EA046126B1

EA046126B1 - PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING COMPLEXES OF ALLOFERON WITH ZINC

Info

Publication number: EA046126B1
Application number: EA202200087
Authority: EA
Inventors: Герман Петрович Беккер; Олег Владимирович Матусевич; Борис Алексеевич Никонов
Original assignee: Герман Петрович Беккер
Priority date: 2019-12-29
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2024-02-08

Description

Изобретение относится к фармацевтической сфере и касается оптимизации состава композиции, содержащей биологически активный комплекс цинка с пептидом аллоферон.The invention relates to the pharmaceutical field and concerns the optimization of the composition of a composition containing a biologically active zinc complex with the peptide alloferon.

Известен патент RU 2470031 (Киселев О.И., Ершов Ф.И., опубл.: 20.12.2012.) описывающий цинксодержащие пептидные комплексы видаKnown patent RU 2470031 (Kiselev O.I., Ershov F.I., publ.: 12.20.2012.) describing zinc-containing peptide complexes of the form

обладающие противовирусной и иммуномодулирующую активностью. Данное решение выбрано как прототип.having antiviral and immunomodulatory activity. This solution was chosen as a prototype.

Комплексные соединения пептидов с цинком данного вида являются основным содержанием патента RU 2470031. Однако предложенная авторами патента структурная формула комплексов, базируется исключительно на общих положениях о свойствах цинка и гистидин-содержащих пептидов, а также данных компьютерного моделирования, являясь по существу сугубо теоретической. Заявленные авторами комплексы относятся к широкому кругу пептидов, молекулы которых содержат несколько (не менее трех) остатков гистидина.Complex compounds of peptides with zinc of this type are the main content of patent RU 2470031. However, the structural formula of the complexes proposed by the authors of the patent is based solely on general principles about the properties of zinc and histidine-containing peptides, as well as computer modeling data, being essentially purely theoretical. The complexes declared by the authors refer to a wide range of peptides, the molecules of which contain several (at least three) histidine residues.

Основным объектом рассмотрения авторов является олигопептид Аллоферон (аллоферон-1 патента RU 2172322 Аллофероны - иммуномодулирующие пептиды Черныш С.И., Ким Су Ин, Беккер Г.П. и др.). Однако свои выводы авторы распространили не только на все обширное семейство аллоферонов, но и на другие пептиды, обогащенные гистидином. Авторы патента предположили, что гистидинсодержащие пептиды образуют с цинком комплексы хелатного типа, в которых цинк координационно связан с остатками гистидина. Однако структурную формулу комплексов, являющуюся основным содержанием изобретения, авторы никакими экспериментальными доказательствами не подтвердили. Правомерность структурной формулы без ее обоснования вызывает большие сомнения. Сомнение вызывает и априорное распространение формулы комплексов и выводов об их биологической активности на широкий круг не исследованных пептидов.The main object of consideration by the authors is the oligopeptide Alloferon (Alloferon-1 patent RU 2172322 Alloferons - immunomodulatory peptides Chernysh S.I., Kim Soo In, Becker G.P., etc.). However, the authors extended their conclusions not only to the entire extensive family of alloferons, but also to other peptides enriched with histidine. The authors of the patent suggested that histidine-containing peptides form chelate-type complexes with zinc, in which zinc is coordinately linked to histidine residues. However, the authors did not confirm the structural formula of the complexes, which is the main content of the invention, with any experimental evidence. The validity of a structural formula without its justification raises serious doubts. The a priori extension of the formula of the complexes and conclusions about their biological activity to a wide range of unstudied peptides also raises doubts.

Из текста патента следует, что для оценки биологических свойств комплексов использовались водные растворы. Однако известно, что в водной среде поведение комплексных соединений носит сложный характер (О.В. Сергеева. Реакции в водных растворах.From the text of the patent it follows that aqueous solutions were used to evaluate the biological properties of the complexes. However, it is known that in an aqueous environment the behavior of complex compounds is complex (O.V. Sergeeva. Reactions in aqueous solutions.

Сложные ионные равновесия. Минск, 2009). Это обстоятельство не позволяет делать однозначных выводов о структуре и составе комплексов на основе лишь теоретических предпосылок. Комплексные соединения являются веществами с в принципе нестабильной структурой (Гринберг А.А., Введение в химию комплексных соединении, 4 изд., Л., 1971). В водных растворах они всегда представляют собой смесь разных форм, равновесие между которыми характеризуется константами устойчивости (нестойкости). Для комплексов пептидов или белков, как слабых лигандов, это выражено в еще большей степени (Неорганическая биохимия Мир, М., 1978, т.1, с.152-162, раздел Комплексы металлов с аминокислотами и пептидами). Для системы аллоферон - цинк это усугубляется тем что, во-первых, цинк является слабым комплексообразователем, во-вторых, аллоферон обладает, на ряду с гистидином, другими функциональными группами способными к координации.Complex ionic equilibria. Minsk, 2009). This circumstance does not allow us to draw unambiguous conclusions about the structure and composition of complexes based only on theoretical premises. Complex compounds are substances with a fundamentally unstable structure (Grinberg A.A., Introduction to the chemistry of complex compounds, 4th ed., Leningrad, 1971). In aqueous solutions they are always a mixture of different forms, the equilibrium between which is characterized by stability (instability) constants. For complexes of peptides or proteins, as weak ligands, this is expressed to an even greater extent (Inorganic Biochemistry Mir, M., 1978, vol. 1, pp. 152-162, section Complexes of metals with amino acids and peptides). For the alloferon-zinc system, this is aggravated by the fact that, firstly, zinc is a weak complexing agent, and secondly, alloferon has, along with histidine, other functional groups capable of coordination.

Авторами патента RU 2470031 показано, что биологическая активность комплексов аллоферона с цинком превышает активность исходного пептида. Однако, приведя данные о биологических свойствах комплексов, авторы патента не привели никаких данных о способе их получения. В описании не указано, какие соли цинка были использованы для получения комплексов, не приведена методика их получения и допустимые условия (рН, растворители, ионная сила, дополнительные компоненты), при которых эти комплексы существуют.The authors of patent RU 2470031 have shown that the biological activity of alloferon complexes with zinc exceeds the activity of the original peptide. However, while providing data on the biological properties of the complexes, the authors of the patent did not provide any data on the method of their preparation. The description does not indicate which zinc salts were used to obtain the complexes, the method of their preparation and the permissible conditions (pH, solvents, ionic strength, additional components) under which these complexes exist are not given.

Таким образом, патент RU 2470031 носит сугубо теоретический характер, он не может быть воспроизведен и использован в практических целях.Thus, patent RU 2470031 is of a purely theoretical nature; it cannot be reproduced or used for practical purposes.

С практической точки зрения необходимо установить, во-первых, факт наличия комплексов аллоферона с цинком в водном растворе, во-вторых, найти условия их существования.From a practical point of view, it is necessary to establish, firstly, the fact of the presence of alloferon complexes with zinc in an aqueous solution, and secondly, to find the conditions for their existence.

Комплексные соединения являются продуктами взаимодействия веществ, одно из которых обладает свойствами акцептора электронов - комплексообразователь, второе является донором электронов - лиганд. При смешивании двух растворов, содержащих ионы металла (комплексообразователь) и лиганд (в данном случае лигандом является аллоферон), начнется процесс комплексообразования, т.е. присоединение лиганда к иону металла. Присоединение лиганда к металлу происходит ступенчато до тех пор, пока количество лиганда не станет равным координационному числу комплексообразователя (для цинка оно, в основном, равно 4). Устанавливается динамическое равновесие, при котором происходит как образование комплекса, так и его распад. Таким образом, в растворе, как правило, одновременно содержатся всеComplex compounds are products of the interaction of substances, one of which has the properties of an electron acceptor - a complexing agent, and the second is an electron donor - a ligand. When mixing two solutions containing metal ions (complexing agent) and a ligand (in this case, the ligand is alloferon), the process of complex formation will begin, i.e. addition of a ligand to a metal ion. The addition of the ligand to the metal occurs stepwise until the amount of the ligand becomes equal to the coordination number of the complexing agent (for zinc it is generally equal to 4). A dynamic equilibrium is established, in which both the formation of the complex and its disintegration occur. Thus, the solution, as a rule, simultaneously contains all

- 1 046126 формы комплексов, образовавшиеся на различных стадиях комплексообразования, а также исходные вещества. Пропорция их зависит от прочности образующихся соединений (Гринберг А.А., Введение в химию комплексных соединении, 4 изд., Л., 1971).- 1 046126 forms of complexes formed at various stages of complexation, as well as starting substances. Their proportion depends on the strength of the compounds formed (Grinberg A.A., Introduction to the chemistry of complex compounds, 4th ed., Leningrad, 1971).

