EA045808B1 - ANTISENSE NUCLEIC ACID THAT INDUCES EXON 50 SKIPPLING - Google Patents
ANTISENSE NUCLEIC ACID THAT INDUCES EXON 50 SKIPPLING Download PDFInfo
- Publication number
- EA045808B1 EA045808B1 EA202291813 EA045808B1 EA 045808 B1 EA045808 B1 EA 045808B1 EA 202291813 EA202291813 EA 202291813 EA 045808 B1 EA045808 B1 EA 045808B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antisense oligomer
- exon
- pharmaceutically acceptable
- hydrate
- acceptable salt
- Prior art date
Links
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title claims description 171
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 19
- -1 hydrogen - Chemical class 0.000 claims description 47
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical group C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 claims description 40
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 40
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 claims description 34
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 24
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims description 20
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 10
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 claims description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 claims description 3
- RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid;morpholine Chemical group NP(N)(O)=O.C1COCCN1 RTINQKRHLKCKBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 98
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 54
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 49
- 101001053946 Homo sapiens Dystrophin Proteins 0.000 description 39
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 14
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 13
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000006935 Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 4
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 3
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000002780 morpholines Chemical class 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GGYVTHJIUNGKFZ-UHFFFAOYSA-N 1-methylpiperidin-2-one Chemical compound CN1CCCCC1=O GGYVTHJIUNGKFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N (2-phenoxyacetyl) 2-phenoxyacetate Chemical compound C=1C=CC=CC=1OCC(=O)OC(=O)COC1=CC=CC=C1 CCSBNBKMACZDGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical compound C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIQMCGMHGVXDFW-UHFFFAOYSA-N 1-methylhypoxanthine Chemical compound O=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 KIQMCGMHGVXDFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIJIUJYANDSEKG-UHFFFAOYSA-N 2,4,4-trimethylpentan-2-amine Chemical class CC(C)(C)CC(C)(C)N QIJIUJYANDSEKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)-2-hydroxyacetic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CNC(=O)NC1=O HLYBTPMYFWWNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 2-[(2,4-dioxo-1h-pyrimidin-5-yl)methylamino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC1=CNC(=O)NC1=O SGAKLDIYNFXTCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 2-dimethylamino-6-hydroxypurine Chemical compound N1C(N(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 XMSMHKMPBNTBOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 3-methylcytosine Chemical compound CN1C(N)=CC=NC1=O KOLPWZCZXAMXKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VPLZGVOSFFCKFC-UHFFFAOYSA-N 3-methyluracil Chemical compound CN1C(=O)C=CNC1=O VPLZGVOSFFCKFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001999 4-Methoxybenzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 4-acetyl-4-amino-1,3-dihydropyrimidin-2-one Chemical compound CC(=O)C1(N)NC(=O)NC=C1 GJAKJCICANKRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOZBINSIAHDCQU-UHFFFAOYSA-N 5-(2-oxopropyl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC(=O)CC1=CNC(=O)NC1=O AOZBINSIAHDCQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 5-[(methoxyamino)methyl]-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CONCC1=CNC(=S)NC1=O WPYRHVXCOQLYLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 5-ethyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CCC1=CNC(=O)NC1=O RHIULBJJKFDJPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound COC1=CNC(=O)NC1=O KELXHQACBIUYSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHVCSCWHWMSGTE-UHFFFAOYSA-N 6-methyluracil Chemical compound CC1=CC(=O)NC(=O)N1 SHVCSCWHWMSGTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N Dibenzylamine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCC1=CC=CC=C1 BWLUMTFWVZZZND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical class C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical class NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical class F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical class OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical class NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical class NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N N(2)-methylguanine Chemical compound O=C1NC(NC)=NC2=C1N=CN2 SGSSKEDGVONRGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical class CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 1
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005228 aryl sulfonate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N benethamine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCCC1=CC=CC=C1 UPABQMWFWCMOFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N benzathine Chemical class C=1C=CC=CC=1CNCCNCC1=CC=CC=C1 JUHORIMYRDESRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical class OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N chloroprocaine Chemical class CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1Cl VDANGULDQQJODZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical class OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 description 1
- 125000000582 cycloheptyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- YKGMKSIHIVVYKY-UHFFFAOYSA-N dabrafenib mesylate Chemical compound CS(O)(=O)=O.S1C(C(C)(C)C)=NC(C=2C(=C(NS(=O)(=O)C=3C(=CC=CC=3F)F)C=CC=2)F)=C1C1=CC=NC(N)=N1 YKGMKSIHIVVYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000012351 deprotecting agent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical class OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005332 diethylamines Chemical class 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 125000006575 electron-withdrawing group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical class CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002301 glucosamine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 150000002357 guanidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004491 isohexyl group Chemical group C(CCC(C)C)* 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000002688 maleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004701 malic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N n-(3-methylbut-3-enyl)-2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(NCCC(C)=C)=C2NC=NC2=N1 XJVXMWNLQRTRGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001038 naphthoyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002815 nickel Chemical class 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 150000003891 oxalate salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000003431 oxalo group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical class OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000004885 piperazines Chemical class 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical class CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 201000008752 progressive muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical class OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003892 tartrate salts Chemical class 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001973 tert-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N tetramethylammonium Chemical class C[N+](C)(C)C QEMXHQIAXOOASZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical class CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005425 toluyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical class OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical class OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 125000003774 valeryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Description
Область техникиField of technology
Изобретение относится к антисмысловому олигомеру, который индуцирует пропуск экзона 50 в человеческом гене дистрофина, и к фармацевтической композиции, содержащей антисмысловой олигомер.The invention relates to an antisense oligomer that induces skipping of exon 50 in the human dystrophin gene, and to a pharmaceutical composition containing the antisense oligomer.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Миодистрофия Дюшенна (МДД) представляет собой наиболее частую и тяжелую форму наследственной прогрессирующей мышечной атрофии, которая развивается примерно у 3500 новорожденных мальчиков. Хотя двигательные функции пациентов с МДД редко отличаются от здоровых людей в младенчестве и детстве, мышечную слабость наблюдают у детей примерно от 4 до 5 лет. Затем мышечная слабость у пациентов с МДД прогрессирует до потери способности ходить примерно к 12 годам и смерти от сердечной или дыхательной недостаточности в 20 лет. В настоящее время не существует достаточной терапии для МДД, и существует сильная потребность в разработке эффективного терапевтического средства.Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form of inherited progressive muscular atrophy, affecting approximately 3,500 male births. Although motor function in patients with DMD rarely differs from healthy controls during infancy and childhood, muscle weakness is observed in children approximately 4 to 5 years of age. Muscle weakness in patients with DMD then progresses to loss of the ability to walk by approximately 12 years of age and death from cardiac or respiratory failure at 20 years of age. Currently, there is no sufficient therapy for DMD, and there is a strong need to develop an effective therapeutic agent.
Известно, что МДД вызывает мутация в гене дистрофина. Ген дистрофина расположен на Ххромосоме и представляет собой огромный ген, состоящий из 2,2 миллионов пар оснований ДНК. ДНК транскрибируется в предшественники мРНК, а интроны удаляются путем сплайсинга для синтеза мРНК из 11058 оснований, соответствующих транслируемой области, в которой 79 экзонов соединены вместе. Эта мРНК транслируется в 3685 аминокислот для производства белка дистрофина. Белок дистрофина связан с поддержанием мембранной стабильности в мышечных клетках и необходим для того, чтобы сделать мышечные клетки менее хрупкими. Ген дистрофина у пациентов с МДД содержит мутацию и, таким образом, редко экспрессируется белок дистрофина, который является функциональным в мышечных клетках. Таким образом, структура мышечных клеток не может поддерживаться в организме пациентов с МДД, что приводит к большому притоку ионов кальция в мышечные клетки. Таким образом, возникает воспалительно-подобный ответ, способствующий фиброзу, что затрудняет регенерацию мышечных клеток.DMD is known to be caused by a mutation in the dystrophin gene. The dystrophin gene is located on the X chromosome and is a huge gene consisting of 2.2 million base pairs of DNA. The DNA is transcribed into precursor mRNAs and introns are removed by splicing to synthesize an mRNA of 11,058 bases corresponding to the translated region in which 79 exons are joined together. This mRNA is translated into 3685 amino acids to produce the protein dystrophin. The dystrophin protein is associated with maintaining membrane stability in muscle cells and is needed to make muscle cells less fragile. The dystrophin gene in DMD patients contains a mutation and thus rarely expresses the dystrophin protein that is functional in muscle cells. Thus, the muscle cell structure cannot be maintained in DMD patients, resulting in a large influx of calcium ions into the muscle cells. Thus, an inflammatory-like response occurs, promoting fibrosis, which makes it difficult for muscle cells to regenerate.
Миодистрофию Беккера (МДБ) также вызывает мутация в гене дистрофина. Симптомы включают мышечную слабость, сопровождающуюся атрофией мышц, но, как правило, они слабо выражены и прогрессируют медленно, по сравнению с МДД. Во многих случаях ее начало приходится на взрослый возраст. Считается, что различия в клинических симптомах между МДД и МДБ заключаются в том, нарушена ли мутацией рамка считывания аминокислот при трансляции мРНК дистрофина в белок дистрофина (непатентная литература 1). Более конкретно, при МДД присутствует мутационный сдвиг рамки считывания аминокислот и, тем самым, функциональный белок дистрофина экспрессируется редко, тогда как при МДБ вырабатывается белок дистрофина, который функционирует, хотя и несовершенно, поскольку сохранена рамка считывания аминокислот, в то время как часть экзонов удалена мутацией.Becker muscular dystrophy (BMD) is also caused by a mutation in the dystrophin gene. Symptoms include muscle weakness accompanied by muscle wasting, but they are generally mild and progress slowly compared to DMD. In many cases, its onset occurs in adulthood. The differences in clinical symptoms between DMD and BMD are thought to be whether the amino acid reading frame is disrupted by the mutation in the translation of dystrophin mRNA into dystrophin protein (Non-Patent Literature 1). More specifically, in DMD there is a mutational amino acid frameshift and thus functional dystrophin protein is rarely expressed, whereas in DMD a dystrophin protein is produced that functions, albeit imperfectly, because the amino acid reading frame is preserved while some exons are deleted mutation.
Ожидается, что пропуск экзона будет служить способом лечения МДД. Этот способ включает модификацию сплайсинга для восстановления аминокислотной рамки считывания мРНК дистрофина и индукции экспрессии белка дистрофина с частично восстановленной функцией (непатентная литература 2). Часть аминокислотной последовательности, которая является мишенью пропуска экзона, будет потеряна. По этой причине белок дистрофина, экспрессируемый при таком лечении, становится короче, чем обычно, но, поскольку аминокислотная рамка считывания сохраняется, функция стабилизации мышечных клеток частично сохраняется. Таким образом, ожидается, что пропуск экзона приведет МДД к симптомам, подобным симптомам МДБ, которая протекает мягче. Пропуск экзона был испытан на животных с использованием мышей или собак и в настоящее время его оценивают в клинических испытаниях на людях с МДД.Exon skipping is expected to serve as a treatment for DMD. This method involves modifying splicing to restore the amino acid reading frame of dystrophin mRNA and inducing expression of dystrophin protein with partially restored function (Non-Patent Literature 2). The portion of the amino acid sequence that is the target of exon skipping will be lost. For this reason, the dystrophin protein expressed with this treatment becomes shorter than normal, but since the amino acid reading frame is preserved, the function of stabilizing muscle cells is partially preserved. Thus, exon skipping is expected to result in DMD with symptoms similar to those of BMD, which is milder. Exon skipping has been tested in animals using mice or dogs and is currently being evaluated in clinical trials in humans with DMD.
Пропуск экзона можно индуцировать связыванием антисмысловых нуклеиновых кислот, нацеленных либо на 5'-, либо на 3'-сайт сплайсинга, либо на оба сайта, либо на сайты внутри экзона. Экзон будет включен в мРНК только тогда, когда оба его сайта сплайсинга распознаются сплайсосомным комплексом. Таким образом, пропуск экзона можно индуцировать нацеливанием антисмысловых нуклеиновых кислот на сайты сплайсинга. Кроме того, связывание белка SR с энхансером сплайсинга экзонов (ESE) считается необходимым для того, чтобы экзон распознавался механизмом сплайсинга. Таким образом, пропуск экзона также можно индуцировать нацеливанием на ESE.Exon skipping can be induced by the binding of antisense nucleic acids targeting either the 5' or 3' splice site, both sites, or sites within the exon. An exon will only be included in the mRNA when both its splice sites are recognized by the spliceosomal complex. Thus, exon skipping can be induced by targeting antisense nucleic acids to splice sites. In addition, binding of the SR protein to the exon splicing enhancer (ESE) is thought to be necessary for the exon to be recognized by the splicing machinery. Thus, exon skipping can also be induced by targeting the ESE.
Поскольку мутация гена дистрофина может варьировать в зависимости от пациентов с МДД, антисмысловые нуклеиновые кислоты необходимо разрабатывать на основе сайта или типа соответствующей генетической мутации. В прошлом антисмысловые нуклеиновые кислоты, вызывающих пропуск экзона для всех 79 экзонов, производили Steve Wilton, et al., Университет Западной Австралии (непатентная литература 3), а антисмысловые нуклеиновые кислоты, вызывающих пропуск экзона для 39 экзонов, производили Annemieke Aartsma-Rus, et al., Нидерланды (непатентная литература 4).Because dystrophin gene mutation may vary among DMD patients, antisense nucleic acids need to be designed based on the site or type of the corresponding genetic mutation. In the past, exon skipping antisense nucleic acids for all 79 exons were produced by Steve Wilton, et al., University of Western Australia (Non-Patent Literature 3), and exon skipping antisense nucleic acids for exon 39 were produced by Annemieke Aartsma-Rus, et al. al., Netherlands (non-patent literature 4).
Считают, что примерно 4% всех пациентов с МДД можно лечить пропуском 50-го экзона (далее в настоящем документе обозначаемый как экзон 50) (непатентная литература 5). В последние годы несколько исследовательских организаций, в том числе заявитель, сообщили об исследованиях, в которых экзон 50 в гене дистрофина был мишенью для пропуска экзона (патентная литература с 1 по 6 и непатентная литература 6).It is believed that approximately 4% of all patients with DMD can be treated by skipping exon 50 (hereinafter referred to as exon 50) (Non-Patent Literature 5). In recent years, several research organizations, including the applicant, have reported studies in which exon 50 of the dystrophin gene was targeted for exon skipping (patent literature 1 to 6 and non-patent literature 6).
- 1 045808- 1 045808
Список цитированияCitation list
Патентная литература.Patent literature.
Патентная литература 1. Международная публикация WO 2013/100190.Patent literature 1. International publication WO 2013/100190.
Патентная литература 2. Международная публикация WO 2004/048570.Patent literature 2. International publication WO 2004/048570.
Патентная литература 3. Международная публикация WO 2006/000057.Patent literature 3. International publication WO 2006/000057.
Патентная литература 4. Международная публикация WO 2010/050802.Patent literature 4. International publication WO 2010/050802.
Патентная литература 5. Международная публикация WO 2010/048586.Patent literature 5. International publication WO 2010/048586.
Патентная литература 6. Международная публикация WO 2011/057350.Patent literature 6. International publication WO 2011/057350.
Непатентная литература.Non-patent literature.
Непатентная литература 1. Monaco A.P. et al., Genomics 2:90-95 (1988).Non-patent literature 1. Monaco A.P. et al., Genomics 2:90-95 (1988).
Непатентная литература 2. Matsuo M., Brain and Development 18:167-172 (1996).Non-patent literature 2. Matsuo M., Brain and Development 18:167-172 (1996).
Непатентная литература 3. Wilton S.D. et al., Molecular Therapy 15:1288-96 (2007).Non-patent literature 3. Wilton S.D. et al., Molecular Therapy 15:1288-96 (2007).
Непатентная литература 4. Annemieke Aartsma-Rus et al., Neuromuscular Disorders 12:S71-S77 (2002).Non-patent literature 4. Annemieke Aartsma-Rus et al., Neuromuscular Disorders 12:S71-S77 (2002).
Непатентная литература 5. Bladen C.L. et al., Human Mutation 36:395-402 (2015).Non-patent literature 5. Bladen C.L. et al., Human Mutation 36:395–402 (2015).
Непатентная литература 6. Bo Wu et al., PLosOne 6(5):el9906 (2011).Non-patent literature 6. Bo Wu et al., PLosOne 6(5):el9906 (2011).
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Техническая задача.Technical problem.
При указанных выше обстоятельствах были желательны новые антисмысловые олигомеры, которые индуцируют пропуск экзона 50 в гене дистрофина с высокой эффективностью. Кроме того, желательны антисмысловые олигомеры, которые обладают превосходными физическими свойствами (например, растворимостью) в качестве лекарственных средств, сохраняя при этом активность по индукции пропуска экзона 50 в гене дистрофина с высокой эффективностью.Under the above circumstances, new antisense oligomers that induce skipping of exon 50 in the dystrophin gene with high efficiency were desired. In addition, antisense oligomers are desirable that have excellent physical properties (eg, solubility) as drugs while retaining exon 50 skipping inducing activity in the dystrophin gene with high efficiency.
Решение задачи.The solution of the problem.
