EA045929B1 - MPO INHIBITORS FOR MEDICAL USE - Google Patents
MPO INHIBITORS FOR MEDICAL USE Download PDFInfo
- Publication number
- EA045929B1 EA045929B1 EA202090266 EA045929B1 EA 045929 B1 EA045929 B1 EA 045929B1 EA 202090266 EA202090266 EA 202090266 EA 045929 B1 EA045929 B1 EA 045929B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sperm
- male infertility
- treatment
- infertility
- patient
- Prior art date
Links
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 7
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 37
- RSPDBEVKURKEII-ZCFIWIBFSA-N 3-[[(2r)-oxolan-2-yl]methyl]-2-sulfanylidene-7h-purin-6-one Chemical compound C1=2N=CNC=2C(=O)NC(=S)N1C[C@H]1CCCO1 RSPDBEVKURKEII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 claims description 32
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 claims description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 7
- 231100000521 sperm damage Toxicity 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 229940122159 Myeloperoxidase inhibitor Drugs 0.000 description 35
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 19
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 17
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 16
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 16
- DNCYBUMDUBHIJZ-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrimidin-6-one Chemical compound O=C1C=CN=CN1 DNCYBUMDUBHIJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 15
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 15
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 5
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 4
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TZYQTWHRLVDYPL-UHFFFAOYSA-N 5h-pyrimidin-4-one Chemical compound O=C1CC=NC=N1 TZYQTWHRLVDYPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 3
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 3
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 3
- 230000008010 sperm capacitation Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FVJCUZCRPIMVLB-UHFFFAOYSA-N 1-(2-propan-2-yloxyethyl)-2-sulfanylidene-5h-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-one Chemical compound O=C1NC(=S)N(CCOC(C)C)C2=C1NC=C2 FVJCUZCRPIMVLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPBZMCGPFHZRHJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 WPBZMCGPFHZRHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- -1 hypochlorous acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000009612 semen analysis Methods 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 231100000469 sperm hypomotility Toxicity 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- ACWBBAGYTKWBCD-ZETCQYMHSA-N 3-chloro-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(Cl)=C1 ACWBBAGYTKWBCD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 3-nitro-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 FBTSQILOGYXGMD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282323 Felidae Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001099460 Homo sapiens Myeloperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 102100038609 Lactoperoxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010043298 Testicular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010788 atrophy of testis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000006311 cyclobutyl amino group Chemical group [H]N(*)C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004850 cyclobutylmethyl group Chemical group C1(CCC1)C* 0.000 description 1
- 125000006312 cyclopentyl amino group Chemical group [H]N(*)C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 1
- 125000004186 cyclopropylmethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C1([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 231100000690 decreased sperm viability Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N ethyl Chemical compound C[CH2] QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108700017488 glutathione sulfonamide Proteins 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 102000051251 human MPO Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000003368 hypogonadotropic hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013038 irreversible inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 239000008263 liquid aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000005001 male reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000003622 mature neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 201000002663 oligoasthenoteratozoospermia Diseases 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 201000005737 orchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000006950 reactive oxygen species formation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001625 seminal vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000005586 smoking cessation Effects 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 231100000527 sperm abnormality Toxicity 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100001044 testicular atrophy Toxicity 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 150000004684 trihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 201000010653 vesiculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 230000037221 weight management Effects 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение направлено на соединения для применения в лечении мужского бесплодия и способы лечения мужского бесплодия.The present invention is directed to compounds for use in the treatment of male infertility and methods for treating male infertility.
Перечисление или обсуждение явно ранее опубликованного документа в данном описании не обязательно должно восприниматься как подтверждение того, что документ является частью уровня техники или является общеизвестными знаниями.The listing or discussion of an apparently previously published document in this specification should not necessarily be taken as an endorsement that the document is part of the prior art or is generally known knowledge.
На глобальном уровне бесплодие затрагивает приблизительно 15% пар репродуктивного возраста, пытающихся зачать; причем это примерно соответствует 48,5 миллионам пар. Мужское бесплодие является способствующим фактором при 50% случаев проблем, связанных с бесплодием, и, как сообщается, является единственной причиной бесплодия примерно в 20-30% всех случаев. Эти цифры могут быть заниженными, поскольку информация в отношении оценки и отчетности о мужском бесплодии, вероятно, не является полной во многих странах.Globally, infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age trying to conceive; and this roughly corresponds to 48.5 million pairs. Male infertility is a contributing factor in 50% of cases of infertility related problems and is reported to be the sole cause of infertility in approximately 20-30% of all cases. These figures may be an underestimate because information regarding the assessment and reporting of male infertility is likely to be incomplete in many countries.
Мужское бесплодие может быть вызвано различными состояниями, некоторые из которых могут быть легко идентифицированы и подвергнуты коррекции, такие как обструкция протоков и гипогонадотропный гипогонадизм. Другие состояния являются необратимыми, как, например, двусторонняя атрофия яичек, обусловленная вирусным орхитом. У мужчин, которые не имеют поддающейся установлению причины, но демонстрируют аномальный профиль спермы при анализе, как это имеет место у многих пациентов, такое состояние называют идиопатическим мужским бесплодием. Были определены стандартные критерии WHO для образцов спермы, которые широко применяются в ходе оценки мужчин, подвергающихся исследованиям в отношении бесплодия (см. таблицу). Мужской фактор бесплодия, как правило, определяется как изменение концентрации, и/или подвижности, и/или морфологии сперматозоидов по крайней мере в одном образце из двух анализов спермы, собранных с интервалом в 1 и 4 недели. До 90% случаев мужского бесплодия обусловлены аномалиями в отношении концентрации сперматозоидов, их морфологии или функции без какой-либо определимой причины; причем это иногда называют идиопатической олигоастенотератозооспермией. В данной когорте окислительный стресс считается значительным фактором, способствующим повреждению сперматозоидов. На фиг. 1 схематически представлена роль окислительного стресса в мужском бесплодии.Male infertility can be caused by a variety of conditions, some of which can be easily identified and treated, such as ductal obstruction and hypogonadotropic hypogonadism. Other conditions are irreversible, such as bilateral testicular atrophy caused by viral orchitis. In men who have no identifiable cause but show an abnormal sperm profile on analysis, as is the case in many patients, the condition is called idiopathic male infertility. Standard WHO criteria for semen samples have been defined and are widely used in the evaluation of men undergoing infertility investigations (see table). Male factor infertility is generally defined as a change in sperm concentration and/or motility and/or morphology in at least one sample of two semen samples collected 1 and 4 weeks apart. Up to 90% of cases of male infertility are caused by abnormalities in sperm concentration, morphology or function without any identifiable cause; and this is sometimes called idiopathic oligoasthenoteratozoospermia. In this cohort, oxidative stress is considered a significant contributor to sperm damage. In fig. Figure 1 schematically presents the role of oxidative stress in male infertility.
Окислительный стресс (OS) отражает дисбаланс между образованием активных форм кислорода (ROS) и эндогенных антиоксидантов, и при наличии избытка ROS может происходить повреждение клеток и тканей. Эпидемиологические данные из США свидетельствуют о том, что избыток ROS является основной причиной мужского фактора бесплодия; причем 30-40% бесплодных мужчин характеризуются повышенными уровнями ROS в их семенной плазме. Сперматозоиды особенно уязвимы к OS, поскольку их клеточные мембраны богаты полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA), что делает их восприимчивыми к перекисному окислению липидов. Это приводит к быстрой потере внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТР), что вызывает повреждение аксонемы, снижение жизнеспособности сперматозоидов и увеличение морфологических дефектов шеек сперматозоидов, что в совокупности способствует снижению подвижности сперматозоидов. Кроме того, сперматозоиды имеют характерные дефициты во внутриклеточных ферментах антиоксидантной защиты, и, в отличие от большинства типов клеток, сперматозоиды обладают ограниченной способностью выявлять и репарировать повреждения ДНК.Oxidative stress (OS) reflects an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and endogenous antioxidants, and in the presence of excess ROS, cell and tissue damage can occur. Epidemiological evidence from the United States suggests that excess ROS is a major cause of male factor infertility; with 30-40% of infertile men having elevated levels of ROS in their seminal plasma. Sperm are particularly vulnerable to OS because their cell membranes are rich in polyunsaturated fatty acids (PUFAs), making them susceptible to lipid peroxidation. This results in rapid loss of intracellular adenosine triphosphate (ATP), which causes axonemal damage, decreased sperm viability, and increased morphological defects of sperm necks, which collectively contribute to decreased sperm motility. In addition, sperm have characteristic deficiencies in intracellular antioxidant enzymes and, unlike most cell types, sperm have a limited ability to detect and repair DNA damage.
Критерии WHO для анализа спермыWHO criteria for semen analysis
Нормальный анализ семенной жидкости (Всемирная организация здравоохранения, 2002 г.) • Объем: > 2 мл • Концентрация сперматозоидов: > 20 миллионов/мл • Подвижность сперматозоидов: > 50% с прогрессивной или > 25% с быстрой прогрессивной подвижностью • Морфология (строгие критерии): > 15% нормальных форм • Белые клетки крови: < 1 миллион/мл • Иммуногранулотест или тест смешанной антиглобулиновой реакции*: < 10% покрытых * Тесты на присутствие покрывающих сперматозоид антителNormal semen analysis (World Health Organization, 2002) • Volume: > 2 ml • Sperm concentration: > 20 million/ml • Sperm motility: > 50% with progressive or > 25% with rapidly progressive motility • Morphology (strict criteria ): > 15% normal • White blood cells: < 1 million/ml • Immunogranulotest or mixed antiglobulin test*: < 10% coated * Tests for the presence of sperm-coating antibodies
ROS вырабатываются как самими сперматозоидами, так и полиморфноядерными лейкоцитами (PMN), такими как нейтрофилы, которые локализуются вместе со сперматозоидами в яичках и придатках яичка, в ходе сперматогенеза и обычно обнаруживаются в семенной плазме, происходящей из предстательной железы и семенных пузырьков. PMN могут вырабатывать и высвобождать примерно в 1000 раз большее количество ROS, чем сперматозоиды, и, таким образом, они, вероятно, являются основным источником OS при идиопатическом мужском бесплодии. Сперматозоиды, инкубированные совместно с активированными нейтрофилами, показывают снижение подвижности, связанное с концентрацией, при увеличении количества нейтрофилов.ROS are produced both by sperm and by polymorphonuclear leukocytes (PMN), such as neutrophils, which colocalize with sperm in the testes and epididymis during spermatogenesis and are typically found in seminal plasma originating from the prostate and seminal vesicles. PMNs can produce and release approximately 1000 times more ROS than sperm and are thus likely to be the major source of OS in idiopathic male infertility. Spermatozoa co-incubated with activated neutrophils show a concentration-related decrease in motility as the number of neutrophils increases.
Нейтрофилы составляют около 60% популяции PMN, обнаруживаемой в мужских половых путях, и при активации генерируют супероксид и перекись водорода в качестве составной части их окислительного взрыва. Кроме того, нейтрофилы содержат большое количество гем-содержащего фермента миелопероксидазы (МРО), которая использует образующуюся перекись водорода для продуцирования хлорноNeutrophils make up about 60% of the PMN population found in the male reproductive tract and, when activated, generate superoxide and hydrogen peroxide as part of their oxidative burst. In addition, neutrophils contain large amounts of the heme-containing enzyme myeloperoxidase (MPO), which uses the resulting hydrogen peroxide to produce chloride.
