CD28/anti-CD2 beads (Miltenyi Biotec) at a ratio of 1:2 (T cell:bead) in cell culture medium (RPMI+ 10% FBS). Following activation, regulatory T cells and effector T cells were added to 96-well culture plates at a 1:3 ratio (Treg:Teff) in the presence of anti-CD3/anti-CD28/anti-CD2 beads, soluble or cross-linked (with using anti-Fc F(ab') 2 antibody, Jackson ImmunoResearch) pab1949-1 or IgGi isotype control (10 μg/ml). Samples were incubated for 4 days at 37°C and 5% CO 2 . After activation, the supernatant was collected and IL-10 or IL-2 was measured using AlphaLISA® (Perkin Elmer).
В этом in vitro анализе с совместным культивированием Teff:Treg антитело к ОХ40 pab 1949-1 ослабляло подавление популяций клеток Teff клетками Treg, что подтверждалось усиленной продукцией IL-2 (фиг. 9А) и ослабленной продукцией IL-10 (фиг. 9В) из pab 1949-1-обработанных клеток по сравнению с обработанными изотипом клетками.In this in vitro Teff:Treg coculture assay, the anti-OX40 antibody pab 1949-1 attenuated the suppression of Teff cell populations by Treg cells, as demonstrated by increased IL-2 production (Fig. 9A) and attenuated IL-10 production (Fig. 9B) from pab 1949-1-treated cells compared with isotype-treated cells.
6.2.4 Влияние антител к ОХ40 на РВМС человека при стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA)6.2.4 Effect of antibodies to OX40 on human PBMCs when stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA)
Функциональную активность антител к ОХ40 pab1949 и pab1949-1 на первичные РВМС человека дополнительно определяли после стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA). Замороженные РВМС (105 клеток/лунка) в RPMI1640, дополненной пенициллином, стрептомицином и 10% FBS (Hyclone), добавляли в 96-луночные планшеты с поверхностью NUNCLON дельта (NUNC™). Клетки культивировали в отсутствии или в присутствии фиксированной концентрации (10 мкг/мл на фиг. 10А и 10В) или варьирующих концентраций (20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 0,0064 и 0,00128 мкг/мл на фиг. 10С и 10D; 50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016 и 0,0032 мкг/мл на фиг. 10Е) антитела к ОХ40 или изотипического контроля и 100 нг/мл SEA (Toxin Technologies) в течение 5 дней при 37°С, 5% СО2 и влажности 97%. Очищенный супернатант собирали и хранили при -80°С до проведения анализа. Титры цитокинов для IL-2 и IL-10 получали с помощью электрохемилюминесценции (Meso Scale Discovery).The functional activity of anti-OX40 antibodies pab1949 and pab1949-1 on primary human PBMCs was further determined after stimulation with staphylococcal enterotoxin A (SEA). Frozen PBMCs (10 5 cells/well) in RPMI1640 supplemented with penicillin, streptomycin and 10% FBS (Hyclone) were added to 96-well NUNCLON delta surface plates (NUNC™). Cells were cultured in the absence or presence of a fixed concentration (10 μg/ml in Fig. 10A and 10B) or varying concentrations (20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.0064 and 0.00128 μg/ml per Fig. 10C and 10D; 50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 and 0.0032 μg/ml in Fig. 10E) anti-OX40 antibody or isotype control and 100 ng/ml SEA (Toxin Technologies) in for 5 days at 37°C, 5% CO 2 and humidity 97%. The cleared supernatant was collected and stored at -80°C until analysis. Cytokine titers for IL-2 and IL-10 were obtained using electrochemiluminescence (Meso Scale Discovery).
Антитело к ОХ40 pab1949 характеризовалось агонистической активностью в этом анализе с использованием первичных РВМС человека, индуцируя продукцию IL-2 (фиг. 10А) и подавляя продукцию IL10 (фиг. 10В). Усиление продукции IL-2 pab1949 при концентрации 10 мкг/мл было выше по сравнению с наблюдаемой в случае эталонных антител к ОХ40 pab1784 и pab2045 (фиг. 10А). На фиг. 10С, 10D и 10Е представлены кривые доза-ответ из трех независимых экспериментов, показывающие кратность изменения продукции IL-2 после костимуляции различными концентрациями pab1949, pab1949-1 или эталонных антител pab1784 и pab2045. Антитела pab1949 и pab1949-1 характеризовались отличающейся взаимосвязью доза-ответ, относительно эталонных антител, и были способны индуцировать продукцию IL-2 на высоких уровнях при фармакологически приемлемых концентрациях антител. Продукция IL-2, индуцированная pab1949 или pab 1949-1, представляла собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антитела в широком диапазоне концентраций антител (например, от 0,032 до 20 мкг/мл, как показано на фиг. 10С и 10D, или от 0,0032 до 50 мкг/мл, как показано на фиг. 10Е).Anti-OX40 antibody pab1949 exhibited agonistic activity in this assay using primary human PBMCs, inducing IL-2 production (Fig. 10A) and inhibiting IL10 production (Fig. 10B). The enhancement of IL-2 production by pab1949 at 10 μg/ml was greater than that observed with the reference anti-OX40 antibodies pab1784 and pab2045 (Fig. 10A). In fig. 10C, 10D, and 10E are dose-response curves from three independent experiments showing the fold change in IL-2 production following co-stimulation with various concentrations of pab1949, pab1949-1, or the reference antibodies pab1784 and pab2045. Antibodies pab1949 and pab1949-1 had a different dose-response relationship relative to the reference antibodies and were able to induce IL-2 production at high levels at pharmacologically acceptable antibody concentrations. IL-2 production induced by pab1949 or pab 1949-1 was largely increasing as a function of antibody concentration over a wide range of antibody concentrations (eg, from 0.032 to 20 μg/ml, as shown in Figs. 10C and 10D, or from 0.0032 to 50 μg/ml, as shown in Fig. 10E).