В результате детального изучения технического содержания вышеуказанных документов и структуры гена дистрофина авторы настоящего изобретения обнаружили, что пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека с высокой эффективностью индуцируется введением антисмыслового олигомера, имеющего последовательность оснований, представленную любой из SEQ ID NO: 3-5. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что антисмысловой олигомер обладает превосходной растворимостью, индуцируя пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека с высокой эффективностью. Основываясь на этом открытии, авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение.As a result of detailed study of the technical content of the above documents and the structure of the dystrophin gene, the present inventors have discovered that skipping of exon 50 in the human dystrophin gene is induced with high efficiency by the introduction of an antisense oligomer having the base sequence represented by any of SEQ ID NO: 3-5. The present inventors also discovered that the antisense oligomer has excellent solubility, inducing skipping of exon 50 in the human dystrophin gene with high efficiency. Based on this discovery, the present inventors have completed the present invention.
Таким образом, настоящее изобретение заключается в следующем.Thus, the present invention is as follows.
Антисмысловой олигомер, который выбран из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:An antisense oligomer that is selected from the group consisting of (a)-(d) below:
а) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований любой из SEQ ID NO: от 3 до 5;a) an antisense oligomer containing the base sequence of any of SEQ ID NO: 3 to 5;
(b) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований, которая имеет делецию, замену, вставку и/или добавление от 1 до 5 оснований в последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека;(b) an antisense oligomer comprising a base sequence that has a deletion, substitution, insertion and/or addition of 1 to 5 bases in the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene ;
(c) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований, которая имеет по меньшей мере 80% идентичности последовательности с последовательностью оснований любой из SEQ ID NO: 3-5 и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека; и (d) антисмысловой олигомер, который гибридизуется при жестких условиях с олигонуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека, или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат.(c) an antisense oligomer comprising a base sequence that has at least 80% sequence identity with the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5 and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene; and (d) an antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of any of SEQ ID NOs: 3-5 and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene, or a pharmaceutically acceptable salt thereof or hydrate.
Антисмысловой олигомер, который выбран из группы, состоящей из (e)-(h) ниже:An antisense oligomer that is selected from the group consisting of (e)-(h) below:
(e) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5;(e) an antisense oligomer that consists of the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5;
(f) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований, имеющей делецию и/или замену от 1 до 5 оснований в последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека;(f) an antisense oligomer that consists of a base sequence having a deletion and/or substitution of 1 to 5 bases in the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene;
(g) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований, имеющей по меньшей мере 80% идентичности последовательности с последовательностью оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека; и (h) антисмысловой олигомер, который гибридизуется при очень жестких условиях с олигонуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека, или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат.(g) an antisense oligomer that consists of a base sequence having at least 80% sequence identity with the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene; and (h) an antisense oligomer that hybridizes under very stringent conditions to an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of any of SEQ ID NOs: 3-5 and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene, or a pharmaceutically acceptable amount thereof salt or hydrate.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно вышеуказанным [1] или [2], где антисмысловой олигомер представляет собой антисмысловой олигомер, который имеет нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с последовательностью оснований любой из SEQ ID NO: 3-5 и обладает активностью индуцироватьAn antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof as defined in [1] or [2] above, wherein the antisense oligomer is an antisense oligomer that has a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity with a base sequence of any of SEQ ID NO : 3-5 and has activity to induce
- 2 045808 пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека.- 2 045808 skipping of exon 50 in the human dystrophin gene.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно любому из вышеуказанных [1]-[3], где антисмысловой олигомер представляет собой олигонуклеотид.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof, according to any one of the above [1]-[3], wherein the antisense oligomer is an oligonucleotide.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно [4] выше, где молекула сахара и/или группа с фосфатной связью по меньшей мере одного нуклеотида, входящего в состав олигонуклеотида, модифицированы.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to [4] above, wherein the sugar molecule and/or the phosphate bond group of at least one nucleotide included in the oligonucleotide is modified.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно [4]-[5] выше, где молекула сахара по меньшей мере одного нуклеотида, входящего в состав олигонуклеотида, представляет собой рибозу, в которой группа 2'-ОН заменена любой одной, выбранной из группы, состоящей из OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br и I (где R представляет собой алкил или арил, a R' представляет собой алкилен).An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to [4]-[5] above, wherein the sugar molecule of at least one nucleotide included in the oligonucleotide is a ribose in which the 2'-OH group is replaced by any one, selected from the group consisting of OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br and I (where R is alkyl or aryl and R' is an alkylene).
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно любому из [4]-[6] выше, где группа с фосфатной связью по меньшей мере одного нуклеотида, входящего в состав олигонуклеотида, представляет собой любую одну, выбранную из группы, состоящей из тиофосфатной связи, фосфородитиоатной связи, алкилфосфонатной связи, фосфорамидатной связи и боранофосфатной связи.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to any one of [4]-[6] above, wherein the phosphate bond group of at least one nucleotide included in the oligonucleotide is any one selected from the group consisting of thiophosphate bond, phosphorodithioate bond, alkylphosphonate bond, phosphoramidate bond and boranophosphate bond.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно любому из [1]-[3] выше, где антисмысловой олигомер представляет собой морфолиновый олигомер.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof, according to any one of [1]-[3] above, wherein the antisense oligomer is a morpholine oligomer.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно [8] выше, где антисмысловой олигомер представляет собой фосфородиамидатный морфолиновый олигомер.The antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to [8] above, wherein the antisense oligomer is a phosphorodiamidate morpholine oligomer.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно [8] или [9] выше, где 5'-конец является любой одной из химических формул (1)-(3) ниже:An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to [8] or [9] above, wherein the 5' end is any one of chemical formulas (1)-(3) below:
Формула 1Formula 1
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно любому из [1]-[10] выше, где длина антисмыслового олигомера составляет 19 или 20 оснований.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof, according to any of [1]-[10] above, wherein the length of the antisense oligomer is 19 or 20 bases.
Фармацевтическая композиция для лечения миодистрофии, содержащая антисмысловой олигомер или его фармацевтически приемлемую соль, или гидрат согласно любому из [1]-[11] выше.A pharmaceutical composition for the treatment of muscular dystrophy containing an antisense oligomer or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to any one of [1]-[11] above.
Фармацевтическая композиция согласно [12] выше, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.The pharmaceutical composition according to [12] above, further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
Фармацевтическая композиция согласно [12] или [13] выше для введения пациенту с миодистрофией, где пациентом является пациент с мутацией, которая восприимчива к пропуску экзона 50 в гене дистрофина.A pharmaceutical composition according to [12] or [13] above for administration to a patient with muscular dystrophy, where the patient is a patient with a mutation that is susceptible to exon 50 skipping in the dystrophin gene.
Фармацевтическая композиция согласно [14] выше, где пациент имеет ген дистрофина, который имеет, по меньшей мере, мутацию сдвига рамки считывания, вызванную делецией экзона вблизи экзона 50, и в котором рамка считывания аминокислот корректируется пропуском экзона 50.The pharmaceutical composition according to [14] above, wherein the patient has a dystrophin gene that has at least a frameshift mutation caused by an exon deletion near exon 50, and in which the amino acid reading frame is corrected by skipping of exon 50.
Фармацевтическая композиция согласно [14] или [15] выше, где пациент имеет мутацию сдвига рамки считывания, вызванную делециями экзонов 51, 51-53, 51-55 или 51-57 в гене дистрофина.Pharmaceutical composition according to [14] or [15] above, where the patient has a frameshift mutation caused by deletions of exons 51, 51-53, 51-55 or 51-57 in the dystrophin gene.
Фармацевтическая композиция согласно любому из [14]-[16] выше, где пациент является человеком.A pharmaceutical composition according to any one of [14]-[16] above, where the patient is a human.
Применение антисмыслового олигомера или его фармацевтически приемлемой соли, или гидрата согласно любому из [1]-[11] выше в производстве лекарственного средства для лечения миодистрофии.Use of an antisense oligomer or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to any of [1]-[11] above in the production of a medicament for the treatment of muscular dystrophy.
Способ для лечения миодистрофии, который предусматривает введение пациенту с миодистрофией эффективного количества антисмыслового олигомера или его фармацевтически приемлемой соли, или гидрата согласно любому из [1]-[11] выше, или фармацевтической композиции согласно любому из [12][16] выше.A method for treating muscular dystrophy, which comprises administering to a patient with muscular dystrophy an effective amount of an antisense oligomer or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to any of [1]-[11] above, or a pharmaceutical composition according to any of [12][16] above.
Способ для лечения согласно [19] выше, где пациент является человеком.A method for treatment according to [19] above, where the patient is a human.
Антисмысловой олигомер, или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат согласно любому из [1]-[11] выше, или фармацевтическая композиция согласно любому из [12]-[16] выше для применения для лечения миодистрофии.An antisense oligomer, or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof according to any one of [1]-[11] above, or a pharmaceutical composition according to any one of [12]-[16] above for use in the treatment of muscular dystrophy.
Антисмысловой олигомер или его фармацевтически приемлемая соль, или гидрат, или фармацевтическая композиция согласно [21] выше, где при лечении пациент с миодистрофией является человеком.An antisense oligomer or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof, or a pharmaceutical composition according to [21] above, wherein the patient with muscular dystrophy is a human being treated.
Эффекты по изобретениюEffects of the invention
Изобретение может обеспечить антисмысловой олигомер, который с высокой эффективностью индуцирует пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека. Настоящее изобретение может обеспечить анThe invention may provide an antisense oligomer that induces skipping of exon 50 in the human dystrophin gene with high efficiency. The present invention can provide an
- 3 045808 тисмысловой олигомер, который обладает превосходной растворимостью, сохраняя при этом активность, чтобы индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека с высокой эффективностью.- 3 045808 tissene oligomer that has excellent solubility while maintaining activity to induce exon 50 skipping in the human dystrophin gene with high efficiency.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На фиг. 1 представлена эффективность пропуска экзона 50 в гене дистрофина человека посредством антисмысловых олигомеров ФМО № 1 и 2 в клетках рабдомиосаркомы человека (клетки RD);In fig. 1 shows the efficiency of exon 50 skipping in the human dystrophin gene by antisense oligomers FMO No. 1 and 2 in human rhabdomyosarcoma cells (RD cells);
на фиг. 2 представлена эффективность пропуска экзона 50 в гене дистрофина человека посредством антисмысловых олигомеров ФМО № 1, 3 и 4 в клетках RD;in fig. Figure 2 shows the efficiency of exon 50 skipping in the human dystrophin gene by antisense oligomers FMO No. 1, 3 and 4 in RD cells;
на фиг. 3 представлена эффективность пропуска экзона 50 в гене дистрофина человека посредством антисмысловых олигомеров ФМО № 1, 5, 6 и 7 в клетках RD.in fig. Figure 3 shows the efficiency of exon 50 skipping in the human dystrophin gene by antisense oligomers FMO no. 1, 5, 6 and 7 in RD cells.
Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments
Далее в настоящем документе настоящее изобретение описано подробно. Варианты осуществления, описанные ниже, предназначены для использования в качестве примера только для описания изобретения, но не предназначены для ограничения настоящего изобретения только следующими вариантами осуществления. Настоящее изобретение может быть реализовано разными способами без отступления от сути изобретения.Hereinafter, the present invention is described in detail. The embodiments described below are intended to be used by way of example only to describe the invention, but are not intended to limit the present invention to only the following embodiments. The present invention can be implemented in various ways without departing from the spirit of the invention.
1. Антисмысловой олигомер.1. Antisense oligomer.
Настоящее изобретение относится к антисмысловому олигомеру (далее в настоящем документе обозначаемому как антисмысловой олигомер по настоящему изобретению), который с высокой эффективностью вызывает пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека.The present invention provides an antisense oligomer (hereinafter referred to as the antisense oligomer of the present invention) that is highly effective in causing skipping of exon 50 in the human dystrophin gene.
Экзон 50 в гене дистрофина человека.Exon 50 in the human dystrophin gene.
В настоящем изобретении термин ген включает геномный ген, а также включает кДНК, предшественник мРНК и мРНК. Предпочтительно, ген представляет собой предшественник мРНК, т.е. премРНК.In the present invention, the term gene includes a genomic gene and also includes cDNA, precursor mRNA and mRNA. Preferably, the gene is an mRNA precursor, i.e. pre-mRNA.
В геноме человека ген дистрофина человека расположен в локусе Хр21.2. Ген дистрофина человека имеет размер 2,2 миллиона пар оснований и является самым большим геном среди известных человеческих генов. Однако кодирующая область гена дистрофина человека насчитывает всего 14 т.п.н., распределенных в виде 79 экзонов по всему гену дистрофина человека (Roberts R.G., et al., Genomics, 16: 536538 (1993); и Koenig, M., et al., Cell 53, 219-228, 1988). Пре-мРНК, которая является транскриптом гена дистрофина человека, подвергается сплайсингу с образованием зрелой мРНК из 14 т.п.н. Известна последовательность оснований человеческого гена дистрофина дикого типа (номер доступа GeneBank NM_004006).In the human genome, the human dystrophin gene is located at the Xp21.2 locus. The human dystrophin gene is 2.2 million base pairs in size and is the largest known human gene. However, the coding region of the human dystrophin gene is only 14 kb, distributed in 79 exons throughout the human dystrophin gene (Roberts R. G., et al., Genomics, 16: 536538 (1993); and Koenig, M., et al. al., Cell 53, 219-228, 1988). The pre-mRNA, which is a transcript of the human dystrophin gene, is spliced to form a mature 14-kb mRNA. The base sequence of the wild-type human dystrophin gene is known (GeneBank accession number NM_004006).
Последовательность оснований, включающая экзон 50 и последовательность вблизи 5'-конца интрона 50 в человеческом гене дистрофина дикого типа, представлена в SEQ ID NO: 1.The base sequence including exon 50 and the sequence near the 5' end of intron 50 in the wild-type human dystrophin gene is shown in SEQ ID NO: 1.
Антисмысловой олигомер.Antisense oligomer.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению предназначен для того, чтобы вызывать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека, тем самым модифицируя белок типа МДД, кодируемый геном дистрофина, в белок дистрофина типа МДБ. Таким образом, экзон 50 в гене дистрофина, который является мишенью для пропуска экзона посредством антисмыслового олигомера, включает и дикий тип, и мутантные типы.The antisense oligomer of the present invention is designed to cause skipping of exon 50 in the human dystrophin gene, thereby modifying the DMD type protein encoded by the dystrophin gene into a DMD type dystrophin protein. Thus, exon 50 in the dystrophin gene, which is the target of exon skipping by an antisense oligomer, includes both wild type and mutant types.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению представляет собой специфический антисмысловой олигомер, который выбран из группы, состоящей из (a)-(d) ниже:The antisense oligomer of the present invention is a specific antisense oligomer that is selected from the group consisting of (a) to (d) below:
(a) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований любой из SEQ ID NO: 3-5;(a) an antisense oligomer containing the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5;
(b) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований, которая имеет делецию, замену, вставку и/или добавление от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или от 1 оснований в последовательность оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека;(b) an antisense oligomer comprising a base sequence that has a deletion, substitution, insertion, and/or addition of 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1 base in the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has activity to induce skipping of exon 50 in the human dystrophin gene;
(c) антисмысловой олигомер, содержащий последовательность оснований, которая имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности с последовательностью оснований любой из SEQ ID NO: 3-5 и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека; и (d) антисмысловой олигомер, который гибридизуется при жестких условиях с олигонуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5 и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека.(c) an antisense oligomer containing a base sequence that is at least 80%, at least 84%, at least 85%, at least 89%, at least 90%, at least 94%, or at least at least 95% sequence identity with the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5 and has the activity to induce skipping of exon 50 in the human dystrophin gene; and (d) an antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions to an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5 and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene.
В другом варианте осуществления антисмысловой олигомер по настоящему изобретению представляет собой специфический антисмысловой олигомер, который выбран из группы, состоящей из (e)-(h) ниже.In another embodiment, the antisense oligomer of the present invention is a specific antisense oligomer that is selected from the group consisting of (e)-(h) below.
(e) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5;(e) an antisense oligomer that consists of the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5;
(f) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований, имеющей делецию и/или замену от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или одного основания (оснований) в последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает способностью индуцировать пропуск экзона(f) an antisense oligomer that consists of a base sequence having a deletion and/or substitution of 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or one base(s) in the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has the ability to induce exon skipping
- 4 045808 в гене дистрофина человека;- 4 045808 in the human dystrophin gene;
(g) антисмысловой олигомер, который состоит из последовательности оснований, имеющих по меньшей мере 80%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности с идентичностью последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5 и обладает способностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека; и (h) антисмысловой олигомер, который гибридизуется при очень жестких условиях с олигонуклеотидом, состоящим из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, и обладает активностью индуцировать пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека(g) an antisense oligomer that consists of a sequence of bases having at least 80%, at least 84%, at least 85%, at least 89%, at least 90%, at least 94%, or has at least 95% sequence identity with the base sequence identity of any of SEQ ID NO: 3-5 and has the ability to induce exon 50 skipping in the human dystrophin gene; and (h) an antisense oligomer that hybridizes under very stringent conditions to an oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, and has the activity of inducing exon 50 skipping in the human dystrophin gene
Антисмысловые олигомеры (b)-(d) и антисмысловые олигомеры (f)-(h) являются мутантами антисмыслового олигомера (а) и антисмыслового олигомера (е), соответственно, и, в частности, предназначены для соответствия мутациям (например, полиморфизму) гена дистрофина пациентов.Antisense oligomers (b)-(d) and antisense oligomers (f)-(h) are mutants of antisense oligomer (a) and antisense oligomer (e), respectively, and are specifically designed to match mutations (eg, polymorphisms) of a gene dystrophin in patients.