- 1 045929 ватистой кислоты и других окислителей с высокой реакционной способностью. Эти окислители вредны для клеток человека и поэтому могут привести к повреждению сперматозоидов и изменению их жизнеспособности и функции. Повышенные уровни миелопероксидазы в семенной жидкости были ассоциированы со снижением концентрации сперматозоидов у молодых здоровых мужчин. Кроме того, было показано, что миелопероксидаза играет важную роль в формировании нейтрофильной внеклеточной ловушки (NET) в ходе нетоза. Человеческие сперматозоиды могут индуцировать высвобождение NET из нейтрофилов, которые затем прочно прикрепляются к сперматозоидам, обездвиживая их. Было показано, что обработка нейтрофилов гидразидом 4-аминобензойной кислоты, доклиническим средством, являющимся ингибитором МРО, значительно снижает образование NET, индуцированное сперматозоидами. Насколько известно авторам настоящего изобретения, до настоящего времени не проводилось каких-либо исследований по применению ингибитора МРО для лечения бесплодных мужчин.- 1 045929 cottony acid and other highly reactive oxidizing agents. These oxidizing agents are harmful to human cells and can therefore damage sperm and alter their viability and function. Elevated levels of myeloperoxidase in seminal fluid have been associated with decreased sperm concentration in young healthy men. In addition, myeloperoxidase has been shown to play an important role in neutrophil extracellular trap (NET) formation during NETosis. Human sperm can induce the release of NETs from neutrophils, which then attach firmly to the sperm, immobilizing them. Treatment of neutrophils with 4-aminobenzoic acid hydrazide, a preclinical MPO inhibitor, has been shown to significantly reduce sperm-induced NET formation. To the best of the inventors' knowledge, no studies have been conducted to date on the use of an MPO inhibitor for the treatment of infertile men.
Применяемый в настоящее время режим лечения для мужчин, испытывающих идиопатическое бесплодие, начинается с консультирования в отношении образа жизни, как, например, прекращение курения, воздержание от алкоголя, оптимизация веса, сведение к минимуму воздействия на яички тепла и токсинов окружающей среды. Доступен ассортимент продаваемых без рецепта препаратов пероральных добавок на основе витаминов и антиоксидантов. Были проведены многочисленные клинические испытания для оценки эффективности этих терапевтических средств. Однако многие из них были небольшими, в совокупности они демонстрируют заметную методологическую и клиническую неоднородность, и в целом они показали смешанные результаты. Недавно проведенный мета-анализ показал, что применение пероральных антиоксидантов у бесплодных мужчин может улучшить качество спермы и показатели беременности. Однако для регулирования клинической практики необходимо должным образом обеспеченное проведение надежных испытаний отдельных антиоксидантов и их комбинаций. В том случае, когда, несмотря на эти меры, парам по-прежнему не удается зачать, используют вспомогательные репродуктивные методы, такие как внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ICSI) или IVF. Данные методы инвазивны, дороги и не являются общедоступными.The current treatment regimen for men experiencing idiopathic infertility begins with lifestyle counseling, such as smoking cessation, abstinence from alcohol, weight management, and minimizing testicular exposure to heat and environmental toxins. A range of over-the-counter oral vitamin and antioxidant supplements are available. Numerous clinical trials have been conducted to evaluate the effectiveness of these therapeutic agents. However, many of them were small, collectively they exhibited notable methodological and clinical heterogeneity, and overall they showed mixed results. A recent meta-analysis found that oral antioxidants in infertile men may improve sperm quality and pregnancy rates. However, to regulate clinical practice, it is necessary to properly ensure reliable testing of individual antioxidants and their combinations. When, despite these measures, couples still fail to conceive, assisted reproductive techniques such as intracytoplasmic sperm injection (ICSI) or IVF are used. These methods are invasive, expensive and not widely available.
Поэтому существует явная потребность в новых вариантах лечения мужского бесплодия и, в частности, идиопатического мужского бесплодия. Это особенно очевидно в свете нынешней недокументированной терапии, эффективность которой не установлена. Целью настоящего изобретения является предоставление новых терапевтических средств для лечения мужского бесплодия.Therefore, there is a clear need for new treatment options for male infertility and, in particular, idiopathic male infertility. This is especially evident in light of current undocumented therapies whose effectiveness has not been established. The purpose of the present invention is to provide new therapeutic agents for the treatment of male infertility.
Ввиду высокой распространенности окислительного стресса при идиопатическом мужском бесплодии, роли миелопероксидазы в нейтрофил-опосредованном образовании сильных окислителей и поступающих данных, показывающих роль МРО в активируемом сперматозоидами нетозе, авторы настоящего изобретения считают, что ингибиторы МРО могут найти применение в качестве терапевтических средств для лечения или профилактики мужского бесплодия и, в частности, для лечения идиопатического мужского бесплодия.In view of the high prevalence of oxidative stress in idiopathic male infertility, the role of myeloperoxidase in neutrophil-mediated generation of strong oxidants, and the emerging data showing the role of MPO in sperm-activated NETosis, the present inventors believe that MPO inhibitors may find use as therapeutic agents for treatment or prevention. male infertility and, in particular, for the treatment of idiopathic male infertility.
Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение предусматривает ингибитор миелопероксидазы (МРО) для применения в лечении или профилактике мужского бесплодия. Ингибитор МРО для применения может быть использован для лечения идиопатического мужского бесплодия. Ингибитор МРО для применения может быть использован профилактически у пациента с выявленной склонностью к идиопатическому мужскому бесплодию в связи с выявлением повышенных уровней активных форм кислорода в образце их семенной жидкости и/или дисфункции сперматозоидов, обусловленных окислительным стрессом.Accordingly, in a first aspect, the present invention provides a myeloperoxidase inhibitor (MPO) for use in the treatment or prevention of male infertility. MPO inhibitor for use can be used to treat idiopathic male infertility. The MPO inhibitor for use can be used prophylactically in a patient with an identified tendency to idiopathic male infertility due to the identification of elevated levels of reactive oxygen species in a sample of their seminal fluid and/or sperm dysfunction due to oxidative stress.
Во втором аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения или профилактики бесплодия у пациента мужского пола, нуждающегося в этом, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора МРО. Пациентом мужского пола, нуждающимся в этом, обычно является пациент с идиопатическим мужским бесплодием или пациент с установленной склонностью к идиопатическому мужскому бесплодию.In a second aspect, the present invention provides a method of treating or preventing infertility in a male patient in need thereof, comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of an MPO inhibitor. The male patient requiring this is usually a patient with idiopathic male infertility or a patient with an established tendency towards idiopathic male infertility.
В третьем аспекте настоящее изобретение предусматривает ингибитор миелопероксидазы или его фармацевтически приемлемую соль или сольват для использования в изготовлении лекарственного препарата для лечения или профилактики мужского бесплодия.In a third aspect, the present invention provides a myeloperoxidase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof for use in the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of male infertility.
В четвертом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор миелопероксидазы или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, для применения в лечении или профилактике мужского бесплодия, в частности для применения при идиопатическом мужском бесплодии.In a fourth aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a myeloperoxidase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof for use in the treatment or prevention of male infertility, in particular for use in idiopathic male infertility.
В пятом аспекте предусмотрен набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор миелопероксидазы или его фармацевтически приемлемую соль или сольват, и инструкции по применению фармацевтической композиции для лечения или профилактики идиопатического мужского бесплодия.In a fifth aspect, there is provided a kit containing a pharmaceutical composition comprising a myeloperoxidase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof, and instructions for use of the pharmaceutical composition for the treatment or prevention of idiopathic male infertility.
В предпочтительных аспектах, описанных в данном документе и указанных выше, пациентом мужского пола, нуждающимся в лечении, является пациент с идиопатическим мужским бесплодием или, в случае профилактики, пациент с установленной склонностью к идиопатическому мужскому бесплодию.In preferred aspects described herein and mentioned above, the male patient in need of treatment is a patient with idiopathic male infertility or, in the case of prophylaxis, a patient with an established predisposition to idiopathic male infertility.
В предпочтительных аспектах, описанных в данном документе и указанных выше, пациентом мужIn preferred aspects described herein and noted above, the patient's husband
- 2 045929 ского пола является человек. Настоящее изобретение также предусматривает применение ингибитора миелопероксидазы для лечения мужского бесплодия у наземных млекопитающих, отличных от человека, например у представителей семейств Canidae, Felidae, Bovidae, Equidae, Suidae, Camelini и Cervidae.- 2 045929 of the Russian gender is a person. The present invention also provides the use of a myeloperoxidase inhibitor for the treatment of male infertility in non-human terrestrial mammals, such as members of the families Canidae, Felidae, Bovidae, Equidae, Suidae, Camelini and Cervidae.
В вариантах осуществления аспектов, представленных выше, ингибиторы миелопероксидазы для применения, для применения в способах лечения, для применения в изготовлении лекарственного препарата или представленные в виде фармацевтической композиции применяются для подавления активируемого сперматозоидами нетоза. В таких вариантах осуществления пациент может быть подвергнут скринингу для лечения путем анализа образца его спермы, в результате чего может быть обнаружено, что он демонстрирует признаки индуцированного окислительным стрессом повреждения сперматозоидов, например при низком количестве/концентрации сперматозоидов, пониженной подвижности сперматозоидов, признаках фрагментации ДНК сперматозоидов, наличии стерильной лейкоцитоспермии в контексте идиопатического мужского бесплодия или высокой степени семенного нетоза.In embodiments of the aspects presented above, myeloperoxidase inhibitors for use, for use in methods of treatment, for use in the manufacture of a medicinal product, or presented in the form of a pharmaceutical composition are used to suppress sperm-activated NETosis. In such embodiments, the patient may be screened for treatment by analyzing a sample of his sperm, which may be found to exhibit signs of oxidative stress-induced sperm damage, e.g., low sperm count/concentration, decreased sperm motility, signs of sperm DNA fragmentation , the presence of sterile leukocytospermia in the context of idiopathic male infertility or a high degree of seminal NETosis.
В вариантах осуществления аспектов, представленных выше, ингибиторы миелопероксидазы для применения, для применения в способах лечения, для применения в изготовлении лекарственного препарата или представленные в виде фармацевтической композиции применяются для подавления окислительного стресса посредством подавления образования активных форм кислорода и/или последующих продуктов, опосредованных активными формами кислорода. Таким образом, ингибитор МРО для применения или для применения в способе лечения можно использовать для подавления продуцирования активных форм кислорода, представляющих собой гипогалоидные кислоты, такие как хлорноватистая кислота, а также других продуктов, опосредованных МРО, в том числе без ограничения 3-хлортирозина и 3-нитротирозина.In embodiments of the aspects presented above, myeloperoxidase inhibitors for use, for use in methods of treatment, for use in the manufacture of a medicinal product, or presented in the form of a pharmaceutical composition are used to suppress oxidative stress by inhibiting the formation of reactive oxygen species and/or downstream products mediated by reactive oxygen species. forms of oxygen. Thus, an MPO inhibitor for use or for use in a method of treatment can be used to inhibit the production of reactive oxygen species that are hypohalic acids such as hypochlorous acid, as well as other MPO-mediated products, including but not limited to 3-chlorotyrosine and 3 -nitrotyrosine.