Затем функциональную активность антитела IgG1 pab1949-1 и антитела IgG2pab2193-1 сравнивали в анализе с использованием первичных РВМС человека, описанном выше. Вкратце, замороженные РВМСThe functional activities of IgG1 antibody pab1949-1 and IgG2pab2193-1 antibody were then compared in the primary human PBMC assay described above. Briefly, frozen PBMCs
- 99 046360 человека (Research Blood Components) высевали в концентрации 105 клеток/лунка в среду RPMI1640, дополненную Normocin™ (Invivogen, #ant-nr) и 10% термоинактивированной FBS (Gibco, Invitrogen Corporation), в 96-луночные планшеты с поверхностью NUNCLON дельта. Клетки инкубировали с возрастающими концентрациями (50, 10, 2, 0,4, 0,08, 0,016 и 0,0032 мкг/мл) pab 1949-1, pab2193-1, антитела изотипического контроля IgGi или антитела изотипического контроля IgG2 и 100 нг/мл суперантигена SEA (Toxin Technologies) в течение 5 дней при 37°С, 5% СО2 и 97% влажности. Очищенный супернатант собирали и хранили при -80°С до проведения анализа. Концентрации IL-2 измеряли с помощью ELISA.- 99 046360 human (Research Blood Components) were seeded at a concentration of 10 5 cells/well in RPMI1640 medium supplemented with Normocin™ (Invivogen, #ant-nr) and 10% heat-inactivated FBS (Gibco, Invitrogen Corporation), in 96-well plates with surface NUNCLON delta. Cells were incubated with increasing concentrations (50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 and 0.0032 μg/ml) of pab 1949-1, pab2193-1, IgGi isotype control antibodies, or IgG isotype control antibodies 2 and 100 ng/ml superantigen SEA (Toxin Technologies) for 5 days at 37°C, 5% CO 2 and 97% humidity. The cleared supernatant was collected and stored at -80°C until analysis. IL-2 concentrations were measured using ELISA.
Как показано на фиг. 10F, IgGi-антитело pab1949-1 и IgG2-антитело pab2193-1 индуцировали продукцию IL-2 РВМС человека. Аналогично pab1949-1, pab2193-1 также характеризовалось взаимосвязью доза-ответ, при которой продукция IL-2 представляла собой возрастающую в значительной степени функцию от концентрации антител.As shown in FIG. 10F, IgGi antibody pab1949-1 and IgG 2 antibody pab2193-1 induced IL-2 production by human PBMC. Similar to pab1949-1, pab2193-1 also exhibited a dose-response relationship in which IL-2 production was increasing and largely a function of antibody concentration.
Кроме того, роль взаимодействия с FcyR в отношении функциональной активности антитела к ОХ40 pab1949-1 исследовали путем сравнения IgGi-антитела pab1949-1 с агликозилированным вариантом pab1949-1-N297A. pab1949-1-N297A имеет вариабельную область тяжелой цепи и последовательности легкой цепи, общие с pab1949-1, однако содержит замену N297A в константной области тяжелой цепи, пронумерованной согласно системе нумерации EU.In addition, the role of interaction with FcyR on the functional activity of the anti-OX40 antibody pab1949-1 was examined by comparing the IgGi antibody pab1949-1 with the aglycosylated variant pab1949-1-N297A. pab1949-1-N297A shares heavy chain variable region and light chain sequences with pab1949-1, but contains the N297A substitution in the heavy chain constant region numbered according to the EU numbering system.
РВМС человека, выделенные в градиенте плотности Ficoll из лейкоцитарной пленки здоровых доноров (Research Blood Components, LLC), хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% термоинактивированная FBS) и инкубировали с 100 нг/мл SEA (Toxin Technologies) и pab1949-1, pab1949-1-N297A с титрованием дозы или антителом изотипического контроля IgG1 (0-50 мкг/мл) в течение 5 дней при 37°С и 5% СО2. Супернатант собирали и затем исследовали на наличие IL-2 с применением AlphaLISA® (Perkin Elmer).Human PBMCs isolated on a Ficoll density gradient from the buffy coat of healthy donors (Research Blood Components, LLC) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Cells were resuspended in cell culture medium (RPMI + 10% heat-inactivated FBS) and incubated with 100 ng/ml SEA (Toxin Technologies) and pab1949-1, pab1949-1-N297A dose titration or IgG1 isotype control antibody (0-50 μg /ml) for 5 days at 37°C and 5% CO 2 . The supernatant was collected and then assayed for the presence of IL-2 using AlphaLISA® (Perkin Elmer).
Как показано на фиг. 10G, как pab1949-1, так и pab1949-1-N297A индуцировали продукцию IL-2 дозозависимым образом клетками РВМС человека при стимуляции SEA. Наличие ключевого гликозилирования в одном N-связанном сайте гликозилирования по аспарагину в положении 297 (N297) утрачивается в случае вариантного антитела pab 1949-1-N297A, приводя к потере связывания его Fc-фрагмента с FcyR. Это вариантное антитело характеризовалось сниженной агонистической активностью по сравнению с аналогом дикого типа.As shown in FIG. 10G, both pab1949-1 and pab1949-1-N297A induced IL-2 production in a dose-dependent manner by human PBMCs upon SEA stimulation. The presence of a key glycosylation at one N-linked glycosylation site at asparagine at position 297 (N297) is lost in the case of the variant antibody pab 1949-1-N297A, resulting in loss of binding of its Fc fragment to FcyR. This variant antibody had reduced agonist activity compared to its wild-type counterpart.