Как применяют в настоящем документе, термин антисмысловой олигомер, который гибридизуется при жестких условиях относится, например, к антисмысловому олигомеру, полученному путем гибридизации колоний, гибридизации бляшек, саузерн-гибридизации или т.п., с использованием в качестве зонда целого олигонуклеотида или его части, состоящего из последовательности оснований, комплементарной последовательности оснований, например любой из SEQ ID NO: 3-5. Способ гибридизации, который можно использовать, включает в себя способы, описанные, например, в Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 и т.д.As used herein, the term antisense oligomer that hybridizes under stringent conditions refers, for example, to an antisense oligomer obtained by colony hybridization, plaque hybridization, Southern hybridization, or the like, using all or part of the oligonucleotide as a probe consisting of a base sequence complementary to a base sequence, for example any of SEQ ID NO: 3-5. The hybridization method that can be used includes those described, for example, in Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc.
Как применяют в настоящем документе, термин жесткие условия может представлять собой любые из условий с низкой жесткостью, условий с умеренной жесткостью или условий с высокой жесткостью. Термин условия с низкой жесткостью означает, например, 5х SSC, 5х раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамид при 32°С. Термин условия с умеренной жесткостью означает, например, 5х SSC, 5х раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамид при 42°С, или 5х SSC, 1% SDS, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 50% формамид при 42°С. Термин условия с высокой жесткостью означает, например 1) 5х SSC, 5х раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамид при 50°С, (2) 0,2х SSC, 0,1% SDS при 60°С, (3) 0,2х SSC, 0,1% SDS при 62°С, (4) 0,2х SSC, 0,1% SDS при 65°С, или (5) 0,1х SSC, 0,1% SDS при 65°С, но не ограничивается указанными. Ожидается, что в этих условиях антисмысловые олигомеры с более высокой идентичностью последовательности будут эффективно получать при более высокой температуре. На жесткость гибридизации влияет множество факторов, включая температуру, концентрацию зонда, длину зонда, ионную силу, время, концентрацию солей и другие, и специалисты в данной области могут подходящим образом выбрать эти факторы для достижения аналогичной жесткости. В настоящем документе термин идентичность последовательности относится к идентичности во всем диапазоне оснований последовательности, подлежащей сравнению между парой двух определенных нуклеиновых кислот, и обозначается соотношением (%) совпадающих оснований при оптимальном выравнивании последовательности оснований, которое производят с использованием математического алгоритма, известного в области техники по настоящему изобретению. Например, антисмысловой олигомер, состоящий из последовательности оснований, имеющих по меньшей мере 80% идентичности последовательности по отношению к антисмысловому олигомеру, состоящему из последовательности из 20 оснований, означает антисмысловой олигомер, имеющий 16 или более оснований, идентичных антисмысловому олигомеру из 20 оснований.As used herein, the term stringent conditions can be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, or high stringency conditions. The term low stringency conditions means, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 32°C. The term moderate stringency conditions means, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 42°C, or 5x SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamide at 42°C. The term high stringency conditions means, for example, 1) 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 50°C, (2) 0.2x SSC, 0.1% SDS at 60°C, ( 3) 0.2x SSC, 0.1% SDS at 62°C, (4) 0.2x SSC, 0.1% SDS at 65°C, or (5) 0.1x SSC, 0.1% SDS at 65°C, but not limited to those indicated. Under these conditions, it is expected that antisense oligomers with higher sequence identity will be efficiently produced at higher temperatures. The stringency of hybridization is influenced by many factors, including temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, salt concentration, and others, and those skilled in the art can appropriately select these factors to achieve similar stringency. As used herein, the term sequence identity refers to the identity over the entire base range of a sequence to be compared between a pair of two specific nucleic acids, and is denoted by the ratio (%) of matching bases in an optimal base sequence alignment, which is produced using a mathematical algorithm known in the art the present invention. For example, an antisense oligomer consisting of a sequence of bases having at least 80% sequence identity to an antisense oligomer consisting of a 20-base sequence means an antisense oligomer having 16 or more bases identical to a 20-base antisense oligomer.
В этих условиях ожидается, что антисмысловые с более высокой идентичностью последовательности будут эффективно получать при более высоких температурах.Under these conditions, antisense with higher sequence identity is expected to be produced efficiently at higher temperatures.
Когда для гибридизации используют коммерчески доступные наборы, можно, например, использовать систему прямой маркировки и обнаружения Alkphos (GE Healthcare). В этом случае, согласно приложенному к набору протоколу, после инкубации с меченым зондом в течение ночи мембрану отмывают первичным промывочным буфером, содержащим 0,1% (мас./об.) SDS при 55°С, что позволяет выявить гибридизированный антисмысловой олигомер. Альтернативно, когда зонд метят дигоксигенином (DIG) с использованием доступных реагентов (например, PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics) и т.д.) при получении зонда на основе всей или части комплементарной последовательности к последовательности оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, гибридизацию можно выявить с помощью набора для обнаружения нуклеиновых кислот DIG (Roche Diagnostics).When commercially available kits are used for hybridization, for example, the Alkphos direct labeling and detection system (GE Healthcare) can be used. In this case, according to the protocol included with the kit, after incubation with the labeled probe overnight, the membrane is washed with a primary wash buffer containing 0.1% (w/v) SDS at 55°C to reveal the hybridized antisense oligomer. Alternatively, the probe is labeled with digoxigenin (DIG) using available reagents (e.g., PCR Labeling Mix (Roche Diagnostics), etc.) to obtain a probe based on all or part of the complementary sequence to the base sequence of any of SEQ ID NO: 3- 5, hybridization can be detected using the DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche Diagnostics).
В дополнении к описанному выше антисмысловому олигомеру другие антисмысловые олигомеры, которые могут гибридизоваться, включают антисмысловые олигомеры, имеющие 90% или выше, 91% или выше, 92% или выше, 93% или выше, 94% или выше, 95% или выше, 96%. или выше, 97% или выше, 98% или выше, 99% или выше, 99,1% или выше, 99,2% или выше, 99,3% или выше, 99,4% или выше, 99,5% или выше, 99,6% или выше, 99,7% или выше, 99,8% или выше и 99,9% или выше идентичности последовательности с последовательностью оснований любой из SEQ ID NO: 3-5, как рассчитано программой для поиска гомологии, такой как FASTA и BLAST с использованием параметров по умолчанию.In addition to the antisense oligomer described above, other antisense oligomers that can hybridize include antisense oligomers having 90% or higher, 91% or higher, 92% or higher, 93% or higher, 94% or higher, 95% or higher, 96%. or higher, 97% or higher, 98% or higher, 99% or higher, 99.1% or higher, 99.2% or higher, 99.3% or higher, 99.4% or higher, 99.5% or greater, 99.6% or greater, 99.7% or greater, 99.8% or greater, and 99.9% or greater sequence identity to the base sequence of any of SEQ ID NO: 3-5, as calculated by the search program homology tests such as FASTA and BLAST using default parameters.
- 5 045808- 5 045808
Идентичность последовательности можно определить с помощью FASTA (Science 227 (4693): 14351441, (1985)) или алгоритма BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Карлина и Альтшула (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Были разработаны программы blastn, blastx, tblastn и tblastx, основанные на алгоритме BLAST (Altschul S.F., et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Если последовательность оснований анализируют с помощью blastn, параметрами являются, например, оценка=100 и длина слова=12. Если используют программы BLAST и Gapped BLAST, используют параметры по умолчанию для каждой программы.Sequence identity can be determined using FASTA (Science 227 (4693): 14351441, (1985)) or the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) algorithm by Carlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873, 1993). The blastn, blastx, tblastn and tblastx programs were developed, based on the BLAST algorithm (Altschul S.F., et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). If the base sequence is analyzed using blastn, the parameters are, for example, score=100 and word length=12. If using the BLAST and Gapped BLAST programs, use the default parameters for each program.
Термин индуцировать (активировать) пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека предназначен для обозначения того, что за счет связывания антисмыслового олигомера по настоящему изобретению с участком, соответствующим экзону 50 и/или соседнему с ним интрону транскрипта (например, пре-мРНК) в гене дистрофина человека происходит исключение экзона 50 и, например, последовательность оснований, соответствующая 5'-концу экзона 52 связана с последовательностью оснований, соответствующей 3'-концу экзона 49 у пациентов с МДД с делецией экзона 51, когда транскрипт подвергается сплайсингу, в результате чего образуется зрелая мРНК, свободная от сдвига рамки кодона.The term induce (activate) skipping of exon 50 in the human dystrophin gene is intended to mean that by binding the antisense oligomer of the present invention to the region corresponding to exon 50 and/or an adjacent intron of a transcript (e.g., pre-mRNA) in the dystrophin gene In humans, exon 50 is deleted and, for example, the base sequence corresponding to the 5' end of exon 52 is associated with the base sequence corresponding to the 3' end of exon 49 in DMD patients with exon 51 deletion, when the transcript is spliced, resulting in the formation of a mature mRNA free of codon frameshift.
Таким образом, пациентов с МДД, имеющих мутацию, восприимчивую к пропуску экзона 50 в гене дистрофина, можно лечить путем пропуска экзона 50. Примеры таких пациентов с МДД включают пациентов с МДД с геном дистрофина, который имеет, по меньшей мере, мутацию сдвига рамки считывания, вызванную делецией экзона вблизи экзона 50, и в котором аминокислотная рамка считывания корректируется путем пропуска экзона 50, и более конкретно, включают пациентов с МДД, имеющих мутацию сдвига рамки считывания, вызванную делецией экзонов 51, 51-53, 51-55, 51-57 и т.д. в гене дистрофина.Thus, patients with DMD who have an exon 50 skipping-susceptible mutation in the dystrophin gene can be treated by skipping exon 50. Examples of such DMD patients include patients with DMD with a dystrophin gene that has at least a frameshift mutation caused by a deletion of an exon near exon 50, and in which the amino acid reading frame is corrected by skipping exon 50, and more specifically include DMD patients having a frameshift mutation caused by deletion of exons 51, 51-53, 51-55, 51- 57, etc. in the dystrophin gene.
В настоящем документе вышеописанный термин связывание предназначен для обозначения того, что, когда антисмысловой олигомер по настоящему изобретению смешивают с транскриптом гена дистрофина человека, они оба гибридизируются друг с другом в физиологических условиях с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Термин в физиологических условиях относится к условиям, имитирующим среду in vivo в отношении рН, состава композиции и температуры. Условия: от 25 до 40°С, предпочтительно 37°С, рН от 5 до 8, предпочтительно рН 7,4 и концентрация хлорида натрия 150 мМ.As used herein, the term binding as described above is intended to mean that when an antisense oligomer of the present invention is mixed with a human dystrophin gene transcript, they both hybridize to each other under physiological conditions to form a double-stranded nucleic acid. The term physiological conditions refers to conditions that mimic the in vivo environment with respect to pH, formulation, and temperature. Conditions: 25 to 40°C, preferably 37°C, pH 5 to 8, preferably pH 7.4 and sodium chloride concentration 150 mM.
Произошел ли пропуск экзона 50 в гене дистрофина человека или нет, можно подтверждать путем введения антисмыслового олигомера по настоящему изобретению в экспрессирующую дистрофин клетку (например, клетки рабдомиосаркомы человека), амплификации мРНК области, окружающей экзон 50 в гене дистрофина человека, из общей РНК клетки, экспрессирующей дистрофин, с помощью ОТ-ПЦР и проведения анализа вложенной ПЦР или последовательности на амплификацию продукта ПЦР. Эффективность пропуска ES (%) можно определить следующим образом. мРНК гена дистрофина человека собирают из исследуемых клеток, и в мРНК измеряют уровень полинуклеотида в полосе, показывающей, что экзон 50 пропущен (уровень полинуклеотида А), и уровень полинуклеотида в полосе, показывающей, что экзон 50 не пропущен (уровень полинуклеотида В). Используя эти значения измерений А и В, эффективность рассчитывается по следующему уравнению (1). Для расчета эффективности пропуска можно обратиться к международной публикации WO 2012/029986Whether skipping of exon 50 in the human dystrophin gene has occurred or not can be confirmed by introducing the antisense oligomer of the present invention into a dystrophin-expressing cell (for example, human rhabdomyosarcoma cells), amplifying the mRNA of the region surrounding exon 50 in the human dystrophin gene from the total RNA of the cell, expressing dystrophin using RT-PCR and performing nested PCR or sequence analysis to amplify the PCR product. The skip efficiency ES (%) can be determined as follows. Human dystrophin gene mRNA is collected from the cells of interest, and the mRNA is measured for the level of polynucleotide in the band indicating that exon 50 is skipped (polynucleotide A level) and the level of polynucleotide in the band indicating that exon 50 is not skipped (polynucleotide B level). Using these A and B measurement values, the efficiency is calculated using the following equation (1). To calculate the pass efficiency, you can refer to the international publication WO 2012/029986
ES=100xA/(A+B) (1)ES=100xA/(A+B) (1)
Предпочтительно, антисмысловой олигомер по настоящему изобретению вызывает пропуск экзона 50 с эффективностью 10% или выше, 20% или выше, 30% или выше, 40% или выше, 50% или выше, 60% или выше, 70% или выше, 80% и выше и 90% и выше.Preferably, the antisense oligomer of the present invention causes exon 50 skipping with an efficiency of 10% or greater, 20% or greater, 30% or greater, 40% or greater, 50% or greater, 60% or greater, 70% or greater, 80% and above and 90% and above.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению относится, например, к олигонуклеотиду, морфолиновому олигомеру или олигомеру пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК) с длиной 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 оснований. Длина антисмыслового олигомера составляет предпочтительно от 16 до 25, от 16 до 23, 19 или 20 оснований и предпочтительными являются морфолиновые олигомеры.The antisense oligomer of the present invention refers to, for example, an oligonucleotide, morpholine oligomer or peptide nucleic acid (PNA) oligomer with a length of 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 or 35 bases. The length of the antisense oligomer is preferably 16 to 25, 16 to 23, 19 or 20 bases, and morpholine oligomers are preferred.
Олигонуклеотид, описанный выше (далее в настоящем документе, обозначаемый как олигонуклеотид по настоящему изобретению) представляет собой антисмысловый олигомер по настоящему изобретению, состоящий из нуклеотидов в качестве составных единиц. Такие нуклеотиды могут быть любыми из рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов и модифицированных нуклеотидов.The oligonucleotide described above (hereinafter referred to as the oligonucleotide of the present invention) is an antisense oligomer of the present invention consisting of nucleotides as constituent units. Such nucleotides may be any of ribonucleotides, deoxyribonucleotides and modified nucleotides.
Модифицированный нуклеотид относится к нуклеотиду, имеющему полностью или частично модифицированные нуклеиновые основания, молекулы сахара и/или группы фосфатной связи, которые составляют рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид.Modified nucleotide refers to a nucleotide having wholly or partially modified nucleotide bases, sugar molecules and/or phosphate bond groups that constitute a ribonucleotide or deoxyribonucleotide.
В настоящем изобретении нуклеиновое основание включает, например, аденин, гуанин, гипоксантин, цитозин, тимин, урацил и их модифицированные основания. Примеры таких модифицированных оснований включают, но не ограничиваются ими, псевдоурацил, 3-метилурацил, дигидроурацил, 5-алкилцитозины (например, 5-метилцитозин), 5-алкилурацилы (например, 5-этилурацил), 5-галогенурацилы (5-бромурацил), 6-азапиримидин, 6-пиримидины (6-метилурацил), 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5'-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, 1-метиладенин, 1-метилгипоксантин, 2,2-диметилгуанин, 3-метилцитозин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, 5-меIn the present invention, the nucleic acid base includes, for example, adenine, guanine, hypoxanthine, cytosine, thymine, uracil and modified bases thereof. Examples of such modified bases include, but are not limited to, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosines (e.g., 5-methylcytosine), 5-alkyluracils (e.g., 5-ethyluracil), 5-halogenuracils (5-bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-pyrimidines (6-methyluracil), 2-thiouracil, 4-thiouracil, 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethylaminomethyluracil, 1-methyladenine, 1 -methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-me
- 6 045808 тиламинометилурацил, 5-метилкарбонилметилурацил, 5-метилоксиурацил, 5-метил-2-тиоурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту, 2-тиоцитозин, пурин, 2,6-диаминопурин, 2-аминопурин, изогуанин, индол, имидазол, ксантин и т.д.- 6 045808 thylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-hydroxyacetic acid, 2-thiocytosine, purine, 2,6-diaminopurine, 2- aminopurine, isoguanine, indole, imidazole, xanthine, etc.
Модификация молекул сахара может включать, например, модификации в 2'-положении рибозы и модификации других положений сахара. Модификация в 2'-положении рибозы включает модификацию, замещающую 2'-ОН рибозы на OR, R, R’OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br или I, где R представляет собой алкил или арил, a R' представляет собой алкилен.Modification of sugar molecules may include, for example, modifications at the 2' position of ribose and modifications at other sugar positions. Modification at the 2'-position of ribose includes a modification that replaces the 2'-OH of ribose with OR, R, R'OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br or I, where R represents alkyl or aryl and R' represents alkylene.