В дополнение или в качестве альтернативы, у пациента, нуждающегося в лечении, могло быть диагностировано идиопатическое мужское бесплодие, например, после неудачных попыток зачатия в партнерстве с фертильным партнером в течение периода 6 месяцев или больше. В случае профилактического вмешательства нуждающийся в этом пациент может быть подвергнут анализу на предмет его склонности к развитию идиопатического мужского бесплодия путем анализа характеристик его спермы или других физиологических параметров, например, пациент с определенным профилем маркеров/характеристик в образце спермы, указывающим на опосредованную окислительным стрессом дисфункцию сперматозоидов, или аномально высокий уровень окислительного стресса в семенной жидкости (например, снижение общей антиоксидантной способности, повышенное количество активных форм кислорода или повышенное перекисное окисление липидов), или семенную лейкоцитоспермию (по определению WHO) в контексте субнормальной мужской фертильности или высокой степени семенного нетоза.In addition or alternatively, the patient seeking treatment may have been diagnosed with idiopathic male infertility, for example, after having failed to conceive with a fertile partner for a period of 6 months or more. In the case of prophylactic intervention, a patient in need may be assessed for their susceptibility to developing idiopathic male infertility by analyzing their sperm characteristics or other physiological parameters, for example, a patient with a certain profile of markers/characteristics in a semen sample indicating oxidative stress-mediated dysfunction sperm, or abnormally high levels of oxidative stress in seminal fluid (eg, decreased total antioxidant capacity, increased reactive oxygen species, or increased lipid peroxidation), or seminal leukocytospermia (as defined by WHO) in the context of subnormal male fertility or high degree of seminal NETosis.
В вариантах осуществления аспектов, представленных выше, предусмотрен способ восстановления фертильности у субъекта мужского пола, определенного как нуждающийся в этом пациент с идиопатическим бесплодием, включающий введение дозы терапевтически эффективного количества ингибитора МРО. В одном варианте осуществления способ лечения идиопатического мужского бесплодия или способ восстановления фертильности у пациента с идиопатическим мужским бесплодием включает введение дозы терапевтически эффективного количества ингибитора МРО для подавления индуцированного окислительным стрессом повреждения сперматозоидов и предупреждения активируемого сперматозоидами нетоза.In embodiments of the aspects presented above, there is provided a method of restoring fertility in a male subject, identified as an idiopathic infertility patient in need thereof, comprising dosing a therapeutically effective amount of an MPO inhibitor. In one embodiment, a method of treating idiopathic male infertility or a method of restoring fertility to a patient with idiopathic male infertility includes dosing a therapeutically effective amount of an MPO inhibitor to suppress oxidative stress-induced sperm damage and prevent sperm-activated NETosis.
Ингибиторы миелопероксидазы для применения, для применения в способах лечения, для применения в изготовлении лекарственного препарата или представленные в виде фармацевтической композиции могут быть выбраны из любого известного ингибитора МРО. В предпочтительных вариантах осуществления вышеуказанных аспектов ингибитор МРО выбран из ингибиторов МРО, описанных в WO 2006/062465 А1, WO 2008/152420 А1 и/или WO 2016/087338 А1.Myeloperoxidase inhibitors for use, for use in methods of treatment, for use in the manufacture of a medicinal product, or presented in the form of a pharmaceutical composition can be selected from any known MPO inhibitor. In preferred embodiments of the above aspects, the MPO inhibitor is selected from the MPO inhibitors described in WO 2006/062465 A1, WO 2008/152420 A1 and/or WO 2016/087338 A1.
В вариантах осуществления ингибитор миелопероксидазы представляет собой 3-[[(2R)-тетрагидрофуран-2-ил]метил]-2-тиоксо-7Н-пурин-6-он (AZD5904) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.In embodiments, the myeloperoxidase inhibitor is 3-[[(2R)-tetrahydrofuran-2-yl]methyl]-2-thioxo-7H-purin-6-one (AZD5904) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В вариантах осуществления ингибитор миелопероксидазы представляет собой 1-(2-изопропоксиэтил)-2-тиоксо-2,3-дигидро-Ш-пирроло[3,2^]пиримидин-4(5Н)-он или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.In embodiments, the myeloperoxidase inhibitor is 1-(2-isopropoxyethyl)-2-thioxo-2,3-dihydro-N-pyrrolo[3,2^]pyrimidin-4(5H)-one or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В вариантах осуществления ингибитор миелопероксидазы представляет собой соединение формулы (I) где R1 представляет собой Н, F, Cl или CF3;In embodiments, the myeloperoxidase inhibitor is a compound of formula (I) wherein R 1 is H, F, Cl or CF 3 ;
- 3 045929- 3 045929
R2 представляет собой Н, СН3 или С2Н5;R 2 represents H, CH3 or C 2 H 5 ;
R3 представляет собой Н, СН3, С2Н5, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, третбутил, циклопропил, циклопропилметил, циклобутил, циклобутилметил или циклопентил;R3 is H, CH3, C2H5 , n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, cyclopropyl, cyclopropylmethyl, cyclobutyl, cyclobutylmethyl or cyclopentyl;
или его фармацевтически приемлемую соль или сольват.or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.
В одном варианте осуществления соединение формулы (I) выбрано из:In one embodiment, a compound of formula (I) is selected from:
- {2- [ (1R) -1 -аминопропил] -4-хлорбензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-с!]пиримидин-4-она;- {2-[(1R)-1-aminopropyl]-4-chlorobenzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-c!]pyrimidin-4-one;
- [2-( 1 -аминоэтил)-4-хлорбензил] -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Н-пирроло [3,2<1]пиримидин-4-она;- [2-(1-aminoethyl)-4-chlorobenzyl]-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2<1]pyrimidin-4-one;
- {2- [(1R)-1 -аминоэтил] -4-хлорбензил} -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-с1]пиримидин-4-она;- {2-[(1R)-1-aminoethyl]-4-chlorobenzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-c1]pyrimidin-4-one;
l-{2-[(lS)-l -аминоэтил] -4-хлорбензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-с!]пиримидин-4-она;l-{2-[(lS)-l -aminoethyl]-4-chlorobenzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-c!]pyrimidin-4-one;
- {4-хлор-2- [ 1 -(метиламино)этил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {4-chloro-2-[1-(methylamino)ethyl]benzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- {4-хлор-2- [(этиламино)метил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {4-chloro-2-[(ethylamino)methyl] benzyl} -2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- [2-(аминометил)-4-хлорбензил]-2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Н-пирроло[3,2<1]пиримидин-4-она;- [2-(aminomethyl)-4-chlorobenzyl]-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4H-pyrrolo[3,2<1]pyrimidin-4-one;
- {4-хлор-2- [(метиламино)метил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {4-chloro-2-[(methylamino)methyl] benzyl} -2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
-(2- {[(циклобутилметил)амино] метил } бензил)-2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;-(2-{[(cyclobutylmethyl)amino]methyl}benzyl)-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- {2- [(циклобутиламино)метил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {2-[(cyclobutylamino)methyl]benzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- {2- [(циклопентиламино)метил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {2-[(cyclopentylamino)methyl]benzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
1-(2-{[(2-метилпропил)амино]метил}бензил)-2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;1-(2-{[(2-methylpropyl)amino]methyl}benzyl)-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- {2- [(пропан-2-иламино)метил] бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- {2-[(propan-2-ylamino)methyl] benzyl} -2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- [2-(аминометил)-4-(трифторметил)бенз ил] -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро-4Нпирроло[3,2-<1]пиримидин-4-она;- [2-(aminomethyl)-4-(trifluoromethyl)benzyl]-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro-4Hpyrrolo[3,2-<1]pyrimidin-4-one;
- {2- [(метиламино)метил] -4-(трифторметил)бензил } -2-тиоксо-1,2,3,5-тетрагидро4Н-пирроло[3,2-с1]пиримидин-4-она и их фармацевтически приемлемых солей или сольватов.- {2-[(methylamino)methyl]-4-(trifluoromethyl)benzyl}-2-thioxo-1,2,3,5-tetrahydro4H-pyrrolo[3,2-c1]pyrimidin-4-one and pharmaceutically acceptable ones thereof salts or solvates.
В случае, когда абсолютная конфигурация (R или S) одного энантиомера соединения формулы (I) указана в списке соединений формулы (I) выше, стереоцентром (хиральным центром), о котором идет речь, является атом углерода, к которому присоединен R2.In the case where the absolute configuration (R or S) of one enantiomer of a compound of formula (I) is indicated in the list of compounds of formula (I) above, the stereocenter (chiral center) in question is the carbon atom to which R 2 is attached.
Гидразид 4-аминобензойной кислоты для применения в лечении мужского бесплодия, в способах лечения мужского бесплодия, в способах изготовления лекарственного средства для лечения мужского бесплодия или в фармацевтических композициях для лечения мужского бесплодия, как описано данном документе выше, в частности, исключается из всех аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе.4-Aminobenzoic acid hydrazide for use in the treatment of male infertility, in methods of treating male infertility, in methods of making a medicament for treating male infertility, or in pharmaceutical compositions for treating male infertility, as described herein above, is specifically excluded from all aspects and embodiments described herein.
Термин фармацевтически приемлемый используется для указания того, что объект (например, соль, сольват, лекарственная форма, разбавитель или носитель) подходит для применения у пациентов. Иллюстративный перечень фармацевтически приемлемых солей можно найти в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth, editors, W einheim/Zurich: W iley-V CH/VHCA, 2002.The term pharmaceutically acceptable is used to indicate that an entity (eg, salt, solvate, dosage form, diluent, or carrier) is suitable for use in patients. An illustrative list of pharmaceutically acceptable salts can be found in the Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth, editors, W einheim/Zurich: W iley-V CH/VHCA, 2002.
Соединения и соли, описываемые в настоящем изобретении, могут существовать в сольватированных формах и несольватированных формах. Например, сольватированная форма может представлятьThe compounds and salts described in the present invention may exist in solvated forms and non-solvated forms. For example, the solvated form may be
- 4 045929 собой гидратированную форму, такую как полугидрат, моногидрат, дигидрат, тригидрат или другая степень гидратации. Настоящее изобретение охватывает все такие сольватированные и несольватированные формы ингибиторов миелопероксидазы, например соединений формулы (I).- 4 045929 is a hydrated form, such as hemihydrate, monohydrate, dihydrate, trihydrate or other degree of hydration. The present invention covers all such solvated and non-solvated forms of myeloperoxidase inhibitors, for example the compounds of formula (I).
Термин терапия предназначен для обозначения своего обычного значения, когда он касается заболевания, для полного или частичного ослабления одного, нескольких или всех его симптомов или для устранения или купирования лежащей в основе патологии. Термин терапия также включает профилактику, если нет конкретных указаний об обратном. Термины терапевтический и терапевтически должны интерпретироваться соответствующим образом.The term therapy is intended to denote its ordinary meaning as it relates to a disease, to relieve in whole or in part one, more, or all of its symptoms, or to eliminate or arrest the underlying pathology. The term therapy also includes prophylaxis unless specifically stated otherwise. The terms therapeutic and therapeutically should be interpreted accordingly.
