EA045888B1 - USE OF BIOMARKERS IN IDENTIFYING PATIENTS WITH CANCER WHO WILL BE CHARACTERIZED BY THE PRESENCE OF SUSPECTIVE TREATMENT WITH A PRMT5 INHIBITOR - Google Patents

USE OF BIOMARKERS IN IDENTIFYING PATIENTS WITH CANCER WHO WILL BE CHARACTERIZED BY THE PRESENCE OF SUSPECTIVE TREATMENT WITH A PRMT5 INHIBITOR Download PDF

Info

Publication number
EA045888B1
EA045888B1 EA201992026 EA045888B1 EA 045888 B1 EA045888 B1 EA 045888B1 EA 201992026 EA201992026 EA 201992026 EA 045888 B1 EA045888 B1 EA 045888B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cancer
prmt5
cell
mmol
sequencing
Prior art date
Application number
EA201992026
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Дирк Бремер
Лейс Беке
Дана Сьюзанн Гаффни
Кристофер Х Мой
Original Assignee
Янссен Фармацевтика Нв
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Фармацевтика Нв filed Critical Янссен Фармацевтика Нв
Publication of EA045888B1 publication Critical patent/EA045888B1/en

Links

Description

Область техникиTechnical field

В данном документе предусмотрены способы идентификации пациента, характеризующегося высокой вероятностью наличия восприимчивости к лечению ингибитором белковой аргинин-Nметилтрансферазы 5, и способы его лечения.Provided herein are methods for identifying a patient who is likely to be susceptible to treatment with a protein arginine Nmethyltransferase 5 inhibitor and methods for treating the same.

Предпосылки изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Белковая аргинин-Ы-метилтрансфераза 5 (PRMT5), также описанная как Hsl7, Jbp1, Skb1, Capsuleen или Dart5, является одной из основных метилтрансфераз, ответственных за моно- и симметричное диметилирование аргининов. PRMT5 принадлежит к семейству ферментов sym-Arg диметилтрансфераз. Каталитическая активность связана с активацией сигнального пути онкогенного фактора в легких (сплайсинг и передача сигнала с участием WNT) и эпигенетической репрессией опухолевых супрессоров, а также опухолевых иммуногенных хемокинов. Уровень и локализация белка коррелирует с более высоким клеточным метилированием, потерей фенотипа бронхиального эпителия и слабым прогрессированием заболевания.Protein arginine N-methyltransferase 5 (PRMT5), also described as Hsl7, Jbp1, Skb1, Capsuleen or Dart5, is one of the major methyltransferases responsible for the mono- and symmetric dimethylation of arginines. PRMT5 belongs to the sym-Arg dimethyltransferase enzyme family. Catalytic activity is associated with activation of the oncogenic factor signaling pathway in the lungs (splicing and signal transduction involving WNT) and epigenetic repression of tumor suppressors, as well as tumor immunogenic chemokines. Protein levels and localization correlate with higher cellular methylation, loss of bronchial epithelial phenotype, and poor disease progression.

Посттрансляционное метилирование аргинина на гистоновых и негистоновых белках имеет решающее значение для множества биологических процессов, таких как организация генома, транскрипция, дифференциация, функционирование сплайсосом, передача сигнала и регуляция прохождения клеточного цикла, направление развития стволовых клеток и Т-клеток. PRMT5 многоклеточных животных образует функциональный комплекс с метилосомным белком 50 (МЕР50), также называемым Wdr77, коактиватором андрогенового рецептора р44 и Valois. Как повышенный уровень, так и цитоплазматическое накопление белка PRMT5-MEP50 вовлечены в онкогенез рака, и недавно была установлена их взаимосвязь с неблагоприятным клиническим исходом. Эксперименты по восстановлению клеток, которые направлены как на каталитическую, так и на каркасную функцию комплекса PRMT5-MEP50, помимо всесторонних ферментативных исследований, доказали онкогенную связь между уровнем белка, локализацией и ферментативной функцией. Эта корреляция превращает PRMT5 в важную мишень для низкомолекулярных лекарственных средств против рака и других заболеваний.Post-translational arginine methylation on histone and non-histone proteins is critical for a variety of biological processes, such as genome organization, transcription, differentiation, spliceosome function, signal transduction and regulation of cell cycle progression, stem cell and T cell direction. Metazoan PRMT5 forms a functional complex with methylosome protein 50 (MEP50), also called Wdr77, androgen receptor coactivator p44 and Valois. Both elevated levels and cytoplasmic accumulation of PRMT5-MEP50 protein have been implicated in cancer tumorigenesis and have recently been associated with poor clinical outcome. Cell reconstitution experiments that target both the catalytic and scaffolding functions of the PRMT5-MEP50 complex, in addition to comprehensive enzymatic studies, have proven an oncogenic link between protein level, localization, and enzymatic function. This correlation makes PRMT5 an important target for small molecule drugs against cancer and other diseases.

PRMT5 является членом подсемейства PRMT II типа, который предусматривает использование Sаденозилметионина (SAM) для получения симметричного диметилированного аргинина на гистоновых и негистоновых белковых субстратах и S-аденозилгомоцистеина (SAH). Регуляция активности PRMT5 происходит посредством огромного числа различных участников связывания, посттрансляционных модификаций, miRNA и субклеточной локализации. Метилирование гистонов Н2А и Н4 по Arg3 и гистона Н3 по Arg8 регулирует организацию хроматина для специфической репрессии/активации экспрессии генных транскриптов, которые вовлечены в дифференциацию, трансформацию, прохождение клеточного цикла и подавление роста опухолей. Кроме того, опосредованное PRMT5 метилирование гистона Н4 на Arg3 может способствовать связыванию гистона с ДНК-метилтрансферазой DNMT3A и метилированию ДНК для длительного сайленсинга гена.PRMT5 is a member of the PRMT type II subfamily, which involves the use of Sadenosylmethionine (SAM) to produce symmetrical dimethylated arginine on histone and non-histone protein substrates and S-adenosylhomocysteine (SAH). Regulation of PRMT5 activity occurs through a myriad of different binding participants, post-translational modifications, miRNAs, and subcellular localization. Methylation of histones H2A and H4 at Arg3 and histone H3 at Arg8 regulates chromatin organization for specific repression/activation of the expression of gene transcripts that are involved in differentiation, transformation, cell cycle progression and suppression of tumor growth. In addition, PRMT5-mediated methylation of histone H4 on Arg3 may promote histone binding to the DNA methyltransferase DNMT3A and DNA methylation for long-term gene silencing.

Негистоновое метилирование может происходить либо в цитоплазме, либо в ядре в зависимости от клеточной локализации PRMT5. Метилирование Sm белков D1 и D3, которые требуются для сборки ядерной сплайсосомы, происходит в цитоплазме как часть PRMT5-содержащей метилосомы. Дополнительные доказательства того, что PRMT5 вовлечен в сплайсинг, были получены посредством условного нокаута PRMT5 в нейральных стволовых клетках мыши. Клетки, в которых отсутствовал PRMT5, показали избирательное удержание интронов и пропускание экзонов со слабыми 5'-донорными сайтами. Помимо участия в сплайсинге, PRMT5 оказывает влияние на ключевые сигнальные пути, вовлеченные в направление развития клеток и гомеостаз, путем непосредственного метилирования ключевых узлов передачи сигнала, таких как р53,30 EGFR,26 CRAF,3 PI3K/AKT,64 и NFkB.Non-histone methylation can occur in either the cytoplasm or the nucleus depending on the cellular localization of PRMT5. Methylation of the Sm proteins D1 and D3, which are required for nuclear spliceosome assembly, occurs in the cytoplasm as part of the PRMT5-containing methylosome. Further evidence that PRMT5 is involved in splicing was obtained by conditional knockout of PRMT5 in mouse neural stem cells. Cells lacking PRMT5 showed selective intron retention and exon skipping with weak 5' donor sites. In addition to its involvement in splicing, PRMT5 influences key signaling pathways involved in cell guidance and homeostasis by directly methylating key signal transduction nodes such as p53,30 EGFR,26 CRAF,3 PI3K/AKT,64 and NFkB.

Поскольку PRMT5 представляет собой одну из основных sym-Arg метилтрансфераз и вовлечен во множество клеточных процессов, повышенная экспрессия белка, похоже, является важным фактором в его онкогенности. Интересно, что трансляция PRMT5 при лимфоме из клеток мантийной зоны (MCL), по-видимому, регулируется miRNA. Хотя клетки MCL характеризуются меньшим количеством мРНК и более медленной скоростью транскрипции PRMT5, чем нормальные В-лимфоциты, уровень PRMT5 и метилирование H3R8 и H4R3 значительно увеличены. Повторная экспрессия miRNA, которая связывает 3'UTR область PRMT5 снижает уровень белка PRMT5. Удивительно, что антисмысловая РНК PRMT5 была обнаружена в гене PRMT5 человека, что подтверждает гипотезу о специфичной регуляции трансляции, а не о высоком уровне экспрессии мРНК.Because PRMT5 is one of the major sym-Arg methyltransferases and is involved in a variety of cellular processes, increased protein expression appears to be an important factor in its tumorigenicity. Interestingly, translation of PRMT5 in mantle cell lymphoma (MCL) appears to be regulated by miRNA. Although MCL cells have less mRNA and a slower transcription rate of PRMT5 than normal B cells, PRMT5 levels and H3R8 and H4R3 methylation are significantly increased. Re-expression of a miRNA that binds the 3'UTR region of PRMT5 reduces PRMT5 protein levels. Surprisingly, PRMT5 antisense RNA was found in the human PRMT5 gene, supporting the hypothesis of specific translational regulation rather than high-level mRNA expression.

Хотя PRMT5 уделяется значительное внимание как клинически подходящей мишени, пока что имеется крайне мало публикаций в отношении селективных ингибиторов PRMT5. Недавно был описан новый субнаномолярный сильный ингибитор PRMT5 (EPZ015666) с противоопухолевой активностью в нескольких моделях ксенотрансплантатов MCL как первый химический зонд, подходящий для дальнейшего установления биологии PRMT5 и его роли при раке (Chan-Penebre E, Kuplast KG, Majer CR, et al. A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nat Chem Biol. Jun 2015; 11(6):432-437).Although PRMT5 has received considerable attention as a clinically relevant target, there are very few publications regarding selective PRMT5 inhibitors to date. Recently, a novel subnanomolar potent inhibitor of PRMT5 (EPZ015666) with antitumor activity in several MCL xenograft models was described as the first chemical probe suitable for further elucidating the biology of PRMT5 and its role in cancer (Chan-Penebre E, Kuplast KG, Majer CR, et al. A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nat Chem Biol. Jun 2015; 11(6):432-437).

В документе WO 2014100695A1 раскрыты соединения, пригодные для ингибирования активности PRMT5; также описаны способы применения соединений для лечения опосредованных PRMT5 нарушеWO 2014100695A1 discloses compounds useful for inhibiting PRMT5 activity; Methods of using the compounds to treat PRMT5-mediated disorders are also described.

- 1 045888 ний.- 1 045888 ni.

В документе WO 2014100730A1 раскрыты ингибиторы PRMT5, содержащие дигидро- или тетрагидроизохинолин, и пути их применения.WO 2014100730A1 discloses PRMT5 inhibitors containing dihydro- or tetrahydroisoquinoline and routes for their use.

В Devkota, K. et al., ACS Med Chem Lett, 2014. 5: p. 293-297 описан синтез ряда аналогов природного продукта синефунгина и способность этих аналогов ингибировать ЕНМТ1 и ЕНМТ2.In Devkota, K. et al., ACS Med Chem Lett, 2014. 5: p. 293-297 describe the synthesis of a number of analogs of the natural product sinefungin and the ability of these analogs to inhibit EHMT1 and EHMT2.

В документе WO 2003070739 раскрыты частичные и полные агонисты аденозиновых рецепторов А1, их получение и их терапевтическое применение.WO 2003070739 discloses partial and full adenosine A1 receptor agonists, their preparation and their therapeutic use.

В документе WO 2012082436 раскрыты соединения и композиции в качестве модуляторов метилтрансфераз гистонов и применяемые для лечения заболеваний, вызванных модуляцией активности метилтрансфераз гистонов.WO 2012082436 discloses compounds and compositions as modulators of histone methyltransferases and used for the treatment of diseases caused by modulation of the activity of histone methyltransferases.

В документе WO 2014100719 раскрыты ингибиторы PRMT5 и пути их применения.WO 2014100719 discloses PRMT5 inhibitors and their uses.

В документе WO 03074083 раскрыты комбинированные терапевтические средства, которые селективно уничтожают дефицитные по метилтиоаденозинфосфорилазе клетки. Аналоги МТА описаны в этом документе в качестве антитоксичных средств.WO 03074083 discloses combination therapeutic agents that selectively kill methylthioadenosine phosphorylase-deficient cells. MTA analogues are described in this document as antitoxic agents.

В Rung, P.-P. et al., Bioorg Med Chem Lett, 2005. 15: p. 2829-2833 описаны структура, синтез и биологическая оценка новых субстратов 5'-дезокси-5'-метилтиоаденозинфосфорилазы (МТАР) человека.In Rung, P.-P. et al., Bioorg Med Chem Lett, 2005. 15: p. 2829-2833 describe the structure, synthesis and biological evaluation of new human 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) substrates.

В документе WO 2012075500 раскрыты 7-деазапуриновые модуляторы метилтрансферазы гистонов.WO 2012075500 discloses 7-deazapurine modulators of histone methyltransferase.

В документе WO 2014035140 раскрыты соединения и композиции для модуляции активности метилтрансферазы гистонов.WO 2014035140 discloses compounds and compositions for modulating histone methyltransferase activity.

В документе WO 2015200680 описаны ингибиторы PRMT5 и пути их применения.WO 2015200680 describes PRMT5 inhibitors and their uses.

В документах WO 2017/032840 и WO 2017/153186 также описаны ингибиторы PRMT5 и пути их применения, и они включены в данный документ посредством ссылки.WO 2017/032840 and WO 2017/153186 also describe PRMT5 inhibitors and their uses and are incorporated herein by reference.

PRMT5 был связан с раком легких посредством нескольких механизмов. Повышенная экспрессия PRMT5 и МЕР50 при NSCLC высоко коррелирует с более низкой выживаемостью. Механистическое понимание этой повышенной экспрессии при аденокарциноме легких было показано исследованиями, в которых высокая экспрессия PRMT5 в цитоплазме непосредственно коррелировала с неблагоприятным прогнозом, вероятно, опосредованная эпителиально-мезенхимальным переходом и метилированием гистонов. Помимо этого, сверхэкспрессия PRMT5 вызывает образование опухолей у голых мышей. Механизм, лежащий в основе способностей PRMT5 трансформировать клетки, неясен, однако предполагается, что фермент играет роль в клеточной смерти, прохождении клеточного цикла, сплайсинге, росте и пролиферации клеток.PRMT5 has been associated with lung cancer through several mechanisms. Increased expression of PRMT5 and MEP50 in NSCLC is highly correlated with lower survival. Mechanistic insight into this increased expression in lung adenocarcinoma was provided by studies in which high cytoplasmic PRMT5 expression was directly correlated with poor prognosis, likely mediated by epithelial-mesenchymal transition and histone methylation. In addition, PRMT5 overexpression induces tumor formation in nude mice. The mechanism underlying PRMT5's cell transforming abilities is unclear, but the enzyme is thought to play a role in cell death, cell cycle progression, splicing, cell growth and proliferation.

Доклинические данные демонстрируют, что ингибирование PRMT5 вызывает гибель клеток рака легких подгруппы популяции рака легких, в то время как на другие подгруппы длительное воздействие ингибитора PRMT5 не влияет. Таким образом, существует явная потребность в фармакодинамических (PD) и/или предиктивных биомаркерах для определения либо того, характеризуется ли заболевание конкретного пациента, опосредованное PRMT5, высокой вероятностью ответа на лечение ингибитором PRMT5, либо для измерения фармакодинамических эффектов лечения ингибитором PRMT5 у пациента с NSCLC, или SCLC, или другими заболеваниями, опосредованными PRMT5. Такие биомаркеры в настоящее время неизвестны.Preclinical data demonstrate that PRMT5 inhibition causes lung cancer cell death in a subset of the lung cancer population, while other subsets are unaffected by long-term exposure to a PRMT5 inhibitor. Thus, there is a clear need for pharmacodynamic (PD) and/or predictive biomarkers to determine either whether a particular patient's PRMT5-mediated disease is highly likely to respond to PRMT5 inhibitor treatment or to measure the pharmacodynamic effects of PRMT5 inhibitor treatment in a patient with NSCLC , or SCLC, or other PRMT5-mediated diseases. Such biomarkers are currently unknown.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В данном документе раскрыты способы идентификации пациента, который будет характеризоваться высокой вероятностью наличия восприимчивости к лечению ингибитором белковой аргинин-Nметилтрансферазы 5 (PRMT5).Disclosed herein are methods for identifying a patient who will have a high likelihood of being responsive to treatment with a protein arginine Nmethyltransferase 5 (PRMT5) inhibitor.

Ингибиторы PRMT5 могут связывать фермент PRMT5, конкурируя с природным субстратом SAM ^-аденозил-Ь-метионином), с ингибированием такого фермента.PRMT5 inhibitors can bind the PRMT5 enzyme, competing with the natural SAM substrate (N-adenosyl-L-methionine), inhibiting such enzyme.

Таким образом, предполагается, что ингибиторы PRMT5 или фармацевтические композиции на их основе могут быть пригодными для лечения или предупреждения, в частности лечения, заболеваний, таких как нарушение крови, нарушения обмена веществ, аутоиммунные нарушения, рак, воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, нейродегенеративные заболевания, панкреатит, полиорганная недостаточность, заболевания почек, агрегация тромбоцитов, недостаточная подвижность сперматозоидов, отторжение трансплантата, отторжение трансплантата ткани, повреждения легких и т.п.Thus, it is contemplated that PRMT5 inhibitors or pharmaceutical compositions based thereon may be useful for the treatment or prevention, in particular treatment, of diseases such as blood disorders, metabolic disorders, autoimmune disorders, cancer, inflammatory diseases, cardiovascular diseases, neurodegenerative diseases, pancreatitis, multiple organ failure, kidney disease, platelet aggregation, poor sperm motility, transplant rejection, tissue graft rejection, lung damage, etc.

В частности, ингибиторы PRMT5 или фармацевтические композиции на их основе могут быть пригодными для лечения или предупреждения, в частности лечения, заболеваний, таких как аллергия, астма, рак гемопоэтической системы, рак легкого, рак предстательной железы, меланома, нарушение обмена веществ, диабет, ожирение, нарушение крови, серповидноклеточная анемия и т.п.In particular, PRMT5 inhibitors or pharmaceutical compositions based thereon may be suitable for the treatment or prevention, in particular treatment, of diseases such as allergies, asthma, hematopoietic cancer, lung cancer, prostate cancer, melanoma, metabolic disorders, diabetes, obesity, blood disorder, sickle cell anemia, etc.

Ингибиторы PRMT5 или фармацевтические композиции на их основе могут быть пригодными для лечения или предупреждения, в частности лечения, заболеваний, как например пролиферативное нарушение, такое как аутоиммунное заболевание, рак, доброкачественное новообразование или воспалительное заболевание.PRMT5 inhibitors or pharmaceutical compositions based thereon may be useful for the treatment or prevention, in particular the treatment, of diseases, such as a proliferative disorder such as an autoimmune disease, cancer, benign neoplasm or inflammatory disease.

Ингибиторы PRMT5 или фармацевтические композиции на их основе могут быть пригодными для лечения или предупреждения, в частности лечения, заболеваний, таких как нарушение обмена веществ, включающее диабет, ожирение; пролиферативное нарушение, включающее рак, рак гемопоэтическойPRMT5 inhibitors or pharmaceutical compositions based thereon may be useful for the treatment or prevention, in particular treatment, of diseases such as metabolic disorders including diabetes, obesity; proliferative disorder, including cancer, hematopoietic cancer

- 2 045888 системы, рак легкого, рак предстательной железы, меланому или рак поджелудочной железы; нарушение крови; гемоглобинопатия; серповидноклеточная анемия; β-талассемия, воспалительное заболевание и аутоиммунное заболевание, например ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, диарея, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь и подобные.- 2 045888 systems, lung cancer, prostate cancer, melanoma or pancreatic cancer; blood disorder; hemoglobinopathy; sickle cell anemia; β-thalassemia, an inflammatory disease and an autoimmune disease, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjögren's syndrome, diarrhea, gastroesophageal reflux disease and the like.

