EA045843B1 - Полипептиды, имитирующие эпитоп широконейтрализующего антитела vrc01, в качестве антигенов для вакцины, предотвращающей инфекцию вич-1 - Google Patents
Полипептиды, имитирующие эпитоп широконейтрализующего антитела vrc01, в качестве антигенов для вакцины, предотвращающей инфекцию вич-1 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045843B1 EA045843B1 EA202290897 EA045843B1 EA 045843 B1 EA045843 B1 EA 045843B1 EA 202290897 EA202290897 EA 202290897 EA 045843 B1 EA045843 B1 EA 045843B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- amino acids
- hiv
- polypeptide according
- vrc01
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 34
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 title claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 9
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 57
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims description 37
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000350158 Prioria balsamifera Species 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 34
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 10
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 10
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 6
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 102000013264 Interleukin-23 Human genes 0.000 description 4
- 108010065637 Interleukin-23 Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 4
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000002849 thermal shift Methods 0.000 description 3
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 2
- 101000853012 Homo sapiens Interleukin-23 receptor Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000043557 human IFNG Human genes 0.000 description 2
- 102000057111 human IL23R Human genes 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 239000004135 Bone phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000004274 CCR5 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000764773 Inna Species 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005717 Myeloma Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045503 Myeloma Proteins Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229940068840 d-biotin Drugs 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000001048 orange dye Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Description
Настоящее изобретение относится к новому классу полипептидов, которые подходят в качестве антигенов, имитирующих эпитоп шиловидного отростка гликопротеина gp120 ВИЧ-1, распознаваемого широконейтрализующим антителом VRC01, и, таким образом, подходят в качестве иммуногенов для стимуляции продукции нейтрализующих антител к ВИЧ-1 и для разработки вакцины, предотвращающей заражение ВИЧ.
Уровень техники
Инфекция ВИЧ-1 и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) представляют собой глобальную пандемию, унесшую примерно 35 миллионов жизней во всем мире. Несмотря на интенсивные исследования, не существует коммерческой вакцины. Наиболее важными препятствиями являются огромная антигенная изменчивость ВИЧ-1 и уникальные биохимические, биологические и иммунологические свойства наиболее многообещающего кандидата на вакцину, гликопротеина оболочки ВИЧ-1 (Env), который отвечает за прикрепление ВИЧ-1 и проникновение в клетку-хозяина (Robinson HL HIV/AIDS Vaccines: 2018. Clin Pharmacol Ther 2018, 104: 1062-73; Moore PL The Neutralizing Antibody Response to the HIV-1 Env Protein. Curr HIV Res 2018, 16: 21-8). Env представляет собой тример белков gp160, расщепленный на две функциональные субъединицы: трансмембранный гликопротеин gp41 и гликопротеин gp120, экспонируемый на поверхности вируса. Большинство идентифицированных и клонированных антител человека, способных нейтрализовать широкий спектр вариантов Env ВИЧ-1 (bn-mAb), включая VRC01, распознают субъединицы gp120.
Новые стратегии в разработке вакцины против ВИЧ-1 поощрялись после идентификации нескольких таких bn-mAb, поскольку они могли ограничивать виремию, как показано для элитных нейтрализаторов, группы индивидуумов с широкой и мощной нейтрализующей активностью. Генерация специфических bn-mAb к ВИЧ-1 в естественных условиях представляет собой долгосрочный процесс, длящийся годами, и его трудно вызвать с помощью обычной вакцинации. Большинство идентифицированных bnmAb обладают уникальными свойствами, включая длинный HCDR3, необычайную частоту мутаций V(D)J и поли- или аутореактивность с липидами и белками человека, что, по-видимому, является серьезным препятствием для разработки успешной стратегии вакцинации.
Несмотря на увеличение знаний о молекулярной структуре гликопротеина Env ВИЧ-1, его взаимодействии с нейтрализующими антителами и механизме развития иммунного ответа, современные вакцины вызывают иммунный ответ с низкой эффективностью и недостаточным разнообразием вариантов ВИЧ-1. (T.Q. Zhou, I. Georgiev, X. L. Wu, Z. Y. Yang, K. F. Dai, A. Finzi, Y. D. Kwon, J. F. Scheid, W. Shi, L. Xu, Y. P. Yang, J. A. Zhu, M. С Nussenzweig, J. Sodroski, L. Shapiro, G. J. Nabel, J. R. Mascola, P. D. Kwong, Structural Basis for Broad and Potent Neutralization of HIV-1 by Antibody VRC01. Science 329, 811817 (2010); K. J. Bar, M. С Sneller, L. J. Harrison, J. S. Justement, E. T. Overton, M. E. Petrone, D. B. Salantes, С A. Seamon, B. Scheinfeld, R. W. Kwan, G. H. Learn, M. A. Proschan, E. F. Kreider, J. Blazkova, M. Bardsley, E. W. Refsland, M. Messer, K. E. Clarridge, N. B. Tustin, P. J. Madden, K. S. Oden, S. J. O'Dell, B. Jarocki, A. R. Shiakolas, R. L. Tressler, N. A. Doria-Rose, R. T. Bailer, J. E. Ledgerwood, E. V. Capparelli, R. M. Lynch, B. S. Graham, S. Moir, R. A. Koup, J. R. Mascola, J. A. Hoxie, A. S. Fauci, P. Tebas, T. W. Chun, Effect of HIV Antibody VRC01 on Viral Rebound after Treatment Interruption. New England Journal of Medicine 375, 2037-2050 (2016)).
Одним из инновационных решений для преодоления существующих проблем с разработкой эффективной стратегии вакцинации против ВИЧ-инфекции является стимуляция продукции нейтрализующих антител к гликопротеину Env вируса ВИЧ-1 методом направленной эволюции белков, которые могут представлять собой белковые реплики эпитопов, распознаваемых хорошо изученными нейтрализующими антителами (bn-mAb). Эти небольшие связывающие белки можно затем использовать в качестве рекомбинантных антигенов для конструирования вакцины, которая будет стимулировать иммунную систему хозяина к выработке сывороточных антител требуемой специфичности и нейтрализующей широты, аналогичных первоначально использовавшимся нейтрализующим Env-специфическим моноклональным антителам (bn-mAb).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к полипептидам, имитирующим эпитоп гликопротеина gp120 вируса ВИЧ-1, распознаваемый моноклональным антителом VRC01, полученным из искусственных связывающих белков, идентифицированных путем отбора из высокосложной комбинаторной библиотеки белковых вариантов (фиг. 1), полученных из родительской структуры альбумин-связывающего домена стрептококкового белка G (Ahmad JN, Li J, Biedermannova L, et al Novel high-affinity binders of human interferon gamma derived from albumin-binding domain of protein G. Proteins 2012, 80: 774-89), по методу рибосомного дисплея.
