EA045759B1 - MONOCLONAL ANTIBODIES TO SIRPα AND THEIR APPLICATIONS - Google Patents

MONOCLONAL ANTIBODIES TO SIRPα AND THEIR APPLICATIONS Download PDF

Info

Publication number
EA045759B1
EA045759B1 EA202291928 EA045759B1 EA 045759 B1 EA045759 B1 EA 045759B1 EA 202291928 EA202291928 EA 202291928 EA 045759 B1 EA045759 B1 EA 045759B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
cancer
Prior art date
Application number
EA202291928
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Жуньшэн Ли
Original Assignee
Ланова Медисинс Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ланова Медисинс Лимитед filed Critical Ланова Медисинс Лимитед
Publication of EA045759B1 publication Critical patent/EA045759B1/en

Links

Description

Уровень техникиState of the art

Сигнальный регуляторный белок альфа (SIRPa) является членом семейства сигнальных регуляторных белков (SIRP), а также относится к суперсемейству иммуноглобулинов. Члены семейства SIRP представляют собой трансмембранные гликопротеины рецепторного типа, которые, как известно, участвуют в отрицательной регуляции процессов сигнализации, связанных с рецепторной тирозинкиназой. SIRPa может быть фосфорилирован тирозинкиназами. Было показано, что фосфотирозиновые остатки этой РТР рекрутируют SH2-содержащие протеинтирозинфосфатазы (РТР) и служат субстратами РТР. Было обнаружено, что SIRPa участвует в передаче сигнала, опосредованной различными рецепторами фактора роста. Было продемонстрировано, что CD47 является лигандом. SIRPa имеет очень высокое сходство с несколькими другими членами семейства SIRP. SIRPa экспрессируется главным образом миелоидными клетками, а также стволовыми клетками или нейронами.Signal regulatory protein alpha (SIRPa) is a member of the signal regulatory protein (SIRP) family and also belongs to the immunoglobulin superfamily. Members of the SIRP family are receptor-type transmembrane glycoproteins known to be involved in the negative regulation of receptor tyrosine kinase-related signaling. SIRPa can be phosphorylated by tyrosine kinases. The phosphotyrosine residues of this PTP have been shown to recruit SH2-containing protein tyrosine phosphatases (PTPs) and serve as PTP substrates. SIRPa has been found to be involved in signal transduction mediated by various growth factor receptors. CD47 has been demonstrated to be a ligand. SIRPa has very high similarity to several other members of the SIRP family. SIRPa is expressed primarily by myeloid cells, but also by stem cells or neurons.

SIRPa выполняет функцию ингибирующего рецептора и взаимодействует с широко экспрессируемым трансмембранным белком CD47, также называемым сигналом не ешь меня. Это взаимодействие отрицательно регулирует эффекторную функцию клеток врожденной иммунной системы, такую как фагоцитоз клеток-хозяев. SIRPa латерально диффундирует на мембрану макрофага и накапливается в фагоцитарном синапсе для связывания CD47 и сигнала свой, который ингибирует цитоскелетинтенсивный процесс фагоцитоза макрофагом.SIRPa functions as an inhibitory receptor and interacts with the widely expressed transmembrane protein CD47, also called the don't eat me signal. This interaction negatively regulates the effector function of innate immune cells, such as phagocytosis of host cells. SIRPa diffuses laterally onto the macrophage membrane and accumulates at the phagocytic synapse to bind CD47 and signal its own, which inhibits the cytoskeleton-intensive process of phagocytosis by the macrophage.

При лигировании CD47 SIRPa фосфорилируется и рекрутирует фосфатазы, такие как SHP1 и SHP2. Внеклеточная область содержит три домена суперсемейства иммуноглобулинов - один домен V-set и два домена C1-set IgSF. SIRPe и γ имеют схожую внеклеточную структуру, но разные цитоплазматические области, дающие противоположные типы сигналов.Upon CD47 ligation, SIRPa is phosphorylated and recruits phosphatases such as SHP1 and SHP2. The extracellular region contains three domains of the immunoglobulin superfamily - one V-set domain and two C1-set domains of IgSF. SIRPe and γ have similar extracellular structures but different cytoplasmic regions that produce opposing types of signals.

SIRPa распознает CD47 - антифагоцитарный сигнал, который отличает живые клетки от умирающих клеток. Внеклеточный домен SIRPa связывается с CD47 и передает внутриклеточные сигналы через свой цитоплазматический домен. Связывание CD47 опосредовано через NH2-концевой V-подобный домен SIRPa.SIRPa recognizes CD47, an antiphagocytic signal that distinguishes living cells from dying cells. The extracellular domain of SIRPa binds to CD47 and transmits intracellular signals through its cytoplasmic domain. CD47 binding is mediated through the NH2-terminal V-like domain of SIRPa.

Цитоплазматическая область содержит четыре ITIM, которые становятся фосфорилированными после связывания лиганда. Фосфорилирование опосредует активацию тирозинкиназы SHP2. SIRPa также связывает фосфатазу SHP1, адаптерный белок SCAP2 и FYN-связывающий белок. Рекрутинг к мембране фосфатаз SHP приводит к ингибированию накопления миозина на поверхности клетки и обеспечивает ингибирование фагоцитоза.The cytoplasmic region contains four ITIMs that become phosphorylated upon ligand binding. Phosphorylation mediates the activation of the SHP2 tyrosine kinase. SIRPa also binds the phosphatase SHP1, the adapter protein SCAP2 and the FYN-binding protein. Recruitment of SHP phosphatases to the membrane leads to inhibition of myosin accumulation on the cell surface and provides inhibition of phagocytosis.

Раковые клетки на высоком уровне экспрессируют CD47, который активирует SIRPa и ингибирует опосредованное макрофагами разрушение. Было показано, что высокоаффинные варианты SIRPa, которые антагонизировали CD47 на раковых клетках, увеличивали фагоцитоз раковых клеток. Было также показано, что антитела к SIRPa помогают макрофагам снижать рост и метастазирование рака, по отдельности и синергически с другими способами лечения рака.Cancer cells express CD47 at high levels, which activates SIRPa and inhibits macrophage-mediated destruction. High-affinity variants of SIRPa that antagonized CD47 on cancer cells were shown to increase phagocytosis of cancer cells. Anti-SIRPa antibodies have also been shown to help macrophages reduce cancer growth and metastasis, alone and synergistically with other cancer treatments.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

В настоящей заявке предложены антитела к SIRPa, которые обладают высокой аффинностью к обоим вариантам v1 и v2, способны дозозависимо и эффективно блокировать взаимодействие между SIRPa и CD47 и эффективно индуцируют опосредованный макрофагами фагоцитоз клеток, экспрессирующих CD47. В отличие от них известные антитела к SIRPa способны распознавать только вариант 1.The present application provides anti-SIRPa antibodies that have high affinity for both v1 and v2 variants, are capable of dose-dependently and effectively blocking the interaction between SIRPa and CD47, and effectively induce macrophage-mediated phagocytosis of CD47-expressing cells. In contrast, known antibodies to SIRPa are capable of recognizing only variant 1.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где (а) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 21 или 22, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (b) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, 36, 37 или 38, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (с) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 53 или 54, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; (d) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64, CDRH3 содержит амиAccording to one embodiment, the present invention provides an antibody or fragment thereof having binding specificity for wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein (a) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 21 or 22, CDRH3 contains the amino acid sequence the sequence is SEQ ID NO: 17, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; (b) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, 36, 37 or 38, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35; (c) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, 53 or 54, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, CDRL2 contains the amino acid sequence the sequence is SEQ ID NO: 51 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52; (d) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, CDRH3 contains amy

- 1 045759 нокислотную последовательность SEQ ID NO: 65, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; (е) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82; (f) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; или (g) CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108.- 1045759 the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68; (e) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 79, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 80, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 81 and CDRL3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 82; (f) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 94, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 95 and CDRL3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 96; or (g) CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108.

В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 21 или 22, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.In one embodiment, the present invention provides an antibody or fragment thereof having binding specificity for wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 21 or 22, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23-27, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23-27.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 23-27, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 1 and 23-27.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 28-29, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 28-29.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 and 28-29, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 2 and 28-29.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.In some embodiments, the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

В еще одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, 36, 37 или 38, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.In yet another embodiment, there is provided an antibody or fragment thereof having binding specificity for wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, 36, 37 or 38, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 и 39-44, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 и 39-44.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 and 39-44, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 3 and 39-44.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 45-46, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 45-46.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 and 45-46, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 4 and 45-46.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.In some embodiments, the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.

В еще одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комIn yet another embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region containing the defining com

- 2 045759 плементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 53 или 54, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.- 2 045759 tribalism of the heavy chain regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: : 48, 53 or 54, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и 55-60, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и 55-60.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 and 55-60, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 5 and 55-60.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и 61-62, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и 61-62.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 and 61-62, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 6 and 61-62.

В некоторых вариантах реализации антитело или фрагмент, раскрытые в настоящей заявке, способны связываться с вариантом 1 и вариантом 2 SIRPa. В некоторых вариантах реализации антитело или фрагмент являются гуманизированными. В некоторых вариантах реализации антитело или фрагмент, раскрытые в настоящей заявке, дополнительно обладают специфичностью связывания со вторым белком-мишенью.In some embodiments, an antibody or fragment disclosed herein is capable of binding to SIRPa variant 1 and variant 2. In some embodiments, the antibody or fragment is humanized. In some embodiments, an antibody or fragment disclosed herein additionally has binding specificity for a second target protein.

Также в некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие антитело или его фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно содержит второе антитело, обладающее специфичностью к опухолевому антигену. В некоторых вариантах реализации второе антитело представляет собой опухоль-опсонизирующее антитело.Also provided in some embodiments are compositions comprising an antibody or fragment thereof and a pharmaceutically acceptable carrier. In some embodiments, the composition further comprises a second antibody having specificity for a tumor antigen. In some embodiments, the second antibody is a tumor opsonizing antibody.

Также предложены способы и применения для лечения заболеваний и состояний. В одном варианте реализации предложен способ лечения рака у нуждающегося в этом пациента, включающий введение указанному пациенту антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению.Methods and uses for treating diseases and conditions are also provided. In one embodiment, there is provided a method of treating cancer in a patient in need thereof, comprising administering to said patient an antibody or fragment thereof of the present invention.

Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials

На фиг. 1 показано перекрестное связывание SIRPa v1 и v2 антителами.In fig. Figure 1 shows cross-linking of SIRPa v1 and v2 antibodies.

На фиг. 2 показана аффинность связывания антитела к SIRPa v1.In fig. 2 shows the binding affinity of the antibody to SIRPa v1.

На фиг. 3 показана конкуренция антител с CD47 за взаимодействие с SIRPa.In fig. Figure 3 shows the competition of antibodies with CD47 for interaction with SIRPa.

На фиг. 4 показана индукция антителами опосредованного макрофагами фагоцитоза.In fig. Figure 4 shows antibody induction of macrophage-mediated phagocytosis.

На фиг. 5 показано увеличение опосредованного макрофагами фагоцитоза опухолевых клеток за счет обработки антителами.In fig. Figure 5 shows an increase in macrophage-mediated phagocytosis of tumor cells due to antibody treatment.

На фиг. 6 представлены визуализации организмов животных и диаграммы, демонстрирующие, что 03-hz51 синергически взаимодействовало с ритуксимабом, вызывая полное ингибирование роста опухоли на модели лимфомы Raji.In fig. Figure 6 shows animal renderings and diagrams demonstrating that 03-hz51 interacted synergistically with rituximab to cause complete inhibition of tumor growth in a model of Raji lymphoma.

Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention

ОпределенияDefinitions

Следует отметить, что термин в единственном числе относится к одному или более выраженным таким термином объектам; например, под антителом подразумевается одно или более антител. Соответственно, термины в единственном числе, один или более и по меньшей мере один в настоящей заявке могут использоваться взаимозаменяемо.It should be noted that a term in the singular refers to one or more objects expressed by such a term; for example, by antibody is meant one or more antibodies. Accordingly, the terms singular, one or more, and at least one may be used interchangeably herein.

В контексте настоящей заявки подразумевается, что термин полипептид охватывает полипептид в единственном числе, а также множество полипептидов, и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин полипептид относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот, и не относится к определенной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, белок, аминокислотная цепь или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, охватываются определением полипептид, и термин полипептид может использоваться вместо любого из этих терминов или взаимозаменяемо с ним. Также подразумевается, что термин полипептид относится к продуктам постэкспрессионных модификаций полипептида, в том числе, не ограничиваясь перечисленным, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолиза или модификации аминокислотами неприродного происхождения. Полипептид может происходить из естественного биологического источника или быть получен с помощью рекомбинантной технологии, однако он не обязательно транслирован с заданной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.As used herein, the term polypeptide is intended to include the singular polypeptide as well as a plurality of polypeptides, and refers to a molecule consisting of monomers (amino acids) linearly linked by amide bonds (also known as peptide bonds). The term polypeptide refers to any chain or chains of two or more amino acids, and does not refer to a specific length of product. Thus, peptides, dipeptides, tripeptides, oligopeptides, protein, amino acid chain, or any other term used to designate a chain or chains of two or more amino acids are covered by the definition of polypeptide, and the term polypeptide may be used in place of or interchangeably with any of these terms . The term polypeptide is also intended to refer to the products of post-expression modifications of the polypeptide, including, but not limited to, glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting/blocking groups, proteolysis, or modification with non-naturally occurring amino acids. The polypeptide may be derived from a natural biological source or produced by recombinant technology, but is not necessarily translated from a given nucleic acid sequence. It can be obtained by any method, including chemical synthesis.

Гомология, или идентичность, или сходство относится к сходству последовательностей двух пептидов или двух молекул нуклеиновой кислоты. Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которые для целей сравнения могут быть выравнены. КогдаHomology or identity or similarity refers to the sequence similarity of two peptides or two nucleic acid molecules. Homology can be determined by comparing positions in each sequence, which can be aligned for comparison purposes. When

- 3 045759 положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием или аминокислотой, молекулы в этом положении гомологичны. Степень гомологии последовательностей зависит от количества совпадающих или гомологичных положений, общих для последовательностей. Неродственная или негомологичная последовательность идентична менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 25%, одной из последовательностей согласно настоящему изобретению.- 3 045759 the position in the compared sequence is occupied by the same base or amino acid, the molecules in this position are homologous. The degree of sequence homology depends on the number of matching or homologous positions shared by the sequences. An unrelated or non-homologous sequence is less than 40% identical, preferably less than 25%, identical to one of the sequences according to the present invention.

Если полинуклеотид или полинуклеотидная область (или полипептид или полипептидная область) имеет определенный процент (например, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) идентичности последовательностей с другой последовательностью, это означает, что при выравнивании последовательностей этот процент оснований (или аминокислот) при сравнении двух последовательностей является одинаковым.If a polynucleotide or polynucleotide region (or polypeptide or polypeptide region) has a certain percentage (for example, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or 99%) of sequence identity with another sequence, this means that in a sequence alignment, that percentage of bases (or amino acids) when comparing the two sequences is the same.

Термин эквивалентная нуклеиновая кислота или полинуклеотид относится к нуклеиновой кислоте, имеющей нуклеотидную последовательность с некоторой степенью гомологии или идентичности нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты или ее комплемента. Подразумевается, что гомолог двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает нуклеиновые кислоты с нуклеотидной последовательностью, которая в некоторой степени гомологична ей или ее комплементу. В одном аспекте гомологи нуклеиновых кислот способны гибридизоваться с нуклеиновой кислотой или ее комплементом. Аналогичным образом эквивалентный полипептид относится к полипептиду с некоторой степенью гомологии или идентичности аминокислотной последовательности референсного полипептида. В некоторых аспектах идентичность последовательностей составляет по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%. В некоторых аспектах эквивалентный полипептид или полинуклеотид содержит одну, две, три, четыре или пять вставок, делеций, замен и их комбинаций по сравнению с референсным полипептидом или полинуклеотидом. В некоторых аспектах эквивалентная последовательность сохраняет активность (например, связывание с эпитопом) или структуру (например, солевой мостик) референсной последовательности.The term equivalent nucleic acid or polynucleotide refers to a nucleic acid having a nucleotide sequence with some degree of homology or identity to the nucleotide sequence of the nucleic acid or its complement. A double-stranded nucleic acid homolog is intended to include nucleic acids with a nucleotide sequence that is somewhat homologous to it or its complement. In one aspect, nucleic acid homologues are capable of hybridizing with a nucleic acid or its complement. Likewise, an equivalent polypeptide refers to a polypeptide with some degree of homology or amino acid sequence identity to the reference polypeptide. In some aspects, the sequence identity is at least about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99%. In some aspects, the equivalent polypeptide or polynucleotide contains one, two, three, four, or five insertions, deletions, substitutions, and combinations thereof compared to the reference polypeptide or polynucleotide. In some aspects, the equivalent sequence retains the activity (eg, epitope binding) or structure (eg, salt bridge) of the reference sequence.

В контексте настоящей заявки антитело или антигенсвязывающий полипептид относится к полипептиду или полипептидному комплексу, который специфичным образом распознает антиген и связывается с ним. Антитело может представлять собой целое антитело и любой антигенсвязывающий фрагмент или одну его цепь. Таким образом, термин антитело включает любую молекулу, содержащую белок или пептид, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, обладающую биологической активностью связывания с антигеном. Их примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, определяющий комплементарность участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный (FR) участок, или любую их часть, или по меньшей мере одну часть связывающего белка.As used herein, an antibody or antigen-binding polypeptide refers to a polypeptide or polypeptide complex that specifically recognizes and binds to an antigen. The antibody can be the whole antibody and any antigen binding fragment or one chain thereof. Thus, the term antibody includes any protein or peptide-containing molecule that contains at least a portion of an immunoglobulin molecule having antigen binding biological activity. Examples thereof include, but are not limited to, a heavy or light chain complementarity determining region (CDR) or a ligand binding portion thereof, a heavy chain or light chain variable region, a heavy chain or light chain constant region, a framework (FR) region, or any portion thereof, or at least one part of the binding protein.

Термины фрагмент антитела или антигенсвязывающий фрагмент в контексте настоящей заявки представляют собой часть антитела, такую как F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv и тому подобное. Независимо от структуры фрагмент антитела связывается с тем же антигеном, который распознается интактным антителом. Термин фрагмент антитела включает аптамеры, шпигельмеры и диатела. Термин фрагмент антитела также включает любой синтетический или генетически модифицированный белок, действующий как антитело, связываясь с определенным антигеном с образованием комплекса.The terms antibody fragment or antigen binding fragment as used herein are a portion of an antibody such as F(ab') 2 , F(ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv and the like. Regardless of structure, the antibody fragment binds to the same antigen that is recognized by the intact antibody. The term antibody fragment includes aptamers, spiegelmers and diabodies. The term antibody fragment also includes any synthetic or genetically modified protein that acts as an antibody by binding to a specific antigen to form a complex.