6.2.5 Влияние агонистического антитела к ОХ40 на клеточную линию с репортерной системой NFкВ-люцифераза, экспрессирующую ОХ406.2.5 Effect of an agonistic anti-OX40 antibody on an NFκB-luciferase reporter cell line expressing OX40
Способность антитела к ОХ40 pab1949-1 опосредовать передачу сигнала в Т-клетках измеряли с использованием клеточной линии с репортерной системой NF-кВ-люцифераза, экспрессирующей ОХ40. Клетки с репортерной системой, полученные с использованием клеточной линии Jurkat, ресуспендировали в среде для анализа (RPMI + 10% FBS + пенициллин/стрептомицин/глутамин + 1 мкг/мл пуромицина) и инкубировали с различными концентрациями растворимого pab1949-1 (0-6 мкг/мл) или антитела изотипического контроля IgG1 в присутствии реагента антитела к Fc (в связанном в комплекс состоянии) или без него (в растворимом состоянии). Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С и 5% СО2. После инкубации планшеты уравновешивали при комнатной температуре и затем добавляли равный объем реагента Nano-Glo (Promega). Люминесценцию считывали с помощью многоканального ридера EnVision 2100. Только перекрестносшитое pab1949-1 индуцировало значимую активацию клеточной линии с репортерной системой NF-кВ-люцифераза, экспрессирующей ОХ40 (фиг. 11В). Растворимое pab1949-1 индуцировало минимальную активацию клеточной линии с репортерной системой, и антитело изотипического контроля IgG1 не индуцировало экспрессии люциферазы на выявляемых уровнях (фиг. 11A и 11В).The ability of the anti-OX40 antibody pab1949-1 to mediate signal transduction in T cells was measured using an NF-κB-luciferase reporter cell line expressing OX40. Reporter cells generated using the Jurkat cell line were resuspended in assay medium (RPMI + 10% FBS + penicillin/streptomycin/glutamine + 1 μg/ml puromycin) and incubated with various concentrations of soluble pab1949-1 (0-6 μg /ml) or isotype control IgG1 antibodies in the presence of anti-Fc antibody reagent (in a complexed state) or without it (in a soluble state). The plates were incubated for 2 hours at 37°C and 5% CO 2 . After incubation, the plates were equilibrated at room temperature and then an equal volume of Nano-Glo reagent (Promega) was added. Luminescence was read using an EnVision 2100 multichannel reader. Only cross-linked pab1949-1 induced significant activation of the NF-κB-luciferase reporter cell line expressing OX40 (Fig. 11B). Soluble pab1949-1 induced minimal activation of the reporter cell line, and the IgG1 isotype control antibody did not induce luciferase expression at detectable levels (Fig. 11A and 11B).
6.2.6 Влияние агонистического антитела к ОХ40 на репортерную клеточную линию, экспрессирующую Fc-гамма рецептор IIIA6.2.6 Effect of agonistic anti-OX40 antibody on a reporter cell line expressing Fc-gamma receptor IIIA
В этом примере способность антитела IgG1 pab1949-1 и антитела IgG4 pab2044-l совместно связывать ОХ40, и сигнал посредством активации Fc-гамма рецепторов оценивали с помощью репортерной клеточной линии, экспрессирующей Fc-гамма рецептор IIIA совместно с целевыми клетками, экспрессирующими ОХ40 человека. Клетки Jurkat с репортерной системой NFAT-люцифераза, сверхэкспрессирующие FcyRIIIA (полиморфизм 158 V/V) (Promega) использовали в качестве эффекторных клеток. Связывание комплекса антитело/антиген в случае, если антиген расположен на поверхности клетокмишеней, с FcyRIIIA на эффекторных клетках способствует передаче сигнала к конструкции промотор/репортер и приводит к экспрессии гена люциферазы. ОХ40-сверхэкспрессирующие клетки (PHAактивированные клетки Hut102) совместно культивировали с репортерными клетками, экспрессирующими FcyRIIIA в присутствии растворимого pab1949-1, pab2044-1, изотипического контроля IgG1 или изотипического контроля IgG2 с титрованием дозы (0-10 мкг/мл). Aктивацию репортерных клеток определяли в соответствии с инструкциями производителями и фиксировали относительные световые единицы (RLU). A RLU рассчитывали как разницу RLU антитела к ОХ40 и RLU изотипического контроля. Как показано на фиг. 12A, при связывании с ОХ40-сверхэкспрессирующими клетками только IgG1-антитело pab1949-1 активировало репортерные клетки, экспрессирующие FcyRIIIA.In this example, the ability of IgG1 antibody pab1949-1 and IgG 4 antibody pab2044-l to co-bind OX40 and signal through activation of Fc-gamma receptors was assessed using a reporter cell line expressing Fc-gamma receptor IIIA together with human OX40-expressing target cells. Jurkat cells with an NFAT-luciferase reporter system overexpressing FcyRIIIA (158 V/V polymorphism) (Promega) were used as effector cells. Binding of the antibody/antigen complex, if the antigen is located on the surface of target cells, with FcyRIIIA on effector cells promotes signal transmission to the promoter/reporter construct and leads to expression of the luciferase gene. OX40-overexpressing cells (PHA-activated Hut102 cells) were co-cultured with reporter cells expressing FcyRIIIA in the presence of soluble pab1949-1, pab2044-1, IgG1 isotype control, or IgG 2 isotype control with dose titration (0-10 μg/ml). Activation of reporter cells was determined according to the manufacturer's instructions and relative light units (RLU) were recorded. A RLU was calculated as the difference between the RLU of the anti-OX40 antibody and the RLU of the isotype control. As shown in FIG. 12A, when bound to OX40-overexpressing cells, only the IgG1 antibody pab1949-1 activated FcyRIIIA-expressing reporter cells.
- 100 046360- 100 046360
6.2.7 Влияние агонистического антитела к ОХ40 на репортерную клеточную линию, экспрессирующую Fc-гамма рецептор IIA6.2.7 Effect of agonistic anti-OX40 antibody on a reporter cell line expressing Fc-gamma receptor IIA
Затем способность антител IgG, pab1949-l и pab1949-1-S267E/L328F, а также антитела IgG2 pab2193-1 совместно связывать ОХ40 и сигнал посредством FcyRIIA оценивали с использованием репортерной клеточной линии, экспрессирующей FcyRIIA (Promega), совместно с целевыми клетками (клетками Jurkat, экспрессирующими ОХ40 человека). pab1949-1-S267E/L328F имеет последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, общие с pab1949-1, однако содержит замены S267E и L328F в константной области тяжелой цепи, пронумерованной согласно системе нумерации EU.The ability of the IgG antibodies pab1949-l and pab1949-1-S267E/L328F, as well as the IgG 2 antibody pab2193-1, to co-bind OX40 and signal through FcyRIIA was then assessed using a reporter cell line expressing FcyRIIA (Promega) together with target cells ( Jurkat cells expressing human OX40). pab1949-1-S267E/L328F shares heavy chain and light chain sequences with pab1949-1, but contains substitutions S267E and L328F in the heavy chain constant region numbered according to the EU numbering system.