Устойчивость комплексов определяется как фундаментальными факторами (природой комплексообразователя и лигандов), так и внешними условиями (температурой, природой растворителя, ионной силой, составом раствора). Среди фундаментальных факторов, влияющих на устойчивость комплексов, следует выделить природу центрального атома и лиганда, структуру лиганда и стерические факторы. Лиганды имеющие несколько сайтов связывания (полидентантные лиганды) могут образовывать циклические комплексы - хелаты, которые обладают большей устойчивостью.The stability of complexes is determined by both fundamental factors (the nature of the complexing agent and ligands) and external conditions (temperature, nature of the solvent, ionic strength, solution composition). Among the fundamental factors influencing the stability of complexes are the nature of the central atom and the ligand, the structure of the ligand, and steric factors. Ligands with several binding sites (polydentate ligands) can form cyclic complexes - chelates, which are more stable.

Пептиды, как лиганды, имеют несколько сайтов связывания с металлами, т.е. являются полидентантными лигандами. Такими сайтами могут быть: концевые амино и карбоксильная группы, амидный атом азота пептидной связи, а также боковые функциональные группы аминокислотных остатков. Поэтому для пептидов характерно образование комплексов хелатного типа.Peptides, as ligands, have several metal binding sites, i.e. are polydentate ligands. Such sites can be: terminal amino and carboxyl groups, the amide nitrogen atom of the peptide bond, as well as side functional groups of amino acid residues. Therefore, peptides are characterized by the formation of chelate-type complexes.

Аллоферон, наряду с указанными выше активными группами, имеет в своем составе 4 остатка гистидина - аминокислоты, содержащей имидазольное кольцо, которое обладает склонностью к образованию комплексов. Это придает аллоферону свойства активного лиганда. Данное обстоятельство использовано в вышеуказанном патенте RU 2470031. Поскольку координационное число цинка обычно равно 4, а в молекуле аллоферона присутствует 4 остатка гистидина, формула хелатного комплекса, предложенная авторами патента RU 2470031 кажется очевидной. Однако наличие в составе молекулы аллоферона других функциональных групп, способных координироваться с ионами металлов, предполагает возможность существования иных структур. Особенности комплексообразования в водной среде также должны влиять на состав и структуру образующихся соединений.Alloferon, along with the above active groups, contains 4 histidine residues - an amino acid containing an imidazole ring, which has a tendency to form complexes. This gives alloferon the properties of an active ligand. This circumstance is used in the above-mentioned patent RU 2470031. Since the coordination number of zinc is usually 4, and there are 4 histidine residues in the alloferon molecule, the formula of the chelate complex proposed by the authors of the patent RU 2470031 seems obvious. However, the presence of other functional groups in the alloferon molecule that can coordinate with metal ions suggests the possibility of the existence of other structures. The peculiarities of complex formation in an aqueous environment should also affect the composition and structure of the resulting compounds.

Комплексные соединения аллоферона и его производных с ионами меди, образующиеся в водных растворах, тщательно изучены группой польских ученых и описаны в ряде статей. В работе T.KowalikJankowsca, L. Biega, M. Kuzer, D.Konopinska. Mononuclear Copper (II) complexes of alloferon 1 and 2: A combined potentiometric and spectroscopic studies. J. Inorg. Biochem. 103, 2009, 135-142 авторы проводят детальный анализ равновесия в системе аллоферон - медь (при их эквимолекулярных соотношениях), основывающийся на данных потенциометрического титрования и спектрометрии. Медь и цинк как комплексообразователи обладают схожими свойствами, поэтому данные, полученные для меди, могут быть приняты во внимание при изучении комплексов аллоферона с цинком.Complex compounds of alloferon and its derivatives with copper ions, formed in aqueous solutions, were carefully studied by a group of Polish scientists and described in a number of articles. In the work of T. Kowalik Jankowska, L. Biega, M. Kuzer, D. Konopinska. Mononuclear Copper (II) complexes of alloferon 1 and 2: A combined potentiometric and spectroscopic studies. J. Inorg. Biochem. 103, 2009, 135-142, the authors conduct a detailed analysis of the equilibrium in the alloferon - copper system (at their equimolecular ratios), based on potentiometric titration and spectrometry data. Copper and zinc as complexing agents have similar properties, so the data obtained for copper can be taken into account when studying alloferon complexes with zinc.

Работы польских исследователей показали, что в системе аллоферон - медь в водных растворах образуется множество соединений хелатного типа, состав и количество которых очень сильно зависит от рН среды. Было показано, что при всех значениях рН ионы меди и аллоферон образуют комплексы, находящиеся в равновесии с исходными компонентами. Установлено, что ион меди образует связь с остатками гистидина и непременно с концевой аминогруппой аллоферона. Число связей меди с азотом гистидина зависит от рН среды и растет с повышением ее величины. Она может быть связана с одним, двумя или тремя остатками гистидина. Важно то, что один из четырех остатков гистидина всегда остается свободным не связанным с ионом металла. Такая структура комплексов отличается от формулы, приведенной в патенте RU 2470031, в которой рассматривается связывание именно по 4 остаткам гистидина. Авторами польской статьи показано, что связывание по 4 гистидинам возможно, но только в случае блокирования концевой аминогруппы, например, путем ее ацетилирования.The work of Polish researchers has shown that in the alloferon-copper system in aqueous solutions many chelate-type compounds are formed, the composition and quantity of which very much depends on the pH of the medium. It was shown that at all pH values, copper ions and alloferon form complexes that are in equilibrium with the original components. It has been established that the copper ion forms a bond with histidine residues and certainly with the terminal amino group of alloferon. The number of copper bonds with histidine nitrogen depends on the pH of the medium and increases with increasing pH value. It can be associated with one, two or three histidine residues. The important thing is that one of the four histidine residues always remains free, not associated with a metal ion. This structure of the complexes differs from the formula given in patent RU 2470031, which considers binding specifically to 4 histidine residues. The authors of the Polish article showed that binding at 4 histidines is possible, but only if the terminal amino group is blocked, for example, by acetylation.

Важным обстоятельством, обнаруженным авторами статьи, является то, что в системе аллоферон медь одновременно присутствуют комплексные соединения разного состава и строения. Так в ней найдены полиядерные комплексы, в которых с одной молекулой аллоферона координировано несколько ионов металла. Таким образом, система аллоферон - медь в водном растворе имеет сложный состав, в ней одновременно присутствуют как комплексные соединения различного состава, так и исходные вещества - аллоферон и соль меди.An important circumstance discovered by the authors of the article is that complex compounds of different composition and structure are simultaneously present in the copper alloferon system. Thus, polynuclear complexes were found in it, in which several metal ions are coordinated with one alloferon molecule. Thus, the alloferon - copper system in an aqueous solution has a complex composition; it simultaneously contains both complex compounds of various compositions and the starting substances - alloferon and copper salt.

Близкие закономерности должны наблюдаться и для водных растворов системы аллоферон - цинк. Однако, важно иметь в виду то, что цинк в ряду Ирвинга-Уильямса по комплексообразующей активности уступает меди (О.В. Сергеева. Реакции в водных растворах. Сложные ионные равновесия. Минск, 2009, 70 с). Поэтому комплексные соединения цинка, как правило, менее устойчивы, чем медные. Однако можно предположить, что природа и закономерности существования комплексных соединений в системе аллоферон - цинк будут близкими к описанным выше для меди.Similar patterns should be observed for aqueous solutions of the alloferon-zinc system. However, it is important to keep in mind that zinc in the Irving-Williams series is inferior to copper in complex-forming activity (O.V. Sergeeva. Reactions in aqueous solutions. Complex ionic equilibria. Minsk, 2009, 70 pp.). Therefore, zinc complex compounds are usually less stable than copper ones. However, it can be assumed that the nature and patterns of existence of complex compounds in the alloferon-zinc system will be close to those described above for copper.