Настоящее изобретение относится к полипептидам, имитирующим эпитоп гликопротеина gp120 вируса ВИЧ-1, который распознается широким спектром нейтрализующих антител VRC01 (т.е. полипептидных антигенов). Эти полипептиды содержат аминокислотную последовательность:
X1YKNX2INX3AX4X5VX6X7VKRX8IDX9ILAX10LP (SEQ ID NO: 1), с N-концевой или С-концевой связанной альфа-спиральной структурой, причем указанная альфа
- 1 045843 спиральная структура предпочтительно представляет собой последовательность LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO. 2).
Альфа-спиральная структура непосредственно связана с SEQ ID NO: 1.
X1 выбран из аминокислот A, N, R;
X2 выбран из аминокислот A, R, D;
X3 выбран из аминокислот R, V, Р;
X4 выбран из аминокислот V, L, S;
X5 выбран из аминокислот Т, G, R;
X6 выбран из аминокислот G, Т;
X7 выбран из аминокислот L, А;
X8 выбран из аминокислот V, I;
X9 выбран из аминокислот G, A, R;
X10 выбран из аминокислот R, A, G.
Предпочтительно настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
AYKNAINRAVTVGLVKRVIDGILARLP (SEQ ID NO: 3),
NYKNRiNVALGGTAVKRIIDAILAALP (SEQ ID NO: 4),
RYKNDINPASRVGAVKRVIDRILAGLP (SEQ ID NO: 5), с N-концевой или С-концевой присоединенной альфа-спиральной структурой.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к полипептидам, содержащим последовательность, выбранную из группы, включающей:
LAEAKVLANRELDKYGVSDAYKNAINRAVTVGLVKRVIDGILARLP (SEQ. ID NO. 6),
LAEAKVLANRELDKYGVSDNYKNRINVALGGTAVKRIIDAILAALP (SEQ. ID NO. 7),
LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNDINPASRVGAVKRVIDRILAGLP (SEQ. ID NO. 8).
В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что полипептиды согласно настоящему изобретению связываются со всем моноклональным антителом lgG VRC01, а также с Fab-фрагментом VRC01. Полипептид может быть произвольно удлинен с обеих сторон, например, содержать до 100 аминокислотных остатков, предпочтительно до 80, или до 70, или до 60, или до 50 аминокислот. На иммунный ответ, вызванный полипептидами, можно воздействовать комбинацией начальной иммунизирующей дозы и последующих бустерных доз, при которых укороченная версия конкретной белковой последовательности может сузить иммунный ответ и выработку антител к части родственного белка, соответствующей SEQ ID NO: 1.
Настоящее изобретение дополнительно относится к последовательности ДНК, выбранной из группы, включающей комплементарную ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность полипептидов по настоящему изобретению, и ДНК, гибридизующуюся с указанной комплементарной ДНК в условиях с высокой степенью строгости. Условия с высокой степенью строгости относятся к следующим условиям и раствору для промывки меченого ДНК-зонда: промывающий раствор, содержащий 0,5 х SSC + 0,1% SDS, температура 60°С.
Настоящее изобретение дополнительно включает применение указанной последовательности ДНК для получения полипептидов или рекомбинантных белков, продуцируемых в клетках-хозяевах бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих или человека, а также в этих клетках-хозяевах, содержащих по меньшей мере одну последовательность ДНК по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает применение указанной последовательности ДНК в качестве активного ингредиента ДНК-вакцины для профилактики заражения вирусом ВИЧ-1. ДНКвакцины содержат ДНК для введения в клетки, поэтому клетки-хозяева непосредственно продуцируют антиген, стимулирующий превентивный иммунный ответ. Иммунные клетки распознают такой антиген как гетерогенную структуру, зрелую и ответственную за развитие антиген-специфического иммунного ответа. ДНК может быть введена в организм хозяина свободно или инкапсулирована в белок для упрощения проникновения в клетку-хозяина.
Полипептиды согласно настоящему изобретению подходят для использования в фармацевтической технологии, в частности, в качестве имитации рекомбинантных белковых лигандов для разработки более эффективной вакцины, предотвращающей заражение вирусом ВИЧ-1. С этой целью особенно предпочтительно присоединять дополнительные вспомогательные белки к полипептидам согласно настоящему изобретению, причем указанные вспомогательные белки подходят для стимуляции продукции антител. Примеры вспомогательных белков включают сывороточный альбумин, белок теплового шока hsp70 или спиральный спейсерный белок TolA или его укороченную версию TolS. Эти вспомогательные белки могут быть ковалентно связаны с полипептидами, образуя таким образом химерный белок. Кроме того, полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы путем присоединения вспомогательных N- или С-концевых последовательностей (меток), которые способствуют их специфической
- 2 045843 детекции или их ориентированной иммобилизации на поверхности носителей, таких как нанолипосомы, что приводит к повышению эффективности иммунизации. Такие метки включают, например, метки аффинности или детекции как poly(His), FLAG, AviTag, НА, Мус, S-tag или V5-tag.