Модификация других положений сахара включает, например, замену О в 4’-положении рибозы или дезоксирибозы на S, соединение между 2'- и 4'-положениями сахара, например, ЗНК (закрытой нуклеиновой кислотой) или ENA (нуклеиновые кислоты с 2'-О,4'-С-этиленовым мостиком), но не ограничивается ими.Modification of other sugar positions includes, for example, replacing the O at the 4' position of ribose or deoxyribose with an S, joining between the 2' and 4' positions of the sugar, such as an LNA (closed nucleic acid) or ENA (nucleic acids with 2' O,4'-C-ethylene bridge), but is not limited to them.
Модификация группы фосфатной связи включает, например, модификацию замены фосфодиэфирной связи тиофосфатной связью, фосфородитиоатной связью, алкилфосфонатной связью, фосфорамидатной связью или боранофосфатной связью. (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (см., например, японские отечественные повторные публикации заявок РСТ № 2006/129594 и 2006/038608).Modification of a phosphate bond group includes, for example, modification of replacing a phosphodiester bond with a thiophosphate bond, a phosphorodithioate bond, an alkylphosphonate bond, a phosphoramidate bond, or a boranophosphate bond. (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (see, for example, Japanese domestic republication of PCT applications No. 2006/129594 and 2006/038608).
В настоящем изобретении, алкил включает предпочтительно неразветвленный или разветвленный алкил имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Конкретные примеры включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, сек-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, пеопентил, трет-пентил, н-гексил и изогексил. Алкил необязательно может быть замещенным. Примеры таких заместителей представляют собой галоген, алкокси, циано и нитро. Алкил может быть замещен 1-3 заместителями.In the present invention, alkyl preferably includes straight or branched alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, isopentyl, peopentyl, t-pentyl, n-hexyl and isohexyl. Alkyl may optionally be substituted. Examples of such substituents are halogen, alkoxy, cyano and nitro. Alkyl may be substituted with 1-3 substituents.
В настоящем изобретении, циклоалкил включает предпочтительно циклоалкил, имеющий от 5 до 12 атомов углерода. Конкретные примеры включают циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклодецил и циклододецил.In the present invention, cycloalkyl preferably includes cycloalkyl having from 5 to 12 carbon atoms. Specific examples include cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclodecyl and cyclododecyl.
В настоящем изобретении, галоген включает фтор, хлор, бром и йод.In the present invention, halogen includes fluorine, chlorine, bromine and iodine.
Алкокси включает неразветвленный или разветвленный алкокси, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, такой как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, сек-бутокси, третбутокси, н-пентилокси, изопентилокси, н-гексилокси, изогексилокси и т.д. Наряду с другими, предпочтительным является алкокси, имеющий от 1 до 3 атомов углерода.Alkoxy includes straight or branched alkoxy having from 1 to 6 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, t-butoxy, n-pentyloxy, isopentyloxy, n-hexyloxy, isohexyloxy etc. Among others, alkoxy having 1 to 3 carbon atoms is preferred.
В настоящем изобретении, арил включает предпочтительно арил, имеющий от 6 до 10 атомов углерода. Конкретные примеры включают фенил, α-нафтил и β-нафтил. Наряду с другими предпочтительным является фенил. Арил необязательно может быть замещенным. Примеры таких заместителей представляют собой алкил, галоген, алкокси, циано и нитро. Арил может быть замещен 1-3 заместителями.In the present invention, aryl preferably includes aryl having 6 to 10 carbon atoms. Specific examples include phenyl, α-naphthyl and β-naphthyl. Among others, phenyl is preferred. Aryl may optionally be substituted. Examples of such substituents are alkyl, halogen, alkoxy, cyano and nitro. Aryl may be substituted with 1-3 substituents.
В настоящем изобретении, алкилен включает предпочтительно неразветвленный или разветвленный алкилен, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Конкретные примеры включают метилен, этилен, триметилен, тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен, 2-этил триметилен и 1-метилтетраметилен.In the present invention, alkylene preferably includes straight or branched alkylene having 1 to 6 carbon atoms. Specific examples include methylene, ethylene, trimethylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene, 2-ethyl trimethylene and 1-methyltetramethylene.
В настоящем изобретении, ацил включает неразветвленный или разветвленный алканоил или ароил. Примеры алканоила включают формил, ацетил, 2-метилацетил, 2,2-диметилацетил, пропиноил, бутиррил, изобутирил, пентаноил, 2,2-диметилпропионил, гексаноил и т.д. Примеры ароила включают бензоил, толуоил и нафтоил. Ароил необязательно может быть замещен по замещаемым положениям и может быть замещен алкилом/алкилами.In the present invention, acyl includes straight or branched alkanoyl or aroyl. Examples of alkanoyl include formyl, acetyl, 2-methylacetyl, 2,2-dimethylacetyl, propinoyl, butyrryl, isobutyryl, pentanoyl, 2,2-dimethylpropionyl, hexanoyl, etc. Examples of aroyl include benzoyl, toluoyl and naphthoyl. Aroyl may optionally be substituted at substitutable positions and may be substituted by alkyl(s).
Олигонуклеотид по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, содержащий составную единицу, представленную общей формулой ниже, где группа -ОН в положении 2' в рибозе замещена метокси и группа фосфатной связи представляет собой тиофосфатную связьThe oligonucleotide of the present invention is preferably an antisense oligomer of the present invention containing a compound unit represented by the general formula below, wherein the -OH group at the 2' position in the ribose is replaced by methoxy and the phosphate linkage group is a thiophosphate linkage
Формула 2Formula 2
ОснованиеBase
О' ЪСНз где основание представляет собой нуклеиновое основание.O' bCH3 where the base is a nucleic acid base.
Олигонуклеотид по настоящему изобретению можно легко синтезировать с использованием различных автоматических синтезаторов (например, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Альтернативно, синтез также можно поручить сторонней организации (например, Promega Inc., Takara Co., или Japan Bio Service Co.) и т.д.The oligonucleotide of the present invention can be easily synthesized using various automatic synthesizers (eg, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternatively, synthesis can also be outsourced to a third party (eg, Promega Inc., Takara Co., or Japan Bio Service Co.), etc.
Морфолиновый олигомер по настоящему изобретению представляет собой антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, содержащий составную единицу, представленную общей формулой ниже:The morpholine oligomer of the present invention is an antisense oligomer of the present invention containing a constituent unit represented by the general formula below:
- 7 045808- 7 045808
где основание имеет такое же значение, как определено выше, и W представляет собой группу, показанную одной из следующих групп:where the base has the same meaning as defined above and W is a group shown by one of the following groups:
Формула 4 где X представляет собой -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 или F;Formula 4 where X is -CH2R 1 , -O-CH2R 1 , -S-CH2R 1 , -NR 2 R 3 or F;
R1 представляет собой Н или алкил;R 1 represents H or alkyl;
R2 и R3 могут быть одинаковыми или разными, и каждый представляет собой Н, алкил, циклоалкил или арил;R 2 and R 3 may be the same or different and each is H, alkyl, cycloalkyl or aryl;
Y1 представляет собой О, S, СН2 или NR1;Y1 is O, S, CH 2 or NR 1 ;
Y2 представляет собой О, S или NR1;Y 2 represents O, S or NR1;
Z представляет собой О или S.Z represents O or S.
Примеры морфолиновых мономерных соединений, которые используют в синтезе морфолинового олигомера по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными, следующие: морфолиновое мономерное соединение (А), морфолиновое мономерное соединение (С), морфолиновое мономерное соединение (Т) и морфолиновое мономерное соединение (G).Examples of morpholine monomer compounds that are used in the synthesis of the morpholine oligomer of the present invention include, but are not limited to, the following: morpholine monomer compound (A), morpholine monomer compound (C), morpholine monomer compound (T) and morpholine monomer compound (G ).
Морфолнноюе соединение АMorphol compound A
МорфолиновоеMorpholine
И,СI, C
Морфолнноюе соединение ТMorphol compound T
о. <' ' *.....O. <' ' *.....
**
Жффолншшое соединение GFull connection G
Таблица 1Table 1
И ·AND ·
-''''λ-''''λ
Морфолиновый олигомер предпочтительно представляет собой олигомер, содержащий составную единицу, представленную общей формулой ниже (фосфордиамидатный морфолиновый олигомер (далее в настоящем документе, обозначаемый как ФМО)):The morpholine oligomer is preferably an oligomer containing a constituent unit represented by the general formula below (phosphorodiamidate morpholine oligomer (hereinafter referred to as PMO)):
Формула 5Formula 5
где основание, R2 и R3 имеют такое же значение, как определено выше.where base, R 2 and R 3 have the same meaning as defined above.
Морфолиновый олигомер по настоящему изобретению включает олигомер, в котором все или часть нуклеиновых оснований, молекулы морфолинового кольца, группы фосфатной связи, 3'-конец и/или 5'конец, которые составляют морфолиновый олигомер, являются модифицированными.The morpholine oligomer of the present invention includes an oligomer in which all or part of the nucleobases, morpholine ring molecules, phosphate bond groups, 3' end and/or 5' end that constitute the morpholine oligomer are modified.
Модификация группы фосфатной связи включает, например, модификацию замещения фосфородиамидатной связью, тиофосфатной связью, фосфородитиоатной связью, алкилфосфонатной связью, фосфорамидатной связью и боранофосфатной связью (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (см., например, японские отечественные повторные публикации заявок РСТ № 2006/129594 и 2006/038608).Modification of a phosphate bond group includes, for example, substitution modification with a phosphorodiamidate bond, thiophosphate bond, phosphorodithioate bond, alkylphosphonate bond, phosphoramidate bond and boranophosphate bond (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160) (see, for example , Japanese domestic republication of PCT applications No. 2006/129594 and 2006/038608).
- 8 045808- 8 045808
Морфолиновый олигомер можно получать в соответствии, например, с WO 1991/009033 или WO 2009/064471. В частности, ФМО можно получать способом, описанным в WO 2009/064471, или получать способом, показанным ниже.The morpholine oligomer can be prepared in accordance with, for example, WO 1991/009033 or WO 2009/064471. In particular, FMO can be obtained by the method described in WO 2009/064471, or obtained by the method shown below.
Способ получения ФМО.Method for obtaining FMO.
Вариант осуществления ФМО включает, например, соединение, представленное общей формулой (I) ниже (далее в настоящем документе ФМО (I)):An embodiment of the FMO includes, for example, a compound represented by the general formula (I) below (hereinafter referred to as FMO (I)):
Формула 6Formula 6
снование (t) ft где основание, R2 и R3 имеют такое же значение, как определено выше; и, n представляет собой заданное целое число от 1 до 99, предпочтительно заданное целое число от 15 до 34, от 15 до 24 или от 15 до 22, более предпочтительно 18 или 19.base (t) ft where base, R 2 and R 3 have the same meaning as defined above; and, n is a predetermined integer from 1 to 99, preferably a predetermined integer from 15 to 34, 15 to 24, or 15 to 22, more preferably 18 or 19.
ФМО (I) можно получать в соответствии с известным способом, например можно получать, выполняя способы на следующих стадиях.FMO (I) can be obtained in accordance with a known method, for example, can be obtained by performing the methods in the following steps.
Соединения и реагенты, применяемые на стадиях ниже, конкретно не ограничены при условии, что они являются общепринятыми для получения ФМО.The compounds and reagents used in the steps below are not particularly limited as long as they are conventional for the preparation of FMO.
Кроме того, все следующие стадии могут быть выполнены с помощью способа жидкой фазы или твердофазного способа (вручную или с использованием коммерческих автоматизированных синтезаторов для твердой фазы). При производстве ФМО по твердофазному способу целесообразно использовать автоматизированные синтезаторы ввиду простоты работы и точности синтеза.In addition, all of the following steps can be performed using a liquid phase method or a solid phase method (manually or using commercial automated solid phase synthesizers). When producing FMO using the solid-phase method, it is advisable to use automated synthesizers due to the ease of operation and accuracy of synthesis.
(1) Стадия А.(1) Stage A.
Проводят реакцию соединения, представленного общей формулой (II) ниже (далее в настоящем документе, обозначаемого как соединение (II)) с кислотой для получения соединения, представленного общей формулой (III) ниже (далее в настоящем документе, обозначаемого как соединение (III)):The compound represented by the general formula (II) below (hereinafter referred to as compound (II)) is reacted with an acid to produce the compound represented by the general formula (III) below (hereinafter referred to as compound (III)) :
где n, R2 и R3 имеют такое же значение, как определено выше;where n, R 2 and R 3 have the same meaning as defined above;
каждый В независимо представляет собой нуклеиновое основание, которое необязательно может быть защищенным;each B independently represents a nucleic base, which may not necessarily be protected;
Т представляет собой тритил, монометокситритил или диметокситритил; и,T represents trityl, monomethoxytrityl or dimethoxytrityl; And,
L представляет собой водород, ацил или группу, представленную общей формулой (IV) ниже (далее в настоящем документе, обозначаемую как группа (IV)):L represents hydrogen, acyl or a group represented by the general formula (IV) below (hereinafter referred to as group (IV)):
Формула 8Formula 8
Твердый носитель------ Линкер ____Solid carrier------ Linker ____
Нуклеиновое основание для BP включает такое же нуклеиновое основание как и в основании, при условии, что аминогруппа или гидроксигруппа в нуклеиновом основании, показанном в BP может быть защищенной.The nucleobase for BP includes the same nucleobase as in the base, provided that the amino group or hydroxy group in the nucleic base shown in BP may be protected.
Такая защитная группа для аминогруппы конкретно не ограничена при условии, что ее используют в качестве защитной группы для нуклеиновых кислот. Конкретные примеры включают бензоил, 4метоксибензоил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, фенилацетил, феноксиацетил, 4-третбутилфеноксиацетил, 4-изопропилфеноксиацетил и диметиламинометилен. Конкретные примеры защитной группы для гидроксигруппы включают 2-цианоэтил, 4-нитрофенэтил, фенилсульфонилэтил, метилсульфонилэтил, триметилсилилэтил, фенил, который может быть замещен от 1 до 5 электроноакцепторных групп в необязательных замещаемых положениях, дифенилкарбамоил, диметилкарбамоил, диэтилкарбамоил, метилфенилкарбамоил, 1-пиролидинилкарбамоил, морфолинокарбамоил, 4-(трет-бутилкарбокси)бензил, 4-[(диметиламино)карбокси]бензил и 4-(фенилкарбокси)бензил (см., например, WOSuch a protecting group for an amino group is not particularly limited as long as it is used as a protecting group for nucleic acids. Specific examples include benzoyl, 4methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl, and dimethylaminomethylene. Specific examples of the protecting group for the hydroxy group include 2-cyanoethyl, 4-nitrophenethyl, phenylsulfonylethyl, methylsulfonylethyl, trimethylsilylethyl, phenyl, which may be substituted with 1 to 5 electron-withdrawing groups at optional substitutable positions, diphenylcarbamoyl, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, methylphenylcarbamoyl, 1 -pyrolidinylcarbamoyl, morpholinocarbamoyl, 4-(tert-butylcarboxy)benzyl, 4-[(dimethylamino)carboxy]benzyl and 4-(phenylcarboxy)benzyl (see e.g. WO
- 9 045808- 9 045808
2009/064471).2009/064471).
Твердый носитель конкретно не ограничен при условии, что он является носителем, пригодным для твердофазной реакции нуклеиновых кислот. Желательно, чтобы твердый носитель обладал следующими свойствами: например, (i) он умеренно растворим в реагентах, которые можно использовать для синтеза морфолиновых производных нуклеиновых кислот (например, дихлорметан, ацетонитрил, тетразол, N-метилимидазол, пиридин, уксусный ангидрид, лутидин, трифторуксусная кислота); (ii) химически устойчив к реагентам, которые можно использовать для синтеза морфолиновых производных нуклеиновых кислот; (iii) его можно химически модифицировать; (iv) его можно загрузить желаемыми морфолиновыми производными нуклеиновых кислот; (v) он имеет достаточную прочность, чтобы выдерживать высокое давление при обработке; и (vi) имеет определенный диапазон диаметров и распределение частиц. В частности, набухающий полистирол (например, аминометильная полистироловая смола с 1% сшитым дивинилбензолом (200-400 меш) (2,4-3,0 ммоль/г) (Tokyo Chemical Industry), аминометилированная полистирольная смола с HCl [дивинилбензол 1%, 100-200 меш] (Peptid Institute, Inc.)), ненабухающий полистирол (например, Primer Support (GE Healthcare)), полистирол с присоединенными цепями ПЭГ (например, смола NH2-ПЭГ (Watanabe Chemical Co.), смола TentaGel), стекло с контролируемым размером пор (CPG) (производится, например, CPG), оксалиловое стекло с контролируемым размером пор (см., например, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), аминополиэтиленгликолевое производное подложки TentaGel (например, Wright et al., см., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), и сополимер полистирол/дивинилбензол марки Poros.The solid support is not particularly limited as long as it is a support suitable for the solid phase reaction of nucleic acids. It is desirable that the solid support has the following properties: for example, (i) it is sparingly soluble in reagents that can be used for the synthesis of morpholine derivatives of nucleic acids (for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrazole, N-methylimidazole, pyridine, acetic anhydride, lutidine, trifluoroacetic acid); (ii) is chemically resistant to reagents that can be used for the synthesis of morpholine derivatives of nucleic acids; (iii) it can be chemically modified; (iv) it can be loaded with the desired morpholine nucleic acid derivatives; (v) it has sufficient strength to withstand high processing pressure; and (vi) has a defined range of diameters and particle distribution. In particular, swelling polystyrene (for example, aminomethyl polystyrene resin with 1% cross-linked divinylbenzene (200-400 mesh) (2.4-3.0 mmol/g) (Tokyo Chemical Industry), aminomethyl polystyrene resin with HCl [divinylbenzene 1%, 100-200 mesh] (Peptid Institute, Inc.)), non-swelling polystyrene (eg, Primer Support (GE Healthcare)), polystyrene with attached PEG chains (eg, NH 2 -PEG resin (Watanabe Chemical Co.), TentaGel resin) , controlled pore glass (CPG) (manufactured, for example, by CPG), controlled pore size oxalyl glass (see, for example, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), aminopolyethylene glycol derivative TentaGel substrates (eg, Wright et al., see Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), and Poros brand polystyrene/divinylbenzene copolymer.