Термин профилактика предназначен для обозначения своего обычного значения и включает первичную профилактику для предупреждения развития заболевания и вторичную профилактику, при которой заболевание уже развилось и пациента временно или постоянно защищают от обострения или усугубления заболевания или развития новых симптомов, ассоциированных с заболеванием. Пациент с выявленной склонностью к идиопатическому мужскому бесплодию и которому, следовательно, показано профилактическое лечение (т.е. пациент, нуждающийся в профилактике) в соответствии с настоящим изобретением, обычно считается пациентом, у которого выявлены повышенные уровни активных форм кислорода в образце его семенной жидкости и/или дисфункция сперматозоидов, обусловленная окислительным стрессом. В некоторых вариантах осуществления выявление склонности к идиопатическому мужскому бесплодию можно осуществлять на основе анализа комбинации факторов образа жизни, таких как курение, употребление алкоголя, вес и воздействие на яички тепла и токсинов окружающей среды.The term prophylaxis is intended to denote its usual meaning and includes primary prevention to prevent the development of a disease and secondary prevention in which the disease has already developed and the patient is temporarily or permanently protected from exacerbation or worsening of the disease or the development of new symptoms associated with the disease. A patient with an identified predisposition to idiopathic male infertility and who is therefore indicated for prophylactic treatment (i.e., a patient in need of prophylaxis) in accordance with the present invention is generally considered to be a patient who has elevated levels of reactive oxygen species in his seminal fluid sample and/or sperm dysfunction due to oxidative stress. In some embodiments, identification of susceptibility to idiopathic male infertility may be based on analysis of a combination of lifestyle factors, such as smoking, alcohol consumption, weight, and testicular exposure to heat and environmental toxins.
Термин лечение используется как синоним термина терапия. Аналогичным образом термин лечить можно рассматривать как применение терапии, где терапия определена в данном документе.The term treatment is used synonymously with the term therapy. Likewise, the term treat can be thought of as the application of a therapy, where therapy is defined herein.
Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству ингибитора миелопероксидазы, как описано в любом из вариантов осуществления в данном документе, которое является эффективным для обеспечения терапии у субъекта или для лечения заболевания или нарушения у пациента.The term "therapeutically effective amount" refers to an amount of a myeloperoxidase inhibitor, as described in any of the embodiments herein, that is effective to provide therapy in a subject or to treat a disease or disorder in a subject.
Ингибиторы миелопероксидазы и их фармацевтически приемлемые соли или сольваты можно вводить в виде фармацевтических композиций, содержащих один или несколько фармацевтически приемлемых разбавителей или носителей.Myeloperoxidase inhibitors and their pharmaceutically acceptable salts or solvates can be administered in the form of pharmaceutical compositions containing one or more pharmaceutically acceptable diluents or carriers.
Следовательно, в одном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор миелопероксидазы, например 3-[[(2R)-тетрагидрофуран-2-ил]метил]-2-тиоксо7Н-пурин-6-он, 1-(2-изопропоксиэтил)-2-тиоксо-2.3-дигидро-1Н-пирроло[3.2Л|пиримидин-4(5Н)-он или соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сольват и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель. Композиции могут находиться в форме, подходящей для перорального применения (например, в виде таблеток, пастилок, твердых или мягких желатиновых капсул, водных или масляных суспензий, эмульсий, диспергируемых порошков или гранул, сиропов или настоек), для местного применения (например, в виде кремов, мазей, гелей или водных или масляных растворов или суспензий), для введения путем ингаляции (например, в виде тонкодисперсного порошка или жидкого аэрозоля), для введения путем инсуффляции (например, в виде тонкодисперсного порошка) или для парентерального введения (например, в виде стерильного водного или масляного раствора для внутривенного, подкожного или внутримышечного введения дозы), или в виде суппозитория для ректального введения дозы. Композиции можно получать с помощью традиционных процедур с применением традиционных фармацевтических вспомогательных веществ, хорошо известных из уровня техники. Таким образом, композиции, предназначенные для перорального применения, могут содержать, например, один или несколько красителей, подсластителей, ароматизаторов и/или консервантов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ингибитор МРО подлежит пероральному введению. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления ингибитор МРО подлежит введению в форме с пролонгированным высвобождением, например пероральной форме с пролонгированным высвобождением или вводимой подкожно форме с пролонгированным высвобождением.Therefore, in one embodiment, a pharmaceutical composition is provided comprising a myeloperoxidase inhibitor, for example 3-[[(2R)-tetrahydrofuran-2-yl]methyl]-2-thioxo7H-purin-6-one, 1-(2-isopropoxyethyl)- 2-thioxo-2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3.2L|pyrimidin-4(5H)-one or a compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof and at least one pharmaceutically acceptable diluent or carrier. The compositions may be in a form suitable for oral administration (for example, tablets, lozenges, hard or soft gelatin capsules, aqueous or oily suspensions, emulsions, dispersible powders or granules, syrups or tinctures), for topical application (for example, creams, ointments, gels, or aqueous or oily solutions or suspensions), for administration by inhalation (for example, as a fine powder or liquid aerosol), for administration by insufflation (for example, as a fine powder), or for parenteral administration (for example, in as a sterile aqueous or oily solution for intravenous, subcutaneous or intramuscular dosing), or as a suppository for rectal dosing. The compositions can be prepared by conventional procedures using conventional pharmaceutical excipients well known in the art. Thus, compositions intended for oral administration may contain, for example, one or more coloring agents, sweeteners, flavoring agents and/or preservatives. In some preferred embodiments, the MPO inhibitor is orally administered. In some preferred embodiments, the MPO inhibitor is administered in a sustained release form, such as an oral sustained release form or a subcutaneously administered sustained release form.
В одном варианте осуществления предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор миелопероксидазы, например соединение формулы (I), 3-[[(2R)-тетрагидрофуран-2-ил]метил]-2тиоксо-7Н-пурин-6-он (AZD5904) или 1-(2-изопропоксиэтил)-2-тиоксо-2,3-дигидро-1Н-пирроло[3,2d]пиримидин-4(5Н)-он или его фармацевтически приемлемая соль или сольват и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель, для применения в лечении мужского бесплодия.In one embodiment, a pharmaceutical composition is provided comprising a myeloperoxidase inhibitor, for example a compound of formula (I), 3-[[(2R)-tetrahydrofuran-2-yl]methyl]-2thioxo-7H-purin-6-one (AZD5904) or 1 -(2-isopropoxyethyl)-2-thioxo-2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,2d]pyrimidin-4(5H)-one or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof and at least one pharmaceutically acceptable diluent or carrier , for use in the treatment of male infertility.
Ингибитор миелопероксидазы будут обычно вводить теплокровному животному в стандартной дозе в диапазоне 2,5-5000 мг/м2 площади тела животного или приблизительно 0,05-100 мг/кг, и данное количество обычно обеспечивает терапевтически эффективную дозу. Стандартная лекарственная форма, такая как таблетка или капсула, будет обычно содержать, например, 0,1-500 мг активного ингредиента. Суточная доза обязательно будет варьировать в зависимости от получающего лечение пациента, конкретного пути введения, каких-либо вводимых совместно терапевтических средств и тяжести заболевания, подлежащего лечению. Соответственно, практикующий врач, который лечит любого конкретного пациента, может определить оптимальную дозировку.The myeloperoxidase inhibitor will typically be administered to a warm-blooded animal at a standard dose in the range of 2.5-5000 mg/m 2 animal body area, or approximately 0.05-100 mg/kg, and this amount will generally provide a therapeutically effective dose. A unit dosage form such as a tablet or capsule will typically contain, for example, 0.1-500 mg of active ingredient. The daily dosage will necessarily vary depending on the patient being treated, the particular route of administration, any co-administered therapeutic agents and the severity of the disease being treated. Accordingly, the practitioner treating any particular patient can determine the optimal dosage.
- 5 045929- 5 045929
Чтобы проверить гипотезу о том, что ингибиторы МРО могут быть пригодны для лечения идиопатического мужского бесплодия, был проведен ряд исследований ex vivo на диагностических андрологических образцах, собранных с согласия пациентов, посещающих отделение искусственного оплодотворения (ACU) в больнице Ninewells в Данди, как описано ниже. Эксперименты проводились для оценки различных параметров подвижности и функции сперматозоидов, как описано ниже.To test the hypothesis that MPO inhibitors may be useful for the treatment of idiopathic male infertility, a series of ex vivo studies were carried out on diagnostic andrology samples collected from consenting patients attending the Assisted Fertilization Unit (ACU) at Ninewells Hospital in Dundee, as described below . Experiments were performed to evaluate various parameters of sperm motility and function as described below.
Для лучшего понимания изобретения сделана ссылка на следующие графические материалы.For a better understanding of the invention, reference is made to the following drawings.
На фиг. 1 схематически изображена роль окислительного стресса в мужском бесплодии.In fig. Figure 1 schematically depicts the role of oxidative stress in male infertility.
На фиг. 2 представлена таблица, иллюстрирующая краткое изложение исходной информации, относящейся к данным по андрологии, полученным в клинике, касающейся каждого тестируемого пациента (возраст, первичное/вторичное бесплодие и длительность бесплодия). Единицы измерения количества представляют собой миллион на мл (млн/мл), эталонными значениями согласно WHO являются: концентрация 15 млн/мл, прогрессия 32%, морфология 4%, лейкоциты 1 млн/мл.In fig. 2 is a table illustrating a summary of background information related to andrology data obtained in the clinic for each patient tested (age, primary/secondary infertility, and duration of infertility). Quantity units are million per ml (ppm), WHO reference values are: concentration 15 ppm, progression 32%, morphology 4%, leukocytes 1 ppm.
На фиг. 3а представлена столбчатая диаграмма, показывающая процентную разницу между измерениями CASA в нулевой момент времени и после 24-часовой инкубации в отношении показателей подвижности, прогрессивной подвижности, быстрой подвижности, средней скорости по траектории (VAP), прямолинейной скорости (VSL), криволинейной скорости (VCL) и бокового смещения головки (ALH) для полного набора данных (n=29). Измерения проводили в трех условиях: только сперматозоиды в качестве контроля (левая колонка, а), сперматозоиды с активированными нейтрофилами (соотношение 3:1) со средой-носителем в качестве контроля (средняя колонка, б) и сперматозоиды с активированными нейтрофилами (соотношение 3:1) плюс 3 мкМ AZD5904 (правая колонка, с). Тест Крускала-Уоллиса показывает положительную динамику для AZD5904, которая не достигает статистической значимости для каждого измеренного параметра (Р>0,1). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего значения.In fig. Figure 3a is a bar graph showing the percentage difference between CASA measurements at time zero and after 24 hours of incubation for motility, progressive motility, rapid motility, mean path velocity (VAP), straight-line velocity (VSL), and curved velocity (VCL). ) and lateral head displacement (ALH) for the full data set (n=29). Measurements were performed under three conditions: sperm alone as a control (left column, a), sperm with activated neutrophils (ratio 3:1) with vehicle as a control (middle column, b) and sperm with activated neutrophils (ratio 3: 1) plus 3 µM AZD5904 (right column, c). The Kruskal-Wallis test shows a positive trend for AZD5904, which does not reach statistical significance for each measured parameter (P>0.1). Error bars represent standard error of the mean.