Одноцепочечный вариабельный фрагмент или scFv относится к слитому белку вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей иммуноглобулинов. В некоторых аспектах области соединены коротким линкерным пептидом длиной от 10 до приблизительно 25 аминокислот. Линкер может иметь высокое содержание глицина для гибкости, а также серина или треонина для растворимости, и может либо соединять N-конец VH с С-концом VL, либо наоборот. Этот белок сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление константных областей и введение линкера. Молекулы scFv известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 5892019.Single chain variable fragment or scFv refers to a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light ( VL ) chains of immunoglobulins. In some aspects, the regions are connected by a short linker peptide ranging from 10 to about 25 amino acids in length. The linker may be high in glycine for flexibility and serine or threonine for solubility, and can either connect the N-terminus of VH to the C-terminus of VL or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin despite the removal of constant regions and the introduction of a linker. scFv molecules are known in the art and are described, for example, in US Pat. No. 5,892,019.

Термин антитело охватывает различные широкие классы полипептидов, которые являются биохимически различимыми. Специалистам в данной области техники известно, что тяжелые цепи подразделяют на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε), среди которых также есть несколько подклассов (например, γ1-γ4). Именно природа этой цепи определяет класс антитела как IgG, IgM, IgA IgG или IgE соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно, придают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко различимы специалистом в данной области техники с учетом настоящего описания и, соответственно, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Все классы иммуноглобулинов со всей ясностью находятся в пределах объема настоящего изобретения, при этом последующее обсуждение будет большей частью касаться класса IgG молекул иммуноглобулинов. Что касается IgG, стандартная молекула иммуноглобулина содержит два идентичных полипептида легкой цепи молекулярной массой приблизительно 23000 Да и два идентичных полипептида тяжелой цепи молекулярной массой 53000-70000. Четыре цепи, как правило, соединены дисульфидными связями в конфигурацию Y, где легкие цепи заключают в себе тяжелые цепи, начинающиесяThe term antibody covers various broad classes of polypeptides that are biochemically distinct. Those skilled in the art will recognize that heavy chains are classified into gamma, mu, alpha, delta or epsilon (γ, μ, α, δ, ε), of which there are also several subclasses (eg, γ1-γ4). It is the nature of this chain that determines the class of the antibody as IgG, IgM, IgA IgG or IgE, respectively. Subclasses (isotypes) of immunoglobulins, such as IgG1, IgG2, IgG3 , IgG4, IgG5 , etc., are well characterized and are known to confer functional specialization. Modified versions of each of these classes and isotypes are readily discernible by one skilled in the art given the present disclosure and are accordingly within the scope of the present invention. All classes of immunoglobulins are clearly within the scope of the present invention, and the following discussion will largely concern the IgG class of immunoglobulin molecules. For IgG, a standard immunoglobulin molecule contains two identical light chain polypeptides with a molecular weight of approximately 23,000 Da and two identical heavy chain polypeptides with a molecular weight of 53,000-70,000. The four chains are typically linked by disulfide bonds in a Y configuration, where the light chains enclose the heavy chains starting

- 4 045759 в устье Y и продолжающиеся через вариабельную область.- 4 045759 at the mouth of Y and continuing through the variable region.

Антитела, антигенсвязывающие полипептиды, их варианты или производные согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, поликлональные, моноклональные, мультиспецифичные, человеческие, гуманизированные, приматизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab')2, Fd, Fvs, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fvs (sdFv), фрагменты, содержащие домен VK или VH, фрагменты, полученные с помощью экспрессионной библиотеки Fab-фрагментов, и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id-антитела к антителам LIGHT, раскрытым в настоящей заявке). Молекулы иммуноглобулинов или антител согласно настоящему изобретению могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.Antibodies, antigen-binding polypeptides, variants or derivatives thereof of the present invention include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, multispecific, human, humanized, primatized or chimeric antibodies, single chain antibodies, epitope-binding fragments, for example, Fab, Fab' and F( ab')2, Fd, Fvs, single-chain Fvs (scFv), single-chain antibodies, disulfide-linked Fvs (sdFv), VK or VH domain-containing fragments, Fab expression library-derived fragments, and anti-idiotypic (anti- Id) antibodies (including, for example, anti-Id antibodies to the LIGHT antibodies disclosed herein). The immunoglobulin or antibody molecules of the present invention can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass of the immunoglobulin molecule.

Легкие цепи подразделяют на каппа или лямбда (K, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан с легкой каппа- или лямбда-цепью. Как правило, легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, а хвостовые части двух тяжелых цепей связываются друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда молекулы иммуноглобулинов вырабатываются гибридомами, В-клетками или генетически модифицированными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от N-конца на раздвоенных концах Y-образной конфигурации до С-конца в нижней части каждой цепи.Light chains are classified as kappa or lambda (K, λ). Each class of heavy chain can be associated with a kappa or lambda light chain. Typically, the light and heavy chains are covalently linked to each other, and the tail portions of the two heavy chains are linked to each other by covalent disulfide bonds or non-covalent bonds when immunoglobulin molecules are produced by hybridomas, B cells or genetically modified host cells. In the heavy chain, the amino acid sequences run from the N-terminus at the bifurcated ends in a Y-shaped configuration to the C-terminus at the bottom of each chain.

Как легкие, так и тяжелые цепи делятся на области структурной и функциональной гомологии. Термины константный и вариабельный используются в отношении функции. В этой связи следует понимать, что вариабельные домены частей как легкой (VK), так и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание антигена и специфичность. Напротив, константные домены легкой цепи (CK) и тяжелой цепи (CH1, CH2 или СН3) придают важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарный перенос, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента и тому подобное. Принято, что номера доменов константной области возрастают при удалении от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. N-концевая часть является вариабельной областью, а C-концевая часть является константной областью; домены СН3 и CK фактически содержат карбоксиконец тяжелой и легкой цепей, соответственно.Both light and heavy chains are divided into regions of structural and functional homology. The terms constant and variable are used in relation to a function. In this regard, it should be understood that the variable domains of both the light (VK) and heavy (VH) chain portions determine antigen recognition and specificity. In contrast, the light chain (CK) and heavy chain constant domains (CH1, CH2 or CH3) confer important biological properties such as secretion, transplacental transport, Fc receptor binding, complement fixation and the like. It is accepted that the numbers of constant region domains increase with distance from the antigen-binding site or amino terminus of the antibody. The N-terminal portion is the variable region and the C-terminal portion is the constant region; the CH3 and CK domains actually contain the carboxy terminus of the heavy and light chains, respectively.

Как указано выше, вариабельная область позволяет антителу селективно распознавать и специфичным образом связывать эпитопы на антигенах. То есть, домен VK и домен VH, или подмножество определяющих комплементарность участков (CDR) антитела объединяются, образуя вариабельную область, которая определяет трехмерный антигенсвязывающий сайт. Эта четвертичная структура антитела образует антигенсвязывающий сайт, присутствующий на конце каждого плеча Y. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя CDR на каждой из VH- и VK-цепей (т.е. CDR-H1, CDR-H2, CDRH3, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3). В некоторых случаях, например, в определенных молекулах иммуноглобулинов, происходящих из верблюдовых или полученных на основе иммуноглобулинов верблюдовых с помощью генной инженерии, полная молекула иммуноглобулина может состоять только из тяжелых цепей без легких цепей. См., например, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448(1993).As stated above, the variable region allows the antibody to selectively recognize and specifically bind epitopes on antigens. That is, the VK domain and the VH domain, or a subset of complementarity determining regions (CDRs), of an antibody combine to form a variable region that defines a three-dimensional antigen-binding site. This quaternary antibody structure forms an antigen binding site present at the end of each Y arm. More specifically, the antigen binding site is defined by three CDRs on each of the VH and VK chains (i.e. CDR-H1, CDR-H2, CDRH3, CDR-L1 , CDR-L2 and CDR-L3). In some cases, such as certain immunoglobulin molecules derived from camelids or genetically engineered from camelid immunoglobulins, the complete immunoglobulin molecule may consist of only heavy chains and no light chains. See, for example, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

Во встречающихся в природе антителах шесть определяющих комплементарность участков или CDR, присутствующих в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, расположенные особым образом, образуя антигенсвязывающий домен при принятии антителом его трехмерной конфигурации в водной среде. Остальные аминокислоты в антигенсвязывающих доменах, называемые каркасными участками, демонстрируют меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные участки в основном принимают конформацию β-листа, а CDR образуют петли, которые соединяют, а в некоторых случаях являются частью структуры β-листа. Таким образом, каркасные участки формируют каркас, который обеспечивает расположение CDR в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий домен, образованный занявшими свои положения CDR, определяет поверхность, комплементарную эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с распознанным эпитопом. Аминокислоты, составляющие CDR и каркасные участки, соответственно, могут быть легко установлены для любой отдельно взятой вариабельной области тяжелой или легкой цепи специалистом в данной области техники, поскольку они были точно определены (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987)).In naturally occurring antibodies, the six complementarity determining regions, or CDRs, present in each antigen binding domain are short, non-contiguous sequences of amino acids arranged in a specific manner to form the antigen binding domain when the antibody assumes its three-dimensional configuration in an aqueous environment. The remaining amino acids in the antigen-binding domains, called framework regions, exhibit less intermolecular variability. The framework regions generally adopt a β-sheet conformation, and the CDRs form loops that connect, and in some cases are part of, the β-sheet structure. Thus, the framework regions form a framework that ensures that the CDRs are positioned in the correct orientation through interchain non-covalent interactions. The antigen-binding domain, formed by the CDRs that occupy their positions, defines a surface complementary to the epitope on the immunoreactive antigen. This complementary surface facilitates non-covalent binding of the antibody to the recognized epitope. The amino acids constituting the CDRs and framework regions, respectively, can be easily determined for any given heavy or light chain variable region by one skilled in the art since they have been precisely determined (see Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); and Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987)).

В случае, когда существует два или более определений термина, который используется и/или принят в данной области техники, подразумевается, что определение термина, используемое в настоящей заявке, включает все такие значения, если явно не указано иное. Конкретным примером является использование термина определяющий комплементарность участок (CDR) для описания несмежных антигенсвязывающих сайтов, присутствующих в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Этот конкретный участок был описан в источниках Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) и Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917In the event that there are two or more definitions of a term that is used and/or accepted in the art, the definition of the term used in this application is intended to include all such meanings unless expressly stated otherwise. A specific example is the use of the term complementarity determining region (CDR) to describe non-contiguous antigen binding sites present in the variable region of both heavy and light chain polypeptides. This particular site has been described by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) and Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917

- 5 045759 (1987), полностью включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Определения CDR по Kabat и Chothia включают перекрывающиеся или подмножества аминокислотных остатков при сравнении друг с другом. Тем не менее, подразумевается, что использование любого из определений в контексте CDR антитела или его вариантов находится в рамках этого термина, как определено и используется в настоящей заявке. Сравнение соответствующих аминокислотных остатков, включающих CDR, как определено в каждом из приведенных выше источников, приведено в таблице ниже. Точные номера остатков, включающих конкретный CDR, будут варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области техники могут рутинным образом определять, какие остатки образуют конкретный CDR, при известной аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.- 5 045759 (1987), incorporated herein by reference in its entirety. The Kabat and Chothia definitions of CDRs include overlapping or subsets of amino acid residues when compared to each other. However, the use of any of the terms in the context of a CDR antibody or variants thereof is intended to be within the scope of that term as defined and used herein. A comparison of the corresponding amino acid residues comprising the CDRs as defined in each of the above references is shown in the table below. The exact residue numbers comprising a particular CDR will vary depending on the sequence and size of the CDR. Those skilled in the art can routinely determine which residues form a particular CDR given the known amino acid sequence of the antibody variable region.

Kabat Kabat Chothia Chothia CDR-H1 CDR-H1 31-35 31-35 26-32 26-32 CDR-H2 CDR-H2 50-65 50-65 52-58 52-58 CDR-H3 CDR-H3 95-102 95-102 95-102 95-102 CDR-L1 CDR-L1 24-34 24-34 26-32 26-32 CDR-L2 CDR-L2 50-56 50-56 50-52 50-52 CDR-L3 CDR-L3 89-97 89-97 91-96 91-96

Kabat et al. также определили систему нумерации для последовательностей вариабельных доменов, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области техники может однозначным образом применить эту систему нумерации по Kabat к любой последовательности вариабельного домена, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные, помимо самой последовательности. В контексте настоящей заявки термин система нумерации по Kabat относится к системе нумерации, сформулированной Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1983).Kabat et al. also defined a numbering system for variable domain sequences that is applicable to any antibody. One skilled in the art can unambiguously apply this Kabat numbering system to any variable domain sequence without relying on any experimental data other than the sequence itself. As used herein, the term Kabat numbering system refers to the numbering system formulated by Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequence of Proteins of Immunological Interest (1983).

В дополнение к вышеприведенной таблице система нумерации по Kabat описывает участки CDR следующим образом: CDR-H1 начинается приблизительно с 31 аминокислоты (т.е., приблизительно через 9 остатков после первого остатка цистеина), включает приблизительно 5-7 аминокислот и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-H2 начинается с пятнадцатого остатка после окончания CDR-H1, включает приблизительно 16-19 аминокислот и заканчивается на следующем остатке аргинина или лизина. CDR-H3 начинается приблизительно с тридцать третьего аминокислотного остатка после окончания CDR-H2; включает 3-25 аминокислот; и заканчивается на последовательности W-G-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту. CDR-L1 начинается приблизительно с 24 остатка (т.е., после остатка цистеина); включает приблизительно 10-17 остатков; и заканчивается на следующем остатке триптофана. CDR-L2 начинается приблизительно с шестнадцатого остатка после окончания CDR-L1 и включает приблизительно 7 остатков. CDR-L3 начинается приблизительно с тридцать третьего остатка после окончания CDR-L2 (т.е., после остатка цистеина); включает приблизительно 7-11 остатков и заканчивается на последовательности F или W-G-X-G, где X представляет собой любую аминокислоту.In addition to the table above, the Kabat numbering system describes the CDR regions as follows: CDR-H1 begins at approximately 31 amino acids (i.e., approximately 9 residues after the first cysteine residue), includes approximately 5-7 amino acids, and ends at the next residue tryptophan. CDR-H2 begins at the fifteenth residue after the end of CDR-H1, contains approximately 16-19 amino acids, and ends at the next arginine or lysine residue. CDR-H3 begins approximately at the thirty-third amino acid residue after the end of CDR-H2; includes 3-25 amino acids; and ends with the sequence W-G-X-G, where X represents any amino acid. CDR-L1 starts at approximately residue 24 (ie, after the cysteine residue); includes approximately 10-17 residues; and ends at the next tryptophan residue. CDR-L2 begins approximately the sixteenth residue after the end of CDR-L1 and includes approximately 7 residues. CDR-L3 begins at approximately the thirty-third residue after the end of CDR-L2 (ie, after the cysteine residue); contains approximately 7-11 residues and ends with the sequence F or W-G-X-G, where X is any amino acid.

Антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут иметь происхождение от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно антитела представляют собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или курицы. В еще одном варианте реализации вариабельная область может иметь происхождение от хрящевых рыб (например, от акул).The antibodies disclosed herein can be derived from any animal, including birds and mammals. Preferably, the antibodies are human, mouse, donkey, rabbit, goat, guinea pig, camel, llama, horse or chicken. In yet another embodiment, the variable region may be derived from cartilaginous fish (eg, sharks).

В контексте настоящей заявки термин константная область тяжелой цепи включает аминокислотные последовательности, происходящие из тяжелой цепи иммуноглобулина. Полипептид, содержащий константную область тяжелой цепи, содержит по меньшей мере одно из следующего: домен СН1, шарнирный (например, верхняя, средняя и/или нижняя шарнирная область) домен, домен СН2, домен СН3 или его вариант или фрагмент. Например, антигенсвязывающий полипептид для использования в изобретении может содержать полипептидную цепь, содержащую домен СН1; полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен СН2; полипептидную цепь, содержащую домен СН1 и домен СН3; полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена и домен СН3, или полипептидную цепь, содержащую домен СН1, по меньшей мере часть шарнирного домена, домен СН2 и домен СН3. В еще одном варианте реализации полипептид согласно изобретению содержит полипептидную цепь, содержащую домен СН3. Кроме того, антитело для использования в изобретении может не иметь по меньшей мере части домена СН2 (например, всего или части домена СН2). Как указано выше, специалисту в данной области техники будет ясно, что константная область тяжелой цепи может быть модифицирована таким образом, что ее аминокислотная последовательность будет отличаться от встречающейся в природе молекулы иммуноглобулина.As used herein, the term heavy chain constant region includes amino acid sequences derived from the immunoglobulin heavy chain. The heavy chain constant region-containing polypeptide contains at least one of the following: a CH1 domain, a hinge (eg, upper, middle, and/or lower hinge) domain, a CH2 domain, a CH3 domain, or a variant or fragment thereof. For example, an antigen binding polypeptide for use in the invention may comprise a polypeptide chain comprising a CH1 domain; a polypeptide chain containing a CH1 domain, at least part of a hinge domain and a CH2 domain; a polypeptide chain containing a CH1 domain and a CH3 domain; a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, and a CH3 domain, or a polypeptide chain comprising a CH1 domain, at least a portion of a hinge domain, a CH2 domain, and a CH3 domain. In yet another embodiment, the polypeptide of the invention comprises a polypeptide chain comprising a CH3 domain. In addition, an antibody for use in the invention may lack at least a portion of the CH2 domain (eg, all or part of the CH2 domain). As stated above, one skilled in the art will appreciate that the heavy chain constant region can be modified such that its amino acid sequence differs from the naturally occurring immunoglobulin molecule.

Константная область тяжелой цепи антитела, раскрытого в настоящей заявке, может происходить из разных молекул иммуноглобулина. Например, константная область тяжелой цепи полипептида может содержать домен СН1, происходящий из молекулы IgG1, и шарнирную область, происходящую из молекулы IgG3. В еще одном примере константная область тяжелой цепи может содержать шарнирную область, происходящую частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В еще одном примере часть тяжелой цепи может содержать химерный шарнир, происходящий частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.The heavy chain constant region of the antibody disclosed herein may be derived from different immunoglobulin molecules. For example, the heavy chain constant region of a polypeptide may comprise a CH1 domain derived from an IgG1 molecule and a hinge region derived from an IgG 3 molecule. In yet another example, the heavy chain constant region may comprise a hinge region derived in part from an IgG1 molecule and in part from an IgG 3 molecule. In yet another example, the heavy chain portion may comprise a chimeric hinge derived in part from an IgG1 molecule and in part from an IgG 4 molecule.

В контексте настоящей заявки термин константная область легкой цепи включает аминокислот- 6 045759 ные последовательности, происходящие из легкой цепи антитела. Предпочтительно константная область легкой цепи содержит по меньшей мере один из константного каппа-домена или константного лямбдадомена.As used herein, the term light chain constant region includes amino acid sequences derived from the light chain of an antibody. Preferably, the light chain constant region comprises at least one of a kappa constant domain or a lambda constant domain.