Линкер, который можно использовать, представляет собой известный линкер, обычно используемый для соединения производных нуклеиновых кислот или морфолиновых нуклеиновых кислот. Примеры включают 3-аминопропил, сукцинил, 2,2'-диэтанолсульфонил и алкиламино с длинной цепью (LCAA).The linker that can be used is a known linker generally used for connecting nucleic acid derivatives or morpholino nucleic acids. Examples include 3-aminopropyl, succinyl, 2,2'-diethanolsulfonyl, and long chain alkylamino (LCAA).
На этой стадии можно проводить реакцию соединения (II) с кислотой.At this stage, it is possible to react compound (II) with an acid.
Кислота, которую можно использовать на этой стадии, включает, например, трифторуксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту и трихлоруксусную кислоту. Количество используемой кислоты находится в диапазоне, например, от 0,1 моль-эквивалента до 1000 моль-эквивалентов на 1 моль соединения (II), предпочтительно в диапазоне от 1 моль-эквивалента до 100 моль-эквивалентов на 1 моль соединения (II).The acid that can be used in this step includes, for example, trifluoroacetic acid, dichloroacetic acid and trichloroacetic acid. The amount of acid used is in the range, for example, from 0.1 mol equivalent to 1000 mol equivalent per 1 mol of compound (II), preferably in the range from 1 mol equivalent to 100 mol equivalent per 1 mol of compound (II).
Органический амин можно использовать в комбинации с кислотой, описанной выше. Органический амин конкретно не ограничен и включает, например, триэтиламин. Количество используемого органического амина обычно находится в диапазоне, например, от 0,01 моль-эквивалента до 10 мольэквивалентов, и предпочтительно в диапазоне от 0,1 моль-эквивалента до 2 моль-эквивалентов на 1 моль кислоты.The organic amine can be used in combination with the acid described above. The organic amine is not particularly limited and includes, for example, triethylamine. The amount of organic amine used is typically in the range of, for example, 0.01 mole equivalent to 10 mole equivalent, and preferably in the range of 0.1 mole equivalent to 2 mole equivalent per mole of acid.
Когда соль или смесь кислоты и органического амина используют на этой стадии, соль или смесь включает, например, соль или смесь трифторуксусной кислоты и триэтиламина, и более конкретно, смесь 1 эквивалента триэтиламина и 2 эквивалентов трифторуксусной кислоты.When a salt or mixture of an acid and an organic amine is used in this step, the salt or mixture includes, for example, a salt or mixture of trifluoroacetic acid and triethylamine, and more specifically, a mixture of 1 equivalent of triethylamine and 2 equivalents of trifluoroacetic acid.
Кислоту, которую можно использовать на этой стадии, также можно развести соответствующим растворителем в концентрации от 0,1 до 30%. Растворитель конкретно не ограничен, поскольку он инертен в реакции, и включает, например, дихлорметан, ацетонитрил, спирт(ы) (этанол, изопропанол, трифторэтанол и т.д.), воду или их смесь.The acid that can be used at this stage can also be diluted with a suitable solvent in a concentration of 0.1 to 30%. The solvent is not particularly limited as long as it is inert in the reaction, and includes, for example, dichloromethane, acetonitrile, alcohol(s) (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
Температура реакции в описанной выше реакции предпочтительно находится в диапазоне, например, от 10 до 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 20 до 40°С, и наиболее предпочтительно в диапазоне от 25 до 35°С.The reaction temperature in the above reaction is preferably in the range of, for example, 10 to 50°C, more preferably in the range of 20 to 40°C, and most preferably in the range of 25 to 35°C.
Время реакции может варьироваться в зависимости от вида используемой кислоты и температуры реакции, и находится в диапазоне от 0,1 мин до 24 ч, и предпочтительно в диапазоне от 1 мин до 5 ч.The reaction time may vary depending on the type of acid used and the reaction temperature, and is in the range of 0.1 minutes to 24 hours, and preferably in the range of 1 minute to 5 hours.
После завершения этой стадии можно добавить основание, если это необходимо, чтобы нейтрализовать кислоту, оставшуюся в системе. Основание конкретно не ограничено и включает, например, диизопропилэтиламин. Основание также можно использовать в разбавленной форме с соответствующим растворителем в концентрации от 0,1% (об./об.) до 30% (об./об.).Once this step is complete, a base can be added if necessary to neutralize any acid remaining in the system. The base is not particularly limited and includes, for example, diisopropylethylamine. The base can also be used in diluted form with a suitable solvent at a concentration of 0.1% (v/v) to 30% (v/v).
Растворитель, используемый на этой стадии, конкретно не ограничен при условии, что он инертен в реакции, и включает дихлорметан, ацетонитрил, спирт(ы) (этанол, изопропанол, трифторэтанол и т.д.), воду и их смесь. Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне, например, от 10 до 50°С, более предпочтительно в диапазоне от 20 до 40°С и наиболее предпочтительно в диапазоне от 25 до 35°С.The solvent used in this step is not particularly limited as long as it is inert to the reaction, and includes dichloromethane, acetonitrile, alcohol(s) (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water and a mixture thereof. The reaction temperature is preferably in the range of, for example, 10 to 50°C, more preferably in the range of 20 to 40°C, and most preferably in the range of 25 to 35°C.
Время реакции может варьироваться в зависимости от вида используемого основания и температуры реакции, и составляет в основном от 0,1 мин до 24 ч, и предпочтительно в диапазоне от 1 мин до 5 ч.The reaction time may vary depending on the type of base used and the reaction temperature, and is generally from 0.1 minute to 24 hours, and preferably in the range from 1 minute to 5 hours.
В соединении (II), соединение общей формулы (IIa) ниже (далее в настоящем документе соединение (IIa)), где n равно 1 и L представляет собой группу (IV), можно получать с помощью следующего способа:In compound (II), the compound of the general formula (IIa) below (hereinafter referred to as compound (IIa)), where n is 1 and L represents group (IV), can be prepared by the following method:
- 10 045808- 10 045808
Формула 9Formula 9
( 1 1 ) где BP, Т, линкер и твердый носитель имеют такое же значение, как определено выше.( 1 1 ) where B P , T , linker and solid support have the same meaning as defined above.
Стадия 1.Stage 1.
Проводят реакцию соединения, представленного общей формулой (V) ниже, с ацилирующим средством для получения соединения, представленного общей формулой (VI) ниже (далее в настоящем документе, обозначаемого как соединение (VI)):The compound represented by the general formula (V) below is reacted with an acylating agent to obtain the compound represented by the general formula (VI) below (hereinafter referred to as compound (VI)):
Формула 10Formula 10
ОН ^-ЦЛинкер|—OH ^-CLinker|—
LjX ,Вр ........ -θρ LjX ,В р ........ -θ ρ
I; ι:I; ι:
ΝΝ'ΝΝ'
IJIJ
Т (V) (V I >T (V) (V I >
где BP, Т и линкер имеют такое же значение, как определено выше; и,where BP , T and linker have the same meaning as defined above; And,
R4 представляет собой гидрокси, галоген, карбоксильную или аминогруппу.R 4 represents hydroxy, halogen, carboxyl or amino.
Эту стадию можно проводить известными способами для введения линкеров с использованием соединения (V) в качестве исходного вещества.This step can be carried out by known methods for introducing linkers using compound (V) as a starting material.
В частности, соединение, представленное общей формулой (VIa) ниже, можно получать, выполняя способ, известный как этерификация, с использованием соединения (V) и янтарного ангидрида.In particular, the compound represented by the general formula (VIa) below can be obtained by performing a method known as esterification using compound (V) and succinic anhydride.
Формула 11Formula 11
где BP и Т имеют такое же значение, как определено выше. Стадия 2.where B P and T have the same meaning as defined above. Stage 2.
Проводят реакцию соединения (VI) с твердым носителем с использованием конденсирующего средства или т.п. для получения соединения (IIa)Compound (VI) is reacted with a solid support using a condensing agent or the like. to obtain compound (IIa)
Формула 12 я4 1™™*; о CSSSEI -^^.1 оFormula 12 i 4 1™™*; o CSSSEI -^^.1 o
ГГ _ о , < V К Т ( Ϊ F . 5 Т где BP, R4, Т, линкер и твердый носитель имеют такое же значение, как определено выше.GG _ o , < V K T ( Ϊ F . 5 T where BP , R 4 , T , linker and solid support have the same meaning as defined above.
Эту стадию можно проводить с использованием соединения (VI) и твердого носителя в соответствии со способом, известным как реакция конденсации.This step can be carried out using compound (VI) and a solid support in accordance with a method known as a condensation reaction.
В соединении (II), соединение, представленное общей формулой (IIa2) ниже, где n представляет собой от 2 до 99 (предпочтительно, заданное целое число от 16 до 35, от 16 до 25 или от 16 до 23, предпочтительно 19 или 20) и L представляет собой группу, представленную общей формулой (IV), можно получать с использованием соединения (IIa) в качестве исходного вещества и повтора стадии А и стадии В из способа получения ФМО, приведенного в описании, необходимое число раз.In compound (II), a compound represented by the general formula (IIa2) below, where n is 2 to 99 (preferably a predetermined integer of 16 to 35, 16 to 25, or 16 to 23, preferably 19 or 20) and L represents the group represented by the general formula (IV), can be prepared by using compound (IIa) as the starting material and repeating Step A and Step B of the FMO production method given in the specification as many times as necessary.
Формула 13Formula 13
- 11 045808 где BP, R2, R3, Т, линкер и твердый носитель имеют такое же значение, как определено выше; и n' представляет собой от 1 до 98 (в конкретном варианте осуществления n' представляет собой, например, от 1 до 34, от 1 до 24, от 1 до 23, от 1 до 22, от 1 до 21, от 1 до 20, от 1 до 19, от 1 до 18, от 1 до 17, от 1 до 16, от 1 до 15.- 11 045808 where BP, R 2 , R 3 , T, linker and solid support have the same meaning as defined above; and n' is 1 to 98 (in a particular embodiment, n' is, for example, 1 to 34, 1 to 24, 1 to 23, 1 to 22, 1 to 21, 1 to 20 , from 1 to 19, from 1 to 18, from 1 to 17, from 1 to 16, from 1 to 15.
(2) Стадия В.(2) Stage B.
Проводят реакцию соединения (III) с соединением морфолинового мономера в присутствии основания для получения соединения, представленного общей формулой (VII) ниже (далее в настоящем документе обозначаемого как соединение (VII)):Compound (III) is reacted with a morpholine monomer compound in the presence of a base to obtain a compound represented by the general formula (VII) below (hereinafter referred to as compound (VII)):
Формула 14Formula 14
где каждый из BP, L, n, R2, R3 и Т имеет такое же значение, как определено выше.where each of BP, L, n, R 2 , R 3 and T has the same meaning as defined above.
На этой стадии можно проводить реакцию соединения (III) с соединением морфолинового мономе ра в присутствии основания.At this stage, it is possible to react compound (III) with a morpholine monomer compound in the presence of a base.
Соединение морфолинового мономера включает, например, соединения, представленные общей формулой (VIII) ниже:The morpholine monomer compound includes, for example, those represented by the general formula (VIII) below:
Формула 15Formula 15
R2 ? R2 ?
^N-P-O^N-P-O
R3 όR 3ό
VV
I тI t
(V I 1 I ) где BP, R2, R3 и Т имеют такое же значение, как определено выше.(VI 1 I) where BP, R 2 , R 3 and T have the same meaning as defined above.
Основание, которое можно использовать на этой стадии, включает, например, диизопропилэтиламин, триэтиламин и N-этилморфолин. Количество используемого основания находится соответственно, например, в диапазоне от 1 моль-эквивалента до 1000 моль-эквивалентов на 1 моль соединения (III), предпочтительно от 10 моль-эквивалентов до 100 моль-эквивалентов на 1 моль соединения (III).A base that can be used in this step includes, for example, diisopropylethylamine, triethylamine and N-ethylmorpholine. The amount of base used is suitably in the range of 1 mol equivalent to 1000 mol equivalent per 1 mol of compound (III), preferably 10 mol equivalent to 100 mol equivalent per 1 mol of compound (III).
Соединение морфолинового мономера и основание, которое можно использовать на этой стадии, также можно использовать в разбавленном виде с соответствующим растворителем в концентрации от 0,1 до 30%. Растворитель конкретно не ограничен, поскольку инертен в реакции, и включает, например, N, N-диметилимидазолидон, N-метилпиперидон, ДМФ, дихлорметан, ацетонитрил, тетрагидрофуран или их смесь.The morpholine monomer compound and base that can be used in this step can also be used diluted with an appropriate solvent at a concentration of 0.1 to 30%. The solvent is not particularly limited as long as it is inert in the reaction, and includes, for example, N,N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone, DMF, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, or a mixture thereof.
Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне, например, от 0 до 100°С и более предпочтительно в диапазоне от 10 до 50°С.The reaction temperature is preferably in the range, for example, from 0 to 100°C and more preferably in the range from 10 to 50°C.
Время реакции может варьировать в зависимости от типа используемого основания и температуры реакции, и соответственно находится в диапазоне от 1 мин до 48 ч, в основном, и предпочтительно в диапазоне от 30 мин до 24 ч.The reaction time may vary depending on the type of base used and the reaction temperature, and is suitably in the range of 1 minute to 48 hours, generally and preferably in the range of 30 minutes to 24 hours.
Кроме того, после завершения этой стадии можно добавлять при необходимости ацилирующее средство. Ацилирующее средство включает, например, уксусный ангидрид, ацетилхлорид и феноксиуксусный ангидрид. Ацилирующее средство также можно использовать, например, в разведенном виде с соответствующим растворителем в концентрации от 0,1 до 30%. Растворитель конкретно не ограничен, поскольку он инертен в реакции, и включает, например, дихлорметан, ацетонитрил, тетрагидрофуран, спирт(ы) (этанол, изопропанол, трифторэтанол, и т.д.), воду или их смесь.In addition, after completion of this stage, an acylating agent can be added if necessary. The acylating agent includes, for example, acetic anhydride, acetyl chloride and phenoxyacetic anhydride. The acylating agent can also be used, for example, diluted with a suitable solvent in a concentration of from 0.1 to 30%. The solvent is not particularly limited as long as it is inert in the reaction, and includes, for example, dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran, alcohol(s) (ethanol, isopropanol, trifluoroethanol, etc.), water, or a mixture thereof.
При необходимости также можно использовать основание, такое как пиридин, лутидин, коллидин, триэтиламин, диизопропилэтиламин, N-этилморфолин и т.д. в комбинации с ацилирующим средством. Количество используемого ацилирующего средства находится предпочтительно в диапазоне от 0,1 мольэквивалента до 10000 моль-эквивалентов, и более предпочтительно в диапазоне от 1 моль-эквивалента до 1000 моль-эквивалентов. Количество используемого основания соответственно находится в диапазоне, например, от 0,1 моль-эквивалента до 100 моль-эквивалентов, а также в диапазоне от 1 моль-эквивалента до 10 моль-эквивалентов на 1 моль ацилирующего средства.If necessary, a base such as pyridine, lutidine, collidine, triethylamine, diisopropylethylamine, N-ethylmorpholine, etc. can also be used. in combination with an acylating agent. The amount of acylating agent used is preferably in the range of 0.1 mole equivalent to 10,000 mole equivalent, and more preferably in the range of 1 mole equivalent to 1000 mole equivalent. The amount of base used is suitably in the range, for example, from 0.1 mole equivalent to 100 mole equivalent, and also in the range from 1 mole equivalent to 10 mole equivalent per 1 mole of acylating agent.
Температура реакции в этой реакции находится предпочтительно в диапазоне от 10 до 50°С, болееThe reaction temperature in this reaction is preferably in the range from 10 to 50°C, more
- 12 045808 предпочтительно, в диапазоне от 10 до 50°С, еще более предпочтительно, в диапазоне от 20 до 40°С, и наиболее предпочтительно, в диапазоне от 25 до 35°С. Время реакции может варьировать в зависимости от типа используемого ацилирующего средства и температуры реакции, и соответственно находится в диапазоне от 0,1 мин до 24 ч, в основном, и предпочтительно в диапазоне от 1 мин до 5 ч.- 12 045808 preferably in the range from 10 to 50°C, even more preferably in the range from 20 to 40°C, and most preferably in the range from 25 to 35°C. The reaction time may vary depending on the type of acylating agent used and the reaction temperature, and is suitably in the range of 0.1 minutes to 24 hours, generally and preferably in the range of 1 minute to 5 hours.
