EA045614B1 - IMPROVED LARGE SCALE PRODUCTION METHOD CRM197 - Google Patents
IMPROVED LARGE SCALE PRODUCTION METHOD CRM197 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045614B1 EA045614B1 EA201992527 EA045614B1 EA 045614 B1 EA045614 B1 EA 045614B1 EA 201992527 EA201992527 EA 201992527 EA 045614 B1 EA045614 B1 EA 045614B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- crm197
- medium
- fermentation medium
- crm
- amino acids
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 56
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 title claims description 49
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 49
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 42
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 29
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 29
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 21
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 21
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 claims description 20
- WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N pimelic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCC(O)=O WLJVNTCWHIRURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 20
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 19
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 18
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 14
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 14
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 12
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 11
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 11
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 11
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 10
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 10
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 10
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 9
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 8
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 8
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 6
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 claims description 4
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 4
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 4
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 3
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 claims description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 55
- 101150044687 crm gene Proteins 0.000 description 47
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 9
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 9
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 9
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 9
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000702141 Corynephage beta Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124950 Prevnar 13 Drugs 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- KRGPXXHMOXVMMM-UHFFFAOYSA-N nicotianamine Natural products OC(=O)C(N)CCNC(C(O)=O)CCN1CCC1C(O)=O KRGPXXHMOXVMMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021048 nutrient requirements Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229940103143 riboflavin 50 mg Drugs 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Description
Область изобретенияField of invention
Изобретение относится к улучшенному способу крупномасштабного производства CRM197 с использованием генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197.The invention relates to an improved method for large-scale production of CRM 197 using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene.
Уровень техникиState of the art
CRM197 является генетически детоксифицированной формой дифтерийного токсина. Единичная мутация в положении 52, заменяющая глютаминовую кислоту на глицин, приводит к потере АДФрибозилтрансферазной активности нативного токсина. Была выяснена структурная основа CRM197, лишенная токсичности, которая широко используется в качестве белка-носителя для конъюгатных вакцин. CRM197, подобно дифтерийному токсину, представляет собой одну полипептидную цепь из 535 аминокислот (58,4 кДа), состоящую из двух субъединиц (связанных дисульфидными мостиками).CRM 197 is a genetically detoxified form of diphtheria toxin. A single mutation at position 52, replacing glutamic acid with glycine, leads to loss of ADPribosyltransferase activity of the native toxin. The toxicity-free structural basis of CRM 197 has been elucidated and is widely used as a carrier protein for conjugate vaccines. CRM 197 , like diphtheria toxin, is a single polypeptide chain of 535 amino acids (58.4 kDa), consisting of two subunits (linked by disulfide bridges).
CRM197 используется в качестве белка-носителя в ряде одобренных к применению конъюгатных вакцин, таких как конъюгат Haemophilus influenza типа b, продаваемый под торговым наименованием Hibtiter TM, 13-валентный пневмококковый полисахаридный конъюгат, продаваемый под торговым наименованием PREVNAR 13® и т.п.CRM197 is used as a carrier protein in a number of approved conjugate vaccines, such as the Haemophilus influenza type b conjugate marketed under the trade name Hibtiter™, the 13-valent pneumococcal polysaccharide conjugate marketed under the trade name PREVNAR 13®, and the like.
Ruth M. Drew et al., Bacteriol. 1951 Nov; 62 (5):549-59; описали среду с определенным химическим составом, подходящую для производства дифтерийного токсина с высоким титром, и определили потребности в аминокислотах Corynebacterium diphtheriae, штамма Toronto Park-Williams № 8. Среда содержит аминокислоты, которые эффективно заменяют компонент животного происхождения, т.е. гидролизат казеина. Аминокислоты включают глютаминовую кислоту, цистин, пролин, триптофан, лейцин, валин, метионин и глицин.Ruth M. Drew et al., Bacteriol. 1951 Nov; 62 (5):549-59; described a chemically defined medium suitable for the production of high titer diphtheria toxin and determined the amino acid requirements of Corynebacterium diphtheriae strain Toronto Park-Williams No. 8. The medium contains amino acids that effectively replace the animal component, i.e. casein hydrolysate. Amino acids include glutamic acid, cystine, proline, tryptophan, leucine, valine, methionine and glycine.
Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983, Vol. 46 (3):560-564 отмечают, что нетандемные двойные лизогены являются стабильными и способны обеспечивать высокие выходы CRM197, до трех раз превышающие выход, обеспечиваемый монолизогенами.Rappuoli et al; Applied and Environmental Microbiology 1983, Vol. 46 (3):560-564 note that non-tandem dual lysogens are stable and capable of providing high yields of CRM 197 , up to three times the yield provided by monolysogens.
R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1):83-88, описывают подход, обеспечивающий рост в условиях высокой плотности с целью получения мутированного дифтерийного токсина из двух штаммов Corynebacterium diphtheria: С7 (β) (tox-201, tox-9) и С7 (β) (tox-107). Процедура включает использование модифицированной необезжелезенной среды, которая обеспечивает быстрый и высокоплотный рост бактерий и которая, в случае одновременного истощения глюкозы и железа, способствует увеличению выработки токсинов. Для обеспечения роста бактерий до плотности клеток с величиной поглощения 70 при 600 нм (15-20 г/л сухого веса) подавали обогащенный кислородом воздух. Максимальная концентрация токсина в культуральном супернатанте составляла 150 мг/л.R Fass. et al., Applied Microbiology and Biotechnology; April 1995, Volume 43(1):83-88, describe a high-density growth approach to produce mutated diphtheria toxin from two Corynebacterium diphtheria strains: C7 (β) (tox-201, tox-9) and C7 ( β) (tox-107). The procedure involves the use of a modified non-iron-free medium, which allows for rapid and high-density bacterial growth and which, if glucose and iron are simultaneously depleted, increases the production of toxins. Oxygen-enriched air was supplied to ensure bacterial growth to a cell density of 70 at 600 nm (15-20 g/L dry weight). The maximum concentration of toxin in the culture supernatant was 150 mg/l.
Parag P. Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220; описывают схему использования аминокислот во время роста дифтерии Corynebacterium и показывают, что только четыре из девяти протестированных аминокислот, а именно цистин, гистидин, аспартат и метионин, являются критическими для роста дифтерии Corynebacterium и выработки ею токсинов.Parag P. Nagarkar et al., Journal of Applied Microbiology 2002, 92, 215-220; describe the pattern of amino acid usage during the growth of Corynebacterium diphtheria and show that only four of the nine amino acids tested, namely cystine, histidine, aspartate and methionine, are critical for Corynebacterium diphtheria growth and toxin production.