На фиг. 3b представлена линейная диаграмма, показывающая абсолютное изменение общей подвижности сперматозоидов от исходного уровня до уровня после 2 и 24 ч инкубации для первых 11 субъектов (выделено синим цветом на фиг. 2), у которых наблюдались более выраженные отклонения в исходных параметрах спермы, чем у следующих 18 исследуемых субъектов. Измерения проводили в трех условиях: только сперматозоиды в качестве контроля (а), сперматозоиды с активированными нейтрофилами (соотношение 3:1) со средой-носителем в качестве контроля (б) и сперматозоиды с активированными нейтрофилами (соотношение 3:1) плюс 3 мкМ AZD5904 (с). Двусторонний t-критерий Стьюдента между AZD5904 и группами, получавшими среду-носитель, показал статистический тренд: Р=0,09.In fig. Figure 3b is a line graph showing the absolute change in total sperm motility from baseline to 2 and 24 hours of incubation for the first 11 subjects (in blue in Figure 2) who exhibited greater variations in baseline sperm parameters than the next. 18 study subjects. Measurements were performed under three conditions: sperm alone as a control (a), sperm with activated neutrophils (ratio 3:1) with vehicle as a control (b), and sperm with activated neutrophils (ratio 3:1) plus 3 μM AZD5904 (With). A two-tailed Student's t test between AZD5904 and vehicle groups showed a statistical trend: P = 0.09.
На фиг. 4 показаны кумулятивные результаты пенетрационного теста Кремера для полного набора данных (n=29) с результатами, выраженными в виде отношения к контролю (только сперматозоиды). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего значения. Анализ с использованием t-критерия Стьюдента показывает, что при 1 см в группе лечения AZD5904 было обнаружено значительно больше сперматозоидов, чем в группе, не получавшей лекарственное средство. Р=0,02.In fig. Figure 4 shows the cumulative results of the Kremer penetration test for the full data set (n=29) with the results expressed as a ratio to the control (sperm only). Error bars represent standard error of the mean. Analysis using Student's t test shows that at 1 cm, significantly more sperm were found in the AZD5904 treatment group than in the non-drug group. P=0.02.
На фиг. 5 показаны примеры данных пенетрационного теста Кремера в 2-часовой временной точке для четырех субъектов, ответивших на лечение. Данные выражены в виде отношения к контролю (только сперматозоиды). Значения над столбцами соответствуют фактическому количеству сперматозоидов при 1 см; самое верхнее число означает условие теста (среда-носитель или AZD5904), а число в скобках является контрольным количеством. Числа R вдоль оси X означают анонимные номера пациентов. Изменение, составляющее по меньшей мере 0,25, принимается как значимая разница у индивидуумов.In fig. 5 shows examples of Kremer penetration test data at the 2-hour time point for four treatment responders. Data are expressed as a ratio to control (sperm only). The values above the bars correspond to the actual sperm count at 1 cm; the topmost number indicates the test condition (vehicle or AZD5904), and the number in parentheses is the control quantity. The R numbers along the X axis represent anonymous patient numbers. A change of at least 0.25 is accepted as a significant difference between individuals.
На фиг. 6 показано среднее окрашивание MDA у 29 пациентов и в зависимости от условий обработки in vitro: только сперматозоиды (а), сперматозоиды + нейтрофилы + среда носитель в качестве контроля (b), сперматозоиды + нейтрофилы + AZD5904 (лекарственное средство) (с) и сперматозоиды + 4 мМ Н2О2 (d). Результаты для сперматозоидов с 4 мМ Н2О2 характеризовались значительно большим окрашиванием, чем в других условиях (Р<0,01). Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего значения.In fig. Figure 6 shows the average MDA staining in 29 patients and according to in vitro processing conditions: sperm only (a), sperm + neutrophils + vehicle control (b), sperm + neutrophils + AZD5904 (drug) (c) and sperm + 4 mM H 2 O 2 (d). The results for spermatozoa with 4 mM H 2 O 2 were characterized by significantly greater staining than in other conditions (P < 0.01). Error bars represent standard error of the mean.
Материалы и способыMaterials and methods
Схема эксперимента.Experimental design.
Серию из 5 тестов проводили в отношении каждого полученного образца спермы (фиг. 2). Этот подход использовали для оценки различных параметров подвижности и функции сперматозоидов. Способы валидировали до сбора данных для обеспечения надежности и повторяемости результатов.A series of 5 tests were performed on each semen sample obtained (Fig. 2). This approach has been used to evaluate various parameters of sperm motility and function. Methods were validated prior to data collection to ensure reliability and repeatability of results.
Субъекты исследования/сбор образцов.Study subjects/sample collection.
Избыточные диагностические андрологические образцы (N=29) собирали с согласия мужчин, посещающих отделение искусственного оплодотворения (ACU) в больнице Ninewells в Данди.Excess diagnostic andrology samples (N=29) were collected with consent from men attending the Assisted Fertilization Unit (ACU) at Ninewells Hospital, Dundee.
Материалы.Materials.
Среда, препятствующая капацитации (рН 7,4): 1,8 мМ CaCl2, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO4-7H2O, 116,4 NaCl, 1 мМ NaH2PO4-2H2O, 5,55 мМ D-глюкозы, 2,73 мМ пирувата натрия, 41,75 мМ лактата натрия, 25 мМ HEPES, 0,3% BSA.Anti-capacitation medium (pH 7.4): 1.8 mM CaCl 2 , 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO 4 -7H 2 O, 116.4 NaCl, 1 mM NaH 2 PO 4 -2H 2 O , 5.55 mM D-glucose, 2.73 mM sodium pyruvate, 41.75 mM sodium lactate, 25 mM HEPES, 0.3% BSA.
Среда, обеспечивающая капацитацию (рН 7,4): 1,8 мМ CaCl2, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO4-7H2O,Medium providing capacitation (pH 7.4): 1.8 mM CaCl 2 , 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO 4 -7H 2 O,
- 6 045929- 6 045929
116,4 мМ NaCl, 1 мМ NaH2PO4-2H2O, 5,55 мМ D-глюкозы, 2,73 мМ пирувата натрия, 25 мМ лактата натрия, 26 мМ бикарбоната натрия, 0,3% BSA.116.4 mM NaCl, 1 mM NaH2PO 4 -2H2O, 5.55 mM D-glucose, 2.73 mM sodium pyruvate, 25 mM sodium lactate, 26 mM sodium bicarbonate, 0.3% BSA.
sEBSS (рН 7,4): 1,01 мМ NaH2PO4, 5,4 мМ KCl, 0,8 мМ MgSO4-7H2O, 5,5 мМ С6Н12О6, 2,5 мМ пирувата натрия, 19 мМ лактата натрия, 25 мМ бикарбоната натрия, 15 мМ HEPES, 1,8 мМ CaCl2-2H2O, 118,4 мМ NaCl, 0,3% BSA.sEBSS (pH 7.4): 1.01 mM NaH 2 PO 4 , 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO 4 -7H 2 O, 5.5 mM C 6 H 12 O 6 , 2.5 mM pyruvate sodium, 19 mM sodium lactate, 25 mM sodium bicarbonate, 15 mM HEPES, 1.8 mM CaCl 2 -2H 2 O, 118.4 mM NaCl, 0.3% BSA.
Подготовка образца спермы.Preparing a sperm sample.
Образцы спермы отбирали путем мастурбации в стерильные пластиковые контейнеры после минимум 2 дней и максимум 7 дней полового воздержания. Образцы спермы получали на месте в ACU и выдерживали для обеспечения разжижения в течение 30 мин. (37°С). Перед подготовкой образца из каждого образца отбирали 20 мкл необработанной спермы и 10 мкл из этого объема использовали для получения мазков спермы на чистых предметных стеклах (исследование лейкоцитов). Для каждого образца делали два мазка, оборачивали их в фольгу и хранили в морозильной камере при -20°С до востребования. Образцы спермы затем обрабатывали центрифугированием с градиентом плотности Percoll (DGC), как описано ранее (Tardif S., Madamidola O.A., Brown S.G., Frame L., Lefievre L., Wyatt P.G., et al. Human Reproduction, 2014; 29:10, 2123-2135). Затем максимум 2 мл на градиент необработанной спермы аккуратно наслаивали сверху. Затем градиент центрифугировали при 300 g в течение 20 мин. Самый верхний слой, который содержал только сперму, собирали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл. Затем этот слой центрифугировали при 17x106xg в течение 20 мин для осаждения любых клеток и дебриса в слое спермы, чтобы производился отбор только семенной жидкости. Супернатант затем собирали и снова центрифугировали при 17000xg в течение 20 мин. Супернатант собирали и хранили в морозильной камере при -20°С до востребования. Осадок из 80% DGC-фракции собирали и промывали в 4 мл среды, препятствующей капацитации, в течение 10 мин при 300 g. Супернатант затем удаляли. Осадок собирали, ресуспендировали в 1 мл раствора sEBSS и инкубировали (37°С) для анализа функции сперматозоидов.Semen samples were collected by masturbation into sterile plastic containers after a minimum of 2 days and a maximum of 7 days of sexual abstinence. Semen samples were obtained on site in the ACU and kept for liquefaction for 30 min. (37°C). Before sample preparation, 20 μl of raw semen was collected from each sample and 10 μl of this volume was used to obtain semen smears on clean slides (leukocyte examination). For each sample, two swabs were made, wrapped in foil and stored in a freezer at -20°C until required. Sperm samples were then processed by Percoll density gradient centrifugation (DGC) as previously described (Tardif S, Madamidola OA, Brown SG, Frame L, Lefievre L, Wyatt PG, et al. Human Reproduction, 2014; 29:10, 2123-2135). A maximum of 2 ml of untreated sperm gradient was then carefully layered on top. The gradient was then centrifuged at 300 g for 20 min. The topmost layer, which contained only sperm, was collected in a 1.5 ml Eppendorf tube. This layer was then centrifuged at 17 x 10 6 xg for 20 min to sediment any cells and debris in the sperm layer so that only seminal fluid was sampled. The supernatant was then collected and centrifuged again at 17,000xg for 20 min. The supernatant was collected and stored in a freezer at -20°C until required. The precipitate from the 80% DGC fraction was collected and washed in 4 ml of anticapacitation medium for 10 min at 300 g. The supernatant was then removed. The pellet was collected, resuspended in 1 ml sEBSS solution and incubated (37°C) for sperm function analysis.
Изоляция нейтрофилов.Isolation of neutrophils.