Полипептиды согласно настоящему изобретению, определенные аминокислотной последовательностью, показанной выше, стимулируют выработку сывороточных антител после их использования для иммунизации экспериментальных животных. Гипериммунные сыворотки иммунизированных животных подавляли заражение репортерных клеток тестируемыми Env-псевдотипированными вирусами в модельной системе, что представляет собой один из ключевых механизмов борьбы с инфекцией ВИЧ-1 и одну из целей разработки профилактической вакцины, которая до сих пор не доступна на рынке. Полипептиды были идентифицированы из ABD-производных библиотеки рандомизированных пептидов как пептиды с наивысшим специфическим связыванием с моноклональным антителом VRC01, которое было выявлено у индивидуума, инфицированного вирусом ВИЧ-1, как один из решающих факторов, поддерживающих длительный низкий уровень ВИЧ-1 в его сыворотке и способствующий устойчивости к развитию СПИДа даже без применения антиретровирусных препаратов. VRC01 известен своей способностью нейтрализовать широкий спектр вариантов ВИЧ-1, выявленных в разных регионах мира. Обнаруженные полипептиды имитируют структуру, распознаваемую антителом VRC01 (эпитоп, распознаваемый антителом). Преимущество этих полипептидов по сравнению с испытываемыми в настоящее время вакцинами заключается в простоте получения, стабильности и отсутствии посттрансляционных модификаций, что позволяет биотехнологически легко получать их в прокариотических клетках-хозяевах Escherichia coli и использовать в дальнейшем в качестве вакцинных антигенов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Схематическое изображение выявления Env-специфических нейтрализующих сывороточных антител с использованием белковых связывателей, выбранных из библиотеки ABD. Широконейтрализующее антитело VRC01 использовали в качестве мишени для отбора связывателей из комбинаторной библиотеки ABD с теоретической сложностью 1014 вариантов. Отрицательную селекцию использовали для минимизации присутствия связывателей, не участвующих в распознавании эпитопов. Положительную селекцию проводили в 96-луночных планшетах с иммобилизованным VRC01 bn-mAb с последующим выделением мРНК, обратной транскрипцией в кДНК и отбором рибосомного дисплея. После нескольких циклов селекции в плазмидный вектор вводили библиотеку вариантов кДНК, называемых связывателями VRA. Три варианта VRA017, VRA019 и VRA177 были идентифицированы как наиболее многообещающие кандидаты и в форме рекомбинантных слитых белков, включая укороченную версию VRA017, обозначенную как VRA017S, использовали для иммунизации экспериментальных мышей с последующим анализом их гипериммунных сывороток в отношении их Env-специфичности к ВИЧ-1 и нейтрализующей активности псевдовируса ВИЧ-1.
Фиг. 2. Идентификация лигандов VRA паратопа VRC01, выбранного из библиотеки ABD. Варианты, предпочтительно связывающиеся с lgG VRC01, идентифицировали с помощью ELISA. Клеточные лизаты клонов VRA подвергали скринингу на связывание с VRC01 lgG и контролем изотипа IgG. Клоны VRA получали в виде биотинилированных слитых белков His6-VRA-TolA-AVI, и связывание с lgG визуализировали с помощью конъюгата стрептавидин-HRP. Родительский биотинилированный белок His6ABDwt-TolA-AVI использовали в качестве отрицательного контроля. Связывание гликопротеина V5-taggp120 с антителом VRC01 использовали в качестве положительного контроля, обнаруживаемого с помощью конъюгата анти-V5 Ab-HRP.
Фиг. 3. Структура домена ABD с 11 рандомизированными аминокислотами.
Фиг. 4. (а) Связывание белков VRA017-, VRA019- и VRA177-TolA-AVI с VRC01, контрольным изотипом lgG kappa и BSA в ELISA. Связывание ABDwt-TolA-AVI в качестве исходного немутированного белка с VRC01 показано в сравнении с VRA019-TolA-AVI. (b) Связывание белков VRA017-, VRA019- и VRA177-TolA-AVI с фрагментом VRC01/Fab и BSA в ELISA. Все белки VRA и ABDwt были биотинилированы и обнаружены конъюгатом стрептавидин-HRP. Каждый эксперимент показан как среднее значение трипликата со стандартным отклонением (SD).
Фиг. 5. Белки VRA конкурируют с gp120 за связывание с VRC01. Увеличение концентрации gp120 ингибирует связывание белков VRA017-, VRA019-u VRA177-TolA-AVI при постоянной концентрации 2x1°’7 М с VRC01 lgG (а) и VRC01 Fab (b). Все белки VRA и ABDwt были биотинилированы и обнаружены конъюгатом стрептавидин-HRP. Результаты каждого эксперимента показаны как среднее значение трипликата (дубликата в случаях экспериментов по конкуренции VRA019 и VRA177) со стандартным отклонением (SD).
Фиг. 6. Малый связывающий белок VRA017 конкурирует с гликопротеином gp120 за связывание с антителом VRC01. Увеличение концентрации слитого белка VRA017-TolA-AVI в качестве конкурента снижает связывание gp120 при постоянной концентрации 5x10’1° М с lgG VRC01 (слева) и с Fabфрагментом VRC01 (справа). Обнаружено с помощью ELISA с конъюгатом анти-V5 Ab-HRP.
Фиг. 7. Сыворотка мышей, иммунизированных VRA017, VRA177, VRA019 и VRA017S, специфически распознает Env ВИЧ-1. (а) Мышей иммунизировали в двух независимых экспериментах введением
- 3 045843 трех доз определенного варианта ABD, включая контрольный ABD дикого типа (ABDwt), три варианта связывания VRC01 VRA017, VRA019 и VRA177 и укороченную версию VRA017S. Каждая отдельная группа состоит из 5 животных. После иммунизации собирали сыворотку и мультимеризованные Clade В рекомбинантные варианты Env (gp120 MBL) без какой-либо очистки и идентификационных меток, использовали для тестирования титров Env-специфических сывороточных антител lgM, всех изотипов lgG (lgGtot), lgG1 и lgG2a с помощью ELISA. (b) Env-специфические сывороточные lgGtot из эксперимента I. (с) Env-специфические сывороточные lgGtot, lgG1, lgG2a и lgM из эксперимента II. Статистическое сравнение проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса ANOVA с посттестом Данна (*Р<0,05, **Р<0,01).
Фиг. 8. (a) VRC01 конкурирует с сывороткой иммунизированных мышей за связывание с gp120. Планшеты покрывали gp120. VRC01, серийно разбавленный в блокирующем буфере (в дуплетах), наносили с сывороткой мыши, разбавленной 1:400. После промывки планшеты инкубировали с кроличьим HRP-конъюгированным антимышиным lgG антителом, промывали, проявляли субстратом и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Средние значения указаны горизонтальными полосами. (b) Интактную сыворотку, а также антитело 10Е8 использовали в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 9. Кривые титрования смешанных сывороток мышей во время анализа нейтрализации псевдовируса ВИЧ-1. Анализы нейтрализации проводили с использованием набора псевдовирусов ВИЧ-1 Clade В и С уровня 2 или 3 с индикаторными клетками TZM-bl. Серийно разбавленные образцы сыворотки в дупликатах инкубировали с псевдовирусами. Нагрузку псевдовирусами устанавливали для достижения примерно 150000 RLU в 150 мкл DMEM при отсутствии сыворотки. После инкубации добавляли клетки TZM-bl с плотностью 105 клеток/мл, инкубировали, лизировали, добавляли субстрат и измеряли люминесценцию. На участках (а), (b), (c) показаны кривые титрования конкретных псевдовирусов и сывороток мышей отдельных иммунизируемых групп.