(3) Стадия С.(3) Stage C.
В соединении (VII), полученном на стадии В, защитную группу удаляют с использованием агента для снятия защиты для получения соединения, представленного общей формулой (IX) Формула 16 (V ί Ϊ ) где основание, BP, L, n, R2, R3 In compound (VII) obtained in step B, the protecting group is removed using a deprotecting agent to obtain the compound represented by the general formula (IX) Formula 16 (V ί Ϊ ) where base, BP, L, n, R 2 , R 3
нn
и Т имеют такое же значение как определено выше. На этой стадии можно проводить реакцию соединения (VII) с агентом для снятия защиты.and T have the same meaning as defined above. At this stage, compound (VII) can be reacted with a deprotection agent.
Агент для снятия защиты включает, например, концентрированную аммиачную воду и метиламин. Агент для снятия защиты, используемый на этой стадии, также можно использовать в в разбав ленном виде, например, с водой, метанолом, этанолом, изопропиловым спиртом, ацетонитрилом, тетрагидрофураном, ДМФА, N,N-диметилимидазолидоном, N-метилпиперидоном или смесью этих растворителей. Среди них предпочтительным является этанол. Количество используемого агента для снятия защиты соответственно находится, например, в диапазоне от 1 моль-эквивалента до 100000 мольэквивалентов, и предпочтительно в диапазоне от 10 моль-эквивалентов до 1000 моль-эквивалентов на 1 моль соединения (VII).The deprotection agent includes, for example, concentrated ammonia water and methylamine. The deprotection agent used in this step can also be used in dilute form, for example with water, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetonitrile, tetrahydrofuran, DMF, N,N-dimethylimidazolidone, N-methylpiperidone or a mixture of these solvents . Among them, ethanol is preferred. The amount of deprotection agent used is suitably, for example, in the range of 1 mol equivalent to 100,000 mol equivalent, and preferably in the range of 10 mol equivalent to 1000 mol equivalent, per 1 mol of compound (VII).
Температура реакции находится соотвественно, например, в диапазоне от 15 до 75°С, предпочтительно, в диапазоне от 40 до 70°С, и более предпочтительно, в диапазоне от 50 до 60°С. Время реакции для снятия защиты может варьировать в зависимости от типа соединения (VII), температуры реакции и т.д., и находится соответственно в диапазоне от 10 мин до 30 ч, предпочтительно от 30 мин до 24 ч, и более предпочтительно в диапазоне от 5 ч до 20 ч.The reaction temperature is suitably, for example, in the range of 15 to 75°C, preferably in the range of 40 to 70°C, and more preferably in the range of 50 to 60°C. The deprotection reaction time may vary depending on the type of compound (VII), reaction temperature, etc., and is suitably in the range of 10 minutes to 30 hours, preferably 30 minutes to 24 hours, and more preferably in the range of 5 hours to 20 hours
(4) Стадия D.(4) Stage D.
ФМО (I) получают путем реакции соединения (IX), полученного на стадии С с кислотой Формула 17FMO (I) is obtained by reacting compound (IX) obtained in step C with the acid Formula 17
Основаине но нBasic but n
Основание !Foundation!
R< ТR<T
N Р —о θ _п Ц^Оч^Осмивамне где основание, n, R2, R3 и Т имеют такое же значение как определено выше.N Р -о θ _п Ц^Оч^Осмивамн where the base, n, R 2 , R 3 and T have the same meaning as defined above.
На этой стадии можно проводить добавление кислоты к соединению (IX).At this stage, the addition of acid to compound (IX) can be carried out.
Кислота, которую можно использовать на этой стадии, включает, например, трихлоруксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту, уксусную кислоту, фосфорную кислоту, соляную кислоту и т.д. Количество используемой кислоты применяют соответствующим образом для получения раствора с рН в диапазоне от 0,1 до 4,0, например, и более предпочтительно, в диапазоне рН от 1,0 до 3,0. Растворитель кон кретно не ограничен при условии, что он инертен в реакции, и включает, например, ацетонитрил, воду или смесь этих растворителей.The acid that can be used in this step includes, for example, trichloroacetic acid, dichloroacetic acid, acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, etc. The amount of acid used is suitably used to obtain a solution with a pH in the range of 0.1 to 4.0, for example, and more preferably, in the pH range of 1.0 to 3.0. The solvent is not particularly limited as long as it is inert in the reaction, and includes, for example, acetonitrile, water, or a mixture of these solvents.
Температура реакции находится предпочтительно в диапазоне от 10 до 50°С, более предпочтительно, в диапазоне от 20 до 40°С и более предпочтительно в диапазоне от 25 до 35°С. Время реакции для снятия защиты может варьировать в зависимости от типа соединения (IX), температуры реакции, и т.д., и наодится соотвественно в диапазоне от 0,1 мин до 5 ч, предпочтительно от 1 мин до 1 ч и более предпочтительно в диапазоне от 1 до 30 мин.The reaction temperature is preferably in the range of 10 to 50°C, more preferably in the range of 20 to 40°C, and more preferably in the range of 25 to 35°C. The deprotection reaction time may vary depending on the type of compound (IX), reaction temperature, etc., and will accordingly range from 0.1 min to 5 h, preferably from 1 min to 1 h, and more preferably range from 1 to 30 min.
ФМО (I) можно получать, подвергая смесь, полученную на этой стадии, общепринятым способам разделения и очистки, таким как экстракция, концентрирование, нейтрализация, фильтрация, разделение центрифугированием, перекристаллизация, колоночная хроматография с обращенной фазой с использованием от С8 до С18, хроматография с катионообмнными колонками, хроматография с анионообменными колонками, хроматография с колонками для гель-фильтрации, высокоэффективная жидкостная хроматография, диализ, ультрафильтрация и т.д., отдельно или в сочетании.FMO (I) can be obtained by subjecting the mixture obtained in this step to conventional separation and purification methods, such as extraction, concentration, neutralization, filtration, centrifugal separation, recrystallization, reverse phase column chromatography using C8 to C18, chromatography with cation exchange columns, anion exchange column chromatography, gel filtration column chromatography, high performance liquid chromatography, dialysis, ultrafiltration, etc., alone or in combination.
Таким образом, желаемый ФМО (I) можно выделить и очистить (см., например, WO 1991/09033).In this way, the desired FMO (I) can be isolated and purified (see, for example, WO 1991/09033).
- 13 045808- 13 045808
При очистке ФМО (I) с использованием обратно-фазовой хроматографии в качестве растворителя для элюции можно использовать, например, раствор смеси 20 мМ триэтиламина/ацетатнго буфера и ацетонитрила.When purifying FMO (I) using reverse phase chromatography, for example, a solution of a mixture of 20 mM triethylamine/acetate buffer and acetonitrile can be used as an elution solvent.
При очистке ФМО (I) с использованием ионообменной хроматографии в качестве растворителя для элюции можно использовать, например, раствор смеси 1М физиологического раствора и 10 мМ водного раствора гидроксида натрия.When purifying FMO (I) using ion exchange chromatography, for example, a solution of a mixture of 1 M physiological solution and 10 mM aqueous sodium hydroxide solution can be used as an elution solvent.
Пептидная нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, характеризующийся группой, представленной следующей общей формулой в виде составной единицы:The peptide nucleic acid is an antisense oligomer of the present invention characterized by a group represented by the following general formula as a unit:
Формула 18Formula 18
ОснованиеBase
Ν'Ν'
О где основание имеет такое же значение, как определено выше. Пептидную нуклеинов кислоты можно получать, обращаясь, например, к следующим литературным источникам:O where base has the same meaning as defined above. Peptide nucleic acid can be obtained by referring, for example, to the following literature sources:
1) P.E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg, О. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991).1) P.E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991).
2) М. Egholm, О. Buchardt, P.E. Nielsen, R.H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992).2) M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, R.H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992).
3) K.L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H.F. Hansen, T. Vulpius, K.H. Petersen, R.H. Berg, P.E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994).3) K.L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H.F. Hansen, T. Vulpius, K.H. Petersen, R.H. Berg, P.E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994).
4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995).4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K.H. Petersen, H.F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P.E. Nielsen, J. Coull, R.H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995).
5) T. Koch, H.F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H.G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997).5) T. Koch, H.F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H.G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997).
В антисмысловом олигомере по настоящему изобретению, 5'-конец может быть одним из группы, показанной химической формулой (1)-(3) ниже, и предпочтительно представляет собой (3)-ОНIn the antisense oligomer of the present invention, the 5' end may be one of the group shown by chemical formula (1)-(3) below, and is preferably (3)-OH
Формула 19Formula 19
Далее в настоящем документе, группы, показанные (1), (2) и (3) выше обозначают как Группа (1), Группа (2) и Группа (3), соответственно.Hereinafter, the groups shown (1), (2) and (3) above are referred to as Group (1), Group (2) and Group (3), respectively.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению может включать соединение со стереохимически оптически чистым атомом фосфора, поскольку атом фосфора в группе фосфатной связи служит центром ассиметрии. Специалист в данной области может получить чистые оптически активные формы из смесей изомеров (WO 2017/024264). Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению может быть синтезирован в виде чистой оптически активной формы. Специалист в данной области может получать чистые оптически активные формы, контролируя реакции синтеза (японская патентная публикация для всеобщего ознакомления № 2018-537952).The antisense oligomer of the present invention may include a compound with a stereochemically optically pure phosphorus atom, since the phosphorus atom in the phosphate bond group serves as a center of asymmetry. One skilled in the art can obtain pure optically active forms from mixtures of isomers (WO 2017/024264). The antisense oligomer of the present invention can be synthesized in a pure optically active form. One skilled in the art can obtain pure optically active forms by controlling the synthesis reactions (Japanese Patent Publication No. 2018-537952).
2. Пептид-конъюгированный антисмысловой олигомер.2. Peptide-conjugated antisense oligomer.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению может образовывать комплекс с функциональным пептидом, направленным на повышение эффективности (например, мембранопроницаемым пептидом, направленным на повышение эффективности доставки к клеткам-мишеням) (WO 2008/036127, WO 2009/005793, WO 2012/150960, WO 2016/187425, WO 2018/118662, WO 2018/118599, WO 2018/118627, J. D. Ramsey, N. Н. Flynn, Pharmacology & Therapeutics 154, 78-86 (2015), M.K. Tsoumpra et al., EBioMedicine, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.036). Сайт конъюгации конкретно не ограничен. Желательно, 5'-конец или 3'-конец антисмыслового олигомера соединяется (конъюгируется) с аминоконцом или карбокси-концом функционального пептида.The antisense oligomer of the present invention can form a complex with a functional peptide aimed at increasing efficiency (for example, a membrane permeable peptide aimed at increasing the efficiency of delivery to target cells) (WO 2008/036127, WO 2009/005793, WO 2012/150960, WO 2016 /187425, WO 2018/118662, WO 2018/118599, WO 2018/118627, J. D. Ramsey, N. N. Flynn, Pharmacology & Therapeutics 154, 78-86 (2015), M. K. Tsoumpra et al., EBioMedicine, https:/ /doi.org/10.1016/j.ebiom.2019.06.036). The conjugation site is not particularly limited. Desirably, the 5' end or 3' end of the antisense oligomer is conjugated to the amino terminus or carboxy terminus of the functional peptide.
В другом варианте осуществления антисмысловой олигомер по настоящему изобретению и функциональный пептид могут образовывать комплекс (конъюгат) через линкер. Линкер конкретно не ограничен. Предпочтительно, 5'-конец или 3'-конец антисмыслового олигомера соединен с одним концом линкера, в то время как амино-конец или карбокси-конец функционального пептида соединен с другим концом линкера. Между функциональным пептидом и линкером может присутствовать дополнительная аминокислота.In another embodiment, the antisense oligomer of the present invention and the functional peptide can form a complex (conjugate) through a linker. The linker is not particularly limited. Preferably, the 5' end or 3' end of the antisense oligomer is connected to one end of the linker, while the amino end or carboxy end of the functional peptide is connected to the other end of the linker. An additional amino acid may be present between the functional peptide and the linker.
- 14 045808- 14 045808
3. Фармацевтическая композиция.3. Pharmaceutical composition.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, даже если его длина является короткой по сравнению с антисмысловыми олигомерами известного уровня техники, может вызывать пропуск экзона 50 с высокой эффективностью. Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению обладает отличной растворимостью, сохраняя при этом активность по индукции пропуска экзона 50 с высокой эффективностью. Таким образом, ожидают, что состояния миодистрофии могут быть улучшены с высокой эффективностью путем введения антисмыслового олигомера по настоящему изобретению пациентам с МДД, у которых есть мутация, восприимчивая к пропуску экзона 50 гена дистрофина (например, мутация со сдвигом рамки и миссенс-мутация/нонсенс-мутация в экзоне 50). Таким образом, ожидают, что состояния миодистрофии могут быть улучшены с высокой эффективностью путем введения антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, например, по меньшей мере, у пациентов с МДД, у которых есть предопределенный мутантный ген дистрофина, имеющий делецию экзона вблизи экзона 50. Предопределенный мутантный ген дистрофина представляет собой ген дистрофина, который имеет, по меньшей мере, мутацию сдвига рамки считывания, вызванную делецией экзона вблизи экзона 50, и в котором аминокислотная рамка считывания корректируется путем удаления (пропуска) экзона 50. Примеры пациентов, имеющих такой предопределенный мутантный ген дистрофина, включают пациентов с МДД с мутацией сдвига рамки считывания, вызванной делецией экзонов 51, 51-53, 51-55, 51-57 и т.п.The antisense oligomer of the present invention, even if its length is short compared with the antisense oligomers of the prior art, can cause skipping of exon 50 with high efficiency. The antisense oligomer of the present invention has excellent solubility while maintaining exon 50 skipping inducing activity with high efficiency. Thus, it is expected that muscular dystrophy conditions can be improved with high efficiency by administering the antisense oligomer of the present invention to patients with DMD who have a mutation susceptible to exon 50 skipping of the dystrophin gene (eg, frameshift mutation and missense/nonsense mutation -mutation in exon 50). Thus, it is expected that muscular dystrophy conditions can be improved with high efficiency by administering the antisense oligomer of the present invention, for example, to at least patients with DMD who have a predetermined mutant dystrophin gene having an exon deletion near exon 50. Predetermined mutant a dystrophin gene is a dystrophin gene that has at least a frameshift mutation caused by a deletion of an exon near exon 50, and in which the amino acid reading frame is corrected by deletion (skipping) of exon 50. Examples of patients having such a predetermined mutant dystrophin gene , include patients with DMD with a frameshift mutation caused by deletion of exons 51, 51-53, 51-55, 51-57, etc.
Более конкретно, ожидают, что состояния миодистрофии могут быть улучшены с высокой эффективностью путем введения фармацевтической композиции, содержащей антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, пациентам с МДД, у которых есть мутация, превращающаяся в мутацию внутри рамки считывания за счет пропуска экзона 50, например у пациентов с делецией экзона 51, пациентов с делецией экзона 51-53, пациентов с делецией экзона 51-55, пациентов с делецией экзона 51-57 и т.д. Например, когда фармацевтическая композиция содержит антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, тот же терапевтический эффект может быть достигнут даже в меньшей дозе, чем у олигомеров известного уровня техники. Таким образом, можно облегчить побочные эффекты и получить экономическую выгоду.More specifically, it is expected that muscular dystrophy conditions can be improved with high efficiency by administering a pharmaceutical composition containing the antisense oligomer of the present invention to patients with DMD who have a mutation that becomes an in-frame exon 50 skipping mutation, e.g. with exon 51 deletion, patients with exon 51-53 deletion, patients with exon 51-55 deletion, patients with exon 51-57 deletion, etc. For example, when the pharmaceutical composition contains the antisense oligomer of the present invention, the same therapeutic effect can be achieved even at a lower dose than prior art oligomers. In this way, side effects can be alleviated and economic benefits can be achieved.
Антисмысловой олигомер по настоящему изобретению также подходит для получения фармацевтических композиций, потому что антисмысловой олигомер обладает превосходной растворимостью, сохраняя при этом активность по индукции пропуска экзона 50 с высокой эффективностью.The antisense oligomer of the present invention is also suitable for the preparation of pharmaceutical compositions because the antisense oligomer has excellent solubility while retaining exon 50 skipping inducing activity with high efficiency.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения миодистрофии, содержащей в качестве активного ингредиента антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, его фармацевтически приемлемую соль или гидрата (далее в настоящем документе, обозначаемой как композиция по настоящему изобретению).In another embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of muscular dystrophy containing as an active ingredient an antisense oligomer of the present invention, a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof (hereinafter referred to as the composition of the present invention).
Также, настоящее изобретение относится к способу лечения миодистрофии, который предусматривает введение пациенту с МДД антисмыслового олигомера по настоящему изобретению.Also, the present invention relates to a method for treating muscular dystrophy, which involves administering to a patient with DMD an antisense oligomer of the present invention.
В указанном способе лечения антисмысловой олигомер по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтической композиции для лечения миодистрофии.In this treatment method, the antisense oligomer of the present invention can be administered in a pharmaceutical composition for the treatment of muscular dystrophy.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антисмыслового олигомера по настоящему изобретению в производстве фармацевтической композиции для лечения миодистрофии и антисмыслового олигомера по настоящему изобретению для применения для лечения миодистрофии.Furthermore, the present invention relates to the use of the antisense oligomer of the present invention in the production of a pharmaceutical composition for the treatment of muscular dystrophy and the antisense oligomer of the present invention for use in the treatment of muscular dystrophy.