Образцы крови отбирали у добровольных доноров в вакутейнер, содержащий EDTA, чтобы остановить свертывание (Zambrano F., Carrau T., Garner U., Seipp A., Taubert A., Felmer R., et al. Fertility and Sterility, 2016; 106(5):1053-1060). Кровь смешивали с Histopaque 1119 (Sigma, Великобритания) в соотношении 1:1,2 в 15 мл пробирках фирмы Falcon (Zambrano et al., 2016.). Затем смесь центрифугировали при 800 g в течение 20 мин. После этого супернатант удаляли и осадок переносили в новую пробирку фирмы Falcon. Затем данную пробирку заполняли до 15 мл фосфатно-солевым буфером (PBS) и центрифугировали при 300xg в течение 10 мин. Градиенты Percoll получали путем добавления сначала 2 мл 10Х PBS к 18 мл Percoll для создания 100% исходного раствора. Затем его разбавляли 1XPBS, чтобы получить пять 4 мл исходных растворов градиентаBlood samples were collected from voluntary donors into a vacutainer containing EDTA to stop clotting (Zambrano F., Carrau T., Garner U., Seipp A., Taubert A., Felmer R., et al. Fertility and Sterility, 2016; 106 (5):1053-1060). Blood was mixed with Histopaque 1119 (Sigma, UK) in a ratio of 1:1.2 in 15 ml Falcon tubes (Zambrano et al., 2016.). Then the mixture was centrifuged at 800 g for 20 minutes. After this, the supernatant was removed and the sediment was transferred to a new Falcon tube. This tube was then filled to 15 ml with phosphate-buffered saline (PBS) and centrifuged at 300xg for 10 min. Percoll gradients were prepared by first adding 2 mL of 10X PBS to 18 mL of Percoll to create a 100% stock solution. It was then diluted with 1XPBS to obtain five 4 mL gradient stock solutions
Percoll в концентрациях 65, 70, 75, 80 и 85%. Далее 2 мл каждой градиентной концентрации наслаивали поверх другой в 15 мл пробирку фирмы Falcon, при этом концентрация 85% находилась на дне пробирки, а концентрация 65% находилась наверху. После 10-минутного центрифугирования супернатант снова удаляли и осадок ресуспендировали до 4 мл с помощью PBS. Затем 2 мл крови аккуратно наслаивали на градиенты плотности и центрифугировали при 800 g в течение 20 мин. Самый верхний слой удаляли, а слои с концентрациями 70-80% собирали и переносили в новую пробирку фирмы Falcon. Затем пробирку заполняли до 15 мл с помощью PBS и центрифугировали в течение 10 мин при 300 g. Супернатант удаляли, и осадок собирали и промывали в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Эту стадию повторяли до исчезновения красного цвета осадка, при этом супернатант каждый раз удаляли. Наконец, осадок ресуспендировали в 1 мл sEBSS и помещали в инкубатор при 37°С.Percoll in concentrations of 65, 70, 75, 80 and 85%. Next, 2 ml of each gradient concentration was layered on top of the other in a 15 ml Falcon tube, with the 85% concentration at the bottom of the tube and the 65% concentration at the top. After 10 min of centrifugation, the supernatant was again removed and the pellet was resuspended to 4 ml with PBS. Then 2 ml of blood were carefully layered onto density gradients and centrifuged at 800 g for 20 min. The topmost layer was removed, and layers with concentrations of 70-80% were collected and transferred to a new Falcon tube. The tube was then filled to 15 ml with PBS and centrifuged for 10 min at 300 g. The supernatant was removed, and the pellet was collected and washed in 2 ml of red blood cell lysis buffer. This step was repeated until the red color of the precipitate disappeared, and the supernatant was removed each time. Finally, the pellet was resuspended in 1 ml sEBSS and placed in an incubator at 37°C.
Обработка сперматозоидов AZD5904 или средой-носителем 10 мМ исходный раствор лекарственного средства получали в 100% DMSO. Затем его серийно разбавляли до рабочей концентрации в 3 мкМ, используя sEBSS в качестве разбавителя, и хранили при 4°С. Затем к нейтрофилам добавляли лекарственное средство или среду-носитель и помещали на водяную баню при 37°С на 10 мин. Затем нейтрофилы добавляли к сперматозоидам в безопасных для спермы 5 мл полистирольных круглодонных пробирках (Falcon) в соотношении примерно 1:3. Зимозан в конечной концентрации 1 мкг/мл добавляли для активации нейтрофилов и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Четыре варианта условий были получены для проведения оценки подвижности, проточной цитометрии и тестов Кремера: только сперматозоиды, сперматозоиды + нейтрофилы + среда-носитель, сперматозоиды + нейтрофилы + AZD5904 (лекарственное средство) и сперматозоиды + 4 мМ (конечная концентрация) перекись водорода (Н2О2; положительный контроль повреждений).Treatment of sperm with AZD5904 or vehicle 10 mM drug stock solution was prepared in 100% DMSO. It was then serially diluted to a working concentration of 3 μM using sEBSS as a diluent and stored at 4°C. Drug or vehicle media were then added to the neutrophils and placed in a water bath at 37°C for 10 min. Neutrophils were then added to the sperm in sperm-safe 5 ml polystyrene round-bottom tubes (Falcon) in a ratio of approximately 1:3. Zymosan at a final concentration of 1 μg/ml was added to activate neutrophils and incubated for 2 h at 37°C. Four conditions were generated for motility assessment, flow cytometry, and Kremer tests: sperm only, sperm + neutrophils + vehicle, sperm + neutrophils + AZD5904 (drug), and sperm + 4 mM (final concentration) hydrogen peroxide (H2O2; positive damage control).
Оценка подвижности.Mobility assessment.
Подвижность сперматозоидов оценивали с использованием системы Hamilton-Thorn CASA. Для каждого условия проводили подсчет в общей сложности 200 клеток как минимум при четырех разных полях зрения. Если образец характеризовался очень низкой подвижностью, подсчитывали по меньшей мере 100 клеток. Параметры подвижности оценивали в начале совместной инкубации с нейтрофилами (нулевой момент времени), через 2 ч и через 24 ч. Подвижность выражали в процентной разнице между нулевым моментом времени и через 2 ч и процентной разнице между нулевым моментом времени и чеSperm motility was assessed using the Hamilton-Thorn CASA system. For each condition, a total of 200 cells were counted under at least four different fields of view. If a sample had very low motility, at least 100 cells were counted. Motility parameters were assessed at the beginning of co-incubation with neutrophils (time zero), after 2 hours and after 24 hours. Motility was expressed as the percentage difference between time zero and after 2 hours and the percentage difference between time zero and
- 7 045929 рез 24 ч для каждой временной точки для каждого образца.- 7 045929 res 24 h for each time point for each sample.
Пенетрационный тест Кремера.Kremer penetration test.
Пенетрационный тест Кремера оценивает способность сперматозоидов проникать и плыть через вязкие среды. Этот тест также известен как тест на проникновение сперматозоидов в цервикальную слизь. Заменитель цервикальной слизи получали с использованием 1% метилцеллюлозы, растворенной в среде, обеспечивающей капацитацию. Раствор насыщали газом в инкубаторе с 5% СО2 при 37°С в течение 20 мин. Затем плоские капиллярные трубки (Rectangle Boro Tubing, CM Scientific) помещали в раствор метилцеллюлозы на дополнительные 20 мин с обеспечением подъема среды вверх по капиллярным трубкам. После 2-часовой инкубации аликвоты объемом 100 мкл, отобранные для каждого варианта условий, помещали в свежую пробирку, безопасную для сперматозоидов. Один конец каждой пробирки затем блокировали с помощью пластилина, а затем одну пробирку помещали открытым концом в образец каждого из вариантов условий. Каждую пробирку, безопасную для сперматозоидов, содержащую капиллярную трубку, инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 5% СО2. Через 1 ч капиллярные трубки удаляли и количество клеток на отметке 1 см подсчитывали вручную. Результаты выражали в виде отношения к контролю (только сперматозоидам).The Kremer Penetration Test evaluates the ability of sperm to penetrate and swim through viscous media. This test is also known as the cervical mucus penetration test. Cervical mucus substitute was prepared using 1% methylcellulose dissolved in capacitation medium. The solution was saturated with gas in an incubator with 5% CO 2 at 37°C for 20 minutes. Flat capillary tubes (Rectangle Boro Tubing, CM Scientific) were then placed in the methylcellulose solution for an additional 20 min, allowing the medium to rise up the capillary tubes. After a 2-hour incubation, 100-μL aliquots of each condition were placed into a fresh sperm-safe tube. One end of each tube was then blocked with plasticine, and then one tube was placed open end into a sample of each condition. Each sperm-safe tube containing a capillary tube was incubated for 1 hour at 37°C with 5% CO 2 . After 1 h, the capillary tubes were removed and the number of cells at the 1 cm mark was counted manually. The results were expressed as a ratio to the control (sperm only).
Проточная цитометрия.Flow cytometry.
После 2-часовой инкубации с активированными нейтрофилами отбирали аликвоты по 50 мкл из всех 4 вариантов условий и переносили в пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл. Н2О2 использовали в качестве положительного контроля. Дополнительную аликвоту для единичного вторичного контроля отбирали из пробирки с вариантом, соответствующим только сперматозоидам. Клетки (кроме пробирки с единичным вторичным контролем) инкубировали в течение 0,5 ч при 37°С с антителом к малоновому диальдегиду (MDA) (ab27642, abcam, Кембридж) в рабочем соотношении 1:50. (Moazamian R., Polhemus A., Connaughton H., Fraser В., Whiting S., Gharagozloo P., Aitken R.J. Mol. Hum. Reprod. 2015; 21(6):502-15). Затем пробирки центрифугировали при 300 g в течение 5 мин для осаждения клеток и удаляли супернатант. Затем клетки дважды промывали sEBSS и каждый раз удаляли супернатант. Затем ко всем вариантам условий добавляли флуоресцентно меченые вторичные антитела козы к иммуноглобулину кролика (Thermofisher, Великобритания) в соотношении 1:50 и пробирки инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Клетки осаждали и дважды промывали, как описано выше. После последней промывки осадки ресуспендировали в 250 мкл раствора sEBSS и переносили в новые пробирки, безопасные для сперматозоидов. Затем оценивали уровень окрашивания MDA при каждом условии в 10000 клеток с использованием предварительно валидированной программы проточной цитометрии в анализаторе клеток BD LSRFortessa. Ввиду технической ошибки один образец не был оценен с помощью проточной цитометрии.After a 2-hour incubation with activated neutrophils, 50 μl aliquots were taken from all 4 conditions and transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes. H 2 O 2 was used as a positive control. An additional aliquot for a single secondary control was taken from a tube containing the sperm-only option. Cells (except the single secondary control tube) were incubated for 0.5 h at 37°C with anti-malondialdehyde (MDA) antibody (ab27642, abcam, Cambridge) at a working ratio of 1:50. (Moazamian R, Polhemus A, Connaughton H, Fraser B, Whiting S, Gharagozloo P, Aitken RJ Mol. Hum. Reprod. 2015; 21(6):502-15). The tubes were then centrifuged at 300 g for 5 min to pellet the cells, and the supernatant was removed. The cells were then washed twice with sEBSS and the supernatant was removed each time. Then fluorescently labeled secondary goat anti-rabbit immunoglobulin antibodies (Thermofisher, UK) were added to all conditions in a ratio of 1:50 and the tubes were incubated for 10 min at 37°C. Cells were pelleted and washed twice as described above. After the final wash, the pellets were resuspended in 250 μL sEBSS solution and transferred to new sperm-safe tubes. The level of MDA staining under each condition was then assessed in 10,000 cells using a pre-validated flow cytometry program on a BD LSRFortessa Cell Analyzer. Due to a technical error, one sample was not assessed by flow cytometry.
Подсчет лейкоцитов.Leukocyte count.