Клетки Jurkat, экспрессирующие FcyRIIA с полиморфизмом высокой аффинности 131 Н/Н и NFATотвечающим элементом, управляющим экспрессией люциферазы светлячка, использовали в качестве эффекторных клеток. Вкратце, 25 мкл целевых клеток (бх10б клеток/мл) смешивали с 25 мкл серийно разведенных антител в лунках с двумя повторами 9б-луночных планшетов для анализа. Исследуемыми антителами были pab1949-1, pab1949-1-S267E/L328F, pab2193-1, антитело изотипического контроля IgGi и антитело изотипического контроля IgG2. Затем 25 мкл эффекторных клеток (бх10б клеток/мл) добавляли в каждую лунку, с получением соотношения эффектора и мишени 1:1. Планшеты инкубировали в течение 20 часов при 37°С и 5% СО2. После этой инкубации реагент для анализа экспрессии люциферазы Bio-Glo (Promega) размораживали при комнатной температуре и 75 мкл добавляли в каждую лунку. Через 5-10 минут измеряли люминесценцию с помощью многоканального планшетного ридера EnVision (PerkinElmer). Фоновую люминесценцию вычитали из показателей для каждого образца и фиксировали откорректированные относительные световые единицы (RLU). Как показано на фиг. 12В в случае связывания с клетками, экспрессирующими ОХ40, IgG2-антитело pab2193-1 характеризовалось наиболее сильной активацией FcyRIIAH131, за которой следовали pab1949-1-S267E/L328F и pab1949-1.Jurkat cells expressing FcyRIIA with the high affinity 131 H/H polymorphism and the NFAT response element driving firefly luciferase expression were used as effector cells. Briefly, 25 μl of target cells (x10 b cells/ml) were mixed with 25 μl of serially diluted antibodies in duplicate wells of 9-well assay plates. The antibodies tested were pab1949-1, pab1949-1-S267E/L328F, pab2193-1, IgGi isotype control antibody, and IgG2 isotype control antibody. Then, 25 μl of effector cells (x10 b cells/ml) were added to each well, resulting in a 1:1 ratio of effector to target. The plates were incubated for 20 hours at 37°C and 5% CO2. After this incubation, Bio-Glo Luciferase Expression Assay Reagent (Promega) was thawed at room temperature and 75 μl was added to each well. After 5-10 minutes, luminescence was measured using an EnVision multi-channel plate reader (PerkinElmer). Background luminescence was subtracted from the values for each sample and the corrected relative light units (RLU) were recorded. As shown in FIG. 12B, when bound to OX40-expressing cells, the IgG 2 antibody pab2193-1 had the strongest activation of FcyRIIA H131 , followed by pab1949-1-S267E/L328F and pab1949-1.
б.2.8 Взаимодействие антитела к ОХ40 с регуляторными Т-клетками или эффекторными Тклеткамиb.2.8 Interaction of antibodies to OX40 with regulatory T cells or effector T cells
В этом примере исследовали экспрессию ОХ40 человека активированными естественными регуляторными Т-клетками (nTreg) и эффекторными Т-клетками (Teff). РВМС, выделенные от здоровых доноров, обогащали необработанными CD3+ Т-клетками (Teff) или CD4+ CD25+ CD45RA+ Т-клетками (nTreg) с помощью магнитного разделения. Т-лимфоциты активировали гранулами, связанными с антителом к CD3/антителом к CD28, с использованием 500 ЕД rIL-2 в течение 4 дней и 50 ЕД rIL-2 еще в течение 4 дней. Через 8 дней после активации Т-клетки собирали и окрашивали красителем для мертвых клеток для оценки живых/мертвых клеток, фиксированных в диапазоне ближней ИК-области в PBS в течение 20 минут при 4°С. Смесь поверхностных антител, содержащую конъюгированные антитела к CD4 (BV605, ОКТ4), CD8a (BV650, RPA-T8), CD127 (BV421, АО1905), CD25 (АРС, М-А251) и ОХ-40 (РЕ, АСТ35), разведенные в буфере (PBS с 2% FBS), добавляли к каждому образу и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Затем клетки промывали буфером, фиксировали и окрашивали смесью внутриклеточных антител, содержащей конъюгированные антитела к CD3 (BV711, OKT3) и Foxp3 (AF488, РСН101), разведенные в буфере. Один образец из каждой популяции Т-клеток также окрашивали флуоресцентным контролем флуоресценции с комбинацией выявляемых меток без одной (FMO) на наличие ОХ40 с использованием РЕ-конъюгированного изотипического контроля мышиного антитела к IgG1 человека. Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии. РЕ-конъюгированные гранулы Quantibrite пропускали одновременно и использовали для количественного анализа плотности рецепторов ОХ40, согласно инструкциям производителя.In this example, the expression of human OX40 by activated natural regulatory T cells (nTreg) and effector T cells (Teff) was examined. PBMCs isolated from healthy donors were enriched for untreated CD3+ T cells (Teff) or CD4+ CD25+ CD45RA+ T cells (nTreg) using magnetic separation. T cells were activated with anti-CD3/anti-CD28 coupled beads using 500 U of rIL-2 for 4 days and 50 U of rIL-2 for an additional 4 days. 8 days after activation, T cells were harvested and stained with dead cell dye to assess live/dead cells fixed with NIR in PBS for 20 min at 4°C. A mixture of surface antibodies containing conjugated antibodies to CD4 (BV605, OKT4), CD8a (BV650, RPA-T8), CD127 (BV421, AO1905), CD25 (APC, M-A251) and OX-40 (PE, AST35), diluted in buffer (PBS with 2% FBS) was added to each sample and incubated for 30 minutes at 4°C. Cells were then washed with buffer, fixed, and stained with an intracellular antibody mixture containing conjugated antibodies to CD3 (BV711, OKT3) and Foxp3 (AF488, PCH101) diluted in buffer. One sample from each T cell population was also fluorescence-monitored with a combination of detectable labels without one (FMO) stained for OX40 using a PE-conjugated isotype control mouse anti-human IgG1 antibody. Samples were analyzed using flow cytometry. PE-conjugated Quantibrite beads were run simultaneously and used for quantitation of OX40 receptor density according to the manufacturer's instructions.
Как показано на фиг. 13А, поверхностная экспрессия ОХ40 человека на активированных nTreg клетках была выше, чем на активированных CD4+ или CD8+ Т-эффекторных клетках.As shown in FIG. 13A, surface expression of human OX40 on activated nTreg cells was higher than on activated CD4+ or CD8+ T effector cells.