Примеры фармацевтически приемлемой соли антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, содержащейся в композиции по настоящему изобретению, включают соли щелочных металлов, такие как соль натрия, соль калия и соль лития; соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция и соль магния; соли металлов, такие как соль алюминия, соль железа, соль цинка, соль меди, соль никеля, соль кобальта и т.д.; аммонийные соли; соли органических аминов, такие как т-октиламиновая соль, дибензиламиновая соль, морфолиновая соль, глюкозаминовая соль, фенилглициновая соль алкилового сложного эфира, этилендиаминовая соль, N-метилглюкаминовая соль, гуанидиновая соль, диэтиламиновая соль, триэтиламиновая соль, дициклогексиламиновая соль, N,N'-дибензилэтилендиаминовαя соль, хлорпрокаиновая соль, прокаиновая соль, диэтаноламиновая соль, N-бензилфенэтиламиновая соль, пиперазиновая соль, тетраметиламмонийная соль, трис(гидроксиметил)аминометановая соль; гидрогалогенидная соль, так как фтористоводородная кислая соль, гидрохлоридная соль, гидробромидная соль и йодогидратная соль; неорганические кислые соли, такие как нитратная соль, перхлоратная соль, сульфатная соль, фосфатная соль и т.д.; соли низших алкансульфонатов, такие как метансульфонатная соль, трифторметансульфонатная соль и этансульфонатная соль; арилсульфонатная соль, такая как бензолсульфонатная соль и п-толуолсульфонатная соль; органические кислые соли, такие как ацетатная соль, соль яблочной кислоты, соль фумаровой кислоты, соль янтарной кислоты, соль лимонной кислоты, соль винной кислоты, оксалатная соль, соль малеиновой кислоты и т.д.; и, аминокислая соль, такая как глициновая соль, лизиновая соль, аргининовая соль, орнитиновая соль, глутаминовая кислая соль и аспарагиновая кислая соль. Эти соли можно получать известным способом. Альтернативно, антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, может быть в форме его гидрата.Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; metal salts such as aluminum salt, iron salt, zinc salt, copper salt, nickel salt, cobalt salt, etc.; ammonium salts; organic amine salts such as t-octylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, glucosamine salt, phenylglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methylglucamine salt, guanidine salt, diethylamine salt, triethylamine salt, dicyclohexylamine salt, N,N' -dibenzylethylenediamine salt, chloroprocaine salt, procaine salt, diethanolamine salt, N-benzylphenethylamine salt, piperazine salt, tetramethylammonium salt, tris(hydroxymethyl)aminomethane salt; hydrohalide salt such as hydrofluoride salt, hydrochloride salt, hydrobromide salt and iodohydrate salt; inorganic acid salts such as nitrate salt, perchlorate salt, sulfate salt, phosphate salt, etc.; lower alkanesulfonate salts such as methanesulfonate salt, trifluoromethanesulfonate salt and ethanesulfonate salt; arylsulfonate salt such as benzenesulfonate salt and p-toluenesulfonate salt; organic acid salts such as acetate salt, malic acid salt, fumaric acid salt, succinic acid salt, citric acid salt, tartaric acid salt, oxalate salt, maleic acid salt, etc.; and, an amino acid salt such as glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, glutamic acid salt and aspartic acid salt. These salts can be obtained in a known manner. Alternatively, the antisense oligomer of the present invention included in the composition of the present invention may be in the form of a hydrate thereof.
Способ введения композиции по настоящему составу конкретно не ограничен при условии, что этоThe method of administration of the composition of the present formulation is not particularly limited, provided that it
- 15 045808 фармацевтический приемлемый способ введения, и он может быть выбран в зависимости от способа лечения. Ввиду легкости доставки в мышечные ткани предпочтительны внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, пероральное введение, введение в ткань, трансдермальное введение и т.д. Кроме того, лекарственные формы, которые доступны для композиции по настоящему изобретению, конкретно не ограничены и включают, например, различные инъекции, пероральные средства, капельницы, ингаляции, мази, лосьоны и т.д.- 15 045808 pharmaceutical acceptable mode of administration, and it can be selected depending on the method of treatment. Due to ease of delivery to muscle tissue, intravenous administration, intra-arterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, tissue administration, transdermal administration, etc. are preferred. Moreover, dosage forms that are available for the composition of the present invention are not particularly limited and include, for example, various injections, oral agents, droppers, inhalations, ointments, lotions, etc.
При введении антисмыслового олигомера по настоящему изобретению пациентам с миодистрофией композиция по настоящему изобретению может содержать носитель для ускорения доставки олигомера в мышечные ткани. Такой носитель конкретно не ограничен, поскольку он является фармацевтически приемлемым, и примеры включают катионные носители, такие как катионные липосомы, катионные полимеры и т.д., или носители с использованием вирусной оболочки. Примеры катионных липосом включают, например, липосомы, состоящие из 2-О-(2-диэтиламиноэтил)карабамоил-1,3-O-диолеоилглицерина и фосфолипидов в качестве основных компонентов (далее в настоящем документе, обозначаемые как липосома А), Олигофектамин (зарегистрированный товарный знак) (Invitrogen Corp.), Липофектин (зарегистрированный товарный знак) (Invitrogen Corp.), Липофектамин (зарегистрированный товарный знак) (Invitrogen Corp.), Липофектамин 2000 (зарегистрированный товарный знак) (Invitrogen Corp.), DMRIE-C (зарегистрированный товарный знак) (Invitrogen Corp.), GeneSilencer (зарегистрированный товарный знак) (Gene Therapy Systems), TransMessenger (зарегистрированный товарный знак) (QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (зарегистрированый товарный знак) (Minis) и Nucleofector II (Lonza). Наряду с другими, предпочтительной является липосома А. Примеры катионных полимеров включают JetSI (зарегистрированный товарный знак) (Qbiogene, Inc.) и Jet-PEI (зарегистрированный товарный знак) (полиэтиленимин, Qbiogene, Inc.). Примеры носителей с использованием вирусной оболочки включают GenomeOne (зарегистрированный товарный знак) (липосома HVJ-E, Ishihara Sangyo). В качестве альтернативы, можно также использовать медицинские устройства, описанные в японском патенте № 2924179, и катионные носители, описанные в японских отечественных повторных публикациях заявок РСТ № 2006/129594 и 2008/096690.When administering the antisense oligomer of the present invention to patients with muscular dystrophy, the composition of the present invention may contain a carrier to accelerate delivery of the oligomer to muscle tissue. Such a carrier is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples include cationic carriers such as cationic liposomes, cationic polymers, etc., or carriers using a viral shell. Examples of cationic liposomes include, for example, liposomes consisting of 2-O-(2-diethylaminoethyl)carabamoyl-1,3-O-dioleoylglycerol and phospholipids as the main components (hereinafter referred to as liposome A), Oligofectamine (registered trademark) (Invitrogen Corp.), Lipofectin (registered trademark) (Invitrogen Corp.), Lipofectamine (registered trademark) (Invitrogen Corp.), Lipofectamine 2000 (registered trademark) (Invitrogen Corp.), DMRIE-C ( registered trademark) (Invitrogen Corp.), GeneSilencer (registered trademark) (Gene Therapy Systems), TransMessenger (registered trademark) (QIAGEN, Inc.), TransIT TKO (registered trademark) (Minis), and Nucleofector II (Lonza ). Among others, liposome A is preferred. Examples of cationic polymers include JetSI (registered trademark) (Qbiogene, Inc.) and Jet-PEI (registered trademark) (polyethylenimine, Qbiogene, Inc.). Examples of carriers using a viral shell include GenomeOne (registered trademark) (HVJ-E liposome, Ishihara Sangyo). Alternatively, the medical devices described in Japanese Patent No. 2924179 and the cationic carriers described in Japanese domestic republication of PCT Application Nos. 2006/129594 and 2008/096690 can also be used.
Для дополнительных деталей можно обратиться к патенту США № 4235871, патенту США № 4737323, WO 96/14057, New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pp 33-104, и т.д.For further details, reference may be made to US Patent No. 4,235,871, US Patent No. 4,737,323, WO 96/14057, New RRC, Liposomes: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990) pp 33-104, etc.
Концентрация антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от типа носителя и т.д., и в одном из вариантов осуществления соответственно находится в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ, предпочтительно в диапазоне от 100 нМ до 10 мкМ. Соотношение массы антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, и носителя (носитель/антисмысловой олигомер по настоящему изобретению) может варьироваться в зависимости от свойств олигомера, типа носителя и т.д., и соответственно находится в диапазоне от 0,1 до 100, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 10.The concentration of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention may vary depending on the type of carrier, etc., and in one embodiment is suitably in the range from 0.1 nM to 100 μM, preferably in the range from 100 nM to 10 µM. The weight ratio of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition of the present invention and the carrier (carrier/antisense oligomer of the present invention) may vary depending on the properties of the oligomer, the type of carrier, etc., and is suitably in the range of 0. 1 to 100, preferably in the range from 0.1 to 10.
Композиция по настоящему изобретению может быть в форме водного раствора. В этом случае, композиция по настоящему изобретению может содержать антисмысловой олигомер по настоящему изобретению в концентрации от 2,5 до 500 мг/мл, от 5 до 450 мг/мл, от 10 до 400 мг/мл, от 15 до 350 мг/мл, от 20 до 300 мг/мл, от 20 до 250 мг/мл, от 20 до 200 мг/мл, от 20 до 150 мг/мл, от 20 до 100 мг/мл, от 20 до 50 мг/мл, от 20 до 40 мг/мл, от 20 до 30 мг/мл, от 23 до 27 мг/мл, от 24 до 26 мг/мл или от 25 мг/мл. Альтернативно, композиция по настоящему изобретению может содержать антисмысловой олигомер по настоящему изобретению в концентрации от 10 до 100 мг/мл, от 15 до 95 мг/мл, от 20 до 80 мг/мл, от 25 до 75 мг/мл, от 30 до 70 мг/мл, от 35 до 65 мг/мл, от 40 до 60 мг/мл, от 45 до 55 мг/мл, от 47 до 53 мг/мл, от 48 до 52 мг/мл, от 49 до 51 мг/мл или 50 мг/мл.The composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution. In this case, the composition of the present invention may contain the antisense oligomer of the present invention at a concentration of 2.5 to 500 mg/ml, 5 to 450 mg/ml, 10 to 400 mg/ml, 15 to 350 mg/ml , from 20 to 300 mg/ml, from 20 to 250 mg/ml, from 20 to 200 mg/ml, from 20 to 150 mg/ml, from 20 to 100 mg/ml, from 20 to 50 mg/ml, from 20 to 40 mg/ml, 20 to 30 mg/ml, 23 to 27 mg/ml, 24 to 26 mg/ml, or 25 mg/ml. Alternatively, the composition of the present invention may contain the antisense oligomer of the present invention at a concentration of from 10 to 100 mg/ml, from 15 to 95 mg/ml, from 20 to 80 mg/ml, from 25 to 75 mg/ml, from 30 to 70 mg/ml, from 35 to 65 mg/ml, from 40 to 60 mg/ml, from 45 to 55 mg/ml, from 47 to 53 mg/ml, from 48 to 52 mg/ml, from 49 to 51 mg /ml or 50 mg/ml.
Композиция по настоящему изобретению может находиться в сухой форме. В этом случае, чтобы приготовить композицию по настоящему изобретению в виде водного раствора, композицию по настоящему изобретению в сухой форме, содержащую, например, 125 мг или 250 мг антисмыслового олигомера по настоящему изобретению в сухой форме, можно смешивать с 0,5-100 мл воды (что соответствует антисмысловому олигомеру по настоящему изобретению в концентрации от 1,25 до 250 мг/мл или от 2,5 до 500 мг/мл), предпочтительно от 1 до 50 мл воды (что соответствует антисмысловому олигомеру по настоящему изобретению в концентрации от 2,5 до 125 мг/мл или от 5 до 250 мг/мл), более предпочтительно от 5 до 10 мл воды (что соответствует антисмысловому олигомеру по настоящему изобретению в концентрации от 12,5 до 25 мг/мл или от 25 до 50 мг/мл) и использовать.The composition of the present invention may be in dry form. In this case, to prepare the composition of the present invention as an aqueous solution, the composition of the present invention in dry form containing, for example, 125 mg or 250 mg of the antisense oligomer of the present invention in dry form, can be mixed with 0.5-100 ml water (corresponding to the antisense oligomer of the present invention at a concentration of 1.25 to 250 mg/ml or 2.5 to 500 mg/ml), preferably 1 to 50 ml of water (corresponding to the antisense oligomer of the present invention at a concentration of 2.5 to 125 mg/ml or 5 to 250 mg/ml), more preferably 5 to 10 ml of water (corresponding to the antisense oligomer of the present invention at a concentration of 12.5 to 25 mg/ml or 25 to 50 mg/ml) and use.
В дополнение к антисмысловым олигомерам по настоящему изобретению и их носителям, описанным выше, фармацевтически приемлемые добавки также могут необязательно входить в состав композиции по настоящему изобретению. Примерами таких добавок являются эмульгирующие добавки (например, жирные кислоты, имеющие от 6 до 22 атомов углевода и их фармацевтически приемлемые соли, альбумин и декстран), стабилизаторы (например, холестерин, фосфатидная кислота, сахароза, маннит, сорбит и ксилит), средства, регулирующие изотоничность (например, хлорид натрия, глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, трегалоза, маннит, сорбит и ксилит) и средства, регулирующие рН (например, солянаяIn addition to the antisense oligomers of the present invention and their carriers described above, pharmaceutically acceptable additives may also optionally be included in the composition of the present invention. Examples of such additives are emulsifying additives (for example, fatty acids having from 6 to 22 carbohydrate atoms and their pharmaceutically acceptable salts, albumin and dextran), stabilizers (for example, cholesterol, phosphatidic acid, sucrose, mannitol, sorbitol and xylitol), agents, isotonicity regulators (e.g. sodium chloride, glucose, maltose, lactose, sucrose, trehalose, mannitol, sorbitol and xylitol) and pH adjusters (e.g. hydrochloric
- 16 045808 кислота, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, гидроксид натрия, гидроксид калия и триэтаноламин) Можно использовать одну или несколько из этих добавок. Содержание добавки в композиции по настоящему изобретению соответствует 90 мас.% или менее, предпочтительно 70 мас.% или менее и более предпочтительно 50 мас.% или менее.- 16 045808 acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide and triethanolamine) One or more of these additives may be used. The content of the additive in the composition of the present invention is 90 mass% or less, preferably 70 mass% or less, and more preferably 50 mass% or less.
Композицию по настоящему изобретению можно получить путем добавления антисмыслового олигомера по настоящему изобретению к дисперсии носителя и перемешивания смеси надлежащим образом. Добавки можно добавлять на соответствующей стадии либо до, либо после добавления антисмыслового олигомера по настоящему изобретению. Когда композиция по настоящему изобретению находится в форме водного раствора, водный растворитель, который можно использовать при добавлении антисмыслового олигомера по настоящему изобретению конкретно не ограничен, поскольку он является фармацевтически приемлемым, и примеры водного растворителя включают инъекционную воду или инъекционную концентрированную воду, электролитную жидкость, такую как физиологический раствор, и т.д., и сахарную жидкость, такую как глюкозная жидкость, мальтозная жидкость и т.д. Специалист в данной области может подходящим образом подобрать условия по рН и температуре для такого случая.The composition of the present invention can be prepared by adding the antisense oligomer of the present invention to a carrier dispersion and mixing the mixture appropriately. Additives can be added at an appropriate stage either before or after the addition of the antisense oligomer of the present invention. When the composition of the present invention is in the form of an aqueous solution, the aqueous solvent that can be used when adding the antisense oligomer of the present invention is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples of the aqueous solvent include injection water or injection concentrated water, electrolyte liquid, such such as saline solution, etc., and sugar liquid such as glucose liquid, maltose liquid, etc. One skilled in the art can appropriately select the pH and temperature conditions for such a case.
Композицию по настоящему изобретению можно получать, например, в жидкой форме и в форме ее лиофилизированного препарата. В одном из вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению в сухой форме, лиофилизированная композиция по настоящему изобретению может быть получена путем лиофилизации композиции по настоящему изобретению в жидкой форме общепринятым способом. Лиофилизацию можно проводить, например, путем соответствующей стерилизации композиции по настоящему изобретению в жидкой форме, дозирования аликвоты в контейнер, проведения предварительного замораживания в течение 2 ч при температуре приблизительно от -40 до -20°С, проведения первичной сушки при приблизительно от 0 до 10°С при пониженном давлении, а затем проведения вторичной сушки при приблизительно от 15 до 25°С при пониженном давлении. Как правило, лиофилизированный препарат композиции по настоящему изобретению можно затем получать путем замены газа в флаконе газообразным азотом и закупоркой.The composition of the present invention can be obtained, for example, in liquid form and in the form of a lyophilized preparation thereof. In one embodiment of the composition of the present invention in dry form, the lyophilized composition of the present invention can be obtained by lyophilizing the composition of the present invention in liquid form in a conventional manner. Lyophilization can be carried out, for example, by suitably sterilizing the composition of the present invention in liquid form, dispensing an aliquot into a container, pre-freezing for 2 hours at a temperature of about -40 to -20° C., performing a primary drying at about 0 to 10 °C under reduced pressure, followed by secondary drying at approximately 15 to 25°C under reduced pressure. Typically, a lyophilized preparation of the composition of the present invention can then be prepared by replacing the gas in the vial with nitrogen gas and capping.