Предметные стекла с мазками спермы вынимали из морозильной камеры и помещали в сосуды Коплина, заполненные раствором Гимзы-Май-Грюнвальда (разбавленный 1:20 в дистиллированной воде), на 5 мин. Затем предметные стекла промывали в PBS в течение 1,5 мин. Затем предметные стекла помещали в свежий раствор Гимзы-Май-Грюнвальда на 20 мин, затем промывали дистиллированной водой. Стеклам давали высохнуть на воздухе, прежде чем начинали осуществление подсчета. Регистрировали среднее количество для двух мазков на образец. Подсчет количества лейкоцитов производили в той же области, в которой регистрировали 400 сперматозоидов, и рассчитали концентрацию лейкоцитов в образце с использованием концентрации сперматозоидов в соответствии с рекомендованными WHO способами от 2010 года.(Cooper T.G., Noonan E., von Eckardstein S., Augur J., Baker H.W.G., Behre H.M., et al. Human Reproduction Update, 2010; 16(3):231-245).Slides containing sperm smears were removed from the freezer and placed in Coplin flasks filled with Giemsa-May-Grunwald solution (diluted 1:20 in distilled water) for 5 min. The slides were then washed in PBS for 1.5 min. The slides were then placed in fresh Giemsa-May-Grunwald solution for 20 min and then rinsed with distilled water. The slides were allowed to air dry before counting began. The average number of two swabs per sample was recorded. A white blood cell count was performed in the same area in which 400 sperm were recorded, and the white blood cell concentration in the sample was calculated using the sperm concentration according to the 2010 WHO recommended methods (Cooper T.G., Noonan E., von Eckardstein S., Augur J. ., Baker H. W. G., Behre H. M., et al. Human Reproduction Update, 2010; 16(3):231-245).
Результатыresults
Персональные данные пациентов.Personal data of patients.
В таблице на фиг. 2 представлено краткое описание исходной информации, относящейся к данным по андрологии, полученным в клинике, касающейся каждого тестируемого пациента (возраст, первичное/вторичное бесплодие и длительность бесплодия). Также записали параметры необработанных и обработанных сперматозоидов, а также количества лейкоцитов.In the table in Fig. 2 provides a brief description of background information related to andrology data obtained at the clinic for each patient tested (age, primary/secondary infertility, and duration of infertility). The parameters of untreated and treated spermatozoa, as well as the number of leukocytes, were also recorded.
Более подробно, в таблице указаны возраст, продолжительность времени, в течение которого пара пыталась зачать (продолжительность бесплодия), и состояние бесплодия пациента (первичное или вторичное). Параметры спермы измеряли до (необработанная) и после (обработанная) центрифугирования в градиенте плотности с использованием системы Hamilton-Thorne CASA, за исключением подсчета, производимого в отношении необработанной спермы, которую оценивал андролог вручную в соответствии с руководством WHO (World Health Organization. (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. Geneva : World Health Organization). Красный текст относится к любому образцу с параметрами ниже нормальных согласно WHO 2010 г. Количество лейкоцитов относится к концентрации лейкоцитов, обнаруженных в образце необработанной спермы. Номера R относятся к анонимным номерам пациентов.In more detail, the table shows age, length of time the couple has been trying to conceive (duration of infertility), and the patient's infertility status (primary or secondary). Sperm parameters were measured before (untreated) and after (treated) density gradient centrifugation using the Hamilton-Thorne CASA system, with the exception of counts performed on untreated sperm, which were manually assessed by an andrologist according to WHO guidelines (World Health Organization. (2010). WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen, 5th ed. Geneva: World Health Organization). Red text refers to any sample with parameters below the normal values according to WHO 2010. White blood cell count refers to the concentration of white blood cells found in the unprocessed semen sample. R numbers refer to anonymous patient numbers.
Оценка подвижности.Mobility assessment.
- 8 045929- 8 045929
Образцы спермы собирали у пациентов в день их андрологических исследований и записывали параметры подвижности. Каждый образец измеряли в трех условиях тестирования в течение 24 часов: только сперматозоиды, сперматозоиды с нейтрофилами в соотношении 3:1 плюс среда-носитель в качестве контроля и сперматозоиды с нейтрофилами в соотношении 3:1 плюс 3 мкМ AZD5904. Подвижность измеряли в нулевой момент времени, через 2 ч инкубации и через 24 ч. На фиг. 3 а представлены показатели процентной разницы между параметрами спермы в нулевой момент времени и после 24-часовой инкубации. Тест Крускала-Уоллиса показал, что наблюдался незначительный тренд к увеличению значения полезного относительного эффекта приблизительно на 30% при обработке AZD5904 в отношении снижения нарушения общей подвижности сперматозоидов (р>0,01 для каждого измеренного параметра). Чтобы визуализировать различия в подвижности с течением времени, данные для общей подвижности, быстрой и прогрессивной подвижностей также наносили в виде линейных графиков для первых 11 изученных субъектов, у которых были более выраженные отклонения в исходных параметрах спермы. На фиг. 3b показаны различия с течением времени в отношении показателей подвижности, определенных у испытуемых пациентов (N=11).Semen samples were collected from patients on the day of their andrology examinations and motility parameters were recorded. Each sample was measured under three test conditions over 24 hours: sperm alone, 3:1 sperm plus neutrophils plus vehicle control, and 3:1 sperm plus neutrophils plus 3 µM AZD5904. Motility was measured at time zero, after 2 hours of incubation and after 24 hours. In FIG. Figure 3a shows the percentage difference between sperm parameters at time zero and after 24-hour incubation. The Kruskal-Wallis test showed that there was a non-significant trend towards an increase in the beneficial relative effect value of approximately 30% with AZD5904 treatment in reducing impairment of overall sperm motility (p>0.01 for each parameter measured). To visualize differences in motility over time, data for total motility, rapid motility, and progressive motility were also plotted as line graphs for the first 11 subjects studied who had greater variations in baseline semen parameters. In fig. Figure 3b shows differences over time in mobility scores measured in test patients (N=11).
Пенетрационный тест Кремера.Kremer penetration test.
Образец сперматозоидов от каждого субъекта исследования также оценивали в отношении способности проникать в вязкие среды с использованием пенетрационного теста Кремера (N=29). На фиг. 4 показаны средние для когорты результаты в отношении сперматозоидов с активированными нейтрофилами плюс среда-носитель и сперматозоидов с активированными нейтрофилами плюс AZD5904. Результаты показали улучшение проникновения сперматозоидов через вязкую среду для образцов, обработанных AZD5904, по сравнению с контролем со средой-носителем. Анализ с использованием t-критерия Стьюдента показывает, что при 1 см в группе лечения лекарственным средством было обнаружено значительно больше сперматозоидов, чем в группе не получавшей лекарственное средство (р=0,02). Наблюдались различия в индивидуальном ответе на лечение AZD5904, при этом 15 из 29 субъектов демонстрировали рассматриваемые как клинически значимые улучшения в отношении показателя проникновения сперматозоидов после AZD5904. Четыре примера субъектов, ответивших на лечение AZD5904, показаны на фиг. 5.A sperm sample from each study subject was also assessed for ability to penetrate viscous media using the Kremer penetration test (N=29). In fig. Table 4 shows cohort average results for neutrophil-activated sperm plus vehicle and neutrophil-activated sperm plus AZD5904. Results showed improved sperm penetration through viscous media for samples treated with AZD5904 compared to vehicle controls. Analysis using Student's t test shows that at 1 cm, significantly more sperm were found in the drug-treated group than in the non-drug group (p=0.02). Variation in individual response to AZD5904 treatment was observed, with 15 of 29 subjects demonstrating clinically significant improvements in sperm penetration rates following AZD5904. Four examples of subjects who responded to treatment with AZD5904 are shown in FIG. 5.
Проточная цитометрия.Flow cytometry.
После 2-часовой инкубации уровни MDA измеряли с помощью проточной цитометрии (N=29). Четыре варианта условий измеряли после 2-часовой инкубации: только сперматозоиды (контроль), сперматозоиды с нейтрофилами в соотношении 3: 1 плюс среда-носитель в качестве контроля, сперматозоиды с нейтрофилами в соотношении 3:1 плюс 3 мкМ AZD5904 (лекарственное средство) и сперматозоиды с 4 мМ Н2О2. На фиг. 6 показано среднее окрашивание MDA для всех 4 условий. Односторонний анализ ANOVA показал, что сперматозоиды с 4 мМ Н2О2 окрашивались значительно интенсивнее, чем в других тестируемых условиях (Р<0,01).After 2-hour incubation, MDA levels were measured by flow cytometry (N=29). Four conditions were measured after a 2-hour incubation: sperm alone (control), sperm plus neutrophils 3:1 plus vehicle control, sperm plus neutrophils 3:1 plus 3 µM AZD5904 (drug) and sperm with 4 mM H 2 O 2 . In fig. Figure 6 shows the average MDA staining for all 4 conditions. One-way ANOVA analysis showed that spermatozoa with 4 mM H 2 O 2 were significantly more intensely stained than in other tested conditions (P < 0.01).
Анализ результатов.Analysis of results.
AZD5904 был выбран в качестве репрезентативного ингибитора МРО ввиду его обширного предварительного клинического профилирования у человека и наблюдаемого при этом хорошего профиля безопасности. Ожидается, что результаты, полученные с использованием данного репрезентативного ингибитора МРО, будут также получены с использованием сильнодействующих селективных ингибиторов МРО, таких как без ограничения соединения, описанные в WO 2006/062465 А1 (который раскрывает 1 -(2-изопропоксиэтил)-2-тиоксо-2,3-дигндро-Ш-пнрроло [3,2^]пиримидин-4(5Н)-он (также известный как AZD3241), WO 2008/152420 А1 и/или WO 2016/087338 А1 (который описывает соединения формулы (I), раскрытые, в частности, в настоящем документе).AZD5904 was selected as a representative MPO inhibitor due to its extensive preliminary clinical profiling in humans and its observed good safety profile. It is expected that the results obtained using this representative MPO inhibitor will also be obtained using potent selective MPO inhibitors, such as, but not limited to, the compounds described in WO 2006/062465 A1 (which discloses 1-(2-isopropoxyethyl)-2-thioxo -2,3-digndro-III-pnrrolo[3,2^]pyrimidin-4(5H)-one (also known as AZD3241), WO 2008/152420 A1 and/or WO 2016/087338 A1 (which describes compounds of formula ( I) disclosed in particular herein).
Более подробно, AZD5904 является эффективным (IC50 140 нМ) необратимым ингибитором МРО человека с аналогичной эффективностью у мышей и крыс. Он является в 10-19 раз более селективным по сравнению с близкородственными лактопероксидазой и пероксидазой щитовидной железы; в >70 раз в отношении широкого спектра других ферментов, ионных каналов и рецепторов. В изолированных нейтрофилах человека 1 мкМ данного соединения подавлял РМА-стимулированную выработку HOCl на >90%. У крыс концентрация в плазме крови, составляющая ~5 мкМ, снижала образование in vivo глутатионсульфонамида (продукта реакции HOCl с глутатионом) в активированных зимозаном in situ нейтрофилах брюшины. AZD5904 вводили перорально здоровым добровольцам в однократных дозах до 1200 мг (1400 мг для состава с пролонгированным высвобождением, ER) и в многократных дозах до 325 мг TID (600 мг BID в течение 10 дней для состава с ER). В общей сложности 181 субъекту вводили дозы в пяти исследованиях фазы 1. Никаких явных побочных эффектов, связанных с лекарственным средством, пока не выявлено.In more detail, AZD5904 is a potent (IC 50 140 nM) irreversible inhibitor of human MPO with similar efficacy in mice and rats. It is 10-19 times more selective compared to the closely related lactoperoxidase and thyroid peroxidase; >70-fold with respect to a wide range of other enzymes, ion channels and receptors. In isolated human neutrophils, 1 μM of this compound suppressed PMA-stimulated HOCl production by >90%. In rats, a plasma concentration of ~5 μM reduced the in vivo formation of glutathione sulfonamide (a product of the reaction of HOCl with glutathione) in peritoneal neutrophils activated in situ by zymosan. AZD5904 was administered orally to healthy volunteers in single doses up to 1200 mg (1400 mg for the extended-release formulation, ER) and in multiple doses up to 325 mg TID (600 mg BID over 10 days for the ER formulation). A total of 181 subjects were dosed in five phase 1 studies. No apparent drug-related side effects have yet been identified.