В европейском патенте № 1849860 В1 раскрыто использование белкового материала неживотного происхождения, такого как белки из соевых бобов, семян хлопчатника, картофеля и т.д., в качестве питательной среды для культивирования патогенных бактерий.European Patent No. 1849860 B1 discloses the use of protein material of non-animal origin, such as proteins from soybeans, cotton seeds, potatoes, etc., as a nutrient medium for the cultivation of pathogenic bacteria.
В патенте США № 6962803 В2 раскрыт способ очистки дифтерийного токсина путем ферментации штамма микроорганизма, способного продуцировать дифтерийный токсин, причем указанный способ включает добавление глюкозы в растущую культуру, и такое добавление глюкозы поддерживает рост микроорганизмов на уровне, эффективном для продуцирования дифтерийного токсина. Также указано, что помимо источника углерода существуют другие минимальные требования к питательным веществам, необходимым для роста, которые включают металлические микроэлементы, фосфат, источник азота, обычно казаминокислоты и дрожжевой экстракт.US Pat. No. 6,962,803 B2 discloses a method for purifying diphtheria toxin by fermenting a strain of microorganism capable of producing diphtheria toxin, the method comprising adding glucose to a growing culture and such addition of glucose maintaining the growth of the microorganisms at a level effective to produce diphtheria toxin. It is also stated that in addition to the carbon source, there are other minimum nutrient requirements needed for growth, which include trace metals, phosphate, a nitrogen source, usually casamino acids and yeast extract.
В публикации заявки на патент США № 2011/0097359 А1 раскрыта среда для культивирования штамма Corynebacterium diphtheriae для производства дифтерийного токсина или его аналога, причем среда по существу не содержит продуктов животного происхождения и содержит воду; источник углеводов; источник азота; и количество свободных аминокислот в исходной концентрации, при этом исходная концентрация каждой свободной аминокислоты не ограничивает уровень продуцирования дифтерийного токсина или его аналога. Также указано, что источник углеводов не содержит глюкозы.US Patent Application Publication No. 2011/0097359 A1 discloses a medium for culturing a strain of Corynebacterium diphtheriae for the production of diphtheria toxin or an analogue thereof, the medium being substantially free of animal products and containing water; source of carbohydrates; nitrogen source; and the amount of free amino acids at the initial concentration, wherein the initial concentration of each free amino acid does not limit the level of production of diphtheria toxin or an analogue thereof. The carbohydrate source is also stated to be glucose-free.
В WO 2006/100108 А1 раскрыт ферментативный процесс, включающий этап выращивания штамма Corynebacterium diphtheria в среде внутри ферментера в условиях перемешивания, достаточных для поддержания гомогенной культуры и ограниченной аэрации, такой что рО2 в культуре падает до менее чем 4% в течение большей части этапа ферментации. Далее раскрыто, что за счет степени аэрации рН внутри ферментера поддерживается на уровне от 7,0 до 7,8, без необходимости добавления кислоты или основания.WO 2006/100108 A1 discloses an enzymatic process comprising the step of growing a strain of Corynebacterium diphtheria in a medium within a fermenter under stirring conditions sufficient to maintain a homogeneous culture and limited aeration such that the pO 2 in the culture drops to less than 4% for most of the step. fermentation. It is further disclosed that due to the degree of aeration, the pH within the fermenter is maintained at between 7.0 and 7.8, without the need to add acid or base.
Процесс получения CRM197 обычно чувствителен к небольшим изменениям компонентов процесса, а также параметров процесса. Во всем мире CRM197 получают из Corynebacterium diphtheriae, хотя коммерческий успех такого производства ограничен. Ни в одном из указанных выше документов не раскрытThe CRM 197 derivation process is typically sensitive to small changes in process components as well as process parameters. Worldwide, CRM 197 is produced from Corynebacterium diphtheriae, although its commercial success has been limited. Not disclosed in any of the above documents
- 1 045614 способ производства CRM197 с высоким выходом, например >150 мг/л, с использованием генномодифицированного штамма Corynebacterium diphtheria. Авторы настоящего изобретения разработали модель метаболического потока для крупномасштабного производства CRM197 с использованием генномодифицированного штамма Corynebacterium diphtheria.- 1 045614 method for the production of CRM197 in high yield, for example >150 mg/l, using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria. The present inventors have developed a metabolic flow model for large-scale production of CRM197 using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria.
Задача изобретенияObjective of the invention
Главная задача настоящего изобретения состоит в предоставлении улучшенного способа крупномасштабного производства CRM197.The main object of the present invention is to provide an improved method for large-scale production of CRM197.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление улучшенного способа крупномасштабного производства CRM197, который является экономически эффективным и может использоваться для производства конъюгатных вакцин.Another object of the present invention is to provide an improved method for large-scale production of CRM197 that is cost-effective and can be used for the production of conjugate vaccines.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Настоящее изобретение обеспечивает улучшенный способ производства CRM197 с высоким выходом путем использования генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197, включающий выращивание штамма в ферментативной среде, содержащей одну или более аминокислот и не содержащей компонентов животного происхождения.The present invention provides an improved method for producing CRM197 in high yield by using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM197 gene, comprising growing the strain in a fermentative medium containing one or more amino acids and free of animal components.
Настоящее изобретение обеспечивает улучшенный способ производства CRM197, который включает культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами.The present invention provides an improved method for the production of CRM197, which includes cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients.
Настоящее изобретение также обеспечивает улучшенный способ производства CRM197, который включает культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока.The present invention also provides an improved method for the production of CRM197, which includes cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on a metabolic flux model.
Краткое описание чертежейBrief description of drawings
На фиг. 1 показана конструкция плазмиды, обозначенной как pBE33.In fig. 1 shows the construction of the plasmid designated pBE33.
Фиг. 2 представляет собой блок-схему модели метаболического потока.Fig. 2 is a block diagram of a metabolic flow model.
Подробное описание изобретенияDetailed Description of the Invention
Настоящее изобретение относится к улучшенному способу крупномасштабного производства CRM197 с использованием генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количество копий гена CRM197, включающему выращивание штамма в ферментативной среде, содержащей более 10 аминокислот и не содержащей компоненты животного происхождения.The present invention relates to an improved method for large-scale production of CRM197 using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM197 gene, including growing the strain in a fermentative medium containing more than 10 amino acids and not containing components of animal origin.