В некоторых вариантах осуществления ингибирование PRMT 5 может быть пригодным для лечения или предупреждения, в частности лечения, следующего неограничивающего перечня видов рака: рака молочной железы, рака легкого, рака пищевода, рака мочевого пузыря, рака гемопоэтической системы, лимфомы, медуллобластомы, аденокарциномы прямой кишки, аденокарциномы толстой кишки, рака желудочно-кишечного тракта, рака поджелудочной железы, рака печени, аденокистозной карциномы, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, опухолей головного мозга, гепатоцеллюлярной карциномы, почечно-клеточной карциномы, меланомы, олигодендроглиомы, светлоклеточной карциномы яичников и серозной кистозной аденомы яичников.In some embodiments, PRMT 5 inhibition may be useful for treating or preventing, in particular treating, the following non-limiting list of cancers: breast cancer, lung cancer, esophageal cancer, bladder cancer, hematopoietic cancer, lymphoma, medulloblastoma, rectal adenocarcinoma , colon adenocarcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, liver cancer, adenoid cystic carcinoma, lung adenocarcinoma, head and neck squamous cell carcinoma, brain tumors, hepatocellular carcinoma, renal cell carcinoma, melanoma, oligodendroglioma, ovarian clear cell carcinoma and serous cystic adenoma of the ovaries.

Примеры нарушений обмена веществ, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения диабет или ожирение.Examples of metabolic disorders that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, diabetes or obesity.

Примеры заболеваний крови, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения гемоглобинопатию, такую как серповидноклеточная анемия или β-талассемия.Examples of blood diseases that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, hemoglobinopathy such as sickle cell anemia or β-thalassemia.

Примеры видов рака, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения невриному слухового нерва, аденокарциному, рак надпочечника, рак анального канала, ангиосаркому (например, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиальная саркома, гемангиосаркома), рак аппендикса, доброкачественную моноклональную гаммапатию, рак желчных протоков (например, холангиокарцинома), рак мочевого пузыря, рак груди (например, аденокарцинома молочной железы, папиллярная карцинома молочной железы, рак молочной железы, медуллярная карцинома молочной железы), рак головного мозга (например, менингиома; глиома, например астроцитома, олигодендроглиома; медуллобластома), рак бронхов, карциноидную опухоль, рак шейки матки (например, аденокарцинома шейки матки), хордому, хориокарциному, краниофарингиому, колоректальный рак (например, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальная аденокарцинома), карциному эпителия, эпендимому, эндотелиосаркому (например, саркома Капоши, идиопатическая множественная геморрагическая саркома), рак эндометрия (например, рак матки, саркома матки), рак пищевода (например, аденокарцинома пищевода, аденокарцинома Барретта), саркому Юинга, рак глаза (например, внутриглазная меланома, ретинобластома), семейную гиперэозинофилию, рак желчного пузыря, рак желудочно-кишечного тракта (например, аденокарцинома желудка), гастроинтестинальную стромальную опухоль (GIST), рак головы и шеи (например, плоскоклеточная карцинома головы и шеи), рак ротовой полости (например, плоскоклеточная карцинома ротовой полости (OSCC), рак горла (например, рак глотки, рак гортани, рак носоглотки, рак ротоглотки)), виды рака гемопоэтической системы (например, лейкемия, такая как острый лимфоцитарный лейкоз (ALL) (например, В-клеточный ALL, Т-клеточный ALL), острый миелоцитарный лейкоз (AML) (например, В-клеточный AML, Т-клеточный AML), хронический миелоцитарный лейкоз (CML) (например, В-клеточный CML, Т-клеточный CML) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) (например, В-клеточный CLL, Т-клеточный CLL); лимфому, такую как Ходжкинская лимфома (HL) (например, В-клеточная HL, Т-клеточная HL) и неходжкинская лимфома (NHL) ((например, В-клеточная NHL, такая как диффузная крупноклеточная лимфома (DLCL) (например, диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома (DLBCL)), фолликулярную лимфому, хронический лимфолейкоз/мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (CLL/SLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), лимфомы из В-клеток маргинальной зоны (например, лимфомы, ассоциированные с лимфоидной тканью слизистых оболочек (MALT), узловые лимфомы из В-клеток краевой зоны, лимфома из В-клеток маргинальной зоны селезенки), первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, лимфоплазматическую лимфому (т.е. макроглобулинемия Вальденстрема), иммунобластную крупноклеточную лимфому, волосатоклеточный лейкоз (HCL), В-лимфобластную лимфому из клеток-предшественников и первичную лимфому центральной нервной системы (CNS); а также Т-клеточную NHL, такую как Т-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников/лейкемия, периферическая Т-клеточная лимфома (PTCL) (например, кожная Т-клеточная лимфома (CTCL) (например, грибовидный микоз, синдром Сезари), ангиоиммунобластомная Т-клеточная лимфома, экстранодальная Т-клеточная лимфома из естественных киллеров, Т-клеточная лимфома энтеропатического типа, подкожная Т-клеточная лимфома типа панникулита, анапластическая крупноклеточная лимфома); сочетание одного или нескольких видов лейкемий/лимфом, описанных выше; и множественную миелому (ММ)), болезнь тяжелых цепей (например, болезнь альфацепей, болезнь гамма-цепей, болезнь мю-цепей), гемангиобластому, воспалительные миофибробластические опухоли, иммуноцитарный амилоидоз, рак почек (например, нефробластома почки, также называемая опухолью Вильмса, почечноклеточная карцинома), рак печени (например, гепатоцеллюлярный рак (НСС), злокачественная гепатома), рак легкого (например, бронхогенный рак, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), плоскоклеточный рак легких (SLC), аденокарцинома легкого, карцинома легкого Льюиса, нейроэндокринная опухоль легкого: типичный карциноид, атипичный карциноид, мелкоклеточный рак легких (SCLC) и крупноклеточная нейроэндокринная карцинома), лейомиосаркому (LMS), мастоциExamples of cancers that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, acoustic neuroma, adenocarcinoma, adrenal cancer, anal cancer, angiosarcoma (eg, lymphangiosarcoma, lymphangioendothelial sarcoma, hemangiosarcoma), appendix cancer, benign monoclonal gammopathy, cancer bile duct (eg, cholangiocarcinoma), bladder cancer, breast cancer (eg, breast adenocarcinoma, papillary breast carcinoma, breast cancer, medullary breast carcinoma), brain cancer (eg, meningioma; glioma, eg, astrocytoma, oligodendroglioma ; medulloblastoma), bronchial cancer, carcinoid tumor, cervical cancer (eg, cervical adenocarcinoma), chordoma, choriocarcinoma, craniopharyngioma, colorectal cancer (eg, colon cancer, rectal cancer, colorectal adenocarcinoma), epithelial carcinoma, ependymoma, endotheliosarcoma (eg, Kaposi's sarcoma, idiopathic multiple hemorrhagic sarcoma), endometrial cancer (eg, uterine cancer, uterine sarcoma), esophageal cancer (eg, esophageal adenocarcinoma, Barrett's adenocarcinoma), Ewing's sarcoma, eye cancer (eg, intraocular melanoma, retinoblastoma), familial hypereosinophilia, gallbladder cancer, gastrointestinal cancer (eg, gastric adenocarcinoma), gastrointestinal stromal tumor (GIST), head and neck cancer (eg, head and neck squamous cell carcinoma), oral cancer (eg, oral squamous cell carcinoma (OSCC), throat cancer (eg, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, nasopharyngeal cancer, oropharyngeal cancer)), hematopoietic cancers (eg, leukemia such as acute lymphocytic leukemia (ALL) (eg, B-cell ALL, T-cell cellular ALL), acute myelocytic leukemia (AML) (eg, B-cell AML, T-cell AML), chronic myelocytic leukemia (CML) (eg, B-cell CML, T-cell CML), and chronic lymphocytic leukemia (CLL) (eg, B cell CLL, T cell CLL); lymphoma such as Hodgkin lymphoma (HL) (eg B cell HL, T cell HL) and non-Hodgkin lymphoma (NHL) (eg B cell NHL such as diffuse large cell lymphoma (DLCL) (eg diffuse B large cell lymphoma (DLBCL), follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia/small cell lymphocytic lymphoma (CLL/SLL), mantle cell lymphoma (MCL), marginal zone B-cell lymphomas (eg, mucosal tissue-associated lymphomas) meningeal (MALT), nodal marginal zone B-cell lymphoma, splenic marginal zone B-cell lymphoma), primary mediastinal B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, lymphoplasmacytic lymphoma (i.e. Waldenström's macroglobulinemia), immunoblastic large cell lymphoma, hairy cell leukemia (HCL), B-lymphoblastic progenitor cell lymphoma and primary central nervous system (CNS) lymphoma; and T-cell NHL such as T-lymphoblastic progenitor cell lymphoma/leukemia, peripheral T-cell lymphoma (PTCL ) (eg, cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) (eg, mycosis fungoides, Sezary syndrome), angioimmunoblastoma T-cell lymphoma, extranodal natural killer T-cell lymphoma, enteropathic-type T-cell lymphoma, subcutaneous T-cell lymphoma panniculitis, anaplastic large cell lymphoma); a combination of one or more types of leukemia/lymphoma described above; and multiple myeloma (MM)), heavy chain disease (eg, alpha chain disease, gamma chain disease, mu chain disease), hemangioblastoma, inflammatory myofibroblastic tumors, immunocytic amyloidosis, kidney cancer (eg, renal nephroblastoma, also called Wilms tumor, renal cell carcinoma), liver cancer (eg, hepatocellular carcinoma (HCC), malignant hepatoma), lung cancer (eg, bronchogenic carcinoma, non-small cell lung cancer (NSCLC), squamous cell lung cancer (SLC), lung adenocarcinoma, Lewis lung carcinoma, neuroendocrine tumor lung: typical carcinoid, atypical carcinoid, small cell lung cancer (SCLC) and large cell neuroendocrine carcinoma), leiomyosarcoma (LMS), mastitis

- 3 045888 тоз (например, системный мастоцитоз), миелодиспластические синдромы (MDS), мезотелиому, миелопролиферативные нарушения (MPD) (например, истинная полицитемия (PV), эссенциальный тромбоцитоз (ЕТ), агногенная миелоидная метаплазия (АММ), также называемая миелофиброзом (MF), хронический идиопатический миелофиброз, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), хронический нейтрофильный лейкоз (CNL), гиперэозинофильный синдром (HES)), нейробластому, нейрофиброму (например, нейрофиброматоз (NF) типа 1 или типа 2, шванноматоз), нейроэндокринный рак (например, гастроэнтеропанкреатическая нейроэндокринная опухоль (GEP-NET), карциноидная опухоль), остеосаркому, рак яичников (например, цистаденокарцинома, эмбриональный рак яичников, аденокарцинома яичников), папиллярную аденокарциному, рак поджелудочной железы (например, аденокарцинома поджелудочной железы, внутрипротоковая папиллярно-муцинозная опухоль (IPMN), инсуломы), рак полового члена (например, болезнь Педжета полового члена и мошонки), пинеалому, примитивную нейроэктодермальную опухоль (PNT), рак предстательной железы (например, аденокарцинома предстательной железы), рак прямой кишки, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, рак кожи (например, плоскоклеточная карцинома (SCC), кератоакантома (КА), меланома, базальноклеточная карцинома (ВСС)), рак тонкой кишки (например, рак аппендикса), карциному мягких тканей (например, злокачественная фиброзная гистиоцитома (MFH), липосаркома, злокачественная опухоль оболочек периферических нервов (MPNST), хондросаркома, фибросаркома, миксосаркома), карциному сальных желез, карциному потовых желез, синовиому, рак яичка (например, семинома, эмбриональная карцинома яичка), рак щитовидной железы (например, папиллярная карцинома щитовидной железы, папиллярная тиреоидная карцинома (РТС), медуллярный рак щитовидной железы), рак уретры, рак влагалища, рак вульвы (например, болезнь Педжета вульвы).- 3 045888 tosis (eg systemic mastocytosis), myelodysplastic syndromes (MDS), mesothelioma, myeloproliferative disorders (MPD) (eg polycythemia vera (PV), essential thrombocytosis (ET), agnogenic myeloid metaplasia (AMM), also called myelofibrosis ( MF), chronic idiopathic myelofibrosis, chronic myelocytic leukemia (CML), chronic neutrophilic leukemia (CNL), hypereosinophilic syndrome (HES)), neuroblastoma, neurofibroma (eg, neurofibromatosis (NF) type 1 or type 2, schwannomatosis), neuroendocrine cancer ( eg, gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor (GEP-NET), carcinoid tumor), osteosarcoma, ovarian cancer (eg, cystadenocarcinoma, embryonal ovarian cancer, ovarian adenocarcinoma), papillary adenocarcinoma, pancreatic cancer (eg, pancreatic adenocarcinoma, intraductal papillary mucinous tumor (IPMN), insulinomas), penile cancer (eg, Paget's disease of the penis and scrotum), pinealoma, primitive neuroectodermal tumor (PNT), prostate cancer (eg, prostate adenocarcinoma), rectal cancer, rhabdomyosarcoma, salivary gland cancer , skin cancer (eg, squamous cell carcinoma (SCC), keratoacanthoma (KA), melanoma, basal cell carcinoma (BCC)), small bowel cancer (eg, appendix cancer), soft tissue carcinoma (eg, malignant fibrous histiocytoma (MFH), liposarcoma , malignant peripheral nerve sheath tumor (MPNST), chondrosarcoma, fibrosarcoma, myxosarcoma), sebaceous carcinoma, sweat gland carcinoma, synovioma, testicular cancer (eg, seminoma, embryonal testicular carcinoma), thyroid cancer (eg, papillary thyroid carcinoma, papillary thyroid carcinoma (PTC), medullary thyroid cancer), urethral cancer, vaginal cancer, vulvar cancer (eg Paget's disease of the vulva).

Примеры нейродегенеративных заболеваний, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения заболевание двигательных нейронов, прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Пика, болезнь Альцгеймера, деменцию, ассоциированную со СПИДом, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, пигментный ретинит, спинальную мышечную атрофию и мозжечковую дегенерацию.Examples of neurodegenerative diseases that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, motor neuron disease, progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, Pick's disease, Alzheimer's disease, AIDS-associated dementia, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, spinal muscular atrophy and cerebellar degeneration.

Примеры сердечно-сосудистых заболеваний, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения гипертрофию сердца, рестеноз, атеросклероз и гломерулонефрит.Examples of cardiovascular diseases that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, cardiac hypertrophy, restenosis, atherosclerosis and glomerulonephritis.

Примеры воспалительных заболеваний, которые можно лечить или предупреждать, в частности, лечить, включают без ограничения воспаление, ассоциированное с акне, анемию (например, апластическую анемию, гемолитическую аутоиммунную анемию), ринит, астму, артериит (например, полиартериит, височный артериит, узелковый периартериит, артериит Такаясу), артрит (например, кристаллический артрит, остеоартрит, псориатический артрит, подагрический артрит, реактивный артрит, ревматоидный артрит и артрит Рейтера), заболевание верхних дыхательных путей, анкилозирующий спондилит, амилоз, боковой амиотрофический склероз, аутоиммунные заболевания, аллергии или аллергические реакции, атеросклероз, бронхит, бурсит, хронический простатит, конъюнктивит, болезнь Чагаса, хроническое обструктивное заболевание легкого, дивертикулит, дерматомиозит, диабет (например, сахарный диабет 1го типа, сахарный диабет 2-го типа), заболевание кожи (например, псориаз, экзему, реакции гиперчувствительности при экземе, ожоги, дерматит, зуд (чесотку)), эндометриоз, синдром Гийена-Барре, инфекцию, ишемическую болезнь сердца, болезнь Кавасаки, гломерулонефрит, гингивит, гиперчувствительность, головные боли (например, головные боли при мигрени, головные боли тензионного типа), кишечную непроходимость (например, послеоперационную кишечную непроходимость и кишечную непроходимость при сепсисе), идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит (синдром раздраженного мочевого пузыря), нарушение работы желудочно-кишечного тракта (например, выбранное из пептических язв, регионарного энтерита, дивертикулита, желудочно-кишечного кровотечения, эозинофильных нарушений работы желудочно-кишечного тракта (например, эозинофильного эзофагита, эозинофильного гастрита, эозинофильного гастроэнтерита, эозинофильного колита), гастрита, диареи, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (GORD или ее синоним GERD), воспалительного заболевания кишечника (IBD) (например, болезни Крона, язвенного колита, коллагенозного колита, лимфоцитарного колита, ишемического колита, воспаления в отключенной кишке, синдрома Бехчета, неуточненного колита) и синдрома воспаленного кишечника (IBS)), волчанку, кольцевидную склеродермию, миастению гравис, ишемию миокарда, рассеянный склероз, нефротический синдром, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, пептические язвы, полимиозит, первичный билиарный цирроз, нейровоспаление, ассоциированное с мозговыми нарушениями (например, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и болезнь Альцгеймера), простатит, хроническое воспаление, ассоциированное с лучевым поражением черепа, воспалительное заболевание органов таза, реперфузионное повреждение, регионарный энтерит, ревматическую лихорадку, системную красную волчанку, склеродермию, склеродому, саркоидоз, виды спондилоартропатии, синдром Шегрена, тиреоидит, отторжение трансплантата, тендинит, травму или повреждение (например, обморожение, воздействие химических раздражителей, токсины, рубцевание, ожоги, физическое повреждение), васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.Examples of inflammatory diseases that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, inflammation associated with acne, anemia (eg, aplastic anemia, hemolytic autoimmune anemia), rhinitis, asthma, arteritis (eg, polyarteritis, temporal arteritis, nodular periarteritis, Takayasu arteritis), arthritis (eg, crystalline arthritis, osteoarthritis, psoriatic arthritis, gouty arthritis, reactive arthritis, rheumatoid arthritis, and Reiter's arthritis), upper respiratory tract disease, ankylosing spondylitis, amylosis, amyotrophic lateral sclerosis, autoimmune diseases, allergies, or allergic reactions, atherosclerosis, bronchitis, bursitis, chronic prostatitis, conjunctivitis, Chagas disease, chronic obstructive pulmonary disease, diverticulitis, dermatomyositis, diabetes (for example, type 1 diabetes mellitus, type 2 diabetes mellitus), skin disease (for example, psoriasis, eczema, eczema hypersensitivity reactions, burns, dermatitis, pruritus (scabies), endometriosis, Guillain-Barré syndrome, infection, coronary heart disease, Kawasaki disease, glomerulonephritis, gingivitis, hypersensitivity, headaches (eg, migraine headaches, headaches tension-type pain), intestinal obstruction (for example, postoperative intestinal obstruction and intestinal obstruction in sepsis), idiopathic thrombocytopenic purpura, interstitial cystitis (irritable bladder syndrome), gastrointestinal dysfunction (for example, selected from peptic ulcers, regional enteritis, diverticulitis, gastrointestinal bleeding, eosinophilic gastrointestinal disorders (eg, eosinophilic esophagitis, eosinophilic gastritis, eosinophilic gastroenteritis, eosinophilic colitis), gastritis, diarrhea, gastroesophageal reflux disease (GORD or its synonym GERD), inflammatory bowel disease (IBD ) (eg, Crohn's disease, ulcerative colitis, collagenous colitis, lymphocytic colitis, ischemic colitis, inflammatory bowel disease, Behçet's syndrome, unspecified colitis) and inflammatory bowel syndrome (IBS)), lupus, annular scleroderma, myasthenia gravis, myocardial ischemia, multiple sclerosis, nephrotic syndrome, pemphigus vulgaris, pernicious anemia, peptic ulcers, polymyositis, primary biliary cirrhosis, neuroinflammation associated with brain disorders (eg, Parkinson's disease, Huntington's disease and Alzheimer's disease), prostatitis, chronic inflammation associated with cranial radiation injury , pelvic inflammatory disease, reperfusion injury, regional enteritis, rheumatic fever, systemic lupus erythematosus, scleroderma, sclerodoma, sarcoidosis, types of spondyloarthropathy, Sjögren's syndrome, thyroiditis, graft rejection, tendinitis, trauma or injury (eg, frostbite, exposure to chemical irritants, toxins, scarring, burns, physical injury), vasculitis, vitiligo and Wegener's granulomatosis.