Пара легкой и тяжелой цепей относится к объединению легкой цепи и тяжелой цепи, которые могут образовывать димер посредством дисульфидной связи между доменом CL легкой цепи и доменом СН1 тяжелой цепи.A light-heavy chain pair refers to a combination of a light chain and a heavy chain that can form a dimer through a disulfide bond between the CL domain of the light chain and the CH1 domain of the heavy chain.

Как отмечено ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. В контексте настоящей заявки термин домен VH включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, и термин домен СН1 включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен СН1 соседствует с доменом VH и является аминоконцевым относительно шарнирной области молекулы тяжелой цепи иммуноглобулина.As noted earlier, the subunit structures and three-dimensional configuration of the constant regions of the various classes of immunoglobulins are well known. As used herein, the term VH domain includes the amino-terminal variable domain of an immunoglobulin heavy chain, and the term CH1 domain includes the first (most amino-terminal) domain of the immunoglobulin heavy chain constant region. The CH1 domain is adjacent to the VH domain and is amino-terminal relative to the hinge region of the immunoglobulin heavy chain molecule.

В контексте настоящей заявки термин домен СН2 включает часть молекулы тяжелой цепи, которая простирается, например, с приблизительно 244 остатка до 360 остатка антитела, как указано с помощью традиционных схем нумерации (остатки 244-360, система нумерации по Kabat, и остатки 231-340, система нумерации EU, см. Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)). Домен СН2 уникален тем, что он тесно не связан с другим доменом. Скорее, две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG. Также хорошо описано, что домен СН3 простирается от домена СН2 до Сконца молекулы IgG и содержит приблизительно 108 остатков.As used herein, the term CH2 domain includes the portion of the heavy chain molecule that extends, for example, from approximately residue 244 to residue 360 of an antibody, as indicated by conventional numbering schemes (residues 244-360, Kabat numbering system, and residues 231-340 , EU numbering system, see Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)). The CH2 domain is unique in that it is not closely associated with another domain. Rather, two N-linked branched carbohydrate chains are located between the two CH2 domains of the intact native IgG molecule. It is also well described that the CH3 domain extends from the CH2 domain to the end of the IgG molecule and contains approximately 108 residues.

В контексте настоящей заявки термин шарнирная область включает часть молекулы тяжелой цепи, которая соединяет домен СН1 с доменом СН2. Эта шарнирная область содержит приблизительно 25 остатков и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям перемещаться независимо друг от друга. Шарнирные области можно подразделить на три отдельных домена: верхний, средний и нижний шарнирные домены (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).As used herein, the term hinge region includes the portion of the heavy chain molecule that connects the CH1 domain to the CH2 domain. This hinge region contains approximately 25 residues and is flexible, allowing the two N-terminal antigen-binding regions to move independently of each other. The hinge regions can be divided into three distinct domains: the upper, middle and lower hinge domains (Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).

В контексте настоящей заявки термин дисульфидная связь включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В большинстве встречающихся в природе молекул IgG области СН1 и CK связаны дисульфидной связью и две тяжелые цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих 239 и 242 с использованием системы нумерации по Kabat (положение 226 или 229, система нумерации EU).As used herein, the term disulfide bond includes a covalent bond formed between two sulfur atoms. The amino acid cysteine contains a thiol group that can form a disulfide bond or bridge with a second thiol group. In most naturally occurring IgG molecules, the CH1 and CK regions are linked by a disulfide bond and the two heavy chains are linked by two disulfide bonds at positions corresponding to 239 and 242 using the Kabat numbering system (position 226 or 229, EU numbering system).

В контексте настоящей заявки за термином химерное антитело закреплено значение любого антитела, в котором иммунореактивная область или сайт получены или происходят из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной в соответствии с настоящим изобретением) получена из второго вида. В отдельных вариантах реализации мишеньсвязывающая область или сайт будут получены из источника, отличного от человека (например, мыши или примата), а константная область является человеческой.As used herein, the term chimeric antibody refers to any antibody in which the immunoreactive region or site is derived from or derived from a first species and the constant region (which may be intact, partial, or modified in accordance with the present invention) is derived from a second species. In certain embodiments, the target binding region or site will be derived from a non-human source (eg, mouse or primate) and the constant region will be human.

В контексте настоящей заявки процент гуманизации рассчитывают путем определения количества различий в аминокислотах каркаса (т.е., различий в участках, отличных от CDR) между гуманизированным доменом и доменом зародышевой линии, вычитания этого количества из общего количества аминокислот, а затем деления этой разности на общее количество аминокислот и умножения на 100.As used herein, the percentage of humanization is calculated by determining the amount of backbone amino acid difference (i.e., difference in regions other than the CDR) between the humanized domain and the germline domain, subtracting that amount from the total number of amino acids, and then dividing that difference by total number of amino acids and multiply by 100.

Под специфично связывает или обладает специфичностью к обычно подразумевается, что антитело связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание подразумевает некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Согласно этому определению антитело, как говорят, специфично связывается с эпитопом, когда оно связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена вероятнее, чем оно связалось бы со случайным, неродственным эпитопом. Термин специфичность используется в настоящей заявке для оценки относительной аффинности, с которой определенное антитело связывается с определенным эпитопом. Например, можно считать, что антитело А имеет более высокую специфичность для данного эпитопа, чем антитело В, или об антителе А можно сказать, что оно связывается с эпитопом С с более высокой специфичностью, чем его специфичность для родственного эпитопа D.By specifically binds or has specificity for, it is generally meant that the antibody binds to an epitope via its antigen binding domain, and that binding implies some complementarity between the antigen binding domain and the epitope. By this definition, an antibody is said to specifically bind to an epitope when it binds to that epitope through its antigen binding domain more likely than it would to a random, unrelated epitope. The term specificity is used herein to assess the relative affinity with which a particular antibody binds to a particular epitope. For example, antibody A may be said to have a higher specificity for a given epitope than antibody B, or antibody A may be said to bind epitope C with a higher specificity than its specificity for the related epitope D.

В контексте настоящей заявки термины лечить или лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, например, прогрессирования рака. Благоприятные или желательные клинические результаты включают, не ограничиваясь перечисленным, частичное снятие симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) течение заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление течения заболевания и ремиссию (частичную или полную), как обнаружимые, так и не обнаружимые. Лечение также может означать увеличение выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если лечение не проводится. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают уже имеющих состояние или расстройство, а также тех, кто предрасположен к развитию состояния или расстройства, или тех, у кого состояние или расстройство необхо- 7 045759 димо предупредить.As used herein, the terms treat or treatment refer to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic measures where the goal is to prevent or slow (reduce) an undesirable physiological change or disorder, such as the progression of cancer. Beneficial or desirable clinical outcomes include, but are not limited to, partial relief of symptoms, reduction in disease severity, stable (i.e., not worsening) disease, delay or slowing of disease progression, reduction or temporary relief of disease, and remission (partial or complete). ), both detectable and undetectable. Treatment may also mean longer survival than would be expected if no treatment was given. Subjects in need of treatment include those already having the condition or disorder, as well as those who are predisposed to developing the condition or disorder, or those whose condition or disorder needs to be prevented.

Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим подразумевается любой субъект, в частности, млекопитающее, для которого желательны диагностика, прогнозирование или терапия. Субъекты-млекопитающие включают людей, одомашненных животных, сельскохозяйственных животных и животных зоопарка, животных, принимающих участие в спорте, или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы и так далее.By subject or individual or animal or patient or mammal is meant any subject, particularly a mammal, for which diagnosis, prognosis or therapy is desired. Mammalian subjects include humans, domesticated animals, farm and zoo animals, sports animals, or pets such as dogs, cats, guinea pigs, rabbits, rats, mice, horses, cattle, cows, and the like. Further.

В контексте настоящей заявки такие фразы, как нуждающемуся в лечении пациенту или нуждающийся в лечении субъект, включают субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, которые получили бы пользу от введения антитела или композиции согласно настоящему изобретению при применении, например, для обнаружения, для процедуры диагностики и/или для лечения.As used herein, phrases such as a patient in need of treatment or a subject in need of treatment include subjects, such as mammalian subjects, who would benefit from administration of an antibody or composition of the present invention in use for, for example, a detection, diagnostic procedure and/or for treatment.

Антитела к SIRPaAntibodies to SIRPa

Согласно настоящему изобретению предложены антитела и фрагменты к SIRPa, которые обладают высокой аффинностью к обоим вариантам v1 и v2. Вариант 1 (hSIRPaV1) является доминирующим вариантом среди европейцев, африканцев, американцев смешанной расы и уроженцев Южной Азии. Вариант 2 (hSIRPaV2) является доминирующим вариантом среди уроженцев Восточной Азии. Последовательности hSIRPaV1 и hSIRPaV2 отличаются в пределах внеклеточного Ig-подобного V-подобного (IgV) домена. Способность раскрытых в настоящей заявке антител и фрагментов распознавать оба варианта обуславливает их эффективность у самой широкой популяции пациентов.The present invention provides anti-SIRPa antibodies and fragments that have high affinity for both v1 and v2 variants. Variant 1 (hSIRPaV1) is the dominant variant among Europeans, Africans, mixed-race Americans, and South Asians. Variant 2 (hSIRPaV2) is the dominant variant among East Asians. The sequences of hSIRPaV1 and hSIRPaV2 differ within the extracellular Ig-like V-like (IgV) domain. The ability of the antibodies and fragments disclosed herein to recognize both variants makes them effective in the broadest patient population.

Кроме того, раскрытые в настоящей заявке антитела и фрагменты продемонстрировали превосходную аффинность связывания, сильную индукцию макрофаг-опосредованного фагоцитоза и пригодность к производству с точки зрения превосходных химических свойств, процесса производства и контроля качества (CMC).In addition, the antibodies and fragments disclosed herein demonstrate excellent binding affinity, potent induction of macrophage-mediated phagocytosis, and manufacturing suitability in terms of superior chemical properties, manufacturing process, and quality control (CMC).

Таким образом, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, способные связываться с обоими вариантами 1 и 2 SIRPa. Примеры антител включают мышиные антитела, перечисленные в табл. 1, а также гуманизированные антитела из табл. 2-8.Thus, according to one embodiment of the present invention, antibodies and antigen-binding fragments thereof are provided that are capable of binding to both SIRPa variants 1 and 2. Examples of antibodies include the murine antibodies listed in table. 1, as well as humanized antibodies from table. 2-8.

Также включены антитела, которые содержат те же CDR, что проиллюстрированы в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации раскрытые антитела и фрагменты включают антитела и фрагменты, которые связываются с тем же эпитопом, что и проиллюстрированные в настоящей заявке, и антитела и фрагменты, которые конкурируют с раскрытыми в настоящей заявке антителами и фрагментами за связывание с SIRPa.Also included are antibodies that contain the same CDRs as illustrated herein. In some embodiments, the disclosed antibodies and fragments include antibodies and fragments that bind to the same epitope as those illustrated herein, and antibodies and fragments that compete with the disclosed antibodies and fragments for binding to SIRPa.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложено антитело или его фрагмент, включающие вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи с участками CDR, раскрытыми в настоящей заявке, а также их биологические эквиваленты.According to one embodiment, the present invention provides an antibody or fragment thereof comprising heavy chain and light chain variable domains with CDR regions disclosed herein, as well as biological equivalents thereof.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 248G3F6, как показано в таблицах 2В и 2D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, 21 или 22 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDRs 248G3F6, as shown in Tables 2B and 2D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, 21 or 22 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 17 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 18 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, со- 8 045759 держащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region containing the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 17, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23-27, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23-27.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 23-27, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 1 and 23-27.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 28-29, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и 28-29.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 and 28-29, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 2 and 28-29.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29.In some embodiments, the heavy chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 300A6A6, как показано в таблицах 3В и 3D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, 36, 37 или 38 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDR 300A6A6, as shown in Tables 3B and 3D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, 36, 37 or 38 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антителоIn one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody

- 9 045759 или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.- 9 045759 or a fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 и 39-44, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3 и 39-44.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 and 39-44, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 3 and 39-44.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 45-46, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4 и 45-46.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 and 45-46, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 4 and 45-46.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43 and the light chain variable region contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 102A10F2, как показано в табл. 4В и 4D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, 53 или 54 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDR 102A10F2, as shown in Table. 4B and 4D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, 53 or 54 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having specificity for binding to wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

- 10 045759- 10 045759

В одном варианте реализации предложено антитело или его фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, и где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51 и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.In one embodiment, an antibody or fragment thereof is provided having binding specificity for wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and a variable a light chain region comprising the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, and wherein CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, CDRL1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и 55-60, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и 55-60.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 and 55-60, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 5 and 55-60.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и 61-62, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6 и 61-62.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 6 and 61-62, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 6 and 61-62.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 62D2H6, как показано в таблицах 5В и 5D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDR 62D2H6, as shown in Tables 5B and 5D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 65 or a variant thereof, containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 66 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 68 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и 69-72, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и 69-72.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 and 69-72, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 7 and 69-72.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и 73-76, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8 и 73-76.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 and 73-76, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 8 and 73-76.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 211F8E11, как показано в таблицах 6В и 6D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDR 211F8E11, as shown in Tables 6B and 6D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 79 or a variant thereof, containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 80 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 81 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9 и 83-86, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9 и 83-86.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 and 83-86, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 9 and 83-86.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 87-90, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10 и 87-90.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10 and 87-90, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 10 and 87-90.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 217D11E5, как показано в таблицах 7В и 7D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, заменыIn one embodiment, the CDRs are CDR 217D11E5, as shown in Tables 7B and 7D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 92 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions, or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 93 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions

- 11 045759 или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 94 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 95 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ- 11 045759 or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 94 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 95 or a variant thereof containing one , two or three deletions, insertions, substitutions, or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ

ID NO: 96 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.ID NO: 96 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11 и 97-100, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11 и 97-100.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 11 and 97-100, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 11 and 97-100.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12и 101-102, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12 и 101-102.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 and 101-102, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 and 101-102.

В одном варианте реализации CDR представляют собой CDR 234B7D5, как показано в таблицах 8В и 8D. В одном варианте реализации CDRH1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRH3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, CDRL2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации, и CDRL3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 108 или ее вариант, содержащий одну, две или три делеции, вставки, замены или их комбинации.In one embodiment, the CDRs are CDR 234B7D5, as shown in Tables 8B and 8D. In one embodiment, CDRH1 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRH3 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 105 or a variant thereof, containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL1 contains the amino acid sequence SEQ ID NO: 106 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, CDRL2 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof, and CDRL3 contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 108 or a variant thereof containing one, two or three deletions, insertions, substitutions or combinations thereof.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13 и 109-112, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13 и 109-112.In some embodiments, the heavy chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 13 and 109-112, or a peptide that is at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs : 13 and 109-112.

В некоторых вариантах реализации вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14 и 113-118, или пептид, по меньшей мере на 90% идентичный аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14 и 113-118.In some embodiments, the light chain variable region comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 14 and 113-118, or a peptide at least 90% identical to an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: : 14 and 113-118.

Антитела, которые содержали эти участки CDR, будь то мышиные, гуманизированные или химерные, обладали сильной активностью связывания и ингибирования SIRPa. Как показано в Примере 5, определенные остатки в CDR могут быть модифицированы для сохранения или улучшения свойства или снижения вероятности посттрансляционных модификаций (РТМ). Такие модифицированные CDR могут называться CDR с созревшей аффинностью или CDR со сниженным риском.Antibodies that contained these CDR regions, whether murine, humanized, or chimeric, had potent SIRPa binding and inhibition activity. As shown in Example 5, certain residues in the CDR can be modified to maintain or improve properties or reduce the likelihood of post-translational modifications (PTMs). Such modified CDRs may be referred to as affinity matured CDRs or risk reduced CDRs.

Неограничивающие примеры CDR со сниженным риском представлены в табл. 2В, 3В и 4В. Модифицированные CDR могут включать CDR, которые имеют вставку, делецию и/или замены одной, двух или трех аминокислот. В некоторых вариантах реализации замены могут представлять собой консервативные замены.Non-limiting examples of reduced risk CDRs are presented in Table. 2B, 3B and 4B. Modified CDRs may include CDRs that have an insertion, deletion, and/or substitution of one, two, or three amino acids. In some embodiments, the substitutions may be conservative substitutions.

Консервативная аминокислотная замена представляет собой такую замену, при которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В данной области техники установлены семейства аминокислотных остатков, содержащих схожие боковые цепи, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, не являющийся необходимым аминокислотный остаток в полипептиде иммуноглобулина предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В другом варианте реализации цепочку аминокислот можно заменить структурно схожей цепочкой, которая отличается по порядку и/или составу представителей семейства боковых цепей.A conservative amino acid substitution is one in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. The art has identified families of amino acid residues containing similar side chains, including basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), beta-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). Thus, a non-essential amino acid residue in an immunoglobulin polypeptide is preferably replaced with another amino acid residue from the same side chain family. In another embodiment, the amino acid chain may be replaced by a structurally similar chain that differs in the order and/or composition of the side chain family members.

Неограничивающие примеры консервативных аминокислотных замен представлены в таблице ниже, где оценка сходства 0 или выше указывает на консервативную замену между двумя аминокислотами.Non-limiting examples of conservative amino acid substitutions are presented in the table below, where a similarity score of 0 or higher indicates a conservative substitution between two amino acids.