В аналогичном исследовании активированные nTreg и Teff от двух доноров окрашивали коммерческим антителом к ОХ40 (клон BER-ACT35) или антителом изотипического контроля и анализировали с помощью проточной цитометрии. Дельта средней интенсивности флуоресценции (Δ MFI) представляет собой разницу MFI антитела к ОХ40 и MFI изотипического контроля. Результаты показаны на фиг. 13В.In a similar study, activated nTreg and Teff from two donors were stained with a commercial anti-OX40 antibody (clone BER-ACT35) or an isotype control antibody and analyzed by flow cytometry. Delta mean fluorescence intensity (Δ MFI) is the difference between the MFI of the OX40 antibody and the MFI of the isotype control. The results are shown in Fig. 13V.
Затем способность антитела к ОХ40 pab1949 совместно связывать ОХ40 и сигнал посредством активации Fc-гамма рецепторов оценивали с использованием репортерной линии клеток, экспрессирующей Fc-гамма рецептор IIIA (FcyRIIIA), описанный выше, совместно с активированными эффекторными Тклетками (Teff) или nTreg клетками, полученными, как описано выше. Антитело к ОХ40 pab1949 или изотипический контроль IgG1 серийно разводили с 3-кратными разведениями, начиная с конечной концентрации 10 мкг/мл. В лунки с двумя повторами 25 мкл разведения каждого антитела добавляли к Teff клеткам или nTreg клеткам. Клетки Jurkat с репортерной системой NFAT-люцифераза, сверхэкспрессирующие FcyRIIIA (полиморфзизм 158 V/V) добавляли в соотношении эффектора и мишени 1:1. Планшеты инкубировали в течение 20 часов и затем анализировали с использованием реагента для анализа экспрессии люциферазы Bio-Glo (Promega). Фоновую люминесценцию (контрольные наружные лунки) вычитали из показателей каждого образца и фиксировали откорректированные относительные световые единицы (RLU). A RLU показаны на фиг. 13С, отображающие разницу RLU антитела к ОХ40 и RLU изотипического контроля.The ability of the OX40 antibody pab1949 to co-bind OX40 and signal through activation of Fc-gamma receptors was then assessed using the reporter cell line expressing Fc-gamma receptor IIIA (FcyRIIIA) described above, together with activated effector T cells (Teff) or nTreg cells generated , as described above. Anti-OX40 antibody pab1949 or isotype control IgG 1 was serially diluted in 3-fold dilutions, starting with a final concentration of 10 μg/ml. In duplicate wells, 25 μl of each antibody dilution was added to Teff cells or nTreg cells. Jurkat cells with an NFAT-luciferase reporter system overexpressing FcyRIIIA (158 V/V polymorphism) were added at a 1:1 ratio of effector to target. The plates were incubated for 20 hours and then analyzed using Bio-Glo Luciferase Expression Assay Reagent (Promega). Background luminescence (control outer wells) was subtracted from each sample and the corrected relative light units (RLU) were recorded. A RLUs are shown in FIG. 13C showing the difference between the RLU of the anti-OX40 antibody and the RLU of the isotype control.
- 101 046360- 101 046360
Исследование, показанное на фиг. 13С, повторяли с использованием несколько модифицированного протокола. Вкратце, лейкоцитарную пленки от здорового добровольца (Research Blood Components) использовали для выделения первичных регуляторных Т-клеток и эффекторных Т-клеток. Обе субпопуляции Т-клеток очищали с помощью разделения с использованием магнитных гранул (набор для выделения CD4+CD25+CD127dim/- регулярных Т-клеток II и набор для выделения общих Т-клеток соответственно, Miltenyi Biotec) и затем активировали в течение 7 дней путем инкубирования клеток с гранулами с антителами к CD3/антителами к CD28/антителами к CD2 (Miltenyi Biotech) в соотношении 1:4 (Тклетка:гранула) в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% FBS). Активированные клетки Treg или клетки Teff совместно культивировали с FcYRInA-экспрессирующими клетками Jurkat с репортерной системой NFAT-люцифераза (Promega), описанными выше, в присутствии растворимого pab1949-1 или антитела изотипического контроля IgGj с титрование дозы (0-10 мкг/мл). Активацию репортерных клеток определяли в соответствии с инструкциями производителями и А RLU показаны на фиг. 13D.The study shown in FIG. 13C was repeated using a slightly modified protocol. Briefly, buffy coats from a healthy volunteer (Research Blood Components) were used to isolate primary regulatory T cells and effector T cells. Both T cell subsets were purified by magnetic bead separation (CD4 + CD25 + CD127 dim/- Regular T Cell Isolation Kit II and Total T Cell Isolation Kit, respectively, Miltenyi Biotec) and then activated for 7 days by incubating cells with anti-CD3/anti-CD28/anti-CD2 beads (Miltenyi Biotech) at a ratio of 1:4 (Cell:bead) in cell culture medium (RPMI + 10% FBS). Activated Treg cells or Teff cells were cocultured with FcYRInA-expressing Jurkat cells with the NFAT-luciferase reporter system (Promega) described above in the presence of soluble pab1949-1 or IgGj isotype control antibody with dose titration (0-10 μg/ml). Activation of reporter cells was determined according to the manufacturers' instructions and the RLUs are shown in Fig. 13D.
В соответствии с дифференциальной экспрессией поверхностного ОХ40 между активированными nTreg и активированными CD4+ или CD8+ эффекторными Т-клетками (фиг. 13А и 13В), антитела к ОХ40 pab1949 (фиг. 13С) и pab1949-1 (фиг. 13D), предпочтительно меченые, активировали nTreg клетки, индуцируя FcYRIIIA-зависимую передачу сигнала в репортерной линии клеток.Consistent with the differential expression of surface OX40 between activated nTregs and activated CD4+ or CD8+ effector T cells (Fig. 13A and 13B), the OX40 antibodies pab1949 (Fig. 13C) and pab1949-1 (Fig. 13D), preferentially labeled, activated nTreg cells by inducing FcYRIIIA-dependent signaling in a reporter cell line.