В частности, воспалительное заболевание может представлять собой острое воспалительное заболевание (например, воспаление вследствие инфекции). В частности, воспалительное заболевание можетIn particular, the inflammatory disease may be an acute inflammatory disease (eg, inflammation due to infection). In particular, inflammatory disease can

- 4 045888 представлять собой хроническое воспалительное заболевание (например, состояния, вызванные астмой, артритом и воспалительным заболеванием кишечника). Ингибиторы PRMT5 могут также быть пригодны в лечении воспаления, ассоциированного с травмой и миалгией невоспалительного характера. Соединения могут также быть пригодны в лечении воспаления, ассоциированного с раком.- 4 045888 be a chronic inflammatory disease (eg conditions caused by asthma, arthritis and inflammatory bowel disease). PRMT5 inhibitors may also be useful in the treatment of inflammation associated with trauma and non-inflammatory myalgia. The compounds may also be useful in the treatment of inflammation associated with cancer.

Примеры аутоиммунных заболеваний, которые можно лечить или предупреждать, в частности, лечить, включают без ограничения артрит (включая ревматоидный артрит, спондилоартропатии, подагрический артрит, дегенеративные заболевания суставов, такие как остеоартрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, анкилозирующий спондилит, недифференцированный спондилит, болезнь Бехчета, гемолитические аутоиммунные анемии, боковой амиотрофический склероз, амилоз, рассеянный склероз, острый плечекистевой синдром, псориатический и хронический артрит у детей), астму, атеросклероз, остеопороз, бронхит, тендинит, бурсит, заболевание кожи (например, псориаз, экзема, реакции гиперчувствительности при экземе, ожоги, дерматит, зуд (чесотка)), энурез, эозинофильную болезнь, нарушение желудочно-кишечного тракта (например, выбранное из пептических язв, регионарного энтерита, дивертикулита, желудочно-кишечного кровотечения, эозинофильных нарушений желудочнокишечного тракта (например, эозинофильный эзофагит, эозинофильный гастрит, эозинофильный гастроэнтерит, эозинофильный колит), гастрита, диареи, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (GORD или ее синоним GERD), воспалительного заболевания кишечника (IBD) (например, болезнь Крона, язвенный колит, коллагенозный колит, лимфоцитарный колит, ишемический колит, воспаление в отключенной кишке, синдром Бехчета, неуточненный колит) и синдрома воспаленного кишечника (IBS)), и нарушения, тяжесть которых снижают гастропрокинетическими средствами (например, непроходимость кишечника, послеоперационная непроходимость кишечника и непроходимость кишечника при сепсисе; гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (GORD или ее синоним GERD); эозинофильный эзофагит, парез желудка, такой как диабетический парез желудка; пищевая непереносимость и пищевые аллергии и другие функциональные нарушения кишечника, такие как безъязвенная диспепсия (NUD) и экстракардиальная боль в груди (NCCP, включая реберный хондрит)).Examples of autoimmune diseases that can be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, arthritis (including rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, gouty arthritis, degenerative joint diseases such as osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, Sjögren's syndrome, ankylosing spondylitis, undifferentiated spondylitis, Behçet's disease, hemolytic autoimmune anemias, amyotrophic lateral sclerosis, amylosis, multiple sclerosis, acute brachial syndrome, psoriatic and chronic arthritis in children), asthma, atherosclerosis, osteoporosis, bronchitis, tendonitis, bursitis, skin disease (eg, psoriasis, eczema, reactions hypersensitivity eczema, burns, dermatitis, pruritus (scabies), enuresis, eosinophilic disease, gastrointestinal disorder (eg, selected from peptic ulcers, regional enteritis, diverticulitis, gastrointestinal bleeding, eosinophilic gastrointestinal disorder (eg, eosinophilic esophagitis, eosinophilic gastritis, eosinophilic gastroenteritis, eosinophilic colitis), gastritis, diarrhea, gastroesophageal reflux disease (GORD or its synonym GERD), inflammatory bowel disease (IBD) (eg, Crohn's disease, ulcerative colitis, collagenous colitis, lymphocytic colitis, ischemic colitis , inflammation in the disconnected bowel, Behçet's syndrome, colitis unspecified) and inflammatory bowel syndrome (IBS)), and disorders the severity of which is reduced by gastroprokinetic agents (eg, ileus, postoperative ileus, and ileus in sepsis; gastroesophageal reflux disease (GORD or its synonym GERD); eosinophilic esophagitis, gastroparesis such as diabetic gastroparesis; food intolerances and food allergies and other functional bowel disorders such as non-ulcer dyspepsia (NUD) and non-cardiac chest pain (NCCP, including costochondritis).

В конкретном варианте осуществления ингибитор PRMT5 может быть пригодным в перепрограммировании соматических клеток, как например перепрограммировании соматических клеток в стволовые клетки. В конкретном варианте осуществления ингибитор PRMT5 может быть пригодным в разработке технологии на основе зародышевых клеток и, таким образом, представляются пригодными для использования в областях репродуктивной технологии и регенеративной медицины.In a particular embodiment, a PRMT5 inhibitor may be useful in reprogramming somatic cells, such as reprogramming somatic cells into stem cells. In a particular embodiment, a PRMT5 inhibitor may be useful in the development of germ cell-based technology and thus appears suitable for use in the fields of reproductive technology and regenerative medicine.

Другие заболевания, которые можно лечить или предупреждать, в частности лечить, включают без ограничения инфаркты миокарда, ассоциированные с ишемическим повреждением, иммунные заболевания, инсульт, аритмию, заболевания печени, вызванные токсинами или связанные с приемом алкоголя, чувствительный к аспирину риносинусит, муковисцидоз, боли при раке и заболевания крови, например хроническую анемию и апластическую анемию.Other diseases that may be treated or prevented, particularly treated, include, but are not limited to, myocardial infarction associated with ischemic injury, immune diseases, stroke, arrhythmia, liver disease caused by toxins or associated with alcohol intake, aspirin-sensitive rhinosinusitis, cystic fibrosis, pain for cancer and blood diseases, such as chronic anemia and aplastic anemia.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает способ идентификации пациента, который, вероятно, будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором белковой аргинин-Ы-метилтрансферазы 5 (PRMT5), включающий оценку биологического образца от пациента на наличие любого из следующего:Thus, the present invention provides a method for identifying a patient who is likely to be susceptible to treatment with a protein arginine N-methyltransferase 5 (PRMT5) inhibitor, comprising assessing a biological sample from the patient for the presence of any of the following:

активирующей мутации PIC3CA;activating mutation PIC3CA;

изменение сплайсосомы;change in spliceosome;

усиления сигнального пути циклина D1; и/или изменения сигнального пути WNT;enhancing the cyclin D1 signaling pathway; and/or changes in the WNT signaling pathway;

где наличие чего-либо из указанных мутации или изменения свидетельствует о более высокой вероятности того, что указанный пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению указанным ингибитором PRMT5, чем при отсутствии чего-либо из указанных мутации или изменения.wherein the presence of any of the specified mutations or changes indicates a higher probability that the specified patient will be characterized by the presence of responsiveness to treatment with the specified PRMT5 inhibitor than in the absence of any of the specified mutations or changes.

В предпочтительном варианте осуществления изменение сплайсосомы предусматривает мутацию гена, выбранного из группы, состоящей из U2AF1, RBM10 и KIAA1429. В конкретном варианте осуществления ген представляет собой U2AF1 и мутация представляет собой S34F. В другом конкретном варианте осуществления ген представляет собой RBM10, и мутация выбрана из группы, состоящей из I696fs, I348N, G840fs. В еще одном конкретном варианте осуществления ген представляет собой KIAA1429, и мутация выбрана из группы, состоящей из L837V, F1260L, D251if, T1333M, V1548L, G397A и Q962E. Другие изменения сплайсосомы также могут указывать на более высокую вероятность того, что пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором PRMT5.In a preferred embodiment, the alteration of the spliceosome involves mutation of a gene selected from the group consisting of U2AF1, RBM10 and KIAA1429. In a specific embodiment, the gene is U2AF1 and the mutation is S34F. In another specific embodiment, the gene is RBM10, and the mutation is selected from the group consisting of I696fs, I348N, G840fs. In yet another specific embodiment, the gene is KIAA1429, and the mutation is selected from the group consisting of L837V, F1260L, D251if, T1333M, V1548L, G397A, and Q962E. Other spliceosome changes may also indicate a higher likelihood that the patient will be susceptible to treatment with a PRMT5 inhibitor.

В другом варианте осуществления активирующая мутация PIC3CA, выбрана из группы, состоящей из H1047R, PG106-R108del, Т1025А и Е542К. Однако другая активирующая мутация также может указывать на более высокую вероятность того, что пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором PRMT5.In another embodiment, the activating mutation PIC3CA is selected from the group consisting of H1047R, PG106-R108del, T1025A and E542K. However, another activating mutation may also indicate a higher likelihood that the patient will be susceptible to treatment with a PRMT5 inhibitor.

В другом варианте осуществления усиление сигнального пути циклина D1 представляет собой усиление экспрессии циклина D1, CDK4 или CDK6. Однако другие виды усиления сигнального пути циклина D1 также могут указывать на более высокую вероятность того, что пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором PRMT5.In another embodiment, the enhancement of the cyclin D1 signaling pathway is an increase in the expression of cyclin D1, CDK4 or CDK6. However, other types of enhancement of the cyclin D1 signaling pathway may also indicate a higher likelihood that the patient will be susceptible to treatment with a PRMT5 inhibitor.

- 5 045888- 5 045888

В другом варианте осуществления изменение сигнального пути WNT предусматривает аутокринную передачу сигнала с участием WNT. Предпочтительно изменение сигнального пути WNT предусматривает мутацию гена АРС или CTNNB1. В конкретном варианте осуществления ген представляет собой АРС, и мутация выбрана из группы, состоящей из R213Q, R2673G, I1177M и D2796G. В другом конкретном варианте осуществления ген представляет собой CTNNB1, и мутация выбрана из группы, состоящей из Y670*, S45F и Т41А. Однако другие изменения сигнального пути WNT также могут указывать на более высокую вероятность того, что пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором PRMT5.In another embodiment, alteration of the WNT signaling pathway involves autocrine signaling involving WNT. Preferably, the change in the WNT signaling pathway involves mutation of the APC or CTNNB1 gene. In a specific embodiment, the gene is APC and the mutation is selected from the group consisting of R213Q, R2673G, I1177M and D2796G. In another specific embodiment, the gene is CTNNB1 and the mutation is selected from the group consisting of Y670*, S45F and T41A. However, other changes in the WNT signaling pathway may also indicate a higher likelihood that the patient will be susceptible to treatment with a PRMT5 inhibitor.

В конкретном варианте осуществления мутация или изменение в соответствии с настоящим изобретением предусматривает изменение сплайсосомы, и при этом пациента имеется NSCLC.In a specific embodiment, the mutation or change in accordance with the present invention involves an alteration of the spliceosome, and the patient has NSCLC.

В другом конкретном варианте осуществления мутация или изменение в соответствии с настоящим изобретением предусматривает усиление сигнального пути циклина D1 или изменение сигнального пути WNT, и при этом у пациента имеется NSCLC.In another specific embodiment, the mutation or change according to the present invention involves an increase in the cyclin D1 signaling pathway or an alteration in the WNT signaling pathway, and the patient has NSCLC.

В другом конкретном варианте осуществления мутация или изменение в соответствии с настоящим изобретением предусматривает активирующую мутацию PIC3CA, а у пациента имеется SCLC.In another specific embodiment, the mutation or change in accordance with the present invention involves an activating mutation of PIC3CA, and the patient has SCLC.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитор PRMT5 представляет собой соединение 2 или соединение 80.In a preferred embodiment of the present invention, the PRMT5 inhibitor is Compound 2 or Compound 80.

В настоящей заявке раскрыта связь между восприимчивостью и мутациями, активирующими PI3K, при SCLC, и изменениями сплайсосомы и повышенной регуляцией сигнального пути WNT при NSCLC. Усиления сигнального пути циклина D1 ассоциированы с ответом на ингибиторы PRMT5 при NSCLC.This application discloses a link between susceptibility and PI3K activating mutations in SCLC and spliceosome alterations and upregulation of the WNT signaling pathway in NSCLC. Increases in cyclin D1 signaling are associated with response to PRMT5 inhibitors in NSCLC.

Наборы и праймеры для идентификации наличия одной или нескольких мутаций или изменений, описанных выше, в биологическом образце дополнительно предусмотрены в данном документе.Kits and primers for identifying the presence of one or more of the mutations or changes described above in a biological sample are further provided herein.

Более легкое понимание раскрытых способов, наборов и праймеров может быть достигнуто при обращении к следующему более подробному описанию, рассматриваемому в сочетании с прилагаемыми фигурами, которые образуют часть настоящего раскрытия. Следует понимать, что раскрытые способы, наборы и праймеры не ограничиваются конкретными способами, наборами и праймерами, описанными и/или показанными в данном документе, и что терминология, используемая в данном документе, представлена с целью описания конкретных вариантов осуществления только в качестве примера и не предполагает ограничения заявленных способов, наборов и праймеров.An easier understanding of the disclosed methods, kits, and primers may be achieved by reference to the following more detailed description, taken in conjunction with the accompanying drawings, which form a part of the present disclosure. It should be understood that the disclosed methods, kits and primers are not limited to the specific methods, kits and primers described and/or shown herein, and that the terminology used herein is presented for the purpose of describing specific embodiments by way of example only and not involves limitations of the claimed methods, kits and primers.

Отсылка на определенное числовое значение включает в себя по меньшей мере это конкретное значение, если из контекста явно не следует иное. Если приводится диапазон значений, то любой вариант осуществления включает в себя значения от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Кроме того, ссылка на значения, указанные в диапазонах, включает в себя все без исключения значения в пределах этого диапазона. Все диапазоны являются включающими и комбинируемыми.A reference to a specific numerical value includes at least that specific value unless the context clearly requires otherwise. If a range of values is given, then any embodiment includes values from one particular value and/or to another particular value. Additionally, reference to values specified in ranges includes any and all values within that range. All ranges are inclusive and combinable.

Следует понимать, что определенные свойства раскрытых способов, наборов и праймеров, которые для наглядности описаны в данном документе в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предусмотрены в комбинации в одном варианте осуществления. С другой стороны, различные свойства раскрытых способов, наборов и праймеров, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предусмотрены отдельно или в любой подкомбинации.It should be understood that certain properties of the disclosed methods, kits, and primers, which for clarity are described herein in the context of individual embodiments, may also be provided in combination in a single embodiment. On the other hand, various properties of the disclosed methods, kits and primers, which for brevity are described in the context of a single embodiment, may also be provided separately or in any subcombination.

Используемые в данном документе формы единственного числа включают формы множественного числа.The singular forms used herein include the plural forms.

Используемый в данном документе термин лечение и подобные термины относятся к уменьшению тяжести и/или частоты проявления симптомов рака, устранению симптомов рака и/или лежащей в основе причины указанных симптомов, уменьшению частоты или вероятности проявления симптомов рака и/или лежащей в их основе причины и уменьшению или восстановлению вреда, вызванного прямо или косвенно раком.As used herein, the term treatment and similar terms refer to reducing the severity and/or frequency of symptoms of cancer, eliminating symptoms of cancer and/or the underlying cause of said symptoms, reducing the frequency or likelihood of symptoms of cancer and/or the underlying cause thereof, and reducing or restoring harm caused directly or indirectly by cancer.

Термин биологические образцы относится к любому образцу от пациента, из которого могут быть получены раковые клетки и выделена РНК. Подходящие биологические образцы включают в себя без ограничения кровь, лимфатическую жидкость, костный мозг, образец солидной опухоли или любую их комбинацию.The term biological samples refers to any sample from a patient from which cancer cells can be obtained and RNA isolated. Suitable biological samples include, but are not limited to, blood, lymph fluid, bone marrow, a solid tumor sample, or any combination thereof.

Используемый в данном документе термин предамплификация относится к процедуре, связанной с ПЦР, которая проводится до стадии амплификации с целью повышения количества матричной cDNA для стадии амплификации. Стадию предамплификации можно осуществлять, например, с помощью мастер-микса TaqMan® PreAmp Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystems®, № продукта 4391128).As used herein, the term preamplification refers to a PCR-related procedure that is performed prior to the amplification step to increase the amount of template cDNA for the amplification step. The preamplification step can be carried out, for example, using a TaqMan® PreAmp Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystems®, Product No. 4391128).

Используемые в данном документе термины амплифицирование, амплифицировать и т.п. относятся к образованию множества идентичных копий образца нуклеиновой кислоты. Подходящие методики амплификации образца нуклеиновой кислоты включают без ограничения полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-PCR). В некоторых вариантах осуществления стадия амплификации предусматривает RT-PCR.As used herein, the terms amplification, amplify, etc. refer to the formation of multiple identical copies of a nucleic acid sample. Suitable techniques for amplifying a nucleic acid sample include, but are not limited to, polymerase chain reaction (PCR) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). In some embodiments, the amplification step involves RT-PCR.

Термин секвенирование следующего поколения или NGS относится к любому методу секвенирования, который определяет нуклеотидную последовательность либо отдельных молекул нуклеиновыхThe term next generation sequencing or NGS refers to any sequencing method that determines the nucleotide sequence or individual nucleic acid molecules

- 6 045888 кислот (например, при одномолекулярном секвенировании), либо клонально размноженных эквивалентов индивидуальных молекул нуклеиновых кислот в высокоскоростном параллельном способе (например, более 103, 104, 105 или более молекул можно секвенировать одновременно). Иллюстративные методики секвенирования следующего поколения включают секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования и секвенирование путем гибридизации. Иллюстративные методы секвенирования следующего поколения включают в себя массивно-параллельное опознавательное секвенирование (Lynx Therapeutics); 454-пиросеквенирование (454 Life Sciences/Roche Diagnostics); твердофазное секвенирование по методу обратимых меченых красителем терминаторов (Solexa/Illumina); технологию SOLiD (Applied Biosystems); ионное полупроводниковое секвенирование (Ion Torrent) и секвенирование ДНК на наносферах (Complete Genomics). Описания определенных платформ NGS можно найти в следующих источниках: Shendure, et al, Next-generation DNA sequencing, Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145; платформы NGS.- 6,045,888 acids (for example, in single-molecule sequencing), or clonally propagated equivalents of individual nucleic acid molecules in a high-speed parallel manner (for example, more than 103, 104, 105 or more molecules can be sequenced simultaneously). Exemplary next generation sequencing techniques include sequencing by synthesis, sequencing by ligation, and sequencing by hybridization. Exemplary next generation sequencing methods include massively parallel sequencing (Lynx Therapeutics); 454 pyrosequencing (454 Life Sciences/Roche Diagnostics); solid-phase sequencing using reversible dye-labeled terminators (Solexa/Illumina); SOLiD technology (Applied Biosystems); ion semiconductor sequencing (Ion Torrent) and DNA sequencing on nanospheres (Complete Genomics). Descriptions of specific NGS platforms can be found in the following references: Shendure, et al, Next-generation DNA sequencing, Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145; NGS platforms.

В некоторых вариантах осуществления при высокопроизводительном массивно-параллельном секвенировании используется секвенирование путем синтеза по методу обратимых меченых красителем терминаторов. В других вариантах осуществления секвенирование выполняют с помощью секвенирования путем лигирования. В еще одних вариантах осуществления секвенирование представляет собой секвенирование одной молекулы. Примеры методик секвенирования следующего поколения включают без ограничения пиросеквенирование, секвенирование по методу обратимых меченых красителем терминаторов, секвенирование SOLiD, ионное полупроводниковое секвенирование, одномолекулярное секвенирование Helioscope и т.д.In some embodiments, high-throughput massively parallel sequencing utilizes reversible dye-terminator synthesis sequencing. In other embodiments, sequencing is performed using ligation sequencing. In yet other embodiments, the sequencing is single molecule sequencing. Examples of next-generation sequencing techniques include, but are not limited to, pyrosequencing, reversible dye-terminator sequencing, SOLiD sequencing, semiconductor ion sequencing, Helioscope single-molecule sequencing, etc.