Фиг. 10. Анализ термостабильности белков VRA017S, VRA019S и VRA177S с использованием анализа теплового сдвига (TSA). Показаны нормированные кривые флуоресценции термического плавления белков, связывающих His6-VRA-TolS-AVI (слева), и первая производная флуоресценции в зависимости от температуры (справа). Температура плавления указана как самая нижняя точка пунктирной кривой. Измерение проводили в дупликатах и усредняли. Определенные температуры плавления (Tm) для белков, связывающих VRA017S, VRA019S и VRA177S, соответствуют Tm 50°С, 50°С и 58,5°С соответственно. Tm для родительского немутированного слитого белка His6-ABDwt-TolS-AVI составляет 55,5°С (пунктирная линия).
Примеры осуществления изобретения
Материалы и методы.
Конструирование и производство рекомбинантного gp120.
Мультимерный рекомбинантный белок gp120 Clade В с N-концевой His-меткой и С-концевой V5меткой получали с использованием протокола, описанного ранее (Raska M, Takahashi K, Czernekova L, et al Glycosylation patterns of HIV-1 gp120 depend on the type of expressing cells and affect antibody recognition. The Journal of biological chemistry 2010, 285: 20860-9; Raska M, Moldoveanu Z, Novak J, et al Delivery of DNA HIV-1 vaccine to the liver induces high and long-lasting humoral immune responses. Vaccine 2008, 26: 1541-51; Raska M, Czernekova L, Moldoveanu Z, et al Differential glycosylation of envelope gp120 is associated with differential recognition of HIV-1 by virus-specific antibodies and cell infection. AIDS Res Ther 2014, 11: 23) в концентрации 1,2 мг/мл. Этот белок использовали для анализа конкуренции с белками VRA.
Антитела, используемые для предварительной селекции, селекции и дальнейшей характеристики
Широконейтрализующее человеческое gp120 моноклональное антитело VRC01 (RRID: АВ_2491019) получали от доктора Джона Масколы (номер по каталогу 12033) (Wu X, Yang ZY, Li Y, et al. Rational Design of Envelope Identities Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies to HIV-1. Science 2010, 329: 856-61) через Программу реагентов NIH AIDS, Отделение AIDS, NIAID, NIH. Fabфрагмент VRC01 готовили с использованием набора Fab Micro Preparation (Pierce, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) в соответствии с инструкциями производителя. 125 мкл антитела VRC01 (100 мкг) наносили на колонку, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, и инкубировали в течение 5 часов при 37°С. Расщепленное антитело элюировали центрифугированием и добавляли в колонку с уравновешенным иммобилизованным белком А. Колонку центрифугировали для сбора фрагмента Fab. Измеряли концентрацию очищенного Fab-фрагмента. Белок VRC01 lgG, a также его Fab тестировали на его активность в отношении связывания gp120 при иммобилизации на планшете Polysorp (NUNC, Roskilde, Дания) в ELISA. Человеческий lgG kappa 1 мг/мл (очищенный белок миеломы, Sigma-Aldrich, СентЛуис, Миссури) использовали в качестве отрицательного контроля в ELISA, а также в качестве изотипического контроля для предварительной селекции в рибосомном дисплее, хранили как 1 мг/мл исходного раствора при -20°С. VRC01 mAb использовали для рибосомного дисплея в качестве целевого белка, хранящегося в виде исходного раствора 3 мг/мл в PBS (рН 7,2) при -80°С.
Сборка библиотеки ABD и селекция рибосомного дисплея.
Комбинаторную библиотеку, полученную из ABD, собирали с помощью ПЦР (Ahmad JN, Li J, Biedermannova L, et al Novel high-affinity binders of human interferon gamma derived from albumin-binding
- 4 045843 domain of protein G. Proteins 2012, 80: 774-89) и использовали для трансляции in vitro и дальнейшей селекции рибосомных дисплеев (Kuchar M, Vankova L, Petrokova H, et al Human interleukin-23 receptor antagonists derived from an albumin-binding domain scaffold inhibit IL-23-dependent ex vivo expansion of IL-17producing T-cells. Proteins 2014, 82: 975-89). Проводили трех-и пятираундовую селекцию RD, 96луночные планшеты Polysorp (NUNC) покрывали VRC01 lgG, разбавленным в 100 мМ растворе бикарбоната/карбоната для покрытия (рН 9,6) в концентрации в соответствии с отрегулированной строгостью в каждом раунде процедуры селекции рибосомного дисплея: 1-й раунд - 50 мкг/мл, 2-й раунд - 25 мкг/мл, 3-й раунд - 10 мкг/мл, 4-й раунд - 5 мкг/мл и 5-й раунд - 5 мкг/мл. Процедуру предварительной селекции проводили в лунках, покрытых человеческим lgG1 kappa антителом (Sigma-Aldrich) в постоянной концентрации 25 мкг/мл в каждом раунде. Конечную кДНК после третьего и пятого раундов селекции амплифицировали с помощью ПЦР и вводили в вектор pET-28b, несущий клонированную tolA-AviTag последовательность (Krizova L, Kuchar M, Petrokova H, et al p19-targeted ABD-derived protein variants inhibit IL-23 binding and exert suppressive control over IL-23-stimulated expansion of primary human IL-17+ T-cells. Autoimmunity 2017, 50: 102-13) и вводили в клетки-хозяева E.coli XL1 blue.