- 12 045759- 12 045759

Таблица А. Матрица сходства аминокислотTable A. Amino acid similarity matrix

с With G G Р R S S А A Т T D D Е E N N Q Q Н N К TO R R V V М M | | L L F F Y Y W W W W -8 -8 -7 -7 -6 -6 -2 -2 -6 -6 -5 -5 -7 -7 -7 -7 -4 -4 -5 -5 -3 -3 -3 -3 2 2 -6 -6 -4 -4 -5 -5 -2 -2 0 0 0 0 17 17 Y Y 0 0 -5 -5 -5 -5 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -4 -4 -4 -4 -2 -2 -4 -4 0 0 -4 -4 -5 -5 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -1 -1 7 7 10 10 F F -4 -4 -5 -5 -5 -5 -3 -3 -4 -4 -3 -3 -6 -6 -5 -5 -4 -4 -5 -5 -2 -2 -5 -5 -4 -4 -1 -1 0 0 1 1 2 2 9 9 L L -6 -6 -4 -4 -3 -3 -3 -3 -2 -2 -2 -2 -4 -4 -3 -3 -3 -3 -2 -2 -2 -2 -3 -3 -3 -3 2 2 4 4 2 2 6 6 1 1 -2 -2 -3 -3 -2 -2 -1 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 4 2 2 5 5 М M -5 -5 -3 -3 -2 -2 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -3 -3 -2 -2 0 0 -1 -1 -2 -2 0 0 0 0 2 2 6 6 V V -2 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 0 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 4 R R -4 -4 -3 -3 0 0 0 0 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 0 1 1 2 2 3 3 6 6 К TO -5 -5 -2 -2 -1 -1 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 5 5 Н N -3 -3 -2 -2 0 0 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 1 1 1 2 2 3 3 6 6 Q Q -5 -5 -1 -1 0 0 -1 -1 0 0 -1 -1 2 2 2 2 1 1 4 4 N N -4 -4 0 0 -1 -1 1 1 0 0 0 0 2 2 1 1 2 2 Е E -5 -5 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 3 3 4 4 D D -5 -5 1 1 -1 -1 0 0 0 0 0 0 4 4 Т T -2 -2 0 0 0 0 1 1 1 1 3 3 А A -2 -2 1 1 1 1 1 1 2 2 S S 0 0 1 1 1 1 1 1 Р R -3 -3 -1 -1 6 6 G G -3 -3 5 5 С WITH 12 12

Таблица В. Консервативные аминокислотные заменыTable B. Conservative amino acid substitutions

Для аминокислоты For amino acid Замена на Change to Аланин Alanin D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys D-Ala, Gly, Aib, β-Ala, L-Cys, D-Cys Аргинин Arginine D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn D-Arg, Lys, D-Lys, Orn D-Orn Аспарагин Asparagine D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gin, D-GIn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu Gin, D-GIn Аспарагиновая кислота Aspartic acid D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-GIn Цистеин Cysteine D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr, L-Ser, D-Ser Глутамин Glutamine D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp D-GIn, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp Глутаминовая Кислота Glutamic Acid D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-GIn Глицин Glycine Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, β-Ala Изолейцин Isoleucine D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met D-lle, Vai, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met Лейцин Leucine Vai, D-Val, Met, D-Met, D-lle, D-Leu, lie Vai, D-Val, Met, D-Met, D-lle, D-Leu, lie Лизин Lysine D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn D-Lys, Arg, D-Arg, Orn, D-Orn Метионин Methionine D-Met, S-Me-Cys, lie, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val D-Met, S-Me-Cys, lie, D-lle, Leu, D-Leu, Vai, D-Val Фенилаланин Phenylalanine D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp D-Phe, Tyr, D-Tyr, His, D-His, Trp, D-Trp Пролин Proline D-Pro D-Pro Серин Serin D-Ser, Thr, D-Thr, алло-Thr, L-Cys, D-Cys D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, L-Cys, D-Cys Треонин Threonine D-Thr, Ser, D-Ser, алло-Thr, Met, D-Met, Vai, D-Val D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Vai, D-Val Тирозин Tyrosine D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp D-Tyr, Phe, D-Phe, His, D-His, Trp, D-Trp Валин Valin D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-lle, Met, D-Met D-Val, Leu, D-Leu, lie, D-lle, Met, D-Met

Специалисту в данной области техники также будет ясно, что антитела, раскрытые в настоящей заявке, могут быть модифицированы таким образом, что их аминокислотная последовательность будет отличаться от встречающегося в природе связывающего полипептида, из которого они происходят. Например, полипептидная или аминокислотная последовательность, происходящая из обозначенного белка, может быть схожей, например иметь определенный процент идентичности исходной последовательности, например, она может быть на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична исходной последовательности.One skilled in the art will also appreciate that the antibodies disclosed herein may be modified such that their amino acid sequence differs from the naturally occurring binding polypeptide from which they are derived. For example, the polypeptide or amino acid sequence derived from the designated protein may be similar, e.g. have a certain percentage identity to the original sequence, e.g. it may be 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 98% or 99% identical to the original sequence.

В отдельных вариантах реализации антитело содержит аминокислотную последовательность или один или более фрагментов, которые обычно не связаны с антителом. Примеры модификаций более подробно описаны ниже. Например, антитело согласно изобретению может содержать гибкую линкерную последовательность или может быть модифицировано с добавлением функционального фрагмента (например, ПЭГ (полиэтиленгликоля), лекарственного средства, токсина или метки).In certain embodiments, the antibody contains an amino acid sequence or one or more fragments that are not typically associated with the antibody. Examples of modifications are described in more detail below. For example, an antibody of the invention may contain a flexible linker sequence or may be modified to add a functional moiety (eg, PEG, drug, toxin, or label).

Антитела, их варианты или производные согласно изобретению включают производные, которые были модифицированы, т.е., путем ковалентного присоединения молекулы любого типа к антителу таким образом, что ковалентное присоединение не препятствует связыванию антитела с эпитопом. Например, не ограничиваясь перечисленным, антитела могут быть модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолиза, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любая из многочисленных химических модификаций может быть осуществлена известными способами, включая, не ограничиваясь перечисленным, специфичное химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, антитела могут содержать одну или более неканонических аминокислот.Antibodies, variants or derivatives thereof according to the invention include derivatives that have been modified, i.e., by covalently attaching a molecule of any type to the antibody in such a way that the covalent attachment does not prevent the antibody from binding to the epitope. For example, but not limited to, antibodies can be modified, for example, by glycosylation, acetylation, PEGylation, phosphorylation, amidation, derivatization with known protecting/blocking groups, proteolysis, binding to a cellular ligand or other protein, etc. Any of numerous chemical modifications can be accomplished by known methods, including, but not limited to, specific chemical cleavage, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, etc. In addition, antibodies may contain one or more non-canonical amino acids.

В некоторых вариантах реализации антитела могут быть конъюгированы с терапевтическими агентами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами или ПЭГ.In some embodiments, antibodies may be conjugated to therapeutic agents, prodrugs, peptides, proteins, enzymes, viruses, lipids, biological response modifiers, pharmaceutical agents, or PEGs.

Антитела могут быть конъюгированы или слиты с терапевтическим агентом, который может вклю- 13 045759 чать детектируемые метки, такие как радиоактивные метки, иммуномодулятор, гормон, фермент, олигонуклеотид, фотоактивный терапевтический или диагностический агент, цитотоксический агент, который может представлять собой лекарственное средство или токсин, агент, усиливающий контраст ультразвукового изображения, нерадиоактивную метку, их комбинацию и другие подобные агенты, известные в данной области техники.Antibodies may be conjugated or fused to a therapeutic agent, which may include detectable labels such as radiolabels, an immunomodulator, a hormone, an enzyme, an oligonucleotide, a photoactive therapeutic or diagnostic agent, a cytotoxic agent, which may be a drug or a toxin. , an ultrasound image contrast enhancing agent, a non-radioactive tracer, a combination thereof, and other similar agents known in the art.

Антитела могут быть мечены с возможностью обнаружения путем их связывания с хемилюминесцентным соединением. Присутствие меченого хемилюминесцентным соединением антигенсвязывающего полипептида затем определяют путем обнаружения люминесценции, возникающей в ходе химической реакции. Примерами соединений, особенно подходящих в качестве хемилюминесцентной метки, являются люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и сложный оксалатный эфир.Antibodies can be labeled for detection by binding them to a chemiluminescent compound. The presence of a chemiluminescent compound-labeled antigen-binding polypeptide is then determined by detecting the luminescence produced by the chemical reaction. Examples of compounds particularly suitable as a chemiluminescent label are luminol, isoluminol, aromatic acridinium ester, imidazole, acridinium salt and oxalate ester.

Антитела также могут быть мечены с возможностью обнаружения с использованием металлов, испускающих флуоресцентное излучение, таких как 152Eu или другие металлы семейства лантаноидов. Эти металлы могут быть присоединены к антителу с использованием таких металл-хелатирующих групп, как диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) или этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Методики конъюгирования различных фрагментов с антителами хорошо известны, см. например, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, в Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), стр. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom etal, Antibodies For Drug Delivery, в Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., стр. 623- 53 (1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), стр. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press стр. 303-16 (1985), и Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).Antibodies can also be labeled for detection using metals that emit fluorescent radiation, such as 152 Eu or other metals of the lanthanide family. These metals can be attached to the antibody using metal chelating groups such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Techniques for conjugating various moieties to antibodies are well known, see, for example, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303- 16 (1985), and Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).

Бифункциональные молекулы и комбинированные терапииBifunctional molecules and combination therapies

Важным компонентом врожденной иммунной системы являются макрофаги. Макрофаги ингибируют рост опухоли посредством фагоцитоза опухолевых клеток. Опухолевые клетки могут ускользать от надзора макрофагов путем активации сигнала не ешь меня - CD47 - на их клеточной поверхности. CD47 экспрессируется повсеместно, но подвергается повышающей регуляции при различных типах опухолей. Взаимодействуя с различными лигандами, CD47 играет роль в регуляции подвижности клеток, адгезии, миграции и активации тромбоцитов. SIRPa является еще одним членом суперсемейства иммуноглобулинов и главным образом экспрессируется на поверхности нейронов и миелоидных клеток, включая макрофаги, гранулоциты, моноциты и дендритные клетки. Ось CD47/SIRPa является известным основным путем уклонения опухолевых клеток от иммунного надзора.Macrophages are an important component of the innate immune system. Macrophages inhibit tumor growth through phagocytosis of tumor cells. Tumor cells can evade macrophage surveillance by activating the don't eat me signal - CD47 - on their cell surface. CD47 is expressed ubiquitously but is up-regulated in various tumor types. By interacting with various ligands, CD47 plays a role in the regulation of cell motility, adhesion, migration and platelet activation. SIRPa is another member of the immunoglobulin superfamily and is primarily expressed on the surface of neurons and myeloid cells, including macrophages, granulocytes, monocytes and dendritic cells. The CD47/SIRPa axis is a known major pathway for tumor cells to evade immune surveillance.

Агенты, нацеленные на CD47, могут инициировать опсонизацию антителами и активировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) или антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ), который способствует разрушению опухолевых клеток. Однако из-за повсеместной экспрессии CD47 может приводить к эритротоксичности и другим гематологическим побочным действиям из-за присутствия антигена на клетках крови. Молекулы, нацеленные на SIRPa, либо биспецифичные агенты, нацеленные как на SIRPa, так и на CD47, могут быть сконструированы таким образом, чтобы вызывать эффект АЗКЦ и АЗКФ за счет наличия функциональных Fc-доменов.Agents targeting CD47 can initiate antibody opsonization and activate antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) or antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), which promotes tumor cell destruction. However, due to its ubiquitous expression, CD47 can lead to erythrotoxicity and other hematological side effects due to the presence of the antigen on blood cells. Molecules targeting SIRPa, or bispecific agents targeting both SIRPa and CD47, can be designed to induce the effect of ADCC and ADCP through the presence of functional Fc domains.

Поскольку SIRPa более ограничен в экспрессии по сравнению с CD47, эти молекулы не должны иметь столько гематологических осложнений по сравнению с молекулами, нацеленными только на CD47. Таким образом, антитела к SIRPa могут быть более безопасными, чем антитела к CD47. Другой вариант представляет собой разработку биспецифичных агентов, нацеленных как на ось CD47/SIRPa, так и на другой опухолевый антиген. Эти агенты могут представлять собой биспецифичные антитела, слитые белки или комбинированные терапии.Because SIRPa is more restricted in expression compared to CD47, these molecules should not have as many hematological complications compared to molecules targeting CD47 alone. Thus, anti-SIRPa antibodies may be safer than anti-CD47 antibodies. Another option is the development of bispecific agents targeting both the CD47/SIRPa axis and another tumor antigen. These agents may be bispecific antibodies, fusion proteins, or combination therapies.

Примеры опухолевых антигенов, в частности, тех, которые могут вызывать опсонизацию опухоли, включают, не ограничиваясь перечисленным, CD19, CD20, EGFR, HER2, CD3, CD16, PD1, PD-L1, LAG3, TIM3, CTLA4, VISTA, CSFR1, A2AR, CD73, CD39, CD40, СЕА, HER2, VEGFR, TIGIT, клаудин 18.2, CD24, GPC3, Il13RA2, 4-1BB, CCR8 и CMET.Examples of tumor antigens, particularly those that can cause tumor opsonization, include, but are not limited to, CD19, CD20, EGFR, HER2, CD3, CD16, PD1, PD-L1, LAG3, TIM3, CTLA4, VISTA, CSFR1, A2AR , CD73, CD39, CD40, CEA, HER2, VEGFR, TIGIT, claudin 18.2, CD24, GPC3, Il13RA2, 4-1BB, CCR8 and CMET.

Также предложен другой формат биспецифичных антител. В некоторых вариантах реализации каждый из фрагмента к SIRPa и второго фрагмента независимо выбран из Fab-фрагмента, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) или однодоменного антитела. В некоторых вариантах реализации биспецифичное антитело дополнительно содержит Fc-фрагмент.Another format of bispecific antibodies has also been proposed. In some embodiments, the SIRPa fragment and the second fragment are each independently selected from a Fab fragment, a single chain variable fragment (scFv), or a single domain antibody. In some embodiments, the bispecific antibody further comprises an Fc moiety.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела, и способы получения антителAntibody-encoding polynucleotides and methods for producing antibodies

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам или молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим антитела, их варианты или производные согласно изобретению. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут кодировать целые вариабельные области тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающих полипептидов, их вариантов или производных на одной и той же мо- 14 045759 лекуле полинуклеотида или на отдельных молекулах полинуклеотидов. Кроме того, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут кодировать части вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антигенсвязывающих полипептидов, их вариантов или производных на одной и той же молекуле полинуклеотида или на отдельных молекулах полинуклеотидов.The present invention also relates to isolated polynucleotides or nucleic acid molecules encoding antibodies, variants or derivatives thereof according to the invention. The polynucleotides of the present invention may encode entire variable regions of the heavy and light chains of antigen binding polypeptides, variants or derivatives thereof, on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules. In addition, the polynucleotides of the present invention may encode portions of the heavy and light chain variable regions of antigen binding polypeptides, variants or derivatives thereof, on the same polynucleotide molecule or on separate polynucleotide molecules.

Способы получения антител хорошо известны в данной области техники и описаны в настоящей заявке. В отдельных вариантах реализации как вариабельные, так и константные области антигенсвязывающих полипептидов согласно настоящему изобретению являются полностью человеческими. Полностью человеческие антитела могут быть получены с использованием методик, описанных в данной области техники и в настоящей заявке. Например, полностью человеческие антитела против определенного антигена могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, которое было модифицировано для выработки таких антител в ответ на стимуляцию антигеном, при этом его эндогенные локусы были дезактивированы. Примеры методик, которые могут быть использованы для получения таких антител, описаны в патентах США №№ 6150584, 6458592, 6420140, полностью включенных посредством ссылки.Methods for producing antibodies are well known in the art and are described herein. In certain embodiments, both the variable and constant regions of the antigen binding polypeptides of the present invention are entirely human. Fully human antibodies can be obtained using techniques described in the art and in this application. For example, fully human antibodies against a particular antigen can be obtained by administering the antigen to a transgenic animal that has been modified to produce such antibodies in response to antigen stimulation while its endogenous loci have been inactivated. Examples of techniques that can be used to produce such antibodies are described in US Pat. Nos. 6,150,584, 6,458,592, 6,420,140, incorporated by reference in their entirety.

Способы леченияTreatment methods

Как описано в настоящей заявке, антитела, варианты или производные согласно настоящему изобретению могут быть использованы в определенных способах лечения и диагностики.As described herein, the antibodies, variants or derivatives of the present invention can be used in certain methods of treatment and diagnosis.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам терапии на основе антител, включающим введение антител согласно изобретению пациенту, такому как животное, млекопитающее и человек, для лечения одного или более расстройств или состояний, описанных в настоящей заявке. Терапевтические соединения согласно изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, антитела согласно изобретению (включая их варианты и производные, как описано в настоящей заявке) и нуклеиновые кислоты или полинуклеотиды, кодирующие антитела согласно изобретению (включая их варианты и производные, как описано в настоящей заявке).The present invention further relates to methods of antibody therapy comprising administering antibodies of the invention to a patient, such as an animal, mammal and human, to treat one or more of the disorders or conditions described herein. Therapeutic compounds of the invention include, but are not limited to, antibodies of the invention (including variants and derivatives thereof as described herein) and nucleic acids or polynucleotides encoding antibodies of the invention (including variants and derivatives thereof as described herein).

Антитела согласно изобретению также могут применяться для лечения или ингибирования рака. Как указано выше, SIRPa может быть сверхэкспрессирован в опухолевых клетках, в частности, в опухолях желудка, поджелудочной железы, пищевода, яичника и легкого. Было показано, что ингибирование SIRPa эффективно для лечения опухолей.The antibodies of the invention may also be used to treat or inhibit cancer. As stated above, SIRPa can be overexpressed in tumor cells, particularly in gastric, pancreatic, esophageal, ovarian and lung tumors. Inhibition of SIRPa has been shown to be effective in the treatment of tumors.

Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложены способы лечения рака у нуждающегося в этом пациента. Способ в одном из вариантов реализации включает введение указанному пациенту эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере одна из раковых клеток (например, стромальных клеток) у пациента сверхэкспрессирует SIRPa.Accordingly, some embodiments provide methods for treating cancer in a patient in need thereof. The method in one embodiment includes administering to said patient an effective amount of an antibody of the present invention. In some embodiments, at least one of the cancer cells (eg, stromal cells) in the patient overexpresses SIRPa.

Способы клеточной терапии, такие как терапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR), также охватываются настоящим изобретением. Можно использовать подходящую клетку, которую приводят в контакт с антителом к SIRPa согласно настоящему изобретению (или, в качестве альтернативы, генетически модифицированную для экспрессии антитела к SIRPa согласно настоящему изобретению). После такого контакта или генетической модификации клетка затем может быть введена больному раком, нуждающемуся в лечении. Больной раком может иметь рак любого типа из описанных в настоящей заявке. Клетка (например, Т-клетка) может представлять собой, например, опухольинфильтрирующий Т-лимфоцит, CD4+ Т-клетку, CD8+ Т-клетку или их комбинацию, не ограничиваясь перечисленным.Cell therapy methods, such as chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy, are also covered by the present invention. A suitable cell that is contacted with an anti-SIRPa antibody of the present invention (or, alternatively, genetically modified to express an anti-SIRPa antibody of the present invention) may be used. After such contact or genetic modification, the cell can then be administered to a cancer patient in need of treatment. The cancer patient may have any type of cancer described herein. The cell (eg, a T cell) may be, for example, a tumor-infiltrating T lymphocyte, a CD4+ T cell, a CD8+ T cell, or a combination thereof, but is not limited to.

В некоторых вариантах реализации клетка была выделена от самого больного раком. В некоторых вариантах реализации клетка была предоставлена донором или из банка клеток. Когда клетка выделена от больного раком, нежелательные иммунные реакции могут быть сведены к минимуму.In some embodiments, the cell was isolated from the cancer patient himself. In some embodiments, the cell was provided by a donor or from a cell bank. When a cell is isolated from a cancer patient, unwanted immune reactions can be minimized.

Неограничивающие примеры раковых заболеваний включают рак мочевого пузыря, рак молочной железы, колоректальный рак, рак эндометрия, рак пищевода, рак головы и шеи, рак почки, лейкоз, рак печени, рак легкого, лимфому, меланому, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы и рак щитовидной железы. В некоторых вариантах реализации рак представляет собой один или более из рака желудка, поджелудочной железы, пищевода, яичника и легкого.Non-limiting examples of cancers include bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, endometrial cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, leukemia, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma, pancreatic cancer, prostate cancer and thyroid cancer. In some embodiments, the cancer is one or more of gastric, pancreatic, esophageal, ovarian, and lung cancer.