В системе секвенирования ампликонов Ion Torrent™ (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) используется проточный подход, который выявляет изменения значения рН, вызванные высвобождением ионов водорода во время включения немодифицированных нуклеотидов при репликации ДНК. Для применения в данной системе изначально получают библиотеку для секвенирования путем генерации фрагментов ДНК, фланкированных с помощью адаптеров для секвенирования. В некоторых вариантах осуществления эти образцы могут быть клонально амплифицированы на частицах путем эмульсионной ПЦР. Частицы с амплифицированной матрицей затем помещают в кремниевый полупроводниковый чип для секвенирования. Во время репликации чип заполняют одним нуклеотидом за другим, и если нуклеотид комплементарен молекуле ДНК в определенной микролунке в чипе, то будет происходить его включение. Когда нуклеотид включается с помощью полимеразы в молекулу ДНК, то естественным образом высвобождается протон, приводя к детектируемому локальному изменению значения рН. Значение рН раствора в этой лунке затем изменяется и выявляется с помощью ионного сенсора. Если гомополимерные повторы присутствуют в последовательности матрицы, то за один цикл будут включены несколько нуклеотидов. Это приводит к соответствующему количеству высвобожденного водорода и пропорционально более высокому электронному сигналу.The Ion Torrent™ Amplicon Sequencing System (Life Technologies, Carlsbad, CA) uses a flow-through approach that detects changes in pH caused by the release of hydrogen ions during the incorporation of unmodified nucleotides during DNA replication. For use in this system, a sequencing library is initially prepared by generating DNA fragments flanked with sequencing adapters. In some embodiments, these patterns may be clonally amplified on the particles by emulsion PCR. The amplified template particles are then placed on a silicon semiconductor chip for sequencing. During replication, the chip is filled with one nucleotide after another, and if the nucleotide is complementary to the DNA molecule in a particular microwell in the chip, then its inclusion will occur. When a nucleotide is incorporated into a DNA molecule by polymerase, a proton is naturally released, resulting in a detectable local change in pH value. The pH value of the solution in this well is then changed and detected using an ion sensor. If homopolymeric repeats are present in the template sequence, then several nucleotides will be included in one cycle. This results in a corresponding amount of hydrogen released and a proportionately higher electronic signal.

В системе секвенирования 454ТМ GS FLX™ (Roche, Германия) используется методика световой детекции в крупномасштабной параллельной системе пиросеквенирования. При пиросеквенировании используется полимеризация ДНК, добавляя по одной молекуле нуклеотида и осуществляя детекцию и количественную оценку числа нуклеотидов, добавленных к определенному положению, с помощью света, испускаемого при высвобождении присоединенных пирофосфатов. Для применения с системой 454™ фрагменты ДНК, лигированные с адаптером, фиксируют на небольших гранулах для захвата ДНК в эмульсии по типу вода в масле и амплифицируют путем ПЦР (эмульсионная ПЦР). Каждую связанную с ДНК гранулу помещают в лунку на пикотитровальный планшет, и реагенты для секвенирования доставляют во все лунки планшета. По четыре нуклеотида ДНК добавляют последовательно в установленном порядке во все лунки пикотитровального планшетного устройства во время цикла секвенирования. Во время прохождения потока нуклеотидов миллионы копий ДНК, связанных с каждой из гранул, секвенируют параллельно. Когда нуклеотид, комплементарный нити матрицы, добавляют в лунку, нуклеотид включается в существующую нить ДНК, генерируя световой сигнал, который записывается ПЗС-камерой в устройстве.The 454TM GS FLX™ sequencing system (Roche, Germany) uses light detection techniques in a large-scale parallel pyrosequencing system. Pyrosequencing uses DNA polymerization, adding nucleotides one molecule at a time, and detecting and quantifying the number of nucleotides added to a specific position using light emitted when the attached pyrophosphates are released. For use with the 454™ System, DNA fragments ligated to the adapter are captured onto small DNA capture beads in a water-in-oil emulsion and amplified by PCR (emulsion PCR). Each DNA-bound bead is placed into a well on a picotiter plate, and sequencing reagents are delivered to all wells of the plate. Four nucleotides of DNA are added sequentially in a prescribed order to all wells of a picotiter plate device during a sequencing run. As the nucleotide flows through, millions of copies of DNA associated with each bead are sequenced in parallel. When a nucleotide complementary to the template strand is added to a well, the nucleotide is incorporated into the existing DNA strand, generating a light signal that is recorded by a CCD camera in the device.

Технология секвенирования на основе обратимых меченых красителем терминаторов: молекулы ДНК вначале присоединяют к праймерам на пластине и амплифицируют таким образом, что образуются локальные клональные колонии. Добавляют четыре типа обратимых оснований-терминаторов (RTоснований), а невключенные нуклеотиды вымывают. В отличие от пиросеквенирования, ДНК может удлиняться только на один нуклеотид за один раз. Фотоаппарат фиксирует изображения флуоресцентно меченых нуклеотидов, затем краситель вместе с концевым 3'-блокатором химически удаляют из ДНК, обеспечивая возможность осуществления следующего цикла.Sequencing technology based on reversible dye-labeled terminators: DNA molecules are first attached to primers on the plate and amplified in such a way that local clonal colonies are formed. Four types of reversible terminator bases (RT bases) are added and unincorporated nucleotides are washed away. Unlike pyrosequencing, DNA can only be extended one nucleotide at a time. The camera captures images of fluorescently labeled nucleotides, then the dye, along with the 3' end blocker, is chemically removed from the DNA, allowing the next cycle to proceed.

При одномолекулярном секвенировании Helicos используются фрагменты ДНК с добавленными полиаденильными хвостовыми адаптерами, которые прикрепляются к поверхности проточной ячейки. При каждом цикле добавляются ДНК-полимераза и один вид молекул флуоресцентно меченого нуклеотида, приводя к зависимому от матрицы удлинению иммобилизированных на поверхности дуплексов праймер-матрица. Прочтения выполняли с помощью секвенатора Helioscope. После получения изобраHelicos single-molecule sequencing uses DNA fragments with added polyadenyl tail adapters that attach to the surface of the flow cell. At each cycle, DNA polymerase and one type of fluorescently labeled nucleotide molecule are added, leading to template-dependent elongation of surface-immobilized primer-template duplexes. Reads were performed using a Helioscope sequencer. After receiving the image

- 7 045888 жений, покрывающих полный массив, химическое расщепление и высвобождение флуоресцентной метки обеспечивает последующий цикл удлинения и визуализации.- 7,045,888 lines covering the entire array, chemical cleavage and release of the fluorescent tag allows for a subsequent cycle of extension and imaging.

Секвенирование путем синтеза (SBS), подобно устаревшему электрофоретическому секвенированию с использованием меченых красителем терминаторов, основано на включении нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы для определения последовательности оснований. Библиотеку ДНК с прикрепленными адаптерами денатурируют на отдельные нити и прививают к проточной ячейке с последующей мостиковой амплификацией с образованием высокоплотного массива пятен на стеклянном чипе. В методах на основе обратимых терминаторов используют обратимые варианты меченых красителем терминаторов, осуществляя добавление по одному нуклеотиду с выявлением флуоресценции в каждом положении в результате повторяющегося удаления блокирующей группы с обеспечением полимеризации присоединением другого нуклеотида. Сигнал, свидетельствующий о включении нуклеотида, может варьировать в зависимости от всех используемых флуоресцентно меченых нуклеотидов, опосредованных фосфатом световых реакций и детекции ионов водорода. Примеры платформ SBS включают в себя Illumina GA и HiSeq 2000. В системе персонального секвенирования MiSeq® (Illumina, Inc.) также используется секвенирование путем синтеза с помощью химии обратимых терминаторов.Sequencing by synthesis (SBS), similar to the older electrophoretic sequencing using dye-labeled terminators, relies on the incorporation of nucleotides by DNA polymerase to determine the sequence of the bases. The DNA library with attached adapters is denatured into individual strands and grafted onto a flow cell, followed by bridging amplification to generate a high-density array of spots on a glass chip. Reversible terminator methods use reversible versions of dye-labeled terminators by adding one nucleotide at a time, detecting fluorescence at each position as a result of repeated removal of the blocking group, allowing polymerization by adding another nucleotide. The signal indicating nucleotide incorporation may vary depending on all fluorescently labeled nucleotides used, phosphate-mediated light reactions, and hydrogen ion detection. Examples of SBS platforms include Illumina GA and HiSeq 2000. The MiSeq® Personal Sequencing System (Illumina, Inc.) also uses sequencing by synthesis using reversible terminator chemistry.

В отличие от метода секвенирования путем синтеза, в методе секвенирования путем лигирования используется ДНК-лигаза для определения целевой последовательности. Этот метод секвенирования основан на ферментативном лигировании олигонуклеотидов, которые располагаются рядом в результате локальной комплементарности на нити матричной ДНК. В данном технологии используется разделение всех возможных олигонуклеотидов определенной длины, меченых в соответствии с положением, подлежащим секвенированию. Олигонуклеотиды отжигают и лигируют, а предпочтительное лигирование с помощью ДНК-лигазы в случае совпадающих последовательностей приводит к образованию сигнала цветового пространства кодируемого динуклеотида в этом положении (путем высвобождения флуоресцентно меченого зонда, который соответствует известному нуклеотиду в известном положении в олигонуклеотиде). Данный метод преимущественно используется секвенаторами SOLiD™ от Life Technologies. Перед секвенированием ДНК амплифицируют с помощью эмульсионной ПЦР. Образующиеся в результате гранулы, каждая из которых содержит только копии одной и той же молекулы ДНК, помещают на твердый плоский субстрат.Unlike the sequencing-by-synthesis method, the sequencing-by-ligation method uses DNA ligase to determine the target sequence. This sequencing method is based on the enzymatic ligation of oligonucleotides that are located nearby as a result of local complementarity on the template DNA strand. This technology uses the separation of all possible oligonucleotides of a certain length, labeled according to the position to be sequenced. Oligonucleotides are annealed and ligated, and preferential ligation with a DNA ligase in the case of matching sequences results in a color space signal of the encoded dinucleotide at that position (by releasing a fluorescently labeled probe that matches a known nucleotide at a known position in the oligonucleotide). This method is primarily used by SOLiD™ sequencers from Life Technologies. Before sequencing, DNA is amplified using emulsion PCR. The resulting beads, each containing only copies of the same DNA molecule, are placed on a solid, flat substrate.

Секвенирование SMRT™ основано на секвенировании на основе подхода с использованием синтеза. ДНК синтезируется в лункообразных контейнерах с использованием волноводов нулевой моды (ZMW), при этом средства захвата располагаются на дне лунки. Секвенирование осуществляют с помощью немодифицированной полимеразы (прикрепленной ко дну ZMW) и флуоресцентно меченых нуклеотидов, свободно двигающихся в растворе. Лунки конструируют таким образом, чтобы выявлять только флуоресценцию, происходящую на дне лунки. Флуоресцентную метку отделяют от нуклеотида при его включении в нить ДНК, оставляя немодифицированную нить ДНК.SMRT™ sequencing is based on sequencing based on a synthesis approach. DNA is synthesized in well-shaped containers using zero mode waveguides (ZMW), with the capture means located at the bottom of the well. Sequencing is performed using unmodified polymerase (attached to the bottom of the ZMW) and fluorescently labeled nucleotides freely moving in solution. The wells are designed to detect only the fluorescence occurring at the bottom of the well. The fluorescent tag is separated from the nucleotide as it is incorporated into the DNA strand, leaving an unmodified DNA strand.

Праймеры для амплификации мутантных вариантов.Primers for amplification of mutant variants.

Специалисту в данной области техники известно, что для амплификации нуклеиновой кислоты требуются праймеры, которые являются комплементарными и связываются с 5'- и 3'-участками нити нуклеиновой кислоты, которые фланкируют область, подлежащую амплификации. Используемый в данном документе термин пара праймеров относится к прямому и обратному праймерам, используемым на стадии амплификации.One skilled in the art will know that nucleic acid amplification requires primers that are complementary to and bind to the 5' and 3' regions of the nucleic acid strand that flank the region to be amplified. As used herein, the term primer pair refers to the forward and reverse primers used in the amplification step.

Специалист в данной области техники может легко идентифицировать подходящие праймеры для амплификации и выявления определенных мутаций, описанных выше, с помощью известных способов.One skilled in the art can readily identify suitable primers for amplification and detection of the specific mutations described above using known methods.

Г еномика и анализ.Genomics and analysis.

Функциональная геномика и анализ транскрипции могут быть использованы для анализа усиления сигнальных путей и генов с помощью стандартных методик и протоколов.Functional genomics and transcriptional analysis can be used to analyze the amplification of signaling pathways and genes using standard techniques and protocols.

Ингибиторы PRMT5 для применения в раскрытых способах.PRMT5 inhibitors for use in the disclosed methods.

В данном документе предусмотрены подходящие ингибиторы PRMT5 для применения в раскрытых способах. В некоторых вариантах осуществления в случае, если одна или несколько мутаций или усилений, в том числе активирующая мутация PIC3CA, изменение сплайсосомы, усиление сигнального пути циклина D1 и/или изменение сигнального пути WNT присутствуют в образце, пациента можно лечить ингибитором PRMT5, раскрытым в документе РСТ/ЕР2016/070097 (включенном в данный документ посредством ссылки), в том числе любой его таутомерной или стереохимически изомерной формой, а также его N-оксидом, его фармацевтически приемлемыми солями или его сольватом (подходящие R-группы также раскрыты в РСТ/ЕР2016/070097). В некоторых аспектах, например, пациента можно лечить соединением 2 или соединением 80, в том числе любой их таутомерной или стереохимически изомерной формой, а также их N-оксидом, их фармацевтически приемлемыми солями или их сольватом. В некоторых аспектах фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.Provided herein are suitable PRMT5 inhibitors for use in the disclosed methods. In some embodiments, if one or more mutations or amplifications, including a PIC3CA activating mutation, a spliceosome alteration, an amplification of the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway are present in the sample, the patient may be treated with a PRMT5 inhibitor disclosed herein PCT/EP2016/070097 (incorporated herein by reference), including any tautomeric or stereochemically isomeric form thereof, as well as an N-oxide thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof (suitable R groups are also disclosed in PCT/EP2016 /070097). In some aspects, for example, a patient may be treated with Compound 2 or Compound 80, including any tautomeric or stereochemically isomeric form thereof, as well as an N-oxide thereof, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof. In some aspects, the pharmaceutically acceptable salt is an HCl salt.

В некоторых вариантах осуществления пациента можно лечить ингибитором PRMT5, если одна или несколько мутаций или усилений, в том числе активирующая мутация PIC3CA, изменение сплайсосомы, усиление сигнального пути циклина D1 и/или изменение сигнального пути WNT присутствуют в образIn some embodiments, a patient may be treated with a PRMT5 inhibitor if one or more mutations or amplifications, including an activating PIC3CA mutation, a spliceosome alteration, an amplification of the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway are present in the pattern.

- 8 045888 це, при этом ингибитор PRMT5 представляет собой антитело к PRMT5.- 8 045888 ce, wherein the PRMT5 inhibitor is an antibody to PRMT5.

Соли могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основный или кислотный фрагмент, традиционными химическими способами, такими как способы, описанные в Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 390639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002, которое включено в данный документе посредством ссылки. Как правило, такие соли могут быть получены путем реагирования свободных кислотных или основных форм этих соединений с подходящими основанием или кислотой в воде, или в органическом растворителе, или в смеси и того и другого; причем, как правило, используют неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Ингибиторы PRMT5 для применения в раскрытых способах могут существовать в виде моно- или дисолей в зависимости от рКа кислоты, с использованием которой образована соль.Salts can be synthesized from a starting compound that contains a basic or acidic moiety by conventional chemical methods, such as those described in Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor) , ISBN: 390639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002, which is incorporated herein by reference. In general, such salts can be prepared by reacting the free acid or base forms of these compounds with a suitable base or acid in water or an organic solvent or a mixture of both; and, as a rule, non-aqueous media are used, such as ether, ethyl acetate, ethanol, isopropanol or acetonitrile. PRMT5 inhibitors for use in the disclosed methods may exist as mono- or di-salts depending on the pKa of the acid with which the salt is formed.

Соли присоединения кислоты могут быть образованы с использованием множества кислот, являющихся как неорганическими, так и органическими. Примеры солей присоединения кислоты включают соли, образованные с помощью кислоты, включающей без ограничения уксусную, 2,2-дихлоруксусную, адипиновую, альгиновую, аскорбиновую (например, L-аскорбиновую), L-аспарагиновую, бензолсульфоновую, бензойную, 4-ацетамидобензойную, бутановую, (+)-камфорную, камфорсульфоновую, (+)-(1S)камфор-10-сульфоновую, каприновую, капроновую, каприловую, коричную, лимонную, цикламовую, додецилсерную, этан-1,2-дисульфоновую, этансульфоновую, 2-гидроксиэтансульфоновую, муравьиную, фумаровую, галактаровую, гентизиновую, глюкогептоновую, D-глюконовую, глюкуроновую (например, D-глюкуроновую), глутаминовую (например, L-глутаминовую), α-оксоглутаровую, гликолевую, гиппуровую, бромистоводородную, хлористоводородную, йодистоводородную, изэтиновую, молочную (например, (+)-Ь-молочную, (±)-DL-молочную), лактобионовую, малеиновую, яблочную, (-)-Ь-яблочную, малоновую, (±)-DL-миндальную, метансульфоновую, нафталинсульфоновую (например, нафталин-2сульфоновую), нафталин-1,5-дисульфоновую, 1-гидрокси-2-нафтойную, никотиновую, азотную, олеиновую, оротовую, щавелевую, пальмитиновую, памоевую, фосфорную, пропионовую, Lпироглутаминовую, пировиноградную, салициловую, 4-аминосалициловую, себациновую, стеариновую, янтарную, сернистую, дубильную, (+)-к-винную. тиоциановую, толуолсульфоновую (например, птолуолсульфоновую), ундециленовую и валериановую кислоты, а также ацилированные аминокислоты и катионообменные смолы.Acid addition salts can be formed using a variety of acids, both inorganic and organic. Examples of acid addition salts include salts formed with an acid including, but not limited to, acetic, 2,2-dichloroacetic, adipic, alginic, ascorbic (e.g., L-ascorbic), L-aspartic, benzenesulfonic, benzoic, 4-acetamidobenzoic, butane, (+)-camphor, camphorsulfonic, (+)-(1S)camphor-10-sulfonic, capric, capronic, caprylic, cinnamic, citric, cyclamic, dodecylsulfuric, ethane-1,2-disulfonic, ethanesulfonic, 2-hydroxyethanesulfonic, formic , fumaric, galactaric, gentisic, glucoheptonic, D-gluconic, glucuronic (for example, D-glucuronic), glutamic (for example, L-glutamic), α-oxoglutaric, glycolic, hippuric, hydrobromic, hydrochloric, hydroiodic, isethic, lactic (for example , (+)-L-lactic, (±)-DL-lactic), lactobionic, maleic, apple, (-)-L-apple, malonic, (±)-DL-almond, methanesulfonic, naphthalene sulfonic (for example, naphthalene- 2sulfonic), naphthalene-1,5-disulfonic, 1-hydroxy-2-naphthoic, nicotinic, nitric, oleic, orotic, oxalic, palmitic, pamoic, phosphoric, propionic, Lpyroglutamic, pyruvic, salicylic, 4-aminosalicylic, sebacic, stearic , amber, sulfurous, tannic, (+)-wine. thiocyanic, toluenesulfonic (eg ptoluenesulfonic), undecylenic and valeric acids, as well as acylated amino acids and cation exchange resins.