Задачей данного изобретения является создание фармацевтической композиции обладающей повышенной биологической активностью, содержащей активные комплексы аллоферона с цинком в оптимальном составе, а также условий, которые позволяют получить раствор, содержащий максимальную концентрацию этих соединений.The objective of this invention is to create a pharmaceutical composition with increased biological activity, containing active complexes of alloferon with zinc in an optimal composition, as well as conditions that make it possible to obtain a solution containing the maximum concentration of these compounds.

Техническим результатом изобретения является композиция, состав и свойства которой позволяют достигнуть в растворе высокой концентрации комплексных соединений, образуемых взаимодействием аллоферона с ионами цинка, которая обладает биологической активностью, причем противовирусная активность композиции превышает противовирусную активность самого аллоферона.The technical result of the invention is a composition, the composition and properties of which make it possible to achieve in solution a high concentration of complex compounds formed by the interaction of alloferon with zinc ions, which has biological activity, and the antiviral activity of the composition exceeds the antiviral activity of alloferon itself.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлена фармацевтическая компоThe specified technical result is achieved due to the fact that the claimed pharmaceutical component

- 2 046126 зиция, обладающая противовирусной и иммуномодулирующей активностью, содержащей в качестве активных веществ аллоферон и цинк, отличающаяся тем, что ее активным началом является смесь биологически активных комплексных соединений, образуемых взаимодействием олигопептида аллоферон с ионами цинка в водной среде, причем цинк и аллоферон в растворе образуют комплексные соединения различного состава, а концентрация растворов аллоферона и соли цинка подобрана таким образом, что мольное соотношение компонентов аллоферона и соли цинка составляет от 1:1 до 1:2.- 2 046126 position, which has antiviral and immunomodulatory activity, containing alloferon and zinc as active substances, characterized in that its active principle is a mixture of biologically active complex compounds formed by the interaction of the oligopeptide alloferon with zinc ions in an aqueous medium, with zinc and alloferon in solution form complex compounds of various compositions, and the concentration of solutions of alloferon and zinc salt is selected in such a way that the molar ratio of the components of alloferon and zinc salt is from 1:1 to 1:2.

Допустимо, что состав композиции образуют аллоферон, соль цинка, взятая в эквимолекулярном или большем количестве; в качестве среды используется 0,9% раствор натрия хлорида или натрия ацетата, а рН раствора находится в пределах от 6,5 до 8,0 (преимущественно 7,5).It is acceptable that the composition consists of alloferon, a zinc salt taken in equimolecular or greater quantities; a 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate is used as a medium, and the pH of the solution ranges from 6.5 to 8.0 (mostly 7.5).

Допустимо, что в качестве соли цинка используют его ацетат или хлорид.It is acceptable that zinc acetate or chloride is used as a zinc salt.

Допустимо, что при приготовлении композиции сначала готовят первый раствор, который получают растворением 100 мг аллоферона в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата, параллельно готовят второй раствор, который получают растворением 17,4 мг ацетата цинка дигидрата или 10,8 мг хлорида цинка безводного в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата; после чего в первый раствор постепенно при перемешивании вводят второй раствор; через 30 мин контролируют рН раствора и доводят его до величины 6,5-8,0 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной; полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы или флаконы, которые герметизируют.It is acceptable that when preparing the composition, first prepare the first solution, which is obtained by dissolving 100 mg of alloferon in 50 ml of 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate, in parallel prepare the second solution, which is obtained by dissolving 17.4 mg of zinc acetate dihydrate or 10.8 mg of anhydrous zinc chloride in 50 ml of 0.9% sodium chloride or sodium acetate solution; after which the second solution is gradually introduced into the first solution with stirring; after 30 minutes, control the pH of the solution and bring it to a value of 6.5-8.0 using a 0.1 M solution of sodium hydroxide or hydrochloric acid; the resulting solution is sterilized by filtration through a filter with pores of 0.2 microns, dosed into ampoules or bottles that are sealed.

Допустимо, что обеспечивают конечные концентрации компонентов композиции: аллоферон - 1 мг/мл, соль цинка - от 0,052 до 0,104 мг цинка /мл.It is acceptable that the final concentrations of the components of the composition are provided: alloferon - 1 mg/ml, zinc salt - from 0.052 to 0.104 mg zinc/ml.

Допустимо, что при приготовлении композиции сначала готовят первый раствор, который получают растворением 100 мг аллоферона в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата, параллельно готовят второй раствор, который получают растворением 34,8 мг ацетата цинка дигидрата или 21,6 мг хлорида цинка безводного в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата; после чего в первый раствор постепенно при перемешивании вводят второй раствор; через 30 минут контролируют рН раствора и доводят его до величины 6,5-8,0 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной; полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы или флаконы, которые затем герметизируют.It is acceptable that when preparing the composition, first prepare the first solution, which is obtained by dissolving 100 mg of alloferon in 50 ml of 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate, in parallel prepare the second solution, which is obtained by dissolving 34.8 mg of zinc acetate dihydrate or 21.6 mg of anhydrous zinc chloride in 50 ml of 0.9% sodium chloride or sodium acetate solution; after which the second solution is gradually introduced into the first solution with stirring; after 30 minutes, control the pH of the solution and bring it to a value of 6.5-8.0 using a 0.1 M solution of sodium hydroxide or hydrochloric acid; the resulting solution is sterilized by filtration through a filter with pores of 0.2 microns, dosed into ampoules or bottles, which are then sealed.

Краткое описание чертежейBrief description of drawings

На фиг. 1 показан масс-спектр 0,001 М раствора аллоферона в воде.In fig. Figure 1 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of alloferon in water.

На фиг. 2 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при мольном соотношении аллоферон - цинк 1:1.In fig. Figure 2 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc in water at a molar ratio of alloferon - zinc of 1:1.

На фиг. 3 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при соотношении аллоферон - цинк 1:2.In fig. Figure 3 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc in water at an alloferon-zinc ratio of 1:2.

На фиг. 4 показан фрагмент масс-спектра комплекса аллоферона с цинком. Трехзарядный ион m/z 443,1721. Экспериментальные данные.In fig. Figure 4 shows a fragment of the mass spectrum of the alloferon complex with zinc. Triple charged ion m/z 443.1721. Experimental data.

На фиг. 5 показан фрагмент теоретически рассчитанного масс-спектра комплекса аллоферона с цинком, m/z 443,1721.In fig. Figure 5 shows a fragment of the theoretically calculated mass spectrum of the alloferon complex with zinc, m/z 443.1721.

На фиг. 6 показан масс-спектр системы аллоферон + цинк в 0,9% растворе натрия хлорида.In fig. Figure 6 shows the mass spectrum of the alloferon + zinc system in a 0.9% sodium chloride solution.

На фиг. 7 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 4,0.In fig. Figure 7 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc at pH 4.0.

На фиг. 8 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 6,0.In fig. Figure 8 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc at pH 6.0.

На фиг. 9 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 8,0.In fig. Figure 9 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc at pH 8.0.

Осуществление изобретенияCarrying out the invention

При осуществлении разработки в качестве солей цинка были использованы ацетат цинка и хлорид цинка. Только эти соли цинка входят в состав лекарственных препаратов для парентерального введения, прежде всего в различные формы инсулина. В качестве растворителя были использованы 0,9% растворы натрия хлорида и натрия ацетата в воде. Другие изотонические растворы (раствор Рингера и т.д.) в данном случае не применимы, т.к. содержат дополнительно ионы кальция, а также фосфаты и карбонаты, образующие с цинком нерастворимые соединения.During the development, zinc acetate and zinc chloride were used as zinc salts. Only these zinc salts are included in drugs for parenteral administration, primarily in various forms of insulin. The solvent used was 0.9% solutions of sodium chloride and sodium acetate in water. Other isotonic solutions (Ringer's solution, etc.) are not applicable in this case, because additionally contain calcium ions, as well as phosphates and carbonates, which form insoluble compounds with zinc.

Растворы, содержащие аллоферон и соли цинка, были изучены с помощью потенциометрического титрования и масс-спектрометрии.Solutions containing alloferon and zinc salts were studied using potentiometric titration and mass spectrometry.