Генно-модифицированный штамм Corynebacterium diphtheriae (С7Ер) по настоящему изобретению относится к Corynebacterium diphtheriae, содержащему в форме эписом многочисленные копии гена CRM197, регулируемые тем же механизмом, что и ген CRM197 хозяина, а фоновым генотипом указанного штамма является одиночный лизоген.The genetically modified strain of Corynebacterium diphtheriae (C7Ep) of the present invention refers to Corynebacterium diphtheriae containing in the form of episomes multiple copies of the CRM197 gene, regulated by the same mechanism as the host CRM197 gene, and the background genotype of the said strain is a single lysogen.
Аминокислоты, используемые в настоящем изобретении, выбирают из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глютаминовой кислоты, глютамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, валина и их солей, причем каждую аминокислоту используют в количестве примерно от 0,05 до 2 г/л.The amino acids used in the present invention are selected from alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, valine and salts thereof, each amino acid being used in an amount of from about 0.05 to 2 g/L.
Изучено влияние аминокислот, витаминов и условий процесса продуцирования CRM197. Было обнаружено, что некоторые аминокислоты оказывают негативное влияние на рост бактерий. Однако установлено, что продуцирование CRM197 увеличивается, если в оптимальной концентрации используется более 10 аминокислот. Концентрация аминокислот была оптимизирована в экспериментах на основе плана Плаккета-Бермана (Plackett Burman).The influence of amino acids, vitamins and conditions of the CRM197 production process was studied. Some amino acids have been found to have a negative effect on bacterial growth. However, CRM197 production has been found to increase when more than 10 amino acids are used at the optimal concentration. Amino acid concentrations were optimized in experiments based on the Plackett Burman design.
План Плаккета-Бермана представляет собой план проведения экспериментов по изучению зависимости некоторого измеряемого количества от нескольких независимых переменных (факторов) для минимизации дисперсию оценок этих зависимостей, используя ограниченное количество экспериментов. Результаты показали, что аминокислоты, такие как аспарагиновая кислота, глютамин, глицин, изолейцин, лейцин, валин при температуре от 35 до 36°C оказывают положительное влияние на синтез CRM197, а аминокислоты, такие как аланин, изолейцин, валин и при температуре от 35 до 36°C оказывают негативное влияние на синтез CRM197. Для достижения крупномасштабного производства CRM197 выполняли несколько уровней плана экспериментов при различных концентрациях. Использование тирозина и аспарагина приводило к снижению общего выхода CRM197, и, следовательно, эти аминокислоты не являются частью изобретения.The Plackett-Burman design is a plan for conducting experiments to study the dependence of some measured quantity on several independent variables (factors) to minimize the variance of estimates of these dependences, using a limited number of experiments. The results showed that amino acids such as aspartic acid, glutamine, glycine, isoleucine, leucine, valine at a temperature of 35 to 36°C have a positive effect on the synthesis of CRM197, and amino acids such as alanine, isoleucine, valine at a temperature of 35 up to 36°C have a negative effect on the synthesis of CRM197. To achieve large-scale production of CRM197, multiple levels of experimental design were performed at different concentrations. The use of tyrosine and asparagine resulted in a decrease in the overall yield of CRM197, and therefore these amino acids are not part of the invention.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативная среда содержит комбинацию фенилаланина, аргинина и одной или более других аминокислот, причем количество используемых фенилаланина и аргинина составляет примерно менее чем 1 г/л.In a preferred embodiment of the present invention, the fermentation medium contains a combination of phenylalanine, arginine and one or more other amino acids, the amount of phenylalanine and arginine used being approximately less than 1 g/L.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативная среда содержит комбинацию фенилаланина, аргинина и одной или более других аминокислот, причем фенилаланин находится в количестве от примерно 0,25 до 0,75 г/л, а аргинин - от примерно 0,1 до 0,5 г/л.In a more preferred embodiment of the present invention, the fermentation medium contains a combination of phenylalanine, arginine and one or more other amino acids, wherein phenylalanine is in an amount of from about 0.25 to 0.75 g/L and arginine is from about 0.1 to 0. 5 g/l.
В настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197 с использо- 2 045614 ванием генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197, включающий выращивание штамма в ферментативной среде, содержащей более 10 аминокислот, дополнение среды витаминами в диапазоне от примерно 0,05 до 20 мг на литр, причем среда не содержит компонентов животного происхождения.The present invention provides an improved method for the production of CRM197 using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM197 gene, including growing the strain in a fermentative medium containing more than 10 amino acids, supplementing the medium with vitamins ranging from about 0.05 to 20 mg per liter, and the medium does not contain components of animal origin.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения аминокислоты, витамины, микроэлементы и т.п. добавляют в ферментативную среду в качестве питательных веществ во время культивирования.In another embodiment of the present invention, amino acids, vitamins, microelements, and the like. added to the fermentation medium as nutrients during cultivation.
Различные питательные вещества, используемые в настоящем изобретении в качестве добавок, включают витамины, выбранные из никотиновой кислоты, тиамина, пантотеновой кислоты, биотина, рибофлавина, фолиевой кислоты; пимелиновой кислоты; фосфата, источника азота и металлических микроэлементов, и т.п., и каждый витамин используется в количестве от примерно 0,05 до 20 мг на литр.Various nutrients used in the present invention as additives include vitamins selected from niacin, thiamine, pantothenic acid, biotin, riboflavin, folic acid; pimelic acid; phosphate, a source of nitrogen and trace metals, etc., and each vitamin is used in an amount of from about 0.05 to 20 mg per liter.
Ферментативная среда, используемая в настоящем изобретении, является обезжелезенной средой и совсем не содержит компонентов животного происхождения. Кроме того, указанная среда также не содержит традиционных сред Леффлера на основе мяса и обезжелезенных сред YC с низким содержанием железа на основе казаминовой кислоты. Компоненты ферментативной среды по настоящему изобретению включают дрожжевой экстракт (YC), растительный пептон, калия дигидрофосфат (KH2PO4), триптофан, глюкозу, раствор YC с солями микроэлементов.The fermentation medium used in the present invention is an iron-free medium and does not contain any components of animal origin. In addition, the medium also does not contain traditional meat-based Loeffler's media and YC's low-iron casamic acid-based iron-free media. The components of the fermentation medium of the present invention include yeast extract (YC), plant peptone, potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4), tryptophan, glucose, YC solution with trace element salts.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав среды для культивирования генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 включает базовую ферментативную среду, содержащую дрожжевой экстракт, растительный пептон, калия дигидрофосфат (KH2PO4), триптофан, глюкозу, раствор YC с солями микроэлементов; одну или более аминокислот, витамины, микроэлементы и т.п.In another embodiment of the present invention, the composition of the medium for cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM197 gene includes a basic fermentation medium containing yeast extract, plant peptone, potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), tryptophan, glucose, YC solution with salts of microelements; one or more amino acids, vitamins, microelements, etc.