Производство вариантов белков, полученных из ABD
Варианты белков получали в виде слитых рекомбинантных белков His6-VRA-TolA-AVI, позволяющих биотинилировать in vivo связывающие белки на С-конце (Krizova L, Kuchar M, Petrokova H, et al. p19-targeted ABD-derived protein variants inhibit IL-23 binding and exert suppressive control over IL-23stimulated expansion of primary human IL-17+ T-cells. Autoimmunity 2017, 50: 102-13). Укороченные слитые белки VRA были сконструированы путем замены полноразмерного tolA (инвентарный номер UniProt: P19934, эталонная последовательность NCBI: NC_000913.3) с его С-концевой частью, называемой tolS, посредством ПЦР с праймерами to!A-C-end 5’-ATTAGGATCCCCGTCAGGGCCGATATCAATAACTATGC-3' (SEQ ID
NO: 9) и tolA-AVI_rev1 5‘TTTCCGCTCGAGCTATTCGTGCCATTCGATTTTGAGCCTCGAAGATGTCGTTCAGG
CCCGGTTTGAAGTCCAATGGCGC-3’ (SEQ ID NO: 10)
Связывающие белки VRA получали в виде in vivo биотинилированных белков в штамме BirA E.coli BL21 (DE3) с добавлением 50 мкМ d-биотина (приготовленный 5 мМ раствор в 10 мМ бициновом буфере, рН 8,3) в среде LB, содержащей канамицин (60 мкг/мл) и хлорамфеникол (30 мкг/мл). Продукцию белка индуцировали при 35°С 1,5 мМ IPTG после того, как культура достигла плотности OD600 = 0,6. Клетки собирали через 4 часа после индукции, обрабатывали ультразвуком в TN буфере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 8,0), центрифугировали (40000xg, 20 мин, 4°С) и в дальнейшем бактериальные лизаты анализировали или белки очищали на колонке с Ni-NTA агарозой.
Скрининг вариантов ABD с помощью ELISA.
Клеточные лизаты клонов клеток-хозяев E.coli BL21 BirA, продуцирующих биотинилированные варианты белка, готовили с использованием раствора лизоцима (PBS буфер, 0,05% Tween, 1% лизоцим, 25 ед/мл бензоназы, рН 7,4) или с использованием ультразвукового аппарата (Misonix 3000). Планшет Polysorp (NUNC, Roskilde, Дания) покрывали VRC01 lgG1 (5 мкг/мл) или lgG1 каппа (5 мкг/мл) в покрывающем буфере (100 мМ бикарбонат/карбонатный буфер, рН 9,6) при 7°С в течение ночи. На следующий день планшет промывали раствором PBST (буфер PBS, содержащий 0,05% Tween, рН 7,4) и лунки блокировали PBSTB (буфер PBS, рН 7,4, содержащий 0,05% Tween и 1% BSA). Наносили образцы лизата (разбавленные в 33 раза), очищенные варианты белка, а также отрицательный контроль ABDwt, разбавленный в PBSTB, и их связывание определяли с использованием конъюгата стрептавидина Poly-HRP (Pierce), разбавленного в PBSTB 1:10 000. Меченный V5 рекомбинантный белок gp120 разбавляли в PBSTB и обнаруживали с помощью анти-У5 метки - HRP конъюгата в PBSTB (1:10 000). Связывание белка визуализировали ферментативной реакцией HRP с субстратом OPD (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в цитратном буфере (3,31% дигидрат трехосновного цитрата натрия, фосфорная кислота, рН 5,0) или в субстрате TMB-Complete 2 (TestLine Clinical Diagnostics sro, Брно, Чешская Республика) и реакцию останавливали 2 М серной кислотой и измеряли оптическую плотность при 492 или 450 нм соответственно. С помощью этого метода было проверено почти 800 лизатов бактериальных клонов и обнаружено четыре варианта, которые преимущественно связываются с широконейтрализующим антителом VRC01 по сравнению с контрольным изотипическим антителом lgG kappa (фиг. 2). Эти связывающие белки были обозначены как VRA белки. Варианты VRA017 (SEQ ID NO: 6) и VRA019 (SEQ ID NO: 7) получали при пятираундовой селекции рибосомного дисплея (RD), тогда как варианты VRA174 и VRA177 были обнаружены при трехраундовой RD-селекции. Анализ последовательности ДНК выявил идентичность последовательностей вариантов VRA174 и VRA177, и поэтому для дальнейшего анализа использовали только клон VRA177 (SEQ ID NO: 8) (табл. 1, фиг. 3). Этот метод в дальнейшем использовали для проверки специфического связывания белков VRA017, VRA019 и VRA177 с иммобилизованным нейтрализующим антителом VRC01 (фиг. 4а), а также с иммобилизованным Fab-фрагментом VRC01 lgG (фиг. 4б) по сравнению со связыванием с контролем изотипа lgG kappa.
- 5 045843
Конкуренция ELISA.
Лунки планшета Polysorp (NUNC, Дания) покрывали VRC01 lgG антителом или Fab-фрагментом, разбавленным в покрывающем буфере (5 мкг/мл). Покрытые лунки блокировали PBSTB раствором и наносили меченный V5 gp120 в качестве серийно разбавленного конкурента в PBSTB растворе, содержащем вариант белка VRA при постоянной концентрации (5 мкг/мл) и связывающие биотинилированные in vivo VRA017, VRA019 и VRA177 (как слитый белок His6-VRA-TolA-AVI) выявляли с помощью конъюгата стрептавидин-HRP. В качестве альтернативы, VRA017 белок наносили в качестве серийно разбавленного конкурента в PBSTB при постоянной концентрации меченного V5 gp120 (1,2 мкг/мл), и определение связанного gp120 проводили с использованием конъюгата анти-V5 метка - HRP-антитело. Результаты визуализировали ферментативной реакцией HRP с OPD субстратом (Sigma-Aldrich, МО) в цитратном буфере или TMB-Complete 2 субстратом (TestLine Clinical Diagnostics sro, Брно), и реакцию останавливали 2 М серной кислотой и абсорбцией при 492 или 450 нм соответственно. Этот метод использовали для демонстрации результатов, в которых увеличение количества гликопротеина gp120 ингибирует связывание VRA017, VRA019 и VRA177 с иммобилизованным VRC01 lgG, а также с Fabфрагментом, полученным расщеплением VRC01 lgG (фиг. 5b). Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что варианты белка VRA017, VRA019 и VRA177 распознают вариабельную область антитела VRC01, поэтому их можно распознать как неродственный эпитоп VRC01. Более того, конкуренция за связывание между VRA017 и gp120 также подтверждается другим экспериментом, подтверждающим, что увеличение концентрации VRA017 приводит к ингибированию связывания гликопротеина gp120 с иммобилизованным VRC01 lgG, а также с его Fab-фрагментом (фиг. 6).