Установлено, что в системе аллоферон - соль цинка в водной среде происходит процесс комплексообразования. При этом в растворе всегда присутствует равновесная смесь исходных компонентов - аллоферона и соли цинка, а также образуемых ими комплексных соединений. Найдено, что цинк и аллоферон в растворе образуют комплексные соединения различного состава. Преимущественно образуются комплексы, в которых молекула аллоферона связана с одним ионом цинка. Однако наряду с ними, в растворе присутствуют комплексы, в которых с молекулой аллоферона связаны сразу два иона цинка, а также димеры, в которых один ион цинка связывается с двумя молекулами аллоферона. Таким образом, в системе аллоферон - цинк в водном растворе присутствует сложная смесь веществ, включающая исходные компоненты и комплексы различных структур и составов. При этом очевидно, что состав и структура этих комплексов, существенно отличаются от формулы, данной в патенте RU 2470031.It has been established that in the system alloferon - zinc salt in an aqueous environment the process of complexation occurs. In this case, the solution always contains an equilibrium mixture of the initial components - alloferon and zinc salt, as well as the complex compounds they form. It was found that zinc and alloferon in solution form complex compounds of various compositions. Complexes are predominantly formed in which the alloferon molecule is associated with one zinc ion. However, along with them, the solution contains complexes in which two zinc ions are bound to an alloferon molecule, as well as dimers in which one zinc ion is bound to two alloferon molecules. Thus, in the alloferon - zinc system in an aqueous solution there is a complex mixture of substances, including initial components and complexes of various structures and compositions. It is obvious that the composition and structure of these complexes differ significantly from the formula given in patent RU 2470031.

Найдено, что состав и концентрация образующихся комплексов зависит от рН, соотношения аллоIt was found that the composition and concentration of the formed complexes depend on pH, the ratio of allo

- 3 046126 ферон:цинк и ионной силы раствора. Увеличение величины рН повышает концентрацию комплексов. Такой же эффект дает увеличение количества соли цинка выше эквимолекулярного. Использование в качестве среды 0,9% растворов натрия хлорида или натрия ацетата имеющих рН в пределах от 6,5 до 8,0 позволило получить композицию, в которой степень комплексообразования близка к количественной.- 3 046126 feron:zinc and ionic strength of solution. An increase in pH increases the concentration of complexes. The same effect is achieved by increasing the amount of zinc salt above the equimolecular one. The use of 0.9% solutions of sodium chloride or sodium acetate with a pH in the range from 6.5 to 8.0 as a medium made it possible to obtain a composition in which the degree of complexation is close to quantitative.

В итоге разработанная композиция включает комплексные соединения аллоферона и цинка различного строения, исходные аллоферон и соль цинка (ацетат или хлорид), 0,9% раствор натрия хлорида или натрия ацетата и имеет рН в диапазоне от 6,5 до 8,0, преимущественно 7,5. При этом для приготовления композиции берут аллоферон и эквивалентное ему или большее количество соли цинка. Композиция получается путем смешения равных объемов растворов ацетата или хлорида цинка и аллоферона в 0,9% растворе натрия хлорида или натрия ацетата, с последующей корректировкой рН до указанной величины 6,5-8,0 (предпочтительно 7,5).As a result, the developed composition includes complex compounds of alloferon and zinc of various structures, initial alloferon and zinc salt (acetate or chloride), 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate and has a pH in the range from 6.5 to 8.0, mainly 7 ,5. In this case, to prepare the composition, alloferon and an equivalent or greater amount of zinc salt are taken. The composition is obtained by mixing equal volumes of solutions of zinc acetate or chloride and alloferon in a 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate, followed by adjusting the pH to the specified value of 6.5-8.0 (preferably 7.5).

Биологическая активность заявляемых композиций была подтверждена экспериментами. В качестве препаратов сравнения использовали лекарственное средство Аллокин-альфа, лиофлизат для приготовления раствора для подкожного введения, содержащее 1 мг чистого аллоферона без вспомогательных веществ, а также стандартный противогерпетический препарат Ацикловир. Противовирусная активность разработанной композиции, показанная ранее (патент RU 2470031) на примере вируса гриппа, проверена испытаниями с вирусом герпеса. Результат испытаний подтвердил данные патента RU 2470031, показав более высокую противовирусную активность композиции в сравнении с аллофероном. Иммуномодулирующие свойства разработанной композиции, показанные на примере индукции интерферонагамма и интерлейкина-18, также выше, чем у чистого пептида аллоферона.The biological activity of the claimed compositions was confirmed by experiments. As comparison drugs, we used the drug Allokin-alpha, a lyoflysate for the preparation of a solution for subcutaneous administration, containing 1 mg of pure alloferon without excipients, as well as the standard antiherpetic drug Acyclovir. The antiviral activity of the developed composition, shown previously (patent RU 2470031) using the example of the influenza virus, was verified by tests with the herpes virus. The test result confirmed the data of patent RU 2470031, showing higher antiviral activity of the composition in comparison with alloferon. The immunomodulatory properties of the developed composition, shown by the example of the induction of interferon gamma and interleukin-18, are also higher than those of the pure alloferon peptide.

Выводы подтверждены примерами.The conclusions are supported by examples.

Пример 1. Масс-спектрометрические исследования.Example 1. Mass spectrometric studies.

В силу методических требований к оборудованию, в растворах для масс-спектрометрии ESI-MS нежелательно присутствие неорганических солей, поэтому большая часть растворов готовились на воде дистиллированной. Растворы с различными значениями рН готовили, используя формиатный буфер (рН 4 и 6) и трисбуфер (рН 8,0). Концентрация растворов аллоферона и соли цинка составляла 0,001 М, мольное соотношение компонентов составляло 1:1 и 1:2. В качестве соли цинка использовали ацетат цинка.Due to methodological requirements for equipment, the presence of inorganic salts in solutions for ESI-MS mass spectrometry is undesirable, therefore most of the solutions were prepared using distilled water. Solutions with different pH values were prepared using formate buffer (pH 4 and 6) and tris buffer (pH 8.0). The concentration of solutions of alloferon and zinc salt was 0.001 M, the molar ratio of the components was 1:1 and 1:2. Zinc acetate was used as the zinc salt.

Для работы использован масс-спектрометрический детектор - LTQ OrbiTrap Velos с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и программным обеспечением для управления и обработки данных Xcalibur.For the work, a mass spectrometric detector was used - LTQ OrbiTrap Velos with electrospray ionization at atmospheric pressure and software for control and data processing Xcalibur.

Условия работы масс-спектрометрического детектора.Operating conditions of the mass spectrometric detector.

Поток газа-осушителя - 10 у.е.Drying gas flow - 10 c.u.

Поток вспомогательного газа - 5 у.е.Auxiliary gas flow - 5 c.u.

Температура газа-осушителя - 80°С.The temperature of the drying gas is 80°C.

Температура вспомогательного потока - 280°С.Auxiliary flow temperature - 280°C.

Напряжение на капилляре - 3500В.The voltage on the capillary is 3500V.

Прямой ввод образца с помощью шприца объемом 500 мкл и скоростью потока 5 мкл/мин.Direct sample injection using a 500 µL syringe with a flow rate of 5 µL/min.

Детектирование в режиме сканирования по полному ионному току (SCAN): регистрация ионов в диапазоне m/z от 300 до 1500 (при положительной ионизации).Scanning total ion current (SCAN) detection: detects ions in the m/z range from 300 to 1500 (with positive ionization).

Моноизотопные массы некоторых возможных ионов аллоферона представлены ниже:Monoisotopic masses of some possible alloferon ions are presented below:

Аллоферон: Брутто формула C5₂H-₆N₂₂O|₆. моноизотопная молекулярная массаAlloferon: Gross formula C5 ₂ H- ₆ N ₂₂ O| ₆ . monoisotopic molecular weight

M.W.= 1264.58096M.W.= 1264.58096

Однозарядный ион m/z [M+H]+=1265.58824Singly charged ion m/z [M+H]+=1265.58824

Двухзарядный ион m/z [M+2H]²⁺=633.29776Doubly charged ion m/z [M+2H] ²⁺ =633.29776

Двухзарядный ион с натрием m/z [M+2Na]2+=644.28873Doubly charged ion with sodium m/z [M+2Na]2+=644.28873

Трехзарядный ион m/z [M+3H]³⁺=422.53426Triple charged ion m/z [M+3H] ³⁺ =422.53426

На фиг. 1 показан масс-спектр 0,001М раствора аллоферона в воде. Хорошо определяются несколько характерных для пептида ионов. Ион с m/z 1265,5896 - однозарядный ион, ион с m/z 633,2992 является двухзарядным ионом [М+2Н]²⁺ и трехзарядный ион [М+3Н]³⁺ с m/z 422,5351.In fig. Figure 1 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of alloferon in water. Several peptide-specific ions are well identified. The ion with m/z 1265.5896 is a singly charged ion, the ion with m/z 633.2992 is a doubly charged [M+2H] ²⁺ ion, and the triply charged ion [M+3H] ³⁺ with m/z 422.5351.