Подходящие металлические микроэлементы включают калий, магний, кальций, хлорид, холин, медь, марганец, сульфат, цинк и т.п.Suitable trace metals include potassium, magnesium, calcium, chloride, choline, copper, manganese, sulfate, zinc and the like.
В настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197 с использованием генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197, включающий добавление в ферментативную среду питательных веществ на основе модели метаболического потока.The present invention provides an improved method for the production of CRM197 using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM197 gene, including adding nutrients to the fermentation medium based on a metabolic flux model.
Модель метаболического потока относится ко всей сети теплообмена, массопереноса, скорости переноса кислорода (OTR), скорости поглощения кислорода (OUR) и кинетики переноса ионов, где OTR поддерживается за счет перемешивания, обратного избыточного давления и закачивания чистого кислорода. Эта модель показана на фиг 2.The metabolic flow model refers to the entire network of heat transfer, mass transfer, oxygen transfer rate (OTR), oxygen uptake rate (OUR), and ion transport kinetics, where OTR is maintained by stirring, backpressure, and pure oxygen injection. This model is shown in Fig 2.
Разработка модели метаболических потоков.Development of a metabolic flux model.
Эта модель создана на основе интерпретации онлайн данных о накоплении в процессе ионов водорода, в качестве основной переменной, с последующей конверсией растворенного кислорода в CO2, что сопровождается выделением тепла в указанном процессе. Например, модель работает в условиях ограничения источника углерода. Источник углерода подают порциями, и в процессе оценивают ответ. Исходя из ответа, корректируют образование ионов водорода. Затем оптимизируют питательные вещества для получения постоянного значения рН, растворенного кислорода (DO) и скорости теплопередачи (например, для рН 7,4; остаточного DO >2-20; скорости теплопередачи HTR).This model is created based on the interpretation of online data on the accumulation of hydrogen ions in the process as the main variable, followed by the conversion of dissolved oxygen to CO2, which is accompanied by the release of heat in the specified process. For example, the model operates under conditions of limited carbon source. The carbon source is fed in portions and the response is assessed during the process. Based on the answer, the formation of hydrogen ions is adjusted. Nutrients are then optimized to produce a constant pH, dissolved oxygen (DO), and heat transfer rate (e.g., pH 7.4; residual DO >2-20; heat transfer rate HTR).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ включает добавление в среду глюкозы в течение всего процесса ферментации.In one embodiment of the present invention, the method includes adding glucose to the medium throughout the fermentation process.
Настоящее изобретение не включает использование мальтозы в качестве источника углерода и этап обезжелезивания.The present invention does not include the use of maltose as a carbon source and the deferrization step.
CRM197, полученный в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать для изготовления конъюгатных вакцин, таких как пневмококковый конъюгат, тифозный конъюгат, Hib-конъюгат и т.п.CRM197 obtained in accordance with the present invention can be used for the manufacture of conjugate vaccines such as pneumococcal conjugate, typhoid conjugate, Hib conjugate and the like.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающий культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока, при этом аминокислоты выбирают из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глютаминовой кислоты, глютамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, валина и их солей.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM197, comprising cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on a metabolic flux model wherein the amino acids are selected from alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, valine and their salts.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающий культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, причем каждую аминокислоту используют в количестве от примерно 0,05 до 2 г/л.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM197, comprising cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM197 gene in a fermentation medium without animal components containing more than 10 amino acids, each amino acid being used in an amount of from about 0. 05 to 2 g/l.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающий культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacte- 3 045614 rium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока, причем каждую аминокислоту используют в количестве от примерно 0,05 до 2 г/л.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM197, comprising cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with increased copy number of the CRM 197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on a metabolic flux model, with each amino acid used in an amount of from about 0.05 to 2 g/L.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающий культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей базовую среду, более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока, причем каждую аминокислоту используют в количестве от примерно 0,05 до 2 г/л.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM 197 , comprising cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM 197 gene in a fermentative medium without animal components containing a basal medium, more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on a metabolic flux model, with each amino acid used in an amount of from about 0.05 to 2 g/L.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, который включает культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока, причем аминокислоты выбирают из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глютаминовой кислоты, глютамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, валина и их солей, причем каждую аминокислоту используют в количестве от примерно 0,05 до 2 г/л.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM 197 , which includes cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on metabolic flux model, wherein the amino acids are selected from alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, valine, and salts thereof, wherein each amino acid is used in an amount of from about 0.05 to 2 g/L.
В другом варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающий культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, причем аминокислоты выбирают из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глютаминовой кислоты, глютамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, валина и их солей, причем каждую аминокислоту используют в количестве от примерно 0,05 до 2 г/л.In another embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM 197 , comprising cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM 197 gene in a fermentation medium without animal components containing more than 10 amino acids, wherein the amino acids are selected from alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, valine and salts thereof, each amino acid being used in an amount of from about 0.05 to 2 g/l.
В предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, включающийIn a preferred embodiment, the present invention provides an improved method for producing CRM 197 , comprising
i) культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментационной среде без компонентов животного происхождения, содержащей базовую среду и более 10 аминокислот, выбранных из аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глютаминовой кислоты, глютамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, валина и их солей, и ii) дополнение среды глюкозой и питательными веществами, основыванное на модели метаболического потока.i) cultivation of a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene in a fermentation medium without components of animal origin, containing a basic medium and more than 10 amino acids selected from alanine, arginine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, valine and their salts, and ii) supplementation of the medium with glucose and nutrients based on the metabolic flux model.
В другом варианте осуществления во время ферментативного процесса температуру поддерживают в диапазоне от 30 до 40°C, а pH поддерживают на уровне от 7,0 до 8,0, предпочтительно от 7,4 до 7,6, используя 20% ортофосфорную кислоту и 12,5% гидроксид аммония. Ферментативный процесс длится от 15 до 24 ч, предпочтительно от 16 до 20 ч.In another embodiment, during the enzymatic process, the temperature is maintained in the range of 30 to 40°C and the pH is maintained at 7.0 to 8.0, preferably 7.4 to 7.6, using 20% phosphoric acid and 12 .5% ammonium hydroxide. The enzymatic process lasts from 15 to 24 hours, preferably from 16 to 20 hours.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции и способу ферментации, в которых отсутствуют тирозин и аспарагин. В одном из вариантов осуществления способ по настоящему изобретению не содержит обезжелезенную среду YC с низким содержанием железа на основе казаминовой кислоты, мальтозу в качестве источника углерода и этап обезжелезивания.In one embodiment, the present invention provides a fermentation composition and method that lacks tyrosine and asparagine. In one embodiment, the method of the present invention does not contain a low-iron YC medium based on casamino acid, maltose as a carbon source and a deferrization step.
В настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, который включает культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащую комбинацию фенилаланина и аргинина в количестве примерно менее 1 г/л и одну или более других аминокислот.The present invention provides an improved method for the production of CRM 197 , which includes cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene in a fermentation medium without animal components containing a combination of phenylalanine and arginine in an amount of less than about 1 g/l and one or more than other amino acids.
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197, который включает культивирование генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в ферментативной среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока, где выход полученного CRM197 составляет более 150 мг/л.In one embodiment, the present invention provides an improved method for the production of CRM 197 , which includes cultivating a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased copy number of the CRM 197 gene in a fermentative medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients to based on a metabolic flux model where the yield of CRM 197 produced is greater than 150 mg/L.
В одном из вариантов настоящее изобретение обеспечивает возможность изготовления конъюгатной вакцины, включающего конъюгирование полисахаридов из Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, meningococcus, Haemophilus influenzae с CRM197, полученным в соответствии с настоящим изобретением.In one embodiment, the present invention provides the possibility of producing a conjugate vaccine, including conjugating polysaccharides from Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, meningococcus, Haemophilus influenzae with CRM 197 obtained in accordance with the present invention.
В настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197 с высоким выходом с использованием генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197, включающий выращивание штамма в среде без компонентов животного происхождения, содержащей более 10 аминокислот, и дополнение среды питательными веществами на основе модели метаболического потока.The present invention provides an improved method for the production of CRM 197 in high yield using a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene, including growing the strain in a medium without animal components containing more than 10 amino acids, and supplementing the medium with nutrients based on metabolic flow models.
- 4 045614- 4 045614
В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении предоставляется улучшенный способ производства CRM197 с выходами, такими как 150 мг/л, 200 мг/л, 300 мг/л, 500 мг/л, 1 г/л, 1,5 г/л, 2 г/л, 2,5 г/л, 3 г/л, 3,5 г/л, 4 г/л, 4,5 г/л и 5 г/л.In one embodiment, the present invention provides an improved method for producing CRM197 with yields such as 150 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L, 1 g/L, 1.5 g/L, 2 g/l, 2.5 g/l, 3 g/l, 3.5 g/l, 4 g/l, 4.5 g/l and 5 g/l.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к генномодифицированному штамму Corynebacterium diphtheria C7 (β 197), в который методом электропорации переносят плазмиду pBE33.In one embodiment, the present invention relates to a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria C7 (β 197), into which the plasmid pBE33 is transferred by electroporation.
Количественную оценку CRM197, полученного в соответствии с настоящим изобретением, выполняют с помощью ферментно-связанного иммуно-сорбентного анализа (IC-ELISA).Quantitative assessment of CRM 197 obtained in accordance with the present invention is performed using an enzyme-linked immunosorbent assay (IC-ELISA).
Разработка генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 в плазмидном векторе экспрессии.Development of a genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria with an increased number of copies of the CRM 197 gene in a plasmid expression vector.
Corynebacterium diphtheriae C7 (β-197) АТСС 53821, ген, кодирующий CRM197, существует в виде единственной копии, а секреция мутантного белка CRM197 в культуральную среду находится под контролем железа. Выход CRM197 увеличивается в три раза, если использовать штамм Corynebacterium diphtheriae C7, содержащего две копии коринефага-бета (АТСС 39255). Это позволяет предположить, что количество копий гена связано с увеличенной продуктивностью. Для достижения промышленных масштабов производства CRM197 с помощью Corynebacterium diphtheriae желательно повысить уровень экспрессии. Интеграция большего количества копий в бактериальный геном технически сложна. Интегранты с большим количеством копий фага генетически нестабильны и теряют дополнительные копии гена CRM. Авторы настоящего изобретения намеревались повысить уровни экспрессии CRM197 путем увеличения копий гена CRM197, доставляемых на плазмидах, которые наряду с нативными регуляторными элементами CRM197 содержат селективный маркер устойчивости к антибиотику. Соответственно, авторы изобретения разработали штамм Corynebacterium diphtheria с увеличенным количеством копий гена CRM197 и оценили стабильность этого штамма. Модифицированный штамм имел более высокие уровни экспрессии CRM197 по сравнению с немодифицированными штаммами Corynebacterium.Corynebacterium diphtheriae C7 (β-197) ATCC 53821, the gene encoding CRM 197 , exists as a single copy, and secretion of the mutant CRM 197 protein into the culture medium is under the control of iron. The yield of CRM 197 is increased threefold when using Corynebacterium diphtheriae strain C7, which contains two copies of corynephage beta (ATCC 39255). This suggests that gene copy number is associated with increased productivity. To achieve industrial scale production of CRM197 by Corynebacterium diphtheriae, it is desirable to increase the expression level. Integrating more copies into the bacterial genome is technically difficult. Integrants with high phage copy numbers are genetically unstable and lose additional copies of the CRM gene. The present inventors intended to increase CRM 197 expression levels by increasing copies of the CRM 197 gene delivered on plasmids that, along with the native CRM 197 regulatory elements, contain a selectable antibiotic resistance marker. Accordingly, the inventors developed a Corynebacterium diphtheria strain with increased copy number of the CRM 197 gene and assessed the stability of this strain. The modified strain had higher levels of CRM 197 expression compared to unmodified Corynebacterium strains.
Настоящее изобретение более конкретно проиллюстрировано со ссылкой на приведенные ниже примеры. Однако следует понимать, что настоящее изобретение никоим образом не ограничено этими примерами, и включает их вариации в пределах параметров, раскрытых в настоящем описании, как известно специалистам в данной области техники.The present invention is more particularly illustrated with reference to the following examples. However, it should be understood that the present invention is in no way limited to these examples, and includes variations thereof within the parameters disclosed herein, as is known to those skilled in the art.
Пример 1. Улучшение экспрессии CRM197 за счет эписомальной копии CRM197.Example 1: Improvement of CRM 197 expression by an episomal copy of CRM 197 .