Анализ последовательности выбранных вариантов.
Секвенировали плазмидную ДНК, кодирующую полноразмерные варианты белка (Основное учреждение - Геномика, Факультет естественных наук, Карлов университет, BIOCEV, Vestec). Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием NCBI BLAST (Национальный центр биотехнологической информации, https://www.ncbi.nlm.nih.qov/). Проанализировали несколько десятков отобранных клонов, и наиболее важные из них представлены в табл. 1.
Табл. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей связывающих VRA белков и родительского ABDwt. Серые прямоугольники указывают 11 позиций, в которых были рандомизированы ABD аминокислоты в области 20-46.
Таблица 1
| 20 | 24 | 27 | 29 30 | 32 33 | 36 | 37 | 40 | 44 | |
| ABDwt | Y Y К | N L | INNA | К Т | Уг Е G | V К А | L I D | Е I L | A A L Р |
| УК АО 17 | A Y К | N А | I N R А | V Т | V G L | V К R | У' I D | G I L | A R L Р |
| VRA019 | N Y К | N R | I N V А | L G | G Т Λ | V К R | I I D | A I L | A A L Р |
| УК А174 | R Y К | N D | I N Р А | S R | V G А | V К R | У' I D | R I L | A G L Р |
| VRA177 | R Y К | N D | I N Р А | S R | V G Λ | V К R | V I D | R I L | A G L Р |
Иммунизация экспериментальных мышей.
Все эксперименты проводили на самках мышей BALB/c в возрасте от 6 до 8 недель, приобретенных в AnLab (Брно, Чехия) в стандартных условиях содержания в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Эксперименты по вакцинации были одобрены Комитетом по этике факультета медицины и стоматологии (Университет Палацкого в Оломоуце, Чешская Республика) и Министерством образования, молодежи и спорта, Чешская Республика (MSMT-15434/2015-7). Образцы предиммунной сыворотки (130 мкл на животное) получали с использованием метода сбора образцов крови из хвостовой вены. Каждую мышь иммунизировали три раза соответствующим вариантом ABD/VRA. Были проведены два независимых эксперимента по иммунизации. В первом эксперименте использовали варианты VRA017, VRA019 и VRA177 и ABD дикого типа (ABDwt) для оценки иммуногенности и специфичности полученных антител из мышиной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 7a, b Во втором эксперименте (фиг. 7а, с) тестировали VRA017, VRA177 и укороченную версию белка VRA017, обозначенную как VRA017S, с укороченным С-концевым сегментом TolS-AVI, который позволяет сузить очаг иммунного ответа на VRC01-подобный эпитоп или контроль ABDwt. Все иммунизации проводили внутрикожно равными дозами 20 мкг варианта ABD/VRA (разбавленного в 50 мкл стерильного PBS) на мышь на одну иммунизацию, смешанного 1:1 (объем : объем) с адъювантом Фрейнда. Наши результаты подтвердили, что иммунизация мышей белками VRA приводит к выработке антител против протестированных вариантов белков VRA и что сыворотка мышей, иммунизированных вариантами VRA, значительно нацелена на gp120 по сравнению с контрольной сывороткой неиммунизированных животных или индивидуумов, иммунизированных контрольным белком ABD. Это показывает, что поверхность отдельных вариантов VRA демонстрирует существенную комплементарность формы паратопу нейтрализующего антитела VRC01 и, таким образом, может имитировать часть гликопротеина Env ВИЧ-1.
Определение Env-специфических сывороточных антител с помощью ELISA.
Для определения реактивности сыворотки мышей с Env ВИЧ-1 в ELISA использовали рекомби
- 6 045843 нантный тримерный Clade В gp120 MBL без меток для обнаружения или очистки. Планшеты Maxisorp (NUNC, Roskilde, Дания) покрывали gp120 MBL (50 нг/лунка) в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали и блокировали 1% BSA/PBS/Tween20 на 3 часа при комнатной температуре. Сыворотки серийно разбавляли (начиная с разбавления 1:100) в блокирующем буфере (в дупликатах) и инкубировали в течение ночи при 4°С, чтобы определить одно разбавление, соответствующее линейной пропорции кривых титрования, полученных от большинства иммунизированных VRA животных в итоговом сравнении. Окончательное разбавление сыворотки устанавливали на 1:400. Для обнаружения связанных антител, специфичных к gp120, планшеты промывали и инкубировали с кроличьими антимышиными lgG, lgG1, lgG2a и вторичными антителами lgM, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, СентЛуис, Миссури, США), разбавленными в блокирующем буфере в течение 3 часов при комнатной температуре. Сигнал проявлялся с субстратом О-фенилендиамин-Н2О2. Реакцию останавливали 1 М серной кислотой и измеряли оптическую плотность при 492 нм. Эту методическую процедуру использовали для получения результатов, показанных на фиг. 7с. Представленные данные показывают, что сыворотки мышей, иммунизированных белками VRA017 и VRA177, имеют значительно повышенное связывание с тримерной версией рекомбинантного гликопротеина gp120 для lgG1, lgG2a и общего lgG, в то время как антитела lgM не связываются с gp120.
Конкуренция VRC01 с сывороткой гипериммунных мышей за связывание gp120, проверенная с помощью ELISA.
Планшеты покрывали, как описано выше, для определения Env-специфических сывороточных антител с помощью ELISA. VRC01, серийно разбавленный в блокирующем буфере (в дуплетах), наносили с сывороткой мыши, разбавленной 1:400. Для обнаружения связанных мышиных антител планшеты промывали и инкубировали с кроличьим антимышиным lgG вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, разбавленной в блокирующем буфере, в течение 3 часов при комнатной температуре. Планшеты обрабатывали и измеряли, как указано выше. Эту экспериментальную процедуру выполняли для получения результатов, показанных на фиг. 8а. Эти результаты показывают, что увеличивающаяся концентрация нейтрализующего антитела VRC01 блокирует связывание разбавленной сыворотки мышей, иммунизированных VRA177, VRA017S и VRA017, с иммобилизованным gp120. Это подтверждает конкуренцию моноклинального антитела VRC01 с вновь продуцируемыми сывороточными антителами против VRA и подчеркивает специфичность вновь продуцируемых сывороточных антител против gp120 ВИЧ-1. Это открытие дополнительно подтверждается неспособностью контрольного gp120нерелевантного Env антитела 10Е8 конкурировать за связывание с сывороткой иммунизированных мышей (фиг. 8b).