Дополнительные заболевания или состояния, связанные с повышенной выживаемостью клеток, подлежащие лечению, предупреждению, диагностике и/или прогнозированию с помощью антител или их вариантов или производных согласно изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, прогрессирование и/или метастазы злокачественных новообразований и ассоциированные расстройства, такие как лейкоз (в том числе острые лейкозы (например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (в том числе миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз и эритролейкоз)) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинная полицитемия, лимфомы (например, болезнь Ходжкина и неходжкинская лимфома), множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей и солидные опухоли, в том числе, не ограничиваясь перечисленными, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогеннаяAdditional diseases or conditions associated with increased cell survival that may be treated, prevented, diagnosed, and/or predicted by antibodies or variants or derivatives thereof of the invention include, but are not limited to, cancer progression and/or metastasis and associated disorders such as leukemia (including acute leukemia (eg, acute lymphocytic leukemia, acute myelocytic leukemia (including myeloblastic, promyelocytic, myelomonocytic, monocytic leukemia, and erythroleukemia)) and chronic leukemia (eg, chronic myelocytic (granulocytic) leukemia and chronic lymphocytic leukemia goats) , polycythemia vera, lymphomas (eg, Hodgkin's disease and non-Hodgkin's lymphoma), multiple myeloma, Waldenström's macroglobulinemia, heavy chain disease and solid tumors, including, but not limited to, sarcomas and carcinomas such as fibrosarcoma, myxosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, osteogenic

- 15 045759 саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома ободочной кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома.- 15 045759 sarcoma, chordoma, angiosarcoma, endothelial sarcoma, lymphangiosarcoma, lymphangioendothelial sarcoma, synovioma, mesothelioma, Ewing's tumor, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, colon carcinoma, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, basal cell carcinoma , adenocarcinoma, sweat gland carcinoma, sebaceous gland carcinoma, papillary carcinoma, papillary adenocarcinomas, cystadenocarcinoma, medullary carcinoma, bronchogenic carcinoma, renal cell carcinoma, hepatoma, bile duct carcinoma, choriocarcinoma, seminoma, embryonal carcinoma, Wilms tumor, cervical cancer uterine cancer, testicular tumor , lung carcinoma, small cell carcinoma of the lung, uric bubble carcinoma, epithelial carcinoma, glioma, astrocytoma, medulloblastoma, craniopharymia, ependema, pinealoma, hemangiwhistoma, acoustic neurinoma, oligodendrolyme, meningioma, melanoma, neo -nominal and nerm Tinoblastoma.

Конкретная дозировка и режим лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включая конкретные используемые антитела, их вариант или производное, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания пациента, а также время введения, скорость выведения, комбинацию назначенных лекарственных средств и тяжесть конкретного заболевания, подлежащего лечению. Оценка таких факторов медицинскими работниками находится в пределах обычной квалификации специалиста в данной области техники. Количество также будет зависеть от конкретного пациента, подлежащего лечению, способа введения, типа рецептуры, характеристик используемого соединения, тяжести заболевания и желаемого эффекта. Используемое количество может быть определено с помощью фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в данной области техники.The specific dosage and treatment regimen for any given patient will depend on a variety of factors, including the specific antibody, variant or derivative used, age, body weight, general health, gender and diet of the patient, as well as the time of administration, rate of elimination, combination of prescribed medications and the severity of the specific disease being treated. The assessment of such factors by medical professionals is within the normal skill of one skilled in the art. The amount will also depend on the particular patient being treated, the route of administration, the type of formulation, the characteristics of the compound used, the severity of the disease and the desired effect. The amount used can be determined using pharmacological and pharmacokinetic principles well known in the art.

Способы введения антител или их вариантов включают, не ограничиваясь перечисленным, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Антигенсвязывающие полипептиды или композиции могут быть введены любым подходящим путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальную выстилку или слизистую оболочку (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.), и могут быть введены вместе с другими биологически активными агентами. Таким образом, фармацевтические композиции, содержащие антигенсвязывающие полипептиды согласно изобретению, могут быть введены перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, интравагинально, внутрибрюшинно, местно (например, с помощью порошков, мазей, капель или трансдермального пластыря), буккально или в виде перорального или назального спрея.Routes of administration of antibodies or variants thereof include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. Antigen-binding polypeptides or compositions can be administered by any suitable route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through the epithelial lining or mucosa (eg, oral mucosa, rectal and intestinal mucosa, etc.), and can be administered together with other biologically active agents. Thus, pharmaceutical compositions containing the antigen-binding polypeptides of the invention can be administered orally, rectally, parenterally, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, topically (for example, by powders, ointments, drops or transdermal patch), buccally, or by oral or nasal administration. spray.

В контексте настоящей заявки термин парентеральный относится к способам введения, включающим внутривенную, внутримышечную, внутрибрюшинную, интрастернальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию.As used herein, the term parenteral refers to routes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous and intra-articular injection and infusion.

Введение может быть системным или местным. Кроме того, может быть желательным введение антител согласно изобретению в центральную нервную систему любым подходящим путем, включая внутрижелудочковую и интратекальную инъекцию; внутрижелудочковая инъекция может быть упрощена с помощью внутрижелудочкового катетера, например, присоединенного к резервуару, такому как резервуар Оммайя. Также может быть использовано пульмональное введение, например, с помощью ингалятора или небулайзера и рецептуры с распыляющим агентом.Administration may be systemic or local. In addition, it may be desirable to administer the antibodies of the invention to the central nervous system by any suitable route, including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection can be simplified by using an intraventricular catheter, for example, attached to a reservoir such as an Ommaya reservoir. Pulmonary administration may also be used, for example, using an inhaler or nebulizer and a nebulizing agent formulation.

Может быть желательно вводить антигенсвязывающие полипептиды или композиции согласно изобретению местным образом в область, нуждающуюся в лечении; это может быть достигнуто, например, не ограничиваясь перечисленным, путем местной инфузии во время хирургического вмешательства, местного нанесения, например, в сочетании с перевязкой раны после хирургического вмешательства, путем инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория или с помощью имплантата, причем указанный имплантат может быть выполнен из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембраны, такие как мембраны Sikalastic, или волокна. Предпочтительно при введении белка, включая антитело, согласно изобретению необходимо следить, чтобы использовались материалы, не абсорбирующие белок.It may be desirable to administer the antigen-binding polypeptides or compositions of the invention locally to the area in need of treatment; this may be achieved, for example, but not limited to, by local infusion during surgery, topical application, for example in combination with wound dressing after surgery, by injection, by catheter, by suppository or by implant, wherein said the implant may be made of porous, non-porous or gel-like material, including membranes such as Sikalastic membranes, or fibers. Preferably, when administering a protein, including an antibody, according to the invention, care must be taken to ensure that non-protein absorbent materials are used.

Количество антител согласно изобретению, которое будет эффективным для лечения, ингибирования и предупреждения воспалительного, иммунного или злокачественного заболевания, расстройства или состояния, может быть определено стандартными клиническими способами. Кроме того, необязательно, в качестве вспомогательных средств для установления оптимальных диапазонов дозировок могут быть использованы in vitro анализы. Точная доза, которую следует использовать в препарате, также будет зависеть от способа введения и серьезности заболевания, расстройства или состояния, и ее следует выбирать в соответствии с мнением практикующего врача и спецификой каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из систем испытаний in vitro или на животных моделях.The amount of antibodies of the invention that will be effective for treating, inhibiting and preventing an inflammatory, immune or malignant disease, disorder or condition can be determined by standard clinical methods. Additionally, in vitro assays may optionally be used as aids in establishing optimal dosage ranges. The exact dosage to be used in a drug will also depend on the route of administration and the severity of the disease, disorder or condition, and should be selected in accordance with the judgment of the practitioner and the specifics of each patient. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained from in vitro test systems or animal models.

В качестве общего предложения, дозировка антигенсвязывающих полипептидов согласно настоящему изобретению, вводимая пациенту, обычно составляет от 0,1 до 100 мг/кг массы тела пациента, от 0,1 до 20 мг/кг массы тела пациента или от 1 до 10 мг/кг массы тела пациента. Как правило, человеческие антитела имеют более длительный период полужизни в организме человека, чем антитела, происходящиеAs a general guideline, the dosage of the antigen binding polypeptides of the present invention administered to a patient is typically 0.1 to 100 mg/kg patient body weight, 0.1 to 20 mg/kg patient body weight, or 1 to 10 mg/kg patient's body weight. In general, human antibodies have a longer half-life in the human body than antibodies originating

- 16 045759 из других видов, что связано с иммунным ответом на чужеродные полипептиды. Таким образом, часто возможно использование более низких дозировок человеческих антител и меньшей частоты введения.- 16 045759 from other species, which is associated with an immune response to foreign polypeptides. Thus, it is often possible to use lower dosages of human antibodies and lower frequency of administration.

Кроме того, дозировка и частота введения антител согласно изобретению может быть уменьшена за счет усиления поглощения и проникновения антител в ткани (например, в мозг) с помощью модификаций, таких как, например, липидирование.In addition, the dosage and frequency of administration of antibodies according to the invention can be reduced by enhancing the uptake and penetration of antibodies into tissues (eg, brain) through modifications such as, for example, lipidation.

В дополнительном варианте реализации композиции согласно изобретению вводят в комбинации с цитокинами. Цитокины, которые могут быть введены с композициями согласно изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, анти-CD40, CD40L и TNF-a.In a further embodiment, the compositions of the invention are administered in combination with cytokines. Cytokines that can be administered with the compositions of the invention include, but are not limited to, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL -13, IL-15, anti-CD40, CD40L and TNF-a.

В дополнительных вариантах реализации композиции согласно изобретению вводят в комбинации с другими терапевтическими или профилактическими схемами, такими как, например, радиационная терапия.In additional embodiments, the compositions of the invention are administered in combination with other therapeutic or prophylactic regimens, such as, for example, radiation therapy.

Способы диагностикиDiagnostic methods

Сверхэкспрессия SIRPa наблюдается в некоторых образцах опухолей, и пациенты, имеющие сверхэкспрессирующие SIRPa клетки, вероятно, будут отвечать на лечение антителами к SIRPa согласно настоящему изобретению. Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению также могут применяться в целях диагностики и прогнозирования.Overexpression of SIRPa is observed in some tumor samples, and patients having SIRPa overexpressing cells are likely to respond to treatment with anti-SIRPa antibodies according to the present invention. Accordingly, the antibodies of the present invention can also be used for diagnostic and prognostic purposes.

Образец, который предпочтительно включает клетку, может быть получен от пациента, который может представлять собой больного раком или пациента, ожидающего диагностики. Клетка может представлять собой клетку опухолевой ткани или опухолевого блока, образца крови, образца мочи или любого образца от пациента. После необязательной предварительной обработки образца он может быть инкубирован с антителом согласно настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих возможность взаимодействия антитела с белком SIRPa, потенциально присутствующим в образце. Могут быть использованы такие способы, как ELISA, в которых используют антитело к SIRPa для обнаружения присутствия белка SIRPa в образце.The sample, which preferably includes a cell, may be obtained from a patient, which may be a cancer patient or a patient awaiting diagnosis. The cell may be a cell from a tumor tissue or tumor block, a blood sample, a urine sample, or any sample from a patient. After optional pre-treatment of the sample, it can be incubated with the antibody of the present invention under conditions that allow the antibody to interact with the SIRPa protein potentially present in the sample. Methods such as ELISA, which use an anti-SIRPa antibody to detect the presence of SIRPa protein in a sample, can be used.

Определение присутствия белка SIRPa в образце (необязательно с определением количества или концентрации) может применяться для диагностики рака, как свидетельство того, что пациент подходит для лечения антителом, или как свидетельство того, что пациент ответил (или не ответил) на лечение рака. Для способа прогнозирования обнаружение может быть осуществлено один, два или более раз, на определенных стадиях, после начала лечения рака, чтобы проверить ход лечения.Determining the presence of SIRPa protein in a sample (optionally with quantitation or concentration) can be used to diagnose cancer, as evidence that a patient is eligible for antibody treatment, or as evidence that a patient has responded (or not responded) to cancer treatment. For a predictive method, detection may be performed one, two or more times, at certain stages, after the start of cancer treatment, to check the progress of treatment.

КомпозицииCompositions

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям. Такие композиции содержат эффективное количество антитела и приемлемый носитель. В некоторых вариантах реализации композиция дополнительно включает второй противораковый агент (например, ингибитор иммунных контрольных точек).The present invention also relates to pharmaceutical compositions. Such compositions contain an effective amount of the antibody and an acceptable carrier. In some embodiments, the composition further includes a second anticancer agent (eg, an immune checkpoint inhibitor).

В отдельном варианте реализации термин фармацевтически приемлемый означает одобренный федеральным или региональным надзорным органом или указанный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее как подходящий для применения у животных и, более конкретно, у человека. Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель обычно представляет собой нетоксичный твердый, полутвердый или жидкий наполнитель, разбавитель, инкапсулирующий материал или вспомогательную композицию любого типа.In a particular embodiment, the term pharmaceutically acceptable means approved by a federal or state regulatory agency or listed in the United States Pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeia as suitable for use in animals and, more particularly, in humans. In addition, the pharmaceutically acceptable carrier is typically a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or any type of adjuvant composition.

Термин носитель относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводится терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобные. Вода является предпочтительным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция при необходимости может также содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов, таких как ацетаты, цитраты или фосфаты. Также предусмотрены антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, драже, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и тому подобного. Композиция может быть получена в виде суппозитория с традиционными связующими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный препарат может включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической степени чистоты и т.д. Примеры подхоThe term carrier refers to a diluent, adjuvant, excipient or excipient with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids such as water and oils, including petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and the like. Water is the preferred carrier for intravenous administration of a pharmaceutical composition. Saline solutions and aqueous solutions of dextrose and glycerol can also be used as liquid carriers, particularly for injection solutions. Suitable pharmaceutical excipients include starch, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, chalk, silica gel, sodium stearate, glycerol monostearate, talc, sodium chloride, skim milk powder, glycerin, propylene glycol, water, ethanol and the like. The composition may optionally also contain minor amounts of wetting or emulsifying agents or buffering agents such as acetates, citrates or phosphates. Antibacterial agents such as benzyl alcohol or methylparabens are also provided; antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite; chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; and agents for adjusting tonicity, such as sodium chloride or dextrose. These compositions may take the form of solutions, suspensions, emulsions, tablets, dragees, capsules, powders, sustained release formulations, and the like. The composition can be formulated as a suppository with conventional binding agents and carriers such as triglycerides. The oral preparation may include standard carriers such as mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, pharmaceutical grade magnesium carbonate, etc. Examples of approaches

- 17 045759 дящих фармацевтических носителей описаны в источнике Remington's Pharmaceutical Sciences за авт. Е. W. Martin, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество антигенсвязывающего полипептида, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения пациенту. Препарат должен соответствовать способу введения. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.- 17 045759 active pharmaceutical carriers are described in the source Remington's Pharmaceutical Sciences per ed. E. W. Martin, incorporated herein by reference. Such compositions will contain a therapeutically effective amount of the antigen binding polypeptide, preferably in purified form, together with a suitable amount of carrier to provide a form for proper administration to a patient. The drug must correspond to the method of administration. The parenteral drug may be contained in ampoules, single-use syringes, or multi-dose vials made of glass or plastic.

В одном варианте реализации рецептура композиции разработана в соответствии с рутинными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буферном растворе. При необходимости композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты поставляются либо по отдельности, либо в виде смеси в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композиция подлежит введению путем инфузии, она может быть помещена, например, в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду фармацевтической степени чистоты или физиологический раствор. Если композиция подлежит введению путем инъекции, может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.In one embodiment, the composition is formulated according to routine procedures as a pharmaceutical composition adapted for intravenous administration to humans. Typically, compositions for intravenous administration are solutions in a sterile isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the composition may also include a solubilizing agent and a local anesthetic, such as lignocaine, to relieve pain at the injection site. Typically, the ingredients are supplied either individually or as a mixture in a unit dosage form, such as a dry lyophilized powder or an anhydrous concentrate in a sealed container such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active agent. If the composition is to be administered by infusion, it may be placed, for example, in an infusion bottle containing sterile pharmaceutical grade water or saline. If the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided so that the ingredients can be mixed before administration.

Соединения согласно изобретению могут быть включены в состав препарата в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные с анионами, такими как соли, полученные с соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотами и т.д., и соли, образованные с катионами, такими как соли, полученные с натрием, калием, аммонием, кальцием, гидроксидами железа (III), изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д.The compounds according to the invention can be included in the preparation in the form of neutral or salt forms. Pharmaceutically acceptable salts include salts formed with anions, such as salts formed with hydrochloric, phosphoric, acetic, oxalic, tartaric acids, etc., and salts formed with cations, such as salts formed with sodium, potassium, ammonium , calcium, iron (III) hydroxides, isopropylamine, triethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine, etc.

ПримерыExamples

Пример 1. Получение мышиных моноклональных антител к SIRPa человекаExample 1. Preparation of mouse monoclonal antibodies to human SIRPa

Белок SIRPa человека использовали для иммунизации различных линий мышей, и соответствующим образом генерировали гибридомы. Было сделано восемь слияний для получения достаточного количества клонов гибридомы. SIRPa v1/v2-положительные связующие вещества отбирали и субклонировали. Затем проводили in vitro связывание и функциональный скрининг с использованием около 30 очищенных антител и выявляли лучшие антитела с самой высокой аффинностью связывания и самой сильной функциональной активностью. Лучшие антитела были гуманизированы.Human SIRPa protein was used to immunize various strains of mice, and hybridomas were generated accordingly. Eight fusions were made to obtain a sufficient number of hybridoma clones. SIRPa v1/v2-positive binders were selected and subcloned. In vitro binding and functional screening was then performed using approximately 30 purified antibodies and the best antibodies with the highest binding affinity and the strongest functional activity were identified. The best antibodies have been humanized.

Последовательности VH/VL лучших мышиных антител представлены в таблице ниже.The VH/VL sequences of the best mouse antibodies are presented in the table below.