На фиг. 2 показан масс-спектр 0,001М раствора содержащего аллоферон и соль цинка при мольном соотношении аллоферон - цинк 1:1. Сравнение спектров фиг. 1 (аллоферон) и фиг. 2 (композиция) показывает, что в системе появились сигналы новых ионов, наличие которых может быть объяснено только образованием комплексных соединений аллоферона с цинком. Малая интенсивности сигналов новых ионов свидетельствует, что содержание в растворе свободного аллоферона значительно выше, чем концентрация комплекса.In fig. Figure 2 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution containing alloferon and zinc salt at a molar ratio of alloferon - zinc of 1:1. Comparison of the spectra of Fig. 1 (alloferon) and Fig. 2 (composition) shows that signals of new ions appeared in the system, the presence of which can only be explained by the formation of complex compounds of alloferon with zinc. The low intensity of the signals of new ions indicates that the content of free alloferon in the solution is significantly higher than the concentration of the complex.

Спектр фиг. 2 содержит сигнал с m/z 443,1731, соответствующий трехзарядному иону цинкового комплекса [M+Zn+H]³⁺, а также сигнал с m/z 664,2556, который соответствует двухзарядному иону комплекса [M+Zn]²⁺. Оба сигнала соответствуют комплексу с брутто формулой C₅₂H₇₆N₂₂O₁₆Zn.Spectrum Fig. 2 contains a signal with m/z 443.1731, corresponding to the triply charged ion of the zinc complex [M+Zn+H] ³⁺ , as well as a signal with m/z 664.2556, which corresponds to the doubly charged ion of the [M+Zn] ²⁺ complex. Both signals correspond to a complex with the gross formula C ₅₂ H ₇₆ N ₂₂ O ₁₆ Zn.

На фиг. 3 показан масс-спектр 0,001М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при мольном соотношении аллоферон - цинк 1:2. Он показывает, что увеличение содержания цинка ведет к существенному росту концентрации комплекса в растворе. Композиции с отношением аллоферон:цинк больIn fig. Figure 3 shows the mass spectrum of a 0.001 M solution of the alloferon complex with zinc in water at a molar ratio of alloferon - zinc of 1:2. It shows that an increase in zinc content leads to a significant increase in the concentration of the complex in solution. Compositions with the ratio alloferon:zinc pain

- 4 046126 шим, чем 1:2 не исследовались. Представленные на фиг. 4 и фиг. 5 реальный и теоретический массспектры трехзарядного иона комплекса практически совпадают, что свидетельствует о правильности интерпретации этого сигнала в масс-спектре как соответствующего комплексу с брутто-формулой C₅₂H₇₆N₂₂O₁₆Zn. Такое же совпадение теории и практики было получено и для двухзарядного иона.- 4 046126 shim than 1:2 were not studied. Shown in FIGS. 4 and fig. 5, the real and theoretical mass spectra of the triply charged ion of the complex practically coincide, which indicates the correct interpretation of this signal in the mass spectrum as corresponding to a complex with the gross formula C ₅₂ H ₇₆ N ₂₂ O ₁₆ Zn. The same agreement between theory and practice was obtained for a doubly charged ion.

Кроме того, в спектрах имеются сигналы с m/z 465,1425 и 697,2097. Они соответствуют комплексу с брутто формулой C₅₂H₇₂N₂₂O₁₆Zn₂, в котором аллоферон связан сразу с 2 атомами цинка. Выполненное сравнение реального и теоретически рассчитанного масс-спектра трехзарядного иона с m/z 465,1425 подтверждает это отождествление. Также наблюдается наличие трехзарядного иона с m/z 886,6705, соответствующего димеру аллоферона с цинком C₁₀₄H₁₅₂N₄₄O₃₂Zn.In addition, the spectra contain signals with m/z 465.1425 and 697.2097. They correspond to a complex with the gross formula C ₅₂ H ₇₂ N ₂₂ O ₁₆ Zn ₂ , in which alloferon is bonded to 2 zinc atoms at once. A comparison of the real and theoretically calculated mass spectrum of the triply charged ion with m/z 465.1425 confirms this identification. The presence of a triply charged ion with m/z 886.6705, corresponding to an alloferon dimer with zinc C ₁₀₄ H ₁₅₂ N ₄₄ O ₃₂ Zn, is also observed.

Таким образом, масс-спектрометрическое исследование показывает, что в водной среде алллоферон в сочетании с солями цинка образует комплексные соединения различных форм и составов.Thus, mass spectrometric research shows that in an aqueous environment, alloferon in combination with zinc salts forms complex compounds of various forms and compositions.

Несмотря на имеющиеся технические ограничения, были получены масс-спектр системы аллоферон цинк в солевых растворах. На фиг. 6 приведен масс-спектр композиции в 0,9% растворе натрия хлорида. Интенсивность двух- и трехзарядного сигналов с m/z 664,2558 и 443,1728 показывает, что в изотоническом растворе достигается высокое содержание комплексов аллоферона с цинком состава C₅₂H₇₆N₂₂O₁₆Zn. Интенсивность сигналов двухзарядного иона комплекса с m/z 664,2558 в спектре фиг. 6 существенно выше, чем для иона аллоферона m/z 633.29776, а трехзарядного m/z 443,1721 на его уровне (m/z 422.53426). Масс-спектр композиции в растворе ацетата натрия аналогичен фиг. 6.Despite the existing technical limitations, a mass spectrum of the alloferon zinc system in saline solutions was obtained. In fig. Figure 6 shows the mass spectrum of the composition in a 0.9% sodium chloride solution. The intensity of doubly and triply charged signals with m/z 664.2558 and 443.1728 shows that in an isotonic solution a high content of alloferon complexes with zinc of the composition C ₅₂ H ₇₆ N ₂₂ O ₁₆ Zn is achieved. The signal intensity of the doubly charged ion of the complex with m/z 664.2558 in the spectrum of Fig. 6 is significantly higher than for the alloferon ion m/z 633.29776, and the triply charged one m/z 443.1721 is at its level (m/z 422.53426). The mass spectrum of the composition in sodium acetate solution is similar to Fig. 6.

Была исследована зависимость содержания комплексных соединений в растворе аллоферона с цинком от величины рН раствора.The dependence of the content of complex compounds in a solution of alloferon with zinc on the pH value of the solution was studied.

Результаты (фиг. 7-9) показывают, что содержание комплексных соединений аллоферона с цинком зависит от величины рН. При увеличении значения рН в интервале от 4 до 8 наблюдается увеличение интенсивности соответствующих сигналов в масс-спектрах водных растворов комплексных соединений цинка и аллоферона, что может свидетельствовать об увеличении их концентрации в растворе вследствие изменения рН.The results (Fig. 7-9) show that the content of complex compounds of alloferon with zinc depends on the pH value. As the pH value increases in the range from 4 to 8, an increase in the intensity of the corresponding signals is observed in the mass spectra of aqueous solutions of complex compounds of zinc and alloferon, which may indicate an increase in their concentration in the solution due to a change in pH.

Максимальная интенсивность двухзарядного цинкового комплекса m/z 664,2558 наблюдается при рН 8. Сигнал трехзарядного иона комплекса при этом рН отсутствует. Приведенные выше результаты масс-спектрометрических исследований с большой вероятностью показали, что:The maximum intensity of the doubly charged zinc complex m/z 664.2558 is observed at pH 8. The signal of the triply charged ion of the complex is absent at this pH. The above results of mass spectrometric studies have most likely shown that:

аллоферон с солями цинка в водном растворе образует комплексные соединения;alloferon forms complex compounds with zinc salts in aqueous solution;

в водном растворе одновременно присутствуют комплексы аллоферона с цинком различного состава и строения, а также свободный аллоферон;in an aqueous solution, complexes of alloferon with zinc of various compositions and structures, as well as free alloferon, are simultaneously present;

концентрация комплексов зависит от рН раствора, с его ростом их концентрация увеличивается с максимумом при рН 8,0;the concentration of complexes depends on the pH of the solution; as it increases, their concentration increases with a maximum at pH 8.0;

концентрация комплексов зависит от соотношения аллоферон - цинк и ионной силы раствора.the concentration of the complexes depends on the ratio of alloferon - zinc and the ionic strength of the solution.