Лиофилизированный препарат композиции по настоящему изобретению можно использовать в основном после восстановления путем добавления необязательного растворителя (жидкости для восстановления) и повторного растворения препарата. Такая жидкость для восстановления включает инъекционную воду, физиологический раствор и другие инфузионные жидкости. Объем восстанавливающей жидкости может варьироваться в зависимости от назначения применения, и т.д., конкретно не ограничен, и обычно составляет от 0,5 до 2-кратного объема до лиофилизации или не более чем 500 мл.The lyophilized preparation of the composition of the present invention can be used generally after reconstitution by adding an optional solvent (reconstitution liquid) and redissolving the preparation. Such recovery fluid includes injection water, saline and other infusion fluids. The volume of the reconstituting liquid may vary depending on the intended use, etc., is not particularly limited, and is generally 0.5 to 2 times the volume before lyophilization or not more than 500 ml.
Желательно контролировать вводимую дозу композиции по настоящему изобретению, принимая во внимание следующие факторы: тип и лекарственную форму антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, содержащегося в композиции, состояния пациентов, включая возраст, массу тела и т.д., способ введения, и характеристики и степень заболевания. Суточная доза, рассчитанная как количество антисмыслового олигомера по настоящему изобретению, обычно составляет от 0,1 мг до 10 г/человек и предпочтительно от 1 мг до 1 г/человек. Этот числовой диапазон может иногда меняться в зависимости от типа заболевания-мишени, способа введения и молекулы-мишени. Таким образом, в некоторых случаях может быть достаточно дозы ниже диапазона и, наоборот, иногда может потребоваться доза выше диапазона. Композицию можно вводить от одного до нескольких раз в сутки или с интервалом от одних суток до нескольких суток.It is desirable to control the administered dose of the composition of the present invention, taking into account the following factors: the type and dosage form of the antisense oligomer of the present invention contained in the composition, the conditions of the patients, including age, body weight, etc., the route of administration, and the characteristics and extent diseases. The daily dose, calculated as the amount of antisense oligomer of the present invention, is usually from 0.1 mg to 10 g/person and preferably from 1 mg to 1 g/person. This numerical range may sometimes vary depending on the type of target disease, route of administration, and target molecule. Thus, in some cases a dose below the range may be sufficient and, conversely, sometimes a dose above the range may be required. The composition can be administered one to several times a day or at intervals of one day to several days.
В другом варианте осуществления композиции по настоящему изобретению предлагается фармацевтическая композиция, содержащая вектор, способный экспрессировать олигонуклеотид по настоящему изобретению, и носитель, описанный выше. Такой экспрессирующий вектор может быть вектором, способным экспрессировать несколько олигонуклеотидов по настоящему изобретению. Композицию можно формулировать с помощью фармацевтически приемлемых добавок в виде композиции по настоящему изобретению, содержащей антисмысловый олигомер по настоящему изобретению. Концентрация экспрессирующего вектора, содержащегося в композиции, может варьироваться в зависимости от типа носителя, и т.д., и в одном из вариантов осуществления соответственно находится в диапазоне от 0,1 нМ до 100 мкМ, предпочтительно в диапазоне от 100 нМ до 10 мкМ. Массовое соотношение экспрессирующего вектора и носителя, содержащихся в композиции (носитель/экспрессирующий вектор), может варьировать в зависимости от свойств экспрессирующего вектора, типа носителя и т.д., соответственно находится в диапазоне от 0,1 до 100, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 10. Содержание носителя, содержащегося в композиции, такое же, как в случае с композицией по настоящему изобретению, содержащей антисмысловый олигомер по настоящему изобретению, и способ его получения также такой же, как и в случае с композицией по настоящему изобретению.In another embodiment, the composition of the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a vector capable of expressing an oligonucleotide of the present invention and a carrier as described above. Such an expression vector may be a vector capable of expressing multiple oligonucleotides of the present invention. The composition can be formulated with pharmaceutically acceptable additives into a composition of the present invention containing an antisense oligomer of the present invention. The concentration of the expression vector contained in the composition may vary depending on the type of carrier, etc., and in one embodiment is suitably in the range of 0.1 nM to 100 μM, preferably in the range of 100 nM to 10 μM . The weight ratio of the expression vector and the carrier contained in the composition (carrier/expression vector) may vary depending on the properties of the expression vector, the type of carrier, etc., and is suitably in the range of 0.1 to 100, preferably in the range of 0 ,1 to 10. The content of the carrier contained in the composition is the same as in the case of the composition of the present invention containing the antisense oligomer of the present invention, and the method for its preparation is also the same as in the case of the composition of the present invention.
Далее в настоящем документе настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры и примеры исследований ниже, но оно ими не ограничено.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples and research examples below, but it is not limited to them.
ПримерыExamples
Пример 1. Получение антисмыслового олигомера.Example 1. Preparation of antisense oligomer.
Согласно способу, описанному в WO 2013/100190, синтезировали антисмысловые олигомеры, показанные в табл. 1 (ФМО № 1-7 (SEQ ID NO: 2-8)), которые нацелены на частичную последовательностьAccording to the method described in WO 2013/100190, the antisense oligomers shown in table were synthesized. 1 (FMO No. 1-7 (SEQ ID NO: 2-8)), which target partial sequence
- 17 045808 оснований экзона 50 и/или соседний З'-интрон (интрон 50) в гене дистрофина человека. Полный размер каждого антисмыслового олигомера составил от 19 до 21 звеньев. Также показано теоретическое значение молекулярной массы каждого антисмыслового олигомера и ее величина, найденная путем ESI-TOFMS.- 17,045,808 bases of exon 50 and/or the adjacent 3'-intron (intron 50) in the human dystrophin gene. The total size of each antisense oligomer ranged from 19 to 21 units. The theoretical molecular weight of each antisense oligomer and its value found by ESI-TOFMS are also shown.
В табл. 1, например, Н50_109-129 представляет собой вариант, когда 5'-концевое основание экзона 50 в гене дистрофина человека считается 1-м основанием, а его нижележащие основания в 3'направлении нумеруются по порядку, антисмысловой олигомер нацелен на последовательность со 109 по 129 основание. Поскольку полноразмерный экзон 50 составляет 109 оснований, последовательность оснований со ПО по 130в целевой последовательности оснований представляет собой последовательность оснований в интроне 50 в этом примере.In table 1, for example, H50_109-129 is a variant where the 5' terminal base of exon 50 in the human dystrophin gene is considered the 1st base and its downstream bases in the 3' direction are numbered in order, the antisense oligomer targeting the sequence 109 to 129 base. Since full-length exon 50 is 109 bases, the base sequence at 130b of the target base sequence is the base sequence in intron 50 in this example.
Таблица 1Table 1
Синтезированные антисмысловые олигомеры (ФМО № 1 -7)Synthesized antisense oligomers (FMO no. 1 -7)
Пример 2. Исследование активности антисмыслового олигомера по пропуску экзона.Example 2. Study of exon skipping activity of antisense oligomer.
Тест in vitro по пропуску экзона 50 в гене дистрофина человека.In vitro test for exon 50 skipping in the human dystrophin gene.
(1) Способ исследования.(1) Research method.
С использованием набора Ашаха Cell Line Nucleofector L и Nucleofector II (Lonza) трансфицировали до 3,5xl05 клеток RD (линии клеток рабдомиосаркомы человека, CCL-136, куплены в АТСС)) от 0,1 до 1 мкМ каждого антисмыслового олигомера из табл. 1. Для трансфекции использовалась импульсная программа Т-030.Using the Asch's Cell Line Nucleofector L and Nucleofector II kit (Lonza), up to 3.5 x l0 5 RD cells (human rhabdomyosarcoma cell line, CCL-136, purchased from ATCC) were transfected with 0.1 to 1 μM of each antisense oligomer from Table. 1. For transfection, the T-030 pulse program was used.
После трансфекции клетки RD культивировали в течение трех ночей в 2 мл минимальной эссенциальной среды Игла (ЕМЕМ) (Sigma, далее в настоящем документе то же), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen) в условиях 37°С и 5% СО2.After transfection, RD cells were cultured for three nights in 2 ml of Eagle's minimal essential medium (EMEM) (Sigma, hereinafter) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen) at 37°C and 5% CO2 .
Трансфицированные клетки RD однократно отмывали PBS (Nissui, далее в настоящем документе то же) и добавляли к клеткам 350 мкл Буфера RAI (Takara Bio Inc.), содержащего 1% 2-меркаптоэтанола (Nacalai Tesque, Inc.). После того как клеткам давали постоять при комнатной температуре в течение нескольких минут для лизиса клеток, лизат собирали на фильтре NucleoSpin (зарегистрированный товарный знак) (Takara Bio Inc.). Гомогенат был получен с помощью центрифугирования при llOOOxg в течение 1 мин. Тотальную РНК экстрагировали из клетогк в соответствии с протоколом, прилагаемым к NucleoSpin RNA (зарегистрированный товарный знак) (Takara Bio Inc.). Концентрация выделенной тотальной РНК определяли с использованием NanoDrop ONE (Thermo Fisher Scientific Inc.).Transfected RD cells were washed once with PBS (Nissui, hereinafter) and 350 μl of RAI Buffer (Takara Bio Inc.) containing 1% 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque, Inc.) was added to the cells. After the cells were allowed to stand at room temperature for several minutes to lyse the cells, the lysate was collected on a NucleoSpin (registered trademark) filter (Takara Bio Inc.). The homogenate was obtained by centrifugation at llOOOxg for 1 min. Total RNA was extracted from cells according to the protocol supplied with NucleoSpin RNA (registered trademark) (Takara Bio Inc.). The concentration of isolated total RNA was determined using NanoDrop ONE (Thermo Fisher Scientific Inc.).
Одностадийную ОТ-ПЦР проводили с 400 нг выделенной тотальной РНК с использованием набора QIAGEN One Step RT-PCR (Qiagen) и термоциклера. Реакционный раствор получали в соответствии с протоколом, приложенным к набору. Использовали термоциклер TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio Inc.). Использовали следующую программу ОТ-ПЦР.One-step RT-PCR was performed on 400 ng of isolated total RNA using the QIAGEN One Step RT-PCR kit (Qiagen) and a thermal cycler. The reaction solution was prepared according to the protocol included with the kit. A TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch (Takara Bio Inc.) was used. The following RT-PCR program was used.
50°С, 30 мин: реакция обратной транскрипции;50°C, 30 min: reverse transcription reaction;
95°С, 15 мин: активация полимеразы, инактивация обратной транскриптазы, термоденатурация кДНК;95°C, 15 min: polymerase activation, reverse transcriptase inactivation, cDNA thermal denaturation;
94°С, 30 с; 60°С, 30 с; 72°С, 1 мин]х35 циклов: амплификация ПНР;94°C, 30 s; 60°C, 30 s; 72°C, 1 min]x35 cycles: PNR amplification;
72°С, 10 мин: финальное удлинение;72°C, 10 min: final extension;
Последовательности оснований прямого праймера и обратного праймера, используемые для ОТПЦР, приведены ниже.The base sequences of forward primer and reverse primer used for RTPCR are given below.
Прямой праймер: 5'-AACAACCGGATGTGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 9)Forward primer: 5'-AACAACCGGATGTGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 9)
Обратный праймер: 5'-TTGGAGATGGCAGTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 10).Reverse primer: 5'-TTGGAGATGGCAGTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 10).
- 18 045808 мкл продукт реакции ПЦР выше анализировали с использованием биоанализатора (Agilent Technologies, Inc.) и MultiNA (Shimadzu Corp).- 18045808 µl of the PCR reaction product above was analyzed using a Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) and MultiNA (Shimadzu Corp).
Уровень полинуклеотида в полосе, показывающей, что экзон 50 был пропущен (уровень полинуклеотида А), и уровень полинуклеотида в полосе, показывающей, что экзон 50 не был пропущен (уровень полинуклеотида В), измеряли как интенсивности сигналов полос. На основании этих измеренных значений А и В, оценивали эффективность пропуска по уравнению (1), упомянутому выше.The level of polynucleotide in the band indicating that exon 50 was skipped (polynucleotide A level) and the polynucleotide level in the band indicating that exon 50 was not skipped (polynucleotide B level) were measured as signal intensities of the bands. Based on these measured values of A and B, the skip efficiency was estimated using equation (1) mentioned above.
) Результаты исследований.) Research results.
На фиг. 1-3 показаны результаты относительно эффективности пропуска экзона 50, полученной по каждому антисмысловому олигомеру. В табл. 2-4 ниже показано значение эффективной концентрации (EC50), при которой каждый антисмысловой олигомер проявляет 50% эффективность пропуска ES, которую рассчитывали из этих результатов. Это исследование показало, что ФМО № 1-4 среди антисмысловых олигомеров имели высокую эффективность пропуска ES и низкое значение EC50 и, таким образом, эффективно вызывали пропуск экзона 50.In fig. 1-3 show the results regarding the exon 50 skipping efficiency obtained for each antisense oligomer. In table 2-4 below shows the effective concentration (EC 50 ) at which each antisense oligomer exhibits 50% ES skip efficiency, which was calculated from these results. This study showed that FMOs #1-4 among antisense oligomers had high ES skipping efficiency and low EC 50 value and thus effectively caused exon 50 skipping.
Среди антисмысловых олигомеров с полноразмерной длиной 19 звеньев, как в ФМО № 3 и 4, ФМО № 5-7 имели низкую эффективность пропуска и высокое значение EC50. Также велика степень перекрытия между последовательностями оснований, на которые нацелены ФМО № 3 и 4 и ФМО № 5-7. Таким образом, заметна эффективность ФМО № 3 и 4 для пропуска экзона 50.Among antisense oligomers with a full-length length of 19 units, as in FMOs No. 3 and 4, FMOs No. 5-7 had low pass efficiency and a high EC 50 value. There is also a high degree of overlap between the base sequences targeted by FMOs #3 and 4 and FMOs #5–7. Thus, the effectiveness of FMOs No. 3 and 4 for skipping exon 50 is noticeable.
Эти результаты показали, что антисмысловой олигомер по настоящему изобретению, даже если его длина коротка по сравнению с известным уровнем техники, может индуцировать пропуск экзона 50 с высокой эффективностью.These results showed that the antisense oligomer of the present invention, even if its length is short compared with the prior art, can induce exon 50 skipping with high efficiency.
Пример 3. Исследование растворимости антисмыслового олигомера. Исследование растворимости антисмыслового олигомера в физиологическом растворе.Example 3. Solubility study of antisense oligomer. Study of the solubility of antisense oligomer in physiological solution.
Среди антисмысловых олигомеров с высокой эффективностью пропуска ES в примере 2, каждый антисмысловой олигомер ФМО № 2, 3 и 4, который имел полную длину от от 19 до 20 нуклеотидов и был синтезирован подходящим способом, тестировали на его растворимость в физиологическом растворе для того, чтобы дополнительно подтвердить полезность для медицинского применения.Among the antisense oligomers with high ES skipping efficiency in Example 2, each antisense oligomer FMO No. 2, 3 and 4, which had a total length of 19 to 20 nucleotides and was synthesized by a suitable method, was tested for its solubility in saline in order to further confirm its usefulness for medical use.
(1) Способ исследования.(1) Research method.
мкл физиологического раствора добавляли в бутылку для образцов, содержащую 4,5 мг каждого антисмыслового олигомера выше, и перемешивали с использованием ультразвуковых волн и вортекса для приготовления 100 мг/мл физиологического раствора. Последовательность, которая не вызывала осаждения при комнатной температуре в течение 24 ч, оценивали как имеющую высокую растворимость.μL of saline was added to a sample bottle containing 4.5 mg of each antisense oligomer above and mixed using ultrasonic waves and vortex to prepare 100 mg/mL of saline. A sequence that did not cause precipitation at room temperature within 24 hours was judged to have high solubility.
(2) Результаты исследований.(2) Research results.
Все исследованные антисмысловые олигомеры показали растворимость, равную или превышающую 100 мг/мл в физиологическом растворе. Эти антисмысловые олигомеры являются антисмысловыми олигомерами, в высшей степени полезными в качестве лекарственных средств из-за их высокой эффективности по пропуску экзона 50, а также высокой растворимости в физиологических растворах.All antisense oligomers tested showed solubility equal to or greater than 100 mg/ml in saline. These antisense oligomers are antisense oligomers that are highly useful as drugs due to their high exon 50 skipping efficiency as well as high solubility in physiological solutions.
Эти результаты демонстрируют, что антисмысловой олигомер по настоящему изобретению имеетThese results demonstrate that the antisense oligomer of the present invention has
--
Claims (17)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019-236704 | 2019-12-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA045808B1 true EA045808B1 (en) | 2023-12-27 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2020200679B2 (en) | Antisense nucleic acids | |
JP6977998B2 (en) | Antisense nucleic acid | |
JP6208349B2 (en) | Antisense nucleic acid | |
JP7292636B2 (en) | Antisense nucleic acid that induces exon 51 skipping | |
US11655472B2 (en) | Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50 | |
EA045808B1 (en) | ANTISENSE NUCLEIC ACID THAT INDUCES EXON 50 SKIPPLING |