Для оценки того, являлась ли сверхэкспрессия ОХ40 характеристикой регуляторных Т-клеток, локализованных в опухолевом микроокружении, экспрессию ОХ40 сравнивали для Т-клеток, выделенных из крови здоровых доноров-людей (фиг. 14А, а-с, n=3) или из опухолевых тканей пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC) (фиг. 14А, d-f, n=3). Для исключения фонового связывания антител с иммунными популяциями все клетки инкубировали с очищенными антителом к CD16/32 (10 мкг/мл, 20 минут при комнатной температуре) перед добавлением антител к антигенам клеточной поверхности и внутриклеточных антител. После блокирования FcR все образцы инкубировали с АРС-конъюгированным антителом к ОХ40 (клон Ber-АСТ35) или изотипическим контролем и смесью линий антител к антигенам клеточной поверхности (CD3-FITC, CD25-PECy7, CD4-BV650 и CD8a-PE) в течение 45 минут на льду (1 мкг/мл каждого), промывали три раза буфером для FACS (PBS, EDTA и 0,5% BSA), за которым следовала фиксация/пермеабилизация и инкубация с Pacific Blue-конъюгированным FOXP3 (фиксация/пермеабилизация и инкубация каждого в течение 45 минут на льду, 1 мкг/мл). Затем окрашенные образцы анализировали с помощью проточного цитометра LSRFortessa (BD Biosciences). Популяции клеток на фиг. 14А определяли как: Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD251ow, FOXP3-) или Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25high, FOXP3+).To assess whether OX40 overexpression was a characteristic of regulatory T cells localized in the tumor microenvironment, OX40 expression was compared for T cells isolated from the blood of healthy human donors (Fig. 14A, a-c, n=3) or from tumor cells. tissues from patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) (Fig. 14A, d-f, n=3). To exclude background binding of antibodies to immune populations, all cells were incubated with purified anti-CD16/32 antibody (10 μg/ml, 20 minutes at room temperature) before adding antibodies to cell surface antigens and intracellular antibodies. After FcR blocking, all samples were incubated with APC-conjugated antibody to OX40 (clone Ber-ACT35) or isotype control and a mixture of antibody lines to cell surface antigens (CD3-FITC, CD25-PECy7, CD4-BV650 and CD8a-PE) for 45 minutes on ice (1 μg/ml each), washed three times with FACS buffer (PBS, EDTA, and 0.5% BSA), followed by fixation/permeabilization and incubation with Pacific Blue-conjugated FOXP3 (fixation/permeabilization and incubation of each for 45 minutes on ice, 1 µg/ml). Stained samples were then analyzed using an LSRFortessa flow cytometer (BD Biosciences). The cell populations in Fig. 14A was defined as: Tconv (CD3+, CD4+, CD8a-, CD251ow, FOXP3-) or Treg (CD3+, CD4+, CD8a-, CD25high, FOXP3+).
Как показано на фиг. 14А, поверхностная экспрессия ОХ40 была наибольшей на регуляторных Тклетках, выделенных из опухолевых тканей пациентов с NSCLC, с незначительным уровнем или невыявляемым уровнем на Treg клетках или обычных Т-клетках от здоровых доноров.As shown in FIG. 14A, surface expression of OX40 was greatest on regulatory T cells isolated from tumor tissues of NSCLC patients, with little or undetectable levels on Treg cells or conventional T cells from healthy donors.
Аналогичные анализы проводили для всех видов опухолей. Вкратце, замороженные диссоциированные образцы опухоли (Conversant) или РВМС размораживали в смачивающей жидкости AutoMACS (промывочном буфере, Miltenyi Biotec) и блокировали Fc клеток (Trustain FcX, Biolegend) перед окрашиванием клеточной поверхности. Клетки промывали промывочным буфером и окрашивали в течение 45 минут при 4°С антителами-маркерами клеточной линии, которые включали: антитело к CD3 (клон SP34), антитело к CD4 (клон OKT4), антитело к CD8 (клон SK1), антитело к CD25 (клон МА-251) и антитело к ОХ40 (клон BER-ACT35). Клетки промывали и пермеабилизовали с помощью набора буферов для окрашивания по транскрипционным факторам forkhead box Р3 (FOXP3) (eBioscience) в соответствии с инструкциями производителя. После пермеабилизации клетки окрашивали меченым eFluor450 антителом к FOXP3 (клон РСН101, eBioscience). Окрашенные образцы определяли с помощью проточного цитометра BD Biosciences Fortessa и данные анализировали с помощью программного обеспечения Flojo.Similar analyzes were performed for all types of tumors. Briefly, frozen dissociated tumor samples (Conversant) or PBMCs were thawed in AutoMACS wetting fluid (wash buffer, Miltenyi Biotec) and cell Fc blocked (Trustain FcX, Biolegend) before cell surface staining. Cells were washed with wash buffer and stained for 45 minutes at 4°C with cell line marker antibodies, which included: anti-CD3 (clone SP34), anti-CD4 (clone OKT4), anti-CD8 (clone SK1), anti-CD25 (clone MA-251) and antibody to OX40 (clone BER-ACT35). Cells were washed and permeabilized with forkhead box P3 (FOXP3) transcription factor staining buffer kit (eBioscience) according to the manufacturer's instructions. After permeabilization, cells were stained with eFluor450-labeled anti-FOXP3 antibody (clone PCH101, eBioscience). Stained samples were detected using a BD Biosciences Fortessa flow cytometer and data were analyzed using Flojo software.
Образцы из нескольких типов опухолей, в том числе рака яичников, колоректальной карциномы (CRC), карциномы эндометрия, почечно-клеточной карциномы (RCC), немелкоклеточной карциномы (NSCLC) и рака молочной железы, характеризовались более высокой экспрессией ОХ40 на опухольассоциированных регуляторных Т-клетках по сравнению с опухоль-ассоциированными эффекторными Т-клетками (фиг. 14В, 14С и 14D).Samples from several tumor types, including ovarian cancer, colorectal carcinoma (CRC), endometrial carcinoma, renal cell carcinoma (RCC), non-small cell carcinoma (NSCLC), and breast cancer, had higher OX40 expression on tumor-associated regulatory T cells compared to tumor-associated effector T cells (FIGS. 14B, 14C and 14D).