Одна конкретная группа солей состоит из солей, образованных из уксусной, хлористоводородной, йодистоводородной, фосфорной, азотной, серной, лимонной, молочной, янтарной, малеиновой, яблочной, изэтионовой, фумаровой, бензолсульфоновой, толуолсульфоновой, метансульфоновой (мезилата), этансульфоновой, нафталинсульфоновой, валериановой, уксусной, пропановой, бутановой, малоновой, глюкуроновой и лактобионовой кислот. Другая группа солей присоединения кислоты включает соли, образованные из уксусной, адипиновой, аскорбиновой, аспарагиновой, лимонной, DL-молочной, фумаровой, глюконовой, глюкуроновой, гиппуровой, хлористоводородной, глутаминовой, DL-яблочной, метансульфоновой, себациновой, стеариновой, янтарной и винной кислот.One particular group of salts consists of salts formed from acetic, hydrochloric, hydroiodic, phosphoric, nitric, sulfuric, citric, lactic, succinic, maleic, malic, isethionic, fumaric, benzenesulfonic, toluenesulfonic, methanesulfonic (mesylate), ethanesulfonic, naphthalene sulfonic, valeric , acetic, propane, butanoic, malonic, glucuronic and lactobionic acids. Another group of acid addition salts includes those formed from acetic, adipic, ascorbic, aspartic, citric, DL-lactic, fumaric, gluconic, glucuronic, hippuric, hydrochloric, glutamic, DL-malic, methanesulfonic, sebacic, stearic, succinic and tartaric acids .

Если соединение является анионным или имеет функциональную группу, которая может быть анионной (например, -СООН может представлять собой -COO-), то можно образовывать соль с подходящим катионом. Примеры подходящих неорганических катионов включают без ограничения ионы щелочных металлов, такие как Na+ и K+, катионы щелочноземельных металлов, такие как Са2+ и Mg2+, и другие катионы, такие как Al3+. Примеры подходящих органических катионов включают без ограничения ион аммония (т.е. NH4 +) и ионы замещенного аммония (например, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+).If the compound is anionic or has a functional group that can be anionic (eg, -COOH can be -COO- ), then a salt can be formed with a suitable cation. Examples of suitable inorganic cations include, but are not limited to, alkali metal ions such as Na + and K + , alkaline earth metal cations such as Ca 2+ and Mg2 + , and other cations such as Al 3+ . Examples of suitable organic cations include, but are not limited to, ammonium ion (ie, NH 4 + ) and substituted ammonium ions (eg, NH 3 R + , NH 2 R 2 + , NHR 3 + , NR 4 + ).

Примерами некоторых подходящих ионов замещенного аммония являются ионы, полученные из этиламина, диэтиламина, дициклогексиламина, триэтиламина, бутиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, пиперазина, бензиламина, фенилбензиламина, холина, меглумина и трометамина, а также аминокислот, таких как лизин и аргинин. Примером распространенного иона четвертичного аммония является N(CH3)4 +.Examples of some suitable substituted ammonium ions are those derived from ethylamine, diethylamine, dicyclohexylamine, triethylamine, butylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, piperazine, benzylamine, phenylbenzylamine, choline, meglumine and tromethamine, as well as amino acids such as lysine and arginine. An example of a common quaternary ammonium ion is N(CH 3 ) 4 + .

Если соединения содержат функциональную аминогруппу, то они могут формировать соли четвертичного аммония, например, путем реакции с алкилирующим средством согласно способам, хорошо известным специалисту. Такие соединения четвертичного аммония находятся в пределах объема раскрытых соединений. Соединения, содержащие функциональную аминогруппу, также могут образовывать Nоксиды. Упоминание в данном документе соединения, которое содержит функциональную аминогруппу, также предусматривает N-оксид. Если соединение содержит несколько функциональных аминогрупп, то один или несколько атомов азота могут быть окислены с образованием N-оксида. Конкретными примерами N-оксидов являются N-оксиды третичного амина или атома азота в азотсодержащем гетероцикле. N-оксиды могут быть образованы путем обработки соответствующего амина окислителем, таким как пероксид водорода или перкислота (например, пероксикарбоновая кислота), см., например, Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages. Более конкретно, N-оксиды могут быть получены с помощью процедуры из L.W. Deady (Syn. Сотт. (1977), 7, 509-514), при которой аминосоединение подвергают реакции с м-хлорпероксибензойной кислотой (МСРВА), например, в инертномIf the compounds contain an amino function, they can form quaternary ammonium salts, for example by reaction with an alkylating agent according to methods well known to the person skilled in the art. Such quaternary ammonium compounds are within the scope of the disclosed compounds. Compounds containing an amino functional group can also form Noxides. Reference herein to a compound that contains an amino function also includes an N-oxide. If a compound contains several amino functional groups, then one or more nitrogen atoms can be oxidized to form an N-oxide. Specific examples of N-oxides are N-oxides of a tertiary amine or a nitrogen atom in a nitrogen-containing heterocycle. N-oxides can be formed by treating the corresponding amine with an oxidizing agent such as hydrogen peroxide or a peracid (eg, peroxycarboxylic acid), see, for example, Advanced Organic Chemistry, by Jerry March, 4th Edition, Wiley Interscience, pages. More specifically, N-oxides can be prepared using a procedure from LW Deady (Syn. Sot. (1977), 7, 509-514), in which the amino compound is reacted with m-chloroperoxybenzoic acid (MCPBA), for example, in an inert

- 9 045888 растворителе, таком как дихлорметан.- 9 045888 solvent such as dichloromethane.

Используемый в данном документе термин сольват означает физическую связь соединения с одной или несколькими молекулами растворителя. Эта физическая связь подразумевает различную степень ионного и ковалентного связывания, включая водородную связь. В некоторых случаях сольват будет способен к выделению, например, когда одна или несколько молекул растворителя включены в кристаллическую решетку кристаллического твердого вещества. Подразумевается, что термин сольват охватывает как жидкофазовые, так и изолируемые сольваты. Неограничивающие примеры подходящих сольватов включают раскрытые соединения в комбинации с водой, изопропанолом, этанолом, метанолом, DMSO, этилацетатом, уксусной кислотой или этаноламином и т.п. Соединение может оказывать свои биологические эффекты, находясь в растворе.As used herein, the term solvate means the physical association of a compound with one or more solvent molecules. This physical bonding involves varying degrees of ionic and covalent bonding, including hydrogen bonding. In some cases, the solvate will be capable of separating, such as when one or more solvent molecules are incorporated into the crystal lattice of the crystalline solid. The term solvate is intended to cover both liquid phase and isolated solvates. Non-limiting examples of suitable solvates include the disclosed compounds in combination with water, isopropanol, ethanol, methanol, DMSO, ethyl acetate, acetic acid or ethanolamine and the like. The compound can exert its biological effects while in solution.

Сольваты хорошо известны в фармацевтической химии. Они могут быть важными для способов получения вещества (например, в отношении его очистки), хранения вещества (например, его стабильности) и удобства осуществления манипуляций с веществом, и зачастую их образуют как часть стадий выделения или очистки при химическом синтезе. Специалист в данной области сможет определить посредством стандартных и длительно используемых методик, образовался ли гидрат или другой сольват при условиях выделения или условиях очистки, используемых для получения данного соединения. Примеры таких методик включают в себя термогравиметрический анализ (TGA), дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC), рентгеновскую кристаллографию (например, монокристаллическую рентгеновскую кристаллографию или рентгеновскую порошковую дифрактометрию) и ЯМР твердого тела (SSNMR, также известный как ЯМР с вращением образца под магическим углом или MAS-NMR). Такие методики являются такой же частью стандартного аналитического инструментария квалифицированного химика, как ЯМР, IR, HPLC и MS. В качестве альтернативы квалифицированный специалист сможет при необходимости сформировать сольват с использованием условий кристаллизации, которые предусматривают количество растворителя, необходимое для конкретного сольвата. Впоследствии стандартные способы, описанные выше, могут быть использованы для установления формирования сольватов. Также охватываются любые комплексы (например, комплексы включения или клатраты с соединениями, такими как циклодекстрины, или комплексы с металлами) ингибитора PRMT5.Solvates are well known in pharmaceutical chemistry. They can be important to the methods of obtaining the substance (eg, its purification), the storage of the substance (eg, its stability) and the ease of handling the substance, and are often formed as part of the isolation or purification steps in chemical synthesis. One skilled in the art will be able to determine, through standard and routine techniques, whether a hydrate or other solvate has formed under the isolation conditions or purification conditions used to prepare a given compound. Examples of such techniques include thermogravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC), x-ray crystallography (such as single-crystal x-ray crystallography or x-ray powder diffraction) and solid-state nuclear magnetic resonance (SSNMR, also known as spinning NMR or magic angle spinning NMR). MAS-NMR). Such techniques are as much a part of a skilled chemist's standard analytical toolkit as NMR, IR, HPLC and MS. Alternatively, one skilled in the art will be able to form the solvate, if necessary, using crystallization conditions that provide the amount of solvent required for the particular solvate. Subsequently, standard methods described above can be used to determine the formation of solvates. Also covered are any complexes (eg, inclusion complexes or clathrates with compounds such as cyclodextrins, or complexes with metals) of a PRMT5 inhibitor.

Кроме того, соединение может иметь одну или несколько полиморфных (кристаллических) или аморфных форм.In addition, the compound may have one or more polymorphic (crystalline) or amorphous forms.

Соединения включают соединения с одним или несколькими изотопными замещениями, и упоминание конкретного элемента включает в свой объем все изотопы данного элемента. Например, упоминание водорода включает в свой объем 'Н. 2Н (D) и 3Н (Т). Подобным образом, упоминания углерода и кислорода включают в свой объем 12С, 13С и 14С и 16O и 18O соответственно. Изотопы могут быть радиоактивными или нерадиоактивными. В одном варианте осуществления соединения не содержат радиоактивные изотопы. Такие соединения являются предпочтительными для терапевтического применения. В другом варианте осуществления, однако, соединение может содержать один или несколько радиоизотопов. Соединения, содержащие такие радиоизотопы, могут быть применимы в диагностическом контексте.Compounds include those with one or more isotopic substitutions, and reference to a particular element includes within its scope all isotopes of that element. For example, the mention of hydrogen includes 'H' in its volume. 2 N (D) and 3 N (T). Similarly, references to carbon and oxygen include 12 C, 13 C and 14 C and 16 O and 18 O, respectively. Isotopes can be radioactive or non-radioactive. In one embodiment, the compounds do not contain radioactive isotopes. Such compounds are preferred for therapeutic use. In another embodiment, however, the compound may contain one or more radioisotopes. Compounds containing such radioisotopes may be useful in a diagnostic context.

В некоторых вариантах осуществления пациента лечат ингибитором PRMT5, если в образце присутствует один или несколько мутантных вариантов U2AF1, при этом ингибитор PRMT5 представляет собой соединение 2 или соединение 80, или их фармацевтически приемлемую соль, или их сольват.In some embodiments, the patient is treated with a PRMT5 inhibitor if one or more U2AF1 mutant variants are present in the sample, wherein the PRMT5 inhibitor is Compound 2 or Compound 80, or a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.

Способы лечения рака у пациента.Methods of treating cancer in a patient.

В данном документе раскрыты способы лечения рака у пациента, предусматривающие: оценку биологического образца от пациента на наличие одной или нескольких мутаций или усилений, в том числе активирующей мутации PIC3CA, изменения сплайсосомы, усиления сигнального пути циклина D1 и/или изменения сигнального пути WNT; и лечение пациента ингибитором PRMT5, если одна или несколько мутаций или усилений, в том числе активирующая мутация PIC3CA, изменение сплайсосомы, усиление сигнального пути циклина D1 и/или изменение сигнального пути WNT присутствуют в образце.Disclosed herein are methods of treating cancer in a patient, comprising: assessing a biological sample from the patient for the presence of one or more mutations or amplifications, including a PIC3CA activating mutation, a spliceosome alteration, an amplification of the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway; and treating the patient with a PRMT5 inhibitor if one or more mutations or amplifications, including a PIC3CA activating mutation, a spliceosome alteration, an amplification of the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway are present in the sample.

Раскрытые способы могут быть использованы для лечения ряда типов рака, в том числе без ограничения рака мочевого пузыря, метастатического рака мочевого пузыря, рака яичников, рака головы и шеи, рака пищевода, немелкоклеточной аденокарциномы легких, немелкоклеточной плоскоклеточной карциномы легких, рака предстательной железы, рака легких, рака желудочно-кишечного тракта, уротелиальной карциномы, мелкоклеточного рака легких, рака молочной железы, рака эндометрия, холангиокарциномы, глиобластомы, глиом, карциномы толстой кишки, сарком, солидных опухолей плоскоклеточного происхождения и множественной миеломы.The disclosed methods can be used to treat a number of types of cancer, including, but not limited to, bladder cancer, metastatic bladder cancer, ovarian cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, non-small cell lung adenocarcinoma, non-small cell squamous cell lung carcinoma, prostate cancer, cancer lung, gastrointestinal cancer, urothelial carcinoma, small cell lung cancer, breast cancer, endometrial cancer, cholangiocarcinoma, glioblastoma, gliomas, colon carcinoma, sarcomas, solid tumors of squamous cell origin and multiple myeloma.

В некоторых вариантах осуществления стадия оценки предусматривает: выделение РНК из биологического образца; синтез cDNA на основе выделенной РНК; предамплификацию cDNA; и амплификацию предамплифицированной cDNA с помощью пары праймеров, которые связывают и амплифицируют одну или несколько мутаций, в том числе активирующую мутацию PIC3CA, изменение сплайсосомы, усиление сигнального пути циклина D1 и/или изменением сигнального пути WNT.In some embodiments, the evaluation step comprises: isolating RNA from a biological sample; synthesis of cDNA based on isolated RNA; cDNA preamplification; and amplifying the pre-amplified cDNA with a pair of primers that bind and amplify one or more mutations, including a PIC3CA activating mutation, a spliceosome alteration, an increase in the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway.

Выделение РНК из биологического образца можно выполнять с помощью ряда процедур, известных специалисту в данной области техники. В одном варианте осуществления РНК можно выделить из биологического образца с помощью набора AllPrep DNA/RNA FFPE от Qiagen (продукт № 80234).Isolation of RNA from a biological sample can be performed using a number of procedures known to one skilled in the art. In one embodiment, RNA can be isolated from a biological sample using the AllPrep DNA/RNA FFPE kit from Qiagen (product no. 80234).

- 10 045888- 10 045888

Синтез cDNA на основе выделенной РНК можно осуществлять с помощью ряда процедур, известных специалисту в данной области. В одном варианте осуществления cDNA можно синтезировать на основе выделенной РНК с помощью высокопроизводительного набора на основе обратной транскриптазы cDNA с ингибитором РНКазы от ABI (продукт № 4374966).Synthesis of cDNA from isolated RNA can be accomplished using a number of procedures known to one skilled in the art. In one embodiment, cDNA can be synthesized from isolated RNA using the High Throughput cDNA Reverse Transcriptase Kit with RNase Inhibitor from ABI (Product No. 4374966).

Предамплификацию cDNA можно осуществлять с помощью ряда процедур, известных специалисту в данной области. Процедуры амплификации хорошо известны в данной области техники. В одном варианте осуществления cDNA можно предамплифицировать с помощью мастер-микса TaqMan® PreAmp Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystems®, продукт № 4391128).Preamplification of cDNA can be accomplished using a number of procedures known to one of ordinary skill in the art. Amplification procedures are well known in the art. In one embodiment, cDNA can be preamplified using TaqMan® PreAmp Master Mix (Life Technologies/Applied Biosystems®, product no. 4391128).

Подходящие ингибиторы PRMT5 для применения в способах лечения включают описанные ранее в данном документе.Suitable PRMT5 inhibitors for use in the treatment methods include those described previously herein.

Способы идентификации пациента, имеющего рак, который будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором белковой аргинин-Н-метилгрансферазы 5 (PRMT5).Methods for identifying a patient having cancer that will be responsive to treatment with a protein arginine H-methylgranferase 5 (PRMT5) inhibitor.

Наборы для идентификации наличия мутантных или измененных генов.Kits for identifying the presence of mutant or altered genes.

Кроме того, раскрыты наборы для идентификации наличия одной или нескольких мутаций или усилений, в том числе активирующей мутации PIC3CA, изменения сплайсосомы, усиления сигнального пути D1 и/или изменения сигнального пути WNT в биологическом образце, содержащие: пары праймеров, имеющих последовательности их комбинации; и инструкции для осуществления анализа для выявления одной или нескольких мутаций или усилений, в том числе активирующей мутации PIC3CA, изменения сплайсосомы, усиления сигнального пути циклина D1 и/или изменения сигнального пути WNT.In addition, kits are disclosed for identifying the presence of one or more mutations or amplifications, including an activating mutation of PIC3CA, a spliceosome alteration, an amplification of the D1 signaling pathway, and/or an alteration of the WNT signaling pathway in a biological sample, containing: pairs of primers having sequences of their combination; and instructions for performing an assay to detect one or more mutations or amplifications, including a PIC3CA activating mutation, a spliceosome alteration, an amplification of the cyclin D1 signaling pathway, and/or an alteration in the WNT signaling pathway.

Краткое описание, а также нижеследующее подробное описание будут более понятны при их рассмотрении в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. С целью иллюстрации раскрытых способов, наборов и праймеров в графических материалах показаны иллюстративные варианты осуществления способов, наборов и праймеров; однако способы, наборы и праймеры не ограничены конкретными раскрытыми вариантами осуществления.The Brief Description, as well as the following detailed description, will be better understood when considered in conjunction with the accompanying graphics. For the purpose of illustrating the disclosed methods, kits and primers, the graphics show illustrative embodiments of the methods, kits and primers; however, the methods, kits, and primers are not limited to the specific embodiments disclosed.

Подробное описание иллюстративных вариантов осуществленияDetailed Description of Illustrative Embodiments

Ингибиторы PRMT5, представляющие собой соединения 2 и 80, используемые в примерах, также представлены в качестве примера в документе РСТ/ЕР2016/070097.The PRMT5 inhibitors compounds 2 and 80 used in the examples are also presented as an example in document PCT/EP2016/070097.