Вывод: композиция с максимальной концентрацией комплексных соединений включает аллоферон, соль цинка в количестве равном или большем эквимолекулярного в 0,9% растворе натрия хлорида или натрия ацетата с рН от 6,0 до 8,0.Conclusion: the composition with the maximum concentration of complex compounds includes alloferon, zinc salt in an amount equal to or greater than equimolecular in a 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate with a pH from 6.0 to 8.0.

Пример 2. Потенциометрическое титрование.Example 2. Potentiometric titration.

Исследуемые растворы имели концентрацию 0,001 М по аллоферону и цинку при мольном соотношение 1:1. Растворитель -0,9% раствор натрия хлорида. Объем титруемых растворов составлял 30 мл. Для приготовления растворов использовали дигидрат ацетата цинка Zn(CH₃COO)₂*2H₂O и безводный хлорид цинка ZnCl₂.The solutions under study had a concentration of 0.001 M for alloferon and zinc at a molar ratio of 1:1. Solvent -0.9% sodium chloride solution. The volume of titrated solutions was 30 ml. To prepare solutions, zinc acetate dihydrate Zn(CH ₃ COO) ₂ *2H ₂ O and anhydrous zinc chloride ZnCl ₂ were used.

Для работы использовался титратор потенциометрический автоматический АТП-02, позволяющий получать кривую титрования в интегральной и дифференциальной формах. Были выполнены титрования как композиции аллоферона с солями цинка, так и растворов исходных компонентов - аллоферона, ацетата и хлорида цинка. Титрование проводилось раздельно в кислую и щелочную область раздельно. Каждое титрование проводилось трижды. Усредненные данные титрований приведены в интегральной (фиг. 10) и дифференциальной (фиг. 11) форме.For the work, a potentiometric automatic titrator ATP-02 was used, which makes it possible to obtain a titration curve in integral and differential forms. Titrations were performed of both the composition of alloferon with zinc salts and solutions of the initial components - alloferon, acetate and zinc chloride. Titration was carried out separately in the acidic and alkaline regions. Each titration was carried out three times. The average titration data are presented in integral (Fig. 10) and differential (Fig. 11) form.

Кривая титрования аллоферона имеет два четко выраженных скачка при рН 4,75 и 9,4, которые количественно точно соответствуют присутствию 4-х остатков гистидина и одной концевой СООН-группы.The titration curve of alloferon has two clearly defined jumps at pH 4.75 and 9.4, which quantitatively precisely correspond to the presence of 4 histidine residues and one terminal COOH group.

Кривые титрования смесей аллоферон + соль цинка носят существенно иной характер. Во-первых, введение соли цинка в раствор аллоферона существенно (с 7,5 до 6,5) меняет величину рН раствора. Уже это обстоятельство позволяет предположить наличие взаимодействия между компонентами в изучаемой системе.The titration curves for mixtures of alloferon + zinc salt are of a significantly different nature. Firstly, the introduction of zinc salt into the alloferon solution significantly (from 7.5 to 6.5) changes the pH value of the solution. This circumstance alone suggests the presence of interaction between the components in the system under study.

Во-вторых, скачки титрования растворов композиций в сравнении с кривой для аллоферона сильно размыты (амплитуда скачка dE/dV на дифференциальных кривых резко уменьшена). В-третьих, на кривых присутствуют новые скачки титрования. Данные отличия невозможно описать путем простого сложения кривых титрования чистого аллоферона и чистых растворов солей цинка (фиг. 10). Дифференциальные кривые (фиг. 11 и более подробно фиг. 12) показывают это более четко. Эти обстоятельства однозначно свидетельствуют о наличии взаимодействия между аллофероном и солями цинка. Таким взаимодействием может быть только комплексообразование. Однако малая амплитуда скачков титрования свидетельствует о слабой связанности аллоферона с цинком.Secondly, the jumps in the titration of solutions of the compositions in comparison with the curve for alloferon are greatly blurred (the amplitude of the dE/dV jump on the differential curves is sharply reduced). Thirdly, the curves contain new titration jumps. These differences cannot be described by simply adding the titration curves of pure alloferon and pure solutions of zinc salts (Fig. 10). The differential curves (Fig. 11 and in more detail Fig. 12) show this more clearly. These circumstances clearly indicate the presence of interaction between alloferon and zinc salts. Such an interaction can only be complex formation. However, the small amplitude of titration jumps indicates a weak connection of alloferon with zinc.

- 5 046126- 5 046126

В кислой области наблюдается исчезновение скачка при рН 4,75, характерного для аллоферона, и возникновение скачка при рН 4,25. Имеется также новый, но очень слабый, скачок при рН 6,5, более выраженный в случае ацетата цинка.In the acidic region, the disappearance of the jump at pH 4.75, characteristic of alloferon, and the appearance of a jump at pH 4.25 are observed. There is also a new, but very weak, jump at pH 6.5, more pronounced in the case of zinc acetate.

Наиболее важные изменения имеют место в щелочной области. Так практически отсутствует скачок при рН 9,4, характерный как для аллоферона, так и для солей цинка. Это свидетельствует о том, что содержание свободных аллоферона и ионов цинка в растворе в щелочной области не велико. Следовательно, они в основном находятся в составе комплексного соединения друг с другом. При этом возникает два новых скачка: один при рН 8,0, второй около 10,0, которые могут быть интерпретированы как скачки титрования различных форм комплекса. В щелочной области при больших значениях рН (выше 8,0) возможно наличие комплексов с депротонированными формами аллоферона.The most important changes take place in the alkaline region. Thus, there is practically no jump at pH 9.4, which is characteristic of both alloferon and zinc salts. This indicates that the content of free alloferon and zinc ions in the solution in the alkaline region is not high. Therefore, they are mainly found in a complex compound with each other. In this case, two new jumps appear: one at pH 8.0, the second around 10.0, which can be interpreted as jumps in the titration of various forms of the complex. In the alkaline region at high pH values (above 8.0), the presence of complexes with deprotonated forms of alloferon is possible.

Наиболее интересной является узкая область между скачками при рН 6,5 и 8,0. В этой области для незаряженной молекулы аллоферона возможно взаимодействие с солями цинка с образованием структуры хелатного типа.The most interesting is the narrow region between the jumps at pH 6.5 and 8.0. In this region, an uncharged alloferon molecule can interact with zinc salts to form a chelate-type structure.

Полученные данные показывают, что:The data obtained show that:

аллоферон и соль цинка в растворе вступают во взаимодействие друг с другом, взаимодействие аллоферона и солью цинка с образованием комплексных соединений наблюдается во всем диапазоне рН от 4,0 до 10,0, область рН от 6,5 до 8,0 является предпочтительной для фармацевтических целей, данные потенциометрического титрования подтверждают закономерности, выявленные при массспектрометрических исследованиях (пример 1) системы аллоферон - цинк.alloferon and zinc salt in solution interact with each other, the interaction of alloferon and zinc salt with the formation of complex compounds is observed over the entire pH range from 4.0 to 10.0, the pH range from 6.5 to 8.0 is preferable for pharmaceuticals purposes, potentiometric titration data confirm the patterns identified during mass spectrometric studies (example 1) of the alloferon - zinc system.

Вывод: аллоферон с цинком в 0,9% растворе натрия хлорида с рН от 6,5 до 8,0 образуют композицию, содержащую максимальную концентрацию комплексных соединенийConclusion: alloferon with zinc in a 0.9% sodium chloride solution with a pH from 6.5 to 8.0 form a composition containing the maximum concentration of complex compounds

Пример 3. Приготовление композиций. Композиция 1 (мольное соотношение 1:1).Example 3. Preparation of compositions. Composition 1 (molar ratio 1:1).