Результаты, полученные в тестах, описанных в настоящем документе, связанные с активностью ингибитора МРО в отношении свойств сперматозоидов, которые представлены на прилагаемых фигурах, иллюстрируют эффекты репрезентативного ингибитора МРО (AZD5904) в отношении сперматозоидов, полученных от пациентов, страдающих идиопатическим мужским бесплодием. В общей сложности были протестированы образцы спермы от 29 пациентов. Несмотря на то, что отдельные результаты показали степень изменчивости, в совокупности, и несмотря на небольшой размер выборки (пилотное исследоваThe results obtained in the tests described herein related to the activity of the MPO inhibitor on sperm properties, which are presented in the accompanying figures, illustrate the effects of a representative MPO inhibitor (AZD5904) on sperm obtained from patients suffering from idiopathic male infertility. In total, sperm samples from 29 patients were tested. Although individual results showed a degree of variability, taken together and despite the small sample size (pilot study
- 9 045929 ние), данные показывают положительный тренд к улучшению общей подвижности сперматозоидов через 24 ч после введения AZD5904 для совместной инкубации сперматозоидов человека с активированными нейтрофилами человека относительно среды-носителя.- 9 045929 nie), data show a positive trend towards improvement in overall sperm motility 24 hours after administration of AZD5904 for co-incubation of human spermatozoa with activated human neutrophils relative to the carrier medium.
Пенетрационный тест Кремера является особенно применимым тестом для оценки влияния лекарственного средства на подвижность сперматозоидов. Это объясняется тем, что он оценивает способность сперматозоидов проникать и плыть через среды с вязкостью, аналогичной вязкости, обнаруживаемой в женском тракте, через который сперматозоиды естественным образом проплывают in vivo (Ivic A., Onyeaka H., Girling A., Brewis I.A., Ola В., Hammadieh H. et al. Human Reproduction, 2002; 17(1):143-149). Тест на проникновение сперматозоидов дает объективную, количественную и воспроизводимую информацию о функциональном состоянии сперматозоидов и, как было показано, является ценным маркером фертильности, особенно при мужском факторе бесплодия (см. Eggert-Krause W., Gerhard I., Tilgen W., Runnebaum B. Fertil Steril, 1989; 52:1032-1040; Eggert-Krause W., Leinhos G., Gerhard I., Tilgen W., Runnebaum B. Fertil Steril, 1989; 51:317-323; Polansky F.F. and Lamb E.J. Fertil Steril, 1989; 51(2):215-28; Ola B., Afnan M., Papaioannou S., Sharif K., Bjorndahl L., Coomarasamy A. Hum Reprod, 2003; 18(5):103746). Было показано, что заменитель цервикальной слизи, который применяли в исследовании и созданный с использованием метилцеллюлозы и сред, обеспечивающих капацитацию, является подходящим заменителем цервикальной слизи человека (Ivic et al., 2002; Tang S., Garrett C., Baker H.W. Human Reprod 1999; 14(11):2812-7). Результаты этого предварительного исследования показали, что после 2-часовой обработки спермы, совместно инкубированной с активированными нейтрофилами, было получено статистически значимое улучшение проникновения сперматозоидов при обработке AZD5904 по сравнению со средой-носителем (р=0,02). На уровне индивидуальных субъектов AZD5904 оказывал клинически значимый положительный эффект чуть более чем у 50% протестированных пациентов (15 пациентов, ответивших на лечение, из 29 обследованных пациентов), в то время как еще у 8 пациентов наблюдалось меньшее улучшение. Были предприняты попытки определить фенотипические или демографические факторы, которые были связаны с положительным ответом на лечение AZD5904, но размер выборки был слишком мал, чтобы осуществить это. Дальнейшая работа с большим количеством субъектов продолжается.The Kremer penetration test is a particularly useful test for assessing the effect of a drug on sperm motility. This is because it assesses the ability of sperm to penetrate and swim through media with a viscosity similar to that found in the female tract through which sperm naturally swim in vivo (Ivic A., Onyeaka H., Girling A., Brewis I.A., Ola V., Hammadieh H. et al. Human Reproduction, 2002; 17(1):143-149). The sperm penetration test provides objective, quantitative and reproducible information about the functional status of sperm and has been shown to be a valuable marker of fertility, especially in male factor infertility (see Eggert-Krause W., Gerhard I., Tilgen W., Runnebaum B. Fertil Steril, 1989;52:1032-1040;Eggert-Krause W., Leinhos G., Gerhard I., Tilgen W., Runnebaum B. Fertil Steril, 1989;51:317-323;Polansky F.F. and Lamb E.J. Fertil Steril 1989;51(2):215-28; Ola B, Afnan M, Papaioannou S, Sharif K, Bjorndahl L, Coomarasamy A. Hum Reprod 2003;18(5):103746). The cervical mucus substitute used in the study, which was formulated using methylcellulose and capacitation media, has been shown to be a suitable substitute for human cervical mucus (Ivic et al., 2002; Tang S., Garrett C., Baker H.W. Human Reprod 1999 ; 14(11):2812-7). The results of this preliminary study showed that after 2 hours of treatment with sperm co-incubated with activated neutrophils, there was a statistically significant improvement in sperm penetration when treated with AZD5904 compared to vehicle (p=0.02). At the individual subject level, AZD5904 had a clinically significant benefit in just over 50% of patients tested (15 responders out of 29 patients tested), while an additional 8 patients showed less improvement. Attempts were made to identify phenotypic or demographic factors that were associated with positive response to AZD5904 treatment, but the sample size was too small to accomplish this. Further work with a larger number of subjects continues.
Хотя точный механизм действия, с помощью которого ингибирование МРО обеспечивает улучшение свойств сперматозоидов, еще предстоит установить, различия в тестах на подвижность становились более очевидными после 24-часовой инкубации.Although the exact mechanism of action by which MPO inhibition provides improved sperm properties remains to be determined, differences in motility tests became more apparent after 24-hour incubation.
Подводя итог, можно сказать, что результаты предварительного исследования потенциала ингибиторов МРО для лечения идиопатического мужского бесплодия, раскрытых выше, показывают, что обработка сперматозоидов человека in vitro ингибитором МРО связана с сильной тенденцией к проявлению положительного эффекта защиты сперматозоидов от повреждения, опосредованного нейтрофилами, в отношении улучшения общей подвижности сперматозоидов через 24 ч и показателя проникновения сперматозоидов через всего 2 ч. У 15 из 29 субъектов улучшение в пенетрационном тесте Кремера было признано клинически важным, и общее лечение ингибитором МРО привело к статистически значимому улучшению показателя проникновения сперматозоидов в тесте Кремера. Эти результаты убедительно подтверждают предположение, что ингибиторы МРО, как, например, AZD5904, могут быть пригодны для лечения идиопатического мужского бесплодия. Расширенные исследования для подтверждения результатов, полученных в этих первоначальных исследованиях, продолжаются.In summary, the results of the preliminary study on the potential of MPO inhibitors for the treatment of idiopathic male infertility disclosed above indicate that in vitro treatment of human spermatozoa with an MPO inhibitor is associated with a strong tendency to exhibit a positive effect of protecting spermatozoa from neutrophil-mediated damage in relation to improvements in overall sperm motility after 24 hours and sperm penetration after just 2 hours. In 15 of 29 subjects, the improvement in the Kremer penetration test was considered clinically important, and overall treatment with an MPO inhibitor resulted in a statistically significant improvement in the Kremer penetration test. These results strongly support the idea that MPO inhibitors, such as AZD5904, may be useful for the treatment of idiopathic male infertility. Extended studies to confirm the results obtained in these initial studies are ongoing.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/533,448 | 2017-07-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045929B1 true EA045929B1 (en) | 2024-01-18 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11738027B2 (en) | MPO inhibitors for use in medicine | |
| EP1196153B1 (en) | Process for the improvement of spermatozoa fertilization activity | |
| Yang et al. | Epigallocatechin-3-gallate ameliorates hyperglycemia-induced embryonic vasculopathy and malformation by inhibition of Foxo3a activation | |
| Li et al. | The association between serum uric acid and glaucoma severity in primary angle closure glaucoma: a retrospective case-control study | |
| Osborne et al. | Induction of apoptosis in cultured human retinal pigment epithelial cells is counteracted by flupirtine. | |
| Lim et al. | Schirmer tear test values and tear film break‐up times in cats with conjunctivitis | |
| EA045929B1 (en) | MPO INHIBITORS FOR MEDICAL USE | |
| NZ761505B2 (en) | Mpo inhibitors for use in medicine | |
| Marín et al. | Assessment of the Fournier's Gangrene Severity Index Score with 34 patients | |
| Gupta et al. | Antioxidants and female reproductive pathologies | |
| Francavilla et al. | Relationship between acrosome reactions and hamster egg penetration after ionophore challenge in absence of teratozoospermia | |
| Evgeni et al. | Sperm Motility | |
| Jawaa et al. | Serum claudin-5 level as a predictor of changes in the microvascular endothelium in young women with polycystic ovary syndrome | |
| Al Gharyani et al. | Clinical Characteristics and Mortality of Intensive Care Patients With Intracerebral Hemorrhage and COVID-19: A Retrospective Cohort Analysis | |
| Emorinken et al. | Unmasking a Hidden Culprit: Neurocysticercosis, an Overlooked Cause of Acquired Epilepsy | |
| Allen | Skeletal Muscle Mitochondria-Endoplasmic Reticulum Contacts (Mercs): Impact of Aging and Exercise | |
| Bennett | Current Research About Senotherapeutics | |
| McCormick | The effect of acute aerobic exercise and rapamycin treatment on autophagy and the heat shock response in peripheral blood mononuclear cells of prediabetics | |
| JP2024533116A (en) | Methods for Treating Autism Spectrum Disorders | |
| More et al. | Cytogenetic study in females with secondary infertility | |
| Peixin et al. | Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) ameliorates hyperglycemia-induced embryonic vasculopathy and malformation by inhibition of Foxo3a activation | |
| Bragina | ULTRASTRUCTURAL SPERM FEATURES AS THE REASON OF ASSISTED REPRODUCTION TECHNOLOGY FAILURE. | |
| Belloc et al. | IS HMS (HIGH MAGNIFICATION SPERM SELECTION) SUFFICIENT TO COUNSEL PATIENTS TOWARD IMSI? | |
| Aștefanei et al. | ORAL PRESENTATIONS: INTERNAL MEDICINE SESSION | |
| Rabbani et al. | OriginalArticle Role of Pioglitazone with Metformin or Glimepiride on Oxidative Stress-induced Nuclear Damage and Reproductive Toxicity in Diabetic Rats |