Далее в данном документе термин кт, к.т. или КТ означает комнатную температуру; Me означает метил; МеОН означает метанол; Et означает этил; EtOH означает этанол; NaH означает гидрид натрия; DEAD означает диэтилазодикарбоксилат; НМРТ означает гексаметилфосфора триамид; Boc2O означает трет-бутоксикарбонила ангидрид; ButONO означает трет-бутилнитрит; TosOH означает 4-метилбензолсульфоновую кислоту; TosCl означает 4-метилбензолсульфонилхлорид (также п-толуолсульфонилхлорид); СМВР означает цианометилентрибутилфосфоран; DBAD означает дитрет-бутилазодикарбоксилат; LAH означает алюмогидрид лития; NaBH(AcO)3 или NaBH(OAc)3 означает триацетоксиборгидрид натрия; EtOAc означает этилацетат; TEA или Et3N означает триэтиламин; DCM означает дихлорметан; q.s. означает достаточное количество; пром. соед. означает промежуточное соединение; MeCN или ACN означает ацетонитрил; DMF означает N,Nдиметилформамид; DMA означает N,N-диметилαцетамид; DMF-DMA означает N,Nдиметилформамида диметилацеталь; Pd(dppf)Cl2 означает [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(П); THF означает тетрагидрофуран;Further in this document the term ct, kt. or RT means room temperature; Me means methyl; MeOH means methanol; Et means ethyl; EtOH means ethanol; NaH means sodium hydride; DEAD means diethyl azodicarboxylate; HMPT means hexamethylphosphorus triamide; Boc 2 O means tert-butoxycarbonyl anhydride; ButONO means tert-butyl nitrite; TosOH means 4-methylbenzenesulfonic acid; TosCl means 4-methylbenzenesulfonyl chloride (also p-toluenesulfonyl chloride); CMBP means cyanomethylenetributylphosphorane; DBAD means di-tert-butyl azodicarboxylate; LAH means lithium aluminum hydride; NaBH(AcO) 3 or NaBH(OAc) 3 means sodium triacetoxyborohydride; EtOAc means ethyl acetate; TEA or Et 3 N means triethylamine; DCM means dichloromethane; qs means sufficient quantity; prom. conn. means intermediate connection; MeCN or ACN means acetonitrile; DMF means N,Ndimethylformamide; DMA means N,N-dimethylαcetamide; DMF-DMA means N,Ndimethylformamide dimethyl acetal; Pd(dppf)Cl 2 means [1,1'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(P); THF means tetrahydrofuran;

C34H28FeP2.Cl2Pd означает [1,Г-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(п); i-PrOH или iPrOH означает 2-пропанол; LC означает жидкостную хроматографию; LCMS означает жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию; HPLC означает высокоэффективную жидкостную хроматографию; пром. соед. означает промежуточное соединение; prep-HPLC означает препаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию; m-СРВА означает мета-хлорпероксибензойную кислоту; TFA означает трифторуксусную кислоту; т. пл. означает температуру плавления; RP означает обращенную фазу; мин означает минуту(минуты); ч означает час(ы); РЕ означает петролейный эфир; об./об. означает отношение объема к объему; Celite® означает диатомитовую землю; DMSO означает диметилсульфоксид; SFC означает сверхкритическую флюидную хроматографию; DIPE означает диизопропиловый эфир; dppf или DPPF означает 1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен; DIPEA или DIEA означает N,N-диизопропилэтилαмин; PPh3 означает трифенилфосфин; Et2O означает диэтиловый эфир; Pd/C означает палладий на угле; Pt/C означает платину на угле; Pd(OH)2/C означает гидроксид палладия на угле; СРМЕ означает циклопентилметиловый эфир; Pd2(dba)3 означает трис(дибензилиденацетон)дипалладий; DIAD означает диизопропилазодикарбоксилат; TMSCF3 означает триметил(трифторметил)силан; TBAF означает тетрабутиламмония фторид; фунт/кв. дюйм означает фунт-силу на квадратный дюйм; Et4NCl означает тетраэтиламмония хлорид; экв. означает эквивалент(ы); Pd(OAc)2 означает ацетат палладия(П); АсОН означает уксусную кислоту; DMAP означает 4-(диметиламино)пиридин; t-BuOK, tBuOK или KOtBuозначает трет-бутоксид калия; периодинан Десс-Мартина означает 1,1,1-триацетокси-1,1-дигидро-1,2-бензиодоксол-3(1Н)-он; TBDMSCl означает трет-бутилдиметилсилилхлорид; PPh3-полимер или PPh3-pol означает полимерсвязанный трифенилфосфин; Ph3PCH3Br означает метилтрифенилфосфония бромид; Bn означаетC 34 H 28 FeP 2 .Cl 2 Pd means [1,G-bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(n); i-PrOH or iPrOH means 2-propanol; LC means liquid chromatography; LCMS stands for liquid chromatography/mass spectrometry; HPLC stands for High Performance Liquid Chromatography; prom. conn. means intermediate connection; prep-HPLC means preparative high performance liquid chromatography; m-CPBA means meta-chloroperoxybenzoic acid; TFA means trifluoroacetic acid; m.p. means melting point; RP means reversed phase; min means minute(s); h means hour(s); PE means petroleum ether; v/v means volume to volume ratio; Celite® means diatomaceous earth; DMSO means dimethyl sulfoxide; SFC stands for supercritical fluid chromatography; DIPE means diisopropyl ether; dppf or DPPF means 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene; DIPEA or DIEA means N,N-diisopropylethylamine; PPh 3 means triphenylphosphine; Et 2 O means diethyl ether; Pd/C means palladium on carbon; Pt/C means platinum on carbon; Pd(OH) 2 /C means palladium hydroxide on carbon; CPME means cyclopentyl methyl ether; Pd 2 (dba) 3 means tris(dibenzylideneacetone)dipalladium; DIAD means diisopropyl azodicarboxylate; TMSCF3 means trimethyl(trifluoromethyl)silane; TBAF means tetrabutylammonium fluoride; psi inch means pound-force per square inch; Et 4 NCl means tetraethylammonium chloride; eq. means equivalent(s); Pd(OAc) 2 means palladium(P) acetate; AcOH means acetic acid; DMAP means 4-(dimethylamino)pyridine; t-BuOK, tBuOK or KOtBu means potassium tert-butoxide; Dess-Martin periodinane means 1,1,1-triacetoxy-1,1-dihydro-1,2-benziodoxol-3(1H)-one; TBDMSCl means tert-butyldimethylsilyl chloride; PPh 3 -polymer or PPh 3 -pol means polymer-bound triphenylphosphine; Ph 3 PCH 3 Br means methyltriphenylphosphonium bromide; Bn means

- 11 045888 бензил; Bz означает бензоил; p-TSA означает 4-метилбензолсульфоновую кислоту; BF3.Et2O означает комплекс бора трифторида-этилового эфира; 9-BBN означает 9-борабицикло[3.3.1]нонан; Pd-118 означает дихлор[1,Г-бис(ди-трет-бутилфосфино)ферроцен]палладий(П); и TLC означает тонкослойную хроматографию; prep-TLC означает препаративную TLC; p-MeC6H4SO3H.H2O означает паратолуолсульфоновой кислоты гидрат; РМВ означает пара-метоксибензил; KOAc означает ацетат калия; PTSA означает пара-толуолсульфоновую кислоту; МТВЕ означает метил-трет-бутиловый эфир; Rh(acac)(eth)2 означает ацетилацетонатобис(этилен)родий([); (S)-MonoPhos означает (S)-N,Nдиметилдинафто[2,1-О:Г,2'-Р][1,3,2]диоксафосфепин-4-амин; Tf2O означает трифторметансульфоновый ангидрид; MeI означает метилйодид; Me2NH означает диметиламин; Me2NH.HCl означает диметиламин-хлористоводородная кислота; Me4NCl означает тетраметиламмония хлорид; MeONa означает метоксид натрия; Ts означает тозил; MsCl означает мезилхлорид; DIBAH означает диизобутилалюминия гидрид; TBDMS означает трет-бутилдиметилсилил; Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2 означает [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(П) в комплексе с дихлорметаном; РРА означает полифосфорную кислоту;КН2Вп означает бензиламин; Pd(PPh3)2Cl2 означает дихлорбис(трифенилфосфин)палладий(П).- 11 045888 benzyl; Bz means benzoyl; p-TSA means 4-methylbenzenesulfonic acid; BF3.Et2O means boron trifluoride-ethyl ether complex; 9-BBN means 9-borabicyclo[3.3.1]nonane; Pd-118 means dichloro[1,G-bis(di-tert-butylphosphino)ferrocene]palladium(P); and TLC means thin layer chromatography; prep-TLC means preparative TLC; p-MeC 6 H 4 SO 3 HH 2 O means paratoluenesulfonic acid hydrate; PMB means para-methoxybenzyl; KOAc means potassium acetate; PTSA means p-toluenesulfonic acid; MTBE means methyl tert-butyl ether; Rh(acac)(eth)2 means acetylacetonatobis(ethylene)rhodium([); (S)-MonoPhos means (S)-N,Ndimethyldinaphtho[2,1-O:G,2'-P][1,3,2]dioxaphosphepin-4-amine; Tf 2 O means trifluoromethanesulfonic anhydride; MeI means methyl iodide; Me 2 NH means dimethylamine; Me 2 NH.HCl means dimethylamine hydrochloric acid; Me 4 NCl means tetramethylammonium chloride; MeONa means sodium methoxide; Ts means tosyl; MsCl means mesyl chloride; DIBAH means diisobutylaluminum hydride; TBDMS means tert-butyldimethylsilyl; Pd(dppf)Cl 2 .CH 2 Cl 2 means [1,1'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(P) complexed with dichloromethane; PPA means polyphosphoric acid; KH 2 Bp means benzylamine; Pd(PPh 3 ) 2 Cl 2 means dichlorobis(triphenylphosphine)palladium(P).

Для промежуточных соединений, которые применяли на следующей стадии реакции в качестве не очищенного или частично очищенного промежуточного соединения, рассчитанные мольные количества (в некоторых случаях указанные при помощи «) указаны в протоколах реакций, описанных ниже, или, в качестве альтернативы, указаны теоретические мольные количества.For intermediates that were used in the next reaction step as an unrefined or partially purified intermediate, the calculated molar amounts (in some cases indicated by ") are indicated in the reaction protocols described below, or alternatively the theoretical molar amounts are indicated .

Получение промежуточного соединения 1Preparation of intermediate 1

В смесь 6-хлор-7-деазапуринбета^-рибозида (25,0 г, 87,5 ммоль) в ацетоне (330 мл) одной порцией добавляли 2,2-диметоксипропан (18,2 г, 175 ммоль) и 4-метилбензолсульфоновую кислоту (TosOH) (1,51 г, 8,75 ммоль) при 25°С в атмосфере N2. Смесь перемешивали при 60°С в течение 2 ч. Смесь охлаждали до 25°С. Реакцию гасили путем медленного добавления насыщенного NaHCO3 (100 мл) и затем экстрагировали этилацетатом (125 мл х5). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором (120 мл), высушивали с помощью безводного MgSO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (градиентное элюирование: DCM/этилацетат от 1:0 до 2:1) с получением неочищенного промежуточного соединения 1 (38,0 г) в виде светло-желтой камеди.To a mixture of 6-chloro-7-deazapurine beta-riboside (25.0 g, 87.5 mmol) in acetone (330 ml), 2,2-dimethoxypropane (18.2 g, 175 mmol) and 4-methylbenzenesulfonic acid were added in one portion. acid (TosOH) (1.51 g, 8.75 mmol) at 25°C in an N2 atmosphere. The mixture was stirred at 60°C for 2 hours. The mixture was cooled to 25°C. The reaction was quenched by slowly adding saturated NaHCO 3 (100 ml) and then extracted with ethyl acetate (125 ml x5). The combined organic phase was washed with brine (120 ml), dried with anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified by silica gel chromatography (gradient elution: DCM/ethyl acetate 1:0 to 2:1) to give crude intermediate 1 (38.0 g) as a light yellow gum.

Получение промежуточного соединения 59Obtaining intermediate compound 59

Диизопропилазодикарбоксилат (0,221 мл, 1,125 ммоль) добавляли по каплям в перемешанную суспензию промежуточного соединения 1 (0,27 г, 0,80 ммоль), 3-бромхинолин-7-ола (0,18 г, 0,80 ммоль) и трифенилфосфиновой смолы (0,375 г, 3 ммоль/г, 1,125 ммоль) в THF (8 мл) при комнатной температуре. После добавления реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч. Реакционную смесь фильтровали через подушку из Dicalite®. Остаток промывали метанолом. Растворители из фильтрата выпаривали. Остаток использовали как таковой на следующей стадии.Diisopropyl azodicarboxylate (0.221 mL, 1.125 mmol) was added dropwise to a stirred suspension of intermediate 1 (0.27 g, 0.80 mmol), 3-bromoquinolin-7-ol (0.18 g, 0.80 mmol) and triphenylphosphine resin (0.375 g, 3 mmol/g, 1.125 mmol) in THF (8 ml) at room temperature. After addition, the reaction mixture was stirred for 18 hours. The reaction mixture was filtered through a Dicalite® pad. The residue was washed with methanol. The solvents from the filtrate were evaporated. The residue was used as such in the next step.

Получение промежуточного соединения 105Preparation of intermediate 105

Неочищенное промежуточное соединение 59 (q.s., теоретически 0,83 ммоль) растворяли в 7М NH3 в МеОН (20 мл, 7М, 140 ммоль). Полученный раствор перемешивали и нагревали при 130°С при помощи микроволнового излучения в течение 2 ч. Растворители выпаривали. Остаток растворяли в дихлорметане и очищали на колонке с SiO2, типа Grace Reveleris SRC, 12 г, Si 40, на системе очистки Grace Reveleris X2, используя дихлорметан и метанол в качестве элюентов с градиентом, начиная со 100% DCM для 20Crude intermediate 59 (qs, theoretical 0.83 mmol) was dissolved in 7M NH3 in MeOH (20 mL, 7M, 140 mmol). The resulting solution was stirred and heated at 130°C using microwave radiation for 2 hours. The solvents were evaporated. The residue was dissolved in dichloromethane and purified on a SiO 2 column, type Grace Reveleris SRC, 12 g, Si 40, on a Grace Reveleris X2 purification system using dichloromethane and methanol as eluents with a gradient starting from 100% DCM for 20

- 12 045888 объемов колонки до 20% МеОН и 80% DCM для 20 объемов колонки. Фракции, содержащие продукт, объединяли, и выпаривали растворители с получением неочищенного промежуточного соединения 105 (175 мг), которое применяли как таковое на следующей стадии реакции.- 12,045,888 column volumes up to 20% MeOH and 80% DCM for 20 column volumes. The product containing fractions were combined and the solvents were evaporated to give crude intermediate 105 (175 mg), which was used as such in the next reaction step.

Получение соединения 2Receiving Connection 2

BrBr

nh2 но он nh 2 but he

Соединение 2Connection 2

BrBr

nh2 nh 2

н. НС1 в 1,4-диоксане, МеОН, к. т., 18 ч.n. HC1 in 1,4-dioxane, MeOH, rt., 18 h.

Промежуточное соединение 105Intermediate 105

4М HCl в диоксане (0,7 мл, 2,9 ммоль) добавляли в перемешанный раствор промежуточного соединения 105 (175,1 г, неочищенное, -0,29 ммоль) в МеОН (10 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакцию гасили добавлением 1,5 мл 7 н. раствора NH3 в МеОН. Растворители выпаривали. Остаток растворяли в DCM. Осадок отфильтровывали. Фильтрат очищали на колонке с SiO2, типа Grace Reveleris SRC, 12 г, Si 40, на системе для очистки Armen Spot II Ultimate, используя DCM и МеОН в качестве элюентов в градиенте, начиная со 100% DCM и заканчивая 40% МеОН и 60% DCM. Фракции, содержащие продукт, объединяли, и растворители выпаривали с получением 24,5 мг соединения 2.4M HCl in dioxane (0.7 mL, 2.9 mmol) was added to a stirred solution of intermediate 105 (175.1 g, crude, -0.29 mmol) in MeOH (10 mL) at room temperature. The reaction mixture was stirred at room temperature for 18 hours. The reaction was quenched by adding 1.5 ml of 7 N. solution of NH 3 in MeOH. The solvents were evaporated. The residue was dissolved in DCM. The precipitate was filtered off. The filtrate was purified on a SiO 2 column, type Grace Reveleris SRC, 12 g, Si 40, on an Armen Spot II Ultimate purification system using DCM and MeOH as eluents in a gradient starting from 100% DCM to 40% MeOH and 60 % DCM. The product containing fractions were combined and the solvents were evaporated to give 24.5 mg of compound 2.

Получение промежуточного соединения 10 ciPreparation of 10 ci intermediate

Промежуточное соединение 9 пропан-2-ол / Н2О (7:1), 90°С, 23 часа »Intermediate 9 propan-2-ol/ H2O (7:1), 90°C, 23 hours"

I 1 М НС1, 50°С, 2 часа .I 1 M HC1, 50°C, 2 hours.

Стадия а)Stage a)

В смесь 4,6-дихлор-5-(2,2-диэтоксиэтил)пиримидина (14,0 г, 52,8 ммоль) и гидрохлорида (1R, 2S,3R,5R)-3-амино-5-(гидроксиметил)циклопентан-1,2-диола (10,7 г, 58,1 ммоль) в пропан-2-оле/Н20 (208 мл, 7:1) одной порцией добавляли Et3N (13,4 г, 132 ммоль) при 25°С в атмосфере N2. Смесь перемешивали при 90°С в течение 23 ч. Смесь охлаждали до 50°С, и медленно добавляли 4М HCl (24 мл, 106 ммоль). Остаток затем перемешивали при 50°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали до 25°С, и медленно добавляли NaHCO3 (14 г, 100 ммоль). Добавляли этилацетат (230 мл) с последующим добавлением полунасыщенного раствора NaHCO3 (q.s.). Органическую фазу выделяли, и водную фазу экстрагировали этилацетатом (230 мл х2). Объединенную органическую фазу высушивали над безводным MgSO4, фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением промежуточного соединения 9 в виде желтого твердого вещества (17,4 г, количественный выход на 2 стадиях). Неочищенный продукт непосредственно применяли как таковой на следующей стадии реакции без дополнительной очистки.In a mixture of 4,6-dichloro-5-(2,2-diethoxyethyl)pyrimidine (14.0 g, 52.8 mmol) and (1R, 2S,3R,5R)-3-amino-5-(hydroxymethyl) hydrochloride cyclopentane-1,2-diol (10.7 g, 58.1 mmol) in propan-2-ol/H20 (208 ml, 7:1) was added in one portion with Et 3 N (13.4 g, 132 mmol) at 25°C in N 2 atmosphere. The mixture was stirred at 90°C for 23 hours. The mixture was cooled to 50°C, and 4M HCl (24 ml, 106 mmol) was slowly added. The residue was then stirred at 50°C for 2 hours. The reaction mixture was cooled to 25°C and NaHCO 3 (14 g, 100 mmol) was added slowly. Ethyl acetate (230 ml) was added followed by the addition of half-saturated NaHCO 3 solution (qs). The organic phase was isolated and the aqueous phase was extracted with ethyl acetate (230 ml x2). The combined organic phase was dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo to give intermediate 9 as a yellow solid (17.4 g, quantitative yield in 2 steps). The crude product was directly used as such in the next reaction step without further purification.

Стадия b)Stage b)

ClCl

MeO.OMe но онMeO.OMe but he

TosOHTosOH

Промежуточное соединение 10Intermediate 10

Промежуточное соединение 9Intermediate 9

В смесь промежуточного соединения 9 (17,4 г, -52,7 ммоль) в ацетоне (250 мл) добавляли 2,2диметоксипропан (11,0 г, 105 ммоль) и TsOH.H2O (908 мг, 5,27 ммоль) одной порцией при 25°С в атмосфере N2. Смесь перемешивали при 60°С в течение 2 ч. Смесь охлаждали до 25°С, и раствор концентрировали под вакуумом, медленно гасили насыщенным NaHCO3 (100 мл), а затем экстрагировали этилацетатом (100 мл х3). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором (100 мл), сушили над безводным MgSO4, отфильтровывали и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на силикагеле (градиентное элюирование: DCM/этилацетат от 1/0 до 2/1) с получением промежуточного соединения 10 в виде светло-желтой камеди (15,5 г, выход 89%).To a mixture of intermediate 9 (17.4 g, -52.7 mmol) in acetone (250 ml) was added 2,2dimethoxypropane (11.0 g, 105 mmol) and TsOH.H 2 O (908 mg, 5.27 mmol ) in one portion at 25°C in an N 2 atmosphere. The mixture was stirred at 60°C for 2 hours. The mixture was cooled to 25°C and the solution was concentrated in vacuo, quenched slowly with saturated NaHCO3 (100 ml) and then extracted with ethyl acetate (100 ml x3). The combined organic phase was washed with brine (100 ml), dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified by flash chromatography on silica gel (gradient elution: DCM/ethyl acetate 1/0 to 2/1) to give intermediate 10 as a light yellow gum (15.5 g, 89% yield).

Получение промежуточного соединения 33Preparation of intermediate 33

- 13 045888- 13 045888

Cl реактив Десса-МартинаCl Dess-Martin reagent

DCMDCM

ClCl

Промежуточное соединение 1Intermediate 1

Промежуточное соединение 33Intermediate 33

В смесь промежуточного соединения 1 (2,00 г, теоретически 6,18 ммоль) в DCM (40 мл) одной порцией добавляли перйодинан Десса-Мартина (5,24 г, 12,36 ммоль) при 0°С в атмосфере N2. Смесь перемешивали при 0°С в течение 3 ч. В смесь добавляли Na2S2O3 (4 г) в насыщенном NaHCO3 (20 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Водную фазу экстрагировали с помощью DCM (20 мл х3). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором (20 мл х2), сушили над безводным MgSO4, фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением промежуточного соединения 33 (1,80 г, неочищенное) в виде светло-желтой камеди. Неочищенный продукт непосредственно применяли на следующей стадии реакции без дополнительной очистки.To a mixture of intermediate 1 (2.00 g, theoretical 6.18 mmol) in DCM (40 ml) was added Dess-Martin periodinane (5.24 g, 12.36 mmol) in one portion at 0° C. under N2. The mixture was stirred at 0°C for 3 hours. Na 2 S 2 O 3 (4 g) in saturated NaHCO 3 (20 ml) was added to the mixture and stirred for 10 minutes. The aqueous phase was extracted with DCM (20 ml x3). The combined organic phase was washed with brine (20 ml x2), dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo to give intermediate 33 (1.80 g, crude) as a light yellow gum. The crude product was directly used in the next reaction step without further purification.