100 мг аллоферона растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата - раствор 1. Параллельно готовят раствор 17,4 мг ацетата цинка дигидрата (или 10,8 мг хлорида цинка безводного) цинка в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата - раствор 2. В раствор 1 постепенно при перемешивании вводят раствор 2. Через 30 мин контролируют рН раствора и доводят его до величины 7,5 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы, которые затем запаивают или флаконы, которые герметизируют пробками и колпачками.100 mg of alloferon is dissolved in 50 ml of 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate - solution 1. In parallel, prepare a solution of 17.4 mg of zinc acetate dihydrate (or 10.8 mg of anhydrous zinc chloride) of zinc in 50 ml of 0.9% solution sodium chloride or sodium acetate - solution 2. Solution 2 is gradually introduced into solution 1 with stirring. After 30 minutes, control the pH of the solution and bring it to a value of 7.5 using a 0.1 M solution of sodium hydroxide or hydrochloric acid. The resulting solution is sterilized by filtration through a filter with pores of 0.2 microns, dosed into ampoules, which are then sealed, or vials, which are sealed with stoppers and caps.

Солевые растворы для приготовления композиций получают растворением 9,0 г натрия хлорида или 14,75 г натрия ацетата тригидрата в 1 литре воды очищенной. Растворы стерилизуют автоклавированием и до применения хранят при температуре +4 - 8°С. Композиция 2 (мольное соотношение 1:2).Salt solutions for preparing compositions are prepared by dissolving 9.0 g of sodium chloride or 14.75 g of sodium acetate trihydrate in 1 liter of purified water. Solutions are sterilized by autoclaving and stored at +4 - 8°C until use. Composition 2 (molar ratio 1:2).

Приготовление аналогично композиции 1, но берут 34,8 мг ацетата цинка дигидрата (или 21,6 мг хлорида цинка безводного).The preparation is similar to composition 1, but take 34.8 mg of zinc acetate dihydrate (or 21.6 mg of anhydrous zinc chloride).

Пример 4. Индукция интерферона-гамма (IFN-γ) и интерлейкина-18 (IL-18)Example 4: Induction of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-18 (IL-18)

С целью оценки иммуномодулирующей активности (ИА) заявляемых композиций, а также выявления вклада содержащихся в них комплексных соединений, проведено определение уровня индукции цитокинов (IFN-γ и IL-18) как композициями, так и исходными компонентами - аллофероном и солью цинка (ацетатом). Кроме того, была определена индукция цитокинов вызываемая при использовании обоих компонентов (аллоферон и соль цинка), введенных в организм раздельно во времени.In order to assess the immunomodulatory activity (IA) of the claimed compositions, as well as to identify the contribution of the complex compounds contained in them, the level of induction of cytokines (IFN-γ and IL-18) was determined both by the compositions and the initial components - alloferon and zinc salt (acetate) . In addition, the induction of cytokines caused by the use of both components (alloferon and zinc salt), introduced into the body separately over time, was determined.

Испытанию были подвергнуты 6 образцов.6 samples were tested.

1. Аллоферон (Аллокин-альфа, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения) - препарат сравнения.1. Alloferon (Allokin-alpha, lyophilisate for the preparation of a solution for subcutaneous administration) - a comparison drug.

2. Композиция 1.2. Composition 1.

3. Композиция 2.3. Composition 2.

4. Цинка ацетат.4. Zinc acetate.

5. Аллоферон и ацетат цинка, введенные раздельно с интервалом 15 мин.5. Alloferon and zinc acetate, administered separately with an interval of 15 minutes.

6. 0,9% раствор натрия хлорида - контроль.6. 0.9% sodium chloride solution - control.

Образцы 1, 2, 3, и 5 имели концентрацию аллоферона 1 мг/мл. Раствор аллоферона в образцах 1 и 5 получали растворением содержимого ампулы препарата Аллокин-альфа (1 мг аллоферона) в 1 мл раствора натрия хлорида 0,9%. Раствор ацетата цинка в примерах 4 и 5 имел концентрацию 0,17 мг/мл (соответственно концентрации в композиции 1). Для определения фонового количества IFN-γ и IL-18 в сыворотке крови исследуемых животных использовался раствор натрия хлорида 0,9%.Samples 1, 2, 3, and 5 had an alloferon concentration of 1 mg/ml. The alloferon solution in samples 1 and 5 was prepared by dissolving the contents of an ampoule of the drug Allokin-alpha (1 mg of alloferon) in 1 ml of 0.9% sodium chloride solution. The zinc acetate solution in examples 4 and 5 had a concentration of 0.17 mg/ml (corresponding to the concentration in composition 1). To determine the background amount of IFN-γ and IL-18 in the blood serum of the studied animals, a 0.9% sodium chloride solution was used.

Для экспериментов использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16-22 г, возраста 18 недель, разбитые на 6 групп по 15 особей в каждой. Образцы вводили однократно подкожно в дозе из расчета 1 мг аллоферона на 1 кг тела лабораторного животного. Компоненты образца 5 вводили раздельно с интервалом 15 мин. Количество вводимого ацетата цинка (образцы 4 и 5) соответствовало его количеству в композиции 1.For the experiments, female BALB/C mice were used, weighing 16-22 g, 18 weeks old, divided into 6 groups of 15 individuals each. The samples were administered once subcutaneously at a dose of 1 mg of alloferon per 1 kg of body of a laboratory animal. The components of sample 5 were introduced separately with an interval of 15 min. The amount of introduced zinc acetate (samples 4 and 5) corresponded to its amount in composition 1.

Уровень интерферона-гамма в сыворотке крови определялся путем твердофазного гетерогенного иммунного анализа с использованием специфических антител через 3 ч после введения образца, когдаThe level of interferon-gamma in the blood serum was determined by solid-phase heterogeneous immunoassay using specific antibodies 3 hours after injection of the sample, when

- 6 046126 наблюдается максимальный уровень индукции IFN-γ. Для определения индукции интерлейкина-18 была использована методика, описанная в патенте RU 2482866, временной точкой определения уровня IL-18 исходя из данных этой работы выбрано 36 ч после введения образца. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытных группах доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку. Результаты тестирования исследуемых образцов приведены в табл. 1.- 6 046126 the maximum level of IFN-γ induction is observed. To determine the induction of interleukin-18, the method described in patent RU 2482866 was used; the time point for determining the level of IL-18, based on the data of this work, was 36 hours after the introduction of the sample. For the control group, the confidence interval was calculated from dilution measurements of the same sample. In the experimental groups, the confidence interval was calculated relative to three samples from three animals for each measured point. The results of testing the samples under study are given in table. 1.

Таблица 1Table 1

Концентрация интерферона-гамма и интерлейкина-18 в сыворотке кровиConcentration of interferon-gamma and interleukin-18 in blood serum

№ No. Образец Sample Гамма-интерферон через 3 часа (nr/мл сыворотки) Interferon gamma after 3 hours (nr/ml serum) Иитерлейкин-18 через 36 часов (nr/мл сыворотки) Interleukin-18 after 36 hours (nr/ml serum) 1 1 Аллоферон Alloferon 95116 95116 360120 360120

2 2 Композиция! Composition! 140120 140120 402120 402120 3 3 Композиция 2 Composition 2 148120 148120 422125 422125 4 4 Аллоферон ♦ цинк (раздельное введение) Alloferon ♦ zinc (separate administration) 120115 120115 354115 354115 5 5 Цинка ацетат Zinc acetate 8218 8218 194112 194112 6 6 0,9% раствор натрия хлорида, контроль 0.9% sodium chloride solution, control чэ+я cha+ya 186112 186112

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы.The results obtained allow us to draw the following conclusions.

Выводы.Conclusions.

1. Изученные композиции обладают специфической способностью к индукции IFN-γ и IL-18.1. The studied compositions have a specific ability to induce IFN-γ and IL-18.

2. Композиции, содержащие комплексы аллоферона с цинком вызывают индукцию цитокинов, существенно превышающую уровень цитокинов, вызываемый аллофероном.2. Compositions containing complexes of alloferon with zinc cause the induction of cytokines, significantly exceeding the level of cytokines caused by alloferon.

3. Максимальный уровень индукции цитокинов вызывает композиция 2 с соотношением аллофенон:цинк 1:2.3. The maximum level of cytokine induction is caused by composition 2 with an allophenone:zinc ratio of 1:2.