Получали вектор, который может стабильно реплицироваться в Corynebacterium diphtheria C7 (β197). Выделение нативной плазмиды из дифтерии Corynebacterium C7 выполняли согласно протоколу выделения крупной плазмиды, описанному в Т.С Currier et al., Anal Biochem. 1976; 76 (2):431441. Используя препарат нативной плазмидной ДНК амплифицировали участок инициации репликации 1,87Kb (oriR). Одновременно амплифицировали последовательность kanR 1,033Kb, используя матричную ДНК pUC4-KIXX, и тупой конец лигировали с oriR с образованием pBE30. Кроме того, из геномной ДНК Corynebacterium diphtheria C7 (β-197) амплифицировали последовательность гена CRM197 размером 2.13 Kb, содержащую промоторную область рТох (Boyd et al., 1988), cru и предсказанную терминаторную последовательность, и клонировали в уникальный сайт рестрикции SpeI, сконструированный в pBE30. Мутацию GAG в этом ампликоне подтверждали с помощью аллель-специфического анализа ПЦР (Pushnova et al., Analytical Biochemistry. 1998; 260:24-29) и секвенирования ДНК. Полученную таким образом плазмиду назвали pBE33 (фиг. 1).A vector was obtained that could stably replicate in Corynebacterium diphtheria C7 (β197). Isolation of native plasmid from Corynebacterium C7 diphtheria was performed according to the large plasmid isolation protocol described in T.C. Currier et al., Anal Biochem. 1976; 76(2):431441. Using a native plasmid DNA preparation, the 1.87Kb origin of replication region (oriR) was amplified. Simultaneously, the 1.033Kb kanR sequence was amplified using pUC4-KIXX template DNA, and the blunt end was ligated to oriR to generate pBE30. In addition, from the genomic DNA of Corynebacterium diphtheria C7 (β-197), a 2.13 Kb CRM 197 gene sequence containing the pTox promoter region (Boyd et al., 1988), cru and the predicted terminator sequence was amplified and cloned into a unique SpeI restriction site, constructed in pBE30. The GAG mutation in this amplicon was confirmed using allele-specific PCR analysis (Pushnova et al., Analytical Biochemistry. 1998;260:24-29) and DNA sequencing. The plasmid thus obtained was named pBE33 (Fig. 1).
Плазмиду pBE33 переносили методом электропорации согласно процедурам, оптимизированным для Corynebacterium diphtheria C7 (β-197). Трансформированные колонии Corynebacterium diphtheria C7 (β-197) (pBE33) подтверждали ПЦР-скринингом специфических колоний и выделением плазмиды и рестрикционным расщеплением. Экспрессию CRM197 в колониях анализировали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. CRM197 в среде количественно определяли методом ИФА и ВЭЖХ и представляли в виде концентрации CRM197, выраженной на литр культуральной среды.Plasmid pBE33 was transferred by electroporation according to procedures optimized for Corynebacterium diphtheria C7 (β-197). Transformed colonies of Corynebacterium diphtheria C7 (β-197) (pBE33) were confirmed by PCR screening of specific colonies and plasmid isolation and restriction digestion. Expression of CRM 197 in colonies was analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. CRM 197 in the medium was quantified by ELISA and HPLC and presented as the concentration of CRM 197 expressed per liter of culture medium.
Пример 2. Продуцирование CRM197 генно-модифицированным штаммом Corynebacterium diphtheria C7Ep в базовой среде без компонентов животного происхождения.Example 2. Production of CRM 197 by the genetically modified strain of Corynebacterium diphtheria C7Ep in a basic medium without components of animal origin.
В этом процессе использовали штамм Corynebacterium diphtheria С7Ер. Инокулят получали во встряхиваемой колбе методом двухэтапного культивирования. Среда для культивирования во встряхиваемой колбе содержала 10 г/л дрожжевого экстракта (YE), 15 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 4,0 г/л глюкозы, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина и 4,0 г/л глюкозы.The Corynebacterium diphtheria strain C7Ep was used in this process. The inoculum was obtained in a shake flask using a two-stage culture method. Shake flask culture medium contained 10 g/L yeast extract (YE), 15 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 4.0 g/L glucose, 0.8 mg /l nicotinic acid, 0.08 mg/l pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O , 0.5 g/l cystine, 25 mg/l kanamycin and 4.0 g/l glucose.
Для запуска процесса в среду ферментера объемом 20 л добавляли 5% инокулята. Среда для культивирования ферментера содержала 15 г/л YE, 30 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина, 4,0 г/л глюкозы.To start the process, 5% inoculum was added to the 20 L fermenter medium. The fermenter culture medium contained 15 g/L YE, 30 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 0.8 mg/L nicotinic acid, 0.08 mg/L pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H2O, 0.5 g/l cystine, 25 mg/l kanamycin, 4 .0 g/l glucose.
Всю партию культуры перемешивали при 300 об/мин. Температуру поддерживали на уровне 35°C, а рН поддерживали на уровне 7,4, используя 20% ортофосфорную кислоту и 5 н NaOH. Культуру аэриThe entire batch of culture was mixed at 300 rpm. The temperature was maintained at 35°C and the pH was maintained at 7.4 using 20% phosphoric acid and 5 N NaOH. Aeri culture
- 5 045614 ровали потоком 1,0 об/об/мин воздуха. Культуру обогащали кислородом для поддержания растворенного кислорода (DO) на уровне 20%. После первых нескольких часов уровень DO продолжал падать ниже 20%, когда был достигнут предел обогащения О2. Уровень DO в остальной части партии оставался близким к нулю и повышался в последние часы. Когда уровень остаточной глюкозы в бульоне падал ниже 0,5 г/л, вводили подпитку, содержащую 40% глюкозы, со скоростью 2 г/л/час. Партию собирали через 14 ч культивирования при достижении плотности клеток, равной примерно 90 единиц оптической плотности при 600 нм. Пену в реакторе контролировали, используя 30% органический пеногаситель. Продукция CRM197 достигала титра от 60 до 65 мг/л ферментативного бульона.- 5 045614 were driven with a flow of 1.0 rpm air. The culture was oxygenated to maintain dissolved oxygen (DO) at 20%. After the first few hours, the DO level continued to fall below 20% when the O2 enrichment limit was reached. DO levels in the rest of the batch remained close to zero and increased in the final hours. When the level of residual glucose in the broth fell below 0.5 g/L, a feed containing 40% glucose was introduced at a rate of 2 g/L/h. The batch was harvested after 14 h of culture when the cell density reached approximately 90 optical density units at 600 nm. Foam in the reactor was controlled using a 30% organic defoamer. CRM197 products reached a titer of 60 to 65 mg/L fermentation broth.