Таблица 1. Последовательность VH/VL лучших мышиных антителTable 1. VH/VL sequence of the best mouse antibodies

Название Name Последовательность (CDR подчеркнуты) Sequence (CDRs underlined) SEQ ID NO: SEQ ID NO: 248G3F6 VH 248G3F6 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYMHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKYNPKFQDKATITVDT S SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYMHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKYNPKFQDKATITVDT S SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS 1 1 248G3F6 VL 248G3F6 VL QIVLIQSPAIMSASРGERVTLTCRASSSVSSSYLYWYQQКРGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK QIVLIQSPAIMSASРGERVTLTCRASSSVSSSYLYWYQQКРGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK 2 2 300Аб Аб VH 300Ab Ab VH QVQLQQSGTELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNYIHWIRQQPGNGLEWIGW IYPGDGDTNYNQKFNGKATLTADKS S STAYMQLS SLTS EDYAVYFCAINY GGIWFAYWGQ GT LVTVS S QVQLQQSGTELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNYIHWIRQQPGNGLEWIGW IYPGDGDTNYNQKFNGKATLTADKS S STAYMQLS SLTS EDYAVYFCAINY GGIWFAYWGQ GT LVTVS S 3 3 300Аб Аб VL 300Ab Ab VL DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKSPRLMIHY VTNLPGGVPLRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYYCLQYKQNPLTFGS GTKLEIK DIQMTQSPSSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKSPRLMIHY VTNLPGGVPLRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYYCLQYKQNPLTFGS GTKLEIK 4 4 102A10F2 VH 102A10F2 VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYDIGMGWIRQPSGKGLEWL AHIWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSNTQVFLKIASVDTADTATYYCVRI DYFGSGQAWFTYWGQGTLVTVSA QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYDIGMGWIRQPSGKGLEWL AHIWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSNTQVFLKIASVDTADTATYYCVRI DYFGSGQAWFTYWGQGTLVTVSA 5 5 102A10F2 VL 102A10F2 VL EIVLTQSPPTMAASPGEKITITCSSSSTISSTYLHWYQQKPGFSPKLLIS GTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTIGTLEAEDVATYYCQQGSRIPFTFG SGTKLEIK EIVLTQSPPTMAASPGEKITITCSSSSTISSTYLHWYQQKPGFSPKLLIS GTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTIGTLEAEDVATYYCQQGSRIPFTFG SGTKLEIK 6 6

- 18 045759- 18 045759

62D2H6 VH 62D2H6 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGR IDPEDGETKYAPKFQGKATITADT S SNTAYLQLS S LTS EDTAVYYC S RSW AYWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGR IDPEDGETKYAPKFQGKATITADT S SNTAYLQLS S LTS EDTAVYYC S RSW AYWGQGTTLTVSS 7 7 62D2H6 VL 62D2H6 VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFG GGTKLEIK QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFG GGTKLEIK 8 8 211F8E11 VH 211F8E11 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGR IDPANVNTIYDPKFQGKATITADT S SNTAYLQLS SLTSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGR IDPANVNTIYDPKFQGKATITADT S SNTAYLQLS SLTSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTLTVSS 9 9 211F8E11 VL 211F8E11 VL DIVLTQS PASLAVS LGQRATIS CRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKL LIYRASNLESGI PARE S G S G S RT D FT LTIN PVEADDVATYYCQQNNEDPL TFGAGTKLELK DIVLTQS PASLAVS LGQRATIS CRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKL LIYRASNLESGI PARE S G S G S RT D FT LTIN PVEADDVATYYCQQNNEDPL TFGAGTKLELK 10 10 217D11E5 VH 217D11E5 VH EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSS STAYMELS SLTSEDSAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTLTVSS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSS STAYMELS SLTSEDSAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTLTVSS 11 eleven 217D11E5 VL 217D11E5 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKSGQSPKLLIYS ASYRYTGDPDRFTGSGSGTDFTFTIS SVQAED LAVYYCQQHYSTPWT FG G GTKLEIK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKSGQSPKLLIYS ASYRYTGDPDRFTGSGSGTDFTFTIS SVQAED LAVYYCQQHYSTPWT FG G GTKLEIK 12 12 234B7D5 VH 234B7D5 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYIHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKHNPKFHDKATVTVDTS SNTAYLELS S LTS EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYIHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKHNPKFHDKATVTVDTS SNTAYLELS S LTS EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS 13 13 234B7D5 VL 234B7D5 VL QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVTSSYLYWYQQKPG5SPKLWIY SASNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVTSSYLYWYQQKPG5SPKLWIY SASNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK 14 14

Пример 2. Перекрестное связывание SIRPa v1 и v2Example 2: Crosslinking SIRPa v1 and v2

В этом примере измеряли дозозависимый ответ связывания в ELISA мышиного mAb к SIRPa с рекомбинантным белком SIRPa варианта 1 и варианта 2 человека (0,5 мкг/мл в дозе 100 мкл). Рекомбинантный белок SIRPa v1 или v2 человека (Biointron) наносили в концентрации 0,5 мкг/мл в PBS на микротитровальные планшеты на 2 ч при комнатной температуре. После нанесения антигена лунки блокировали PBS/0,05% твином (PBST) с 1% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре.In this example, the dose-dependent binding response of a mouse anti-SIRPa mAb to recombinant human SIRPa variant 1 and variant 2 protein (0.5 μg/ml in a 100 μl dose) was measured in an ELISA. Recombinant human SIRPa v1 or v2 protein (Biointron) was applied at a concentration of 0.5 μg/ml in PBS to microtiter plates for 2 h at room temperature. After antigen application, wells were blocked with PBS/0.05% Tween (PBST) with 1% BSA for 1 h at room temperature.

После промывки лунок PBST в лунки добавляли различные концентрации антител к SIRPa и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения связывающих антител добавляли HRP-конъюгированные вторичные антитела к мышиному Fc (Jackson Immuno Research) с последующим добавлением флуорогенных субстратов (Roche). Между всеми этапами инкубации лунки планшета трижды промывали PBST. Флуоресценцию измеряли в устройстве для считывания планшетов TECAN Spectrafluor.After washing the wells with PBST, various concentrations of anti-SIRPa antibodies were added to the wells and incubated for 1 h at room temperature. To detect binding antibodies, HRP-conjugated anti-mouse Fc secondary antibodies (Jackson Immuno Research) were added followed by fluorogenic substrates (Roche). Between all incubation steps, the plate wells were washed three times with PBST. Fluorescence was measured in a TECAN Spectrafluor plate reader.

Результаты показаны на фиг. 1. Оба протестированных антитела, 248G3F6 и 300А6А6, продемонстрировали аффинность на уровне нанограммов к обоим вариантам 1 и 2.The results are shown in Fig. 1. Both antibodies tested, 248G3F6 and 300A6A6, demonstrated nanogram-level affinity for both variants 1 and 2.

Анализ кинетики связывания антитела с вариантом 1 проводили с использованием системы Biacore 8K с помощью подхода с захватом человеческих антител. IgG к мышиному Fc иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 в соответствии с инструкцией производителя. Исследуемое антитело вводили и захватывали иммобилизованным IgG к человеческому Fc. По отдельности вводили последовательные концентрации антигена и регистрировали профиль связывания для аналита-антигена в каждой концентрации, соответственно.Antibody binding kinetics analysis of variant 1 was performed using the Biacore 8K system using a human antibody capture approach. Anti-mouse Fc IgG was immobilized on the CM5 sensor chip according to the manufacturer's instructions. The antibody of interest was injected and captured by immobilized anti-human Fc IgG. Separately, successive concentrations of antigen were administered and the binding profile for the analyte-antigen at each concentration was recorded, respectively.

Аналитическую систему регенерировали путем введения 10 мМ глицина-HCl, рН 1,5, в течение 30 с. Рабочий буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% Р20). Температура проведения анализа составляла 25 °С, а время ассоциации и диссоциации составляло 180 и 600 с соответственно. Данные Biacore аппроксимировали с использованием программного обеспечения для оценки Biacore K8 1.0 в соответствии с моделью связывания 1:1 для расчета констант скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd), a также константы равновесия (KD).The analytical system was regenerated by introducing 10 mM glycine-HCl, pH 1.5, for 30 s. The running buffer was HBS-EP+ (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% P20). The assay temperature was 25°C, and the association and dissociation times were 180 and 600 s, respectively. Biacore data were fitted using Biacore K8 1.0 evaluation software according to a 1:1 binding model to calculate association (ka) and dissociation (kd) rate constants as well as equilibrium constant (KD).

Результаты показаны на фиг. 2 и обобщены в таблице ниже. Оба протестированных антитела проявили превосходную аффинность связывания.The results are shown in Fig. 2 and summarized in the table below. Both antibodies tested showed excellent binding affinity.

Образец Sample ka (1/Mc) ka (1/Mc) kd (1/c) kd(1/c) KD (M) KD(M) 248G3F6 248G3F6 l,87E+05 l,87E+05 3,74E-04 3.74E-04 2,00E-09 2.00E-09 300A6A6 300A6A6 l,31E+05 l,31E+05 l,48E-04 l,48E-04 1ДЗЕ-09 1DZE-09

Пример 3. Конкуренция с CD47Example 3: Competition with CD47

В этом примере исследовали способность антител к SIRPa конкурировать с CD47 за связывание с SIRPa.In this example, the ability of anti-SIRPa antibodies to compete with CD47 for binding to SIRPa was examined.

Рекомбинантный слитый белок CD47-Fc (Acrobiosystems) наносили в концентрации 1 мкг/мл в PBS на микротитровальные планшеты на 16 ч при 4°С. После блокирования в течение 1 ч 1% BSA в PBST при комнатной температуре добавляли 1 мкг/мл белка SIRPa-His либо в отсутствие, либо в присутствии различных концентраций антител к SIRPa при комнатной температуре на 1 ч. Затем планшеты трижды промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным вторичным антителом к His в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки в каждую лунку на 30 мин добавляли раствор ТМВ, останавливали реакцию 2М H2SO4 и измеряли OD (оптическую плотность) при 490 нм.Recombinant CD47-Fc fusion protein (Acrobiosystems) was applied at a concentration of 1 μg/ml in PBS to microtiter plates for 16 h at 4°C. After blocking for 1 h with 1% BSA in PBST at room temperature, 1 μg/ml SIRPa-His protein was added either in the absence or presence of various concentrations of anti-SIRPa antibodies at room temperature for 1 h. The plates were then washed three times and incubated with HRP -conjugated secondary antibody to His for 1 hour at room temperature. After washing, TMB solution was added to each well for 30 min, the reaction was stopped with 2M H2SO4, and OD (optical density) was measured at 490 nm.

Как показано на фиг. 3, как 248G3F6, так и 300А6А6 сильно и дозозависимо ингибировали связывание CD47 с SIRPa.As shown in FIG. 3, both 248G3F6 and 300A6A6 potently and dose-dependently inhibited CD47 binding to SIRPa.

Пример 4. Индукция опосредованного макрофагами фагоцитозаExample 4: Induction of Macrophage-Mediated Phagocytosis

- 19 045759- 19 045759

В этом примере исследовали способность антител к SIRPa индуцировать опосредованный макрофагами фагоцитоз.In this example, the ability of anti-SIRPa antibodies to induce macrophage-mediated phagocytosis was examined.

Выделяли МНПК (мононуклеарные клетки периферической крови) из крови человека и дифференцировали моноциты в макрофаги в течение 6 дней. Макрофаги моноцитарного происхождения (MDM) соскабливали и повторно высевали в 24-луночные планшеты и оставляли для осуществления адгезии на 24 ч. Линию клеток опухоли человека Raji, которая эндогенно экспрессировала CD47, трансфицировали PD-L1 человека для сверхэкспрессии PD-L1 человека на поверхности. Эти сверхэкспрессирующие PD-L1 клетки Raji выбирали в качестве клеток-мишеней и метили 1 мкМ CFSE в течение 10 мин, затем добавляли к MDM в соотношении 5:1 опухолевых клеток на фагоцит.PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) were isolated from human blood and monocytes were differentiated into macrophages within 6 days. Monocyte-derived macrophages (MDM) were scraped and replated into 24-well plates and allowed to adhere for 24 hours. The human tumor cell line Raji, which endogenously expressed CD47, was transfected with human PD-L1 to overexpress human PD-L1 on the surface. These PD-L1-overexpressing Raji cells were selected as target cells and labeled with 1 μM CFSE for 10 min, then added to MDM at a ratio of 5:1 tumor cells per phagocyte.

В культуральную систему добавляли антитела к SIRP-альфа и антитело к PD-L1. После инкубации в течение 3 ч нефагоцитированные клетки-мишени смывали PBS, а оставшиеся фагоциты соскабливали, окрашивали антителом С76 к маркеру макрофагов и анализировали с помощью проточной цитометрии. Фагоцитоз измеряли путем гейтирования по клеткам С76+, а затем оценки процента клеток CFSE+.Anti-SIRP-alpha antibody and anti-PD-L1 antibody were added to the culture system. After incubation for 3 h, nonphagocytosed target cells were washed with PBS, and remaining phagocytes were scraped off, stained with macrophage marker antibody C76, and analyzed by flow cytometry. Phagocytosis was measured by gating on C76 + cells and then assessing the percentage of CFSE+ cells.

Результаты фагоцитоза опухолевых клеток, экспрессирующих PD-L1, за счет комбинированной обработки антителом к SIRPa и антителом к PD-L1 показаны на фиг. 4. Комбинация антитела к PD-L1 с любым из антител к SIRPa демонстрировала самый высокий фагоцитоз (две колонки справа).The results of phagocytosis of tumor cells expressing PD-L1 by combined treatment with anti-SIRPa antibody and anti-PD-L1 antibody are shown in FIG. 4. The combination of anti-PD-L1 antibody with any of the anti-SIRPa antibodies demonstrated the highest phagocytosis (two columns on the right).

Пример 5. Гуманизация мышиных mAbExample 5 Humanization of Murine mAbs

Гены вариабельных областей мышиных антител использовали для создания гуманизированных mAb. На первом этапе этого процесса аимнокислотные последовательности VH и VL mAb сравнивали с доступной базой данных последовательностей генов Ig человека, чтобы найти наиболее совпадающие последовательности генов зародышевой линии Ig человека.Mouse antibody variable region genes were used to create humanized mAbs. In the first step of this process, the amino acid sequences of the VH and VL mAbs were compared to an available database of human Ig gene sequences to find the best matching human Ig germline gene sequences.

Аминокислотные последовательности гуманизированного антитела представлены ниже.The amino acid sequences of the humanized antibody are presented below.

Гуманизированные последовательности A. 248G3F6Humanized sequences of A. 248G3F6

Таблица 2А. Гуманизация 248G3F6-VHTable 2A. Humanization 248G3F6-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 248G3F6 VH 248G3F6 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYMHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKYNPKFQDKATITVDT S SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYMHWVKQRPDQGLEWIGR IDPADGDTKYNPKFQDKATITVDT S SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTLTVSS 1 1 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTMTRDT S Т S Т VYME L S S L RS EDTAVYYCARGN YVNWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTMTRDT S T S T VYME L S S L RS EDTAVYYCARGN YVNWGQGTTVTVSS 23 23 V2 (с обратными мутациями) V2 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS 24 24 V3 (с обратными мутациями) V3 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADGDTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS 25 25 V4 (с обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPAEGDTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPAEGDTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS 26 26 V5 (с обратными мутациями) V5 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADADTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPADADTKYNPKFQDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGN YVNWGQGTTVTVSS 27 27

Таблица 2В. Последовательности CDRTable 2B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 DTYMH DTYMH 15 15 CDR-H2 CDR-H2 RIDPADGDTKYNPKFQD RIDPADGDTKYNPKFQD 16 16 CDR-H3 CDR-H3 GNYVN GNYVN 17 17 CDR-H2 (v4) CDR-H2 (v4) RIDPAEGDTKYNPKFQD RIDPAEGDTKYNPKFQD 21 21 CDR-H2 (v5) CDR-H2 (v5) RIDPADADTKYNPKFQD RIDPADADTKYNPKFQD 22 22

Таблица 2С. Гуманизация 248G3F6-VLTable 2C. Humanization 248G3F6-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 248G3F6 VL 248G3F6 VL QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIY STSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWYSYPRTFG GGTKLEIK 2 2 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFG GGTKVEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFG GGTKVEIK 28 28 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFG GGTKVEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIY STSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFG GGTKVEIK 29 29

Таблица 2D. Последовательности CDRTable 2D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 RASSSVSSSYLY RASSSVSSSYLY 18 18 CDR-L2 CDR-L2 STSNLAS STSNLAS 19 19 CDR-L3 CDR-L3 HQWYSYPRT HQWYSYPRT 20 20

- 20 045759- 20 045759

Таблица 2Е. Гуманизированные антителаTable 2E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VLv2 VLv2 VH VH HSP210-02-Chi HSP210-02-Chi VHvl VHvl HSP210-02-hzll HSP210-02-hzll HSP210-02-hzl2 HSP210-02-hzl2 VHv2 VHv2 HSP210-02-hz21 HSP210-02-hz21 HSP210-02-hz22 HSP210-02-hz22 VHv3 VHv3 HSP210-02-hz31 HSP210-02-hz31 HSP210-02-hz32 HSP210-02-hz32 VHv4 VHv4 HSP210-02-hz41 HSP210-02-hz41 HSP210-02-hz42 HSP210-02-hz42 VHv5 VHv5 HSP210-02-hz51 HSP210-02-hz51 HSP210-02-hz52 HSP210-02-hz52

В. 300А6А6V. 300A6A6

Таблица 3А. Гуманизация 3OOA6A6-VHTable 3A. Humanization 3OOA6A6-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 300A6A6 VH 300A6A6 VH QVQLQQSGTELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNYIHWIRQQPGNGLEWIGW IYPGDGDTNYNQKFNGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDYAVYFCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVS S QVQLQQSGTELVKPGSSVKISCKASGYTFTSNYIHWIRQQPGNGLEWIGW IYPGDGDTNYNQKFNGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDYAVYFCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVS S 3 3 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTITADKST STAYMELS SLRSEDTAVYYCARNY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTITADKST STAYMELS SLRSEDTAVYYCARNY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 39 39 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 40 40 V3 (c обратными мутациями) V3 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 41 41 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGEGDTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGEGDTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 42 42 V5 (c обратными мутациями) V5 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDADTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDADTNYNQKFNGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 43 43 V6 (c обратными мутациями) V6 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGW IYPGDGDTNYNQKFQGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAINY GGIWFAYWGQGTLVTVSS 44 44

Таблица 3В. Последовательности CDRTable 3B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 SNYIH SNYIH 30 thirty CDR-H2 CDR-H2 WIYPGDGDTNYNQKFNG WIYPGDGDTNYNQKFNG 31 31 CDR-H3 CDR-H3 NYGGIWFAY NYGGIWFAY 32 32 CDR-H2 (v4) CDR-H2 (v4) WIYPGEGDTNYNQKFNG WIYPGEGDTNYNQKFNG 36 36 CDR-H2 (v5) CDR-H2 (v5) WIYPGDADTNYNQKFNG WIYPGDADTNYNQKFNG 37 37 CDR-H2 (v6) CDR-H2 (v6) WIYPGDGDTNYNQKFQG WIYPGDGDTNYNQKFQG 38 38