6.2.9 Влияние антител к ОХ40 на стимулированную антителом к CD3 продукцию цитокинов РВМС макака-крабоеда6.2.9 Effect of anti-OX40 antibodies on anti-CD3-stimulated cytokine production by cynomolgus macaque PBMCs
Затем агонистическую активность антитела к ОХ40 pab1949-1 на РВМС макака-крабоеда исследовали с помощью анализа субоптимальной стимуляции антителом к CD3. Вкратце, замороженные РВМС макака-крабоеда (World Wide Primates) хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% FBS + 20 ЕД./мл IL-2) и инкубировали со связанным на планшете антителом к CD3 (0,8 мкг/мл) и связанным на планшете pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgGj (0, 0,8, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25, или 50 мкг/мл) в течение 4 дней при 37°С и 5% СО2. Супернатант клеточных культур собирали и секретируемые цитокины исследовали с помощью набора для анализа приматов помимо человека (NHP) V-Plex (Meso Scale Discovery).The agonistic activity of the anti-OX40 antibody pab1949-1 on cynomolgus monkey PBMCs was then examined using an anti-CD3 suboptimal stimulation assay. Briefly, frozen cynomolgus monkey PBMCs (World Wide Primates) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Cells were resuspended in cell culture medium (RPMI + 10% FBS + 20 U/ml IL-2) and incubated with plate-bound anti-CD3 antibody (0.8 μg/ml) and plate-bound pab1949-1 or isotype antibody. IgGj control (0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, or 50 μg/ml) for 4 days at 37°C and 5% CO 2 . Cell culture supernatant was collected and secreted cytokines were assayed using a V-Plex non-human primate (NHP) assay kit (Meso Scale Discovery).
Антитело к ОХ40 pab1949-1 дозозависимо усиливало продукцию GM-CSF (фиг. 15А и 15В), IL-17Anti-OX40 antibody pab1949-1 dose-dependently increased the production of GM-CSF (Fig. 15A and 15B), IL-17
- 102 046360 (фиг. 16А и 16В), ΤΝΕβ (фиг. 17А и 17В), IL-5 (фиг. 18А и 18В) и IL-10 (фиг. 19А и 19В) в РВМС нескольких макак-крабоедов.- 102 046360 (Figs. 16A and 16B), ΤΝΕβ (Figs. 17A and 17B), IL-5 (Figs. 18A and 18B) and IL-10 (Figs. 19A and 19B) in PBMCs of several cynomolgus macaques.
6.2.10 Влияние антител к ОХ40 на РВМС макака-крабоеда при стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA)6.2.10 Effect of antibodies to OX40 on cynomolgus monkey PBMCs stimulated with staphylococcal enterotoxin A (SEA)
Далее анализировали способность pab 1949-1 костимулировать РВМС макака-крабоеда после стимуляции стафилококковым энтеротоксином A (SEA). Замороженные РВМС макака-крабоеда (World Wide Primates) хранили в жидком азоте и размораживали в день эксперимента. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI + 10% термоинактивированная FBS) и инкубировали с антигеном SEA (100 нг/мл), а также титрованием дозы pab1949-1 или антителом изотипического контроля IgGi (0, 0,8, 1,6, 3,1, 6,3, 12,5, 25 или 50 мкг/мл) в течение 5 дней при 37°С и 5% СО2. После активации супернатант клеточных культур собирали и секретируемые цитокины исследовали с помощью набора Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). Как показано на фиг. 20А и 20В, антитело к ОХ40 pab1949-1 повышало продуцирование IL-2 РВМС макака-крабоеда от двух доноров.The ability of pab 1949-1 to costimulate cynomolgus monkey PBMCs after stimulation with staphylococcal enterotoxin A (SEA) was further analyzed. Frozen PBMCs from cynomolgus monkeys (World Wide Primates) were stored in liquid nitrogen and thawed on the day of the experiment. Cells were resuspended in cell culture medium (RPMI + 10% heat-inactivated FBS) and incubated with SEA antigen (100 ng/ml) and dose titration of pab1949-1 or IgGi isotype control antibody (0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25 or 50 µg/ml) for 5 days at 37°C and 5% CO 2 . After activation, cell culture supernatant was collected and secreted cytokines were assayed using the Non-human primate (NHP) V-Plex assay kit (Meso Scale Discovery). As shown in FIG. 20A and 20B, anti-OX40 antibody pab1949-1 increased IL-2 production by cynomolgus macaque PBMC from two donors.
6.3 Пример 3. Картирование эпитопов антител к ОХ406.3 Example 3: Epitope mapping of anti-OX40 antibodies
В этом примере эпитопы pab1949 и эталонного антитела к ОХ40 pab1928 анализировали с помощью аланин-сканирования. Антитело pab1928 получали на основе вариабельных областей антитела Hu106122, предусмотренного в патентной публикации США 2013/0280275 (включенной в данный документ посредством ссылки). Тяжелая цепь pab1928 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи Hu106-122 (SEQ ID NO: 56) и константную область IgG1 человека под SEQ ID NO: 65. Легкая цепь pab1928 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи Hu106-122 (SEQ ID NO: 57) и константную область под SEQ ID NO: 25. Таким образом, тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 72 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59.In this example, the epitopes of pab1949 and the reference anti-OX40 antibody pab1928 were analyzed using alanine scanning. The pab1928 antibody was derived from the variable regions of the Hu106122 antibody provided in US Patent Publication 2013/0280275 (incorporated herein by reference). The pab1928 heavy chain contains the amino acid sequence of the heavy chain variable region of Hu106-122 (SEQ ID NO: 56) and the human IgG1 constant region of SEQ ID NO: 65. The pab1928 light chain contains the amino acid sequence of the light chain variable region of Hu106-122 (SEQ ID NO: 57) and a constant region of SEQ ID NO: 25. Thus, the heavy chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 72 and the light chain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59.