Промежуточные соединения, указанные ниже, получали с помощью протокола реакции, аналогичного применяемому для получения промежуточного соединения 33, с применением соответствующих исходных веществ (табл. 6).The intermediates listed below were prepared using a reaction protocol similar to that used for the preparation of intermediate 33, using the appropriate starting materials (Table 6).

Пром. соед.Prom. conn.

ИсходноеOriginal

Таблица 6Table 6

СтруктураStructure

веществоsubstance

Промежуточное соединение 10Intermediate 10

Способ 1.Method 1.

Получение промежуточного соединения 3 8Obtaining intermediate compound 3 8

C1 Ph3PCH3Br ‘Buck, THF C1 Ph 3 PCH 3 Br 'Buck, THF

Промежуточное соединение 35Intermediate 35

Промежуточное соединение 38Intermediate 38

В смесь метилтрифенилфосфония бромида (4,87 г, 13,62 ммоль) в THF (500 мл) добавляли t-BuOK (11,4 мл, 1M в THF, 1,27 г, 11,35 ммоль,) по каплям при 0°С в атмосфере N2. Суспензия становилась ярко-желтой, и ее перемешивали при 0°С в течение 0,5 ч, а затем нагревали до 25°С в течение 0,5 ч. Смесь охлаждали до -40°С. Добавляли по каплям раствор промежуточного соединения 35 (1,46 г, теоретически 4,54 ммоль) в THF (130,0 мл), а затем перемешивали при -20°С в течение 1 ч, после этого смесь нагревали до 25°С в течение 2 ч. В смесь добавляли насыщенный NH4C1 (300 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Слои разделяли, и водную фазу экстрагировали с помощью DCM (300 мл х2). Объединенную органическую фазу промывали насыщенным солевым раствором (500 мл), высушивали с помощью безводного MgSO4, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (ISCO®; 80 г колонка SepaFlash® для флэш-хроматографии на силикагеле, градиентное элюирование: от 0 до 15% этилацетата/петролейного эфира). Необходимые фракции собирали, и растворитель выпаривали. Промежуточное соединение 38 получали в виде грязно-белого твердого вещества (530 мг, выход 36%).To a mixture of methyltriphenylphosphonium bromide (4.87 g, 13.62 mmol) in THF (500 ml) add t-BuOK (11.4 ml, 1M in THF, 1.27 g, 11.35 mmol) dropwise at 0 °C in N2 atmosphere. The suspension turned bright yellow and was stirred at 0°C for 0.5 hours and then heated to 25°C for 0.5 hours. The mixture was cooled to -40°C. A solution of intermediate 35 (1.46 g, theoretical 4.54 mmol) in THF (130.0 ml) was added dropwise and then stirred at -20°C for 1 hour, after which the mixture was heated to 25°C in for 2 hours. Saturated NH4C1 (300 ml) was added to the mixture and stirred for 10 minutes. The layers were separated and the aqueous phase was extracted with DCM (300 ml x2). The combined organic phase was washed with brine (500 ml), dried with anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified by silica gel chromatography (ISCO®; 80 g SepaFlash® silica gel flash column, gradient elution: 0 to 15% ethyl acetate/petroleum ether). The required fractions were collected and the solvent was evaporated. Intermediate 38 was obtained as an off-white solid (530 mg, 36% yield).

Способ 2.Method 2.

Промежуточное соединение 38 оIntermediate 38 o

CIC.I.

Me(Znl),Me(Znl),

THFTHF

Промежуточное соединение 38Intermediate 38

Промежуточное соединение 35Intermediate 35

Раствор промежуточного соединения 35 (10,0 г, теоретически 31,1 ммоль) в THF (100 мл) добавляли по каплям в атмосфере N2 в течение периода 30 мин в раствор бис(йодцинк)метана в THF (180 мл, 0,31М, 55,9 ммоль, полученный согласно процедуре, описанной в Tetrahedron 2002, 58, 8255-8262), при этомA solution of intermediate 35 (10.0 g, theoretical 31.1 mmol) in THF (100 ml) was added dropwise under N2 atmosphere over a period of 30 min to a solution of bis(iodozinc)methane in THF (180 ml, 0.31 M, 55.9 mmol, obtained according to the procedure described in Tetrahedron 2002, 58, 8255-8262), with

- 14 045888 перемешивание продолжали до полного превращения (приблизительно 2 ч). Реакционную смесь гасили медленным добавлением насыщенного водного раствора NH4Cl, во время чего наблюдали образование соли. Перед экстракцией (EtOAc, 2x200 мл) соли снова растворяли добавлением водного раствора аммиака (25%). Объединенные органические фазы промывали водным раствором бисульфита натрия и солевым раствором, высушивали над безводным MgSO4, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (элюент: дихлорметан/EtOAc 95/5) с получением промежуточного соединения 38 в виде грязно-белого твердого вещества (6,9 г, 66%).- 14 045888 stirring was continued until complete conversion (approximately 2 hours). The reaction mixture was quenched by slow addition of a saturated aqueous NH4Cl solution, during which salt formation was observed. Before extraction (EtOAc, 2x200 ml), the salts were redissolved by adding aqueous ammonia (25%). The combined organic phases were washed with aqueous sodium bisulfite and brine, dried over anhydrous MgSO 4 , filtered and concentrated in vacuo. The residue was purified by chromatography on silica gel (eluent: dichloromethane/EtOAc 95/5) to give intermediate 38 as an off-white solid (6.9 g, 66%).

Получение промежуточного соединения 174Obtaining intermediate compound 174

3-бром-7-йодхинолин (5,99 г, 17,7 ммоль) растворяли в дихлорметане (60 мл), затем добавляли порциями m-СРВА (4,57 г, 26,5 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 дней. Смесь гасили насыщенным водным раствором Na2S2O3 (40 мл) и насыщенным водным раствором NaHCO3 (pH до 6-7), затем экстрагировали дихлорметаном (50 мл x3). Органическую фазу промывали Н2О (50 мл), сушили над безводным Na2SO4 и выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали посредством колонки на силикагеле (элюент: петролейный эфир/этилацетат = от 10/1 до 1/1) с получением требуемого продукта, представляющего собой промежуточное соединение 174 (1,9 г, выход 14,1%), в3-bromo-7-iodoquinoline (5.99 g, 17.7 mmol) was dissolved in dichloromethane (60 ml), then m-CPBA (4.57 g, 26.5 mmol) was added portionwise. The mixture was stirred at room temperature for 4 days. The mixture was quenched with saturated aqueous Na 2 S 2 O 3 (40 ml) and saturated aqueous NaHCO 3 (pH 6-7), then extracted with dichloromethane (50 ml x3). The organic phase was washed with H2O (50 ml), dried over anhydrous Na 2 SO 4 and evaporated under reduced pressure. The residue was purified by a silica gel column (eluent: petroleum ether/ethyl acetate = 10/1 to 1/1) to obtain the desired product, intermediate 174 (1.9 g, 14.1% yield), in

виде желтого твердого вещества.as a yellow solid.

Получение промежуточного соединения 175Preparation of intermediate 175

РОС13, СНС13 Вг Ί|- I 80°С, 12 ч. * CI ОROS1 3 , SNS1 3 Вг Ί| - I 80°C, 12 hours * CI O

Промежуточное соединение 174 Промежуточное соединение 175Intermediate 174 Intermediate 175

В раствор промежуточного соединения 174 (2,9 г, 8,29 ммоль) в хлороформе (60 мл) добавляли фосфорилтрихлорид (8,3 г, 54,1 ммоль). Смесь перемешивали при 80°С в течение 12 ч. Смесь выпаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией (элюент: петролейный эфир/этилацетат = от 10/1 до 1/1). Требуемые фракции собирали и концентрировали с получением продукта, представляющего собой промежуточное соединение 175 (1,3 мг, выход 41,5%), в виде белого твердого вещества.To a solution of intermediate 174 (2.9 g, 8.29 mmol) in chloroform (60 ml) was added phosphoryl trichloride (8.3 g, 54.1 mmol). The mixture was stirred at 80°C for 12 hours. The mixture was evaporated under reduced pressure to obtain the crude product. The crude product was purified by column chromatography (eluent: petroleum ether/ethyl acetate = 10/1 to 1/1). The desired fractions were collected and concentrated to give Intermediate 175 (1.3 mg, 41.5% yield) as a white solid.

Получение промежуточного соединения 176Preparation of intermediate 176

PMBNH2 герметично закупоренная Промежуточное соединение 175 пробирка, 100°С Промежуточное соединение 176PMBNH 2 hermetically sealed Intermediate 175 tube, 100°C Intermediate 176

4-Метоксибензиламин (1,34 г, 9,78 ммоль) добавляли в смесь промежуточного соединения 175 (0,84-Methoxybenzylamine (1.34 g, 9.78 mmol) was added to a mixture of intermediate 175 (0.8

г, «1,95 ммоль) в этаноле (10 мл). Смесь нагревали в герметично закупоренной пробирке при 100°С в течение 12 ч. Смесь выпаривали под вакуумом с получением неочищенного продукта. Его очищали колоночной хроматографией (градиент элюента: этилацетат/петролейный эфир от 0/1 до 1/10). Требуемые фракции собирали и концентрировали с получением продукта, представляющего собой промежуточное соединение 176 (600 мг, выход 51,6%), в виде масла.g, "1.95 mmol) in ethanol (10 ml). The mixture was heated in a sealed tube at 100°C for 12 hours. The mixture was evaporated under vacuum to obtain the crude product. It was purified by column chromatography (eluent gradient: ethyl acetate/petroleum ether from 0/1 to 1/10). The desired fractions were collected and concentrated to give intermediate 176 (600 mg, 51.6% yield) as an oil.

Получение промежуточного соединения 177Preparation of intermediate 177

Промежуточное соединение Ί 76 Промежуточное соединение 177Intermediate connection Ί 76 Intermediate connection 177

Смесь промежуточного соединения 38 (44 мг, 0,138 ммоль) в 9-BBN (1,3 мл, 0,69 ммоль, 0,5М в THF) нагревали с обратным холодильником в течение 1 ч в атмосфере N2. Смесь охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли K3PO4 (87 мг, 0,413 ммоль) в Н2О (1 мл), с последующим добавлением THF (5 мл), промежуточного соединения 176 (122,727 мг, «0,206 ммоль) и [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(П) (4,48 мг, 0,007 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь концентрировали. Остаток растворяли в этилацетате (40 мл), промывали водой (6 мл), солевым раствором (6 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением фракции 1 в виде неочищенного промежуточного соедиA mixture of intermediate 38 (44 mg, 0.138 mmol) in 9-BBN (1.3 mL, 0.69 mmol, 0.5 M in THF) was refluxed for 1 h under N2. The mixture was cooled to room temperature, then K 3 PO 4 (87 mg, 0.413 mmol) in H2O (1 ml) was added, followed by the addition of THF (5 ml), intermediate 176 (122.727 mg, "0.206 mmol) and [1, 1'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(P) (4.48 mg, 0.007 mmol). The reaction mixture was refluxed for 3 hours. The mixture was concentrated. The residue was dissolved in ethyl acetate (40 ml), washed with water (6 ml), saline (6 ml). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated to give fraction 1 as a crude intermediate

- 15 045888 нения 177 (120 мг, выход 71,5%).- 15 045888 neniya 177 (120 mg, yield 71.5%).

Смесь промежуточного соединения 38 (233,7 мг, 0,73 ммоль) в 9-BBN (7,31 мл, 3,65 ммоль, 0,5М в THF) нагревали с обратным холодильником в течение 1 ч в атмосфере N2. Смесь охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли КЗРО4 (87 мг, 0,413 ммоль) в Н2О (1 мл), с последующим добавлением THF (5 мл), промежуточного соединения 176 (478 мг, -0,80 ммоль) и [1,1'бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладия(П) (23,8 мг, 0,037 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь концентрировали. Остаток растворяли в этилацетате (40 мл), промывали водой (6 мл), солевым раствором (6 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали с получением фракции 2 в виде неочищенного промежуточного соединения 177 (600 мг, выход 63,1%).A mixture of intermediate 38 (233.7 mg, 0.73 mmol) in 9-BBN (7.31 mL, 3.65 mmol, 0.5 M in THF) was refluxed for 1 h under N2. The mixture was cooled to room temperature, then K3PO4 (87 mg, 0.413 mmol) in H2O (1 mL) was added, followed by THF (5 mL), intermediate 176 (478 mg, -0.80 mmol) and [1.1 'bis(diphenylphosphino)ferrocene]dichloropalladium(P) (23.8 mg, 0.037 mmol). The reaction mixture was refluxed for 3 hours. The mixture was concentrated. The residue was dissolved in ethyl acetate (40 ml), washed with water (6 ml), saline (6 ml). The organic phase was dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated to give fraction 2 as crude intermediate 177 (600 mg, 63.1% yield).

Две фракции объединяли и очищали колоночной хроматографией (градиент элюента: этилацетат/петролейный эфир от 1/10 до 1/1). Требуемые фракции собирали и концентрировали с получением промежуточного соединения 177 (300 мг, выход 61,0%) в виде твердого вещества.The two fractions were combined and purified by column chromatography (eluent gradient: ethyl acetate/petroleum ether 1/10 to 1/1). The desired fractions were collected and concentrated to give intermediate 177 (300 mg, 61.0% yield) as a solid.

Получение промежуточного соединения 178Preparation of intermediate 178

Смесь промежуточного соединения 177 (300 мг, -0,446 ммоль) и NH3.H2O (10 мл) в диоксане (10 мл) перемешивали в герметично закупоренной пробирке при 120°С в течение 14 ч. Эту реакционную смесь выпаривали под вакуумом с получением промежуточного соединения 178 (250 мг, выход 87,1%) в виде масла.A mixture of intermediate 177 (300 mg, -0.446 mmol) and NH 3 .H 2 O (10 ml) in dioxane (10 ml) was stirred in a sealed tube at 120°C for 14 hours. This reaction mixture was evaporated under vacuum with yielding intermediate 178 (250 mg, 87.1% yield) as an oil.

Получение промежуточного соединения 179Preparation of intermediate 179

Смесь промежуточного соединения 178 (250 мг, -0,388 ммоль) в TFA (5 мл) перемешивали при 50°С в течение 1 ч. Смесь выпаривали под вакуумом с получением промежуточного соединения 179 (350 мг, выход 63,4%) в виде масла.A mixture of intermediate 178 (250 mg, -0.388 mmol) in TFA (5 ml) was stirred at 50°C for 1 hour. The mixture was evaporated in vacuo to give intermediate 179 (350 mg, 63.4% yield) as an oil .

Получение соединения 80Receiving connection 80

Смесь промежуточного соединения 179 (350 мг) и K2CO3 (102 мг, 0,74 ммоль) в метаноле (3 мл) перемешивали при 60°С в течение 1 ч. Смесь фильтровали и выпаривали под вакуумом с получением неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищали с помощью prep-HPLC (колонка: Waters Xbridge Prep OBD C18 150x30 мм, 5 мкм, условие: градиент вода (0,05% гидроксида аммония o6./o6.)-ACN). Требуемые фракции собирали, и растворитель выпаривали с получением соединения 80 (113,3 мг, выход 94,9%) в виде белого твердого вещества.A mixture of intermediate 179 (350 mg) and K2CO 3 (102 mg, 0.74 mmol) in methanol (3 ml) was stirred at 60°C for 1 hour. The mixture was filtered and evaporated in vacuo to give the crude product. The crude product was purified by prep-HPLC (column: Waters Xbridge Prep OBD C18 150x30 mm, 5 µm, condition: gradient water (0.05% ammonium hydroxide o6./o6.)-ACN). The desired fractions were collected and the solvent was evaporated to give compound 80 (113.3 mg, 94.9% yield) as a white solid.

Аналитическая часть.Analytical part.

ЯМР.NMR.

Для ряда соединений 1Н-ЯМР-спектры регистрировали на Bruker DPX-360, функционирующем при 360 МГц, на Bruker Avance 600, функционирующем при 600 МГц, на Bruker Avance 400, функционирующем при 400 МГц, или на спектрометре Varian 400MR, функционирующем при 400 МГц. В качестве растворителей применяли хлороформ-d (дейтерированный хлороформ, CDCl3), метанол^4 или DMSO-d6 (дейтерированный DMSO, диметилсульфоксид^6). Значения химического сдвига (δ) указаны в частях на миллион (ppm) относительно тетраметилсилана (TMS), который применяли в качестве внутреннего стандарта.For a number of compounds, 1H NMR spectra were recorded on a Bruker DPX-360 operating at 360 MHz, a Bruker Avance 600 operating at 600 MHz, a Bruker Avance 400 operating at 400 MHz, or a Varian 400MR spectrometer operating at 400 MHz . The solvents used were chloroform-d (deuterated chloroform, CDCl3), methanol^ 4 or DMSO- d6 (deuterated DMSO, dimethyl sulfoxide^ 6 ). Chemical shift (δ) values are reported in parts per million (ppm) relative to tetramethylsilane (TMS), which was used as an internal standard.

Соед. 80: 1Н-ЯМР (600 МГц, DMSO-d6) δ ppm 1,50-1,56 (m, 1Н), 1,68-1,75 (m, 1Н), 1,85-1,92 (m, 1Н), 1,96 (ddt, J=13,0, 9,0, 6,5, 6,5 Гц, 1H), 2,25 (dt, J=12,7, 7,9 Гц, 1H), 2,69-2,80 (m, 2 Н), 3,76 (br t, J=4,7 Гц, 1H), 4,21 (dd, J=7,6, 6,0 Гц, 1H), 4,57 (br s, 1H), 4,72 (br s, 1H), 4,80 (dt, J=10,5, 7,9 Гц, 1H), 6,50 (br s, 2H), 6,59 (d, J=3,5 Гц, 1H), 7,07 (br s, 2H), 7,12 (dd, J=8,2, 1,6 Гц, 1H), 7,29 (d, J=3,6 Гц, 1H), 7,34 (s, 1H), 7,58 (d, J=8,1 Гц, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,31 (s, 1H).Conn. 80: 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ) δ ppm 1.50-1.56 (m, 1H), 1.68-1.75 (m, 1H), 1.85-1.92 (m, 1H), 1.96 (ddt, J=13.0, 9.0, 6.5, 6.5 Hz, 1H), 2.25 (dt, J=12.7, 7.9 Hz , 1H), 2.69-2.80 (m, 2 H), 3.76 (br t, J=4.7 Hz, 1H), 4.21 (dd, J=7.6, 6.0 Hz, 1H), 4.57 (br s, 1H), 4.72 (br s, 1H), 4.80 (dt, J=10.5, 7.9 Hz, 1H), 6.50 (br s, 2H), 6.59 (d, J=3.5 Hz, 1H), 7.07 (br s, 2H), 7.12 (dd, J=8.2, 1.6 Hz, 1H) , 7.29 (d, J=3.6 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.58 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H) , 8.31 (s, 1H).

- 16 045888- 16 045888

Экспериментальные процедуры. Анализ in vitro (анализ 1a и 1b).Experimental procedures. In vitro assay (assay 1a and 1b).

Реагенты.Reagents.

Фермент PRMT5-MEP50 приобретали у Charles River (Argenta). Ферментный комплекс продуцировали в клетках насекомых (Sf9), инфицированных одновременно двумя бакуловирусами. Один вирус экспрессирует полноразмерный PRMT5 человека с Flag-меткой на N-конце, второй вирус экспрессирует полноразмерный МЕР50 с сайтом расщепления His6-TEV на N-конце. Белок аффинно очищали с использованием частиц, покрытых антителом к Flag (M2), с последующим элюированием пептидом 3xFLAG, а затем His-Select, проводя элюирование 0,5М имидазолом. Элюированный белок затем подвергали диализу против трис-буферного солевого раствора (TBS) (рН 8,0), содержащего 20% глицерина и 3 мМ дитиотреитол (DTT).PRMT5-MEP50 enzyme was purchased from Charles River (Argenta). The enzyme complex was produced in insect cells (Sf9) simultaneously infected with two baculoviruses. One virus expresses full-length human PRMT5 with a Flag tag at the N-terminus, and the second virus expresses full-length MEP50 with a His6-TEV cleavage site at the N-terminus. The protein was affinity purified using anti-Flag (M2)-coated beads, followed by elution with 3xFLAG peptide and then His-Select, eluting with 0.5 M imidazole. The eluted protein was then dialyzed against Tris-buffered saline (TBS) (pH 8.0) containing 20% glycerol and 3 mM dithiothreitol (DTT).