Ферментация, проводимая в сходных условиях с использованием немодифицированного штамма Corynebacterium diphtheriae C7 CRM197, давала примерно 35-40 мг/л CRM197, что ниже выхода, наблюдаемого в случае генно-модифицированного штамма. Это показывает влияние дополнительных копий гена на увеличение продуцирования CRM197.Fermentations carried out under similar conditions using the unmodified Corynebacterium diphtheriae C7 strain CRM197 yielded approximately 35-40 mg/L CRM197, which is lower than the yield observed with the genetically modified strain. This shows the effect of additional copies of the gene on increasing CRM197 production.
Пример 3. Продуцирование CRM197 генно-инженерным штаммом Corynebacterium diphtheria C7Ep в базовой среде без компонентов животного происхождения с использованием модели баланса метаболического потока.Example 3. Production of CRM197 by the genetically engineered strain Corynebacterium diphtheria C7Ep in a basal medium without animal components using a metabolic flux balance model.
В этом процессе использовали штамм Corynebacterium diphtheria С7Ер. Инокулят получали во встряхиваемой колбе методом двухэтапного культивирования. Среда для культивирования во встряхиваемой колбе содержала 10 г/л YE, 15 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 4,0 г/л глюкозы, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина, 4,0 г/л глюкозы.The Corynebacterium diphtheria strain C7Ep was used in this process. The inoculum was obtained in a shake flask using a two-stage culture method. Shake flask culture medium contained 10 g/L YE, 15 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 4.0 g/L glucose, 0.8 mg/L nicotinic acid , 0.08 mg/l pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O, 0.5 g/l cystine, 25 mg/l kanamycin, 4.0 g/l glucose.
Для запуска процесса в среду ферментера объемом 20 л добавляли 5% инокулята. Среда для культивирования ферментера содержала 15 г/л YE, 30 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина и 4,0 г/л глюкозы.To start the process, 5% inoculum was added to the 20 L fermenter medium. The fermenter culture medium contained 15 g/L YE, 30 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 0.8 mg/L nicotinic acid, 0.08 mg/L pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O, 0.5 g/l cystine, 25 mg/l kanamycin and 4.0 g/l glucose.
Всю партию культуры перемешивали при 300 об/мин. Температуру поддерживали на уровне 35°C, а рН поддерживали на уровне 7,4 с использованием 20% ортофосфорной кислоты и 12,5% гидроксида аммония. Культуру аэрировали потоком воздуха 1,0 об/об/мин. Культуру обогащали кислородом для поддержания DO на уровне 20%. Вводили модель, которая отслеживала уровень метаболической конверсии в заданный момент времени, эта модель брала данные из онлайн-параметра остаточного DO в соответствии с изменениями с учетом рН, СО2, тепловыделения. В лог-фазе уровни DO продолжали падать ниже 20%, несмотря на достижение предела обогащения О2. Уровень DO в остальной части партии оставался близком к нулю и повышался в последние часы. Когда уровень остаточной глюкозы в бульоне падал ниже 0,5 г/л, вводили подпитку, содержащую 40% глюкозы, для соответствия модели метаболического потока. Партию собирали через 14 ч культивирования при достижении плотности клеток, равной примерно 90 единиц оптической плотности при 600 нм. Пену в реакторе контролировали, используя 30% органический пеногаситель. Продукция CRM197 достигала титра 150 мг/л ферментативного бульона.The entire batch of culture was mixed at 300 rpm. The temperature was maintained at 35°C and the pH was maintained at 7.4 using 20% phosphoric acid and 12.5% ammonium hydroxide. The culture was aerated with an air flow of 1.0 rpm. The culture was enriched with oxygen to maintain DO at 20%. A model was introduced that tracked the level of metabolic conversion at a given point in time, this model took data from the online parameter of residual DO in accordance with changes taking into account pH, CO2, heat generation. During the log phase, DO levels continued to fall below 20% despite reaching the O2 enrichment limit. DO levels in the rest of the batch remained close to zero and increased in the final hours. When the residual glucose level in the broth fell below 0.5 g/L, a feed containing 40% glucose was introduced to match the metabolic flux model. The batch was harvested after 14 h of culture when the cell density reached approximately 90 optical density units at 600 nm. Foam in the reactor was controlled using a 30% organic defoamer. CRM197 production reached a titer of 150 mg/L fermentation broth.
Пример 4. Продуцирование CRM197 согласно настоящему изобретению.Example 4 Production of CRM197 according to the present invention.
Инокулят получали методом трехэтапного культивирования. Первые два этапа выполняли во встряхиваемых колбах. Среда для культивирования во встряхиваемых колбах содержала 10 г/л YE, 15 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 4,0 г/л глюкозы, 2 мл/л раствора YC с солями микроэлементов, 1 мл/л цистиновой добавки, 25 мг/л канамицина, 4,0 г/л глюкозы.The inoculum was obtained by a three-stage cultivation method. The first two steps were performed in shake flasks. The culture medium in shake flasks contained 10 g/L YE, 15 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 4.0 g/L glucose, 2 ml/L YC solution with salts microelements, 1 ml/l cystine supplement, 25 mg/l kanamycin, 4.0 g/l glucose.
Состав базовой среды для посевного ферментера был следующим: 15 г/л YE, 30 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина, 4,0 г/л глюкозы.The composition of the seed fermenter base medium was as follows: 15 g/L YE, 30 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH2PO4, 50 mg/L tryptophan, 0.8 mg/L niacin, 0.08 mg/L l pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O, 0.5 g/l cystine, 25 mg/l kanamycin, 4.0 g/l glucose.
Ниже приведен состав среды в ферментере (табл. I) и ингредиенты, который был разработан в соответствии с планом Плаккета-Бермана.Below is the composition of the fermenter medium (Table I) and ingredients, which was developed according to the Plackett-Burman plan.
- 6 045614- 6 045614
Таблица ITable I
В ферментер объемом 20 л с указанными выше компонентами в базовой среде (15 г/л YE, 30 г/л растительного пептона, 4,3 г/л KH2PO4, 50 мг/л триптофана, 0,8 мг/л никотиновой кислоты, 0,08 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 ZnSO4-5H2O мг/л, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,5 г/л цистина, 25 мг/л канамицина, 4,0 г/л глюкозы) добавляли 5% инокулята из посевного ферментера для запуска процесса. Температуру поддерживали на уровне 35°C, и рН поддерживали на уровне 7,4-7,6 с использованием 20% ортофосфорной кислоты, 12,5% гидроксида аммония, и используя модель, основанную на модуляции метаболического потока (фиг. 2) подачи глюкозы и OTR.In a 20 L fermenter with the above components in a basic medium (15 g/L YE, 30 g/L plant peptone, 4.3 g/L KH 2 PO 4 , 50 mg/L tryptophan, 0.8 mg/L nicotinic acid, 0.08 mg/l pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 ZnSO 4 -5H 2 O mg/l, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O, 0, 5 g/L cystine, 25 mg/L kanamycin, 4.0 g/L glucose) 5% inoculum from the seed fermenter was added to start the process. The temperature was maintained at 35°C and the pH was maintained at 7.4-7.6 using 20% phosphoric acid, 12.5% ammonium hydroxide, and using a metabolic flux modulation model (Figure 2) of glucose supply and OTR.