6.3.1 Картирование эпитопов - аланин-сканирование6.3.1 Epitope mapping - alanine scanning
Характеристики связывания pab1949-1 и эталонного антитела pab1928 определяли с помощью аланин-сканирования. Вкратце, систему конструирования белков QuikChange HT от компании Agilent Technologies (G5901A) использовали для получения мутантов ОХ40 человека с аланиновыми заменами во внеклеточном домене. Мутантов ОХ40 человека экспрессировали на поверхности клеток 1624-5 с помощью стандартных методик трансфекции с последующей трансдукцией, как описано выше. Клетки, экспрессирующие надлежащие образом уложенные мутанты ОХ40 человека, о чем свидетельствовало связывание с поликлональным антителом к ОХ40 при проточной цитометрии, дополнительно отбирали на наличие субпопуляций, которые экспрессировали мутанты ОХ40 человека, которые не связывались с моноклональным антителом к ОХ40 pab1949-1 или pab1928. Клетки, которые характеризовались специфичным связыванием с антителом, отделяли от популяции несвязывающихся клеток, с помощью препаративного высокоскоростного FACS (FACSAriaII, BD Biosciences). Популяции клеток, реактивные и нереактивные в отношении антителам, размножали повторно в культуре тканей, и благодаря фенотипу стабильной экспрессии трансдуцированных с помощью ретровирусов клеток, циклы направленных на антитела клеточной сортировки и экспансии культуры тканей повторяли, до момента включительно, когда получали отчетливо выявляемую популяцию клеток, нереактивных в отношении антителу ОХ40 (pab1949-1 или pab1928). Такую популяцию клеток, нереактивную в отношении ОХ40, подвергали конечной стадии сортировки отдельных клеток. Через несколько дней после экспансии клеток отдельные отсортированные клетки снова исследовали на предмет связывания с поликлональным антителом к ОХ40 и несвязывания с моноклональным антителом pab1949-1 или pab1928 с помощью проточной цитометрии. Вкратце, клетки 1624-5, экспрессирующие отдельные мутанты ОХ40 человека по аланину, инкубировали с моноклональным антителом к ОХ40 pab1949-1 или pab1928. Для каждого антитела исследовали две концентрации антител (pab1949-1:2 мкг/мл и 0,5 мкг/мл; pab1928: 1,1 мкг/мл и 0,4 мкг/мл). Поликлональное антитело к ОХ40 (AF3388, R&D systems), конъюгированное с АРС, разводили в соотношении 1:2000. Добавляли Fc-рецепторный блокирующий раствор (1:200; № по каталогу BD 553142) и образцы инкубировали в течение 20 минут при 4°С. После промывания клетки инкубировали с вторичным антителом к IgG при необходимости в выявлении (конъюгированным с РЕ; № по каталогу BD 109-116-097) в течение 20 минут при 4°С. Затем клетки промывали и определяли с помощью проточной цитометрии (BD Biosciences).The binding characteristics of pab1949-1 and the reference antibody pab1928 were determined by alanine scanning. Briefly, the QuikChange HT protein engineering system from Agilent Technologies (G5901A) was used to generate human OX40 mutants with alanine substitutions in the extracellular domain. Human OX40 mutants were expressed on the surface of 1624-5 cells using standard transfection techniques followed by transduction as described above. Cells expressing properly folded human OX40 mutants, as evidenced by binding to the anti-OX40 polyclonal antibody by flow cytometry, were further screened for subpopulations that expressed human OX40 mutants that did not bind to the anti-OX40 monoclonal antibody pab1949-1 or pab1928. Cells that exhibited specific antibody binding were separated from the nonbinding cell population using preparative high-speed FACS (FACSAriaII, BD Biosciences). Antibody-reactive and nonreactive cell populations were repeatedly expanded in tissue culture, and due to the stable expression phenotype of the retrovirally transduced cells, cycles of antibody-directed cell sorting and tissue culture expansion were repeated until a clearly detectable population of cells was obtained. non-reactive to the OX40 antibody (pab1949-1 or pab1928). This OX40 nonreactive cell population was subjected to a final single cell sorting step. Several days after cell expansion, individual sorted cells were again examined for binding to polyclonal anti-OX40 antibody and non-binding to monoclonal antibody pab1949-1 or pab1928 by flow cytometry. Briefly, 1624-5 cells expressing single human OX40 alanine mutants were incubated with the anti-OX40 monoclonal antibody pab1949-1 or pab1928. For each antibody, two antibody concentrations were tested (pab1949-1: 2 μg/ml and 0.5 μg/ml; pab1928: 1.1 μg/ml and 0.4 μg/ml). Polyclonal antibody to OX40 (AF3388, R&D systems), conjugated to APC, was diluted in a ratio of 1:2000. Fc receptor blocking solution (1:200; BD Cat. No. 553142) was added and samples were incubated for 20 minutes at 4°C. After washing, cells were incubated with secondary anti-IgG antibody as required for detection (PE-conjugated; Cat. No. BD 109-116-097) for 20 minutes at 4°C. Cells were then washed and detected by flow cytometry (BD Biosciences).
Для связывания фенотипа (поликлональное антитело к ОХ40 +, моноклональное антитело к ОХ40) с генотипом выполняли секвенирование мутантов ОХ40 человека из отдельных отсортированных клеток. На фиг. 21 представлена таблица, показывающая мутанты ОХ40 человека по аланину, которые попрежнему связываются с поликлональным антителом к ОХ40 человека, но не связываются с моноклональным антителом к ОХ40 pab1949-1 или pab1928. Все остатки пронумерованы в соответствии со зрелой аминокислотной последовательностью ОХ40 человека (SEQ ID NO: 55). + указывает на связывание и - указывает на отсутствие связывания на основе анализа проточной цитометрии.To link the phenotype (polyclonal anti-OX40+ antibody, monoclonal anti-OX40 antibody) to the genotype, sequencing of human OX40 mutants from individual sorted cells was performed. In fig. 21 is a table showing human OX40 alanine mutants that still bind to the human OX40 polyclonal antibody but do not bind to the anti-OX40 monoclonal antibody pab1949-1 or pab1928. All residues are numbered according to the mature human OX40 amino acid sequence (SEQ ID NO: 55). + indicates binding and - indicates no binding based on flow cytometry analysis.
Настоящее изобретение не предполагает ограничения в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, кроме описанных, будут очевидны специалистам в данной области из вышеизложенного описания иThe present invention is not intended to be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention other than those described will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and
- 103 -- 103 -
Claims (46)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/158,515 | 2015-05-07 | ||
| US62/161,198 | 2015-05-13 | ||
| US62/262,373 | 2015-12-02 | ||
| US62/323,458 | 2016-04-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA046360B1 true EA046360B1 (en) | 2024-03-06 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11472883B2 (en) | Methods of administering anti-OX40 antibodies | |
| US20210324097A1 (en) | Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof | |
| US11359028B2 (en) | Anti-OX40 antibodies and anti-GITR antibodies | |
| US20200317797A1 (en) | Antibodies and methods of use thereof | |
| EA046360B1 (en) | ANTIBODIES TO OX40 AND METHODS OF THEIR APPLICATION |