Таблица 3С. Гуманизация 300A6A6-VLTable 3C. Humanization 300A6A6-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 300A6A6 VL 300A6A6 VL DIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKSPRLMIHY VTNLPGGVPLRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYYCLQYKQNPLTFGS GTKLEIK DIQMTQSPSSSMSASLGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKSPRLMIHY VTNLPGGVPLRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDMADYYCLQYKQNPLTFGS GTKLEIK 4 4 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGNKLIWYQQKPGKAPKLLIYY VTNLPGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYKQNPLTFGQ GTKLEIK DIQMTQSPSSSLSASVGDRVTITCQASQDIGNKLIWYQQKPGKAPKLLIYY VTNLPGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYKQNPLTFGQ GTKLEIK 45 45 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKAPKLLIHY VTNLPGGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYKQNPLTFGQ GTKLEIK DIQMTQSPSSSLSASVGDRVTITCQASQDIGNKLIWFQQKPGKAPKLLIHY VTNLPGGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYKQNPLTFGQ GTKLEIK 46 46

Таблица 3D. Последовательности CDRTable 3D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 QASQDIGNKLI QASQDIGNKLI 33 33 CDR-L2 CDR-L2 YVTNLPG YVTNLPG 34 34 CDR-L3 CDR-L3 LQYKQNPLT LQYKQNPLT 35 35

Таблица 3Е. Гуманизированные антителаTable 3E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VL v2 VL v2 VH VH HSP210-03-Chi HSP210-03-Chi VHvl VHvl HSP210-03-hzll HSP210-03-hzll HSP210-03-hzl2 HSP210-03-hzl2 VHv2 VHv2 HSP210-03-hz21 HSP210-03-hz21 HSP210-03-hz22 HSP210-03-hz22 VHv3 VHv3 HSP210-03-hz31 HSP210-03-hz31 HSP210-03-hz32 HSP210-03-hz32 VHv4 VHv4 HSP210-03-hz41 HSP210-03-hz41 HSP210-03-hz42 HSP210-03-hz42 VHv5 VHv5 HSP210-03-hz51 HSP210-03-hz51 HSP210-03-hz52 HSP210-03-hz52 VHv6 VHv6 HSP210-03-hz61 HSP210-03-hz61 HSP210-03-hz62 HSP210-03-hz62

С. 102A10F2S. 102A10F2

Таблица 4А. Гуманизация 102A10F2-VHTable 4A. Humanization 102A10F2-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 102A10F2 VH 102A10F2 VH QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYDIGMGWIRQPSGKGLEWLAH IWWNDREYYNSALQSRVTI5KDT5MTQVFLKIASVDTADTATYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQ GT LVTVSA QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYDIGMGWIRQPSGKGLEWLAH IWWNDREYYNSALQSRVTI5KDT5MTQVFLKIASVDTADTATYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQ GT LVTVSA 5 5 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIGH IWWNDREYYNSALQSRVTISVDT S KNQFS LKLS SVTAADTAVYYCARIDYFG SGQAWFTYWGQ GT LVTVS S QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIGH IWWNDREYYNSALQSRVTISVDT S KNQFS LKLS SVTAADTAVYYCARIDYFG SGQAWFTYWGQ GT LVTVS S 55 55

- 21 045759- 21 045759

V2 (с обратными мутациями) V2 (with back mutations) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIGH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIGH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS 56 56 V3 (с обратными мутациями) V3 (with back mutations) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS 57 57 V4 (с обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLSTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLSTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS 58 58 V5 (с обратными мутациями) V5 (with back mutations) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYSSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYSSALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS 59 59 V6 (с обратными мутациями) V6 (with back mutations) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNPALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTFSGFSLNTYDIGMGWIRQPPGKGLEWIAH IWWNDREYYNPALQSRVTISKDTSKTQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRIDYFG SGQAWFTYWGQGTLVTVSS 60 60

Таблица 4В. Последовательности CDRTable 4B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 TYDIGMG TYDIGMG 47 47 CDR-H2 CDR-H2 HIWWNDREYYNSALQS HIWWNDREYYNSALQS 48 48 CDR-H3 CDR-H3 IDYFGSGQAWFTY IDYFGSGQAWFTY 49 49 CDR-H2 (v5) CDR-H2 (v5) HIWWNDREYYSSALQS HIWWNDREYYSSALQS 53 53 CDR-H2 (v6) CDR-H2 (v6) HIWWNDREYYNPALQS HIWWNDREYYNPALQS 54 54

Таблица 4С. Гуманизация 102A10F2-VLTable 4C. Humanization 102A10F2-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 102A10F2 VL 102A10F2 VL EIVLTQSPPTMAASPGEKITITCSSSSTISSTYLHWYQQKPGFSPKLLIS STSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTIGTLEAEDVATYYCQQSSRIPFTFG SGTKLEIK EIVLTQSPPTMAASPGEKITITCSSSSTISSTYLHWYQQKPGFSPKLLIS STSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLTIGTLEAEDVATYYCQQSSRIPFTFG SGTKLEIK 6 6 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSSSSTISSTYLHWYQQKPGQAPRLLIY GTSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGSRIPFTFG QGTKLEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCSSSSTISSTYLHWYQQKPGQAPRLLIY GTSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGSRIPFTFG QGTKLEIK 61 61 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCSSSSTISSTYLHWYQQKPGQAPRLLIS GTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDVAVYYCQQGSRIPFTFG QGTKLEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCSSSSTISSTYLHWYQQKPGQAPRLLIS GTSNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDVAVYYCQQGSRIPFTFG QGTKLEIK 62 62

Таблица 4D. Последовательности CDRTable 4D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 SSSSTISSTYLH SSSSTISSTYLH 50 50 CDR-L2 CDR-L2 GTSNLAS GTSNLAS 51 51 CDR-L3 CDR-L3 QQGSRIPFT QQGSRIPFT 52 52

Таблица 4Е. Гуманизированные антителаTable 4E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VL v2 VL v2 VH VH HSP210-01-Chi HSP210-01-Chi VHvl VHvl HSP210-01-hzll HSP210-01-hzll HSP210-01-hzl2 HSP210-01-hzl2 VHv2 VHv2 HSP210-01-hz21 HSP210-01-hz21 HSP210-01-hz22 HSP210-01-hz22 VHv3 VHv3 HSP210-01-hz31 HSP210-01-hz31 HSP210-01-hz32 HSP210-01-hz32 VH v4 VH v4 HSP210-01-hz41 HSP210-01-hz41 HSP210-01-hz42 HSP210-01-hz42 VHv5 VHv5 HSP210-01-hz51 HSP210-01-hz51 HSP210-01-hz52 HSP210-01-hz52 VHv6 VHv6 HSP210-01-hz61 HSP210-01-hz61 HSP210-01-hz62 HSP210-01-hz62

D. 62D2H6D.62D2H6

Таблица 5А. Гуманизация 62D2H6-VHTable 5A. Humanization 62D2H6-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 62D2H6 VH 62D2H6 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGR IDPEDGETKYAPKFQGKATITADTS SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCSRSW AYWGQGTTLTVSS EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRTEQGLEWIGR IDPEDGETKYAPKFQGKATITADTS SNTAYLQLS S LT S EDTAVYYCSRSW AYWGQGTTLTVSS 7 7 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSW AYWGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATSW AYWGQGTTVTVSS 69 69 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSW AYWGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSW AYWGQGTTVTVSS 70 70 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS OKAS G FNIKDYYMHWVRQAPGQGL EWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSW AYWGQGTTVTVSS QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS OKAS G FNIKDYYMHWVRQAPGQGL EWMGR IDPEDGETKYAPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSW AYWGQGTTVTVSS 71 71 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS OKAS G FNIKDYYMHWVRQAP GQGL EWMG R IDPEDGETKYAPKFQGRVTMTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSW AYWGQGTTVTVSS QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS OKAS G FNIKDYYMHWVRQAP GQGL EWMG R IDPEDGETKYAPKFQGRVTMTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSW AYWGQGTTVTVSS 72 72

Таблица 5В. Последовательности CDRTable 5B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 DYYMH DYYMH 63 63 CDR-H2 CDR-H2 RIDPEDGETKYAPKFQG RIDPEDGETKYAPKFQG 64 64 CDR-H3 CDR-H3 SWAY SWAY 65 65

- 22 045759- 22 045759

Таблица 5С. Гуманизация 62D2H6-VLTable 5C. Humanization 62D2H6-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 62D2H6 VL 62D2H6 VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFGGGTK LEIK QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYST SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFGGGTK LEIK 8 8 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK 73 73 V2 (с обратными мутациями) V2 (with back mutations) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYFCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYFCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK 74 74 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK 75 75 V4 (с обратными мутациями) V4 (with back mutations) EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAAVYFCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAAVYFCHQWSSYPRTFGGGTK VEIK 76 76

Таблица 5D. Последовательности CDRTable 5D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 SASSSVSSSYLY SASSSVSSSYLY 66 66 CDR-L2 CDR-L2 STSNLAS STSNLAS 67 67 CDR-L3 CDR-L3 HQWSSYPRT HQWSSYPRT 68 68

Таблица 5Е. Гуманизированные антителаTable 5E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VLv2 VLv2 VLv3 VLv3 VLv4 VLv4 VH VH Химерное Chimeric VHvl VHvl hzll hzll VHv2 VHv2 hz22 hz22 hz24 hz24 VHv3 VHv3 hz33 hz33 VHv4 VHv4 hz42 hz42 hz44 hz44

Е. 211F8E11E. 211F8E11

Таблица 6А. Гуманизация 211F8E11-VHTable 6A. Humanization 211F8E11-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 211F8E11 VH 211F8E11 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGR IDPANVNTIYDPKFQGKATITADT S SNTAYLQL S S LT S EDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTLTVS S EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWVGR IDPANVNTIYDPKFQGKATITADT S SNTAYLQL S S LT S EDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTLTVS S 9 9 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTITADT S T DTAYMEL S S LRS EDTAVYYCATVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTITADT S T DTAYMEL S S LRS EDTAVYYCATVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS 83 83 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS 84 84 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS 85 85 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTMTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGR IDPANVNTIYDPKFQGRVTMTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARVG AYDGYDFDYWGQGTTVTVSS 86 86 Название Name Таблица 6В. Последовательности CDR CDR Последовательность SEQ ID NO: CDR-H1 DTYMH 77 CDR-H2 RIDPANVNTIYDPKFQG 78 CDR-H3 VGAYDGYDFDY 79 Таблица 6С. Гуманизация 211F8E11-VL Последовательность Table 6B. CDR sequences CDR Sequence SEQ ID NO: CDR-H1 DTYMH 77 CDR-H2 RIDPANVNTIYDPKFQG 78 CDR-H3 VGAYDGYDFDY 79 Table 6C. Humanization 211F8E11-VL Subsequence SEQ ID NO: | SEQ ID NO: | 211F8E11 VL 211F8E11 VL DIVLTQS PAS LAVS LGQRATIS CRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGIPAR FS G S G S RTD FT LTIN PVEADDVATYYCQQNNEDPLTFGA GTKLELK DIVLTQS PAS LAVS LGQRATIS CRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGIPAR FS G S G S RTD FT LTIN PVEADDVATYYCQQNNEDPLTFGA GTKLELK 10 10 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGVPDR FSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGVPDR FSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK 87 87 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLI YRASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK 88 88 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGKVPKLLI YRASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK DIQMTQSPSSLSSASVGDRVTITCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGKVPKLLI YRASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK 89 89 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGKVPKLLI YRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK DIQLTQSPSSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGKVPKLLI YRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQNNEDPLTFGQ GTKLEIK 90 90

Таблица 6D. Последовательности CDRTable 6D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 RASESVDNYGNSFMH RASESVDNYGNSFMH 80 80 CDR-L2 CDR-L2 RASNLES RASNLES 81 81 CDR-L3 CDR-L3 QQNNEDPLT QQNNEDPLT 82 82

- 23 045759- 23 045759

Таблица 6Е. Гуманизированные антителаTable 6E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VLv2 VLv2 VLv3 VLv3 VLv4 VLv4 VH VH Химерное Chimeric VHvl VHvl hzll hzll VHv2 VHv2 hz22 hz22 hz24 hz24 VHv3 VHv3 hz33 hz33 VHv4 VHv4 hz42 hz42 hz44 hz44

F. 217D11E5F.217D11E5

Таблица 7А. Гуманизация 217D11E5-VHTable 7A. Humanization 217D11E5-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 217D11E5 VH 217D11E5 VH EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNBKFKGKATLTSDKSSS T AYME L S S LT S ED SAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTT LTVSS EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNBKFKGKATLTSDKSSS T AYME L S S LT S ED SAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTT LTVSS 11 eleven VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) QVQ LVQS GAEVKKP GASVKVS C KAS GYT FT SYVMHWVRQAP GQRLEWMGY INPYNDGTKYNBKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVSS QVQ LVQS GAEVKKP GASVKVS C KAS GYT FT SYVMHWVRQAP GQRLEWMGY INPYNDGTKYNBKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVSS 97 97 V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVS S QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTITSDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVS S 98 98 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGS FDYWGQGTTVTVS S QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGS FDYWGQGTTVTVS S 99 99 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTMTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQGLEWMGY INPYNDGTKYNEKFKGRVTMTSDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSY YDYDGSFDYWGQGTTVTVSS 100 100

Таблица 7В. Последовательности CDRTable 7B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 SYVMH SYVMH 91 91 CDR-H2 CDR-H2 YINPYNDGTKYNEKFKG YINPYNDGTKYNEKFKG 92 92 CDR-H3 CDR-H3 SYYDYDGSFDY SYYDYDGSFDY 93 93

Таблица 7С. Гуманизация 217D11E5-VLTable 7C. Humanization 217D11E5-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 217D11E5 VL 217D11E5 VL DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKSGQSPKLLIYSAS YRYTGDPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKL EIK DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTTAVAWYQQKSGQSPKLLIYSAS YRYTGDPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKL EIK 12 12 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGКАРKLLIYSAS YRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFGGGTKV EIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKARKLLIYSAS YRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPWTFGGGTKV EIK 101 101 V2 (химерное 2) V2 (chimeric 2) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKVPKLLIYSAS YRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHYSTPWTFGGGTKV EIK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVTTAVAWYQQKPGKVPKLLIYSAS YRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHYSTPWTFGGGTKV EIK 102 102

Таблица 7D. Последовательности CDRTable 7D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 KASQDVTTAVA KASQDVTTAVA 94 94 CDR-L2 CDR-L2 SASYRYT SASYRYT 95 95 CDR-L3 CDR-L3 QQHYSTPWT QQHYSTPWT 96 96

Таблица 7Е. Гуманизированные антителаTable 7E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VLv2 VLv2 VH VH Химерное Chimeric VHvl VHvl hzll hzll VHv2 VHv2 hz21 hz21 hz22 hz22 VHv3 VHv3 VHv4 VHv4 hz41 hz41 hz42 hz42

G. 234B7D5G. 234B7D5

Таблица 8А. Гуманизация 234B7D5-VHTable 8A. Humanization 234B7D5-VH

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 234B7D5 VH 234B7D5 VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYIHWVKQRPDQGLEWIGRID PADGDTKHNPKFHDKATVTVDTSSNTAYLELSSLTSEDTAVYYCVRGNYVNW EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNFEDTYIHWVKQRPDQGLEWIGRID PADGDTKHNPKFHDKATVTVDTSSNTAYLELSSLTSEDTAVYYCVRGNYVNW 13 13 GQGTTLTVSS GQGTTLTVSS VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNFEDTYIHWVQQAPGKGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTITADT S T DTAYME L S S L RS EDTAVYYCATGNYVNW EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNFEDTYIHWVQQAPGKGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTITADT S T DTAYME L S S L RS EDTAVYYCATGNYVNW 109 109 GQGTTVTVSS GQGTTVTVSS V2 (c обратными мутациями) V2 (with back mutations) EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNFEDTYIHWVQQAPGKGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGNYVNW GQGTTVTVSS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGFNFEDTYIHWVQQAPGKGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTITVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGNYVNW GQGTTVTVSS 110 110 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVNW GQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYVNW GQGTTVTVSS 111 111 V4 (c обратными мутациями) V4 (with back mutations) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGNYVNW GQGTTVTVSS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNFEDTYIHWVRQAPGQGLEWMGRID PADGDTKHNPKFHDRVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGNYVNW GQGTTVTVSS 112 112

- 24 045759- 24 045759

Таблица 8В. Последовательности CDRTable 8B. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-H1 CDR-H1 DTYIH DTYIH 103 103 CDR-H2 CDR-H2 RIDPADGDTKHNPKFHD RIDPADGDTKHNPKFHD 104 104 CDR-H3 CDR-H3 GNYVN GNYVN 105 105

Таблица 7С. Гуманизация 234B7D5-VLTable 7C. Humanization 234B7D5-VL

Название Name Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: 234B7D5 VL 234B7D5 VL QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVTSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSA SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAASYFCHQWYSYPRTFGGGTK LEIK QIVLIQSPAIMSASPGERVTLTCRASSSVTSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSA SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAASYFCHQWYSYPRTFGGGTK LEIK 14 14 VI (привитие CDR) VI (CDR grafting) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 113 113 V2 (с обратными мутациями) V2 (with back mutations) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 114 114 V3 (химерное 2) V3 (chimeric 2) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 115 115 V4 (с обратными мутациями) V4 (with back mutations) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVLTQSPGTLLSLSPGERATLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 116 116 V5 (химерное 3) V5 (chimera 3) EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 117 117 V6 (с обратными мутациями) V6 (with back mutations) EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASSSVTSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSA SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAAVYFCHQWYSYPRTFGGGTK VEIK 118 118

Таблица 8D. Последовательности CDRTable 8D. CDR sequences

CDR CDR Последовательность Subsequence SEQ ID NO: SEQ ID NO: CDR-L1 CDR-L1 RASSSVTSSYLY RASSSVTSSYLY 106 106 CDR-L2 CDR-L2 SASNLAS SASNLAS 107 107 CDR-L3 CDR-L3 HQWYSYPRT HQWYSYPRT 108 108

Таблица 8Е. Гуманизированные антителаTable 8E. Humanized Antibodies

VL VL VLvl VLvl VLv2 VLv2 VLv3 VLv3 VLv4 VLv4 VLv5 VLv5 VLv6 VLv6 VH VH Химерное Chimeric VHvl VHvl hzll hzll VHv2 VHv2 hz22 hz22 hz24 hz24 hz26 hz26 VHv3 VHv3 hz33 hz33 VHv4 VHv4 hz42 hz42 hz44 hz44 hz46 hz46

Пример 6. Тестирование гуманизированных антителExample 6 Testing Humanized Antibodies

В данном примере тестировали некоторые из гуманизированных антител на способность блокировать взаимодействия между SIRPa и CD47.In this example, some of the humanized antibodies were tested for the ability to block interactions between SIRPa and CD47.