Анализ на нейтрализацию вируса.
Анализ на нейтрализацию проводили с использованием различных псевдовирусов из clade В и clade С, продуцируемых в клеточной линии HEK293/17. Клетки с конфлюэнтностью 60-90% в колбе для культивирования объемом 75 см2 котрансфицировали с использованием реагента для трансфекции FuGene6 (Promega, Madison, WI). Перед трансфекцией 8 мкг плазмиды pSG3deltaEnv, 4 мкг кодирующей Env плазмиды и 48 мкл FuGene6 смешивали с культуральной средой DMEM в общем объеме 800 мкл и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь добавляли к 12 мл RPMI-1640 в колбу с лунками. Через 2 дня культуральную среду с продуцированными псевдовирусами собирали, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С до использования. Анализ на нейтрализацию проводили с использованием клеточной линии TZM-bl, стабильно экспрессирующей рецептор CD4, корецепторов CCR5 и CXCR4 и содержащей гены люциферазы и β-галактозидазы под контролем промотора длинных концевых повторов ВИЧ-1 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH). Серийно разбавленные образцы сыворотки в дупликатах инкубировали с псевдовирусами примерно при 150000 RLU в 150 мкл DMEM. После 90-минутной инкубации при 37°С добавляли 100 мкл клеток плотностью 105 клеток/мл. Планшет инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 48 ч. Затем удаляли 150 мкл культуральной среды и добавляли 100 мкл лизирующего буфера, содержащего люциферин (Promega). Через 2 мин 100 мкл лизированных клеток переносили в черные 96-луночные планшеты и измеряли люминесценцию с помощью НР-люминометра. Эту методическую процедуру использовали для получения набора результатов нейтрализации, обобщенных в табл. 2. Наши результаты показывают, что сыворотки мышей, иммунизированных белками VRA177 и VRA017, проявляют нейтрализующую активность, которая представлена на наборе из 13 подготовленных псевдовирусов ВИЧ. Сыворотка мышей варианта VRA177 блокировала связывание 5 типов псевдовирусов с индикаторными клетками человека, тогда как сыворотка мышей, иммунизированных VRA017, блокировала связывание только 2 типов псевдовирусов. Наилучшая нейтрализующая активность была достигнута при комбинированной иммунизации VRA177TolA и VRA017S, вызывающей высокие титры сывороточных антител, блокирующих связывание 8 из 13 протестированных псевдовирусов. Подробные кривые связывания сывороток гипериммунных и интактных мышей для каждого типа псевдовируса показаны на фиг. 9a, b, c. Обобщенные комбинированные данные показывают, что полученные связывающие белки VRA177, VRA017 и VRA017S обладают способностью имитировать эпитоп нейтрализующего антитела VRC01, поскольку их использование для иммунизации животных вызывало продукцию антител, специфичных к gp120/Env ВИЧ-1, за
- 7 045843 счет индуцированной антиген-имитирующей способности. Нейтрализующий потенциал сывороточных антител, индуцированных белками VRA, свидетельствует о перспективности использования этих уникальных белков-имитаторов для разработки профилактической вакцины против ВИЧ и для индукции защиты от развития СПИДа.
Таблица 2 Нейтрализация псевдовирусов ВИЧ-1 сывороткой мышей, _________________иммунизированных в эксперименте II._________________
Кратность разбавления сыворотки приводило к 50% нейтрализации псевдовирусов
| Псевдовирус | Ряд | преимунный (интактный) | ABDwt | V RAI 77 | VRA177 +VRA017S +VRA017S | VRA017 |
| pWlTO | 2B | <30 | <30 | <30 | <30 | <30 |
| pREJO | 2B | <30 | <30 | 31 | 61 | <30 |
| HIV-1 АС10.0 | 2B | <30 | <30 | <30 | 48 | <30 |
| ; ' tro | 2B | <30 | <30 | <30 | 37 | <30 |
| в | ||||||
| 422664 | 2B | <30 | <30 | 57 | 71 | 34 |
| pRHPA | 2B | <30 | <30 | 84 | 90 | 40 |
| PVO | ЗВ | <30 | <30 | <30 | <30 | <30 |
| Du422 | 2C | <30 | <30 | <30 | <30 | <30 |
| ...... Du172 | 2C | <30 | <30 | <30 | <30 | <30 |
| Du156 ZM53M | 2C | <30 | <30 | 34 | 65 | <30 |
| 2C | <30 | <30 | 32 | 87 | <30 | |
| ZM214 | 2C | <30 | <30 | <30 | 32 | <30 |
| CAP210.2 | 20 | <30 | <30 | <30 | <30 | <30 |
Результаты выражены как кратность разбавления сыворотки, которое привело к 50% нейтрализации вируса.
Определение стабильности белка с помощью анализа теплового сдвига на основе флуоресценции.
Образцы белка (0,2 мг/мл) в ФСБ и красителе 5xSypro Orange (Sigma-Aldrich) смешивали в общем объеме 25 мкл и измеряли с использованием системы обнаружения ПЦР в режиме реального времени CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), как описано ранее (Kuchar М, Vankova L, Petrokova H, et al. Human interleukin-23 receptor antagonists derived from an albumin-binding domain scaffold inhibit IL-23 dependent ex vivo expansion of IL-17-producing T-cells. Proteins 2014, 82: 975-89). Термическая стабильность белков VRA017S, VRA019S и VRA177S показана на фиг. 10 с определенной температурой плавления (Тт) 50°С для VRA017S и VRA019S и 58,5°С в случае VRA177S. Температура плавления исходного немутированного слитого белка Hise-ABDwt-TolS-AVI составляет 55,5°С (пунктирная линия). Результаты показывают, что замена аминокислот в рандомизированных положениях домена ABD значительно не нарушала температурную стабильность вариантов белка. Это предполагает, что белки VRA-TolS можно использовать в качестве компонентов при разработке экспериментальных вакцин.