Культуру аэрировали потоком воздуха 1,0 об/об/мин. Культуру обогащали кислородом для поддержания DO на уровне 20%. В лог-фазе уровни DO продолжали падать ниже 20%, несмотря на достижение предела обогащения О2. Уровень DO в остальной части партии оставался близким к нулю и повышался в последние часы. Когда остаточная глюкоза в бульоне падала ниже 0,5 г/л, подавали 40% раствор глюкозы со скоростью 4,5 г/л/час. Периодически добавляли витамины и микроэлементы в следующих количествах: 6,425 мг/л никотиновой кислоты, 0,465 мг/л пимелиновой кислоты, 25 мг/л CuSO4-5H2O, 12,5 мг/л ZnSO4-5H2O, 6,25 мг/л MnCl2-4H2O, 0,08 мг/л тиамина, 0,25 мг/л пантотеновой кислоты, 0,006 мг/л биотина, 0,3 мг/л рибофлавина, 0,06 мг/л фолиевой кислоты. Партию собирали через 18 часов культивирования при достижении плотности клеток примерно 132 единиц OD при 600 нм. Пену в реакторе контролировали, используя 30% органический пеногаситель. Продукция CRM197 достигла титра 450-500 мг/л ферментативного бульона.The culture was aerated with an air flow of 1.0 rpm. The culture was enriched with oxygen to maintain DO at 20%. In log phase, DO levels continued to fall below 20% despite reaching the O2 enrichment limit. DO levels in the rest of the batch remained close to zero and increased in the final hours. When the residual glucose in the broth dropped below 0.5 g/L, 40% glucose solution was added at a rate of 4.5 g/L/h. Vitamins and microelements were periodically added in the following quantities: 6.425 mg/l nicotinic acid, 0.465 mg/l pimelic acid, 25 mg/l CuSO 4 -5H 2 O, 12.5 mg/l ZnSO 4 -5H 2 O, 6.25 mg/l MnCl 2 -4H 2 O, 0.08 mg/l thiamine, 0.25 mg/l pantothenic acid, 0.006 mg/l biotin, 0.3 mg/l riboflavin, 0.06 mg/l folic acid. The batch was harvested after 18 hours of culture when the cell density reached approximately 132 OD units at 600 nm. Foam in the reactor was controlled using a 30% organic defoamer. CRM 197 products reached a titer of 450-500 mg/l of fermentation broth.
Пример 5. Сравнение выходов CRM197 при использовании нативного Corynebacterium diphtheriae C7 и генно-модифицированного штамма Corynebacterium diphtheriae C7Ep.Example 5. Comparison of CRM 197 yields using native Corynebacterium diphtheriae C7 and genetically modified strain Corynebacterium diphtheriae C7Ep.
Ферментацию выполняли в базовой среде без компонентов животного происхождения, используя ранее полученные улучшения процесса на основе модели, и среды и способы в соответствии с настоящим изобретением с использованием нативного штамма Corynebacterium diphtheria C7 и генномодифицированного штамма Corynebacterium diphtheria.Fermentation was performed in a basal medium without animal components, using previously obtained model-based process improvements, and the media and methods of the present invention using native Corynebacterium diphtheria strain C7 and a genetically modified Corynebacterium diphtheria strain.
Для оптимизации процесса использовали один лизогенный штамм Corynebacterium diphtheriae C7 и генно-модифицированный штамм с эпизодически размещенными дополнительными копиями гена CRM197 (С7Ер). В типичной необезжелезенной среде YC, содержащей компоненты животного происхождения, С7 давал от 22 до 25 мг/л CRM197, тогда как С7Ер давал от 40 до 45 мг/л. Когда среда была модифицирована путем замены компонентов животного происхождения растительным пептоном, штамм С7To optimize the process, one lysogenic strain of Corynebacterium diphtheriae C7 and a genetically modified strain with occasional additional copies of the CRM 197 gene (C7Ep) were used. In a typical non-deferrified YC medium containing animal components, C7 gave 22 to 25 mg/L CRM 197 while C7Ep gave 40 to 45 mg/L. When the medium was modified by replacing animal components with plant peptone, strain C7
--
Claims (10)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN201741014335 | 2017-04-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045614B1 true EA045614B1 (en) | 2023-12-12 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6961819B2 (en) | Recombinant bacteria that produce L-lysine, its construction method and L-lysine production method | |
| EP2102337B1 (en) | A microorganism of corynebacterium genus having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same | |
| CN103497979B (en) | The glyoxylate bypass of the change of the amino acid and chemicals aspartate-derived for improved production | |
| JP2021500914A5 (en) | ||
| CN107034250A (en) | The manufacture method of glutamic acid-type L amino acid | |
| US20100015673A1 (en) | Microorganism Of Corynebacterium Genus Having Enhanced L-Lysine Productivity And A Method Of Producing L-Lysine Using The Same | |
| JP5897197B2 (en) | Production method of useful substances | |
| JP2010503395A (en) | Corynebacterium genus having improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| CN108467848A (en) | Corynebacteria microorganism using xylose and the method using its generation L-lysine | |
| JP2004236660A (en) | Microbe strain, plasmid for fermentative production of l-methionine, method for preparing microbe strain, and method for producing l-methionine | |
| CN105980544B (en) | Microorganism producing L-amino acid and method for producing L-amino acid using the same | |
| KR102637436B1 (en) | Improved method for high level production of CRM197 | |
| EA045614B1 (en) | IMPROVED LARGE SCALE PRODUCTION METHOD CRM197 | |
| KR100816472B1 (en) | - - Corynebacterium glutamicum deleted a gene gltI encoding glutamate ABC-type transporter and method for producing L-lysine using the same | |
| Masilamani et al. | Method for high level production of CRM 197 | |
| OA20586A (en) | An improved method for high level production of CRM | |
| JP2001057896A (en) | Production of l-lysine | |
| CN115572703A (en) | Recombinant strain and method for producing amino acid by using same | |
| CN116904379A (en) | Gene recombination strain for high yield tetrahydropyrimidine and construction method and application thereof | |
| SU526295A3 (en) | Method for producing lysine |