4. Иммуностимулирующая активность композиций не является результатом сложения активностей исходных компонентов, что свидетельствует о вкладе образующихся комплексных соединений в активацию иммунной системы.4. The immunostimulating activity of the compositions is not the result of the addition of the activities of the initial components, which indicates the contribution of the resulting complex compounds to the activation of the immune system.

Пример 5. Противовирусная активность композиций на модели герпетической инфекции у мышейExample 5. Antiviral activity of the compositions in a model of herpes infection in mice

Проведена оценка защитного действия разработанных композиций на модели герпетической инфекции. В качестве препаратов сравнении использованы: 1/ Аллокин-альфа, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения - лекарственный препарат, используемый в терапии генитального герпеса, содержащий 1 мг аллоферона на ампулу, 2/ Ацикловир - лекарственный препарат, используемый при стандартной терапии герпеса.The protective effect of the developed compositions was assessed on a model of herpes infection. The drugs used for comparison were: 1/ Allokin-alpha, a lyophilisate for preparing a solution for subcutaneous administration - a drug used in the treatment of genital herpes, containing 1 mg of alloferon per ampoule, 2/ Acyclovir - a drug used in standard therapy of herpes.

Белых беспородных мышей (самки) массой 16-20 г получали из питомника Рапполово (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. Животные были разделены на 5 групп по 20 животных: четыре опытные, в которых животные получали инъекции композиции 1, композиции 2, препарата Аллокин-альфа, препарата Ацикловир, соответственно, и одна контрольная, в которой животные получали инъекции 0,9% раствора натрия хлорида.White outbred mice (females) weighing 16-20 g were obtained from the Rappolovo nursery (Leningrad region) and kept on a standard diet in regulated vivarium conditions. The selection of animals into experimental groups was carried out using random sampling. The animals were divided into 5 groups of 20 animals: four experimental ones, in which the animals received injections of composition 1, composition 2, the drug Allokin-alpha, the drug Acyclovir, respectively, and one control, in which the animals received injections of 0.9% sodium chloride solution .

В исследовании использован вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2) штамм G (АТСС VR-734). Инфицирование производилось вагинально. Повреждение вагинального эпителия осуществляли при помощи скарификатора для влагалищных мазков, после чего животных инфицировали вирусом в дозе 1,7x105 TCID50 в объеме 30 мкл.The study used herpes simplex virus type 2 (HSV-2) strain G (ATCC VR-734). Infection was carried out vaginally. Damage to the vaginal epithelium was carried out using a scarifier for vaginal smears, after which the animals were infected with the virus at a dose of 1.7x105 TCID50 in a volume of 30 μl.

Аллокин-альфа и композиции 1 и 2 вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1.25 мг/кг один раз в сутки в течение 3 дней после заражения по лечебной схеме: через 1, 2 и 3 суток после заражения. Ацикловир вводили по той же схеме в дозе 50 мг/кг. Контрольная группа животных получала инъекцию 0,9% раствора натрия хлорида.Allokin-alpha and compositions 1 and 2 were administered to animals intraperitoneally at a dose of 1.25 mg/kg once a day for 3 days after infection according to the treatment regimen: 1, 2 and 3 days after infection. Acyclovir was administered according to the same regimen at a dose of 50 mg/kg. The control group of animals received an injection of 0.9% sodium chloride solution.

Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольной и опытных группах. На основании полученных данных в каждой группе рассчитывали процент смертности М (отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараThe animals were observed for 14 days. The mortality of animals in the control and experimental groups was recorded daily. Based on the data obtained in each group, the percentage of mortality M was calculated (the ratio of the number of animals that died in 14 days to the total number of deaths

- 7 046126 женных животных в группе) и индекс защиты IP (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту летальности в контрольной группе).- 7,046,126 female animals in the group) and the IP protection index (the ratio of the difference in the percentage of mortality in the control and experimental groups to the percentage of mortality in the control group).

M=N₁₄/Nx100%,M=N ₁₄ /Nx100%,

Где:Where:

N₁₄ - число животных, павших в группе на 14 день после заражения,N ₁₄ - the number of animals that died in the group on the 14th day after infection,

N - общее число животных в группе;N is the total number of animals in the group;

^Мс-Ме/Мсх^/о, где Мс и Me - летальность, выраженная в процентах в опытной и контрольной группах. Данные, полученные в эксперименте, представлены в табл. 2.^Мс-Ме/Мсх^/о, where Мс and Me are mortality expressed as a percentage in the experimental and control groups. The data obtained in the experiment are presented in table. 2.

Таблица 2table 2

Протективный эффект изученных препаратов на модели герпетической инфекции у мышейProtective effect of the studied drugs on a model of herpes infection in mice

Препарат A drug Й Y Результаты эксперимента Experiment results 1Р(%) 1Р(%) Композиция 1 Composition 1 20 20 3 3 15,0 15.0 75,0 75.0 Композиция 2 Composition 2 20 20 2 2 10,0 10.0 83,3 83.3 Аллокин-альфа Allokin-alpha 20 20 4 4 20,0 20.0 66,7 66.7 Ацикловир Acyclovir 20 20 3 3 15,0 15.0 75,0 75.0 Контроль Control 20 20 12 12 60,0 60.0

Вывод.Conclusion.

1. Заявляемые композиции, содержащие комплексные соединения аллоферона с цинком, где концентрация растворов аллоферона и соли цинка подобрана таким образом, что мольное соотношение компонентов аллоферона и соли цинка составляет от 1:1 до 1:2, демонстрируют высокую противовирусную активность, обеспечивая по отношению к вирусу герпеса защитное действие, превосходящее эффект исходного аллоферона (препарат Аллокин-альфа).1. The inventive compositions containing complex compounds of alloferon with zinc, where the concentration of solutions of alloferon and zinc salt are selected in such a way that the molar ratio of the components of alloferon and zinc salt is from 1:1 to 1:2, demonstrate high antiviral activity, providing against the herpes virus has a protective effect superior to the effect of the original alloferon (the drug Allokin-alpha).

2. Протективное действие композиций, применяемых в дозе 1,25 мг/кг равно (композиция 1) или превышает (композиция 2) эффективность стандартного противогерпетического препарата Ацикловир в дозе 50 мг/кг.2. The protective effect of compositions used at a dose of 1.25 mg/kg is equal (composition 1) or exceeds (composition 2) the effectiveness of the standard antiherpetic drug Acyclovir at a dose of 50 mg/kg.

Claims

CLAIM

1. A pharmaceutical composition with antiviral and immunomodulatory activity, containing alloferon and zinc as active substances, characterized in that its active principle is a mixture of biologically active complex compounds formed by the interaction of the oligopeptide alloferon with zinc ions in 0.9% solutions of sodium chloride or sodium acetate with subsequent adjustment of pH to a value from 6.5 to 8.0, and zinc and alloferon in solution form complex compounds of various compositions, and the concentration of alloferon and zinc chloride or acetate is selected in such a way that their molar ratio is from 1:1 up to 1:2.

2. The method of obtaining a pharmaceutical composition according to claim 1, consisting in the fact that when preparing the composition, first prepare the first solution, which is obtained by dissolving alloferon in a solution of sodium chloride or sodium acetate, in parallel prepare a second solution, which is obtained by dissolving zinc acetate or zinc chloride in sodium chloride or sodium acetate solution; after which the second solution is gradually introduced into the first solution with stirring; after 30 minutes, control the pH of the solution and bring it to a value of 6.5-8.0 (mainly 7.5) using a 0.1 M solution of sodium hydroxide or hydrochloric acid; the resulting solution is sterilized by filtration through a filter with pores of 0.2 microns, dosed into ampoules or bottles, which are then sealed.

3. The method according to claim 2, characterized in that the final concentrations of the components of the composition are provided: alloferon - 1 mg/ml, zinc salt - from 0.052 to 0.104 mg zinc/ml.

4. The method according to claim 2, characterized in that the first solution of alloferon is prepared with a concentration of 2 mg/ml in a 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate, and the second solution is prepared in an equal volume of a solution of zinc acetate or zinc chloride with a concentration of 0.104 mg zinc/ml in 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate.

5. The method according to claim 2, characterized in that the first solution is obtained by dissolving 100 mg of alloferon in 50 ml of 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate, and the second solution is obtained by dissolving 34.8 mg of zinc acetate dihydrate or 21.6 mg of chloride anhydrous zinc in 50 ml of 0.9% solution of sodium chloride or sodium acetate.