Статистика.
Различия между группами и статистическую значимость определяли с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), критерия Краскела-Уоллиса и посттеста Данна. Все статистические анализы были выполнены с использованием статистических пакетов SPSS v. 21 (IBM Corp., Армонк, Нью-Йорк) или программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc, Сан-Диего, Калифорния).
Claims (13)
1. Полипептид, имитирующий эпитоп гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, распознаваемый паратопом широконейтрализующего антитела VRC01, отличающийся тем, что указанный полипептид имеет длину до 100 аминокислотных остатков и содержит аминокислотную последовательность
X1YKNX2INX3AX4X5VX6X7VKRX8IDX9ILAX10LP (SEQ ID NO: 1), в которой
X1 выбран из аминокислот A, N, R;
X2 выбран из аминокислот A, R, D;
X3 выбран из аминокислот R, V, Р;
X4 выбран из аминокислот V, L, S;
X5 выбран из аминокислот Т, G, R;
X6 выбран из аминокислот G, Т;
-8045843
X7 выбран из аминокислот L, А;
X8 выбран из аминокислот V, I;
X9 выбран из аминокислот G, A, R;
X10 выбран из аминокислот R, A, G;
где альфа-спиральная структура связана С-концом или N-концом с указанной последовательностью SEQ ID NO: 1.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 выбрана из группы, включающей
AYKNAINRAVTVGLVKRVIDGILARLP (SEQ ID NO: 3), NYKNRINVALGGTAVKRIIDAILAALP (SEQ ID NO: 4), RYKNDINPASRVGAVKRVIDRILAGLP (SEQ ID NO: 5), где альфа-спиральная структура связана С-концом или N-концом с указанной последовательностью SEQ ID NO: 1.
3. Полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что альфа-спиральная структура представляет собой последовательность
LAEAKVLANRELDKYGVSD (SEQ ID NO: 2).
4. Полипептид по п.3, отличающийся тем, что он содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
LAEAKVLANRELDKYGVSDAYKNAINRAVTVGLVKRVIDGILARLP (SEQ ID NO: 6), LAEAKVLANRELDKYGVSDNYKNRINVALGGTAVKRIIDAILAALP (SEQ ID NO: 7), LAEAKVLANRELDKYGVSDRYKNDINPASRVGAVKRVIDRILAGLP (SEQ ID NO: 8).
5. Полипептид по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что он содержит метку аффинной очистки и/или детекции.
6. Химерный белок, отличающийся тем, что он содержит полипептид по любому из пп.1-5, спиральный белок TolA, или его укороченный вариант TolS, или сывороточный альбумин, или белок теплового шока hsp70.
7. Последовательность ДНК, отличающаяся тем, что она выбрана из группы, включающей комплементарную ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность полипептидов по любому из пп.1-5.
8. Применение последовательности ДНК по п.7 для получения полипептидов или рекомбинантных белков, продуцируемых в клетках-хозяевах бактерий, дрожжей, насекомых, млекопитающих или человека.
9. Клетка-хозяин, отличающаяся тем, что она содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК по п.7.
10. Применение полипептида по любому из пп.1-5 в медицине.
11. Применение полипептида по любому из пп.1-5 в качестве активного ингредиента или вспомогательного ингредиента вакцины для профилактики заражения вирусом ВИЧ-1.
12. Применение полипептида по любому из пп.1-5 в качестве антигена для стимуляции нейтрализующих антител, подходящего для разработки вакцины, предотвращающей заражение вирусом ВИЧ-1.
13. Применение ДНК, кодирующей полипептид по любому из пп.1-5, в качестве активного ингредиента ДНК-вакцины для профилактики заражения вирусом ВИЧ-1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZPV2019-585 | 2019-09-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045843B1 true EA045843B1 (ru) | 2023-12-29 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2021254327A1 (zh) | 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法 | |
| US20180193440A1 (en) | Immunogenic compositions and expression systems | |
| US11135280B2 (en) | Modified ebolavirus glycoproteins comprising mutations in the head and base domains that increase antibody cross-reactivity | |
| CN116964080A (zh) | 模拟MPER和V3-环HIV-1 Env糖蛋白表位的多肽 | |
| CN113018427A (zh) | 基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗 | |
| Kosztyu et al. | Proteins mimicking epitope of HIV-1 virus neutralizing antibody induce virus-neutralizing sera in mice | |
| US20220402978A1 (en) | Polypeptides mimicking epitope of broadly neutralizing antibody vrc01 as antigens for a vaccine preventing hiv-1 infection | |
| EA045843B1 (ru) | Полипептиды, имитирующие эпитоп широконейтрализующего антитела vrc01, в качестве антигенов для вакцины, предотвращающей инфекцию вич-1 | |
| Somanathan et al. | Process development and preclinical evaluation of a major Plasmodium falciparum blood stage vaccine candidate, Cysteine-Rich Protective Antigen (CyRPA) | |
| AU2017251715A1 (en) | Antibody recognizing arbitrarily designed epitope of three or more amino acid residues in a peptide and method of generating thereof | |
| Mühle et al. | Epitope mapping of the antibody response against the envelope proteins of the feline foamy virus | |
| US20240226269A9 (en) | Polypeptides mimicking mper and v3-loop hiv-1 env glycoprotein epitopes | |
| Fahimi et al. | Immunogenicity of a novel tetravalent dengue envelope protein domain III-based antigen in mice | |
| CA3117390A1 (en) | Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion | |
| WO2022225033A1 (ja) | 糖鎖修飾ｒｂｄ及びその使用 | |
| US20230220012A1 (en) | High-potency sars coronavirus 2 antigen and vaccine composition comprising same | |
| US20060275309A1 (en) | Peptide oligomers for use as hiv vaccines | |
| US10273292B2 (en) | Non-HIV vaccine antigen from the vaginal microbiota capable of inducing a mucosal neutralizing protective antibody response against HIV infection | |
| US10660951B2 (en) | Antibody recognizing arbitrarily designed epitope of three or more amino acid residues in a peptide and method of generating thereof | |
| Wang et al. | Exploration of the cross-immunity between SARS-CoV and SARS-CoV-2 in mice | |
| CA2711930A1 (en) | A truncated form of the hiv p17 protein |