Рекомбинантный слитый белок CD47-Fc (Acrobiosystems) наносили в концентрации 1 мкг/мл в PBS на микротитровальные планшеты на 16 ч при 4°С. После блокирования в течение 1 ч 1% BSA в PBST при комнатной температуре добавляли 1 мкг/мл белка SIRPa-His либо в отсутствие, либо в присутствии различных концентраций антител к SIRPa при комнатной температуре на 1 ч. Затем планшеты трижды промывали и инкубировали с HRP-конъюгированным вторичным антителом к His в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки в каждую лунку на 30 минут добавляли раствор ТМВ, останавливали реакцию 2М H2SO4 и измеряли OD при 490 нм.Recombinant CD47-Fc fusion protein (Acrobiosystems) was applied at a concentration of 1 μg/ml in PBS to microtiter plates for 16 h at 4°C. After blocking for 1 h with 1% BSA in PBST at room temperature, 1 μg/ml SIRPa-His protein was added either in the absence or presence of various concentrations of anti-SIRPa antibodies at room temperature for 1 h. The plates were then washed three times and incubated with HRP -conjugated secondary antibody to His for 1 hour at room temperature. After washing, TMB solution was added to each well for 30 minutes, the reaction was stopped with 2M H 2 SO 4 and OD was measured at 490 nm.

Все антитела, перечисленные в таблицах 2Е (248G3F6), 3Е (300А6А6) и 4Е (102A10F2), были протестированы и продемонстрировали высокое значение IC50 (табл. 9).All antibodies listed in Tables 2E (248G3F6), 3E (300A6A6) and 4E (102A10F2) were tested and demonstrated high IC50 values (Table 9).

Таблица 9. Активность гуманизированных антител в отношении блокирования взаимодействия SIRPa с CD47Table 9. Activity of humanized antibodies in blocking the interaction of SIRPa with CD47

Антитело Antibody IC50 (нМ) IC50 (nM) 248G3F6 248G3F6 02-chi 02-chi 0,14 0.14 02-hz22 02-hz22 0,092 0.092 02-hz32 02-hz32 0,11 0.11 02-hz42 02-hz42 0,12 0.12 02-hz52 02-hz52 0,11 0.11 300A6A6 300A6A6 03-chi 03-chi 0,14 0.14 03-hz22 03-hz22 0,16 0.16 03-hz32 03-hz32 0,145 0.145 03-hz42 03-hz42 0,13 0.13 03-hz52 03-hz52 0,13 0.13 102A10F2 102A10F2 01-hz22 01-hz22 0,21 0.21 01-hz32 01-hz32 0,16 0.16 01-hz52 01-hz52 0,23 0.23 01-hz61 01-hz61 0,21 0.21 01-hz62 01-hz62 0,16 0.16

- 25 045759- 25 045759

Пример 7. Повышение опосредованного макрофагами фагоцитоза опухолевых клетокExample 7: Enhancing Macrophage-Mediated Phagocytosis of Tumor Cells

В данном примере тестировали некоторые из гуманизированных антител на их способность увеличивать опосредованный макрофагами фагоцитоз опухолевых клеток.In this example, some of the humanized antibodies were tested for their ability to enhance macrophage-mediated phagocytosis of tumor cells.

Выделяли МНПК из крови человека и дифференцировали моноциты в макрофаги, используя стандартный протокол. Макрофаги моноцитарного происхождения (MDM) соскабливали и повторно высевали в 24-луночные планшеты и оставляли для осуществления адгезии на 24 ч. Линию клеток опухоли человека Raji, которая эндогенно экспрессировала CD47, выбирали в качестве клеток-мишеней и метили 1 мкМ CFSE в течение 10 мин, затем добавляли к MDM в соотношении 5:1 опухолевых клеток на фагоцит и добавляли различные концентрации антител к SIRPa в указанных концентрациях. После 3 ч инкубации нефагоцитированные клетки-мишени смывали PBS, а оставшиеся фагоциты соскабливали, окрашивали антителом С76 и анализировали с помощью проточной цитометрии. Фагоцитоз измеряли путем гейтирования по клеткам С76+, а затем оценки процента клеток CFSE+.PBMCs were isolated from human blood and monocytes were differentiated into macrophages using a standard protocol. Monocyte-derived macrophages (MDM) were scraped and replated into 24-well plates and allowed to adhere for 24 hours. The Raji human tumor cell line, which endogenously expressed CD47, was selected as target cells and labeled with 1 μM CFSE for 10 minutes. , were then added to MDM at a ratio of 5:1 tumor cells per phagocyte, and various concentrations of anti-SIRPa antibodies were added at the indicated concentrations. After 3 h of incubation, nonphagocytosed target cells were washed with PBS, and the remaining phagocytes were scraped off, stained with C76 antibody, and analyzed by flow cytometry. Phagocytosis was measured by gating on C76 + cells and then assessing the percentage of CFSE+ cells.

Результаты представлены на фиг. 5. Из протестированных антител 02-hz52 (248G3F6) и 03-hz51 (300A6A6) проявляли наибольшую активность, и все остальные также проявляли превосходную активность.The results are presented in Fig. 5. Of the antibodies tested, 02-hz52 (248G3F6) and 03-hz51 (300A6A6) showed the greatest activity, and all others also showed excellent activity.

Пример 8. Аффинность связывания с SIRPa v1 и v2Example 8: Binding affinity for SIRPa v1 and v2

В данном примере гуманизированные антитела 02-hz52 (248G3F6) и 03-hz51 (300А6А6) тестировали на их аффинность связывания с SIRPa v1 и v2.In this example, humanized antibodies 02-hz52 (248G3F6) and 03-hz51 (300A6A6) were tested for their binding affinity to SIRPa v1 and v2.

Анализ кинетики связывания антитела с антигеном проводили с использованием системы Biacore 8K с помощью подхода с захватом человеческих антител. IgG к мышиному Fc иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 в соответствии с инструкцией производителя. Исследуемое антитело вводили и захватывали иммобилизованным IgG к человеческому Fc. Затем по отдельности вводили последовательные концентрации белка SIRPa v1 или SIRPa v2 человека, и регистрировали профиль связывания для аналита-антигена в каждой концентрации соответственно. Аналитическую систему регенерировали путем введения 10 мМ глицина-HCl, рН 1,5, в течение 30 с. Рабочий буфер представлял собой HBS-EP+ (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,05% Р20). Температура проведения анализа составляла 25°С, а время ассоциации и диссоциации составляло 180 и 600 с соответственно. Данные Biacore аппроксимировали с использованием программного обеспечения для оценки Biacore K8 1.0 в соответствии с моделью связывания 1:1 для расчета констант скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd), а также константы равновесия (KD).Antibody-antigen binding kinetics analysis was performed using the Biacore 8K system using a human antibody capture approach. Anti-mouse Fc IgG was immobilized on the CM5 sensor chip according to the manufacturer's instructions. The antibody of interest was injected and captured by immobilized anti-human Fc IgG. Successive concentrations of human SIRPa v1 or SIRPa v2 protein were then administered individually, and the binding profile for the antigen analyte at each concentration was recorded, respectively. The analytical system was regenerated by introducing 10 mM glycine-HCl, pH 1.5, for 30 s. The running buffer was HBS-EP+ (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% P20). The assay temperature was 25°C, and the association and dissociation times were 180 and 600 s, respectively. Biacore data were fitted using Biacore K8 1.0 evaluation software according to a 1:1 binding model to calculate association (ka) and dissociation (kd) rate constants as well as equilibrium constant (KD).

Результаты тестов показаны в табл. 10А-В.The test results are shown in table. 10A-B.

Таблица 10А. Аффинность связывания с SIRPa v1Table 10A. Binding affinity for SIRPa v1

Образец Sample ка (1/Мс) ka (1/Ms) kd (1/с) kd (1/s) KD (М) KD (M) 02-hz52 02-hz52 7,04Е+05 7.04E+05 2,98Е-04 2.98E-04 4,23Е-10 4.23E-10 03-hz51 03-hz51 8Д5Е+05 8D5E+05 8Д4Е-04 8D4E-04 9,99Е-10 9.99E-10

Таблица 10В. Аффинность связывания с SIRPa v2Table 10B. Binding affinity for SIRPa v2

Образец Sample ка (1/Мс) ka (1/Ms) kd (1/с) kd (1/s) KD (М) KD (M) 02-hz52 02-hz52 3,ЗЗЕ+О5 3,ЗЗЭ+О5 2,47Е-03 2.47E-03 7,40Е-09 7.40E-09 03-hz51 03-hz51 3,31Е+05 3.31E+05 1,00Е-03 1.00E-03 3,ОЗЕ-09 3, OZE-09

Пример 9. Исследования пригодности к производствуExample 9: Manufacturing feasibility studies

Антитела 02-hz52 (248G3F6) и 03-hz51 (300A6A6), слитые с человеческими константными областями тяжелой цепи IgG4 и константными областями легкой каппа-цепи, тестировали на их пригодность к производству. Оба антитела не содержат свободных цистеинов. Результаты тестирования показали, что оба антитела могут быть очищены для достижения клинической степени чистоты, имеют подходящие Tm, соотношения кислотного/основного пиков, гидрофобность и pI. Результаты представлены в табл. 11.Antibodies 02-hz52 (248G3F6) and 03-hz51 (300A6A6), fused to human IgG4 heavy chain constant regions and kappa light chain constant regions, were tested for their suitability for production. Both antibodies do not contain free cysteines. Test results showed that both antibodies could be purified to clinical purity and had suitable Tm, acid/base peak ratios, hydrophobicity and pI. The results are presented in table. eleven.

Таблица 10А. Аффинность связывания с SIRPa v1Table 10A. Binding affinity for SIRPa v1

Образец Sample Агрегаты Aggregates SEC (% мономера) SEC (% monomer) Выход (мг/л) Yield (mg/l) pl pl Кислотный ПИК Acid PEAK Основной ПИК Basic PEAK Основный ПИК Main PIC Tm pH 7,5 (°C) Tm pH 7.5 (°C) HIC (NlhhSOj (Μ) HIC (NlhhSOj (Μ) 02-hz52 02-hz52 Не обнаружены Not detected 99,2 99.2 >10 >10 6,9 6.9 35,5 35.5 57,2 57.2 7,2 7.2 65/71 65/71 1,02 1.02 03-hz51 03-hz51 Не обнаружены Not detected 97,91 97.91 >10 >10 7,9 7.9 34,5 34.5 62,3 62.3 3,2 3.2 65/74 65/74 0,96 0.96

Пример 10. Исследование in vivoExample 10 In Vivo Study

В данном примере исследовали эффективность гуманизированного антитела 03-hz51 (300A6A6) у мышей, отдельно или в комбинации с ритуксимабом.In this example, the effectiveness of the humanized antibody 03-hz51 (300A6A6) in mice, alone or in combination with rituximab, was examined.

Клетки Raji-Luc, ресуспендированные в PBS, инокулировали в хвостовую вену гуманизированных мышей B-NDG-hSIRPa при концентрации 1x105 клеток/0,2 мл и в объеме 0,2 мл/животное. Для измерения значения сигнала визуализации опухоли на третий день инокуляции использовали небольшое устройство для визуализации организмов животных. Когда средняя интенсивность сигнала визуализации достигала 1,35x106 ф/с, животных делили на группы в соответствии со значением сигнала визуализации опухоли и массой тела животного и равномерно распределяли в 4 экспериментах. В каждой экспериментальной группе было по 6 мышей.Raji-Luc cells resuspended in PBS were inoculated into the tail vein of humanized B-NDG-hSIRPa mice at a concentration of 1x105 cells/0.2 ml and in a volume of 0.2 ml/animal. A small animal imaging device was used to measure the tumor imaging signal value on the third day of inoculation. When the average imaging signal intensity reached 1.35 x 106 fps, the animals were divided into groups according to the tumor imaging signal value and the animal's body weight and were evenly distributed across 4 experiments. There were 6 mice in each experimental group.

- 26 045759- 26 045759

Ритуксимаб демонстрировал значительное ингибирующее действие на лимфому Raji-Luc на уровне дозы 10 мг/кг, без клинически неблагоприятных симптомов. 03-hz51 в комбинации с ритуксимабом (10 мг/кг + 0,1 мг/кг) продемонстрировало значительное ингибирующее действие на лимфому Raji-Luc. Данные показывают, что 03-hz51 синергически взаимодействовало с ритуксимабом, вызывая полное ингибирование роста опухоли на модели лимфомы Raji.Rituximab demonstrated significant inhibitory effects on Raji-Luc lymphoma at the 10 mg/kg dose level, without clinically adverse symptoms. 03-hz51 in combination with rituximab (10 mg/kg + 0.1 mg/kg) demonstrated significant inhibitory effects on Raji-Luc lymphoma. Data show that 03-hz51 interacted synergistically with rituximab to cause complete inhibition of tumor growth in a Raji lymphoma model.

Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен отдельными описанными вариантами реализации, которые играют роль отдельных иллюстраций конкретных аспектов изобретения, и любые композиции или способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники будет понятно, что способы и композиции согласно настоящему изобретению могут быть подвергнуты различным модификациям и вариациям без отклонения от сущности или объема изобретения. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение охватывает его модификации и вариации при условии, что они входят в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.The scope of the present invention is not to be limited by the individual embodiments described, which serve as individual illustrations of specific aspects of the invention, and any compositions or methods that are functionally equivalent are within the scope of the present invention. Those skilled in the art will appreciate that the methods and compositions of the present invention may be subject to various modifications and variations without departing from the spirit or scope of the invention. Thus, the present invention is intended to cover modifications and variations thereof provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

Все публикации и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретным и индивидуальным образом включена посредством ссылки.All publications and patent applications mentioned in this specification are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application were specifically and individually incorporated by reference.

Claims (11)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающие специфичностью связывания с сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa) человека дикого типа, где указанные антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность участки тяжелой цепи CDRH1, CDRH2 и CDRH3, имеющие последовательности аминокислот VH CDRH1, VH CDRH2 и VH CDRH3 SEQ ID: 43 соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющие комплементарность участки легкой цепи CDRL1, CDRL2 и CDRL3, имеющие последовательности аминокислот VL CDRL1, VL CDRL2 и VL CDRL3 SEQ ID NO: 45 соответственно.1. An antibody or antigen-binding fragment thereof having binding specificity for wild-type human signal regulatory protein alpha (SIRPa), wherein said antibody or fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) comprising the heavy chain complementarity determining regions CDRH1, CDRH2 and CDRH3, having the amino acid sequences VH CDRH1, VH CDRH2 and VH CDRH3 SEQ ID: 43, respectively, and a light chain variable region (VL) containing the light chain complementarity determining regions CDRL1, CDRL2 and CDRL3, having the amino acid sequences VL CDRL1, VL CDRL2 and VL CDRL3 SEQ ID NO: 45 respectively. 2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 SEQ ID NO: 43 и VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 SEQ ID NO: 45 определены согласно системе нумерации по Kabat.2. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3 SEQ ID NO: 43 and VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 SEQ ID NO: 45 are defined according to the Kabat numbering system. 3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что VH CDR1, VH CDR2 и VH CDR3 SEQ ID NO: 43 и VL CDR1, VL CDR2 и VL CDR3 SEQ ID NO: 45 определены согласно системе нумерации по Chothia.3. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3 SEQ ID NO: 43 and VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3 SEQ ID NO: 45 are defined according to the Chothia numbering system. 4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, отличающиеся тем, что указанная вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и указанная вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.4. The antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein said heavy chain variable region has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, and said light chain variable region has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 45. 5. Композиция для лечения рака, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.5. A composition for the treatment of cancer containing an antibody or fragment thereof according to any one of claims 1 to 4 and a pharmaceutically acceptable carrier. 6. Композиция по п.5, дополнительно содержащая второе антитело, обладающее специфичностью к опухолевому антигену.6. The composition according to claim 5, additionally containing a second antibody having specificity for the tumor antigen. 7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что указанное второе антитело представляет собой опсонизирующее опухоль антитело.7. The composition according to claim 6, characterized in that said second antibody is a tumor opsonizing antibody. 8. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4 для лечения рака.8. Use of an antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 4 for the treatment of cancer. 9. Применение по п.8, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака печени, рака ободочной кишки, рака прямой кишки, рака эндометрия, лейкоза, лимфомы, рака поджелудочной железы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, рака уретры, рака головы и шеи, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, рака пищевода, рака яичника, рака почки, меланомы, рака предстательной железы и рака щитовидной железы.9. Use according to claim 8, characterized in that said cancer is selected from the group consisting of bladder cancer, liver cancer, colon cancer, rectal cancer, endometrial cancer, leukemia, lymphoma, pancreatic cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, urethral cancer, head and neck cancer, gastrointestinal cancer, stomach cancer, esophageal cancer, ovarian cancer, kidney cancer, melanoma, prostate cancer and thyroid cancer. 10. Применение по п.8, дополнительно включающее введение указанному пациенту второго антитела, нацеленного на белок, запускающий опсонизацию опухоли.10. The use of claim 8, further comprising administering to said patient a second antibody targeting a protein that triggers tumor opsonization. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанный белок выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, HER2, CD3, CD16, PD1, PD-L1, LAG3, TIM3, CTLA4, VISTA, CSFR1, A2AR, CD73, CD39, CD40, СЕА, HER2, VEGFR, TIGIT, клаудина 18.2, CD24, GPC3, II13RA2, 4-1ВВ, CCR8 и СМЕТ.11. Use according to claim 10, characterized in that said protein is selected from the group consisting of CD19, CD20, EGFR, HER2, CD3, CD16, PD1, PD-L1, LAG3, TIM3, CTLA4, VISTA, CSFR1, A2AR, CD73, CD39, CD40, CEA, HER2, VEGFR, TIGIT, claudin 18.2, CD24, GPC3, II13RA2, 4-1BB, CCR8 and SMET.
EA202291928 2019-12-24 2020-12-24 MONOCLONAL ANTIBODIES TO SIRPα AND THEIR APPLICATIONS EA045759B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2019/127915 2019-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045759B1 true EA045759B1 (en) 2023-12-22

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11634490B2 (en) Blocking antibodies against CD47 and methods of use thereof
CA3086936C (en) Antibodies to t cell immunoreceptor with ig and itim domains (tigit) and uses thereof
JP7410141B2 (en) Anti-claudin-18.2 and anti-4-1BB bispecific antibody and use thereof
US20220169726A1 (en) ANTI-SIRPalpha MONOCLONAL ANTIBODIES AND USES THEREOF
KR102634374B1 (en) Anti-OX40 antibodies and uses thereof
JP2021536437A (en) Anti-PD-L1 / anti-LAG3 bispecific antibody and its use
US20240066121A1 (en) Anti-cd47 antibodies and uses thereof
US20230203160A1 (en) Chimeric antigen receptors targeting gprc5d
WO2022148370A1 (en) Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof
CN114437227A (en) Bispecific antibodies and uses thereof
EA045759B1 (en) MONOCLONAL ANTIBODIES TO SIRPα AND THEIR APPLICATIONS
US20240301052A1 (en) Anti-slc34a2 monoclonal antibodies and uses thereof
US20240101716A1 (en) BISPECIFIC ANTIBODIES TARGETING SIRPa AND PD-L1
TW202330593A (en) Anti-gprc5d monoclonal antibodies and uses thereof