Полноразмерный немеченый рекомбинантный гистон Н2А человека (остатки 1-130, номер доступа в Genbank NM 021052, MW=14,1 кДа), экспрессируемый в Е. coli, приобретали у Reaction Biology Corporation, № по кат. НМТ-11-146. Приобретали реагенты, используемые для получения реакционного буфера или буфера для остановки реакции, в том числе основание Tris (№ по кат. Sigma Т-1503), NaCl (№ по кат. Sigma RGF-3270), MgCl2 (№ по кат. Sigma М0250), DTT (№ по кат. Invitrogen 15508-013) и муравьиную кислоту (№ по кат. Riedel deHaen 33015).Full-length untagged recombinant human histone H2A (residues 1–130, Genbank accession no. NM 021052, MW=14.1 kDa) expressed in E. coli was purchased from Reaction Biology Corporation, cat. no. NMT-11-146. Reagents used to prepare the reaction or stop buffer were purchased, including Tris Base (Sigma Cat. No. T-1503), NaCl (Sigma Cat. No. RGF-3270), MgCl 2 (Sigma Cat. No. M0250), DTT (Invitrogen Cat. No. 15508-013) and formic acid (Riedel deHaen Cat. No. 33015).

Анализ на высокопроизводительном масс-спектрометре PRMT5 катализирует последовательные метилирования концевых атомов азота на гуанидиновых группах остатков аргинина в белках, используя субстратный кофактор S-аденозил-L-метионин (AdoMet, SAM), при этом образуется монометил (ММА), симметричный диметиларгинин (sDMA) и S-аденозил-L-гомоцистеин (AdoHcy, SAH). Ферментативную активность определяли после образования продукта SAH, используя высокопроизводительную массспектрометрию (система Agilent Rapidfire 300 с трехквадрупольным MS/MS Sciex 4000 серии QTrap®). Реакционный буфер представлял собой 20 мМ Tris-HCl, рН 8,5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT. Реакцию останавливали с использованием 1% муравьиной кислоты (конечная концентрация).PRMT5 high-performance mass spectrometer analysis catalyzes sequential methylations of terminal nitrogen atoms on guanidine groups of arginine residues in proteins using the substrate cofactor S-adenosyl-L-methionine (AdoMet, SAM), resulting in the formation of monomethyl (MMA), symmetrical dimethylarginine (sDMA) and S-adenosyl-L-homocysteine (AdoHcy, SAH). Enzyme activity was determined after formation of the SAH product using high-throughput mass spectrometry (Agilent Rapidfire 300 system with Sciex 4000 series QTrap® triple quadrupole MS/MS). The reaction buffer was 20 mM Tris-HCl, pH 8.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 and 1 mM DTT. The reaction was stopped using 1% formic acid (final concentration).

Исследования ингибирования. Исследования в отношении IC50 проводили с использованием одиннадцати точек доз, полученных для каждого соединения путем последовательного разведения 1:2 в диметилсульфоксиде (DMSO), причем точка 12 представляла собой DMSO в качестве контроля. Соединения сначала наносили на планшеты, и затем добавляли смесь растворов 2 мкМ SAM и 0,6 мкМ Н2А (гистон Н2А). Такой же объем ферментного раствора добавляли для инициации ферментативных реакций. Конечные концентрации реакционной смеси составляли 1 мкМ SAM, 0,3 мкМ Н2А и 10 нМ фермента (анализ 1а) или 1,25 нМ фермента (анализ 1b). Реакционную смесь инкубировали при 30°С в течение 60 мин, если использовали 10 нМ фермента, и в течение 120 мин, если использовали 1,25 нМ фермента. Затем реакционную смесь гасили путем добавления муравьиной кислоты до конечной концентрации 1%. Значения ингибирования образования SAH в присутствии соединений рассчитывали как процент контроля относительно неингибированной реакционной смеси в зависимости от концентрации ингибитора. Данные подгоняли следующим образом:Inhibition studies. IC50 studies were performed using eleven dose points obtained for each compound by serial dilution 1:2 in dimethyl sulfoxide (DMSO), with point 12 representing DMSO as a control. Compounds were first coated onto the plates, and then a solution mixture of 2 μM SAM and 0.6 μM H2A (histone H2A) was added. The same volume of enzyme solution was added to initiate enzymatic reactions. The final reaction mixture concentrations were 1 μM SAM, 0.3 μM H2A, and 10 nM enzyme (assay 1a) or 1.25 nM enzyme (assay 1b). The reaction mixture was incubated at 30°C for 60 min if 10 nM enzyme was used and for 120 min if 1.25 nM enzyme was used. The reaction mixture was then quenched by adding formic acid to a final concentration of 1%. Inhibition values for SAH formation in the presence of compounds were calculated as the percentage of control relative to the uninhibited reaction mixture as a function of inhibitor concentration. The data was adjusted as follows:

Y=Нижнее значение+(Верхнее значение - Нижнее значение)/^^^^ IC50-X)*h));Y=Lower value+(Upper value - Lower value)/^^^^ IC50-X)*h));

где IC50 представляет собой концентрацию ингибитора (в тех же единицах, что и X) при 50% ингибировании, и h представляет собой угловой коэффициент Хилла. Y представляет собой процент ингибирования, X представляет собой log концентрации соединения. Нижнее значение и верхнее значение представляют собой значения для плато в тех же единицах, что и Y.where IC50 is the inhibitor concentration (in the same units as X) at 50% inhibition, and h is the Hill slope. Y is the percent inhibition, X is the log concentration of the compound. The lower value and upper value represent the values for the plateau in the same units as Y.

Значения pIC50 в табл. 1 ниже представляют собой усредненные значения (№ соед. означает номер соединения).pIC50 values in table. 1 below are average values (connection no. means connection number).

Таблица 1Table 1

№ соед. Connection no. р1С50, анализ 1а p1C 50 , analysis 1a р1С50, анализ 1Ь р1С 50 , analysis 1b 2 2 8, 1 8, 1 7, 6 7, 6 80 80 9, 9 9, 9 9, 7 9, 7

Пример 1. Активирующие мутации PIK3CA ассоциированы с восприимчивостью к ингибиторам PRMT5 при SCLC.Example 1: Activating PIK3CA mutations are associated with susceptibility to PRMT5 inhibitors in SCLC.

Профиль восприимчивости клеток к соединению 2 оценивали в отношении SCLC-субкатегории широкой панели клеточных линий рака легких. Удивительно, что некоторые из наиболее восприимчивых клеточных линий содержали разные мутации приобретения функции в гене Р1К3Са, и они упомянуты в табл. 2. Активация сигнального пути PI3Ka (мутации с приобретением функции или стимуляция сигнального пути) в качестве опухолевого ответа на стандарт лечения (цисплатин) или даже на средства целенаправленного воздействия, такие как ингибиторы PARP последнего поколения, подразумевает решающую роль в процессе устойчивости, с чем может быть связана низкая общая выживаемость пациентов с SCLC после лечения.The cell susceptibility profile to compound 2 was assessed against the SCLC subcategory of a broad panel of lung cancer cell lines. Surprisingly, some of the most susceptible cell lines contained various gain-of-function mutations in the P1K3Ca gene, and these are mentioned in Table 1. 2. Activation of the PI3Ka signaling pathway (gain-of-function mutations or stimulation of the signaling pathway) as a tumor response to standard of care (cisplatin) or even to targeted agents such as the latest generation of PARP inhibitors implies a critical role in the process of resistance, which may may be associated with poor overall survival of patients with SCLC after treatment.

- 17 045888- 17 045888

Таблица 2table 2

Клеточная линия Cellular line Мутация PIK3CA Mutation PIK3CA Подтип гистологического образца Histological specimen subtype GI50 GI50 NCI-H1048 NCI-H1048 H1047R H1047R SCLC SCLC 94, 62 нМ 94.62 nM LU99a LU99a Т1025А Т1025А SCLC SCLC 128,53 нМ 128.53 nM H69V H69V G106_R108del G106_R108del SCLC SCLC 85,62 нМ 85.62 nM

Пример 2. Изменения сплайсосомы ассоциированы с восприимчивостью к ингибиторам PRMT5 при NSCLC.Example 2: Spliceosome alterations are associated with susceptibility to PRMT5 inhibitors in NSCLC.

Известно, что специфические в отношении рака явления сплайсинга инициируют развитие злокачественной опухоли, а также способствуют прогрессированию заболевания. К настоящему времени были описаны два белка, вовлеченные в сплайсинг, представляющие собой U2AF1 и RBM10, которые характеризуются разрегуляцией при NSCLC.Cancer-specific splicing events are known to initiate the development of malignant tumors and also contribute to disease progression. To date, two proteins involved in splicing have been described, U2AF1 and RBM10, which are dysregulated in NSCLC.

U2AF1, представляющий собой хорошо описанный фактор сплайсинга, содержит мутацию с приобретения функции типа горячей точки (S34F) у 3-8% пациентов с NSCLC. Недавно РНК-связывающий белок RBM10, также являющийся критическим для сборки сплайсосомы, классифицировали в качестве опухолевого супрессора, который инактивируется в результате мутаций потери функции, главным образом у пациентов с NSCLC (~8%), в анамнезе которых имеет место курение.U2AF1, a well-characterized splicing factor, contains a hot spot gain-of-function mutation (S34F) in 3-8% of NSCLC patients. Recently, the RNA-binding protein RBM10, also critical for spliceosome assembly, was classified as a tumor suppressor that is inactivated by loss-of-function mutations, primarily in NSCLC patients (~8%) with a history of smoking.

Sm белки, являющиеся критическими для сборки сплайсосом, были описаны как непосредственные субстраты PRMT5, и, таким образом, функция PRMT5 была связана с модулированием активности сплайсосом.Sm proteins, which are critical for spliceosome assembly, have been described as direct substrates of PRMT5, and thus PRMT5 function has been linked to modulating spliceosome activity.

Поскольку мутация с приобретением функции S34F в U2AF1 была подтверждена в качестве онкогенной, небольшую панель всех коммерчески доступных клеточных линий NSCLC, содержащих мутацию S34F, собирали для анализа потенциальной синтетической летальной связи между U2AF1-S34F и ингибированием PRMT5.Because the S34F gain-of-function mutation in U2AF1 was confirmed to be oncogenic, a small panel of all commercially available NSCLC cell lines containing the S34F mutation was collected to analyze the potential synthetic lethal association between U2AF1-S34F and PRMT5 inhibition.

Все (три из трех) клеточных линий NSCLC, которые содержат эту мутацию типа горячей точки, являются пролиферационно-чувствительными к ингибитору PRMT5, представляющему собой соединение 2, см. табл. 3.All (three of three) NSCLC cell lines that contain this hot spot mutation are proliferation sensitive to the PRMT5 inhibitor compound 2, see table. 3.

Таблица 3Table 3

Клеточная линия Cell line Ген/мутация Gene/mutation Подтип гистологического образца Histological specimen subtype GI50 GI50 NCI-H441 NCI-H441 U2AF1-S34F U2AF1-S34F Аденокарцинома Adenocarcinoma 98,40 нМ 98.40 nM LC-2/ad LC-2/ad U2AF1-S34F U2AF1-S34F Аденокарцинома Adenocarcinoma 116,08 нМ 116.08 nM НСС78 NSS78 U2AF1-S34F U2AF1-S34F Аденокарцинома Adenocarcinoma 107,65 нМ 107.65 nM

Пример 3. Усиления сигнального пути циклина D1 ассоциированы с восприимчивостью к ингибиторам PRMT5 при NSCLC.Example 3: Increases in cyclin D1 signaling are associated with susceptibility to PRMT5 inhibitors in NSCLC.

Усиление и/или повышенная экспрессия представителей семейства циклинов G1 была описана при многих вида рака, в том числе NSCLC. Наблюдали корреляцию между PRMT5 и экспрессией модуляторов клеточного цикла, в том числе циклина D1, CDK4 и CDK6, указывая на то, что PRMT5 может оказывать регуляторный эффект на G1-фазу. Анализ панели линий клеток легкого, обработанных соединением 2, выявил значительную ассоциацию между усилением (усилениями) циклина D1/CDK4/CDK6 и восприимчивостью к PRMT5i, указывая на то, что нарушения сигнального пути циклина могут быть использованы в качестве маркеров для отбора пациентов. В табл. 4 показано, что клеточные линии NSCLC, содержащие такое (такие) усиление (усиления) циклина D1/CDK4/CDK6 восприимчивы к обработке соединением 2.Enhanced and/or increased expression of members of the G1 cyclin family has been described in many cancers, including NSCLC. A correlation was observed between PRMT5 and the expression of cell cycle modulators, including cyclin D1, CDK4, and CDK6, indicating that PRMT5 may have a regulatory effect on G1 phase. Analysis of a panel of lung cell lines treated with Compound 2 revealed a significant association between cyclin D1/CDK4/CDK6 amplification(s) and susceptibility to PRMT5i, indicating that disruptions in the cyclin signaling pathway can be used as markers for patient selection. In table 4 shows that NSCLC cell lines containing such cyclin D1/CDK4/CDK6 amplification(s) are susceptible to treatment with Compound 2.

Таблица 4Table 4

Клеточная линия Cellular line Аплифицированный ген Amplified gene Подтип гистологического образца Histological specimen subtype GI50 GI50 EPLC272H EPLC272H Циклин D1 Cyclin D1 Аденокарцинома Adenocarcinoma 98,53 нМ 98.53 nM NCI-H226 NCI-H226 CDK4 CDK4 Аденокарцинома Adenocarcinoma 204,52 нМ 204.52 nM HLC1 HLC1 CDK6 CDK6 Плоскоклеточная карцинома Squamous carcinoma 96,39 нМ 96.39 nM

Пример 4. Изменения сигнального пути WNT ассоциированы с восприимчивостью к ингибиторам PRMT5.Example 4: Changes in the WNT signaling pathway are associated with susceptibility to PRMT5 inhibitors.

Клеточные линии, содержащие мутации в ключевых генах сигнального пути Wnt, в том числе β- 18 045888 катенине и АРС, характеризуются восприимчивостью к лечению PRMT5i, как показано в табл. 5.Cell lines containing mutations in key genes of the Wnt signaling pathway, including β-18 045888 catenin and APC, are characterized by susceptibility to PRMT5i treatment, as shown in Table. 5.

Таблица 5Table 5

Клеточная линия Cell line Ген/мутация Gene/mutation Подтип гистологического образца Histological specimen subtype GI50 GI50 А427 A427 CTNNB1/T41A CTNNB1/T41A Аденокарцинома Adenocarcinoma 166,52 нМ 166.52 nM НСС15 NSS15 CTNNB1/S45F, Y670* CTNNB1/S45F, Y670* Плоскоклеточная карцинома Squamous carcinoma 266,07 нМ 266.07 nM LK2 LK2 APC/W685*, Е1020К APC/W685*, E1020K Плоскоклеточная карцинома Squamous carcinoma 114,53 нМ 114.53 nM

ПримерыExamples

Специалистам в данной области техники будет понятно, что многочисленные изменения и модификации могут быть выполнены в отношении предпочтительных вариантов осуществления, и что такие изменения и модификации могут быть выполнены без отклонения от сути настоящего изобретения. Таким образом, предусмотрено, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие эквивалентные вариации, которые находятся в пределах истинной сущности и объема настоящего изобретения.Those skilled in the art will appreciate that numerous changes and modifications can be made to the preferred embodiments, and that such changes and modifications can be made without departing from the spirit of the present invention. It is therefore intended that the appended claims cover all such equivalent variations that fall within the true spirit and scope of the present invention.

Раскрытия каждого патента, заявки на патент и публикации, цитируемых или описываемых в данном документе, тем самым включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.The disclosures of each patent, patent application and publication cited or described herein are hereby incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (2)

1. Способ идентификации пациента, который будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению ингибитором белковой аргинин-И-метилтрансферазы 5 (PRMT5), предусматривающий:1. A method for identifying a patient who will be susceptible to treatment with a protein arginine-I-methyltransferase 5 (PRMT5) inhibitor, comprising: оценку биологического образца от пациента на наличие изменения сплайсосомы;assessing a biological sample from the patient for the presence of spliceosome alteration; где наличие любого указанного изменения свидетельствует о более высокой вероятности того, что указанный пациент будет характеризоваться наличием восприимчивости к лечению указанным ингибитором PRMT5, чем при отсутствии любого указанного изменения;where the presence of any specified change indicates a higher likelihood that the specified patient will be characterized by the presence of responsiveness to treatment with a specified PRMT5 inhibitor than in the absence of any specified change; где изменение сплайсосомы предусматривает мутацию S34F в гене U2AF1;where the change in the spliceosome involves the S34F mutation in the U2AF1 gene; где ингибитор PRMT 5 представляет собойwhere PRMT inhibitor 5 is 2. Способ по п.1, где биологический образец предусматривает наличие изменения сплайсосомы, и у пациента имеется NSCLC.2. The method of claim 1, wherein the biological sample contains a spliceosome alteration and the patient has NSCLC.
EA201992026 2017-02-27 2018-02-26 USE OF BIOMARKERS IN IDENTIFYING PATIENTS WITH CANCER WHO WILL BE CHARACTERIZED BY THE PRESENCE OF SUSPECTIVE TREATMENT WITH A PRMT5 INHIBITOR EA045888B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/464006 2017-02-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045888B1 true EA045888B1 (en) 2024-01-12

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7225106B2 (en) Use of biomarkers in identifying cancer patients who respond to treatment with PRMT5 inhibitors
JP2023021979A (en) Compounds and methods for treating rna mediated diseases
EP2993177A1 (en) A chemo-enzymatic preparation method for purine nucleosides and their deaza- and aza- analogues
JP5756995B2 (en) New fluorescent artificial base
US20190330197A1 (en) Substituted naphthalene diimides and their use
EA045888B1 (en) USE OF BIOMARKERS IN IDENTIFYING PATIENTS WITH CANCER WHO WILL BE CHARACTERIZED BY THE PRESENCE OF SUSPECTIVE TREATMENT WITH A PRMT5 INHIBITOR
CN110582496A (en) Methods for synthesizing variously substituted purines
JP5137118B2 (en) Universal base
JP2009221168A (en) Nucleoside or nucleotide derivative, nucleic acid derivative, target substance-capturing material, method for capturing and/or releasing target substance, and hemin aptamer
OA19298A (en) Use of biomarkers in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with a PRMT5 inhibitor.
Berg et al. Synthesis of Bicyclic N‐Arylmethyl‐Substituted Iminoribitol Derivatives as Selective Nucleoside Hydrolase Inhibitors
Tak-Tak et al. Synthesis of purin-2-yl and purin-6-yl-aminoglucitols as C-nucleosidic ATP mimics and biological evaluation as FGFR3 inhibitors
CN111606888A (en) Pyrrole derivative and preparation method and application thereof
US11807643B2 (en) Fluorescent dyes
Läppchen Synthesis of GTP analogues and evaluation of their effect on the antibiotic target FtsZ and its eukaryotic homologue tubulin
JP2023542302A (en) Methods for labeling nucleic acids
Ayala-Aguilera et al. Ligand-Centred Phenotype-Driven Development of Potent Kinase Inhibitors against Oesophageal Cancer
JP6709999B2 (en) Method for detecting compound, probe, condensate and cytosine
Endsjø Synthesis Directed towards Potential hOGG1 Inhibitors
Blain et al. Chapter Four: Synthesis and non-enzymatic polymerization of 2о-NH2-TNA
Johnson Hypoxia selective DNA alkylating analogs of tirapazamine and AP-derived DNA interstrand cross-links
JP2018039842A (en) Modified nucleosides or modified nucleotides
Salandria DNA Minor Groove Modifications: Synthesis and Application of 3-deaza-3-substituted-2'-deoxyadenosine Analogues
JP2007224013A (en) Unnatural base
JP2007015948A (en) Nucleoside derivative